CN103154244A - 寡核苷酸标记及其鉴定方法 - Google Patents
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- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Abstract
本发明提供了寡核苷酸标记和使用其鉴定物质的方法。所述寡核苷酸标记使短时间内以高精确性分析痕量的物质成为可能,具有改进的在油性溶剂中的溶解度,并且可以改进检测方法从而使得在2小时内可检测到所述寡核苷酸标记。所述寡核苷酸标记可标记多种产品(包括油产品和石油产品,艺术品和收藏品),并且可用于进行犯罪调查。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸标记及其鉴定方法。
背景技术
寡核苷酸具有独特的优势,这是由于它们即使以很少的量存在也可通过聚合酶链式反应(PCR)大量扩增,并且其原始的核苷酸序列可通过核苷酸测序确定。因此,当将很少量的这种寡核苷酸添加至多种物质或产品(包括油、涂料(paint)、爆炸物和艺术品)时,可以精确地测定物质或产品的最初来源或运输途径,或者产品是否真实的。
一般使用添加荧光剂、色素或特定化学物质的方法来标记油产品。但是问题在于:很难对很少量的样品进行定量分析,很难对多种产品进行标记,操作者可造成污染,并且可进行变造(manipulation)例如移除标记。
用于寡核苷酸合成仪的标准合成法是亚磷酸三酯法。在亚磷酸三酯法中,形成DNA结构骨架的磷酸二酯键使用β-氰乙基亚磷酰胺产生。在该方法中,从连接有核苷的固体支持物开始,通过重复由去保护(deblocking)、偶联、加帽和氧化组成的合成过程来合成具有期望长度的寡核苷酸。作为合成过程的第一步的去保护步骤起始于使DMT从固体支持物上脱离,去保护步骤生成的5′-羟基与核苷亚磷酰胺单体发生偶联反应,以合成具有期望核苷酸序列的寡核苷酸。去保护步骤在酸性条件下使用三氯乙酸或二氯乙酸进行。偶联步骤后,未反应的5′-羟基可以参与下一偶联步骤以生成具有不期望核苷酸序列的(n-1)mer,因此,使未反应的5′-羟基通过用乙酸酐和N-甲基咪唑乙酰化进行加帽。偶联步骤得到的结构为亚磷酸酯,用碘将其氧化以将其转化成磷酸酯形式,这是实际DNA结构的一部分。重复上述合成过程使得合成具有期望长度的寡核苷酸。合成完成后,用氨处理使合成的寡核苷酸从固体支持物上脱离,β-氰乙氧基被从中去除,从而使得所合成的寡核苷酸恢复为形成DNA结构骨架的磷酸二酯键。
由于在中性pH下磷酸二酯键带负电,所以由多个磷酸二酯键组成的寡核苷酸显示强亲水性。
因此,寡核苷酸易溶于水溶液,但一般不溶于有机溶剂。该特性导致寡核苷酸溶解于有机溶剂中时溶解度低的问题。
对于使用这种DNA标记对象的方法,WO87/06383公开了可作为标记使用的核苷酸,但未公开通过DNA扩增或测序鉴定对象的方法,并且未公开在有机溶剂中溶解亲水性DNA的方法。WO90/14441公开了使用去污剂将DNA溶于油中,从而将亲水性DNA引入有机层的技术。然而,WO90/14441仅公开了使用特定引物检测DNA是否扩增来确定DNA存在与否。而且,其未提及使用DNA的核苷酸序列作为鉴定标记。此外,使用去污剂时,DNA在有机层中以反向胶束的形式存在,以致其聚集而不是在分子水平上分散。另外,以反向胶束形式引入有机层的DNA可容易地被提取至水层,从而可能被去除。
WO91/17265公开了通过用特定引物(WO90/14441中描述的)扩增基因来确定基因的核苷酸序列,还公开了DNA可与固体支持物或物质共价连接。对于WO91/17265的公开,当核苷酸直接与涂料或油成键时,在提取和收集寡核苷酸的过程中共价键会被破坏,从而改变核苷酸。因此,寡核苷酸不能扩增为准确序列,因此它们难以被商业化。
WO94/14918公开了基因扩增和测序的更为改进的方法,其使用两种或更多种发光物质或显色化合物作为标记。然而,该方法也未考虑到寡核苷酸的羟基或核苷酸的氨基的反应性。由于羟基或氨基部分的反应,在进行聚合酶链式反应(PCR)或核苷酸测序时无法得到具有原始序列的寡核苷酸。
美国专利No.5665538公开了监测水溶液中石油物质运动的方法,包括在石油物质中添加微轨迹添加剂(microtrace additive)。使用DNA以0.01-1000pg/DNA/μl的终浓度将微轨迹添加剂加入至石油物质中。将DNA配制为可溶于石油物质,从而微轨迹添加剂的疏水性使其分配到石油物质中。该制剂确保DNA溶解于或分散于石油物质中,从而使得其基本上不被水性清洗除去。含微轨迹添加剂的石油物质在其移动后取样,然后将微轨迹添加剂从石油物质中取出,最后通过扩增反应对DNA微轨迹添加剂进行检测。
美国专利公开2007/0065876公开了标记系统,其包含具有不同大小的寡核苷酸的组合。每个DNA包括三个片段,其中中间片段具有根据寡核苷酸的长度而不同的长度,从而使得这种不同的长度作为编码,并且两个末端片段为具有不同序列的引物。引物作为检测元件来确定物质的存在与否。寡核苷酸DNA通过扩增进行检测。
美国专利No.5451505公开了监测暴露于自然紫外照射的物质是否存在的方法,其包括使用至少20个且少于1,000个核苷酸的核酸使物质(如空气污染物、油或芳族化合物)标签化,以使所述物质和核酸暴露于自然紫外照射的方式释放经标签化的物质,收集核酸,用聚合酶链式反应扩增所述核酸,并且监测物质的存在。
EP1171633公开了包含相同探针序列和不同引物序列的核苷酸标签,还公开了这样的核苷酸标签序列,其中正向引物和探针是固定的,而反向引物是变化的。其中,通过用引物和荧光标记之标签进行的PCR对样品中的核苷酸标签进行定量检测,从而允许定量测定物质中标记的量。
为了克服现有技术的上述局限性,以申请人名义申请的韩国专利申请No.10-0851764公开了在亲脂性溶剂中具有提高的溶解度的寡核苷酸,以及使用其鉴定物质的方法。同样,以申请人名义申请的韩国专利申请No.10-0851765公开了寡核苷酸标记以及使用其检测交通工具的方法,所述寡核苷酸标记添加至交通工具涂层膜并且适于用作交通工具鉴定标记。根据所公开的方法,可通过以下用核苷酸序列信息跟踪和监视物质:提取溶于涂料的痕量寡核苷酸,收集所述寡核苷酸,通过PCR扩增所收集的寡核苷酸,然后对所扩增的寡核苷酸进行测序。在该方法中,需要解码核苷酸序列的过程,因为序列信息是编码的。由于分析成本、精确性、时间消耗以及过程的复杂性,分析核苷酸序列的方法不易商业化,并且以简单而迅速的方式确定物质的编码信息(内部使用的鉴定编号,例如批号、生产商等)以及物质是否真实存在局限性。
此外,由于市场上存在多种质量的油,油等级的变造以及非标准汽油的流通造成了问题。因此,为了控制制造商的品牌形象并且在这些的流通中建立秩序,需要能够鉴定流通油的种类和质量的技术。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供更稳定的寡核苷酸,以及用寡核苷酸标记物质并且在短时间内从物质中回收和鉴定经标记的寡核苷酸标记的方法。
问题的解决方法
一方面,本发明提供了连接有阳离子型相转移剂(cationic phasetransfer agent)(为季铵盐化合物或阳离子表面活性剂)的寡核苷酸,以及使用所述寡核苷酸标记物质并且在短时间内从物质中回收和鉴定经标记寡核苷酸标记的方法。
下文将对本发明进行详细说明。
一方面,本发明提供了用于鉴定物质的寡核苷酸标记,所述寡核苷酸标记为连接有阳离子型相转移剂(为季铵盐化合物或阳离子表面活性剂)的寡核苷酸,所述寡核苷酸标记包含用于实时聚合酶链式反应(PCR)的探针序列和连接至探针序列两端的引物序列。
本发明中,所述阳离子型相转移剂可为烷基季铵离子(quaternaryalkylammonium ion),如四丁基氢氧化铵或十六烷基三甲基溴化铵。
本发明中,所述寡核苷酸的末端可被封闭剂封闭,其中所述封闭剂不含化学物质或末端基团,例如脂质或磷酸酯/盐(phosphate)。
本发明中,所述寡核苷酸包含与含1-50个碳原子的有机化合物连接的反应性氮和氧部分,其中所述含1-50个碳原子的有机化合物为选自以下的化合物中的任一种:与氮形成酰胺键并且与氧形成酯键的羰基化合物、形成O-Si键与N-Si的硅基(silanyl)化合物、形成O-S键与N-S的磺酰基化合物,以及形成O-C键与N-C的饱和烃、芳香烃、不饱和烃或含杂原子的饱和或不饱和烃化合物,其中N-C和O-C之间的键可通过用氨处理断裂。
本发明中,所述寡核苷酸的长度为20-1000个核苷酸。
另一方面,本发明提供了用于鉴定物质的方法,所述方法包括将所述寡核苷酸标记添加至所述物质。
所述物质可以是选自以下的物质中的一种:交通工具涂层(vehiclecoating)、漆(lacquer)、交通线涂料(paints for traffic line)、石油、涂料稀释剂(paint diluent)、冲淡剂(thinner)、爆炸物、天然油,建筑涂料、有机溶剂、粘合剂、染料、肉和鱼。
另一方面,本发明提供了用于鉴定物质的方法,所述方法包括:
1)从标记有寡核苷酸标记的物质中提取寡核苷酸标记,所述寡核苷酸标记为与阳离子型相转移剂连接的寡核苷酸,所述阳离子型相转移剂为季铵盐化合物或阳离子表面活性剂,所述寡核苷酸标记包含用于实时聚合酶链式反应(PCR)的探针序列和连接至探针序列两端的引物序列;
2)使用引物和探针通过实时PCR扩增所提取的寡核苷酸;
3)通过实时PCR产物鉴定标记有所述寡核苷酸标记的物质。
本发明中,所述探针可为荧光标记探针。
本发明中,1)中的提取可以通过向所述物质中添加阴离子表面活性剂来进行。
本发明中,所述物质可以为脂溶性或水溶性物质。
更特别地,所述物质可以为选自以下的物质中的一种:交通工具涂层、漆、交通线涂料、石油、涂料稀释剂、冲淡剂、爆炸物、天然油,建筑涂料、有机溶剂、粘合剂、染料、肉和鱼。
本发明中,可以通过以下进行鉴定:通过包含在所述物质中的具有不同序列的寡核苷酸标记的组合来鉴定所述物质。
另一方面,本发明提供了用于鉴定物质的组合物,所述组合物包含所述寡核苷酸标记。
本发明中,所述组合物还可包含与所述寡核苷酸标记相对应的引物和探针。
发明的有利效果
本发明的用于鉴定物质的寡核苷酸标记使得短时间内以高精确性分析痕量物质成为可能,其在油性溶剂中具有改进的溶解度,并且可以改进检测方法从而使得可以在2小时内检测寡核苷酸标记。
与使用测序的常规标记方法或利用荧光染料进行标记的常规方法相比,本发明的用于鉴定物质的方法可提供灵敏几百倍的标记,而且其可标记多种产品,从而使得在实际生产过程对产品进行控制成为可能。
本发明的用于鉴定物质的寡核苷酸标记可标记多种产品,包括油产品和石油产品、艺术品和收藏品,并且还可用于进行犯罪调查。
附图简述
本发明的上述和其他目的、特征以及其他优点将通过以下结合附图的对一些优选实施方案的说明变得显而易见,附图中:
图1显示与相转移剂连接的寡核苷酸,其中寡核苷酸5和3区的核苷酸部分或醇形成酰胺键和酯键(R:C1~C18);
图2显示作为使用阳离子型相转移剂之函数的寡核苷酸在有机溶剂中的溶解度的分析结果((A):溶于柴油的寡核苷酸的量;(B):溶于汽油的寡核苷酸的量;(C):溶于柴油的含脂质的寡核苷酸的量;(D):溶于汽油的含脂质的寡核苷酸的量);
图3显示溶于有机溶剂汽油的本发明寡核苷酸的回收的分析结果((A):溶于柴油的寡核苷酸的回收率;(B):溶于汽油的寡核苷酸的回收率);
图4图3显示溶于作为有机溶剂的柴油的本发明寡核苷酸的回收率的分析结果;
图5显示为了检测从有机溶剂汽油中回收的本发明寡核苷酸的分子结构修饰而进行的MALDI-TOF质量分析结果;
图6显示为了检测从有机溶剂柴油中回收的本发明寡核苷酸的分子结构修饰而进行的MALDI-TOF质量分析结果;
图7为显示以下的一组图:用本发明寡核苷酸进行的实时定量核酸扩增反应的荧光曲线图(A);使用荧光曲线绘制的定量曲线线图(B);
图8为显示以下的一组图:作为拷贝数之函数的以系列稀释标准寡核苷酸作为模板以及探针和引物进行的实时定量核酸扩增反应的荧光曲线图(A);使用荧光曲线绘制的定量曲线线图(B);
图9为显示以下的一组图:作为拷贝数之函数的以从汽油中纯化的寡核苷酸标记和标准寡核苷酸作为模板以及探针和引物进行的实时定量核酸扩增反应的荧光曲线图(A);使用荧光曲线绘制的定量曲线线图(B);
图10是显示本发明寡核苷酸标记的鉴定信息的示意图;
图11为示意图,其显示用4种不同引物组和5种探针组标记的样品是否产生实施例4中的多种鉴定编码(引物组1:红,引物组2:黄,引物组3:绿,引物组4:蓝,探针1:紫,探针2:蓝,探针3:绿,探针4:橘红,以及探针5:亮绿);
图12为显示本发明实施例4中使用qPCR反应进行的定量分析结果的图,qPCR反应使用探针组SEQ ID NO:35和39,引物组SEQ ID NO:27和28,以及引物组SEQ ID NO:29和30作为对照。
图13为显示对本发明实施例4的4种模板使用qPCR反应进行的定量分析结果的图,qPCR反应使用探针组SEQ ID NO:35和39,引物组SEQ ID NO:27和28。
图13为显示对本发明实施例4的4种模板使用qPCR反应进行的定量分析结果的图,qPCR反应使用探针组SEQ ID NO:35和39,引物组为SEQ ID NO:29和30。
具体实施方式
下文将参照实施例对本发明进行进一步详细阐述。然而,这些实施例仅用于说明目的,而不以任何方式将本发明的范围限于这些实施例。
除非另有定义,本文所用全部技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。在下面的描述和附图中,省略了将使本发明主题不需要地含糊的已知功能和构造的描述。
[实施例1]有机溶剂中寡核苷酸的溶解
1)寡核苷酸的制备
为了检测寡核苷酸通过相转移剂(PTA)在有机溶液中溶解度,通过自动合成系统在受控孔度玻璃(controlled pore glass,CPG)上合成了具有期望核苷酸序列的寡核苷酸。寡核苷酸序列设计成使其可通过qPCR(定量聚合酶链式反应)分析,其为68mer长的模板DNA。
SEQ ID NO:1(正常-68mer):
5′-ATTCGGTGAATAAGCACTCTCATAGTCCTCATCCAACTGCGCGTCTTGCATAGAGCTGCTGACCCTAC-3′(MW=20777).
为了增强作为模板的寡核苷酸在有机溶剂中的溶解度和稳定油中的寡核苷酸,可以将寡核苷酸合成为在其两端添加有脂质。在本实施例中,设计寡核苷酸以使其3′端还包含C12,在5′端还包含C18。
SEQ ID NO:2(脂质-68mer):
5′-C18-ATTCGGTGAATAAGCACTCTCATAGTCCTCATCCAACTGCGCGTCTTGCATAGAGCTGCTGACCCTAC-C12-3′
用氨(浓度为28%或更高)从受控孔度玻璃(CPG)回收合成的寡核苷酸。为了实现该目的,合成后,将1ml28%氨水添加至受控孔度玻璃(约10mg),然后室温下(约25℃)孵育约30分钟,之后回收氨溶液,从而回收作为水溶液的寡核苷酸。回收上述条件下处理的寡核苷酸,使得DNA碱基保护基团被部分保留。这些碱基保护基团有利于寡核苷酸在有机溶剂中的溶解,并防止寡核苷酸被酶等降解。这些保护基团在回收后可用有机溶剂除去,使得寡核苷酸可通过qPCR分析。水溶液中的寡核苷酸用260nm处的UV吸光度进行定量。
(2)样品的制备
使用15ml锥形管(Corning)进行将寡核苷酸的水溶液溶于有机溶剂的实验。将寡核苷酸溶于无菌水中以使OD达到每毫升约50(但在其它实验中其稀释至多种浓度)。作为相转移剂(PTA),可以使用通过静电吸引力与寡核苷酸的阴离子区域连接的阳离子型相转移剂(+PTA)。在这样的实施例中,使用十六烷基三甲基溴化铵(分子量=364.5)作为相转移剂,将其以1.3nM的浓度(但在其它实验中溶解为多种浓度)溶于无菌水。
作为有机溶剂,可以使用甲苯和醚,也可以使用油,如汽油和柴油。在本实施例中,使用汽油(SK Energy Co.,Ltd.,Korea)和柴油(SK EnergyCo.,Ltd.,Korea)作为运输工具用油。
(3)实验步骤
用15ml锥形管(Corning)进行将寡核苷酸水溶液溶于有机溶剂的实验。
将寡核苷酸加至锥形管以使OD达到每毫升约100,然后加入阳离子型相转移剂(+PTA)使样品体积达到2ml,之后加入等体积的有机溶剂。将包含样品和有机溶剂的锥形管用盖封闭,用涡旋器充分混合样品1分钟或更长时间。此时,寡核苷酸的极性部分与相转移剂通过静电连接而中和,以使其溶于有机溶剂。将混合的样品以3,000RPM离心10,得到水层和有机溶剂层,收集下方水层并测定UV吸光度,从而测定水层中寡核苷酸的量。当寡核苷酸留在水层中,从上方水层部分中回收有机溶剂,向其中加入阳离子型相转移剂和有机溶剂,重复混合和分离过程。
如图2结果所示,由于使用了2当量或更多(基于使用的寡核苷酸)的阳离子型相转移剂,90%或更多寡核苷酸从水溶液中进入有机溶剂,两末端添加有脂质的样品显示相似结果。本实施例中,可以看出寡核苷酸在有机溶剂中分配系数(Pk)为约20。此外可以看出,通过控制所用相转移剂和有机溶剂的种类和比例,95%或更多的水溶液中的寡核苷酸可溶于有机溶剂。
[实施例2]溶于有机溶剂的寡核苷酸的回收
由于利用阳离子型相转移剂(+PTA)的亲脂特性将寡核苷酸溶于有机溶剂中以及碱基保护基团已稳定溶于有机溶剂,当使用与水混合或用氨水煮的方法时,其不会以任何显著量溶于水层。
因此,如果加入能够为阳离子型相转移剂(+PTA)提供反离子(counter ion)的阴离子型相转移剂(-PTA)从而使得这些反离子与阳离子型相转移剂(-PTA)结合以替代寡核苷酸,则寡核苷酸可用水萃取出来。
本实施例中,将实施例1中得到的溶于有机溶剂的各寡核苷酸(脂质-68mer和正常-68mer)稀释至OD值为每ml约30(其他实验中稀释成多种浓度)。将寡核苷酸的回收率表示为相对于最初添加量的百分比。作为阴离子型相转移剂(-PTA),使用溶于无菌水的浓度为0.5M的SDS(十二烷基硫酸钠,分子量:288.4),但也可用任何试剂作为阴离子型相转移剂,只要其可溶于有机溶剂并且可作为阳离子型相转移剂(+PTA)的反离子通过静电吸引与有机溶剂中的寡核苷酸连接。
本实施例中,使用了与实施例所用相同的包含溶解于其中的寡核苷酸的有机溶剂和阴离子型相转移剂(-PTA),并且回收了其中溶有寡核苷酸的水层。
表1 溶于汽油的寡核苷酸的回收
表2 溶于柴油的寡核苷酸的回收
从上表1和表2结果可以看出,通过测量添加的SDS量以及UV吸光度来确定水层中所回收寡核苷酸的量,其结果是,90%或更多的样品可通过向汽油中添加15当量的SDS以及向柴油中添加35当量的SDS而回收。
表3
从上表3结果可以看出,甚至在同时以最终当量比加入阴离子型相转移剂SDS时也可得到与表1和表2中所示相同的结果。
[实施例3]回收的寡核苷酸的分析
(1)定量分析:MALDI-TOF方法
检测了使用相转移剂将寡核苷酸溶于溶剂以及回收溶解的寡核苷酸过程中寡核苷酸的分子结构是否被改变。例如,使用其分子量可通过MALDI-TOF质量测定的短寡核苷酸(脂质-22mer)。
SEQ ID NO3:(脂质-22mer):
5′-C18-TAATACGACTCACTATAGGG-C12-3′(MW=6,722)
表4
寡核苷酸在有机溶剂中的溶解以及溶解的寡核苷酸的回收以与实施例1和实施例2相同的方式进行。从上表4的结果可以看出,寡核苷酸以为90%或更多的回收率被回收,同时处理过程中其分子结构得以保持而没有变化。
(2)定量分析:qPCR(定量聚合酶链式反应)方法
为了检验是否可以通过qPCR(定量聚合酶链式反应)分析在有机溶剂中溶解后回收的寡核苷酸,进行了以下实验。使用了长度为68mer的模板(实施例1和实施例2所制备),如下合成和使用对模板特异的引物和探针。
模板序列:
5′-C18-ATTCGGTGAATAAGCACTCTCATAGTCCTCATCCAACTGCGCGTCTTGCATAGAGCTGCTGACCCTAC-C12-3′
qPCR引物/探针Oligo:
-正向引物序列(SEQ ID NO4):5′-ATTCGGTGAATAAGCACTCTC-3′
-反向引物序列(SEQ ID NO5):5′-GTAGGGTCAGCAGCTCTATG-3′
-探针序列(SEQ ID NO6):5′-(FAM)-AGTCCTCATCCAACTGCGCGTCT-(Dabcyl)-3′
本实施例中所用探针的长度为23mer,并且用荧光染料FAM标记5末端,用荧光染料DABCYL标记3末端。用于本发明寡核苷酸标记(模板)以及样品1,2,3,4和5的实时定量核酸扩增使用AccuPower DualStarqPCR PreMix(Bioneer Co.,Ltd)和AccuPower Greenstar qPCR PreMix(Bioneer Co.,Ltd)进行。使用NANODROP2000/2000c(ThermoScientific Co.,Ltd.)对样品进行DNA定量,汽油(SK Energy Co.,Ltd.)用作待标记的油。
制备用于寡核苷酸标记样品1,2,3,4,5和模板的qPCR分析的样品。
(1)对于模板,将1ml模板稀释至1013拷贝/ml。
(2)对于样品1至5,将1ml模板稀释至1013-109拷贝/ml。
(3)切割模板和样品1至5,然后脱盐纯化。
(4)为每个样品准备1ml汽油。
(5)将含各模板的1ml蒸馏水和溶于其中的样品1至5((3)中制备)加入并溶于所准备的1ml汽油中。
(6)将1ml各模板和样品1至5的上清液((5)中分离)与1ml其中溶有SDS的Tamra cocktail混合,然后各混合物于90?去保护1小时,之后取800μl各上清液并干燥。
(7)将(6)中制备的各模板和样品1至5加入并溶于50μl蒸馏水。
(8)通过使用NANODROP2000/2000c(Thermo Scientific Co.,Ltd.)在260nm处测量吸光度将(7)中制备的模板定量。
(9)所制备样品的实时核酸扩增反应(qPCR)实验以如下方式进行。
从汽油中纯化的寡核苷酸标记模板稀释为下表5所示拷贝数,每个样品反应一式两份制备。
表5
从汽油中纯化的定量模板被制备为下表6所示拷贝数,每个样品反应一式两份制备。
表6
具有最终体积的实时核酸扩增反应按下表7制备。
表7
在下表8所示的反应条件下使用实时PCR仪ExcyclerTM(Bioneer Co.,Ltd)进行反应。
表8
将稀释为相应拷贝数的寡核苷酸标记模板样品1,2,3,4,5与汽油反应,之后将其回收和纯化。然后,用探针和引物对各经纯化模板样品1至5进行实时定量扩增反应,实时定量扩增反应荧光图如图7A所示,其中x轴表示反应循环(以下称为“Cy”),y轴表示根据反应循环测得的荧光。道1至5表示拷贝数分别为1×1012,1×1011,1×1010,1×109和1×108拷贝时实时定量扩增反应的结果。道0表示NTC(无模板对照)条件下的反应结果。
图7B是显示用图7A所示的荧光曲线(系列稀释条件)绘制的定量曲线线图,其中y轴表示所测荧光的log值,x轴表示反应循环。道1至5表示分别为1×1012,11×1011,1×1010,1×109和1×108拷贝时实时定量核酸扩增反应的定量曲线。图7B的定量曲线显示PCR扩增效率为91%,PCR线性度(R2值)为0.9994
图8A为一组荧光图,其显示使用探针和引物以及标准寡核苷酸(系列稀释至相应拷贝数)作为模板进行的实时定量扩增反应。图8A中,x轴表示反应循环(以下称为“Cy”),y轴表示根据反应循环所测的荧光值。道1至6分别表示每20μl反应中拷贝数为1×1011,1×1010,1×109,1×108,1×107和1×106时的实时定量扩增反应结果。
图8B是显示使用图8A所示的荧光曲线(系列稀释条件)绘制的定量曲线的线性图,其中y轴表示所测荧光值的log值,x轴表示反应循环数。道1至6分别表示每20μl反应拷贝数为1×1012,1×1011,1×1010,1×109和1×108时的实时定量核酸扩增反应的定量曲线。图8B的定量曲线显示PCR扩增效率为90%,以及PCR线性(R2值)为0.9999。
图9A为一组重叠的荧光图,其显示模板(蓝色)以及样品1(I)、2(II)、3(III)、4(IV)和5(V(红色)的实时定量核酸扩增反应的结果。图9A中,x轴表示反应循环(“Cy”),y轴表示根据反应循环所测的荧光值。道1至6分别表示每20μl反应中模板拷贝数为1×1011,1×1010,1×109,1×108,1×107和1×106时的实时定量扩增反应结果。道I,II,III,IV和V表示每20μl反应分别为1×1012,1×1011,1×1010,1×109和1×108拷贝时样品1至5(系列稀释至相应拷贝数)的实时定量扩增反应结果。如图9A所示,系列稀释的样品的纯化效率约比模板低100倍。而且,图9B的线性图表明系列稀释样品的结果与模板的结果一致。
使用从汽油中纯化的各寡核苷酸标记(稀释至相应拷贝数)以及标准寡核苷酸模板进行实时核酸扩增反应,从结果中可以看出,通过AccuPower DualStar qPCR PreMix实时核酸扩增反应纯化汽油中所含的寡核苷酸标记,以及从汽油中纯化的寡核苷酸标记(稀释至相应拷贝数)可扩增至每20μl反应1×108拷贝。
从以上结果,用AccuPower DualStar qPCR PreMix通过实时核酸扩增反应纯化的寡核苷酸标记模板(稀释至相应拷贝数)以及汽油中所含的寡核苷酸标记(模板)可被扩增至每20μl反应1×108拷贝的拷贝数。
[实施例4]用寡核苷酸标记的组合进行标记
(1)寡核苷酸标记鉴定信息
连接至寡核苷酸标记模板两端的用于PCR扩增的引物结合区域(qPCR引物)和产生荧光测量的探针区的基因序列可以多种方式不同,从而使得其可有利地作为引物(正向引物和反向引物)以及与特异寡核苷酸标记模板互补反应的探针。
具体而言,如果连接至寡核苷酸标记模板两端的引物区和用于荧光测定的探针区的序列被分成20种颜色,4个引物组(红,黄,绿和蓝)和5个探针(紫,蓝,绿,橘红和亮绿)的组合可以如图11所示呈现。其中,取5个相互组合,可产生约1500个鉴定编码,并可产生成千上万种条码。
例如,如图11所示,如果对应全红和全绿的两个模板被标记,可显示出四孔中从顶部至底部的第一孔红色和第三孔绿色。或者,如果显示第二孔紫色和蓝色以及第四孔绿色,可示出对应于黄色引物/紫色探针组合模板、黄色引物/蓝色探针模板组合和蓝色引物/绿色探针组合模板被标记。
如下构建总共有20个模板,对模板特异的4个引物组和5个探针:
模板序列:5′->3′方向
#1-1(SEQ ID NO7):C18间隔物-ACAGGTAGGTAAGGTTCATGGTACCC-GAACCAAGACGCATCTACCGGGGTCTGAATGACCAGAAGCACCT-C12间隔物
#1-2(SEQ ID NO8):C18间隔物-ACAGGTAGGTAAGGTTCATGGACGCTCC-TAGTGCCGACTCCTACGTCCTACTGAATGACCAGAAGCACCT-C12间隔物
#1-3(SEQ ID NO9):C18间隔物-ACAGGTAGGTAAGGTTCATGGATTCGCC-CTCGGATGCTGTCTCAGCGAGTCTGAATGACCAGAAGCACCT-C12间隔物
#1-4(SEQ ID NO10):C18间隔物-ACAGGTAGGTAAGGTTCATGGTCTGC-CACCCGTGAGCGAATCGTCAGTCACTGAATGACCAGAAGCACCT-C12间隔物
#1-5(SEQ ID NO11):C18间隔物-ACAGGTAGGTAAGGTTCATGGAGGTTAC-CGAGACACCTGTGCATCCGCTCCTGAATGACCAGAAGCACCT-C12间隔物
#2-1(SEQ ID NO12):C18间隔物-GACCACGTCGTTCAGAATAAGTACCC-GAACCAAGACGCATCTACCGGGGTGTAAGCAGGTTATGTTGCCG-C12间隔物
#2-2(SEQ ID NO13):C18间隔物-GACCACGTCGTTCAGAATAAGACGCTCC-TAGTGCCGACTCCTACGTCCTAGTAAGCAGGTTATGTTGCCG-C12间隔物
#2-3(SEQ ID NO14):C18间隔物-GACCACGTCGTTCAGAATAAGATTCGCC-CTCGGATGCTGTCTCAGCGAGTGTAAGCAGGTTATGTTGCCG-C12间隔物
#2-4(SEQ ID NO15):C18间隔物-GACCACGTCGTTCAGAATAAGTCTGC-CACCCGTGAGCGAATCGTCAGTCAGTAAGCAGGTTATGTTGCCG-C12间隔物
#2-5(SEQ ID NO16):C18间隔物-GACCACGTCGTTCAGAATAAGAGGTTAC-CGAGACACCTGTGCATCCGCTCGTAAGCAGGTTATGTTGCCG-C12间隔物
#3-1(SEQ ID NO17):C18间隔物-GACCGTTCTATTAAGGCAAGCTACCC-GAACCAAGACGCATCTACCGGGGTCTCTGCGATCTTCTGCTCTA-C12间隔物
#3-2(SEQ ID NO18):C18间隔物-GACCGTTCTATTAAGGCAAGCACGCTCC-TAGTGCCGACTCCTACGTCCTACTCTGCGATCTTCTGCTCTA-C12间隔物
#3-3(SEQ ID NO19):C18间隔物-GACCGTTCTATTAAGGCAAGCATTCGCC-CTCGGATGCTGTCTCAGCGAGTCTCTGCGATCTTCTGCTCTA-C12间隔物
#3-4(SEQ ID NO20):C18间隔物-GACCGTTCTATTAAGGCAAGCTCTGC-CACCCGTGAGCGAATCGTCAGTCACTCTGCGATCTTCTGCTCTA-C12间隔物
#3-5(SEQ ID NO21):C18间隔物-GACCGTTCTATTAAGGCAAGCAGGTTAC-CGAGACACCTGTGCATCCGCTCCTCTGCGATCTTCTGCTCTA-C12间隔物
#4-1(SEQ ID NO22):C18间隔物-CGTGTCATGTTGTACCTAAGCTACCC-GAACCAAGACGCATCTACCGGGGTCTTCAAGTCGAGATACGCCT-C12间隔物
#4-2(SEQ ID NO23):C18间隔物-CGTGTCATGTTGTACCTAAGCACGCTCC-TAGTGCCGACTCCTACGTCCTACTTCAAGTCGAGATACGCCT-C12间隔物
#4-3(SEQ ID NO24):C18间隔物-CGTGTCATGTTGTACCTAAGCATTCGCC-CTCGGATGCTGTCTCAGCGAGTCTTCAAGTCGAGATACGCCT-C12间隔物
#4-4(SEQ ID NO25):C18间隔物-CGTGTCATGTTGTACCTAAGCTCTGC-CACCCGTGAGCGAATCGTCAGTCACTTCAAGTCGAGATACGCCT-C12间隔物
#4-5(SEQ ID NO26):C18间隔物-CGTGTCATGTTGTACCTAAGCAGGTTAC-CGAGACACCTGTGCATCCGCTCCTTCAAGTCGAGATACGCCT-C12间隔物
引物序列:4组
-正向引物#1(SEQ ID NO27):5′-ACAGGTAGGTAAGGTTCATGG-3′
-反向引物#1(SEQ ID NO28):5′-AGGTGCTTCTGGTCATTCAG-3′
-正向引物#2(SEQ ID NO29):5′-GACCACGTCGTTCAGAATAAG-3′
-反向引物#2(SEQ ID NO30):5′-CGGCAACATAACCTGCTTAC-3′
-正向引物#3(SEQ ID NO31):5′-GACCGTTCTATTAAGGCAAGC-3′
-反向引物#3(SEQ ID NO32):5′-TAGAGCAGAAGATCGCAGAG-3′
-正向引物#4(SEQ ID NO33):5′-CGTGTCATGTTGTACCTAAGC-3′
-反向引物#4(SEQ ID NO34):5′-AGGCGTATCTCGACTTGAAG-3′
-探针序列:5
-探针#1(SEQ ID NO35):
5′-(FAM)-ACCCGAACCAAGACGCATCTACCG-(BHQ1)-3′
-探针#2(SEQ ID NO36):
5′-(TET)-CGCTCCTAGTGCCGACTCCTACG-(BHQ1)-3′
-探针#3(SEQ ID NO37):
5′-(Tamra)-TTCGCCCTCGGATGCTGTCTCA-(BHQ1)-3′
-探针#4(SEQ ID NO38):5′-(TexasRed)-TGCCACCCGTGAGCGAATCGT-(BHQ2)-3′
-探针#5(SEQ ID NO39):
5′-(Cy5)-ACCGAGACACCTGTGCATCCGC-(BHQ2)-3′
将引物组#1(SEQ ID NO:27/SEQ ID NO:28)和引物组#2(SEQID NO:29/SEQ ID NO:30)各引物引入包含探针#1(SEQ ID NO35)(FAM,绿色)和探针#5(SEQ ID NO:39)(Cy5标记,红色)的qPCR反应管。将20个模板添加至每个引物组,制备四个模板混合样品,之后使用模板样品进行qPCR反应。结果,如图12和14所示,NTC(无模板对照)条件没有PCR反应。另一方面,含各引物组#1和#2的反应中,可观察到CY5探针和FAM探针的多种反应。
无序列表文本
SEQ ID NO:1是本发明正常-68mer寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是本发明脂质-68mer寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是本发明脂质-22mer寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4为用于分析回收的本发明寡核苷酸的正向qPCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5为用于分析回收的本发明寡核苷酸的反向qPCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6为用于分析回收的本发明寡核苷酸的探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7为本发明特异寡核苷酸标记模板(#1-1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8为本发明特异寡核苷酸标记模板(#1-2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9为本发明特异寡核苷酸标记模板(#1-3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10为本发明特异寡核苷酸标记模板(#1-4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11为本发明特异寡核苷酸标记模板(#1-5)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12为本发明特异寡核苷酸标记模板(#2-1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13为本发明特异寡核苷酸标记模板(#2-2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14为本发明特异寡核苷酸标记模板(#2-3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15为本发明特异寡核苷酸标记模板(#2-4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16为本发明特异寡核苷酸标记模板(#2-5)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17为本发明特异寡核苷酸标记模板(#3-1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18为本发明特异寡核苷酸标记模板(#3-2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19为本发明特异寡核苷酸标记模板(#3-3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20为本发明特异寡核苷酸标记模板(#3-4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21为本发明特异寡核苷酸标记模板(#3-5)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22为本发明特异寡核苷酸标记模板(#4-1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23为本发明特异寡核苷酸标记模板(#4-2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24为本发明特异寡核苷酸标记模板(#4-3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25为本发明特异寡核苷酸标记模板(#4-4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26为本发明特异寡核苷酸标记模板(#4-5)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27为对本发明20个模板特异的正向PCR引物(#1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28为对本发明20个模板特异的反向PCR引物(#1)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29为对本发明20个模板特异的正向PCR引物(#2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30为对本发明20个模板特异的反向PCR引物(#2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31为对本发明20个模板特异的正向PCR引物(#3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32为对本发明20个模板特异的反向PCR引物(#3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33为对本发明20个模板特异的正向PCR引物(#4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34为对本发明20个模板特异的反向PCR引物(#4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35为对本发明20个模板特异的探针(#1)核苷酸序列。
SEQ ID NO:36为对本发明20个模板特异的探针(#2)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37为对本发明20个模板特异的探针(#3)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38为对本发明20个模板特异的探针(#4)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38为对本发明20个模板特异的探针(#5)的核苷酸序列。
Claims (15)
1.一种用于鉴定物质的寡核苷酸标记,所述寡核苷酸标记为连接有阳离子型相转移剂的寡核苷酸,并且包含用于实时聚合酶链式反应(PCR)的探针序列和连接于所述探针序列两端的引物序列。
2.根据权利要求1的寡核苷酸标记,其中所述寡核苷酸的末端被封闭剂封闭。
3.根据权利要求2的寡核苷酸标记,其中所述封闭剂不含化学物质或末端基团,其为脂质或磷酸酯/盐。
4.根据权利要求1的寡核苷酸标记,其中所述寡核苷酸包含与含有1至50个碳原子的有机化合物连接的反应性氮和氧部分。
5.根据权利要求1的寡核苷酸标记,其中所述寡核苷酸的长度为20至1000个核苷酸。
6.一种用于鉴定物质的方法,所述方法包括向物质中添加权利要求1所述的寡核苷酸标记。
7.根据权利要求6的方法,其中所述物质选自交通工具涂层的涂料、漆、交通线涂料、石油、涂料稀释剂、冲淡剂、爆炸物、天然油,建筑涂料、有机溶剂、粘合剂、染料、肉和鱼。
8.一种用于鉴定物质的方法,所述方法包括:
1)从标记有权利要求1所述寡核苷酸标记的物质中提取寡核苷酸;
2)用引物和探针通过实时PCR扩增提取的所述寡核苷酸;和
3)使用所述实时PCR的产物鉴定标记有所述寡核苷酸标记的所述物质。
9.根据权利要求8的方法,其中所述探针为荧光标记的探针。
10.根据权利要求8的方法,其中1)的所述提取使用阴离子型相转移剂进行。
11.根据权利要求8的方法,其中所述物质为脂溶性或水溶性物质。
12.根据权利要求11的方法,其中所述物质选自交通工具涂层的涂料、漆、交通线涂料、石油、涂料稀释剂、冲淡剂、爆炸物、天然油,建筑涂料、有机溶剂、粘合剂、染料、肉和鱼。
13.根据权利要求8至12中任一项的方法,其中所述鉴定这样进行:通过包含于所述物质中的具有不同序列的所述寡核苷酸标记的组合来鉴定所述物质。
14.一种用于鉴定物质的组合物,所述组合物包含权利要求1所述的寡核苷酸标记。
15.根据权利要求14的组合物,其还包含对应于所述寡核苷酸标记的引物和探针。
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