JP7007298B2 - デジタル微生物学 - Google Patents

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Description

本発明は、試料中の微生物の有無を判断するための方法及び組成物に関する。
本出願は２０１６年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／２８６，８９７号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
微生物の同定及び定量は、多くの分野に関連する。微生物の培養は様々なアッセイにおける工程の一つであり、微生物を培養するには１日以上の時間がかかる。培養工程の時間を短縮することができれば、様々な微生物学的アッセイの改良に役立つであろう。
食品業界においては、食品の安全性に関する多くのパラメータを監視する様々な要件を満たす必要がある。例えば、食品加工業者は、一般的に、原材料の生産、調達、及び取扱いから、完成した食品の製造、流通、および消費までの間の生物学的、化学的、及び物理的危険性を分析し、制御することが求められる。これら要件の一つの側面には、微生物に関する食品品質指標（ＱＩ）を計数することが含まれる。ＱＩの計数は、試験された食品の衛生的品質を示す。衛生的品質に関する情報は、食品中に病原性生物が存在する可能性や食品の保存期限の指標となる。ＱＩを計数する技術の例としては、コロニー計数技術や最確数（ＭＰＮ）技術がある。このような技術では、一般的に、ヒューマンエラーを起こしやすく、また、アッセイ固有のばらつきが生じやすい。また、このような技術においては、様々な標的微生物を計数するための特殊な試薬が必要となる可能性がある。さらに、これらの技術は、結果が得られるまでに長い培養時間（例えば、１８～２４時間又は最長５日間まで）を要する可能性がある。さらに、これらの技術は、過度の手作業を要する可能性もある。
臨床の場において、病原性微生物が示す抗菌剤に対する感受性の程度は様々である。したがって、臨床医にとって、病原菌の種又は株、様々な種類の抗菌剤に対する病原菌の感受性、及びそれらの組み合わせを同定することは有益であることが多い。しかし、当業者が使用する微生物感染の臨床評価の方法では、抗菌剤に対する感受性を判断するのに少なくとも１６～４８時間かかるのが一般的である。また、一般的な抗菌剤感受性試験法では、ヒューマンエラーを起こしやすく、また、アッセイ固有のばらつきが生じやすい可能性がある。さらに、これらの技術では、様々な標的微生物を計数するための特殊な試薬が必要となる可能性がある。さらに、これらの技術は、過度の手作業を要する可能性もある。
試料中の微生物の有無を判断するための方法及び組成物が本明細書に記載される。また、本明細書には、単位質量又は単位体積当たりの多数の標的微生物について、食品マトリックスを迅速にアッセイするための方法も記載される。さらに、本明細書には、試験用抗菌剤の最小阻害濃度について、標的微生物を迅速にアッセイするための方法（例えば、感受性試験）も記載される。
一実施形態では、試料中における微生物の有無を判断する方法は、ｉ）複数の油中水エマルジョンの液滴に試料を封入し、前記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、ｉｉ）前記複数の油中水エマルジョンの液滴を、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、前記標的微生物が５～４５回倍加するのに十分な時間培養し、ｉｉｉ）標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定し、ｉｖ）少なくとも１つの油中水エマルジョンの液滴において標的微生物を同定したことに応答して、前記試料中に前記標的微生物が存在すると判断することを含む。
図１のＡ－Ｊは、概念実証実験の結果を示す。概念実証実験では、大腸菌（E. Coli）細胞を液滴に分割し、増殖期において後述の時間培養し、光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡で観察した。この結果は、６時間以内に細菌を検出することができ、８時間以内に強い自己蛍光を検出することができることを示している。 図２のＡ－Ｂは、液滴生成との適合性について後述の食品マトリックスを試験した実験の結果を示す。 図３のＡ－Ｏは、ハムの食品マトリックスから得られた大腸菌を油中水液滴を用いて迅速に計数する様子を示す。 図４のＡ－Ｊは、様々な細菌を油中水液滴を用いて迅速に検出する様子を示す。 図５のＡ－Ｆは、様々な酵母及びカビを油中水液滴を用いて迅速に検出する様子を示す。 図６のＡ－Ｂは、自動液滴リーダにおいて、陽性の液滴及び陰性の液滴を計数することにより、標的細菌を正確に計数する様子を示す。 図７Ａは、自動液滴リーダにおいて、陽性の液滴及び陰性の液滴を計数することにより、標的細菌及び標的酵母を正確に計数する様子を示す。 図７Ｂは、自動液滴リーダにおいて、陽性の液滴及び陰性の液滴を計数することにより、標的細菌及び標的酵母を正確に計数する様子を示す。 図８のＡ－Ｄは、特異的検出のためのβ～ガラクトシダーゼ基質の使用及び／又はβ～ガラクトシダーゼ酵素を発現する標的微生物の計数の様子を示す。 図９のＡ－Ｂは、液滴におけるカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）を培養せずに検出する様子を示す。 図１０のＡ－Ｃは、５時間培養後の０．１マクファーランド及び１／２００のコンジュゲートに相当するカンジダ・アルビカンス接種材料を示す。 図１１のＡ－Ｃは、２４時間培養後の０．１マクファーランド及び１／２００のコンジュゲートに相当するカンジダ・アルビカンス接種材料を示す。 図１２のＡ－Ｂは、培養していない１マクファーランド及び１／２００のコンジュゲートに相当するカンジダ・パラプシローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）接種材料を示す。 図１３のＡ－Ｂは、セフォキシチン（「ＦＯＸ」）を添加していない６時間培養後の黄色ブドウ球菌（「ＳＡ」）＋ヨウ化プロピジウム（「ＰＩ」）の試料を示す。 図１４のＡ－Ｃは、６時間培養後のＳＡ＋ＰＩ＋０．２５ｍｇ／ＬのＦＯＸの試料を示す。 図１５のＡ－Ｃは、６時間培養後のＳＡ＋ＰＩ＋０．５ｍｇ／ＬのＦＯＸの試料を示す。 図１６のＡ－Ｃは、６時間培養後のＳＡ＋ＰＩ＋４ｍｇ／ＬのＦＯＸの試料を示す。 図１７のＡ－Ｆは、ヨウ化プロピジウムの使用及び細菌が増殖した液滴（Ｇ）から検出された蛍光シグナルを増強するための加熱工程を示す。液滴は、ヨウ化プロピジウムの非存在下（図１７のＡ及びＤ）又は存在下（図１７のＢ、Ｃ、Ｅ及びＦ）において、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２株を添加した緩衝ペプトン水ブロスから形成した。液滴は、３７℃で２４時間培養した。図１７のＣ及びＦに示す液滴は、９０℃で５分間加熱した。 図１８のＡ－Ｄは、微生物の検出のためのｐＨ指示薬の使用を示す。液滴は、ｐＨ指示薬であるｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄの非存在下（図１８のＡ及びＣ）及び存在下（図１８のＢ及びＤ）において、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２株を添加したトリプトン・グルコースブロスから形成した。 図１９のＡ－Ｄは、特異的検出のためのβ～グルコシダーゼ基質の使用及び／又はβ～グルコシダーゼ酵素を発現する標的微生物の計数の様子を示す。液滴は、ＡＬＤＯＬ（登録商標）５１８～ｐ～グルコシドの非存在下（図１９のＡ及びＣ）又は存在下（図１９のＢ及びＤ）において、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＡＴＣＣ１３０４８株を添加した緩衝ペプトン水ブロスから生成した。 図２０のＡ－Ｂは、水相中にカビ胞子（例えば、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）ＤＳＭ１０９６株）を有する油中水液滴の油相中に抗真菌化合物が含まれていない対照条件を示す。４８時間培養後、カビの菌糸は、液滴の膜を通過することができ、液滴合体を引き起こした（図２０のＡ）。さらなる増殖により、胞子が形成された（図２０のＢ）。 図２１のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に６０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２１のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における４８時間培養後のＹＣＧブロス中のムコール・ラセモサス（Mucor racemosus）ＣＥＣＴ２０８２１株の増殖の様子を示す。 図２２のＡ－Ｄは、油中水液滴の油相中に４０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。油相中のジクロランの存在下において、ＹＣＧブロス中でムコール・ラセモサスＣＥＣＴ２０８２１株を４８時間培養した。蛍光発生基質として５，６カルボキシフルオレセインジアセテート（２５ｍｇ／ｄＬ）を当該ブロスに添加し、その画像を図２２のＣ及びＤに示した。 図２３のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に８０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２３のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における２４時間培養後のＹＣＧブロス中のアスペルギルス・レストリクタス（Aspergillus restrictus）ＣＥＣＴ２０８０７株の増殖の様子を示す。図２３のＡにおいて、スライドインレットは、図の右側にある。 図２４のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に１００ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２４のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における４８時間培養後のＹＣＧブロス中のアスペルギルス・レストリクタスＣＥＣＴ２０８０７株の増殖の様子を示す。図２４のＡにおいて、スライドインレットは、図の右側にある。 図２５のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に８０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２５のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における２４時間培養後のＹＣＧブロス中のペニシリウム・ヒルスツム（Penicillium hirsutum）ＡＴＣＣ１６０２５株の増殖の様子を示す。スライドインレットは、図２５のＡの左側及び図２５のＢの右側にある。 図２６のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に６０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２６のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における２４時間培養後のＹＣＧブロス中のユーロチウム・ルブラム（Eurotium rubrum）ＣＥＣＴ２０８０７株の増殖の様子を示す。 図２７のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に８０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２７のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における４８時間培養後のＹＣＧブロス中のユーロチウム・ルブラムＣＥＣＴ２０８０７株の増殖の様子を示す。図２７のＡにおいて、スライドインレットは、図の右側にある。 図２８のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に８０ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるユーロチウム・ルブラムＣＥＣＴ２０８０７の増殖が阻害される様子を示す。蛍光発生基質として、５，６カルボキシフルオレセインジアセテート（２５ｍｇ／Ｌ）を当該ブロスに添加した。 図２９のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に１００ｍｇ／Ｌのジクロランが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図２９のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のジクロランの非存在下及び存在下における４８時間培養後のＹＣＧブロス中のフザリウム・グラミネアラムＤＳＭ１０９６株の増殖の様子を示す。図２９のＡにおいて、スライドインレットは、図の右側にある。 図３０のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に１５０ｍｇ／Ｌのローズベンガルが含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図３０のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のローズベンガルの非存在下及び存在下における４８時間培養後のアスペルギルス・レストリクタスＣＥＣＴ２０８０７株の増殖の様子を示す。 図３１のＡ－Ｂは、油中水液滴の油相中に０．５ｍｇ／Ｌのエニルコナゾール（イマザリル）が含まれるときの、水相の外側におけるカビの増殖が阻害される様子を示す。図３１のＡ及びＢは、それぞれ、油相中のエニルコナゾールの非存在下及び存在下における４８時間培養後のペニシリウム・ヒルスツムＡＴＣＣ１６０２５株の増殖の様子を示す。 図３２～３５は、微生物の検出のためのレクチンの使用を示す。図３２は、カンジダ・グラブラータ（C. glabrata）及びフルオレセイン標識コンカナバリンＡ（Concanavalin A（ＣｏｎＡ））を有する液滴の画像を示す。 図３３は、カンジダ・トロピカリス（C. tropicalis）及びＣｏｎＡを有する液滴の画像を示す。 図３４は、大腸菌及びＣｏｎＡを有する液滴の画像を示す。 図３５は、カンジダ・クルセイ（C. krusei）及びＣｏｎＡを有する液滴の可視画像及び緑色蛍光画像から合成した合成画像を示す。 図３６のＡ－Ｂは、非ゲル化液滴（Ａ）及びゲル化液滴（Ｂ）におけるカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１の増殖の様子を示す。 図３７のＡ－Ｄは、ゲル化がゲル化剤のみによるものではないことを確かめるための対照条件を示す。液滴は、ＹＧＣブロス中のカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１を水相中に含有し、０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸を油相中に含有していた。矢印は、カンジダ・アルビカンスに対して陽性である液滴の例を示す。 図３８のＡ－Ｄは、ゲル化がゲル化剤のみによるものではないことを確かめるための対照条件を示す。液滴は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）ＤＳＭ１３３３を水相中に含有し、０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸を油相中に含有していた。矢印は、出芽酵母に対して陽性である液滴の例を示す。 図３９のＡ－Ｃは、酸性化酵母株である出芽酵母ＤＳＭ１３３３（図３９のＢ及び図４０のＢ）及び非酸性化酵母株であるデバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）ＣＬＩＢ１９７（図３９のＣ及び図４０のＣ）の存在下におけるゲル化の様子を示す。これら菌株を１ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを追加したＹＧＣブロス中において２４時間増殖させた。当該油中には、酢酸を添加しなかった。図３９のＡ及び図４０のＡは、陰性対照を示す。矢印は、微生物に対して陽性である液滴の例を示す。 図４０のＡ－Ｃは、酸性化酵母株である出芽酵母ＤＳＭ１３３３（図３９のＢ及び図４０のＢ）及び非酸性化酵母株であるデバリオマイセス・ハンセニイ（Debaryomyces hansenii）ＣＬＩＢ１９７（図３９のＣ及び図４０のＣ）の存在下におけるゲル化の様子を示す。これら菌株を１ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを追加したＹＧＣブロス中において２４時間増殖させた。当該油中には、酢酸を添加しなかった。図３９のＡ及び図４０のＡは、陰性対照を示す。矢印は、微生物に対して陽性である液滴の例を示す。 図４１のＡ－Ｄは、出芽酵母ＤＳＭ１３３３を含有する液滴を２４時間培養した後の酢酸の非存在下（図４１のＡ及びＣ）及び存在下（図４１のＢ及びＤ）におけるゲル化の様子を示す。 図４２のＡ－Ｄは、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３を含有する液滴を４８時間培養した後の酢酸の非存在下（図４２のＡ及びＣ）及び存在下（図４２のＢ及びＤ）におけるゲル化の様子を示す。 図４３～４５は、特異的検出のための５（６）～カルボキシフルオレセインジアセテート（ＣＦＤＡ）基質の使用及び／又はエステラーゼ酵素を発現する標的微生物の計数の様子を示す。図４３のＡ及びＢは、それぞれ、ＣＦＤＡの非存在下及び非存在下におけるカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１の検出の様子を示す。 図４４のＡ及びＢは、それぞれ、ＣＦＤＡの非存在下及び存在下におけるクルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）ＣＬＩＢ１９６の検出の様子を示す。 図４５のＡ及びＢは、それぞれ、ＣＦＤＡの非存在下及び存在下におけるチゴサッカロミセス・ルーキシィ（Zygosaccharomyces rouxii）ＤＳＭ７５２５の検出の様子を示す。各実験において、微生物を２５ｍｇ／ＬのＣＦＤＡを含有するＹＧＣブロス中で２４時間培養した。 図４６のＡ－Ｄは、ＹＧＣブロス中において４８時間培養した後の２５ｍｇ／ＬのＣＦＤＡの非存在下（図４６のＡ及びＢ）及び存在下（図４６のＣ及びＤ）におけるムコール・ラセモサスＣＥＣＴ２０８２１の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図４７のＡ－Ｄは、ＹＧＣブロス中において２４時間培養した後の２５ｍｇ／ＬのＣＦＤＡの非存在下（図４７のＡ及びＢ）及び存在下（図４７のＣ及びＤ）におけるユーロチウム・ルブラムＣＥＣＴ２０８０８の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図４８のＡ－Ｄは、ＹＧＣブロス中において４８時間培養した後の２５ｍｇ／ＬのＣＦＤＡの非存在下（図４８のＡ及びＢ）及び存在下（図４８のＣ及びＤ）におけるフザリウム・グラミネアラムＤＳＭ１０９６の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図４９のＡ－Ｂは、ＹＧＣブロス中において４８時間培養した後の５０ｍｇ／Ｌのリン酸ＡＬＤＯＬ（登録商標）５１５の非存在下（図４９のＡ）及び存在下（図４９のＢ）におけるカンジダ・トロピカリスＡＴＣＣ７５０の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図５０のＡ－Ｂは、ＹＧＣブロス中において２４時間培養した後の５０ｍｇ／Ｌのリン酸ＡＬＤＯＬ（登録商標）５１５の非存在下（図５０のＡ）及び存在下（図５０のＢ）における出芽酵母ＤＳＭ１３３３の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図５１のＡ－Ｄは、ＹＧＣブロス中において２４時間培養した後の２５ｍｇ／Ｌのリン酸ＡＬＤＯＬ（登録商標）５１５の非存在下（図５１のＡ）及び存在下（図５１のＢ）におけるフザリウム・グラミネアラムＤＳＭ１０９６の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図５２のＡ－Ｄは、ＹＧＣブロス中において２４時間培養した後の２５ｍｇ／Ｌのリン酸ＡＬＤＯＬ（登録商標）５１５の非存在下（図５２のＡ及びＢ）及び存在下（図５２のＣ及びＤ）におけるムコール・ラセモサスＣＥＣＴ２０８２１の特異的検出及び／又は計数の様子を示す。ジクロランを油相に添加して、水相中の菌糸の増殖を制限した。 図５３のＡ－Ｂは、特異的検出のためのβ～グルクロニダーゼ基質の使用及び／又はβ～グルクロニダーゼ酵素を発現する標的微生物の計数の様子を示す。液滴は、レゾルフィン～β～Ｄ～グルクロン酸の非存在下（図５３のＡ）及び存在下（図５３のＢ）において、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２を添加した緩衝ペプトン水ブロスから生成した。
Ｉ．概要
培養工程において倍加時間が少なくて済み、試料中の微生物の有無及び／又は増殖又は数を迅速に分析することができる方法、組成物、及びキットが本明細書に記載される。これらの方法は、食品及び環境に関する品質指標（ＱＩ）並びに微生物感染の臨床診断の分野において有用である。
食品を分析する場合、原材料から完成した食品まで、適切な食品マトリックスについてこの方法を実施する。食品には、水を含む飲料及び固形食品が含まれるが、これらに限定されない。食品のＱＩ計数には、食品が調理され、加工され、保存される環境の分析も含まれる。このような環境試料は、食品が調理され、加工され、保存される機器、表面等から採取されたものである。その例としては、キッチンのカウンターやスライスマシンから綿棒で採取したもの（スワブ）が挙げられる。
記載した方法、組成物、及びキットは、環境のＱＩを判定するためにも有用である。試験を行う環境は、微生物が存在する場合、その微生物がヒトや動物に有害になる任意の環境である。そのような環境は屋内又は屋外でもよく、レクリエーションで使用される水（例えば、プール、湖）、農場、及び建物の表面を含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法、組成物、及びキットによれば、迅速な抗菌剤感受性試験が提供され、場合によっては、対象の微生物を培養せずに又は少しの倍加時間で特異的な同定を行うこともできる。倍加時間（平均世代時間とも呼ばれる）は、最適な増殖条件において、所与の個体群の数（ｎ）が倍数（２ｎ）になるのに必要となる時間である。様々な微生物の倍加時間が知られており、文献に発表されている。微生物の同定（例えば、自己蛍光による）は、同定された微生物のシグナルを増強するためにマーカーを加えることなく任意に達成される。他の実施形態では、試薬により標的微生物を結合して、その同定及び／又は定量化を補助する。
この微生物の質や抗菌剤感受性の評価は、１つ又は複数の標的微生物を含有する試料を、感受性の試験を行う抗生物質を含有する複数の油中水エマルジョンの液滴に分割し、当該液滴を（少なくとも）１～３５（例えば、１～３０、１～２５、１～２０、１～１５、１～１０、５～３５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～３５、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５）倍加時間培養し、当該液滴における標的微生物の有無を検出する。抗菌剤感受性を評価する実施形態では、液滴は、抗生物質又は抗真菌剤を含有する。諸実施形態では、異なる濃度の抗菌剤を試験する。各液滴に識別子を添加することで、どの液滴がどの濃度の抗生物質を含有するかが分かる。このような識別子は、染料又はバーコードであってもよい。諸実施形態では、培養を行わない。
ＩＩ．組成物
本明細書に記載の油中水液滴化学物質は、膜を含有する液滴及び二相界面活性剤の液滴を含む。本明細書において、二相界面活性剤の液滴は、非水相として油及び油相界面活性剤を含有し、水相として水及び水性界面活性剤を含有する。このような油中水液滴は、（ｉ）微生物の増殖及び培養培地成分；（ｉｉ）食品マトリックス；（ｉｉｉ）検出試薬（例えば、蛍光検出試薬）；（ｉｖ）抗菌；（ｖ）臨床試料；（ｖｉ）安定性を高めることにより延長された（例えば、４、８、２４、又は３６時間より長い）培養時間、又は上記（ｉ）～（ｖｉ）のうち２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの組み合わせのとの適合性に適応させることができる。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載のある油中水液滴化学物質が広範囲の食品や臨床マトリックスに適合することを見出した。また、本発明者らは、驚くべきことに、ある油中水液滴化学物質及びその使用方法により、ＱＩ計数、微生物の同定及び／又は抗菌剤感受性が改善され、その結果、必要な時間を短縮することができることを見出した。さらに、驚くべきことに、ある微生物が増殖する液滴の自己蛍光を検出することにより、当該微生物を検出することができ、これにより検出試薬を追加する必要がなくなる。あるいは、インターカレーティング色素を用いてある微生物を検出することができる。驚くべきことに、ある色素は、微生物の細胞を溶解することなく効果を発揮し、また、細胞増殖を妨げない。
Ａ膜組成物を含有する液滴
本明細書に記載の油中水エマルジョンの液滴の例としては、水相と非水相との界面に「膜」又は殻を含有するものが挙げられるが、これに限定されない。このような膜は、膜形成成分から構成される。膜形成成分は、水相／非水相界面の近く又は界面で膜の形成を促進する任意の物質又はそのような物質の組み合わせである。
ｉ．膜形成タンパク質
膜形成成分は、少なくとも１つの膜形成タンパク質を含んでもよい。膜形成タンパク質を非水相と混合する前に水相に供給して、液滴を形成することができる。あるいは、膜形成成分を比較的疎水性にし、これにより、水相と混合する前に非水相に供給して、液滴を形成することができる。水相と非水相とを混合した後、膜形成タンパク質を膜形成前又は膜形成中に水相／非水相界面に供給することができる。
膜形成タンパク質は、膜形成条件下（例えば、加熱条件下）において膜形成を検出するのに有効な濃度を有していてもよい。有効な濃度の例としては、少なくとも約０．０１、０．０３、０．０３～３、０．０５～２、０．１～１、及び約０．１重量％が挙げられるが、これらに限定されない。当該プロテインは、「非特異的ブロッキング」膜形成タンパク質又は「非特異的結合」膜形成タンパク質であってもよい。本明細書で使用される「非特異的ブロッキング」又は「非特異的結合」という語句は、一般に、表面、すなわち疎水性表面及び／又は親水性表面に、場合によって加熱により非特異的に結合する能力を指す。非特異的ブロッキング／結合タンパク質は、典型的には、水溶性タンパク質であり、（中でも）比較的大きな血清タンパク質又は乳タンパク質であってもよく、かつ／または、水相の他のいずれの成分と非特異的に相互作用しなくてもよい。膜形成タンパク質として使用するのに適した非特異的ブロッキング／結合タンパク質の例としては、アルブミン（例えば、血清アルブミン（中でもウシ（ＢＳＡ）、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又はウマ由来の血清アルブミン））、グロブリン（例えば、β～ラクトグロブリン）、カゼイン、ゼラチン（例えば、ウシの膜ゼラチンＢ型）、及びフラグメント（例えば、タンパク質分解フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
ｉｉ．水性界面活性剤
膜を含有する油中水エマルジョンの液滴は、それが存在する液体の表面張力を低下させることができる界面活性物質である界面活性剤を含む水相で形成することができる。界面活性剤は、洗剤及び／又は湿潤剤であってもよい。諸実施形態では、界面活性剤は、親水性部分及び疎水性部分を含み、これにより、両親媒性となる。水相は、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤、少なくとも１つのイオン性界面活性剤、又は少なくとも１つの非イオン性及び少なくとも１つのイオン性界面活性剤を含んでもよい。界面活性剤の例としては、ポリプロピレンオキシドのブロックコポリマー及びポリエチレンオキシド（例えば、ポロキサマー）が挙げられるが、これらに限定されない。ポロキサマーの例としては、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）及びＴＥＴＲＯＮＴＣ（登録商標）の商品名で販売されているものが挙げられるが、これらに限定されない。諸実施形態では、水相は、界面活性剤ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ～６８を含有する。諸実施形態では、水相は、水溶性界面活性剤及び／又は親水性フルオロ界面活性剤を含有する。諸実施形態では、水相は、ＺＯＮＹＬ（登録商標）ＦＳＮフルオロ界面活性剤等のＺＯＮＹＬ（登録商標）の商品名で販売されているフルオロ界面活性剤を含有する。場合によっては、水相は、界面活性剤ポリソルベート２０を含んでもよい。
非水相と混合して膜を含有する油中水エマルジョンの液滴を形成する前、形成中、又は形成後の水相の特定の界面活性剤又は全界面活性剤の濃度は、膜形成（例えば、加熱）に先立ちエマルジョンの液滴を安定化するために選択することができる。水相の界面活性剤の濃度の例としては、約０．０１～約１０、約０．０５～約５、約０．１～約１、又は０．５％（ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、又はｖ／ｖ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ｉｉｉ．油相
膜を含有する油中水エマルジョンの液滴は、非水相で形成することができ、かつ／または、水相と非水相とを混合することにより形成することができる。非水相は、連続相の水と混和しないキャリア流体とすることができる。あるいは、非水相は、分散相であってもよい。本明細書において、非水相は、少なくとも１種の油を含有する油相を指すが、水と混和しない別の液体（又は液化可能な）化合物又は混合物を含有してもよい。油は、合成してもよいが、天然に存在するものでもよい。油は、炭素系（例えば、アルキル）及び／又はシリコン系（例えば、シロキサン系）のオイルであってもよい。油は、炭化水素及び／又はシリコーン油であってもよい。油は、部分的に又は完全にフッ素化してもよい。油は、一般に、１種以上の有機溶媒と混和してもよく、また、混和しなくてもよい。油の例としては、少なくとも１種のシリコーン油（例えば、ポリジメチルシロキサン）、鉱油、フルオロカーボン油、食物油、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な実施形態において、油は、フッ素化油又はペルフルオロ化油である。フッ素化油は、プライマリ油又はプライマリ油の添加剤とすることができる。フッ素化油の例としては、ＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（登録商標）電子流体（electronic fluid）ＦＣ～３２８３、ＦＣ～４０、ＦＣ～４３、若しくはＦＣ～７０等のＦＬＵＯＲＩＮＥＲＴ（登録商標）の商品名で販売されているもの、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別のフッ素化油又は代替的なフッ素化油の例としては、ＮＯＶＥＣ（登録商標）ＦＩＦＥ７５００エンジニアド流体（engineered fluid）等のＮＯＶＥＣ（登録商標）の商品名で販売されているものが挙げられるが、これに限定されない。
Ｂ．二相界面活性剤の液滴
二相界面活性剤の液滴の方法及び組成物には、フルオロ界面活性剤を含有する油相及び非イオン性フルオロ界面活性剤を含有する水相を採用するものが挙げられるが、これに限定されない。場合によっては、油は、フルオラス油である。場合によっては、フルオロ界面活性剤は、非イオン性である。
ｉ．油相フルオロ界面活性剤
場合によっては、油相のフルオロ界面活性剤（例えば、フルオラス油を含有する油相のフルオロ界面活性剤）は、式Ｉで表されるトリブロックコポリマーである。
Figure 0007007298000001
 式Ｉ
式Ｉは、両端でポリヘキサフルオロプロピレン（ＰＦＰＥ）に共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー含有するトリブロックコポリマーである。一実施形態では、ＰＥＧブロックの両端とＰＦＰＥブロックとの間の共有結合は、アミド結合（Ａ及びＢは窒素である）である。他の実施形態では、ＰＥＧブロックと２つのＰＦＰＥブロックとの間の共有結合は、エステル結合（Ａ及びＢは酸素である）である。他の例では、一端をエステル結合とし、他端をアミド結合とすることができる（Ａは酸素であり、Ｂは窒素；又はＡは窒素であり、Ｂは酸素である）。
ＰＦＰＥ鎖及びＰＥＧブロックの長さは、フルオロ界面活性剤の特性に影響を及ぼすことがある。本開示のいくつかの態様では、ｍ１及びｍ２は、それぞれ、約１０～１００の範囲にある。場合によっては、ｍ１及びｍ２は、それぞれ、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１０～６０、約１０～７０、約１０～８０、約１０～９０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０；約２０～６０、約２０～７０、約２０～８０、約２０～９０、約２０～１００、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３０～７０、約３０～８０、約３０～９０、約３０～１００、約４０～５０、約４０～６０、約４０～７０、約４０～８０、約４０～９０、約４０～１００、約５０～６０、約５０～７０、約５０～８０、約５０～９０、約５０～１００、約６０～７０、約６０～８０、約６０～９０、約６０～１００、約７０～８０、約７０～９０、約７０～１００、約８０～９０、約８０～１００、又は約９０～１００の範囲にある。場合によっては、ｍ１は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１０～６０、約１０～７０、約１０～８０、約１０～９０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０；約２０～６０、約２０～７０、約２０～８０、約２０～９０、約２０～１００、約３０～４０、約３０～５０、３０～６０、約３０～７０、約３０～８０、約３０～９０、約３０～１００、約４０～５０、約４０～６０、約４０～７０、約４０～８０、約４０～９０、約４０～１００、約５０～６０、約５０～７０、約５０～８０、約５０～９０、約５０～１００、約６０～７０、約６０～８０、約６０～９０、約６０～１００、約７０～８０、約７０～９０、約７０～１００、約８０～９０、約８０～１００、又は約９０～１００の範囲にある。場合によっては、ｍ２は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１０～６０、約１０～７０、約１０～８０、約１０～９０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０；約２０～６０、約２０～７０、約２０～８０、約２０～９０、約２０～１００、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３０～７０、約３０～８０、約３０～９０、約３０～１００、約４０～５０、約４０～６０、約４０～７０、約４０～８０、約４０～９０、約４０～１００、約５０～６０、約５０～７０、約５０～８０、約５０～９０、約５０～１００、約６０～７０、約６０～８０、約６０～９０、約６０～１００、約７０～８０、約７０～９０、約７０～１００、約８０～９０、約８０～１００、又は約９０～１００の範囲にある。
式Ｉの「ｎ」の値は、約１０～６０の範囲にあってもよい。場合によっては、「ｎ」の値は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１５～２０、約１５～３０、約１５～４０、約１５～５０、約１５～６０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約２５～３０、約２５～４０、約２５～５０、約２５～６０、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３５～４０、約３５～５０、約３５～６０、約４０～５０、約４０～６０、約４５～５０、約４５～６０、約５０～５０、又は約５５～６０の範囲にある。諸実施形態では、ｍ１及びｍ２は、それぞれ、約３５であり、「ｎ」は約２２である。
場合によっては、油相のフルオロ界面活性剤（例えば、フルオラス油を含有する油相のフルオロ界面活性剤）は、式ＩＩで表されるポリマーである。
Figure 0007007298000002
 式ＩＩ
式ＩＩの界面活性剤は、ＰＥＧ及びＰＦＰＥのジブロックコポリマーである。ＰＦＰＥブロックの長さを示すｍ３の値は、約１０～１００の範囲にある。いくつかの態様では、ｍ３は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１０～６０、約１０～７０、約１０～８０、約１０～９０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０；約２０～６０、約２０～７０、約２０～８０、約２０～９０、約２０～１００、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３０～７０、約３０～８０、約３０～９０、約３０～１００、約４０～５０、約４０～６０、約４０～７０、約４０～８０、約４０～９０、約４０～１００、約５０～６０、約５０～７０、約５０～８０、約５０～９０、約５０～１００、約６０～７０、約６０～８０、約６０～９０、約６０～１００、約７０～８０、約７０～９０、約７０～１００、約８０～９０、約８０～１００、又は約９０～１００の範囲にある。ＰＥＧ単位の長さ「ｎ２」は、約１０～６０の範囲にある。場合によっては、「ｎ２」の値は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１５～２０、約１５～３０、約１５～４０、約１５～５０、約１５～６０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約２５～３０、約２５～４０、約２５～５０、約２５～６０、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３５～４０、約３５～５０、約３５～６０、約４０～５０、約４０～６０、約４５～５０、約４５～６０、約５０～５０、又は約５５～６０の範囲にある。ＰＥＧブロックの末端「～ＯＲ」は、ヒドロキシ基（例えば、～ＯＨ）、アルコキシ基、又はアミン（Ｒは、水素、アルキル基、又はアミン）でもよい。
場合によっては、油相のフルオロ界面活性剤（例えば、フルオラス油を含有する油相のフルオロ界面活性剤）は、式ＩＩＩで表されるポリマーである。
Figure 0007007298000003
 式ＩＩＩ
式ＩＩＩで表される界面活性剤は、２単位のＰＥＧ（同一又は異なる長さ）及び１単位のＰＦＰＥがリン酸リンカー（ＰＯ４）で結合したトリブロックコポリマーである。ＰＦＰＥ鎖の長さｍ４は、約１０～１００の範囲にある。場合によっては、ｍ４は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１０～６０、約１０～７０、約１０～８０、約１０～９０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０；約２０～６０、約２０～７０、約２０～８０、約２０～９０、約２０～１００、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３０～７０、約３０～８０、約３０～９０、約３０～１００、約４０～５０、約４０～６０、約４０～７０、約４０～８０、約４０～９０、約４０～１００、約５０～６０、約５０～７０、約５０～８０、約５０～９０、約５０～１００、約６０～７０、約６０～８０、約６０～９０、約６０～１００、約７０～８０、約７０～９０、約７０～１００、約８０～９０、約８０～１００、又は約９０～１００の範囲にある。２つのＰＥＧ単位の長さｎ３及びｎ４は、それぞれ、約１０～６０の範囲にある。場合によっては、ｎ３及びｎ４は、それぞれ、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１５～２０、約１５～３０、約１５～４０、約１５～５０、約１５～６０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約２５～３０、約２５～４０、約２５～５０、約２５～６０、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３５～４０、約３５～５０、約３５～６０、約４０～５０、約４０～６０、約４５～５０、約４５～６０、約５０～５０、又は約５５～６０の範囲にある。場合によっては、ｎ３は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１５～２０、約１５～３０、約１５～４０、１５～５０、約１５～６０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約２５～３０、約２５～４０、約２５～５０、約２５～６０、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３５～４０、約３５～５０、約３５～６０、約４０～５０、約４０～６０、約４５～５０、約４５～６０、約５０～５０、又は約５５～６０の範囲にある。場合によっては、ｎ４は、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１５～２０、約１５～３０、約１５～４０、約１５～５０、約１５～６０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約２５～３０、約２５～４０、約２５～５０、約２５～６０、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３５～４０、約３５～５０、約３５～６０、約４０～５０、約４０～６０、約４５～５０、約４５～６０、約５０～５０、又は約５５～６０の範囲にある。ＣＦＬスペーサー（ｎ５）は、０、１、２、又は３炭素長とすることができる。
場合によっては、フルオロ界面活性剤は、式Ｉ、式ＩＩ、及び／又は式ＩＩＩの混合物を含有する。場合によっては、フルオロ界面活性剤は、式Ｉ及び式ＩＩの混合物、式Ｉ及び式ＩＩＩの混合物、又は式ＩＩ及び式ＩＩＩの混合物を含有する。いくつかの例では、フルオロ界面活性剤は、式Ｉ及び式ＩＩの混合物を少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、又は約９９．９％（ｗ／ｗ）含んでもよい。例えば、フルオロ界面活性剤は、式Ｉ及び式ＩＩの混合物を少なくとも約８０％、約９０％、又は９５％（ｗ／ｗ）含んでもよい。
また、式Ｉ及び式ＩＩの混合物の割合は、約１：１９９、約１：９９、約２：９８、約３：９７、約４：９６、約５：９５、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、約２５：７５、約３０：７０、約３５：６５、約４０：６０、約４５：５５、約５０：５０、約５５：４５、約６０：４０、約６５：３５、約７０：３０、約７５：２５、約８０：２０、約８５：１５、約９０：１０、約９５：５、約９６：４、約９７：３、約９８：２、約９９：１、又は約１９９：１（ｗ／ｗ）より大きくてもよい。例えば、式Ｉ及び式ＩＩの混合物の割合は、約８０：２０、約９０：１０、又は約９５：５（ｗ／ｗ）より大きくてもよい。
ある例においては、混合物は、さらに、式ＸＩで表される混合物を含有してもよい。
Figure 0007007298000004
 式ＸＩ
式中、ｎは、約１０～１００、約１０～８０、約１５～８０、約１５～５０、又は約２０～５０とすることができる。
例えば、フルオロ界面活性剤混合物は、式ＸＩで表される化合物を約０．１～５０％、約０．１～２０％、約０．２～２０％、約０．２～１０％、約０．５～１０％、約０．５～５％、又は約１～５％（ｗ／ｗ）含有してもよい。
また、フルオロ界面活性剤の混合物は、式ＸＩで表される化合物を約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％（ｗ／ｗ）より多く含有してもよい。例えば、フルオロ界面活性剤の混合物は、式ＸＩで表される化合物を約０．１～約０．５％、約１％以上、約２％以上、又は約５％（ｗ／ｗ）含有してもよい。
あるいは、フルオロ界面活性剤の混合物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％（ｗ／ｗ）未満の式ＸＩで表される混合物を含有してもよい。例えば、フルオロ界面活性剤の混合物は、約１％、約２％、約５％、約１０％、又は約２０％（ｗ／ｗ）未満の式ＸＩで表される化合物を含有していてもよい。
場合によっては、油製剤は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％＞、約４．５％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％（ｗ／ｗ）未満の式ＸＩで表される化合物を含有していてもよい。例えば、油製剤は、約１％、約２％、約５％、約１０％、又は約２０％（ｗ／ｗ）未満の式ＸＩで表される化合物を含有してもよい。
他の場合では、油製剤は、式ＸＩで表される化合物を約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％（ｗ／ｗ）より多く含有してもよい。例えば、油製剤は、式ＸＩで表される化合物を約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、又は約５％（ｗ／ｗ）より多く含有してもよい。
界面活性剤は、化合物の総分子量（ＭＷ）に対する化合物の親水性部分のＭＷの比として定義することができる親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）値によって特徴付けることができる。ＨＬＢは、分子の疎水性部分（ＰＦＰＥ）及び親水性部分（ＰＥＧ）の長さ／ＭＷを変えることによって制御することができる。諸実施形態では、より長い（ＭＷが大きい）ペルフルオロポリエーテル鎖を有する油相フルオロ界面活性剤を含む液滴は、熱によって誘発される液滴合体に対する抵抗性が高くなる。
諸実施形態では、ペルフルオロポリエーテル鎖のＭＷは、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、又は少なくとも約１００００である。他の諸実施形態では、ペルフルオロポリエーテル鎖のＭＷは、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、又は約１００００である。
本開示のいくつかの態様では、フルオロ界面活性剤のＨＬＢ値は、約０～２０の範囲にある。場合によっては、非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値は、約０～１０、約０～２０、約５～１０、約５～１５、約５～２０、又は約１０～２０の範囲にある。さらに別のいくつかの態様では、フルオロ界面活性剤のＨＬＢ値は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０である。
一般に、本開示において取得されるフルオロ界面活性剤は、高純度のフルオロ界面活性剤であり、検出試薬の浸出及び／又は検出可能若しくは実質的な微生物増殖の阻害を回避しながら、微生物数アッセイ及び／又は微生物増殖アッセイに首尾よく用いることができる。微生物増殖の阻害は、液滴の水相で使用される培地及び温度と同じ組成物及び温度のバルク培地における標的微生物の倍加時間を比較することによって検出することができる。一般に、適切な増殖レベルは、バルク倍加時間の少なくとも約１０％以内である。
場合によっては、フルオロ界面活性剤の純度は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約８５．５％、約８６％、約８６．５％、約８７％、約８７．５％、約８８％、約８８．５％、約８９％、約８９．５％、約９０％、約９０．５％、約９１．５％、約９２％、約９２．５％、約９３％、約９３．５％、約９４％、約９４．５％、約９５％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、又は約９９．５重量％（ｗ／ｗ）よりも高くてもよい。いくつかの例では、フルオロ界面活性剤の純度は、約９０重量％（ｗ／ｗ）より大きい。例えば、フルオロ界面活性剤は、式Ｉ及び式ＩＩの混合物を少なくとも９０％（ｗ／ｗ）含んでもよい。場合によっては、フルオロ界面活性剤の重量％純度は、約９０％～９１％ｗ／ｗ、約９０％～９２％ｗ／ｗ、約９０％～９３％ｗ／ｗ、約９０％～９４％ｗ／ｗ、約９０％～９５％ｗ／ｗ、約９０％～９６％ｗ／ｗ、約９０％～９７％ｗ／ｗ、約９０％～９８％ｗ／ｗ、約９０％～９９％ｗ／ｗ、約９１％～９２％ｗ／ｗ、約９１％～９３％ｗ／ｗ、約９１％～９４％ｗ／ｗ、約９１％～９５％ｗ／ｗ、約９１％～９６％ｗ／ｗ、約９１％～９７％ｗ／ｗ、約９１％～９８％ｗ／ｗ、９１％～９９％ｗ／ｗ、約９２％～９３％ｗ／ｗ、約９２％～９４％ｗ／ｗ、約９２％～９５％ｗ／ｗ、約９２％～９６％ｗ／ｗ、約９２％～９７％ｗ／ｗ、約９２％～９８％ｗ／ｗ、約９２％～９９％ｗ／ｗ、約９３％～９４％ｗ／ｗ、約９３％～９５％ｗ／ｗ、約９３％～９６％ｗ／ｗ、約９３％～９７％ｗ／ｗ、約９３％～９８％ｗ／ｗ、約９３％～９９％ｗ／ｗ、約９４％～９５％ｗ／ｗ、約９４％～９６％ｗ／ｗ、約９４％～９７％ｗ／ｗ、約９４％～９８％ｗ／ｗ、又は約９４％～９９％ｗ／ｗの範囲にある。
場合によっては、フルオロ界面活性剤の純度は、約９５％（重量％）である。例えば、フルオロ界面活性剤は、式Ｉ及び式ＩＩの混合物を少なくとも９５％（ｗ／ｗ）含んでもよい。場合によっては、フルオロ界面活性剤の重量％純度は、約９５％～９６％ｗ／ｗ、約９５％～９７％ｗ／ｗ、約９５％～９８％ｗ／ｗ、約９５％～９９％ｗ／ｗ、約９６％～９７％ｗ／ｗ、約９６％～９８％ｗ／ｗ、約９６％～９９％ｗ／ｗ、約９７％～９８％ｗ／ｗ、約９７％～９９％ｗ／ｗ、又は約９８％～９９％ｗ／ｗの範囲にある。場合によっては、フルオロ界面活性剤の重量％純度は、約９０％ｗ／ｗ、約９１％ｗ／ｗ、約９２％ｗ／ｗ、約９３％ｗ／ｗ、約９４％ｗ／ｗ、約９５％ｗ／ｗ、約９６％ｗ／ｗ、約９７％ｗ／ｗ、約９８％ｗ／ｗ、又は約９９％ｗ／ｗである。
フルオロ界面活性剤の濃度は、液滴の安定性に影響することがある。場合によっては、フルオロ界面活性剤の濃度は、０．１～１０．０ｍＭの範囲にあってもよい。諸実施形態では、フルオロ界面活性剤の濃度は、約０．１ｍＭ～１．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～２．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～３．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～４．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～５．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～６．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～７．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～８．０ｍＭ、約０．１ｍＭ～９．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～１．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～２．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～３．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～４．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～５．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～６．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約０．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～３．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～４．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～５．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～６．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～７．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約１．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～２．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～３．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～４．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～５．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～６．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約１．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～３．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～４．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～５．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～６．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～７．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約２．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～３．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～４．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～５．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～６．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～８．０ｍＭ．約２．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約２．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～４．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～５．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～６．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～７．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約３．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～４．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～５．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～６．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約３．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～５．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～６．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～７．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約４．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～５．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～６．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約４．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～６．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～７．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約５．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～６．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約５．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～７．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約６．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～７．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約６．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約６．５ ｎｉＭ～１０．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～８．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約７．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約７．５ｍＭ～８．０ｍＭ、約７．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約７．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約８．０ｍＭ～９．０ｍＭ、約８．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、約８．５ｍＭ～９．０ｍＭ、約８．５ｍＭ～１０．０ｍＭ、約９．０ｍＭ～１０．０ｍＭ、又は約９．５ｍＭ～１０．０ｍＭの範囲にある。諸実施形態では、フルオロ界面活性剤の濃度は、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３．０ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４．０ｍＭ、約４．５ｍＭ、約、５．０ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６．０ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７．０ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８．０ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９．０ｍＭ、又は約９．５ｍＭである。
ｉｉ．油相
二相油中水液滴に使用される油相又は連続相は、水と混和しない液体化合物、又は液体化合物の混合物であってもよい。使用される油は、少なくともシリコーン油、鉱物油、炭化水素油、フルオロカーボン油、植物油、又はそれらの組み合わせのうち少なくとも１つであり、又は少なくとも１つを含んでもよいが、これらに限定されない。油相中には、例えば、少なくとも１種類の界面活性剤、試薬、他の添加剤、防腐剤、粒子、又はそれらの組み合わせ等の他の任意の適切な成分が含まれていてもよい。
場合によっては、油は、フッ素化油である。フッ素化油は、任意のフッ素化有機化合物であってもよい。場合によっては、フッ素化油は、ペルフルオロオクタンやペルフルオロヘキサン等のペルフルオロカーボンである。場合によっては、当該フッ素含有化合物は、１，１，１－トリフルオロオクタンや１，１，１，２，２－ペンタフルオロデカン等の部分的にフッ素化された炭化水素である。当該フッ素化有機物は、線状、環状、又は複素環式のものであってもよい。当該フッ素化有機化合物は、炭素及びフッ素に加えて、水素、酸素、窒素、硫黄、塩素、臭素の各原子、又はそれらの組み合わせをさらに含有してもよい。
場合によっては、フッ素化油は、ＮＯＶＥＣ（登録商標）ＨＦＥ－７１００エンジニアド流体（Engineered Fluid）として販売されているメチルノナフルオロイソブチルエーテルのようなペルフルオロアルキルエーテルである。場合によっては、当該フッ素含有化合物は、ＮＯＶＥＣ（登録商標）ＨＦＥ－７２００（Engineered Fluid）として販売されているエトキシノナフルオロブタン又はエトキシノナフルオロブタン混合物である。場合によっては、当該フッ素含油化合物は、ＮＯＶＥＣ（登録商標）ＨＦＥ－７５００エンジニアド流体（Engineered Fluid）として販売されている３－エトキシ１，１，１，２，３，４，４，５ ，５，６，６，６－ドデカフルオロ－２－トリフルオロメチル－ヘキサンである。場合によっては、当該フッ素含有化合物は、ＮＯＶＥＣ（登録商標）ＨＦＥ－７３００エンジニアド流体（Engineered Fluid）として販売されている１，１，１，２，２，３，４，５，５，５－デカフルオロ－３－メトキシ－４－トリフルオロメチル－ペンタンであってもよい。
諸実施形態では、フルオロ界面活性剤は、主として油相に存在する。場合によっては、 少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のフルオロ界面活性剤が、油相に存在する。
ｉｉｉ．水相
水相は、室温で水と混合されると安定な単相水溶液を形成する液体成分又は液化可能な成分を含有してもよい。諸実施形態では、水相は、微生物増殖及び／又は計数に適合する濃度の生理学的に許容される１種又は複数種の試薬及び／又は溶媒等を含んでもよい。水相成分の非限定的な例としては、水、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、メタノール、及びエタノールが挙げられる。水相は、下記のような緩衝剤を含有してもよい。諸実施形態では、水相は、ビーズ等の粒子を含んでもよい。水相は、試薬の放出を遅延させる媒体を含有してもよい。
ｉｖ．非イオン性非フルオロ界面活性剤
二相油中水液滴の水相は、非イオン性非フルオロ界面活性剤を含有してもよい。諸実施形態では、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、ポリアルキレンオキシドブロックコポリマー界面活性剤である。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、一般式［ＰＰＧｎ－ＰＥＧｍ］で表される、ポリプロピレングリコール（Ｈ－（Ｏ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ、ＰＰＧ）とポリエチレングリコール（Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨ、ＰＥＧ）とのブロックコポリマーである。
非イオン性非フルオロ界面活性剤は、ＰＥＧとＰＰＧとのジ、トリ、テトラ、ペンタ、又はそれ以上のブロックポリマーであってもよい。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、規則的に交互に並ぶ一般式（ＰＥＧ－ＰＰＧ）Ｘ（式中ｘは、約１０～１００の範囲にある）で表されるＰＥＧ及びＰＰＧ単位を有する交互共重合体である。場合によっては、ｘは、約１０～２０、約１０～３０、約１０～４０、約１０～５０、約１０～６０、約１０～７０、約１０～８０、約１０～９０、約２０～３０、約２０～４０、約２０～５０、約２０～６０、約２０～７０、約２０～８０、約２０～９０、約２０～１００、約３０～４０、約３０～５０、約３０～６０、約３０～７０、約３０～８０、約３０～９０、約３０～１００、約４０～５０、約４０～６０、約４０～７０、約４０～８０、約４０～９０、約４０～１００、約５０～６０、約５０～７０、約５０～８０、約５０～９０、約５０～１００、約６０～７０、約６０～８０、約６０～９０、約６０～１００、約７０～８０、約７０～ ９０、約７０～１００、約８０～９０、約８０～１００、又は約９０～１００の範囲にある。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、モノマーのＰＥＧ及びＰＰＧブロックがランダムな順序で結合したＰＥＧとＰＰＧとのランダムコポリマーである。
場合によっては、ＰＥＧとＰＰＧとのブロックコポリマーの分子量は、約４，０００ダルトン（「Ｄａ」）～２５，０００Ｄａの範囲にある。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤の分子量は、約１０，０００Ｄａ～２５，０００Ｄａ；約１５，０００Ｄａ～２５，０００Ｄａ；約２０，０００Ｄａ～２５，０００Ｄａ；約４，０００Ｄａ～２０，０００Ｄａ；約１０，０００Ｄａ～２００００Ｄａ；約１５，０００Ｄａ～２０，０００Ｄａ；約４，０００Ｄａ～１５，０００Ｄａ；約１０，０００Ｄａ～１５，０００Ｄａ；又は約４，０００Ｄａ～１０，０００Ｄａの範囲にある。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤の分子量は、約４，０００Ｄａ；約４，５００Ｄａ；約５，０００Ｄａ；約５，５００Ｄａ；約６，０００Ｄａ；約６，５００Ｄａ；約７，０００Ｄａ；約７，５００Ｄａ；約８，０００Ｄａ；約８，５００Ｄａ；約９，０００Ｄａ；約９，５００Ｄａ；約１０，０００Ｄａ；約１０，５００Ｄａ；約１１，０００Ｄａ；約１１，５００Ｄａ；約１２，０００Ｄａ；約１２，５００Ｄａ；約１３，０００Ｄａ；約１３，５００Ｄａ；約１４，０００Ｄａ；約１４，５００Ｄａ；約１５，０００Ｄａ；約１５，５００Ｄａ；約１６，０００Ｄａ；約１６，５００Ｄａ；約１７，０００Ｄａ；約１７，５００Ｄａ；約１８，０００Ｄａ；約１８，５００Ｄａ；約１９，０００Ｄａ；約１９，５００Ｄａ；約２０，０００Ｄａ；約２０，５００Ｄａ；約２１，０００Ｄａ；約２１，５００Ｄａ；約２２，０００Ｄａ；約２２，５００Ｄａ；約２３，０００Ｄａ；約２３，５００Ｄａ；約２４，０００Ｄａ；約２４，５００Ｄａ；又は約２５，０００Ｄａである。
場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、ポロキサマーとして知られるポリプロピレンオキシドとポリエチレンオキシドのトリブロックコポリマーである。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）又はＴＥＴＲＯＮＩＣ（登録商標）の商品名で販売されているポロキサマーである。諸実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－３８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－７７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－８７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－９８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１０８、又はＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－１２７（ａ＝１０１、ｂ＝５６）である。
諸実施形態では、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０である。Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）の一般的な構造には、式ＶＩＩで表される親水性ポリエチレン鎖及び芳香族炭化水素親油基が含まれる。
Figure 0007007298000005
 式ＶＩＩ
場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、ポリエチレングリコール誘導体であってもよい。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、式ＶＩＩＩで表されるポリエチレングリコール誘導体である。
Figure 0007007298000006
 式ＶＩＩＩ
式ＶＩＩＩで表される非イオン性非フルオロポリエチレングリコール誘導体の界面活性剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）界面活性剤が挙げられるが、これに限定されない。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）界面活性剤の例としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１５ （ｘ＝１．５平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－３５（ｘ＝３平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４５（ｘ＝４，５平均）、Ｔｎｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（ｘ＝９．５平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１０２（ｘ＝１２平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１１４（ｘ＝７．５平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１６５（Ｘ＝１６平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－３０５（ｘ＝３０平均）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－４０５（Ｘ＝３５平均）、又はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－７０５（Ｘ＝１．５平均）が挙げられるが、これに限定されない。
諸実施形態では、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、式ＩＸで表されるソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体である。
Figure 0007007298000007
 式ＩＸ
式ＩＸで表されるソルビタンモノラウレートのポリオキシエチレン誘導体の例としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）の商品名で市販されているものが挙げられるが、これに限定されない。場合によっては、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｒ＝ＣＨ２（ＣＨ２）９（ＣＨ３））、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０（Ｒ＝ＣＨ２（ＣＨ２）１３（ＣＨ３））、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（Ｒ＝ＣＨ２（ＣＨ２）１５（ＣＨ３））、又はＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（Ｒ＝（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）８）である。
非イオン性非フルオロ界面活性剤の濃度は、約０．１～５．０重量％の範囲にあってもよい。諸実施形態では、非イオン性非フルオロ界面活性剤の濃度は、約１．５重量％（「ｗ／ｗ」）未満である。場合によっては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の濃度は、約１．４％ｗ／ｗ、約１．３％ｗ／ｗ、約１．２％ｗ／ｗ、約１．１％ｗ／ｗ、約１．０％ｗ／ｗ、約０．９％ｗ／ｗ、約０．８％ｗ／ｗ、約０．７％ｗ／ｗ、約０．６％ｗ／ｗ、約０．５％ｗ／ｗ、約０．４％ｗ／ｗ、約０．３％ｗ／ｗ、約０．２％ｗ／ｗ、又は約０．１％ｗ／ｗ未満である。諸実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－９８の濃度は、約０．５０％ｗ／ｗ～１．５％ｗ／ｗの範囲にある。諸実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－９８の濃度は、約０．５０％ｗ／ｗ～０．６０％ｗ／ｗ、約０．５０％ｗ／ｗ～０．６５％ｗ／ｗ、約０．５０％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．６０％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．６５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗ、約０．６０％ｗ／ｗ～０．６５％ｗ／ｗ、約０．６０％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．６０％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗ、又は約０．７０％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗの範囲にある。さらに別の実施形態においては、非イオン性非フルオロ界面活性剤の濃度は、微生物計数又は微生物増殖アッセイを素倍することなく、液滴の安定性及び液滴サイズを最適化するように調整することができる。
諸実施形態では、フルオロ界面活性剤の濃度は、約１．０～６．０ｍＭであり、非イオン性非フルオロ界面活性剤の濃度は、約０．ｌ％～３．０重量％である。別の実施形態では、フルオロ界面活性剤は式Ｉの構造を有し、約２．５ｍＭの濃度を有し、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ-９８であり、約０．５％ｗ／ｗ～１．５％ｗ／ｗの濃度を有する。場合によっては、フルオロ界面活性剤は、式Ｉの構造を有し、約２．５ｍＭの濃度有し、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ-９８であり、約０．５０％ｗ／ｗ～０．６０％ｗ／ｗ、約０．５０％ｗ／ｗ～０．６５％ｗ／ｗ、約０．５０％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．６０％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．６５％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．５５％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗ、約０．６０％ｗ／ｗ～０．６５％ｗ／ｗ、約０．６０％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．６０％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ～０．７０％ｗ／ｗ、約０．６５％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗ、又は約０．７０％ｗ／ｗ～０．７５％ｗ／ｗの濃度を有する。
諸実施形態では、非イオン性非フルオロ界面活性剤は、本質的に、水相に存在する。場合によっては、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％＞、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の非イオン性非フルオロ界面活性剤は、油中水エマルジョンの液滴の水相に存在する。
Ｃ．液滴塩及び緩衝剤
本明細書に記載の油中水液滴（例えば、膜を含有する液滴及び／又は二相液滴）の水相は、様々な塩、緩衝剤、微生物増殖培地成分、検出試薬（例えば、染料、プローブ、又は蛍光基質若しくは発色基質）、微生物、食品マトリックス、及び／又は微生物増殖及び／又は微生物数を決定するのに必要な追加成分を含んでもよい。そのような追加成分は、すべて、対象とするアッセイと適合するように選択することができる。
適切な緩衝液又は緩衝剤が水相に存在してもよい。緩衝液又は緩衝剤は、微生物増殖及び／又は微生物検出が最適となるｐＨ又はその付近のｐＨ等の任意の適切なｐＨ又はその付近のｐＨに水相のｐＨを維持するように構成される。例えば、ｐＨは、蛍光基質又は発色基質によって検出できる酵素活性に最適なｐＨ又はその付近のｐＨとなるように選択してもい。他の例として、ｐＨは、標的微生物の増殖に最適なｐＨ又はその付近のｐＨとなるように選択してもよい。さらに別の例として、ｐＨ、緩衝剤、及び／又は緩衝剤の濃度は、微生物増殖によって引き起こされ、ｐＨ感受性蛍光色素によって検出可能なｐＨの低下をもたらすように選択してもよい。同様に、水相に存在してもよい適切な塩の例としては、微生物増殖及び／又は微生物検出に適合する塩が挙げられるが、これに限定されない。塩の例としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳ０４、及びリン酸塩のいずれか一つ又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
場合によっては、カリウム塩（例えば、ＫＣｌ）及び／又はナトリウム塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、若しくは約２００ｍＭ、又はそれ以上若しくはそれ以下であってもよい。場合によっては、マグネシウム塩（例えば、ＭｇＣｌ２）の濃度は、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭ、約３．０ｍＭ、約４．０ｍＭ、若しくは約５．０ｍＭ、又はそれ以上若しくはそれ以下である。場合によっては、緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭ、１６０ｍＭ、若しくは２００ｍＭ、又はそれ以上若しくはそれ以下である。
場合によっては、ｐＨは、例えば、約５～９、５～６．５、６．５～８．５、７～８、又は中でも約７．５等の生理的ｐＨに近似することができる。維持する所望のｐＨに比較的近いｐＫａを有し、これから生じる反応に適合する特定の緩衝剤を選択してもよい。この緩衝剤は、生理学的に適合する。適合し得る緩衝剤の例としては、トリス（２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール）、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸）、及びＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸）等が挙げられるが、これに限定されない。場合によっては、緩衝剤は、モノ－、ジ－、及び／又はトリ－塩基性リン酸ナトリウム又はモノ－、ジ－、及び／又はトリ－リン酸カリウム緩衝液等のリン酸緩衝液、又はそれらの組み合わせであり、又はそれを含む。場合によっては、緩衝剤は、最少培地、複合培地、定義された及び／又は未定義の微生物培地の１つ以上の成分によって、もともと与えられている。例えば、トリプトン、種々のペプトン、フィトン、アミノ酸混合物、生理学的ナトリウム塩、カリウム塩、又はがマグネシウム塩等の成分は、本発明の方法及び組成物に十分な緩衝能をもたらすことができる。あるいは、場合によっては、最少培地、複合培地、定義された及び／又は未定義の微生物培地は、緩衝能をもたらすことができるが、前述の１つ以上の緩衝剤等の追加の緩衝剤が、油中水液滴の水相に含まれる。
Ｆ．液滴増殖培地
油中水液滴の水相の成分として、多様な増殖培地を選択することができる。本明細書で使用する培地（増殖培地又は培養培地とも呼ぶ）という用語は、定義された成分又は未定義の成分を含む微生物学的培養に使用される任意の培地を含む。典型的には、計数又は抗菌剤感受性をアッセイされる１以上の標的微生物の増殖に適した、適合した、又は最適な増殖培地が選択される。一般に、増殖培地は、窒素源、炭素源、及び様々な必須元素を含む。
窒素源は、タンパク質、又はタンパク質の混合物であってもよく、又はそれを含んでもよい。例えば、窒素源は、牛肉抽出物又は酵母抽出物であってもよい。窒素源は、ペプトン、トリプトン、若しくはカザミノ酸等の部分的に又は完全に加水分解されたタンパク質、又はタンパク質の混合物であってもよく、又はそれを含んでもよい。窒素源は、アミノ酸、又はアミノ酸の混合物であってもよく、又はそれを含んでもよい。場合によっては、窒素源は、硫酸アルミニウム等の窒素（例えば、硝酸）塩である。
炭素源は、グルコース、ガラクトース、アラビノース、コハク酸塩、グリセロール、ピルビン酸塩、グルタミン酸塩、キシロース、又はそれらの組み合わせであってもよく、又はそれを含んでもよい。場合によっては、１以上の未定義の窒素源（例えば、牛肉抽出物、酵母エキス、トリプトン、又はペプトン）を含有する複合培地において、炭素源は、未定義の窒素源の固有成分である。必須元素の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、窒素、リン、及び硫黄が挙げられるが、これに限定されない。
油中水エマルジョンの液滴の水相に使用するための増殖培地の例としては、トリプトン大豆ブロス（ＴＳＢ）、緩衝ペプトン水（例えば、ＢＡＭ培地Ｍ１９２）、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。場合によっては、油中水エマルジョンの液滴の水相の成分として、選択培地が用いられる。このような選択培地の例としては、発色培地、ベアードパーカー（ＢａｉｒｄＰａｒｋｅｒ）、ブロムクレゾールパープル（「ＢＣＰ」）寒天、胆汁エスクリン寒天（「ＢＥＡ」）寒天、ブライアント・バーキー（Ｂｒｙａｎｔ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅｙ’ｓ）培地、緩衝ペプトン水、チャップマン培地、チョコレート寒天、シスチンラクトース電解質欠乏（「ＣＬＥＤ」）寒天、コレット（ｃｏｌｅｔｓｏｓ）、コロンビア寒天、ドリガルスキー（Ｄｒｉｇａｌｓｋｉ）寒天、フレイザー（Ｆｒａｓｅｒ）、グラナダ（Ｇｒａｎａｄａ）、ＧＶＰＣ寒天、ヘクトン（Ｈｅｋｔｏｅｎ）寒天、キングＡ＆Ｂ、ローエンシュタイン・ジェンセン（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ－Ｊｅｎｓｅｎ）、ＬＴ１００、マックコンキー寒天、ＭＲＳブロス又は寒天、ミューラーヒントン（ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ）ブロス又は寒天、ミューラー・カウフマン（Ｍｕｌｌｅｒ－Ｋａｕｆｆｒｎａｎｎ）、リステリア同定寒天培地（「ＰＡＬＣＡＭ」）、ＰＣＢ、ＲＰＭＩ、ＲＶＳ、サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）、シェドラー（Ｓｃｈａｅｄｌｅｒ）ブロス又は寒天、亜セレン酸ブロス、スラネッツ・バートレイ（Slanetz and Bartley's）培地、ＳＰＳ寒天、ＴＧＹ、ＴＳＢ、ＴＳＩ、ＴＴＣタージトール、ＶＲＢＧ、ＸＬＤ等が挙げられるが、これに限定されない。
Ｇ．液滴の抗菌剤
いくつかの態様では、油中水エマルジョンの液滴の水相は、抗菌剤を含有してもよい。抗菌剤は、交絡因子としての微生物の存在によりアッセイに混乱を生じさせないようにするために含めることができる。例えば、標的微生物が細菌である場合においてＱＩ計数が望まれるときは、非標的生物である真菌の増殖を避けるために、水相に抗真菌剤を含めることができる。他の例として、標的微生物が真菌又はカビである場合においてＱＩ計数が望まれるときは、水相に抗菌剤を含めることができる。あるいは、標的微生物の抗菌剤感受性又は標的微生物の種類を評価するために抗菌剤を含めることができる。例えば、抗菌剤に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、水相中で少なくとも２つ（例えば、３～１０）の異なる濃度の試験抗菌剤を用いて標的微生物の増殖をアッセイすることによって決定することができる。液滴における抗菌剤濃度の勾配を利用する場合等、さらに多くの異なる濃度があってもよい。濃度の勾配は、線形又は非線形であってもよい。他の例では、１つの濃度を使用して、微生物が試験抗菌剤に感受性を有するか否かを決定する。当該選択された１つの濃度は、感受性を有する生物を、感受性を有しない生物から区別するブレークポイント濃度である。
油中水エマルジョンの液滴の水相には、多様な抗菌剤を採用することができる。一般に、抗菌剤は、液滴の存在を妨害しないように選択される。例えば、本質的に水相に存在し、非水相には実質的に分離しない抗菌剤を選択することができる。あるいは、抗菌剤のＭＩＣを決定する前に、抗菌剤の油相への部分的な分離を考慮することができる。さらに別の選択肢として、抗菌剤が油相及び水相の両相に実質的な溶解性を示す場合、その両相に抗菌剤を含めることができる。さらに別の選択肢として、液滴化学物質を調整して、このような抗菌剤の非水相への分離を最小に抑えることができる。例えば、膜系を有する液滴は、二相系で置換することができ、その逆であってもよい。あるいは、ＨＬＢを増加又は減少させた界面活性剤（例えば、非イオン性非フルオロ界面活性剤、又はフルオロ界面活性剤）を利用することができる。
抗菌剤の例としては、β－ラクタム抗菌剤、セファマイシン抗菌剤、セファロスポリン抗菌剤、キノロン抗菌剤、フルオロキノロン抗菌剤、ナフチリジン抗菌剤、ポリケチド抗菌剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤、ポリミキシン抗菌剤、ニトロフラン抗菌剤、アンフェニコール系の抗菌剤、アミノグリコシド抗菌剤、糖ペプチド抗菌剤、ポリエン抗真菌剤、イミダゾール又はトリアゾール系の真菌ラノステロール１４α－デメチラーゼ阻害剤等のイミダゾール又はトリアゾール抗真菌剤、チアゾール抗真菌剤、アリルアミン抗真菌剤、エキノカンジン抗真菌剤、５－フルオロシトシン抗真菌剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。場合によっては、抗菌剤は、セフォキシチン、ピペラシリン、ナリジクス酸、テトラサイクリン、バンコマイシン、トリメトプリム、ニトロフラントイン、コリスチン、ニトロフラン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、又はそれらの組み合わせである。
Ｈ．液滴の抗真菌剤
いくつかの態様では、油中水エマルジョンの液滴の油相は、１以上の抗真菌剤を含有してもよい。抗真菌剤は、水相の外側で微生物が増殖するのを防止するため、又は水相の周囲に「フェンス」を作るために含めることができる。抗真菌剤は、水相の外側でカビが増殖するのを防止するために油相に含めることができる。抗真菌剤の例としては、２，６－ジクロロ－４－ニトロアニリン（又はジクロラン）、４，５，６，７－テトラクロロ－２’，４’，５’，７’－テトラヨードフルオレセイン（又はローズベンガル）、（ＲＳ）－１－［２－（アリルオキシ）－２－（２，４－ジクロロフェニル）エチル］－１Ｈ－イミダゾール（又はエニルコナゾール、クロラミゾール）、及び／又はキトサンが挙げられるが、これに限定されない。
ある実施形態では、油相は、約５ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌ～約１００ｍｇ／Ｌ、又は約２０ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌの濃度のジクロランを含む。諸実施形態では、油相は、約５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ、約３０ｍｇ／Ｌ、約４０ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約６０ｍｇ／Ｌ、約７０ｍｇ／Ｌ、約８０ｍｇ／Ｌ、約９０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１２５ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１７５ｍｇ／Ｌ、又は約２００ｍｇ／Ｌの濃度のジクロランを含む。
ある実施形態では、油相は、約５０ｍｇ／Ｌ～約３７５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌ、又は約５０ｍｇ／Ｌ～約１５０ｍｇ／Ｌの濃度のローズベンガルを含む。諸実施形態では、油相は、約５０ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１２５ｍｇ／Ｌ、約１５０ｍｇ／Ｌ、約１７５ｍｇ／Ｌ、約２００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約３００ｍｇ／Ｌ、約３５０ｍｇ／Ｌ、又は約３７５ｍｇ／Ｌの濃度のローズベンガルを含む。
諸実施形態では、油相は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．０ｇ／Ｌ、約０．５～約１．０ｇ／Ｌ、又は約０．５ｍｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの濃度のエニルコナゾールを含む。諸実施形態では、油相は、約０．１ｍｇ／Ｌ、０．２５ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．７５ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約１．０ｇ／Ｌ、又は約２．５ｇ／Ｌの濃度のエニルコナゾールを含む。
諸実施形態では、油相はキトサンを含み、当該キトサンの濃度は約０．３％以下である。
Ｉ．液滴のゲル化剤
いくつかの態様では、油中水エマルジョンの液滴の水相又は油相は、１つ又は複数のゲル化剤を含む。標的微生物が酵母である諸実施形態では、液滴サイズが変化するのを防止するために（例えば、液滴サイズが減少するのを防止するために）、ゲル化剤を水相に含めることができる。一実施形態では、水相は、カルシウムイオンの添加によってゲル化することができるアルギン酸等のヒドロゲルを含む。ゲル化プロセスでは、アルギン酸塩及び炭酸カルシウムが液滴の水相に含まれ、酢酸が液滴の油相に含まれる。ゲル化プロセスにおいて、酢酸からのＨ＋イオンは、液滴の油相から水相に拡散し、水相のｐＨを減少させ、以下の式に従って炭酸カルシウムからカルシウムイオンを解離させる。
ＣａＣＯ３＋２Ｈ＋－－＞ＣａＨＣＯ３＋Ｈ＋－－＞Ｃａ２＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２
諸実施形態では、水相におけるアルギン酸塩の濃度は、約３．５ｇ／ｌ以下である。ある実施形態では、水相におけるアルギン酸塩の濃度は、約１、２、２，５、３、又は３．５ｇ／ｌである。諸実施形態では、水相におけるカルシウムイオンの濃度は、約１ｇ／ｌである。諸実施形態では、水相におけるカルシウムイオンの濃度は、約０．２５、０．５、０．７５、ｏｒ１ｇ／ｌである。
ゲル化剤として使用することができる他のポリマー材料の例としては、カッパ－カラギーナン、イオタ－カラギーナン、フルセララン、ゼイン、スクシニル化ゼイン、スクシニル化セルロース、及び／又はエチルスクシニル化セルロースが挙げられるが、これに限定されない。ゲル化剤として使用することができる合成水溶性ポリマー材料の例としては、ビニルピロリドン、２－メチル－５－ビニルピリジン－メチルアクリレート－メタクリル酸コポリマー、ビニルアルコール、ビニルピリジン、又はビニルピリジン－スチレンコポリマーから合成したものが挙げられるが、これに限定されない。
Ｊ、液滴検出試薬
油中水エマルジョンの液滴は、１つ又は複数の試薬を含有してもよい。検出試薬は、遺伝子型特異的核酸検出試薬、タンパク質（例えば、抗体、レクチン、又はフィブリノゲン）、又は他の分子であってもよい。遺伝子型特異的核酸検出試薬の例としては、拡散プローブが挙げられるが、これに限定されない。遺伝子型特異的核酸検出試薬は、微生物の特定の属、種、又は株に特異的であってもよい。核酸プローブの例としては、米国特許第５，９２８，８６２号又は９，１９４，００７号に記載された二本鎖プローブ等の二本鎖プローブ、ＷＯ ９８／１００９６に記載されているもの等の分子ビーコンプローブ、米国特許第、５，２１０，０１５号、５，４８７，９７２号５，５３８，８４８号、５，７２３，５９１号、及び６，２５８，５６９号に記載されているもの等のタックマン（ＴａｑＭａｎ）プローブ、スコーピオンプローブ、ライトサイクラ―プローブ、ＬＵＸプローブ、並びにアンプリフルオル（ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プローブが挙げられるが、これに限定されない。このようなプローブは、例えば、標的微生物の増殖条件下でプローブを含有する液滴を培養し、培養後の標的微生物を加熱等により溶解し、標的の遺伝子座を任意に増幅し、拡散プローブを有する遺伝子型の有無を検出するために使用することができる。諸実施形態では、特定の微生物に特異的な標識抗体又は他の分子が使用される。このような標識分子は、特定の抗菌剤に感受性を有する微生物の同定を可能にする微生物株にも特異的とすることができる。
検出試薬は、遺伝子型非特異的核酸検出試薬でもよい。その例としては、インターカレーティング色素が挙げられるが、これに限定されない。インターカレーティング色素は、一般的に、ＤＮＡ二本鎖における積み重なった塩基対の間に、色素分子に対する環境依存的な蛍光増強及び溶液中の遊離色素よりも大きな蛍光シグナルの増加をもたらす配列を挿入する平面構造を有する芳香族カチオンである。シグナル増強により比例応答がもたらされ、直接的な定量的ＤＮＡ測定が可能となる。本開示における好ましいインターカレーティング色素の例としては、蛍光色素が挙げられる。当該色素は、シアニン色素又は非シアニンのインターカレーティング色素であってもよい。場合によっては、インターカレーティング色素は、シアニン色素である。場合によっては、シアニン色素は、チアゾールオレンジ、サイバー（ＳＹＢＲ）（登録商標）（例えば、サイバーグリーンＩ、サイバーグリーンＩＩ、サイバーゴールド、サイバーＤＸ）、オイルグリーン、サイクアント（ＣｙＱｕａｎｔ）ＧＲ、シトックス（ＳＹＴＯＸ）グリーン、ＳＹＴ０９、ＳＹＴＯ１０、ＳＹＴ０１７、ＳＹＢＲ１４、オキサゾールイエロー（Oxazole Yellow）、ＳＹＴＯ、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＢＯＢＯ、又はＰＯＰＯであってもよい。場合によっては、当該色素は、非シアニン色素である。場合によっては、非シアニン色素は、ペンタセン、アントラセン、ナフタレン、フェロセン、メチルビオロゲン、トリモルフォリノアンモニウム、プロピジウム（例えば、ヨウ化プロピジウム）、又は他の芳香族若しくはヘテロ芳香族誘導体である。場合によっては、インターカレーティング色素は、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）、アクリジンオレンジ、エチジウムモノアジド（ＥＭＡ）、プロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）、サイバー（ＳＹＢＲ）（登録商標）グリーンＩ、サイバー（登録商標）ゴールド、臭化エチジウム、臭化プロピジウム、ピコグリーン、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８、ＹＯ－ＰＲＯ－Ｉ及びＹＯ－ＹＯ－Ｉ、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＬＣグリーン（登録商標）、ＬＣグリーン（登録商標）プラス＋、エヴァグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）（登録商標）からなる群から選択される。場合によっては、インターカレーティング色素は、エヴァグリーン（登録商標）である。このようなインターカレーティング色素は、例えば、標的微生物の増殖条件下でプローブを含有する液滴を培養し、培養後の標的微生物を加熱等により溶解し、標的の遺伝子座を任意に増幅し、インターカレーティング色素を有する二本鎖核酸の有無を検出するために使用することができる。諸実施形態では、培養する必要はない。あるいは、標的微生物を検出して標的微生物の増殖を測定するために細胞を溶解する必要はない。
検出試薬は、表現型特異的であってもよい。例えば、検出試薬は、酵素を産生する生物の存在を示す酵素活性の存在を検出する試薬であってもよい。したがって、検出試薬は、ｐＨの変化の結果として吸光度（例えば、可視光の吸光度）及び／又は蛍光を変化させるｐＨ感受性の発色団又はフルオロフォアであってもよい。例示的なｐＨ感受性蛍光プローブは、約５未満のｐＨの水溶液中では、検出波長で検出可能な蛍光性を有するが、約６．５より大きいｐＨの水溶液中では、当該検出波長で検出可能な蛍光性を有しない。
例えば、腸内細菌科等の特定の細菌を含む微生物は、十分な濃度の強い緩衝剤の非存在下で当該微生物が増殖する培地のｐＨを劇的に低下させることが知られており、低ｐＨで色を変えたり蛍光を発したりするマーカー（例えば、プローブ又は他の識別子）により検出することができる。あるいは、検出試薬は、微生物、又は微生物の種類を示す酵素の基質であってもよい。諸実施形態では、検出試薬は、基質と、標的微生物によって産生される酵素との反応生成物である。基質は、比色基質又は蛍光基質であってもよい。酵素、微生物、及び対応する基質の例としては、表１に記載するものが挙げられるが、これらに限定されない。
表１
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一般に、検出試薬は、使用する液滴化学物質と適合するように選択される。例えば、本質的に水相に存在し、非水相には実質的に分離しない検出試薬を選択することができる。場合によっては、液滴化学物質を調整して、検出試薬の非水相への分離を最小に抑えることができる。例えば、膜系を有する液滴は、二相系で置換することができ、その逆であってもよい。あるいは、ＨＬＢを増加又は減少させた界面活性剤（例えば、非イオン性非フルオロ界面活性剤、又はフルオロ界面活性剤）を利用することができる。
Ｊ．試料
油中水液滴に分離するための試料は、標的微生物を含有することが知られている試料又は含有すると思われる試料を含んでもよい。ＱＩ計数のため、当該試料は、食品（例えば、人又は動物のための食品）又は表面若しくは装置から採取された環境試料であってもよく、又はそれを含んでもよい。試料は、１つ以上の標的微生物を含んでもよい。標的微生物は、細菌、酵母、又はカビであってもよく、又はそれを含んでもよい。臨床試料は、様々な体液又は稀釈試料を含む。
開示された方法を用いて任意の微生物を同定することができる。標的微生物は、例えば、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌、腸内細菌科（エシェリキア種（Escherichia spp.）、クレブシエラ種（Klebsiella spp.）、エンテロバクター種（Enterobacter spp.）、セラチアマルセッセンス（Serratia marscescens）、及びシトロバクター種（Citrobacter spp.）、シゲラ種（Shigella spp.）、サルモネラ種（Salmonella spp.）、クロノバクター種（Cronobacter spp.）、シュードモナス種（Pseudomonas spp.）、アシネトバクター種（Acinetobacter spp.）、カンピロバクター種（Campylobacter spp.）、スタフィロコッカス種（Staphylococcus spp.）、レジオネラ種（Legionella spp.）、コリネバクテリウム種（Corynebacterium spp.）、リステリア種（Listeria spp.）、エンテロコッカス種（Enterococcus spp.）、ストレプトコッカス種（Streptococcus spp.）、クロストリジウム種（Clostridium spp.）、バチルス種（Bacillus spp.）、カンジダ種（Candida spp.）、アスペルギルス種（Aspergillus spp.）、クリプトコッカス種（Cryptococcus spp.）、デバロマイセス種（Debaromyces spp.）、ゲオトリクム種（Geotrichum spp.）、ハンセニアスポラ種（Hanseniaspora spp.）、クルイベロマイセス種（Kluyveromyces spp.）、ピキア種（Pichia spp.）、ロドトルラ種（Rhodotorula spp.）、サッカロミセス種（Saccharomyces spp.）、トリコスポロン種（Trichosporon spp.）、ツィゴサッカロマイセス種（Zygosaccharomyces spp.）、アルテルナリア種（Alternaria spp.）、フザリウム種（Fusarium spp.）、ムコール種（Mucor spp.）、ペニシリウム種（Penicillium spp.）、プルラリア種（Pullularia spp.）、トリコセシウム種（Trichothecium spp.）、又はそれらの組み合わせであってもよく、又はそれを含んでもよい。
標的微生物は、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、セラチアマルセッセンス、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アエロゲネス、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ブドウ球菌（Staphylococcus haemolyticus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ミティス（Streptococcus mitis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・クルセイ（Candida krusei）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus）、デバロマイセス・ハンセニィ（Debaromyces hansenii）、ゲオトリクム・キャンディダム（Geotrichum candidum）、ハンセニアスポラ・グイリエルモンデイ（Hanseniaspora guilliermondii）、クルイベロマイセス・ラクティス、ピキア・アングスタ（Pichia angusta）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、出芽酵母、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、チゴサッカロミセス・ルーキシィ、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）、フザリウム・グラミネアラム、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、ペニシリウム・パツルム（Penicillium patulum）、プルラリア・プルランス（Pullularia pullulans）、トリコセシウム・ローゼム（Trichothecium roseum）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、若しくはアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）又はそれらの組み合わせであってもよく、又はそれを含んでもよい。
ｉ．食品マトリックス
食品マトリックスは、ヒトの食品、又はペット用若しくは家畜用の餌等の動物の食品であってもよい。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載される油中水液滴化学物質及びその使用方法が、多様な食品マトリックスと適合することを見出した。食品マトリックスの例としては、動物性食品（例えば、牛肉やハム等の肉、乳やチーズ等の乳製品）若しくは植物性食品（例えば、野菜や果物）を含有するもの、飲料、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、食品マトリックスを含有する肉は、牛挽肉（例えば、８５％又は９５％の牛赤身挽肉）である。場合によっては、食品マトリックスを含有する乳は、全乳、クリーム、ハーフアンドハーフ（全乳とクリームを混ぜたもの）、２％、１％、又は無脂肪（スキム）乳である。
食品マトリックスの多様な脂肪含有量は、本明細書に記載された油中水化学物質に適合する。驚くべきことに、相当量の脂肪が食品マトリックスに存在し、液滴の形成を妨げないことが判明した。考えられる脂肪含有量の例としては、約０％、又は約０．５％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、若しくは約６０％未満が挙げられる。場合によっては、脂肪含有量は、約０％～約２０％、約０％～約２５％、又は約２０％～４５％である。
一般的に、食品マトリックスは、油中水液滴の水相の１つ以上又は全ての成分に懸濁、混合、ブレンド、又は均質化される。例えば、ヒトの食品マトリックスは、食品マトリックスの重量と水相成分の全量との比率が約１：１０、約１０：９０、約１５：８５、約２０：８０、又は約２５：７５となるように油中水液滴の水相の１つ以上又は全ての成分と混合してもよい。
ｉｉ．環境試料
環境を分析するときは、屋内であろうと屋外であろうと目的とする環境から資料を取得する。ＱＩが関連する環境の例としては、レクリエーションで使用される水、砂浜、及び表面が挙げられる。別の例としては、農場、屠殺場、又は食品が加工される他のあらゆる場所（例えば、食品包装工場）の環境が挙げられる。農場から取得する試料の例としては、土壌、農舎の表面、農業用具から取得される試料が含まれる。レクリエーションで称される水は、娯楽で使用されるあらゆる水であり、スイミングプール、湖、川、海等のレクリエーションの主体となる水である。表面は、特に、病院、学校、食品加工施設等に関連する。試料は、表面から取得したスワブであり、スワブは液滴を生成する培地に導入される。
ｉｉｉ．臨床試料
臨床試料における１つ以上の標的微生物の有無又はその抗菌剤感受性を検出する方法及び組成物が、本明細書に記載される。当該試料は、病原性微生物に感染していることが知られている又は感染していると思われる被験体（例えば、ヒト被験体）から取得した試料である。試料は、血液、若しくは血漿や血清等の血液分画物、組織、尿、若しくは唾液、心膜液、胸膜液、若しくは髄液、痰、骨髄幹細胞濃縮物、若しくは血小板濃縮物、鼻スワブ、直腸スワブ、膣スワブ、若しくは鼠径スワブ、創傷、膜、口、舌、若しくは喉から取得したもの、腹水、又は便等であってもよい。このような試料は、微生物数を決定するために分析することができ、これにより、病原性感染の可能性を評価することができる。
あるいは、臨床試料は、既知の標的微生物の純粋な培養物又は実質的に純粋な培養物であってもよい。このような既知の標的微生物の純粋な培養物又は実質的に純粋な培養物は、抗菌剤感受性評価方法によって分析することができる。例えば、被験体から試料を取得して、例えば、被験体から入手した試料又は培養した試料を適切な培地に植えることによって、標的微生物の有無について評価することができる。標的微生物の単一コロニー又は複数のコロニーを選択肢、必要に応じて培養し、試験抗菌剤を含有する複数の油中水エマルジョンの液滴に分離することができる。複数の油中水エマルジョンの液滴における試験抗菌剤の濃度は、１つ又は複数の濃度であってもよい。
試料分析
油中水液滴の水相中の蛍光発生基質又は比色基質により試料を分析することで、基質を認識する酵素を発現する標的微生物の有無を判断することができる。これにより、標的微生物の属、種、又は綱の有無を診断する。あるいは、目的とする微生物に特異的な結合パートナー（例えば、抗体）を用いて標的微生物の有無を判断する。他の実施形態では、標的微生物は、液滴の内部が濁っている場合に存在すると特定される。試料は、抗菌剤感受性試験と並行して又は抗菌剤感受性試験を行わずにアッセイすることができ、また、標的微生物の抗菌剤感受性を同時に評価するために、任意に複数の異なる抗菌剤濃度としてもよい。
水相成分の全体積は、その系が生成する液滴の数及び各液滴の体積の関数である。場合によっては、液滴を生成するために用いられる水相成分の全体積は、５μＬ、１０μＬ、１５ μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、５０μＬ、６０μＬ、７０μＬ、８０μＬ、９０μＬ、１００μＬ、１５０μＬ、１７５μＬ、２００μＬ、２２５μＬ、２５０μＬ、２７５μＬ、３００μＬ、３２５μＬ、３５０μＬ、３７５μＬ、４００μＬ、４２５μＬ、４５０μＬ、４７５μＬ、５００μＬ、５００μＬ、５５０μＬ、６００μＬ、６５０μＬ、７００μＬ、７５０μＬ、８００μＬ、８５０μＬ、９００μＬ、９５０μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、又は４ｍＬである。場合によっては、液滴を生成するために用いられる臨床試料から取得した臨床試料又は純粋培養物を含む（ただし、これに限られない）水相成分の全体積は、約１０μＬ～約１ｍＬ、約２０μＬ～約１ｍＬ、約２５μＬ～約５００μＬ、約５０μＬ～約４００μＬ、約７５μＬ～約３００μＬ、又は約１００μＬ～約２００μＬである。
場合によっては、（例えば、ヒトの食品マトリックス又は臨床試料を含む）複数の液滴の総数は、少なくとも約１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；１５，０００；２０，０００；２５，０００；３０，０００；３５，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；又は１００，０００である。他の実施形態では、最大１００万の液滴が生成される。場合によっては、（例えば、ヒトの食品マトリックス又は臨床試料を含む）複数の液滴の総数は、約１，０００～約１００，０００；約２，０００～約９０，０００；約３，０００～約８０，０００；約４，０００～約７０，０００；約５，０００～約６０，０００；約７，５００～約５０，０００；約１０，０００～約４０，０００；約１５，０００～約３０，０００、又は約２０，０００である。
ＩＩＩ．方法
複数の油中水エマルジョンの液滴に試料を分離し、当該液滴を（少なくとも）１～５０（例えば、５～２０）倍加時間培養し、当該液滴における標的微生物の有無を検出することにより、試料中の１つ以上の標的微生物の増殖又は数を迅速に分析する方法が、本明細書に記載される。
一般に、開示された方法は、複数の油中水エマルジョンの液滴に試料を封入することを含み、油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、また、当該方法は、複数の油中水エマルジョンの液滴を、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、上記標的微生物が５～４５回倍加するのに十分な時間培養し、標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定し、少なくとも１つの油中水エマルジョンの液滴において標的微生物を同定したのに応答して、上記試料中に上記標的微生物が存在すると判断することを含む。諸実施形態では、培養は行われず、液滴は最初に培養することなく分析される。
諸実施形態では、油中水液滴は、インターカレーティング色素、標識タンパク質（例えば、抗体、レクチン、又はフィブリノゲン）、及びウシ血清アルブミンのうちの１つ又はそれ以上をさらに含む。
食品マトリックスを分析して標的微生物の数を決定する一般的な方法は、食品マトリックスの一部を均質化することを含み、上記マトリックスの一部は、質量又は体積が既知であり、当該方法はさらに、複数の油中水エマルジョンの液滴を、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、上記標的微生物が５～４５回倍加するのに十分な時間培養し、培養した油中水エマルジョンの液滴から、微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴の数を決定することにより、陽性の液滴の数を決定し、また、微生物を含有しない油中水エマルジョンの液滴の数を決定することにより、陰性の液滴の数を決定し、上記陽性の液滴の数と上記陰性の液滴の数から、上記標的微生物の総数を決定することにより、上記食品マトリックスの単位質量又は体積当たりの上記標的微生物の数を決定することを含む。微生物増殖培地の例としては、部分的に消化されたタンパク質（例えば、カゼインの部分トリプシン消火物、大豆ミールの部分パパイン消火物、又はそれらの組み合わせ）が挙げられる。油中水液滴は、任意に、（ＢＡＭ培地Ｍｌ１９２等の）緩衝ペプトン水及び界面活性剤のうちの１つ又はそれ以上を含有する。例えば、界面活性剤は、ポロキサマーのように、非イオン性であってもよい。例示的なポロキサマーは、約１，８００ ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。諸実施形態では、ポロキサマーは、ポリオキシエチレンを約８０％含む。界面活性剤の濃度は、約０．０１％以上約５％以下、又は約１％であってもよい。諸実施形態では、封入された微生物増殖培地のｐＨは、約７．２である。
試験抗菌剤の最小阻害濃度を決定するために標的微生物をアッセイする一般的な方法は、微生物増殖培地を含む複数の油中水エマルジョンの液滴に複数の標的微生物を封入することを含み、上記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、上記油中水液滴の第１の部分は、上記試験抗菌剤を第１の濃度で封入し、又は試験抗菌剤を封入せず、上記油中水液滴の第２の部分は、上記試験抗菌剤を、上記第１の濃度と異なる第２の濃度で封入し、任意に、油中水液滴の第４の部分までが、上記試験抗菌剤を別の異なる濃度で封入し、当該方法は、さらに、上記複数の油中水エマルジョンの液滴を、上記試験抗菌剤の非存在化、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、上記標的微生物が上記試験抗菌剤に阻害されない場合、５～２０回又はそれ以上分裂するのに十分な時間培養し、上記培養した油中水エマルジョンの液滴の各部分について、閾値を超える数の標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴の第数を決定することにより、陽性の液滴の数を決定し、閾値を下回る数の標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴の第数を決定することにより、陰性の液滴の数を決定し、上記液滴の各部分について上記陽性の液滴及び上記陰性の液滴から上記試験抗菌剤の最小阻害濃度を決定することを含む。諸実施形態では、油中水エマルジョンの液滴の６つの部分があり、第１～第５の部分における試験抗菌剤の濃度は、第６の部分の連続２倍稀釈濃度である。
諸実施形態では、陽性の液滴の数を決定すること及び陰性の液滴の数を決定することは、目視又はコンピュータ画像処理により液滴中における細菌胞子、酵母、又はカビの菌糸の有無を検出することを含み、陽性の液滴の数は、複数の油中水液滴における細菌胞子、酵母、又はカビの菌糸の存在を示した液滴の数であり、陰性の液滴の数は、複数の油中水液滴における細菌胞子、酵母、又はカビの菌糸の存在を示さなかった液滴の数である。
Ａ．水相及び／又は試料の処理
液滴の形成を容易にするために、液滴形成の前に、試料及び／又は水相を処理してもよい。処理は、水相中の比較的高濃度及び／又は比較的長い真菌フィラメント若しくは微生物クラスターに特に適切なものであってもよい。標準条件で液滴を形成する場合、水相は、その断面積が急激に減少し、引き伸ばされ、分離して、液滴が形成される。微生物がある濃度以上又は特定の形態（例えば、綿状、菌糸等）で存在する場合、液滴形成能が損なわれる可能性がある。例えば、これらの微生物は、液滴形成の迅速なプロセスにおいて互いに絡み合い、拡散により分離するのに十分な時間がないため、液滴を効率よく形成させない紐（ｃｏｒｄ）を形成する。この紐により、ジェッティング、マイクロサテライト、合体、及びエマルジョン形成の他の特徴をもたらす可能性がある。あるいは／さらに、微生物は、液滴界面と相互作用して、表面張力を低下させ、液滴形成を妨げる可能性がある。
場合によっては、液滴形成への影響を取り除くための方法が必要となる。例示的な方法は、液滴が分裂（pinch off）して形成されるように液滴形成の速度を遅くすることである。他の機械的な解決法として、液滴生成器を再設計して、高濃度条件で液滴を形成することが挙げられる。他の例示的案方法は、水相に包含される試料を処理して、凝塊、集合物、凝集物、菌糸の長さ等を低減させることである。場合によっては、特に、少なくとも約４０～５０℃に試料を少なくとも約１、２、５、１０、１５、又は３０分間加熱することにより、凝塊、凝集、凝集、菌糸の長さ等を低減することができる。適用される温度は、分析する微生物の熱安定性に基づいて決定される。
さらに別の方法は、大きな凝塊、集合物、菌糸構造等を機械的に分離することである。このような機械的分離は、別個の工程として、又は試料（例えば、食品マトリックス）と水相の他の成分との均質化又は混合の間に行うことができる。例えば、食品マトリックスの試料は、ストマッカー、ビードビーター、ボルテックス、又は他の適切な装置を用いて水相の成分と均質化又は混合してもよい。このような均質化又は混合により、１つ以上の標的微生物の凝塊、集合物、菌糸構造等が分離される。他の例として、水相の１つ以上の成分と混合する前又は後に標的微生物の純粋培養物等の試料を簡単に（例えば、ボルテックスミキサーを用いて）機械的攪拌してもよい。
Ｂ．液滴の形成
標的微生物、培養培地、及び任意に試験抗菌剤（ただし、これらに限定されない）を含む上記成分を含有する水相及び非水相を提供（例えば、取得及び／又は準備）し、エマルジョンを形成するために利用することができる。これにより、標的微生物を含有する複数の油中水液滴が形成される。
エマルジョンは、一般に、液滴のためのキャリア流体として作用する混和しない連続相（例えば、油相等の非水相）中に位置する分散相（例えば、水相）の液滴を含む。分散相及び連続相は、一般に、少なくとも主に液体である。
任意の適切な方法及び構造を利用して、エマルジョンを形成することができる。一般に、エマルジョンを形成するためには、振盪、攪拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）、超音波処理、攪拌（ａｇｉｔａｔｉｎｇ）、又はエマルジョンを均質化すること等のエネルギー入力が必要である。しかし、これらの方法では、液滴生成が実質的に制御できないことにより、液滴がある範囲のサイズを示す多分散エマルジョンが生成されることがある。あるいは、少なくとも１つの液滴生成器を用いて、連続的な液滴生成を制御することにより、（非常に均一な液滴サイズを有する）単分散エマルジョンを生成することができる。例示的な実施形態では、液滴生成器は、単分散液滴のエマルジョンを生成するためのマイクロチャネルフローフォーカシングにより動作する。適切とすることができる液滴生成のための他の方法及び構造は、例えば、２０１０年３月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／３４１，２１８号、２０１０年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４０９，１０６号、２０１０年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／４０９，４７３号、２０１０年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／４１０，７６９号、２０１０年８月２４日に出願された米国特許出願第１２／８６２，５４２号、２０１０年７月８日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０，１７３，３９４号、２０１４／０，１７９，５４４号、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１４／１３８，７１１及びＷＯ２０１１／１０９，５４６に記載され、その内容の全体が、あらゆる目的のために、及び特に液滴生成、液滴化学物質、マイクロ流体液滴処理、液滴温度の調節、及び検出方法に関連する開示のために本明細書に援用される。
水相に存在する界面活性剤は、非水相に含まれる水性液滴の形成に役立てることができる。界面活性剤は、非水相及び水相と物理的に相互作用し、両相の界面を安定化させ、自己組織化界面層を形成することにより、水性液滴の形成に役立つ。界面活性剤は、液滴の動態安定性を高め、かつ／または、液滴合体を低減して液滴の凝集を低減することができる。液滴は、流体操作中に流体の流れによって生じるせん断力に対して比較的安定にすることができる。例えば、非水相及び水相製剤の選択された組み合わせを用いて、１００μｍ又は２００μｍのチャネルにおいて少なくとも４０Ｌ／ｍｉｎ又は５０Ｌ／ｍｉｎの流速に対して液滴を安定にすることができる。得られる液滴は、任意の適切な形状及びサイズとすることができる。形状が制限されない場合、液滴を球形としてもよい。液滴の平均直径は、約１～５００μｍ、５～５００μｍ、又は５０～５００μｍとすることができ、液滴の平均体積は、約５０ｐＬ～５００ｎＬ、１００ｐＬ～１０ｎＬ、２００ｐＬ～５ｎＬ、約０．５ｎＬ、約１ｎＬ、約２ｎＬ、約３ｎＬ、又は約５ｎＬとすることができる。生成される液滴の数は、使用する計器及び液滴生成の方法（例えば、バルク攪拌、連続生成）、液滴化学物質、液滴体積、液滴生成の間に消費される水相及び／又は非水相の体積、分析する試料の体積、並びに分離される標的微生物の数を含む（ただし、これらに限定されない）多様な要因に依存する。
液滴を形成し、その後、バイアル、試験管、プレートのウェル、チャンバ等の容器にエマルジョンとして収集することができる。諸実施形態では、液滴をＰＣＲチューブ又はマイクロプレートにエマルジョンとして収集し、１つ以上のＰＣＲチューブ又はマイクロプレートを保持するように構成されたインキュベータ内で培養することができる。あるいは／さらに、液滴を容器に収集し、その後、別の容器に移して微生物増殖温度で培養することができ、かつ／又はマイクロ流体力学等の流体力学を介して操作及び／又は培養位置に移動することができる。代替的な実施形態では、液滴が形成され、マイクロ流体チャネルに入る。このような実施形態では、液滴の単一ファイルラインがチャネル内に形成される。
液滴生成前における水相中の微生物の濃度は、特に限定されない。液滴生成において、ただ１つの微生物を含む液滴を実質的に全て取得するためにが、開始水相の濃度を、液滴１０滴のうち１滴に微生物が含まれる濃度とする。他の実施形態では、２以上の微生物が各液滴に存在してもよい。
液滴は、空間（ｓｐａｃｉｎｇ）流体に分散させてもよい。場合によっては、空間流体は、高密度に充填された液滴の流体操作を容易にし、かつ／又は粘着性の液滴若しくはカプセルの分散を容易にすることができる。例えば、液滴を生成し、任意にカプセルに変換し、１つ又は複数の温度（例えば、微生物増殖及び／又は検出温度）で培養し、その後、空間流体に分散させてもよい。あるいは、１つ又は複数の温度による培養の前に、液滴を空間流体に分散させてもよい。場合によっては、空間流体は、液滴を生成するために使用される非水相の油相成分を含有する。場合によっては、空間流体は、油相を含むが、液滴を生成するために使用される非水相の界面活性剤を含まない。
Ｄ．液滴変換
１つ又は複数の膜形成成分（例えば、膜形成タンパク質）を含有する液滴化学物質は、安定性を高めるために、液滴からカプセルに変換することができる。このような変化は、増殖するのが遅い微生物の分析に有用である。このような場合、微生物増殖温度での長期培養中の液滴合体又は凝集を低減又は排除することができる。さらに、場合によっては、標的微生物の菌糸が成長して、変換されていない液滴の壁に浸透し、液滴の安定性を低下させる可能性がある。このような場合、液滴のカプセルへの変換は、そのような菌糸の浸透を低減又は排除するのに有用である。あるいは、微生物増殖温度で液滴を培養した後に、カプセルを形成してもよい。このようなカプセル形成により、例えば、カプセルの形成と同時に標的微生物の死滅が可能となる。このようなカプセルは、後で、任意に保存し、かつ／又は、分析してもよい。場合によっては、微生物増殖温度での液滴の培養後の加熱によるカプセル形成により、内部エプトープを明らかにし、又は液滴中に微生物が存在する場合、その微生物から核酸を放出し、１つ以上のプローブ又はインターカレーティング色素を用いて当該拡散を検出してもよい。
一般に、液滴は、加熱により変換される。液滴、連続相、及び／又はエマルジョンは、膜を生成するのに十分な温度まで加熱してもよく、かつ、膜を形成するのに十分な時間加熱してもよい。このような変換が起こるのに十分な温度と時間との間には、逆の関係が存在し得る。すなわち、液滴を比較的低温で加熱すると、液滴を比較的高温で加熱する場合に比べて、加熱時間が長くなる。しかし、膜の形成は、閾値温度よりも高いと急速に生じ、当該閾値温度よりも数度低い温度では、それよりはるかに遅く生じる。例えば、エマルジョンが閾値温度を超えて加熱されると、膜形成は約５分以内又は約１分以内に生じるか、又は完了する。液滴のカプセルへの変換は、水相における１つ又は複数の膜形成タンパク質（及び／又は他の膜形成成分）の溶解度を低下させる可能性があり、膜形成成分が水相に溶解しにくくなる（例えば、実質的に不溶となる）。したがって、膜が水相において実質的に不溶となる可能性がある。
諸実施形態では、閾値温度は、水相における膜形成タンパク質の変性温度に対応させてもよい。したがって、閾値未満の温度のときよりも、閾値を超えた温度おときにはるかに急激に生じるタンパク質変性の結果として、膜形成が生じ得る。一例として、ＢＳＡは、約５０℃～５５℃で変性することが報告されており、ＢＳＡを膜形成タンパク質として含む液滴は、同じ温度で急激に膜を形成するように誘導することができる。したがって、変性温度が異なる他の膜形成タンパク質を使用すると、膜が形成される前に、対応する別の温度に加熱する必要が生じ得る。
場合によっては、標的微生物の生存を可能にする膜形成（例えば、変性）温度を有する膜形成成分を選択してもよい。例えば、標的微生物が膜形成成分の膜形成温度で（少なくとも）約１～５分間培養した後に実質的に生存したままでいられるように、液滴のカプセル形成のために比較的低い膜形成温度を選択してもよい。あるいは、標的微生物を死滅させる膜形成（例えば、変性）温度を有する膜形成成分又は標的微生物から核酸を放出する膜形成成分を選択してもよい。例えば、標的微生物を膜形成成分の膜形成温度で（少なくとも）約１～３０分間培養した後に実質的に死滅又は溶解できるように、液滴のカプセル形成のために比較的高い膜形成温度を選択してもよい。
液滴を膜形成温度より高い温度に加熱することにより、自己組織化界面層を界面膜に変換することができる。膜は、特に、タンパク質、又はタンパク質及び界面活性剤により構成してもよい。場合によっては、液滴は、ＰＣＲ増幅の間に行われるようなサーマルサイクリングを介して加熱してもよい。サーマルサイクリングプロファイルには、約４℃～約９９ ℃の範囲における温度変動が含まれる。液滴は、フローベースのサーモサイクリングシステムを介した液滴の輸送の結果として、サーマルサイクリングを介して加熱してもよい。例示的なフローベースのサーモサイクリングシステムの他の態様は、２０１０年７月８日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０，１７３，３９４号に開示されており、参照により本明細書に援用される。
Ｄ．培養
液滴又はカプセルの形成後、選択した１つ又は複数の温度で液滴又はカプセルを培養してもよい。例えば、微生物増殖、溶解、比色基質若しくは蛍光発生基質の酵素処理、核酸検出、又はそれらの組み合わせに適した１つ又は複数の温度で液滴又はカプセルを培養してもよい。蛍光発生基質は、標的微生物の酵素で開裂した後、分子内アルドール縮合を経ることにより、蛍光指標化合物を生成する。微生物増殖温度の例としては、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４１℃、４１．５℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、又は５０℃が挙げられるが、これに限定されない。場合によっては、微生物増殖温度は、特定の標的微生物のため、又は標的微生物の種類のために最適化される。例えば、標的微生物が大腸菌である場合、微生物増殖温度を３７℃としてもよい。あるいは、複数の異なる最適増殖温度を有する複数の微生物の増殖に適した標的微生物増殖温度を選択してもよい。例えば、２５℃、３０℃、３５℃、又は３７℃の微生物増殖温度を利用して、酵母、カビ、及び細菌の増殖を同時にアッセイしてもよい。
液滴又はカプセルは、選択した数の倍加時間の間、微生物増殖温度で培養してもよい。本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載された方法及び組成物により、倍加する時間なしに又は比較的少ない数（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５；５～４５、１０～４０、１５～３０、２０～２５、１０～２０、１０～１５、又は５～１５回）の倍加時間の結果として正確な微生物数又は抗菌剤感受性がもたらされ、これにより、液体（ブロス）及び／又はプレーティング技術における標準的な培養と比較して迅速なアッセイが可能になることを発見した。当業者であれば、微生物増殖温度で選択された数の倍加時間培養された標的微生物は、微生物が典型的に示す誘導期、加速期、対数期、減速期、死滅期、又はこれらの組み合わせにより、必ずしも選択された数の分だけ倍加するとは限らないことを理解するであろう。
このような選択された数の倍加時間は、少なくとも約１５分、２０分、３０分、…、１ｈ、２ｈ、３ｈ、４ｈ、５ｈ、６ｈ、７ｈ、８ｈ、９ｈ、１０ｈ、１１ｈ、１２ｈ、１３ｈ、１４ｈ、１５ｈ、１６ｈ、１７ｈ、１８ｈ、１９ｈ、２０ｈ、２１ｈ、２２ｈ、２３ｈ、２４ｈ、２５ｈ、２６ｈ、２７ｈ、２８ｈ、２９ｈ、３０ｈ、３２ｈ、３４ｈ、３６ｈ、３８ｈ、４０ｈ、４４ｈ、４８ｈ、５２ｈ、５８ｈ、６０ｈ、６６ｈ、又は７２ｈとしてもよい。
選択された数の倍加時間は、
・細菌については、少なくとも約４ｈ～約１６ｈ以内又は少なくとも約４ｈ～約８ｈ以内、
・酵母については、少なくとも約６ｈ～約１２ｈ以内又は少なくとも約８ｈ～約１２ｈ以内、
・カビについては、少なくとも約８ｈ～約３６ｈ以内又は少なくとも約８ｈ～約２４ｈ以内、
・３７℃等の最適増殖温度又はその付近の温度で急速に増殖する大腸菌等の微生物については、約２ｈ～約８ｈ、２ｈ～約６ｈ、約４ｈ～約８ｈ、又は約４ｈ～１２ｈ、
・３７℃等の最適増殖温度又はその付近の温度でも増殖が遅いリステリア種等の微生物については、約４ｈ～約１２ｈ、約４～約１６ｈ、約４～約１８ｈ、約４～約２４ｈ、約４～約４８ｈ、約６～約１２ｈ、ｆ約６～約１６ｈ、約６～約１８ｈ、約６～約２４ｈ、約６～約４８ｈ、約８～約１６ｈ、約８～約１８ｈ、約８～約２４ｈ、又は約８～約４８ｈ、
・酵母又はカビについては、約４～約１２ｈ、約６～約１２ｈ、約６～約１６ｈ、約６～約１８ｈ、約６～約２４ｈ、約６～約４８ｈ、約８～約１２ｈ、約８～約１６ｈ、約８～約１８ｈ、約８～約２４ｈ、約８～約４８ｈ、約．１２～約１６ｈ、約１２～約１８ｈ、約１２～約２４ｈ、又は約１２～約４８ｈ
としてもよい。
場合によっては、微生物増殖温度で培養した後、液滴又はカプセルを第２の温度で培養する。第２の温度は低く（例えば、４℃））して、短期間保存してもよい。第２の温度を高く（例えば、６５℃又は９５℃）として、カプセルを形成し、標的微生物を溶解し、拡散を放出させ、かつ／または、サーモサイクリングによる増幅及び／又は検出を開始してもよい。場合によっては、微生物増殖温度で培養した後、微生物増殖温度で蛍光発生基質又は比色基質に対して実質的に作用しない酵素の蛍光検出又は比色検出のために選択された温度で液滴又はカプセルを培養する。あるいは、酵素は、微生物増殖温度で作用してもよく、他の培養温度は必要とされない。場合によっては、酵素は微生物増殖温度で作用してもよいが、標的微生物の細胞内に隔離されている。このような場合、微生物増殖後に高温培養工程を実施して、酵素の断片を放出させ、その後の検出に利用することができる。
Ｅ．検出
複数の液滴又はカプセル中の標的微生物の有無は、多様な方法により検出することができる。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、（例えば、液滴を標的微生物が適切な回数だけ倍加又は分裂する時間培養した後の）閾値濃度を超える標的微生物を含有する液滴が、検出可能な自己蛍光を示すことを発見した。したがって、微生物増殖温度で培養した後、標的微生物の存在を示す自己蛍光の有無について液滴をアッセイすることができる。
場合によっては、検出は、液滴中の濁度について行ってもよい。これにより、封入された微生物が実質的に分裂した液滴を検出することができる。場合によっては、フルオロフォア又は発色団の蛍光又は吸光について行ってもよい。例えば、特徴的な吸光又は蛍光を示す液滴を検出することにより、表１に記載された基質のうちの１つ等の蛍光発生基質又は比色基質の分解を検出することができる。他の例として、蛍光発生プローブ又はインターカレーティング色素を使用して、一般に、核酸配列又は二本鎖核酸の有無を検出することができる。さらに別の例として、ｐＨ感受性発色団又はフルオロフォアを使用して、液滴中の標的微生物の有無を示す液滴中のｐＨの変化の有無を検出することができる。他の実施形態では、目的の微生物に特異的に結合する検出可能部分を使用して、微生物の有無を確認する。このような検出可能部分は、標識タンパク質（例えば、抗体、レクチン、又はフィブリノゲン）であってもよい。これらのようなマーカーは、溶解剤の有無にかかわらず、使用することができる。
一般的に、液滴は、陽性又は陰性のものとして同定される。陽性の液滴は、微生物を含有するもの又は閾値を超える数の微生物を含有するものである。陰性の液滴は、微生物を含有しないもの又は閾値を下回る数の微生物を含有するものである。いくつかのアッセイでは、液滴は培養前後に分析される。このようなアッセイでは、陽性の液滴は、最初の分析から微生物の数が増加したものであり、陰性の液滴は、最初の分析から微生物の数が増加しなかったものである。分析は、例えば、光学顕微鏡を用いて手動で、又は自動化された方法で行うことができる。場合によっては、自動検出は、１つ又は複数の歯超における吸光度、透過率、又は発行（例えば、蛍光）を検出するように構成された検出領域に液滴を連続的に流すことによって行われる。場合によっては、検出器及び／又は励起光源に対して動作可能に配置された検出領域に向かってチャネル内を流れる液滴に、空間流体が加えられる。場合によっては、自動検出は、２０１４年１１月１３日発行の「ネイチャー・コミュニケーションズ（Nature Communications）５、Article number: 5427、doi: 10.1038/ncomms6427」に記載されているような一定量の液滴における高スループット３Ｄ粒子計数システムによって行われる。例えば、高スループット３Ｄ粒子計数を用いて、非蛍光液滴の数ミリリットルのプール中における単一の蛍光液滴を検出することができる。
試料は、全微生物負荷、全細菌負荷、全大腸菌群（coliforms）、全酵母、全カビ、又はそれらの組み合わせについてアッセイしてもよい。あるいは、特定の微生物を同定して、任意に定量する。
Ｆ．微生物数の決定
微生物の有無について液滴を検出することで、陽性の液滴及び陰性の液滴を取得した後、そのデータを分析して、臨床試料における食品マトリックス試料の微生物負荷又は標的微生物の存在等の定量結果を決定することができる。場合によっては、陽性の液滴及び陰性の液滴の数から陽性の液滴の割合（すなわち、全液滴に対する陽性の液滴の比）を算出する。場合によっては、当該割合をポアソン分布に適合させることにより、当該割合を補正する。ポアソン補正による計算は、標的微生物が液滴形成中にランダムに液滴に分離されることを前提としているため、限定された、濃度依存的で予測可能な確率で複数の標的微生物を単一の液滴に分離することができる。場合によっては、ｌｎ（１－ｐ）の値（ｐは、陽性の液滴の割合）により、液滴１滴当たりの標的微生物の数が決定され、これにより、液滴が生成される試料中の標的微生物の数が決定される。
ＩＶ．キット
１つ又は複数の標的微生物の計数、標的微生物の抗菌剤感受性の測定、又はそれらの組み合わせのためのキットが本明細書に記載される。キットは、油（例えば、フルオラス油）及び非水性界面活性剤（例えば、フルオロ界面活性剤又は１つ又は複数の界面活性剤を含有する混合物）等の、二相液滴及び／又は膜含有液滴を形成するための非水相試薬を含んでもよい。キットは、膜形成成分（例えば、ＢＳＡ）等の水相試薬を含んでもよい。他の又は代替の水相試薬は、水性界面活性剤（例えば、非イオン性非フルオロ界面活性剤又は非イオン性非フルオロ界面活性剤を含有する混合物）を含んでもよい。キットは、抗真菌剤（例えば、ジクロラン、ローズベンガル、及び／又はキトサン）等の油相試薬を含んでもよい。キットは、表１に示す１つ又は複数の酵素基質、インターカレーティング色素、抗体、レクチン、フィブリノゲン、又は核酸プローブ（ただし、これらに限定されない）を含有する検出試薬を含んでもよい。キットは、１つ又は複数のコントロール微生物を含んでもよい。キットは、１つ又は複数の試験抗菌剤を含んでもよい。キットは、本明細書に記載の方法を実施するための説明書を含んでもよい。
実施例１：抗菌剤感受性の検出
材料及び方法
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））から取得した単離株から、多様な薬剤に対して十分に特徴付けされた最小阻害濃度（ＭＩＣ）を有する菌株（ＣＬＳＩ：Ｍ１００Ｓ２１。「Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-first informational supplement」、Ｗａｙｎｅ、ＰＡ：Clinical and Laboratory Standards Institute;2011）を選択した。その中には、大腸菌（ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２ＴＭ）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ（登録商標）２９２１２ＴＭ）、エンテロコッカス・フェカリス（ＡＴＣＣ（登録商標）２９２１２ＴＭ）、及びカンジダ・アルビカンス（ＡＴＣＣＣＲ）２４４３３ＴＭ）が含まれていた。ＣＬＳＩドキュメントにおいて特徴付けされていないがＷｉｔｔｅら（Clin Microbiol Infect 2007;13:408-412）によって決定されたＭＩＣを有する黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ（登録商標）４３３００の他の菌株を試験した。この菌株は、ヘテロ耐性表現型を有することが知られ、セファロスポリンの誘導の有無にかかわらず用いた。
各菌株は、－８０℃の凍結ストックとして保存した。特に示す場合を除き、全ての細菌株は、トリプトカゼイン大豆ブロス（ＴＣＳ；バイオ・ラッド、マルヌ＝ラ＝コケット、フランス）中で一晩培養後、開始濁度をＴＣＳ中における０．５マクファーランドの１：１００に相当する同一濁度とした。
感受性試験
液滴は、試料体積及び微生物のおおよその数について調整された混合パラメータにより、エヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油（Droplet Generation Oil）を用いて、製造元（バイオ・ラッド）の説明書に従って調製した。既知の濃度の抗生物質又は抗真菌剤を有する水相試薬中で濁度調整培養液を、水相試薬に対するＴＣＳ培養液の比率が１：１（ｖ／ｖ、１０μＬ／１０μＬ）となるように稀釈した。
試験した抗生物質及び抗真菌剤には、セフォキシチン、ピペラシリン、ナリジクス酸、テトラサイクリン、バンコマイシン、トリメトプリム、ニトロフラントイン、コリスチン、ニトロフラン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ、及びフルコナゾールが含まれていた。
液滴を調整するとすぐに、接着フィルムで保護されたカートリッジを３７℃（カンジダ・アルビカンスについては３０℃）で直接培養した。
培養の４時間後及び６時間後、液滴をピペットで採取し、細胞計数スライド（バイオ・ラッド）に導入した。その後、顕微鏡（対物レンズ１００ｘ又は４００ｘ）を用いて液滴中の微生物を観察した。増殖した微生物を内部に含む液滴のおおよその数を報告した。
最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、微生物の目に見える増殖（例えば、顕微鏡を用いて観察できる細菌又は真菌の増殖が全くないこと）を抑制する抗菌剤の最低濃度として測定した。
結果
Ｉ．大腸菌ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２
１－ピペラシリン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：１～４ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000009
 観察されたＭＩＣ：２ｍｇ／Ｌ
２－ナリジクス酸：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：１～４ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000010
 観察されたＭＩＣ：４ｍｇ／Ｌ
３－テトラサイクリン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０．５～２ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000011
 観察されたＭＩＣ：０．５ｍｇ／Ｌ

４－トリメトプリム：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０．５～２ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000012
 観察されたＭＩＣ：１ｍｇ／Ｌ（４ｈ）又は２ｍｇ／Ｌ（６ｈ）


５－コリスチン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０．５～２ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000013
 観察されたＭＩＣ：１ｍｇ／Ｌ


６－ニトロフラン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：４～１６ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000014
 観察されたＭＩＣ：８ｍｇ／Ｌ


７－クロラムフェニコール：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：２～８ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000015
 観察されたＭＩＣ：２～４ｍｇ／Ｌ


８－ゲンタマイシン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０，２５～１ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000016
 観察されたＭＩＣ：２ｍｇ／Ｌ


ＩＩ．黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ（登録商標）２９２１３(tm)
１－バンコマイシン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０．２５～１ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000017
 観察されたＭＩＣ：１ｍｇ／Ｌ


２－セフォキシチン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：１～４ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000018
 観察されたＭＩＣ：２ｍｇ／Ｌ


ＩＩＩ．エンテロコッカス・フェカリスＡＴＣＣ（登録商標）２９２１２ ＴＭ
１－バンコマイシン：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：１～４ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000019
 観察されたＭＩＣ：１～２ｍｇ／Ｌ


ＩＶ．カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ（登録商標）２４４３３ ＴＭ
１－アンフォテリシンＢ：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０．２５～１ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000020
 観察されたＭＩＣ：２～４ｍｇ／Ｌ


２－フルコナゾール：予想ＭＩＣ（ＣＬＳＩ）：０．２５～１ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000021
 観察されたＭＩＣ：８ｍｇ／Ｌ


Ｖ．黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ（登録商標）４３３００ ＴＷ ：予想ＭＩＣ（ＪＣＭ）：１６～３２ｍｇ／Ｌ
抵抗性の誘導は、この菌株をＭＲＳＡＳＥＬＥＣＴＩＩ（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ））に接種し、一晩培養することにより行った。コロニーを採取して、ＴＣＳ中で細菌懸濁を行った。
Figure 0007007298000022
 観察されたＭＩＣ：非誘導株を用いて２～４ｍｇ／Ｌ
Figure 0007007298000023
 観察されたＭＩＣ：誘導株を用いて１６～３２ｍｇ／Ｌ
前述の結果に示すように、本明細書に記載された油中水液滴の組成物及び方法を用いて、多様な標的微生物について多様な試験抗菌剤に対するＭＩＣを正確かつ迅速に測定することができる。
実施例ＩＩ：微生物の計数
１．封入及び増殖
目的：ｉ）油中水液滴化学物質を用いて細菌細胞を液滴内で封入できるか、ｉｉ）細菌細胞が、液滴内で増殖できるか、及びｉｉｉ）細菌細胞が蛍光シグナルを生成するために液滴中の基質を代謝することができるかどうかを調べること。この目的のために、４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニドの存在下、大腸菌細胞の純粋培養物を液滴内で封入し、３７℃で様々な時間培養した。その後、光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡で液滴を観察した。
材料及び方法：
・大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２をトリプトン大豆ブロス中で一晩増殖させた。
・培養物を稀釈して、以下のものを取得した。
液滴培養物：４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（１００ｍｇ／ｌ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した緩衝ペプトン水における１０５ｃｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液。この懸濁液２０μｍを、バイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油（Droplet Generation Oil）（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ株式会社から入手可能）と混合した。その後、液滴を９６ウェルのマイクロプレートに移した。
バルク反応液：４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（１００ｍｇ／ｌ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した緩衝ペプトン水における５０ｃｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液。
・マクロプレート及びチューブを３７±１℃で２４時間培養した。
・培養の０、４、６、８、及び２４時間後：
ＺＯＥ蛍光細胞イメージャ（Fluorescent Cell Imager）（バイオ・ラッド）により可視チャネル及び青色蛍光チャネルにおいて液滴の試料を観察した。
バイオ・ラッド液滴リーダＱＸ２００により、液滴の試料を試験した。
同時に、３６５ｎｍのウッドランプを用いて紫外光下で５ｍｌチューブを観察した。
結果：図１に示すように、封入してから６時間経過後に細菌増殖を検出することができた。増殖は、細菌で満たされた液滴を直接観察することによって、又は青色蛍光の発光によって観察することができた。ＭＵＧ基質を用いない対照実験（図示せず）及び他の細菌を用いた実験（図４参照）により、この青色蛍光が細菌で満たされた液滴の自動蛍光によるものであることを実証した。基質は油相に浸出した可能性が高い。逆に、基質の代謝がバルク反応液において観察された（図示せず）。この代謝の欠如が、リステリアにより確認された。しかし、この実験により、細菌を短時間に封入して増殖させることが可能であることが示された。液滴における自己蛍光の現象については、これまでに報告されていない。
２、食品マトリックス
目的：液滴の生成が緩衝ペプトン水で１０倍に稀釈した食品マトリックスから取得した懸濁液に適合するかどうかを調べること。概念実証実験のために、いくつかのマトリックスを使用した。
材料及び方法
・２８０μｍのフィルターを含むストマッカーバッグにおける２５ｇの食品マトリックス（脂肪分が５％及び１５％の牛挽肉、ハム、生乳、生乳カマンベール、すりおろしニンジン）を秤量した。
・４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（１００ｍｇ／ｌ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した２２５ｍｌの緩衝ペプトン水を当該バッグに添加した。
・食品試料をストマッカーシステムを用いてブロス中で２分間懸濁した。
・２０μｌの食品懸濁液をバイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油と混合した。
・ＺＯＥ蛍光細胞イメージャにより可視チャネルにおいて、得られた食品懸濁液及び液滴を観察した。
結果：液滴の目視検査（光学顕微鏡）により、液滴が実際には食品マトリックスが何であっても生成されることが示された。液滴は全て均一な大きさであり、経時的な安定性は同等であった。この結果により、食品マトリックスから試料を調整するための標準プロトコルが、これまでに試験されたマトリックス（図２参照）の範囲内において液滴生成に適合することが示された。
３．結果を得るまでの時間
目的：食品懸濁液をペトリ皿に画線する場合よりも早い段階で、同じ懸濁液から取得される封入された細菌の増殖が検出できるかどうかを決定する。この目的のために、ハムマトリックスを大腸菌で汚染し、均質化したマトリックスの試料を封入又はペトリ皿に画線した後、３７℃で様々な時間培養した。
材料及び方法：
・２８０μｍのフィルターを含むストマッカーバッグにおいて、ストマッカーシステムを用いて、２５ｇのハムを２２５ｍｌの緩衝ペプトン水及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８ （１％）中に２分間懸濁した。
・１０５ｃｔｕ／ｍＬでハム懸濁液をスパイクするために、トリプトン大豆ブロス中で一晩培養した大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２の培養物を稀釈した。
・この懸濁液２０μｌをバイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油と混合した。液滴は、エッペンドルフマイクロプレートに移した。
・ハム懸濁液を連続稀釈して、ＴＢＸ寒天上に広げた。
・エッペンドルフマイクロプレート及びＴＢＸプレートを３７±１℃で２４時間培養した。
・培養の０、４、６、８、及び２４時間後：
ＺＯＥ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド）により、可視チャネル及び青色蛍光チャネルにおいて液滴の試料を観察した。
バイオ・ラッド液滴リーダＱＸ２００により、液滴の試料を試験した。
同時に、ＴＢＸ寒天プレートを観察した。
結果：液滴に封入された細菌の増殖は、上記の自己蛍光現象のために、光学顕微鏡によっても蛍光顕微鏡によっても容易に検出可能であった。細菌は封入後６時間で早くも検出されたのに対し、ペトリ皿上でコロニーは２４時間経過するまでは検出されなかった。陽性の液滴を直接目視により計数すること、又はＱＸリーダにより陽性の液滴を読み取ることにより、予想された細菌数に近く、ペトリ皿上での目視による計数に適合する推定結果が得られた。全体として、これらの結果により、液滴の封入を利用して、食品試料の懸濁液中に存在する細菌（図３参照）を計数できることが実証された。
４．他の細菌、酵母、及びカビ
目的：液滴における細菌増殖の早期検出の原理が他の細菌及び微生物にも適用できることを証明すること。
材料及び方法（細菌及び酵母）
・エンテロバクター・クロアカＡＴＣＣ１３０４７、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８、シトロバクター・フロインディー（Citrobacter freundii）ＡＴＣＣ８０９０、枯草菌（Bacillus subtilis）ＡＴＣＣ６６３３、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３、及びカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１をトリプトン大豆ブロス中で一晩増殖させた。
・その後、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した緩衝ペプトン水において１０５ｃｆｕ／ｍｌの細胞懸濁液を取得するために培養物を稀釈した。この懸濁液２０μｌをバイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油と混合した。得られた液滴を、エッペンドルフマイクロプレートのウェルに移した。
・マイクロプレートを３７±１℃で２４時間培養した。
・培養の０、４、６、８、及び２４時間後：
ＺＯＥ蛍光細胞イメージャにより、可視チャネル及び青色蛍光チャネルにおいて液滴の試料を観察した。
バイオ・ラッド液滴リーダＱＸ２００により、液滴の試料を計数した。
結果：封入してから様々な時間経過後、液滴の目視検査により、全ての細菌（グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌）及び酵母を検出することができた（図４及び図５参照）。強度は様々であったが、自己蛍光が検出された。腸内細菌科は、８時間以内に強い自己蛍光を生じたが、枯草菌について同様のシグナルを取得するには２４ｈ必要であった。黄色ブドウ球菌は弱いシグナルを生じ、リステリア（図６も参照）は蛍光シグナルを発生しなかった。陽性の液滴の強度は自己蛍光強度の関数として変化したが（図６及び図７参照）、ＱＸ２００リーダを用いて全ての微生物を計数することができた。
材料及び方法（カビ）
・アスペルギルス・ニガーＴ６４６（バイオ・ラッド内部株収集番号（internal strain collection number））をサブロー寒天上で５日間増殖させた。
・その後、胞子をループで採取し、緩衝ペプトン水中に懸濁させた。
・胞子懸濁液は、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した緩衝ペプトン水において１０５ｃｆｕ／ｍｌの胞子懸濁液を取得するために稀釈した。この懸濁液２０μｌをバイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油と混合した。得られた液滴を、エッペンドルフマイクロプレートのウェルに移した。
・マイクロプレートを３７±１℃で２４時間培養した。
・培養の０、４、６、８、及び２４時間後：
ＺＯＥ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド）により、可視チャネル及び青色蛍光チャネルにおいて液滴の試料を観察した。
バイオ・ラッド液滴リーダＱＸ２００により、液滴の試料を試験した。
細菌及び酵母とは対照的に、カビの増殖により観察可能な量の（おそらく液滴膜を通って菌糸が突出していることによる）液滴合体がもたらされたが（図５参照）、液滴中においてカビの増殖を観察することができた。代替的な液滴化学物質を用いてこの液滴合体を防止することができる。カビの増殖により、弱いが検出可能な自己蛍光が生じた。
５．リステリア種
目的：リステリアは、増殖が遅い細菌である。この実験は、液滴中におけるリステリアの増殖が２４時間以内に検出できるかどうかを決定するために行われた。また、特定の基質を検出に用いることができるかどうかについても検討した。リステリア種の個体群を表すために３種のリステリアを混合し、４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄグルコシドの存在下、液滴中において増殖させた。
材料及び方法
・リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ＡＴＣＣ１３９３２、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）ＡＴＣＣ３３０９０、及びリステリア・グレイ（Listeria grayi）ＡＴＣＣ１９１２０をトリプトン大豆ブロス中で一晩増殖させた。
・その後、培養物を稀釈して、以下のものを取得した：
４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（１００ｍｇ／ｌ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した緩衝ペプトン水における１０５ｃｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液。この懸濁液２０μｍを、バイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油と混合した。取得した液滴は、マイクロプレートのウェルに移した。
４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（１００ｍｇ／ｌ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した５ｍｌの緩衝ペプトン水における５０ｃｆｕ／ｍｌの細菌懸濁液
・マクロプレート及びチューブを３７±１℃で２４時間培養した。
・培養の０、４、６、８、及び２４時間後：
ＺＯＥ蛍光細胞イメージャにより、可視チャネル及び青色蛍光チャネルにおいて液滴の試料を観察した。
バイオ・ラッド液滴リーダＱＸ２００により、液滴の試料を試験した。
同時に、３６５ｎｍのウッドランプを用いて紫外光下で５ｍｌチューブを観察した。
結果：図４に示すように、右下のパネルでは、細菌で満たされた液滴を直接観察することにより、２４時間以内に細菌の増殖を検出することができた。蛍光が観察されなかったことにより、ｉ）リステリアの増殖では自己蛍光は発生しないこと及びｉｉ）ＭＵＧ基質は代謝されなかったか、又は大腸菌について既に記載したように検出可能なシグナルを生じるほど十分には代謝されなかったことが示された。増殖は、最適化された条件下では、より短時間で検出できる可能性がある。より感受性の高い基質を容易にスクリーニングすることができる。また、リステリアの増殖のために最適化されていない培地を用いて、この実験を行った。専用のブロスを用いることにより、より良い結果が期待される。
６．大腸菌群（Ｅ．ｃｏｌｉ）検出のためのＡＬＤＯＬ（登録商標）基質の使用
目的：Ｅ．ｃｏｌｉ等のβ－ガラクトシダーゼ発現大腸菌に特異的な緑色蛍光基質を用いて、代替の基質がＭＵＧよりも良好に機能するかどうか評価すること。
材料及び方法（細菌及び酵母）：
・大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２をトリプトン大豆ブロス中で一晩増殖させた。
・培養物は、４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルクロニド（１００ｍｇ／ｌ）及びＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－９８（１％）を補充した緩衝ペプトン水において１０５ｃｆｕ／ｍｌの細胞懸濁液を取得するために稀釈した。この懸濁液２０μｌをバイオ・ラッド液滴生成システムにより５０μｌのエヴァグリーン（＋界面活性剤）用ＱＸ２００(tm)液滴生成油と混合した。得られた液滴を、エッペンドルフマイクロプレートのウェルに移した。
・マイクロプレートを３７±１℃で２４時間培養した。
・培養の０、４、６、８、及び２４時間後：
ＺＯＥ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド）により、可視チャネル及び青色蛍光チャネルにおいて液滴の試料を観察した。
バイオ・ラッド液滴リーダＱＸ２００により、液滴の試料を試験した。
結果：６時間後、緑色蛍光シグナルがはっきりと観察できた（図８参照）。このシグナルは、基質の非存在下において同様の条件で得られた青色蛍光とは異なっていた。蛍光はＱＸリーダ（図示せず）のＦＡＭチャネル上で読み取ることができ、青色自己蛍光よりも強い蛍光を生じた。これにより、特定の基質を用いて液滴中の細菌を同定できることが実証された。
７．抗体をマーカーとして用いた微生物の検出
キット・リンクス（Kit Lynx）ＬＮＫ０２４ＲＰＥ（Abd Serotec）を用いて、カンジダ・アルビカンスを認識する抗カンジダ抗体ＡｃＥＢＣＡｉ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）を標識した。サブロー寒天（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）で一晩培養した後、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ（登録商標）２４４３３ＴＭ（１マクファーランド）の混合物（ｖ／ｖ）を１／２５～１／２００のコンジュゲートの稀釈物に添加することにより、最初に液滴を生成した。試料は、ΖΟΕＴＭ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）を用いて読み取った。図９のＡ及びＢは、１マクファーランドと同等の接種材料及び１／２００のコンジュゲートを用いて、Ｔ０において明確な蛍光を示している。
さらなる実験において、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ（登録商標）２４４３３ＴＭ（０．１マクファーランド）の接種材料を減じた混合物（ｖ／ｖ）を１／２５～１／２００のコンジュゲートの希釈液に添加することにより液滴を生成し、３０℃で培養した。５時間又は２４時間後、試料をΖΟΕＴＭ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）を用いて読み取った。図１０のＡ～Ｃは、５時間後の０．１マクファーランドと同等の接種材料及び１／２００のコンジュゲートの画像を示す。図１１のＡ～Ｃは、２４時間後の０．１マクファーランドと同等の接種材料及び１／２００のコンジュゲートの画像を示す。
抗体が特異的に結合しないカンジダ・パラプシローシス（ＡＴＣＣ（登録商標）２２０１９ｒＭ）を上記カンジダ・アルビカンスと同じ方法で観察した。図１２のＡ及びＢは、Ｔ０における１マクファーランドと同等の接種材料及び１／２００のコンジュゲートの画像を示す。抗体がカンジダ・パラプシローシスに特異的に結合しないので、予想されるように微生物は可視ではない。
さらなる実験では、キット・リンクスＬＮＫ１７４ＰＥＴＲ（Abd Serotec）を用いて、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）におけるメチシリン耐性を示すＰＢＰ２ａを認識する抗ＰＢＰ２ａ抗体（Biosource clone M0071933）を標識した。血液寒天プレート（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）上で一晩培養した後、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡの試験した４種類の菌株のコロニーをブロス中にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋／－セフォキシチン（０又は２ｍｇ／ＬのＦＯＸ）を補充した１／２００のコンジュゲートに添加（０．５マクファーランドの１／５０ 、液滴２０滴中における約１～１０細菌細胞と同等）することにより、最初に液滴を生成した。３７℃で３時間培養した後、ＺＯＥ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）により、試料を読み取った。以下の表は、試験したＭＳＳＡ株及びＭＲＳＡ株についての増殖（可視）及び標識（蛍光）を示す。
Figure 0007007298000024
Figure 0007007298000025
増殖を促し、ＳＡ株の同定に役立てるため、ＢＳＡをブロスに添加した。ＢＳＡを添加することにより、細菌細胞のマイクロコロニー（すなわち、細菌細胞は、単体でいるよりもクラスターを形成する）の生産が促され、これにより強力な検出シグナルが次々に放出され、微生物の検出に役立っている。ＭＲＳＡに特異的であるはずの抗体がＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの両方を検出した場合、ＦＯＸを添加して、ＭＳＳＡの増殖を特異的に阻害し、ＭＲＳＡに限定した蛍光シグナルを取得した。細菌細胞に関連のない蛍光のためにバックグラウンドノイズ（ＢＮ）が観察された。バックグラウンド蛍光を減らすために、抗体の濃度を調整してもよい。
結果は、標識抗体、ＢＳＡ，及びセファマイシンの組み合わせを用いることにより、低濃度でも３時間以内に、液滴においてＭＲＳＡを検出できることを示している。
８．フィブリノゲンをマーカーとして用いた微生物の検出
黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌細胞は、フィブロネクチン等の、宿主タンパク質への付着を促進する表面タンパク質を発現する）に結合するフィブリノゲン（シグマアルドリッチ（Sigma Aldrich））をキット・リンクスＬＮＫ１７４ＰＥＴＲ（Abd Serotec）を用いて標識した。血液寒天プレート（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）上で一晩培養した後、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡの試験した４種類の菌株のコロニーをブロス中にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋／－セフォキシチン（０又は２ｍｇ／ＬのＦＯＸ）を補充した１／２００のコンジュゲートに添加（０．５マクファーランドの１／５０、液滴２０滴中における約１～１０細菌細胞と同等）することにより、最初に液滴を生成した。３７℃で３時間培養した後、ＺＯＥＴＭ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）により、試料を読み取った。以下の表は、試験したＭＳＳＡ株及びＭＲＳＡ株についての増殖（可視）及び標識（蛍光）を示す。
Figure 0007007298000026
Figure 0007007298000027
結果は、標識フィブリノゲン、ＢＳＡ，及びセファマイシンの組み合わせを用いることにより、低濃度でも３時間以内に、液滴においてＭＲＳＡを検出できることを示している。
９．インターカレーティング剤をマーカーとして用いた微生物の検出
ヨウ化プロピジウム（「ＰＩ」、シグマアルドリッチ）の溶液１ｍｇ／ｍＬを調製し、そのうち４００μｌを、０．００５マクファーランドの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ（登録商標）２９２１３ＴＭ（「ＳＡ」）を事前にスパイクした９ｍｌのＴＣＳブロス（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）に添加した。そのうち１０μｌを様々な濃度のセフォキシチン（「ＦＯＸ」）１０μｌと混合し、それを用いて液滴を調製した。試料は、ＺＯＥＴＭ蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）を用いて８時間まで経時的に読み取った。結果は、反応液に溶解剤を添加することなく、ＰＩを利用して試料中における特定の微生物の有無を同定できることを実証している。
図１３のＡ及びＢは、培養６時間後のＳ＋ＰＩ（ＦＯＸなし）の試料を示す。図１４のＡ～Ｃは、培養６時間後のＳＡ＋ＰＩ＋０．２５ｍｇ／ＬのＦＯＸの試料を示す。図１５のＡ～Ｃは、培養６時間後のＳＡ＋Ｐ１＋０．５ｍｇ／ＬのＦＯＸの試料を示す。図１６のＡ～Ｃは、培養６時間後のＳＡ＋Ｐ１＋４ｍｇ／ＬのＦＯＸの試料を示す。ＰＩは可視細胞から除外され、死んだ細胞又は死にかけの細胞の細胞膜に浸透する。驚くべきことに、ＰＩは、この実験において、全ての生細胞を標識した。インターカレーティング剤は、ＤＮＡと反応して細胞の複製を阻止するため、細胞増殖にとって有害であると考えられている。しかし、ＰＩの存在下又は非存在下で経時的に細菌培養物の濁度を測定することで、本発明者らはＰＩが細菌又は酵母の増殖に与える影響は限られていることを発見した。
１０．他の加熱工程を含み、インターカレーティング剤をマーカーとして用いた微生物の検出
目的：他の加熱工程とともにインターカレーティング剤を用いることで、細菌細胞を有する液滴から検出された蛍光シグナルが増強されるかどうかを決定すること。
材料及び方法：
・１５μΜヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含まない／含む緩衝ペプトン水ブロスを大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２でスパイクした。
・その後、バイオ・ラッドＱＸ２００(tm)液滴生成器及びエヴァグリーン油を用いて、液滴１０滴のうち１滴に単一の細菌細胞が含まれるように液滴を生成した。液滴をマイクロウェルに移し、３７℃で２４時間培養した。
・ヨウ化プロピジウムを有する液滴の一部は、９０℃で５分間加熱した。
・その後、明視野チャネル（図１７のＡ～Ｃ）又は赤色蛍光フィルタ（図１７のＤ～Ｆ）を用いてＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャにより液滴を撮影した。
結果：図１７のＡ～Ｃに示すように、ＰＩなし、ＰＩあり、及びＰＩ＋他の加熱工程を含む各試料において、緩衝ペプトン水における細胞増殖（Ｇ）が観察された。しかし、ＰＩが存在しない場合（図１７のＤ）、どの液滴からも蛍光シグナルは観察されなかった。細菌及びＰＩを有する液滴（図１７のＥ）からは、弱い蛍光シグナルが観察され、ＰＩを使用して細胞が増殖した液滴と空の液滴を区別できるということが示された。図１７のＦに示すように、細菌及びＰＩを有する液滴を９０℃で５分間加熱することにより、蛍光シグナルが増強される。
１１．ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）ＲｅｄをｐＨ指示薬として用いた微生物の検出
目的：ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄにより微生物を検出できるかどうかを決定すること。
材料及び方法（細菌及び酵母）：
・トリプトン・グルコースブロス（５μΜのｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄあり及びなし）を大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２でスパイクした。
・その後、バイオ・ラッドＱＸ２００(tm)液滴生成器及びエヴァグリーン油を用いて、液滴１０滴のうち１滴に単一の細菌細胞が含まれるように液滴を生成した。液滴をマイクロウェルに移し、３７℃で２４時間培養した。
・その後、明視野チャネル（図１８のＡ及びＣ）又は赤色蛍光フィルタ（図１８のＢ及びＤ）を用いてＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャにより液滴を撮影した。
結果：ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄが存在しない場合、細菌増殖Ｇを有する液滴において蛍光は観察されなかった（図１８のＢ）。ｐＨｒｏｄｏ（登録商標）Ｒｅｄが存在する場合、細胞が増殖した液滴において、グルコース発光後の酸の存在下でｐＨ指示薬特性の変化により、赤い蛍光が発生した（図１８のＤ）。これにより、ｐＨ指示薬を用いて液滴における細胞を同定できることが実証された。
１２．大腸菌群（エンテロバクター・アエロゲネス）検出のためのＡＬＤＯＬ５１８（登録商標）基質の使用
目的：エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８等のβ－グルコシダーゼ発現大腸菌群に特異的な赤色蛍光基質を用いて、代替の基質がＭＵＧよりも良好に機能するかどうか評価すること。
材料及び方法：
・緩衝ペプトン水ブロス（２５０ｍｇ／ＬのＡＬＤＯＬ５１８（登録商標）－β－グルコシドあり及びなし）をエンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８でスパイクした。
・その後、バイオ・ラッドＱＸ２００(tm)液滴生成器及びエヴァグリーン油を用いて、液滴１滴当たり１０，０００の細菌が含まれるように液滴を生成した。その後、当該液滴を、同じブロスを含有するが細菌を含有しない液滴で稀釈した。得られた液滴をマイクロプレートのウェルに移した。
・マイクロプレートを３７±１℃で２４時間培養した。明視野チャネル（図１９のＡ及びＢ）又は赤色蛍光フィルタ（図１９のＣ及びＤ）を用いてＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャにより液滴を撮影した。
結果：ＡＬＤＯＬ５１８（登録商標）－β－グルコシドの非存在下では、最近が増殖した液滴において蛍光は観察されなかった（図１９のＣ）。ＡＬＤＯＬ５１８（登録商標）－β－グルコシドの存在下では、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８のβ－グルコシダーゼ活性により、基質が加水分解され、蛍光ＡＬＤＯＬ化合汚物が放出され、細菌が増殖した液滴において赤い蛍光が発生した（図１９のＤ）。これにより、特定の基質を用いて、液滴における細菌を同定できることが実証された。
１３．液滴の水相の外側におけるジクロランを用いたカビの増殖の阻害
目的：抗真菌剤（例えば、ジクロラン）を液滴の油相に含有させることにより、液滴の水相の外側におけるカビの増殖が阻害されるかどうかを決定すること。
材料：
Figure 0007007298000028
Figure 0007007298000029
方法：
胞子ストック懸濁液の調整
通常の食物媒介カビ菌株は、２８℃で、適切な培地上において胞子形成期（通常、５～７日）まで増殖した。その後、胞子を０．０５％のＴｗｅｅｎ８０減菌溶液中にこすり落とした。収集した懸濁液を菌糸及び菌糸体断片の大部分を除去するために圧縮した数層のガーゼで濾過した。真菌構造物からの胞子放出を確実に最適化するために、必要に応じて、濾過工程前に、暗所において室温で懸濁液を攪拌し続けた。胞子濃度は、血球計チャンバ―において及び／又は寒天ペトリ皿に播種することにより測定した。
その後、懸濁液を１０．０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。３０％のグリセロールを含有する適量のＹＧＣブロスでペレットを再懸濁し、アリコートを２０℃で最大６月保存した。
液滴生成のための試料調整
アリコートを室温で解凍し、ＹＧＣブロスで１回洗浄してグリセロールを除去した。その後、５％のＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８界面活性剤を含有するＹＧＣブロスにおいて１０ｓ胞子／ｍＬの濃度に胞子を稀釈した。
検出アッセイのために、ＹＧＣブロスに蛍光発生基質ＣＦＤＡ（５（６）－カルボキシフルオレセインジアセテート）を添加した。１ｍＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に１０ｍｇの基質を溶解させることにより、基質を調製した。１０ｍＬのＹＧＣブロスに、この溶液を２８．７５μｌ添加した。
界面活性剤及び接種材料の体積による１５％稀釈係数を考慮して、最終濃度２５ｍｇ／ＬでＣＦＤＡを使用した。
エヴァグリーン油へのジクロランの添加
アセトン中において４０ｍｇ／ｍＬでジクロランストック溶液を調製した。その後、ストック溶液を稀釈して、以下の表に示す稀釈標準溶液を生成した。
Figure 0007007298000030
その後、１０μＬの適切な稀釈標準溶液を標的差異終濃度（０．５％ｖ／ｖ）（以下の表参照）となるように２ｍＬのエヴァグリーン用油に添加した。
Figure 0007007298000031
液滴生成及び分析
ＱＸ２００(tm)液滴生成器を用いた液滴生成のために、「試料」及びＤＧ８カートリッジの「油」ウェルを、それぞれ、２０μＬの調整胞子懸濁液（ＣＦＤＡあり又はなし）及び７０μＬのエヴァグリーン用油（ジクロランあり又はなし）充填した。生成工程の後、液滴エマルジョン（３０－３５μＬ／ウェル）を９６ウェルエッペンドルフプレートに移し、２８℃で４８時間放置した。分析のために、ＺＯＥＴＭ蛍光細胞イメージャにより液滴エマルジョン（２０μＬ／試料）を観察した。
結果：抗真菌化合物が存在しない場合（対照条件）、カビの菌糸は液滴膜を通過し、試料中を伝播することができ、液滴合体が生じた（図２０のＡ）。さらなる増殖により、菌株の胞子形成がもたらされ、より大きな液滴では胞子をランダムに観察された（図２０のＢ）。場合によっては、菌株により、観察スライドの試料入口で目詰まりの原因となった菌糸体が生成された。
ジクロランを４０～１００ｍｇ／Ｌの濃度でエヴァグリーン用油に添加すると、菌糸の広がりは抑制され、カビの増殖は液滴内に限定された。図１２のＡ～図２９のＢは、いくつかの通常の食物媒介カビ菌株（例えば、フザリウム・グラミネアラムＤＳＭ１０９６、ムコール・ラセモサスＣＥＣＴ２０８２１、アスペルギルス・レストリクタスＣＥＣＴ２０８０７、ペニシリウム・ヒルスツムＡＴＣＣ１６０２５、及びユーロチウム・ルブラムＣＥＣＴ２０８０７）についてのジクロランによるカビ伝播の阻害の例を示す。図２２及び図２８は、蛍光発生基質ＣＦＤＡをＹＧＣブロスに添加したときに、液滴における菌糸の制限により、どのようにカビに対して陽性の液滴の検出を改善するかを示す。なお、ジクロラン溶液をアセトンで調製したので、試験した各カビ菌株について、アセトン単独（０．５％ｖ／ｖ）による菌株の阻害の有無を調べた。
１４．ローズベンガル又はエニルコナゾールによる液滴の水相の外側におけるカビの増殖の阻害
目的：液滴の油相に抗真菌剤（例えば、ローズベンガル又はエニルコナゾール）を含有させることで、液滴の水相の外側におけるカビの増殖が阻害されるかどうかを決定する。
材料：
Figure 0007007298000032
Figure 0007007298000033
Figure 0007007298000034
方法：
・ローズベンガルをエタノールに溶解し、１５０ｍｇ／Ｌの濃度でエヴァグリーン用油に添加した。油相におけるエタノールの最終濃度は、０．５％（ｖ／ｖ）であった。
・エニルコナゾールをアセトンで調製し、０．５ｍｇ／Ｌの濃度でエヴァグリーン用油に添加した。油相におけるアセトンの最終濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）であった。
・胞子懸濁液をＹＧＣブロス中において１０５胞子／ｍＬの濃度で、陽性の液滴（１つの細胞を含有する）１０滴のうち１滴の割合となるように封入した。適切な殺菌剤を補充したエヴァグリーン用油で液滴エマルジョンを調製した。
・その後、液滴を移して、２８℃で２４～４８時間放置した。
・培養後、ＺＯＥＴＭ蛍光細胞イメージャにより、液滴試料を観察した。
・なお、エニルコナゾールを試験するために使用された菌株の増殖におけるアセトンの影響がないことと同様に、ローズベンガルを試験するために使用された菌株の増殖におけるエタノールの影響がないことが確認された。
結果：抗真菌化合物が存在しない（対照条件）場合、カビの菌糸は液滴膜を通過し、試料中を伝播することができ、液滴合体が生じた（図３０のＡ及び図３１のＡ）。１５０ｍｇ／Ｌのローズベンガル（図３０のＢ）又は０．５ｍｇ／Ｌのエニルコナゾール（図３１のＢ）をエヴァグリーン用油に添加すると、菌糸の広がりは抑制され、カビの増殖は液滴内に限定された。
１５．レクチンをマーカーとして用いた微生物の増殖
重炭酸ナトリウム中におけるフルオレセイン標識コンカナバリンＡ（「ＣｏｎＡ」、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｒｎｏｆｉｓｈｅｒ））溶液５ｍｇ／ｍＬをＴＣＳブロス（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）又は事前に菌株を（酵母については１マクファーランド及び細菌については０．５マクファーランドで）スパイクしたＲＰＭＩ中において稀釈した。菌株は、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラータ、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、枯草菌、又は黄色ブドウ球菌に属するものであった。この混合物を２０μＬ用いて、液滴を調製し、当該液滴を培養時間を経ることなくＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）により読み取った。
結果（カンジダ・グラブラータ、カンジダ・トロピカリス、及び大腸菌については図３２、３３、及び３４）及び以下の表により、カンジダ（すなわち、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・パラプシローシス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラータ）を直接及び特異的に検出できるが、大腸菌等の細菌は蛍光を発せず、検出できないことが示された。
Figure 0007007298000035
カンジダ・クルセイを用いた他のアッセイでは、液滴生成工程の前に、最大１０％の血液を添加した。Ｔ０においてＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャ（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ）を用いて試料を読み取った。図３５は、試料の可視画像と緑色蛍光画像との合成画像を示す。図３５において、赤血球は灰色であり、カンジダ・クルセイ細胞は緑色蛍光を発していた。この結果により、試料中のカンジダ種が１０％の血液を含有していたとしても、その存在をＣｏｎＡを用いて特異的に検出できることが実証された。
１６．液滴のゼラチン化
目的：ゲル化剤を含有することにより、液滴において酵母菌株が増殖したときに、液滴サイズの減少が防止されるかどうかを決定すること。
材料：
Figure 0007007298000036
Figure 0007007298000037
Figure 0007007298000038
方法：
・炭酸カルシウム（０、０．５、又は１ｇ／Ｌ）及びアルギン酸ナトリウム（０、２．５、又は３．５ｇ／Ｌ）を補充した減菌ＹＧＣブロスを培養培地として用いた。
・液滴の有効なゼラチン化を観察するために、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１、出芽酵母ＤＳＭ１３３３、及びデバリオマイセス・ハンセニイＣＬＩＢ１９７の細胞を封入した。
・特に明記しない限り、０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸を含有するエヴァグリーン用油を用いて液滴を生成した。
・液滴エマルジョンを２８℃で２２～４８時間培養し、ＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャにより観察した。
結果：図３６のＡ～図４２のＤは、液滴のゲル化の結果を示す。図３６のＡ及びＢは、２２時間培養後の、非ゲル化（図３６のＡ）及びゲル化（図３６のＢ）液滴におけるカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１の増殖を示す。液滴は、ＹＧＣ培養ブロスに３．５ｇ／Ｌのアルギン酸ナトリウム及び１ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを補充することにより、ゲル化された。ゲル化された液滴の形状の変化は観察されなかった。ゲル化は、細胞増殖でのみ視認された。細胞は動きを示し、非ゲル化液滴に散乱した。細胞は埋め込まれたように見え、ゲル化した液滴ではマイクロコロニーとして増殖した。
アルギン酸ナトリウム又は炭酸カルシウムの存在単独ではゲル化が生じないことを確認するため、アルギン酸ナトリウム及び炭酸カルシウムをカンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１（図３７のＡ～Ｄ）又は出芽酵母ＤＳＭ１３３３（図３８のＡ～Ｄ）を用いた対照アッセイで別々に試験した。図３７のＡ～Ｄ及び図３８のＡ～Ｄは、２４時間培養後の液滴における微生物の増殖を示す。微生物は、（Ａ）ＹＧＣブロス；（Ｂ）２．５ｇ／Ｌのアルギン酸塩を補充したＹＧＣ；（Ｃ）０．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを補充したＹＧＣ；又は（Ｄ）２．５ｇ／Ｌのアルギン酸塩及び０．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを補充したＹＧＣにおいて増殖させた。液滴のゲル化は、陽性の液滴におけるマイクロコロニーの生成（図３７のＤ及び図３８のＤ）によって示されるように、アルギン酸ナトリウム及び炭酸カルシウムが同時に存在する場合のみ生じた。他のアッセイ（図３７のＡ～Ｃ及び図３８のＡ～Ｃ）では、細胞は運動性を示し、拡散した。矢印は、陽性の液滴の例を示す。
図３９のＡ～Ｃ及び図４０のＡ～Ｃは、油相に酢酸を添加せず酸性化酵母株及び非酸性化酵母株用いた実験結果を示す。図３９のＡ及び図４０のＡは、陰性対照を示す。出芽酵母ＤＳＭ１３３３（図３９のＢ及び図４０のＢ）又はデバリオマイセス・ハンセニイＣＬＩＢ１９７（図３９のＣ及び図４０のＣ）は、１ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを補充したＹＣＧブロス中において、培養後２４時間増殖させた。酸化サッカロミセス株のみの存在下で、炭酸カルシウムは部分的に解離した。非酸化デバロマイセス株では、陰性対照と同様に、炭酸カルシウムの粒子が観察された。矢印は、陽性の液滴の例を示す。
図４１のＡ～Ｄは、出芽酵母ＤＳＭ１３３３を含有する液滴を２４時間培養した後の酢酸の存在下（図４１のＡ及びＣ）及び非存在下（図４１のＢ及びＤ）でのゼラチン化実験の結果を示す。図４１のＡ及びＢに示すように、サッカロミセス株は、ＹＧＣブロスのみにおいて増殖した。図４１のＣ及びＢに示すように、サッカロミセス株は、２．５ｇ／Ｌのアルギン酸塩及び０．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを補充したＹＧＣブロスにおいて増殖した。ゲル化は、酢酸の存在下においても非存在下においても生じた。
図４２のＡ～Ｄは、カンジダ・アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１を含有する液滴を２４時間培養した後の酢酸の存在下（図４２のＡ及びＣ）及び非存在下（図４２のＢ及びＤ）でのゼラチン化実験の結果を示す。図４２のＡ及びＢに示すように、カンジダ株は、ＹＧＣブロスのみにおいて増殖した。図４２のＣ及びＢに示すように、カンジダ株は、２．５ｇ／Ｌのアルギン酸塩及び０．５ｇ／Ｌの炭酸カルシウムを補充したＹＧＣブロスにおいて増殖した。ゲル化は、酢酸の存在下においても非存在下においても生じた。
この結果により、ゲル化剤が液滴において酵母が増殖したときに、液滴サイズの減少が防止されることが実証された。この結果は、また、アルギン酸塩及び炭酸カルシウムを補充したＹＧＣブロス中において酸化酵母菌株を増殖させる際に、油相において酢酸が必要ないことを示している。
１７．酵母及びカビの様々な菌株の検出のためのエステラーゼ基質又はホスファターゼ基質の使用
材料：
Figure 0007007298000039
Figure 0007007298000040
Figure 0007007298000041
方法：
・ＣＦＤＡ及びリン酸アルドール（登録商標）５１５基質をＤＭＳＯに溶解し、最終濃度が２５ｍｇ／ＬとなるようにＹＧＣブロスに添加した。５０ｍｇ／Ｌのリン酸アルドール（登録商標）５１５により、いくつか実験を行った。
・ＤＭＳＯの濃度は、０．１４％（ｖ／ｖ）であった。
・ＹＧＣブロス中において１０５細胞又は胞子／ｍｌの濃度で、液滴１０滴当たり（１つの細胞を含有する）陽性の液滴１滴の割合となるように細胞懸濁液を封入した。カビアッセイのために（液滴における菌糸の成長を限定するために）ジクロランを補充したエヴァグリーン用油により液滴エマルジョンを調製した。
・その後、液滴を移し、２８℃で２４時間（図４３のＡ～図４５のＢ、図４７のＡ～Ｄ、及び図４９のＡ～図５２のＤ）又は４８時間（図４６のＡ～Ｄ及び図４８のＡ～Ｄ）放置した
・培養後、エステラーゼ（ＣＦＤＡ加水分解）又はホスファターゼ（リン酸アルドール（登録商標）５１５加水分解）活性の検出のために、ＺＯＥ(tm)蛍光細胞イメージャにより液滴試料を観察した。
結果：図４３のＡ～図４８Ｄは、２５ｍｇ／ＬのＣＦＤＡの非存在下又は存在下で増殖した酵母及びカビの様々な菌株の画像を示す。所与の微生物を示す図のために、酵母及びカビの菌株を記載した上記表を参照されたい。ＣＦＤＡの非存在下では、酵母又はカビが増殖した液滴において蛍光は観察されなかった。ＣＦＤＡの存在下では、微生物のエステラーゼ活性により、基質が加水分解され、蛍光化合物が放出され、酵母又はカビが増殖した液滴において緑色の蛍光が発生した。これにより、特定の基質を使用して、液滴における微生物を同定できることが実証された。
図４９のＡ～図５２のＤは、５０ｍｇ／Ｌのリン酸アルドール（登録商標）５１５（図４９のＡ～図５０のＢ）又は２５ｍｇ／Ｌのリン酸アルドール（登録商標）５１５（図５２のＡ～Ｄ）の非存在下又は存在下で増殖した酵母及びカビの様々な菌株の画像を示す。所与の微生物を示す図のために、酵母及びカビの菌株を記載した上記表を参照されたい。リン酸アルドール（登録商標）５１５の非存在下では、酵母又はカビが増殖した液滴において蛍光は観察されなかった。リン酸アルドール（登録商標）５１５の存在下では、微生物のホスファターゼ活性により、基質が加水分解され、蛍光化合物が放出され、酵母又はカビが増殖した液滴において赤色の蛍光が発生した。これにより、特定の基質を使用して、液滴における微生物を同定できることが実証された。
１８．大腸菌の検出のためのグルクロニダーゼ基質の使用
材料及び方法：
・１００ｍｇ／Ｌのレソルフィン－β－Ｄ－グルクロン酸メチルエステルＴＭを補充したペプトン－アルギン酸－塩ブロスを大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２でスパイクした。
・その後、１／１０の液滴が単一の細菌細胞を含有するように、バイオ・ラッド液滴生成器及びエヴァグリーン油を用いて液滴を生成した。
・単層において液滴を３７℃で６時間培養し、明視野チャネル（図５３のＡ）又は赤色蛍光フィルタ（図５３のＢ）を用いてＺＯＥ(tm)蛍光細胞撮像システムにより撮影した。
結果：細菌増殖（Ｇ）を示す液滴において、大腸菌株のグルクロニダーゼによるレソルフィン－β－Ｄ－グルクロン酸メチルエステルＴＭ基質の開裂により、明るい赤色蛍光が生じた。これにより、特定の基質を使用して、液滴における微生物を同定できることが実証された。
上述の発明は、理解を明確にするために例示及び実施例としてある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲内において種々の変更及び修正が可能であることが当業者に理解されよう。また、本開示を通して、特許、特許出願、特許刊行物、雑誌、書籍、論文、及ぶウェブコンテンツ等の本明細書で提供される各参考文献は、参照により個々に援用されるかのように、参照によりその全体が、あらゆる目的のために、本明細書に援用される。本願と本明細書において提供される参照との間に矛盾が生じる場合、本願が優先するものとする。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容を明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書で使用されるように、「約」という用語は、提示された数字、及び提示された数字との差が１０％以内の任意の値を示す。したがって、「約５」は、４．５及び５．５を含む４．５～５．５の任意の値を指す。

Claims (10)

  1. 試料中における微生物の有無を判断する方法であって、
    ｉ）複数の油中水エマルジョンの液滴に前記微生物を含む試料を封入し、前記油中水エマルジョンの液滴は、微生物増殖培地をさらに封入し、
    ｉｉ）前記複数の油中水エマルジョンの液滴を、標的微生物の増殖を許容する温度で、かつ、前記標的微生物が５～４５回倍加するのに十分な時間培養し、
    ｉｉｉ）標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定し、
    ｉｖ）少なくとも１つの油中水エマルジョンの液滴において微生物を同定したことに応答して、前記試料中に前記微生物が存在すると判断し、
    前記ｉｉｉ）の同定する工程は、複数の油中水エマルジョンの液滴中の、微生物を含む液滴の存在を示す自己蛍光を検出することを含み、
    前記標的微生物は、細菌、酵母及びカビから選択され、
    前記培養は、
    前記標的微生物が細菌であるときは、少なくとも約４時間～約１６時間、
    前記標的微生物が酵母であるときは、少なくとも約６時間～約１２時間、及び
    前記標的微生物がカビであるときは、少なくとも約８時間～約３６時間
    実施される
    判断方法。
  2. 請求項１に記載の判断方法であって、
    前記油中水エマルジョンの液滴は、標識タンパク質をさらに含有し、
    前記油中水エマルジョンの液滴は、溶解剤を含有せず、
    前記標的微生物を含有する油中水エマルジョンの液滴を同定することは、前記標識タンパク質を検出することを含み、
    好ましくは、前記油中水エマルジョンの液滴は、牛血清アルブミンをさらに含有する
    判断方法。
  3. 請求項１又は２に記載の判断方法であって、
    前記試料は、環境試料、レクリエーションの主体となる水から取得した水、表面から採取される試料、臨床試料、又は食品マトリックスである
    判断方法。
  4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の判断方法であって、
    前記微生物増殖培地は、
    （ａ）部分的に消化されたタンパク質、
    （ｂ）緩衝ペプトン水（ＢＡＭ培地Ｍ１９２）、又は
    （ｃ）界面活性剤
    を含む
    判断方法。
  5. 請求項４に記載の判断方法であって、
    （ｉ）前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤であり、好ましくは前記非イオン性界面活性剤がポロキサマーであり、より好ましくは前記ポロキサマーの分子量が約１，８００ｇ／ｍｏｌであり、最も好ましくは前記ポロキサマーがポリオキシエチレンを約８０％含み、又は
    （ｉｉ）前記微生物増殖培地は、界面活性剤を少なくとも約０．０１％～約５％の濃度で含む
    判断方法。
  6. 請求項１から５のいずれか１項に記載の判断方法であって、
    前記培養の前において、前記封入した微生物増殖培地のｐＨは約７．２である
    判断方法。
  7. 請求項３に記載の判断方法であって、
    前記食品マトリックスは、動物性タンパク質、乳製品、チーズ、牛挽肉、ハム、低温殺菌されていない牛乳、植物、又は２０～４５％の脂肪を含む
    判断方法。
  8. 請求項１から３のいずれか１項に記載の判断方法であって、
    （ａ）陽性の液滴の数を決定すること及び陰性の液滴の数を決定することが前記複数の油中水エマルジョンの液滴における自己蛍光を検出することを含み、前記陽性の液滴の数が前記自己蛍光の存在を示した液滴の数であり、前記陰性の液滴の数が前記自己蛍光の存在を示さなかった液滴の数であり、
    （ｂ）前記陽性の液滴の数を決定することは、さらに、単一の液滴における複数の標的微生物の包含を勘定するためにポアソン分布補正を適用することにより、前記陽性の液滴の数を補正することを含む
    判断方法。
  9. 請求項８に記載の判断方法であって、
    前記陽性の液滴の数を決定すること及び前記陰性の液滴の数を決定することは、検出デバイスの検出領域を連続的に移動する前記液滴からデータを収集することを含む
    判断方法。
  10. 請求項９に記載の判断方法であって、
    好ましくは、前記標的微生物がカビであり、前記油相が少なくとも１つの抗真菌剤を含み、
    より好ましくは、前記少なくとも１つの抗真菌剤は、２，６－ジクロロ－４－ニトロアニリン、４，５，６，７－テトラクロロ－２'，４'，５'，７'－テトラヨードフルオレセイン、（ＲＳ）－１－［２－（アリルオキシ）－２－（２，４－ジクロロフェニル）エチル］－１Ｈ－イミダゾール、及びキトサンからなる群から選択され、
    最も好ましくは、
    （ａ）前記２，６－ジクロロ－４－ニトロアニリンの濃度は、約５ｍｇ／Ｌ～約２００ｍｇ／Ｌであり、
    （ｂ）前記４，５，６，７－テトラクロロ－２'，４'，５'，７'－テトラヨードフルオレセインの濃度は、約５０ｍｇ／Ｌ～約３７５ｍｇ／Ｌであり、又は
    （ｃ）前記（ＲＳ）－１－［２－（アリルオキシ）－２－（２，４－ジクロロフェニル）エチル］－１Ｈ－イミダゾールの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌである
    判断方法。
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