JP6631771B2 - 微生物分析装置及び微生物分析方法 - Google Patents

Description

この発明は、微生物の挙動を分析する微生物分析装置及び微生物分析方法に関する。

微生物の化学物質への感受性、特に薬剤への感受性を調べるものとして、例えば特許文献１に記載した薬剤感受性試験がある。薬剤感受性試験は、薬剤を含む培地又は濾紙に、一定量の微生物を接種して一定時間培養後に、その発育の有無や増殖具合から微生物の薬剤への感受性を調べるものである。

特開２０１３−２５５４４５号公報

しかしながら、上述の薬剤感受性試験は、半日〜１日程度、微生物の種類によってはそれ以上の培養時間が必要になるので、分析に時間がかかるという問題がある。また、上述の薬剤感受性試験は、微生物の培養過程を観察するものではないので、培養中の微生物の挙動を分析することはできない。

本発明は上述した課題に鑑み、分析にかかる時間を短縮することができるとともに、培養中の微生物の挙動を分析することができる新たな微生物分析装置及び微生物分析方法を提供することをその主たる課題とするものである。

本発明の微生物分析装置は、微生物が付着するとともに、サンプルが流れるマイクロ流路と、前記マイクロ流路を動画で撮像する撮像部と、前記撮像部により得られた動画から、前記微生物の挙動を分析する分析部とを備え、前記分析部が、前記撮像部が前記マイクロ流路に前記サンプルを流している状態で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の前記微生物の挙動を分析するものであることを特徴とする。

このようなものであれば、分析部が、撮像部がマイクロ流路にサンプルを流している状態で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の微生物の挙動を分析するので、例えばサンプルを流した直後から微生物の挙動を観察することができ、微生物を培養する培養時間を待つ必要がなく、分析にかかる時間を短縮することができるとともに、培養中の微生物の挙動を観察することができる。
また、複数の微生物の挙動を分析することによって、微生物の個体差によるばらつきを取り除くことができるので、より精確な分析を行うことができる。

本発明の微生物分析装置の具体的な一態様としては、前記マイクロ流路が、前記撮像部に撮像される被撮像領域と、前記被撮像領域の上流及び下流に接続されて、前記被撮像領域の流路幅よりも小さい流路幅を有する接続領域とを備えるものを挙げることができる。

マイクロ流路を流れるサンプルの流速によっては、微生物の挙動が止まってしまうので、このようなマイクロ流路を用いた分析装置では、サンプルの流速が微生物の挙動を止めない程度に緩やかとなる安定状態になるまで待つ必要がある。しかし、本発明の微生物分析装置は、マイクロ流路が、撮像部に撮像される被撮像領域と、被撮像領域の上流及び下流に接続されて被撮像領域よりも小さい流路幅を有する接続領域とを備えるので、被撮像領域を流れるサンプルの流速を、接続領域を流れるサンプルの流速に比べて遅くすることができる。そのため、被撮像領域に存在する微生物の挙動を止めることなく、サンプルを流している状態であっても分析を行うことができるので、上述した安定状態となるまで待つ必要がなく、分析にかかる時間を確実に短縮することができ、これまで分析できなかった初期応答の分析を可能にすることができる。

本発明の分析装置の具体的な別の一態様としては、前記微生物が細菌、特に大腸菌であり、前記分析部が前記細菌が回転する回転挙動、特に前記単位領域に含まれる複数の前記大腸菌のうち、時計回りの回転挙動をしているもの、又は反時計回りの回転挙動をしているものの割合を分析するものを挙げることができる。

細菌、例えば大腸菌等は走化性を有し、大腸菌にとって好ましい物質（誘引物質）であれば反時計回りに回転し、大腸菌によって好ましくない物質（忌避物質）であれば時計回りに回転する。
そのため、単位領域に含まれる全ての大腸菌のうち、時計回りの回転挙動をしているもの、又は反時計回りの回転挙動をしているものの割合を分析部で分析すれば、例えばその割合から、サンプルを特定する等といった微生物をセンサとして使用するセンシングも可能となり、新たな知見を得ることができる。

また、微生物が付着したマイクロ流路にサンプルを流している状態を撮像部で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の前記微生物の挙動を分析することを特徴とする微生物分析方法も本発明のひとつである。

本発明によれば、分析にかかる時間を短縮することができるとともに、培養中の微生物の挙動を分析することができる。

本実施形態における分析装置の斜視図。 本実施形態におけるマイクロ流路が形成されたセルの斜視図。 本実施形態におけるマイクロ流路のＡＡ線断面図。 本実施形態におけるマイクロ流路の平面図。 本実施形態における撮像部が撮像した撮像画像。 本実施形態における分析部が作成したグラフ。

本発明の微生物分析装置の一実施形態について、以下図面を参照しながら説明する。

本実施形態における微生物分析装置１は、例えば、大腸菌やコレラ菌等の細菌や真核生物等の微生物の分析を行うものであって、図１に示すように、微生物が付着するとともに、サンプルが流れるマイクロ流路２と、マイクロ流路２を動画で撮像する撮像部３と、撮像部３により得られた動画から、微生物の挙動を分析する分析部４とを備えるものである。

マイクロ流路２は、例えば細菌等の微生物が付着するとともに、この微生物が付着した状態でサンプルを流すものであって、図２に示すように、半導体微細加工技術等によってＰＤＭＳ、シリコン等のセル５に複数形成された略長片形状の流路である。

以下、マイクロ流路２について詳述する。
マイクロ流路２は、図３に示すように、その両端部に、サンプルを導入又は導出するための導入孔２ａ、導出孔２ｂがそれぞれ設けられており、導入孔２ａから導入孔２ａまでが途切れることなく連通するものであって、サンプルが流れる方向に対して垂直な方向の流路幅によって５つの領域に分けることができる。

５つの領域とは、図４に示すように、導入孔２ａが形成されてサンプルが導入される導入領域６、マイクロ流路２の略中央部に設けられて、撮像部３に撮像される被撮像領域８、導出孔２ｂが形成されてサンプルが導出される導出領域１０、導入領域６と被撮像領域８とを接続する第１接続領域７、及び、被撮像領域８と導出領域１０とを接続する第２接続領域９のことである。

そして、第１接続領域７及び第２接続領域９の流路幅は、被撮像領域８の流路幅に比べて小さくなるように構成されており、本実施形態では、被撮像領域８の流路幅は０．３ｍｍ、第１接続領域７及び第２接続領域９の流路幅は０．０４ｍｍとなるように構成されている。なお、導入領域６及び導出領域１０の流路幅は、被撮像領域８、第１接続領域７及び第２接続領域９の流路幅よりも大きくなるように構成されており、その流路幅は０.５ｍｍとなっている。また、各領域の流路の高さは数十μｍとなるように構成されている。

撮像部３は、マイクロ流路２にサンプルを流している状態でマイクロ流路２の被撮像領域８を動画で撮像し、その動画データを分析部４に送信するものであって、例えば図１に示すように、倒立顕微鏡に取り付けられたＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラを用いることができる。なお、撮像部３の構成は上述したものに限られず、例えば顕微鏡の接眼レンズに取り付けられたＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラであっても構わない。

分析部４は、撮像部３がマイクロ流路２にサンプルを流している状態で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の微生物の挙動を分析するものであって、撮像部３から送られてきた動画データを受け付けて、動画データが示す動画の所定の単位領域に含まれる複数の微生物の挙動を統計するものであり、構造的には、ＣＰＵ、内部メモリ、Ｉ／Ｏバッファ回路、ＡＤコンバータ等を有した所謂コンピュータ回路である。そして、内部メモリの所定領域に格納したプログラムに従って動作することで情報処理を行うものである。

以下、本実施形態における微生物分析装置１の分析方法について説明する。

＜マイクロ流路２の準備工程＞
まず、マイクロ流路２が形成されたセル５をオゾン処理する。その後、リン酸緩衝液等の緩衝液をピペットで採取してマイクロ流路２の導入孔２ａに落とし、手袋等をつけた指でマイクロ流路２に流し込む。

顕微鏡で、緩衝液がマイクロ流路２内の導入孔２ａから導出孔２ｂまで貫通しているか否かを確認する。そして、緩衝液が導入孔２ａから導出孔２ｂまで貫通していた場合には、導入孔２ａ又は導出孔２ｂからピペット等を用いてマイクロ流路２内の緩衝液を吸いだす。

その後、マイクロ流路に微生物を流し込むが、本実施形態では微生物として大腸菌を使用する。そして、大腸菌をピペットで採取してマイクロ流路２の導入孔２ａに落とし、手袋等をつけた指でマイクロ流路２に流し込む。

この状態でしばらく放置すると、鞭毛がマイクロ流路２に付着した大腸菌は、鞭毛が付着した位置に留まるが、鞭毛がマイクロ流路２に付着していない大腸菌は、マイクロ流路内を浮遊する。この浮遊している大腸菌を取り除くために、マイクロ流路２に再度緩衝液を流し込んで、この緩衝液をピペット等で取り除く。

以上の工程を経ることで、大腸菌が付着したマイクロ流路２を形成する。

＜撮像工程＞
次に、上述の準備工程を経て大腸菌が付着したマイクロ流路２に、例えばアミノ酸等のサンプルを流している状態で、撮像部３でマイクロ流路２の被撮像領域８を動画で撮像する。ここで、サンプルを流している状態とは、導入孔２ａへのサンプルの導入を開始した時点又は導入孔２ａへのサンプルの導入を終えた直後のことをいい、撮像部３が撮像を行う期間としては、例えば、マイクロ流路２に流した直後のサンプルの流速が徐々に低下し、ある一定の流速となるまでの期間を挙げることができるが、微生物に合わせてこの撮像期間は適宜変更することができる。

大腸菌は、特定の化学物質の濃度勾配に対して方向性を持った行動を起こす走化性を有し、好ましい物質（誘引物質）であれば反時計回りに回転し、好ましくない物質（忌避物質）であれば時計回りに回転する性質を有する。そのため、撮像部３は、サンプルを流した直後から所定時間間隔における大腸菌の時計回り又は反時計回りに回転する回転挙動、又は、大腸菌が停止している状態を動画で撮像することとなる。図５は、撮像部３で撮像した撮像画像の一例を示すものである。撮像部３で撮像された撮像データは、分析部４へと送信される。

＜分析工程＞
分析部４は、マイクロ流路２にサンプルを流している状態で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の微生物の挙動を分析するものであって、具体的には、時間とともに変化する複数の大腸菌の挙動を、いくつかの挙動パターンに分けて統計するものである。この所定の単位領域とは、撮像部３が撮像した動画に含まれる任意の領域のことをいう。

ここで、大腸菌の挙動パターンは、時計回りするもの、反時計回りするもの、静止するものの３つに大別することができるので、所定時間間隔毎に大腸菌の挙動を上記３つのパターンに分けて統計し、この結果を、縦軸に単位領域に含まれる全大腸菌のうち、時計回りの回転挙動をしているもの又は反時計回りの回転挙動をしているものの割合、横軸に時間を示すグラフ形式で、外付けのディスプレイ等に表示する。

図６は、分析部４が表示するグラフの一例であって、Ｌ−グルタミン酸１０ｍＭからなるサンプルを用いた場合に、単位領域に含まれる全大腸菌のうち、時計回りの回転挙動の割合を縦軸、時間を横軸に表したものである。

この図６に示すように、サンプルを注入した直後は、時計回りの大腸菌の割合が４０〜６０％程度存在し、その後時計回りの大腸菌の割合が０％となったあと、１５０秒が過ぎた程度から徐々に時計回りの大腸菌の割合が増加し始めて、その後、３０％〜７０％程度の割合で、時計回りの大腸菌が存在することとなる。

上述したように構成した本実施形態の微生物分析装置１は、以下のような格別の効果を奏する。

つまり、分析部４が、撮像部３がマイクロ流路２にサンプルを流している状態で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の微生物の挙動を分析するので、例えば、サンプルを流した直後から微生物の挙動を観察することができ、微生物を培養する培養時間を待つ必要がなく、分析にかかる時間を短縮することができるとともに、培養中の微生物の挙動を観察することができる。
また、複数の微生物の挙動を分析することによって、微生物の個体差によるばらつきを取り除くことができるので、より精確な分析を行うことができる。

また、マイクロ流路２が、撮像部３に撮像される被撮像領域８と、被撮像領域８の上流及び下流に接続されて被撮像領域８よりも小さい流路幅を有する第１接続領域７及び第２接続領域９とを備えるので、被撮像領域８を流れるサンプルの流速を、第１接続領域７及び第２接続領域９を流れるサンプルの流速に比べて遅くすることができる。そのため、微生物の挙動を止めることなく、サンプルを流している状態で撮像を行うことができるので、分析にかかる時間を確実に短縮することができ、これまで分析できなかった初期応答の分析を可能にすることができる。

さらに、上記実施形態では微生物として大腸菌を用いているが、大腸菌は、走化性を有し、大腸菌にとって好ましい物質（誘引物質）であれば反時計回りに回転し、大腸菌によって好ましくない物質（忌避物質）であれば時計回りに回転するので、サンプル毎に相違する時間変化に伴う大腸菌の時計回り又は反時計回りの回転挙動の割合を分析部４で分析すれば、例えば、時間変化に伴う微生物の時計回り又は反時計回りの回転挙動の割合を把握しただけで、サンプルを特定する等といった大腸菌をセンサとして使用するセンシングも可能となり、新たな知見を得ることができる。

本発明は上記実施形態に限られたものではない。

マイクロ流路は上記実施形態に限られたものではなく、例えば所定の流路幅を有する長片形状のものを用いてもよい。このとき、サンプルが流れる流速は流路幅が小さくなるほど早くなるので、微生物の挙動が止まらない程度の流速になるように流路幅を微生物に合わせて適宜変更することができる。

また、撮像部も上記実施形態に限られることなく、適宜微生物やサンプルに合わせて変更することができる。

本発明は、その他その趣旨に反しない範囲で様々な変形が可能である。

１・・・分析装置
２・・・マイクロ流路
３・・・撮像部
４・・・分析部

Claims (5)

1. 微生物が付着するとともに、サンプルが流れるマイクロ流路と、
   前記マイクロ流路を動画で撮像する撮像部と、
   前記撮像部により得られた動画から、前記微生物の挙動を分析する分析部とを備え、
   前記分析部が、前記撮像部が前記マイクロ流路に前記サンプルを流している状態で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の前記微生物の挙動を分析するものであり、
   前記マイクロ流路が、前記撮像部により撮像される被撮像領域と、該被撮像領域を流れるサンプルの流速を調節する接続領域とを備えることを特徴とする微生物分析装置。
2. 前記マイクロ流路が、前記撮像部に撮像される被撮像領域と、前記被撮像領域の上流及び下流に接続されて、前記被撮像領域の流路幅よりも小さい流路幅を有する接続領域とを備えることを特徴とする請求項１記載の分析装置。
3. 前記微生物が、細菌であり、
   前記分析部が、前記細菌が回転する回転挙動を分析することを特徴とする請求項１又は２記載の分析装置。
4. 前記微生物が、大腸菌であり、
   前記分析部が、前記単位領域に含まれる複数の前記大腸菌のうち、時計回りの回転挙動をしているもの、又は反時計回りの回転挙動をしているものの割合を分析するものであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の分析装置。
5. 微生物が付着したマイクロ流路にサンプルを流している状態を撮像部で撮像した動画の所定の単位領域に含まれる複数の前記微生物の挙動を分析することを特徴とする微生物分析方法であって、
   前記マイクロ流路が、前記撮像部により撮像される被撮像領域と、該被撮像領域を流れるサンプルの流速を調節する接続領域とを備えることを特徴とする微生物分析方法。