JP2009522576A - 低分子プリンティング - Google Patents
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- UZHMTXNXIFUPPP-UHFFFAOYSA-N CCC(C12)=[O](C(CC(NC)=O)C3)C13N2C(Nc(cc1)ccc1NC(C)=S)=S Chemical compound CCC(C12)=[O](C(CC(NC)=O)C3)C13N2C(Nc(cc1)ccc1NC(C)=S)=S UZHMTXNXIFUPPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)項の下、2006年1月3日に出願された米国仮特許出願USSN60/755,946に対する優先権を主張し、この米国仮特許出願は本明細書中に参考として援用される。
本明細書で記載される研究は、一部、米国国立健康研究所(NIH R01−AR049832)、米国国立一般医科学研究所(GM38627)、および米国国立がん研究所の遺伝生化学に対するイニシアチブ(20XS139A、N01−CO−12400)からの助成金によって援助された。米国政府は、本発明における特定の権利を有し得る。
対象となる任意のタンパク質または生体分子に対する低分子リガンドを同定する能力は、タンパク質機能の解明および新規の医薬品開発に対して広範囲に影響を及ぼす。天然産物ならびに多様性指向合成(DOS)およびコンビナトリアル・ケミストリーの生成物は、豊富な低分子プールを構成し、そこから、対象となるタンパク質または生体分子への特異的リガンドを見つけることができる(非特許文献1;参照により本明細書に引用したものとする)。特に、スプリット−プール合成法の導入(非特許文献2;各々は参照により本明細書に引用したものとする)および適切な標識技術の開発(非特許文献3;参照により本明細書に引用したものとする)により、化学者はポリマー合成ビーズ上に固定化した膨大な天然産物様化合物を今では調製することができる(非特許文献4;参照により本明細書に引用したものとする)。これらのライブラリーは、新規リガンドの発見に対する豊富な分子源を提供する。
これまで、いくつかの穏やかで選択的なカップリング反応が、ガラス表面上の合成化合物を共有結合的に捕捉し、低分子マイクロアレイを調製するのに使用されている。反応例としては、マイケル付加(MacBeathら Printing small molecules as microarrays and detecting protein−small molecule interactions en masse.J.Am.Chem.Soc.1999;121:7967−68;米国特許第6,824,987号明細書、2004年11月30日に発行;米国特許出願第10/998,867号、2004年11月29日に出願、2005年5月5日に米国特許第2005/0095639号明細書として公開;各々は参照により本明細書に引用したものとする)、第一級アルコールのシリルクロリドへの付加(Hergenrotherら Small molecule microarrays: covalent attachment and screening of alcohol−containing small molecules on glass slides.J.Am.Chem.Soc.2000;122:7849−50;参照により本明細書に引用したものとする)、ジアゾベンジリデン媒介によるフェノール類の捕捉(Barnes−Seemanら Expanding the functional group compatibility of small−molecule microarrays: discovery of novel calmodulin ligands.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003;42(21):2376−9;米国特許出願第10/370,885号、2003年2月20日に出願、2003年11月20日に米国特許第2003/0215876号明細書として公開;各々は参照により本明細書に引用したものとする)、1,3−双極性付加環化(Fazioら Synthesis of sugar arrays in microtiter plate.J.Am.Chem.Soc.2002;124(48):14397−402;参照により本明細書に引用したものとする)、ディールス・アルダー反応(Housemanら Carbohydrate arrays for the evaluation of protein binding and enzymatic modification.Chem Biol 2002;9(4):443−54;参照により本明細書に引用したものとする)、ホスファン修飾したスライド上のアジド類のストーディンガーライゲーション(Staudinger ligation)(Kohnら Staudinger ligation: a new immobilization strategy for the preparation of small−molecule arrays.Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(47):5830−4;参照により本明細書に引用したものとする)、およびエポキシド官能化されたガラス上のヒドラジド結合した化合物の捕捉およびその逆(Leeら Facile preparation of carbohydrate microarrays by site−specific, covalent immobilization of unmodified carbohydrates on hydrazide−coated glass slides.Org.Lett.2005;7(19):4269−72;Leeら Fabrication of Chemical Microarrays by Efficient Immobilization of Hydrazide−Linked Substances on Epoxide−Coated Glass Surfaces.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2005;44(19):2881−2884;各々は参照により本明細書に引用したものとする)が挙げられる。これらの表面捕捉方法のほとんどは、固相有機合成の一部として導入し、表面上の低分子の配向をバイアスするアルコールまたはアジドなどの官能基を利用する(Kohnら Staudinger ligation:a new immobilization strategy for the preparation of small−molecule arrays.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003;42(47):5830−4;Tallaricoら An alkylsilyl−tethered,high−capacity solid support amenable to diversity−oriented synthesis for one−bead,one−stock solution chemical genetics.J.Comb.Chem.2001;3(3):312−8;各々は参照により本明細書に引用したものとする)。非選択的光誘起架橋は、スライドガラス上の10個の複合天然産物のセットの固定化にも使用されている(Kanohら Immobilization of natural products on glass slides by using a photoaffinity reaction and the detection of protein−small−molecule interactions.Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(45):5584−7;参照により本明細書に引用したものとする)。ペプチド核酸共役のオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションなどの非共有結合性アプローチも使用されている(Winssingerら PNA−encoded protease substrate microarrays.Chem Biol 2004;ll(10):1351−60;Winssingerら Profiling protein function with small molecule microarrays.Proc Natl Acad Sci USA 2002;99(17):11139−44;各々は参照により本明細書に引用したものとする)。
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化合物である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され:
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化合物である。ある実施形態において、Lは
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化合物である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され:
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは前記固体支持体に結合されている前記化合物である。ある実施形態において、Lは
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数である。ある実施形態において、Lは
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数である。ある実施形態において、Lは
特記無き場合、下記に定義される語は以下の意味を有する:
「脂肪族」:本明細書で使用する「脂肪族」なる語は、飽和および不飽和の両方、直鎖(すなわち、非分枝状)、分枝状、非環状、環状、または多環脂肪族の炭化水素を含み、これらは、1つまたはそれより多くの官能基で任意に置換される。当業者には当然のことであるが、本明細書で「脂肪族」には、限定的ではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニル部分を含めるものとする。そのため、本明細書で使用する「アルキル」なる語には、直鎖、分枝、および環状アルキル基が含まれる。同様の規定が、例えば「アルケニル」、「アルキニル」等の他の一般的な用語にも適用される。さらに、本明細書で使用する「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」等なる語は、置換および未置換基の両方を包含する。ある実施形態において、本明細書で使用する「低級アルキル」は、1〜6個の炭素原子を有するこれらのアルキル基(環状、非環状、置換、未置換、分枝または非分枝)を示すのに使用する。
100万と同等またはそれ以上のメンバーを有する天然産物様化合物の複雑なケミカルライブラリーの生成における近年の進歩により、生物活性に対してこれらの化合物の効率的スクリーニングを容易化するその後の必要性を生じている。この目的のために、本発明は、対象となる望ましい特性を有する非常に多数の化学物質を同定するためそれら化学物質のハイスループットスクリーニングを可能にするシステムを提供する。ある実施形態において、生体高分子と相互作用可能な非常に多くの化学物質を同定するためそれら化学物質のハイスループットスクリーニングを可能にする方法および組成物を提供する。ある実施形態において、本発明のスクリーニングシステムは、対象となる生体高分子の低分子結合パートナーを同定するのに使用される。
前述のように、一態様において、本発明は、本明細書において「低分子プリンティング」と呼ばれる、高密度アレイの生成方法および結果的に得られる組成物を提供し、ここで低分子はイソシアネート化学(例えば、図2に示すように)またはイソチオシアネート化学を用いて固体支持体に結合されている。
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化学物質である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され:
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、Lは
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
nはそれぞれ1以上20以下の整数であり;
mは1以上20以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、nおよびmはそれぞれ1以上10以下の整数である。ある実施形態において、支持体はスライドガラスである。
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数である。ある実施形態において、Lは
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、Lは非環状脂肪族または複素環脂肪族リンカーである。ある実施形態において、Lはアリールリンカーである。ある特定の実施形態において、Lは置換または非置換されていてよいフェニル部分である。ある実施形態において、Lはパラ置換されたフェニル部分である。リンケージは、化合物を式の活性化表面と反応させることで生成され:
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、Lは
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
nはそれぞれ1以上20以下の整数であり;
mは1以上20以下の整数であり;
XはN、S、またはOであり;
Rは固体支持体に結合されている化学物質である。ある実施形態において、nおよびmはそれぞれ1以上10以下の整数である。ある実施形態において、支持体はスライドガラスである。
支持体はガラス表面、スライドガラス、ポリマー支持体、プラスチック支持体、金属支持体などの固体支持体であり;
Lは置換または非置換で、分枝または非分枝で、環状または非環状で、脂肪族またはヘテロ脂肪族のリンカー(例えば、ポリエチレングリコールスペーサー、ポリエチレンリンカー、−CH2−、−CH2CH2−;−CH2CH2CH2−、等)であり;
nは1以上12以下の整数である。ある実施形態において、Lは
当業者であればわかることであるが、極めて高い空間密度を有する化合物のアレイの生成により、特異的なケミカルライブラリーにおける化合物と生体高分子との間に起こる結合および/または活性化事象の検出が容易になる。そのため、本発明は、さらに別の態様において、対象となる生体高分子に対する低分子パートナーの同定方法を提供する。パートナーは、対象となる特定の高分子に結合し、対象となる生体高分子を活性化または阻害することができる化合物であってよい。一般に、この方法は、(1)上述のように、1つまたはそれより多くの種類の化合物のアレイを提供する工程と、低分子のアレイは1cm2あたり少なくとも1000スポットの密度を有し;(2)アレイを対象となる1つまたはそれより多くの種類の生体高分子に接触させる工程と;(3)特定の低分子−生体高分子パートナーの相互作用を決定する工程とを含む。
ここで、種々の固相有機合成経路および天然産物を含む生物活性化合物から発生するDOS化合物を捕捉するためのイソシアネート官能化されたスライドガラスの調製および使用を説明する。イソシアネートは、酸性副生成物を残すことなく多くの求核官能基と反応する(Vandenabeele−Trambouzeら Reactivity of organic isocyanates with nucleophilic compounds: amines, alcohols, thiols, oximes, and phenols in dilute organic solutions.Advanced Environmental Research 2001;6:45−55;参照により本明細書に引用したものとする)ことにより、イソシアネート表面には、天然または合成源からの多様な低分子が増加し、単一の低分子マイクロアレイ(SMM)の上に固定化することができる。イソシアネートガラス基板を調製し、マイクロアレイ形式でオリゴヌクレオチドを固定化するのに使用した(Ameringerら Ultrathin functional star PEG coatings for DNA Microarrays.Biomacromolecules 2005;6(4):1819−23;Chunら Diisocyanates as novel molecular binders for monolayer assembly of zeolite crystals on glass.Chem Commun(Camb)2002(17):1846−7;Guoら Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports.Nucleic Acids Res.1994;22(24):5456−65;Sompuramら A water−stable protected isocyanate glass array substrate.Anal.Biochem.2004;326(l):55−68;各々は参照により本明細書に引用したものとする)。
さまざまな反応性を有する求核試薬を含む低分子を、低分子または環境湿度のいずれかとゆっくり反応し、かつ、酸などの潜在的に有害な副生成物を生じない弱求電子性の表面の上にアレイした。図2に示すように、γ−アミノプロピルシランスライド(S1)を短いポリエチレングリコール(PEG)スペーサーで被覆し、尿素結合経由で1,6−ジイソシアナトヘキサンにカップリングさせ、推定イソシアネート官能化されたスライドガラス(S2)を生成した。化合物原液でプリントされたスライドをその後、乾燥環境下に置き、スライド表面(S3)上の低分子の共有結合捕捉を触媒するピリジン蒸気にさらした。
ウェルに特徴づけた化学反応(Vandenabeele−Trambouzeら Reactivity of organic isocyanates with nucleophilic compounds: amines, alcohols, thiols, oximes, and phenols in dilute organic solutions.Advanced Environmental Research 2001;6:45−55;Ameringerら Ultrathin functional star PEG coatings for DNA microarrays.Biomacromolecules 2005;6(4):1819−23;Chunら Diisocyanates as novel molecular binders for monolayer assembly of zeolite crystals on glass.Chem Commun(Camb)2002(17):1846−7;Guoら Direct fluorescence analysis of genetic polymorphisms by hybridization with oligonucleotide arrays on glass supports.Nucleic Acids Res 1994;22(24):5456−65;Sompuramら A water−stable protected isocyanate glass array substrate.Anal Biochem 2004;326(1):55−68;各々は参照により本明細書に引用したものとする)を使用し、かつ、天然源および合成源の両方から生じる低分子を含む最初のマイクロアレイを調製できる低分子の共有結合捕捉戦略を使用した。イソシアネート媒介捕捉は、種々の求核官能基を含む化合物に適用可能であり、化合物がアルコールまたはアジドなどの特殊反応性付属肢を含むことを必要とせず(Barnes−Seemanら Expanding the functional group compatibility of small−molecule microarrays: discovery of novel calmodulin ligands.Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(21):2376−9;Hergenrotherら Small molecule microarrays: covalent attachment and screening of alcohol−containing small molecules on glass slides.J.Am.Chem.Soc.2000;122:7849−50;Kohnら Staudinger ligation: a new immobilization strategy for the preparation of small−molecule arrays.Angew Chem Int Ed Engl 2003;42(47):5830−4;各々は参照により本明細書に引用したものとする)、アレイにおける共有結合捕捉用合成中に導入される。イソシアネート官能性は、電気陽性の塩素部分を用いた捕捉試薬を含むいくつかの上述の捕捉試薬と対照的に;副生成物を生じない。後者は、低分子の近傍に酸性残基の堆積および凝縮をもたらす結果となり、これは、低分子の部分的分解およびスクリーニング結果の不明化をもたらし得る。多数の求核官能基を含む化合物は、所与のスポットで配向を変えて表示される潜在力も有する。多重モードの表示により、タンパク質が所与のマイクロアレイフィーチャで異なる結合配向をサンプリングすることができる場合がある。しかしながら、イソシアネートスライドはタンパク質結合が必要となる求核試薬と反応する場合があるため、スクリーニングでいくつかの偽陰性につながることがある。プリントされたフィーチャ内の潜在的な異質性という理由から、フォローアップ用の陽性に優先順位をつけるためには、マイクロアレイ蛍光強度よりも表面プラズモン共鳴系二次結合アッセイから生じるデータを使用することが好ましい。このアプローチにより、リアルタイムおよび定量的アッセイで陽性の特性を明らかにするため、ハイスループットのマイクロアレイスクリーニングプラットフォームおよび表面プラズモン共鳴プラットフォームを用いて候補となるリガンドを迅速に同定することが可能になる。
材料。生物活性低分子および天然産物を市販供給元から購入した。DOS分子はBroad Chemical Biology Programから入手した。化合物3sはJohn Tallarico博士から贈与された。化合物27、28はAriad PharmaceuticalsのTimothy Clackson博士から入手した。Flag−FKBP12哺乳類発現構成体はPaul Clemons博士から贈与された。EGFP−FKBP12哺乳類発現ベクターはClontech Laboratoriesから購入したCreator(商標)クローニングシステムおよびHarvard Institute of Proteomicsから入手したFKBP12ライブラリーベクターを用いて作製した。コルチコステロン、エストラジオール、およびジギトキシンに対する抗体はSigmaから購入した。マウス抗Flag(商標)モノクロナール抗体はSigmaから購入した。Alexa Fluor(登録商標)647ヤギ抗ウサギ抗体はInvitrogenから購入した。Cy5(商標)標識ヤギ抗GSTおよびウサギ抗マウス抗体はAmersham Biosciencesから購入した。スライドは635nmおよび532nmのレーザを用いて5μm分解能のAxon4000Bスキャナーを用いるかまたは488nmおよび532nmのレーザを用いて5μm分解能のAxon4200Aスキャナーを用いるかのいずれかでスキャンした。アレイはモレキュラーデバイスから購入したGenePix Pro 6.0 ソフトウェアを用いて分析した。
HEK293T細胞のトランスフェクション
1.70〜90%融合するまで、DMEM/10%FBS+P/S+Glutで細胞を成長させる
2.6ウェルプレート24のウェルごとに5×105細胞をメッキする(1ウェル=1SMM)
3.37℃で24時間インキュベートする
4.2mLの温かなDMEM/10%FBSで培地を交換する
5.脂質トランスフェクション反応を以下の順序で調製する:
a.OptiMEM(インビトロゲン) 100mL
b.Fugene 6(ロシュ・ダイアグノスティックス) 3uL
c.プラスミドDNA 2ug
6.軽くたたいて混合し、室温で15分インキュベートする
7.ピペットで優しく100uLのトランスフェクション反応物をウェルの周りに滴下する
8.37℃で36〜48時間インキュベートする
9.EGFPによってトランスフェクション効率を監視および記録する
トランスフェクト細胞の採取
10.EGFP効率>70%で、かつ、強い場合、細胞を採取する
11.培地を吸引し、捨てる
12.500uLの冷却PBSを各ウェルにピペットする
13.PBSの繰り返しピペット操作によって細胞層を穏やかに解放する
14.15mLのファルコンチューブで共通の細胞をプールする
15.l,000gで、4℃×3分スピンする
16.浮遊物を捨てる
17.PBS中で穏やかに再懸濁する
18.洗浄工程15〜17を全部で3回繰り返す
19.エッペンドルフチューブで洗浄した細胞懸濁液を等分する
20.l,000gで、4℃×3分スピンする
21.浮遊物を慎重に最大限捨てる
22.EtOH/ドライアイスで細胞ペレットをスナップ凍結する
23.使用するまで−80℃で保存する
細胞溶解物の調製
24.湿り氷上で細胞ペレットを解凍する
25.プロテアーゼ阻害剤およびDTT(フレッシュ)でMIPPリシスバッファーを調製する
26.ペレットを100〜200uLのリシスバッファーで再懸濁する
27.15分間、氷上でインキュベートする
28.l4,000gで、4℃×10分スピンする
29.新たな、冷却エッペンドルフチューブに清澄化浮遊物を静かに移す
30.ブラッドフォードアッセイを行い、タンパク質濃度を評価する
31.0.3〜1ug/uLを達成するためリシスバッファーで調整する
プリントされた低分子マイクロアレイのスクリーニング
32.細胞溶解物をスライド表面に塗布する(方法により決定した容量):
a.Hybeチャンバー 1.4mL
b.パラフィルム 0.3mL
c.カバースリップ 0.15mL
33.4℃×1時間でインキュベートする
34.冷却PBSTで、4℃で、3×1分間洗浄する
35.一次抗体を塗布する(PBST+1%BSAで1:1000希釈)
36.4℃×1時間でインキュベートする
37.冷却PBSTで、4℃で、3×1分間洗浄する
38.二次Cy5標識抗体を塗布する(PBST+1%BSAで1:1000希釈)
39.4℃×1時間でインキュベートする
40.冷却PBSTで、4℃で、3×3分間洗浄する
41.ddH2Oで軽くすすぐ
42.1000rpm×1分間、スライドを遠心分離機にかけ、乾燥させる
43.PMT電圧(500)および100%出力により635でスキャンする
MIPPリシスバッファー 1.00L
NaH2PO42H2O 20mM 3.12g
Na3VO4 1mM 0.184g
NaF 5mM 0.08g(80mg)
B−グリセロリン酸 25mM 5.48g
EGTA 2mM 0.78g
EDTA 2mM 0.72g
トリトンX−100 0.5% 2.5mL
DTT 1mM フレッシュ
pH 7.2
PBST=PBS+0.1%ツイーン20
統計的方法
10個のマイクロアレイ(5個の処理および5個の対照)を、FKBP12含有胞溶解液を有するプリントされた低分子の相互作用を決定するため使用した。各マイクロアレイは、全部で10,800個のプリントされたフィーチャを含んでいた。各マイクロアレイ上の10,800個のフィーチャのうちで、158個のフィーチャは溶媒のみを含んでおり、強度の閾値を確立するために陰性対照として使用した。全ての溶媒細胞(158×10=1,580)に対する最大蛍光強度値(すなわち、閾値)は2.243であることが分かった。データを二分するためこの閾値を用いて、フィッシャーの正確確率検定を、処理細胞が対照フィーチャの強度よりも大きな強度を有しているという仮説を評価するために使用した。分割表およびp値は、少なくとも1つの細胞が閾値を超える蛍光強度を実証した104個の溶媒のみのフィーチャに対して作成した。計算はSAS(キャリー、ノースカロライナ州)で厳密なオプションを用いて行った。
SPR測定はBiacore S51装置(ビアコア社(Biacore,Inc)、Piscataway、ニュージャージー州)で行った。Biacore CM5リサーチグレードセンサーチップ上の各フロー細胞は3つのアドレス可能なスポット:2つのサンプルスポットと1つのリファレンススポットを含む。抗GSTを13,000応答単位(RU)レベルでスポット1およびスポット2上に固定化した。10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)で希釈した抗GSTをEDC/NHS結合ケミストリーアプリケーションウィザードを用いて固定化した。固定化ケミストリーをエタノールアミンで急冷した。GST標識FKBP12を1,600RUレベルでスポット1上に捕捉し、組み換えGSTをスポット2上に捕捉した。
カルボン酸官能化されたFKBP12−リガンド3fを以下の刊行物:Terence Keenan, David R.Yaeger, Nancy L.Courage, Carl T.Rollins, Mary Ellen Pavone, Victor M.Rivera, Wu Yang, Tao Guoy, Jane F.Amara, Tim Clackson, Michael Gilman and Dennis A.Holt;Bioorganic & Medicinal Chemistry 6(1998)1309−1335におけるプロトコルにしたがって合成した。3fは他の報告された合成FBBP12−リガンド(3a〜eおよび3g〜q)用の共通中間体として機能した。
第一級アルコール3a:方法A
第二級アルコール3b:方法A
第三級アルコール3c:方法B
フェノール3d:方法A
メチルエーテル3e:方法A
ヒドロキサム酸3g:方法A
アルキル3h:方法A
チオール3i:方法A
第一級アミン3j:方法A
第二級アミン3k:方法A
インドール3l:方法A
アニリン3m:方法A
3−PEG第一級アミン3n:方法A
2−PEG第一級アルコール3o:方法B
3−PEG第一級アルコール3p:方法B
5−PEG第一級アルコール3q:方法B
カップリング反応用の出発原料、カルボン酸AP1497誘導体3f:
この実施例では、マイクロアレイ形式における多様な反応性官能基を有する低分子のロバストな共有結合捕捉方法について説明し、対象となるタンパク質を有する低分子マイクロアレイのプローブ手順を概説する。蒸気触媒し、イソシアネート媒介した表面固定化スキームを、多様性指向合成経路由来の生物活性低分子、天然産物、および低分子を結合するのに使用する。さらに、精製タンパク質および細胞溶解物を有する低分子マイクロアレイスクリーニング用の最適化方法論について説明する。最後に市販のソフトウェアと互換性があるデータ分析用の提案モデルを提供する。これらの手順により、免疫グロブリンプロファイリング、細胞状態の比較分析、およびリガンド発見への潜在用途を有する新規の相互作用を発見するためのプラットフォーム能力を可能にする。
試薬
・コーニング GAPS II被覆スライドガラス(フィッシャー、07−200−006)
・Fmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(NeoMPS、FA03202)。可変長のポリエチレングリコールスペーサー(n=2〜10のエチレングリコール単位)は、このプロトコルでうまく用いられている。より長い長さのスペーサー(n>30)は、より低い蛍光強度値および非一貫性のスポット形態を提供する。
・ピペリジン、再蒸留(シグマアルドリッチ、411027)
・1,6−ジイソシアナトヘキサン(アルドリッチ、D124702)
・ピリジン(アルドリッチ、270970)
・エチレングリコール(アクロス・オーガニクス、295530010)
・N,N−ジメチルホルムアミド、DMF(フィッシャーケミカル、D131−4)
・N,N−ジイソプロピルエチルアミン、DIPEA(シグマアルドリッチ、550043)
・ジメチルスルホキシド(アクロス・オーガニクス、414880010)
・アセトニトリル(フィッシャーケミカル、A998−4)
・テトラヒドロフラン、THF、安定化(アクロス・オーガニクス、164240025)
・Texas Red(登録商標)カダベリン(インビトロゲン、T−2425)
・Oregon Green(登録商標)488 カダベリン(インビトロゲン、O−10465)
・Alexa Fluor(登録商標)647 カダベリン(インビトロゲン、A−30679)
・ラパマイシン(LCラボラトリーズ、R−5000)
・FK506(LCラボラトリーズ、F−4900)
・AP1497は、参照文献18に記載されているように調製した
・FKBP12−6xHisは、リファレンス8に記載されているように調製した
・Alexa Fluor(登録商標)647 共役抗5xHis抗体(キアゲン、35370)
・Cy5モノ反応性抗体 Labeling Dye Pack(GEヘルスケア、PA25001)
・293T細胞(ATCC、CRL−11268)
・Lipofectamine 2000 トランスフェクション試薬(インビトロゲン、11668−019)
・OptiMEM還元血清、コンポーネント・フリー培地(インビトロゲン、11058)
・参照文献15に記載されているFlag−FKBP12哺乳類過剰発現構成体
・抗FLAG(登録商標)M5モノクローナルマウス抗体 (シグマ、F4042)
・抗マウスヤギ二次抗体、Alexa Fluor(登録商標)647複合体(インビトロゲン、A−21237)
・抗ウサギヤギ二次抗体、Alexa Fluor(登録商標)647複合体(インビトロゲン、A−21246)
・ビオチン(シグマ、B4501)
・ビオチン−PEGアミン(シグマ、B9931)
・ビオチンカダベリン(インビトロゲン、A−1594)
・ストレプトアビジン、Alexa Fluor(登録商標)647複合体(インビトロゲン、S−32357)
・ジゴキシン(シグマ、D6003)
・抗ジゴキシンマウスモノクロナール抗体、クローンDI−22、腹水液(シグマ、D8156)
・コルチコステロン(フルカ、27840)
・抗コルチコステロンウサギ抗体、全抗血清(シグマ、C8784)
・プロテアーゼインヒビターカクテルタブレット(ロシュ、11836170001)
・トリス緩衝食塩水(TBS、0.025M トリスHCl、0.137M NaCl、0.003M KCl、pH 7.4)
・ツイーン20を有するトリス緩衝食塩水(TBST、0.025MトリスHCl、0.137M NaCl、0.003M KCl、pH 7.4、0.01%(v/v)ツイーン20)
・リン酸緩衝食塩水(PBS、0.012M NaH2PO4、0.137M NaCl、0.003M KCl、pH 7.4)
・ツイーン20を有するリン酸緩衝食塩水(PBST、0.012M NaH2PO4、0.137M NaCl、0.003M KCl、pH 7.4、0.01%(v/v)ツイーン20)
・MIPPリシスおよびインキュベーションバッファー(0.02M NaH2PO4、0.001M Na3VO4、0.005M NaF、0.025M β−グリセロリン酸、0.002M EGTA、0.001M DTT、0.5%(v/v)トリトンX−100、pH 7.2)。RIPAリシスおよび抽出バッファー(0.025MトリスHCl、0.15M NaCl、1%(v/v)NP−40、1%(v/v)デオキシコール酸ナトリウム、0.1%(v/v)SDS、pH 7.6)の使用は、アッセイ中の信号対雑音を著しく低下させるスライド表面上の自家蛍光フィルムの形成をもたらすため、回避すべきである。
・OmniGrid 100 マイクロアレイヤー(ゲノミック・ソリューションズ)
・946プリントヘッド(テレコム・インターナショナル、946PH48)
・946マイクロスポッティングピン(テレコム・インターナショナル、946MP3)
・384ウェルポリプロピレンナチュラルマイクロアレイプレート、円筒状ウェル(アブゲン、AB−1055)
・熱剥離プレートシール(ベロシティ11、06643001)
・デシケーター乾燥保存箱、アクリル(VWR、24987−053)
・マイクロプレートキャリア付き卓上遠心分離機
・低粒子ニトリルグローブ(VWR、40101−222)(いくつかの粉付きグローブの使用により、マイクロアレイ上に自家蛍光残留物をもたらすことができる)
・吸水紙(フィッシャー・サイエンティフィック、11−998)
・ステンレス製50スライドラック(ウィートン・サイエンティフィック、900404)
・ステンレス製蓋付き大型ガラストラフ、500mL(レイモンド・ア・ラム、E102−6)
・Oリング端付き三叉ガラス真空管(アルドリッチ、Z271330)
・タイゴンチューブR−3603(耐真空)
・ガラス製減圧デシケーター(アルドリッチ、Z114340)
・4ウェル矩形ポリスチレン製皿(ヌンク、267061)
・正方形ペトリ皿、100×100×15mm(ヌンク、4021)
・パラフィルム(登録商標)M(フィッシャー・サイエンティフィック、13−374−10)
・ハイブリスリップ(商標)ハイブリダイゼーションカバー、60×22mm(インビトロゲン、H−18202)
・エッペンドルフチューブ
・軌道式平台震盪器(VWR、82004−958)
・マイクロアレイ乾燥用2スライド型遠心分離機(スネルジア・メディカル、MSC−T)
・Genepix 4200A 4レーザースライドスキャナー(モレキュラーデバイス)
・Genepix Pro 6.0 ソフトウェア(モレキュラーデバイス)
試薬準備
低分子:イソシアネート反応性官能基を含むいくつかの低分子を、本方法を評価するため試験分子として提案する(表1)。
カスタマイズされたマイクロアレイヤー洗浄ステーション。標準OmniGrid 100 セットアップはプリンティングピンの水性洗浄用の超音波処理器を含む。低分子マイクロアレイにおいて、ピンから化合物を洗い流すためアセトニトリルなどの有機溶媒を使用する。超音波処理ステーションは撹拌プレートとアセトニトリルを含む再結晶皿に置き換えている。各洗浄工程の際、プリントヘッドを撹拌アセトニトリル皿に5秒間浸し、その後、真空乾燥ステーションで3秒乾燥させる。各ピンの浸漬において、試料のキャリー・オーバーを最小化するため洗浄乾燥サイクルを3回繰り返す。撹拌棒は、ピンが溶媒と接触しないような深い渦を作らないようにする。確実にピンが効率的に洗浄されるように、溶媒レベルを時折監視する。
プリンティング用低分子原液の調製
1.対象となる低分子をDMSOに溶解する。一般に、プリンティングストック濃度は1mM〜10mMの範囲である。DMFは原液調製用の適切な代替溶媒である。原液は−20℃で保存する。
2.各原液5μLを384ウェルポリプロピレンマイクロアレイプレートの個々のウェルに移す。大量の試料数においては、液体移動ロボットを使用するのが望ましい。密閉ストックプレートを−20℃で保存し、凍結融解サイクルを10回まで行った後、液体クロマトグラフィー質量分析(LC−MS)を行い、化合物ストックの安定性を監視する。許容凍結融解サイクル数はプリントされる低分子の性質によることが多い。プリンティングストックプレートの一般的なセットは12回の凍結融解サイクル後に廃棄する。
3.100枚のアミノ官能化されたGAPS IIスライド(コーニング)を2つのステンレス製50スライドラック中に入れる。各ラックを、フレッシュなPEG溶液:1LのDMF中にFmoc−8−アミノ−3,6−ジオキサオクタン酸(1mM)、PyBOP(2mM)、およびDIPEA(0.5mM)を含む大型ガラストラフに浸す。溶液はスライドを完全に覆わなければならない。ドラフト・チャンバーで、少なくとも4時間室温で撹拌しながらPEG溶液中でスライドをインキュベートする。インキュベーションは一般に一晩行う。
4.PEG溶液からラックを取り出し、DMFで軽くすすぐ前にPEG溶液を滴り落とす。ラックを再びドリップドライし、1LのDMF中に1%(v/v)ピペリジンを含む清浄タンクに入れ、表面からFmoc基を除去した。脱保護反応は室温で10分後に完了する。スライドは一晩、脱保護溶液に放置することができる。
5.ピペリジン溶液からラックを取り出し、ドリップドライし、撹拌しながらDMFで1分間洗浄する。スライドの表面上にイソシアネート基を取り付けるため、脱保護化スライドをDMF中に1%(v/v)1,6−ジイソシアナトヘキサンを含むトラフに入れる。完全に浸したスライドを室温で30分間、撹拌しながらこの溶液中でインキュベートする。
6.撹拌しながら活性化スライドをDMFに浸し、3分間洗浄する。フレッシュなDMFで繰り返す。撹拌しながらスライドをTHFに浸し、2分間洗浄する。この洗浄シーケンスにより、余分なイソシアネート試薬をスライドから効率的に除去し、無菌で乾燥したスライドを提供する。スライドは一般に、余分な溶媒および試薬がマイクロアレイヤープラットフォームにさらされないようプリンティング前に乾燥させる。スライドは、THFの最終すすぎ後、空気の緩流下で、1分または2分間乾燥させてもよい。あるいは、単にTHFを数分間蒸発させる。
7.化合物ストックプレートを冷凍庫から取り出し、デシケーター乾燥保存箱で解凍させる。
8.乾燥させ、活性化させたスライドをマイクロアレイヤープラットフォームの上に注意深く置く。スライドをバーコードステッカに対して全て共通の方向にすること。
9.ピンの先端に触れないように注意しながら、プリントヘッドに無菌プリンティングピンを装填する。
10.OmniGrid 100 ソフトウェアを用いてプリンティング構成を設計する。DMSOからのプリンティングは一般に、およそ150μmのスポット直径を有するフィーチャを提供する。300μmの中心間距離を用いることにより、10,800個のフィーチャを48個のピンを用いて15×15サブアレイに無理なくプリントすることができる。
11.Genevac HT−24またはマイクロプレートアダプタを有する標準型卓上遠心分離機を用いて1分間、400gで全ての化合物ストックプレートを遠心分離する。全ての原液が確実にウェルの底部に存在するように、プレートを遠心分離しなければならない。
12.無菌ガラスブロッターを3つのマイクロプレート位置の1つに挿入する。最初の2枚の化合物ストックプレートを残りのマイクロプレートホルダに挿入する。実際のプリンティングシーケンスと理論的プリントシーケンスまたはGALファイルとの間の不整合を防止するため、全てのストックプレートをマイクロプレートホルダ上にウェルA01に対して適切な方向に戴置する。
13.所望のアレイ形式で化合物をプリントする。アレイヤーに試料ピックアップごとにブロッター上の中心間距離400μmで30フィーチャを前スポットするように指示する。2枚のプレートごとのプリンティング後、吸水紙およびメタノールでブロッターをきれいにする。活性化スライド上にスポッティングする前にブロッター上のプリンティング溶液により、余分な溶液がプリント実行の最初の数枚のスライド上に大きなスポットを生じるのを防ぐ。
14.プリント実行が完了後、スライドを少なくとも10分間、マイクロアレイヤープラットフォーム上に放置し、プリントされた試料を乾燥させる。
15.プリントされたスライドをステンレス製スライドラックに移す。ラックを換気ケミカルドラフト・チャンバーにタイゴンチューブを介して三叉ガラスバルブに取り付けた減圧デシケーターに入れる。主要な出口は、バルブの一つもまたチューブを介して真空ラインに向けた状態で、チューブを介してデシケーターに向けなければならない。他方の(閉鎖)バルブは、チューブを介して、2mL無水ピリジンを有するフラスコに向けなければならない。スライドを含むデシケーターを真空排気する。スライドを、任意の余分なプリンティング溶媒の除去を支援するため5分間真空下に保持する。真空ラインを閉鎖し、ピリジンを含有するフラスコにバルブを開く。デシケーター内のプリントされたスライドをその後、ピリジン蒸気に少なくとも2時間さらす。ピリジンはイソシアネートに反応しにくい官能基の共有結合を触媒する。最後に、ピリジンラインを閉鎖し、デシケーターを真空排気し、スライドを乾燥させる。スライドは一般に、一晩インキュベートする際にピリジン蒸気にさらす。
16.デシケーターからラックを取り出し、乾燥したスライドをDMF中に5%(v/v)エチレングリコールおよび0.1%(v/v)ピリジンの溶液中に30分間撹拌しながら浸し、イソシアネート表面を急冷する。
17.エチレングリコールを急冷後、スライドをDMFですすぐ。スライドをDMFで1時間、撹拌しながら洗浄し、その後、THFで2回、それぞれ3分間ずつ軽く洗浄する。スライドを遠心分離で乾燥させる。
18.乾燥したスライドをパラフィルムで密閉した5枚用スライドボックスに包装する。マイクロアレイは−20℃で6ヶ月間まで保存できる。アレイは数日間4℃で保持できる。
19.公知のフルオロフォア(表1に記載)を見て、自家蛍光化合物を同定するため前スキャンする。
20.4℃で冷却維持されていたTBST緩衝液中の公知のプリントされたリガンド(表1に記載)を検出するため使用されるタンパク質溶液または抗体溶液を調製する。精製したタンパク質および抗体は一般に、0.1〜5.0μg mL−1の範囲でスクリーニングする。対象となるタンパク質に適当な緩衝液を使用することが重要である。緩衝液は活性または安定性に必要な特異的補因子または試薬を含まなければならない。自家蛍光付加剤を回避するのが最良である。TBSTおよびPBSTを一般に使用し、例として提供する。
21.希釈したタンパク質をマイクロアレイで、4℃で1時間インキュベートする。2つのインキュベーション方法を以下に述べる。方法Aは、タンパク質の供給量が制限されていない場合、または、攪拌が望ましい場合(次に続き得る抗体インキュベーションに対する同一のプロトコルを使用)に使用する。廉価な方法Bは結合アッセイに使用するタンパク質の量を最小化するため使用する。この方法はカバースリップの代替として使用し、それにより、一貫性の無い結果と、カバースリップの先端を包囲する高バックグラウンド領域をもたらす:
A)皿法
(i)4ウェル矩形皿のウェルに、マイクロアレイを、プリント面を上にして置く。
(i)パラフィルム片を切り取り、実験用冷蔵庫または冷蔵室への移送用の、冷蔵室内の無菌実験台などの滑らかで平坦な表面上かまたは冷却した平坦な表面上に置く。
22.マイクロアレイからタンパク質溶液を注意深く除去する。冷却したTBST緩衝液(4℃)を用いて余分なタンパク質溶液をスライドから軽くすすぎ落とす。直接標識蛍光タンパク質を用いたアッセイにおいては、方法Aに従う。標識抗体を介して検出に関与するアッセイにおいては、方法Bに従う。
A)Fluor標識タンパク質の直接検出
蛍光部分(例えば、Alexa 647、フルオレセイン、GFP等)で直接標識するタンパク質においては、プラットフォーム振盪機または揺動機上で、攪拌しながら2分間、3mL緩衝液中で各スライドを洗浄する。2回繰り返す。冷却したTBS緩衝液(4℃)で1分間、1回洗浄し、工程23に進む。
B)抗体に基づく検出
fluor標識抗体に基づく検出(例えば、抗His、抗GST、抗FLAG等)を用いる際には、対象となる希釈抗体をTBSTまたは別の適当な緩衝液に直ちに塗布し、スライドを4℃で1時間置く。fluor標識抗体溶液をマイクロアレイから注意深く除去する。冷却したTBST緩衝液を用いて余分なタンパク質溶液をスライドから軽くすすぐ。スライドを3mL緩衝液で2分間、攪拌しながら洗浄する。2回繰り返す。冷却したTBS緩衝液で2分間、1回洗浄する。
23.スライド遠心分離機を用いて、遠心分離によりスライドを乾燥させる。プローブしたマイクロアレイは分析する準備が整った状態である。スライドはタンパク質でプローブした直後にスキャンするのが理想的である。乾燥したスライドは、蛍光信号に著しい劣化を起こすことなく、スキャニング前に室温遮光下で2日間まで保存できる。
24.HEK−293T細胞を対象となるエピトープ標識タンパク質をコード化する哺乳類の過剰発現構成体でトランスフェクトする。1つのウェルが1つのSMMインキュベーションにつき必要であることを見越して、1ウェルあたり5×105細胞での6ウェルプレートで、細胞をシードする。信頼性の高い、ハイレベルの発現は市販のほとんどの脂質トランスフェクション試薬、それに続いて提供された技術プロトコルにより、この細胞株で達成されている。細胞は一般に、EGFPベクターでトランスフェクトしたウェルが安定した、高度の発現を達成する時点で、トランスフェクション後、48〜72時間の間に採取する。タンパク質の発現および検出は免疫ブロット法によって確認することができる。実行可能であれば、免疫沈澱タンパク質は、適当な生化学アッセイで、活性に対し評価することができる。
25.保存または溶解用細胞を採取する。粘着細胞を6ウェルプレートで、冷却PBSで2回洗浄し、冷却PBSの1ウェルあたり500μLで再懸濁し、標識エッペンドルフチューブに移した。細胞を軽い遠心分離によってペレット化し、浮遊物を捨てる。ペレット化細胞は一般に液体窒素でスナップ凍結し、使用するまで−80℃で保存する。
26.インキュベーション用の細胞溶解物を低分子アレイとともに調製する。細胞ペレットを湿り氷上で解凍し、プロテアーゼ阻害剤およびフレッシュDTT(ソースウェルあたり300μL容量)を補充したMIPPリシスバッファー内で迅速かつ穏やかに再懸濁する。氷上で15分間インキュベートする。溶解物をその後、4℃で10分間、14,000gの遠心分離によって清澄化する。遠心分離した直後、浮遊物を新しい、冷却エッペンドルフチューブに静かに移す。タンパク質定量化アッセイを行い、0.3μg mL−1を達成するためリシスバッファーで調整する。MIPPリシスバッファーは、前述のように調製したアレイとの自家蛍光を最小化するため決められている。TGNおよびRIPAリシスバッファーは、対照実験における信号対雑音を干渉する。
27.SMMを溶解物で、工程21で説明した方法を用いて、4℃で1時間インキュベートする。冷却PBSTで1分間、穏やかに回転させながら洗浄し、これを3回繰り返す。
28.SMMを一次抗体で1時間、4℃で直ちにインキュベートする。抗FLAGまたは抗Hisなどのエピトープ標的抗体においては、0.1%BSAを補充したPBSTで1:1000希釈することを提案する。冷却PBST(4℃)で3分間、穏やかに回転させながら洗浄し、これを3回繰り返す。
29.SMMを二次抗体で1時間、4℃で直ちにインキュベートする。1:1000の希釈が、市販のほとんどのfluor標識抗体溶液に対して適している。冷却PBSTで3分間、穏やかに回転させながら洗浄し、これを3回繰り返す。蒸留水で軽くすすぎ、スライドを1分間、遠心分離することで乾燥させる。プローブしたスライドは分析する準備が整った状態である。
30.提案した設定を用いたGenepix 4200Aスライドスキャナーを用いてスライドをスキャンする。
31.マイクロアレイ位置をマイクロプレート位置に翻訳しながら、対応するGALファイルを、Genepix Pro 6.0 ソフトウェアを用いて各スキャンされた画像にアラインする。各サブアレイのアラインを助けるためプリントされたfluorマーカーを使用する。各GALファイルフィーチャを実際にプリントされたマイクロアレイフィーチャの直径に適切にサイズ変更し、各マイクロアレイに対するGenepix results(GPR)ファイルを生成する。
32.a)蛍光染料マーカーが存在するか否か、b)公知のリガンドが存在するか否か、c)マーカー化合物が次の試料へキャリー・オーバーすることにより、隣接するフィーチャに汚染をもたらしているか否か、d)どの化合物が実験波長で自家蛍光であるか、およびe)マイクロアレイに塗布したタンパク質または抗体に結合する新たな低分子があるか否か、を評価するためにresultsファイルを分析する。
33.アッセイ陽性を、各SMM上に溶媒のみを含むフィーチャによって定められたモック処理分布からの偏差に基づいた3重の実験データからスコアする。GenePixソフトウェア内でスポットごとに、蛍光強度をバックグラウンド信号に合わせて調整し、この測定基準を分析において主として使用する。
34.アッセイ陽性をその後、必要に応じて、対照実験から集めた3重の実験データと比較する。このプラットフォームは低分子と免疫グロブリンとの間の相互作用を検出することが可能なので、緩衝液のみとの比較または対照溶解物の実験に続いて、抗体インキュベートすることが不可欠である。
このプロトコルで概説した各実験工程は、多くの関心ある研究者によるスクリーニング用アレイの製造に適応するように、能力、収率、および再現性において最適化している。一般に、研究者は、顕微鏡用スライドガラス上にマイクロアレイ形式で11,000個近くの多様な化合物の固定化が成功すると予想することができる。この結果に至る途中で、スクリーニング状況においてプラットフォームを確認するためプリンティング工程および公知の高親和性リガンドに対する対照として蛍光リガンドとともにスクリーニングする「アッセイ開発」を推奨する。
当業者であれば、前述の内容が、本発明のある好ましい実施形態を単に表していることを容易に理解するであろう。以下の特許請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱せずに上述の手順および組成物の種々の変更物および修正物を作製することができる。
Claims (51)
- イソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して固体支持体に結合した複数の1より多くの種類の化合物を含むアレイであって、該化合物のアレイの密度は1cm2あたり少なくとも100スポットを含む、アレイ。
- 前記化合物のアレイが低分子のアレイを含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物のアレイが非オリゴマー性化合物のアレイを含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物のアレイが非ペプチド性化合物および非オリゴマー性化合物のアレイを含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物のアレイが2000g/mol未満の分子量を有する化合物のアレイを含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物のアレイが、ポリヌクレオチドでもペプチドでもタンパク質でもない化合物のアレイを含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物のアレイが、細胞溶解産物からの生体分子である化合物のアレイを含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物が第一級アルコール、第二級アルコール、フェノール、チオール、アニリン、ヒドロキサム酸、第一級アミド類、脂肪族アミン類、およびスルホンアミド類からなる群から選択される結合用官能基を含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記化合物が第一級アルコール類、第二級アルコール類、フェノール類、カルボン酸類、ヒドロキサム酸類、チオール類、およびアミン類からなる群から選択される結合用官能基を含む、請求項1に記載のアレイ。
- 前記結合は、結果的に得られるリンケージが、前記化合物が(1)その後の操作工程の際に不用意に開裂せず、かつ、(2)用いた官能基がその後の操作工程に干渉しないように不活性であるように十分に強固であることを特徴とする、請求項1に記載のアレイ。
- 前記アレイ中の各前記化合物が、イソシアネート部分またはイソチオシアネート部分に対する求核試薬の付加によって生じたリンケージを介して前記固体支持体に結合されている、請求項1に記載のアレイ。
- 前記付加が蒸気によって触媒される、請求項11に記載のアレイ。
- 前記付加が求核試薬によって触媒される、請求項11に記載のアレイ。
- 前記蒸気がピリジンである、請求項12に記載のアレイ。
- 前記蒸気が揮発性の複素環アミンである、請求項12に記載のアレイ。
- 前記固体支持体がガラスである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体が誘導体化ガラスである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体がシリル化ガラスである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体がγ−アミノプロピルシリル化ガラスである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体がポリマーである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体が金属である、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体が金属被覆面である、請求項1に記載のアレイ。
- 前記固体支持体が金被覆面である、請求項1に記載のアレイ。
- 前記アレイの密度が1cm2あたり少なくとも1000スポットである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記アレイの密度が1cm2あたり少なくとも2500スポットである、請求項1に記載のアレイ。
- 前記アレイの密度が1cm2あたり少なくとも5000スポットである、請求項1に記載のアレイ。
- イソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して固体支持体に結合した複数の1つまたはそれより多くの種類の化合物を含むアレイであって、該化合物のアレイの密度は1cm2あたり少なくとも100スポットを含む、アレイ。
- 化合物のアレイの形成のための方法であって、
固体支持体を提供する工程であって、該固体支持体は、1より多くの種類の化合物と相互作用して共有結合を形成可能な弱求電子性部分で官能化されている、工程と;
該固体支持体に結合されるべき1より多くの種類の化合物の1つまたはそれより多くの溶液を提供する工程と;
該1より多くの種類の化合物の該1つまたはそれより多くの溶液を該固体支持体に送達し、それによって該化合物はそれぞれ、共有結合性相互作用を介して該固体支持体に結合し、かつ、該化合物のアレイは1cm2あたり少なくとも100スポットの密度を有する工程と;
該化合物の該支持体への共有結合を触媒するのに十分な条件下、該固体支持体を蒸気形態の塩基にさらす工程と、
を含む、方法。 - 前記弱求電子性部分がイソシアネート部分である、請求項36に記載の方法。
- 前記弱求電子性部分がイソチオシアネート部分である、請求項36に記載の方法。
- 前記塩基がピリジンである、請求項36に記載の方法。
- 前記化合物の前記支持体への共有結合を触媒するのに十分な前記条件が無水環境で該結合を行う工程を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記化合物の前記支持体への共有結合を触媒するのに十分な前記条件が不活性雰囲気で該結合を行う工程を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記不活性雰囲気がアルゴンまたは窒素雰囲気である、請求項36に記載の方法。
- 対象となる生体高分子に対する低分子パートナーを同定する方法であって、
請求項1に記載のアレイを提供する工程であって、該アレイはイソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して支持体に結合した低分子のアレイを含み、該低分子のアレイは1cm2あたり少なくとも100スポットの密度を有する工程と;
該アレイを対象となる1つまたはそれより多くの種類の生体高分子に接触させる工程と;
特定の低分子−生体高分子パートナーの結合を決定する工程と、
を含む、方法。 - 遺伝子産物に対する低分子パートナーを同定する方法であって、
請求項1に記載のアレイを提供する工程であって、該アレイはイソシアネート由来のリンカーまたはイソチオシアネート由来のリンカーを介して支持体に結合した低分子のアレイを含み、該低分子のアレイは1cm2あたり少なくとも100スポットの密度を有する工程と;
該アレイを生体分子のライブラリーに接触させる工程と;
特定の組み換えタンパク質と低分子パートナーとの結合を決定する工程と、
を含む、方法。 - 前記生体分子のライブラリーがタンパク質のライブラリーである、請求項44に記載の方法。
- 前記生体分子のライブラリーが組み換えタンパク質のライブラリーである、請求項44に記載の方法。
- 前記生体分子のライブラリーが細胞溶解産物である、請求項44に記載の方法。
- イソシアネート部分で誘導体化された固体支持体を含む、固体支持体。
- イソチオシアネート部分で誘導体化された固体支持体を含む、固体支持体。
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