JP2001145488A - シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子 - Google Patents
シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。 【効果】 本発明により、糖鎖において非常に重要な機
能をもつフコースの付加を行うために必須であるGDP-L-
フコースを、多量に効率よく生産することができる。
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。 【効果】 本発明により、糖鎖において非常に重要な機
能をもつフコースの付加を行うために必須であるGDP-L-
フコースを、多量に効率よく生産することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、GDP-L-フコース合
成に関与する酵素の遺伝子に関し、より詳細には、シロ
イヌナズナ由来のGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース
-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ遺伝子、及び該遺伝
子を利用するGDP-L-フコースの製造方法に関する。
成に関与する酵素の遺伝子に関し、より詳細には、シロ
イヌナズナ由来のGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース
-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ遺伝子、及び該遺伝
子を利用するGDP-L-フコースの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】糖タンパク質などの糖鎖は、生体におい
て非常に重要な働きをしていることが明らかとなってお
り、このことから、糖鎖の構造を自在に変換するための
糖鎖工学が重要な技術分野となってきている。現在糖鎖
を改変する技術としては、化学合成により目的の糖鎖を
合成したものをタンパク質に結合させる化学的手法、細
胞内の糖鎖合成遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変
する、あるいは糖タンパク質を生産する宿主を変えて生
産する生物学的手法、糖鎖合成酵素を用いる糖鎖合成法
などがある。
て非常に重要な働きをしていることが明らかとなってお
り、このことから、糖鎖の構造を自在に変換するための
糖鎖工学が重要な技術分野となってきている。現在糖鎖
を改変する技術としては、化学合成により目的の糖鎖を
合成したものをタンパク質に結合させる化学的手法、細
胞内の糖鎖合成遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変
する、あるいは糖タンパク質を生産する宿主を変えて生
産する生物学的手法、糖鎖合成酵素を用いる糖鎖合成法
などがある。
【０００３】化学的手法では、大量合成の手法に道が開
けてきてはいるが、糖鎖の複雑性から、いまだに全ての
種類の糖鎖を簡単に供給するには至っていない。一方、
生物学的手法では、遺伝子工学の発展により、糖鎖合成
関連遺伝子の発現を制御することが可能となったため、
糖鎖の改変は可能となってきているが、全ての糖鎖につ
いて均一に合成することは困難であり、常に種類の異な
った糖鎖が混在しているのが現状である。
けてきてはいるが、糖鎖の複雑性から、いまだに全ての
種類の糖鎖を簡単に供給するには至っていない。一方、
生物学的手法では、遺伝子工学の発展により、糖鎖合成
関連遺伝子の発現を制御することが可能となったため、
糖鎖の改変は可能となってきているが、全ての糖鎖につ
いて均一に合成することは困難であり、常に種類の異な
った糖鎖が混在しているのが現状である。
【０００４】これに対して、糖鎖合成酵素を用いた生体
外での糖鎖合成は、均一な構造の糖鎖合成には非常に有
用であり、特に生物学的手法と組み合せると、均一で、
大量の糖鎖の生産が可能となる。しかしながら、この生
体外での糖鎖合成では、糖ヌクレオチドが糖転移酵素の
糖供与体として必須であるところ、この糖ヌクレオチド
は非常に高価であるので、この方法を大量生産に用いる
ことは困難となっている。糖ヌクレオチドは、生体内に
微量でしか存在せず、かつ、高エネルギー結合で結ばれ
た非常に反応性に富む不安定な物質であるので、各生物
におけるその産生量があまり多くなく、大量に生産する
ことが困難であるのが原因である。
外での糖鎖合成は、均一な構造の糖鎖合成には非常に有
用であり、特に生物学的手法と組み合せると、均一で、
大量の糖鎖の生産が可能となる。しかしながら、この生
体外での糖鎖合成では、糖ヌクレオチドが糖転移酵素の
糖供与体として必須であるところ、この糖ヌクレオチド
は非常に高価であるので、この方法を大量生産に用いる
ことは困難となっている。糖ヌクレオチドは、生体内に
微量でしか存在せず、かつ、高エネルギー結合で結ばれ
た非常に反応性に富む不安定な物質であるので、各生物
におけるその産生量があまり多くなく、大量に生産する
ことが困難であるのが原因である。
【０００５】近年、バクテリアを用いた生産系により、
比較的多種類の糖ヌクレオチドの大量生産系が実用的な
ものへ近づいてきており、その供給は安定する方向へ向
かっている。しかしながら、このバクテリアを用いる系
では、２種の微生物を混合して、なおかつ、細胞中に含
まれる一方の原料を他方の細胞中に送り込むために細胞
を破壊した状況で生産を行うことから、ある程度反応過
程の長いものでは生産量はそれほど多くなく、新たな手
法の開発が求められている。
比較的多種類の糖ヌクレオチドの大量生産系が実用的な
ものへ近づいてきており、その供給は安定する方向へ向
かっている。しかしながら、このバクテリアを用いる系
では、２種の微生物を混合して、なおかつ、細胞中に含
まれる一方の原料を他方の細胞中に送り込むために細胞
を破壊した状況で生産を行うことから、ある程度反応過
程の長いものでは生産量はそれほど多くなく、新たな手
法の開発が求められている。
【０００６】糖ヌクレオチドのうち、GDP-L-フコースは
フコース転移酵素の糖供与体としてフコースを含んだ糖
鎖合成を行う際には必須のものである。このフコース残
基の付加した糖鎖は機能的に重要な役割を果たすことが
多く、糖供与体の大量で安価な供給が望まれている。こ
のGDP-L-フコースはGDP-D-マンノースから３段階の反応
を経て合成され、これらの３つの反応が２種類の酵素に
よって触媒されることが報告されている（図１）（Tone
ttiら、J. Biol. Chem., Vol.271, 27274 (1996)）。こ
れらの酵素は、原核生物である大腸菌などから真核生物
であるヒトなどの高等哺乳類にいたるまで、フコースを
使用するあらゆる生物がもっている普遍的な酵素であ
る。しかし、このような生物は合成したGDP-L-フコース
を使用していくため、細胞内にGDP-L-フコースが蓄積す
ることはない。このため、生物体からGDP-L-フコースを
単離する場合、その量は極めて低くかつ高価である。ま
た、その合成に長い行程を必要とするため、上記のバク
テリアの系を用いる手法においても十分な量を供給する
ことは、現状では困難である。
フコース転移酵素の糖供与体としてフコースを含んだ糖
鎖合成を行う際には必須のものである。このフコース残
基の付加した糖鎖は機能的に重要な役割を果たすことが
多く、糖供与体の大量で安価な供給が望まれている。こ
のGDP-L-フコースはGDP-D-マンノースから３段階の反応
を経て合成され、これらの３つの反応が２種類の酵素に
よって触媒されることが報告されている（図１）（Tone
ttiら、J. Biol. Chem., Vol.271, 27274 (1996)）。こ
れらの酵素は、原核生物である大腸菌などから真核生物
であるヒトなどの高等哺乳類にいたるまで、フコースを
使用するあらゆる生物がもっている普遍的な酵素であ
る。しかし、このような生物は合成したGDP-L-フコース
を使用していくため、細胞内にGDP-L-フコースが蓄積す
ることはない。このため、生物体からGDP-L-フコースを
単離する場合、その量は極めて低くかつ高価である。ま
た、その合成に長い行程を必要とするため、上記のバク
テリアの系を用いる手法においても十分な量を供給する
ことは、現状では困難である。
【０００７】この３段階の反応を触媒する酵素は、最初
の１段階目の反応であるGDP-D-マンノースから脱水反応
を起こしてGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースに変換
する反応を触媒するGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラタ
ーゼと、その次の異性化及び還元といった２つの反応を
行うGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメ
ラーゼ-4-レダクターゼの２種類である。植物であるシ
ロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では、最初の反
応を触媒するGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼの
遺伝子としてMUR1が既に単離されている（Boninら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.94, 2085 (1997)）。
の１段階目の反応であるGDP-D-マンノースから脱水反応
を起こしてGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノースに変換
する反応を触媒するGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラタ
ーゼと、その次の異性化及び還元といった２つの反応を
行うGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメ
ラーゼ-4-レダクターゼの２種類である。植物であるシ
ロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では、最初の反
応を触媒するGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼの
遺伝子としてMUR1が既に単離されている（Boninら、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.94, 2085 (1997)）。
【０００８】しかしながら、その次の反応を触媒するGD
P-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-
4-レダクターゼ遺伝子の単離についてはまだ報告されて
おらず、遺伝子データベースに他の生物種のGDP-4-ケト
-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダク
ターゼと相同性の高い配列が登録されているのみであ
る。
P-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-
4-レダクターゼ遺伝子の単離についてはまだ報告されて
おらず、遺伝子データベースに他の生物種のGDP-4-ケト
-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダク
ターゼと相同性の高い配列が登録されているのみであ
る。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、GDP-
L-フコースを効率良く合成するためのGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ遺伝子を提供することにある。
L-フコースを効率良く合成するためのGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ遺伝子を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、GDP-D-マンノース
からのGDP-L-フコース合成において後半２段階の反応を
触媒する、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由
来のGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメ
ラーゼ-4-レダクターゼをコードする遺伝子(AtFX遺伝
子)を単離し、この遺伝子の塩基配列を明らかにすると
ともに、該遺伝子を、シロイヌナズナのGDP-L-フコース
合成において最初の反応を触媒するMUR1遺伝子とともに
共発現させることによって、生体内及び生体外で効率よ
くGDP-L-フコースが合成されることを見いだし、本発明
を完成させるに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、GDP-D-マンノース
からのGDP-L-フコース合成において後半２段階の反応を
触媒する、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由
来のGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメ
ラーゼ-4-レダクターゼをコードする遺伝子(AtFX遺伝
子)を単離し、この遺伝子の塩基配列を明らかにすると
ともに、該遺伝子を、シロイヌナズナのGDP-L-フコース
合成において最初の反応を触媒するMUR1遺伝子とともに
共発現させることによって、生体内及び生体外で効率よ
くGDP-L-フコースが合成されることを見いだし、本発明
を完成させるに至った。
【００１１】すなわち、本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）のタンパク質を提供する。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質を提供する。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】さらに、本発明は、以下の（ａ）又は
（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。 前記ＤＮＡは、好ましくは配列番号２で表される塩基配
列を含む。
（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。 前記ＤＮＡは、好ましくは配列番号２で表される塩基配
列を含む。
【００１３】さらに、本発明は、上記ＤＮＡを含む発現
ベクターを提供する。さらに、本発明は、上記発現ベク
ターによって形質転換された形質転換体を提供する。こ
のような形質転換体としては、例えば、酵母W303/pYO-A
tFX-Myc株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５１）が挙げられ
る。さらに、本発明は、該形質転換体を培地に培養し、
得られる培養物からGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノー
ス-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼを採取することを
特徴とするGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-
エピメラーゼ-4-レダクターゼの製造方法を提供する。
ベクターを提供する。さらに、本発明は、上記発現ベク
ターによって形質転換された形質転換体を提供する。こ
のような形質転換体としては、例えば、酵母W303/pYO-A
tFX-Myc株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５１）が挙げられ
る。さらに、本発明は、該形質転換体を培地に培養し、
得られる培養物からGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノー
ス-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼを採取することを
特徴とするGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-
エピメラーゼ-4-レダクターゼの製造方法を提供する。
【００１４】さらに、本発明は、上記発現ベクター及び
GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼをコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクターによって形質転換された形質転
換体を提供する。このような形質転換体としては、例え
ば、酵母W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６５０）が挙げられる。さらに、本発明は、
該形質転換体を用いてGDP-D-マンノースをGDP-L-フコー
スに変換する方法、並びに、該形質転換体を、GDP-D-マ
ンノースと共に培地に培養し、得られる培養物からGDP-
L-フコースを採取することを特徴とするGDP-L-フコース
の製造方法を提供する。
GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼをコードするＤ
ＮＡを含む発現ベクターによって形質転換された形質転
換体を提供する。このような形質転換体としては、例え
ば、酵母W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６５０）が挙げられる。さらに、本発明は、
該形質転換体を用いてGDP-D-マンノースをGDP-L-フコー
スに変換する方法、並びに、該形質転換体を、GDP-D-マ
ンノースと共に培地に培養し、得られる培養物からGDP-
L-フコースを採取することを特徴とするGDP-L-フコース
の製造方法を提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列の略号に
よる表示は、IUPAC-IUBの規定及び当該分野における通
称又は慣行に従うものとする。 １．GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメ
ラーゼ-4-レダクターゼ遺伝子の単離 本発明のGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エ
ピメラーゼ-4-レダクターゼ遺伝子は、一般的手法に従
ってシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から調製
したｃＤＮＡライブラリを鋳型とし、ＰＣＲ法により単
離することができる。
本明細書において、アミノ酸配列及び塩基配列の略号に
よる表示は、IUPAC-IUBの規定及び当該分野における通
称又は慣行に従うものとする。 １．GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメ
ラーゼ-4-レダクターゼ遺伝子の単離 本発明のGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エ
ピメラーゼ-4-レダクターゼ遺伝子は、一般的手法に従
ってシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）から調製
したｃＤＮＡライブラリを鋳型とし、ＰＣＲ法により単
離することができる。
【００１６】シロイヌナズナのｃＤＮＡライブラリは、
通常用いられているプラスミドベクター、λファージ由
来のベクター等を用い、当業者に公知の方法に従って作
製することができる。また、市販のシロイヌナズナ由来
ｃＤＮＡライブラリを用いてもよい。
通常用いられているプラスミドベクター、λファージ由
来のベクター等を用い、当業者に公知の方法に従って作
製することができる。また、市販のシロイヌナズナ由来
ｃＤＮＡライブラリを用いてもよい。
【００１７】ＰＣＲ法は、生体外において、ＤＮＡの特
定の領域を、そのセンスプライマー及びアンチセンスプ
ライマー、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ増幅シ
ステム等の組み合わせを用いて、約２〜３時間で10〜10
0万倍に特異的に増幅することができる技術である。本
発明のＤＮＡは、適切なプライマーを用いることによ
り、ＰＣＲ法での増幅が可能である。
定の領域を、そのセンスプライマー及びアンチセンスプ
ライマー、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ増幅シ
ステム等の組み合わせを用いて、約２〜３時間で10〜10
0万倍に特異的に増幅することができる技術である。本
発明のＤＮＡは、適切なプライマーを用いることによ
り、ＰＣＲ法での増幅が可能である。
【００１８】上記ＰＣＲにおいて用いることのできるプ
ライマーは、他種の酵素遺伝子との塩基配列の相同性等
に基づいて設計することができる。他種の酵素遺伝子の
塩基配列としては、GenBank等の公知のＤＮＡ配列デー
タベースに登録されているものを用いることができ、こ
れらは、当業者であれば容易に検索することができる。
このような塩基配列としては、例えば、GenBankアクセ
ッション番号U38473、U58766、及びAF045286に登録され
ているものが挙げられる。さらに、プライマーを設計す
る際には、ＰＣＲ増幅後に行う遺伝子操作を考慮して、
プライマーの塩基配列中に制限酵素部位等の配列を含ま
せることができる。
ライマーは、他種の酵素遺伝子との塩基配列の相同性等
に基づいて設計することができる。他種の酵素遺伝子の
塩基配列としては、GenBank等の公知のＤＮＡ配列デー
タベースに登録されているものを用いることができ、こ
れらは、当業者であれば容易に検索することができる。
このような塩基配列としては、例えば、GenBankアクセ
ッション番号U38473、U58766、及びAF045286に登録され
ているものが挙げられる。さらに、プライマーを設計す
る際には、ＰＣＲ増幅後に行う遺伝子操作を考慮して、
プライマーの塩基配列中に制限酵素部位等の配列を含ま
せることができる。
【００１９】このようにして設計されるプライマーとし
ては、以下の塩基配列を有するものが挙げられる。 フォワードプライマー： 5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3'（配
列番号３） リバースプライマー： 5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCAT
AAG-3'（配列番号４）
ては、以下の塩基配列を有するものが挙げられる。 フォワードプライマー： 5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3'（配
列番号３） リバースプライマー： 5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCAT
AAG-3'（配列番号４）
【００２０】ここで、フォワードプライマーの塩基配列
中の下線部分はKpnI部位を示し、リバースプライマーの
塩基配列中の下線部分はEcoRV部位を示す。これらのプ
ライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本発明のＤ
ＮＡが良好に増幅することができる。
中の下線部分はKpnI部位を示し、リバースプライマーの
塩基配列中の下線部分はEcoRV部位を示す。これらのプ
ライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、本発明のＤ
ＮＡが良好に増幅することができる。
【００２１】ＰＣＲを行うためのＰＣＲ溶液には、鋳型
として用いるｃＤＮＡライブラリ及びプライマーの他、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物等を添加す
る必要があり、このようなＰＣＲ溶液は当業者であれば
適切に調製することができるが、例えば、以下の表１に
示すような組成とすることができる。
として用いるｃＤＮＡライブラリ及びプライマーの他、
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合物等を添加す
る必要があり、このようなＰＣＲ溶液は当業者であれば
適切に調製することができるが、例えば、以下の表１に
示すような組成とすることができる。
【００２２】
【表１】
【００２３】ＰＣＲの条件は、使用するプライマーの塩
基配列等に従って、当業者は適切に設定することができ
るが、例えば、94℃で15秒（変性）、50℃で30秒（アニ
ーリング）及び68℃で２分（伸長）の反応を30サイクル
とするとよい。このような反応は、市販のサーマルサイ
クラー等を用いて容易に行うことができる。
基配列等に従って、当業者は適切に設定することができ
るが、例えば、94℃で15秒（変性）、50℃で30秒（アニ
ーリング）及び68℃で２分（伸長）の反応を30サイクル
とするとよい。このような反応は、市販のサーマルサイ
クラー等を用いて容易に行うことができる。
【００２４】上記ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡは、
適切なプラスミド中にクローン化することができる。Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドとしては、宿主内で複製保持
されるものであればいずれも使用することができるが、
例えば、大腸菌由来のpBR322やpUC19などを用いること
ができる。
適切なプラスミド中にクローン化することができる。Ｄ
ＮＡを組み込むプラスミドとしては、宿主内で複製保持
されるものであればいずれも使用することができるが、
例えば、大腸菌由来のpBR322やpUC19などを用いること
ができる。
【００２５】また、増幅されたＤＮＡのクローン化は、
市販のキットを用いて行うこともでき、このようなキッ
トとしては、例えば、TAクローニングキット（Invitrog
en）が挙げられる。市販のキットを用いる場合には、プ
ラスミドとしては、該キットに含まれるものを用いるこ
とができる。
市販のキットを用いて行うこともでき、このようなキッ
トとしては、例えば、TAクローニングキット（Invitrog
en）が挙げられる。市販のキットを用いる場合には、プ
ラスミドとしては、該キットに含まれるものを用いるこ
とができる。
【００２６】本発明のＤＮＡを含むプラスミドを大腸菌
等に組み込む方法としては、例えば、T.Maniatisらの方
法[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y, 1st Edition, p.250 (1982)]、F. M. Ausubelらの方
法[Short Protocols in Molecular Biology, 4th Editi
on, 1-27 (1999)]等が挙げられる。
等に組み込む方法としては、例えば、T.Maniatisらの方
法[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborator
y, 1st Edition, p.250 (1982)]、F. M. Ausubelらの方
法[Short Protocols in Molecular Biology, 4th Editi
on, 1-27 (1999)]等が挙げられる。
【００２７】本発明のＤＮＡの塩基配列は、上記のよう
にして得られるプラスミドを用い、ジデオキシ法等の公
知の方法によって決定することができる。このような塩
基配列決定は、市販のキットを用いて行うこともでき、
このようなキットとしては、例えば、シークエンスキッ
ト（PE Biosystems）が挙げられる。さらに、本発明の
ＤＮＡの塩基配列が決定されると、該塩基配列から、本
発明のタンパク質のアミノ酸配列が推定される。
にして得られるプラスミドを用い、ジデオキシ法等の公
知の方法によって決定することができる。このような塩
基配列決定は、市販のキットを用いて行うこともでき、
このようなキットとしては、例えば、シークエンスキッ
ト（PE Biosystems）が挙げられる。さらに、本発明の
ＤＮＡの塩基配列が決定されると、該塩基配列から、本
発明のタンパク質のアミノ酸配列が推定される。
【００２８】本発明のタンパク質は、配列番号１に表さ
れるアミノ酸配列を含んでおり、該タンパク質はGDP-4-
ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レ
ダクターゼ活性を有する。さらに、本発明のタンパク質
のアミノ酸配列は配列番号１に表されるものに限定され
るものではなく、該タンパク質がGDP-4-ケト-6-デオキ
シ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ活
性を有する限りにおいて、配列番号１において１個又は
複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、又は挿入され
たアミノ酸配列であってもよい。
れるアミノ酸配列を含んでおり、該タンパク質はGDP-4-
ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レ
ダクターゼ活性を有する。さらに、本発明のタンパク質
のアミノ酸配列は配列番号１に表されるものに限定され
るものではなく、該タンパク質がGDP-4-ケト-6-デオキ
シ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼ活
性を有する限りにおいて、配列番号１において１個又は
複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、又は挿入され
たアミノ酸配列であってもよい。
【００２９】本発明のＤＮＡは、上記のような本発明の
タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
む。このような塩基配列としては、１つのアミノ酸に対
して複数のコード配列が存在し得ることを考慮すると、
多くの塩基配列が考えられるが、例えば、配列番号２に
表される塩基配列が挙げられる。配列番号２に表される
塩基配列以外の塩基配列を含む本発明のＤＮＡは、部位
特異的変異誘発法（Zollerら, Nucleic Acids Res., Vo
l. 10, No. 20, 6487-6500 (1982)）、化学的合成法等
により、当業者であれば容易に調製することができる。
タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含
む。このような塩基配列としては、１つのアミノ酸に対
して複数のコード配列が存在し得ることを考慮すると、
多くの塩基配列が考えられるが、例えば、配列番号２に
表される塩基配列が挙げられる。配列番号２に表される
塩基配列以外の塩基配列を含む本発明のＤＮＡは、部位
特異的変異誘発法（Zollerら, Nucleic Acids Res., Vo
l. 10, No. 20, 6487-6500 (1982)）、化学的合成法等
により、当業者であれば容易に調製することができる。
【００３０】２．本発明のＤＮＡを発現する発現ベクタ
ーの構築 クローン化された本発明のＤＮＡは、発現に適したベク
ター中のプロモーターの下流に連結して発現ベクターを
構築することができる。ベクターとしては、酵母由来の
プラスミドYEp352GAP、YEp51、pSH19、pYO325等が挙げ
られる。
ーの構築 クローン化された本発明のＤＮＡは、発現に適したベク
ター中のプロモーターの下流に連結して発現ベクターを
構築することができる。ベクターとしては、酵母由来の
プラスミドYEp352GAP、YEp51、pSH19、pYO325等が挙げ
られる。
【００３１】発現用ベクターに組み込むＤＮＡとして
は、本発明のＤＮＡであって、その5'末端に翻訳開始コ
ドンであるATGを有し、3'末端に翻訳終止コドンであるT
AA、TGA又はTAGを有するものを用いる。また、5'末端又
は3'末端に、例えばヘマグルチニンタンパク質の一部分
である標識抗原遺伝子やGSTタンパク質等の標識タンパ
ク質遺伝子を結合させて発現させてもよい。
は、本発明のＤＮＡであって、その5'末端に翻訳開始コ
ドンであるATGを有し、3'末端に翻訳終止コドンであるT
AA、TGA又はTAGを有するものを用いる。また、5'末端又
は3'末端に、例えばヘマグルチニンタンパク質の一部分
である標識抗原遺伝子やGSTタンパク質等の標識タンパ
ク質遺伝子を結合させて発現させてもよい。
【００３２】さらに該遺伝子を発現させるためには、そ
の上流にプロモータを接続することが好ましいが、本発
明で用いられるプロモータとしては、遺伝子の発現に用
いる宿主に対応した適切なプロモータであれば、いかな
るものでもよい。例えば、形質転換する宿主が酵母であ
る場合には、プロモータとしては、ENO1プロモータ、GA
L10プロモータ、GAPDHプロモータ、ADHプロモータ等が
挙げられる。
の上流にプロモータを接続することが好ましいが、本発
明で用いられるプロモータとしては、遺伝子の発現に用
いる宿主に対応した適切なプロモータであれば、いかな
るものでもよい。例えば、形質転換する宿主が酵母であ
る場合には、プロモータとしては、ENO1プロモータ、GA
L10プロモータ、GAPDHプロモータ、ADHプロモータ等が
挙げられる。
【００３３】さらに該遺伝子の転写を終了させるため
に、その下流にターミネータを接続してもよい。本発明
で用いられるターミネータとしては、遺伝子の発現に用
いる宿主に対応した適切なターミネータであれば、いか
なるものでもよい。例えば、形質転換する宿主が酵母で
ある場合には、ターミネータとしては、ENO1ターミネー
タ、GAL10ターミネータ、GAPDHターミネータ、ADHター
ミネータ等が挙げられる。これらの本発明のＤＮＡ、プ
ロモータ、ターミネータ等の発現用ベクターへの組込み
操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
に、その下流にターミネータを接続してもよい。本発明
で用いられるターミネータとしては、遺伝子の発現に用
いる宿主に対応した適切なターミネータであれば、いか
なるものでもよい。例えば、形質転換する宿主が酵母で
ある場合には、ターミネータとしては、ENO1ターミネー
タ、GAL10ターミネータ、GAPDHターミネータ、ADHター
ミネータ等が挙げられる。これらの本発明のＤＮＡ、プ
ロモータ、ターミネータ等の発現用ベクターへの組込み
操作は、当業者であれば適切に行うことができる。
【００３４】３．本発明の発現ベクターを保持する形質
転換体の作製 上記「２．本発明のＤＮＡを発現する発現ベクターの構
築」の記載に従って構築される本発明の発現ベクター
を、適切な宿主に導入することによって、本発明のタン
パク質を発現する形質転換体を作製することができる。
転換体の作製 上記「２．本発明のＤＮＡを発現する発現ベクターの構
築」の記載に従って構築される本発明の発現ベクター
を、適切な宿主に導入することによって、本発明のタン
パク質を発現する形質転換体を作製することができる。
【００３５】宿主としては、GDP-L-フコースを生体内で
消費しないものであればいかなるものでも使用すること
ができ、特に制限されないが、好ましくは酵母を使用す
る。酵母としては、例えば、出芽酵母(Saccharomyces c
erevisiae)その他の酵母(Pichia pastorisなど)等が挙
げられる。また、GDP-L-フコースの生産に酵素抽出物を
用いる場合、すなわち、生体外でGDP-L-フコースを生産
する場合、細胞質内で本発明のタンパク質を発現するこ
とが可能な宿主であれば、いかなるものでも用いること
ができる。
消費しないものであればいかなるものでも使用すること
ができ、特に制限されないが、好ましくは酵母を使用す
る。酵母としては、例えば、出芽酵母(Saccharomyces c
erevisiae)その他の酵母(Pichia pastorisなど)等が挙
げられる。また、GDP-L-フコースの生産に酵素抽出物を
用いる場合、すなわち、生体外でGDP-L-フコースを生産
する場合、細胞質内で本発明のタンパク質を発現するこ
とが可能な宿主であれば、いかなるものでも用いること
ができる。
【００３６】上記形質転換体の作製は、それぞれの宿主
について一般的に行われている方法により行うことがで
きる。例えば、宿主が酵母であれば、リチウム法、エレ
クトロポレーション法等により、本発明の発現ベクター
を導入する。このようにして得られる形質転換体として
は、例えばW303/pYO-AtFX-Myc株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７
６５１）を挙げることができる。
について一般的に行われている方法により行うことがで
きる。例えば、宿主が酵母であれば、リチウム法、エレ
クトロポレーション法等により、本発明の発現ベクター
を導入する。このようにして得られる形質転換体として
は、例えばW303/pYO-AtFX-Myc株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７
６５１）を挙げることができる。
【００３７】さらに、形質転換体の培養によりGDP-L-フ
コースの生産を行うためには、宿主は、あらかじめGDP-
D-マンノース-4,6-デヒドラターゼを発現する発現ベク
ターで形質転換されているか、あるいは本来GDP-D-マン
ノース-4,6-デヒドラターゼを発現しているものである
必要がある。GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ遺
伝子としては、好ましくはシロイヌナズナ由来のMUR1遺
伝子を用いる。
コースの生産を行うためには、宿主は、あらかじめGDP-
D-マンノース-4,6-デヒドラターゼを発現する発現ベク
ターで形質転換されているか、あるいは本来GDP-D-マン
ノース-4,6-デヒドラターゼを発現しているものである
必要がある。GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ遺
伝子としては、好ましくはシロイヌナズナ由来のMUR1遺
伝子を用いる。
【００３８】GDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼを
発現する発現ベクターは、本発明のタンパク質を発現す
る発現ベクターについて上述した方法に従って、構築す
ることができる。ただし、GDP-D-マンノース-4,6-デヒ
ドラターゼをコードするＤＮＡをクローニングする際の
ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、GDP-D-マンノー
ス-4,6-デヒドラターゼ遺伝子の公知の塩基配列の比較
等により設計したものを用いる必要があるが、例えば、
以下の塩基配列を有するプライマーを用いることができ
る。
発現する発現ベクターは、本発明のタンパク質を発現す
る発現ベクターについて上述した方法に従って、構築す
ることができる。ただし、GDP-D-マンノース-4,6-デヒ
ドラターゼをコードするＤＮＡをクローニングする際の
ＰＣＲにおいて使用するプライマーは、GDP-D-マンノー
ス-4,6-デヒドラターゼ遺伝子の公知の塩基配列の比較
等により設計したものを用いる必要があるが、例えば、
以下の塩基配列を有するプライマーを用いることができ
る。
【００３９】フォワードプライマー： 5'-GTCGAATTCATGGCGTCAGAGAACAAC-3'（配列番号５） リバースプライマー： 5'-GAACTCGAGAGGTTGCTGCTTAGCATC-3'（配列番号６）
【００４０】上記のような、GDP-D-マンノース-4,6-デ
ヒドラターゼを発現する発現ベクターが導入された形質
転換体としては、例えばW303/YEp-MUR1-HA株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６４９）が挙げられる。さらに、このような
形質転換体に本発明の発現ベクターを導入した形質転換
体としては、例えば、W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５０）が挙げられる。
ヒドラターゼを発現する発現ベクターが導入された形質
転換体としては、例えばW303/YEp-MUR1-HA株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１７６４９）が挙げられる。さらに、このような
形質転換体に本発明の発現ベクターを導入した形質転換
体としては、例えば、W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc
株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５０）が挙げられる。
【００４１】なお、上述のW303/pYO-AtFX-Myc株、W303/
YEp-MUR1-HA株、及びW303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株
は、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７６５１、ＦＥＲＭ Ｐ
−１７６４９、及びＦＥＲＭ Ｐ−１７６５０の受託番
号で、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
YEp-MUR1-HA株、及びW303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株
は、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１７６５１、ＦＥＲＭ Ｐ
−１７６４９、及びＦＥＲＭ Ｐ−１７６５０の受託番
号で、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に寄託されている。
【００４２】４．本発明の形質転換体の培養による本発
明のタンパク質の生産 本発明の形質転換体、すなわち本発明の発現ベクターを
導入したもの（例えば、W303/pYO-AtFX-Myc株）、又はG
DP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼを発現する発現ベ
クターがさらに導入されている形質転換体（例えば、W3
03/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株）を適切な培地に培養
し、得られる培養物から本発明のタンパク質、すなわち
GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラー
ゼ-4-レダクターゼを単離することができる。
明のタンパク質の生産 本発明の形質転換体、すなわち本発明の発現ベクターを
導入したもの（例えば、W303/pYO-AtFX-Myc株）、又はG
DP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼを発現する発現ベ
クターがさらに導入されている形質転換体（例えば、W3
03/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株）を適切な培地に培養
し、得られる培養物から本発明のタンパク質、すなわち
GDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラー
ゼ-4-レダクターゼを単離することができる。
【００４３】本発明の形質転換体を培地に培養する方法
は、宿主の培養に用いられる通常の方法によって行うこ
とができる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得ら
れた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化
し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換
体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。
は、宿主の培養に用いられる通常の方法によって行うこ
とができる。大腸菌や酵母等の微生物を宿主として得ら
れた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化
し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換
体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合
成培地のいずれを用いてもよい。
【００４４】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸類、及び又はエタノール、プロパノー
ル等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは
有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプ
トン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられ
る。
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸類、及び又はエタノール、プロパノー
ル等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは
有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ペプ
トン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられ
る。
【００４５】無機塩類としては、リン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。特に、酵母を
培養するための培地としては、例えば、YPD培地、SD培
地等が挙げられる。
リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、
硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。特に、酵母を
培養するための培地としては、例えば、YPD培地、SD培
地等が挙げられる。
【００４６】微生物を宿主として得られた形質転換体の
培養は、好ましくは、２５〜３７℃で１２時間〜５日間
行い、必要により通気や撹拌を行うことができる。pHは
通常用いられる範囲であればよく、特に制限されない
が、好ましくは5.0〜7.5、より好ましくは約7.5に保持
する。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等
を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テ
トラサイクリン等の抗生物質を培地に加えてもよい。プ
ロモーターとして誘導性プロモーターを有する発現ベク
ターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応
じてインデユーサーを培地に添加してもよい。
培養は、好ましくは、２５〜３７℃で１２時間〜５日間
行い、必要により通気や撹拌を行うことができる。pHは
通常用いられる範囲であればよく、特に制限されない
が、好ましくは5.0〜7.5、より好ましくは約7.5に保持
する。pHの調整は、無機酸又は有機酸、アルカリ溶液等
を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テ
トラサイクリン等の抗生物質を培地に加えてもよい。プ
ロモーターとして誘導性プロモーターを有する発現ベク
ターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応
じてインデユーサーを培地に添加してもよい。
【００４７】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地にウシ胎児血清等を
添加した培地が用いられる。植物細胞を宿主として得ら
れた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ
れているムラシゲ及びスクーグ（ＭＳ）の培地が用いら
れる。
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地にウシ胎児血清等を
添加した培地が用いられる。植物細胞を宿主として得ら
れた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ
れているムラシゲ及びスクーグ（ＭＳ）の培地が用いら
れる。
【００４８】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
の培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、約３７℃で１〜２
日間行う。培養中は、必要に応じてカナマイシン、ペニ
シリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
の培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、約３７℃で１〜２
日間行う。培養中は、必要に応じてカナマイシン、ペニ
シリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４９】培養後、本発明のタンパク質を培養物から
採取する。該酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合
には、菌体又は細胞を破砕等することにより、該酵素を
採取することができる。また、該酵素が菌体外又は細胞
外に生産される場合には、培養液をそのまま使用して、
又は遠心分離等により菌体若しくは細胞を除去した後
に、該酵素を採取することができる。該酵素の採取は、
タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方
法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等
を、単独で又は適宜組合せて用いることにより行うこと
ができる。以上のようにして得られたタンパク質が本発
明のタンパク質であることの確認は、一般的な酵素化学
反応、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気
泳動法、抗原抗体反応等の免疫学的方法などにより行う
ことができる。
採取する。該酵素が菌体内又は細胞内に生産される場合
には、菌体又は細胞を破砕等することにより、該酵素を
採取することができる。また、該酵素が菌体外又は細胞
外に生産される場合には、培養液をそのまま使用して、
又は遠心分離等により菌体若しくは細胞を除去した後
に、該酵素を採取することができる。該酵素の採取は、
タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方
法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等
を、単独で又は適宜組合せて用いることにより行うこと
ができる。以上のようにして得られたタンパク質が本発
明のタンパク質であることの確認は、一般的な酵素化学
反応、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等の電気
泳動法、抗原抗体反応等の免疫学的方法などにより行う
ことができる。
【００５０】５．GDP-L-フコースの生産 GDP-L-フコースの生産は、本発明の形質転換体を培養す
ることにより、又はGDP-L-フコース製造に必要な酵素源
を用いる酵素反応により行うことができる。
ることにより、又はGDP-L-フコース製造に必要な酵素源
を用いる酵素反応により行うことができる。
【００５１】（１）本発明の形質転換体の培養によるGD
P-L-フコースの生産 本発明の発現ベクター及びGDP-D-マンノース-4,6-デヒ
ドラターゼを発現する発現ベクターの双方が導入されて
いる形質転換体（例えば、W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-
Myc株）を、GDP-D-マンノースと共に適切な培地に培養
し、得られる培養物からGDP-L-フコースを単離・精製す
ることができる。形質転換体を培養する際の培地、温
度、培養期間、pHその他の条件は、上記「４．本発明の
形質転換体の培養による本発明のタンパク質の生産」に
記載したとおりである。また、必要に応じてNADPH等の
補助因子を培地に添加してもよい。
P-L-フコースの生産 本発明の発現ベクター及びGDP-D-マンノース-4,6-デヒ
ドラターゼを発現する発現ベクターの双方が導入されて
いる形質転換体（例えば、W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-
Myc株）を、GDP-D-マンノースと共に適切な培地に培養
し、得られる培養物からGDP-L-フコースを単離・精製す
ることができる。形質転換体を培養する際の培地、温
度、培養期間、pHその他の条件は、上記「４．本発明の
形質転換体の培養による本発明のタンパク質の生産」に
記載したとおりである。また、必要に応じてNADPH等の
補助因子を培地に添加してもよい。
【００５２】上記培養物からのGDP-L-フコースの抽出
は、宿主細胞を遠心分離によって培地と分け、宿主細胞
を破砕して、さらに遠心分離することにより行うことが
できる。宿主が酵母である場合、例えばグラスビーズに
よって細胞を破壊し、遠心分離によって、GDP-L-フコー
スを含む上清画分を得ることができる。
は、宿主細胞を遠心分離によって培地と分け、宿主細胞
を破砕して、さらに遠心分離することにより行うことが
できる。宿主が酵母である場合、例えばグラスビーズに
よって細胞を破壊し、遠心分離によって、GDP-L-フコー
スを含む上清画分を得ることができる。
【００５３】上記の上清画分からのGDP-L-フコースの単
離・精製は、当業者であれば容易に行うことができる
が、例えば、ゲルろ過法により低分子量の画分を集め、
さらにHPLCによる分離を行うことにより行うことができ
る。ここで用いるゲルろ過用ゲル、カラムのサイズ及び
溶離液、並びにHPLC用カラム及び溶離液等は、当業者で
あれば適切に選択することができる。
離・精製は、当業者であれば容易に行うことができる
が、例えば、ゲルろ過法により低分子量の画分を集め、
さらにHPLCによる分離を行うことにより行うことができ
る。ここで用いるゲルろ過用ゲル、カラムのサイズ及び
溶離液、並びにHPLC用カラム及び溶離液等は、当業者で
あれば適切に選択することができる。
【００５４】（２）酵素源を用いる酵素反応によるGDP-
L-フコースの生産 GDP-L-フコースの生産は、必要な酵素を含む酵素源を用
いる酵素反応によっても行うことができる。酵素反応の
基質としてGDP-D-マンノースを用いる場合には、必要と
なる酵素はGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ及びG
DP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ
-4-レダクターゼ（本発明のタンパク質）である。これ
らの酵素は、それぞれを発現する形質転換体（例えば、
W303/YEp-MUR1-HA株及びW303/pYO-AtFX-Myc株）を培地
に培養して別個に発現させ、その後に混合して用いても
よいが、好ましくは、これらの酵素の双方を発現する形
質転換体（例えば、W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc
株）を培地に培養して発現させる。形質転換体の培養物
からのこれらの酵素の単離は、上記「４．本発明の形質
転換体の培養による本発明のタンパク質の生産」に記載
されている方法により行うことができる。また、上記の
酵素反応に用いる酵素源は、精製酵素である必要はな
く、上記形質転換体の細胞内抽出液等の粗抽出物であっ
てもよい。
L-フコースの生産 GDP-L-フコースの生産は、必要な酵素を含む酵素源を用
いる酵素反応によっても行うことができる。酵素反応の
基質としてGDP-D-マンノースを用いる場合には、必要と
なる酵素はGDP-D-マンノース-4,6-デヒドラターゼ及びG
DP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ
-4-レダクターゼ（本発明のタンパク質）である。これ
らの酵素は、それぞれを発現する形質転換体（例えば、
W303/YEp-MUR1-HA株及びW303/pYO-AtFX-Myc株）を培地
に培養して別個に発現させ、その後に混合して用いても
よいが、好ましくは、これらの酵素の双方を発現する形
質転換体（例えば、W303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc
株）を培地に培養して発現させる。形質転換体の培養物
からのこれらの酵素の単離は、上記「４．本発明の形質
転換体の培養による本発明のタンパク質の生産」に記載
されている方法により行うことができる。また、上記の
酵素反応に用いる酵素源は、精製酵素である必要はな
く、上記形質転換体の細胞内抽出液等の粗抽出物であっ
てもよい。
【００５５】上記酵素源及び基質となるGDP-D-マンノー
スを含む反応液を調製し、適切な条件下で酵素反応を行
うことができる。該反応液には、必要に応じて、NADPH
等の補助因子を添加してもよい。反応条件は、当業者で
あれば適切に設定することができるため、特に制限され
ないが、温度は、好ましくは３０℃〜３７℃、より好ま
しくは約３７℃とし、pHは、好ましくは6.0〜8.0、より
好ましくは約7.5とする。pHを所望の範囲に保持するた
めには、Tris-HCl等の緩衝液を用いることができる。
スを含む反応液を調製し、適切な条件下で酵素反応を行
うことができる。該反応液には、必要に応じて、NADPH
等の補助因子を添加してもよい。反応条件は、当業者で
あれば適切に設定することができるため、特に制限され
ないが、温度は、好ましくは３０℃〜３７℃、より好ま
しくは約３７℃とし、pHは、好ましくは6.0〜8.0、より
好ましくは約7.5とする。pHを所望の範囲に保持するた
めには、Tris-HCl等の緩衝液を用いることができる。
【００５６】酵素反応液からのGDP-L-フコースの単離
は、当業者であれば容易に行うことができる。例えば、
酵素反応液中のタンパク質を熱変性させ、これを遠心分
離、メンブレンフィルター等を用いて除去した後に、HP
LCによりGDP-L-フコースを単離精製することができる。
該GDP-L-フコースはフコース含有糖鎖の合成の際に糖供
与体として必須なものであるので、機能的に重要と思わ
れる糖鎖へのフコース付加の際に有用なものである。
は、当業者であれば容易に行うことができる。例えば、
酵素反応液中のタンパク質を熱変性させ、これを遠心分
離、メンブレンフィルター等を用いて除去した後に、HP
LCによりGDP-L-フコースを単離精製することができる。
該GDP-L-フコースはフコース含有糖鎖の合成の際に糖供
与体として必須なものであるので、機能的に重要と思わ
れる糖鎖へのフコース付加の際に有用なものである。
【００５７】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕AtFX遺伝子の単離及び配列決定 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のｃＤＮＡラ
イブラリを用いて、ＰＣＲ法によるAtFX遺伝子のクロー
ニングを行った。ｃＤＮＡライブラリとしては、QUICK-
Clone cDNA（CLONTECH社）を用いた。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕AtFX遺伝子の単離及び配列決定 シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のｃＤＮＡラ
イブラリを用いて、ＰＣＲ法によるAtFX遺伝子のクロー
ニングを行った。ｃＤＮＡライブラリとしては、QUICK-
Clone cDNA（CLONTECH社）を用いた。
【００５８】プライマーは、データベース上に登録され
ている塩基配列（ＤＢ名：GenBank；アクセッション番
号：U38473、U58766、及びAF045286）に基づいて設計し
た。その際に、タンパク質をコードしている部分が制限
酵素を用いて容易に切り出せるとともに、標識抗原遺伝
子等が簡単に挿入できるように、N-末端部分にKpnI部
位、C-末端部分にEcoRV部位をあらかじめ含んだプライ
マーを設計した。それぞれのプライマーの塩基配列を以
下に示す。
ている塩基配列（ＤＢ名：GenBank；アクセッション番
号：U38473、U58766、及びAF045286）に基づいて設計し
た。その際に、タンパク質をコードしている部分が制限
酵素を用いて容易に切り出せるとともに、標識抗原遺伝
子等が簡単に挿入できるように、N-末端部分にKpnI部
位、C-末端部分にEcoRV部位をあらかじめ含んだプライ
マーを設計した。それぞれのプライマーの塩基配列を以
下に示す。
【００５９】フォワードプライマー： 5'-ATTGGTACCATGTCTGACAAATCTGCCAAAATCTTCGTC-3'（配
列番号３） リバースプライマー： 5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCAT
AAG-3'（配列番号４）
列番号３） リバースプライマー： 5'-TTAGTCGACGATATCTCGGTTGCAAACATTCTTCAAATACCAATCAT
AAG-3'（配列番号４）
【００６０】ここで、フォワードプライマーの塩基配列
中の下線部分はKpnI部位を示し、リバースプライマーの
塩基配列中の下線部分はEcoRV部位を示す。このように
して設計したプライマーは、常法により合成した。上記
QUICK-Clone cDNA（CLONTECH社）を鋳型として用い、上
記のプライマーを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液
の組成は以下の表２に示す。
中の下線部分はKpnI部位を示し、リバースプライマーの
塩基配列中の下線部分はEcoRV部位を示す。このように
して設計したプライマーは、常法により合成した。上記
QUICK-Clone cDNA（CLONTECH社）を鋳型として用い、上
記のプライマーを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ溶液
の組成は以下の表２に示す。
【００６１】
【表２】
【００６２】また、ＰＣＲの温度条件は、94℃で15秒
（変性）、50℃で30秒（アニーリング）及び68℃で２分
（伸長）の反応を30サイクルとした。このＰＣＲによっ
て得られた約１kbpのＤＮＡ増幅断片を、アガロース電
気泳動で分離した後、TAクローニングキット（Invitrog
en）を用いてpCR2.1ベクターに挿入した。このクローニ
ングされたＤＮＡの塩基配列を、ダイデオキシ法を用い
るシークエンスキット（PE Biosystems）により決定し
た。この塩基配列を配列番号２に、該塩基配列によって
コードされるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
（変性）、50℃で30秒（アニーリング）及び68℃で２分
（伸長）の反応を30サイクルとした。このＰＣＲによっ
て得られた約１kbpのＤＮＡ増幅断片を、アガロース電
気泳動で分離した後、TAクローニングキット（Invitrog
en）を用いてpCR2.1ベクターに挿入した。このクローニ
ングされたＤＮＡの塩基配列を、ダイデオキシ法を用い
るシークエンスキット（PE Biosystems）により決定し
た。この塩基配列を配列番号２に、該塩基配列によって
コードされるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００６３】〔実施例２〕AtFX遺伝子発現ベクター及び
MUR1遺伝子発現ベクターの作製、並びにこれらのプラス
ミドを含む酵母形質転換体の作製 pCR2.1ベクターに挿入されているAtFX遺伝子のEcoRV部
位に、標識抗原をコードする3xMyc遺伝子（Evanら、Mo
l. Cell Biol., Vol.5, 3610 (1985)）を、AtFX遺伝子
とフレームが合うように挿入した。このMyc遺伝子を含
むAtFX遺伝子をKpnI-XhoIで切り出し、この断片を、酵
母の発現ベクターYEp352GAP（Royら、J. Biol. Chem.,
Vol.273, 2583 (1998)）のマルチクローニング部位をpU
C18のマルチクローニング部位のうちのEcoRIからSalIま
での部分でさしかえた発現用ベクターYEp352GAP-IIのKp
nI-SalI部位に挿入した。さらにこのベクターからGAPDH
プロモータ、AtFX-Myc、GAPDHターミネータの３つの部
分を含む断片をBamHIを用いて切り出し、該断片を、LUE
2マーカーを持つ酵母の多コピーベクターpYO325（Qadot
aら、Yeast, Vol.8, 735 (1992)）のBamHI部位に挿入
し、AtFX遺伝子発現ベクターpYO-AtFX-Mycを構築した。
MUR1遺伝子もまた、実施例１と同様にＰＣＲを用いてク
ローニングした。ただし、ＰＣＲ用プライマーとして
は、以下の塩基配列を有するプライマーを用いた。
MUR1遺伝子発現ベクターの作製、並びにこれらのプラス
ミドを含む酵母形質転換体の作製 pCR2.1ベクターに挿入されているAtFX遺伝子のEcoRV部
位に、標識抗原をコードする3xMyc遺伝子（Evanら、Mo
l. Cell Biol., Vol.5, 3610 (1985)）を、AtFX遺伝子
とフレームが合うように挿入した。このMyc遺伝子を含
むAtFX遺伝子をKpnI-XhoIで切り出し、この断片を、酵
母の発現ベクターYEp352GAP（Royら、J. Biol. Chem.,
Vol.273, 2583 (1998)）のマルチクローニング部位をpU
C18のマルチクローニング部位のうちのEcoRIからSalIま
での部分でさしかえた発現用ベクターYEp352GAP-IIのKp
nI-SalI部位に挿入した。さらにこのベクターからGAPDH
プロモータ、AtFX-Myc、GAPDHターミネータの３つの部
分を含む断片をBamHIを用いて切り出し、該断片を、LUE
2マーカーを持つ酵母の多コピーベクターpYO325（Qadot
aら、Yeast, Vol.8, 735 (1992)）のBamHI部位に挿入
し、AtFX遺伝子発現ベクターpYO-AtFX-Mycを構築した。
MUR1遺伝子もまた、実施例１と同様にＰＣＲを用いてク
ローニングした。ただし、ＰＣＲ用プライマーとして
は、以下の塩基配列を有するプライマーを用いた。
【００６４】フォワードプライマー： 5'-GTCGAATTCATGGCGTCAGAGAACAAC-3'（配列番号５） リバースプライマー： 5'-GAACTCGAGAGGTTGCTGCTTAGCATC-3'（配列番号６）
【００６５】次いで、MUR1遺伝子をYEp352GAPベクター
（Royら、J. Biol. Chem., Vol.273,2583 (1998)）のEc
oRI部位に挿入し、さらにインフレームになるように3xH
A標識抗原遺伝子をPvuII部位に挿入してMUR1遺伝子発現
ベクターYEp-MUR1-HAを構築した。
（Royら、J. Biol. Chem., Vol.273,2583 (1998)）のEc
oRI部位に挿入し、さらにインフレームになるように3xH
A標識抗原遺伝子をPvuII部位に挿入してMUR1遺伝子発現
ベクターYEp-MUR1-HAを構築した。
【００６６】これらの発現ベクターは、それぞれ単独で
又は２つ一緒に酵母のW303-1A株(ura3, lue2, his3, tr
p1, ade2)（Kainumaら、Glycobiology, Vol.9, 133 (19
99)）に形質転換し、pYO-AtFX-Mycのみを含むW303/pYO-
AtFX-Myc株、YEp-MUR1-HAのみを含むW303/YEp-MUR1-HA
株、及びpYO-AtFX-MycとYEp-MUR1-HAの双方を含むW303/
YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株を得た。
又は２つ一緒に酵母のW303-1A株(ura3, lue2, his3, tr
p1, ade2)（Kainumaら、Glycobiology, Vol.9, 133 (19
99)）に形質転換し、pYO-AtFX-Mycのみを含むW303/pYO-
AtFX-Myc株、YEp-MUR1-HAのみを含むW303/YEp-MUR1-HA
株、及びpYO-AtFX-MycとYEp-MUR1-HAの双方を含むW303/
YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株を得た。
【００６７】〔実施例３〕MUR1タンパク質及びAtFXタン
パク質の酵母内での発現 実施例２で得られた形質転換体について、それぞれの細
胞内でタンパク質が発現されるかどうかを、ウエスタン
ブロッティングを用いて確認した。まず、上記形質転換
体（W303/YEp-MUR1-HA株、W303/pYO-AtFX-Myc株、及びW
303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株）及びW303株のそれぞ
れをSD培地上にて30℃で24時間培養し、得られた酵母細
胞をガラスビーズで破砕した。得られた破砕物を遠心操
作（100,000×ｇ、４℃、６０分間）することにより細
胞質画分だけを分離し、75%硫酸アンモニウムでタンパ
ク質画分だけを沈降させた。このタンパク質沈殿画分
を、0.5mM DTTを含む20mM Tris-HCl（pH7.5）に溶か
し、Sephadex G50（Pharmacia、0.5mM DTTを含む20mM T
ris-HCl,pH7.5、1.3ｃｍ×2.6ｃｍ）で脱塩することに
より酵素液を得た。該酵素液について、BCAキット（RIE
RCE）を用いてタンパク質定量を行った。それぞれタン
パク質100μgに相当する酵素液をとってSDS-PAGEを行っ
た後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、HA抗体若し
くはMyc抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図
２)。その結果、W303/YEp-MUR1-HA株及びW303/YEp-MUR1
-HA,pYO-AtFX-Myc株ではMUR1タンパク質が、W303/pYO-A
tFX-Myc株及びW303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株ではAt
FXタンパク質が発現していることが確かめられた。
パク質の酵母内での発現 実施例２で得られた形質転換体について、それぞれの細
胞内でタンパク質が発現されるかどうかを、ウエスタン
ブロッティングを用いて確認した。まず、上記形質転換
体（W303/YEp-MUR1-HA株、W303/pYO-AtFX-Myc株、及びW
303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株）及びW303株のそれぞ
れをSD培地上にて30℃で24時間培養し、得られた酵母細
胞をガラスビーズで破砕した。得られた破砕物を遠心操
作（100,000×ｇ、４℃、６０分間）することにより細
胞質画分だけを分離し、75%硫酸アンモニウムでタンパ
ク質画分だけを沈降させた。このタンパク質沈殿画分
を、0.5mM DTTを含む20mM Tris-HCl（pH7.5）に溶か
し、Sephadex G50（Pharmacia、0.5mM DTTを含む20mM T
ris-HCl,pH7.5、1.3ｃｍ×2.6ｃｍ）で脱塩することに
より酵素液を得た。該酵素液について、BCAキット（RIE
RCE）を用いてタンパク質定量を行った。それぞれタン
パク質100μgに相当する酵素液をとってSDS-PAGEを行っ
た後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、HA抗体若し
くはMyc抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図
２)。その結果、W303/YEp-MUR1-HA株及びW303/YEp-MUR1
-HA,pYO-AtFX-Myc株ではMUR1タンパク質が、W303/pYO-A
tFX-Myc株及びW303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株ではAt
FXタンパク質が発現していることが確かめられた。
【００６８】〔実施例４〕GDP-L-フコース合成活性測定 GDP-L-フコース合成活性測定は、実施例３で調製した各
酵素液について、基質としてGDP-D-マンノースを、補助
因子として50mM NADPHを用いて行った。まず、50mM NAD
PHを含有する緩衝液（10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM EDT
A）５０μｌにGDP-D-マンノース５０nmolを添加し、こ
れにタンパク質７００μgに相当する各酵素液を加え
て、37℃で1時間インキュベートした。次いで、この反
応液を100℃で３分間沸騰させた後、沈殿した変性タン
パク質を、10,000rpmで５分間遠心して取り除き、上清
をウルトラフリー(0.20μm)で分子量10,000以上のもの
を取り除き、HPLCによりGDP-L-フコースとGDP-D-マンノ
ースの測定を行った。HPLCはC18カラム（wakosil 5C18-
200、和光純薬工業、直径0.46ｃｍ×長さ２５ｃｍ）を
用いて0.5M KH2PO4水溶液を1ml/minで流して分離を行っ
た。
酵素液について、基質としてGDP-D-マンノースを、補助
因子として50mM NADPHを用いて行った。まず、50mM NAD
PHを含有する緩衝液（10mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM EDT
A）５０μｌにGDP-D-マンノース５０nmolを添加し、こ
れにタンパク質７００μgに相当する各酵素液を加え
て、37℃で1時間インキュベートした。次いで、この反
応液を100℃で３分間沸騰させた後、沈殿した変性タン
パク質を、10,000rpmで５分間遠心して取り除き、上清
をウルトラフリー(0.20μm)で分子量10,000以上のもの
を取り除き、HPLCによりGDP-L-フコースとGDP-D-マンノ
ースの測定を行った。HPLCはC18カラム（wakosil 5C18-
200、和光純薬工業、直径0.46ｃｍ×長さ２５ｃｍ）を
用いて0.5M KH2PO4水溶液を1ml/minで流して分離を行っ
た。
【００６９】その結果、MUR1タンパク質とAtFXタンパク
質を共発現させたW303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株の
みでGDP-L-フコース合成活性を検出した(図３)。MUR1タ
ンパク質のみではなんの活性も示さず、酵母で単独発現
させた場合、活性が保たれていないことが分かった。こ
のことは、GDP-L-フコースを合成する場合、AtFXタンパ
ク質は、MUR1タンパク質による第１段階の反応の後にGD
P-L-フコースを完成させるだけではなく、MUR1タンパク
質の活性型を安定化する作用もあることが明らかとなっ
た。
質を共発現させたW303/YEp-MUR1-HA,pYO-AtFX-Myc株の
みでGDP-L-フコース合成活性を検出した(図３)。MUR1タ
ンパク質のみではなんの活性も示さず、酵母で単独発現
させた場合、活性が保たれていないことが分かった。こ
のことは、GDP-L-フコースを合成する場合、AtFXタンパ
ク質は、MUR1タンパク質による第１段階の反応の後にGD
P-L-フコースを完成させるだけではなく、MUR1タンパク
質の活性型を安定化する作用もあることが明らかとなっ
た。
【００７０】
【発明の効果】本発明により、糖鎖において非常に重要
な機能をもつフコースの付加を行うために必須であるGD
P-L-フコースを、多量に効率よく生産することができ
る。現時点において糖タンパク質糖鎖を均一に合成する
技術は確立されておらず、最終的には生体外での糖鎖の
修飾を行うことで糖鎖の均一な合成を行うことが考えら
れるが、この際、糖供与体として糖ヌクレオチドは必須
なものである。特に、フコースにおいてはGDP-L-フコー
スが大変高価なため、生体外での修飾反応を大量に行う
ことは非現実的であるが、本発明により多量のGDP-L-フ
コースの供給が可能となれば、フコースの付加した高機
能な糖鎖の合成を生体外で行うことができる。
な機能をもつフコースの付加を行うために必須であるGD
P-L-フコースを、多量に効率よく生産することができ
る。現時点において糖タンパク質糖鎖を均一に合成する
技術は確立されておらず、最終的には生体外での糖鎖の
修飾を行うことで糖鎖の均一な合成を行うことが考えら
れるが、この際、糖供与体として糖ヌクレオチドは必須
なものである。特に、フコースにおいてはGDP-L-フコー
スが大変高価なため、生体外での修飾反応を大量に行う
ことは非現実的であるが、本発明により多量のGDP-L-フ
コースの供給が可能となれば、フコースの付加した高機
能な糖鎖の合成を生体外で行うことができる。
【００７１】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of Agency of Industrial Science and Technology <120> A GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3,5-epimerase-4-reductase Gene From Arabidopsis Thaliana <130> 11900303 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 312 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ser Asp Lys Ser Ala Lys Ile Phe Val Ala Gly His Arg Gly Leu 1 5 10 15 Val Gly Ser Ala Ile Val Arg Lys Leu Gln Glu Gln Gly Phe Thr Asn 20 25 30 Leu Val Leu Lys Thr His Ala Glu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Asp 35 40 45 Val Glu Ser Phe Phe Ser Gln Glu Lys Pro Val Tyr Val Ile Leu Ala 50 55 60 Ala Ala Lys Val Gly Gly Ile His Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp 65 70 75 80 Phe Ile Gly Val Asn Leu Gln Ile Gln Thr Asn Val Ile His Ser Ala 85 90 95 Tyr Glu His Gly Val Lys Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile 100 105 110 Tyr Pro Lys Phe Ala Pro Gln Pro Ile Pro Glu Ser Ala Leu Leu Thr 115 120 125 Ala Ser Leu Glu Pro Thr Asn Glu Trp Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala 130 135 140 Gly Ile Lys Thr Cys Gln Ala Tyr Arg Ile Gln His Gly Trp Asp Ala 145 150 155 160 Ile Ser Gly Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe His 165 170 175 Pro Glu Asn Ser His Val Leu Pro Ala Leu Met Arg Arg Phe His Glu 180 185 190 Ala Lys Val Asn Gly Ala Glu Glu Val Val Val Trp Gly Thr Gly Ser 195 200 205 Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys Val 210 215 220 Phe Leu Leu Asp Arg Tyr Ser Gly Leu Glu His Val Asn Ile Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gln Glu Val Thr Ile Arg Glu Leu Ala Glu Leu Val Lys Glu Val 245 250 255 Val Gly Phe Glu Gly Lys Leu Gly Trp Asp Cys Thr Lys Pro Asp Gly 260 265 270 Thr Pro Arg Lys Leu Met Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Leu Gly Trp 275 280 285 Thr Pro Lys Val Ser Leu Arg Asp Gly Leu Ser Gln Thr Tyr Asp Trp 290 295 300 Tyr Leu Lys Asn Val Cys Asn Arg 305 310 <210> 2 <211> 936 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(936) <400> 2 atg tct gac aaa tct gcc aaa atc ttc gtc gcg ggt cat cgt ggt ttg 48 Met Ser Asp Lys Ser Ala Lys Ile Phe Val Ala Gly His Arg Gly Leu 1 5 10 15 gtt gga tct gcc att gtc cgc aag ctt cag gaa caa ggt ttc acc aat 96 Val Gly Ser Ala Ile Val Arg Lys Leu Gln Glu Gln Gly Phe Thr Asn 20 25 30 ctc gtt ctt aaa aca cac gcc gag ctt gat ctc act cgt caa gcc gat 144 Leu Val Leu Lys Thr His Ala Glu Leu Asp Leu Thr Arg Gln Ala Asp 35 40 45 gtt gaa tcc ttc ttt tct caa gag aag cca gtt tat gta atc cta gca 192 Val Glu Ser Phe Phe Ser Gln Glu Lys Pro Val Tyr Val Ile Leu Ala 50 55 60 gca gct aaa gtt ggt ggt att cac gct aac aac acc tat cct gct gat 240 Ala Ala Lys Val Gly Gly Ile His Ala Asn Asn Thr Tyr Pro Ala Asp 65 70 75 80 ttc att ggt gtc aat ctc cag att cag acc aat gtg atc cac tct gca 288 Phe Ile Gly Val Asn Leu Gln Ile Gln Thr Asn Val Ile His Ser Ala 85 90 95 tat gag cac ggt gtg aag aag ctt ctc ttc ctt gga tca tcc tgc att 336 Tyr Glu His Gly Val Lys Lys Leu Leu Phe Leu Gly Ser Ser Cys Ile 100 105 110 tac cct aaa ttt gct cct cag cca att cct gag tct gct ttg tta aca 384 Tyr Pro Lys Phe Ala Pro Gln Pro Ile Pro Glu Ser Ala Leu Leu Thr 115 120 125 gca tcg ctt gaa cca act aat gag tgg tat gct att gct aag atc gct 432 Ala Ser Leu Glu Pro Thr Asn Glu Trp Tyr Ala Ile Ala Lys Ile Ala 130 135 140 ggg att aag act tgt cag gct tat agg att cag cac gga tgg gat gca 480 Gly Ile Lys Thr Cys Gln Ala Tyr Arg Ile Gln His Gly Trp Asp Ala 145 150 155 160 atc tct ggc atg cct act aat ctc tat ggt cct aat gac aat ttc cac 528 Ile Ser Gly Met Pro Thr Asn Leu Tyr Gly Pro Asn Asp Asn Phe His 165 170 175 ccg gag aat tct cat gtg ctt cct gct ctt atg agg agg ttc cac gag 576 Pro Glu Asn Ser His Val Leu Pro Ala Leu Met Arg Arg Phe His Glu 180 185 190 gcg aaa gtg aat gga gcg gag gaa gtt gtg gtg tgg ggt aca ggt agt 624 Ala Lys Val Asn Gly Ala Glu Glu Val Val Val Trp Gly Thr Gly Ser 195 200 205 ccg ttg agg gag ttc ttg cat gtt gat gat ttg gct gat gct tgt gtt 672 Pro Leu Arg Glu Phe Leu His Val Asp Asp Leu Ala Asp Ala Cys Val 210 215 220 ttc ttg ctg gat cga tac agc ggg ttg gag cat gtt aac att gga agt 720 Phe Leu Leu Asp Arg Tyr Ser Gly Leu Glu His Val Asn Ile 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caatcataag 50 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 5 gtcgaattca tggcgtcaga gaacaac 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Primer <400> 6 gaactcgaga ggttgctgct tagcatc 27
【００７２】
【配列表フリーテキスト】配列番号３〜６：プライマー
【図１】GDP-D-マンノースからGDP-L-フコースへの酵素
反応過程を示す図である。
反応過程を示す図である。
【図２】ウエスタンブロッティングによるMUR1及びAtFX
タンパク質の発現を示す電気泳動写真である。
タンパク質の発現を示す電気泳動写真である。
【図３】HPLCによるGDP-L-フコース合成活性の測定結果
を示すクロマトグラムである。
を示すクロマトグラムである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【書類名】 受託番号変更届
【提出日】 平成１２年６月１６日
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１７６４９号
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【新寄託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−７１０７号
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５０号
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【新寄託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−７１０８号
【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【旧寄託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１７６５１号
【新寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技術研
究所
究所
【新寄託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−７１０９号
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 19/02 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 BA07 BA08 CA02 DA12 EA04 4B050 CC03 DD09 LL05 4B064 AF02 CA06 CA19 CB18 CB28 CC24 CD15 DA20 4B065 AA72X AA89Y AB01 AC14 BA01 BB14 BB21 CA20 CA27 CA60
Claims (9)
- 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項２】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むタンパ
ク質。 （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若
しくは複数のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは
挿入されたアミノ酸配列を含み、かつGDP-4-ケト-6-デ
オキシ-D-マンノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクター
ゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項３】 配列番号２で表される塩基配列を含む、
請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項２又は３に記載のＤＮＡを含む発
現ベクター。 - 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターによって形
質転換された形質転換体。 - 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培地に培養
し、得られる培養物からGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マン
ノース-3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼを採取するこ
とを特徴とするGDP-4-ケト-6-デオキシ-D-マンノース-
3,5-エピメラーゼ-4-レダクターゼの製造方法。 - 【請求項７】 請求項４記載の発現ベクター及びGDP-
D-マンノース-4,6-デヒドラターゼをコードするＤＮＡ
を含む発現ベクターによって形質転換された形質転換
体。 - 【請求項８】 請求項７記載の形質転換体を用いてGDP-
D-マンノースをGDP-L-フコースに変換する方法。 - 【請求項９】 請求項７記載の形質転換体を、GDP-D-マ
ンノースと共に培地に培養し、得られる培養物からGDP-
L-フコースを採取することを特徴とするGDP-L-フコース
の製造方法。
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| JP32904599A JP2001145488A (ja) | 1999-11-19 | 1999-11-19 | シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子 |
| PCT/JP2000/002049 WO2001038507A1 (fr) | 1999-11-19 | 2000-03-30 | Gene de la gdp-4-keto-6-desoxy-d-manose-3,5-epimerase-4-reductase tire de l'arabidopsis |
| DE60032630T DE60032630T2 (de) | 1999-11-19 | 2000-03-30 | Gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reduktasegene aus arabidopsis |
| US10/089,014 US7198932B1 (en) | 1999-11-19 | 2000-03-30 | Gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene derived from arabidopsis thaliana |
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Publications (1)
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| EP (1) | EP1231266B1 (ja) |
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