JP4472345B2 - 複数パラメータースクリーニングおよび複数機能性小分子産生細胞への進化方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本出願は、ＰＣＴ／ＤＫ０２／０００５７（２００２年１月２５日出願）の一部継続出願であり、かつデンマーク特許出願番号ＰＡ ２００２ ０１１７４（２００２年８月１日出願）に基づく優先権を主張し、両者はその全体が引用により本明細書に含まれる。

上記出願または本出願に引用される全ての特許および非特許文献もまた、その全体が引用により本明細書に含まれる。

［発明の分野］
本発明は、少なくとも２つの既定の機能性を満たす化合物を産生する細胞を選択する分野に関する。本発明は、基本的には、新規遺伝子構築物を有する宿主細胞により作り出される小分子に関する２またはそれ以上の機能性について細胞をスクリーニングする方法に焦点を合わせている。本発明のある局面における方法は、小分子に関する少なくとも２つの既定の機能性を獲得するよう細胞を進化させる方法と組み合わされる。更に、本発明は、第一の機能性および少なくとも１つの更なる第二の機能性により選択されるリード化合物の生成方法に関する。本発明の方法は、特に、ハイスループット・スクリーニングに使用することができる。

［発明の背景］
スクリーニングおよび選択
自動化スクリーニング方法を用いて細胞を所定の機能性についてスクリーニングする方法は、従来から知られている。そのような方法の例には、以下のものが含まれる：

ＵＳ ２００１００４１３３３ Ａ１(Short & Keller)は、中でも、適した生物に形質転換されたポリヌクレオチド・ライブラリーをＦＡＣＳ(蛍光細胞分析分離装置)にてスクリーニングする方法を開示する。該ライブラリーをスクリーニングして、当該混合物が１またはそれ以上の特定の活性を有するかを決定することができる。別の可能性は、ｓｃｖｆ（一本鎖可変領域断片）ライブラリーを、複数の結合標的（複数種類のエピトープ、複数種類の受容体）に対してスクリーニングし、相異なる結合特性を有する多数のｓｃｖｆを得ることである。

ＵＳ ６，１７４，６７３(Diversa)は、ライブラリーの共カプセル封入物の使用およびＦＡＣＳと組み合わせたアッセイを開示する。基質混合物を用いて、対象とする複数の酵素活性を同時にまたは連続して検出することができると推測される。ＦＡＣＳ装置は相異なる波長の蛍光を発する分子を検出することができるので、相異なる波長で蛍光を発して相異なる酵素活性を示す基質を用いることができる。

ＷＯ ９８／５８０８５(Diversa)は、ＵＳ ６，１７４，６７３のものと非常に良く似たスクリーニング方法を開示する。その記載によると、クローンを発現させて骨格構造物を生じさせることができ、その後それを代謝に富んだ宿主において修飾し、最終的に対象とする活性についてスクリーニングすることができる。あるいは、クローンを発現させて小分子を直接生じさせることができ、それを、対象とする活性についてスクリーニングすることができる。更に、「マルチプレックス（Multiplex）」スクリーニングおよび／またはエンリッチを可能とするため、複数のプローブを設計し利用することができる。「マルチプレックス」スクリーニングおよび／またはエンリッチとは、複数の同時並行スクリーニングにおいて１以上の所望の結果についてスクリーニングし、かつ／または豊富に（エンリッチ）することを意味する。

ＵＳ ５，８３７，４５８(Maxygen)は、反復配列組換え（recursive sequence recombination）の方法に関する。様々なスクリーニングおよび選択の方法が記載されており、これらの中に、ゲル・マイクロドロップおよび該ゲル・ドロップに組み込まれたレポーター細胞を用いるｆａｃｓの使用がある。

ＷＯ ００／０８２１２(Cellay)は、生物学的物質(例えば細胞、ウィルス、染色体)の集団を封入しているゲル微小液滴の集団を形成し、それにより少なくとも幾つかのマイクロドロップが各々１つの物質を封入しており、そのマイクロドロップの集団を少なくとも１つのマイクロドロップ中の物質における相補的配列にハイブリダイズするプローブと接触させ、その少なくとも１つのマイクロドロップを単離することに関する。

ＷＯ ９８／５８０８５(Diversa)は、発現ライブラリーをスクリーニングするためのＦＡＣＳの使用に関し、ここでは該ライブラリーをその「スクリーニング」と共に封入することができる。

ＷＯ ０１／３２８２９(Novo Nordisk)は、ＤＮＡライブラリー由来の宿主細胞をスクリーニングする方法を開示する。該宿主細胞は「試料」に入れられ、該試料中への生産物の分泌が蛍光を用いて検出される。更なる特徴は、宿主細胞の分泌と蛍光との間の対比手段の構築である。その対比手段とは、試料と蛍光標識との間の化学結合のような物理的連結である。細胞と分泌産物との間の接触が失われないことが利点である。

前述のように、ほとんどの従来技術は、改変された酵素または改変抗体の開発に焦点を合わせている。すべての文献に共通するのは、それらが、細胞を１度に１つの機能性についてスクリーニングすることに焦点を合わせていることである。

レポーターシステムの開発に焦点を絞った他の文献は、１つ１つを区別することができる相異なるレポーターシステムを備えることの可能性について示している。

ＵＳ ６，０２０，１９２(University of Florida)は、ヒト化緑色蛍光タンパク質遺伝子に関する。相異なる色を生じるＧＦＰにより、複数のレポーター遺伝子を同時に使用することが可能となることが示されている。例として、相異なる発色をしたＧＦＰを、細胞培養混合物において複数の細胞集団を同定するのに使用できることが述べられている。他の選択肢として、１つの細胞、組織または生物内部で、複数のタンパク質の位置を探知し、決定することが含まれる：２つの相異なるプロモーターに由来する遺伝子発現を、同じ細胞、組織または生物において測定する差動的プロモーター解析（differential promoter analysis)；および混合細胞集団のＦＡＣＳソーティング。同じ細胞内に存在する相異なる特性について同時にスクリーニングするために、区別可能なレポーター遺伝子を使用する概念については開示されていない。

Metcalfら（1993, Gene 129:17-25)は、複数のレポーター遺伝子を同時に使用することを可能とする複数欠失大腸菌変異体を開示し、また、Woodら（1989, Science 244:700-702)は、生物発光の場合に相異なる色を発するルシフェラーゼを産生する、幾つかのルシフェラーゼ遺伝子を開示する。複数のレポーター遺伝子が必要とされる実験において、これらが有用であり得ることが述べられている。

これらの複数のレポーターシステムは、１つの細胞における２以上の酵素の存在をスクリーニングするのに有用であり得るが、それらは、宿主細胞によって産生された小分子に関する性質についてスクリーニングすることに焦点をあてたものではない。

ＷＯ ９８／４１８６９(Chromaxome)は、スクリーニングアッセイを、時間的および空間的に、微生物における天然物合成と組み合わせるよう設計されたドラック・スクリーニング方法を開示する。本文献は、ドラック・スクリーニングのための天然物を産生する産生生物を含むゲル液滴であるスクリーニングユニットおよび所望の生物活性を検出または測定するアッセイシステムを提供する。産生生物は、そのライフサイクルのうち、天然物、例えば二次代謝物の産生に適した相にある時に、アッセイシステムとともにスクリーニングユニットに封入される。産生生物は、該産生生物によって産生された化合物が該アッセイシステムと接触した状態になれるように、アッセイシステムと同じユニット内に空間的に連関して存在する。化合物が所望の活性を有する場合、アッセイシステムはそのスクリーニングユニットを同定および／または単離することができるシグナルを生じるであろう。本文献は、薬理学的機能性以外の化合物の機能性については問題としていない。従って、製薬的化合物を最適化するため、多くのラウンドの連続的スクリーニングを行わなければならず、標準的な創薬において見られるように、第一ラウンドで見つかった化合物のほとんどがすべての基準を満たしていない。さらに該システムは、産生生物における遺伝子発現を調節することができないので、細胞周期に依存する。

ＵＳ ２００１００４７０２９(Handelsmanら)は、スペクトルの広い抗生物質活性および抗真菌活性を発揮するトリアリルカチオン性化合物、該化合物を含有する医薬組成物、および該化合物を用いて細菌または真菌感染を処置する方法を開示する。該化合物は、もともと２５，０００から成る土壌由来の環境性細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリー（ｅＤＮＡ）をスクリーニングすることによって単離された。少なくとも１つのクローンがダークブラウンのメラニン様化合物を産生し、それが抗生物質活性を有することがわかった。該化合物は単離され、新規合成された。陽性クローン内部から、４−ヒドロキシフェニルピルベート酵素ファミリーのメンバーと高度な配列類似性を共有する単一のオープンリーディングフレームが、大腸菌上で少なくとも１つの被験化合物を産生させるのに必要かつ十分であることがわかった。

ＷＯ ８９／１０５６６(MASSACHUSETTS INSTITTUTE OF TECHNOLOGY)は、ゲル微小液滴内部で結合部位において分子を捕らえる方法を開示する。本方法はまた、捕らえられた分子に基づいて細胞を測定または単離することを可能にする。本方法には、細胞から分泌または放出された分子のための結合部位を有するゲル微小液滴の創出(ゲル微小液滴)が関与する。任意で、ゲル微小液滴をインキュベートし、その後ゲル微小液滴結合部位において捕らえられた分子の存在を測定することができる。本方法は、測定および測定に基づいた細胞の単離を可能とし、あるいは、測定無しに単離することを可能とする。この発明はまた、このようなゲル微小液滴を形成し使用する方法として、ゲル微小液滴の測定を増強するマーカー物質を含有するゲル微小液滴を含む。

ＷＯ ００／１７６４３(Cellomics Inc)およびＷＯ ９８／３８４９０(Biodx Inc)は、生物活性化合物の添加に対する細胞の生理学的応答を監視するためのシステム、方法およびスクリーニングを開示する。高内容量の空間的情報および生理学的活性、生化学的活性および分子活性の変化についての時間的情報と、ハイスループットとを、細胞レベルおよび細胞以下のレベルで組み合わせた方法が開示される。これらの方法は、複数のタイプの細胞反応を同時に研究することを可能にする。それ故本システムは、リード化合物のさらなる特性付けに、または生物活性物質の存在について環境由来の試料を調べるのに適している。しかしながら、これらの方法は細胞の固定に依存するので細胞を破壊し、生きた細胞を取り戻すことができず、それ故所望の化合物を産生する細胞を取り戻すことを目的とするスクリーニングにとっては役に立たない。さらに、該システムは９６または３８６ウェルのマルチウェルフォーマットに基づいており、従って非常に大きな集団（１０^６−１０^１２）をスクリーニングする場合に必要とされる極めて高度のハイスループットには適していない。該システムはまた、既知の化合物の複数の局面についての情報を示すことができるのみである。それらは、複数のパラメーターに関して小分子を最適化する方法は提供しない。

医薬品開発
医薬品開発は、化合物の、所望の生物学的作用を発揮する能力、例えば細菌の成長を阻害する能力、標的酵素の活性を阻害する能力、神経伝達物質の取り込みを増強または調節する能力等に基づいた、リード化合物の同定に始まる。生物学的活性は、典型的には、迅速に候補薬物を同定するため設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験またはアッセイに基づいて測定される。更なる開発は処理量が低く、医化学者に依存して一週間にほんの少数（１−５）の化合物しか最適化できないため非常に費用がかかるので、典型的には、その選択基準は試験した化合物のうち数パーセントのみを選択するよう非常に厳しいものでなければならない。

一旦候補またはリード化合物が同定され、さらなる開発のため選択されると、そのＡＤＭＥ／ＰＫ特性が決定される。ＡＤＭＥ／ＰＫは、体内における薬物の吸収、分布、代謝、排泄および動態と関係がある。薬物のＡＤＭＥ／ＰＫ特性は重要であり、しばしば医薬製品と単なるリード化合物と区別するのに役立つ。例えば、経口で吸収が悪い薬物は効果を示発揮させるために静脈内（または非経口）投与する必要がある場合があるが、処置対象の病気によっては許されないことがある。抗生物質として効果的な化合物でも、中枢神経系に送達されない場合には、細菌性髄膜炎に効果がない場合がある。急速に代謝および／または排泄される化合物は、その意図した目的を果たすのに十分な時間体内にとどまらない場合がある。

従って、薬物として使用可能な化合物については、複数の機能的要求を満たさなければならない。それは標的と相互作用しなければならず、所望の方法で標的に影響をおよぼさなければならない。同時に、それは、他の多くの標的（似ている場合が多い）と相互作用すべきではなく、あるいは重大な非特異的作用を有するべきではない。それから、それはさらに適切な物理学的−化学的パラメーターを有し、許容される方法で代謝されなければならない。

この本質的な困難性および複雑さのため、薬物を発見し、開発する方法は非常に成功率が低く、極めて高価であり（成功した１化合物につき＄６００ｍｎ）、そして非常に時間がかかる（発見から臨床までに約８−１２年）。前臨床開発へ進む化合物を生じるのは１５の１次スクリーニングのうち１つにすぎず、市場に出るのは１０のこれら化合物のうちたった１つである。平均的製薬会社は、臨床に入る各化合物について２５０マン・イヤーの研究および開発活動を費やす。結果として、ほとんどの製薬会社は、投資家を満足させるのに必要なペースで新薬を売り出すことができていない。

従って、当業界においてリード化合物を生み出す方法を開発する必要がある。当然、最適化化合物は複数の要求を満たさなければならない。従って、本発明は、医薬品開発における主な障害の１つを扱う。

［発明の概要］
本発明の目的は、２またはそれ以上の所望の性質または機能性について細胞または細胞組成物をスクリーニングすることである。本発明の細胞のスクリーニングの背後にある本質は、個々の細胞において大きな遺伝子の多様性を、および細胞組成物において細胞間で大きな遺伝子の多様性を生み出し、該組成物をスクリーニングにかけ、任意で進化させることである。２またはそれ以上の所望の性質または機能性を有する１またはそれ以上の化合物を産生する細胞を進化させるため、遺伝子が細胞間で交換され得る。

第一の局面において、本発明は、少なくとも１つの化合物を産生する細胞を、該化合物の２またはそれ以上の機能性についてスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
ａ）少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を各々有する細胞であって該異種性配列の少なくとも１つが該細胞において人工染色体上に位置する細胞、を含む細胞組成物を準備し、ここで該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含み（それら細胞は産生細胞と称する）、
ｂ）該機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについて該細胞集団の１度のスクリーニングを行い、そして各パラメーターについて選択基準を決定し、
ｃ）少なくとも１つの既定の選択基準を満たす細胞を選択する。

本発明は、複数の異種性遺伝子を宿主細胞へ挿入し、宿主細胞によって合成される小分子に起因する２またはそれ以上の機能性についてこれら細胞をスクリーニングすることを介して、新規遺伝子組み合わせを形成する方法を提供する。２またはそれ以上の機能性を一回のスクリーニング・ラウンドにおいて組み合わせることにより、スクリーニング工程が迅速化され、すべての基準を満たす化合物が同定される見込みが上昇する。本発明はまた、例えば薬理学的標的に対して活性があるのみならず、同時に他の基準、例えばＡＤＭＥＴパラメーターまたは薬物動態学的パラメーターに関する基準を満たす化合物を合成する能力のある細胞を同定可能にする。本発明の方法によって同定される細胞により合成される化合物は、薬理学的標的に対する活性のみに関して同定されるのではないため、薬になる見込みがより高くなり得る。段階ａ）において規定される細胞は、スクリーニングされ、かつ選択される化合物を産生するので、産生細胞と呼ぶことができる。これは、スクリーニングおよび選択に関連して用いられ得るレポーター細胞とそれらを区別するためである。

ある好ましい態様によれば、遺伝子発現を調節することができるように、その発現カセットのプロモーターを調節することができる。そのようなシステムにおいては、遺伝子発現は細胞周期に依存せず、新規化合物が発見される可能性が増大する。

人工染色体に含まれる発現カセットの設計および組み立ておよび多くの可能性のある起源は、本発明の詳しい説明の部分に記載される。人工染色体以外の他のベクターも異種性発現可能ヌクレオチド配列を宿すために使用することができるが、人工染色体は大きな遺伝子挿入物を宿すことができ、また特に選択的遺伝子マーカーが該人工染色体に挿入される場合には該細胞において安定して複製することできるので、これらは全て実質的には宿主細胞に挿入された１またはそれ以上の人工染色体上に存在することが好ましい。

スクリーニングおよび選択がなされる化合物は、細胞内に含まれても、あるいは細胞から分泌されてもよい。本発明の好ましい態様によれば、選択される化合物は、酵素活性による産物、即ち、選択された細胞に存在する少なくとも１つの酵素によって合成または変換された非天然一次または二次代謝物である。より好ましくは、本発明の化合物は、少なくとも２つの酵素の活性が組み合わせて産生され、これら酵素の少なくとも１つは異種性発現可能ヌクレオチド配列によりコードされており、その配列は好ましくは人工染色体に位置する。本態様によると、化合物の定義には、ポリヌクレオチドまたは翻訳産物は包含されない。一方、本発明はまた、相異なる起源由来の相異なるタンパク質サブユニットを組み合わせることにより最終的に新規タンパク質および酵素を創出し得るが、これらは直接的には選択されない。

本発明の多くの適用うちの１つは、薬物または薬物候補の開発である。それ故、少なくとも１つのパラメーターは、薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターであることが多い。これは、同じ薬理活性の２つ以上の局面について、例えば転写因子の活性化／非活性化について、および該転写因子によって制御される１またはそれ以上の遺伝子の発現についてのスクリーニングの態様においてあり得る。別の態様においては、所望の薬理活性について、および望ましくない薬理活性の欠如についてのスクリーニングであり得る。本局面における別の態様においては、少なくとも１つのパラメーターは薬理学的標的に対する活性に関し、そして少なくとも１つの更なるパラメーターはＡＤＭＥパラメーターである。本発明はまた、上記パラメーターを例えば任意の順序での組み合わせて利用するスクリーニング方法を提供する。複数の基準に基づき化合物を最適化することにより、高価な臨床試験に合格する可能性の高くなった薬物候補を同定することができる。

薬理学的標的に対する活性に関するパラメーターは、以下のうちの１またはそれ以上であってよい：
リガンドである薬理学的標的との相互作用または非相互作用、
酵素である薬理学的標的との相互作用または相互作用の欠如、
受容体である薬理学的標的との相互作用または非相互作用、
薬理学的標的をコードする遺伝子または遺伝子の組の発現の阻害または増強
（発現の阻害または増強は、化合物の、標的遺伝子のプロモーター配列に結合する能力、または転写因子に結合する、またはしない能力に起因し得る）、
レポーター細胞、例えば特定の生理的段階にあるレポーター細胞の成長の阻害または刺激（このレポーター細胞は、細菌、真菌、原生動物、蠕虫、藻類、植物、無脊椎動物、脊椎動物、哺乳類細胞、ヒト体細胞、病原性微生物、農業害虫、細胞内病原体に感染した細胞、ウィルス感染細胞、腫瘍細胞よりなる群から選択することができる。レポーター細胞はまた、細菌、真菌、原生動物、藻類、植物、無脊椎動物、昆虫、緩歩動物、寄生虫、農業害虫などの生存生物そのものであってもよい。

好ましくは、本発明は、２以上のパラメーターの既定の値を満たす細胞を選択すること、例えば各パラメーターの既定の値を満たす細胞を選択することを含む。図１に示すように、スクリーニングの初期のラウンドでは幾つかの選択基準のうち１または数個を満たす細胞を選択することを選んでもよく、スクリーニングの後期のラウンドで全ての選択基準を満たす細胞が選択されることが多い。

細胞に対していくつのスクリーニングでも同時に行うことができる。例えば、２またはそれ以上の機能性に関する少なくとも３つのパラメーターについてスクリーニングすることができる。また、２またはそれ以上の機能性に関する少なくとも４つのパラメーターについてスクリーニングすることもできる。該方法が２またはそれ以上の機能性に関する少なくとも５つのパラメーター、例えば少なくとも６つのパラメーター、例えば少なくとも７つのパラメーター、例えば少なくとも８つのパラメーター、例えば少なくとも９つのパラメーター、例えば少なくとも１０のパラメーター、例えば少なくとも１５のパラメーター、例えば少なくとも２０のパラメーター、例えば少なくとも２５のパラメーター、例えば少なくとも５０のパラメーターについて少なくとも１度のスクリーニングを行うことを含むように、より多くの数も可能である。

選択基準のタイプおよび強さは、以下に更に記載するように、少なくとも何回か繰り返す間に変化または増強してもよい。

本発明の別の局面は、２またはそれ以上の既定の機能性を有する化合物を少なくとも１つ産生する細胞を進化させる方法を用いて化合物を最適化する方法であって、以下の段階を含む方法に関する：
ａ）少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を有する細胞であって該異種性配列の少なくとも１つが該細胞において人工染色体上に位置する細胞、を含む細胞組成物を準備し、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含み（それら細胞は産生細胞と称する）、
ｂ）該機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについて該細胞集団の１度のスクリーニングを行い、各パラメーターについて選択基準を決定し、
ｃ）少なくとも１つの既定の選択基準を満たす細胞を選択し、
ｄ）選択された細胞の発現可能ヌクレオチド配列を別の細胞組成物由来の発現可能ヌクレオチド配列と組み合わせ、それにより少なくとも１つの新規細胞組成物を得て、ここで該新規細胞組成物は少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を有する細胞であって該異種性配列の少なくとも１つが該細胞において人工染色体上に位置する細胞を含み、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含有し、
ｅ）任意で、少なくとも１つの細胞が少なくとも２つの既定の機能性を有する化合物を獲得するまで、段階ｂ）からｄ）を繰り返す。

本発明の進化方法は、人工染色体上に存在する遺伝子を協調的に発現させるため宿主細胞に挿入することができる人工染色体ベクターに多くの異種性遺伝子を集める、または挿入することに基づいて、細胞を進化させる潜在能力を兼ね備える。この発現遺伝子はお互いに、および宿主細胞の遺伝子と相互作用し、新規な、または改変された合成経路を作り出す。異種性遺伝子は、細胞の段階的進化において、他の宿主細胞由来の（場合によっては他の起源由来の）他の異種性遺伝子と組み合わされ、選択基準を満たす化合物を産生する能力が獲得される。

「発現可能配列」なる用語は、通常の意味、即ち問題の宿主細胞において発現する能力のある配列の意味で用いられる。

段階ｄ）において、発現可能配列の組み合わせは、該組み合わせが発現可能配列自体の組み合わせまたは発現カセットもしくは染色体の組み合わせのいずれであっても、１段階の工程によってあるいは幾つかの発現可能配列の混合および結合の工程によって組み合わせることができる。

段階ｅ）は、所望の機能性を有する細胞が得られるまで繰り返すことができる。従って、段階ｅ）は０から少なくとも２００回、好ましくは０から少なくとも１５０回、例えば０から１００回、例えば０から８０回、例えば０から６０回、例えば０から２０回繰り返すことができる。

スクリーニングする機能性は、そのスクリーニング・ラウンドの間の機能性である。スクリーニングする機能性は、通常最終的な所望の機能性と異なるが、ある態様においては、スクリーニングする機能性は所望の機能性と同一である。スクリーニングする機能性はまた、本明細書において既定の機能性と呼ばれる。

できる限り少ないラウンドで目的とする進化対象に到達する可能性を増大させるため、前述の別の細胞組成物は、該機能性の少なくとも１つを細胞に与えるようである発現可能ヌクレオチド配列を含有する細胞を含むことができる。その別の細胞組成物はまた、第三の機能性について事前にスクリーニングされていても良く、あるいはその別の細胞組成物は、少なくとも１つの既定のタンパク質/酵素を発現する、または少なくとも１つの既定の化合物または物質を合成する能力のある細胞を含んでもよい。さらにその別の細胞組成物は、ランダムに選択してもよく、あるいは所望の機能性に貢献する遺伝子と相同性のある遺伝子を含むように選択しても良く、または、所望の機能性の少なくとも１つを有する化合物を産生することが知られている発現状態から選択してもよい。その別の組成物はまた最初の組成物であってよく、同じ集団内の異種性発現可能ヌクレオチド配列を混合し、異種性発現可能ヌクレオチド配列の新規組み合わせを有する細胞を結果としてもたらす。

更なる局面において、本発明は、１つの産生細胞および少なくとも２つのレポーターシステムを含むスクリーニングシステムに関し、ここで各レポーターシステムは該細胞によって産生された１つの化合物の１つの機能性に関係する１つのパラメーターに対するものである。
本スクリーニングシステムは、本発明の複数パラメータースクリーニング方法および進化方法に使用することができる。

スクリーニングシステムの物理的設計は、少なくとも２つのレポーターシステムを有するゲル微小液滴の形態であってよい。それはまた、少なくとも２つのレポーターシステムを伴う半固体または液体環境であってもよい。スクリーニングシステムの物理的設計の更なる例は、本発明の詳しい説明に開示されている。

さらなる局面において、本発明は、少なくとも２つの既定の機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについて産生細胞組成物をスクリーニングすることを含む、最適化リード化合物の生成方法にであって、該細胞組成物が、各々少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を有する細胞であって該異種性配列の少なくとも１つが該細胞において人工染色体上に位置する細胞を含み、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む方法に関する。

最適化リード化合物とは、２以上の既定の機能性を有する化合物を意味する。従来、リード化合物は単に薬理学的標的に対する活性を有する場合にリード化合物として規定される。本方法によれば、リード化合物は該リード化合物を合成する能力を有する細胞と共に同定され、リード化合物として２またはそれ以上の機能性についてスクリーニングされるので、それらは例えば薬になる見込みが高い。上述したように、本方法はまた、リード化合物の開発工程を迅速化する。

好ましくは、リード化合物は薬物のリード化合物であり、少なくとも１つのパラメーターが、吸収、分布、代謝、排泄または毒性に関し、少なくとも１つの更なるパラメーターが薬理学的標的に対する活性に関する。

本発明全体を通して、２またはそれ以上の機能性についてスクリーニングすることには、密接に関係する２つの機能性について同時に、例えば同じ酵素に対して２つのアッセイを用いて、細胞をスクリーニングする可能性も含まれることが意図されており、ここで各アッセイは特異的であり、２つの密接に関係するアッセイにおいて測定される活性は異なることは理解される。しかしながら、その２またはそれ以上の機能性は、相異なる機能性に関することが好ましい。

定義
１度のスクリーニング：本明細書において、「１度のスクリーニング」なる用語は、１回の同時スクリーニングを意味し、例えば、細胞と一緒にそれぞれ各パラメーターについてのアッセイシステムである少なくとも２つの相異なるアッセイシステムを同時に有し、初めに１つのパラメーターについてスクリーニングしその後他方のパラメーターについてスクリーニングするのと対照的である。それ故、１度のスクリーニングとは、１つの細胞が、２つの相異なるスクリーニングアッセイを同時に受けることを意味する。

レポーターシステム：本明細書において、「レポーターシステム」なる用語は、１つの機能性についてのアッセイのアウトプットを表すために用いられる。レポーターシステムは、検出可能なリードアウト（readout)、好ましくは蛍光リードアウトを生じる。相異なるレポーターシステムを用いる場合、各々が相異なる(好ましくは蛍光の)リードアウトを生じる。各細胞はまた、数多くの調節可能な異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む。これらの発現可能配列は、細胞が複数の新規化合物を産生することを可能にする。そして該化合物は相異なるレポーターシステムと相互作用し、蛍光リードアウトを生じることができる。

スクリーニングユニット：本明細書において「スクリーニングユニット」なる用語は、本発明の方法に必要な相互作用を促進するため、化合物およびレポーターシステムが互いに接触した状態になり得る微小環境を表すのに用いられる。

発現可能ヌクレオチド配列：適当な宿主細胞種において、転写され、かつ要すれば翻訳される能力を有するヌクレオチド配列。

オリゴヌクレオチド
約２から１００００核酸（塩基）を有する核酸断片。

制限酵素部位
本発明の目的のため、ＲＳ_ｎ（ｎ＝１，２，３など）なる略語は、制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を指すのに用いられる。制限酵素部位は、認識配列および切断部位によて規定される。切断部位は、認識部位の中または外に位置して良い。「ｒｓ_１」または「ｒｓ_２」なる略語は、切断後の制限酵素部位の２つの末端を指すのに用いられる。配列「ｒｓ_１−ｒｓ_２」は、完全な制限酵素部位を指す。

制限酵素部位の切断部位は、平滑または突出末端のいずれを有する二本鎖ポリヌクレオチド配列を残しても良い。従って、「ｒｓ_１」または「ｒｓ_２」は、平滑または突出末端のいずれを指してもよい。

本発明全体を通して用いられる表記において、
ＲＳ１−ＲＳ２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ＲＳ２−ＲＳ１
の様な式は、個々の配列が指定された順序に従うこと意味すると解釈されるべきである。これは、例えばＲＳ２の認識配列の一部がスペーサー配列と重複することを排除しないが、ＲＳ１およびＲＳ１’を除くすべての項目が機能的であり、また切断および再組み立て後も機能的なままであることが厳に必要とされる。さらに、該式は、挙げられた項目の間に更に配列が挿入されている可能性を排除しない。例えば、本発明において以下に記載するようにイントロンが挿入されてもよく、更なるスペーサー配列がＲＳ１およびＲＳ２の間およびＴＲおよびＲＳ２の間に挿入されてもよい。重要なのは、該配列が機能的なままであることある。

更に、制限酵素部位の大きさおよび／またはその中の特定の塩基について述べる場合、認識配列内のその塩基のみについて述べる。

発現状態
発現状態は、個々の生物の特定の組織におけるある時点での状態である。遺伝子発現の変化をもたらすどのような状態変化も、違った発現状態をもたらす。相異なる発現状態は、相異なる個体、相異なる種において見られるが、同じ種または個体における相異なる器官においても見られる場合がある。相異なる発現状態は、年齢、疾患、感染、干ばつ、湿度、塩度、生体異物への暴露、生理学的エフェクター、温度、圧力、ｐＨ、光、ガス環境、毒素のような化学物質における変化など（但しこれらに限定されない）の相異なる環境条件に、その組織または器官を暴露することにより、１つの種または個体における同じ器官においても得られる場合がある。

人工染色体
本明細書で用いる場合、人工染色体（ＡＣ）は、安定的に複製することができ、かつ内在性染色体の横に分かれて存在し得るＤＮＡ小片である。真核生物にとっては、人工染色体はまた、機能的セントロメア、機能的テロメアおよび少なくとも１つの自己複製配列を含む十分な長さのヌクレオチド配列として説明することができる。人工染色体は、そこに挿入された異種性遺伝子を適合させ、また発現させる能力を有する。活性のある哺乳類セントロメアを含む場合、それは哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）と呼ばれる。植物人工染色体および昆虫人工染色体（ＢＵＧＡＣ）は、それぞれ植物および昆虫セントロメアを含む染色体を意味する。ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は、ヒトセントロメアを含む染色体を意味し、ＡＶＡＣは、鳥類人工染色体を意味する。酵母人工染色体（ＹＡＣ）は、酵母において機能的な染色体、例えば酵母セントロメアを含む染色体を意味する。人工染色体は直鎖状であっても環状であってもよい。

本明細書で用いる場合、安定な染色体維持は、少なくとも約８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９９％の細胞が該染色体を保持している場合に生じる。安定性は選択試薬の存在下にて測定する。これら染色体は、選択試薬の非存在下でも維持されることが好ましい。安定な染色体はまた、細胞培養中、その構造を保持し、染色体内再配置も染色体間再配置も被ることがない。

産生細胞種：発現カセットに含まれる２またはそれ以上の異種性発現可能ヌクレオチド配列を有する細胞の種。

［発明の詳しい説明］
以下の記載は、複数の機能性を有する化合物を産生する細胞を進化させるのに本発明のスクリーニング方法を適用する方法についての背景説明を提供する。

本スクリーニングおよび／または進化は、新規最適化分子の産生並びに商業的価値のある化合物の様々な規模での産生につながり得る。

従って、「細胞の進化」とは、遺伝子の新規組み合わせを発現することにより、細胞の表現型が新規表現型へ変化することを意味する。「組成物の進化」とは、遺伝子の新規組み合わせを発現する細胞の新規組み合わせにより、組成物の性質が変化することを意味する。この新規組み合わせは、本発明の選択方法を用いて選択される。

一定の製薬的、工業的、栄養学的その他の性質を有する分子を進化させようとするには、これら性質と一致する表現型をコードする遺伝子パターンを選択する方法が必要である。

細胞集団における各細胞は、他の細胞と遺伝学的に異なっていることを考慮すると、潜在的に１またはそれ以上の方法でそれ自身を表現し得るという変動性を本来備えている。本発明の目的では、「アウトプット」なる用語は、１またはそれ以上の発現カセットの発現の結果生じる細胞の性質を意味すると理解すべきである。その性質は、任意で１またはそれ以上の発現カセットの発現および宿主遺伝子の一定の組の発現の両方の結果として生じてもよい。

アウトプットは、様々な相異なる基準に従い測定することができる。これらの基準は、直接的に、または間接的に、最適化しようとする機能的または構造的性質と関係してよい。あるいは、それらは、反対に望ましくない機能的または構造的性質と関係してもよい。

アウトプットは、直接的に、またはレポーターコンストラクトを用いて測定することができる。本明細書の目的のため、「レポーターコンストラクト」なる用語は、細胞集団における特定の細胞または細胞サブセットが、特定のアウトプットに関してその細胞集団における他の細胞または細胞サブセットと異なるかについて測定するための、遺伝子または分子デバイスを意味すると理解すべきである。レポーターコンストラクトの例には、転写因子の活性化に応答して蛍光タンパク質を産生する遺伝子コンストラクトが含まれる。レポーターコンストラクトの別の例は、有色／蛍光酵素基質であり、その基質を異なる色／蛍光を有する別の分子へと変換する酵素がその基質に対し添加される。同様に、レポーターシステムは、基質を有色／蛍光産物に変換する酵素であってもよい。細胞が酵素を阻害するアウトプットを生じるならば、その色変化は起こらないであろう。

他のレポーターシステムには、選択基準下の細胞の生存、既定の基質を代謝可能な細胞、１またはそれ以上の周波数の電磁放射線を優先的に吸収する物質を産生可能な細胞、培地中で酵素的効力を有する細胞などが含まれ得るが、これらに限定されない。

「近接する」なる用語は、その発現コンストラクトと同じ細胞内の位置か、あるいは、該細胞に充分近く、無傷または溶解済みの細胞から拡散する、または細胞から積極的に押し出される分子の濃度が、少なくともその周辺で１ピコモルとなる位置を意味すると理解すべきである。

レポーターコンストラクトは、その発現コンストラクトが細胞に組み入れられる前でもまたはその後でも、該細胞に近接して配置され得る。レポーターコンストラクトを近接位置に組み込む方法には、標準的形質転換技術、２つの相異なる酵母接合型の接合、または細胞とレポーターコンストラクトの間を物理的に近接させるシステム、例えば細胞およびレポーターコンストラクトのゲル微小液滴同時封入などが含まれるが、これらに限定されない。

近接するレポーターコンストラクトによって、または他の手段によって測定することができる細胞のアウトプットには以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
新規スペクトル特性、
誘導されたシトクロムオキシダーゼ活性、
変化した大きさ、形態、粘性、または接着特性またはその欠如、
優れた成長、
通常成長することができない基質上で成長する能力、
毒素存在下で成長する能力、
亜致死性基質上で成長する能力、
標準必須要件非存在下で成長する能力、
１またはそれ以上の阻害物質を含む培地上で成長する能力、
変化した物理的条件、例えば温度、浸透圧、ある波長の光などの電磁放射線の下で成長する能力、
ある強さの磁場の下成長する能力、
細胞からの分泌またはその欠如、
酵素阻害の阻害または予防、
受容体の活性化、
活性化分子の受容体への結合の予防、
小分子またはタンパク質の、核酸またはペプチド配列への結合の阻害または促進、
転写または翻訳後プロセシングの翻訳の阻害または促進、
細胞内または細胞小器官内の分子の輸送または局在の変化、
細胞のＤＮＡ含量または形態における変化、
選択的単離を可能にする一定の性質を有する小分子の産生（例えば、当業者にとって全てのクロマトグラフィー原理が利用可能である）、
ある分光特性(広く可視光、電磁波、ＩＲ、ＵＶ、Ｘ線などを含むと規定される）を有する小分子の産生、
細胞分化の予防または促進を含む、細胞の形態における変化、
アポトーシス経路の誘導、
化学的指標。

複数パラメータースクリーニング
薬物として使用可能な化合物は、複数の機能的要件を満たさなければならない。それは、その標的と相互作用し、該標的の機能性に所望の方法で影響を与えなければならない。同時にそれは、他の標的（よく似ていることが多い）と相互作用すべきでなく、あるいは重大な非特異的作用を有すべきではない。さらに、それは適当な物理的−化学的パラメーターを有し、許容される方法で体によって代謝されなければならない。

この本質的な困難性および複雑性のため、薬を発見し、開発するプロセスは非常に成功率が低く、極めて高価であり（成功した１化合物につき＄６００ｍｎ）、そして非常に時間がかかる（発見から臨床までに約８−１２年）。前臨床開発へ進む化合物を生み出すのは１５の一次スクリーニングのうち１つにすぎず、市場に出るのは１０のこれら化合物のうちたった１つである。平均的製薬会社は、臨床に入る各化合物について２５０マン・イヤーの研究および開発活動を費やす。結果として、ほとんどの製薬会社は、投資家を満足させるのに必要なペースで新薬を売り出すことができていない。

現在のプロセスに代わるのは、同時に複数の性質をを目指した小分子化合物の進化であり、これら性質は、該小分子が相互作用すべき治療標的、妨げるべきでない標的、満たすべきＡＤＭＥＴ特性などに直接または間接的に関する。

複数の薬理活性
既知の標的および現在知られているこれら標的間の関係は非常に多いため、全ての既知の標的およびそれらの相互関係について記載することは本発明の範囲を超える。表１は、適当な薬理学的標的のリストを開示する。このリストは単に標的の例を示すために含まれており、本発明の範囲を限定すると解されるべきでない。

［表１］薬物標的

以下は、疾患およびこれら疾患に関与する相異なる標的および最適化化合物を開発する方法の例である。また、これら標的に対して見込みのある新規薬物が、本発明を用いていかにしてスクリーニングされ、かつ／または進化するかについての例の概略を示す。

１）対象疾患：細菌感染（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ阻害、Ｐ４５０阻害および多剤耐性黄色ブドウ球菌の成長阻害）
耐性が広く出現したことにより、細菌性疾患に対する古典的抗生物質治療の有効性が極めて制限された。抗生物質抵抗性は、主としてヒトおよび動物における過剰な、かつ多くの場合不必要な抗生物質の使用によって増幅され、結果として患者の疾病率、死亡率および保健医療の全体的費用を上昇させた。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は、現在アメリカ合衆国において最も流行している院内病原菌であり、また、腸球菌（enterococcus）は、日和見病原体として、院内感染の上位４つに入る。事実、基本的にバンコマイシンを含む全ての抗生物質に対して抵抗性のある腸球菌臨床分離株の割合は増加し続けている。従って、現在の細菌抵抗性の機序を回避することが期待されるであろうことから、新規の、または少なくとも現在認可されている抗生物質とは異なる機序により機能する阻害物質の発見に費用がつぎこまれている。

黄色ブドウ球菌は非常に重要なヒト病原体であり、ハイスループット・スクリーニングにおいて使用するのに好ましい成長特性を有する。抗生物質抵抗性株を使用すると、多剤耐性株に対して活性を有するヒットが優先的に選択されるであろう。

ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは、グラム陽性微生物の複製ＤＮＡ合成に必須であるＤＮＡポリメラーゼ−エキソヌクレアーゼ（Ｐｏｌ−Ｅｘｏ）である。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは、グラム陽性菌の複製に必須であり、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの阻害は、抗生物質抵抗性グラム陽性細菌を処置するための特異的および代替的方法を提供する。

多くの重症疾患患者は、（非感染性の）基礎疾患を処置するための他の薬物と同時に、複数の抗感染薬を投与され得る。この場合、主要なＰ４５０肝酵素により代謝されないクラスの薬物が好ましい。

望ましい治療プロファイル：
・グラム陽性菌特異的：非常に広いスペクトルを有する物質を全身投与すると、宿主の正常な消化器微生物叢に抵抗性を生み出すという、望ましくない効果が示され得る。それ故、より疾患特異的な抗生物質は、院内医薬品認可および全般的により広範に受け入れられる得るのに有利であり得る。

・経口有効性：理想的な薬物候補は、経口で有効であり、更なる製剤として静脈注射の用途を有するであろう。多様な投与が許容されるが、継続的な注入に匹敵するものは慎重に検討する必要がある。競合的治療の投与計画によって、改善されるか、または同等であることが重要である。

・安全性：理想的薬物候補は、微生物特異的であり、かつ少なくとも治療的投与範囲におけるＣｍａｘの１０倍以内で顕著な副作用および薬物相互作用を有さないであろう。

複数パラメータースクリーニング：
このように、複数パラメータースクリーニングには、黄色ブドウ球菌成長阻害、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ阻害およびＰ４５０阻害が含まれるであろう。スクリーニングは、例えば、産生細胞株のライブラリーを組換え枯草菌（Bacillus subtilis）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩによって形質転換し、併せてＰ４５０酵素およびレポーター基質を周囲の培地に含めることにより、組み立てられるであろう。そして該ライブラリーはプレートにまかれ、ＭＲＳＡ株で覆われるであろう。化合物が産生細胞の細胞壁を通過してレポーター株に到達しなければならないアッセイは、適当な溶解特性を有する化合物も選択するであろう。

図２は、このような複数パラメータースクリーニングを例示し、ここではＭＲＳＡ細胞が取り除かれた地帯に存在し、かつ所望の蛍光色の組み合わせを生じる産生細胞が選択されるであろう。

２）対象疾患：癌−固形腫瘍の成長阻害および転移の予防（ＮＦ−κＢ阻害、Ｃｏｘ−２阻害、Ｃｏｘ−１非阻害）
癌はアメリカ合衆国において死因の第二位であり、４人に１人の死因である。外科的手術の不可能な癌に対する既存の処置には、化学療法および放射線処置が含まれる。これらは、非特異的であるか、または良くても部分的に選択的なだけなので、非常に毒性が強い。腫瘍の成長を阻害し、かつ転移を予防する新規治療法が臨床上必要とされている。転移を予防し、かつ副作用を回避するかまたは最小限に抑えるように選択的機序を介して働く分子に多額の金があてられている。

核因子（Nuclear Factor）κＢ（ＮＦ−κＢ）は転写因子であり、複数の炎症性および免疫系遺伝子の発現を制御することにより、宿主防御および幾つかの発病過程に重要な役割を果たしている。その最も一般的な誘導型は、ｐ６５およびｐ５０タンパク質より構成され、通常幾つかの阻害分子の内の１つであるＩκＢとの分子複合体として細胞質に存在する。ＮＦ−κＢによって制御されるタンパク質には、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、細胞接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管内皮細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）およびＥ−セレクチン(Cancer J., 1998, 4, S92; Int. J. Biochem. Cell. Biol., 1997, 29, (6), 867)が含まれる。

ＮＦ−κＢの活性化は、誘導型シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）の合成をもたらすことができる。本酵素は、傷害または感染性物質に対する組織の応答に重要な役割を果たしており、また炎症性応答、傷の最終的回復および発癌に不可欠な要素である。幾つかの集団ベースの研究により、アスピリンその他のＮＳＡＩＤｓを定期的に使用している人の結腸直腸癌の相対リスクが４０−５０％減少していることがわかった。これら知見の分子的機序を決定する試みにより、ヒトおよび動物の結腸直腸腫瘍はいずれもＣＯＸ−２を高レベルで発現し、一方正常な腸粘膜では、ＣＯＸ−２の発現は低いかまたは検出できないことが明らかとなった。これら知見から、ＣＯＸ−２が結腸癌の成長および増悪に関与しているという仮説が立てられた（Faseb, 1998, 12, 1063）。アスピリンもＮＦ−κＢを阻害するので、これらの知見はまた、ＮＦ−κＢを阻害することにより腫瘍の成長および増悪を予防し得ることを示唆する。ＣＯＸ−２が発癌に関与していると思われる別の方法は、細胞をアポトーシスから保護することによるものである（J. Nat. Cancer Inst., 1998, 90, (11), 802）。それ故、ＮＦ−κＢを阻害すると、ＣＯＸ−２誘発性のアポトーシス保護からの保護が小さくなるので、更なる方法により腫瘍の成長の調節を助けることができる。ＮＦ−κＢの阻害はまた、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の増加をもたらし、次にアポトーシスの増加をもたらす。

ＣＯＸ−２の酵素活性を直接的阻害物質である新規分子を開発するため、多大な努力がなされている。しかしながら、単一のメディエーターを阻害しても疾患のすべての症状を取り除くことができないという例が既に存在するので(Inflamm. Res., 1997, 46, 282)、その活性をコードするそれぞれの遺伝子の発現を予防することができる新規物質を見つけることが、それに代わる方法である。

望ましい治療プロファイル：
感受性の高いＮＦ−κＢ阻害物質：ＮＦ−κＢを部分的に阻害することによって作用する幾つかの薬物が知られているが、それらは全て、他の標的との相互作用のため副作用を生じる。新規ＮＦ−κＢ阻害物質はいずれも選択的でなければならないであろう。

Ｃｏｘ−２／Ｃｏｘ−１差別的阻害活性が可能な限り低い選択的ＣＯＸ−２阻害物質：ＣＯＸ−１経路由来のプロスタノイドは、トロンボキサンＡ２を介して血小板凝集を、腸粘膜の機能および統合性を、またプロスタグランジンＥ２およびプロスタサイクリンを介して腎臓機能を制御する。Ｃｏｘ−２は、単核球、繊維芽細胞および滑膜細胞等の様々なタイプの細胞において炎症性刺激に応答して発現する。このため、ＮＳＡＩＤｓによるＣＯＸ−１阻害は消化管および腎臓毒性を伴うが、一方ＣＯＸ−２阻害は、炎症性応答の部位での炎症誘発性サイトカインの形成を制限し、さらに抗癌作用を有する。

経口有効性：この医学上の問題の深刻さを考慮すると、経口で有効な薬物が望ましいが、必須要件ではない。

安全性：理想的候補は、選択的であり、かつ重大な副作用および薬物相互作用がないであろう。しかしながら、また、多くの癌の深刻さおよび治療選択肢がないことから考えて、これらの局面において理想に届かない化合物の歴史は長い。

複数パラメータースクリーニング:
複数パラメータースクリーニングの構成は、例えば、２つの相異なる哺乳類細胞株を用いる産生細胞種ライブラリーの二重ゲルカプセル化であり得る。第一のゲルカプセルは産生細胞およびＮＦ−κＢおよびＣｏｘ−１阻害を伝える（レポートする）哺乳類細胞を含み、一方第二のカプセルはＣｏｘ−２阻害を伝える第二の哺乳類細胞株を含むであろう。所望の蛍光アウトプットを生じるゲル微小液滴が選択されるであろう。

３）対象疾患：癌（ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩα毒の存在下の生存、ＤＮＡ二本鎖切断の非創出およびヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ活性の阻害）
化学療法は、癌を処置するのに最も一般的な方法の１つである。化学療法薬は全て細胞の成長を妨げるものであり、それらは全て何らかの副作用を有する。これらは、非常に望ましくないものから、更なる化学療法の妨げになるほどきつい副作用まで様々である。

化学療法の根底にある問題は、癌細胞が正常な未分化組織または成長の早い組織と相違せず、それ故、癌細胞を殺すとそのような細胞も同時に殺す傾向があることである。この副作用により、適用可能な化学療法薬の投与量が事実上制限される。このため、これらの癌化学療法の中心的問題を克服するために、新規化学療法薬を開発する必要がある。

上記の癌化学療法の問題に対応する最も一般的な方法は、癌細胞に対する特異性をあげる化合物または送達システムを探すことである。一方でそれに代わる方法が、脆弱な正常組織を提案された化学療法薬から保護する化合物を使用することである。このような保護物質は無論正常細胞に対して有害であってはならず、また、癌細胞に到達しないか、または癌細胞では機能しないことが必要である。現在多くの保護物質による方法が臨床的で使用されている。

多くの化学療法薬、例えばドキソルビシンおよびエトポシドは、ＤＮＡ複製の伸長および終結段階において重要な役割を果たす酵素であるトポイソメラーゼＩＩを「害する」という特別な方法により、それらの毒性の大部分（即ち臨床的有用性）を示す。これら薬物は、中間のＤＮＡ／酵素／薬物複合体を安定化し、処置された細胞のＤＮＡにおいて二本鎖切断を創出する。第二のクラスの構造物は、トポイソメラーゼＩＩ酵素サイクルを他のポイントで阻害することにより作用し、二本鎖ＤＮＡ切断を創出しない。これら２つのタイプの化合物は、該サイクルの相異なるポイントを安定化することから、互いにアンタゴニストである。一方が結合すると、他方は結合することができない。それ故、トポＩＩの阻害物質は、トポＩＩ毒の効果を相殺するのに使用することができる。

哺乳類トポイソメラーゼＩＩの２つの相同性の高いアイソフォーム、トポイソメラーゼＩＩα（１７０ｋＤａ）およびトポイソメラーゼＩＩβ（１８０ｋＤａ）が、腫瘍細胞において同定されている(Malonne, H. and Atassi, G., Anti-Cancer Drugs, 1997, 8, 811-822)。この２つのアイソフォームは幾つかの生化学的および薬理学的性質、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性に最適な塩濃度、温度安定性およびテニポシド(非介在型（non-intercalative）ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ毒）に対する感受性が異なる。トポイソメラーゼＩＩαは、哺乳類細胞において重要な薬物標的アイソフォームである(Sehested et al, Cancer Research, 1998, 58, 1460-1468)。

ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの新規阻害物質の発見は、一部の脆弱な組織をトポＩＩ毒から保護し、従って既存の化学療法薬の有効性を広げ、副作用を減らすことを可能とするであろう。

望ましい治療プロファイル：
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩα阻害物質：新規化合物はいずれも該酵素の阻害物質でなければならず、毒であってはならないであろう。
正常細胞の成長の可逆的阻害：該薬物の本効果は、化学療法薬の効果を相殺するのに十分な長さだけ続くべきである。
経口有効性：医学上の問題の深刻さを考慮すると、経口で有効な薬物であることが望ましいが、おそらく必須ではないであろう。
安全性：理想的な候補は、さらなる毒性負担を患者に与えないために、穏やかな毒性を示すものであろう。

複数パラメータースクリーニング：
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害物質のための複数パラメータースクリーニングの構成を図３ａに図示する。本アッセイにおいては、産生細胞種ライブラリーは、各カプセルが平均１細胞を有するようにゲルカプセル化されている。各封入細胞は、クローン細胞株を構築するため、数世代成長することができる。これら細胞株は、その後ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ遺伝子に依存して生存する透過処理済酵母と共に二重ゲルカプセル化される。該ゲル微小液滴環境は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ毒およびＤＮＡ二本鎖切断に特異的な色素を含む。両区画で細胞が生存しており、かつ染色されていないゲル微小液滴が選択される。

癌化学保護物質のため改良された複数パラメータースクリーニングの構成を図３ｂに示す。本アッセイにおいては、産生細胞種ライブラリーは、各カプセルが平均１細胞を有するように封入されており、数世代にわたり成長することができる。これらクローン細胞株は、その後ヒトＤＮＡトポＩＩαに依存して生存する透過処理済酵母と共に二重封入される。該ゲル微小液滴環境は、毒およびＤＮＡ二本鎖切断色素を含む。外層の酵母細胞が生存しており、かつ蛍光を発していない、または染色されていないゲル微小液滴が選択される。

４）対象疾患：糖尿病（ＲＸＲαのリガンド活性化、ＲＸＲ−ＰＰＡＲγのリガンド特異的活性化、脂肪細胞分化）。
２型糖尿病は、最も一般的な慢性疾患の１つであり、肥満、高血圧、高脂血症および心疾患のような併存疾患に合併する。

ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）およびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）は、リガンド誘発性核受容体ファミリーに属する転写因子である。ＲＸＲとヘテロダイマーを形成するＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−β／δおよびＰＰＡＲ−γと呼ばれる関連するが別個の３つのＰＰＡＲが存在する。これら受容体は、脂肪および炭水化物代謝に関与する遺伝子の発現を調節する。ＲＸＲは、ホモダイマーを形成することができ、かつレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、ビタミンＤ受容体および甲状腺ホルモン受容体を含む多様な核受容体とヘテロダイマーを形成することができるので、レチノイド受容体の中で独特である。

ＰＰＡＲγ／ＲＸＲヘテロダイマーは、ＰＰＡＲγリガンドおよび／またはＲＸＲリガンドにより活性化された場合、脂肪生成およびインシュリン感受性を調節する。例えば、チアゾリジンジオンクラス由来の薬物（ＴＺＤ）のようなインシュリン増感剤は、該核受容体のγアイソフォーム（ＰＰＡＲγ）の活性化が関与する機構を介してそれらの抗糖尿病効果を発揮する。

ＲＸＲαの活性化は、ＰＰＡＲγの活性化およびインシュリン感受性を増大させる。臨床研究により、レチノイド(LG100268)およびＴＺＤの同時投与は、インシュリン感受性およびグルコース取り込みを６０％増強することが示される。

レチノイド受容体は、天然および合成ビタミンＡ誘導体、例えばレチノイン酸の生物学的効果を仲介する。ＲＸＲリガンドは、以下のタンパク質ファミリーのメンバーを含む、多数の相異なるタンパク質と相互作用する：ＲＸＲ、ＲＡＲ、レチノイン酸受容体関連オーファン受容体（ＲＺＲ）、細胞質レチノイン酸結合タンパク質、レチナール結合タンパク質（retinal-binding protein）、Ｐ−糖タンパク質およびシトクロムＰ４５０。これらタンパク質それぞれの発現レベルは、様々な細胞タイプにおけるレチノイドの効力および有効性に影響するようである。

レチノイドは、ＲＸＲホモダイマーまたはＰＰＡＲγ以外のパートナーとのヘテロダイマーによって望ましくない効果を仲介し得る。従って、２型糖尿病を処置するためのレチノイドは、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲヘテロダイマーに選択的であるべきである。

望ましい治療プロファイル：
・選択性：ＲＸＲアゴニストは、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲヘテロダイマーに選択的でなければならない。
・経口有効性：理想の薬物候補は経口で有効であろう。
・安全性：理想の薬物候補は、重大な副作用および薬物相互作用を有さないであろう。

複数パラメータースクリーニング：
複数パラメータースクリーニングの構成は、ＲＸＲ−ＲＸＲ活性化を伝える産生細胞種ライブラリーの、ＰＰＡＲγ−ＲＸＲ活性化およびＰ４５０阻害を伝える哺乳類細胞株とのゲルカプセル化であり得る。ＰＰＡＲγ−ＲＸＲ活性化を示すがＲＸＲ−ＲＸＲ活性化を示さないゲル微小液滴が選択される。図４は、そのようなシステムを例示する。

吸収、分布、代謝、排泄および毒性（ＡＤＭＥＴ）
開発においてリード化合物が失格する主な理由には不適切な動態または毒性が関与することが多く、それ故、不適当な化合物に費やすのをできる限り少なくするため、創薬過程においてできるだけ早期に適切な情報を得る必要性が強い。従って製薬およびバイオテクノロジー産業は、現在、創薬過程においてできる限り早期に適切な情報を得るため、もともと非常に処理量の低い物理化学的、薬物動態学的および毒性最適化研究の方法を、高処理量の選択方法に変換することに焦点をあてている。

本発明は、進化的戦略および細胞基盤システムを使用することにより、ＡＤＭＥＴ要件をリード創出工程に含めることを可能にし、それにより薬物に適さない何千もの化合物を産生およびスクリーニングすることを顕著に減少させる。

溶解性
薬が効果的であるためには、それらは有効な量にてその標的に到達しなければならない。無細胞アッセイにおいては、アッセイ緩衝液における化合物の溶解性がこれに関連して存在する唯一の制限である。細胞内標的についての細胞基盤アッセイにおいては、化合物が細胞膜を越えて拡散する能力は、脂肪豊富な膜へ、またはそこから分配する能力に依存する。この工程は、化合物が十分に水溶性であることに加えて一定の親油性を有する場合に、より効率的である。細胞培養培地が(例えばウシ胎児血清由来の）タンパク質を含む場合、血清タンパク質に対する化合物の結合の程度が、自由に拡散可能な化合物の画分、ひいては標的と相互作用することができる量に影響する。血清タンパク質に対する薬物結合の限度は、輸送および分布などの、生物における数多くの重要な示唆を有する。

本発明は、化合物を産生するために宿主生物を使用する。好ましい態様においては、産生生物の外部でアッセイが使用される。従って細胞膜を越えて拡散する化合物の能力を評価することは、本方法特有の部分である。培地タンパク質の存在もまた、本システム特有の部分である。

本発明の別の局面は、宿主の薬物耐性ポンプの発現または活性の調節である。これは、薬物耐性ポンプをコードする配列の前に外部から調節可能なプロモーターを置くことによってなすことができる。産生された化合物の溶解性が鍵となる選択基準でない場合は、この調節により、スクリーニングの第一ラウンドにおいて産生された化合物の大幅な分泌が可能である。疾患標的に到達する化合物が、宿主細胞膜を越えなければならない、つまり妥当な溶解特性を有さなければならないため、スクリーニングの後期のラウンドにおいては該ポンプの発現を次第に消すことができる。

吸収
薬物送達の好ましい経路は経口投与である。腸管膜透過性は、薬物吸収の限度および速度を、および最終的にはバイオアベイラビリティを決定する重要な特徴である。薬物取り込みと関連する他の細胞には、同様に薬物取り込みの経路である、上皮、表皮、鼻、脳血液関門、精巣血液関門、腎臓、肝臓、腸管上皮および肺細胞が含まれる。

ほとんどの吸収モデルは、通常腸管性であり、かつｉｎ ｖｉｖｏにおける吸収と良い相関を示す培養不死化細胞の使用が関与する。それらのうち最も注目すべきは、ヒト結腸癌細胞株由来のＣａＣｏ−２細胞または該ＣａＣｏ−２細胞株のサブクローンであるＴＣ７である。吸収研究にとって有用な他の細胞株は、イヌ腎臓細胞株であるＭａｄｉｎ−Ｄｅｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ腎臓細胞株（ＭＤＣＫ）およびめくれあがった腸管リング（everted intestinal ring）および刷子縁膜顆粒(brush-border membrane vesicles, ＢＢＭＶ)である。これら細胞株は、コンフルエントな単層に培養され、そのレシーバー区画における試験化合物の出現速度に基づいた透過性測定に使用される。該単層の先端面は微絨毛を含み、従って腸管刷子縁の多くの特徴を保持している。さらに、先端に位置する流出ポンプ、Ｐ−糖タンパク質、モノカルボン酸トランスポーター、ジペプチドトランスポーター、大きな中性アミノ酸（ＬＮＡＡ）のためのトランスポーター [Inui K-I, Yamamoto M, Saito H. T, J Pharmacol Exp Ther, 1992; 261: 195-201; Lu S, Guttendorf RJ, Stewart BH, Pharm Res, 1994; 11: S-258.]および代謝酵素[Bjorge S, Halelehle KL, Homan R, Rose SE, Turluck DA, Wright DS., Pharm Res, 1991; 8: 1441-1443]が、全て機能的に発現している。

図５は、吸収および薬理活性についての複数パラメータースクリーニングの例を示す。二元的培養システムを用い、細胞選択の時期を選ぶことにより、所望の薬理活性および良好な吸収特性を有する化合物を産生した産生細胞を選択することができる。

より具体的には、細胞を不死化哺乳類細胞と一緒に培養し、そしてレシーバー区画における該化合物または該化合物の代謝物の効果を検出することにより、機能性をスクリーニングし得る。培養不死化細胞はコンフルエントな単層に培養することができ、所望の透過性を有する化合物を選択することができる。

Ｐ−糖タンパク質（ＰＧＰ）を阻害する薬物は、同時に投与した薬物の吸収、体内動態および除去を変化させる場合があり、バイオアベイラビリティを増強する場合、あるいは望ましくない薬物−薬物相互作用を引き起こす場合がある。従って、吸収研究の別の重要な局面は、極性化ヒトＰＧＰｃＤＮＡ発現ＬＬＣ−ＰＫ１細胞の単層を横切る、ＰＧＰ仲介ジゴキシン輸送の阻害を直接測定することにより、化合物がＰＧＰ阻害物質かどうかについて決定することである。

哺乳類においては、ＭＤＲ１およびＭＲＰ１のようなＡＢＣトランスポーターが、脳血液および精巣血液関門の機能において、並びに腎臓、肝臓、肺および腸管上皮細胞において重要な役割を果たしている。ＭＤＲ１は、通常、排泄組織由来の細胞の頂端膜上に、および脳毛細血管細胞の管腔表面に発現している(Gottesman et al., 1993; Cordon-Cardo et al., 1989)。ＭＤＲ１およびＭＲＰ１は脈絡叢（ＣＰ）の上皮に存在し、両トランスポーターは血液−ＣＳＦ浸透関門（permeation barrier）に関与している(Rao et al., 1999)。ＭＤＲ１−Ｐｇｐは、脳毛細血管上皮細胞における薬物浸透関門に寄与し、中枢神経系（ＣＮＳ）からの有機カチオンおよび生体異物の除去に関与する(Rao et al., 1999; Schinkel et al., 1997)。 ＭＲＰ１はＣＰにおける基底外側広範囲特異性薬物透過関門（basolateral broad-specifity drug-permeation barrier）に寄与し、この上皮を生体異物から保護し、有機アニオンを、またおそらくある種の疎水性化合物をＣＳＦから押し出す(Wijnholds et al., 2000)。幾つかのＡＢＣトランスポーターは特異的膜チャンネルを形成かつ制御しており、一方その他は解毒化された薬物結合体の除去、リン脂質または胆汁酸の輸送、およびさらに様々なタイプの細胞における抗ウィルス免疫反応の開始または特異的自滅に関与する。更に、ＡＢＣトランスポーターファミリーのメンバーは、病原性細菌および寄生虫(例えばPlasmodiumおよびLeishmania種)に多剤耐性を与え、一方また、化学的に汚染された環境において様々な生物に多生体異物耐性（multixenobiotic resistance, MXR)を与えることが示された(Kurelec et al., 1989; 1992)。

化合物の様々な薬理学的関門の透過を予測するため、広範なＡＢＣトランスポーター−化合物相互作用もまた試験されており、例えば、Ｐｇｐ／ＭＤＲ１、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＤＲ３、ＭＲＰ３、ＭＲＰ５、ＭＲＰ６、ＭＸＲ（ＢＣＲＰ、ＡＢＣＧ２）である。

代謝
薬物が、一旦生物に入ると、様々な生物学的運命をたどり得る。シトクロムＰ４５０（肝臓、腎臓、腸その他の臓器に高レベルで存在）等の薬物代謝酵素（ＤＭＥ）は、特定の薬物を、それらが由来するもとの親薬物よりも、より水溶性であり、かつより容易に排泄される物質（代謝物）に化学的に変換するのを触媒することができる。親薬物が本質的に代謝的に不安定な場合、望ましくない薬物動態学的挙動、例えば短く不適切な作用持続時間または貧弱な経口バイオアベイラビリティが観察され得る。それ故、薬物動態学的性質が良くないことが判明する可能性のある化合物を同定するため、リード候補の代謝的安定性についての知識を得ることは当業界において常識である。

さらに、薬物代謝における研究は、複合治療（polytherapy）における薬物の安全な使用に密接に関係する、起こり得る薬物−薬物相互作用の問題を扱うことができる。最も望ましくない薬物−薬物相互作用は、２またはそれ以上の化合物が同じ薬物代謝酵素に対して競合する場合に起こる。その結果、通常１またはそれ以上の関与化合物の薬物動態が変化し、血中化合物レベルが治療的範囲から外れる原因となる。これらのタイプの相互作用は、特異的な薬物代謝酵素による被験化合物の阻害作用の研究を活用して予測することができる。

創薬戦略に組み込まれることが増えてきているｉｎ ｖｉｔｒｏ方法は、様々なものが利用可能である。実用的に今日最も一般的かつ幅広く利用されている系は、肝ミクロソームである。これら調製物は、滑面小胞体に存在するその酵素、例えばシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）、フラビン・モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）、スルホトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グリコシル・トランスフェラーゼ、グルタチオン・トランスフェラーゼおよびＮ−アセチル・トランスフェラーゼの活性を保持している。単離された肝細胞はより広いスペクトルの酵素活性を保持しているようであり、それには細網内皮系のみならず、細胞質内およびミトコンドリア酵素もまた含まれる。肝スライスも、肝細胞のように多様な酵素活性を保持しており、使用されることが増えている。さらに、肝細胞および肝スライスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて酵素誘導を評価することができる。酵母（saccharomyces cerevisiae)、細菌（大腸菌）および哺乳類（Ｂ−リンパ芽球腫）細胞株においてｃＤＮＡから発現させた単離異種性ヒトＣＹＰ酵素は、近年利用可能である[Ohgiya S, Komori M, Fujitani T, Miura T, Shinriki N, Kamataki T., Biochem Int, 1989; 18: 429-438; Winters DK, Cederbaum AI, Biochim Biophys Acta 1992; 1156: 43-49; Crespi CL, Gonzalez FJ, Steimel DT, Turner TR, Gelboin HV, Penman BW, Langenbach R, Chem Res Toxicol, 1991; 4: 566-572]。これらの系は、化合物が特定のＣＹＰアイソザイムの基質であるか、および、そうであるならば該酵素によってどんな代謝物が生じるのかを確かめるために使用されている。

組換えヒトシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９多形を含む）を用いるアッセイ、および肝ミクロソーム調製物におけるアイソザイム特異的な基質と代謝物の組み合わせを用いるアッセイは、試験化合物の潜在的薬物−薬物相互作用に関する価値ある情報を提供し得る。

本発明において、小分子の生成は、ヒト代謝に関与する一連の酵素によってそれ自身形質転換されている場合がある宿主細胞によって行われる。これらは、ヒトＤＭＥによって急速に代謝される化合物によって生じる偽陽性の数を最小限にし、また、代謝後に活性があり、本方法によらなければ発見されなかったであろう化合物を発見する(図６参照)。

本発明の別の局面において、薬物代謝酵素は、無細胞または細胞基盤アッセイにおいて小分子産生細胞の細胞外に含まれる。更なる別の態様においては、ある種の薬物代謝酵素は、小分子産生細胞の細胞内に、および一部が細胞外に含まれる。

本発明は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の、相異なる薬物代謝酵素を同時に用いてもよい。

細胞基盤アッセイを用いる場合、好ましい方法は、肝細胞を使用するものである。

本発明のさらに別の局面においては、酵素阻害についての情報を得るため、薬物代謝酵素の活性についてのレポーターシステムが含まれる。本発明のさらに別の局面においては、薬物−薬物相互作用についての競合アッセイを行うことができる。

特定の場合において、一部の薬物代謝酵素のうち幾つかは、幾つかの疾患と関係することが知られているので、それ自身疾患標的である。

概念的には、薬物代謝酵素は２つの群に分けられる。ＣＹＰ４５０およびＦＭＯなどの酸化的薬物代謝酵素は、基質分子への酸素原子の導入を触媒し、通常結果としてヒドロキシル化または脱メチル化をもたらす。抱合性酵素ファミリーには、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオン・トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）およびＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）が含まれる。抱合性薬物代謝酵素は内部小分子の生体異物に対する結合を触媒し、通常最終的により容易に排泄される可溶性化合物を形成する。

シトクロムＰ４５０
ヒトにおけるシトクロムＰ４５０タンパク質は薬であり、かつコレステロール、ステロイド、および他の重要な脂質、例えばプロスタサイクリンおよびトロンボキサンＡ２、を作るのに用いられる酵素である。これら最後の２つは、アラキドン酸の代謝物である。シトクロムＰ４５０遺伝子における変異または該酵素の欠如は、幾つかのヒト疾患の原因である。ある種のＰ４５０は、前発癌物質を発癌物質に変換することができるので、これらの誘導はいくつかの癌における危険因子である。

肝臓のＣＹＰ４５０酵素は、ほとんどの薬物を含む生体異物化合物の生体内変換の初めの段階を触媒する。これら酵素は、基質分子への酸素原子の導入を触媒し、しばしば結果としてヒドロキシル化または脱アルキル化代謝物を生じる、混合機能オキシダーゼの大きなファミリーのメンバーである。この代謝は２つの相で起こる。第１相は、結合体を連結するのに用いられ得る官能基を添加するための化学修飾である。該結合体は、修飾化合物をより水溶性にして、尿中に排泄させ得るようにする。多くのＰ４５０は、薬物代謝の第１相の段階でヒドロキシル基を添加する。該ヒドロキシル基は、その後薬物代謝の第２相におけるさらなる修飾部位として機能する。

５０を超えるＣＹＰ４５０アイソザイムがヒトに存在することが知られており、それらはアミノ酸配列の類似性に基づき１８のファミリーおよび４３のサブファミリーに分類されている。同じファミリーのタンパク質はアミノ酸レベルで４０％以上一致し、一方同じサブファミリーのものは５５％以上一致する(Nelson, D.R. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 369:1-10)。標準的命名法においては、該ファミリーは、数字とそれに続くサブファミリーのための文字表記および該サブファミリーの個々のメンバーを特定する第二の数字によって示される。

ＣＹＰ１ 薬物代謝（サブファミリー ３、遺伝子 ３、偽遺伝子 １）
ＣＹＰ２ 薬物およびステロイド代謝 （サブファミリー １３、遺伝子 １６，偽遺伝子 １６）
ＣＹＰ３ 薬物代謝（サブファミリー １，遺伝子 ４，偽遺伝子 ２）
ＣＹＰ４ アラキドン酸または脂肪酸代謝 （サブファミリー ５、遺伝子 １１、偽遺伝子 １０）
ＣＹＰ５ トロンボキサンＡ２シンターゼ（サブファミリー １、遺伝子 １）
ＣＹＰ７Ａ 胆汁酸生合成 ステロイド核の７−α−ヒドロキシラーゼ （サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ７Ｂ ７−α−ヒドロキシラーゼの脳特異的型（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ８Ａ プロスタサイクリン・シンターゼ（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ８Ｂ 胆汁酸生合成（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ１１ ステロイド生合成（サブファミリー ２、遺伝子 ３）
ＣＹＰ１７ ステロイド生合成（サブファミリー １、遺伝子 １） １７−α−ヒドロキシラーゼ
ＣＹＰ１９ ステロイド生合成（サブファミリー １、遺伝子 １）アロマターゼがエストロゲンを形成
ＣＹＰ２０ 機能不明（サブファミリー １、遺伝子 １）
ＣＹＰ２１ ステロイド生合成（サブファミリー １、遺伝子 １、偽遺伝子 １）
ＣＹＰ２４ ビタミンＤ分解（サブファミリー １、遺伝子 １）
ＣＹＰ２６Ａ 発達に重要なレチノイン酸ヒドロキシラーゼ（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ２６Ｂ レチノイン酸ヒドロキシラーゼ（推定）（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ２６Ｃ レチノイン酸ヒドロキシラーゼ（推定）（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ２７Ａ 胆汁酸生合成（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ２７Ｂ ビタミンＤ３ １−α−ヒドロキシラーゼがビタミンＤ３を活性化（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ２７Ｃ 機能不明（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ３９ 機能不明（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ４６ コレステロール ２４−ヒドロキシラーゼ（サブファミリー・メンバー １）
ＣＹＰ５１ コレステロール生合成（サブファミリー １、遺伝子 １、偽遺伝子 ３）ラノステロール １４−α−デメチラーゼ

大半の薬物がＣＹＰ１、２および３ファミリーの少数のメンバーによって代謝され、該代謝は主に、体内で最も高濃度のＣＹＰ４５０を含む肝臓において起こる。しかしながら、腸および肺のような肝臓外代謝の重要性もまた認識されている。

生体異物を代謝するＰ４５０は、Ｎ末の単一膜貫通ヘリックスによって小胞体（ＥＲ）に固定された、およそ５０ｋＤａのタンパク質である。分画遠心法を用いた細胞分画により、通常ミクロソームと呼ばれる小胞体に富む粒子調製物が生じる。相異なる個体に由来するミクロソーム画分を詳細に検討すると個々のアイソザイムの発現パターンに有意なばらつきがあることがわかったが、いくらか一般化が可能である(Guengerich, F.P. (1995) Cytpchrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (Second Edition), Chapter 14, edited by Paul R. Ortiz de Montellano, Plenum Press, New York, Shimada, T., et al. (1994) J. Pharmacol. Exp. Ther. 270:414-23)。平均して、成人ヒト肝臓に発現するＰ４５０の７０％が、以下のアイソザイムより成っている：１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃサブファミリー（２Ｃ８、２Ｃ９、２Ｃ１８および２Ｃ１９）、２Ｄ６、２Ｅ１、および３Ａサブファミリー（３Ａ４および３Ａ５）。

Ｐ４５０の非常に重要な別の局面は、遺伝子多型が、集団間および個人間で薬物代謝において顕著な相違を引き起こすことである。遺伝子多型は、集団の１％以上で見られるＤＮＡ配列における相違である。これらのＤＮＡ配列の相違は薬物代謝の相違をもたらす場合があるので、ヒトにおけるＰ４５０遺伝子の重要な特徴である。ＣＹＰ２Ｃ１９は、酵素のメフェニトイン（マーカー薬物）代謝能を変化させる遺伝子多型を有する。コーカサス人においては、不全代謝表現型の遺伝子多型は、集団の３％にしか見られない。一方で、アジア人集団においては２０％に見られる。この相違のため、相異なる集団によって代謝され方が異なる薬物が投与される場合、人種に注意することが重要である。毒性が出る手前の有効投与量の幅が狭い幾つかの薬物は、不全代謝者において過剰摂取となることがある。シトクロムＰ４５０アリルのウェブサイトは、スウェーデンのhttp://www.imm.ki.se/CYPalleles/にて利用可能である。

薬物創出過程の間に薬物代謝的局面について扱うことができることから、本発明の別の局面は、特定の集団あるいはさらに個人のため設計された薬物を進化させる能力である。

Ｐ４５０による有機分子の酸化は極めて複雑であるが(Ortiz de Montellano, P.R. (1995) Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (Second Edition), Chapter 8, edited by Paul R. Ortiz de Montellano, Plenum Press, New York)、全体の反応は、単純に式１によって表すことができる：
式１：ＲＨ＋Ｏ２＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→ＲＯＨ＋Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤＰ＋
ＮＡＤＰＨからの電子が、ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素のフラビンドメインを介して、酸素分子の活性化が起こる場所であるＣＹＰ４５０のヘムドメインに転移する。基質は酸素原子の１つと反応し、もう一方は水に還元される。場合によっては、第二の電子は、シトクロムｂ５還元酵素およびシトクロムｂ５を介してＮＡＤＰＨからもたらされてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成実験の間、シトクロムｂ５は、ある種のＣＹＰ４５０アイソザイム、とりわけ３Ａ４、２Ｅ１および２Ｃ９による様々な基質の代謝を刺激することができる。しかしながら、この刺激機構ははっきりとは理解されていない。アポシトクロム（apocytochrome）ｂ５は、再構成されたＣＹＰ３Ａ４反応の刺激においてホロ酵素と同じくらい効果的であることが示されたので、少なくともこの例においては、電子伝達に直接関与しないようである（Yamazaki, H., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:27438-44）。最も広く支持されている仮説は、シトクロムｂ５がアロステリックにＣＹＰ４５０とＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素との間の相互作用を増強しているか、あるいは基質結合を改善しているというものである。

フラビン・モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）
フラビン・モノオキシゲナーゼは、ＣＹＰ４５０酵素のように、小胞体と結び付き、酸素分子および一方の酸素原子の還元のための電子供与体としてのＮＡＤＰＨを用いて有機化合物の酸化を触媒する（式１）。しかし、それらは基質の非存在下に酸素およびＮＡＤＰＨと反応し、４α−ヒドロペルオキシフラビン酵素中間体を形成する点で、ＣＹＰ４５０と機構的に異なる。従って、ＦＭＯは細胞において活性化型で存在し、触媒回路の完了に必要なのはアミン、チオールまたはリン酸基を含む求核基との相互作用だけである(Rettie, A.E. and Fisher, M.B. (1999) in Handbook of Drug Metabolism, pp131-147, edited by Thomas F. Woolf, Marcel Dekker, Inc, New York)。活性化状態で釣り合っているにもかかわらず安定であり続ける能力により、ＦＭＯアイソザイムの極めて広い基質特異性が説明できるであろう。触媒に必要なエネルギーは基本的に全て酸素活性化中間体に捕獲され、基質分子の配置または変形は必要でないことが提唱されている(Ziegler, D.M. (1993) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 33:179)。従って、ＦＭＯの活性部位は他の酵素ほどは立体的に明確にされていない。ＦＭＯ３はヒト肝臓において最も豊富な型であり、薬物代謝全体から見て本酵素ファミリーの主要なメンバーであると信じられている(Rettie, A.E. and Fisher, M.B. (1999) in Handbook of Drug Metabolism, pp131-147, edited by Thomas F. Woolf, Marcel Dekker, Inc, New York)。

ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）
ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ−グルクロン酸をドナー分子として用いて、生体異物のヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノおよびスルフヒドリル基におけるグルクロン酸抱合を触媒する（式２）。一般的に、これにより、より親水性が高く、それ故より容易に胆汁または尿に排泄される産物が生じる。
式２：ＵＤＰ−グルクロン酸＋Ｒ→ＵＤＰ＋Ｒ−グルクロニド
グルクロン酸抱合は一般的に第二相代謝（ＣＹＰ４５０依存性酸化代謝の後に起こる相）に分類されるが、多くの化合物はすでにグルクロン酸抱合され得る基を有しているので、事前の酸化は必要とされない。ＵＧＴによって触媒される初回通過代謝の例には、モルヒネのＵＧＴ２Ｂ７依存性グルクロン酸抱合（Coffman, B., et al. (1996) Drug Metab. Dispos. 25:1-4）および５−リポキシゲナーゼ阻害薬（抗炎症薬）のグルクロン酸抱合（Coffman, B., et al. (1997) Drug Metab. Dispos. 25:1032-8）が含まれる；後者の場合、グルクロン酸抱合はｉｎ ｖｉｖｏ血漿クリアランスにとって律速段階であることが示された。ＵＧＴは、５０−６０ｋＤａの膜内在性タンパク質であり、触媒ドメインを含むタンパク質の大部分は小胞体内腔に位置し、１５−２０アミノ酸のＣ末固定化領域がＥＲ膜を貫通している（Radominska-Pandya, A., et al. (1999) Drug Metab. Rev. 31:817-99.11. Radominska- Pandya, A., et al. (1999) Drug Metab. Rev. 31:817-99）。アグリコン結合部位は、ＵＧＴアイソザイム間で最も配列の変動性の高い領域である、ＵＧＴポリペプチドのＮ末部分に存在すると考えられている。ＵＤＰＧＡ結合ドメインは、該タンパク質の高度に保存されたＣ末半分に存在する。確かではないが、脂質との結び付きがＵＧＴ活性に必要とされ、かつ活性部位へのアグリコンの接近に影響し得るとの仮説が立てられている。２つのＵＧＴファミリー、ＵＧＴ１およびＵＧＴ２がヒトにおいて同定されている。これらファミリーのメンバーは一次アミノ酸配列において５０％未満しか一致しないが、それらは基質特異性において顕著な重複を示す（Radominska- Pandya, A., et al. (1999) Drug Metab. Rev. 31:817-99）。大部分の生体異物代謝が起こるヒト肝臓において発現するＵＧＴ１ファミリーのメンバーには、ＵＧＴ１Ａ１、１Ａ３、１Ａ４、１Ａ６および１Ａ９が含まれる。ＵＧＴ２ファミリーはそれほど精力的には研究されていないが、肝臓ではＵＧＴ２Ｂ４、２Ｂ７、２Ｂ１０、２Ｂ１１および２Ｂ１５が発現していることが知られている（Radominska-Pandya, A., et al. (1999) Drug Metab. Rev. 31:817-99.11. Radominska- Pandya, A., et al. (1999） Drug Metab. Rev. 31:817-99）。ＣＹＰ４５０のような他の薬物代謝酵素の場合と同様に、ＵＧＴ発現レベルおける個体間変動が観察されており、それは薬物応答における相違と関連している（Weber, W. (1997) Pharmacogenetics, Oxford University Press, New York）。

ヒトＵＧＴ１ファミリーには、主要なビリルビン代謝アイソフォーム（ＵＧＴ１Ａ１）および平面フェノール（planar phenol）と選択的に結合するアイソフォーム（ＵＧＴ１Ａ６）が含まれる。ＵＧＴ２ファミリーにおけるアイソフォームは、生体異物と並んで様々な内在性ステロイド化合物を代謝する。ＣＹＰ４５０と同様に、ほとんどのヒトＵＧＴの生体内変換能にはかなりの重複が存在するので、基質特異性に基づくＵＧＴの分類は幾分限られる。

グルタチオン・トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
グルタチオン・トランスフェラーゼは、直接的添加（式３）または電子求引基の置換（式４）によるグルタチオン（ＧＳＨ）と反応性生体異物との間のチオエーテル結合体の形成を触媒する。
式３：ＧＳＨ＋Ｒ→ＧＳ−Ｒ
式４：ＧＳＨ＋Ｒ−Ｘ→ＧＳ−Ｒ＋ＨＸ
ＧＳＴの主な生物学的機能は、求電子性化学種に対する防御の提供と考えられている。大部分のＧＳＴは、４つの構造的分類：アルファ（α）、ミュウ（μ）、パイ（π）およびシータ（θ）のうちの１つの約２５ｋＤａのサブユニットより構成される細胞質内ホモダイマーである。α−アイソフォーム（ＧＳＴ Ａ１−１）は、哺乳類において、腎臓、腸、肺および肝臓などの少数の組織に限定されている。μ−アイソフォーム（ＧＳＴ Ｍ１−１）は肝臓に見られるが、他の組織にはあまり見られない。それに対し、πアイソフォーム（ＧＳＴ Ｐ１−１）は、肝臓には明らかに存在しないものの、全身に広範に分布している。さらに、ＧＳＴ Ｐ１−１は、ほとんどのタイプの腫瘍細胞に豊富に存在する。

スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）
スルホトランスフェラーゼ酵素は、ヒドロキシルおよびアミン基のようなアクセプター部分を有する様々な生体異物および内在性基質に対する硫酸基の結合を触媒する（式５）。
式５：Ｒ−ＸＨ＋ＰＡＰＳ→Ｒ−ＳＯ４＋ホスホアデノシン＋Ｈ＋
補助因子である３’−ホスホアデノシン５’−ホスホスルフェート（ＰＡＰＳ）が、これら酵素によるスルホン化に必要である。スルホン化は通常分子の生物学的活性を失わせるが、硫酸塩の添加が、ミノキシジルのような反応性の高い代謝中間体、および硫酸化Ｎ−ヒドロキシ ２−アセチルアミノフルオレンのような反応性求電子カチオンの形成をもたらし得ることが、例により実証されている（McCall, J., et al. (1983) J. Med. Chem. 26:1791-3; Miller, J.A. (1994) Chem. Bio. Interact. 92:329-41）。相異なる生物学的性質を有する幾つかのスルホトランスフェラーゼ酵素が動物およびヒト組織において特徴決定されている。組織画分には２つの一般的クラスが存在する：薬物代謝に重要と考えられる細胞質内酵素；およびグリコサミノグリカンおよび糖タンパク質のスルホン化に関与する膜結合酵素（Weinshilboum, R.M., et al.(1997) FASEB J. 11:3-14）。ヒト細胞質内スルホトランスフェラーゼアイソザイムは、３２−３５ｋＤａのサブユニットのホモダイマーとして機能する。現在ヒトにおいて既知のスルホトランスフェラーゼが１０あり、そのうち５つが成人肝臓に発現していることが知られている（ＳＵＬＴ１Ａ１、ＳＵＬＴ１Ａ２、ＳＵＬＴ１Ａ３、ＳＵＬＴ１ＥおよびＳＵＬＴ２Ａ１）。スルホトランスフェラーゼをコードする他の新規遺伝子が同定されるであろうことが期待される。その相異なる遺伝子、それらのｍＲＮＡおよびタンパク質産物の命名が最近修正され、「ＳＵＬＴ」が公認のスーパーファミリーの略称となった（Raftogianis, R.B., et al. (1997) BBRC 239:298- 304）。スルホトランスフェラーゼ酵素の対立遺伝子多型が間違いなく存在し、それらの頻度および薬物体内動態における機能的役割の研究は、非常に活発な研究分野である。

Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ
Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）は、芳香族アミンまたはヒドラジンの、各アミドまたはヒドラジドへの生体内変換を、アセチル補酵素Ａをドナーとして用いて触媒する（式６）。それらはまた、Ｎ−ヒドロキシ芳香族アミンのアセトキシエステルへのＯ−アセチル化を触媒するであろう（式７）。
式６：Ｒ−ＮＨ２＋ＣｏＡ−Ｓ−ＣＯＣＨ３→Ｒ−ＮＣＯＣＨ３＋ＣｏＡ−ＳＨ
式７：ＲＮＨＯＨ＋ＣｏＡ−Ｓ−ＣＯＣＨ３→Ｒ−ＮＨＯＣＯＣＨ３＋ＣｏＡ−ＳＨ
ＮＡＴ１およびＮＡＴ２と呼ばれる２つのＮＡＴアイソフォームがヒトにおいて知られている；両者は肝臓に見られる３３ｋＤａの細胞質内タンパク質である。ＮＡＴ１は他の多くの組織にも発現しているが、一方ＮＡＴ２は肝臓および消化管にのみ発現する。この２つのアイソフォームの基質特異性は相異なるものの重複しており、一方または他方のアイソフォームによってもっぱらアセチル化されると思われる基質は１つもない。Ｎ−アセチル化についての遺伝子多型はよく実証されており、ＮＡＴが複素環芳香族アミン発癌物質の活性化および無毒化の両方に関与することから（Weber, W. (1997) Pharmacogenetics, Oxford University Press, New York）、それはある一部の個人の膀胱癌および大腸癌の罹患率に関与している可能性がある。

毒性
主な毒性の１つは肝毒性である。単離したばかりのヒト肝細胞は、毒性を評価するのに最良のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物系である。正常ヒト肝代謝を反映する幾つかのヒト肝細胞株が開発されている（例えば、Ａｍｐｈｉｏｘｕｓ ＩｎｃのＡＣＴＩＶＴｏｘ、およびＣｅｒｅｐのＨｅｐ Ｇ２）。これら細胞株は、ｉｎ ｖｉｖｏの結果と非常によく一致する細胞増殖アッセイに使用することができる。

化合物が宿主生物中で産生されるので、本発明においては、毒性評価は本スクリーニングに本来備わっているパラメーターである。非常に毒性の強い化合物は宿主生物を殺すであろうことから、選択または検出されないであろう。おおまかに言うと、毒性は細胞増殖アッセイを用いてスクリーニングすることができる。例えば、肝細胞を産生生物および疾患標的と共に封入することにより、より正確なヒト毒性アッセイを複数パラメータースクリーニング方法に組み込み、所望の様式で疾患標的を活性化しかつ肝細胞の成長を阻害しなかったスクリーニングユニットを選択することができる。

図７は、標的活性、ＤＭＥによる代謝および細胞毒性を評価するための本発明のスクリーニングシステムの略図である：第一の微小滴に薬理学的標的およびＤＭＥによって形質転換された産生生物種のクローン株が存在し、第二の微小滴に肝細胞が存在する二重ゲル・封入システムを用いて、標的活性、ＤＭＥ代謝および肝毒性についてスクリーニングすることが可能である。

変異原性
化合物の変異原能は、創薬計画において検討しなければならない別の局面である。化合物の変異原性は、生物における復帰突然変異率を測定することにより評価できる。該生物は動物であってよく、より好ましくは微生物である。例えば、潜在的突然変異原に対する感受性が異なっており、かつ相補的であるネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の幾つかの相異なる株が存在する。

他の目的のための複数パラメータースクリーニング
除草剤のためのスクリーニング
除草剤としての化合物の効果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを用いてスクリーニングすることができる。除草剤としての効果を試験する一次スクリーニングには、毒性、光合成の阻害、中心的代謝酵素の阻害が含まれる。

第一の群と同時にアッセイすることができる更なるスクリーニングの例には、以下のものが含まれる：取り込み（毛根培養、器官培養（苗条培養を含む）を使用）、代謝、他の植物（特に農作物）または他の生物（動物、ヒト、昆虫、真菌）に対する毒性の欠如。

殺真菌剤（農業用）のためのスクリーニング
一次スクリーニングは、レポーター細胞として、および取り込みのため、真菌細胞が使用される点を除き、除草剤を進化させるためのスクリーニングに用いられるものと同様である。

二次スクリーニングもまた、多かれ少なかれ同じタイプである。特に行うべきスクリーニングは、植物、特に農作物に対する毒性の欠如である。

殺虫剤のためのスクリーニング
一次スクリーニングには、殺虫剤としての化合物の機能についてのアッセイ、即ち特定の昆虫種または群に対する毒性についての細胞基盤アッセイ、および／または昆虫の重要な代謝機能における特定の酵素の阻害、または繁殖の阻害についてのアッセイ、が含まれる。

二次スクリーニングには、例えばコンフルエント単層昆虫細胞を用いた、殺虫剤が取り込まれる器官である昆虫の特定の器官における取り込みが含まれる。化合物が昆虫代謝酵素によって代謝されるか、あるいは活性化されるかについて試験するため、更なるスクリーニングには昆虫代謝酵素による代謝が含まれる。更に、動物および／またはヒトに対する毒性または変異原性または催奇形性についてスクリーニングすることが適当である。二次スクリーニングの別の例は、他の昆虫種に対する毒性の欠如である。

化粧品のためのスクリーニング
一次スクリーニングは、化粧品としての化合物の機能を対象とする。
二次スクリーニングには、医薬品のためのスクリーニングまたは医薬品の進化と同様のもの、即ち、（適切であれば）吸収、（適切であれば）分布、代謝、（適切であれば）排泄および毒性、変異原性および催奇形性が含まれる。

香料のためのスクリーニング
一次スクリーニングには、所望の香りについて自動的に評価することが含まれ得る。特定の香りまたは味について評価することができる「人工の鼻」が開発されている。人工鼻または、嗅覚もしくは蒸気選択的検出器は、低レベルの匂い物質を検出することができる。そのような鼻の例は、例えば、ＵＳ ６，３６８，５５８および本明細書に引用される文献に開示される。該技術はまた、人工臭度測定として知られている。
二次スクリーニングは、典型的には、毒性、変異原性、催奇形性、（例えば唾液酵素による）代謝が含まれる。

ファインケミカル：複数パラメータースクリーニングおよび進化の他の例には、ファインケミカル、食品および食品添加物、およひ触媒のための進化およびスクリーニングが含まれる。

スクリーニング技術
陽性細胞は、陽性細胞のみが生存するスクリーニングを構築するか、あるいは物理的に陽性細胞を選択することによって選択することができる。陽性クローンの生存は、例えば以下に基づくアッセイを用いて行うことができる：
ａ．毒性物質存在下における生存、
ｂ．他の生物の存在下における生存、
ｃ．栄養学的レポーター遺伝子、例えばＨｉｓ、または所望の応答を示した場合に重要なタンパク質、例えばＣＤＣ２５を産生するレポーター遺伝子の使用。

陽性細胞の物理的選択は、以下を用いて行うことができる：
ａ．ＦＡＣＳおよび細胞内レポーターアッセイ（天然または遺伝子組換え）、
ｂ．ＦＡＣＳおよびゲルカプセル化（単一、二重またはそれ以上）および細胞外レポーターシステム［細胞基盤（天然または遺伝子組換え）または無細胞］
ｃ．オーバーレイ・アッセイおよび細胞外レポーターシステム［細胞基盤（天然または遺伝子組換え）または無細胞］および採集（手動または自動）
ｄ．マイクロタイター・プレートへの単一クローン細胞株の閉じ込めおよび細胞外レポーターシステム［細胞基盤（天然または遺伝子組換え）または無細胞］および採集（手動または自動）
ｅ．播種および採集（手動または自動）

フロー・サイトメトリー
従来のフロー・サイトメトリーにおいて、短時間に非常に多数の細胞を解析することは一般的である。新しく開発されたフロー・サイトメーターは、１秒につき１００，０００細胞まで解析し、分別することができる。典型的フロー・サイトメーターにおいては、個々の粒子が照射区域および適切な検出器を通過し、電気的にゲート化され、散乱光の程度を表すパルスが測定される。これらパルスの規模は電気的に「瓶」または「チャンネル」に分別され、該チャンネル数に対する一定の量的性質を有する細胞の数のヒストグラムを表示することができる。フロー・サイトメトリー測定から生じるデータは、迅速に（電気的に）解析することができるので、電子工学細胞分別方法を使用し所望の性質を有する細胞を別個の「バケット」に分別することができるであろうことは以前から認識されており、一般的に蛍光細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）として知られている。

蛍光細胞分析分離法は、本来ヒトおよび動物細胞株の研究および細胞培養工程の調節に使用されていた。細胞のフルオロフォア標識および蛍光測定により、特定の標的分子または細胞成分および細胞集団におけるそれらの分布についての定量的データを示すことができる。フロー・サイトメトリーは、実質的にどんな細胞関連特性または蛍光プローブ（または天然蛍光）が存在する細胞小器官でも定量することができる。

細胞分別機は、１秒につき少なくとも１０，０００、より好ましくは１秒につき少なくとも５０，０００、より好ましくは１秒につき少なくとも１００，０００細胞の速度で、細胞分別を行うことができる。

ゲル微小液滴封入
ゲル微小液滴技術は、フロー・サイトメトリー解析において利用可能なシグナルを増強する点、および、バイオテクノロジーのための株改良計画において微生物株のスクリーニングを可能にする点に意義がある。Wittrupら(Biotechnolo. Bioeng. (1993) 42:351-356)は、増強されたアスペルギルス・アワモリ・グルコアミラーゼ（Aspergillus awamori glucoamylase）の分泌について１０^６を超える酵母細胞を迅速かつ定量的にスクリーニングすることを可能にする微封入選択法を開発した。本方法は、高分泌変異体について１回の通過で４００倍エンリッチする。

細胞のハイスループット・スクリーニングにおけるシグナルを局在化させ、かつ増強させるために、ゲル微小液滴または他の関連技術を本発明において用いることができる。好ましくは、本発明のスクリーニング方法は、産生細胞を更なるラウンドで進化させるために使用できるように、それらの生存が保証されるように設計する。しかしながら、発現カセットを、またおそらく人工染色体でさえも該細胞から単離し、これらを他の宿主細胞に再挿入することもまた可能であり、これはスクリーニングによって細胞が死んでしまう場合に必要であろう。

様々なタイプの封入方法および化合物またはポリマーを本発明に使用することができる。適用範囲が広いため、アルギン酸カルシウムにおける封入が特に適切な封入である。更に、アルギン酸カルシウムビーズは室温で作製することができ、かつ封入された細胞を生かしたまま穏やかな方法で溶解することができる。

特に興味深い更なる特徴は、小分子を透過しないようにビーズ（またはゲル微小液滴）を脂質層でコートできることである。これにより、小分子が周囲にもれないこと、およびゲル微小液滴のスクリーニングおよび分別中に産生細胞と小分子との間の接触が失われないことが保証される。

封入技術は、たとえもはや細胞が生存していない場合でも、シグナルを局在化するために用いることができる。

ゲル・マイクロドロップ（ＧＭＤ）は、生体適合性のあるマトリックスにより作られた小さい（直径が２５から２００μｍ）粒子である。生存可能な細胞の場合、細胞子孫が互いに隣り合って保持され、クローン増殖に基づいた細胞の単離が可能となることから、これらマイクロドロップは小型化したペトリ皿として機能する。この基本的方法は、十分に自動化され、かつハイスループットである。細胞は基質と共に封入され、陽性クローンを含む粒子が分別される。蛍光基質標識ガラスビーズもＧＭＤ内部に入れることができる。生存不可能な細胞の場合、ＧＭＤはシグナルの局在化を保証するために用いることができる。

封入は、ビーズ、低または高温度アガロース、アガロース、ポリサッカライド、炭水化物、アルギン酸塩、カラギナン、キトサン、セルルース、ペクチン、デキストラン、またはポリサッカライドから作られたゲル微小液滴、ゴースト赤血球またはマクロファージのような細胞、リポソーム、あるいは分子を封入または局在化する他のいずれの方法においても可能である。

ゲルカプセル化細胞は更に、スクリーニングされる化合物が基本的に透過しない層の中に閉じ込めることができる。それにより、化合物が該細胞に近接したままとなり、細胞と化合物の間の物理的接触が失われない。その上、ゲル微小液滴からゲル微小液滴への漏れが予防される。非透過性物質は脂肪性物質であってよい。

細胞およびレポーターシステムは、ゲル微小液滴の１つの層中に封入されてよい。また細胞がゲル微小液滴の１つの層中に封入され、少なくとも１つのレポーターシステムが同じゲル微小液滴の別の層に封入されてもよい。別の態様においては、１つの層が該細胞および１またはそれ以上のレポーターシステムを含み、第二の層が１またはそれ以上の相異なるレポーターシステムを含み、任意で第三または第四あるいは更なる層が１またはそれ以上のレポーターシステムを含む。更に、細胞がゲル微小液滴の１つの層に封入されて、第一のレポーターシステムが同じゲル微小液滴の別の層に封入され、そして少なくとも第二のレポーターシステムが同じゲル微小液滴のさらに別の層に封入されてもよい。

例えば、リポソームを調製する方法（即ち、米国特許番号５，６５３，９９６、５，３９３，５３０および５，６５１，９８１）、および、様々な分子を封入するためのリポソームの使用（米国特許番号５，５９５，７５６、５，６０５，７０３、５，６２７，１５９、５，６５２，２２５、５，５６７，４３３、４，２３５，８７１、５，２２７，１７０）が記載されている。エンドサイトーシス中の赤血球におけるタンパク質、ウィルス、細菌およびＤＮＡの閉じ込めについても同様に記載されている(Journal of Applied Biochemistry 4, 418-435 (1982))。膜の低浸透圧性溶解または絶縁破壊の間に取り込まれる物質のための担体としてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて用いられる赤血球もまた記載されている(Ihler, G. M. (1983) J. Pharm. Therに概説)。これらの技術は、本発明においてスクリーニングのための試料を封入するのに有用である。

分子相互作用を促進するのに適した環境には、例えばリポソームが含まれる。リポソームは、リン脂質、糖脂質、ステロイド、長鎖アルキルエステル；例えばリン酸アルキル、脂肪酸エステル；例えばレシチン、脂肪族アミンなどを含む様々な脂質から調製することができる。脂肪様物質の混合物、例えば中性ステロイド、荷電両親媒性物質およびリン脂質の組み合わせを用いてもよい。リン脂質の具体例には、レシチン、スフィンゴミエリン、およびジパルミトイルホスファチジルコリンが含まれる。代表的ステロイドには、コレステロール、コレスタノールおよびラノステロールが含まれる。代表的荷電両親媒性化合物は、通常１２−３０の炭素原子を含む。モノ−またはジ−アルキルリン酸エステルまたはアルキルアミン；例えばジセチルリン酸、ステアリル・アミン、ヘキサデシル・アミンなどである。

他のスクリーニングシステム
ゲル微小液滴スクリーニングの代わりに、レポーターシステムおよび陽性細胞の手動または自動採集を含むオーバーレイ・アッセイにより、少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞を選択してもよい。

スクリーニングのための他のシステムは、レポーターシステムを含むマイクロタイター・プレートの１つのウェルに単一のクローン化細胞株を配置することによって行う少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択、および陽性細胞の手動または自動採集を含む。本システムは、マイクロタイター・プレートの自動操作および解析のため開発された多くのシステムを利用する。

細胞は単にプレートの培地上にまいてもよく、陽性細胞は自動または手動のいずれでも採集することができる。

細胞は陽性細胞のみが生存できるように遺伝子組換えされていてもよい。これら細胞は液体培地中で培養してもよく、あるいはプレートにまいてもよい。

複数パラメーターへの進化
一般的に言って進化とは、複製および変化中の一組のパターンが、ある変異体パターンの複製に有利に働く選択工程を受ける工程である。選択工程は、該パターンによってコードされ、かつ基礎となる該パターンの変異の結果変化する表現性質（表現型）に影響する。一連の複製現象の間に、最も複製が有利であるパターンが該集団の中心となる。

パターンの変異は、個々のパターンにおける変化の結果、または個々のパターンの混合の結果生じる。どのパターンがその集団における優性パターンとなるかは、１つには用いた選択基準の結果であり、また１つには初期集団の機能に依存する。

生物および細胞において、優勢な複製パターンはヌクレオチド配列（ＤＮＡまたは（一部のウィルスにおいては）ＲＮＡ）より成り、その選択は、典型的には、他の分子、例えば該ヌクレオチド配列により直接的にまたは間接的にコードされるタンパク質、代謝物および構造的高分子（但しこれらに限定されない）を基準として行われる。

遺伝的アルゴリズムにおいて、複製パターンは、ソフトウェアによって規定される磁性状態より成り、選択が働く変異は、典型的には該磁性状態に直接的に、または間接的にコードされる数学的アルゴリズムの解である（但しこれらに限定されない）。

一連の所定の環境パラメーターにおいてパターンが複製する能力は、該パターンの「適応度」と呼ばれることが多い。適応度は、複製中のパターンが「最適化」しようとする数学的性質とみなすこともできる。所定のパターンの適応度が高くなると、それが自身の１またはそれ以上のコピーを産生する可能性が高くなり、それが平均して産生するであろうコピー数が多くなり、そしてそれが複製前に破壊される可能性が低くなる。数学的関数と同様に、最適化される性質はそれ自身、もともと独立していた性質の複合関数と考えられる。このように、進化は、２以上の基準にわたり最適化することができる。例えば、多くの雄昆虫の交尾期の鳴き声は、同じ種の雌を惹きつけるが、捕食動物は惹きつけないように最適化される。

つまり、遺伝物質を含有する細胞は原理上、各細胞内部で起こる遺伝子配列における変異、該変異が所定の一連の環境パラメーターにおける細胞の適応度に対してもたらす結果、およびこれらの遺伝子配列を子孫細胞に伝える細胞の能力に基づいて進化することができる。

本発明の目的では、「適応関数」なる用語は、スコアを計算する数学的または代数的方程式であり、ここでその方程式中の可変要素は、細胞集団内の相異なる細胞間で様々である出力変数を意味することを理解すべきである。

本発明の目的では、「適応スコア」なる用語は、該適応関数方程式によって生じるスコアとする。

それ故細胞について行われる選択工程はいずれも、以下の一般的手順に従って行うことができることは理解されるべきである：
・適応関数（Ｆ’）は、それが所望の細胞表現型を含み、これを測定可能なパラメーターに数学的に関係付けるように規定される。
・各細胞または細胞群を１またはそれ以上のパラメーターについて測定する。
・該細胞のＦ’を、測定したパラメーターに従って計算する。
・最高のＦ’スコアを有する細胞を該スクリーニングの所から取り除き、成長させる。低めのＦ’スコアを有する細胞は廃棄する。最高のＦ’スコアは上位のスコアを有する細胞の既定の割合を意味し、例えば上位１％、５％、１０％または５０％、または非常に高い選択圧としては上位１‰、上位０．１‰、上位０．０１‰、上位０．００１‰、または上位０．０００１‰である。

他のパターンと比較してあるパターンが選択される基準は基本的に任意であり、原理的にはどのような基準でも用いることができることは、重要な進化の教えである。工業化の結果であるの蛾の黒化の進化、様々な性質を有する血統書付きのイヌの進化、および、例えば商業的価値のある油のレベルが増強された、または結実期間がより均一な、または香りもしくは色がより魅力的な植物の進化により、任意の人為的基準を用いて、生物そのものにおいて進化過程を生じさせ得ることが例証されている。「育種」なる用語は、人為的進化を表すのにしばしば用いられる。その生物は、一連の所定の人為的基準に従ってそれらの適応度を増強させた。これら例から、適応関数方程式については、起こる進化について明示的に示す必要はないことは明らかであろう。

適応関数およびその結果生じる選択圧は、その生物に高い負担をかける（あるいは場合によってはその生物を殺す）表現型を発現する生物をもたらし得ることは、更なる教えである。この場合に必要なのは、それらが該表現型を生じる基礎パターンが普及できるようにする相殺利益を与えることだけである。１つの例はクジャクの尾の進化であり、それは尾を競争相手または捕食者に非常に見えやすくし、かつそれらから攻撃を受けやすくする一方で、仲間を引きつけ、そして繁殖する能力を改善する。二倍体またはそれ以上であり、かつ有性生殖をする生物においては、該集団の中で維持されるための総費用が妥当なレベルであるパターンのこともある。この一例は、西アフリカ人集団における鎌状赤血球貧血突然変異の維持である。該突然変異のヘテロ接合体型は（保因者のマラリアに対する抵抗性を強めることにより）利益を与えるが、一方ホモ接合体は犠牲が大きい（重い貧血をおこす）。ヘテロ接合体のプラスの利益により、結果としてその基礎パターンが該集団において比較的高頻度に維持される。

相異なる位置および時間に集団に作用する複数の選択圧は、該集団において複製中のパターンの変異性を生み出し、かつ維持するのを助けることは、更なる教えである。

２つの等しい選択圧を一見同一だが独立の２つの集団に適用する場合、これら集団はそれぞれ同様の表現型に進化するであろうが、該集団において優勢となる（および進化後の表現型与える）遺伝子パターンが集団間で異なる場合があることが更に知られている。同じ表現型を与える相異なる遺伝子パターンの例は、細菌のストレプトマイシン抵抗性である。

上記より、生物が幅広い環境圧に対して複雑な進化応答をする能力があることは明らかである。

本発明の進化は、図２１に示すように、細胞組成物をスクリーニングにかける段階および既定の機能性を示す細胞を選択する段階の連続またはサイクルに基づく。該サイクルは、所望の機能性、例えば標的特異性および活性が得られるまで繰り返される。別の一般的スクリーニング方法の例は、図２２に図示される。

言いかえると、本発明の進化方法は、以下のものの提供に基づく：
１．適当な一組の多様性ある遺伝子パターンの組、およびまた、
２．それらの性質と一致する表現型をコードする該組内の遺伝子パターンを選択する方法、およびまた、
３．段階２において選択された遺伝子パターンから新規遺伝子パターンを生成する方法。

そして、これらの段階を連続的に、または平行して、あるいは基本的に反復を基礎とした他の方法で組み合わせてよい。本発明は、いかにしてこれら要件を満たすかを提示する。

本発明の別の局面において、該方法は、宿主細胞において、多様な自然界、門、または目の起源に由来する経路を形成することに適用してもよい。この例は、(真菌、藻類および／または植物から得た)カロテノイド産生経路をコードする遺伝子および（哺乳類から得た）ビタミンＡの合成をコードする遺伝子または（昆虫から得た）視覚色素産生をコードする遺伝子の導入によって、レチノイドまたは他の分子を産生する経路を形成することであろう。このように、生化学的経路の要素を界または門を越えて的を絞って選択し、組み合わせることにより、新規代謝物が得られる見込みがさらに増加するであろう。

前述したように、適応関数(Ｆ’)は、所望の細胞表現型を封入し、これを１またはそれ以上の測定したアウトプットに数学的に関係付けるものと規定することができる。例えば、適応関数は、２つの相異なる波長での細胞の吸収の掛け合わせとして規定してもよく、あるいは別の酵素の阻害で割ったある酵素の阻害レベルとして規定してもよく、あるいは細胞毒素の非存在下の細胞の複製率を乗じた、細胞が生存可能な細胞毒のレベルとして規定してもよく、あるいはその他多数の方法により規定することができる。

各スクリーニング・ラウンドにおいて、適応関数の１またはそれ以上の要素と一致するアウトプットを有する細胞が選択される。好ましい態様においては、初期のスクリーニング・ラウンドが１つのアウトプットのみを測定し、一方後期のスクリーニング・ラウンドが複数のアウトプットを測定する。

集団において最高の適応スコアを有する細胞を、後に使用および／または解析するためスクリーニング環境から取り除く。低い方のＦ’スコアを有する細胞は廃棄してよい。最高のＦ’スコアは上位のスコアを有する既定の割合を意味することができ、例えば上位１％、５％、１０％または５０％、あるいは非常に厳しい選択または非常に大きな細胞集団については上位１‰、上位０．１‰、上位０．０１‰、上位０．００１‰、または上位０．０００１％である。あるいは、絶対適応スコアを規定することができ、このスコアを越えた細胞のみを選択する。この手法によれば選択される細胞の割合は変化し得る。

本発明の好ましい態様において、スクリーニングおよび選択工程は繰り返して、または反復して行われるべきであり、ここで各反復は娘集団に対して行われる。

スクリーニング・ステップの各反復について、細胞を分類する基礎となる適応スコアが規定され、細胞集団がスクリーニングを受ける。一連の反復にわたり、次第に所望の標的値に接近するように適応スコアを変更する。適応スコアは、増大させることにより、あるいは適応スコアを導き出す方程式に更なる因子を付加することによって変化させ得る。

こうして選択基準は、必要なスクリーニングおよび選択のラウンドまたはサイクルを通して、次第に所望の機能性へと最適化される。該段階は、所望の機能性を有する細胞が少なくとも１つ進化するまで繰り返し、例えば少なくとも２回、例えば少なくとも３回、例えば少なくとも４回、例えば少なくとも５回、例えば少なくとも１０回、例えば少なくとも２０回、例えば少なくとも５０回、例えば少なくとも１００回、例えば少なくとも２００回繰り返す。

別の態様においては、所望の機能性を有する少なくとも２つの細胞株、または少なくとも５つの細胞株または少なくとも１０の細胞株が進化するまで該段階を繰り返す。好ましい態様においては、進化した細胞株の少なくとも一部は、相異なる遺伝子パターンまたは遺伝子型を有し、より好ましい態様においては、進化したすべての細胞株が相異なる遺伝子パターンまたは遺伝子型を有する。細胞株なる用語は、測定したスクリーニングの対象の機能性に関する選択基準を満たしていた細胞に由来する細胞を意味する。

１またはそれ以上のアウトプットのための選択基準(または閾値)は、各反復で増強してよい。基準の増強は例えば、各反復ごとの成長培地中の化学物質、例えば毒素の濃度の上昇、あるいは、成長培地中の１またはそれ以上の栄養要素の濃度の減少、あるいはレポーターコンストラクトの感受性または近接性の減少であってよい。基準の増強の他の例は、選択した細胞タイプに依存して上昇または低下する、温度の反復的変化であってよい。

選択基準は各反復につき特性が変化してもよく、例えば成長培地中の化学物質の濃度ではじまり、次の段階で光のような物理的パラメーターを付加してもよく、あるいはある酵素に対する活性の測定にはじまり、次の段階で別の酵素に対する活性を付加してもよい。

選択基準が、前述の基準を混合したもの、即ち物理的パラメーターの変化と組み合わせた化学物質の濃度の上昇、および／または別の化学物質の濃度変化と組み合わせたある化学物質の濃度の上昇であり得ることもまた、本発明の範囲内である。

この手法を通して、および進化の一般的原理に従い、一連のスクリーニングおよび選択サイクルの間に、ほぼ必要な特性を示す選択宿主系が選択され、集団において中心的となる。一連のスクリーニングの間に必要な適応スコアが引き上げられ、または入念に検討され、所望の特性の発現が改善された組み合わせが支持される。

ある態様においては、所定の標的にとって興味深いと以前から確信されていた宿主細胞系を選択し、選択した系を図２１に提示するように一連のスクリーニングを通して進化させる。

別の態様においては、本手法は、一般的な／低い活性から特異的な／高い活性へ移行し、各段階の間に新規遺伝子パターンを形成するスクリーニングを用いた、選択圧の漸増の１つである。

別の態様においては、適応スコアを選択サイクル間で意図的にごくわずか上昇させ、それは例えば５０％未満、または２５％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満である。このような漸進的選択圧により、一連の選択サイクルにわたり低レベルの応答を積み上げることが可能となる。適応スコアのわずかな改善を選択することにより、この手法は、選択工程における各場面での遺伝子多様性を最大化する。

新規遺伝子組成物の形成
新規パターンが、選択段階と平行して、あるいは連続して形成されることが、進化過程の要件である。該パターンが遺伝的要素に基づくシステムにおいては、新規遺伝的要素が導入されるか、既存の遺伝的要素の新規組み合わせが創造されるか、あるいはその両方のいずれかが必要とされる。

本発明において、新規パターンは、１またはそれ以上の以下の工程を通して得ることができる。組み合わせまたは練り直し（remixing）なる用語は、これら手法のうち１またはそれ以上を用いて発現コンストラクトの新規組み合わせを形成する工程を意味すると理解すべきである。組み合わせまたは練り直しは、選択工程のいずれの段階でも行うことができ、好ましいタイミングは、既定の機能性の要素を有する細胞が組成物の少なくとも１つに見られる時であり、好ましくは組成物の少なくとも０．１％、例えば少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または少なくとも５０％である。娘集団なる用語は、主に遺伝的に、１またはそれ以上の細胞集団において一定の閾値より上の適応スコアを有する細胞の子孫であり、更に該娘集団の大部分の細胞が練り直し段階を通して形成されたことによって特徴付けられる細胞集団を意味すると理解すべきである。

原理上は、組み合わせまたは練り直しは、少なくとも以下の手法によって行うことが出来る：発現カセットの物理的単離および練り直し、発現カセットを含む人工染色体の単離および練り直し、有性交配、細胞-または原形質融合 (vide Hugerat Y, Spencer F, Zenwirth D, Simchen G (1994). Genomics 22(1), p. 108-117)、およびＹＡＣ−ダクション (vide Curran BP, Bugeja VC (1996), Methods Mol. Biol. 53, p 45-49）。物理的練り直しの例は図２３に図示されている。

物理的単離の１つの利点は、蓄積していく宿主の突然変異が、新規宿主系への遺伝子の練り直しによって取り除かれることである。レポーター遺伝子もまた、この工程の一部として導入することができ、細胞内レポーターアッセイの導入が可能となる。練り直しは、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも２つの相異なる細胞から発現可能配列を単離し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで個々の発現可能配列を組み合わせて新規組み合わせとし、そして組み合わせた発現可能配列を細胞へ導入して相異なる組み合わせを有する少なくとも２つの細胞を得ることによって行う。

本発明の好ましい態様に従う発現カセットの共通の構造によって（９８頁から始まる「鎖状体」の節参照）、これらは、ｒｓ_１−ｒｓ_２制限酵素部位に特異的な制限酵素を用いて宿主細胞から再度容易に切り出すことができる。本発明によれば、ｒｓ１−ｒｓ２制限酵素部位に特異的な酵素は珍しい制限酵素であり、それ故発現カセットのサイズとよく似たサイズに宿主ゲノムＤＮＡ断片が切断される可能性が非常に限られることが好ましい。切り出し後、発現カセットを同様の構造を有する他の発現カセットと組み合わせ、再び連結して新規組み合わせを生産し、そして別の組み合わせにおける別の宿主細胞に再挿入して、進化段階の間により大きな多様性を創造する。

発現可能配列の組み合わせは、無論、該細胞における完全長染色体の組み合わせ、例えば人工染色体の組み合わせであってもよい。人工染色体の組み合わせは、宿主細胞に依存して少なくとも４つの方法で得ることができる。本明細書に記載されるように、これらは、物理的単離、交配、原形質融合、およびＹＡＣ-ダクションである。

発現カセットを物理的に練り直しする別の方法は、１またはそれ以上の細胞集団から人工染色体を単離し、新規宿主細胞を再び形質転換するものである。該宿主細胞は、発現カセットを含む人工染色体を既に含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。

このように、新規遺伝子組成物は、２(またはそれ以上)の集団において相異なる交配型を誘導し、その後有性交配を行い、染色体の正常相補体について二倍体であり、かつ該交配における両方のパートナーの人工染色体を含む細胞を生み出すことによって行うことができる。

新規遺伝物質の追加
練り直しは、好ましくは別の細胞組成物由来の遺伝物質を追加して行う。その別の組成物は、少なくとも１つの既定の表現型、例えばタンパク質または代謝物、所定の代謝経路またはその一部を発現する能力がある組成物から選択してもよく、あるいはランダムに選択してもよい。

ある態様においては、一連の独立した集団において選択を行い、一旦別々に有用な形質を進化させた後に一緒することが望ましい。これに関して、同じ表現型について別の選択を使用すると、観念的には後に互いに相乗的に作用し得る、相異なる遺伝的バックグラウンドが提供される(平行進化の型）。

別の態様においては、所望の機能性を有する少なくとも１つの細胞を目的とする場合、２またはそれ以上の組成物における選択の結果を進化のある段階で合わせ、さらに改変された組成物を創出する。

発現可能配列の組換え、即ち例えばクロスオーバーによる遺伝物質の変化は、任意で、遺伝子挿入、特にスペーサー配列の構築を介して、および細胞における組換えを抑制する通常の試みによって避けることができる。これに関して、組換えにより遺伝物質の機能を破壊する危険性が低い、無傷の遺伝子またはｃＤＮＡ物質の組み合わせが好まれる。

所望の機能性を示す娘集団を得たら、細胞を最適化するため、該娘集団をスクリーニングおよび選択の更なる段階にかけてもよい。

進化した細胞
別の局面において本発明は、所望の機能性を有する進化した細胞に関する。好ましい態様においては、進化した細胞は、出発材料に関して前述した遺伝子構築を有するが、初期集団とは異なる異種性遺伝物質の組み合わせを有することが多い。

所望の表現型をもたらす遺伝子をなんとかして最適化するため、進化した細胞を所望の機能性に関与する遺伝子に関する解析にかけてもよい。

しかしながら、該細胞はまた、新規代謝物または新規経路を産生する能力のある産生細胞として使用してもよい。この点において、進化した細胞は、例えば発酵タンクにおける産生に適した細胞であることが好ましい。

新規分子および経路
本発明の進化方法の目的は、新規代謝物、新規タンパク質のような新規物質を産生することができ、かつ／または新規経路を有することができる細胞を進化させることである。

従って、更なる局面において本発明は、本発明に従って進化した細胞により産生される物質に関し、ここで該物質は、代謝物、タンパク質、炭水化物、ポリ−およびオリゴサッカライドおよび核酸である。新規表現型を生じる相互作用のいくつかは酵素によって仲介されるので、その結果には、化学合成によっては生産するのが特に難しいキラル中心を有する新規化合物が含まれるであろう。

新規経路の創出は、天然の非進化細胞によっては代謝不可能な化合物を代謝、即ち変換する能力のある細胞を創出する可能性につながり得る。

経路形成の具体的方法
別の態様において、該方法は、スロットマシンをするのと似た様式で、特定の複数段階代謝物経路を進んでいくものである。該経路の第一段階を得たら、該段階のための遺伝物質を、細胞集団のほとんどの細胞が該遺伝物質を含むようにその相対存在量を増やすことによって「保留」し、そして第二段階を達成するまで残りの遺伝物質を変化させ（回転させ、または選び出し）、その後それもまた「保留」する。この工程を経路全体が得られるまで繰り返す。

他の態様においては、該方法は、特定の複数段階経路の構築を逆行するものである。該経路の最後の段階を得たら、該段階のための遺伝物質を、細胞集団のほとんどの細胞が該遺伝物質を含むようにその相対存在量を増やすことによって「保留」し、そして次の終わりの段階を達成するまで残りの遺伝物質を変化させ（回転させ、または選び出し）、その後それもまた「保留」する。この工程を経路全体が得られるまで繰り返す。

また、該経路が「両端」から作られるように、両態様を組み合わせて行ってもよい。

本発明のある態様においては、細胞にとって異種性の遺伝子も含めて、細胞によって発現される遺伝子の数が最大となる条件下で細胞に選択基準を課す。あるいは、細胞にとって異種性の遺伝子のサブセットの一定の割合のみが発現する条件下で細胞に選択基準を課す。

上記方法は概念的には一般的であり、所望の目標に依存して、多くの変異体の構築に役立つことは理解されるべきである。

更に、細胞基盤システムを使用することによる利点は、適応関数に含まれないパラメーターに基づいて化合物を選択し得ることであることは理解されるべきであり、ここで該システムは例えば細胞に対して無毒な性質を示す化合物および細胞内で迅速に拡散する化合物の進化を本質的に促進する。

既知の、または構造的クラスに焦点を絞った経路を作る方法の例は以下である：
小型から中型の経路、即ち宿主細胞の代謝物から６−７段階までの経路については、スクリーニング方法は、適当な遺伝子を有するファンダー集団（founder population）を豊富（エンリッチ）にでき、および一連の選択ラウンドの間に所望の性質を低レベルで生じる経路を組み立てる可能性がかなり高いことに依存する。

大型の経路（即ち６−７段階以上）については、スクリーニング方法は、経路をサブセットに分け、ａ）経路を前向きに築くために各サブセットにつきスクリーニング・パラメーターを規定し、あるいはｂ）経路を後ろ向きに組み立てるために細胞集団に供給される中間代謝物を同定することに関与し得る。

例えば、レチノイド様化合物の場合、カロテノイドが特定のクラスの生物における特定の組織によって代謝されレチノイドが産生されることがよく知られている。従って、初めにカロテノイドを産生する細胞の集団を進化させ、そして本集団の遺伝子をレチノイド遺伝子についてエンリッチされた集団の遺伝子と混合し、このようにしてレチノイド様化合物を産生する集団を進化させることが可能である。

別の例がタキソール様化合物の場合であり、その正確な生合成経路は知られていないが、酵母代謝物から１２−２０くらいの酵素的段階と予想されており、その中間化合物の幾つかが単離されている。従って、タキソールから数段階離れた代謝物からタキソール様化合物を産生可能な細胞の集団を同定するため、この前駆物質の供給から始めることができる。一旦これが達成されると、その小型経路に関与する遺伝子はロックされ、例えば、統計的にほとんどの細胞で起こるように高いレベルで宿主ゲノムに統合され、または人工染色体に組み込まれ、そして第二の進化工程が開始される。この回に該細胞集団に供給される前駆物質は、タキソール生合成に由来するより初期の代謝物である。これら部分的進化を何回も繰り返すことにより、宿主代謝物から開始してタキソール様化合物を産生する細胞の集団を進化させることが可能である。

最後に、前述の両方法の組み合わせを使用して、即ち経路を後ろ向きおよび前向きにカバーする同時進化工程を開始することによって、あるクラスの化合物を産生することもまた可能であることを言っておかなければならない。

多様な遺伝子パターン
進化が統計学的工程であることを考慮すると、選択工程が作用することができる十分な遺伝子バリエーションを提供することが必要である。本発明において、これは２つの要素を含む：
・十分に大きくかつ多様性のある集団を提供すること。
・該多様性の遺伝学的基盤およびその発現方法を調節すること。

選択は、操作対象に遺伝的多様性を必要とする。従って本発明の第一の要件は、遺伝的多様性を具現化した細胞集団を提供することである。「遺伝的多様性」なる用語は、ほとんどの細胞が初めは他のいずれの細胞においても現れていない遺伝子型を示すように、相異なる遺伝子および／または相異なる調節システムの調節下にある同一の遺伝子を含む点で、実質的に全ての細胞が相異なることを意味する。無論、細胞分裂により、幾つかの細胞は実質的に同一であり得る。

「細胞集団」なる用語は、該集団の少なくとも１０^４細胞、例えば少なくとも１０^５細胞、例えば少なくとも１０^６細胞、例えば少なくとも１０^７細胞、例えば少なくとも１０^８細胞、例えば少なくとも１０^９細胞、例えば少なくとも１０^１０細胞、例えば少なくとも１０^１１細胞、例えば少なくとも１０^１２細胞、例えば少なくとも１０^１３、例えば少なくとも１０^１４、例えば少なくとも１０^１６、例えば少なくとも１０^１８、例えば少なくとも１０^２０細胞が、残りのいずれの細胞にも現れていない遺伝子型を示す、細胞の集団を意味すると理解すべきである。

つまり、本発明による進化方法の原則は、非常に高い遺伝的多様性を有する細胞の集団を得ることである。

この原則の１つの具体的態様は、新規かつランダムな遺伝子産物の組み合わせを単一の細胞内において産生するように、様々な無関係の、または遠縁もしくは近縁の種から、あるいは相異なる界または門の種から得た数多くの相異なる発現状態に由来する発現可能ヌクレオチド配列を有するカセットを含む鎖状体の組み合わせを有する細胞を産生することである

新規遺伝子を宿主細胞に挿入することにより、特に相異なる発現状態に由来する、例えば多様な種に由来する多数の新規遺伝子を宿主細胞に挿入することにより、この数々の新規遺伝子に由来する遺伝子産物は、宿主細胞の代謝物のプールと、またそれら自身互いに相互作用し、新規な方法で既知の代謝物および／または中間体を修飾し、新規化合物を創造するであろう。本発明の方法を用いて形成し得る実質的に相異なる細胞の数が、非常に多い、例えば少なくとも１０^４細胞、例えば少なくとも１０^５細胞、例えば少なくとも１０^６細胞、例えば少なくとも１０^７細胞、例えば少なくとも１０^８、例えば少なくとも１０^９、例えば少なくとも１０^１０、例えば少なくとも１０^１２であるため、この大きな集団はこのような相互作用を有する亜集団を必ずもたらす、または少なくとももたらし得る。このような相互作用を有する該亜集団は最大で１０^１０細胞、例えば最大で１０^９細胞、例えば最大で１０^８、例えば最大で１０^７細胞、例えば最大で１０^６細胞、例えば最大で１０^５細胞、例えば最大で１０^４細胞、例えば最大で１０^３細胞、例えば最大で１０^２細胞または単に１０細胞を含み得る。

宿主細胞
本目的のために選択された宿主細胞は、好ましくは標準的な培地や実験手順など標準的な実験室環境において標準的な培養環境を用いて培養できる。好ましくは宿主細胞は、適当な方法で鎖状体の細胞分裂期を維持させることができる実質的に安定な細胞系からなる。宿主細胞を形質転換する標準的な技術が利用可能なこと、特に人工染色体を宿主細胞に挿入する方法が知られていることはまた大きな強みである。宿主細胞はまた産生細胞と表される。

宿主細胞に性染色体を組換える減数分裂能があるならばまた有利である。減数分裂が細胞培養液の外部操作によって制御できることはまた好都合である。特に有利な宿主細胞型は、外部操作によって異なる接合型へ処置できるものである。

ただし、宿主細胞は好ましくは相同的組換えを起こす能力を欠いているべきである。宿主細胞は好ましくは供与体生物のコドンと類似したコドンを持つべきである。さらに非相同なゲノムＤＮＡである場合、真核生物供与体が用いられるならば、例えばイントロンをスプライスするなど、宿主細胞が供与体メッセンジャーＲＮＡを適当に加工する能力を持つのが好ましい。

宿主細胞は細菌、古細菌または真核生物のものでよく、相同細胞株または混合培養を構成できる。適当な細胞には細菌および真核生物細胞株が含まれ、通常遺伝子操作およびタンパク質発現に用いられる。適当な哺乳類の細胞には例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類およびヒトの細胞、相同細胞株および初代培養が含まれる。

好ましい原核生物宿主には、大腸菌（Escherichia coli）、バシラス スブティリス（Bacillus subtilis）、バシラス リセニフォルミス（B.licehniformis）、バシラス セレウス（B.cereus）、ストレプトミセス リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、シュードモナス アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、ミクソコッカス キサンタス（Myxococcus xanthus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、ストレプトミセス属（Streptomycetes）、アクチノミセス属（Actinomycetes）、コリネバクテリア属（Corynebacteria）、バシラス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、サルモネラ属（Salmonella）およびエルビニア属（Erwinia）が含まれるが、これに限定されない。大腸菌とバシラス スブティリスの完全なゲノム配列はBlattnerら、Science 277、1454-1462 （1997）; Kunstら、Nature 390、249-256 （1997））に記載されている。

好ましい真核生物宿主は哺乳類、魚、昆虫、植物、藻類および菌類である。

哺乳類細胞の例には、例えばサル、マウス、ラット、ハムスター、霊長類およびヒトの細胞、両細胞株および初代培養が含まれる。好ましい哺乳類宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａなど、ヒト、サルおよび齧歯類由来の細胞（Kriegler M. in 嶋笂`子 Transfer and 発現: A Laboratory Manual煤ANew York、Freeman & Co. 1990参照）、および胚幹細胞、造血幹細胞を含む幹細胞、接合子、繊維芽細胞、リンパ球、腎臓、肝臓、筋および皮膚細胞が含まれるが、これらに限定されない。

昆虫細胞の例にはバクロ レピドプテラ（baclo lepidoptera）が含まれる。

植物細胞の例には、トウモロコシ、イネ、コムギ、ワタ、ダイズおよびサトウキビが含まれる。タバコおよびシロイヌナズナ由来の細胞などの植物細胞が好ましい。

菌類の例には、ペニシリウム属（penicillium）、アスペルギルス ニデュランス（Aspergillus nidulans）などのアスペルギルス属（aspergillus）、ポドスポラ属（podospora）、ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）などのニューロスポラ属（neurospora）、サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）（出芽酵母（budding yeast））などのサッカロミセス属（saccharomyces）、スキゾサッカロミセス ポムベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母（fission yeast））などのスキゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）およびハンセヌラ ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（メチロトローフ酵母（methylotropic yeasts））などのピキア種（Pichia spp）が含まれる。

宿主選びは、病原性、基質の範囲、環境に対する耐久性、重要な中間体の有無、遺伝子操作の容易さ、および他の生物との遺伝情報の交雑移入可能性を含む多くの要因に依存し、また人工宿主を意図して使用するかにも依拠する。

宿主細胞は、次の特徴により酵母が好ましい：成長が速い、真核生物である、培養規模が可変である、遺伝子操作が可能である、代謝が活発である、比較的透過性のある細胞膜／壁を持つ、および原核細胞と比較して非相同な真核生物タンパク質を正確に併せ持つ。

実例となるが限定はされない適当な酵母宿主細胞を列挙する：パン酵母（baker’s yeast）、クルイウェロミセス マルクシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、クルイウェロミセス ラクティス（K. lactis）、カンディダ ウティリス（Candida utilis）、ハッフィア ロドジーマ（Phaffia rhodozyma）、サッカロミセス ボウラルジー（Saccharomyces boulardii）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）、ハンセヌラ ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ヤロウィア リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、カンディダ パラフィニカ（Candida paraffinica）、スクワニオミセス カステリー（Schwanniomyces castellii）、ピキア スティピティス（Pichia stipitis）、カンディダ シェハタエ（Candida shehatae）、ロドトルラ グルティニス（Rhodotorula glutinis）、リポミセス リポファー（Lipomyces lipofer）、クリプトコッコス クルワタス（Cryptococcos curvatus）、カンディダ種（Candida spp.）（例えばカンディダ パルミオレオフィラ（C. palmioleophila））、ヤロウィア リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンディダ グィリエルモンディー（Candida guilliermondii）、カンディダ属（Candida）、ロドトルラ種（Rhodotorula spp.）、サッカロミコプシス種（Saccharomycopsis spp.）、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）、カンディダ ブルムティー（Candida brumptii）、カンディダ ヒドロカルボフマリカ（Candida hydrocarbofumarica）、トルロプシス属（Torulopsis）、カンディダ トロピカリス（Candida tropicalis）、サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ロドトルラ ルブラ（Rhodotorula rubra）、カンディダ フラウェリ（Candida flaveri）、エレモテシウム アシュビー（Eremothecium ashbyii）、ピキア種（Pichia spp.）、ピキア パストリス（Pichia pastoris）、スキゾサッカロミセス ポムペ（Schizosaccharomyces pompe （分裂酵母（fission yeast））、クルイウェロミセス属（Kluyveromyces）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クロエケラ属（Kloeckera）、ピキア属（Pichia）、パキソレン種（Pachysolen spp.）またはトルロプシス ボムビコラ（Torulopsis bombicola）。

好ましくは、宿主細胞は中心的生合成経路に少なくともひとつの変異を持つ。この変異は、非相同発現可能ヌクレオチド配列を含むベクターに挿入された選択可能マーカーによって見分けられる、すなわちそのベクターを持つ細胞は選択可能である。

いずれの宿主細胞においても、可能性のある全ての配列から発現可能ヌクレオチド配列の種々の組み合わせを作ることが可能である。さらに、プロモーターおよび／またはスペーサーおよび／またはイントロンおよび／またはターミネーターの組み合わせを同一の発現可能ヌクレオチド配列と組み合わせて作ることが可能である。

好ましい態様において、進化細胞は、多数のカセットを含む鎖状体を宿主細胞に挿入することにより産生され、その宿主細胞中で鎖状体は維持でき、発現可能ヌクレオチド配列は同調的に発現できる。鎖状体に含まれるカセットは宿主細胞から切り出してもよく、−好ましくは−カセット間に互換性制限酵素認識部位を有する構造的な統一性により再構築できる。

本発明において定義された細胞は、好ましくは本発明を使用するために集団状に収集される。進化に供される細胞組成物は、集団またはいくつかの亜集団から細胞を選択することによって産生される。個々の細胞集団は、供与体の多数の種由来の、無作為に構築または連結された発現可能ヌクレオチド配列から調製された発現コンストラクトの集団であり、発現可能ヌクレオチド配列は、適当な宿主細胞において発現可能ヌクレオチド配列の発現を駆動する調節領域と操作的に関連している。用いられる宿主細胞は供与体の機能遺伝子産物の産生が可能である。宿主細胞における発現の上、供与体の遺伝子産物は相互作用し、新たな生合成経路を形成する。

本発明のこの態様による集団は、いずれの細胞においても、独特且つ、好ましくは宿主細胞に対して非相同な多数の発現カセットの無作為な組み合わせを含む。この発現カセットの無作為な組み合わせにより、それぞれの細胞から新しく独特な遺伝子産物の組み合わせが得られる。そのような集団は、非天然の遺伝子産物の組み合わせにより作り出される新たな代謝経路の発見に特に適している。

好ましい態様において、集団は個々の細胞を含む集団として定義され、その細胞は次のように表わされる
細胞_１、細胞_２、．．．、細胞_ｉ、ここでｉ≧２であり、
各細胞は個々のオリゴヌクレオチド カセットの少なくともひとつの鎖状体を含み、各鎖状体は次式のオリゴヌクレオチドを含む：
［ｒｓ_２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ_１］_ｎ
［式中、ｒｓ_１およびｒｓ_２はともに制限酵素認識部位を表し、ＳＰは少なくとも２塩基のスペーサーを表し、Ｘは発現可能ヌクレオチド配列を表し、ＰＲは該細胞において機能可能で、該細胞においてＸの発現の制御が可能なプロモーターを表し、ＴＲはターミネーターを表し、ｎ＞＝２であり、
細胞１の少なくともひとつの鎖状体が細胞２の鎖状体とは異なる。］。

本明細書において、式［ｒｓ_２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ_１］_ｎのヌクレオチドは式［ｒｓ_２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ_１］_ｎの発現カセットとしても用いられる。

亜集団は上記の集団において定義した細胞を含みうるが、亜集団の細胞は、共通のプロモーターの組み合わせ、共通の種からの遺伝物質、共通の表現型など、少なくとも１つの共通の形質を持つ。

集団と亜集団の機能は、進化すべき細胞組成物を得る場合は多様性の起源として働くことである。このように、一態様において、組成物は亜組成物の集まりであり、亜組成物は少なくともひとつの表現型を共通して持つ個々の細胞の集まりである。好ましい態様において、組成物は少なくとも２つの、または少なくとも５つの、または少なくとも１０の個々の異なる亜組成物を含み、それぞれの亜組成物は少なくとも１０個の、または少なくとも５０個の、または少なくとも１００個の、または少なくとも１０^３個の、または少なくとも１０^４個の、または少なくとも１０^５個の、または少なくとも１０^６個の、または少なくとも１０^７個の、または少なくとも１０^８個の、または少なくとも１０^９個の遺伝的に異なる細胞を含む。

細胞組成物は好ましくは少なくとも２０個の、または少なくとも５０個の、または少なくとも１００個の、または少なくとも１５０個の、または少なくとも２００個の、または少なくとも２５０個の、または少なくとも５００個の、または少なくとも７５０個の、または少なくとも１０００個の、または少なくとも１０^４個の、または少なくとも１０^５個の、または少なくとも１０^６個の、または少なくとも１０^７個の、または少なくとも１０^８個の、または少なくとも１０^９個の遺伝的に異なる細胞を含む。

好ましい態様において、少なくとも個々の細胞の大多数は異なる遺伝的パターンまたは遺伝子型を有しており、それにより多様性が大きい。

「ファンディング集団（founding population）」または「ファンダー集団（founder population）」なる語はそれ自身選択ラウンドをうけていない細胞集団を意味し、本明細書においてはまた細胞組成物を意味する。随意的に、細胞集団中の発現コンストラクトは、所望の構造的クラスの化合物、または求める機能効果を持つ化合物を産生することが従来から知られている種、または該化合物についての知見とは無関係に求める機能効果と関係する種の遺伝物質が優勢であるように構成されている。

「娘集団」なる語は、少なくとも１回の選択ラウンドを受ける細胞集団である。本明細書においてはまた、娘集団はさらに改変された組成物として用いられる。

多様性の遺伝的基礎の制御
遺伝子の起源
自然界には著しい量の遺伝的多様性が存在する。様々な権威者が、少なくとも１０^７種の異なる種が存在し、これらの種はそれぞれ少なくとも平均１０^４個の遺伝子を持つと推定している。これらの遺伝子の多くは種間で比較的保存されているという事実を考慮しても、これは高いレベルの遺伝的多様性を表している。

本発明の目的に適すると思われる１つのアプローチは、得られた遺伝子の分類学的多様性が最大となるように遺伝物質を調達することである。

２つめは、遺伝物質を、構造的クラスの分子または求める機能効果を持つ分子を産生することが知られている、またはそのように考えられている生物、または既知の分子によらず求める機能効果を持つことが知られている、またはそのように考えられている生物またはあらゆるそのような生物と分類学的に類縁の生物から調達することである。

３つめのアプローチは、特に興味のある遺伝子の選択である。

４つめのアプローチは、一般に宿主の代謝経路を拡張する遺伝子を選択することである。

これらのアプローチはあらゆる適当な方法で任意に合体させることが出来る。

遺伝子はその集まりから調達でき、様々な形態の遺伝物質に加工することが出来る。ベクター、鎖状体および本発明によるところの細胞に挿入可能な発現可能ヌクレオチド配列は、ＲＮＡやＤＮＡなどあらゆるタイプのヌクレオチドを包含する。そのようなヌクレオチド配列は例えば本質的に発現可能であるｃＤＮＡなどから得ることが出来る。しかし特定の遺伝子をコードするゲノムＤＮＡ配列を用いることも可能である。好ましくは、発現可能なヌクレオチド配列は、実質的に完全長であるｃＤＮＡのような完全長遺伝子に相当するが、完全長クローンよりも短いペプチドをコードするヌクレオチド配列を用いてもよい。より短いペプチドでも天然のタンパク質の触媒活性を依然として残し持っているかもしれない。ゆえに、本発明の好ましい態様はｃＤＮＡを得るために伝令転写物（ｍＲＮＡ）を調達し集めることである。

発現可能なヌクレオチド配列を得る他の方法は、既知のペプチドやタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列の化学合成による。本質的には自然発生のヌクレオチド配列を用いるのが好ましいが、このような発現可能ＤＮＡ配列は自然発生の配列でなくともよい。ＤＮＡが１本鎖か２本鎖かどうかは用いられるベクター系に依拠するであろう。

「発現状態」なる語は、あらゆる時点で収穫された、特定種の特定の細胞、組織、組織の組み合わせまたは生物における遺伝子発現の状態（例えばｍＲＮＡ転写物集団）を意味する。相異なる個体、または同一個体の異なる時点、または同一個体の異なる生活環上の時点、または同一個体が異なる外部環境下に置かれた場合に、異なる発現状態が見られる。特定個体の特定の細胞または組織の発現状態は、同一個体の他の細胞や組織に対して異なる。いずれの種または個体においても、同一器官や組織を異なる環境状態においた場合もまた異なる発現状態が得られる。ここにおける環境状態は次に示すものを含むがそれらの変化に限定されない：発生過程、年齢、疾患、感染症、乾燥、湿度、塩分、生体異物への被爆、生理学的エフェクター、温度、圧力、ｐＨ、光、ガス環境、毒物などの化学薬品。

続いて本発明を、進化可能な人工染色体を含む形質転換宿主細胞を得るための操作が遂行される順番に沿って、始めにエントリーベクターから記載する。

ほとんどの場合において発現可能ヌクレオチド配列のプロモーターに対する位置づけは、コード鎖が適当なｍＲＮＡに転写される、というものであろう。ところが、配列が逆転され、特定遺伝子の発現をブロックするアンチセンスな転写物が生成されるということも考えられる。

細胞集団のそれぞれの細胞は、始めに少なくともひとつの発現状態から選択された遺伝子を組み合わせることにより産生される。もちろん始めから、ひとつの宿主細胞中で２、３、４またはそれ以上の発現状態から選択した遺伝子を、またはひとつの細胞中で異なる生物から選択した遺伝子を組み合わせることも可能である。本発明のいくつかの態様において、幅広い種の生物からひとつの宿主細胞に、それぞれの細胞が少なくとも２つの発現可能ヌクレオチド配列を含むようになる方法で、遺伝子を組み入れるのが好ましく、その配列は細胞中で非相同、すなわち天然の細胞型には見つからない配列である。

全ての可能性のある起源からの発現可能ヌクレオチド配列の多種多様な組み合わせが細胞内で生じる。さらに、プロモーターおよび／またはスペーサーおよび／またはイントロンおよび／またはターミネーターの組み合わせを同一の発現可能ヌクレオチド配列と組み合わせて作成することが可能である。

従って、いずれの細胞においても、２つの異なる発現状態からの発現可能ヌクレオチド配列があるのが好ましい。さらに、これらの２つの発現可能ヌクレオチド配列は１つの種からか、またはより有利には２つの異なる種からであってもよい。いずれの宿主細胞もまた、少なくとも３つの種、例えば４、５、６、７、８、９または１０種などからかまたは、１６種以上、例えば２１種以上などから、例えば３１、４１または５１種以上から、例えば１０１種以上の異なる種から、例えば３０１種以上の異なる種から、例えば５０１種以上の異なる種から、例えば７５１種以上の異なる種からの発現可能ヌクレオチド配列を含んでもよく、それにより多数の種からの多数の発現可能ヌクレオチド配列の組み合わせが得られる。この方法で、発現可能ヌクレオチド配列の潜在的な無限の組み合わせを、異なる発現状態にわたって組み合わせることが出来る。これらの異なる発現状態は少なくとも２つの異なる組織や器官、種、または属に存在してもよい。異なる種は、少なくとも２つの異なる動物門、綱、植物門、より好ましくは亜界や界からのものであってもよい。つまり、同一細胞中に真核生物と原核生物からの発現可能ヌクレオチド配列が組み合わさっていてもよい。

本発明の別の態様によると、発現可能ヌクレオチド配列は、同一発現状態からのものであってもよい。これらの配列の産物は互いに、および宿主細胞の遺伝子の産物と相互作用し、新規な生化学経路を導く新しい酵素の組み合わせを形成しうる。

遺伝的多様性の起源
構造的にまたは機能的に有用な化合物を産生する既知の種のグループおよび個々の種の例は次のものを含むがこれに限定されない
細菌 ストレプトミセス属（Streptomyces）、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）、ノルカディア属（Norcadia）、アクチノマデュラ属（Actinomadura）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、ストレプトスポランギウム属（Streptosporangium）、ミクロビスポラ属（Microbispora）、キタサトスポリアム属（Kitasatosporiam）、アゾバクテリウム属（Azobacterium）、リゾビウム属（Rhizobium）、アクロモバクテリウム属（Achromobacterium）、エンテロバクテリウム属（Enterobacterium）、ブルケラ属（Brucella）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、バシラス属（Bacillus）（B.t.毒（B.t.toxins））、Clostridium （毒）、ブレウィバクテリウム属（Brevibacterium）、シュードモナス属（Pseudomonas）、エアロバクター属（Aerobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、ハロバクテリウム属（Halobacterium）、ミコプラズマ属（Mycoplasma）、サイトファガ属（Cytophaga）、ミクソコッカス属（Myxococcus）

菌類 アマニタ ムスカリア（Amanita muscaria）（ベニテングダケ（fly agaric）、イボテン酸（ibotenic acid）、ムシモール（muscimol））、シロシベ（シロシビン）フィサリウム（Psilocybe （psilocybin） Physarium）、フリゴ属（Fuligo）、ムコル属（Mucor）、フィトフトラ属（Phytophtora）、リゾプス属（Rhizopus）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）（ペニシリン（penicillin））、コプリヌス属（Coprinus）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、アクレモニウム属（Acremonium）（セファロスポリン（Cephalosporin））、トロコデルマ属（Trochoderma）、ヘルミントスポリウム属（Helminthosporium）、フサリウム属（Fusarium）、アルテルナリア属（Alternaria）、ミロテシウム属（Myrothecium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）

藻類 ディゲネアシムプレックス属（Digeneasimplex）（カイニン酸、駆虫薬））、ラミナリア アンクスタタ（Laminaria anqustata）（ラミニン、降圧性）

地衣類 ウスネアファシアタ属（Usneafasciata）（ブルピニン酸（vulpinicacid）、抗菌剤;ウスニン酸、抗腫瘍性）

高等植物 アルテミシア属（Artemisia）（アルテミシニン）、コレウス属（Coleus）（フォルスコリン）、デスモディウム属（Desmodium）（Ｋチャネル アゴニスト）、カタランタス属（Catharanthus）（ビンカアルカロイド）、ディギタリス属（Digitalis）（強心配糖体）、ポドフィルム属（Podophyllum）（ポドフィロトキシン）、タクサス属（Taxus）（タキソール）、セファロタクサス属（Cephalotaxus）ホモハリングトニン（homoharringtonine）、カムプトテカ属（Camptotheca）（カンプトテシン）、カメリアシネシス属（Camelliasinensis）（茶）、カナビシンディカ属（Cannabisindica）、カナビサティワ属（Cannabissativa）（麻）、エリトロクシルムコカ属（Erythroxylumcoca）（コカ）、ロフォフォラウィリアムシー属（Lophophorawilliamsii）（ペヨーテミリスティカ フラグランス（ニクズク（Nutmeg））、タバコ、パパウェル ソムニフェルム（Papaver somniferum）（ケシ）、ファラリス アルンディナセア（Phalaris arundinacea）（クサヨシ）

原生動物 ティコディスクスブレウィス属（Ptychodiscusbrevis）;ディノフラゲラテス属（Dinoflagellates）（ブレベトキシン、心血管）

海面類 ミクロキオナプロリフェラ属（Microcionaprolifera）（エクチオニン（ectyonin）、アンチミクロビアル（antimicrobial））、クリプトテティアクリタ属（Cryptotethyacryta）（Ｄ−アラビノフラノシド（D-arabinofuranosides））

腔腸動物 カツオノエボシ（Portuguese Man o War）と他のクラゲ、およびクラゲ毒

珊瑚 シュードテロゴニア種（Pseudoterogonia species）（シュードテラシン（Pseudoteracins）、抗炎症）、エリスロポディウム属（Erythropodium）（エリスロリド（erythrolides）、抗炎症）

袋型動物 線虫分泌化合物

軟体動物 イモガイ毒、ウミウシ毒、頭足類 神経伝達物質、イカ墨

環形動物 ルムブリコネレイ ヘテロパ（Lumbriconereis heteropa）（ネライストキシン、殺虫性）

クモ型類動物 ドロメデス属（Dolomedes）（「ウオツリハシリグモ」毒液）
甲殻類 クセノバラヌス属（Xenobalanus）（皮膚接着性）

昆虫 エピラクナ属（Epilachna）（インゲンテントウ アルカロイド）

スピヌンクリダ（Spinunculida） ボネリア ウィリディス（Bonellia viridis）（ボネリン（bonellin）、向神経活性）
コケムシ類 ブグラ ネリティナ（Bugula neritina）（ブリオスタチン、抗癌性）

棘皮動物 ウミユリ化学物質

尾索類 トリディデムヌム ソリヅム（Trididemnum solidum）（ディデムニン（didemnin）、抗腫瘍および抗ウイルス；エクテイナキディア ツルビナタ（Ecteinascidia turbinata） エクテイナキジン（ecteinascidins）、抗腫瘍性）

脊椎動物 エプタトレトゥス ストウティイ（Eptatretus stoutii）（エプタトレチン（eptatretin）、心臓作用性）、トラキヌス ドラコ（Trachinus draco）（タンパク質性毒、血圧、呼吸減少および心拍減少）。ヤドクガエル（バトラコトキシン、プミリオトキシン（pumiliotoxins）、ヒストリオニックトキシン（histrionicotoxins）、および他のポリアミン）；ヘビ毒；オリントリノフス アナティヌス（Orinthorhynohus anatinus）（カモノハシ毒）、修飾カロテノイド、レチノイドおよびステロイド；トリ:ヒストリオニックトキシン（histrionicotoxins）、修飾カロテノイド、レチノイドおよびステロイド。

遺伝子発現の制御−発現カセット
遺伝子は主として、遺伝子のＲＮＡへの転写およびＲＮＡのタンパク質への翻訳によって選択可能な表現型を生じさせる。さらに表現型は多くの場合、複数の遺伝子とそれらの遺伝子産物との相互作用の結果生じる。

本発明の要素のひとつは、非相同遺伝子は、それらの個々および集団の発現（ＲＮＡへの転写）が制御できる型式で提供されるということである。

宿主細胞内の多数の非天然遺伝子の組み合わせによって、宿主細胞にとって致死または亜致死である複数の遺伝子または単一の遺伝子の組み合わせが挿入される。宿主細胞での遺伝子の同調発現により、あらゆる遺伝子のサブセットの発現を開始させるだけでなく、例えば致死または亜致死遺伝子の発現を抑圧することが可能である。

発現可能ヌクレオチド配列を調節するプロモーターの外部制御により、発現遺伝子の新規で非天然に生じる組み合わせが得られる。これらの新規で非天然な遺伝子産物の組み合わせが同一細胞中に見られる時、非相同な遺伝子産物は新しい方法で宿主細胞の代謝に影響し、宿主細胞に一次的または二次的な代謝物および／または新規な量の既知の代謝物および／または細胞または細胞外の新規な区域に既知の代謝物を産生させる。新規な代謝経路および／または新規または修飾代謝物は鎖状体内または外の組換えによって、またそれによらずに、導入された遺伝子と宿主ゲノムのセグメントまたは宿主細胞のエピソームとを実質的に組換えることなく得ることが出来る。

独立して誘導可能または抑制可能な多数のプロモーターの制御下に発現可能ヌクレオチド配列が存在すると、挿入された発現可能ヌクレオチド配列のグループを選択的に作動させたり遮断したりすることによって、非常に多くの異なる発現状態をひとつの単一細胞内に作り出すことが出来る。ひとつの細胞内で独立に誘導可能および／または抑制可能なプロモーターの数は、１個から１０個、例えば２、３、４、５、６、７、８または９個、またはさらに１５、２０、２５個まで、または５１個以上など多岐にわたる。

制御可能なプロモーターであるとスクリーニングおよび選択段階過程でプロモーターを作動させたり抑制させたりすることが可能であり、発現遺伝子の多様性をより大きくすることができるので、進化の段階においては細胞の制御可能なプロモーターの機能性が用いられる。

「プロモーター」なる語は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼが結合し転写を開始するＤＮＡ配列など、通常の意味で用いられる。プロモーターはどのストランドを転写するかを特定し、転写の方向性を決定する。
・細菌のプロモーターは通常、特定のシグマ因子およびＲＮＡポリメラーゼが結合している、（転写開始位置から）３５および１０コンセンサス配列からなる。
・真核生物のプロモーターはより複雑である。発現ベクター用に有用化されたほとんどのプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写される。基本転写因子（ＧＴＦ）は始めに転写開始位置近くの特定の配列に結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの結合を漸加する。これら最小のプロモーター要素に加えて、小さな配列要素は、特定プロモーターの活性を調節するモジュラーＤＮＡ−結合／転写−活性化タンパク質（例えばＡＰ−１、ＳＰ−１）によって特異的に認識される。
・ウイルスのプロモーターは細菌と真核生物のプロモーターと同じ機能を持つ。宿主にウイルスが感染すると、ウイルスのプロモーターは、宿主の転写機構を用いるか、宿主機構の置換部位にウイルスにコードされた酵素を供給して転写を管理する。ウイルスのプロモーターは、非常に多数の宿主生物の転写機構によって認識され、そのためしばしばクローニングおよび発現ベクターに用いられる。

プロモーターはさらに調節因子を含むこともあり、調節因子はプロモーターと連携して働き、リプレッサー（例えば、大腸菌（E.coli）におけるｌａｃＯ／ＬＡＣ Ｉｑリプレッサー系）もしくはインデューサー（例えば、酵母におけるｇａｌ１／ＧＡＬ４インデューサー系）のどちらかと結合するＤＮＡ配列要素である。いずれにしても転写は、プロモーターが抑制解除または誘導されて「作動（turned-on）」するまで実質的に「遮断（shut off）」される。カセットにおけるプロモーターの選択は、主にそのカセットが挿入される宿主生物に依拠する。この時重要なことは、そのプロモーターが発現可能ヌクレオチド配列を発現させる宿主細胞において機能可能であることである。

好ましくは、プロモーターは、誘導可能プロモーターおよび／または抑制可能プロモーターなど、外部から制御可能なプロモーターである。そのプロモーターは、例えば、代謝物、基質、金属、ホルモン、糖などの化学的インデューサーの有無のように、化学物質によって（抑制可能／誘導可能の）どちらにも制御可能でありうる。同様に、そのプロモーターは温度、ｐＨ、酸化還元状態、成長段階、発生段階のような特定の生化学的パラメーターによって制御可能であり、またそのプロモーターはガル（gal） インデューサーのような合成インデューサー／リプレッサーによって誘導可能／抑制可能でありうる。

宿主細胞の遺伝子調節系の非意図的な干渉を避けるため、および同調的遺伝子発現の制御性を向上させるために、好ましくは、プロモーターは合成プロモーターである。適当なプロモーターは米国特許５，７９８，２２７、米国特許５，６６７，９８６に記載されている。適当な合成真核生物プロモーターを設計する上での原則は、米国特許５，５５９，０２７、米国特許５，８７７，０１８または米国特許６，０７２，０５０に記載されている。

遺伝子転写調節のための合成誘導可能真核生物プロモーターにより、タンパク質発現レベルおよび遺伝子発現の低い基底レベルを修正できる。そのようなプロモーターは好ましくは、通常ひとつの誘導可能要素を含む天然プロモーターに他の誘導可能要素を挿入することにより少なくとも２つの異なる種類の調節要素を含む。たとえば、付加金属反応要素（ＩＲ：Ｅｓ）および／またはグルココルチコイド反応要素（ＧＲＥｓ）がさらに天然プロモーターに挿入できる。そのうえ、ひとつまたはそれ以上の構成要素は低い基底レベルの遺伝子発現を提供することを機能的にできなくさせられるかもしれない。

プロモーターの好ましい例は、例えばガラクトースなどの炭水化物、低い無機リン酸レベル、温度（例えば低もしくは高温度シフト）、例えば銅イオンなどの金属または金属イオン、例えばジヒドロテストステロン、デオキシコルチコステロンのようなホルモン、熱ショック（例えば３９℃）、メタノール、酸化還元状態、例えば発生段階のような成長段階、例えばガル（gal） インデューサーのような合成インデューサーからなる群から選択されるあらゆる因子に誘導および／または抑制されるプロモーターを含むがそれらに限定されない。そのようなプロモーターの例はＡＤＨ １、ＰＧＫ １、ＧＡＰ ４９１、ＴＰＩ、ＰＹＫ、ＥＮＯ、ＰＭＡ １、ＰＨＯ５、ＧＡＬ １、ＧＡＬ ２、ＧＡＬ １０、ＭＥＴ２５、ＡＤＨ２、ＭＥＬ １、ＣＵＰ １、ＨＳＥ、ＡＯＸ、ＭＯＸ、ＳＶ４０、ＣａＭＶ、Ｏｐａｑｕｅ−２、ＧＲＥ、ＡＲＥ、ＰＧＫ／ＡＲＥハイブリッド、ＣＹＣ／ＧＲＥハイブリッド、ＴＰＩ／α２オペレーター、ＡＯＸ １、ＭＯＸ Ａを含む。

しかしながらより好ましくは、そのプロモーターは、ＰＧＫ／ＡＲＥハイブリッド、ＣＹＣ／ＧＲＥハイブリッドのようなハイブリッド プロモーターから、または合成プロモーターから選択される。そのようなプロモーターは、過剰に干渉せずとも、発現宿主の天然遺伝子の調整で制御可能である。

本発明の組み合わせに用いられうる既知の酵母プロモーターの例を次に示す。この例は本発明に有用なプロモーターを選択または設計する方法を当業者に示すために提供するためのもので、決して限定するためものではない。

酵母において機能性のある多数の転写プロモーターが書物に記載されているが、それらのうちいくつかは組み換えルートでのポリペプチドの産生に有用である。とくに、ＰＧＫ遺伝子（３−ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド リン酸デヒドロゲナーゼ）をコードするＴＤＨ遺伝子、ＴＥＦ１遺伝子（伸長因子１）のプロモーター、ＭＦα１（α性フェロモン前駆体）（これは強力な構成プロモーターもしくは、グルコース、またはチアミンにより調節可能なＰＨＯ５の存在下で抑制される調節可能プロモーターＣＹＣｌであると考えられる）について述べられている。ところが、未解明の原因で、それらのプロモーターは通常それらが制御する遺伝子の効果的な発現を許さない。本明細書において、新しい効果的な宿主／ベクター系を作るために、新しいプロモーターを用いることができるのは通常有利である。さらに、特定の細胞において効果的なプロモーターを選択することは、相同配列間での組換え問題を回避している一方、同一細胞における複数のタンパク質（例えば、同じ代謝鎖のいくつかの酵素）の産生を予想することをも可能にする。

一般的に、プロモーター領域は遺伝子の５’領域に位置し、ＤＮＡフラグメントの転写を制御し許容する全ての要素を含む。特に:
（1） ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位を含む、いわゆる最小プロモーター領域であり、転写開始部位の位置および基底レベルを決定する。サッカロミセス セレウィシアエ（Saccharomyces cerevisiae）において、プロモーター領域の長さは比較的可変である。実際、ＴＡＴＡボックスの正確な位置は異なる遺伝子同士を見比べると多様であり、開始部位の４０から１２０ヌクレオチド上流に位置する（Chen and Struhl、1985、EMBO J.、4、3273-3280）。
（2） ＴＡＴＡボックスの上流（すぐ近くの数百ヌクレオチドまでの上流）の配列であり、恒常的に（培養条件に関わらず、あらゆる細胞サイクルを通して比較的一定の転写レベル）あるいは、調節可能な方法で（アクチベーター存在下での転写の活性化および／またはリプレッサー存在下での抑制）効果的な転写レベルを保証することを可能にする。これらの配列にはいくつかのタイプがあり（アクチベーター、インヒビター、エンハンサー、インデューサー、リプレッサー）、細胞因子や多様な培養条件に反応する。

そのようなプロモーターの例は、米国特許５，６４１，６６１記載のＺＺＡ１およびＺＺＡ２プロモーター、ＷＯ９７／４４４７０記載のＥＦ１−αタンパク質プロモーターおよびリボソームタンパク質Ｓ７遺伝子プロモーター、米国特許５，９５２，１９５記載のＣＯＸ ４プロモーターおよび二つの未知プロモーター（本明細書の配列番号：１および２ ）である。他の有用なプロモーターは、ＷＯ９８／５４３３９記載のＨＳＰ１５０プロモーター、米国特許４，８７０，０１３記載のＳＶ４０およびＲＳＶプロモーターならびにヨーロッパ特許０ ３２９ ２０３ Ａ１記載のＰｙＫおよびＧＡＰＤＨプロモーターを含む。

より好ましくは、本発明は合成プロモーターを用いる。合成プロモーターはしばしばある遺伝子の最小プロモーター領域と別の遺伝子の上流調節領域の組み合わせから構成される。上流調節配列中の特定の配列を、例えば置換および除去、または特定調節配列の複数のコピーを挿入するなどして修飾することにより、プロモーター制御を増強することができる。合成プロモーターを用いる利益のひとつは、過剰な干渉をせずとも、宿主細胞の天然プロモーターで制御が可能なことである。

そのような合成酵母プロモーターのひとつは、異なる２つの酵母由来遺伝子、酵母キラー蛋白リーダーペプチドおよびＩＬ−１βのアミノ末端、のプロモーターまたはプロモーター要素からなる（ＷＯ９８／５４３３９）。

別の酵母合成プロモーター例は米国特許５，４３６，１３６ （Hinnenら）に記載されており、酵母ＰＨＯ５遺伝子の上流活性部位を含む５’上流プロモーター要素および、酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子の−３００から−１８０ヌクレオチドで始まり−１ヌクレオチドで終わる酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子の３’下流プロモーター要素を含む酵母ハイブリッドプロモーターに関する。

酵母合成プロモーターの別の例は米国特許５，０８９，３９８（Rosenbergら）に記載されている。そこではプロモーターが一般式（Ｐ．Ｒ．（２）−Ｐ．Ｒ．（１））−
［式中:
Ｐ．Ｒ．（１）はコード配列に近位で、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を持ち、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、ならびに例えばキャッピング配列のような転写調節シグナルを含むプロモーター領域である；
Ｐ．Ｒ．（２）は、ＲＮＡポリメラーゼ結合領域の転写効果の増強に関係し、Ｐ．Ｒ．（１）の５’末端に結合するプロモーター領域である。]で記載されている。

米国特許４，９４５，０４６（Horiiら）には、合成酵母プロモーターの設計の仕方のさらなる例が記載されている。この特定プロモーターは、酵母と哺乳類の両方に由来するプロモーター要素からなる。そのハイブリッド プロモーターは基本的にサッカロミセス セレウィシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のＰＨＯ５またはＧＡＰ−ＤＨプロモーターからなり、それから上流活性部位（ＵＡＳ）が除去され、ＳＶ４０ウイルス由来の初期エンハンサー領域に置き換わっている。

遺伝子の同調発現サブセットはまた、特定の表現型に対応する非相同遺伝子を同定するのに有用である。

ＲＮＡの単離からエントリー ベクターへの挿入まで本発明の細胞を提供するためにとられる処置の順番を次に記載する。要約すると、その手順は次の処置を含む。
ｉ） 発現状態からのｍＲＮＡの単離
ｉｉ） そのｍＲＮＡ配列に対応する実質的に完全長のｃＤＮＡクローンの獲得
ｉｉｉ） 実質的に完全長のｃＤＮＡクローンの、一次ベクター中のカセットのクローニング部位への挿入。このカセットは５’→３’方向に次の一般式で表される：
［ＲＳ１−ＲＳ２−ＳＰ−ＰＲ−ＣＳ−ＴＲ−ＳＰ−ＲＳ２’−ＲＳ１’］
［式中、ＣＳはクローニング部位を表す。］。

発現カセット
本発明の発現カセットは好ましくは、高秩序配列のヌクレオチドのカセットに編集し、そのカセットは５’→３’方向へ次の一般式で表される：
［ＲＳ１−ＲＳ２−ＳＰ−ＰＲ−ＣＳ−ＴＲ−ＳＰ−ＲＳ２’−ＲＳ１’］
［式中、ＲＳ１およびＲＳ１’は制限酵素認識部位を表し、ＲＳ２およびＲＳ２’はＲＳ１およびＲＳ１’とは異なる制限酵素認識部位を表し、ＳＰは少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサー配列を表し、ＰＲはプロモーターを表し、ＣＳはクローニング部位を表し、ＴＲはターミネーターを表し、これらは全て本明細書の別の場所で議論されるとおりである。］。

発現コンストラクトの両側の２つの異なる制限酵素認識部位を用いると有利である。一次ベクターを両制限酵素認識部位を切断する制限酵素で処置することにより、発現コンストラクトおよび一次ベクターが２つの非互換性末端とともに残る。空のベクターは発現コンストラクトの連結に関与しないので、これが連結過程を促進する。

原理上は、制限酵素認識酵素が既知のあらゆる制限酵素認識部位が利用可能である。これらは分子生物学の分野で一般に知られ、用いられている、Sambrook、Fritsch、Maniatis、“A laboratory Manual”、第二版、Cold Spring Habor Laboratory Press、1989に記載されているような制限酵素を含む。

制限酵素認識部位認識配列は、カセット中の同一の制限酵素認識部位が出現する可能性が最小になるように、好ましくはかなりの長さである。従って、第一制限酵素認識部位は少なくとも６塩基からなり、より好ましくは、７または８塩基からなる。制限配列中に７個またはそれ以上の非Ｎ塩基を持つ制限酵素認識部位は一般に「珍しい制限酵素認識部位」として知られている（例１７参照）。ところが、制限配列はまた、少なくとも１０塩基、例えば少なくとも１５塩基、例えば少なくとも１６塩基、例えば少なくとも１７塩基、例えば少なくとも１８塩基、例えば少なくとも１９塩基、例えば少なくとも２０塩基、例えば少なくとも２１塩基、例えば少なくとも２２塩基、例えば少なくとも２３塩基、例えば少なくとも２５塩基、例えば少なくとも３０塩基、例えば少なくとも３５塩基、例えば少なくとも４０塩基、例えば少なくとも４５塩基、例えば少なくとも５０塩基でありうる。

好ましくは、第一制限酵素認識部位ＲＳ１およびＲＳ１’は、二本鎖ヌクレオチド配列の平滑末端を作る制限酵素によって認識される。この部位に平滑末端を作ることにより、ベクターが後の連結に関与する危険性が大幅に減少する。第一制限酵素認識部位はまた突出末端を生じさせるが、これらは好ましくは、第二制限酵素認識部位ＲＳ２およびＲＳ２’から生じる突出末端とは非互換性である。

本発明の好ましい態様によると、第二制限酵素認識部位、ＲＳ２およびＲＳ２’は珍しい制限酵素認識部位を含む。このように、珍しい制限酵素認識部位の認識配列がより長いほど、より珍しくなり、それを認識する制限酵素が「望まない」他の位置のヌクレオチド配列を切断することがより少なくなる。

珍しい制限酵素認識部位はさらにＰＣＲ開始部位となりうる。それにより、ＰＣＲによりカセットをコピーし、間接的にベクターからカセットを「切除」することが可能になる。

一本鎖互換性末端は、制限酵素で消化することにより作られる。連結のためには、カセットを切除する好ましい酵素は珍しいカッター、すなわち７個かそれ以上のヌクレオチド配列を認識する酵素であるのが望ましい。非常に稀に切断する酵素の例はメガヌクレアーゼであり、それらの多くは例えばＩ−Ｃｅｕ Ｉ、Ｉ−Ｓｃｅ Ｉ、Ｉ−Ｐｐｏ Ｉ、およびＰＩ−Ｐｓｐ Ｉなど（さらには例１７ｄ参照）をコードするイントロンである。他の好ましい酵素は、例えばＡｓｃ Ｉ、ＡｓｉＳ Ｉ、ＣｃｉＮ Ｉ、ＣｓｐＢ Ｉ、Ｆｓｅ Ｉ、ＭｃｈＡ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｐａｃ Ｉ、Ｓｂｆ Ｉ、Ｓｄａ Ｉ、Ｓｇｆ Ｉ、ＳｇｒＡ Ｉ、Ｓｓｅ２３２ Ｉ、およびＳｓｅ８３８７ Ｉなどの８ヌクレオチドの配列を認識し、それらの全ては一本鎖のパリンドローム互換性末端を作成する。

個々のカセットの配向性を制御するのに用いることもできる他の好ましい珍しいカッターは、例えばＡａｒ Ｉ、Ｓａｐ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｄｉ Ｉ、およびＶｐａなど（さらには例１７ｃ参照）の非パリンドローム配列を認識する酵素である。

もしくは、カセットは、例えばＰＣＲまたはリンカー（短い合成二本鎖ＤＮＡ分子）への連結によって末端へ制限酵素認識部位を付加して調製する。制限酵素は次々に単離され、特徴づけられており、そのような新規な酵素の多くが本発明の一本鎖互換性末端の産生に使用できることが予測される。

一本鎖互換性末端は合成カッターでベクターを切断することにより作成できると考えられる。このように、通常ＤＮＡを非特異的に切断できる作用性化学薬品群は、特定の配列を認識して結合する別の分子と連結すると、特定の位置で切断することが出来るようになる。特定の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する分子の例は、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ホスホチオエート（phosphothioates）、ペプチド、およびアミドである。例えばArmitage、B.（1998） Chem. Rev. 98: 1171-1200を参照すると、例えばアントラキノンおよびＵＶ光を用いた光切断が記載されている。Dervan P.B. & Burli R.W.（1999）Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 688-93 にはポリメラーゼのＤＮＡへの特異的結合が記載されている。Nielsen, P.E.（2001）Curr. Opin. Biotechnol. 12: 16-20 にはＰＮＡのＤＮＡへの特異的結合が記載されている。そしてChemical Reviews 特別テーマ別号：RNA/DNA Cleavage （1998） vol. 98（3）Bashkin J.K.（ed.）ACS 出版物には、ＤＮＡを切断する化学製品のいくつかの例が記載されている。

一本鎖互換性末端はまた、例えばｄＵＴＰを含むＰＣＲプライマーを用い、それからプライマーの一部を分解するウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（米国特許５，０３５，９９６参照）でそのＰＣＲ産物を処置することにより、作成することが出来る。もしくは、互換性末端は、両ベクターの後に付くことにより作成することができ、末端転移酵素を用いて相補的ヌクレオチドで挿入する（Chang、LMS、Bollum TJ（1971）J Biol Chem 246:909）。

ＲＳ２およびＰＲ配列間に位置するスペーサー配列は好ましくは、非転写スペーサー配列である。スペーサー配列の目的は、同一細胞に存在する異なる鎖状体間または同一鎖状体に存在するカセット間の組換えを最小にすることであるが、より「宿主」に似ているカセットのヌクレオチド配列を作る目的にも用いられる。さらなるスペーサー配列の目的は、カセットが頭と頭または尾と尾が接するように構築された時に隣接するパリンドローム配列間のヘアピン形成の発生を少なくすることである。スペーサー配列はまた、カセットのアフィニティー精製を可能にする、例えば核酸、ＰＮＡまたはＬＮＡプローブなどとのハイブリダイゼーションのための、例えばＰＣＲプライマー部位またはターゲットとして働く短い保存ヌクレオチド配列を誘導する時に便利である。

カセットはまた随意的に、ＴＲおよびＲＳ２間に少なくとも２ヌクレオチドの別のスペーサー配列を含む。カセットがベクターから切り離され、カセットの鎖状体中に連結される時、スペーサー配列は同時に、二つの連続的な同一プロモーターまたはターミネーター配列間に一定の距離が開くことを確実にする。この距離は少なくとも５０塩基、例えば少なくとも６０塩基、例えば少なくとも７５塩基、１００塩基、１５０塩基、２００塩基、２５０塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、７５０塩基、１０００塩基、１１００塩基、１２００塩基、１３００塩基、１４００塩基、１５００塩基、１６００塩基、１７００塩基、１８００塩基、１９００塩基、２０００塩基、２１００塩基、２２００塩基、２３００塩基、２４００塩基、２５００塩基、２６００塩基、２７００塩基、２８００塩基、２９００塩基、３０００塩基、３２００塩基、３５００塩基、３８００塩基、４０００塩基、４５００塩基、５０００塩基、６０００塩基などからなりうる。

ＰＲ配列の５’側に位置するスペーサーとＴＲ配列の３’側に位置するスペーサー間のヌクレオチド数はいくらでもよい。とはいえ、少なくともひとつのスペーサー配列が１００から２５００塩基、好ましくは２００から２３００塩基、より好ましくは３００から２１００塩基、例えば４００から１９００塩基、より好ましくは５００から１７００塩基、例えば６００から１５００塩基、より好ましくは７００から１４００塩基からなることが確実になるとより有利である。

意図する宿主細胞が酵母である場合、鎖状体に存在するスペーサーは好ましくは、いくつかのＡＲＳｅｓと種々のλファージＤＮＡフラグメントの組み合わせを含むべきである。

スペーサー配列の好ましい例は、次のものを含むが限定されない：λファージＤＮＡ、大腸菌（E.coli）のような原核生物ゲノムＤＮＡ、ＡＲＳｅｓ。

一次ベクター中のカセットのクローニング部位はあらゆるヌクレオチド配列がその中にクローニングできるように設計されるべきである。

カセットのクローニング部位は好ましくは、方向性クローニング（directional cloning）ができる。これにより、宿主細胞において望む方向でコーディング領域から転写が遂行され、翻訳されたペプチドはオリジナルヌクレオチド配列がコードするペプチドと同一であることが確実となる。

ところが、いくつかの態様によると、逆方向に配列を挿入するのが有利なことがある。これらの態様によると、特定経路に含まれる特定遺伝子の機能発現を妨げる、いわゆるアンチセンス コンストラクトが挿入されうる。それによりある代謝経路を優勢経路からより優勢でない経路へ転換させることが可能になる。

カセットのクローニング部位は複数のクローニング部位を含んでいてもよく、それは一般にＭＣＳまたはポリリンカー部位として知られており、制限エンドヌクレアーゼ認識部位系列をコードする合成ＤＮＡ配列である。これらの部位は、ベクターの特定位置へのＤＮＡクローニングを簡便にするため、また挿入の方向性クローニングのために設計される。

ｃＤＮＡのクローニングは制限酵素の使用を含まなくてもよい。他の別のシステムは次のものを含むが限定されない：
・ Clontech の Creator^ＴＭ Cre-loxP システムの、組換えおよびｌｏｘＰ部位の使用。
・ Life Technologies の Gateway^ＴＭ システムなどの、λ吸着部位の使用。
これらの両システムは方向性である。

ターミネーター配列の役割は、コーディング配列の長さに転写を限定することである。最適なターミネーター配列は、宿主細胞においてこの働きを遂行できる配列である。

原核生物において、転写ターミネーターとして知られる配列は、ＲＮＡポリメラーゼに対し、ＤＮＡテンプレートを離し新生ＲＮＡへの転写を止めるようにシグナルを送る。

真核生物において、ＲＮＡ分子は成熟ｍＲＮＡ分子の末端をはるかに超えて転写される。新しい転写物は酵素学的に切断され、ｐｏｌｙ−Ａテール（poly-A tail）として知られるアデニル酸残基の長い配列が付加され修飾される。ポリアデニル化コンセンサス配列は、実際の切断部位から約１０から３０塩基上流に位置する。

ターミネーター配列を得た酵母の好ましい例は、次のものを含むが限定されない：ＡＤＮ１、ＣＹＣ１、ＧＰＤ、ＡＤＨ１ アルコール デヒドロゲナーゼ。

宿主細胞の特質により、少なくともひとつのカセットがプロモーターと発現可能ヌクレオチド配列との間にイントロンを、より好ましくは実質的にすべてのカセットがプロモーターと発現可能ヌクレオチド配列との間にイントロンを含むことは、有利である。イントロン配列の選択は宿主細胞の要求に依拠する。

このように、ベクターのカセットは随意的にイントロン配列を含み、それは発現可能ヌクレオチド配列の５’または３’に位置する。イントロンの設計や配置は当分野で周知である。イントロン設計の選択は、発現可能ヌクレオチド配列が最終的に発現される意図する宿主細胞に大いに依拠する。発現カセット中にイントロンを持つことの効果は、通常のイントロン配列に関係する効果である。

酵母イントロンの例は、書物および２０００年４月１５日更新のAres Lab 酵母イントロンデータベース（バージョン２．１）のような特定のデータベースで見つけられる。初期バージョンのデータベースならびにデータベースの抜粋が、Spingola M、Grate L、Haussler D、Ares M Jr.による「Genome-wide bioinformatic and molecular analysis of introns in Saccharomyces cerevisiae」（ＲＮＡ 1999 Feb;5（2）:221-34）およびDavis CA、Grate L、Spingola M、Ares M Jr.による「Test of intron predictions reveals novel splice sites, alternatively spliced mＲＮＡs and new introns in meiotically regulated genes of yeast.」（Nucleic Acids Res 2000 Apr 15;28（8）:1700-6）に公開されている。

一次ベクター（エントリー ベクター）
エントリー ベクターなる用語は、本発明のカセットを用いて、ｃＤＮＡまたは他の発現可能ヌクレオチド配列を保存し増幅するベクターを意味する。エントリー ベクターまたは一次ベクターは、好ましくは大腸菌（E.coli）または他のあらゆる適当な標準宿主細胞において増殖可能である。好ましくは、それは増幅可能であり、標準的なノーマライゼーションおよびエンリッチ過程に対して従順であるべきである。

エントリー ベクターは、基本的な要求ａ）からｃ）を持つあらゆるタイプのＤＮＡである： ａ）少なくともひとつの適当な宿主生物において自己複製可能である ｂ）のちにそのベクターとともに複製される外来性ＤＮＡの挿入ができる ｃ）好ましくは該外来性ＤＮＡの挿入を含むベクター分子の選択が可能である。好ましい態様において、ベクターは酵母、細菌のような標準宿主内で複製でき、好ましくは宿主細胞につき多数の複製を持つべきである。複製の宿主特定開始点に加え、ベクターは、例えば繊維状ファージのためのｆ１開始点など単一の標準細菌ための複製の開始点を含むことが好ましい。これはクローン配列のノーマライゼーションやエンリッチ過程に有用である一本鎖核酸の産生を可能にする。膨大な数のクローニング ベクターが記載され一般に用いられており、参照が例えば、Sambrook,J; Fritsch、E.F；and Maniatis T.（1989）Molecular Cloning：A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press、USA、Netherlands Culture Collection of Bacteria （www.cbs.knaw.nl/NCCB/collection.htm）またはDepartment of Microbial genetics、National Institute of genetics、Yata 1111 Mishima Shizuoka 411-8540、Japan（www.shigen.nig.ac.jp/cvector/cvector.html）に記載されている。多くの人気のある誘導体の親であるいくつかのタイプ例は、Ｍ１３ｍｐ１０、ｐＵＣ１８、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ １０、およびｐＹＡＣ４Ａである。一次ベクターの例は次のものを含むが限定されない：Ｍ１３Ｋ０７、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＳＰ６４、ｐＳＰ６５、ｐＧＥＭ−３、ｐＧＥＭ−３Ｚ、ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（−）、ｐＧＥＭ−４、ｐＧＥＭ−４Ｚ、πＡＮ１３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ＣＨＡＲＯＮ ４Ａ、λ^＋、ＣＨＡＲＯＮ ２１Ａ、ＣＨＡＲＯＮ ３２、ＣＨＡＲＯＮ ３３、ＣＨＡＲＯＮ ３４、ＣＨＡＲＯＮ ３５、ＣＨＡＲＯＮ ４０、ＥＭＢＬ３Ａ、λ２００１、λＤＡＳＨ、λＦＩＸ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λｇｔ１８、λｇｔ２０、λｇｔ２２、λＯＲＦ８、λＺＡＰ／Ｒ、ｐＪＢ８、ｃ２ＲＢ、ｐｃｏｓ１ＥＭＢＬ。

ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのベクターへのクローニング方法は当分野で周知である。参照が、J. Sambrook、E.F. Fritsch、T. Maniatis：Molecular Cloning、A Laboratory Manual（2^ｎｄ edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989）に記載されている。

環状モデルエントリー ベクターの例が図１０に記載されている。ベクター、ＥＶＥは発現カセット、Ｒ１−Ｒ２−スペーサー−プロモーター−マルチ クローニング部位−ターミネーター−スペーサー−Ｒ２−Ｒ１を含む。そのベクターはさらにアンピシリン耐性遺伝子ＡｍｐＲ、および大腸菌（E.coli）の複製の開始点ＣｏｌＥ１を含む。

図１１、１２および１３にエントリー ベクター ＥＶＥ４、ＥＶＥ５、およびＥＶＥ８を示す。これらは全てＲ１としてＳｒｆＩおよびＲ２としてＡｓｃＩを含む。これらの両領域はパリンドロームであり、８塩基の認識配列を持つ珍しい制限酵素認識部位である。該ベクターはさらにＡｍｐＲアンピシリン耐性遺伝子、およびＣｏｌＥ１開始点または大腸菌（E.coli）用の開始点ならびにＭ１３のような繊維状ファージの複製の開始点ｆ１を含む。ＥＶＥ４（図１１）はＭＥＴ２５プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターを含む。スペーサー１およびスペーサー２は複数クローニング部位ＭＣＳに由来する短い配列である。ＥＶＥ５（図１２）はＣＵＰ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターを含む。ＥＶＥ８（図１３）はＣＵＰ１プロモーターおよびＡＤＨ１ターミネーターを含む。ＥＶＥ８のスペーサーは５５０ｂｐ λファージＤＮＡ（スペーサー３）および酵母からのＡＲＳ配列（スペーサー４）である。

ヌクレオチド ライブラリー（エントリー ライブラリー）
発現段階からヌクレオチド ライブラリーを導く手順の模式的な図解を図８に示す。

細胞内ヌクレオチド配列のライブラリーを構築し維持するための適当なベクターと宿主細胞ならびにその方法は当分野で周知である。ライブラリーに第一に要求されることは、そこで本発明の多数の一次ベクター（コンストラクト）を保存し増幅できることであり、そのベクター（コンストラクト）は少なくともひとつの発現状態からの発現ヌクレオチド配列を含み、そこでは少なくとも２つのベクター（コンストラクト）が異なっている。

そのようなライブラリーの特定の例は、周知で広く用いられているｃＤＮＡライブラリーである。ｃＤＮＡライブラリーの利点は、主にそれが細胞中の転写されたメッセンジャーＲＮＡに対応するＤＮＡ配列のみを含むことである。実質的に完全長のｃＤＮＡがライブラリーにクローン化されるように、単離されたｍＲＮＡまたは合成されたｃＤＮＡを精製するための適当な方法も存在する。

実質的に完全長のｃＤＮＡを産出する過程の最適化の方法は、例えば電気泳動、クロマトグラフィー、沈殿などによるサイズ選択、または例えばＳＭＡＲＴ^ＴＭ法（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、またはＣａｐＴｒａｐ^ＴＭ法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などによる完全長ｃＤＮＡを得る可能性を増す方法を含む。

好ましくは、ヌクレオチド ライブラリーを作成する方法は、ｃＤＮＡ種のノーマライズされた表示を含む実質的に完全長のｃＤＮＡ集団を得ることを含む。より好ましくは、実質的に完全長のｃＤＮＡ集団は、特定の発現状態特有のｃＤＮＡのノーマライズされた表示からなる。

ノーマライゼーションは、大量のｍＲＮＡ種を表すクローンの重複性を減少させ、希なｍＲＮＡ種からのクローンの相対的な表示を増加させる。

ｃＤＮＡライブラリーのノーマライゼーション方法は、当分野で周知である。ノーマライゼーションの適当なプロトコールは、米国特許５，７６３，２３９（ＤＩＶＥＲＳＡ）およびＷＯ９５／１１９８６、およびBonaldo、Lennon、Soares、Genome Research 1996、6:791-806；Ali、Holloway、Taylor、Plant Mol Biol Reporter、2000、18:123-132 などに参照されている。

エンリッチ方法は、特定の発現状態特有のｍＲＮＡを表すクローンの単離に用いられる。
広くサブトラクティブ ハイブリダイゼーションと名付けられた多数の様々な方法は当分野で周知である。参照は、Sive、John、Nucleic Acid Res、1988、16：10937；Diatchenko、Lau、Campbellら、PNAS、1996、93：6025-6030；Carninci、Shibata、Hayatsu、Genome Res、2000、10：1617-30、Bonaldo、Lennon、Soares、Genome Research 1996、6：791-806；Ali、Holloway、Taylor、Plant Mol Biol Reporter、2000、18：123-132 に記載されている。たとえば、多数のクローン ライブラリーからのｃＤＮＡを用いるか、または単純に誘導状態に由来するテスター ライブラリーに対するドライバーとしての非誘導状態を表すライブラリーからのｃＤＮＡなどを用いて、ノーマライゼーションの処置と同様、ハイブリダイゼーションを繰り返し行うことにより、エンリッチされうる。あるいは、選択した発現状態に由来するｍＲＮＡまたはＰＣＲ増幅cＤＮＡは、テスター ライブラリーから共通配列を取り去るのに用いることが出来る。ドライバーおよびテスター集団の選択は、それぞれの特定の実験における標的発現可能ヌクレオチド配列の特性に依拠するであろう。

最後に、サブトラクティブ ハイブリダイゼーションの後にコロニーを採集してエンリッチできる。

ライブラリーにおいて、あるペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列は、好ましくは相異なるが類似しているベクター内の相異なるプロモーターの制御下にある。好ましくは、ライブラリーは、異なる３個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも３個の一次ベクターからなる。より好ましくは、ライブラリーは、異なる４個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも４個の一次ベクターからなる。より好ましくは、ライブラリーは、異なる５個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも５個の一次ベクターからなる。例えば、異なる６個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも６個の一次ベクターからなる。例えば、異なる７個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも７個の一次ベクターからなる。例えば、異なる８個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも８個の一次ベクターからなる。例えば、異なる９個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも９個の一次ベクターからなる。例えば、異なる１０個のプロモーターの制御下で同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列を持つ少なくとも１０個の一次ベクターからなる。

同じペプチドをコードする発現可能ヌクレオチド配列は、好ましくは基本的に同じヌクレオチド配列を含み、より好ましくは同じヌクレオチド配列である。

異なるベクターにおける多数の異なるプロモーターの制御下にある遺伝子を含むライブラリーを得ることにより、ヌクレオチド ライブラリーから遺伝子とプロモーターの多数の組み合わせを構築することが可能である。好ましくは、ライブラリーは、遺伝子およびプロモーターの二次元アレイのような完全または実質的に完全な組み合わせを含み、そこでは実質的にすべての遺伝子が、実質的に全ての選択された数のプロモーターの制御下にある。

本発明の別の態様によると、ヌクレオチド ライブラリーは、異なるベクター内で異なるスペーサー配列および／または異なるイントロン配列と結合した発現ヌクレオチド配列の組み合わせを含む。いずれの発現ヌクレオチド配列も、２、３、４または５次元アレイ内で、異なるプロモーターおよび／または異なるスペーサーおよび／または異なるイントロンおよび／または異なるターミネーターと結合されうる。その２、３、４、または５次元アレイは、全ての組み合わせが存在しなければならないということはないので、完全または不完全であってもよい。

ライブラリーは、原核生物細胞または真核生物細胞の宿主細胞において適切に維持できる。好ましい原核生物宿主生物は、次のものを含むがそれらに限定されない：大腸菌（Escherichia coli）、バシラス スブティリス（Bacillus subtilis）、ストレプトミセス リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、シュードモナス アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、ミクソコッカス キサンタス（Myxococcus xanthus）。

サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）（出芽酵母（budding yeast））、スキゾサッカロミセス ポムベ（Schizosaccharomyces pombe）（分裂酵母（fission yeast））、ピキア パストリス（Pichia pastoris）およびハンセヌラ ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（メチロトローフ酵母（methylotropic yeasts））などの酵母種を用いてもよい。ニューロスポラ クラッサ（Neurospora crassa）およびアスペルギルス ニデュランス（Aspergillus nidulans）のような繊維状子嚢菌を用いてもよい。例えばタバコおよびシロイヌナズナ由来の植物細胞は好ましい。好ましい哺乳類宿主細胞は次に由来するものを含むがそれらに限定されない：ヒト、サルおよび齧歯類、例えばチャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａなど（Kriegler M. in “gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual”、New York、Freeman & Co. 1990 参照）。

鎖状体
図９に、発現可能ヌクレオチド配列を含む移行ライブラリーから進化可能人工染色体（ＥＶＡＣ）を導き適切な宿主細胞内にトランスフォームするまでの手順のフローチャートを示す。図９ａに、連結（concatenation）、サイズ選択および人工染色体ベクターへの挿入を含むＥＶＡＣの産生の一方法を示す。図９ｂに、ＥＶＡＣを得るための連結（concatenation）およびベクターアームの連結のための一連の処置を示す。

単一の宿主細胞の中へ複数の発現カセット（「カセット（cassettes）」）を構築し、細胞間での容易な再混合を可能にするための方法は、発現カセットは鎖状体内に構築することである。

鎖状体は連結されたユニットのシリーズである。本発明による鎖状体は、ただひとつの発現状態からの発現可能ヌクレオチド配列の選択を含む場合は、この発現状態を表すひとつのライブラリーから構築でき、もしくは多数の異なる発現状態からのカセットを含んでもよい。本発明による鎖状体は、特に人工染色体内への連結に適しており、その染色体は同調発現用に宿主細胞へ挿入できる。そのためには、宿主ゲノムのセグメントまたは宿主細胞のエピトープと鎖状体の組換えを得ることは本発明のこの態様の目的ではなく、鎖状体内組換えまたは鎖状体外組換えを得ることも目的ではないので、カセット間の差異が、いずれの鎖状体においても生じる繰り返し配列のレベルを最小にすることなどによって、宿主細胞が細胞分裂をする際に乗換えの機会を最小にするようなものであればよい。

本発明の好ましい態様によると、鎖状体は少なくとも第一カセットと第二カセットからなり、その第一カセットと第二カセットとは異なる。より好ましくは、鎖状体は複数のカセットからなり、実質的に全てのカセットが異なっている。そのカセット間の差異は、プロモーター間、および／または発現可能ヌクレオチド配列間、および／または スペーサー間、および／またはイントロン間、および／またはターミネーター間の差異に起因しうる。

単一鎖状体内のカセット数は、主としてその鎖状体が最終的に挿入される宿主種およびその挿入を実行するベクターにより決定される。このように鎖状体は少なくとも１０カセット、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、例えば少なくとも３０、例えば３０から６０または６１以上、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも５００、例えば少なくとも７５０、例えば少なくとも１０００、例えば少なくとも１５００、例えば少なくとも２０００カセットを含んでもよい。

それぞれのカセットは上記のように配列してもよい。

このように、好ましい態様において、鎖状体は連続的に連結された多数のヌクレオチド配列を表すのに用いられ、連続的に連結された少なくとも２個のヌクレオチド ユニットは基本構造［ｒｓ_２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ_１］を持つカセットからなる
［式中、
ｒｓ_１およびｒｓ_２はともに制限酵素認識部位を表し、
ＳＰは少なくとも２個のヌクレオチド塩基のスペーサーを表し、
ＰＲは宿主細胞において機能するプロモーターを表し、
Ｘは発現可能ヌクレオチド配列を表し、
ＴＲはターミネーターを表し、
ＳＰは少なくとも２個のヌクレオチド塩基のスペーサーを表す。］。
ここで、カセットの変数は本明細書の他の場所で定義された意味を持つ。そのカセットは上記に記載したように随意的に、プロモーターと発現可能ヌクレオチド配列間、および／またはターミネーターと発現可能ヌクレオチド配列間にイントロン配列を含む。

本発明の一側面によると、鎖状体は異なる発現状態からの発現可能ヌクレオチドを持つカセットを含み、結果、発現可能ヌクレオチド配列の非天然的に生じる組み合わせもしくは非天然の組み合わせが得られる。

本発明の好ましい態様によると、鎖状体は少なくとも第一カセットと第二カセットからなり、その第一カセットと第二カセットとは異なる。より好ましくは、その鎖状体は複数のカセットからなり、実質的に全てのカセットが異なっている。そのカセット間の差異は、プロモーター間、および／または発現可能ヌクレオチド配列間、および／またはスペーサー間、および／またはターミネーター間、および／またはイントロン間の差異に起因しうる。

鎖状体形成は、異なる方法で行うこともできる。

連結されるべきカセットは、通常ベクターから切り出されるか、またはＰＣＲによって合成される。切り出し後、ゲルろ過のようなサイズ分画により、または該カセットの既知の配列のタギングにより、該カセットを該ベクターから分離することができる。単離されたカセットは、次に突出末端間の相互作用により、または平滑末端のライゲーションにより１つに連結することができる。

より好ましくは、一方が該カセットに突出末端をもたらし他方が該ベクターに平滑末端をもたらす２つの制限酵素を用いてベクターから切り出すことを介して、中間の生成段階なしにカセットを連結してもよい。

ベクター配列を含まない鎖状体を産生する代替法は、一本鎖の基礎ベクターから発現カセットをＰＣＲ増幅することであろう。ＰＣＲ産物は制限酵素認識部位ＲＳ２およびＲＳ２’を含まねばならず、それらは後にその同族酵素によって切断される。そして消化済ＰＣＲ産物を用いて、基本的に一本鎖の基礎ベクター鋳型またはその末端から切断された小さな二本鎖断片により妨害されることなく、鎖状体形成を行うことができる。

カセットを含むベクターが一本鎖の場合、該カセットを切り出してＰＣＲ技術により二本鎖を形成することができ、これによると該ベクター配列は含まれず該発現カセットの配列のみが用意される。突出末端をもたらす制限酵素を用いて切断することにより突出末端を形成でき、該カセットを一本鎖ベクター断片との相互作用なしに組み立てることができる。

鎖状体は、各々が第一の突出末端、スペーサー配列、プロモーター、発現可能ヌクレオチド配列、ターミネーターおよび第二の突出末端を含むカセットである少なくとも２つのヌクレオチド配列のカセットの連結によって組み立て、あるいは形成し得る。

鎖状体形成が完了した後、所望のサイズの鎖状体をサイズ選択により選択することができ、例えば少なくとも１０カセット、例えば少なくとも１５、例えば少なくとも２０、例えば少なくとも２５、例えば少なくとも３０、例えば３０から６０または６０以上、例えば少なくとも７５、例えば少なくとも１００、例えば少なくとも２００、例えば少なくとも５００、例えば少なくとも７５０、例えば少なくとも１０００，例えば少なくとも１５００、例えば少なくとも２０００カセットを有する鎖状体を選択する。鎖状体のサイズはカセットの数とほぼ比例するので、各鎖状体のカセットの数は鎖状体形成後のサイズ分画によって調節することができる。

好ましくは各細胞に挿入された少なくとも１つの鎖状体は、少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。選択可能マーカーは、一般的にベクターを含む細胞のみを成長に関して選択する手段を提供する。選択可能マーカーは、宿主細胞に挿入されている中心的生合成経路における１つまたはそれ以上の突然変異を補うために鎖状体に挿入されている。このようなマーカーには２タイプある：薬物耐性および栄養要求性である。薬物耐性マーカーは、外部から加えられた、さもなければ細胞を殺し得る薬物を細胞が解毒化できるようにする。栄養要求性マーカーは、必須成分を欠く培地において、細胞が該必須成分（通常はアミノ酸）を合成できるようにすることによって細胞を成長可能にする。

以下は、実際かつ制限のない一般的選択可能マーカーの例およびそれらの作用機序の簡単な説明である：
原核生物
アンピシリン：細菌細胞壁合成における最終反応を阻害する。耐性遺伝子（ｂｌａ）は、抗生物質のβ−ラクタム環を切断するβ−ラクタマーゼをコードすることにより、それを解毒化する。
テトラサイクリン：３０Ｓリボソームサブユニットに結合することにより、細菌タンパク質合成を妨げる。耐性遺伝子（ｔｅｔ）は、細菌膜を修飾するタンパク質を特定して細胞への該抗生物質の輸送を妨げる。
カナマイシン：７０Ｓリボソームに結合し、メッセンジャーＲＮＡのミスリーディングを引き起こす。耐性遺伝子（ｎｐｔＨ）は該抗生物質を修飾し、該リボソームとの相互作用を妨げる。
ストレプトマイシン：３０Ｓリボソームサブユニットに結合し、メッセンジャーＲＮＡのミスリーディングを引き起こす。耐性遺伝子（Ｓｍ）は該抗生物質を修飾し、該リボソームとの相互作用を妨げる。
ゼオシン：この新規なブレオマイシン−ファミリー抗生物質は、ＤＮＡにインターカレートされ、それを切断する。ゼオシン耐性遺伝子は、１３，６６５ダルトンのタンパク質をコードする。本タンパク質は、ゼオシンに結合してそれとＤＮＡとの結合を妨げることにより、該抗生物質に対する耐性を与える。ゼオシンは、ほとんどの好気性細胞に対して有効であり、哺乳類細胞株、酵母および細菌における選択に使用することができる。
栄養要求性マーカー。
真核生物
ハイグロマイシン：リボソームでの翻訳を障害して誤訳を促進することにより、タンパク質合成を阻害するアミノサイクリトールである。耐性遺伝子（ｈｐｈ）は、ハイグロマイシン−Ｂ−リン酸化を解毒化する。
ヒスチジノール：ヒスチジン不含培地においてヒスチジル−ｔＲＮＡ合成を阻害することにより、哺乳類細胞に対して細胞毒性を示す。耐性遺伝子（ｈｉｓＤ）産物は、ヒスチジノールを必須アミノ酸であるヒスチジンに変換することによりその毒性を不活化する。
ネオマイシン（Ｇ４１８）：リボソームの機能を妨げることによりタンパク質合成を阻害する。耐性遺伝子ＡＤＨは、Ｇ４１８を解毒化するアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼをコードする。
ウラシル：ウラシル生合成に必須の酵素であるオロチジン−５’−ホスフェート・デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の変異を保有する実験室酵母株は、外来のウラシルの非存在下では成長することができない。ベクター上に保有された野生型遺伝子（ura4+, S. pombeまたはURA3 S. cerevisiae）のコピーは、形質転換細胞においてこの欠損を補う。
アデノシン：アデノシン合成に欠損を有する実験室株は、野生型遺伝子であるＡＤＥ２を保有するベクターによって補完されるであろう。
アミノ酸：ＬＥＵ２、ＴＲＰ １、ＨＩＳ ３またはＬＹＳ ２について野生型遺伝子を保有するベクターは、これら遺伝子を欠損した酵母株を補完するのに使用することができる。
ゼオシン：この新規なブレオマイシン−ファミリー抗生物質は、ＤＮＡにインターカレートされ、それを切断する。ゼオシン耐性遺伝子は、１３，６６５ダルトンのタンパク質をコードする。本タンパク質は、ゼオシンに結合してそれとＤＮＡとの結合を妨げることにより、該抗生物質に対する耐性を与える。ゼオシンはほとんどの好気性細胞に対して有効であり、哺乳類細胞株、酵母および細菌における選択に使用することができる。

単一の細胞内の鎖状体の数は、１細胞につき少なくとも１つの鎖状体、好ましくは１細胞につき少なくとも２つの鎖状体、より好ましくは１細胞につき３つ、例えば１細胞につき４つ、より好ましくは１細胞につき５つ、例えば１細胞につき少なくとも５つ、例えば１細胞につき少なくとも６つ、例えば１細胞につき７、８、９または１０、例えば１細胞につき１０以上であってよい。前述のように、各鎖状体は好ましくは１０００カセットまで含むことができ、また、１つの鎖状体が２０００カセットまで含むことができることが予想される。単一の細胞に最大で１０の鎖状体を挿入することにより、適切な条件下で調節可能なプロモーターを調節することによりオンに、またはオフにすることができる最大２０，０００の新規な発現可能遺伝子をこの細胞に含ませることができる。しかしながら、１０から１０００の間の新規遺伝子、例えば２０から９００の新規遺伝子、例えば３０から８００の新規遺伝子、例えば４０から７００の新規遺伝子、例えば５０から６００の新規遺伝子、例えば６０から３００の新規遺伝子を有する細胞を提供することがより好ましくあり得る。該遺伝子は、好都合なことに、該細胞において１から１０の相異なる鎖状体、例えば２から５の相異なる鎖状体に存在し得る。各鎖状体は、好都合なことに、１０から１０００の遺伝子、例えば１０から７５０の遺伝子、例えば１０から５００の遺伝子、例えば１０から２００の遺伝子、例えば２０から１００の遺伝子、例えば３０から６０の遺伝子を含み得る。

鎖状体は、いずれの既知の形質転換技術によって宿主細胞に挿入してもよく、好ましくは安定でかつ一時的でない宿主細胞の形質転換を保証する形質転換技術によって挿入する。従って鎖状体は、細胞が分裂する時にそれらによって複製される人工染色体として挿入してもよく、あるいは宿主細胞の染色体に挿入してもよい。鎖状体はまた、細胞が分裂する時にそれらによって複製されるプラスミドの形態で、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター、コスミドベクターで挿入してもよい。３つの挿入方法のどのような組み合わせもまた可能である。このように、１つまたはそれ以上の鎖状体が宿主細胞の染色体に統合され、かつ１つまたはそれ以上の鎖状体がプラスミドまたは人工染色体として挿入される場合がある。１つまたはそれ以上の鎖状体が人工染色体として挿入され、かつ１つまたはそれ以上が同じ細胞にプラスミドを介して挿入される場合がある。

機能的人工染色体にとっての基本的要件は、ＵＳ ４，４６４，４７２に記載されており、その内容は引用により本明細書に含まれる。人工染色体または機能的なミニ染色体は、それがまた呼ばれることがあるように、宿主の有糸分裂中にセントロメア様活性をコードするＤＮＡセグメントおよび該宿主によって認識される複製部位をコードするＤＮＡ配列を含む、複製および安定な有糸分裂維持の能力のあるＤＮＡ配列を含まなければならない。

適した人工染色体には、酵母人工染色体（ＹＡＣ）（例えば、Murrayら、Nature 305:189-193；またはＵＳ ４，４６４，４７２参照）、メガ酵母人工染色体（メガＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、マウス人工染色体、哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）（例えば、ＵＳ ６，１３３，５０３またはＵＳ ６，０７７，６９７参照）、昆虫人工染色体（ＢＵＧＡＣ）、鳥類人工染色体（ＡＶＡＣ）、バクテリオファージ人工染色体、バキュロウィルス人工染色体、植物人工染色体（ＵＳ ５，２７０，２０１）、ＢＩＢＡＣベクター（ＵＳ ５，９７７，４３９）またはヒト人工染色体（ＨＡＣ）が含まれる。

人工染色体は、宿主細胞がそれを「本物」の染色体と考え、それを維持し、かつ染色体として伝達するほど大きいことが好ましい。酵母その他の適した宿主種にとって、これは該種において最も小さい天然の染色体の大きさとほぼ一致することが多いであろう。サッカロミケス（Saccharomyces）については、最も小さい染色体の大きさは２２５Ｋｂである。

ＭＡＣは、他の種、例えば昆虫および魚類に由来する人工染色体を構築するのに使用することができる。本人工染色体は、好ましくは、完全に機能的な安定的染色体である。２つのタイプの人工染色体が使用可能である。ＳＡＴＡＣ（サテライト人工染色体）と呼ばれる一方のタイプは、安定な異質染色質の染色体であり、他方のタイプは真質染色体の増幅に基づいたミニ染色体である。

哺乳類人工染色体は、対象のタンパク質をコードする遺伝子を導入するためのゲノム外特異的統合部位を提供し、メガベーズサイズのＤＮＡセグメントの統合、例えば本発明の鎖状体の統合を可能にする。

本発明の他の実施例によると、鎖状体は宿主染色体に挿入されるか、または他のタイプのベクター、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクターまたはコスミドベクターなどにクローンされ得る。

好ましい人工染色体ベクターとは、宿主細胞、例えば酵母にて条件付きで増幅することが可能なベクターである。好ましい増殖とは少なくとも１０倍の増幅を意味する。さらに有利なことには、人工染色体ベクターのクローニング部位を、上述したカセット、すなわちＲＳ２および／またはＲＳ２’に隣接するような同じ制限酵素部位を含むように修正することができる。

また組換えは例えば組換えによってＤＮＡ分子を直接的に結合する、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ機構（引用文献：Sauer B 1993 Methods Enzymol 225:890-900）を用いるクリエーター・システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のような、または一方向性組換え（Landy A 1989, Ann Rev Biochem 58:913）のためにラムダ・ａｔｔ結合部位を用いるゲート・ウェイ系（Life Technologies, US 5,888,732）のような技術の改良により、鎖状体を形成するために用いられ得ると考えられる。さらに、ラムダｃｏｓ部位依存系は、鎖状体形成を可能にするために開発され得ることが予想される。

鎖状体は、ヌクレオチド配列の少なくとも２つのカセットの鎖状体形成によって構築または連続化が可能であり、それぞれのカセットは第一の付着末端、スペーサー配列、プロモーター、発現可能ヌクレオチド配列、ターミネーターおよび第二の付着末端を順番に含んでいる。前記手法のフローチャートを、図９ａに示す。

好ましい鎖状体形成はさらに、
一次ベクター［RS1−RS2−SP−PR−X−TR−SP−RS2’−RS1’］から始まり、ここにＸは発現可能なヌクレオチド配列を示し、ＲＳ１およびＲＳ１’は制限酵素部位を示し、ＲＳ２およびＲＳ２’はＲＳ１およびＲＳ１’と相違する制限酵素部位を示し、ＳＰは少なくとも２つのヌクレオチドのスペーサー配列を示し、ＰＲはプロモーターを示し、ＴＲはターミネーターを示し、
ｉ）ＲＳ２およびＲＳ２’に特異的な少なくとも1つの制限酵素の働きにより第一ベクターを切断し、一般式［rs₂-SP-PR-X-TR-SP-rs₁］であるカセットを得て（ここでrs₁およびrs₂は共に機能的な制限部位RS2またはRS2’を示す）、
ｉｉ）rs₁およびrs₂間の相互作用を介するカセットの切出しを構築する、
ことを含む。

特に好ましい実施例によれば、１つの末端にＲＳ２またはＲＳ２’を、および他の末端に非相補的突起あるいは平滑末端をそれぞれ有するベクターアームを、上述したカセットと共に鎖状体形成に添加し、さらに簡便な手法とする(図９ｂを参照のこと)。ベクターアームを供するための好ましいベクターの１つの実施例を図１５に開示し、ここにＴＲＰ１、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３は栄養要求株のマーカー遺伝子であり、ＡｍｐＲは抗生物質マーカー遺伝子である。ＣＥＮ４はセントロメアであり、ＴＥＬはテロメアである。ＡＲＳ１およびＰＭＢ１はそれぞれ、酵母および大腸菌にて複製を可能にする。ＢａｍＨ１およびＡｓｃ１ｈａ，制限酵素認識部位である。ベクターの核酸配列を配列番号：４に示す。ベクターをＢａｍＨ１およびＡｓｃ１で消化しベクターアームを遊離し、鎖状体のライゲーションに用いる。

一般的な鎖状体形成を図１６にて例証する。ベクターアームおよびカセットの比率は、図１７にて例証されるように鎖状体中のカセットの最大数を決定する。ベクターアームとは、好ましくは図１５に記載のような人工染色体ベクターアームである。

さらに、鎖状体形成溶液にストッパー（stopper）断片を加えることが可能である（ここでストッパー断片は、１つの末端にＲＳ２およびＲＳ２’、およびもう１つの末端に非相補的突起あるいは平滑末端をそれぞれ有する）。ストッパー断片とカセットの比率は同様に、鎖状体の最大サイズを制御することができる。

鎖状体形成手段に関するベクターアームを供する手法の別法として、酵母人工染色体、メガ・酵母人工染色体、バクテリア人工染色体、マウス人工染色体、ヒト人工染色体を包含する群から選択された人工染色体へ鎖状体を繋げることが可能である。

単一の細胞における鎖状体の数は、細胞につき少なくとも１つの鎖状体であり、好ましくは細胞につき少なくとも２つの鎖状体であり、より好ましくは細胞につき３つ、例えば細胞につき４つ、より好ましくは細胞につき５つ、例えば細胞につき少なくとも５つ、例えば細胞につき少なくとも６つ、例えば細胞につき７、８、９または１０であり、例えば好ましくは細胞につき１０以上の鎖状体である。上述のように、それぞれの鎖状体は好ましくは１０００以下のカセットを含み、そして１つの鎖状体は２０００以下のカセットを含み得ると考えられる。単一の細胞に１０以下の鎖状体を挿入する場合、前記細胞は２０，０００以下の異種性発現可能遺伝子をエンリッチすることができ、好適な条件下にて制御可能なプロモーターの制御によって作動を制御されうる。

より好ましくは、いかなる場合にも１０〜１０００の異種性遺伝子、例えば２０〜９００の異種性遺伝子、例えば３０〜８００の異種性遺伝子、例えば４０〜７００の異種性遺伝子、例えば５０〜６００の異種性遺伝子、例えば６０〜３００の異種性遺伝子または１００〜４００の異種性遺伝子を有する細胞を提供することがより好ましく、ここで前記異種性遺伝子は、遺伝子に１つの鎖状体をそれぞれ含む２〜４つの人工染色体として挿入されている。前記遺伝子は有意に、細胞内にて１〜１０、例えば２〜５つの異なる鎖状体に位置すること可能である。それぞれの鎖状体は有意に、１０〜２００遺伝子、例えば２０〜１００の遺伝子、例えば３０〜６０の遺伝子または５０〜１００の遺伝子を含むことができる。

［複数パラメータースクリーニングの実施例］
実施例１：ＲＡＲβおよびＰ４５０代謝のリガンドアクチベーターに関する複数パラメータースクリーニング
Ｐ４５０であるCYP3A4α、CYP2C9、CYP2D6、RARβを発現し、かつＨＩＳ３マーカーの転写を誘導するレチノイン酸（ＲＡ）応答プロモーターを含む酵母株を、産生細胞である酵母株（人工染色体に位置する異種性発現カセットのセットを各々含む細胞の集団を含む）と掛け合わせる。２倍体をＨＩＳ選択培地にプレートする場合、ＲＡＲアクチベーターを生産する細胞のみが生存可能である。すべてのコンストラクトの組み立ておよび取り扱いは、molecular biology 1999, John Wiley & Sons, Inc.の現在の手法に記載の標準的な方法によって行われる。

実施例２：ＲＡＲβを活性化するがＲＡＲαを活性化しないＰ４５０代謝およびリガンドに関する複数パラメータースクリーニング
ＲＡＲβのレポーター遺伝子がＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）であることを除いて実施例１と同様の２倍体酵母細胞を、ＲＡＲαを発現し、かつＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）の転写を誘導するＲＡ応答プロモーターを含む他の酵母細胞株と共にゲルカプセル化する。ゲルカプセル化は、Sahar et al., 1994., Flow cytometric analysis of entire microbial colonies. Cytometry 15: 213-221に記載のように行う。次にゲル粒子を、高強度の緑蛍光および低強度の黄蛍光に選別する。

実施例３：ＲＡＲβを活性化するがＲＡＲαおよびＲＡＲγを活性化しないＰ４５０代謝およびリガンドに関する複数パラメータースクリーニング
実施例２と同じゲル粒子を、ＲＡＲγを発現し、かつＣＦＰ（シアン化蛍光蛋白質）の転写を誘導するＲＡ応答プロモーターを含む酵母細胞株と共に２重封入する。２重ゲルカプセル化は、Gift et al., 1996, Nature Biotechnology, Vol. 14, 884-887に代表されえるような方法で行う。次にゲル粒子を、高強度の緑色蛍光および低強度の黄色およびシアン蛍光について選別する。

実施例４：ほ乳類系におけるＰ４５０代謝およびＰＰＡＲγおよびＰＰＡＲαを活性化するリガンドに関する複数パラメータースクリーニング
人工染色体に存在し、かつP450、CYP3A4αおよびCYP2Cを発現する1セットの異種性発現カセットをそれぞれ含む細胞集団を包含する産生細胞である酵母株を、ＰＰＡＲγ、ＰＰＡＲαを発現し、ＹＦＰの転写を誘導するＰＰＡＲγ応答プロモーターおよびＣＦＰの転写を誘導するＰＰＡＲα応答プロモーターを含むほ乳類細胞株と共に封入する。molecular biology 1999, John Wiley & Sons, Incの現在のプロトコルに記載の標準的な手法に従って、哺乳類細胞の取り扱いおよび操作を行う。ゲル粒子を、高強度の黄色およびシアン蛍光について選別する。

実施例５：多剤耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）増殖阻害およびＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ阻害に関する複数パラメータースクリーニング
産生細胞株（人工染色体に位置する1セットの異種性発現カセットをそれぞれ含む細胞の集団を含む)を米国特許番号４，３９９，２１９に記載のようにビーズに対して平均１つの株が存在する条件にてゲルカプセル化する。ビーズを、産生細胞の増殖を可能とする条件および異種性遺伝子が発現する条件下に置換する。ビーズを、代謝により蛍光分子を産する場合、つまりＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの基質が存在する状態でＭＲＳＡ株と共に２重封入する。ＭＲＳＡコロニーが少量または不存在のゲル液滴であり、かつ蛍光性でないものを選択する。

実施例６Ａ：ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害およびＨｅＬａ細胞の増殖阻害に関する複数パラメータースクリーニング
２本鎖ＤＮＡ切断片に結合する染色剤を含む培地における産生細胞株（人工染色体に位置する1セットの異種性発現カセットをそれぞれ含む細胞集団を含む)をプレートする。ＨｅＬａ細胞を産生細胞株上にプレートする。ガン細胞が増殖する領域内の産生細胞株をクローン化し、選択する。図３Ｂを参照のこと。

実施例６Ｂ：特異的ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ毒に関する複数パラメータースクリーニング
産生細胞株（人工染色体に位置する1セットの異種性発現カセットをそれぞれ含む細胞の集団を含む)を、米国特許番号４，３９９，２１９に記載のようにビーズに対して平均１つの株が存在する条件にてゲルカプセル化する。ビーズを、産生細胞株の増殖を可能とする条件および異種性遺伝子が発現する条件下に置換する。ビーズを、トポイソメラーゼＩＩ異型であるｔｏｐ２−１（ＪＮ３９４ｔ２−１類）を有しＧＦＰを発現する酵母細胞、および酵母トポイソメラーゼＩ（ＪＮ３９４ｔ１類）を欠損しＤｓＲｅｄを発現する酵母細胞と共に２重ゲルカプセル化する。ビーズをＦＡＣＳにて緑および赤蛍光について選別する。赤および緑蛍光のいずれも生じないビーズは、トポイソメラーゼＩ特異的な毒を生じる。緑蛍光のみを生ずるビーズは、トポイソメラーゼＩＩ特異的な毒を有している。上述のレポーター株は、molecular biology, 95, 315-327の方法に記載のような株に基づいている。図３Ｂを参照のこと。

［本発明の進化方法を用いた最適化過程の実施例]
製薬上、産業上、農業上または栄養上の有用性を有する可能性のある細胞を進化させるために、いかに本発明を用い得るかの実施例を次に提供する。

（小型から中型の経路を介する特定の構造クラスの進化）
実施例７：カロテノイド様化合物の進化
実用性
カロテノイドは黄、オレンジ、ピンク、赤および青色を示す天然色素である。主な役割は、酸化損傷からの保護である。カロテノイドは、医薬品関連物質であり（気管支ぜんそくの処置に用いられ、ガンの予防に関与する）、かつ商業的価値を有する。

スクリーニングおよび選択方法
・宿主細胞による異なる色素の生産について、プレーティングおよび採取を手動で行いスクリーニングした。
・抗酸化保護について、一重項酸素種の生産体としてメチレンブルーを用いてスクリーニングした。

手法
工程１：ほぼ全長のｃＤＮＡを、本実施例に付した一覧における種から作製する。
工程２：ｃＤＮＡライブラリーを、３０：３０：１：３０の比率におけるpEVE4、pEVE5、pEVE8およびpEVE9の４つのベクターの集まりを用いて作製する。図１１、１２、１３および１４を参照のこと。
工程３：それぞれのｃＤＮＡライブラリーを、基本的にBonaldo, MF et al. (1996) Genome Res. 6: 791-806に記載の方法４のようにノーマライズする。
工程４：非ノーマライズ化酵母（出芽酵母）ｃＤＮＡライブラリー由来のコーディング配列をＰＣＲによって増幅し、工程３にて生産したノーマライズ化ライブラリーから調製した一本鎖環状ＤＮＡに対する減法ハイブリダイゼーション法（subtractive hybridization）の実行に用い、ハウスホールド遺伝子を取り除く。残った一本鎖環を精製し、二本鎖ＤＮＡとし、そして大腸菌の形質転換に用いる。
工程５：ＥＶＡＣ含有細胞集団（Evolvable Artificial Chromosome）を、それぞれ相違なる１０のノーマライズおよびエンリッチしたｃＤＮＡライブラリーを用いて作製する。

発現カセットの調製
１．１００μｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ）５ｍｌにライブラリーの１０倍以上に相当するライブラリー接種菌を植菌し、一晩増殖し、
２．１．５ｍｌの培養液からプラスミドをミニプレップし（例えば、Qiaprep spin miniprep kit）、
３．Ｓｒｆ１でプラスミドを消化し、
４．断片を脱リン酸化し、熱してホスファターゼを不活化し（２０分、８０℃）、
５．Ａｓｃ１で消化し、
６．１％アガロースゲルに反応物の１／１０を泳動し、断片量を測定する。

ｐＹＡＣ４−Ａｓｃアームの調製
１．ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ）１５０ｍｌにｐＹＡＣ４−ＡｓｃＩを含むＤＨ５αの単一コロニーを植菌し、
２．ＯＤ_６００が１になるまで増殖し、細胞を集めプラスミドを調製し、
３．１００μｇのｐＹＡＣ４−ＡｓｃＩをＢａｍＨＩおよびＡｓｃＩで消化し、
４．断片を脱リン酸化し、熱してホスファターゼを不活化し（２０分、８０℃）、
５．断片を精製し（例えば、Qiaquick Gel Extraction Kit）、
６．１％アガロースゲルに泳動し、断片量を測定する。

ＥＶＡＣの調製
１．カセット／アームの率が１０００／１以下となるように、発現カセット断片とＹＡＣアームとを混合し、
２．断片濃度が７５ｎｇ／μＬ以上の反応液とするために必要に応じて混合液を濃縮し（例えば、Microcon YM30を用いる）、
３．Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１Ｕ加え、１６℃で１〜３時間インキュベートする。５００ｍＭのＥＤＴＡを１μＬ加えて反応を停止し、
４．パルスフィールドゲル（CHEF III、１％LMP アガロース、１／２強度TBE、120アングル、温度１２℃、電圧 5.6V／cm、ランプ切替時間５−２５秒、泳動時間３０時間）２レーンにロードした試料を泳動し、
５．分子量マーカーを含むゲルの一部を染色し、
６．分子量１００〜５００ｋｂに相当する試料レーンを切り出し、
７．高ＮａＣＬアガロース培地中にアガロースゲルを浸し（１ｕアガロース／１００ｍｇゲル）、
８．調製液を２０μＬ以下に濃縮し、
９．エレクトロポレーションを用いて調製液で好ましい酵母株を形質転換する：
ＹＰＤ１００ｍｌに１つの酵母コロニーを植菌し、ＯＤ_６００が１．３〜１．５程度になるまで増殖する。培養液を、４０００×ｇおよび４℃での遠心によって集める。細胞を滅菌水１６ｍｌに再懸濁する。ｐＨ７．５の１０×ＴＥ培地２ｍｌを加え、よく混合する。１０×リチウム酢酸溶液（１Ｍ、ｐＨ７．５）２ｍｌを加え、よく混合する。穏やかに３０℃で４５分間振盪する。０．５ＭのＤＴＥ１．０ｍｌを加え混合する。穏やかに３０℃で１５分間振盪する。酵母懸濁液を滅菌水で１００ｍｌに希釈する。細胞を洗浄し、４０００×ｇでの遠心によって集め、ペレットを５０ｍｌの氷冷滅菌水に再懸濁し、４０００×ｇで遠心し、ペレットを氷冷滅菌水５ｍｌに再懸濁し、４０００×ｇで遠心し、そしてペレットを氷冷滅菌１Ｍソルビトール０．１ｍｌに再懸濁する。エレクトロポレーションは、Bio-Rad Gene Pulserを用いて行った。滅菌１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中の濃縮した酵母細胞４０μｌを、１：１０に希釈したＥＶＡＣ調製液５μｌと混合した。酵母−ＤＮＡ混合物（ＥＶＡＣ）を、氷冷した０．２ｃｍギャップ・ディスポーザブル・エレクトロポレーション・キュベットに移し、１．５kV、２５μF、２００Ωで電気を流した。氷冷した１Ｍソルビトール１ｍｌをキュベットに加え、酵母を回収する。溶液を、１Ｍソルビトールを含む選択プレートへまく。３０℃でコロニーが出現するまでインキュベートする。

工程６：工程５にて作製したＥＶＡＣ含有細胞ライブラリーを集め、１つのスクリーニング集団とする。
工程７：スクリーニング集団を等量の２液に分ける。一方の液を抗酸化特性についてスクリーニングし（工程８）、もう一方の液を異なる色素生産についてスクリーニングする（工程９）。
工程８：抗酸化スクリーニング：
ａ．スクリーニング集団を１０倍に増幅し、１０の分液とする。
ｂ．亜集団を、その人工染色体に選択的な条件下で液体培養にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｃ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制し、そして細胞を、スクリーニング前に誘導状態下にて２４時間インキュベートする。
ｄ．それぞれの亜集団を、５つの濃度範囲のうちの１の濃度のメチレンブルーに対して暴露する。メチレンブルーに暴露した直後に、細胞を２００Ｗハロゲンランプで２時間照射する。
ｅ．集団溶液それぞれを異なる希釈率で再びプレートし、残りの集団溶液を保存する。
ｆ．生存率を４８時間後に決定する。最高濃度のメチレンブルーに暴露され、生存している細胞集団を選択し、ここで該細胞はもとの細胞株の１０％のにあたる細胞である。
工程９：示差色素生産スクリーニング：
ａ．スクリーニング集団を、人工染色体に選択的な条件下でプレート上にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｂ．異種性遺伝子を、スクリーニング前に２４時間２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制する。
ｃ．着色した細胞を選択する。
ｄ．１０％の最大色素発現細胞株（統計上）に相当する細胞を選択する。

工程８および工程９にて選択した遺伝的多様性の再混合は、発現カセットの削除、それらの混合および新規ＥＶＡＣへの再結合によって実行される。この過程を工程１０〜１３に記載する：

工程１０：工程８および工程９にて選択した集団それぞれを増幅し、各増幅した集団を当量ずつ集める。
工程１１：総ＤＮＡを以下の標準的な手法によって分離する。
工程１２：総ＤＮＡをＡｓｃＩで消化し、適した大きさ（２−１０ｋｂ）のＤＮＡ断片を分離する。
工程１３：精製したＤＮＡ断片および前記合成段階にて構築したＥＶＡＣには用いなかったカセットを１０％含む新規ＥＶＡＣ（ｗ／ｗ）を、基本的に工程５に記載のように合成する。
工程１４：それぞれのスクリーニングからの常に最良の１０％の細胞株について、工程７〜１３を５回繰り返す。
工程１５：５回目のサイクル終了後に生じた新規細胞集団は分離せず、人工染色体に選択的な条件下でＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで液体培養にて培養する。異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制する。
工程１６：その後、組合せた集団を色素および抗酸化活性について同時にスクリーニングする。メチレンブルーを最高濃度で用いて２時間暴露後、生存している着色細胞の数は元の集団における細胞株の５％である。このＭＢ濃度で生存し着色した細胞を、選択する。
工程１７：選択した集団を増幅し、新規ＥＶＡＣｓを工程１１〜１３に記載のように調製する。
工程１８：工程１５〜１７を常に細胞株の最良の５％を示す細胞について、３０回繰り返す。
工程１９：元の集団より１０倍高濃度のメチレンブルーで生存可能な細胞株であり、黄〜赤色の可視光をはっきりと有する細胞株を進化過程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子をサブクローンし、ＤＮＡシークエンシングにより特性化する。
工程２０：工程１９に記載の特性を有する細胞であり、かなり異なる遺伝子型を有する細胞を、表現型に関与する化合物を同定するために標準天然物有機化学を用いて分析する。

優先種および分類群
発生源種は以下に分類される：
・カロテノイドを生産する種：植物、藻類、菌類および光合成細菌
・他のカロテノイドを生産するためにカロテノイドを修飾する種:動物
・特定の遺伝子

カロテノイドを生産する種：
植物：アクチニディア・デリシオサ（Actinidia deliciosa）(キウイ)；シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）；ブラッシカ・ラパ（Brassica rapa）、タゲテス・エレクタ（Tagetes erecta）（マリーゴールド）、オレア・ヨーロピア（Olea europaea）(オリーブ)、ラクトゥカ・サティバ・バール・ロマーニ（Lactuca sativa var. romaine）（ロマーニレタス）、クェーカス・ロバー（Quercus robur）(カシ)、パイナス・パイナスター（Pinus pinaster）(カイガンショウ)、キャプシカム・アヌム（Capsicum annuum）（コショウ)、ビクサ・オレラナ（Bixa orellana）、サルシナ・ルテア（Sarcina lutea）、ビオラトライカラー（Viola tricolor）、ロニセラ・ジャポニカ（Lonicera japonica）、デロニクス・レギア（Delonix regia）、シー・メイ（Zea mays）（トウモロコシ）、エッショルチア・カリフォルニア（Eschscholzia californica）、カリカ・パパイア（Carica papaya）(パパイア)、デゥーカス・カロータ（Daucus carota）（ニンジン）、リコペルシコン・エスカレンタム（Lycopersicon esculentum）(トマト)、クロッカス・サチバス（Crocus sativus）(サフラン)、ベルバスカム・フロモイデス（Verbascum phlomoides）、フィサリス・アルケケンジ（Physalis alkekengi）、ゲンチアナ種（Gentiana spp.）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ピットストルム・トベラ（Pittosporum tobira）
藻類：リゾフォラ・マングル（Rhizophora mangle）(レッドマングローブ)、ヘマトコッカス・ピルビルス（Haematococcus pluvialis）(緑藻類)、エンテロモルファ・リンザ（Enteromorpha linza）(パタゴニア・マングローブ)、ウルバラクツカ（Ulva lactuca）(アオサ)、カウレルパ・メキシカーナ（Caulerpa mexicana）、ギガルティナ種（Gigartina sp）、ポリシフォニア種（Polysiphonia sp.）、ポルフィラ種（Porphyra sp.）、マクロシスチス・ピリフェラ（Macrocystis pyrifera）(ジャイアントケルプ)、サルガサン種（Sargassun sp）、ナノクロラム・ユーカリオタム（Nanochlorum eucaryotum）、デュナリエラ・バルダウィル（Dunaliella bardawil）、シンデスマス・オブリクス（Scenedesmus obliquus）、 オシラトリア・ルベッセンス（Oscillatoria rubescens）、フォルミジウム・ルリダム（Phormidium luridum）、アルスロスピラ種（Arthrospira spp.）、アスタジア・オセラタ（Astasia ocellata）、フーカス・ベシクロス（Fucus vesiculosus）、バソコッカス・プラジノス（Bathycoccus prasinos）、ミクロモナス・プシラ（Micromonas pusilla）、ボトリオコックス・ブラウニ（Botryococcus braunii）、
菌類: ザンソフィルロマイセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、キャンセレルス・シバリウス（Cantharellus cibarius）、フィコマイセス・ブラケスリーアヌス（Phycomyces blakesleeanus）、プクシニアグラミニス（Puccinia graminis）、エピコッカム種（Epicoccum spp.）、リコゴラ・エピデンドロン（Lycogola epidendron）
バクテリア：ロシフレクス・カステンホルジイ（Roseiflexus castenholzii）、ストレポトコッカス・ヘシウム（Streptococcus faecium）、ロドプシュウドモナス・アシドフィラ（Rhodopseudomonas acidophila）、アーウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）、 アグロバクテリウム・オーランティアカム（Agrobacterium aurantiacum）、ハロロドスピラ・アデルマレキイ・ハロロドスピラ・ハロクロリス（Halorhodospira abdelmalekii Halorhodospira halochloris）、アナベナPCC7120（Anabaena PCC 7120）、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロロフレグス・オーランチアカス（Cholroflexus aurantiacus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、フレキシバクター種（flexibacter spp.）、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ダイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）、メイオザーマス・ラバー（Meiothermus ruber）、クロロフレグス・オーランチアカス（Chloroflexus aurantiacus）

カロテノイドを修飾する種：
鳥類：カーデゥリス・トリスチス（Carduelis tristis）、カーディナリス・カーディナリス（Cardinalis cardinalis）、フラミンゴ（flamingo）
魚類：カラシウス・オーラタス（Carassius auratus）（金魚）、マイクロプテルス・サルモイデス（Micropterus salmoides）（ブラックバス）、パラチェイロドン・アクセルロジ（Paracheirodon axelrodi）(カージナルテトラ)、アンフィプリオン・オセラリス（Amphiprion ocellaris）(カクレクマノミ)、ゼブラソマ・フラベッセン（Zebrasoma flavescens）(黄色ニザダイ)、シンキロプス・スプレンディダス（Synchiropus splendidus）（ニシキテグリ）、ラクトリア・コーヌタ（Lactoria cornuta） (コンゴウフグ)
無脊椎動物：ククマリア・ジャポニカ（Cucumaria japonica）(ナマコ)、ランセラ・バスタ（Ianthella basta）(スポンジ)、クリバナリウス・エルスロプス（Clibanarius erythropus）(ヤドカリ)、ダフニア・マグナ（Daphnia magna）、ホマルス・アメリカヌス（Homarus americanus）(ロブスター)、パラリソデス・ブレビペス（Paralithodes brevipes）(タラバガニ)、フシナス・パープレグス（Fusinus perplexus）(貝殻)、ハリコンドリア・オカダイ（Halichondria okadai）(スポンジ)、スベリテス・マッサ（Suberites massa）(スポンジ)、ペンタクタ・オーストラリス（Pentacta australis）(ナマコ)、シュウドセントロタス・ドプレサス（Pseudocentrotus depressus）(ウニ)、オフィウロイッダ種（Ophiuroidda）(クモヒトデ)、パピリオ・ズータス（Papilio xuthus）(アゲハチョウ)、マイチルス・コルッカス（Mytilus coruscus）(日本海ムラサキイガイ)、クラソソテラ・ギガス（Crassostrea gigas）(カキ)、グロソドリス種（Glossodoris spp.）(ウミウシ)、フロミア・エレガンス（Fromia elegans）(ヒトデ)、アクチニア・エクイナ（Actinia equina）(ストロベリーウメボシアネモネ)、エネモニア・ビリディス（Anemonia viridis）(アネモネ)、ヒッポリマタ・グラガミ（Hippolysmata graghami）(小エビ)、リスマタ・デベリウス（Lysmata debelius ）(小エビ)、ハロシンシア・パピローサ（Halocynthia papillosa）（ホヤ)、クロッサスター・パポサス（Crossaster papposus）(ヒトデ)

特異的カロテノイド遺伝子：
ggps, psy, pds, zds, lcy-b, lcy-e, bhy, zep (リンドウ), idi, crtC, crtF (ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）), crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ (アーウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredovora）), zds (ネンジュモ), pds (シネココッカスPCC7942(Synechococcus PCC7942)), crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ (アーウィニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）), crtM, crtN (黄色ブドウ球菌), crtI, crtYb (ザンソフィルロマイセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）), ccs, crtL (トウガラシ), crtL, bchy (タバコ), lcy-b, lcy-e (プロクロロコッカス種（Prochlorococcus sp）), idi (出芽酵母), crtI, crtYe, crtYf, crtEb (コリネバクテリウム種（Corynebacterium sp）), psy-1 (リコペルシコン・エスカレンタム（Lycopersicon esculentum）), al1 (ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）)

実施例８：オメガ脂肪酸様化合物の進化
実用性
不飽和脂肪酸は正常な細胞機能のために重要な成分であり、細胞膜流動性に関わり、かつプロスタグランジンおよびロイコトリエンを含むエイコサノイドの前駆体である。ほ乳類にてこれらのエイコサノイドは、炎症反応、血圧の制御および生殖機能に関与している。

スクリーニングおよび選択方法
・細胞膜流動性についてフロー・サイトメトリー・スクリーニングを行う。
・耐寒性について増殖分析を行う。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行なった以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程７：スクリーニング集団を等量の２液に分ける。一方の液を耐寒性についてスクリーニングし（工程８）、もう一方の液を細胞膜流動性についてスクリーニングする（工程９）。
工程８：耐寒性：
ａ．スクリーニング集団を１０倍に増幅し、１０の分液とする。
ｂ．亜集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培養にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｃ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制し、細胞を、スクリーニング前に誘導状態下にて２４時間増殖する。
ｄ．それぞれの亜集団をプレートにまき、１０℃から３０℃に温度を上げながら増殖する。耐寒性を、プレートに最初にコロニーが現れた時点（現れた温度）で決定する。最低温度にて既定の時間後に増殖しており、統計的に元の細胞株の１０％の細胞が同様の所定の時間内に増殖する細胞集団を選択する。
工程９：細胞膜流動性スクリーニング：
ａ．スクリーニング集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培養にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｂ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制する。細胞を、２時間経過毎にフローサイトメトリーによって分析しているライブラリーの１／１０と共に誘導状態下で２０時間増殖する。
ｃ．各亜集団についてフローサイトメトリーを、正常に増殖しているが最高細胞膜流動性を有する細胞株１０％を分離するために用いる。この操作は基本的に、Benderitter M. et al, Cytometry, 2000, 39(2), 151−7に記載のように行う。
工程１０：工程８および工程９にて選択した集団それぞれを増幅する。選択した集団それぞれに対して、別々に工程１１〜１３を繰り返す。
工程１６：次に、混合した集団をエタノール耐性および増大した膜流動性についてスクリーニングする。用いるエタノールの濃度は、エタノールに一晩暴露後に３０℃にてその膜流動性が平均流動性を標準偏差の２倍以上超過する生存細胞数が、元の集団における細胞株の５％に相当する、最高濃度である。
工程１９：元の集団より１．５倍高濃度のエタノールで生存可能な細胞であり、３０℃にて元の集団の平均流動性を標準偏差の５倍以上超える細胞膜流動性を有する細胞を、進化過程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子をサブクローニングおよびＤＮＡシークエンシングによって特性化する。

優先種および分類群
・植物（特に、種）
・動物（特に、脂肪組織）
・魚類
・系統分類学的に多様な真核生物種の任意の群

（より長い経路を介する特定の構造クラスの進化）
実施例９：レチノイド様化合物の進化
実用性：
レチノイドはビタミンＡ誘導体であり、形態形成変化のエフェクターであると同時に、細胞増殖のモジュレーターである。抗腫瘍物質としてのレチノイドの活性は、レチノイドに対する細胞反応が一般に、ステロイド甲状腺ホルモン（または、核）受容体スーパーファミリーに属する核受容体の２つの群（RARsとRXRs）に仲介され、標的遺伝子のシス作用反応要素に二量体として結合するリガンド活性型転写因子として作用することを、数回のインビボでの実験における（主として皮膚、呼吸器官、膀胱、胸、消化器官に対する）発ガン物質モデルにて実証されている。

種々のレチノイン酸受容体イソ型は特有の組織分布パターンを示し、RARαは最も遍在して分布している。RARβは肺発達に重要な役割を果たし、肺にて腫瘍抑圧機能を有していることが示されている。

スクリーニングおよび選択方法
・カロテノイド様化合物を得るために色素生産についてスクリーニングし、抗酸化保護物を用いる（実施例７を参照のこと）。
・レチノイド様化合物を得るために、レチノイン酸受容体であるＲＡＲβの活性化アッセイを用いる。このアッセイには、レポーター系を採用する。レポーター構築物を、まず細胞内に置換し、続いて細胞外に置換する。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行なった以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程５：ＥＶＡＣ含有細胞集団をそれぞれ、１０の異なるノーマライズおよびエンリッチしたcDNAライブラリーを用いて作製する。前記ＥＶＡＣは実施例７にて進化した細胞集団内に形質転換される。
１．カロテノイドを生産する細胞集団を、液体培地にて平均対数値２×１０^６から２×１０^７細胞／ｍｌになるまで３０℃で通気しながらＥＶＡＣ選択条件下にて増殖する。
２．４００×ｇで５分間スピンし、細胞をペレットとし；上清を捨てる。
３．全量９ｍｌのＴＥ、ｐＨ７．５に細胞を再懸濁する。スピンし細胞をペレットにし、上清を捨てる。
４．細胞をゆっくりとｐＨ７．５の０．１Ｍリチウム／セシウム酢酸溶液５ｍｌに再懸濁する。
５．ゆっくりと振盪しながら３０℃で１時間インキュベートする。
６．４００×ｇで５分間スピンし細胞をペレットとし、上清を捨てる。
７．ｐＨ７．５のＴＥ１ｍｌにゆっくり再懸濁する。次に細胞を形質転換用に準備する。
８．１．５ｍｌチューブにて以下のものを混合する：
・１００μｌ酵母細胞
・５μｌキャリアＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）
・５μｌヒスタミン溶液
・１０μｌ容量に５／１００ＥＶＡＣ調製液（最大）。（１つのＥＶＡＣ調製液はエントリー・ベクター・ライブラリー・プラスミド混合液１００μｇから作製される）
９．ゆっくり混合し３０分間室温でインキュベートする。
１０．それぞれの形質転換反応液のために０．８ｍｌの５０％（ｗ／ｖ）PEG 4000および０．１ｍｌのＴＥおよび０．１ｍｌの１ＭＬｉＡｃを分離チューブにて混合する。さらにそれぞれの形質転換反応液に前記ＰＥＧ／ＴＥ／ＬｉＡｃ混合液１ｍｌを加える。ゆっくりピペッティングして溶液中の細胞を混合する。
１１．３０℃で１時間インキュベートする。
１２．４２℃で１５分間熱ショックを与え；３０℃に冷却する。
１３．５秒間高速で遠心して細胞をペレットにし、上清を取り除く。
１４．過栄養培地２００μｌに再懸濁し、適した選択培地にプレートする。
１５．形質転換したコロニーが出現するまで３０℃で４８〜１２０時間インキュベートする。

工程７：スクリーニング集団を分けない。
工程８：レチノイン酸受容体活性化：
ａ．スクリーニング集団を１０倍に増幅する。
ｂ．ＥＶＡＣ含有細胞集団を、酵母ベクター内のレポーター構築物およびヒトレチノイン酸受容体（ＲＡＲβ）のｃＤＮＡを含む酵母発現プラスミドを含むレポーター株と合わせ、ハプロイド細胞、レポーター系およびＥＶＡＣを選択する条件下にて培養する。用いたレポーター遺伝子は、βガラクトシダーゼである。レポーター株は基本的に、Salerno et al. 1996, Nucleic Acids Res. 24(4), 566-72に記載のように構築する。
ｃ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制する。細胞を、誘導状態下にて１８時間増殖する。増殖およびβガラクトシダーゼ活性は基本的に、Coldham et al., 1997, Environ. Health Perspect., 105(7), 734-42に記載のように９６ウェル・マイクロタイタープレートにて分析する。
ｄ．１０％の最高βガラクトシダーゼ活性を有する細胞を選択する。
工程９：工程９はなし。

工程８にて選択した遺伝子多様性の再混合は、物理的再分離およびＥＶＡＣの再形質転換によって行われる。

工程１０：工程８にて選択した集団をＹＰＤ５ｍｌにてＯＤ_６００が１．０より大きくなるまで増殖する。
工程１１：総ＤＮＡの１００μ１プラグ２つを、BioRadの「CHEF genomic DNA plug kits」取り扱い説明書の手法 n.2に記載のように調製する。
工程１２：ＥＶＡＣを精製し、分離する：
ａ．プラグを切断し、パルスフィールドゲルの３スロットにロードする。
ｂ．ＰＦＧＥを以下の条件で泳動する
ｉ）EVACsが1000 kbより小さい場合：Chef III、1％アガロース、1／2強度TBE、6V/cm、14℃、１２０度アングル、切替時間５０−９０秒、２２時間泳動。
ｉｉ）EVACs が1000 kbより大きい場合：Chef III、1％アガロース、1／2強度TBE、6V/cm、14℃、１２０度アングル、切替時間６０−１２０秒、２４時間泳動。
ｃ．１つのレーンを染色し、ＥＶＡＣの位置を同定する。
ｄ．２つの非染色レーンに相当する部分を切出し、標準的な手法、例えばパルスフィールドゲル電気泳動後にアガラーゼ処理によってアガロースを消化する。実用的な手法としては、(Ed. A.P. Monaco) Oxford University Press 1995がある。
ｅ．アガラーゼ処理した調製液を濃縮し、限外ろ過により１００μｌとする（例えば、microcon YM-30、Milliporeを用いる）。
ｆ．残留物にＴＥ４００μｌを加え、濃縮工程を繰り返す。繰り返し濃縮し、２５μＬにする。
工程１３：ＥＶＡＣsを前述のように酵母に形質転換する。
工程１６：工程８を基本的に繰り返すが、細胞集団とレポーター株を選択する条件下にて両者を共に培養する。次にＲＡＲβを活性化する前記化合物は、細胞膜に交差するために一般に親水性でなければならない。産生細胞株もまた、実施例１に記載のようにＰ４５０で形質転換する。この方法により、ＲＡＲβの活性化、化合物透過性およびＰ４５０代謝について同時にスクリーニングすることが可能となる。
工程１９：工程１６における第１０サイクルから、０．１μＭのレチノイン酸と同程度のＲＡＲβの活性化を示す細胞を進化過程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子を、サブクローニングおよびDNAシークエンシングにより特性化する。

優先種および分類群
・カロテノイドをレチノイドへ代謝する種：哺乳動物（特に肝臓および網膜組織）、魚（肝臓）、昆虫およびその他の動物。

実施例１０：タキソール様化合物の進化
実用性
タキソールは、種々のカルシノーマ、メラノーマおよびサルコーマの処置にて広範に用いられる有効性の高い抗ガン剤である。タキソールの独特の作用形態が、その顕著な有効性に加え、この薬剤を現在の使用における最も有効な抗ガン性物質の１つとしている。タキソールは、微小管の凝集を促進し、脱重合を防ぐ。これは、安定した微小管の束化および細胞周期有糸分裂の阻害を引き起こす。

スクリーニングおよび選択方法
・微小管重合の安定化について。微小管重合を、ゲルカプセル化および光散乱測定を用いるＦＡＣＳによって記録する。
・マウス繊維芽細胞の増殖阻害について。増殖阻害分析をゲル微小液滴およびフローサイトメトリーを用いて行う。

手法
タキソールの生合成経路は、ゲラニルゲラニル二リン酸から始まる１２から２０の酵素的段階が関与すると考えられる。タキソール形成における第１段階工程では、ゲラニルゲラニル二リン酸の環化を伴う。数段階の酵素工程後に、バッカチン（Baccatin）−IIIと称呼される中間体が合成される。この中間体は再生可能な天然資源から利用可能であり、よってタキソール様化合物を生産することが可能な細胞の集団を進化させるために、細胞集団を供するための前駆物質として用いられうる。上記工程が達成された場合、本過程にて同定した遺伝子を固定するべきである。酵母代謝物質からバッカチン（Baccatin）−IIIまでの工程数は、タキソール産生集団に経路の第1遺伝子を組込むことにより減らすことができる：前記遺伝子は、ゲラニルゲラニル二リン酸、タクサジエン合成酵素およびタクサジエン５α−水酸化酵素を生産するために、酵母代謝物質であるIPPを修飾し得るcrtE（フィトエン合成酵素）として既知である。前駆物質供給を用いない進化の第二モジュール後に、タキソール様化合物を生産することが可能な細胞集団が確立されているだろう。

個々のモジュラー進化について、以下の番号を付した工程に変更を行った以外は、実施例９に記載のような手法で行う。

工程７：スクリーニング集団を等量の２液に分ける。一方を微小管重合の安定性についてスクリーニングし（工程８）、もう一方をマウス繊維芽細胞の増殖阻害についてスクリーニングする（工程９）。
工程８：微小管重合の安定性
ａ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することにより誘導／脱抑制し、かつ細胞をスクリーニング前に誘導状態下にて２４時間増殖する。
ｂ．細胞を含むＥＶＡＣを５ｍｇチューブリン／ｍｌと共に封入する。
ｃ．ゲルカプセルを重合緩衝液に懸濁し、３７℃で１時間インキュベートする。集団の一画分をフローサイトメーターに通し平均光分散を決定する。
ｄ．並行してマイクロカプセルの対照集団を、ＧＴＰ欠損の同じ重合緩衝液中にてインキュベートする。集団をフローサイトメーターに通し、脱重合化したチューブリンを含むマイクロカプセルの光散乱を確認する。
ｅ．上清を３０分間５℃に冷却し、そして重合したチューブリンを含むカプセル上での光散乱に最も近似する光散乱を維持するマイクロカプセルを回収し、工程１０にて処理する。
ｆ．最高光散乱を有する細胞集団の１０％を選択する。

工程９：マウス繊維芽細胞の増殖阻害：
ａ．スクリーニング集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培養にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｂ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することにより誘導／脱抑制する。ＥＶＡＣ含有細胞集団を誘導条件下にて増殖する。
ｃ．マウス繊維芽細胞を繊維芽細胞増殖培地にてゲル微小液滴中に細胞を含むＥＶＡＣと共に封入する。
ｄ．２４時間インキュベートを行った後、液滴をフローサイトメトリーによってスクリーニングし、各液滴中のマウス繊維芽細胞の細胞増殖レベルを測定する。
ｅ．スクリーニングに入る宿主細胞株の１０％が選択されるように最も低い細胞増殖を有する液滴を選択する。

工程１０：工程８および工程９にて選択した集団それぞれを増幅する。選択した集団それぞれに対して、工程１１〜１３を別々に繰り返す。
工程１６：次に全集団を、微小管重合の安定化および二重ゲルカプセル化系を用いるマウス繊維芽細胞の増殖阻害について同時にスクリーニングする。
工程１９：１０ｎＭ濃度のタキソールによって誘引されるのと同程度の活性を有する細胞を、進化過程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子をサブクローンニングおよびＤＮＡシークエンシングにより特性化する。

優先種および分類群
発生源種は以下に由来する：
・タキソールおよび他のタキソール様化合物を生産する種
・系統発生的にタキソール産生細胞と類縁である生物体
・薬理活性に関連することが知られている有機物、例えば抗ガン剤
・タキソール生合成に関与することが知られている酵素をコードしている特定の遺伝子

タキソールを生産する種：
植物：タクサス・ブレビホリア（Taxus brevifolia）、タクサス・カスピダータ(Taxus cuspidata)、タクサス・ユンナネンシス（Taxus yunnanensis）、タクサス・カナデンシス（Taxus canadensis）、タクサス・バッカタ（Taxus baccata）、タクサス・ワリチャイナ（Taxus wallichiana）、タクサス・マイレイ（Taxus mairei）、タクサス・チャイネンシス（Taxus chinensis）、タクサス・メディア（Taxus media）；
菌類：タクソマイセス・アンドレアン（Taxomyces andreanae）、タクソマイセス・ワリチャイナ（Taxomyces wallichiana）、タクソマイセス・バッカタ（Taxomyces baccata）、タクソマイセス・カナデンシス（Taxomyces canadensis）

タキソール産生細胞と類縁である生物体：
同族のもの：タクサス・グロボサ（Taxus globosa）、タクサス・ビッターネイタ（Taxus biternata）、タクサス・カスピトーサ（Taxus caespitosa）、タクサス・レカーベイタ（Taxus recurvata）、タクサス・アンブラクリフェラ（Taxus umbraculifera）、タクサス・コンカータ（Taxus concorta）、タクサス・スマトラ（Taxus sumatrana）、トレヤ・グランジス（Torreya grandis）、トレヤ・アンシフェラ（ Torreya nucifera）；
ヒノキ族：カリトリス・アーボレラ（Callitris arborea）、カマエキパリス・ローソニアナ（Chamaecyparis lawsoniana）、クプレッサス・アリゾニア（Cupressus arizonica）、ユニペラス・チャイネンシス（Juniperus chinensis）、ユニペラス・レカーバス（Juniperus recurvus）、テトラクリニス・アーチキュラタ（Tetraclinis articulata）、ツジャ・オシデンタリス（Thuja occidentalis）、ウィッディントニア・カプレソイデス（Widdringtonia cupressoides）；
マキ族：ポドカルパス・フェルギネウス（Podocarpus ferrugineus）；
ヒノキ族：アガシス・アルバ（Agathis alba）、アラウカリア・インブリカタ（Araucaria imbricata）、アガシス・オーストラリス（Agathis australis）；
マツ族：アビス・バルサミア（Abies balsamea）、アビス・ウェッビアナ（Abies webbiana）、セドルス・デオドラ（Cedrus deodora）、ラリクス・ヨーロッピア（Larix europaea）、ピセ・ルーベンス（Picea rubens）、パイナス・オーストラリス（Pinus australis）、パイナス・パナスター（Pinus pinaster）、パイナス・ワリチャイナ（Pinus wallichiana）、シュウドツガ・タキフォリア（Pseudotsuga taxifolia）、ツガ・カナデンシス（Tsuga canadensis）；
イヌガヤ族：Ｃ．ホルツネイ（C. fortunei）、Ｃ．ハウリントニック（C.Hauringtonic）；
コウヤマキ族：サイアドピティス・ベルチシラタ（Sciadopitys verticillata）

抗ガン活性を有することが報告されている生物体：
植物：シェリドニウム・マジャス（Chelidonium majus）(クサノオウプラント)、レウム・オフィシナル（Rheum officinale）(中国ダイオウ、根)、レウム・ルバーブバルム（Rheum rhabarbarum）(食用ダイオウ、根)、アリウム・セパ（Allium cepa）(タマネギ、球根)、アロエベラ（Aloe vera）(アロエ、プラント)、アラチス・ヒポガー（Arachis hypogaea）(落花生類、種子)、ブラッシカ・オレラセ・バール・キャピタタ（Brassica oleracea var. capitata）(キャベツ、葉)、キャッシア・トラ（Cassia tora）(エビスグサ、種子)、コピチス・チャイネンシス（Coptis chinensis）(中国オウレン、根茎)、コピタス・ジャポニカ（Coptis japonica）(ハング・リア、根茎)、コピタス種（Coptis spp）(オウレン属、根茎）、コリダリス種（Corydalis spp）(ケマンソウ、植物)、エッシェコルジア・カリフォルニア（Eschscholzia californica）(カリフォルニア・ポピー、茎頂)、グラウシム・フラバン（Glaucium flavum）（ツノゲシ、根）、パパバール・ソムニファーム（Papaver somniferum）(ケシ、植物)、ポリゴナム・マルチフロラム（Polygonum multiflorum）(中国Cornbind、根）、レウム・パルマタム（Rheum palmatum）（中国ダイオウ、根)、レウム・ヒメノセパルス（Rumex hymenosepalus）(カナイグリ、根)、サングイナリア・カナデンシス（Sanguinaria canadensis）(アカネグサ、根)、センナ・アラタ（Senna alata）(Ringworm Bush、植物)、アドニス・ベルナリス（Adonis vernalis）(スプリング・フクジュソウ、植物)、
動物・海綿：コルチシウム種（Corticium sp）、ザッジャ・フリジノサ（Zyzzya cf. fuliginosa）、コンドロプシス種（Chondropsis sp）、ジアカルナス・エリスレウス（Diacarnus erythraenus）；
クラゲ：カリブデア・ラストニイ（Carybdea rastonii）、クリサオラ・クインクエシーラ（Chrysaora quinquecirrha）；
アネモネ：アクチニア・エクイナ（Actinia equina）、アネモニア・ビリディス（Anemonia viridis）；
昆虫：パピリオ・ポリゼネス（Papilio polyxenes）、ドロソフィラ・メラノガスター（Drosophila melanogaster）、ロードニウス・プロリクス（Rhodnius prolixus）、アピス・メリフェラ（Apis mellifera）、ラカノビア・オレレシア（Lacanobia oleracea）；
クモ：タランチュラ・ケラトウベイタス（Tarantula keratouveitis）、ロゾセレス・デセルタ（Loxosceles deserta）、ロゾセレス・レクルサ（Loxosceles reclusa）；
カニ：クリバナリウス・ノンギターサス（Clibanarius longitarsus）、タキプレウス・トリデンタス（Tachypleus tridentatus）、ウカ・プギラ（Uca pugilat）；
寄生虫：シストソマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）；
カタツムリ：リピア・シドイデス（Lippia sidoides）、リンネア・スタグナリス（Lymnaea stagnalis）、スチロキルス・ロンギカウダ（Stylocheilus longicauda）、ビオファラリア・グラブレラ（Biomphalaria glabrata）；
ヘビ：ボスロプス・ジャララカ（Bothrops jararaca）、クロタルス・ドリサス（Crotalus durissus）、ビペラ・アスピス（Vipera aspis）、シスタルルス・マラリウス・バルボウリ（Sistrurus Malarius Barbouri）；
ウニ：トクソネウステス・ピレオルス（Toxopneustes pileolus）
ヒトデ：アカリシゴルギア・イナーミス（Acalycigorgia inermis）、オーステリア・ペクチニフェラ（Asterina pectinifera）、フロミア・モニリス（Fromia monilis）；

（特定薬物標的のための細胞の進化）
実施例１１：ＨＩＶプロテアーゼ阻害物質の進化
実用性
後天性免疫不全症候群（AIDS）は、HIVウィルスによって引き起こされる深刻な病原性疾患である。AIDSは地球上のほとんどすべての国で流行しており、世界中で3600万人が感染していると推測されている。HIVプロテアーゼは、HIVウィルスによって発現される酵素である。HIVプロテアーゼを阻害する分子は、HIV感染症の処置に有用である。そのような分子の望ましい特性は、HIVに対する活性、HIVプロテアーゼに対する特異性、ウィルスに達するために細胞膜と交差する能力などを含む。

スクリーニングおよび選択方法
HIVプロテアーゼの活性を測定する分析法は、プロテアーゼのタンパク質基質を蛍光染料、例えば、未消化の基質では蛍光が消えるが、酵素に消化された基質では蛍光が消えない蛍光染料でラベルすることにより構築することが可能である。そのようなスクリーニングを構築するための産生細胞は、Jordan SP, Zugay J, Darke PL, Kuo LC. J Biol Chem 267, 20028-20032 (1992)の「溶媒組成および酵素濃度に応じたヒト免疫不全ウィルスプロテアーゼの活性化および二量化」に記載されている。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行なった以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程７：スクリーニング集団を分けない。
工程８：ＥＶＡＣ含有細胞集団を、発現を誘導する条件下にて１２時間増殖する。上記のように構築したレポーター分析を、微小液滴中にて宿主細胞の近くに組み込む。微小液滴をスクリーニング培地にてインキュベートする。２時間間隔で、１０％の微小液滴をフローサイトメーターに通し、蛍光レベルをスクリーニングする。２時間毎のバッチでは、最低の蛍光レベルの液滴を、統計的に宿主細胞株の１０％が選択された細胞に存在するように選択する。選択した細胞を、異種性遺伝子の誘導を停止する培地に直ちに入れる。各バッチから選択した細胞を集める。
工程９：工程９はなし。
工程１０：工程８にて選択した集団を増幅する
工程１６：次に細胞を、Ｐ４５０代謝およびHIVプロテアーゼ阻害について同時にスクリーニングする。選択基準を、例えばスクリーニングに入る細胞株の５％が選択されているように設定する。
工程１９：２５ｎＭ濃度のインディナビル（Indinavir）と同程度にHIVプロテアーゼを阻害する細胞を、進化工程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子を、サブクローンニングおよびDNAシークエンシングにより特性化する。

優先種および分類群
・系統分類学的に多様な真核生物種の任意の群

実施例１２：ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ毒の進化
実用性
トポイソメラーゼＩＩは細胞分裂にて必須の酵素であり、ＤＮＡの位相を制御し、特に開裂した２本鎖ＤＮＡを切断し、切断面を介して別の鎖を渡し、その後切断面を再結合する。トポイソメラーゼＩＩ酵素にこれらのＤＮＡの２本鎖切断を生じさせるが、それらを結合しない化合物（例えば、ドキソルビシンおよびエトポシドなど）は、抗ガン剤としての有用性を証明されている。そのような活性を有するが、異なる薬理学的特性を有する新規な化合物は、ガンおよび他の増殖性疾患の処置のための化合物として有用である。

スクリーニングおよび選択方法
トポイソメラーゼＩＩ毒（例えば、ドキソルビシンおよびエトポシドなど）は、高濃度のトポイソメラーゼＩＩを有する細胞に対して選択的に毒性を示し、それらの毒性効果は、トポイソメラーゼ酵素にＤＮＡにて２本鎖切断を生成させることにより達成される。

それらの効果は、２本鎖切断を引き起こすことなく該酵素に作用する化合物（例えば、クロロキンおよびデクスラゾキサンなど)によって拮抗される。これらの特性は、トポイソメラーゼ毒のような役割を果たす化合物を産生する細胞を選択し進化する過程を構築するために用いることができる。

酵母宿主細胞は、機能的ヒトトポイソメラーゼＩＩを条件付きで発現するとして科学文献、Wasserman R. et al, Cancer Research, 1993, 53, 3591に記載されている。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行なった以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程５：ＥＶＡＣ含有細胞集団を１０の異なるノーマライズおよびエンリッチしたｃＤＮＡライブラリーを用いて作製する。
工程７：スクリーニング集団を分けない。
工程８：トポイソメラーゼ阻害活性：
ａ．集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培養でＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増幅する。
ｂ．異種性遺伝子を、３５℃で２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することにより誘導／脱抑制する。細胞を、誘導条件下にて１２時間増殖する。３時間毎に細胞集団の２５％を、フローサイトメトリーによってＤＮＡ損傷についてスクリーニングする。それぞれの滴定にて最小ＤＮＡ損傷を示す２５％の細胞を廃棄し、残りを１００μＭ濃度のデクスラゾキサンを含む非誘導培地に置換する。
ｃ．生存し、工程８ｂから選択されるそれらの細胞を再懸濁し、更に１２時間誘導状態下にて増殖するが、この時は１２時間通して１００μＭ濃度のデクスラゾキサンと一緒である。この期間の最後に、細胞をフローサイトメトリーによってＤＮＡ損傷についてのスクリーニングを行い、最小ＤＮＡ損傷を示す細胞株の２５％を選択する。

工程９：ガン細胞増殖の阻害：
ａ．集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培養でＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｂ．非相同遺伝子を、３５℃で２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することにより誘導／脱抑制する。細胞をプレートし、誘導条件下にて４８時間増殖する。ガン細胞株を誘導した細胞集団に重層する。ガン細胞の除去帯に存在する酵母細胞を選択する。
工程１０：工程８および工程９にて選択した集団を増幅する。
工程１６：次に２重ゲルカプセル化系を用いて細胞集団をＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害およびガン細胞の増殖阻害について同時にスクリーニングする。
工程１９：１０サイクル目に、５μＭエトポシドの付加によって引き起こされる損傷と同程度のDNA損傷を示し、かつガン細胞増殖阻害を示す細胞を進化工程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子を、サブクローンニングおよびDNAシークエンシングによって特性化する。

優先種および分類群
・ポドフィロトキシンを生産する植物
・抗ガン活性を有することが周知である種

実施例１３：ｐ５３アクチベーターの進化
実用性
p53は、他の腫瘍細胞にアポトーシスを誘導する周知の腫瘍抑制遺伝子である。機能不全p53とは、アポトーシスが起きず、腫瘍細胞が増殖することを意味しうる。腫瘍の大部分が、機能不全p53タンパク質を有している。

p53タンパク質は転写因子として機能する。機能不全p53の多くの型が、転写因子として機能する能力を失っている。そのような機能不全型を有する腫瘍細胞は、p53タンパク質を蓄積するが転写が起こらず、従ってアポトーシスは生じない。そのような腫瘍細胞にて、機能不全p53の能力を回復する化合物は、転写を開始し、従ってアポトーシスは抗ガン作用としての有用性を有しているだろう（Rastinejad F., Science, 1999, 286, 2507-2510）。

スクリーニングおよび選択方法
ｐ５３は転写因子である。p53の標準細胞内レポーター系は、ａ）GFPまたは同様のレポータータンパク質をコードする遺伝子が異種性ｐ５３誘導プロモーターの制御下に置かれている遺伝子コンストラクトと共に、ｂ）機能不全ｐ５３をコードする誘導遺伝子コンストラクトを包含する。そのようなコンストラクトは、GFPの転写を活性化する化合物をスクリーニングするために用いられ得る。

手法
番号を付した工程に以下の変更を行った以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程５：ＥＶＡＣ含有細胞集団をそれぞれ１０の異なるノーマライズおよびエンリッチしたｃＤＮＡライブラリーを用いて作製する。次に細胞集団をさらに、上述したようなｐ５３レポーター系の標準的な手法により形質転換する。
工程７：スクリーニング集団を分けない。
工程８：ｐ５３活性スクリーニング：
ａ．集団を人工染色体およびｐ５３レポーター系を選択する条件下で液体培地にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｂ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することにより誘導／脱抑制し、細胞を誘導条件下にて３６時間増殖する。ＧＦＰを生産する細胞を取り除く。
ｃ．機能不全ｐ５３を誘導し、誘導を５日間継続し、並行してＥＶＡＣ遺伝子の誘導／脱抑制を行う。細胞を、ＧＦＰの生産について１時間後に観察し、その後１２時間間隔で５日間観察する。ＧＦＰを生産する細胞を選択する。
工程９：工程９はなし。
工程１０：工程８にて選択した集団を増幅する。
工程１６：それぞれの細胞をゲルカプセル化し、増殖を可能としクローン化した亜集団を形成する。クローン化集団を腫瘍細胞株と２重ゲルカプセル化し、ゲル液滴をGFP生産およびアポトーシス誘導についてスクリーニングする。選択基準を、スクリーニングに入る細胞株の５％が選択されるように設定する。
工程１９：誘導の１時間以内にＧＦＰを生産しアポトーシスを誘導する細胞を、進化過程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子をサブクローニングおよびＤＮＡシークエンシングによって特性化する。

優先種および分類群
・抗ガン特性を有することが報告されている生物体（実施例１０を参照のこと）
・系統分類学的に多様な真核生物種の任意の群

実施例１４：フマル酸還元酵素阻害剤の進化
実用性
フマル酸還元酵素は、フマル酸を琥珀酸に還元し、リーシュマニア（Leishmania）、ヘリコバクター（Helicobacter）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）およびストレプトコッカス（Streptococcus）のような属に由来する病原体を含む多くの有機体の嫌気性代謝における基本工程にある。

フマル酸還元酵素の活性を阻害する化合物は、例えば寄生生物または病原体がそれらの生活環を達成するのを防ぎ、よってそのような感染性疾患の制御に有用である。フマル酸還元酵素はヒトに存在しないため、その化合物はヒトに対して重大な毒性を有していないはずである。

スクリーニングおよび選択方法
フマル酸還元酵素活性は、フマル酸の付加の結果としてそれがＮＡＤＨを酸化する割合で測定される。酵素反応の進行は、340nmの分光測光法で測定される。詳細な手法は、Chen et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 2023−2029を参照のこと。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行った以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程７：スクリーニング集団を分けない。
工程８：フマル酸還元酵素スクリーニング：
ａ．スクリーニング集団を１０倍に増幅する。
ｂ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制し、細胞をスクリーニング前に誘導状態下にて２４時間増殖する。
ｃ．フマル酸還元酵素をゲル微小液滴内にて細胞を含むＥＶＡＣと同時に封入する。
ｄ．フマル酸還元酵素を含むが細胞を含むＥＶＡＣを含まない微小液滴を、１００μＭＮＡＤＨおよび１ｍＭフマル酸を含む液体培地にて３０℃でインキュベートした。溶液をフローサイトメトリーによって分析し、最適なインキュベート時間を決定した。
ｅ．微小液滴を１００μＭＮＡＤＨおよび１ｍＭフマル酸を含む液体培地に置換し、最適時間インキュベートした。
ｆ．次いで、ゲル微小液滴をフローサイトメーターに通し、３４０ｎｍでの吸光度を測定した。酵素の活性は、３４０ｎｍでの吸光度レベルから測定する。スクリーン内の細胞株の１０％にあたるフマル酸還元酵素を最大阻害する細胞が選択されるように、最低酵素活性を有する細胞を選択する。

工程９：工程９はなし。
工程１０：工程８にて選択した集団を増幅する。
工程１６：ゲル液滴をＳ型球菌（S. aureus）と共に２重封入し、ゲル液滴をフマル酸還元酵素阻害および細菌細胞増殖阻害について同時にスクリーニングする。選択基準は、スクリーン内の５％細胞株が選択されるように規定する。
工程１９：フマル酸還元酵素の阻害および１μＭ濃度の液滴にリコカルコン（licochalcone）を加えることにより達成するのと同じかそれ以上強力にＳ型球菌増殖阻害を示す細胞を、進化過程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子をサブクローニングおよびＤＮＡシークエンシングによって特性化する。

優先種および分類群
・植物の根
・系統分類学的に多様な真核生物種の任意の群

（機能的に独立した特定の標的の進化）
実施例１５：細胞保護剤の進化
実用性
ガン化学療法の中心的課題の1つは、使用される抗ガン物質がガン細胞と同様に正常細胞も殺してしまうことである。正常細胞を殺す副作用は、生命に危険を及ぼすほど厳しくなることがあり、たびたびガンの処置を止めなくてはならない。そのような抗ガン物質から細胞を保護する化合物はガン化学療法の副作用を減少し、よって治療結果および患者の生活の質の両方を改善する有用性を有している。そのような化合物の既存の例としては、エトポシドのようなガン物質の細胞毒性効果に対して細胞を保護するデクスラゾキサンおよびクロロキンを共に含む。しかし、より良い保護剤が必要とされている。

スクリーニングおよび選択方法
ドキソルビシン、タキソール、ビンクリスチンおよびシスプラチンのような細胞毒性抗ガン物質存在下における生存についてスクリーニングして選択した宿主細胞を誘導しうる。一連の選択ラウンドに関して、細胞が選択されるために生存しなければならない細胞毒性物質の濃度を増加させることができる。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行った以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程７：スクリーニング集団を等量の２液に分ける。一方をエトポシドに対してスクリーニングし（工程８）、もう一方をビンクリスチンに対してスクリーニングする（工程９）。
工程８：エトポシドスクリーニング：
ａ．スクリーニング集団を１０倍に増幅し、１０の分液とする。
ｂ．亜集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培地にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｃ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制し、細胞をスクリーニング前に誘導状態下にて３６時間増殖する。
ｄ．それぞれの亜集団が平均3回出現する細胞株を有するように希釈する。
ｅ．それぞれの亜集団を１０の濃度範囲のうちの１のエトポシドに暴露する。生存率を２時間後に決定する。最高濃度のエトポシドで生存しており、その細胞が統計的に生存している細胞株の１０％にあたる細胞集団を選択する。

工程９：ビンクリスチンスクリーニング：
ａ．スクリーニング集団を１０倍に増幅し、１０分液に分ける。
ｂ．亜集団を、人工染色体に選択的な条件下で液体培地にてＯＤ_６００が０．６〜１．０になるまで増殖する。
ｃ．異種性遺伝子を、２００μＭＣｕ_２ＳＯ_４を含むメチオニン欠損培地に細胞を再懸濁することによって誘導／脱抑制し、細胞をスクリーニング前に誘導状態下にて３６時間増殖する。
ｄ．それぞれの亜集団を１０の濃度範囲のうちの１のビンクリスチンに暴露する。生存率を２時間後に決定する。最高濃度のビンクリスチンで生存しおり、その細胞が統計的に生存している細胞株の１０％にあたる細胞集団を選択する。
工程１０：工程８および工程９にて選択したそれぞれの集団を増幅し、それぞれの増幅集団を等量ずつ集め、
工程１６：次に全集団を、エトポシドおよびビンクリスチン耐性の両方についてスクリーニングする。選択基準は、スクリーニング内の細胞株の５％が選択されているように規定する。
工程１９：元の集団と比較して、エトポシドの１０倍高濃度またはビンクリスチンの１０倍高濃度、あるいは両方を合した５倍高用量に耐える能力を示す細胞を、進化工程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子を、サブクローニングおよびDNAシークエンシングにより特性化する。

優先種および分類群
・ビンカ属の植物種
・タキソールを産することが知られている生物体（実施例１０の一覧を参照のこと）

実施例１６：抗菌性物質の進化
実用性
耐性の広範囲な出現は、細菌性疾病ための古典的な抗生物質治療の有効性を著しく制限する。大部分はヒトと動物における抗生物質の過度および幾度もの不必要な使用による結果であり、抗生物質耐性は、患者の罹患率、死亡率の増加および健康管理全体にかかる費用の増大を招いている。

新興の抗生物質耐性感染症を処置するための新規治療法の必要性が強力に望まれている。プレミアム（premium）は現在の細菌耐性機構を回避すると期待されていることから、新規のまたは現在承認されている抗生物質と少なくとも異なる機構によって機能する阻害物質に費用がつぎ込まれている。

スクリーニングおよび選択方法
スクリーニングはゲル微小液滴およびフローサイトメトリーまたはオーバーレイ系を用いて行うことができる。第一のスクリーニング中にて複数多剤耐性株を用いることは、多重多剤耐性株に対する活性を有するヒットを選択する推測的仮定を提供するだろう。

本実施例にて述べた手段は、本明細書に記載のもの以外の微生物に適用することが可能である。哺乳類細胞は1つまたはそれ以上の選択条件にて使用することが可能であり、哺乳類細胞毒性を有する化合物を生産しない宿主細胞を選択するために用いることができる。

手法
以下の番号を付した工程に変更を行った以外は、実施例７に記載の手法と同様に行う。

工程７：スクリーニング集団を分けない。
工程８：抗菌性スクリーニング：
ａ．ＥＶＡＣ含有細胞集団を誘導状態下にて増幅する。
ｂ．黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）をゲル微小液滴にて細胞を含むＥＶＡＣと共に封入する。
ｃ．２４時間インキュベーションを行い、その後液滴をフローサイトメトリーによりスクリーニングし、それぞれの液滴にて細菌による細胞増殖レベルを測定する。
ｄ．スクリーンに入る宿主細胞株の１０％が選択されるように細胞増殖が最低である液滴を選択する。
工程９：細胞集団をＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｄ６で形質転換する。
工程１０：工程８にて選択した集団を増幅する。
工程１６：次に集団を細菌増殖の阻害およびＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ２Ｄ６の阻害についてスクリーニングする。選択基準をスクリーニングに入る細胞株の５％が選択されるように規定する。
工程１９：Ｐ４５０を阻害せずバンコマイシン１μｇ／ｍｌ濃度で達成するのと等しい抗菌活性を示した細胞を、進化工程から取り出す。これらの活性に関与する遺伝子を、サブクローンニングおよびDNAシークエンシングにより特性化する。

優先種および分類群
・菌類
・系統分類学的に多様な真核生物種の任意の群

その他の実施例：
実施例１７：認識配列および開裂点を有する珍しい制限酵素
本実施例にて珍しい制限酵素をその認識配列および開裂点と共に一覧にする。

W＝AまたはT ； N＝A、C、G、またはT

１７ａ）独特、回帰性突起

AscI GG^∧CGCG_CC
AsiSI GCG_AT^∧CGC
CciNI GC^∧GGCC_GC
CspBI GC^∧GGCC_GC
FseI GG_CCGG^∧CC
MchAI GC^∧GGCC_GC
NotI GC^∧GGCC_GC
PacI TTA_AT^∧TAA
SbfI CC_TGCA^∧GG
SdaI CC_TGCA^∧GG
SgfI GCG_AT^∧CGC
SgrAI CR^∧CCGG_YG
Sse232I CG^∧CCGG_CG
Sse8387I CC_TGCA^∧GG


１７ｂ）突起なし

BstRZ246I ATTT^∧AAAT
BstSWI ATTT^∧AAAT
MspSWI ATTT^∧AAAT
MssI GTTT^∧AAAC
PmeI GTTT^∧AAAC
SmiI ATTT^∧AAAT
SrfI GCCC^∧GGGC
SwaI ATTT^∧AAAT


１７ｃ）非回帰および／または可変突起

AarI CACCTGCNNNN^∧NNNN_
AbeI CC^∧TCA_GC
AloI ^∧NNNNN_NNNNNNNGAACNNNNNNTCCNNNNNNN_NNNNN^∧
BaeI ^∧NNNNN_NNNNNNNNNNACNNNNGTAYCNNNNNNN_NNNNN^∧
BbvCI CC^∧TCA_GC
CpoI CG^∧GWC_CG
CspI CG^∧GWC_CG
Pfl27I RG^∧GWC_CY
PpiI ^∧NNNNN_NNNNNNNGAACNNNNNCTCNNNNNNNN_NNNNN^∧
PpuMI RG^∧GWC_CY
PpuXI RG^∧GWC_CY
Psp5II RG^∧GWC_CY
PspPPI RG^∧GWC_CY
RsrII CG^∧GWC_CG
Rsr2I CG^∧GWC_CG
SanDI GG^∧GWC_CC
SapI GCTCTTCN^∧NNN_
SdiI GGCCN_NNN^∧NGGCC
SexAI A^∧CCWGG_T
SfiI GGCCN_NNN^∧NGGCC
Sse1825I GG^∧GWC_CC
Sse8647I AG^∧GWC_CT
VpaK32I GCTCTTCN^∧NNN_


１７ｄ）メガヌクレアーゼ

I-Sce I TAGGGATAA_CAGG^∧GTAAT
I-Ceu I ACGGTC_CTAA^∧GGTAG
I-Cre I AAACGTC_GTGA^∧GACAGTTT
I-Sce II GGTC_ACCC^∧TGAAGTA
I-Sce III GTTTTGG_TAAC^∧TATTTAT
Endo. Sce I GATGCTGC_AGGC^∧ATAGGCTTGTTTA
PI-Sce I GG_GTGC^∧GGAGAA
PI-Psp I TGGCAAACAGCTA_TTAT^∧GGGTATTATGGGT
I-Ppo I CTCTC_TTAA^∧GGTAG
HO TTTCCGC_AACA^∧GT
I-Tev I NN_NN^∧NNTCAGTAGATGTTTTTCTTGGTCTACCGTTT

多くのメガヌクレアーゼが同定されているが、その正確な認識配列は決定されておらず、例えばwww.meganuclease.comを参照のこと。

実施例１８：鎖状体サイズ制限実験(ストッパーの使用)

材料は次のものを用いた：
pYAC4（Sigma. Burke et al. 1987, science, vol 236, p 806）をEcoR1およびBamH1で消化し、かつ脱リン酸化した。
pSE420（invitrogen）を、EcoR1を用いて直線化し、鎖状体形成するためのモデル断片として用いた。
T4 DNAリガーゼ（Amersham-pharmacia biotech）をメーカーの取扱説明書に従ってライゲーションに用いた。

方法：断片およびアームを、図に示した比率（濃度は任意の単位）で混合した。ライゲーションを、１６℃で１時間行った。５００ｍＭ ＥＤＴＡを１μＬ加えることにより反応を停止した。産物を、標準アガロースGE（１％アガロース、１／２強度TBE）またはPFGE（CHEF III、1％LMPアガロース、１／２強度TBE、角度120、温度１２℃、電圧5.6V／cm、ランプ切替時間５−２５秒、３０時間泳動)によって分析した。

結果を図１７ａおよび１７ｂに示す。

実施例１９：異なる発現条件下にて同じ酵母クローンを用いて得た、相異なるパターンの「表現型」の発現
コロニーを滅菌爪楊枝で採取し、４つの抑制および／または誘導条件（-Ura/-Trp, -Ura/-Trp/-Met, -Ura/-Trp/+200 μM Cu2SO4, -Ura/-Trp/-Met/+200μM Cu2SO4）に相当するプレート上に線画培養した。結果を図24に示す。

図１は、細胞によって合成された化合物についての複数パラメータースクリーニングを示す。その例では、各細胞が３つの相異なるレポーターシステムにより組み換えられている。各レポーターシステムは、相異なる蛍光リードアウトを生じる。各細胞はまた、数多くの異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む。これらの異種性ヌクレオチド配列は、該細胞が複数の新規化合物を産生することを可能にする。該化合物は、該レポーターシステムと相互作用し、蛍光リードアウトをもたらすことができる。本具体例においては、Ｃｏｘ−２およびＮＦ−κＢを阻害し、Ｃｏｘ１を阻害しない化合物が望ましい。本具体例において、初期のラウンドでは１つ、２つまたは３つ全ての基準を満たす細胞が選択される。後期のラウンドでは、全ての選択基準に適合する細胞のみが選択される。 図２は、新規抗菌物質についての複数パラメータースクリーニングの構成を示す。それは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）成長阻害、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ阻害およびＰ４５０非阻害アッセイを含む。本スクリーニングは、例えば、選択された幾つかのヒトＰ４５０の非阻害のための、および組換え枯草菌（Bacillus subtillis）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの阻害のためのＧＦＰレポーターシステムにより、産生細胞株のライブラリーを形質転換することにより組み立てられる。そして該ライブラリーをプレートに播き、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）株で覆う。該化合物は、該産生細胞の細胞壁を通過しＭＲＳＡ株に到達しなければならないので、本スクリーニングはまた、適当な溶解特性を有する化合物を選択するであろう。ＭＲＳＡ細胞の取り除かれた地帯に存在し、かつ所望の蛍光色の組み合わせを産生する産生細胞が選択される。 図３ａは、癌防御化学物質のための複数パラメータースクリーニングの構成を図示する。本アッセイでは、産生細胞種ライブラリーは、各カプセルが平均１つの産生細胞を有するように封入されたゲルである。該微小滴中の細胞は、該産生細胞種の複数のコピーを有することにより多くの化合物が産生されるよう、数世代成長できるものである。これらのクローン細胞株は、その本来の遺伝子以外に、ヒトＤＮＡトポイソメラーゼＩＩを発現する透過処理済酵母とともにゲル封入されている。ゲル微小液滴環境は、トポＩＩ毒および本酵素によって生じる特異的二本鎖切断のためのマーカーを含んでいる。酵母が内側および外側微小滴の両方において生存しており、かつ染色されなかったゲル微小液滴が選択される。 図３ｂは、選択的ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ毒である、新規化学療法薬のための複数パラメータースクリーニングの構成を示す。 図４は、ＲＸＲ−ＲＸＲ活性化を伝える産生細胞種ライブラリーが、ＲＸＲα−ＰＰＡＲγ活性化を伝える哺乳類細胞株とともにゲル封入されている、複数パラメータースクリーニングの構成を示す。ＲＸＲα−ＰＰＡＲγ活性化は伝えるがＲＸＲ−ＲＸＲ活性化は伝えないゲル微小液滴が選択される。 図５は、吸収および薬理活性のための複数パラメータースクリーニングの例を示す。二元的培養システムを使用し、細胞選択の時期を選ぶことにより、所望の薬理活性および良好な吸収プロファイルを有する産生細胞を選択することができる。 図６は、ヒト薬物代謝酵素（ＤＭＥ）により迅速に代謝される化合物により生じる偽陽性の数を最小限にし、そしてまた、代謝後に活性があり、かつ本方法によらなければ発見されないままであったであろう化合物の発見をもたらすスクリーニングシステムの例を示す。 図７は、標的活性、ＤＭＥによる代謝および細胞毒性を評価するための本発明のスクリーニングシステムの略図を示す：第一の微小滴が薬理学的標的およびＤＭＥにより形質転換された産生細胞種のクローン系であり、第二の微小滴が肝細胞である二重ゲル封入システムを使用し、標的活性、ＤＭＥ代謝および肝毒性について同時にスクリーニングすることが可能である。 図８は、ある発現状態からあるエントリーライブラリー(本発明のヌクレオチドライブラリー）への発現可能ヌクレオチド配列の組み込みにつながる段階のフローチャートを示す。 図９は、発現可能ヌクレオチド配列を含むエントリーライブラリーから適した宿主細胞に転換される進化可能人工染色体（ＥＶＡＣ）につながる段階のフローチャートを示す。図９ａは、鎖状体形成、サイズ選択および人工染色体ベクターへの挿入を含むＥＶＡＣの生産方法を示す。 図９は、発現可能ヌクレオチド配列を含むエントリーライブラリーから適した宿主細胞に転換される進化可能人工染色体（ＥＶＡＣ）につながる段階のフローチャートを示す。図９ｂは、ＥＶＡＣを得るための鎖状体形成およびベクター・アームのライゲーションの一段階生産を示す。 図１０は、模範的エントリー・ベクターを示す。ＭＣＳは、発現可能ヌクレオチド配列を挿入するためのマルチクローニングサイトである。ＡｍｐＲは、アンピシリン耐性のための遺伝子である。ＣｏｌＥは、大腸菌における複製開始点である。Ｒ１およびＲ２は、制限酵素認識部位である。 図１１は、本発明のエントリー・ベクターであるＥＶＥ４の例を示す。ＭＥＴ２５はプロモーターであり、ＡＤＨ１はターミネーターであり、ｆ１は、繊維状ファージ、例えばＭ１３のための複製開始点である。スペーサー１およびスペーサー２は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に由来する幾つかのヌクレオチドにより構成され、ＳｃｆＩおよびＡｓｃＩは、制限酵素認識部位である。他の略語は図１０参照のこと。本ベクターの配列は配列番号１に示す。 図１２は、本発明のエントリー・ベクターの例であるＥＶＥ５を示す。ＣＵＰ１はプロモーターであり、ＡＤＨ１はターミネーターであり、ｆ１は、繊維状ファージ、例えばＭ１３のための複製開始点である。スペーサー１およびスペーサー２は、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に由来する幾つかのヌクレオチドにより構成され、ＳｃｆＩおよびＡｓｃＩは、制限酵素認識部位である。他の略語は図１０参照のこと。本ベクターの配列は配列番号２に示す。 図１３は、本発明のエントリー・ベクターの例であるＥＶＥ８を示す。ＣＵＰ１はプロモーターであり、ＡＤＨ１はターミネーターであり、ｆ１は、繊維状ファージ、例えばＭ１３のための複製開始点である。スペーサー３は、ラムダファージＤＮＡ断片の５５０ｂｐ断片である。スペーサー４は酵母由来のＡＲＳ１配列である。ＳｃｆＩおよびＡｓｃＩは制限酵素認識部位である。他の略語は図１０参照のこと。本ベクターの配列は配列番号３に示す。 図１４は、本発明のエントリー・ベクターであるＥＶＥ９の例を示す。ＭＥＴ２５はプロモーターであり、ＡＤＨ１はターミネーターである。スペーサー５よび６はラムダファージＤＮＡである。本ベクターの配列は配列番号５に示す。 図１５は、本発明の鎖状体がクローン化され得る進化可能人工染色体（ＥＶＡＣ）に、アームを提供するためのベクター（ｐＹＡＣ４−ＡｓｃＩ）を示す。ＴＲＰ１、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３は酵母栄養要求性マーカ遺伝子であり、ＡｍｐＲは大腸菌抗生物質マーカー遺伝子である。ＣＥＮ４はセントロメアであり、ＴＥＬはテロメアである。ＡＲＳ１およびＰＭＢ１は、それぞれ酵母および大腸菌における複製を可能とする。ＢａｍＨ ＩおよびＡｓｃ Ｉは制限酵素認識部位である。本ベクターのヌクレオチド配列は配列番号４に示す。 図１６は、一般的鎖状体形成方法を示す。左側に、制限酵素部位、スペーサー、プロモーター、発現可能ヌクレオチド配列およびターミネーターを有する環状エントリー・ベクターを示す。これらをランダムに切り出し、ライゲーションする。レジェンド：レーンＭ：分子量マーカー、Ｐｓｔ１により消化されたλファージＤＮＡ。レーン１−９、鎖状体形成反応。断片対ｙａｃアームの比率（Ｆ／Ｙ）を表に示す（レーン−Ｆ／Ｙ：１−１００／１、２−５０／１、３−２０／１、４−１０／１、５−５／１、６−２／１、７−１／１、８−１／２、９−１／５）。 図１７ａは、実施例１８に記載するように、鎖状体形成と進化可能人工染色体の合成との統合およびベクター・アーム対発現カセットの比率を調節することによりいかにして鎖状体サイズを調節することができるかについて図示する。 図１７ｂは、実施例１８に記載するように、鎖状体形成と進化可能人工染色体の合成との統合およびベクター・アーム対発現カセットの比率を調節することによりいかにして鎖状体サイズを調節することができるかについて図示する。 図１８は、ＥＶＡＣ・ゲル・レジェンド：ＥＶＡＣ含有クローンのＰＦＧＥ：レーンａ：酵母ＤＮＡ ＰＦＧＥマーカー（ＹＮＮ２９５株）、ｂ：ラムダ・ラダー、ｃ：非形質転換宿主酵母、１−９：ＥＶＡＣ含有クローン。ＥＶＡＣは、１４００−１６００ｋｂの範囲のサイズである。レーン２は、それぞれ１５００ｋｂまでおよび５５０ｋｂまでのサイズの２つのＥＶＡＣを含有するクローンを示す。５５０ｋｂのＥＶＡＣは５６４ｋｂの酵母染色体と共に移動しており、その結果、該レーンにおける他のバンドと比較して５６４ｋｂでのバンドの強度が増加している。矢印点はＥＶＡＣのバンドを指す。 図１９は、ＥＶＡＣ含有細胞集団の形成の例を示す。ＥＶＡＣ（進化可能人工染色体）は、異種性ＤＮＡを含有する発現カセットの鎖状体により構成される人工染色体であり、各遺伝子が外部から調節可能なプロモーターの調節下にある。これにより複数の起源由来の多数の異種性遺伝子が単一の宿主細胞において組み合わされ得る 図２０は、ＥＶＡＣ含有細胞集団のスクリーニングの一般的原理を示す。該細胞集団を増殖させ、所望の機能に関する一連のスクリーニングにかける。陽性を示す小集団が選択される。 図２１は、一組の段階的選択条件を通してどのようにして細胞集団が進化するかを示しており。最適な機能／性質が進化するまでにさらに該工程において最良の結果を示す細胞集団を得る 図２２は、一般的スクリーニング方法を示す。個々の集団が同じ一組のスクリーニングにかけられ、選択された相異なる小集団由来の遺伝物質を、選択ラウンドの間に導入された新規な遺伝学的多様性と一緒に組み合わせる。 図２３は、物理的なＥＶＡＣの練り直しを示す。ＥＶＡＣを宿主から単離し、空の宿主細胞の形質転換または既にＥＶＡＣを含有している宿主細胞の形質転換のいずれかに使用し、各宿主細胞においてＥＶＡＣの新規組み合わせを得る。 図２４は、カロチン合成酵素をコードする遺伝子についてエンリッチされたＥＶＡＣ含有細胞集団における調節可能遺伝子発現の例を示す。該発現カセットは、Ｍｅｔ ２５またはＣＵＰ Ｉ プロモーターを含む。プロモーター活性化に応じて、オレンジおよび赤のコロニーが得られる。色の強度および有色コロニーの数は、以下の順番で増加する：ＣＵＰ＋Ｍｅｔ＞ＣＵＰ＞Ｍｅｔ。誘導されなかったコロニーは白である。

Claims (33)

1. ２以上の既定の機能性を有する少なくとも１つの化合物を産生する細胞を進化させる方法であって、以下の工程を含む方法：
   ａ）少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を各々有し該異種性配列の少なくとも１つがその細胞において人工染色体上に位置する細胞を含む細胞組成物を提供する、ここで該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含み、それら細胞は産生細胞と称される、
   ｂ）該機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについて該細胞集団の１度のスクリーニングを行い、各パラメーターについて選択基準を決定する、
   ここで、該パラメーターは、望ましい薬理学的性質に関するパラメーター、望ましくない薬理学的性質に関するパラメーター、薬理学的標的に対する活性に関するパラメーター、およびＡＤＭＥ特性に関するパラメーターからなる群から選択される、または、リガンドである薬理学的標的との相互作用または非相互作用、酵素である薬理学的標的との相互作用または非相互作用、受容体である薬理学的標的との相互作用または非相互作用、標的遺伝子のプロモーター配列との相互作用、または転写因子との相互作用もしくは相互作用不能、およびレポーター細胞の成長の阻害または刺激から成る群から選択される、
   ｃ）少なくとも１つの既定の選択基準を満たす細胞を選択する、
   ｄ）選択された細胞の発現可能ヌクレオチド配列を、互いに、および／または、別の細胞組成物由来の発現可能ヌクレオチド配列と組み合わせ、それにより少なくとも１つの新規細胞組成物を得る、ここで該新規細胞組成物は、少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を有し該異種性配列の少なくとも１つがその細胞において人工染色体上に位置する細胞を含み、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含有する、
   ｅ）少なくとも１つの細胞が少なくとも２つの既定の機能性を有する化合物を獲得するまで、工程ｂ）からｄ）を繰り返す、
   ここで、異種性発現可能ヌクレオチド配列は該化合物の産生に関与する酵素をコードする。
2. 工程ｃ）が２以上のパラメーターの既定の選択基準を満たす細胞を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
3. レポーター細胞が、細菌、真菌、藻類、インビトロ培養哺乳類細胞、および病原性微生物よりなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. レポーター細胞が、細菌、真菌、または藻類の生存生物そのものである、請求項１または２に記載の方法。
5. １つの機能性が、化合物がヒト細胞を含む哺乳類細胞によって取り込まれる能力、毒性、変異原性、および催奇形性からなる群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. 選択基準の強さが少なくとも何回か繰り返す間に増強される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
7. 選択基準のタイプが少なくとも何回か繰り返す間に変更される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
8. 少なくとも１つの選択基準が、生存、優れた成長、異常な形態、粘性、スペクトル特性、または酵素活性の調節に基づく選択である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
9. 少なくとも１つの選択基準が、少なくとも１つの物理的基準から選択され、生存、優れた成長、異常な形態、粘性、スペクトル特性、酵素活性の調節、受容体の活性化、または受容体への活性化分子の結合の阻害に基づき細胞が選択されることになる、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
10. 蛍光分析機を使用することを含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
11. 少なくとも１つの選択基準を満たす陽性細胞の選択が、所望の応答を示した場合に細胞の生存に不可欠な化合物を産生するレポーター遺伝子の発現が成長に必要である培地において、成長優位性を有することによって行われる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
12. 産生細胞がレポーターシステムを含むスクリーニングユニットに閉じ込められている、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
13. 産生細胞が、アガロース、多糖体、炭水化物、アルギン酸塩、カラゲナン、キトサン、セルロース、ペクチン、デキストランまたはポリアクリルアミドを含むゲル液滴に閉じ込められている、請求項１２に記載の方法。
14. 少なくとも１つの産生細胞が、少なくとも１０の相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の方法。
15. 実質的に全ての異種性発現可能ヌクレオチド配列が１以上の人工染色体上に位置する、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
16. 細胞組成物が少なくとも１つの細胞を含み、その少なくとも１つの細胞が以下のものを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の方法：
    以下の式で示される少なくとも２つの発現カセット：
    ［ｒｓ_２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ_１］
    （ここで、
    ｒｓ_１およびｒｓ_２は一緒になってｒｓ _１ −ｒｓ _２ 配列と呼ばれる制限酵素部位を意味し、
    ＳＰはそれぞれスペーサーを意味し、
    ＰＲはその少なくとも１つの細胞において機能する能力のあるプロモーターを意味し、
    Ｘは発現可能ヌクレオチド配列を意味し、
    ＴＲはターミネーターを意味する）。
17. 少なくとも２つの発現可能ヌクレオチド配列が、それぞれ遺伝子および完全長ｃＤＮＡ配列よりなる群から選択される、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
18. 組成物の少なくとも１つの細胞が、独立したオリゴヌクレオチド・カセットの鎖状体を少なくとも１つ含み、各鎖状体が以下の５’→３’方向の式で示されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から１７のいずれかに記載の方法：
    ［ｒｓ_２−ＳＰ−ＰＲ−Ｘ−ＴＲ−ＳＰ−ｒｓ_１］_ｎ
    （ここで、
    ｒｓ_１およびｒｓ_２は一緒になってｒｓ _１ −ｒｓ _２ 配列と呼ばれる制限酵素部位を意味し、
    ＳＰはそれぞれ少なくとも２つのヌクレオチド塩基のスペーサーを意味し、
    ＰＲはその少なくとも１つの細胞において機能する能力のあるプロモーターを意味し、
    Ｘは発現可能ヌクレオチド配列を意味し、
    ＴＲはターミネーターを意味し、
    ｎ≧２であり、および
    少なくとも２つの発現可能ヌクレオチド配列は相異なる発現状態に由来する）。
19. 少なくとも２つの相異なる発現状態が、少なくとも２つの相異なる組織、器官、種、または属を表す、請求項１８に記載の方法。
20. いずれかの産生細胞が少なくとも１０の種に由来する発現可能ヌクレオチド配列を含む、請求項１８に記載の方法。
21. 実質的に全てのｒｓ_１−ｒｓ_２配列が同じ制限酵素によって認識される、または実質的に全てのｒｓ_１−ｒｓ_２配列が実質的に同一である、請求項１６または１８に記載の方法。
22. 該別の細胞組成物が、細胞に少なくとも１つの機能性を与える可能性が高い発現可能ヌクレオチド配列を含有する細胞を含む細胞組成物、事前に第三の機能性についてスクリーニングされている細胞組成物、所望の機能性のうち少なくとも１つを有する化合物を産生することが知られている発現状態に由来する異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む細胞組成物、該選択された細胞組成物における異種性発現可能ヌクレオチド配列と同様の酵素活性をコードする異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む細胞組成物、少なくとも１つの既定のタンパク質／酵素を発現する、または少なくとも１つの既定の化合物または物質を合成する能力がある細胞を含む細胞組成物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
23. 該別の細胞組成物が該選択された細胞組成物と同一であり、および選択された発現可能ヌクレオチド配列の新規組み合わせを得るため発現可能ヌクレオチド配列が混合される、請求項１に記載の方法。
24. 発現可能配列の組み合わせが該細胞における人工染色体の組み合わせである、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
25. 染色体の組み合わせが細胞間の有性交配によって得られる、請求項２４記載の方法。
26. 実質的に全ての異種性発現可能ヌクレオチド配列が１以上の人工染色体上に位置する、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
27. 異種性発現可能配列の組み合わせが、少なくとも２つの相異なる細胞から異種性発現可能配列を単離し、個々の異種性発現可能配列を組み合わせて新規組み合わせとし、そしてその組み合わせた異種性発現可能配列を細胞に導入して、相異なる組み合わせを有する少なくとも２つの細胞を含む細胞を得ることにより実施される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
28. 異種性発現可能ヌクレオチド配列の組み合わせが、発現カセットをＰＣＲにより増幅し、増幅した発現コンストラクトを混合し、個々の発現可能ヌクレオチド配列を組み合わせて新規組み合わせとし、そして組み合わせた異種性発現可能ヌクレオチド配列を細胞へ導入して、相異なる組み合わせを有する少なくとも２つの細胞を含む細胞を得ることにより実施される、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
29. 請求項１〜２８のいずれかの方法に使用される、（ｉ）２以上の異種性発現可能ヌクレオチド配列および（ｉｉ）少なくとも２つのレポーターシステムを含む産生細胞を含むスクリーニングシステムであって、各レポーターシステムが該細胞によって産生される１つの化合物の１つの機能性に関する１つのパラメーターに対するものであるスクリーニングシステム。
30. 少なくとも２つのレポーターシステムと一緒にゲル液滴に封入された産生細胞を含む、請求項２９に記載のスクリーニングシステム。
31. 少なくとも２つのレポーターシステムを含む液体環境中に産生細胞を含む、請求項２９に記載のスクリーニングシステム。
32. 少なくとも２つの既定の機能性に関する少なくとも２つのパラメーターについての産生細胞組成物のスクリーニングを含むリード化合物のスクリーニング方法であって、該細胞組成物が、少なくとも２つの異種性発現可能ヌクレオチド配列を各々有し少なくとも１つの該異種性配列がその細胞において人工染色体上に位置する細胞を含み、該組成物の少なくとも２つの細胞が相異なる異種性発現可能ヌクレオチド配列を含む方法、
    ここで、該パラメーターは、望ましい薬理学的性質に関するパラメーター、望ましくない薬理学的性質に関するパラメーター、薬理学的標的に対する活性に関するパラメーター、およびＡＤＭＥ特性に関するパラメーターからなる群から選択される、または、リガンドである薬理学的標的との相互作用または非相互作用、酵素である薬理学的標的との相互作用または非相互作用、受容体である薬理学的標的との相互作用または非相互作用、標的遺伝子のプロモーター配列との相互作用、または転写因子との相互作用もしくは相互作用不能、およびレポーター細胞の成長の阻害または刺激から成る群から選択される、
    異種性発現可能ヌクレオチド配列は該リード化合物の産生に関与する酵素をコードする。
33. スクリーニングが請求項１から２１のいずれかによって規定される、請求項３２に記載の方法。

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