DE69915468T2 - Photon Dämpfer für Fluoreszenzassays - Google Patents

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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft hauptsächlich Verfahren und Zusammensetzungen zur Reduktion von unerwünschtem Licht von einer Assayprobe, insbesondere Fluoreszenzassays in lebenden Zellen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Zellbasierte Assays werden üblicherweise zur Arzneimittelentdeckung verwendet, um eine große Anzahl von Testchemikalien auf potentielle therapeutische Wirksamkeit zu screenen. Typischerweise enthalten die Zellen ein Ziel, wie ein Protein. Testchemikalien, wie Kandidaten-Liganden für ein Zielprotein, werden auf modulierende Aktivität eines Ziels gescreent. Das Screenen basiert auf einer nachweisbaren Veränderung einer Eigenschaft der Zelle, die zuverlässig Zielaktivität in Anwesenheit einer Testchemikalie anzeigt. Viele Assays verwenden optische Verfahren, um solche Aktivitäten nachzuweisen. Fluoreszenz-Nachweisverfahren sind diesbezüglich besonders wirksame Werkzeuge, da Fluoreszenz-Nachweisverfahren empfindlich sein können. Viele verschiedene Typen von Fluoreszenzsonden sind für solche Assays erhältlich, einschließlich Fluoreszenzsonden, die als Enzymsubstrate, Markierungen für Proteine und Nukleinsäuren, Indikatoren für intrazelluläre Ionen und Sensoren von Membranspannung wirken.
  • US-PS 5,661,035 beschreibt Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung in der Erzeugung von schnellen ratiometrischen spannungssensitiven Fluoreszenzveränderungen in einzelnen oder multiplen Zellsystemen. US-PS 5,434,088 betrifft einen Immunassay, wobei eine Zielsubstanz durch einen Sandwich-Immunassay nachgewiesen wird unter Verwendung eines Feinpartikels, das an einen Fluoreszierer gebunden ist, und eines anderen Feinpartikels, das an einen Quencher gebunden ist, und eines Antikörpers, der spezifisch mit der Zielsubstanz reagiert durch eine andere antigene Determinante. Weiterhin betrifft US-PS 5,027,473 ein Verfahren eines trennungsfreien Festphasen-Immunassays eines Analyten, der in Kontakt bringen eines Antianalyten, der an die Oberfläche einer festen Stütze gebunden ist, mit einem Analyten, ein lichtabsorbierendes Material und einen Tracer für den Analyten, der eine Markierung enthält, einschließt. EP 0 270 206 betrifft einen Immunassay, wobei die Probe mit einem beweglichen Festphasen-Trägermaterial in Kontakt gebracht wird.
  • US-PS 5,670,113 stellt eine automatisierte Messvorrichtung und Verfahren zum automatisierten Arzneimittel-Screening und zur Untersuchung von Ionenkanal- und Zelloberflächenaktivität zur Verfügung. WO 98/55231 und WO 99/42608 betreffen Platten mit vielen Vertiefungen und Plattformen, die eine Schicht geringer Fluoreszenz und hoher Durchlässigkeit umfassen.
  • Trotz der neuesten Fülle von erhältlichen Fluoreszenzwerkzeugen für Assays können Fluoreszenz basierte Assays von unerwünschten und manchmal intolerablen Spiegeln von Hintergrund-Fluoreszenz beeinträchtigt sein. Beispielsweise kann Lösungsfluoreszenz die Hintergrund-Fluoreszenz der Assayprobe steigern. Lösungsfluoreszenz kann ein gewünschtes Signal, das mit einer Fluoreszenzsonde assoziiert ist, verdecken. Lösungsfluoreszenz kann aus vielen Quellen entstehen, einschließlich fluoreszierendem Sondenabbau, Zielen, Zellen, verschiedenen Lösungsbestandteilen und Testchemikalien.
  • In zellbasierten Assays, die kürzlich von einem der Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden, führt Lösungsfluoreszenz zu einem geringeren Verhältnis vom Signal zum Rauschen. Diese zellbasierten Assays verwenden ein membrandurchlässiges Substrat, das spezifisch für Beta-Lactamase ist, ein bakterielles Enzym, das normalerweise nicht in Säugerzellen exprimiert wird. Das Substrat difundiert in die Zelle und wird in der Zelle durch die Wirkung von intrazellulären Esterasen gefangen gehalten. Wen eine Zelle ein Beta-Lactamase Reportergen exprimiert, spaltet das exprimierte Enzym das Substrat. Vor der Spaltung fluoresziert das Substrat grün und nach der Spaltung fluoresziert das Substrat blau. Werden solche Assays für Screenings mit hohem Durchsatz verwendet, so kann die Steigerung des Verhältnisses vom Signal zum Rauschen vorteilhaft sein, da es die Empfindlichkeit des Screening-Systems und die Zuverlässigkeit der Daten erhöht. Allerdings durchkreuzt Lösungsfluoreszenz häufig das Erreichen eines vorteilhaften Verhältnisses vom Signal zum Rauschen. Lösungsfluoreszenz von Testchemikalien, dem Substrat in der Lösung und anderen Lösungsbestandteilen, die die Zelle umgebe, tragen zu Hintergrundfluoreszenz bei.
  • Die derzeitigen Erfinder erkannten, dass Membrankompartiment-Assays, wie zellbasierte Assays, die optische Verfahren verwenden, durch Reduktion von unerwünschtem Licht, das von der Lösung, die die Membrankompartimente umgibt, emittiert wird, insbesondere Lösungsfluoreszenz, verbessert werden können. Die derzeitigen Erfinder untersuchten verschiedene Wasch- und Inkubationsverfahren in einem Versuch, um Farbstoffbeladung und Zurückhaltung zu steigern, während Lösungsfluoreszenz reduziert wurde. Obwohl die Erfinder Lösungsfluoreszenz reduzieren konnten, waren solche Manipulationen aufwändig und zeitraubend.
  • Deshalb entwickelten die derzeitigen Erfinder Zusammensetzungen und Verfahren zur Reduktion der Emission von unerwünschtem Licht aus Lösungen in Membrankompartiment-Assays, die nicht allein auf Wasch- und Inkubationsverfahren beruhen. Solche Zusammensetzungen und Verfahren sind viel leichter anwendbar auf Screening-Systeme mit hohem Durchsatz als Verbesserungen von Wasch- und Inkubationsverfahren.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1A ist eine Darstellung der Fluoreszenzemission von einer Lösung ohne Photon-reduzierendes Mittel.
  • 1B ist eine Darstellung einer Fluoreszenzemission einer Lösung mit einem Photon-reduzierenden Mittel.
  • 2 zeigt die Fähigkeit von Phenol-Rot, die Emission von Fluoreszenz aus einer Lösung, die Coumarin enthält, zu reduzieren.
  • 3 zeigt die Fähigkeit von Phenol-Rot, die Emission von Fluoreszenz von einer Lösung, die Coumarin in Anwesenheit und Abwesenheit von Methanol enthält, zu reduzieren.
  • 4 zeigt die Abhängigkeit der Emission von Fluoreszenz von einer Lösung von der Konzentration eines Kandidaten eines Photon-reduzierenden Mittels.
  • 5 zeigt die Abhängigkeit der Emission von Fluoreszenz von einer Lösung, die Coumarin in Anwesenheit von verschiedenen Photon-reduzierenden Mitteln enthält.
  • 6 zeigt die Abhängigkeit von Emission von Fluoreszenz von einer Lösung, die Fluorescein in der Anwesenheit von verschiedenen gefärbten Photon-reduzierenden Mitteln enthält.
  • 7 zeigt die Abhängigkeit der Emission von Fluoreszenz von einer Lösung, die Rhodamin in Anwesenheit von verschieden gefärbten Photon-reduzierenden Mitteln enthält.
  • 8 zeigt die restliche CCF2-Lösungsfluoreszenz als eine Funktion der Konzentration von gefärbtem Photon-reduzierendem Mittel.
  • 9A, 9B und 9C zeigen die Reduktion von Lösungsfluoreszenz unter Verwendung von nicht-farbstoffbasierten Photonmitteln, die elektronisch mit einem Photon-reduzierenden Mittel interagieren.
  • 10A, 10B und 10C zeigen, dass Coumarin-Fluoreszenz durch Phenol-Rot bei verschiedenen Pfadlängen abgeschwächt wird.
  • 11 zeigt, dass das Photon-reduzierende Mittel die Fluoreszenzemission in nicht-gewaschenen Zellen reduzieren und Signale vergleichbar mit Signalen von gewaschenen Zellen erreichen.
  • 12 fasst die Ergebnisse der Toxizitätstests eines Photon-reduzierenden Mittels zusammen.
  • 13 zeigt die Fähigkeit von Zellen, die mit Photon-reduzierenden Mitteln behandelt wurden, Beta-Lactamase nach Stimulation mit einem geeignetem Agonisten zu exprimieren.
  • 14A und 14B zeigen, dass Sätze Photon-reduzierender Mittel unerwünschte Fluoreszenz besser als ein Einzelfarbstoff-basierte Photon-reduzierende Mittel, reduzieren können.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Reduktion von Lichtemission, wie unerwünschtes Licht von einer Probe, wie einer Lösung, zur Verfügung. Das Verfahren kann bei Fluoreszenzassays verwendet werden, die häufig von Lösungsfluoreszenz, die mit dem Nachweis eines gewünschten Signals von einer Probe interferiert, behindert werden. Membrankompartiment-basierte Assays, wie zellbasierte Assays, zeigen typischerweise unerwünschte Hintergrundfluoreszenz von Sonden, Testchemikalien oder anderen Lösungsbestandteilen, die mit dem gewünschten Signalnachweis interferieren. Um diese Probleme zu lösen, entwickelten die Erfinder ein Verfahren, um unerwünschtes Licht zu reduzieren, das von einer Probe emittiert wurde, durch Zusatz eines Photon-reduzierenden Mittels zu der Probe. Diese Verfahren können beispielsweise verwendet werden, um eine Chemikalie mit einer biologischen Aktivität zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung schließt auch eine therapeutische Zusammensetzung ein, die durch solche Verfahren identifiziert wurde, und ein System, um solche Verfahren durchzuführen und eine Chemikalie mit einer toxikologischen oder Bio-Verfügbarkeitsaktivität zu identifizieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung von Bedeutung zur Verfügung, die ein Membrankompartiment umfasst, das in physikalischem oder optischem Kontakt mit einer festen Oberfläche ist, so wie eine Oberfläche, die Licht durchlassen kann, und eine wässrige Lösung mit wenigstes einem Photon-reduzierenden Mittel. Die feste Oberfläche kann beispielsweise eine Vertiefung oder eine Plattform mit vielen Vertiefungen sein, wie eine Mikrotiterplatte. Optional muss das Membrankompartiment nicht in Kontakt mit einer festen Oberfläche sein. In diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Membrankompartiment in einem Tropfen oder Tröpfchen sein, wie sie während FACS-Verfahren erzeugt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Kit zur Verfügung, der nützlich zur Reduktion von unerwünschtem Licht in einer Probe ist. Der Kit schließt ein Trägermittel ein, das einen oder mehrere Behälter enthält, umfassend einen ersten Behälter, der ein Photon-reduzierendes Mittel enthält.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • DEFINITIONEN
  • Falls nicht anders definiert, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, die sie normalerweise für einen Fachmann auf dem Gebiet zu dem die Erfindung gehört, hat. Allgemein ist die hier verwendete Nomenklatur und sind die Laborverfahren in Spektroskopie, Arzneimittelentdeckung, Zellkultur und Molekulargenetik, die nachstehend beschrieben sind, auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden normalerweise verwendet. Standardtechniken werden typischerweise für Signalnachweis, rekombinante Nukleinsäureverfahren, Polynukleotid-Synthese und mikrobielle Kultur und Transformation (z. B. Elektroporation und Lipofektion) verwendet. Die Techniken und Verfahren werden allgemein durchgeführt gemäß herkömmlicher Verfahren auf dem Fachgebiet und verschiedener allgemeiner Referenzen (vgl. allgemein Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Labroratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; und Lakowicz, J. R. Principles of Flurescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983)) für Fluoreszenztechniken), die durch dieses Dokument zur Verfügung gestellt werden. Standardtechniken werden für chemische Synthesen, chemische Analysen und biologische Assays verwendet. Wie in der Offenbarung verwendet, sollen die folgenden Ausdrücke so verstanden werden, dass sie die folgenden Bedeutungen haben, falls nicht anders angezeigt:
  • „Fluoreszierende Donorgruppe" bezieht sich auf ein Radikal einer Fluoreszenzverbindung, das Energie absorbieren kann, und in der Lage ist, die Energie auf einen Akzeptor zu transferieren, wie eine andere Fluoreszenzverbindung oder einen anderen Teil der Fluoreszenzverbindung. Geeignete Donor Fluoreszenzverbindungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Coumarine und verwandte Farbstoffe, Xanthen-Farbstoffe, wie Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyan-Farbstoffe, Bimane, Acridine, Isoindole, Dansyl-Farbstoffe, Aminophthal-Hydrazine, wie Luminol- und Isoluminol-Derivate, Aminophthalimide, Aminonaphthalimide, Aminobenzofurane, Aminoquinoline, Dicyanohydroquinone und fluoreszierende Europium- und Terbium-Komplexe und verwandte Verbindungen.
  • „Quencher" bezieht sich auf ein Molekül oder einen Teil einer Verbindung, das (der) in der Lage ist, die Emission von einer fluoreszierenden Gruppe zu reduzieren. Diese Reduktion schließt die Reduktion des Lichts nach der Zeit, wenn ein Photon normalerweise von einer fluoreszierenden Gruppe emittiert wird, ein. Quenching kann durch jeden von verschiedenen Mechanismen auftreten, einschließlich Fluoreszenzresonanz-Energietransfer, fotoinduzierter Elektronentransfer, paramagnetische Verstärkung von Intersystemkreuzung, Dexter-Austauschkopplung und Anregungskopplung, wie die Bildung von Dunkelkomplexen.
  • „Akzeptor" bezieht sich auf einen Quencher, der durch Energietransfer arbeitet. Akzeptoren können die transferierte Energie als Fluoreszenz re-emittieren. Beispiele von Akzeptoren schließen Coumarine und verwandte Fluorophoren, Xanthene, wie Fluoresceine, Rhodole und Rhodamine, Resorufine, Cyanine, Difluoroboradiazaindazene und Phthalocyanine ein. Andere chemische Klassen von Akzeptoren re-emittieren die transferierte Energie im Allgemeinen nicht. Beispiele schließen Indigo, Benzoquinone, Anthraquinone, Azo-Verbindungen, Nitro-Verbindungen, Indoaniline und Di- und Tri-Phenylmethane ein.
  • „Bindepaar" bezieht sich auf zwei Gruppen (z. B. chemisch oder biochemisch), die eine Affinität füreinander haben. Beispiele von Bindepaaren schließen Antigen/Antikörper, Lektin/Avidin, Target-Polynukleotid/Sonden-Oligonukleotid, Antikörper/Anti-Antikörper, Rezeptor/Ligand, Enzym/Ligand und dergleichen ein. „Ein Mitglied eines Bindepaars" bezieht auf eine Gruppe des Paars, wie ein Antigen oder Ligand.
  • „Farbstoff" bezieht sich auf ein Molekül oder einen Teil einer Verbindung, das (der) Lichtfrequenzen absorbiert, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf ultraviolettes Licht. Die Ausdrücke „Farbstoff" und „Chromophore" sind Synonyme.
  • „Fluorphore" bezieht sich auf eine Chromophore, die fluoresziert.
  • „Membrandurchdringendes Derivat" bezieht sich auf ein chemisches Derivat einer Verbindung, die gesteigerte Membrandurchlässigkeit hat, verglichen mit einer nicht-derivatisierten Verbindung. Beispiele schließen Ester-, Ether- und Carbamat-Derivate ein. Diese Derivate sind besser in der Lage durch die Zellmembranen zu dringen (d. h. membrandurchdringend), da hydrophile Gruppen maskiert sind, um hydrophobere Derivate zu Verfügung zu stellen. Es werden auch Maskierungsgruppen konstruiert, um von einem Vorläufer (z. B. einem fluorogenen Substratvorläufer) in einer Zelle abgespalten zu werden, um das abgeleitete Substrat intrazellulär zu erzeugen. Da das Substrat hydrophiler ist als das membrandurchdringende Derivat, wird es in der Zelle gefangen. Membrandurchdringend und nicht-membrandurchdringend sind relative Ausdrücke, basierend auf den Permeabilitätscharakteristika einer Verbindung und einem chemischen Derivat davon.
  • „Isoliertes Polynukleotid" bezieht sich auf ein Polynukleotid eines genomischen, cDNA- oder synthetischen Ursprungs oder eine Kombination davon, wobei das „isolierte Polynukleotid" aufgrund seines Ursprungs (1) nicht mit der Zelle, in der das „isolierte Polynukleotid" in der Natur gefunden wird, assoziiert ist, oder (2) funktionell verbunden ist mit einem Polynukleotid, das nicht mit ihm in der Natur verbunden ist.
  • „Isoliertes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das durch cDNA, rekombinante RNA oder eine synthetische Nukleinsäure oder eine Kombination davon kodiert ist, wobei das „isolierte Protein" aufgrund seines Ursprungs (1) nicht mit Proteinen assoziiert ist, mit denen es in der Natur normalerweise gefunden wird, (2) es aus einer Zelle isoliert ist, in der es normalerweise vorkommt, (3) es frei von anderen Proteinen aus der gleichen zellulären Quelle isoliert ist (z. B. frei von humanen Proteinen), (4) es von einer Zelle einer anderen Spezies exprimiert wird oder (5) es nicht in der Natur vorkommt. „Isoliertes, natürlich vorkommendes Protein" bezieht sich auf ein Protein, das aufgrund seines Ursprungs als „isoliertes, natürlich vorkommendes Protein" (1) nicht mit Proteinen assoziiert ist, mit denen es normalerweise in der Natur gefunden wird oder (2) es isoliert ist aus der Zelle, in der es normalerweise vorkommt, oder (3) es frei von anderen Proteinen aus der gleichen zellulären Quelle isoliert wurde, z. B. frei von humanen Proteinen.
  • „Polypeptide", wie hier verwendet, ist ein allgemeiner Ausdruck, der sich auf ein natives Protein, Fragmente oder Analoga einer Polypeptidsequenz bezieht. Somit sind natives Protein, Fragmente und Analoga Spezies des Polypeptid-Genus.
  • „Natürlich vorkommend", wie hier verwendet, wie angewendet auf ein Objekt, bezieht sich auf den Fakt, dass ein Objekt in der Natur gefunden werden kann. Beispielsweise ein Polypeptid oder eine Polynukleotidsequenz, die in einem Organismus vorkommt (einschließlich Viren), das (die) von einer Quelle in der Natur isoliert werden kann und das (die) nicht vorsätzlich vom Menschen im Labor modifiziert wurde, ist natürlich vorkommend.
  • „Funktionell verbunden" bezieht sich auf eine Nebeneinanderstellung, wobei die Bestandteile, die so beschrieben sind, in einer Verbindung stehen, die es ihnen erlaubt, in der vorgesehenen Weise zu funktionieren. Beispielsweise ist eine Kontrollsequenz „funktionell verbunden" mit einer kodierenden Sequenz (z. B. ligiert) so dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind, so wie wenn die geeigneten Moleküle (z. B. Induktoren und Polymerasen) an die Kontroll- oder regulatorische Sequenz(en) gebunden sind.
  • „Kontrollsequenz" bezieht sich auf Polynukleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression von kodierenden und nicht-kodierenden Sequenzen zu bewirken, an die sie gebunden sind (z. B. ligiert). Die Natur solcher Kontrollsequenzen ist unterschiedlich, abhängig von dem Wirtsorganismus. In Eukaryonten enthalten solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Verstärker, Promotoren, ribosomale Bindestellen und Transkriptionsterminationssequenzen. In Prokaryonten enthalten solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotoren und eine Transkriptionsterminationssequenz. Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" soll mindestens Bestandteile enthalten, deren Anwesenheit die Expression eines Gens beeinflussen kann, und kann zusätzliche Bestandteile einschließen, deren Anwesenheit vorteilhaft ist, beispielsweise Leader-Sequenzen und Fusionspartnersequenzen (z. B. Sequenzen, die ein Fusionsprotein kodieren).
  • „Polynukleotid" bezieht sich auf eine polymere Form von Nukleotiden, die wenigstens 10 Basen lang sind, entweder Ribonukleotide oder Deoxynukleotide oder eine modifizierte Form von beiden Nukleotidtypen. Der Ausdruck schließt Einzel- und Doppelstrangformen von DNA ein.
  • „Entsprechen" bezieht sich auf eine Sequenz, die homolog ist (d. h. identisch ist, nicht streng evolutionär verbunden) zu der gesamten oder einem Teil einer Referenzsequenz.
  • „Membrankompartiment" bezieht sich auf ein semi-permeables Material (z. B. eine biologische Membran, ein Vesikel, eine Zelle (z. B. prokaryotisch oder eukaryotisch, wie zum Beispiel Säuger, wie zum Beispiel menschlich), Liposom, Hülle eines Virus oder dergleichen, das ein Volumen einer wässrigen Flüssigkeit, wie eine intrazelluläre Flüssigkeit, umgibt.
  • „Modulation" bezieht sich auf die Fähigkeit, entweder eine funktionelle Eigenschaft einer biologischen Aktivität oder eines Prozesses (z. B. Enzymaktivität oder Rezeptorbindung) zu verstärken oder zu inhibieren. Solche Verstärkung oder Inhibierung kann von dem Auftreten eines spezifischen Ereignisses, wie Aktivierung eines Signaltransduktionswegs, abhängen und kann sich nur in bestimmten Zelltypen zeigen.
  • Der Ausdruck „Modulator" bezieht sich auf eine chemische Verbindung (natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend), wie ein biologisches Makromolekül (z. B. Nukleinsäure, Protein, Nicht-Peptid oder organisches Molekül) oder einen Extrakt, hergestellt aus biologischen Materialien, wie Bakterien, Pflanzen, Pilzen oder Tieren (insbesondere Säuger, einschließlich Mensch), Zellen oder Gewebe. Modulatoren werden aufgrund ihrer potentiellen Aktivität als Inhibitoren oder Aktivatoren (direkt oder indirekt) eines biologischen Verfahrens oder Verfahren bewertet (z. B. Agonist, Teil-Antagonist, Teil-Agonist, inverser Agonist, Antagonist, antineoplastisches Mittel, zytotoxisches Mittel, Inhibitoren der neoplastischen Transformation oder Zellproliferation, zellproliferationsfördernde Mittel und dergleichen) durch Einschließen in Screening-Assays, die hier beschrieben sind. Die Aktivität eines Modulators kann bekannt sein, unbekannt oder teilweise bekannt.
  • Der Ausdruck „Testchemikalie" bezieht sich auf eine Chemikalie, die durch ein oder mehrere Screening-Verfahren der Erfindung als möglicher Modulator getestet werden soll. Eine Testchemikalie kann jede Chemikalie sein, wie eine anorganische Chemikalie, eine organische Chemikalie, ein Protein, ein Peptid, ein Kohlenhydrat, ein Lipid oder eine Kombination davon.
  • Die Ausdrücke „Markierung" oder „markiert" beziehen sich auf den Einbau eines nachweisbaren Markers. Beispielsweise durch Inkorporation einer radioaktiv markierten Aminosäure oder Anheftung von Biotinyl-Gruppen an ein Polypeptid, das durch markiertes Avidin nachgewiesen werden kann (z. B. Strepavidin, enthaltend einen fluoreszierenden Marker oder enzymatische Aktivität, die nachgewiesen werden kann durch optische oder kolorimetrische Verfahren). Verschiedene Verfahren zur Markierung von Polypeptiden und Glykoproteinen sind auf dem Fachgebiet bekannt und können verwendet werden. Beispiele für Markierungen von Polypeptiden schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf die folgenden: Radioisotope (z. B. H3, C14, S35, I125, I131), fluoreszierende Markierungen (z. B. FITC, Rhodamin, Lanthanidphosphor), enzymatische Markierungen oder ein Produkt eines Reportergens (z. B. Meerrettich-Peroxidase, Beta-Galaktosidase, Beta-Lactamase, Luziferase und alkalische Phosphatase), andere Markierungen, wie chemilumineszierende Markierungen, Biotinyl-Gruppen oder vorbestimmte Polypeptidepitope, die von einem sekundären Reporter erkannt werden (z. B. Leucin-Zipper-Paarsequenzen, Bindestellen für sekundäre Antikörper, Metallbindedomänen und Epitopmarkierungen). In einigen Ausführungsformen werden Markierungen durch Spacer-Arme angehängt von verschiedener Länge, um die potentielle sterische Behinderung zu reduzieren.
  • „Fluoreszierende Markierung" bezieht sich auf eine fluoreszierende Gruppe, die auf oder in eine chemische Struktur eingebaut ist, die die gewünschten Eigenschaften besitzt, wie eine Bindung mit einem Ziel oder Anheften an ein Polypeptid von Biotinyl-Gruppen, die nachgewiesen werden können durch Avidin (z. B. Streptavidin, das eine fluoreszierende Markierung enthält, oder enzymatische Aktivität, die durch Fluoreszenz-Nachweisverfahren nachgewiesen werden kann). Verschiedene Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Polypeptiden, Glykoproteinen und anderen Gruppen sind auf dem Fachgebiet bekannt und können verwendet werden. Beispiele von Markierungen für Polypeptide schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Farbstoffe (z. B. FITC und Rhodamin), intrinsische fluoreszierende Proteine und Lanthanid-Phosphore. In einigen Ausführungsformen werden Markierungen durch Spacer-Arme verschiedener Länge angehängt, um potentielle sterische Behinderungen zu reduzieren.
  • „Photon-reduzierendes Mittel" bezieht sich auf ein Molekül oder einen Partikel, wie einen kolloidalen Partikel, das die Menge von Licht, das von einem anderen Molekül in einer Probe emittiert wird, reduziert oder das die Menge von Licht, die ein anderes Molekül in einer Probe anregt, reduziert. Typischerweise reduziert ein Photon-reduzierendes Mittel die Menge von Licht, die von einem anderen Molekül in einer Probe emittiert wird dadurch, dass es ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Anregungs- oder Emissionsspektrum von einem Molekül, das Photonen erzeugt, überlappt. Alternativ können einige Photon-reduzierende Mittel in den Energietransfer eingreifen (z. B. Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)) mit einem Photon-produzierenden Mittel, das die Emission von Licht von dem Photon-produzierenden Mittel verhindert oder verändert.
  • „Photon-produzierendes Mittel" bezieht sich auf ein Molekül, das Photonen emittieren kann. Typischerweise produziert ein Photon-produzierendes Mittel Photonen durch Absorption von Licht bei einer Wellenlänge und emittiert Licht auf einer anderen Wellenlänge. Andere Photon-produzierende Mittel schließen biolumineszierende, chemilumineszierende und elektrolumineszierende Mittel ein.
  • „Reportergen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, das leicht nachweisbar ist, entweder durch seine Anwesenheit oder Aktivität, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Luziferase, grün fluoreszierendes Protein, Chloramphenicol-Acetyltransferase, Beta-Galaktosidase, sekretierte plazentale alkalische Phosphatase, Beta-Laktamase, humanes Wachstumshormon und andere sekretierte Enzym-Reporter. Im Allgemeinen kodieren Reporter-Gene ein Polypeptid, das sonst nicht von einer Wirtszelle produziert wird, das nachweisbar ist durch Analyse der Zelle oder einer Population von Zellen, z. B. durch direkte fluorometrische, radioisotope, optische oder spektrofotometrische Analyse der Zelle oder einer Population von Zellen und vorzugsweise ohne die Zellen für die Signalanalyse zu töten zu müssen. Vorzugsweise kodiert das Reportergen ein Enzym, das eine Veränderung in wenigstens einer Fluoreszenzeigenschaft von oder in der Wirtszelle erzeugt. Die wenigstens eine Fluoreszenzeigenschaft ist vorzugsweise nachweisbar durch qualitative, quantitative oder semi-quantitative Funktionsverfahren, wie dem Nachweis von transkriptioneller Aktivierung. Beispielhafte Enzyme schließen Esterasen, Phosphatasen, Proteasen (z. B. Gewebe Plasminogen Aktivator oder Urokinase) und andere Enzyme (wie Beta-Lactamase oder Luziferase oder Zuckerhydrolasen, wie Beta-Galaktosidase) ein, deren Funktion durch geeignete chromogene oder fluorogene Substrate, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, nachgewiesen werden können.
  • „Platte" bezieht sich auf eine Platte mit vielen Vertiefungen, wenn diese nicht anderweitig im Zusammenhang ihrer Verwendung modifiziert ist.
  • „Probe" bezieht sich auf jede Flüssigkeit, Feststoff, Gelee, Emulsion, Schaum oder ein Gemisch davon, das ein Membrankompartiment enthält. Eine Probe ist vorzugsweise eine wässrige Lösung, die eine Zelle enthält, wie beispielsweise eine eukaryotische Zelle, wie eine Säugerzelle, wie eine humane Zelle.
  • „Signaltransduktions-Nachweissystem" bezieht sich auf ein System zum Nachweis von Signaltransduktion über eine Zellmembran, typischerweise eine Zellplasmamembran. Solche Systeme weisen typischerweise wenigstens eine Aktivität oder physikalische Eigenschaft nach, die direkt oder indirekt mit der Signaltransduktion assoziiert ist. Die Aktivität oder physikalische Eigenschaft von entweder dem Rezeptor (z. B. GPCR) oder einem Kopplungsprotein (z. B. ein Gα-Protein) ist beispielsweise eine Aktivität oder physikalische Eigenschaft, die direkt mit der Signaltransduktion assoziiert ist. Signaltransduktions-Nachweissysteme zur Beobachtung einer Aktivität oder physikalischen Eigenschaft, die direkt mit Signaltransduktion assoziiert ist, schließt den Nachweis von GTPase-Aktivität ein und von Konformationsveränderungen von Mitgliedern des Signaltransduktionssystems. Eine Aktivität oder physikalische Eigenschaft, die indirekt mit Signaltransduktion assoziiert ist, ist die Aktivität oder physikalische Eigenschaft, die durch ein anderes Molekül als den Rezeptor (z. B. GPCR) oder ein Kopplungsprotein (z. B. ein Gα-Protein) assoziiert mit Rezeptor (z. B. GPCR) oder einem Kopplungsprotein (z. B. ein Gα-Protein) produziert wird. Solche indirekten Aktivitäten und Eigenschaften schließen Veränderung in dem intrazellulären Spiegel von Molekülen ein (z. B. Ionen (z. B. Ca++, Na+ oder K+), Second-Messenger Spiegel (z. B. cAMP, cGMP und Inositolphosphat)), Kinaseaktivitäten, transkriptionelle Aktivitäten, enzymatische Aktivität, Phospholipase Aktivitäten, Ionenkanal-Aktivitäten und Phosphatase- Aktivitäten. Signaltransduktions-Nachweissysteme zur Beobachtung einer Aktivität oder physikalischen Eigenschaft, die indirekt mit Signaltransduktion assoziiert sind, schließen beispielsweise transkriptionell basierte Assays, enzymatische Assays, intrazelluläre Ionen-Assays und Second-Messenger Assays ein.
  • „Lösungsfluoreszenz" bezieht sich auf Fluoreszenz von einer Fluorophore in einer Lösung. Beispielsweise kann die Fluorophore eine Testchemikalie (oder ein Bestandteil assoziiert mit der Testverbindung oder ein Bestandteil des Messsystems selbst) in einem Assay-Puffer sein. Lösungsfluoreszenz ist ein Bestandteil der Hintergrundfluoreszenz. Hintergrundfluoreszenz kann von anderen Quellen stammen, wie Assay-Gefäßen (z. B. Mikrotiterplatten), optische Relais-Systeme und Rückstreuung.
  • Ein „Ziel" bezieht sich auf jede biologische Einheit, wie ein Protein, Zucker, Kohlenhydrat, Nukleinsäure, Lipid, eine Zelle oder eine Population von Zellen oder ein Extrakt davon, ein Vesikel oder jede Kombination davon.
  • „Transmission" bezieht sich auf die Fraktion von Einfalllicht, die durch ein Medium bei einer gegebenen Wellenlänge passiert. Das Verhältnis der Strahlungsleistung, die durch ein Medium transmittiert wird zu der Strahlungsleistung, die auf das Medium bei einer bestimmten Wellenlänge einfällt, kann betrachtet werden.
  • Andere chemische Ausdrücke werden hier gemäß der herkömmlichen Verwendung auf dem Fachgebiet verwendet, wie beispielhaft erläutert von The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Hrsg. Parker, S., 1985), McGraw-Hill, San Francisco).
  • EINLEITUNG
  • Die vorliegende Erfindung würdigt erstmals, dass der Zusatz eines Photon-reduzierenden Mittels unerwünschte Lichtemission von einer Probe verringern kann und somit das Verhältnis vom Signal zum Hintergrund eines zellbasierten Assays verbessern kann. Üblicherweise umfasst die Probe ein Membrankompartiment, das ein Photon-produzierendes Mittel enthält. Die vorliegende Erfindung erkennt auch erstmalig, dass Lösungsfluoreszenz in zellbasierten Assays reduziert werden kann durch Zusatz eines Photon-reduzierenden Mittels, wie eines Farbstoffs, zur Lösung, die die Zellen umgibt. Aspekte der Erfindung basieren teilweise auf der nicht eingängigen Erkenntnis, dass der Zusatz einer Chemikalie, die eine „Farbe" hat, Fluoreszenz-Assay Messungen durch Reduktion von Lösungsfluoreszenz verbessern kann, während die Signalfluoreszenz von einem separaten, wässrigen Kompartiment zurückgehalten wird. Die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen ein: (1) Steigern des Verhältnisses des Signals zum Hintergrund in Assays unter Verwendung von Membrankompartimenten, (2) Verringern der Assay-Schwankungen, (3) Reduzieren der Assay-Zeit, (4) Reduzieren der Assay-Manipulation (insbesondere verglichen mit Assays mit Waschschritten) und (5) Minimieren der Lösungsfluoreszenz.
  • Als eine nicht-einschränkende Einführung zum Rahmen der Erfindung schließt die Erfindung mehrere allgemeine und nützliche Aspekte ein, einschließlich:
    • (1) ein Verfahren zur Reduzierung unerwünschter Lichtemission aus einer Probe (z. B. eine biochemische oder zelluläre Probe) mit wenigstens einem Photon-produzierenden Mittel, durch Verwendung von wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel (z. B. farbstoffbasierte Photon-reduzierende Mittel),
    • (2) ein Verfahren zur Reduktion von unerwünschter Lichtemission aus einer Probe (z. B. eine biochemische oder zelluläre Probe) mit wenigstens einem Photon-erzeugenden Mittel durch Verwendung von wenigstens einem kollisionalen Quencher,
    • (3) ein Verfahren zur Reduktion von unerwünschter Lichtemission aus einer Probe (z. B. eine biochemische oder zelluläre Probe) mit wenigstens einem Photon-produzierenden Mittel durch Verwendung von wenigstens einem Quencher, wie einem elektronischen Quencher,
    • (4) ein Verfahren zum Sreenen von Testchemikalien in fluoreszierenden Assays unter Verwendung von Photon-reduzierenden Mitteln,
    • (5) Zusammensetzungen, therapeutische Zusammensetzungen und Kits zur Durchführung von (1), (2), (3), (4) und (5),
    • (6) ein System zur Identifizierung der Zusammensetzungen aus (6) und
    • (7) ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie mit toxikologischer Aktivität.
  • Diese Aspekte der Erfindung und andere, die hier beschrieben sind, können erreicht werden durch Verwendung von Verfahren und Zusammensetzungen, die hier beschrieben sind. Um das volle Verständnis des Rahmens der Erfindung zu erhalten, wird weiterhin erkannt, dass verschiedene Aspekte der Erfindung kombiniert werden könne, um wünschenswerte Ausführungsformen der Erfindung zu erhalten. Beispielsweise schließt die Erfindung ein Verfahren zur Reduktion von Hintergrundfluoreszenz unter Verwendung von farbstoffbasierten, Photon-reduzierenden Mitteln in Assays zur Identifizierung von Testchemikalien, die Zielproteine modulieren, ein. Solche Kombinationen resultieren in besonders nützlichen und stabilen Ausführungsformen der Erfindung.
  • VERFAHREN ZUR REDUKTION VON UNERWÜNSCHTER LICHTEMISSION AUS EINER PROBE UNTE VERWENDUNG VON WENIGSTENS EINEM PHOTON-REDUZIERENENDEN MITTEL
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Reduktion von unerwünschter Lichtemission aus einer Probe zur Verfügung. Dieses Verfahren kann bei Fluoreszenz-Assays verwendet werden, die häufig durch Lösungsfluoreszenz behindert werden, die mit dem Nachweis eines gewünschten Signals aus einer Probe interferieren. Zellbasierte Assays emittieren herkömmlicherweise Lösungsfluoreszenz von Sonden oder Testchemikalien, die den gewünschten Signalnachweis verdecken können. Um diese Probleme zu verhindern, haben die Erfinder ein Verfahren entwickelt, um unerwünschtes Licht, das von einer Probe emittiert wird, zu reduzieren durch Zusatz eines Photon-reduzierenden Mittels zu der Probe. Wie hier vollständiger beschrieben, bezieht sich „Photon-reduzierendes Mittel" auf ein Molekül, das die Menge von Licht von einer Probe durch ein anderes Molekül reduziert.
  • Das Verfahren umfasst die Schritte des in Kontakt bringens einer Probe mit wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel und Nachweisen eines optischen Signals von einem Photon-produzierenden Mittel. Die Probe umfasst herkömmlicherweise ein membranumschlossenes Kompartiment in Kontakt mit einer festen Oberfläche, das Licht durchdringen kann (z. B. übertragen). Das Membrankompartiment schließt normalerweise wenigstens ein Photon-produzierendes Mittel ein. Wie hier vollständiger beschrieben, bezieht sich „Photon-produzierendes Mittel" auf ein Molekül, das Licht emittiert. Das Photon-produzierende Mittel ist typischerweise entweder in dem wässrigen Inneren eines membranumschlossenen Kompartiments lokalisiert oder in Assoziation mit der Membran oder einem anderen Bestandteil des Membrankompartiments (z. B. eine zelluläre Organelle). Das Photon-reduzierende Mittel ist typischerweise in einer wässrigen Lösung lokalisiert, die die äußere Oberfläche des Membrankompartiments kontaktiert. Die wässrige Lösung, die die äußere Oberfläche kontaktiert, enthält typischerweise die Quelle oder Quellen von Licht (z. B. Photon-reduzierende Mittel), die zu unerwünschter Lichtemission von einer Probe führt. Photon-reduzierende Mittel reduzieren das emittierte Licht von einer Probe, die von Photon-produzierenden Mitteln in wässriger Lösung stammen.
  • Proben, die einer Reduktion der unerwünschten Lichtemission bedürfen, wie hier vollständiger beschrieben, sind typischerweise mit fluoreszierenden Assays assoziiert und reichen von chemischen oder biochemischen Proben (z. B. Vesikeln, die Phonton-produzierende Mittel einschließen) bis zu lebenden Zellproben (z. B. zellbasierte Assays, die Reportergene verwenden). Solche Proben haben häufig Lösungsfluoreszenz, die zu einer gesteigerten Hintergrundfluoreszenz beiträgt, die entweder die Messung eines gewünschten Signals verhindern kann oder das Verhältnis von Signal zum Hintergrund, verglichen mit dem Nachweis des Signals in Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels, reduziert.
  • Phonton-produzierende Mittel können fluoreszierende Proteine sein, wie ein Aequorea-verwandtes fluoreszierendes Protein oder eine Mutante davon (vgl. z. B. US-PS Nr. 5,625,048 von Tsien, eingereicht am 29. April 1997; WO 96/23810 von Tsien et al., veröffentlicht am 8. August 1996; WO 97/28261 von Tsien et al., veröffentlicht am 7. August 1997; WO 98/02571, veröffentlicht am 22. Januar 1998 und Wo 98/06737, veröffentlicht am 19. Februar 1998), ein fluoreszierendes oder fluorogenes enzymatisches Substrat (vgl. beispielsweise WO 96/30540 von Tsien et al., veröffentlicht am 3. Oktober 1996), ein Mitglied eines FRET-Paares oder es kann eine Spannung über eine Membran einer Zelle nachweisen (vgl. US-PS Nr. 5,661,035 von Tsien et al., eingereicht 26. August 1997) ein intrazellulärer Ionenindikator, wie Calciumionen, wie Fluo3, Fura2, Indol oder fluoreszierende Markierungen, die für spezifische Bindereaktionen verwendet werden, wie Immunoassays oder Rezeptor-Liganden-Assays.
  • Um Lösungsfluoreszenz zu reduzieren, verwendet die Erfindung ein Photon-reduzierendes Mittel. Photon-reduzierende Mittel können ausgewählt werden, um Licht von einem anderen Molekül zu reduzieren durch einen Mechanismus oder Mechanismen, die es ermöglichen, die Emission von unerwünschter Lichtemission von einer Probe zu reduzieren. Eine Klasse von Photon-reduzierenden Mitteln kann die Menge von unerwünschtem Licht, das von einer Probe emittiert wird, die ein Photon-reduzierendes Mittel umfasst, absorbieren und somit die Menge unerwünschten Lichts reduzieren.
  • Gewünschte Photon-reduzierende Mittel haben normalerweise ein Absorptionsspektrum, das mit dem Absorptions-, Anregungs- und Emissionsspektrum (oder einer Kombination davon) eines Photon-produzierenden Mittels überlappt. Alternativ kann eine weitere Klasse von Photon-reduzierenden Mitteln ein Photon-produzierendes Mittel quenchen (z. B. durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)). Andere Quenching-Mechanismen oder Mittel können verwendet werden, einschließlich Kollisional-Quenchern, elektronischem Quenching, Partikel-Quenching, Exeplex-Bildung, fotoinduzierter Elektronentransfer, paramagnetisches oder Schweratom-Quenching, das zu einer gesteigerten Intersystemkreuzung führt (vgl. Generell Principles of Fluorescence Spectroscopy von Joseph R. Lakowicz, Plenum Press 1983). Andere Photon-reduzierende Mittel sind optische Interferierer, die die Menge von Licht reduzieren, die von einem Photon-reduzierenden Mittel durch Lichtstreuung, Lichtbrechung oder Lichtreflektion emittiert werden. Beispielsweise reduzieren Partikel Lichtemissionen von einem Photon-produzierenden Mittel teilweise durch Lichtstreuung. Man weiß, dass reduzierte Lichtemission von einem Photon-produzierenden Mittel aus vielen Typen von Photon-reduzierenden Mitteln, die mit unterschiedlichen Mechanismen arbeiten, resultieren kann. Man weiß auch, dass es für bestimmte Anwendungen wünschenswert ist, Photon-reduzierende Mittel auszuwählen, die unerwünschte Lichtemission von einer Probe durch mehr als einem Mechanismus verringern, auszuwählen. Beispielsweise kann ein Photon-reduzierendes Mittel ausgewählt werden, das Lösungsfluoreszenz durch FRET reduziert und das ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorption-, Anregungs- oder Emissionsspektrum eines Moleküls, das Licht erzeugt, überlappt. Die Auswahl von (einem) Photon-reduzierenden Mittel(n) ist hier vollständiger beschrieben.
  • Typischerweise kann wenigstens ein Photon-reduzierendes Mittel in einem Fluoreszenz-Assay ausgewählt werden, das ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Emission- oder Anregungsspektrum eines Photon-produzierenden Mittels überlappt, das außerhalb eines Membrankompartiments lokalisiert ist. In einigen Fällen kann das Photon-produzierende Mittel innerhalb und außerhalb des Membrankompartiments lokalisiert sein, so wie mit einem Membran-permeablen Sensor, der aus dem Membrankompartiment austritt, in die umgebende Lösung. Ein Photon-produzierendes Mittel kann auch frei sein oder gebunden innerhalb einer Zelle, wie in einer lebenden Zelle, die keine Zellwand hat, wie eine Säugerzelle (wie eine humane Zelle). Ein Assay kann auch ein zweites Photon-produzierendes Mittel in einer wässrigen Lösung, die das Membrankompartiment umgibt, oder einer anderen Stelle als der Stelle der gewünschten Signalemission einschließen. Die Anzahl an Photon-reduzierenden Mitteln in einem Assay liegt typischerweise zwischen 1 und 5, zwischen 1 und 4, zwischen 1 und 3, zwischen 1 und 2 und kann wenigstens zwei oder mehr oder wenigstens drei oder mehr einschließen. Beispielsweise kann das erste Photon-produzierende Mittel ein Reportergensubstrat oder -produkt sein, das innerhalb einer Zelle lokalisiert ist, und das zweite Photon-produzierende Mittel kann eine Testchemikalie in der umgebenden Lösung sein.
  • Photon-reduzierende Mittel können leicht ausgewählt werden aufgrund eines Absorptionsspektrums, das mit dem Absorption-, Emissions- oder Anregungsspektrum eines Photon-produzierenden Mittels überlappt. Wie hier beschrieben, kann das Absorptionsspektrum eines Photon-reduzierenden Mittels leicht gemessen werden und verglichen werden mit einem gemessenen Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum eines bekannten oder erwarteten Photon-reduzierenden Mittels. Somit schließen bekannte und erwartete Photon-reduzierende Mittel fluoreszierende Reportersubstrate, fluoreszierende Markierungen, fluoreszierende Membransensoren, fluoreszierende Protein, Testchemikalien und intrazelluläre Analyten-Indiktoren (z. B. Ionen-Chelatoren) ein. Bekannte Verfahren oder Verfahren, die auf dem Fachgebiet zur Messung und zum Vergleich von Absorptionsspektren entwickelt wurden, können verwendet werden, um Photon-reduzierende Mittel zu identifizieren. Lichtreduzierende Farbstoffe bezieht sich auf Photon-reduzierende Mittel, die ein Absorptionsspektrum haben, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum eines Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  • Wird ein Photon-reduzierendes Mittel ausgewählt, wie ein lichtreduzierender Farbstoff, ist es vorteilhaft, das Ausmaß des Überlappenes seines Absorptionsspektrums zu vergleichen mit (1) dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum eines Photon-produzierenden Mittels in wässriger Lösung und (2) dem Absorptions-, Emission- oder Anregungsspektrum des erwarteten Signalmoleküls in einer Assayprobe. Dieser Vergleich kann bei der Auswahl des Photon-reduzierenden Mittels helfen, wie ein lichtreduzierender Farbstoff, durch Optimierung der spektralen Überlappungen. Zusätzlich ist es wünschenswert, Photon-reduzierende Mittel mit hohen Extinktionskoeffizienten auszuwählen, um die Menge an Photon-reduzierendem Mittel, das für die gewünschte Wirkung erforderlich ist, zu reduzieren. Vorzugsweise blockieren Photon-reduzierende Mittel typischerweise wenigstens teilweise entweder die Anregungs- oder Emissionswellenlängen von Photon-reduzierenden Mitteln oder beides. So reduzieren bevorzugte Photon-reduzierende Mittel unerwünschte Lichtemission aus einer Probe. Solche bevorzugten Photon-reduzierenden Mittel können bestimmt werden durch Vergleichen der Extinktionskoeffizienten von Kandidaten für Photon-reduzierenden Mittel mit den erwarteten Photon-produzierenden Mitteln bei der gewünschten Wellenlänge oder dem Bereich von Wellenlängen durch empirische Beobachtungen oder durch Routineexperimente, um solche gewünschten Photon-produzierenden Mittel zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung auszuwählen. Photon-reduzierende Mittel können die Emission von unerwünschtem Licht aus einer Probe um wenigstens etwa 10%, vorzugsweise wenigstens etwa 30%, noch bevorzugter wenigstens etwa 50% und am bevorzugtesten zwischen 70 und 99% reduzieren, verglichen mit der Lichtemission von einer Probe oder einem bestimmten Photon-produzierenden Mittel in Abwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels.
  • Solche Photon-produzierende Mittel und Photon-reduzierende Mittel können bestimmt werden beispielsweise durch Anregen einer Probe, die ein Photon-produzierendes Mittel und ein Photon-reduzierendes Mittel enthält, mit Licht einer ersten Wellenlängen-Bandbreite und Sammeln der Emission von der Probe bei einer zweiten Wellenlängen-Bandbreite. Vorzugsweise überlappen die erste Wellenlängen-Bandbreite und die zweite Wellenlängen-Bandbreite nicht, sie können es jedoch. Vorzugsweise können die erste Wellenlängen-Bandbreite und die bevorzugte zweite Wellenlängen-Bandbreite bestimmt werden durch Routineexperimente unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, um solche Wellenlängen-Bandbreitenbereiche zu bestimmen und Überlappunge. Solche Bandbreiten schließen vorzugsweise die geeigneten Anregungs- oder Emissionspeaks von wenigstens einem der Photon-produzierenden Mittel oder Photon-reduzierenden Mittel ein, jedoch muss dies nicht der Fall sein, da signifikante Anregung oder Emission über einen großen Bereich des geeigneten Anregungsspektrums oder Emissionsspektrums erhalten werden kann.
  • Photon-reduzierende Mittel werden vorzugsweise in einer Arbeitskonzentration in der Probe zwischen etwa 0,1 mM und etwa 10 mM und noch bevorzugter zwischen 0,5 mM und 5 mM zur Verfügung gestellt. Wen zwei oder mehr Photon-reduzierende Mittel in einer Probe vorliegen, so liegt die kombinierte Konzentration der Photon-reduzierenden Mittel vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mM und 10 mM und noch bevorzugter zwischen 0,5 mM und 5 mM. Photon-reduzierende Mittel können das Verhältnis von Signal zu Rauschen in einem Assay durch zwischen etwa 50% bis etwa 100% oder mehr steigern und vorzugsweise zwischen etwa 500% und etwa 3000%. Der prozentuale Anstieg in dem Verhältnis von Signal zu Rauschen (S/N) in Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels (PRA) kann berechnet werden durch die Formel ((S/N in Anwesenheit eines PRA)/(S/N in Abwesenheit eines PrA)) × 100 = Prozent Anstieg in S/N.
  • Photon-reduzierende Mittel können im Wesentlichen die Membran eines Membrankompartiments nicht durchdringen. Im Wesentlichen nicht durchdringen heißt in diesem Zusammenhang, dass unter Assaybedingungen, die Konzentration des Photon-reduzierenden Mittels in dem Membrankompartiment weniger als 50% ist, vorzugsweise weniger als 30% und am bevorzugtesten weniger als 10% der Konzentration außerhalb des Membrankompartiments.
  • Vorzugsweise haben Photon-reduzierende Mittel einen Teilungskoeffizienten (Octanol/Wasser), der gleich oder weniger als CCF2/AM ist, bei einem pH zwischen etwa 6 und 8, vorzugsweise etwa pH 7, so dass das Photon-reduzierende Mittel vorzugsweise eher in einer wässrigen Lösung vorliegt als in einer hydrophoben Phase, wie einer Membran (für CCF2/AM, vergl. US-PS Nr. 5,741,657 Tsien et al., eingereicht 21. April 1998). Photon-reduzierende Mittel haben auch vorzugsweise eine Löslichkeit in Wasser von wenigstens etwa 1 mM und vorzugsweise wenigstens etwa 10 mM unter Assaybedingungen, so wie zwischen etwa 4°C und 42°C, vorzugsweise zwischen etwa 24°C und 37°C. Zusätzlich sollten Photon-reduzierende Mittel vorzugsweise schlechter das Membrankompartiment durchdringen, wie eine Säugerzelle, als ein Photon-produzierendes Mittel, das in dem Assay verwendet wird. Photon-reduzierende Mittel können ein pH-Indikatorfarbstoff sein und Farbstoffe sein, wie Azo-Farbstoffe.
  • Vorzugsweise haben Photon-reduzierende Mittel ein Extinktionskoeffizienten von zwischen etwa 2.0000 M–1cm–1 bis etwa 500.000 M–1cm–1, vorzugsweise zwischen etwa 10.000 M–1cm–1 und 200.000 M–1cm–1 und stärker bevorzugt mehr als 10.000 M–1cm–1 bei einer Wellenlänge oder einem Bereich von Wellenlängen, die in einem Assay verwendet werden.
  • In vielen Fällen wird das Photon-produzierende Mittel, das zu unerwünschtem Licht, das von der Probe emittiert wird, führt, für das Signalmolekül in einer nicht gewünschten Lokalisierung oder in einem nicht gewünschten Kompartiment sein. Solche Fälle treten typischerweise auf, wen das Signalmolekül in der umgebenden Lösung vorliegt und die Reduktion der Lösungsfluoreszenz wünschenswert wird. Beispielsweise wird ein Fluoreszenzreporter, der aus dem Membrankompartiment entweicht, wie eine Zelle, häufig das Verhältnis des Signals zum Hintergrund des Assays verringern. Wenn das Photon-produzierende Mittel das Signalmolekül ist, ist es wünschenswert, einen lichtreduzierenden Farbstoff auszuwählen, der ein Absorptionsspektrum hat, das signifikant mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum des erwarteten Signalmoleküls überlappt. Vorzugsweise können solche Photon-reduzierendem Mittel identifiziert werden durch Bestimmen des prozentualen Überlappens von dem Spektrum, wie bestimmt aus der Konzentration und dem Extinktionskoeffizienten eines Photon-produzierenden Mittels und eines Photon-reduzierenden Mittels bei einer gewünschten Wellenlänge oder einem Bereich von Wellenlängen (vergl. Lakowicz, J. R. Priciples of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983)). Generell ist der Wellenlängenbereich für dieses Spektrum etwa 260 nm bis etwa 900 nm, obwohl engere Bereiche verwendet werden können, wie etwa 290 bis 800 nm oder 300 bis 700 nm. Zusätzlich ist es vorteilhaft, ein Photon-reduzierendes Mittel mit einer optischen Dichte oder einem Extinktionskoeffizienten, der ausreichend hoch ist, um wirksam in der Reduktion von Lösungsfluoreszenz zu sein, auszuwählen.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Photon-produzierendes Mittel mit Licht einer engen Wellenlängen-Bandbreite angeregt, sowie mit Licht, das durch einen Durchlass-Anregungsfilter gefiltert wird, oder durch Anregung mit einem engen Wellenlängenband oder mit einer Einzelwellenlänge eines Laserlichts, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Die Emission von einer Probe wird nachgewiesen unter Verwendung einer ausgewählten Bandbreite von Licht, das von dem Photon-produzierenden Mittel emittiert wird unter Verwendung von beispielsweise einem Emissionsdurchlassfilter. Vorzugsweise hat das Photon-reduzierende Mittel einen hohen Extinktionskoeffizienten bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen. Abhängig von der Empfindlichkeit und der Reaktivität der Reagenzien, die in dem Assay verwendet werden, wie Membrankompartimente (wie Zellen) oder Ziele, ist es wünschenswert, Photon-reduzierende Mittel mit geringer oder keiner relevanten biologischen Aktivität auszuwählen, so dass das Photon-reduzierende Mittel nicht mit dem Assay interferiert. Häufig ist es wertvoll, die Toxizität und nicht-spezifische Bindung von Photon-reduzierenden Mitteln in dem Assay zu testen, um ihre Kompatibilität mit Assay-Bestandteilen sicherzustellen. Vorzugsweise sind Photon-reduzierende Mittel nicht toxisch für Zellen, die in einem zellbasiertem Assay verwendet werden in dem Zeitrahmen des Assays. Vorzugsweise reagieren Photon-reduzierende Mittel nicht mit oder binden nicht an die Ziele oder andere Biomoleküle in dem Assay, um die biologische Aktivität oder Eigenschaft, die gemessen werden soll, nicht unerwünschte zu verändern. Vorzugsweise sollten Photon-reduzierende Mittel nicht die (Zell)-Membran durchdringen.
  • Proben können ein oder mehrere oder zwei oder mehrere Photon-produzierende Mittel und ein oder mehrere und zwei oder mehrere Photon-reduzierende Mittel umfassen. Im Fall von mehrfachen Photon-produzierenden Mitteln oder Photon-reduzierenden Mitteln können die Eigenschaften der Photon-produzierenden Mittel oder Photon-reduzierenden Mittel ausgewählt werden, um gewünschte Eigenschaften zu haben. Beispielsweise können Photon-reduzierende Mittel ausgewählt werden, um Kombinationen zu bilden, die Absorptionsspektren haben, die breiter sind als die Absorptionsspektren von individuellen Photon-reduzierenden Mitteln. Diese Kombinationen von Photon-reduzierenden Mitteln können verwendet werden, um die Emission von unerwünschtem Licht von einem oder mehreren Photon-produzierenden Mitteln in einer Probe zu reduzieren. Eine solch reduzierte Emission von unerwünschtem Licht von einer Probe kann erreicht werden während der Anregung und Emission von dem Photon-produzierenden Mittel. Licht, das von einer Probe emittiert wird, kann nachgewiesen werden durch jedes geeignete Mittel für ein bestimmtes Assayformat. Beispielsweise kann Fluoreszenz nachgewiesen werden unter Verwendung eines Fluorometers, das Epifluoreszenz nachweisen kann. Die Proben können in jedem geeigneten Behältnis zur Verfügung gestellt werden, von dem ein Signal nachgewiesen werden kann, wie Fläschchen oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte. Bei Mikrotiterplatten kann die Anzahl von Vertiefungen in einem Standardformat mit 96 Vertiefungen zwischen etwa 6 und etwa 3.456 Vertiefungen sein, vorzugsweise zwischen etwa 96 Vertiefungen und 864 Vertiefungen und stärker bevorzugt zwischen etwa 288 und etwa 384 Vertiefungen, noch stärker bevorzugt mehr als etwa 384 Vertiefungen (vgl. US-PS Nr. 6,232,114 Coassin et al., eingereicht 15. Mai 201). Vorzugsweise hat die Mikrotiterplatte Vertiefungen, die einen Boden haben, der wenigstens einen Teil hat, der Licht einer Wellenlänge, die im Assay verwendet wird, durchlassen kann. Membrankompartimente in der Probe sind vorzugsweise in Kontakt (physikalischer Kontakt oder optischer Kontakt) mit dem Boden solcher Vertiefungen. In diesem Fall bedeutet optischer Kontakt, dass die Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels wenigstens einen Teil des Lichts, das von dem Membrankompartiment emittiert wird, durch den Boden der Vertiefung dringen kann. Das verwendete Lösungsvolumen, das die Probe enthält, ist abhängig von der Volumenkapazität des Behältnisses, das in dem Assay verwendet wird. Vorzugsweise liegt das Probenvolumen zwischen etwa 100 Nanolitern und etwa 1 Milliliter, vorzugsweise zwischen etwa 0,5 Mikrolitern und etwa 0,5 Millilitern und am stärksten bevorzugt zwischen etwa 1 Mikroliter und etwa 250 Mikrolitern oder zwischen etwa 3 Mikrolitern und etwa 100 Mikrolitern.
  • Die Anzahl der Membrankompartimente, wie Zellen in einer Probe, ist vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 1.000.000.000 Membrankompartimente und am stärksten bevorzugt zwischen etwa 100 und etwa 200.000 Membrankompartimente. Wenn die Membrankompartimente Zellen sind, sind die Zellen vorzugsweise lebend und sind vorzugsweise Säugerzellen. Proben können eine vorbestimmte Anzahl von Zellen oder eine unbekannte Anzahl von Zellen enthalten. Proben können Zellen enthalten, die Mitglieder einer klonalen Population sind oder einer heterogenen Population.
  • Zellen
  • Viele Zellen können in der Erfindung für zellbasierte Assays verwendet werden. Solche Zellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Babyhamsternieren-(BHK)-Zellen (ATCC Nr. CCL10), Maus-L-Zellen (ATCC Nr. CCLI.3), Jurkats (ATCC Nr. TIB 152) und 153 DG44-Zellen (vgl. Chasin (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555 menschliche embryonale Nieren-(HEK)-Zellen (ATCC Nr. CRL1573), chinesische Hamsterovarien-(CHO)-Zellen (ATCC Nrn. CRL9618, CCL61, CRL9096), PC12-Zellen (ATCC Nr. CRL17.21), COS-7-Zellen (ATCC Nr. CRL1651) und Hefe. Bevorzugte Zellen für heterologe Zelloberflächen-Proteinexpression sind diejenigen, die leicht und effizient transfiziert werden können. Bevorzugte Zellen schließen Jurkat-Zellen, CHO-Zellen und HEK293-Zellen ein, wie sie beschrieben sind in US-PS Nr. 5,024,939 und von Stillman et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 2051–2060, jeweils hierin durch Referenz eingeschlossen.
  • Ziele
  • Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet Ziele zur Identifizierung von Chemikalien, die nützlich sind zur Modulation der Aktivität von dem Ziel oder einem Ziel, das ähnliche strukturelle oder funktionelle Eigenschaften hat. Das Ziel kann jede biologische Einheit sein, wie ein Protein, Zucker, Nukleinsäure oder Lipid. Typischerweise sind Ziele Proteine wie Enzyme oder Zelloberflächen-Proteine. Ziele können entweder in biochemischen Assays (Ziele frei von Zellen) oder in zellbasierten Assays (Ziele assoziiert mit einer Zelle) untersucht werden.
  • Beispielsweise können Zellen mit Ionen- oder spannungssensitiven Farbstoffen beladen werden, um Rezeptor- oder Ionenkanalaktivität zu berichten, wie Kalziumkanäle oder N-Methyl-D-Aspartat- (NMDA)-Rezeptoren, GABA-Rezeptoren, Kainat/AMPA-Rezeptoren, Nicotinacethylcholin-Rezeptoren, Natriumkanäle, Kalziumkanäle, Kaliumkanäle, exzitatorische Aminosäure (EAA) Rezeptoren und Nicotinacethylcholin-Rezeptoren. Assays zur Bestimmung der Aktivität von solchen Rezeptoren können auch Agonisten und Antagonisten verwenden als negative oder positive Kontrollen, um die Aktivität von Testchemikalien zu bestimmen. In bevorzugten Ausführungsformen von automatisierten Assays zur Identifizierung von Chemikalien, die die Fähigkeit besitzen, die Funktion von Rezeptoren oder Ionenkanäle (z. B. Agonisten/Antagonisten) zu modulieren, Veränderungen in dem Ionenspiegel im Zytoplasma oder der Membranspannung werden beobachtet unter Verwendung von jeweils einem ionensensitiven oder membranspannungsfluoreszierendem Indikator. Unter den ionensensitiven Indikatoren und Spannungssonden, die eingesetzt werden können, sind diejenigen, die in dem Katalog von Molecular Probes von 1997 offenbart sind.
  • Andere Verfahren der vorliegenden Erfindung betreffen die Bestimmung der Aktivität von Rezeptoren. Rezeptoraktivierung kann manchmal nachfolgende intrazelluläre Ereignisse initiieren, die intrazelluläre Speicher von Kalziumionen zur Verwendung als Second-Messenger entlassen oder den Einfluss von Kalziumionen in eine Zelle. Die Aktivierung von einigen G-Protein gekoppelten Rezeptoren stimuliert die Bildung von Inositol-Triphosphat (IP3, ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor oder Tyrosinkinase Second-Messenger) durch Phospholipase C vermittelte Hydrolyse von Phosphatidylinositol, Berridge und Irvine (1984), Nature 312: 315–21. IP3 wiederum stimuliert das Entlassen von intrazellulären Kalziumspeichern. Somit kann eine Veränderung in dem zytoplasmatischen Kalziumionenspiegel, der durch die Entlassung von Kalziumionen von intrazellulären Speichern verursacht wurde, verwendet werden zur Bestimmung der G-Protein gekoppelten Rezeptorfunktion. Unter anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind Muscarin-Acethylcholin-Rezeptoren (mAChR), andrenerge Rezeptoren, Serotonin-Rezeptoren, Dopamin-Rezeptoren, Angiotensin-Rezeptoren, Adenosin-Rezeptoren, Bardykinin-Rezeptoren, metabotropische exzitatorische Aminosäure-Rezeptoren und dergleichen. Zellen, die solche G-Protein gekoppelten Rezeptoren exprimieren, können gesteigerte zytoplasmatische Kalziumspiegel zeigen als ein Ergebnis des Beitrags von sowohl intrazellulären Speichern und durch Aktivierung von Ionenkanälen. In solchen Fällen kann es wünschenswert sein, obwohl nicht notwendig, solche Assays in kalziumfreiem Puffer durchzuführen, optional angereichert mit einem chelatierenden Mittel, wie EGTA, um Fluoreszenzantwort, die aus Klaziumentlassung von internen Speichern resultiert, zu unterscheiden. Beispielhafte Membranprotein, die Ziele sein können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Oberflächenrezeptoren und Ionenkanäle. Oberflächenrezeptoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Muscarin-Rezeptoren, z. B. humaner M2 (Genbank Zugangsnumer M16404); Rattten-M3 (Genbank Zugangsnummer M16407), humaner M4 (Genbank Zugangsnummer M16405), humaner M5 (Boner, et al., (1988), Neuron 1, Seiten 403–410); und dergleichen. Neuronale Nikotinacethylcholin-Rezeptoren schließen ein, z. B. die humanen α2-, α3- und β2-Subtypen, den humane α5-Subtyp (Chini et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1572–1576), die Ratten-α2-Untereinheit (Wada et al. (1988) Science 240, Seiten 330–334), die Ratten-α3-Untereinheit (Boulter, et al. (1986) Nature 319, Seiten 368–374), die Ratten-α4-Untereinheit (Goldman, et al. (1987) Cell 48, Seiten 965–973), die Ratten-α5-Untereinheit (Boulter et al. (1990) I. Biol. Chem. 265, Seiten 4472–4482), die Küken-α7-Untereinheit (Couturier et al. (1990) Neuron 5: 847–856, die Ratten-β2-Untereinheit (Deneris et al. (1988) Neuron 1, Seiten 45–54), die Ratten-β3-Untereinheit (Denersis et al. (1989) J. Biol. Chem. 264, Seiten 6268–6272), die Ratten-β4-Untereinheit (Duvoisin et al. (1989) Neuron 3, Seiten 487–496), Kombinationen von der Ratten α-Untereinheiten, β-Untereinheiten und a- und p-Untereinheiten. GABA-Rezeptoren schließen ein z. B. die Rinder n- und p-Untereinheiten (Schofield et al. (1987) Nature 328, Seiten 221–227), die Rinder n- und a-Untereinheiten (Levitan et al. (1988) Nature 335, Seiten 76–79), die χ-Untereinheit (Pritchett, et al. (1989) Nature 338, Seiten 582–585), die p- und p-Untereinheiten (Ymer et al. (1989) EMBO J. 8, Seiten 1665–1670), die 6-Untereinheit (Shivers, B. D. (1989) Neuron 3, Seiten 327–337) und dergleichen. Glutamat-Rezeptoren schließen ein z. B. Ratten GluR1-Rezeptor (Hollman et al. (1889) Nature 342, Seiten 643–648), Ratten GluR2- und GluR3-Rezeptoren (Boulter et al. (1990) Science 249: 1033–1037, Ratte GluR4-Rezeptor (Keinanen et al. (1990) Science 249: 556–560), Ratten-GluR5-Rezeptor (Bettler et al. (1990) Neuron 5: 583–595), Ratten-GluR6-Rezeptor (Egebjerg et al. (1991) Nature 351: 745–748), Ratten-GluR7-Rezeptor (Bettler et al. (1992) Neuron 8: 257–265), Ratten-NMDAR1-Rezeptor (Moriyoshi et al. (1991) Nature 354: 31–37 und Sugihara et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 185: 826–832), Maus-NMDA-el-Rezeptor (Meguro et al. (1992) Nature 357: 70–74), Ratten-NMDAR2A-, NMDAR2B- und NMDAR2C-Rezeptoren (Monyer et al. (1992) Science 256: 1217–1221), Ratten-metabotropischer mGluR1-Rezeptor (Houamed et al. (1991) Science 252: 1318–1321), Ratten-metabotropioscher mGlu-R2- und mGluR3-R3- und mGluR4-Rezeptoren (Tanabe et al. (1992) Neuron 8: 169–179), Ratten-metabotropischer mGluR5-Rezeptor (Abe et al. (1992) I. Biol. Chem. 267: 13361–13368) und dergleichen. Adrenergische Rezeptoren schließen ein z. B. humanen p1 (Frielle et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84, Seiten 7920–7924), humanen α2 (Kobilka et al. (1987) Science 238, Seiten 650–656), Hamster-β2 (Dixon et al. (1986) Nature 321, Seiten 75–79) und dergleichen. Dopamin-Rezeptoren schließen ein z. B. humanen D2 (Storman et al. (1990) Molec. Phann. 37, Seiten 1–6), Säugerdopamin-D2-Rezeptor (US-PS Nr. 5,128,254), Ratte (Bunzow et al. (1988) Nature 336, Seiten 783–787) und dergleichen. NGF-Rezeptoren schließen ein z. B. humane NGF-Rezeptoren (Hohnson et al. (1986) Cell 47, Seiten 545–554) und dergleichen. Serotonin-Rezeptoren schließen ein z. B. humanen 5HT1a (Kobilka et al. (1987) Nature 329, Seiten 75–79), Serotonin-5HT1C-Rezeptor (US-PS Nr. 4,985,352), humanen 5HT1D (US-PS Nr. 5,155,218), Ratten-5HT2 (Julius et al. (1990) PNAS 87, Seiten 928–932), Ratten-5HT1c (Julius et al. (1988) Science 241, Seiten 558–564) und dergleichen.
  • Ionenkanäle schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Kalziumkanäle, umfassend den humanen Kalziumkanal α2β- und/oder χ-Untereinheiten (vgl. WO 89/09834; humane neuronale α2-Untereinheit, Kaninchenskelettmuskel al Untereinheit (Tanabe et al. (1987) Nature 328, Seiten 313–318), Kaninchenskelettmuskel-α2-Untereinheit (Ellis et al. (1988) Science 241, Seiten 1661–1664), Kaninchenskelettmuskel p-Untereinheit (Ruth et al. (1989) Science 245, Seiten 1115–1118), Kaninchenskelettmuskel γ-Untereinheit (Jay et al. (1990) Science 248, Seiten 490–492) und dergleichen. Kaliumionenkanäle schließen ein z. B. Rattengehirn (BK2) (McKinon, D (1989) J. Biol. Chem. 264, Seiten 9230–8236), Mausgehirn (BK1) (Tempel et al. (1988) Nature 332, Seiten 837–839) und dergleichen. Natriumionenkanäle schließen ein z. B. Rattengehirn I und II (Noda et al. (1986) Nature 320, Seiten 188–192), Rattengehirn III (Kayano et al. (1988) FEBS Lett. 228, Seiten 187–194), humanes II (ATCC Nr. 59742, 59743 und Genomics 5: 204–208 (1989), Chloridionenkanäle (Thiemann et al. (1992) Nature 356, Seiten 57–60 und Paulmichl et al. (1992) Nature 356, Seiten 238–241) und andere, die auf dem Fachgebiet bekannt oder entwickelt sind.
  • Intrazelluläre Rezeptoren können als Ziele verwendet werden, wie Östrogen-Rezeptoren, Glucocorticoid-Rezeptoren, Androgen-Rezeptoren, Progesteron-Rezeptoren und Mineralcorticoid-Rezeptoren in der Erfindung. Transkriptionsfaktoren und Kinasen können auch als Ziele verwendet werden, genauso wie Pflanzenziele.
  • Verschiedene Verfahren zur Identifizierung der Aktivität einer Chemikalie im Hinblick auf ein Ziel können angewendet werden, einschließlich: Ionenkanäle (PCT Veröffentlichung WO 93/13423), intrazelluläre Rezeptoren (PCT Veröffentlichung WO 96/41013), US-PS 5,548,063 , US-PS 5,171,671 , US-PS 5,274,077 , US-PS 4,981,784 , EP 0 540 065 A1 , US-PS 5,071,773 und US-PS 5,298,429 . Fluoreszenzassays, die in der Erfindung verwendet werden können, schließen diejenigen ein, die beschrieben sind in PCT WO 96/3540 (Tsien), PCT WO 96/41166 (Tsien) und PCT WO 96/23810 (Tsien). Die Verfahren, wie dargelegt in PCT WO 96/3540 (Tsien) und PCT WO 96/23810 (Tsien) können auch kombiniert werden mit Verfahren, die beschrieben sind in den US-Patenten 5,401,629 und 5,436,128 durch Harpold et al. für Assays von Zelloberflächen-Rezeptoren und die zellbasierten intrazellulären Rezeptor-Assays, die hier beschrieben sind.
  • Fluoreszenzmessungen
  • Man weiß, dass man bei Verwendung von fluoreszierenden Sensoren, Indikatoren und Sonden, wie Photon-produzierenden Mitteln, unterschiedliche Typen von Fluoreszenz-Monitorsystemen verwenden kann, um die Erfindung auszuführen. Vorzugsweise werden FACS-Systeme oder Systeme, die auf Screening mit hohem Durchsatz gerichtet sind, z. B. 96 Vertiefungen oder größere Mikrotiterplatten oder Multi-Vertiefungsplattformen, verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, wie therapeutische Zusammensetzungen und um die Toxikologie von solchen Zusammensetzungen zu bestimmen (vergl. US-PS Nr. 5,985,214, Stylli et al., eingereicht 16. November 1997). Solche Screening-Systeme mit hohem Durchsatz können beispielsweise umfassen:
    • a) ein Speicher- und Abruf-Modul zum Speichern einer Vielzahl von Chemikalien in Lösung in adressierbaren Chemikalienvertiefungen, einen Chemikalienvertiefungszubringer und eine programmierbare Auswahl und Abruf der adressierbaren Chemikalienvertiefungen und der eine Speicherkapazität von wenigstens 100.000 der adressierbaren Vertiefungen hat, wobei wenigstens eine der adressierbaren Vertiefungen ein Photon-reduzierendes Mittel umfasst,
    • b) ein Probenverteilungsmodul, umfassend einen Flüssigkeitstransporter, um Lösungen aus den ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefungen anzusaugen und zu verteilen, wobei das Chemikalienverteilungsmodul eine programmierbare Auswahl von und Ansaugen aus den ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefungen hat, und eine programmierbare Verteilung in den ausgewählten adressierbaren Probenvertiefungen hat, und wobei der Flüssigkeitstransporter in Reihen der adressierbaren Vertiefungen mit unterschiedlichen Dichten der adressierbaren Vertiefungen pro Quadratzentimeter verteilen kann,
    • c) einen Probentransporter, um die ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefungen zum Probenverteilungsmodul zu transportieren und der gegebenenfalls eine programmierbare Transportkontrolle der ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefung hat,
    • d) ein Reaktionsmodul, umfassend entweder einen Reagenzverteiler, um Reagenzien in die ausgewählten adressierbaren Probenvertiefungen zu verteilen oder einen Fluoreszenzdetektor, um chemische Reaktionen in den ausgewählten adressierbaren Probenvertiefungen nachzuweisen und
    • e) ein Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul, wobei das Speicher- und Abrufmodul, das Probenverteilungsmodul und das Reaktionsmodul integriert sind und durch das Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul programmierbar kontrolliert sind; und das Speicher- und Abrufmodul, das Probenverteilungsmodul, der Probentransporter, das Reaktionsmodul und das Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul operabel miteinander verbunden sind, um eine schnelle Verarbeitung der adressierbaren Probenvertiefungen zu ermöglichen.
  • Multi-Vertiefungsplattformen, die nützlich in der vorliegenden Erfindung sind, können zwischen etwa 6 und etwa 5.000 Vertiefungen haben, vorzugsweise zwischen etwa 96 und etwa 4.000 Vertiefungen, am stärksten bevorzugt in Vielfachen von 96 (vgl. US-PS Nr. 6,063,338, eingereicht am 16. Mai 2000; US-PS Nr. 6,232,114, eingereicht am 15. Mai 2001, US-PS Nr. 6,229,603, eingereicht am 8. Mai 2001; US-PS Nr. 5,910,287, eingereicht am 8. Juni 1995 und US-PS Nr. 6,171,780, eingereicht am 5. Januar 2001). Verfahren zur Durchführung von Assays mit fluoreszierenden Materialien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und sind beschrieben in z. B. Lakowicz, J. R. Principles in Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance Energy Transfer Microscopy in: Fluorescence Micrpscopy of Living Cells in Culture, Teil B, Methods and Cell Ciology, Bd. 30, Hrsg. Taylor, D. L. und Wang, Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), Seiten 219–243; Turro, N. J., Modern Molecular Photochemistry, Menlo Park: Benjamin/Cummings Publishing Col., Inc. (1978), Seiten 296–361.
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um das Verhältnis vom Signal zum Hintergrund bei der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) zu steigern. In diesem Aspekt der Erfindung umfasst das Membrankompartiment wenigstens ein Photon-produzierendes Mittel und die umgebende Lösung zeigt unerwünschten optischen Hintergrund (wie Fluoreszenz) von z. B. wenigstens einem Photon-produzierenden Mittel. In dieser Ausführungsform der Erfindung ist das Probenvolumen vorzugsweise ein kleines Tröpfchen, umfassend das Membrankompartiment, wie es nützlich in FACS-Analysen ist. Die optische Pfadlänge durch den Tropfen ist vorzugsweise nur wenige Mikrometer, so dass die Reduktion des Anregungslichts oder die Absorption der emittierten Fluoreszenz durch Absorptionsfilter in dem Tröpfchen gering ist. Signifikante Reduktion von unerwünschter Lösungsfluoreszenz von dem Tröpfchen kann erreicht werden unter solchen Bedingungen, wenn das Photon-reduzierende Mittel in dem Tropfen mit dem Anregungsstatus des Moleküls, das die Quelle der unerwünschten Lösungsfluoreszenz ist, interagiert. Interaktionen, die zu solch nützlicher Reduktion der unerwünschten Lösungsfluoreszenz führen, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Fluoreszenzresonanz-Energietransfer, Kollisions-Quenching, Grundzustand Dunkel Komplex Bildung, paramagnetische Verstärkung von Intersystemkreuzung, Dexter-Exchange-Kopplung, fotoinduzierter Elektronentransfer. Die gemeinsame Eigenschaft dieser Interaktion ist, dass sie über molekulare Distanzen von weniger als etwa 20 nm auftreten und eine Form von Energietransfer umfassen, die anders ist als einfache Absorption aufgrund von innerer Filterung. Die besonderen Bedingungen für diesen Aspekt der Erfindung können bestimmt werden unter Verwendung von Routineexperimenten unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Fluoreszenz in einer Probe kann unter Verwendung eines Fluorimeters gemessen werden. Im Allgemeinen kann Anregungsstrahlung von einer Anregungsquelle, die eine erste Wellenlänge hat, durch die Anregungsoptik passieren. Die Anregungsoptik ermöglicht es der Anregungsstrahlung, die Probe anzuregen. In Antwort emittiert die Fluoreszenzsonde in der Probe Strahlung, die eine Wellenlänge hat, die anders ist als die Anregungswellenlänge. Sammlungsoptik sammelt dann die Emission von der Probe. Die Vorrichtung kann einen Temperaturregler einschließen, um die Probe bei einer bestimmten Temperatur zu halten, während sie gemessen wird. Gemäß einer Ausführungsform bewegt eine Multi-Achsen-Translationsbühne eine Mikrotiterplatte, die eine Vielzahl von Proben hält, um verschiedene Vertiefungen zu positionieren, die exponiert werden sollen. Die Multi-Achsen-Translationsbühne, der Temperaturregler, die Autofokuseinheit und die Elektronik, die mit der Abbildung und der Datensammlung assoziiert ist, kann durch einen geeigneten programmierten digitalen Computer gehandhabt werden. Der Computer kann auch die während dem Assay gesammelten Daten in ein anderes Format zur Präsentation transformieren.
  • Vorzugsweise kann Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) verwendet werden als Weg, um Aktivität innerhalb einer Zelle zu beobachten, so wie mit dem Reportergensystem, das in Tsien et al. (PCT WO 96/30540) beschrieben ist. Der Grad des FRET kann bestimmt werden durch jede geeignete spektrale oder fluoreszierende Lebenszeiteigenschaft von dem angeregten Konstrukt. Beispielsweise kann der Grad von FRET bestimmt werden durch Bestimmen der Intensität des fluoreszierenden Signals von dem Donor, der Intensität des fluoreszierenden Signals von dem Akzeptor, das Verhältnis der Fluoreszenzamplituden nahe dem Emissionsmaximum des Akzeptors zu den Fluoreszenzamplituden nahe dem Emissionsmaximum des Donors oder durch die Lebenszeit des angeregten Status des Donors. Beispielsweise steigert die Spaltung des Linkers die Intensität der Fluoreszenz von dem Donor, verringert die Intensität der Fluoreszenz von dem Akzeptor, steigert das Verhältnis der Fluoreszenz-Amplituten von dem Donor zu der des Akzeptors und steigert die Lebenszeit des Anregungsstatus' des Donors.
  • Wie von dem Fachmann leicht eingesehen wird, hängt die Wirksamkeit des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers von dem Fluoreszenz-Quantengehalt der Donor-Fluorophore ab, der Orientierung der Fluorophore, der Donor Akzeptor Distanz und dem Überlappungsintegral der Donor Fluoreszenz Emission und Akzeptor-Absorption. Der Energietransfer ist am effizientesten, wenn eine Donor Fluorophore mit hohem Fluoreszenz-Quantengehalt (vorzugsweise eine, die 100% erreicht) mit einem Akzeptor gepaart wird mit einem großen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen, die mit der Emission des Donors zusammenfallen. Die Abhängigkeit des Fluoreszenz-Energietransfers von den vorstehenden Parametern wurde beschrieben (Forster, T. (1948) Ann. Physik 2: 55–75; Lakowicz, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, New York: Plenum Press (1983); Herman, B., Resonance energy transfer microscopy, in: Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture, Teil B, Methods in Cell Biology, Band 30, Hrsg. Taylor, D. L. & Wang, Y.-L., San Diego: Academic Press (1989), Seiten 219–243; Turro, N. J., Modem Molecular Photochemistry, Menlo Part: Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., (1978), Seiten 296–361). Auch Tabellen von spektralen Überlappungsintegralen sind leicht erhältlich für diejenigen, die auf dem Gebiet arbeiten (beispielsweise Berlman, I. B. Energy transfer parameters of aromatic compounds, Academic Press, New York und London (1973)). Die Distanz zwischen dem Donor und dem Akzeptor, bei der FRET mit 50% Wirksamkeit auftritt, wird R0 genannt und kann berechnet werden aus den spektralen Überlappungsintegralen. Für das Donor-Akzeptorpaar Fluoreszein-Tetramethyl-Rhodamin, das häufig für Entfernungsmessungen in Proteinen verwendet wird, beträgt diese Distanz R0 um 50–70 Å (dos Remedios, C. G. et al. (1987) J. Muscle Research and Cell Motility 8: 97–117). Die Distanz, bei der der Energietransfer in diesem Paar 90% überschreitet, ist bei etwa 45 Å.
  • Vorzugsweise werden Veränderungen in dem Grad von FRET bestimmt als eine Funktion von der Veränderung in dem Verhältnis der Menge der Fluoreszenz von dem Donor und Akzeptor, ein Analyseverfahren, das als "rationing" bezeichnet wird. Veränderungen in der absoluten Menge des Substrats, der Anregungsintensität und Trübung oder anderer Hintergrundabsorption in der Probe bei Anregungswellenlängen beeinflussen die Intensitäten von Fluoreszenz von sowohl dem Donor als auch dem Akzeptor etwa gleich. Deshalb ist das Verhältnis von zwei Emissionsintensitäten eine bevorzugte und stabilere Messung der Spaltung als eine Intensität allein.
  • Die Lebenszeit des Anregungsstatus' der Donor-Gruppe ist gleichfalls unabhängig von der absoluten Menge des Substrats, der Anregungsintensität oder der Trübung oder anderen Hintergrundabsorptionen. Seine Messung erfordert Ausrüstung mit einer Auflösung im Nanosekundenbereich, mit der Ausnahme des speziellen Falls der Transition von Metallkomplexen wie Lanthanid-Komplexen, in diesem Fall ist eine Auflösung von Mikrosekunden zu Millisekunden ausreichend.
  • Das ratiometrische Fluoreszenz-Reportersystem, das hier beschrieben wird, hat signifikante Vorteile gegenüber bestehenden Reportern für Gen-Integrationsanalysen, da es den sensiblen Nachweis und Isolierung von sowohl exprimierenden und als auch nicht-exprimierenden einzelnen lebenden Zellen ermöglicht. Dieses Assay-System verwendet ein nicht-toxisches, nicht-polar fluoreszierendes Substrat, das leicht geladen werden kann und dann intrazellulär gefangen ist. Die Spaltung des fluoreszierenden Substrats durch Beta-Lactamase erreicht eine Fluoreszenz-Emissionsverschiebung, wenn das Substrat zum Produkt konvertiert wird. Da das Beta-Lactamase Reporter-Ergebnis ratiometrisch ist, ist es einzigartig unter Reportergen-Assays, da es Variable, wie die Menge des geladenen Substrats in individuelle Zellen, kontrolliert. Die stabile, leicht nachweisbare interzelluläre Anzeige eliminiert den Bedarf, klonale Zelllinien vor der Expressionsanalyse zu etablieren.
  • VERFAHREN ZUM SCREENING VON TESTCHEMIKALIEN IN FLUORESZIERENDEN ASSAYS UNTER VERWENDUNG VON WENIGSTENS EINEM PHOTON-REDUZIERENDEN MITTEL
  • Die vorliegende Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie mit einer biologischen Aktivität (einschließlich toxikologischen Aktivitäten) ein. Das Verfahren wird durchgeführt durch in Kontakt bringen einer Probe mit einer Testchemikalie, wobei die Probe ein Ziel und ein Photon-produzierendes Mittel umfasst. Die Probe wird auch mit wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel in Kontakt gebracht und das optische Signal von dem Photonproduzierenden Mittel wird nachgewiesen. Das Photonproduzierende Mittel kann zugesetzt werden vor oder nach der Testchemikalie, wie geeignet. Die Probe kann ein Membran-Kompartiment in Kontakt mit einer festen Oberfläche, durch die Licht dringen kann, einschließen. Das Membran-Kompartiment schließt wenigstens ein Photon-produzierendes Mittel ein, das direkt oder indirekt die Aktivität des Ziels beobachtet. Das Photon-reduzierende Mittel ist in einer wässrigen Lösung, die die äußere Oberfläche von dem Membran-Kompartiment kontaktiert. Vorzugsweise hat das Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum des Photon-produzierenden Mittels überlappt oder mit dem eines zweiten Photon-produzierenden Mittels in der wässrigen Lösung. Das erste Photon-produzierende Mittel kann in manchen Fällen auch Fluoreszenz-Resonanzenergie auf das Photon-reduzierende Mittel übertragen. Alternativ kann das zweite Photon-produzierende Mittel in einer wässrigen Lösung Fluoreszenz-Resonanzenergie auf das Photon-reduzierende Mittel übertragen. Die vorliegende Erfindung schließt auch eine therapeutische Verbindung und Verbindungen ein, die durch dieses Verfahren identifiziert werden.
  • Eine Testchemikalie mit einer biologischen Aktivität, wie ein Therapeutikum, kann identifiziert werden durch in Kontakt bringen einer Testchemikalie, von der angenommen wird, dass sie eine biologische Aktivität hat, mit einer Probe, die ein Membran-Kompartiment umfasst, das ein Ziel umfasst, wie eine Säugerzelle, die einen Rezeptor umfasst. In manchen Assays kann die Bindung der Testchemikalie an das Ziel in der Expression eines Reportergens in dem Membran-Kompartiment resultieren. Das Reportergen kann ein Photon-produzierendes Mittel oder einen Vorläufer des Photon-produzierenden Mittels kodieren oder ein Enzym kodieren, das ein Photon-produzierendes Mittel von einem geeigneten Substrat erzeugt. Wenn die Probe eine Testchemikalie enthält, mit einer biologischen Aktivität, die durch das Reportergen berichtet wird, dann wird die Menge des fluoreszierenden Reporter-Produkts in der Probe, wie innerhalb oder außerhalb der Zelle, sich entweder steigern oder verringern im Verhältnis zum Hintergrund oder zu Kontrollspiegeln. Die Menge des fluoreszierenden Reporter-Produkts wird gemessen durch Anregen des fluoreszierenden Reporter-Produkts mit einer geeigneten Strahlung einer ersten Wellenlänge und Messen der Emission der Strahlung einer zweiten Wellenlänge, die von der Probe emittiert wird. Die Menge der Emission wird mit dem Hintergrund verglichen oder mit Kontrollspiegeln der Emission. Wenn die Probe, die die Testchemikalie hat, gesteigerte oder verringerte Emission zeigt, im Verhältnis zu der von Kontroll- oder Hintergrundspiegeln, dann wurde ein Kandidaten-Modulator identifiziert. Die Menge der Emission steht im Zusammenhang mit der Menge oder Potenz des Therapeutikums in der Probe. Solche Verfahren identifizieren Kandidaten-Modulatoren von biologischen Verfahren. Der Kandidaten-Modulator kann weiterhin charakterisiert und beobachtet werden auf Struktur, Potenz, Toxikologie und Pharmakologie unter Verwendung von gut bekannten Verfahren oder den Verfahren, die hier beschrieben sind.
  • Das Verhältnis vom Signal zum Hintergrund in solchen Assays kann gesteigert werden durch Zusatz von wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel während dem Verlauf eines solchen Assays. Der Zusatz von wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel kann auch die Empfindlichkeit und Genauigkeit solcher Assays steigern.
  • Die Struktur von einem Kandidaten-Modulator, der durch die Erfindung identifiziert wurde, kann bestimmt werden oder bestätigt werden durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie Massenspektroskopie und Kernmagnetresonanz (NMR). Für mögliche Chemikalien mit einer biologischen Aktivität, die über längere Zeiträume gelagert wurden, kann die Struktur, Aktivität und Potenz von Kandidaten-Modulatoren bestätigt werden.
  • Abhängig von dem System, das verwendet wird, um Kandidaten-Modulatoren zu identifizieren, kann ein Kandidaten-Modulator eine mögliche pharmakologische Aktivität haben. Wenn z. B. herausgefunden wird, dass der Kandidaten-Modulator T-Zell-Proliferation (Aktivierung) in vitro inhibiert, dann würde der Kandidaten-Modulator mögliche pharmakologische Eigenschaften als ein Immun-Suppressionsmittel oder antiinflamatorisches Mittel haben (vgl. Suthanthiran et al., Am. J. Kidney Disease, 28: 159–172 (1996). Solche Verbindungen sind auf dem Fachgebiet für verschiedene Erkrankungsstadien bekannt und es wird erwartet, dass mit der Zeit weitere entdeckt werden. Basierend auf solchen Verbindungen können geeignete Bestätigungen In-vitro- und In-vivo-Modellen von pharmakologischer Aktivität, genauso wie Toxikologie, ausgewählt werden. Die hier beschriebenen Verfahren können auch verwendet werden, um pharmakologische Selektivität und Spezifität und Toxizität zu bestimmen.
  • Bioverfügbarkeit und Toxikologie von Kandidaten-Modulatoren
  • Einmal identifiziert können Kandidaten-Modulatoren auf Bioverfügbarkeit und toxikologische Wirkungen beurteilt werden unter Verwendung von bekannten Verfahren (vgl. Lu, Basic Toxicology, Fundamentals, Target Organs, and Risk Assessment, Hemisphere Publishing Corp., Washington (1985); U.S. Patent Nr. 5,196,313 Culbreth (eingereicht am 23. März 1993) und U.S. Patent Nr. 5,567,952 Benet (eingereicht am 22. Oktober 1996). Beispielsweise kann die Toxikologie eines Kandidaten-Modulators etabliert werden durch Bestimmen der In-vitro-Toxizität gegenüber einer Zelllinie, wie einer Säuger-Zelllinie, d. h. humanen Zelllinie. Kandidaten-Modulatoren können behandelt werden mit beispielsweise Gewebeextrakten, wie einer Präparation aus Leber, wie mikrosomalen Präparationen, um die Steigerung oder Verringerung der toxikologischen Eigenschaften der Chemikalien nach Metabolisierung durch den ganzen Organismus zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Typen von Studien sind häufig Prognosen für toxikologische Eigenschaften von Chemikalien in Tieren, wie Säugern, einschließlich Menschen.
  • Solche Bioverfügbarkeits- und toxikologischen Verfahren können durchgeführt werden unter Verwendung von Verfahren, vorzugsweise unter Verwendung des Screeningsystems der vorliegenden Erfindung. Solche Verfahren schließen in Kontakt bringen einer Probe ein, die ein Ziel mit wenigsten einem Photon-produzierenden Mittel hat, wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel und einer Testchemikalie. Ein optisches Signal von diesem wenigstens einem Photon-produzierenden Mittel wird nachgewiesen, wobei das optische Signal mit einer toxikologischen Aktivität verbunden ist. Die Verfügbarkeit ist jede, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, und kann nachgewiesen werden, beispielsweise durch Messung von Reportergenen, die während Bioverfügbarkeitskriterien aktiviert werden. Toxikologische Aktivität ist jede auf dem Fachgebiet bekannte, wie Apoptose, Zelllyse, Krenation, Zelltod und dgl. Die toxikologische Aktivität kann gemessen werden unter Verwendung von Reportergenen, die während toxikologischer Aktivität oder durch Zelllyse aktiviert werden (vgl. WO 98/13353, veröffentlicht am 2. April 98). Bevorzugte Reportergene erzeugen ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Translationsprodukt (wie beispielsweise ein grün fluoreszierendes Protein (vgl. beispielsweise U.S. Patent Nr. 5,525,048 Tsien et al., eingereicht am 29. April 1998; U.S. Patent Nr. 5,777,079 Tsien et al., eingereicht am 7. Juli 1998; WO 98/23810 Tsien veröffentlicht am 8. August 1996; WO 97/28261; veröffentlicht am 8/7/97; WO 98/02571 veröffentlicht 22. Januar 1998, WO 98/06737, veröffentlicht 19. Februar 1998) oder ein Translationsprodukt, das ein fluoreszierendes oder lumineszierendes Produkt erzeugen kann (wie beispielsweise Beta-Lactamase (vgl. beispielsweise U.S. Patent Nr. 5,741,657 Tsien, veröffentlicht 4/21/98 und WO 96/30540, veröffentlicht 10/3/96)), wie ein enzymatisches Abbauprodukt. Zelllyse kann in der vorliegenden Erfindung als eine Reduktion in einem Fluoreszenzsignal von wenigstens einem Photon-produzierenden Mittel in einer Zelle in Anwesenheit von wenigstens einem Photon-reduzierenden Mittel nachgewiesen werden. Solche toxikologischen Bestimmungen können durchgeführt werden unter Verwendung von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, optional unter Verwendung von toxikologischem Profiling, wie beschrieben in WO 94/17208, veröffentlicht 4. August 1994, Deutsches Patent Nr. 694 06 772.5-08, eingereicht am 25. November 97; EPC 0680517, eingereicht am 12. November 94; U.S. Patent Nr. 5,589,337, eingereicht am 31. Dezember 96; EPO 651825, eingereicht am 14. Januar 98 und U.S. Patent Nr. 5,585,232, eingereicht am 17. Dezember 96).
  • Alternativ oder zusätzlich zu diesen In-vitro-Untersuchungen kann die Bioverfügbarkeit und die toxikologischen Eigenschaften eines Kandidaten-Modulators in einem Tiermodell wie Mäuse, Ratten, Kaninchen oder Affen bestimmt werden unter Verwendung von etablierten Verfahren (vgl. Lu, oben (1985) und Creasey, Drug Disposition in Humans. The Basis of Clinical Pharmakology, Oxford University Press, Oxford (1979), Osweiler, Toxicology, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1995), Yang, Toxicology of Chemical Mixtures; Case Studies, Mechanisms, and Novel Approaches, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1994), Burrell et al., Toxicology of the immune System; A Human Approach, Van Nostrand Reinhild, Co. (1997), Niesink et al., Toxicology; Principles and Applications, CRC Press, Boca Raton, FL (1996)). Abhängig von der Toxizität, dem Zielorgan, dem Gewebe, dem Ort und dem vermutlichen Mechanismus des Kandidaten-Modulators würde der Fachmann nicht damit belastet werden, geeignete Dosen, LD50-Werte, Verabreichungswege und Pläne zu bestimmen, die geeignet wären, um die toxikologischen Eigenschaften des Kandidaten-Modulators zu bestimmen. Zusätzlich zu Tiermodellen können menschliche klinische Studien durchgeführt werden, die etablierten Verfahren folgen, wie diejenigen, die von der US Nahrungs- und Arzneimittelaufsicht (USFDA) oder äquivalenten anderen Regierungen dargelegt sind. Diese Toxizitätsstudien stellen die Basis zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Kandidaten-Modulators in vivo dar.
  • Wirksamkeit von Kandidaten-Modulatoren
  • Die Wirksamkeit eines Kandidaten-Modulators kann etabliert werden unter Verwendung von verschiedenen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, wie In-vitro-Verfahren, Tiermodellen oder menschlichen klinischen Untersuchungen (vgl. Creasey, oben (1979)). Bekannte In-vitro-Modelle existieren für verschiedene Erkrankungen oder Bedingungen. Beispielsweise ist die Fähigkeit einer Chemikalie, die Lebensspanne von HIV-infizierten Zellen in vitro zu verlängern, als ein akzeptables Modell anerkannt, um Chemikalien zu identifizieren, von denen erwartet wird, dass sie wirksam sind, um HIV-Infektionen oder AIDS zu behandeln (vgl. Daluge et al., Antimicro, Agents Chemother. 41: 1082–1093 (1995)). Weiterhin wurde die Fähigkeit von Cyclosporin A (CsA), die Proliferation von T-Zellen in vitro zu verhindern, etabliert als ein akzeptables Modell, um Chemikalien zu identifizieren, von denen erwartet wird, dass sie wirksam als Immunsuppressionsmittel sind (vgl. Suthanthiran et al., oben, (1996)). Für fast jede Klasse von Therapeutikum, Erkrankung oder Zustand ist ein akzeptables In-vitro- oder Tiermodell erhältlich. Solche Modelle existieren beispielsweise für Gastrointestinal-Erkrankungen, Krebs, Kardiologie, Neurobiologie und Immunologie. Zusätzlich können diese In-vitro-Verfahren Gewebeextrakte verwenden, wie Leberpräparationen, wie mikrosomale Präparationen, um eine verlässliche Indikationswirkung von Chemikalien zur Verfügung zu stellen, um die verschiedenen Erkrankungen oder Zustände zu behandeln. Ähnlich können akzeptable Tiermodelle verwendet werden, um einen verlässlichen Hinweis auf die Wirksamkeit von Chemikalien zur Behandlung von verschiedener Erkrankungen und Zustände zur Verfügung zu stellen. Beispielsweise ist das Kaninchenknie ein akzeptiertes Modell für das Testen von Chemikalien auf Wirksamkeit in der Behandlung von Arthritis (vgl. Shaw und Lacy, J. Bone Joint Surg. (Br) 55: 197–205 (1973)). Hydrokortison, das zur Verwendung in Menschen zur Behandlung von Arthritis anerkannt ist, ist wirksam in diesem Modell, was die Zuverlässigkeit dieses Modells bestätigt (vgl. McDonough, Phys. Ther. 62: 835–839 (1982)). Bei der Auswahl eines geeigneten Modells, um die Wirksamkeit eines Kandidaten-Modulators zu bestimmen, kann der Fachmann durch den Stand der Technik angeleitet werden, um ein geeignetes Modell, Dosis und Weg der Verabreichung, Verabreichungsplan und Endpunkt zu wählen und würde somit nicht unnötig belastet.
  • Zusätzlich zu Tiermodellen können humane klinische Studien verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Kandidaten-Modulators in Menschen zu bestimmen. Die USFDA, oder äquivalente Regierungsbüros haben etablierte Verfahren für solche Studien (vgl. www.fda.gov).
  • Selektivität von Modulator-Kandidaten
  • Die vorstehend beschriebenen in-vitro und in-vivo Verfahren etablieren auch die Selektivität eines Modulator-Kandidaten. Es ist bekannt, dass Chemikalien eine große Vielzahl von biologischen Verfahren modulieren können oder selektiv sein können. Eine Reihe von Zellen, basierend auf der vorliegenden Erfindung, können verwendet werden, um die Spezifität von dem Modulator-Kandidaten zu bestimmen. Selektivität ist beispielsweise auf dem Gebiet der Chemotherapie wichtig, wo die Selektivität einer Chemikalie toxisch gegenüber Krebszellen zu sein, jedoch nicht gegenüber Nicht-Krebszellen natürlich wünschenswert ist. Selektive Modulatoren sind vorzuziehen, da sie geringere Nebenwirkungen in den klinischen Anordnungen haben. Die Selektivität eines Modulator-Kandidaten kann in vitro etabliert werden durch Testen der Toxizität und der Wirkung eines Modulator-Kandidaten auf eine Vielzahl von Zelllinien, die eine Vielzahl von zellulären Signalwegen und Empfindlichkeiten zeigen. Daten, die von diesen In-vitro-Toxizitätsstudien erhalten wurden, können auf Tiermodell-Untersuchungen ausgedehnt werden, einschließlich humanen klinischen Untersuchungen, um Toxizität, Wirksamkeit und Selektivität des Modulator-Kandidaten zu bestimmen.
  • Identifizierte Zusammensetzungen
  • Die Erfindung schließt Zusammensetzungen wie neue Chemikalien und Therapeutika ein, die durch die Anwendung der Verfahren, Systeme und Verbindungen, die hier beschrieben sind identifiziert wurden, eine Aktivität zu haben. Neue Chemikalien, wie hier verwendet, schließen nicht Chemikalien ein, die bereits vor dem Tag dieser Anmeldung öffentlich auf dem Fachgebiet bekannt waren. Typischerweise wird eine Chemikalie durch die Verwendung der Erfindung identifiziert eine Aktivität zu haben und dann wird ihre Struktur von einer eigenen Datenbank von chemischen Strukturen bestätigt oder durch analytische Techniken, wie Massenspektroskopie, bestätigt.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist eine Chemikalie mit nützlicher Aktivität, umfassend eine Chemikalie, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wurde. Solche Zusammensetzungen schließen kleine organische Moleküle, Nukleinsäuren, Peptide oder andere Moleküle ein, die leicht synthetisiert werden können durch Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und in der Zukunft entwickelt werden. Beispielsweise sind die folgenden kombinatorischen Verbindungen geeignet zum Screenen: Peptoide (PCT Veröffentlichungsnummer WO 91/19735, 26. Dezember 1991), kodierte Peptide (PCT Veröffentlichungsnummer WO 93/20242, 14. Oktober 1993), Zufalls-Bio-Oligomere (PCT Veröffentlichung WO 92/00091, 9. Januar 1992), Benzodiazepine (U.S. Patent Nr. 5,288,514), Diversomere wie Hydantoine, Benzodiazepine und Dipeptide (Hobbs DeWitt, S. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909–6913 (1993)), vinyloge Polypeptide (Hagihara et al., Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), nicht-peptidische Peptidomimetica mit einem Beta-D-Glukose-Gerüst (Hirschmann, R. et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217–9218 (1992)), analoge organische Synthesen von Bibliotheken kleiner Verbindungen (Chen, C. et al., Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), Oligocarbamate (Cho, C. Y. et al., Science 261: 1303 (1993)), und/oder Peptidyl-Phosphonate (Cambell, D. A. et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)). Vgl. allgemein Gordon, E. M. et al., J. Med Chem. 37: 1385 (1994).
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die identifizierten Chemikalien und ihre jeweiligen Zusammensetzungen, typischerweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst, der für Lagerung und nachfolgende Verabreichung hergestellt wurde, die eine pharmazeutisch wirksame Menge der vorstehend offenbarten Produkte in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel haben. Verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel zur therapeutischen Verwendung sind auf dem pharmazeutischen Fachgebiet gut bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Remingtons's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Farbstoffe und auch Geschmacksstoffe können in der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verfügung gestellt werden. Beispielsweise Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester von p-Hydroxybenzonsäure können als Konservierungsmittel zugesetzt werden. Zusätzlich können Antioxydantien und Lösungsmittel zugesetzt werden.
  • Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können formuliert werden und als Tabletten, Kapseln oder Elixiere zur oralen Verabreichung verwendet werden; Suppositorien für rektale Verabreichung; sterile Lösungen, Suspensionen für injizierbare Verabreichung und dgl. Injizierbare Formen können hergestellt werden in konventioneller Form, entweder als Flüssiglösung oder Suspensionen, Festformen, geeignet für Lösungen oder Suspensionen in Flüssigkeit vor der Injektion, oder als Emulsionen. Geeignete Arzneiträger sind beispielsweise Wasser, Saline, Dextrose, Mannitol, Laktose, Lezithin, Albumin, Natrium-Glutamat, Cystein-Hydrochlorid und der gleichen. Zusätzlich können injizierbare pharmazeutische Zusammensetzung, falls gewünscht, geringere Mengen nicht toxischer Hilfssubstanzen enthalten, wie Befeuchtungsmittel, pH-Puffermittel und dgl. Falls gewünscht, können absorptionsverstärkende Präparationen (z. B. Liposomen) verwendet werden.
  • Die pharmazeutisch wirksame Menge der Zusammensetzung, die für eine Dosis erforderlich ist, hängt von dem Weg der Verabreichung, dem Typ von Tier, das behandelt werden soll, und den physikalischen Eigenschaften des spezifischen Tiers, das zur Diskussion steht, ab. Die Dosis kann zugeschnitten werden, um eine gewünschte Wirkung zu erzielen, sie hängt jedoch von solchen Faktoren wie Gewicht, Diät, gleichzeitiger Medikation und anderen Faktoren ab, die der Fachmann auf dem Gebiet der Medizin kennt.
  • Bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren können die Produkte oder Zusammensetzungen allein oder in Kombination mit einer anderen verwendet werden, oder in Kombination mit anderen Therapeutika oder diagnostischen Mitteln. Diese Produkte können verwendet werden in vivo, normalerweise in einem Säuger, bevorzugt in einem Menschen oder in vitro. Werden sie in vivo eingesetzt, können die Produkte oder Zusammensetzungen an den Säuger auf einer Vielzahl von Wegen verabreicht werden, einschließlich parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, kolonikal, rektal, nasal oder intraperitoneal, unter Einsatz einer Vielzahl von Dosierungsformen. Solche Verfahren können auch angewendet werden, um die chemische Aktivität in vivo zu testen.
  • Wie für den Fachmann leicht ersichtlich ist, variieren die nützliche in vivo Dosierung, die verabreicht werden soll, und der bestimmte Modus der Verabreichung, abhängig von dem Alter, dem Gewicht und der Säugerspezies, die behandelt wird, den bestimmten Verbindungen, die verwendet werden, und der spezifischen Verwendung, für die diese Verbindungen verwendet werden. Die Bestimmung von wirksamen Virusspiegeln, das sind die Dosierungsspiegel, die notwendig sind, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen, können vom Fachmann erreicht werden durch routinemäßige pharmakologische Verfahren. Typischerweise beginnen humane klinische Verabreichungen von Produkten bei geringeren Dosierungsspiegeln, wobei die Dosierungsspiegel gesteigert werden, bis die gewünschte Wirkung erreicht wird. Alternativ können akzeptable in vitro Untersuchungen verwendet werden, um nützliche Dosierungen und Wege der Verabreichung der Zusammensetzungen, die durch die vorliegenden Verfahren unter Verwendung von etablierten pharmakologischen Verfahren identifiziert wurden, zu etablieren.
  • Bei nicht humanen Tierstudien beginnen Verabreichungen von potentiellen Produkten bei höheren Dosierungsspiegeln, wobei die Dosierung verringert wird, bis die gewünschte Wirkung nicht länger erreicht wird oder schädliche Nebenwirkungen verschwinden. Die Dosierung für die Produkte der vorliegenden Erfindung können stark schwanken, abhängig von den gewünschten Wirkungen und der therapeutischen Indikation. Typische Dosierungen können zwischen etwa 10 kg/kg und 100 mg/kg Körpergewicht liegen, vorzugsweise zwischen etwa 100 μg/kg und 10 mg/kg Körpergewicht. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise oral auf einer täglichen Basis.
  • Die genaue Formulierung, der Weg der Verabreichung und die Dosierung kann von dem individuellen Arzt im Hinblick auf den Patientenzustand gewählt werden (vgl. z. B. Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975). Es sollte beachtet werden, dass der ausführende Arzt weiß, wie und wann abzubrechen, zu unterbrechen oder die Verabreichung einzustellen ist aufgrund von Toxizität oder Organdysfunktion. Umgekehrt weiß der ausführende Arzt auch die Behandlung zu höheren Spiegeln einzustellen, wenn die klinische Antwort nicht angemessen ist (Toxizität ausgeschlossen). Die Größenordnung einer Verabreichungsdosis in der Behandlung einer Störung von Interesse wird von der Schwere des Zustands, der behandelt werden soll, und dem Weg der Verabreichung abhängen. Die Schwere des Zustand kann beispielsweise teilweise durch Standard-prognostische Bewertungsverfahren bewertet werden. Weiterhin variiert die Dosis und wahrscheinlich die Dosisfrequenz auch gemäß dem Alter, dem Körpergewicht und der Antwort des individuellen Patienten. Ein Programm, vergleichbar zu dem vorstehend diskutierten, kann in der Veterinärmedizin verwendet werden.
  • Abhängig von den spezifischen Zuständen, die behandelt werden sollen, können solche Mittel formuliert und systemisch oder lokal verabreicht werden. Techniken zur Formulierung und Verabreichung können gefunden werden in Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Geeignete Wege schließen orale, rektale, transdermale, vaginale, transmukosale oder intestinale Verabreichung ein; parenterale Lieferung, einschließlich intramuskuläre, subkutane, intramedullare Injektion, genauso wie intrathekale, direkt intraventrikulare, intravenöse, intraperitoneale, intranasale oder intraokulare Injektionen.
  • Zur Injektion können die erfindungsgemäßen Mittel in wässrigen Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie Hanks' Lösung, Ringer's Lösung oder physiologischem Salzpuffer. Bei solch transmukosaler Verabreichung werden Durchdringungsmittel (Penetrantien), die geeignet sind für die Barriere, die durchdrungen werden soll, in der Formulierung verwendet. Solche Durchdringungsmittel sind allgemein auf dem Fachgebiet bekannt. Die Verwendung von pharmazeutisch verträglichen Trägern, um die Verbindungen, die hier offenbart sind für die Durchführung der Erfindung in Dosierungen zu formulieren, die geeignet für systemische Verabreichung sind, liegt im Rahmen der Erfindung. Mit geeigneter Wahl des Trägers und geeigneter Herstellungspraxis können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, insbesondere diejenigen, die als Lösungen formuliert sind, parenteral verabreicht werden, wie durch intravenöse Injektion. Die Verbindungen können leicht formuliert werden unter Verwendung von pharmazeutisch verträglichen Trägern, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, in Dosierungen, die geeignet sind für orale Verabreichung. Solche Träger ermöglichen es, die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirup, Schäume, Suspensionen und dgl. für orale Aufnahme durch einen Patienten, der behandelt werden soll, zu formulieren.
  • Mittel, die dafür gedacht sind, intrazellulär verabreicht zu werden, können verabreicht werden unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Beispielsweise können solche Mittel in Liposome eingekapselt werden, dann, wie vorstehen beschrieben, verabreicht werden. Alle Moleküle, die in einer wässrigen Lösung zum Zeitpunkt der Liposomenbildung vorliegen, werden in das wässrige Innere eingeschlossen. Die Liposomeninhalte sind von der externen Mikroumgebung geschützt und werden, da die Liposomen mit Zellmembranen fusionieren, effizient in das Zell-Zytoplasma geliefert. Zusätzlich können kleine organische Moleküle direkt intrazellulär verabreicht werden aufgrund ihrer Hydrophobizität.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die geeignet sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, schließen Zusammensetzungen ein, in denen die aktiven Inhaltsstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den gewünschten Zweck zu erfüllen. Die Bestimmung der wirksamen Mengen ist für den Fachmann leicht, insbesondere im Lichte der detaillierten Offenbarung, die zur Verfügung gestellt wird. Zusätzlich zu den aktiven Inhaltsstoffen können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, umfassend Arzneiträger und Hilfsstoffe, die die Verarbeitung der Verbindungen in Präparationen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die Präparationen, die für orale Verabreichung formuliert sind, können in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln oder Lösungen sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden in einer Weise, die bekannt ist, z. B. durch Mittel des konventionellen Mischens, Lösens, Granulierens, der Dragee-Herstellung, des Verreibens, der Emulsionsherstellung, des Einkapselns, des Einschließens oder durch Lyophilisierungsverfahren.
  • Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung schließen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form ein. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen hergestellt werden als geeignete ölige Injektionssuspensionen. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen fettige Öle, wie Sesamöl, oder synthetische Fettsäure-Ester, wie Ethyl-Oleat oder Triglyzeride oder Liposomen ein. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspensionen steigern, wie Natrium-Karboxymethyl-Zellulose, Sorbitol oder Dextrin. Optional können die Suspensionen auch geeignete Stabilisatoren enthalten oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen steigern, um es zu ermöglichen, Präparationen von hochkonzentrierten Lösungen herzustellen.
  • Pharmazeutische Präparationen zur oralen Verwendung können erhalten werden durch Kombinieren der aktiven Verbindungen mit festen Arzneiträgern, optional durch Mahlen eines resultierenden Gemisches und Prozessieren des Gemisches von Körnchen, nach Zusatz von geeigneten Hilfsstoffen, falls gewünscht, um Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Arzneiträger sind, insbesondere Füllstoffe wie Zucker, einschließlich Laktose, Saccharose, Mannitol oder Sorbitol; Zellulose-Präparationen, wie beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragakanthgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Natrium-Karboxymethyl-Zellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Falls gewünscht, könnten auflösende Mittel zugesetzt werden, wie das kreuz-vernetzte Polyvinyl-Pyrrolidon, Agar- oder Algininsäure oder ein Salz davon, wie Natriumalginat. Drageekerne werden zur Verfügung gestellt mit geeigneten Umhüllungen. Für diesen Zweck können geeignete konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummiarabicum, Talg, Polyvinyl-Pyrrolidone, Karbopolgel, Polyethylenglykol und/oder Titan-Dioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsgemische enthalten können. Farbstoffe oder Pigmente können zugesetzt werden zu den Tabletten oder Drageebeschichtungen zur Identifizierung oder zur Charakterisierung von verschiedenen Kombinationen der aktiven Verbindungsdosen. Solche Formulierungen können hergestellt werden unter Verwendung der Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (vgl. z. B. U.S. Patent Nr. 5,733,888 (injizierbare Verbindungen); 5,726,181 (schlecht wasserlösliche Verbindungen); 5,707,641 (therapeutische aktive Proteine oder Peptide); 5,667,809 (lipophile Mittel); 5,576,012 (lösende polymere Mittel); 5,707,615 (antivirale Formulierungen); 5,683,676 (Partikel-Medikamente); 5,654,286 (topicale Formulierungen); 5,688,529 (orale Suspensionen); 5,445,829 (Formulierungen mit verlängerter Entlassung); 5,653,987 (flüssige Formulierungen); 5,641,515 (Formulierungen mit kontrollierter Entlassung) und 5,601,845 (spheroide Formulierungen).
  • Kits
  • Die Materialien und Zusammensetzungen, die hier zur Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben werden, passen ideal für die Herstellung eines Kits. Solch ein Kit kann ein Trägermittel umfassen, das in Kompartimente eingeteilt ist, um ein oder mehrere Containermittel aufzunehmen, umfassend eins der getrennten Elemente, die in dem Verfahren verwendet werden sollen. Beispielsweise kann eines der Containermittel ein Photon-reduzierendes Mittel umfassen. Ein zweiter Container kann weiterhin eine feste Oberfläche umfassen, beispielsweise eine Vertiefung einer Plattform mit vielen Vertiefungen, wie eine Mikrotiterplatte. Das Photon-reduzierende Mittel kann in flüssiger oder lyophilisierter Form sein, wie gewünscht.
  • BEISPIELE
  • Die Struktur von CCF2/AM, die in den Experimenten verwendet wurde, ist hier beschrieben:
  • Figure 00390001
  • Beispiel 1 – REDUKTION DER LÖSUNGSFLUORESZENZ
  • Um die Fähigkeit eines Photon-reduzierenden Mittels die Fluoreszenz einer Lösung zu reduzieren zu untersuchen, wurde die Emission einer Fluorophore von einer Probe beobachtet in Anwesenheit und Abwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels. Die folgenden Experimente zeigen, dass Photon-reduzierende Mittel verwendet werden können, um lösungsbasierte Fluoreszenz von einer Fluorophore zu reduzieren.
  • Fluoreszenz von einer Lösung eines blauen Fluoreszenz-Farbstoffs, 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin 3-Carboxylat wurde in Anwesenheit und Abwesenheit von 1 mM Phenol Rot als Photon reduzierendes Mittel bestimmt. Eine Lösung von 0,5 μM 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin 3-Carboxylat in Lösung, enthaltend 50% (vol/vol) wässrigen 39 mM Phosphatpuffer, pH 7,5 und 50% (vol/vol) Methanol wurde hergestellt. Nach Aufnahme des ersten Fluoreszenzspektrums (front face) der Lösung auf einer Spex-Fluorolog 2, wurde 1% (vol/vol) einer 100 mM wässrigen Phenol Rot Stock-Lösung zugesetzt und ein weiteres Spektrum genommen. Front-face-Fluoreszenz bezieht sich auf Anregen der Probe mit einem rechten Winkel zur Probenoberfläche und Sammeln des emittierten Lichts (beispielsweise von der angeregten Region oder Emissionsregion) bei 12,5 Grad von solch einem Anregungswinkel.
  • 2 zeigt dieses Spektrum. Der Zusatz von Phenol Rot reduzierte die front face Fluoreszenz 70-fach. Das Photon-reduzierende Mittel Phenol Rot reduzierte im Wesentlichen das lösungsbasierte Fluoreszenzsignal. Obwohl die Erfinder nicht auf irgendeinen angenommenen Mechanismus festgelegt werden wollen, bei 50% (vol/vol) kann das organische Lösungsmittel (Methanol) in der Lösung die Assoziation der Farbstoffmoleküle in Lösung verhindern. Dies stimmt mit der Erklärung überein, dass Fluoreszenzreduktion kein Grundstatus Fluoreszenz-Quenching aufgrund von Farbstoffstapelung (stacking) benötigt. Dieses Ergebnis stimmt mit einem Photon reduzierenden Mittel überein, das Fluoreszenz der Fluorophore verringert durch Absorbieren des Anregungs- oder Emissionslichts zu oder von der Fluorophore oder durch Akzeptieren der Energie des angeregten Singlet-Status' der Fluorophore (ein Status, der zu Fluoreszenz führt) durch einen weit reichenden Energietransfer-Mechanismus, wie Fluoreszenzresonanz-Energietransfer.
  • Beispiel 2 – REDUKTION VON LÖSUNGSFLUORESZENZ IST NICHT NOTWENDIGERWEISE MIT STAPELUNG ASSOZIIERT
  • Um weiterhin die Fähigkeit eines Photon-reduzierenden Mittels zu untersuchen, die Fluoreszenz einer Lösung zu reduzieren, wurde die Fluoreszenz eines Farbstoffs in Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels beobachtet in Anwesenheit und Abwesenheit von Methanol. Das folgende Experiment zeigt, dass ein Photon-reduzierendes Mittel, Phenol rot, verwendet werden kann, um Fluoreszenz von einer Fluorophore in wässriger Lösung ohne Farbstoffstapelung zu reduzieren.
  • Die Fluoreszenz einer Fluorophore in Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels (Phenol rot) wurde bestimmt in sowohl wässrigen Puffer als auch wässrigem Puffer, enthaltend 50% (vol/vol) Methanol. Eine 10 μM Lösung von 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin-3-Carboxylat wurde hergestellt in 39 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, und in einem 1 : 1 Gemisch des gleichen Phosphatpuffers und Methanol. 1% (vol/vol) von einer 100 mM wässrigen Phenol rot Stock-Lösung wurde den Lösungen zugesetzt.
  • 3 zeigt Front-face Fluoreszenzspektren dieser Lösungen, die auf einer Spex-Fluorolog 2 erhalten wurden. Die Anwesenheit von Methanol steigerte die Fluoreszenz verglichen mit einem reinen wässrigen Puffer. Diese Ergebnisse bestätigen weiterhin, dass die Fluoreszenz-Variierung, die in Beispiel 1 beobachtet wurde, nicht insgesamt aufgrund von Farbstoffstapelung auftrat. Es ist zu beachten, dass die relativen Fluoreszenzen im Beispiel 2 vergleichbar oder geringer ist als die Fluoreszenz von der Coumarin/Phenol Rot Probe aus Beispiel 1.
  • Die gesteigerte Fluoreszenz in Anwesenheit von Methanol in dem Puffer stimmt mit der Erkenntnis überein, dass 50% Methanolpuffer 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin-3-Carboxylat-Fluoreszenz in Abwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels um etwa 30% steigerte. Die gesteigerte Fluoreszenz in Anwesenheit von Methanol in dem Puffer ist auch in Übereinstimmung mit der Erkenntnis, dass 50% Methanolpuffer die Absorption des Photonreduzierenden Mittels Phenol Rot bei der Emissionswellenlänge von Coumarin um etwa 20% verringerte. Unter diesen Bedingungen trägt Stapelung von Farbstoff-basiertem, Photon-reduzierendem Mittel und dem Photon produzierenden Mittel nicht signifikant zur Fluoreszenz-reduzierenden Wirkung von Farbstoff-basierten, Photon-reduzierenden Mitteln bei. Farbstoffstapelung ist besonders unwahrscheinlich, wenn die Fluorophore sehr wasserlöslich ist und klein, wie 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin-3-Carboxylat.
  • Beispiel 3 – TEST DER REDUKTION VON LÖSUNGSFLUORESZENZ UNTER VERWENDUNG EINES NICHT-FARBSTOFF QUENCHERS UND VON PARTIKELN
  • Um die Fähigkeit eines Kandidaten für ein Photon-reduzierendes Mittel, die Fluoreszenz einer Lösung zu reduzieren, zu untersuchen, wurde die Fluoreszenz einer Fluorophore in Anwesenheit eines Kandidaten für ein Photon-reduzierendes Mittel beobachtet als eine Funktion der Konzentration des Photon-reduzierenden Mittels. Die verwendeten Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel waren nicht Farbstoffmoleküle und Partikel. Die folgenden Experimente zeigen, dass Nicht-Farbstoffmoleküle und Partikel verwendet werden können als Photon-reduzierende Mittel, um die Fluoreszenz von einer Fluorophore im wässrigen Puffer zu reduzieren.
  • Signale von fluoreszierenden Farbstofflösungen, die kein Photon-reduzierendes Mittel oder Photon-reduzierende Mittel enthalten, wie Schilling Rot (Wasser, Propylen Glykol, FD&C Rot Nr. 40 (Allura Rot), FD&C Rot Nr. 3 und Propyparaben (McCormick & Co., Inc. Hunt Valley, MD) und Phenol Rot, wurden mit Lösungen verglichen, die Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel, Nicht-Farbstoffmoleküle (Diatrizonsäure und Tris (2-Aminoäthyl) Amin) und Partikeltinte (Higgins ink) enthielten. In einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden zweifach serielle Verdünnungen von wässriger 0,5 M Diatrizonsäure und 1 M Tris (2-Aminoethyl) Amin (eingestellt auf pH 7,5 mit Hydrochlorsäure), 100 mM Phenol Rot, Schilling Rot Lebensmittelfarbstoff und Higgins ink hergestellt in der Anwesenheit von 10 μM 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin-3-Carboxylat in dem 39 mM Phosphatpuffer (pH 7,5). Das Volumen der Vertiefung war 100 μl. Eine zweifach serielle Verdünnung von 10 μM 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin-3-Carboxylat in Phosphatpuffer pH 7,5 wurde zum Vergleich hergestellt. Es zeigte sich ein lineares Signal über den Bereich der Coumarin-Konzentrationen, die hier untersucht wurden. Die Fluoreszenz-Emissionsintensität der Proben wurde gemessen auf einem Cytofluor Mikrotiterplatten-Fluorimeter. Die Proben wurden angeregt mit 395 nm Licht und die Fluoreszenz-Emission wurde bei 460 nm gemessen. Die Daten für die Higgins ink- und Schilling-Rot-Lösungen wurden normiert durch Absorption bei 395 nm und 460 nm zu Phenol-Rot-Lösung, da ihre Konzentration entweder unbekannt waren (Schilling-Rot) oder nicht definiert (Higgins ink).
  • 4 zeigt graphisch die Konzentration des Kandidaten für das Photon-reduzierende Mittel gegen die übrige Coumarin-Fluoreszenz, was die Abhängigkeit der Proben-Fluoreszenz von Konzentration des Kandidaten für das Photon-reduzierende Mittel zeigt. Eine effiziente Reduktion der Fluoreszenz tritt bei Nicht-Farbstoffkonzentrationen größer als 0,5 M auf, während die partikelförmigen Higgins ink und Schilling-Rot ähnlich wirksam bei Phenol-Rot waren. Das Ergebnis zeigt, dass Photon-reduzierende Mittel, die nur als kollisionale Quencher wirken (Diatrizon-Säure und Tris (2-Aminoäthyl) Amin) typischerweise Konzentrationen erfordern von mehr als 100 mM, die zu Ionenstärke Wirkungen in potentiellen Assays beitragen. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass ein Photon-reduzierendes Mittel, das aus lichtabsorbierenden (oder lichtstreuenden) Partikeln besteht, wie Tinte, effektiv Lösungsfluoreszenz reduzieren kann.
  • Beispiel 4 – TEST DER REDUKTION VON LÖSUNGSFLUORESZENZ UNTER VERWENDUNG VON FARBSTOFF-BASIERTEN PHOTON-REDUZIERENDEN MITTELN MIT ABSORPTIONSSPEKTREN, DIE AUSREICHEND MIT DEM EMISSIONS- ODER ANREGUNGSSPEKTRUM DES PHOTON-PRODUZIERENDEN MITTELS ÜBERLAPPEN
  • Um die Fähigkeit von Kandidaten für farbstoff-basierte Photon-reduzierende Mittel zur Reduktion von Fluoreszenz in einer Lösung zu untersuchen, wurde die Fluoreszenz einer Fluorophore in Anwesenheit von einem Kandidaten für ein Photon-reduzierendes Mittel beobachtet als eine Funktion der Konzentration des Photon-reduzierenden Mittel. Die Kandidaten für das Photon-reduzierende Mittel waren Farbstoffmoleküle mit unterschiedlichen Absorptionsspektren verglichen mit drei verschiedenen Fluorophoren. Die folgenden Experimente zeigen, dass farbstoff-basierte Photon-reduzierende Mittel am effektivsten sind in der Reduktion von lösungsbasierter Fluoreszenz, wenn ihr Absorptionsmaximum signifikant mit dem Anregungs- oder Emissionsspektrum der Fluorophore überlappt.
  • Die Wirksamkeit, mit der wasserlösliche Farbstoffe (Photon-reduzierende Mittel) oder verschiedene Farben in der Lage sind, die Fluoreszenz von Fluorophore-Lösungen in 7-Hydroxy-Coumarin, CCF2, Fluoreszein und Rhodamin B zu reduzieren, wurde untersucht. Ein Gemisch von Farbstoff-Photon-reduzierenden Mitteln mit hoher Extinktion über einen Bereich von 380–555 nM (genannt Tararaf) wurde auch untersucht.
  • TABELLE 1
    Figure 00430001
  • Tararaf enthält Tartrazin, Säure Rot 37 und Säure Fuchsie in einem molaren Verhältnis von 5 : 6 : 4)
  • TABELLE 2
    Figure 00440001
  • 20 mM der Farbstoff-Photon-reduzierenden Mittel wurden in 39 mM Phosphatpuffer pH 7,43, enthaltend 10 μM Fluoreszenz-Farbstoff, hergestellt. Die Tararaf-Gemischkonzentration wurde eingestellt, so dass der Bestandteil Tartrazin 20 mM ist. In einer Fluoreszenzmikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden zehn zweifach serielle Verdünnungen von diesen Farbstoffen hergestellt mit Puffer, enthaltend 10 μM Fluoreszenz-Farbstoff. Die Fluoreszenz der Lösungen in den Vertiefungen wurde gemessen unter Verwendung eines Mikrotiter-Fluorimeters. Von den Werten wurde der Hintergrund abgezogen und sie wurden dividiert durch den Wert, der für 10 μM Fluoreszenz-Farbstoff in Abwesenheit von Photon-reduzierendem Mittel erhalten wurde. Die so erhaltenen Werte wurden Restfluoreszenz genannt.
  • 5 zeigt 6-Chloro-7-Hydroxy-Coumarin 3-Carboxylat-Lösungsfluoreszenz als eine Funktion von der Konzentration des Photon-reduzierenden Mittels. Einzelne gelbe Farbstoffe, die Coumarin Anregungs- und Emissionslicht absorbieren, reduzieren Fluoreszenz bei geringeren Konzentrationen besser als einzelne Rot- oder Blau-Farbstoffe. Tararaf reduzierte auch wirksam Lösungsfluoreszenz. Das Absorptionsspektrum der Bestandteile von Tararaf überlappt signifikant mit den Anregungs- und Emissionsspektren von dieser Fluorophore.
  • 6 zeigt Fluorescein-Lösungsfluoreszenz als eine Funktion der Konzentration von gefärbtem, Photon-reduzierendem Mittel. Einzelne Gelb- und Rot-Farbstoffe, die in den Anregungs- und/oder Emissionsspektren von Fluorescein absorbieren, reduzierten Lösungsfluoreszenz bei geringeren Konzentrationen besser als Blau-Farbstoffe, die vornehmlich außerhalb des Wellenlängenbereichs absorbierten. Tararaf reduzierte auch wirksam Lösungsfluoreszenz. Das Absorptionsspektrum der Bestandteile von Tararaf überlappte signifikant mit den Anregungs- und Emissionsspektren dieser Fluorophore.
  • 7 zeigt Rhodamin Lösungsfluoreszenz als eine Funktion der Konzentration von gefärbtem Photon reduzierenden Mittel. Rot-Farbstoffe, die im Anregungsspektrum von Rhodamin und Blau-Farbstoffe, die in dem Emissionsspektrum von Rhodamin absorbierten, reduzierten Lösungsfluoreszenz bei geringeren Konzentrationen stärker als Gelb-Farbstoffe, die außerhalb des Wellenlängenbereichs absorbierten. Tararaf reduzierte Lösungsfluoreszenz wirksam. Das Absorptionsspektrum der Bestandteile von Tararaf überlappte signifikant mit dem Anregungsspektrum dieser Fluorophore.
  • 8 zeigt übrige CCF2-Lösungsfluoreszenz als eine Funktion der Konzentration von gefärbtem, Photon-reduzierendem Mittel. Einzelne Gelb- und Rot-Farbstoffe, die in den Anregungs- und/oder Emissionsspektren von CCF2 absorbierten, reduzierten Fluoreszenz bei geringeren Konzentrationen als Blau-Farbstoffe, die außerhalb des Bereichs absorbierten. Tararaf reduzierte auch die Lösungsfluoreszenz wirksam. Die Absorptionsspektren der Bestandteile von Tararaf überlappten signifikant mit dem Anregungs- und Emissionsspektrum dieser Fluorophore.
  • Diese Experimente zeigen, dass Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel am wirksamsten in der Reduktion von lösungsbasierter Fluoreszenz sind, wenn ihre Absorptionsmaxima im Spektralbereich der Anregungs- und/oder Emission der Fluorophore liegen.
  • Beispiel 5 – TEST DER REDUKTION VON LÖSUNGSFLUORESZENZ UNTER VERWENDUNG VON NICHT-FARBSTOFF-BASIERTEN, PHOTON-REDUZIERENDEN MITTELN, DIE ELEKTRONISCH MIT DEM PHOTON-PRODUZIERENDEN MITTEL INTERAGIEREN
  • Um die Fähigkeit eines Kandidaten eines Übergansmetall-basierten oder Übergangsmetallkomplex-basierten Photon-reduzierenden Mittels, Fluoreszenz, die von einer Lösung emittiert wird, zu reduzieren, zu untersuchen, wurde Fluoreszenz einer Fluorophore in Anwesenheit eines Kandidaten für ein Photon-reduzierendes Mittel beobachtet, als eine Funktion der Konzentration des Photon-reduzierenden Mittels. Die Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel, die verwendet wurden, waren Ionen, die potentiell elektronisch mit einer Fluorophore interagieren können. Die folgenden Experimente zeigen, dass nicht-Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel, die Übergangsmetall-basiert oder Übergangsmetallkomplex-basiert sind, leicht getestet werden und ausgewählt werden können, um lösungsbasierte Fluoreszenz einer bestimmten Fluorophore zu reduzieren. Die folgenden Experimente zeigen, dass Salze von Übergangsmetallen und ihre Komplexe als Photon-reduzierende Mittel von spezifischen Fluorophoren wirken können.
  • Fluoreszenz wurde gemessen mit einem Mikrotiterplatten-Fluorimeter mit Anregung bei 395 nm und Emission bei 460 nm für die Coumarin-Fluorophore, Anregung bei 485 nm und Emission bei 530 nm für Fluorescein und Anregung bei 530 nm und Emission bei 590 nm für Rhodamin B. 500 mM-Lösungen von Kalium-Ferrocyanid (II), Kalium-Ferricyanid (III), Nickel (II) Chlorid und Kupfer (II) Sulfat wurden in Wasser hergestellt. 800 μl jeder Stock-Lösung wurden verdünnt mit 190 μl 50 mM K-MOPS pH 7,15 und 10 μl 1 mM Fluorophore-Lösung auf letztlich 400 mM (Stock-Lösung). Zweifach serielle Lösungen dieser Stock-Lösungen in 10 μM Fluorophore enthalten K-MOPS-Puffer wurden präpariert in schwarzen Costar-Platten mit 96 Vertiefungen (klarer Boden). Wie in Beispiel 4 wurde der Hintergrund von den Messwerten abgezogen und normiert auf Werte, die von der Fluorophore in Abwesenheit der Photon-reduzierenden Mittel erhalten wurden (vgl. 9).
  • Diese Experimente zeigen, dass Fluoreszenz von Coumarin-Fluorophoren reduziert werden kann durch Eisen (III) und Nickel (II) Salze in geringem millimolaren Bereich. Andere Kombinationen von Ionen-Fluorophoren zeigten eine Wirkung bei höheren Konzentrationen (etwa 10 mM und darüber).
  • Beispiel 6 – TEST DER REDUKTION VON LÖSUNGSFLUORESZENZ ALS FUNKTION DER PFADLÄNGE
  • Um weiterhin die Fähigkeit von Photon-reduzierenden Mitteln, die Fluoreszenz, die von einer Lösung emittiert wird, zu reduzieren zu untersuchen, wurde Fluoreszenz, die von einer Lösung, enthaltend eine Fluorophore in Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels, als eine Funktion der Probendicke beobachtet. Die folgenden Experimente zeigen überraschenderweise, dass Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel Lösungsfluoreszenz einer Fluorophore bei kurzen Übertragungsdistanzen reduzieren.
  • Ein Photon-reduzierendes Mittel, Phenol-Rot, wurde mit einer Fluorophore, Coumarin, getestet, als eine Funktion der Probendicke (Pfadlänge). Das Experiment wurde durchgeführt unter Verwendung eines Mikroskops, das mit Epifluoreszenz ausgestattet war. Die Flüssigproben wurden in Niederfluoreszen Kapillarröhrchen einer definierten Pfadlänge gegeben (Vitro Dynamics, Rockaway NJ), wie in den Diagrammen angegeben. Die folgenden Proben wurden ausgewertet:
    • 1) 10 μM Coumarin (Diamanten)
    • 2) 10 μM Coumarin + 1 mM Phenol-Rot (Quadrate)
    • 3) 10 μM Coumarin + 5% (vol/vol) Schilling-Rot (Dreiecke).
  • Die Proben wurden angeregt unter Verwendung eines 405/20 Filter durch einen 425 dichronischen Reflektor durch ein 20 × Objektiv (Zeiss 20 × Fluar). Emittiertes Licht wurde gefiltert durch einen 460/50 Filter und nachgewiesen durch eine intensivierte CCD-Kamera (Stanford Photonics, Menlo Park, CA). Die Detektorausgabe wurde konvertiert zu einem 512 × 512 Pixel Acht-Bit-Digitalbild. Die Daten spiegeln die durchschnittliche Intensität in einem 20 × 20 Pixel-Bereich in der Kapillare wider. Die Hintergrundintensität des Feldes wurde von allen Werten abgezogen.
  • 10A zeigt die Rohdaten für dieses Experiment. Coumarin-Fluoreszenz wurde signifikant abgeschwächt durch die Anwesenheit von Phenol Rot. Längere Wege wurden auch verstärkt abgeschwächt.
  • 10B zeigt den prozentualen Gehalt der Coumarin-Fluoreszenz, die als eine Funktion der Pfadlänge für jeden getesteten Farbstoff beobachtet wurde. Die Verringerung der Fluoreszenz bei kurzen Pfadlängen stimmt nicht mit einer Filterwirkung des Photon-reduzierenden Mittels überein. Bei kurzen Pfadlängen und geringen Konzentrationen eines Photon-reduzierenden Mittels gibt es keine ausreichende Anzahl von Photon-reduzierenden Molekülen, um Licht herauszufiltern.
  • 10C zeigt die berechnete Verringerung der Coumarin-Fluoreszenz basierend auf Filterwirkungen. Ein Beer-Lambert-Verhältnis wurde verwendet, um die erwartete Verringerung der Fluoreszenz aufgrund der Wirkung von Lichtfilterung entweder durch Verringerung der Menge des verfügbaren Lichts für Anregung der Fluorophore oder der Menge von Licht, das von der Fluorophore emittiert wurde.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Photon-reduzierende Mittel wirksam sein können in der Reduktion von Lösungsfluoreszenz in flachen Proben, wie Assayproben mit geringem Volumen. Dies ist ein überraschendes Ergebnis, da die Menge des Farbstoffs, der in dem Raum zwischen der Fluorophore und dem Detektor lokalisiert ist, in diesem Fall sehr klein ist. Diese Wirkung stimmt mit der Deaktivierung von angeregter Fluorophore durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) auf Photon-reduzierende Mittel überein. Die durchschnittliche Distanz zwischen Molekülen in millimolaren Lösungen von Photon-reduzierenden Mitteln ist geringer als 100 Å. Bei solch kurzen Distanzen wurde gezeigt, dass FRET ein sehr wirksames Mittel ist, Fluorophoren-Fluoreszenz zu quenchen. Obwohl Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel die Lösungsfluoreszenz bei relativ geringen Pfadlängen reduzieren können, erlauben solche Photon-reduzierende Mittel auch fast vollständige Transmission (größer als etwa 80%) durch geringer Pfadlängen (d. h. weniger als 15 μm), was geeignet ist, um die meisten Säugerzellen zu beobachten.
  • Beispiel 7 – PHOTON-REDUZIERENDE MITTEL REDUZIEREN UNERWÜNSCHTE FLUORESZENZ IN ZELL-BASIERTEN ASSAYS
  • Um die Fähigkeit von Photon-reduzierenden Mitteln, unerwünschte Fluoreszenz in einem zellbasierten Assay zu reduzieren, zu untersuchen, wurde die Fluoreszenz einer Fluorophore in Anwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels unter Verwendung von Säugerzellen beobachtet. Die folgenden Experimente zeigen überraschenderweise, dass Photon- reduzierende Mittel lösungs-basierte Fluoreszenz einer Fluorophore in zellbasierten Assays reduzieren.
  • Die Fluoreszenz-Ausgabe von CCF2 (ein Substrat für Beta-Lactamase) in Anwesenheit und Abwesenheit von den Photon-reduzierenden Mitteln wurde gemessen. Das Derivat CCF2/AM, wie beschrieben in PCT-Veröffentlichung WO 96/30540 (Tsien), ist ein Lebendfarbstoff, der in Zellen difundiert und durch lebende Zellen gefangen wird. Die Zellen haben Esterase-Aktivität, die Ester-Gruppen auf den CCF1/AM-Molekülen spalten, was in einem negativ geladenen CCF2-Molekül resultiert, das innerhalb der Zelle gefangen ist. Gefangener Farbstoff erscheint als Grün-Fluoreszenz innerhalb von lebenden Zellen ohne Beta-Lactamase. Zellen, die Beta-Lactamase exprimieren, zeigen Blau-Fluoreszenz, da das Produkt der Beta-Lactamase Spaltung von CCF2 Blau-Fluoreszenz hat. CCF2 wurde, wie früher beschrieben, mit Jurkat Zellen inkubiert (vgl. WO 96/30540). Diese Zellen waren nicht an die Mikrotiterplatten angeheftet, aber es wurde ihnen ermöglicht, sich in den Plattenvertiefungen niederzulassen.
  • In diesen Experimenten wurden zwei Sätze von Ladebedingungen (5 μM CCF2/AM Charge #003 und 10 μM CCF2/AM Charge #003) und zwei Typen von Photon-reduzierenden Mitteln (5% v/v Schilling-Rot-Nahrungsmittelfarbstoff und 0,660 mM (Endkonzentration) Phenol-Rot) verwendet. Die Anwesenheit von Photon-reduzierenden Mitteln steigerte das Verhältnis von Signal zum Hintergrund des Assays um wenigsten 200–300%, verglichen mit der Abwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels. Der Schilling-Rot-Nahrungsmittelfarbstoff kann von Charge zu Charge variieren. Daher ist es wichtig jede Charge zu testen, bevor sie in einer großen Serie von Experimenten oder zellbasierten Screens verwendet wird. In solchen zellbasierten Assays stammt Lösungsfluoreszenz typischerweise von einer Fluorophore (wie CCF2/AM oder seine Hydrolyseprodukte) in dem Zellkultur-Medium, das die Zellen umgibt.
  • Beta-Lactamase Aktivität wird vorzugsweise bestimmt durch Zusetzen von 1/6tel Volumen CCF2/AM wässrige Ladungslösung, enthaltend 6 μm CCF2/AM, 24% PEG-400, 6,2% DMSO, 0,6% Pluron F127, 7,2 mM Tartrazin, 7,2 mM Säure Rot 40 in Mikrotiter-Vertiefungen bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten Inkubation wird die Fluoreszenz von den Vertiefungen auf einem Mikrotiterplatten-Fluorimeter mit Anregung bei 395/20 nm und Emission bei 460/40 nm und 530/30 nm gemessen. Die Roh-Fluoreszenz-Emissionswerte wurden korrigiert mit Signalen von Vertiefungen ohne Zellen. Dann wurde das korrigierte Signal von dem blauen Kanal (460/40 nm) durch das Signal von dem grünen Kanal (530/30 nm) dividiert. Dieser Typ von Analyse wird als Rationing bezeichnet. Bei den Steigerungseinstellungen (gain setting), die für die Experimente verwendet wurden, ergibt eine Population von mehr als 95% blau fluoreszierender Zellen (> 95% Zellen, die Beta-Lactamase exprimieren) ein Verhältnis von mehr als 3,0 und eine Population von gesamt grün fluoreszierenden Zellen (keine Zellen, die Beta-Lactamase exprimieren) gibt ein Verhältnis von etwa 0,1–0,2.
  • Ein Vergleich mit Verfahren aus dem Stand der Technik, um Hintergrundfluoreszenz in zellbasierten Assays durchzuführen, wurde vorgenommen. In dem "gewaschenen Assay" Format wurden Zellen stimuliert um Beta-Lactamase zu exprimieren, gewaschen, beladen mit CCF2/AM, gewaschen mit CCF2/AM freien Medium und dann in Mikrotiterplatten für Fluoreszenzausgabe plattiert. Solch ein Protokoll mit Waschschritten kann funktionieren; allerdings enthält das Protokoll schwerwiegende Einschränkungen und Nachteile beim Screening, Manipulationen mit hohem Durchsatz und bei der Miniaturisierung. Das Waschformat wurde verglichen mit ungewaschenen Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit eines Photon-reduzierenden Mittels (roter Nahrungsmittelfarbstoff) bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0 bis 1,064 mM Endkonzentration unter Verwendung einer Fluoreszenzausgabe von einem Mikrotiterplatten-Lesegerät, was hier beschrieben ist. Photon-reduzierende Mittel, die in Verbindung mit CCF2/AM-Stubstrat-Ester verwendet werden, werden häufig als "verstärktes Substratsystem oder ESS" bezeichnet.
  • 11 zeigt, dass Photon-reduzierende Mittel Fluoreszenz in ungewaschenen Zellen reduzieren und Signale erreichen, die vergleichbar sind mit Signalen von gewaschenen Zellen. Photon-reduzierende Mittel stellen auch viel bessere Signale zur Verfügung als wenn kein Photon-reduzierendes Mittel vorliegt. Von allen Datenpunkten wurde der Hintergrund (Puffer plus ESS plus CCF2/AM (keine Zellen)) subtrahiert. Die Daten werden typischerweise als ein Gemisch von Verhältnissen exprimiert. Das erste Verhältnis ist das Verhältnis der Fluoreszenzwerte bei zwei angezeigten Emissionswellenlängen (460 nm/530 nm) für jeden experimentellen Datenpunkt. Das zweite Verhältnis ist das Verhältnis des ersten Verhältnisses für die zwei experimentellen Bedingungen von Zellen, die konstitutiv Beta-Lactamase exprimieren und Wildtypzellen (CMV Zellen/Wildtypzellen).
  • Beispiel 8 – TESTEN VON FARBSTOFF-BASIERTEN, PHOTON-REDUZIERENDEN MITTELN AUF ZYTOTOXIZITÄT IN ZELLBASIERTEN ASSAYS
  • Um die Fähigkeit von Kandidaten für Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel, die unerwünschte Fluoreszenz in einem Zell basierten Assay zu reduzieren, zu untersuchen, wurde die Zytotoxizität in Anwesenheit eines Kandidaten für ein Photon-reduzierendes Mittel als eine Funktion der Konzentration des Photon-reduzierenden Mittels beobachtet. Die Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel wurden ausgewählt aus einer Anzahl von Farbstoffen, basierend aus ihrem Absorptionsspektrum und ihrer Verwendung mit lebenden Systemen. Die folgenden Experimente zeigen, dass Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel leicht getestet werden können und auf ihre Kompatibilität mit zellbasierten Assays selektiert werden können.
  • Aus einer ursprünglichen Liste von 50 Verbindungen wurden die folgenden Farbstoffe ausgewählt und in Säugerzellen getestet: Bromphenol Blau, Chlorphenol Rot, Tartrazin, Phenol Rot, Naphthol Gelb, Chromotrop F8, Chromazurol S, Patent Blau, Chromotrop 2R, Quinolin Gelb, Säure Fuchsin, Erythrosin, Säure Rot 37 und Alizarin Rot.
  • Die Toxizität von Kandidaten für Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel auf Säugerzellen wurde untersucht mit Wildtyp Jurkat-Zellen. Die Zellen wurden in Assayvertiefungen von Mikrotiterplatten bei Raumtemperatur für 3 Stunden in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von Kandidaten für farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel inkubiert. Propidium-Iodid wurde dann allen Vertiefungen der Assayplatte zugegeben und der prozentuale Anteil von toten Zellen in jeder Vertiefung wurde geschätzt. Tote Zellen schlossen Propidium-Iodid nicht aus.
  • 12 fasst die Ergebnisse der Toxizität-Untersuchung von Kandidaten für farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel zusammen. Bei der getesteten Konzentration zeigte nur ein Kandidat der Farbstoff-basierten, Photon-reduzierenden Mittel signifikante Toxizität über einen Drei-Stunden-Zeitraum. Wahrscheinlich haben die Kandidaten der Farbstoff-basierten, Photon-reduzierenden Mittel eine noch geringere zytotoxische Wirkung bei kürzeren Zeiträumen.
  • Beispiel 9 – TESTEN VON FARBSTOFF-BASIERTEN, PHOTON-REDUZIERENDEN MITTELN AUF WIRKUNGEN AUF GENAKTIVIERUNG UND INTRAZELLULÄRE ENZYMAKTIVITÄT IN ZELLBASIERTEN ASSAYS
  • Um weiterhin die Fähigkeit von Kandidaten für farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel unerwünschte Fluoreszenz in einem zellbasierten Assay zu reduzieren, zu untersuchen, wurde Gen-Aktivierung und intrazelluläre Enzym-Aktivität in Anwesenheit eines Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel beobachtet als Funktion der Konzentration des Photon-reduzierenden Mittels. Die Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel wurden ausgewählt aus einer Anzahl von Farbstoffen, basierend auf ihrem Absorptionsspektrum und ihrer Verwendung mit lebenden Systemen. Die folgenden Experimente zeigen, dass Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel leicht getestet und ausgewählt werden können auf ihre Kompatibilität mit zellbasierten Assays, die transkriptionelle Aktivität haben.
  • Jurkat-Zellen wurden behandelt wie hier für CCF2-Experimente beschrieben. Die Zellen haben ein G-Protein gekoppelten Rezeptor, der ein Antwortelement, das die Transkription von Beta-Lactamase kontrolliert, aktivieren kann. Die Zellen wurden mit einem Agonisten für den G-Protein gekoppelten Rezeptor in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen von individuellen Kandidaten für farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel, die mit den Zellen vorinkubiert wurden, stimuliert. Die Zellen wurden dann mit CCF2/AM inkubiert. Die Zellen wurden nachfolgend auf CCF2/AM-Beladung bewertet und hinsichtlich der Konversion zu CCF2 und hinsichtlich der Reporter-Gen-Expression unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Fluorimeters. Direkt vor der Fluoreszenz-Ausgabe wurde das Photon-reduzierende Mittel, Schilling-Rot-Nahrungsmittelfarbstoff, allen Vertiefungen der Assayplatte zugesetzt, um die Lösungsfluoreszenz zu normieren. Somit wurden diese Experimente konstruiert, um Zellfunktion zu untersuchen in Anwesenheit von Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel.
  • 13 zeigt die Fähigkeit von Zellen, die mit Kandidaten für farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel behandelt wurden, um Beta-Lactamase nach Stimulation mit einem Agonisten, Ladungssubstrat und konvertiertem Substrat zu reduzieren. Die direkte Beobachtung der Zellen zeigte auch, dass die Zellen, Substrat in ihrer eingeschlossenen Form enthielten und genauso, dass sie Beta-Lactamase Aktivität hatten. 2-fach Verdünnungen von ESS-Farbstoffen lagen in einem Bereich von Endkonzentrationen von 0,039 mM (links) bis 10 mM (rechts) mit Ausnahme von Patent-Blau, das von 0,022 mM (links) bis 2,75 mM (rechts) reichte. Die Daten werden als Gemisch von Verhältnissen präsentiert ([durch Agonisten stimulierte Zellen bei Emissionswellenlängen von 460/530 nm]/[unstimulierte Zellen-Emission 460/530 nm]).
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass Zellen, die mit Kandidaten für farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel behandelt wurden, Substrat in ihrer gefangenen Form laden und konvertieren können und G-Protein gekoppelte Rezeptor-Aktivierung unterstützen können und Reporter-Gen-Expression. Substratbeladung und Einfangen zeigt an, dass die Zellmembran intakt ist während der Behandlung mit dem Photon-reduzierenden Mittel. Das Einfangen von Substrat weist auch darauf hin, dass intrazelluläre Esterasen ausreichend aktiv sind um CCF2/AM in seine gefangene Form CCF2 zu konvertieren. G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Aktivierung, Gen-Aktivierung und Gen-Transkriptionsprozesse bleiben auch aktiv in Anwesenheit von Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel, wie bewiesen durch Beta-Lactamase Expression. Letztlich ist die Beta-Lactamase Aktivität auch ausreichend hoch in Zellen, die mit Kandidaten Photon reduzierenden Mitteln behandelt wurden, um Signalnachweis, vergleichbar mit dem Signalnachweis in Abwesenheit von Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel zu ermöglichen. In einigen Fällen war das Signal gegenüber dem Hintergrund von Beta-Lactamase exprimierenden Zellen tatsächlich gesteigert durch die Anwesenheit von Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel, was nahe liegt, dass Kombinationen von Photon-reduzierenden Mitteln überlegene Ergebnisse zur Verfügung stellen können.
  • Diese Experimente sind sehr streng im Testen von Kandidaten für Photon-reduzierende Mittel, da die Länge der Inkubation mit solchen Photon-reduzierenden Mitteln etwa drei Stunden betrug und die Photon-reduzierenden Mittel vor Gen-Aktivierung und Expression zugesetzt wurden. In vielen Screening und Assay-Protokollen können Photon-reduzierende Mittel direkt vor dem Fluoreszenz-Nachweis zugesetzt werden, wodurch die Wirkungen, die solche Photon-reduzierenden Mittel auf die Zellen oder Assays haben können, minimiert werden.
  • Beispiel 10 – FARBSTOFF-BASIERTE, PHOTON-REDUZIERENDE MITTEL-SÄTZE REDUZIEREN UNERWÜNSCHTE FLUORESZENZ IN ZELLBASIERTEN ASSAYS BESSER ALS EIN EINZELNES FARBSTOFF-BASIERTES, PHOTON-REDUZIERENDES MITTEL
  • Um die Fähigkeit von Sätzen farbstoff-basierter, Photon-reduzierenden Mittel unerwünschte Fluoreszenz in einem zellbasierten Assay zu reduzieren zu untersuchen, wurden Sätze farbstoff-basierter, Photon-reduzierende Mittel verglichen mit einem einzelnen Photon-reduzierenden Mittel in dem zellbasierten Assay, der hier beschrieben ist. Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel-Sätze beziehen sich auf wenigstens zwei Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel. Die folgenden Experimente zeigen, dass Farbstoff-basierte, Photon-reduzierende Mittel-Sätze bessere zellbasierte Assay-Ergebnisse erzielen können, so wie verbesserte Verhältnisse vom Signal zum Rauschen und sie sind stabiler im Schutz gegen unerwünschte Fluoreszenz.
  • Die Photon-reduzierenden Mittel, die zur Verwendung in den Sätzen in Betracht gezogen wurden, wurden ausgewählt aus einer Anzahl von Farbstoffen basierend auf den folgenden Kriterien: Löslichkeit in wässriger Lösung, ausreichend hoher molarer Extensionskoeffizient, geringe Toxizität gegenüber Säugerzellen und nicht interferierend mit Gen-Expression, Substrat-Beladung und Substrat-Konversion. Die folgenden Farbstoffe wurden ausgewählt: Tartrazin, Naphthol Gelb, Chromotrop F8, Chromazurol S, Patent Blau, Chromotrop 2R, Säure Fuchsin und Säure Rot 37.
  • Aus dieser Liste von Farbstoffen wurden zwei Gemische erzeugt, basierend auf dem Absorptionsspektrum der Farbstoffe. Farbstoff-Selektion basierte darauf, welche Farbstoffsätze Lösungsfluoreszenz über einen Bereich von Wellenlängen für CCF2-Anregung, Coumarin-Emission und Fluoreszenz-Emission absorbieren würden. Die zwei Gemische wurden "ESS Mix 1" und "ESS Mix 2" genannt. ESS Mix 1 war: 100 mM Tartrazin, 100 mM Chromotrop 2R und 100 mM Säure Fuchsin. ESS Mix 2 war: 40 mM Tartrazin, 60 mM Säure Rot 37 und 40 mM Säure Fuchsin.
  • Das ESS-Farbstoffgemisch wurde untersucht auf geeignete Konzentrationen für die optimale Verwendung in dem homogenen Assay für Beta-Laktamase, wie hier beschrieben. Zunächst wurden Verdünnungen von ESS Mix 1 und ESS Mix 2 getestet unter Verwendung von rotem Nahrungsmittelfarbstoff als Kontrolle. In allen getesteten Zellen verbesserten ESS Mix 1 und ESS Mix 2 die Fluoreszenz-Ausgabe stärker als der rote Nahrungsmittelfarbstoff. Nachfolgende Experimente wurden verwendet, um geringere Konzentrationen von den ESS-Gemischen zu bewerten, um wirksam die Menge von ESS-Gemischen herauszufinden, die für optimale Assay-Durchführung benötigt werden.
  • Nachdem dieser ursprüngliche Satz von ESS-Gemischen getestet wurde, wurde eine weitere Variation von Farbstoffen hergestellt. Dem dritten ESS-Gemisch wurde der Name "Tararaf" gegeben (ein Akronym für Tartrazin, Säure Rot 37 und Säure Fuchsin). Tararaf ist: 50 mM Tartrazin, 60 mM Säure Rot 37, 40 mM Säure Fuchsin.
  • Tararaf wurde verglichen mit ESS Mix 1 und ESS Mix 2, genauso wie mit den Einzelbestandteilen von Tararaf und dem roten Nahrungsmittelfarbstoff in zellbasierten Assays unter Verwendung von CCF2. Tararaf verbesserte die Fluoreszenzausgabe besser als es jede der individuellen Komponenten des Gemisches tat.
  • 14 zeigt die Ergebnisse dieser Experimente. Diese Ergebnisse zeigen, dass Sätze von Photon-reduzierendem Mittel Signale von zellbasierten Assays verbessern können, verglichen mit jedem einzelnen Photon-reduzierenden Mittel oder keinem Photon-reduzierenden Mittel.
  • Publikationen
  • Alle Überschriften sind für die Annehmlichkeiten des Lesers und sollten nicht verwendet werden, um die Bedeutung des Textes, der der Überschrift folgt, einzuschränken, wenn es nicht so spezifiziert ist.

Claims (80)

  1. Verfahren zum Reduzieren unerwünschter Lichtemission aus einer Probe, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Probe mit Bedarf zum Reduzieren von unerwünschtem Licht mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel, wobei die Probe ein Membrankompartiment, das mit einer Festkörperoberfläche in Kontakt ist, umfasst, wobei das Membrankompartiment mindestens ein Photon-produzierendes Mittel einschließt und dieses mindestens eine Photon-reduzierende Mittel in einer wässrigen Lösung ist, die mit einer äußeren Oberfläche des Membrankompartiments in Kontakt ist, und wobei das Photon-reduzierende Mittel in der Lage ist, die Emission des unerwünschten Lichts aus dieser Probe um mindestens 10% im Vergleich zu der Lichtemission aus einer Probe, in der das Photon-reduzierende Mittel fehlt, zu reduzieren, Nachweis eines optischen Signals aus dem mindestens einen Photon-produzierenden Mittel.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel aufweist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel bei einer Konzentration zwischen etwa 0,1 mM und etwa 0,5 mM vorliegt.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel im Wesentlichen nicht membrangängig ist.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Probe mindestens zwei Photon-reduzierende Mittel umfasst.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei mindestens eines der zwei Photon-reduzierenden Mittel Farbstoffe sind.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Membrankompartiment mindestens eine lebende Zelle umfasst.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die mindestens eine lebende Zelle eine Säugetierzelle ist.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem kollosionalen Quencher, einem teilchenförmigen Quencher, einem Absorptions-Quencher, einem FRET-Quencher und einem Dunkelkomplex.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Farbstoff ist.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die mindestens eine lebende Zelle Teil einer Vielzahl von Zellen ist, umfassend mindestens zwei verschiedene Photon-produzierende Mittel.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel einer Enzymaktivität im Inneren der Säugetierzelle entspricht.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel die beta-Lactamase-Aktivität misst.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Säugetierzelle eine von mindestens 100 lebenden Zellen ist.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Säugetierzelle einer klonalen Population von kultivierten Zellen angehört.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel weniger membrangängig ist als das mindestens eine Photon-produzierende Mittel über eine Membran des Membrankompartiments.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Nachweis den Nachweis eines Fluoreszenzsignals umfasst.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel aus einem Vorläufermolekül hergestellt wird, das ein Substrat einer Esterase ist.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel das Vorliegen eines Ions im Inneren des Membrankompartiments nachweist.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel ein fluoreszierendes Protein ist.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das fluoreszierende Protein ein modifiziertes grün-fluoreszierendes Protein ist.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel die Spannung über einer Membran des Membrankompartiments nachweist.
  24. Verfahren zum Reduzieren der Lichtemission aus einer Probe, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Probe mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel, wobei die Probe ein Membrankompartiment umfasst, wobei weiter das Membrankompartiment mindestens ein Photon-produzierendes Mittel umfasst, Nachweis eines Fluoreszenzsignals aus der Probe, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Farbstoff ist und in einer wässrigen Lösung in der Probe vorliegt bei einer Konzentration, welche die unerwünschte Lichtemission aus der Probe um mindestens 30% im Vergleich zu der Lichtemission aus der Probe, in der das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel fehlt, reduziert.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei die Lichtemission nicht mit dem mindestens einen Photon-produzierenden Mittel, das sich im Inneren des Membrankompartiments befindet, verbunden ist.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel einen Verteilungskoeffizienten hat bei einem pH von etwa 7, der äquivalent oder geringer ist als der von CCF2/AM.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit einem Teil des Emissions- oder Anregungsspektrums des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels, das zum Anregen eines FRET-Partners verwendet wird, überlappt.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel einen Extinktionskoeffizienten von mindestens 5000 M–1cm–1 hat.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel kein pH-Indikatorfarbstoff ist.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  31. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel einen Extinktionskoeffizienten von mindestens 5000 M–1cm–1 hat.
  32. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die Probe zwei unterschiedliche Photon-produzierende Mittel umfasst.
  33. Verfahren gemäß Anspruch 30, wobei die Probe mindestens zwei Photon-reduzierende Mittel hat.
  34. Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel einen Azofarbstoff umfasst.
  35. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem intrazellulären Ionenindikator, einem Enzymsubstrat, einem Produkt einer Enzymreaktion, einem Spannungssensor und einem fluoreszierenden Protein.
  36. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel ein fluoreszierendes Enzymsubstrat oder ein fluorogenes Enzymsubstrat ist.
  37. Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel ein Enzymsubstrat für beta-Lactamase ist.
  38. Verfahren gemäß Anspruch 33, wobei die Probe ein optisches Störmittel umfasst.
  39. Verfahren gemäß Anspruch 24, wobei der Nachweis den Nachweis der Epifluoreszenz aus der Probe umfasst.
  40. Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel das optische Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis um mindestens 300% im Vergleich zu dem optischen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis der Probe, bei der das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel fehlt, verbessert.
  41. Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei die Probe in einem Probenformat mit 384 Vertiefungen oder mehr zum Nachweis vorliegt.
  42. Verfahren gemäß Anspruch 41, wobei die Probe etwa 3 μl oder weniger ist.
  43. Verfahren gemäß Anspruch 39, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit einer Membran des Membrankompartiments umfasst.
  44. Verfahren gemäß Anspruch 43, wobei die Probe eine Vielzahl von lebenden Zellen umfasst und das In-Kontakt-Bringen vor dem In-Kontakt-Bringen des mindestens einen Photon-reduzierenden Mittels mit der Probe stattfindet.
  45. Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei die Probe mindestens drei Photon-produzierende Mittel umfasst.
  46. Verfahren gemäß Anspruch 44, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel aus einem Vorläufermolekül hergestellt wird, das ein Substrat für ein intrazelluläres Enzym ist.
  47. Verfahren gemäß Anspruch 46, wobei das intrazelluläre Enzym eine Esterase ist.
  48. Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei die Probe eine Testchemikalie umfasst, die ein optisches Störmittel ist.
  49. Stoffzusammensetzung, umfassend: a) ein Membrankompartiment in Kontakt mit einer Festkörperoberfläche, wobei das Membrankompartiment mindestens ein Photon-produzierendes Mittel umfasst und b) eine wässrige Lösung mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel, wobei das Photon-reduzierende Mittel in einer wässrigen Lösung ist und in der Lage ist, die Emission von unerwünschtem Licht aus der Probe um mindestens 10% im Vergleich zu der Lichtemission aus einer Probe, bei der das Photon-reduzierende Mittel fehlt, zu reduzieren, wobei die wässrige Lösung in Kontakt mit einer äußeren Oberfläche des Membrankompartiments ist.
  50. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei die wässrige Lösung weiter mindestens ein Photon-produzierendes Mittel umfasst.
  51. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel in der wässrigen Lösung bei einer Konzentration vorliegt, die ausreicht, um das Licht, das von dem mindestens einen Photon-produzierenden Mittel, das in der wässrigen Lösung vorliegt, emittiert wird, zu reduzieren.
  52. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 51, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt, oder das mindestens eine Photon-produzierende Mittel in der wässrigen Lösung einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer mit dem mindestens einen Photon-reduzierenden Mittel aufweist.
  53. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 52, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  54. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 53, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel in der wässrigen Lösung bei einer Konzentration vorliegt, welche die unerwünschte Fluoreszenz von der wässrigen Lösung um mindestens 40% im Vergleich zu der unerwünschten Fluoreszenz der wässrigen Lösung, bei der das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel fehlt, reduziert.
  55. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 54, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel eine Wasserlöslichkeit von etwa 100 mM oder mehr hat.
  56. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  57. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 56, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel einen Extinktionskoeffizienten von mindestens 10 000 M–1cm–1 hat.
  58. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 56, wobei das Membrankompartiment eine lebende Zelle ist.
  59. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 58, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel nicht als ein pH-Indikatorfarbstoff agiert und das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-reproduzierenden Mittels in der wässrigen Lösung überlappt.
  60. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel in der wässrigen Lösung Energie auf das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel übertragen kann.
  61. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel einen Extinktionskoeffizienten von mindestens 10 000 M–1cm–1 hat und bei einer Konzentration von mindestens etwa 0,1 mM vorliegt.
  62. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 60, wobei das Membrankompartiment eine lebende Zelle ist und das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Farbstoff ist.
  63. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 62, wobei die lebende Zelle einer Vielzahl von lebenden Zellen angehört in einem Volumen von weniger als etwa 5 μl.
  64. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 62, wobei die Zusammensetzung weiter ein Mikroplatte einschließt und die lebende Zelle einer Vielzahl von lebenden Zellen in einer Vertiefung der Mikroplatte angehört.
  65. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 64, wobei die Mikroplatte 864 oder mehr Vertiefungen hat.
  66. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei die Zusammensetzung weiter ein System umfasst, um Licht mit einer vorbestimmten Wellenlänge durch den Boden einer Assay-Oberfläche einzuführen, wobei die vorbestimmte Wellenlänge eine Anregungswellenlänge für das mindestens eine Photon-produzierende Mittel ist.
  67. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel relativ weniger membrangängig ist als das mindestens eine Photon-produzierende Mittel.
  68. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 67, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel in der wässrigen Lösung bei einer Konzentration vorliegt, die die Fluoreszenz von der wässrigen Lösung um mindestens 75% im Vergleich zu der Fluoreszenz der wässrigen Lösung, bei der das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel fehlt, reduziert.
  69. Stoffzusammensetzung gemäß Anspruch 49, wobei die Stoffzusammensetzung weiter ein zweites Photon-produzierendes Mittel umfasst, das eine Testchemikalie ist, die frei in wässriger Lösung ist.
  70. Stoffzusammensetzung, umfassend: a) mindestens ein Photon-produzierendes Mittel, das im Inneren einer lebenden Zelle vorliegt, in optischem Kontakt mit einer Festkörperoberfläche, die Licht mit einer vorbestimmten Wellenlänge durchlassen kann, die mit dem Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels ausreichend überlappt, um das mindestens eine Photon-produzierende Mittel anzuregen, und b) mindestens ein Photon-reduzierendes Mittel in einer wässrigen Lösung, welche die lebende Zelle umgibt, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  71. Verfahren zum Identifizieren einer Chemikalie mit einer biologischen Aktivität, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einer Testchemikalie, wobei die Probe ein Ziel umfasst, b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel, wobei die Probe ein Membrankompartiment umfasst, das mit einer Festkörperoberfläche in Kontakt ist, wobei das Membrankompartiment mindestens ein Photon-produzierendes Mittel einschließt, das direkt oder indirekt die Aktivität des Ziels verfolgt und das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel in einer wässrigen Lösung ist, die mit der äußeren Oberfläche des Membrankompartiments in Kontakt ist, und c) Nachweis eines optischen Signals von dem mindestens einen Photon-produzierenden Mittel, wobei das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum des mindestens einen Photon-produzierenden Mittels überlappt oder wobei das mindestens eine Photon-produzierende Mittel einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel aufweist.
  72. System zum Identifizieren einer Chemikalie mit einer biologischen Aktivität, umfassend: a) ein Speicherungs- und Abrufmodul zum Speichern einer Vielzahl von Chemikalien in Lösung in adressierbaren Chemikalienvertiefungen, ein Chemikalienvertiefungszubringer und das eine programmierbare Auswahl und Abruf der adressierbaren Chemikalienvertiefungen hat und das eine Speicherkapazität von mindestens 100 000 der adressierbaren Vertiefungen hat, wobei mindestens eine der adressierbaren Vertiefungen ein Photon-reduzierendes Mittel in einer wässrigen Lösung umfasst, b) ein Probenverteilungsmodul, umfassend einen Flüssigkeitstransporter, um Lösungen aus den ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefungen anzusaugen oder zu verteilen, wobei das Chemikalienverteilungsmodul eine programmierbare Auswahl von und Ansaugen aus den ausgewähl ten adressierbaren Chemikalienvertiefungen hat, und eine programmierbare Verteilung in die ausgewählten adressierbaren Probenvertiefungen hat und wobei der Flüssigkeitstransporter in Reihen der adressierbaren Vertiefungen mit unterschiedlichen Dichten der adressierbaren Vertiefungen pro Quadratzentimeter verteilen kann, c) ein Probentransporter, um die ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefungen zum Probenverteilungsmodul zu transportieren, und der gegebenenfalls eine programmierbare Transportkontrolle der ausgewählten adressierbaren Chemikalienvertiefungen hat, d) ein Reaktionsmodul, umfassend entweder einen Reagenzverteiler, um Reagenzien in die ausgewählten adressierbaren Probenvertiefungen zu verteilen, oder einen Fluoreszenzdetektor, um chemische Reaktionen in den ausgewählten adressierbaren Probenvertiefungen nachzuweisen, und e) ein Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul, wobei das Speicher- und Abrufmodul, das Probenverteilungsmodul und das Reaktionsmodul integriert sind und durch das Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul programmierbar kontrolliert sind; und das Speicherungs- und Abrufmodul, das Probenverteilungsmodul, der Probentransporter, das Reaktionsmodul und das Datenverarbeitungs- und Integrationsmodul operabel miteinander verbunden sind, um eine schnelle Verarbeitung der adressierbaren Probenvertiefungen zu ermöglichen.
  73. System gemäß Anspruch 72, wobei die adressierbaren Chemikalienvertiefungen mindestens innerhalb einer Multivertiefungsplattform sind.
  74. System gemäß Anspruch 72, wobei die Multivertiefungsplattform zwischen etwa 96 Vertiefungen und etwa 5000 Vertiefungen umfasst.
  75. System gemäß Anspruch 74, wobei die Zahl der Vertiefungen in der Multivertiefungsplattform ein Vielfaches von 96 ist.
  76. Verfahren zum Identifizieren einer Chemikalie mit einer toxikologischen Aktivität, umfassend: In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einer Testchemikalie, wobei die Probe ein Mernbrankompartiment umfasst, das mindestens ein Photon-produzierendes Mittel einschließt, wobei die Probe ein Ziel umfasst, In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel, Nachweis eines optischen Signals von mindestens einem Photon-produzierenden Mittel, wobei das optische Signal mit einer toxikologischen Aktivität in Beziehung steht und wobei das Photon-reduzierende Mittel in einer wässrigen Lösung vorliegt.
  77. Verfahren zum Identifizieren einer Chemikalie, die eine biologische Aktivität hat, umfassend: a) In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einer Testchemikalie, wobei die Probe ein Ziel umfasst, b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit mindestens einem Photon-reduzierenden Mittel, wobei die Probe ein Membrankompartiment umfasst, wobei das Membrankompartiment mindestens ein Photon-produzierendes Mittel einschließt, das direkt oder indirekt die Aktivität des Ziels verfolgt und das mindestens eine Photon-reduzierende Mittel in einer wässrigen Lösung vorliegt, die mit der äußeren Oberfläche des Membrankompartiments in Kontakt ist und c) Nachweis eines optischen Signals von dem mindestens einen Photon-produzierenden Mittel durch FACS.
  78. Verwendung eines Kits zum Reduzieren einer unerwünschten Lichtemission aus einer Probe, die eine Zelle enthält, wobei die Zelle ein Photon-produzierendes Mittel umfasst, der Kit ein Trägermittel umfasst, das mindestens einen oder mehrere Behälter enthält, umfassend einen ersten Behälter, der ein Photon-reduzierendes Mittel enthält, wobei das Photon-reduzierende Mittel in einer wässrigen Lösung vorliegt.
  79. Verwendung gemäß Anspruch 78, wobei das Photon-reduzierende Mittel ein Absorptionsspektrum hat, das mit dem Absorptions-, Emissions- oder Anregungsspektrum eines Photon-produzierenden Mittels überlappt.
  80. Verwendung gemäß Anspruch 78, wobei der Kit weiter eine Mikroplatte umfasst.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015024576A1 (de) * 2013-08-20 2015-02-26 Testo Ag Polymergebundenes iod als quencher für fluoreszenzmessungen

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6221612B1 (en) 1997-08-01 2001-04-24 Aurora Biosciences Corporation Photon reducing agents for use in fluorescence assays
US7118878B1 (en) 2000-06-09 2006-10-10 Promega Corporation Method for increasing luminescence assay sensitivity
US7465561B2 (en) 2005-06-30 2008-12-16 Roche Molecular Systems, Inc. Probes and methods for hepatitis C virus typing using single probe analysis
US8012744B2 (en) 2006-10-13 2011-09-06 Theranos, Inc. Reducing optical interference in a fluidic device

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8620893D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Unilever Plc Assays
US5017473A (en) * 1987-05-26 1991-05-21 Becton, Dickinson And Company Homogeneous chemiluminescence immunoassay using a light absorbing material
DE69125992T2 (de) * 1990-09-14 1997-08-21 Tosoh Corp Verfahren und Kit für Immunoassay
US5670113A (en) * 1991-12-20 1997-09-23 Sibia Neurosciences, Inc. Automated analysis equipment and assay method for detecting cell surface protein and/or cytoplasmic receptor function using same
US5661035A (en) * 1995-06-07 1997-08-26 The Regents Of The University Of California Voltage sensing by fluorescence resonance energy transfer
US6171780B1 (en) * 1997-06-02 2001-01-09 Aurora Biosciences Corporation Low fluorescence assay platforms and related methods for drug discovery
WO1998055231A1 (en) * 1997-06-02 1998-12-10 Aurora Biosciences Corporation Low background multi-well plates for fluorescence measurements of biological and biochemical samples
DE69913257T2 (de) * 1998-07-17 2004-09-02 Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc, San Diego Detektor und Siebvorrichtung für Ionenkanäle

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015024576A1 (de) * 2013-08-20 2015-02-26 Testo Ag Polymergebundenes iod als quencher für fluoreszenzmessungen

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