JP4918582B2 - グルクロン酸転移酵素の製造方法 - Google Patents
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[1]
ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子を導入した酵母形質転換体を用いるグルクロン酸転移酵素の製造方法であって、
前記グルクロン酸転移酵素遺伝子は、シグナル配列遺伝子をヒト由来のUGT1A7のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1、UGT1A4、UGT1A8またはUGT1A9の遺伝子、またはシグナル配列遺伝子をヒト由来のUGT1A6のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1またはUGT1A8の遺伝子である、グルクロン酸転移酵素の製造方法。
[2]
ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子を導入した酵母形質転換体を用いるグルクロン酸転移酵素の製造方法であって、
前記グルクロン酸転移酵素遺伝子は、シグナル配列遺伝子を以下に示すアミノ酸配列(a)をコードするヒト由来のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1、UGT1A4、UGT1A8またはUGT1A9の遺伝子、またはシグナル配列遺伝子を以下に示すアミノ酸配列(b)をコードするヒト由来のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1またはUGT1A8の遺伝子ある、方法。
(a) MARAGWTGLLPLYVCLLLTCGFAKAG(配列番号1)
(b) MACLLRSFQRISAGVFFLALWGMVVG(配列番号2)
前記グルクロン酸転移酵素遺伝子は、発現量がUGT1A7の50%以下である低発現量グルクロン酸転移酵素遺伝子であり、
前記低発現量グルクロン酸転移酵素遺伝子は、シグナル配列遺伝子を、発現量がUGT1A7の80%以上である高発現グルクロン酸転移酵素のシグナル配列遺伝子と置換したものであり、
酵母形質転換体によるグルクロン酸転移酵素の発現量がシグナル配列遺伝子未置換の形質転換体に比べて強化されている。
前記グルクロン酸転移酵素遺伝子は、発現量がUGT1A7の50%以下である低発現量グルクロン酸転移酵素遺伝子であり、
前記低発現量グルクロン酸転移酵素遺伝子は、シグナル配列遺伝子を(A)以下に示すアミノ酸配列(a)〜(c)のいずれかをコードする遺伝子、(B)アミノ酸配列(a)〜(c)のアミノ酸の1〜5個が置換若しくは欠失したアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子、または(C)1〜5個のアミノ酸がアミノ酸配列(a)〜(c)のアミノ酸に付加されたアミノ酸配列のいずれかをコードする遺伝子と置換したものであり、但し、(B)の置換若しくは欠失したアミノ酸配列および(C)の付加されたアミノ酸配列をコードする遺伝子は、シグナル配列遺伝子とした場合にグルクロン酸転移酵素の発現量が野生型の80%以上である。
(a) MARAGWTGLLPLYVCLLLTCGFAKAG(配列番号1)
(b) MACLLRSFQRISAGVFFLALWGMVVG(配列番号2)
(c) MAPRRVDQPRSFMCVSTADLWLCEAG(配列番号3)
グルクロン酸転移酵素遺伝子は、これまでの研究により多くの分子種がクローニングされ、その塩基配列が明らかにされた(非特許文献2)。本発明の製造方法において製造対象とするグルクロン酸転移酵素は、その遺伝子の発現量がUGT1A7の50%以下である低発現量のグルクロン酸転移酵素である。低発現量グルクロン酸転移酵素としては、例えば、UGT1A1、UGT1A4、UGT1A8およびUGT1A9を挙げることができる。UGT1A1、UGT1A4、およびUGT1A9の発現量は、それぞれUGT1A7の20%、10%、50%および30%である。この点は、第1の態様および第2の態様で共通する。
ヒトグルクロン酸転移酵素におけるシグナル配列領域の塩基配列を表2に示す。シグナル配列置換したヒトグルクロン酸転移酵素は、ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子(UGT1A1,UGT1A4及びUGT1A9)を含むpUC119クローニングベクターを鋳型として、置換配列を有するプライマー(表4 配列番号14〜20)を用いてPCR法によって増幅し構築した。酵母発現ベクターとしては小胞体膜酵素であるシトクロムP450の発現で実績のあるpGYRを用いた(非特許文献5)。図1にはグルクロン酸転移酵素の酵母発現用ベクターpGYRへの挿入を示す。
N末端置換グルクロン酸転移酵素を、ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子(UGT1A1,UGT1A4及びUGT1A9)を含むpUC119クローニングベクターを鋳型としてPCRにより増幅した。DNAポリメラーゼとしてはKOD-plus-(TOYOBO)を用いた。反応液組成は製造業者の指示に従い、以下に示すプライマーと反応条件でPCRを行った。
フォワード配列 : 配列番号14〜19
リバース配列 : 配列番号20
変性 94℃ 2分
5サイクル 94℃ 15秒、37℃ 30秒、68℃1分45秒
30サイクル 94℃ 15秒、55℃ 30秒、68℃1分45秒
最終伸長 68℃4分
PCR断片を37℃で1時間、HindIII処理し、電気泳動後、グルクロン酸転移酵素遺伝子断片をゲルから切り出した。切り出したゲルからWizard(登録商標)SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いてインサート断片を調製した。
変性 98℃ 5分
30サイクル 94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分
最終伸長 72℃ 4分
PCR後、電気泳動を行い、予想サイズ(約1.6kb)に特異的な増幅が見られるクローンを数個得た。
1-1で作成したN末端置換グルクロン酸転移酵素断片を含むプラスミド約1μgを37℃で4時間、HindIII処理し、電気泳動後、グルクロン酸転移酵素遺伝子断片をゲルから切り出した。切り出したゲルからWizard(登録商標)SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)を用いてインサート断片を調製した。
変性 98℃5分
30サイクル 94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分30秒
最終伸長 72℃4分
PCR後、電気泳動を行い、予想サイズ(約3kb)に特異的な増幅がみられるクローンを数個得た。
2-1. 酵母への発現用プラスミドの形質転換
発現用には、酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22株を用いた。AH22株は、L-ヒスチジンとL-ロイシン以外は全ての必須アミノ酸を生合成することが出来る。pGYRはL-ロイシン合成遺伝子(LEU2)を持つため、培地にL-ヒスチジンを添加するとプラスミドを持った酵母のみが増殖できる。
・材料 YPD培地:1%イーストエクストラクト、2%ポリペプトン、2%グルコース
SDプレート:2%グルコース、0.67%N-base w/o アミノ酸、1.5%寒天、20μg/ml L-ヒスチジン、0.2M LiCl: 10ml(フィルター滅菌)、1M LiCl: 10ml(フィルター滅菌)
70%(w/v) PEG 4000: 10ml(溶解後、10mlにメスアップ)
30℃ で培養したS.cerevisiae AH22株1.0x107細胞を使用し、卓上遠心機で13,000rpm、4分遠心を行い、上清を除いた。ペレットを0.2M LiClで洗浄した(少しボルテックスにかけた)。卓上遠心機で13,000rpm、4分遠心を行い、上清を完全に取り除いた。ペレットを1M LiCl 20μlにピペッティングにより懸濁した。DNA(プラスミド)溶液10μl(0.5μgのプラスミドを含有)を加えた。70%(w/v) PEG 4000を30μl加え、ピペッティングによりよく混合した。40℃で30分間インキュベートした。滅菌水140μlを加えてSDプレートに展開し、30℃にてインキュベートした。SDプレート上で30℃、3日間培養し、3〜5mm程度の大きさのコロニーを数個得た。
2-1で得たグルクロン酸転移酵素発現株のコロニーを5mlの濃縮SD培地(2%グルコース、1.6% N-base w/o アミノ酸、20μg/ml L-ヒスチジン)に植菌した。SD培地に植菌した酵母を、30℃、220rpmで培養液が完全に白濁するまで培養し、さらにSD培地5mlx4本に植え継いだ。培養液が完全に白濁した後、さらに300mlのSD培地を含む500ml三角フラスコに植え継ぎ、培養した。最終的に菌体濃度が1.0〜1.2x108細胞/mlとなるまで培養を続け、以下のミクロソーム画分の調製に移った。
・試薬:ザイモリアーゼバッファー:10mM Tris-HCl、2Mソルビトール、0.1mM DTT、0.1mM EDTA、pH7.5、ソニケーションバッファー:10mM Tris-HCl、0.65Mソルビトール、0.1mM DTT、0.1mM EDTA、pH7.5
酵母菌体を4℃、8,000xg、10分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR9-2を用いて6,000rpm)。菌体(沈殿)を100mlの蒸留水で洗浄した。4℃、8,000xg、10分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR9-2を用いて6,000rpm)。菌体(沈殿)を25mlのザイモリアーゼバッファーで洗浄した。4℃、8,000xg、10分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR20-2を用いて7,800rpm)。菌体(沈殿)を300μg/mlのザイモリアーゼ100-T(生化学工業株式会社)を含む、25mlのザイモリアーゼバッファーに懸濁し、30℃で緩やかに1時間振盪した。4℃、9,000xg、10分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR20-2を用いて8,400rpm)。菌体(沈殿)を25mlのザイモリアーゼバッファーで洗浄した。4℃、9,000xg、10分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR20-2を用いて8,400rpm)。菌体(沈殿)を25mlのザイモリアーゼバッファーで洗浄した。4℃、9,000xg、10分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR20-2を用いて8,400rpm)。菌体(沈殿)を25mlのソニケーションバッファー(1mM PMSF含有)に懸濁した。凍結融解のため、一晩-80℃にて静置した。翌日、菌体液を常温で溶解し、ダウンス型ホモジナイザー(Tight)(WHEATON)で20回程度ホモジナイズした。4℃、12,000xg、20分間遠心処理を行った(HITACHI高速冷却遠心機、ローターRPR20-2を用いて10,000rpm)。上清を超遠心用チューブに移した。4℃、100,000xg、60分間超遠心を行った(日立分離用超遠心機LSCP55H2、ローターPR70Tを用いて35,000rpm)。上清を捨て、沈殿(ミクロソーム画分)をテフロン(登録商標)ホモジナイザーにかきとり、適当量(1〜3ml)の50mM Tris-HCl(pH7.4)に完全に懸濁できるまでホモジナイズした。得られた懸濁液を200μlずつ1.5mlのエッペンドルフチューブに分注した。サンプルは-80℃で保存した。
3.1 ケルセチン抱合活性測定
抱合活性は100mM KPi(pH7.4),10mM MgCl2緩衝液中で、以下のものを含む反応系を用いて測定した。基質:100μMケルセチン、1mg/ml 酵母ミクロソーム画分(野生型あるいは変異体ヒトグルクロン酸転移酵素UGT1A1あるいはUGT1A9を含む)。反応は終濃度2mMになるよう、UDP-グルクロン酸を添加して37℃反応を開始し、37℃で1〜24時間反応させた。反応終了後、2分の1容のアセトニトリルを添加し、激しく攪拌した後に遠心分離により除タンパクを行い、代謝物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。条件は以下のとおりである。カラム:Wako社製 WakoPack Navi C-30-5 (内径3.0mm×長さ300mm)、検出波長:370nm、流速:0.4ml/min、カラム温度:37℃、溶出条件:水/アセトニトリル系(0.5%リン酸を含む)、18%アセトニトリル(10分間)、18-55%アセトニトリル直線濃度勾配(10分間)の後、55%アセトニトリル(5分間)
抱合活性は100mM KPi(pH7.4),10mM MgCl2緩衝液中で、以下のものを含む反応系を用いて測定した。基質:500μMトリフルオペラジン、1mg/ml 酵母ミクロソーム画分(野生型あるいは変異体ヒトグルクロン酸転移酵素UGT1A4を含む)。反応は終濃度2mMになるよう、UDP-グルクロン酸を添加して37℃反応を開始し、37℃で24時間反応させた。反応終了後、2分の1容のアセトニトリルを添加し、激しく攪拌した後に遠心分離により除タンパクを行い、代謝物を高速液体クロマトグラフィーにより分析した。条件は以下のとおりである。カラム:Wako社製 WakoPack Navi C-30-5 (内径2.0mm×長さ100mm)、検出波長:370nm、流速:0.4ml/min、カラム温度:37℃、溶出条件:水/アセトニトリル系(0.5%リン酸を含む)、18%アセトニトリル(10分間)、18-55%アセトニトリル直線濃度勾配(10分間)の後、55%アセトニトリル(5分間)
ケルセチン部位特異的なグルクロン酸抱合体を製造するために、1mg/ml 酵母ミクロソーム画分(変異体ヒトグルクロン酸転移酵素UGT1A1を含む)を用いて100mM KPi(pH7.4),10mM MgCl2緩衝液中で2mM UDP-グルクロン酸存在下で100μMケルセチンの抱合体への変換反応をおこなった。反応は37℃で48時間反応させた。この溶液を実施例3と同じ条件で分析した結果、ケルセチン7位、4’位及び3’位抱合体のピークが検出され、変換率はそれぞれ10%、5%及び65%であった(図6)。
Claims (2)
- ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子を導入した酵母形質転換体を用いるグルクロン酸転移酵素の製造方法であって、
前記グルクロン酸転移酵素遺伝子は、シグナル配列遺伝子をヒト由来のUGT1A7のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1、UGT1A4、UGT1A8またはUGT1A9の遺伝子、またはシグナル配列遺伝子をヒト由来のUGT1A6のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1またはUGT1A8の遺伝子である、
グルクロン酸転移酵素の製造方法。 - ヒトグルクロン酸転移酵素遺伝子を導入した酵母形質転換体を用いるグルクロン酸転移酵素の製造方法であって、
前記グルクロン酸転移酵素遺伝子は、シグナル配列遺伝子を以下に示すアミノ酸配列(a)をコードするヒト由来のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1、UGT1A4、UGT1A8またはUGT1A9の遺伝子、またはシグナル配列遺伝子を以下に示すアミノ酸配列(b)をコードするヒト由来のシグナル配列遺伝子と置換したUGT1A1またはUGT1A8の遺伝子である、方法。
(a) MARAGWTGLLPLYVCLLLTCGFAKAG(配列番号1)
(b) MACLLRSFQRISAGVFFLALWGMVVG(配列番号2)
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