CN1784590B - 可光学解码的微载体,阵列和方法 - Google Patents

Abstract

适用于分布式的阵列的微载体的编码方案，包括用淬灭的信号传导发夹分子标记所述载体，所述分子具有三至八个可区别的荧光团中的任意一个，其中，所述发夹具有至少两种类型，最优选的三种类型，它在化学或物理条件发生改变时，例如在温度改变时打开并且发出不同的荧光。具有固定化的捕获探针的微载体的混合物可以通过以下方法解码：在只有一种类型的发夹打开的条件下，在两种类型的发夹打开的条件下等测量由所述荧光团发出的荧光。将具有捕获探针的编码的微载体的混合物用于通过微阵列方法分析核酸。

Description

可光学解码的微载体，阵列和方法

                      技术领域

本发明涉及编码和解码微载体，特别是具有固定化的杂交探针的微珠的混合物，以及所述微载体的阵列，特别是分布式的阵列。

                        背景

用于检测和鉴定生物学和化学物质的阵列的用途是公知的。一种例子是固定的核酸杂交阵列，它含有多种不同的杂交探针固定在平面固体表面上，例如，硅芯片或玻璃载玻片的分开的已知位置上。在所述阵列的每一个位置上，固定了很多拷贝的相同的杂交探针。平面阵列可以包括数百或者甚至数千个不同的区域，各自具有固定化的杂交探针。在将包含核酸的分析物添加到所述阵列上时，不同的核酸序列能够与不同位置上的探针杂交。在特定位置上的杂交的检测，表明了在被分析的样品中与固定在所述位置上的探针序列互补的核酸序列的存在。一般，这种类型的阵列是通过两种方式制备的：或者探针是原位合成的，例如通过光刻法，或者探针是预先合成然后再固定化的。杂交的检测是通过若干种方法中的任意一种完成的，包括在杂交步骤之前将检测标记附着在分析物上，添加嵌入染料，它在与双链核酸接触时能够发出荧光，向分析物中添加颜色生成部分，以便用于随后的颜色形成步骤，或者进行夹心杂交，其中，所述靶与所述阵列上的捕获探针结合，并且，标记的检测探针与结合的靶杂交。业已发现，表面微阵列会发生显著的变化。Lee，M.-L.T.等(2000)，Importanceof Replication in Microarray Gene Expression Studies：Statistical Methods and Evidence from Repetitive cDNAHybridizations，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：9834-9839。

另一种类型的阵列使用微载体，例如，微珠，在它们的表面上具有固定化的捕获物质，如核酸的杂交探针。每一个珠是用一种或另一种杂交探针涂敷的，而分析物与含有至少一个珠的混合物接触，混合物通常包括多个珠，含有每一种探针序列。所述珠可以被分析物调成浆，这克服了平面阵列所遇到的某些变异，然后将微珠排列成平面阵列。作为选择，所述微珠可以在与分析物接触之前排列成平面阵列。微珠可以与分析物接触，洗涤，并且以平面阵列形式安放到显微镜载玻片上。所述平面阵列还可以是一对间隔很小的透明板，它们将微珠限制成单层，并且是分析物和洗涤溶液流过的流动池的一部分。Brenner，S.等(2000)，Gene Expression Analysis by MassivelyParallel Signature Sequencing(MPSS)on Microbeads Arrays，Nat.Biotechnol.18：630-634。微珠还可以安放到在单独股的光导纤维电缆束的末端蚀刻的凹陷中，所述电缆束包括许多股。Ferguson，J.A.等(1996)，A Fiber-Optic DNA BiosensorMicroarray for the Analysis of Gene Expression，Nat.Biotechnol.14：1681-1684。在这种分布式的阵列上，其中，位置不会鉴定存在哪一种探针，因此需要编码方案，以便可以鉴定包括特定探针的珠。除了将珠排列成平面阵列之外，还可将流式细胞术用于了解单个珠，例如，使用荧光激活细胞分选仪。在这里，同样需要编码方案。

用不同颜色的荧光团简单地标记珠，不会提供足够的编码，因为只有少于10种，实际上仅有7种或8种不同的荧光团可以区分。业已设计了若干种复杂的珠编码方法。一种编码方案业已将荧光团的组合埋入所述珠中。颜色和强度的组合构成了编码。Spiro，A.等(2000)，A Bead-Based Method for Multiplexed Identificationand Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry，Appl.Environ.Microbiol.66：4258-4265。激光在不同波长的多种刺激和读数能探询每一种珠以读出它的编码。这种方案需要重大设备，不能够实时解卷积光谱，并且一直局限于大约100种不同编码的珠。另一种编码方案是将不同金属的小条埋入微载体中，并且读出在每一个微载体上的金属图案。该方案涉及复杂的微载体生产。另一种方案是将小型发射应答器包埋在每一个微载体中，它可以通过光电池提供能量，并且发送用于鉴定的五十个数字的二进制代码。所述微载体可以通过一个操作台流动，以便检测杂交，并且用一个独立的操作台解码所述微载体。这种发射应答器方案的缺陷是，微载体不是真正的球体，并且荧光在通过检测操作台时在某种程度上是珠方向的函数。

业已将固定化的寡核苷酸用于编码目的。一种这样的系统将十六种不同的寡核苷酸用于编码。编码是通过事先确定十六种类型的编码寡核苷酸的每一种是或者不是要固定在特定类型的珠表面上的编码寡核苷酸的特定类型实现的。由于要作出十六种选择，所以对每一种编码寡核苷酸而言，不同编码的数目(以及不同类型珠的数目)是216，其结果是65,536。混合物中的珠首先固定在光导纤维束的光导纤维股的末端。所述光导纤维股的远端以固定方式附着在探测器上。通过与标记探针的一系列十六种不同的杂交反应，探询了每一个珠，并且确定与它的光导纤维股结合的每一个珠的性质。然后，所述光导纤维束可以与分析物接触。Oliphant等(2002)，BeadAwayTMTechnology：Enabling an Accurate，Cost-Effective Approach toHigh-Throughput Genotyping，BioTechniques 32：S56-S61。依赖一系列杂交的方案是复杂的，繁琐的和昂贵的。

本发明的一个方面是珠编码方案，它组合了可检测的荧光标记与物理诱导的荧光改变，以便允许对数百种，甚至是数千种不同的珠进行编码和光学解码。

本发明的另一方面是杂交阵列方法和试剂，尤其包括使用这种组合编码方案的分布式的阵列方法和试剂。

                        概述

本发明提供了珠编码方案，通过这种方法可以对数百种，以及如果需要的话，对数千种和数万种不同编码的珠进行简单地和方便地标记，并且可以快速而且精确地解码。所述编码试剂包括固定在珠表面上的信号传导发夹。信号传导发夹是广泛的分子，它是用一对标记部分标记过的，它能依赖于它们是否相互作用而改变光学信号的强度，优选荧光团位于一端，而淬灭剂位于另一端从而形成了发夹结构，其中，荧光是淬灭的。所述分子能够发生构象重排，以便使所述荧光团和淬灭剂分离，其中，在这种情况下，荧光团的荧光不会淬灭。一种类型的合适分子类似于分子信标探针，它描述于，例如，Tyagi等的美国专利号5,925,517中，该文献被以全文形式收作本文参考。可以通过荧光共振能量转移(FRET)淬灭，正如在所述专利中所公开的，或者通过物理相互作用淬灭，正如在Tyagi等的美国专利号6,150,097中所公开的，该专利被以全文形式收作本文参考。Dabcyl是淬灭剂的一种例子，它能够通过物理相互作用淬灭。可通过商业渠道获得的“黑洞(Black Hole)淬灭剂”是另一种例子。

在美国专利号5,925,517中公开的发夹探针包括单链寡核苷酸环，其侧翼是一对“亲和力对”部分，它们相互作用，并且形成发夹结构。一种类型的亲和力对是寡核苷酸序列，它们能彼此杂交，以便形成双链茎。其中所公开的其他亲和力对包括蛋白-配体，抗体-抗原，蛋白亚基，以及核酸结合蛋白-结合位点。某些淬灭剂本身能够与荧光团形成亲和力对。亲和力对的形成或破坏改变了探针的构象及其荧光强度，改变了来自另一种类型的标记对的光学信号，或改变了由至少临时定位的反应产生的信号，如颜色形成，正如在美国专利号5,925,517中所公开的。除了发射之外还可以测量吸收。所述探针的一般例子是“分子信标探针”，即一种寡核苷酸，其具有互补于预期靶的中央单链区(“环”)，其侧翼是能彼此杂交的互补序列(“臂”)，从而形成了发夹构象，其中在一个臂上的淬灭剂能淬灭在另一个臂上的荧光团的荧光。所述环与它的靶的杂交克服了茎杂交体，并且使荧光团与淬灭剂分离，从而显著减弱它们的相互作用，并且产生荧光。不过，正如在美国专利号5,925,517中所公开的，通过对所述探针加热使茎杂交体变性，分子信标探针还可以从它的闭合的发夹构象改变成开放的无规线团构象。

用于本发明的信号传导发夹具有与分子信标探针的相似性。它是具有中央单链环的分子，它由于侧翼亲和力对的相互作用而呈现发夹结构，它们的相互作用可以通过在其环境中的可控制的物理或化学变化而破坏。所述分子的环状部分起着分离亲和力对的接头的作用。它不需，并且在优选实施方案中不会起探针作用。所述中间连接部分可以是核酸序列，碳链，或能够打开和闭合成环的任何其他分子结构。所述亲和力对是一对相互作用部分，它们能够导致该分子在使用期间的预定杂交测定条件下呈现发夹结构，不过，它们的相互作用可以通过其环境中的物理或化学变化而破坏。例如，当所述亲和力对包括构成茎杂交体的互补臂时，所述茎杂交体可以通过提高温度，降低盐浓度，或添加变性试剂，例如，甲酰胺而破坏。所述发夹包括与所述亲和力对的一个成员结合的至少一个荧光团和与所述亲和力对的其他成员结合的至少一种淬灭剂，以便所述亲和力对的相互作用的破坏，导致所述信号传导发夹在受到刺激时发出荧光。正如早先所指出的，在某些场合下，荧光团-淬灭剂对可以同时起着亲和力对的作用。

本发明的编码方案涉及多种信号传导发夹的使用，它们的亲和力对是在不同条件下破坏的。例如，优选的信号传导发夹具有互补性寡核苷酸臂，可以方便地对所述寡核苷酸臂进行构建，以便在需要的温度下解链。可以构建一系列的三种或更多种这样的分子，以便在三种不同的温度下解链，例如，50℃，60℃和70℃。例如，如果使用40℃的杂交测定温度的话，那么所有三种信号传导发夹都会由于它们的亲和力对而闭合，并且都将是淬灭的。但是如果逐渐提高温度的话，首先有一种发夹会打开(50℃)，然后第二种打开(60℃)，最后第三种打开(70℃)。荧光会随着温度而改变。在化学环境逐渐改变时，在恒定的温度下也可以发生相同的作用，即荧光强度发生可识别的改变，例如，诸如甲酰胺的变性剂的浓度的提高，或诸如硫氰酸胍的盐的浓度的降低。在优选实施方案中，物理或化学变化的作用是可逆的，并且，所述发夹可以重复使用。

本发明的编码方案还涉及多种荧光团的使用。现有的检测设备能够将复杂的光谱解卷积成两种至八种不同颜色的荧光团的光谱成分，在某些情况下，甚至解卷积成更多种荧光团，例如九种或十种不同颜色的荧光团。

本发明的编码方案涉及将选择的不同的信号传导发夹固定在微珠上，它们组合起来能够独特地鉴别每一种珠类型。例如，如果一种开始于它们环境中的物理或化学变化可以识别的三个发夹结构，而一种开始于五种不同颜色的荧光团的话，就可以合成十五种不同的信号传导发夹(将五种不同颜色的信号传导分子用于三种物理或化学上可区分的发夹中的每一种)。编码是通过预先确定对于十五种类型的信号传导发夹中的每一种来说，特定类型的信号传导发夹是否会固定在特定类型的珠表面上来实现。由于要做出十五种选择，每一种选择用于每一种信号传导发夹，所以不同编码的数目(以及不同类型珠的数目)为215，即32,768。如果随后在每一种类型的珠上固定一种独特杂交探针，则将具有最多达32,768种编码的杂交探针。

应当理解的是，本发明的编码珠是简单的和直观的。依赖于预期阵列的大小，只需要构建两种或三种不同的发夹分子，尽管可以使用更多数目，例如四种或五种。寡核苷酸分子可以是合成的，在一端具有淬灭剂，并且在另一端具有官能化核苷酸。Glen Research(Sterling，Virginia，美国)出售用于寡核苷酸合成仪上的支持物(柱)，它业已包含了诸如dabcyl的淬灭剂。为了完成所述标记，只需要保持若干荧光团的母液。荧光团的添加和信号传导发夹的固定化可以通过众所周知的方法在合适的微珠上进行，如玻璃或聚苯乙烯微珠。为了将信号传导发夹连接在微珠的表面上，可以将荧光团或淬灭剂放置在信号传导发夹内的内在位置上。可以将诸如伯胺基，巯基，或生物素基的官能团共价连接在信号传导发夹的可利用的末端上。Tyagi S.等(2000)，Wavelength-Shifting Molecular Beacons，Nat.Biotechnol.18：1191-1196。然后可以将所述官能团用于将信号传导发夹连接在微珠的表面上，对所述微珠进行修饰，以便包括琥珀酰亚胺(succinimydal)酯基团、马来酰胺基团或链霉抗生物素蛋白分子。简单温育所述官能化的信号传导发夹与在其表面上包括合适连接基团的微珠，能够将所述信号传导发夹连接在所述微珠的表面上。形成发夹的寡核苷酸的设计可以通过分子信标探针的已知方法完成。其他发夹分子的设计和其他亲和力对的附着属于本领域的公知技术。杂交探针的生产和固定化为本领域所熟知。

本发明的编码的杂交微珠可用于已知的测定方法和系统中。一种优选的实施方案涉及将包括未标记过的杂交探针的编码的微珠在分析物溶液中调成浆，所述探针有时称为捕获探针，在分析物溶液中，对核酸靶分子，例如DNA或cDNA或mRNA进行标记，以便在光学上是可以检测的。我们优选荧光标记。分析物分子的标记不一定是不同的：单一标记，优选来自任何编码标记的不同标记就足够了。我们的最优选的实施方案是将荧光团/淬灭剂-标记的分子信标探针用作杂交探针，分子信标探针在与它们的靶杂交时打开，并且成为非淬灭的。固定在微珠表面上的分子信标探针可以是分子信标，各自用相同的荧光团标记。本发明不局限于任何特定的检测一些分析物分子或靶是否与珠杂交的方法。用于识别靶杂交的任何其他合适的光学检测系统和方法都可以使用，例如，改进的夹心测定方法，正如Spiro等所公开的。同样，随后可以进行探针-靶杂交体的物理或酶促修饰，例如，单个荧光标记的核苷酸在探针3′末端的酶促添加，以便识别单核苷酸多态性在捕获的靶链上的存在。Chen J.等(2000)，AMicrosphere-Based Assay for Multiplexed Single NucleotidePolymorphism Analysis Using Single Base Chain Extension，Genome Research 10：549：557。在杂交完成之后，所述珠可以安放在显微镜载玻片或其他合适的表面上，用合适波长的光线刺激，并且采用已知的和现有的能够进行模式识别的落射荧光显微镜设备“阅读”。这样可以识别哪些珠业已发现了靶。本发明的解码可以根据它们生产的知识识别上述珠是哪些珠，以及它们包括哪些杂交序列。例如，如果所述信号传导发夹被构建成在58，72和82℃下解链，并且分析物的杂交是在50℃进行的话，那么载玻片的温度能够以适合使用仪器的速度提高到88℃，如每分钟提高几度，并且可以获得每一个珠的实时荧光曲线。计算机程序能够将来自每一个微珠的数据快速解卷积成在每一种温度间隔下由每一个荧光团产生的荧光，并且计算机程序能够迅速计算出关于每一个荧光团的温度(T)的变化的荧光强度(I)的变化速度，以便用于标记信号发夹的每一种不同颜色的荧光团的dI/dT对T的图上的峰值表明了在视野中每一个微珠上存在哪种信号传导发夹，从而鉴定每一种珠，并因此鉴定被检测的分析物中的每一种杂交序列。可变温度加热装置对实验室设备来说是众所周知的。例如，标准热循环仪的加热模块可方便地调整，以便用于落射荧光显微镜的镜台上。

使用本发明的编码珠混合物的杂交测定的另一种优选实施方案是Brenner等的方法，所述方法在流动池中组装分布式的平面阵列的微珠，在与分析物混合之前或之后进行。所述组装阵列中的珠可首先对杂交进行读出，然后进行解码。例如，可以按上文所述逐渐提高温度。另外，可以让溶液梯度流过所述池，例如，含有浓度逐渐提高的诸如甲酰胺或尿素的变性剂，或浓度逐渐降低的诸如硫氰酸胍或三氟乙酸钠的盐的溶液会导致较短的茎杂交体首先打开，最长的，或更确切地讲最牢固的茎杂交体最后打开，同样提供了可以通过现有设备分辨的荧光模式。可以检测分析物与特定珠杂交，并且珠可以被阐明并且解码的任何测定都适用于本发明。

在附图和以下说明中提供了本发明的一种或多种实施方案的细节。通过说明书和附图以及权利要求书可以使本发明的其他特征，目的和优点显而易见。

附图描述

图1是用于本发明的固定在珠表面上的信号传导发夹分子的实施方案的程式化示意图。

图2A-2C表示用于本发明的信号传导发夹分子的实施方案的解链行为。图2A是信号发夹的解链曲线，图2B是解链曲线的一阶导数，而图2C是解链曲线的二阶导数。

图3是表示业已制备和检测过的多种信号传导发夹寡核苷酸分子的序列，标记和解链温度的图表。

图4是表示当三种信号传导发夹分子的混合物(它们各自用相同的荧光团标记，并且各自具有不同的解链温度)被逐渐加热通过它们的三种解链温度时获得的荧光曲线的一阶导数。

图5表示用六种不同的信号传导发夹的混合物获得的结果(其中的两种是用Alexa 546标记的，两种是用四氯荧光素[TET]标记的，而另外两种是用四甲基罗丹明[TAMRA]标记的)。在每一种温度下获得的复杂的光谱被解卷积成由三种荧光团中的每一种的荧光产生的光谱，并且，将每一个荧光团的荧光强度的一阶导数作为温度的函数相对于温度作图。由在特定温度下特定颜色的荧光峰值的增加表示所述混合物中六种不同信号传导发夹的每一种的存在。

图6A-6C比较了三种不同的信号传导发夹对提高温度(图6A)，提高甲酰胺浓度(图6B)，和降低硫氰酸胍浓度(图6C)产生的应答。

                     详细描述

图1描述本发明的固定化的信号传导发夹101的实施方案。发夹分子101包括中间连接部分104，其侧翼是亲和力对105，106，它表示为互补的寡核苷酸序列。中间连接部分也可以是寡核苷酸，不过，如上文所述，不一定如此。如果连接部分104是寡核苷酸序列的话，我们优选发夹101在预期的杂交测定中不发挥杂交探针的作用。寡核苷酸臂105，106可以是DNA，RNA或它们的组合。臂105，106可以包括非天然核苷酸，修饰核苷酸和修饰过的核苷酸间连接。如果中间连接部分104是寡核苷酸序列的话，同样的情况适用于所述部分。尽管我们优选互补的寡核苷酸臂作为亲和力对，但在测定条件下通过可逆转的彼此的结合进行相互作用，并且它们的相互作用可以通过其环境中物理或化学改变来破坏的任何部分的配对都可用于本发明的信号传导发夹。与亲和力对成员105连接的是淬灭剂部分107。与亲和力对成员106连接的是荧光团108。部分107，108是这样定位和附着的，以便当发夹101处在所示的位置时，来自荧光团108的荧光是高度淬灭的，并且亲和力对105，106的破坏使荧光团108与淬灭剂107充分分离，使荧光的淬灭程度降低很多。可以包括多个淬灭剂部分，正如可以包括多个荧光团部分一样，所述荧光团包括通过FRET相互作用的一对荧光团。荧光团108和淬灭剂107可以是任何成对的化学部分，其能够依赖于所述亲和力对是否相互结合而改变它们所产生的可检测的信号强度。正如前面所指出的，在某些实施方案中，部分107，108可以构成所述亲和力对的至少一部分。

在我们的最优选的实施方案中，所述亲和力对和连接部分是寡核苷酸，它们可以方便地合成，例如，使用寡核苷酸合成仪。根据分子信标探针的设计，所述结构的设计是众所周知的。参见，例如，美国专利号5,925,517；美国专利号6,150,097；Tyagi，S.和Kramer，F.R.(1996)，Molecular beacons：Probes that Fluoresce uponHybridization，Nat.Biotechnol.14：303-308；Tyagi等(1998)，Multicolor Molecular beacons for Allele Discrimination，Nat.Biotechnol.16：49-53；Marras等(2002)，Efficiencies ofFluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-MediatedQuenching in Oligonucleotide Probes，Nucleic Acids Res.30：e122；Bonnet，G.等(1999)，Thermodynamic Basis of the EnhancedSpecificity of Structured DNA Probes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：6171-6176。上述每一份参考文献都以它们的全文形式收作本文参考。

如图1所示，通过接头102将发夹101固定在固体表面103上，例如，玻璃或聚苯乙烯微珠的表面，将分子，包括核酸分子共价附着在固体表面上的方法是公知的。Adessi，C.等(2003)，Solid PhaseDNA Amplification：Characterization of Primer Attachment andAmplification Mechanisms，Nucleic Acids Res.28：e87；Call，D.R.等(2001)，Fabrication of DNA Microarrays Using UnmodifiedOligonucleotide Probes，BioTechniques 30：368-379；Guo，Z.等(1994)，Direct Fluorescence Analysis of GeneticPolymor phisms by Hybridization with Oligonucleotide Arrays onGlass Supports，Nucleic Acids Res.22：5456-5465。具体公开发夹结构的附着，即分子信标探针的文献包括：Brown L.J.等(2000)，Molecular Beacons Attached to Glass Beads Fluoresceupon Hybridization to Target DNA，Chem.Comm.2000：621-622；Liu，X.和Tan，W.(1999)，A Fiber-Optic Evanescent Wave DNABiosensor Based on Novel Molecular Beacons，Anal.Chem.71：5054-5059；Liu，X.等(2000)，Molecular Beacons for DNABiosensors With Micrometer to Submicrometer Dimensions，Anal.Biochem.283：56063；Steemers，F.J.等(2000)，ScreeningUnlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic GeneArrays，Nat.Biotechnol.18：91-94，其中的每一份文献都被以它们的全文形式收作本文参考。

固体表面103可以是任何合适的微载体的表面。我们的优选实施方案采用了微珠，它可以具有任何合适的材料，例如，玻璃或有机聚合物，如聚苯乙烯。依赖于如何读取所述微珠，它的光学特性，例如透明性可能需要适合系统的要求。

图2A-2C表示具有作为亲和力对的互补臂的寡核苷酸信号传导发夹的解链行为，所述臂是用荧光团和淬灭剂标记过的。图2A表示作为温度函数的荧光强度。所述信号传导发夹是德克萨斯红-标记的TM72。图2B表示图2A的曲线的一阶导数，而图2C表示二阶导数。所述一阶导数在解链温度上产生了陡峰，而二阶导数产生了位于所述解链温度旁侧的正的和负的峰值，所述解链温度是迹线通过零的地方。我们发现了一阶导数最适用于解码。

我们业已设计了多种具有不同解链温度的信号传导发夹，以便在本发明中用于编码。图3鉴定了若干种这样的发夹，提供了它们的序列(互补臂用粗体表示)，以及在可能的测定条件下测定的解链温度：50μl的1×PCR缓冲液(Applied Biosystems)+4mM MgCl₂。解链曲线是通过每30秒降低1℃的速度使温度从95℃降低到23℃测定的。收集每一度的数据。所述发夹都是用荧光团和淬灭剂进行末端标记的，如图1所示。作为淬灭剂，我们通常使用dabcyl，尽管我们还采用了黑洞淬灭剂No.2(用于发夹TM60.B和TM86.C)。如图3所示，偶联在具有变化长度的臂上的9-12个核苷酸长的接头(环)的设计提供了跨越40℃的解链温度范围。

本发明的编码方法采用了具有至少两种，并且对于更大的阵列来说具有三种或更多种，例如四种或五种的不同的发夹的信号传导发夹，随着在解码过程中物理或化学条件的改变，所述发夹能够被彼此区分。如上文所述，物理或化学可区分的发夹的编码方案加上五种荧光团，对于32,256种不同微载体的阵列来说就足够了。图4表示如何随着温度的改变方便地区分三种相同的标记过的发夹。这三种信号传导发夹是TM47，TM72和TM90，它们都是用四氯荧光素标记的。作为温度函数的荧光强度的一阶导数表现出三个独特的峰，这是因为第一个发夹在大约50℃打开，第二个发夹在大约67℃打开，而第三个发夹在大约84℃打开。使用Applied Biosystems 7700 Prism分光荧光热循环仪测量荧光。正如可以理解的，不需要作为温度函数的连续读数。一个读数，例如在40℃的读数，加上在高于每一种解链温度5℃的三种读数就可以显示在每一个发夹开启时的荧光强度跃变。

温度是一种物理或化学环境改变的例子，可将它用于区分发夹-编码的微载体。其他例子包括添加各种浓度的甲酰胺，和添加各种浓度的硫氰酸胍盐。在图6A-6C中提供了这三种例子的比较。图6A提供了三种发夹的解链曲线：TM60，TM72和TM85，它们都是用四氯荧光素标记的。正如可以看出，这三种信号传导发夹在彼此相差大约10℃的三个温度下解链(在存在4mM MgCl₂，50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.0的条件下)。使用此时可以获得的设备，我们不能够区分具有接近的解链温度的发夹，但是我们能够可靠地区分具有相差大约10℃或更多的发夹，并且我们采用所述发夹的混合物。

图6B表示相同的三种信号传导发夹在具有用量逐渐加大的甲酰胺时，在49℃的恒定温度下的荧光强度曲线(在存在1mM MgCl₂，25mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.0的条件下)。即使没有对甲酰胺差异进行最优化，也可获得甲酰胺破坏亲和力对的三种不同的和可区分的曲线。图6C表示在具有用量逐渐减少的硫氰酸胍时，在73℃的恒定温度下的相同的三种信号传导发夹的荧光强度曲线(在存在10mM Tris-HCl，pH8.0的条件下)。在这种情况下，用荧光强度对盐浓度的对数作图。同样，即使没对硫氰酸胍的差异进行最优化，也可获得三种不同的和可区分的曲线。图6B和6C证实了环境的化学组成的改变，可用于区分多种(在这种具体实施方案中为三种)信号传导发夹类型。上述结果提供了读出并且解码微载体的分布式的阵列的非常有意义的可能性。影响核酸双螺旋，如通过互补臂杂交形成的发夹茎的稳定性的环境条件是众所周知的。例如，参见Turner，D.H.(1999)Conformational Changes，appearing as Chapter 8 ofBloomfield，V.A.等，NUCLEIC ACIDS：STRUCTURE，PROPERTIES，AND FUNCTIONS，University Science Books(Sausalito，California，美国)，该文献讨论了改变诸如钠和镁的盐离子浓度的作用，改变诸如乙醇和甲酰胺的助溶剂的作用；改变诸如尿素和离液剂的其他变性剂的浓度的作用；和改变温度和pH的作用。还可参见Freifelder，D.(1982)，PHYSICAL BIOCHEMISTRY，Second Edition，W.H.Freeman and Company(New York，New York，美国)，第19-29页。本领域技术人员可以理解的是，其他亲和力对同样会经受环境改变，例如，抗体和其他蛋白的变性剂。可以使用永久性改变，不过，这不是优选的，因为珠随后不能再次使用。

本发明包括编码微载体，如微珠的方案或方法，编码的微载体的混合物，以及采用所述混合物的阵列和阵列方法。如上文所述，利用仅有三种淬灭剂-标记的寡核苷酸和五种不同的荧光团的母液，人们可以制备十五种不同的信号传导发夹，它们能够以2¹⁵种不同的组合固定在微珠上。使用有限数量的荧光团和有限数量的条件，例如四种荧光团和两种条件，有256种可能的编码。

尽管在我们的优选实施方案中，每一种不同的信号传导发夹只是由颜色和物理特性编码的，但颜色强度可以与颜色性质组合应用在本发明的编码方案中。例如，强度比为2∶1的红色和黄色的组合可以与强度比例为2∶2或1∶2的红色和黄色的组合加以区分，正如本领域所公知的。

图5表示在我们的实验室中Applied Biosystems 7700的解卷积能力。这种仪器能够将包括多达七种不同颜色荧光团的复杂的光谱解卷积成由于每一种不同颜色的荧光团的存在而产生的光谱。在图5所示的例子中，所述仪器将来自六种信号传导发夹的混合物的光谱解卷积成每一种荧光团的曲线，其中的两种是用Alexa 546标记的，两种是用四氯荧光素[TET]标记的，另外两种是用四甲基罗丹明[TAMRA]标记的，从而示出了用相同荧光团标记的两种信号传导发夹的每一种的峰值。正如可以认识的是，更简单的系统是可能的。例如，可以将发光二极管或滤光轮用于刺激，并且将滤光轮用于检测。

根据本发明的测定可以包括以下步骤：让含有或怀疑含有核酸分子或其片段的分析物溶液与按照本发明编码的微载体的混合物接触，确定哪一种微载体能够与分析物分子或靶杂交，并且解码所述微载体。测定可以包括将微载体，优选微珠安放在平面上，例如显微镜载玻片上，作为分布式的阵列，这在测定多少分析物(如果有的话)业已与每一种微载体杂交之前，并且在解码所述微载体之前进行。测定可以包括将微珠的分布式的阵列的位置固定在流动池中的两个平面之间，这在固定所述阵列之后以及在固定所述阵列之前适合分析物杂交，并且它还适合涉及化学环境改变的解码，如以逐渐减少的用量添加硫氰酸胍，作为梯度或以递减的量进行。本发明的测定还可以包括在与分析物溶液接触之前或之后，将编码的微珠混合物捕获在光导纤维束的纤维末端，并且测定哪些纤维具有杂交的靶。由于本发明的解码阵列是如此快捷和方便，所以所述微珠阵列没有必要永久性固定在所述纤维末端，并且在固定之后可以进行解码。本发明的测定可以包括让编码微珠的混合物与分析物溶液接触，然后让珠顺序通过流式细胞术系统，在这里对每一个珠的杂交进行读数，并且还进行解码。具有流动池系统和流式细胞术系统的特征的另一种选择是将微珠的位置固定成线性阵列，如固定在毛细管中，溶液可以从该毛细管中通过，所述溶液例如，用于解码的变性剂。采用微珠或其他微载体的分布式的阵列测定方法可用于根据本发明编码的微珠的混合物。优选方法包括在固定之前将编码的微珠用分析物溶液调成浆，以便利用液相杂交动力学的优点。Chen，J.等(2000)。优选方法还包括使用多拷贝，例如多达20-30个拷贝的每一种微珠，以便获得平均化结果。Danowski，K.L.和Pantano，P.(2001)，Evaluating the ChemicalSpatial Resolution of Imaging Fiber Chemical Sensors，Microchem.J.70：51-61。

可以获得用于对可解码的分布式的微阵列进行测定的各种类型的仪器和软件。除了业已引用的文献之外，参见Albert，K.J.等(2002)，Automatic Decoding of Sensor Types within RandomlyOrdered，High-Density Optical Sensor Arrays，Anal.Bioanal.Chem.373：792-802；Kellar，K.L.和Iannone，M.A.(2002)，Multiplexed Microsphere-Based Flow Cytometric Assays，Exp.Hematol 30：1227-1237；Tsagkatakis，I.等(2001)，Spatial andSpectral Imaging of Single Micrometer-Sized Solvent CastFluorescent Plasticized Poly(vinylchloride)SensingParticles，Anal.Chem.73：315-320；Walt，D.R.(2000)，Bead-Based Fiber-Optic Arrays，Science 287：451-452；和Yang，L.等(2001)，BADGE，Beads Arrays for the Detection of GeneExpression，a High Throughput Diagnostic Bioassay，GenomeResearch 11：1888-1898。为了利用温度改变采用显微镜术进行解码，需要编程的或可编程的可变温度显微镜镜台。各种类型的可变温度样品支架是众所周知的，并且这种显微镜镜台的构建是本领域的公知技术。

业已描述了本发明的多种实施方案。不过，可以理解的是，在不背离本发明构思和范围的前提下可以作出各种修改。

Claims (16)

1.一种编码的微载体，它具有荧光编码，所述荧光编码包括在微载体的表面上固定化的多个淬灭的，标记的信号传导发夹分子，每一个所述信号传导发夹分子包含通过连接部分分离的相互作用的亲和力对，所述亲和力对中的一个成员在它上面结合了至少一个荧光团，而所述亲和力对中的另一个成员在它上面结合了至少一种淬灭剂，其中，每一个发夹分子的亲和力对的相互作用可以通过它的环境的物理或化学变化破坏，其中，至少一个亲和力对的相互作用的破坏是在所述条件的第一种水平上发生的，而至少另一个亲和力对的相互作用的破坏是在所述条件的第二种水平上发生的，并且，其中，所述破坏是可以光学区分的。

2.如权利要求1的微载体，其中，所述亲和力对包括互补核苷酸序列。

3.如权利要求2的微载体，其中，所述连接部分是寡核苷酸序列。

4.一种混合物，所述混合物是多种适用于分布式微阵列的微载体的混合物，所述微载体是如权利要求1的编码的微载体，其中，每一种微载体在它上面各自固定有捕获探针，并且，其中，用于鉴定所述混合物中每一种微载体的编码方案包括来自三至八种光谱可解卷积的荧光团和至少三个亲和力对的组合，所述亲和力对可以在所述条件的可检测的不同水平上被破坏。

5.如权利要求4的混合物，其中，所述亲和力对包括互补核苷酸序列。

6.如权利要求4的混合物，其中，每一种微载体固定于光导纤维束中的纤维的末端。

7.如权利要求4的混合物，其包括多种可鉴定的编码的微载体，在它上面固定了相同的捕获探针。

8.如权利要求4的混合物，其中，所述捕获探针是分子信标探针。

9.采用权利要求4的混合物对分析物中的核酸序列的多样性进行的杂交测定，其包括以下步骤：

a)让所述混合物和所述分析物接触，

b)形成所述微载体的分布式的阵列，

c)测定哪一种微载体具有与所述分析物中的核酸序列杂交的捕获探针，和

d)对所述微载体进行光学解码，以便鉴定它们的捕获探针的序列。

10.如权利要求9的测定，其中，步骤a)在步骤b)之前。

11.如权利要求9的测定，其中，所述解码步骤包括通过提高温度破坏所述亲和力对。

12.如权利要求9的测定，其中，所述解码步骤包括通过添加变性剂破坏所述亲和力对。

13.如权利要求9的测定，其中，所述分布式的阵列是平面阵列。

14.如权利要求13的测定，其中，所述平面阵列包括固定在光导纤维束的纤维末端的微载体。

15.如权利要求9的测定，其中，所述分布式的阵列是线性阵列。

16.如权利要求15的测定，其中，步骤c)和d)包括流式细胞术。

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