WO2015024576A1 - Polymergebundenes iod als quencher für fluoreszenzmessungen - Google Patents

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WO2015024576A1
WO2015024576A1 PCT/EP2013/002504 EP2013002504W WO2015024576A1 WO 2015024576 A1 WO2015024576 A1 WO 2015024576A1 EP 2013002504 W EP2013002504 W EP 2013002504W WO 2015024576 A1 WO2015024576 A1 WO 2015024576A1
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fluorescein
long
halogen
diacetate
chain polymer
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PCT/EP2013/002504
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Simon BRUGGER
Zinaida Vasileuskaya-Schulz
Mike Muhl
Robert Rieger
Martin Strnad
Britta Brunnenkan
Markus Schwär
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Testo Ag
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Publication date
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the invention relates to a method for quenching extracellular fluorescence in the detection and examination or sorting of prokaryotic and eukaryotic cells with (at least) ester cleavage fluorescent esterase substrates by means of halogens, and the use of halogens as a quencher in the study of prokaryotic and eukaryotic cells after ester cleavage of fluorescent esterase substrates, as well as related subject matter, such as intracellular fluorescence measuring devices equipped for use in the method.
  • Esterase substrates such as carboxyfluorescene diacetate, fluorescein diacetate, and modifications thereof, are often used in bioassays, such as e.g. as part of ELISA, cytometric and microscopic
  • Investigations used for the detection of prokaryotic and / or eukaryotic cells.
  • the substrates are converted by intracellular esterases into fluorescent products such as fluorescein, carboxyf luorescein or the like, and thus provide information about the presence and / or the physiological state of the cells.
  • esterase-based assays A disadvantage of esterase-based assays is the often considerable fluorescence background due to nonspecific, extracellular conversion of esterase substrates or the outflow of fluorescent products from the cells.
  • bioassays In order to reduce the resulting measurement errors, bioassays have incorporated washing steps and / or quenching steps (fluorescence quenching, suppression) to minimize non-specific fluorescence.
  • the washing steps are cumbersome, time consuming and not compatible with any assay.
  • iodine in the form of sodium or potassium iodide or other salts is frequently used in high concentration as a contact quencher, but - depending on the buffer and cell type - can penetrate into the cells and thus lead to intracellular quenching.
  • the invention therefore relates in a first embodiment to a method for quenching extracellular fluorescence in the detection, examination and / or sorting of prokaryotic and eukaryotic cells with ester cleavage fluorescent esterase substrates by means of a halogen comprising at least one esterase substrate in combination with at least one halogen as such or in the form of a halide or as Oligohalogenidionen, or as mixtures of two or more of said species, is used in a bound to a long-chain polymer form as a quencher.
  • Another embodiment of the invention relates to the use of long-chain polymers bound halogen, halide and / or ol igohalogenid as a quencher in the study of prokaryotic and eukaryotic cells with ester cleavage fluorescent esterase substrates.
  • this device is equipped for the application of the method or set up for intracellular
  • Fluorescence include one or more reservoirs for solutions of the halogen (s) and long chain polymer (s), or a mixture thereof.
  • Suitable long-chain polymers are, in the first place, polymers which are soluble or dispersible or swellable in aqueous solutions and which bind halogens (as such, in the form of halide or as oligo-halide), for example polyamides or polyimides, such as nylon- ⁇ ; Mannich base type polyamine polymers; polysaccharides ride, such as starch, polydextrose, glycogen or amylopek in; Polyethylene glycol; Aminoglycans, such as hyaluronates; monosubstituted polyacetylenes with methyl, ethyl, propyl, pentyl, t-butyl or phenyl as substituents; or in particular anion exchange resins, for example aminoethyl, diethylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE) and quaternary ammonium groups coupled to cellulose, agarose (agar), dextran (
  • the preferred molecular weights (average molar masses) of the polymers can be in the range from 1000 daltons to 10 million daltons, for example in the ranges given below for PVP.
  • PVP polyvinyl urethane
  • molecular weights average molecular weights
  • "Tied” or “binding” essentially means one reversible bonding, whether by van deralak forces, by hydrogen bonds, by ionic bonds and / or further by covalent bonds, wherein in particular one or more of the first three mentioned types of bonding are or are realized.
  • halogens or, in particular, halides (halogen anions, for example as salts) or oligomeric halides are the corresponding species of the elements of the seventh main group of the Periodic Table of the Elements, in particular fluorine, chlorine or, especially, bromine or, primarily, iodine.
  • halogen or "iodine” or “bromine” or “fluorine” or “chlorine” always includes one or more of the three forms (halogen as a molecule, halide or oligohalide) if it not explicitly mentioned otherwise or to be understood differently from the context.
  • Halides are preferably used in the form of their salts, for example as alkaline earth metal salts, such as magnesium chloride, magnesium bromide or magnesium iodide or the corresponding calcium salts, or in particular as ammonium salts, such as ammonium chloride, bromide or iodide, or as alkali metal salts, such as sodium chloride, sodium bromide, Potassium chloride, potassium bromide, or especially sodium iodide or potassium iodide.
  • the halogens and the long-chain polymer can be used in the The method or uses according to the invention can be added to the test sample (sample) separately from one another or already in an interconnected form. Where the plural is used, this always includes the singular. Where "a” is used, this also includes "one or more".
  • Suitable esterase substrates are acylated or alcohol-esterified forms of fluorescent dyes, such as corresponding xanthene, fluorescein, coumarin, boron-dipyrromethene ("BODIPY”), eosin, dicyanobenzene, ethidine or resorufin derivatives. Examples of such compounds include:
  • Fluoresceinace at, fluorescein laura, fluorescein diacetate (FDA), fluorescein dilaurate, halogenated
  • Azidofluorescein monoaceta azidofluorescein diacetate, fluorescein dipropionate, fluorescein dibutyrate, fluorescein dilaurate, 5 (6) -2 ', 7'-dichloro-CFDA, 5 (6) -sulfof FDA, di-beta-D-galactoside fluorescein, 3 o-methylfluorescein phosphate, pentaacetoxy esters of 2 ', 7'-bis (carboxyethyl) -5 (6) -carboxyfluorescein (BCECF / AM), pentaacetoxy esters of 2', 7'-bis (carboxyethyl) -5 (6) -Fluorescein (BCECF / AM) or chloromethyl f luorescein diacetat,;
  • Alcoholates such as methanolates, ethanolates or butanolates of the following BOPIDY compounds:
  • Fluorescein derivatives especially those specifically mentioned, are particularly preferred.
  • aqueous solutions such as culture or cell culture media known to the person skilled in the art, buffer solutions and salt solutions are to be provided in particular.
  • Non-exhaustive examples include Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (eg from Gibco), F-12 Nutrient Mixture (eg from F12), or Phosphate buffered saline (PBS), saline-sodium citrate buffer (SSC for saline sodium citrate buffer), tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS), TTRIS-HC1, 2- (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethanesulfonic acid (HEPES), citrate buffer, acetate buffer, cocodylate, dimethyl glutarate, imidazole, bis (2-hydroxyethyl) amino tris (hydroxymethyl) methane (bis-tris-), N- (2-acetamido) -2 -
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Saline / sodium phosphate -EDTA buffer each adjusted with suitable inorganic acids such as HCl or sulfuric acid, or organic acids such as acetic acid or the like.
  • the measurement or determination of the fluorescence of samples to be examined is carried out using methods known to those skilled in the art, for example by means of photometry,
  • Flow cytometry or microscopy eg using photomultipliers or photodiodes or by digitally usable light sensors, such as diode arrays, for example by means of CCD chips or CMOS technology, or by means of microscopes.
  • the measurement can take place in the interior of measuring instruments or by means of sensors which transmit measuring signals to evaluation units, or the like.
  • the excitation of the fluorescence for example, by means of suitable light sources, for example using electromagnetic radiation suitable (ie, in particular suitable for fluorescence excitation, preferably not affecting the measurement of fluorescence) wavelengths, such as monochromator, with light sources, for example selected from xenon or tungsten halogen lamps , LEDs or lasers (for example, also in pulse mode) with excitation wavelengths suitable for the respective dye.
  • suitable light sources for example using electromagnetic radiation suitable (ie, in particular suitable for fluorescence excitation, preferably not affecting the measurement of fluorescence) wavelengths, such as monochromator
  • light sources for example selected from xenon or tungsten halogen lamps , LEDs or lasers (for example, also in pulse mode) with excitation wavelengths suitable for the respective dye.
  • samples for hygiene and quality control such as smears from surfaces whose germ coverage is to be determined, or washing liquid after surface treatment or after penetration of materials or liquid-permeable (eg porous) objects, samples of liquids,
  • Body fluids such as blood, blood plasma, blood serum, urine, saliva, tears, sweat, juices from the digestive tract, nasal mucus or semen, or cell cultures, or food, or the like in question .0
  • Detectable cells include both prokaryotic cells, such as bacteria (and antibiotic-resistant bacteria such as resistant Staphylococcus aureus, Pseodomonas species, Escherichia coli or Mycobacterium tuberculosis, or Archaea); as well as eukaryotic cells, such as algae, yeasts, other unicellular fungi, protozoa, cells from cell cultures, cells from tissues (especially after singulation), or the like.
  • prokaryotic cells such as bacteria (and antibiotic-resistant bacteria such as resistant Staphylococcus aureus, Pseodomonas species, Escherichia coli or Mycobacterium tuberculosis, or Archaea)
  • eukaryotic cells such as algae, yeasts, other unicellular fungi, protozoa, cells from cell cultures, cells from tissues (especially after singulation), or the like.
  • the measurement allows, via the number (eg concentration), the metabolic state (eg weak fluorescence in damaged cells) and the identity of the cells (eg different esterase activities for different esterase substrates, different size of cells or the like) to gain information - in the latter case can also be a sorting of cells with different fluorescence behavior (for example, uptake or cleavage of different esterase substrates with different wavelengths of fluorescence or separation of non-fluorescent from fluorescent Cells), for example by means of flow sorting under flow cytometry, eg by means of FACS.
  • the number eg concentration
  • the metabolic state eg weak fluorescence in damaged cells
  • the identity of the cells eg different esterase activities for different esterase substrates, different size of cells or the like
  • Fig. 1 shows the quenching of the dye-induced background.
  • Fig. 2 shows the fluorescence spectrum of carboxyfluorescein and of carboxyfluorescein with PVP-I.
  • Fig. 3 shows the quenching of the dye-induced background in a suspension of stained E. coli.
  • Scatter plot FSC-H / SSC-H (a) and histogram FL1-H (c) show the dye-induced background (population below 10 4 FSC-H and 2 * 10 3 FL1-H, respectively) and a population of stained Escherichia coli (region Rl).
  • FSC-H / SSC-H (b) and histogram FL1-H (d) the population of stained E. coli can be seen after the addition of PVP-I, the background has disappeared
  • Fig. 4 shows the staining intensity of bacteria after quenching with PVP-I or KI.
  • Histograms show staining intensity of Escherichia coli (a) and Enterococcus mundtii (b) after quenching with IM KI (small peaks) or 0.003% PVP-I (large peaks). Both strains have comparable staining intensity (FL1-H) after the addition of both quenchers. To illustrate this effect, bacteria were used for KI and PVP-I in different cell counts (counts), which can be seen in the height of the histograms corresponding to the event count (counted events).
  • Fig. 5 shows the counts of Escherichia coli and Enterococcus mundtii after quenching with PVP-I and KI.
  • the diagrams represent the cell number of the stained E. coli (a) and Ent. Mundtii after quenching with PVP-I and KI immediately after addition (0h), after one hour of incubation and after two hours of incubation is.
  • the tested strains of Escherichia coli DSM 498 and Enterococcus mundtii DSM 4838 were obtained from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) (Braunschweig, Germany). Both strains were selected as test organisms with different cell wall structure. It is well known that gram-positive Microorganisms and Gram-negative bacteria differ in the structure of their cell walls. Gram-positive bacteria, such as Enterococcus mundtii, have a single membrane with a thick outer layer of peptidoglycan. The cell wall of Gram-negative bacteria, such as E. coli, consists of a double membrane, the peptidoglycans are less common and dispersed. Due to the different
  • Gram-positive and Gram-negative bacteria exhibit, in part, different permeabilities for many substances, including dyes and quenchers, and thus different staining and quenching behaviors.
  • the bacterial strains were prepared according to the manufacturer's instructions and stored as plate culture (smear plate) for about 1-2 weeks at 4 ° C.
  • the test organisms used overnight in CASO broth complex medium for the cultivation of sophisticated bacteria, yeasts and molds - the medium corresponds in composition to the recommendations of the current European Pharmacopoeia (EP) and the United States Pharmacopoeia (USP), Heipha Diagnostica, Eppelheim, Germany) were incubated on a shaker (HeizThermomixer MHR 23, Ditabis, Pforzheim) at 200 min -1 and 30 ° C. After the incubation time, a portion of the bacterial suspension with 0.85% NaCl solution (Carl Roth GmbH + Co.
  • the dye carboxyfluorescein diacetate was used to detect the test organisms for their detection to stain in the cytometer. It is a membranorgen dye with the living microorganisms stained and detected. CFDA is converted into the fluorescent carboxyfluorescein by intracellular esterases by cleavage of two acetate groups. This is less membrane-permeable and fluoresces particularly strongly in the fluorescence channel FL-1 of the cytometer. The CFDA was frozen as a stock solution at a concentration of 1 mg / ml in anhydrous Dimethylsul foxid (abb.
  • aqueous 1 M potassium iodide solution (Roth, 8491.1) or aqueous PVP-I solution (Sigma-Aldrich, PVP1-100G) in a final concentration of 0.003% for flow cytometric analysis or of 0.025% used for fluorescence spectroscopy.
  • PVP-I is a water-soluble complex of iodine and polyvinylpyrrolidone (PVP, povidone), which is normally used as a disinfectant or antiseptic.
  • hydrogen triiodide H + I 3 ⁇
  • Both quenchers were after 15 min staining reaction of the bacterial culture or the
  • the fluorescence spectra were recorded using the Thermo Scientific Varioskan Flash Multifunction Spectral Reader. The excitation of CFDA took place at 480 nm, the fluorescence spectrum was recorded in the 495-600 nm range in 5 nm steps.
  • results presented in the following examples were generated using a BD Accuri TM C6 Flow Cytometer equipped with red (640 nm) and blue (488 nm) lasers Stray light detectors and four fluorescence detectors with filters (FL1 533/30 nm, FL2 585/40 nm, FL3> 670 nm, FL4 675/25 nm) is equipped.
  • the detection of CFDA-labeled bacteria took place in the FL1 channel during excitation with a blue laser.
  • the device has a threshold of 1000 FL1-H and 500 SSC-H, and a flow rate of 35 ⁇ / min set.
  • the measurement data taken with the Accuri C6 cytometer was evaluated using the device's CFlow Plus Analysis software.
  • Flow cytometry is a well-known and widely used method for the analysis of cells of all kinds, whereby several parameters such as cell size, cell number, DNA, RNA, protein content can be measured simultaneously.
  • the fluorescence as well as the scattered light parameters of the bacteria and the dye background were analyzed.
  • FIG. 1 shows a typical result of a cytometric measurement of the esterase substrate CFDA in staining buffer. Each point represents a single (unwanted) count event. The addition of 0.003% PVP-I complex leads to a marked reduction of this background, visible in scattered light (SSC-H / FSC-H) and FL1-H channel (SSC-H / FL1 -H).
  • Figure 2 shows the fluorescence spectra of 50 g / ml carboxyfluorescein (1), 0.025% PVP-I (3) and the mixture of both substances (2) in dyeing buffer, recorded with the Varioskan ° Flash at an excitation wavelength of 480 nm Mixture demonstrates the effectiveness of PVP-I as a quencher for carboxyf luorescein.
  • PVP-I predominantly quench extracellularly.
  • the large polymer molecules of PVP do not penetrate into the cell and bind iodine outside the cells, resulting in predominantly extracellular quenching of unwanted fluorescence, eg nonspecifically hydrated fluorogenic substrate or dye leaking out of the cells.
  • KI penetrates the cells much more rapidly and likewise suppresses (undesirably) the fluorescence of the dye formed, as a result of which its fluorescence intensity is pressed below the detection threshold. As a result, only the more stained bacteria can be detected.

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Abstract

Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion, Untersuchung und/oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels einem Halogen, umfassend, dass mindestens ein Esterase- Substrat in Kombination mit mindestens einem Halogen als solchem oder in Form eines Halogenids oder als Oligohalogenidionen, oder als Mischungen von zwei oder mehr der genannten Species, in an ein langkettiges Polymer gebundener Form als Quencher eingesetzt wird, entsprechende Verwendung von an langkettige Polymeren gebundenen Halogen/Halogenid/Oligohalogenid und Messvorrichtungen, die mit Reservoirs für das Halogen/Halogenid/Oligohalogenid und das langkettige Polymer, getrennt oder als Mischung.

Description

Polymergebundenes lod als Quencher für Fluoreszenzmessungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion und Untersuchung oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit (zumindest) nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels Halogenen, sowie die Verwendung von Halogenen als Quencher bei der Untersuchung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten, sowie damit verwandte Erfindungsgegenstände, wie für die Anwendung des Verfahrens ausgestattete Messvorrichtungen für intrazelluläre Fluoreszenz.
Esterase-Substrate , wie beispielsweise Carboxyf luores- ceindiacetat , Fluoresceindiacetat und Modifikationen hiervon, werden häufig in Bioassays, wie z.B. im Rahmen von ELISA, zytometrischen Untersuchungen und mikroskopischen
Untersuchungen, unter anderem für die Detektion von prokaryotischen und/oder eukaryotischen Zellen eingesetzt. Die Substrate werden von intrazellulären Esterasen in fluoreszierende Produkte wie Fluorescein, Carboxyf luorescein oder dergleichen, umgesetzt und liefern somit Informationen über das Vorhandensein und/oder den physiologischen Zustand der Zellen.
Ein Nachteil von esterasebasierten Assays zeigt sich in einem oft beträchtlichen Fluoreszenz -Hintergrund durch unspezifische, extrazelluläre Umsetzung von Esterase- Substraten oder den Ausfluss von fluoreszierenden Produkten aus den Zellen. Um daraus resultierende Störungen der Messung zu verringern, wurden in Bioassays Waschschritte und/oder Schritte zum Quenchen (Fluoreszenzlöschen, -unterdrücken) eingebaut zur Minimierung der unspezifischen Fluoreszenz. Die Waschschritte sind umständlich, zeitaufwändig und nicht mit jedem Assay kompatibel. In chemischen Assays wird häufig Iod in Form von Natrium- oder Kaliumiodid oder anderen Salzen in hoher Konzentration als Kontaktquencher verwendet, der aber - abhängig u.a. vom Puffer und Zelltyp - in die Zellen eindringen und somit zu intrazellulärem Quenching führen kann .
Es bestand somit die Aufgabe, neue Methoden und Ansätze zur Unterdrückung von unerwünschter extrazellulärer Fluoreszenz bei der Verwendung von fluoreszierende Farbstoffe freisetzenden Esterase-Substraten bereitzustellen, welche die genannten Nachteile eindämmen oder beseitigen.
Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe durch die Verwendung langkettiger Polymere gelöst werden kann, welche Halogene, wie Iodid, zu binden vermögen, beispielsweise durch Van-der-Waals- , Wasserstoffbrücken- oder ionische oder kovalente Interaktionen oder zwei oder mehr davon, und so das Eindringen von Halogen (z.B. als Halogenid und somit die Fluoreszenzquenchung im Zellinneren, vermindern oder sogar vollständig verhindern.
Die Erfindung betrifft daher in einer ersten Ausführungsform ein Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion, Untersuchung und/oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels einem Halogen, umfassend, dass mindestens ein Esterase- Substrat in Kombination mit mindestens einem Halogen als solchem oder in Form eines Halogenids oder als Oligohalogenidionen, oder als Mischungen von zwei oder mehr der genannten Species, in an ein langkettiges Polymer gebundener Form als Quencher eingesetzt wird. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von an langkettige Polymeren gebundenem Halogen, Halogenid und/oder Ol igohalogenid als Quencher bei der Untersuchung von prokaryot ischen und eukaryotischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung betrifft diese für Anwendung des Verfahrens ausgestattete bzw. eingerichtete Messvorrichtungen für intrazelluläre
Fluoreszenz. Beispielsweise beinhalten diese ein oder mehrere Reservoirs für Lösungen des oder der Halogene und des oder der langkettigen Polymeren, oder einer Mischung hiervon.
Weitere Erfindungsgegenstände gehen aus der nachfolgenden Beschreibung sowie den Ansprüchen hervor, wobei Letztere hier durch Bezugnahme aufgenommen werden. Auch die in der Zusammenfassung beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung werden hier durch Bezugnahme inkorporiert .
Die nachfolgenden Definitionen dienen der Konkretisierung bevorzugter Formen verwendeter allgemeiner Begriffe, wobei in den Ausführungsformen der Erfindung ein, zwei, mehrere oder alle verwendeten allgemeinen Begriffe durch konkretere Begriffe ersetzt werden könne, was zu vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung führt.
Als langkettige Polymere kommen in erster Linie in wässrigen Lösungen lösbare oder dispergierbare oder quellbare, Halogen (als solches, in Form von Halogenid oder als Ol igohalogenid) bindende Polymere in Frage, z.B. Polyamide oder Polyimide, wie Nylon-β; Mannichbasen—Typ- Polyaminpolymere ; Polysaccha- ride, wie Stärke, Polydextrose , Glykogen oder Amylopek in ; Polyethylenglykol ; Aminoglycane , wie Hyaluronate; monosub- stituierte Polyacetylene mit Methyl, Ethyl , Propyl , Pentyl , t-Butyl oder Phenyl als Substituenten; oder insbesondere Anionenaustauscherharze , z.B. Aminoethyl-, Diethylaminoethyl - (DEAE-) , quarternäre Aminoethyl- (QAE-) und quarternäre Ammoniumgruppen, gekoppelt an Cellulose, Agarose (Agar) , Dextran (Dextrane) oder Polystyrol; Polyvinylalkohol (PVA) , insbesondere syndiotaktisch angereichert (S-PVA) ; oder vor allem gesättigte (bevorzugt) oder ganz oder teilweise ungesättigte Heterocyclen mit 3 bis 10 Ringatomen, wovon ein bis drei unabhängig voneinander aus N oder NH, O und S ausgewählt sind und die vorzugsweise ein oder zwei Oxo-Reste tragen, beinhaltende Polymere, wie vor allem Polyvinylpyrrol idon (PVP) (auch als Polyvidon, Povidon bezeichnet) (auch ganz oder teilweise quervernetzt) , in Frage. Die Polymeren sind dabei insbesondere in dem verwendeten Lösungsmittel mindestens für die Anregungs- und die Emissionswellenlänge der Fluoreszenz transparent .
Die bevorzugten Molekulargewichte (mittlere Molmassen) der Polymeren können dabei im Bereich von 1000 Dalton bis 10 Millionen Dalton liegen, beispielsweise in den unten für PVP angegebenen Bereichen.
Besonders bevorzugt ist PVP, welches handelsüblich mit Molekulargewichten (mittleren Molmassen) von 2.500 bis 2.500.000 Dalton erhältlich ist. Es wurde beobachtet, dass beispielsweise mit Molekulargewichten von 10.000 bis 40.000 Dalton gute Resultate erzielt werden, ohne dass dies eine Einschränkung hinsichtlich des zuvor erwähnten
Molekulargewichgtsbereichs bedeutet, wobei zu erwarten ist, dass mit höheren Molekulargewichten tendenziell bessere Ergebnisse möglich sind.
„Gebunden" oder „bindend" bedeutet eine im Wesentlichen reversible Bindung, sei es durch Van-der- aalskräfte , durch Wasserstoffbrücken, durch ionische Bindungen und/oder ferner durch kovalente Bindungen, wobei insbesondere ein oder mehr der drei ersten genannten Bindungsarten verwirklicht sind bzw. werden. Die Halogene werden dabei als Anionen, als Moleküle oder als Ol igohalogenide (worunter hier negativ geladene Ionen mit drei oder mehr Halogenatomen pro Molekül des Typs (Hal)n " (Hai = Halogen, N = ungerade ganze Zahl 3, 5 oder höher) zu verstehen sind, wie Tri- oder Pentahalogenide , z.B. Br3 " oder Br5 "' I3 " oder I5 ~, gebunden.
Bei den Halogenen oder insbesondere Halogeniden (Halogen- anionen, z.B. als Salze) oder oligomeren Halogeniden handelt es sich um die entsprechenden Species der Elemente der siebten Hauptgruppe des Periodensystems der Elemente, insbesondere von Fluor, Chlor oder vor allem Brom oder in erster Linie Iod.
Sofern vor- und nachstehend von „Halogenen" oder „Iod" oder „Brom" oder „Fluor" oder „Chlor" die Rede ist, beinhaltet dies stets ein oder mehrere der drei Formen (Halogen als Molekül, Halogenid oder Oligohalogenid) , wenn es nicht ausdrücklich anders erwähnt oder aus dem Kontext ersichtlich anders zu verstehen ist.
Halogenide werden dabei vorzugsweise in Form ihrer Salze eingesetzt, beispielsweise als Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumchlorid, Magnesiumbromid oder Magnesiumiodid oder die entsprechenden Calciumsalze , oder insbesondere als Ammonium- salze, wie Ammoniumchlorid, - bromid oder -iodid, oder als Alkalimetallsalze, wie Natriumchlorid, Natriumbromid, Kaliumchlorid, Kaliumbromid, oder insbesondere Natriumiodid oder Kai iumiodid . Die Halogene und das langkettige Polymer können bei den er- f indungsgemäßen Verfahren oder Verwendungen getrennt voneinander oder bereits in miteinander verbundener Form der Testprobe (Probe) zugesetzt werden. Wo der Plural verwendet wird, schließt dies stets auch den Singular mit ein. Wo „ein" verwendet wird, schließt dies auch „ein oder mehrere" ein.
Als Esterase - Substrate kommen acylierte oder mit Alkoholen veresterte Formen von Fluoreszenzfarbstoffen in Betracht, wie entsprechende Xanthen-, Fluorescein- , Coumarin-, Bor-dipyrro- methen- („BODIPY"-), Eosin-, Dicyanobenzol , Ethidin oder Resoruf inderivate . Als Beispiele für derartige Verbindungen seien genannt:
Xanthene der folgenden Formeln, insbesondere Verbindung 9 ;
Figure imgf000007_0001
1 F C02H. Y = 0 4 R -= C02H, X « H 7 R =. COJH X * H
2 R S03H. Y » O 5 R = C02H, X = Br 8 R■ C02H, X -= Br
3 R = C02H. Y = +N(CH3)2 Θ R = S03H. X = H 9 R = S03H. X = H
Fluoresceinace at , Fluoresceinlaura , Fluoresceindiacetat (FDA) , Fluoresceindilaurat , halogeniertes
Fluoresceinmonoaceta , halogeniertes Fluoresceindiacetat , z.B. 21 , 7 ( -Dichlorfluoresceindiacetat oder Diacetyl - 2 , 7 - dichlorofluorescein, Carboxyf luoresceinmonoacetat , Carboxyfluoresceindiacetat , wie 5 , 6 - oder 5,6-
Carboxyfluoresceindiacetat ' CFDA) , -CFDA -N- hydroxysuccinimidester , 5-Maleimid-FDA, carboxyl iertes halogeniertes Fluorescein, Sulfofluoresceinmonoacetat , 5- oder 5 , 6 -sulfo-FDA Sulfof luoresceindiacetat ,
Azidofluoreszeinmonoaceta , Azidof luoresceindiacetat , Fluoreszein-Dipropionat , Fluoresceindibutyrat , Fluoresceindi - laurat, 5 ( 6 ) - 2 ' , 7 ' dichloro-CFDA, 5 ( 6 ) - sul fo- FDA, Di-beta-D- galactosid Fluorescein, 3 -o-methylfluorescein Phosphat, pentaacetoxy Ester des 2 ', 7 ' -Bis- (Carboxyethyl ) -5 (6)- Carboxyfluorescein (BCECF / AM) , pentaacetoxy Ester des 2 ' , 7' -Bis (carboxyethyl) -5 ( 6 ) -Fluorescein (BCECF / AM) oder Chlormethyl f luorescein diacetat, ;
Alanin- 7 -Amino-4 -methylcumarin, Glycin- 7 -Amino-4 - methylcoumarin, Prolylvaline-7-Amino-4-methylcoumarin oder Glycyl-L- Prolin- 7 -Amino-4 -methylcoumarin,
3- (2 -Benzoxazolyl ) umbilliferylacetat , 4-Methylumbelliferyl- butyrat oder -acetat, , 4-beta-D methylumbelliferyl Galactosid, 4 -Methylumbell i feryl -alpha-D-mannopyranosid, 4- Methylumbelliferyl nonanoate, 4 -Methylumbelliferylphosphat oder Methyl - 1 -umbel 1 i ferylglucoromide , ;
Eosindiacetat oder Carboxyeosindiacetat , Diacetoxy-2 , 3 -Dicyanbenzol acetat (ABD ) oder Hydroethidin
Resoruf inacetat ;
Alkohoholate , wie Methanolate, Ethanolate oder Butanolate der folgenden BOPIDY-Verbindungen :
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000009_0003
^I CO^H BODIPY 630/650 BODIPY 650/665
oder 8-Octanoylpyrene-l , 3 , 6 - trisul fonsäure- trialkalimetall (z.B. natrium) salz ; oder dergleichen, oder Mischungen von zwei oder mehr davon.
Fluoresceinderivate , insbesondere die spezifisch genannten, sind dabei besonders bevorzugt.
Als Lösungsmittel (Medium) für die erfindungsgemäßen Assays sind vor allem wässrige Lösungen, wie dem Fachmann bekannte Kultur- bzw. Zellkulturmedien, Pufferlösungen und Salzlösungen vorzusehen. Nicht erschöpfend genannte Beispiele sind Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (z.B. von Gibco) , F-12 Nutrient Mixture (z.B. von F12), oder Phosphatgepufferte Physiologische Kochsalzlösung (PBS), Saline-Natriumcitrat-Puf fer (SSC für Saline Sodium Citrate Buffer), Tris (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS), TTRIS-HC1, 2- (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinyl) ethansulfonsäure (HEPES) , Citratpuffer, Acetatpuf fer , Cocodylat-, Dimethylglutarat - , Imidazol- , Bis- ( 2 -hydroxyethyl ) amino- tris (hydroxymethyl ) methan- (Bis-Tris-), N- ( 2 -Acetamido) - 2 - aminoethansulfonsäure- (ACES-), N- ( 2 -Acetamido) - iminodiessigsäure- (ADA-), Piperazin- 1 , 4 -ethansul fonsäure (PIPES) , Saline Sodium Phosphate EDTA- (SSPA
Kochsalzlösung/Natriumphosphat -EDTA) -Puffer, jeweils eingestellt mit geeigneten anorganischen Säuren, wie HCl oder Schwefelsäure, oder organischen Säuren, wie Essigsäure oder dergleichen .
Die Messung bzw. Bestimmung der Fluoreszenz zu untersuchender Proben erfolgt unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise mittels Photometrie,
Durchf lusszytometrie oder Mikroskopie, z.B. mithilfe von Photomultipliern oder Photodioden oder durch digitale verwendbare Lichtsensoren, wie z.B. Diodenarrays , beispielsweise mittels CCD-Chips oder der CMOS -Technik , oder mittels Mikroskopen. Die Messung kann im inneren von Messgeräten oder mittels Sensoren, die Messsignale an Auswerteeinheiten weitergeben, oder dergleichen mehr erfolgen. Die Anregung der Fluoreszenz kann beispielsweise mittels geeigneter Lichtquellen, z.B. unter Verwendung von elektromagnetischer Strahlung geeigneter (d.h. insbesondere zu Fluoreszenzanregung geeigneten, vorzugsweise nicht die Messung der Fluoreszenz beeinträchtigenden) Wellenlängen, etwa mittels Monochromator, mit Lichtquellen beispielsweise ausgewählt aus Xenon- oder Wol framhalogen- Lampen , LEDs oder Laser (beispielsweise auch im Pulsbetrieb) mit für den jeweiligen Farbstoff geeigneten Anregungswellenlängen erfolgen. Als Untersuchungsmaterial kommen beispielsweise Proben für Hygiene- und Qualitätskontrolle, wie Abstriche von Oberflächen, deren Keimbedeckung ermittelt werden soll, oder Waschflüssigkeit nach Oberflächenbehandlung oder nach Durchdringung von Materialien oder flüssigkeitsdurchlässigen (z.B. porösen) Gegenständen, Proben von Flüssigkeiten, wie Getränken oder Wasserproben aus Leitungen, Gefäßen (wie Aquarien) oder Gewässern oder Proben für medizinisch- diagnostische Untersuchungen beispielweise
Körperflüssigkeiten wie Blut, Blutplasma, Blutserum, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Säfte aus dem Verdauungstrakt, Nasenschleim oder Sperma, oder Zellkulturen, oder Nahrungsmittel, oder dergleichen in Frage .0
Diese können nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren aufbereitet werden, beispielsweise durch Filtrieren, Zentrifugieren, Chromatograf ie (z.B. Gelchromatographie), Einengen (z.B. unter Unterdruck oder über wasseraufnehmenden Stoffen, wie Natriumsulfat oder Calciumchlorid) , Verdünnen (beispielsweise mit geeigneten wässrigen Lösungen wie den oben genannten Pufferlösungen), oder dergleichen.
Zu den bestimmbaren Zellen gehören sowohl prokaryot ische Zellen, wie Bakterien (ferner auch antibiotikaresistente Bakterien, wie resistente Staphylokokkus aureus, Pseodomonas species, Escherichia coli oder Mycobacterium tuberculosis, oder Archaeen) ; als auch eukaryot ische Zellen, wie Algen, Hefen, andere einzellige Pilze, Protozoen, Zellen aus Zellkulturen, Zellen aus Geweben (insbesondere nach Vereinzelung), oder dergleichen.
Die Messung ermöglicht, über die Zahl (z.B. Konzentration), den Stoffwechselzustand (z.B. schwache Fluoreszenz bei geschädigten Zellen) und die Identität der Zellen (z.B. unterschiedliche Esteraseaktivitäten für unterschiedliche Esterasesubstrate, unterschiedliche Größe der Zellen oder dergleichen) Informationen zu gewinnen - im letzteren Falle kann so auch eine Sortierung von Zellen mit unterschiedlichem Fluoreszenzverhalten (beispielsweise Aufnahme oder Spaltung unterschiedlicher Esterase-Substrate mit unterschiedlichen Wellenlängen der Fluoreszenz oder Trennung nicht fluoreszierender von fluoreszierenden Zellen) erreicht werden, beispielsweise mittels Fluss -Sortieren unter Durchf lusszytometrie , z.B. mittels FACS .
Das/Die nachfolgende (n) Beispiel (e) dienen/dient der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einzuschränken. Abbildungen:
Fig. 1 zeigt das Quenchen des farbstoffverursachten Hintergrundes .
In (a) und (b) ist der vom CFDA verursachte Hintergrund zu erkennen, (a)als Plot der beiden Streulichkanäle FSC-H und SSC-H gegeneinander und (b)als Darstellung des Fluoreszenz- Kanals FL1-H gegen das Seitwärtsstreulicht SSC-H.
(c) und (d) zeigen die Reduktion des vom CFDA verursachten Hintergrundes nach Zugabe von PVP- I , (c) im FSC-H/SSC-H Diagramm und (d) im SSC-H/FL1-H Plot.
Fig. 2 zeigt das Fluoreszenzspektrum von Carboxyfluorescein und von Carboxyfluorescein mit PVP-I.
Emmisionspektrum von Carboxyf luorescein (CF) , Polyvinylpyrrol idone - Iodine complex (PVP-I) und Kombination von Carboxyf luorescein und Polyvinylpyrrol idone- Iodine in Färbepuffer .
Fig. 3 zeigt das Quenchen des farbstoffverursachten Hintergrundes in einer Suspension gefärbter E. coli. Punktediagramm FSC-H/SSC-H (a) und Histogramm FL1-H (c) zeigen den farbstoffverursachten Hintergrund (Population unterhalb 104 FSC-H resp. 2*103 FL1-H) , sowie eine Population angefärbter Escherichia coli (Region Rl) . Im Punktediagramm FSC-H/SSC-H (b) und Histogramm FL1-H (d) ist die Population angefärbter E. coli nach der Zugabe von PVP-I zu sehen, der Hintergrund ist verschwunden
Fig. 4 zeigt die Färbeintensität von Bakterien nach dem Quenchen mit PVP-I oder KI.
Histogramme (FL1-H) zeigen Färbeintensität von Escherichia coli (a) und Enterococcus mundtii (b) nach dem Quenchen mit IM KI (kleine Peaks)oder 0,003% PVP-I (große Peaks) . Beide Stämme weisen vergleichbare Färbeintensität (FL1-H) nach der Zugabe von beiden Quenchersubstanzen auf. Um diesen Effekt zu veranschaulichen, wurden für KI und PVP-I Bakterien in unterschiedlicher Zellzahl (Counts) verwendet, was an der Höhe der Histogramme, die der Eventszahl (gezählte Ereignisse) entspricht, zu sehen ist.
Fig. 5 zeigt die Counts von Escherichia coli und Enterococcus mundtii nach dem Quenchen mit PVP-I und KI.
Die Diagramme stellen die Zellzahl der gefärbten E. coli (a) und Ent . mundtii nach dem Quenchen mit PVP-I und KI sofort nach Zugabe (0h), nach einer Stunde Inkubation und nach zwei Stunden Inkubation dar.
Beispiele : Die getesteten Stämme von Escherichia coli DSM 498 und Enterococcus mundtii DSM 4838 wurden von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) (Braunschweig, Deutschland) erhalten. Beide Stämme wurden als Testorganismen mit unterschiedlicher Zellwandstruktur ausgewählt. Es ist allgemein bekannt, dass sich Gram-positive Mikroorganismen und Gram-negative Bakterien im Aufbau ihrer Zellwände unterscheiden. Gram-positive Bakterien, wie Enterococcus mundtii, besitzen eine einzelne Membran mit einer dicken äußeren Schicht aus Peptidoglycan. Die Zellwand von Gram-negativen Bakterien, wie E. coli, besteht aus einer Doppelmembran, die Peptidoglycane sind weniger häufig und dispergiert. Aufgrund der unterschiedlichen
Zellwandorganisation weisen Gram-positive und Gram-negative Bakterien teilweise eine unterschiedliche Permeabilität für zahlreiche Substanzen, einschließlich Farbstoffen und Quenchern, und somit unterschiedliche Färbe- und Quenchingverhalten auf.
Die Bakterienstämme wurden nach Herstellerangaben aufbereitet und als Plattenkultur (Ausstrichplatte) für ca. 1-2 Wochen bei 4 °C gelagert. Für die Versuche wurden die verwendeten Testorganismen über Nacht in CASO-Bouillon (Komplexmedium zur Anzüchtung von anspruchsvollen Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen - das Medium entspricht in seiner Zusammensetzung den Empfehlungen der aktuellen Europäischen Pharmacopoeia (EP) und der United States Pharmacopoeia (USP) ; Heipha Diagnostica, Eppelheim, Deutschland) auf einem Schüttler (HeizThermomixer MHR 23, Ditabis, Pforzheim) bei 200 min"1 und 30 °C inkubiert. Nach der Bebrütungszeit wurde ein Teil der Bakteriensuspension mit 0,85 % NaCl-Lösung (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe) so verdünnt, dass ein Wert von 0,5 McF im Densitometer (DEN- 1B , Biosan, Lettland) angezeigt wurde. Dies entspricht circa 1,5*108 Zellen/ml. Anschließend wurde die Bakteriensuspension weiter in isotonischer Salzlösung oder Färbepuffer verdünnt, um die gewünschte Zellkonzentration zu erreichen.
In den vorgenommenen Experimenten wurde der Farbstoff Carboxyfluorescein-Diacetat , kurz CFDA ( Sigma-Aldrich , 21879) , eingesetzt um die Testorganismen für deren Detektion im Zytometer anzufärben. Es handelt sich dabei um einen membrangängigen Farbstoff mit dem lebende Mikroorganismen angefärbt und nachgewiesen werden. CFDA wird von intrazellulären Esterasen durch die Abspaltung zweier Acetatgruppen in das fluoreszierende Carboxyf luorescein überführt. Dieses ist weniger membrangängig und fluoresziert besonders stark im Fluoreszenzkanal FL-1 des Zytometers . Das CFDA wurde als Stammlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml in wasserfreiem Dimethylsul foxid (Abk. DMSO, Sigma-Aldrich, 276855-100ML) zu Portionen von jeweils 50 μΐ eingefroren und bei -21 °C gelagert. Zu Beginn der Messungen wurde ein Aliquot entnommen, aufgetaut und jeweils 100-fach verdünnt der Bakterienlösung zugefügt. Nach einer Färbezeit von 15 Minuten bei Raumtemperatur in Färbepuffer wurden die Bakterien im Accuri Zytometer analysiert.
Für die Quenching Versuche wurde entweder wässrige 1 M Kai iumiodid-Lösung (Roth, 8491.1), oder wässrige PVP-I-Lösung (Sigma-Aldrich, PVP1-100G) in einer Endkonzentration von 0,003 % für die durchf lusszytometrische Analyse oder von 0,025 % für die Fluoreszenzspektroskopie verwendet. PVP-I ist ein wasserlöslicher Komplex von Iod und Polyvinylpyrrol idon (PVP, Povidon) , der normalerweise als Desinfektionsmittel bzw. Antiseptikum verwendet wird. Im PVP-I Komplex fungiert Wasserstofftriiodid (H+I3 ~) als Ionenpaar innerhalb des Povidons. Beide Quenchersubstanzen wurden nach 15 min Färbereaktion der Bakterienkultur oder der
FarbstoffSuspension zugesetzt.
Die Fluoreszenzspektren wurden mit dem Thermo Scientific Varioskan Flash Multifunktions -Spektralreader aufgenommen. Die Anregung von CFDA erfolgte bei 480 nm, das Fluoreszenzspektrum wurde im 495-600 nm Bereich in 5 nm Schritten aufgenommen.
Die in den folgenden Beispielen dargestellten Ergebnisse wurden mit einem BD Accuri™ C6 Flow Cytometer erstellt, das mit rotem (640 nm) und blauem Laser (488 nm) , zwei Streulichtdetektoren und vier Fluoreszenzdetektoren mit Filtern (FL1 533/30 nm, FL2 585/40 nm, FL3 > 670 nm, FL4 675/25 nm) ausgestattet ist. Die Detektion von CFDA- markierten Bakterien erfolgte im FL1 Kanal bei der Anregung mit blauem Laser. Am Gerät wurde ein Threshold von 1000 FL1-H und 500 SSC-H, sowie eine Flussrate von 35 μΐ/min eingestellt. Die mit dem Accuri C6-Zytometer aufgenommenen Messdaten wurden mithilfe der zum Gerät gehörenden Software CFlow Plus Analysis ausgewertet. Die Durchflusszytometrie ist eine allgemein bekannte und häufig verwendete Methode zur Analyse von Zellen jeglicher Art, wobei mehrere Parameter wie Zellgröße, Zellzahl, DNA, RNA, Proteingehalt gleichzeitig vermessen werden können. Bei den vorgelegten Beispielen wurden die Fluoreszenz, sowie die Streulichtparameter der Bakterien und der Farbstoffhintergrund analysiert.
Figur 1 zeigt ein typisches Ergebnis einer zytometrischen Messung des Esterase-Substrates CFDA in Färbepuffer. Jeder Punkt stellt ein einzelnes (unerwünschtes) Zählereignis dar. Die Zugabe von 0,003 % PVP-I Komplex führt zu einer deutlichen Reduktion dieses Hintergrunds, sichtbar im Streulicht ( SSC-H/FSC-H) und FL1-H Kanal (SSC-H/FL1 -H) .
Figur 2 zeigt die Fluoreszenzspektren von 50 g/ml Carboxyfluorescein (1), 0,025 % PVP-I (3) und der Mischung beider Substanzen (2) in Färbepuffer, aufgenommen mit dem Varioskan° Flash bei einer Anregungswellenlänge von 480 nm. Das Spektrum der Mischung belegt die Wirksamkeit des PVP-I als Quencher für Carboxyf luorescein .
Durch die Zugabe von 0,003 % PVP-I zu einer Suspension fluoreszenz -gefärbter E. coli kann der durch den Farbstoff verursachte Hintergrund deutlich reduziert werden, wie aus Figur 3 ersichtlich. Nach der Zugabe von I M KI oder 0,003 % PVP-I ( Polyvinylpyrrolidon- Iod) zu gefärbten Escherichia coli oder Enterococcus mundtii weisen beide Bakterienstämme eine vergleichbare Färbeintensität auf, wie Figur 4 veranschaulicht. Verwendet man jedoch 1 KI anstelle von 0,003 % PVP-I als Quencher, sinkt die Zellzahl nach dessen Zugabe zur angefärbten Probe innerhalb von zwei Stunden deutlich ab. Die Zellzahl nach der Zugabe von PVP-I verändert sich hingegen nicht. Das ist plausibel erklärbar, wenn man annimmt, dass PVP-I überwiegend extrazellulär quench . Die großen Polymermoleküle von PVP dringen nicht in die Zelle ein und binden Iod außerhalb der Zellen, wodurch überwiegend extrazelluläres Quenching von unerwünschter Fluoreszenz, z.B. von unspezifisch hydrat isiertem fluorogenem Substrat oder Farbstoff, der aus den Zellen rausfließt, stattfindet. KI hingegen dringt wesentlich schneller in die Zellen ein und unterdrückt dort ebenfalls (unerwünscht) die Fluoreszenz des gebildeten Farbstoffes, wodurch deren Fluoreszenzintensität unter die Detektionsschwelle gedrückt wird. In der Folge können nur noch die stärker gefärbten Bakterien detektiert werden .
Dies veranschaulichen die Diagramme der Figur 5 für Escherichia coli und für Enterococcus mundtii. Anstatt des PVP- Iod Komplex kann ein PVP Polymer (unterschiedliche Molekulargewichte) mit unterschiedlichen Konzentrationen von Halogenen als Quencher verwendet werden. Dies ermöglicht eine flexible Optimierung des Bioassays, abhängig vom Zelltyp, der verwendeten Methode usw.
Ergänzende Angaben können den Texten für die Figuren oben entnommen werden.
/ Ansprüche

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Quenchen extrazellulärer Fluoreszenz bei der Detektion, Untersuchung und/oder Sortierung von prokaryotischen und eukaryot ischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase-Substraten mittels einem Halogen, umfassend, dass mindestens ein Esterase- Substrat in Kombination mit mindestens einem Halogen als solchem oder in Form eines Halogenids oder als Oligohalogenidionen, oder als Mischungen von zwei oder mehr der genannten Species, in an ein langkettiges Polymer gebundener Form als Quencher eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den eingesetzten Halogenen in der an das langkettige Polymer gebundenen Form um Brom oder Iod, Bromid- oder Iodidsalze, oder Tri- oder Pentabromid oder Tri- oder Pentaiodid, oder Gemische von zwei oder mehr davon handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem eingesetzten langkettigen Polymeren um ein in wässrigen Lösungen lösbares oder dispergierbares oder quellbares, Halogen als solches, in Form von Halogenid und/oder als Ol igohalogenid bindendes Polymer handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei es sich bei dem eingesetzten langkettigen Polymer um ein Polyamid oder Polyimid, wie Nylon-6; ein Mannichbasen—Typ- Polyaminpolymer ; ein Polysaccharid, wie Stärke, Polydextrose , Glykogen oder Amylopektin; ein Polyethylenglykol ; ein Aminoglycan, wie Hyaluronat; ein monosubst ituiertes Polyacetylen mit Methyl, Ethyl, Propyl , Pentyl , t-Butyl oder Phenyl als Subst ituenten ; ein Anionenaustauscherharz , z.B. Aminoethyl - ,
Diethylaminoethyl - (DEAE-) , quarternäre Aminoethyl- (QAE-) und quarternäre Ammoniumgruppen, gekoppelt an Cellulose,- Agarose (Agar), Dextran (Dextrane) oder Polystyrol; einen Polyvinylalkohol (PVA) , insbesondere syndiotaktisch angereichert (S-PVA) ; oder um ein gesättigte oder ganz oder teilweise ungesättigte Heterocyclen mit 3 bis 10 Ringatomen, wovon ein bis drei unabhängig voneinander aus N oder NH, O und S ausgewählt sind und die vorzugsweise ein oder zwei Oxo- Reste tragen, beinhaltendes Polymer, wie vor allem Polyvinylpyrrolidon (PVP) , auch ganz oder teilweise quervernetzt, handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei dem eingesetzten Polymer um Polyvinylalkohol oder
Polyvinylpyrrolidon handelt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei Die bevorzugten mittleren Molmassen des langkettigen Polymeren im Bereich von 1000 Dalton bis 10 Millionen Dalton liegen, beispielsweise im Bereich von 2.500 bis 2.500.000 Dalton.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei als Esterase-Substrat Xanthene der folgenden Formeln:
Fluoresceinacetat , Fluoresceinlaurat , Fluoresceindiacetat (FDA) , Fluoresceindilaurat , halogeniertes
Fluoresceinmonoacetat , halogeniertes Fluoresceindiacetat, z.B. 2 7 ' -Dichlorf luoresceindiacetat oder Diacetyl-2 , 7- dichlorofluoreseein, Carboxyfluoresceinmonoacetat ,
Carboxyfluoresceindiacetat , wie 5, 6- oder 5,6- Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) , 5 (6)-CFDA -N- hydroxysuccinimidester , 5 -Maleimid- FDA, carboxyl iertes halogeniertes Fluorescein, Sulfof luoresceinmonoacetat , 5- oder 5 , 6 -sulfo-FDA Sulfof luoresceindiacetat ,
Azidofluoreszeinmonoacetat , Azidofluoresceindiacetat ,
Fluoreszein-Dipropionat , Fluoresceindibutyrat , Fluoresceindilaurat, 5 (6) -2 ' , 7 ' dichloro-CFDA, 5 ( 6 ) - sul fo- FDA, Di-beta-D- galactosid Fluorescein, 3-o-methylf luorescein Phosphat, pentaacetoxy Ester des 2 ', 7 ' -Bis- (Carboxyethyl ) -5 (6)- Carboxyfluorescein (BCECF / AM) , pentaacetoxy Ester des 2 ' , 7 ' -Bis (carboxyethyl) -5 ( 6 ) -Fluorescein (BCECF / AM) oder Chlormethylf luorescein diacetat, ;
Alanin-7-Amino-4-methylcumarin, Glycin- 7 -Amino-4 - methylcoumarin, Prolylvaline-7-Amino-4-methylcoumarin oder Glycyl -L-Prolin-7 -Amino-4 -methylcoumarin, 3- (2-Benzoxazolyl) umbilliferylacetat , 4-Methylumbelliferyl - butyrat oder -acetat, , 4-beta-D methylumbelliferyl Galactosid, 4 -Methylumbelliferyl -alpha-D-mannopyranosid, 4- Methylumbell iferyl nonanoate, 4-Methylumbelliferylphosphat oder Methyl - 1-umbelliferylglucoromide , ;
Eosindiacetat oder Carboxyeosindiacetat ,
Diacetoxy-2 , 3 -Dicyanbenzol acetat (ABD) oder Hydroethidin Resoruf inacetat ;
Alkohoholate , wie Methanolate, Ethanolate oder Butanolate der folgenden BOPIDY-Verbindungen :
Figure imgf000021_0001
BODIPY 6G
Figure imgf000021_0002
oder 8 -Octanoylpyrene- 1 , 3 , 6-trisulfonsäure- trialkalimetall (z. B . natrium) salz ; oder dergleichen, oder Mischungen von zwei oder mehr davon, eingesetzt werden.
8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Halogen und das langkettige Polymer gemischt und anschließend mit einer zu prüfenden Probe gemischt werden.
9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Halogen und das langkettige Polymer zugleich mit einer zu prüfenden Probe vermischt werden.
10. Verwendung von an ein langkettiges Polymer gebundenem Halogen, Halogenid und/oder Ol igohalogenid als Quencher bei der Untersuchung von prokaryot ischen und eukaryot ischen Zellen mit nach Esterspaltung fluoreszierenden Esterase- Substraten, wobei das langkettige Polymer, das Esterase- Substrat und die Halogene insbesondere wie in einem der vorstehenden Ansprüche definiert sind.
11. Messvorrichtung für intrazelluläre Fluoreszenz, beinhaltend ein oder mehrere Reservoirs für Lösungen des oder der Halogene und des oder der langkettigen Polymeren, oder einer Mischung hiervon, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 genannt .
Zusammenfassung
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