JP4258670B2 - Udp−ラムノ−スの製造方法 - Google Patents
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Description
これらの酵素はUDP-ラムノ-スを使用する生物であればもっている普遍的な酵素である。ただし、このような生物は合成したUDP-ラムノ-スを使用していくため、細胞内にUDP-ラムノ-スが蓄積していくことはない。このため、生物体からUDP-ラムノ-スを単離する場合、その生産量は極めて低くかつ高価である。また、遺伝子工学的手法を用いてUDP-ラムノ-スを合成した例は見あたらない。
(1)以下のA)に記載の蛋白質をコードするDNAにより組み換えられたベクター及び以下のB)に記載の蛋白質をコードするDNAにより組み換えられたベクターが同一の宿主細胞に導入されているか、又は以下のA)に記載の蛋白質をコードするDNAと以下のB)に記載のタンパク質をコードするDNAとをともに導入した組み換えベクターが宿主細胞に導入されていることを特徴とする、形質転換体。
A)(a)配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは(b)配列番号6で示されるアミノ酸配列において、1乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、UDP-グルコース4、6-デヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
B)(a)配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは(b)配列番号8で示されるアミノ酸配列において、1乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコース3、5-エピメラーゼ及びUDP-4-ケト-ラムノース4-ケト-レダクターゼ活性を有するタンパク質。
(2)上記(1)A)に記載のDNAが(a)配列番号5で示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする、上記(1)に記載のDNA。
(3)上記(1)B)に記載のDNAが(a)配列番号7で示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする、上記(1)に記載の形質転換体。
(4)宿主細胞が、UDP-グルコースを細胞内に含有していることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の形質転換体。
(5)宿主細胞が、酵母細胞であることを特徴とする、上記(1)〜(4)に記載の形質転換体。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の形質転換体を培養し、培養物からUDP-ラムノースを採取することを特徴とする、UDP-ラムノースの製造方法。
(7)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素をUDP-グルコースと接触させることにより、UDP-グルコースをUDP-ラムノースに変換させることを特徴とする、UDP-ラムノースの製造方法。
(8)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の形質転換体を同位体元素により置換されたグルコースを炭素源として培養し、培養物から同位体元素でラベルされたUDPラムノースを採取することを特徴とする、標識UDP-ラムノースの製造方法。
(9)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の形質転換体を培地で培養することにより得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素を同位体元素により置換されたUDP-グルコースと接触させ、同位体元素でラベルされたUDP-ラムノースを採取することを特徴とする、標識UDP-ラムノースの製造方法。
本発明の第1の酵素遺伝子は、上記したアミノ酸配列コ-ドするDNAである。具体的な塩基配列は、配列番号1、配列番号3、もしくは配列番号19にそれぞれ示されるが(以下、配列番号1に示される遺伝子をRHM1遺伝子といい、配列番号3に示される遺伝子をRHM2遺伝子、配列番号19で示される遺伝子をRHM3遺伝子とそれぞれいう場合がある。)これのみでなく、配列番号1、配列番号3もしくは配列番号19で示される塩基配列において、1乃至数個のヌクレオチドが、欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものであっても、UDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼ活性、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼ活性及びUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼ活性をともに有するタンパク質をコ-ドするものであれば、本発明において使用できる。
本発明においては、上記シロイヌナズナのRHM1、RHM2遺伝子もしくはRHM3遺伝子あるいは上記の変異遺伝子を用いて、遺伝子工学的手法によりUDP-ラムノ-スを効率よく生産可能であるが、この製造法には大別して細胞内で生産する方法(培養法)と、細胞外で生産する方法(酵素変換法)の2つがある。
(1)シロイヌナズナのRHM1、RHM2もしくはRHM3遺伝子〔UDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼ、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼ及びUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼ遺伝子(UDP-glucose 4,6-dehidratase-3,5-epimerase/4-keto-reductase)〕を取得する;
(2)シロイヌナズナRHM1、RHM2もしくはRHM3遺伝子を発現用プラスミド等のベクタ-に導入し、RHM1、RHM2もしくはRHM3遺伝子を発現するベクタ-を構築する;
(3)上記発現ベクタ-を、UDP-グルコ-スを細胞内に持つ宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する;
(4)上記(3)の組換え体を培地に培養し、得られた培養物あるいは細胞破砕物等の培養処理物から抽出によりUDP-ラムノ-スを採取し、さらに単離・精製する。
(1)シロイヌナズナのRHM1、RHM2もしくはRHM3遺伝子(UDP-glucose 4,6-dehidratase-3,5-epimerase/4-keto-reductase遺伝子)を取得する;
(2)シロイヌナズナRHM1、RHM2もしくはRHM3遺伝子を発現用プラスミド等のベクタ-に導入し、RHM1、RHM2もしくはRHM3遺伝子を発現するベクタ-を構築する;
(3)上記発現ベクタ-を、上記発現ベクタ-を、UDP-グルコ-スを細胞内に持つ宿主細胞に導入し、該宿主細胞を形質転換する。
(4)上記の形質転換体の培養物、細胞破砕物等の培養処理物、細胞内抽出物あるいは該抽出物から単離精製した酵素を酵素源とし、UDP-グルコ-スおよびNADPHを添加することによりUDP-グルコ-スをUDP-ラムノ-スに変換し、単離・精製を行う。該UDP-ラムノ-スはラムノ-ス含有糖鎖の合成の際に糖供与体として必須なものであるので、機能的に重要と思われる糖鎖へのラムノ-ス付加の際に有用なものである。
上記配列番号4で示されるRHM2タンパク質及びその遺伝子は、その配列中にUDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼドメイン、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼドメイン及びUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼドメインを有する。
本発明の第2の酵素タンパク質は、上記RHM2タンパク質のUDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼドメインに対応するタンパク質であり、配列番号6に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつUDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼ活性を有するタンパク質である(以下、配列番号6に示される酵素タンパク質をRHM2-Nタンパク質という場合がある。)。
また、本発明の第2の遺伝子は、RHM2-Nタンパク質あるいはその上記変異体タンパク質をコ-ドするDNAであり、より具体的には、配列番号5に示されるが(以下、配列番号5に示される遺伝子をRHM2遺伝子という場合がある。)これのみでなく、配列番号5に示される塩基配列において、1乃至数個のヌクレオチドが、欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものであっても、UDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼ活性をコ-ドするものであれば、本発明に含まれる。
本発明の第3の酵素タンパク質は、上記RHM2タンパク質のUDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼドメインとUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼドメインの両者を含むタンパク質であり、配列番号8に示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは該アミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつUDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼドメインとUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼの2つの酵素活性を有するタンパク質である(以下、配列番号8に示される酵素タンパク質をRHM2-Cタンパク質という場合がある。)。
本発明の第3の遺伝子は、RHM2-Cタンパク質あるいはその上記変異体タンパク質をコ-ドするDNAであり、より具体的には、配列番号7に示されるが(以下、配列番号7に示される遺伝子をRHM2-C遺伝子という場合がある。)これのみでなく、配列番号7に示される塩基配列において、1乃至数個のヌクレオチドが、欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものであっても、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼ活性とUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼ活性の2つの酵素活性を有するタンパク質をコ-ドするものであれば、本発明に含まれる。
これらの第2及び第3の酵素タンパク質は、上記第2及び第3の遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的手法により容易に得ることができる。得られた第2及び第3の酵素タンパク質は、図1に示されるように、UDP-グルコ-スをUDP-4-ケト-デオキシグルコ-スに転換する反応、及びUDP-4-ケト-デオキシグルコ-スをUDP-ラムノ-スに転換する反応をそれぞれ触媒するから、例えば、これら酵素を順次または同時に用いることにより、UDP-グルコ-スからUDP-ラムノ-スを製造することができる。
しかし、本発明におけるUDP-ラムノ-スの生産において、最も生産性が高い方法は、上記第2及び第3の遺伝子を同一宿主細胞において共発現する方法である。この方法による場合、RHM2遺伝子を用いる場合に比べ、UDP-ラムノ-スの生産量は著しく向上する。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。本明細書において、アミノ酸配列および塩基配列の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定および当該分野における通称または慣行に従うものとする。
ベクタ-を組み込む方法としては、例えばT.Maniatisらの方法[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.239 (1982)]に従うことができる。
さらに該遺伝子を発現させるためには、その上流にプロモ-タ-を接続するが、本発明で用いられるプロモ-タ-としては遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモ-タ-であれば、いかなるものでもよい。
また、形質転換する宿主が酵母である場合、ENO1プロモ-タ-、GAL10プロモ-タ-、GAPDHプロモ-タ-、ADHプロモ-タ-、AOXプロモ-タ-などが挙げられる。
宿主としては、UDP-ラムノ-スを生体内で消費しない出芽酵母(Saccharomyces cerevisia)などが挙げられるが、この他UDP-ラムノ-スを消費しない他の酵母(Pichia pastorisなど)などでもよい。また、酵母以外でも、UDP-ラムノ-スの消費する酵素系を持たない宿主であればいかなるものでもよい。
また、細胞破砕物、酵素抽出物等を用い、生体外でUDP-ラムノ-スを生産する場合、細胞質内で該遺伝子産物を生産することが可能な宿主であれば、いかなるものでも用いることができる。
上記形質転換体の作成は、それぞれの宿主について一般的に行われている方法で行う。または一般的ではなくても適用可能な方法ならばよい。例として、宿主が酵母であれば、リチウム法あるいはエレクトロポレ-ション法により組み換えDNAを含むベクタ-を導入する。
上記の遠心分離によって分離された上清画分からUDP-ラムノ-スを分離する場合は、ゲルろ過法等により低分子量の画分を集め、さらにHPLCによる分離を行うことにより、精製単離する。また、イオン交換カラムや逆相カラムを用いて精製単離することも可能である。
また、生体外で酵素変換反応を行い、UDP-ラムノ-スを製造する場合においては、細胞破砕物や上清画分をそのまま酵素源として利用することが可能であるが、上清画分硫酸アンモニウムを75%の濃度に溶かし、これにより沈殿してくるタンパク質画分を集め、透析等により脱塩したものも酵素源として使用することができる。
一方、本発明においては、シロイヌナズナ由来の上記配列番号2、配列番号4及び配列番号20に示されるタンパク質(RHM1タンパク質、RHM2タンパク質及びRHM3タンパク質)のみではなく、UDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼ、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼ及びUDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼ活性を有するタンパク質として、RHM1タンパク質、RHM2タンパク質及びRHM3タンパク質に対して相同率70%以上の相同性を有するタンパク質も挙げることができ、本発明においてはこれら相同性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコ-ドする塩基配列を有する遺伝子も包含する。これら相同性を有するタンパク質としては、植物由来の、例えばイネ(Oryza Sativa)、タバコ(Nicotiana tabacum)由来のタンパク質が挙げられ、イネにおける相同性を有するタンパク質のアミノ酸配列及びこれをコ-ドする遺伝子の塩基配列はそれぞれ配列番号22、配列番号21に示される。
これら相同性を有するタンパク質は、これらをコ-ドするDNAを用いて、上記RHM1タンパク質、RHM2タンパク質及びRHM3タンパク質について記載したのと同様な遺伝子工学手法を用いて製造することが出来る。すなわち本発明においては、これら相同性を有するタンパク質をコ-ドするDNAにより組み換えられた組換えベクタ-、該組換えベクタ-が導入されている形質転換体、及び該形質転換体を用いた、上記相同性を有する酵素タンパク質の製造方法、及び該形質転換体あるいは該相同酵素タンパク質を用いたUDP-ラムノ-スの製造方法をも包含する。
また別法として、本発明の形質転換体から得られた、酵素タンパク質を含む培養物、培養処理物、酵素抽出液あるいは精製酵素を、同位体元素でその構成元素を置換したUDP-グルコ-スと接触させることにより、同位体元素でラベルされたUDP-ラムノ-スに変換することも可能である。
このような酵素変換法では、上記同位体元素を有するUDP-グルコ-スに対し、上記RHM2-N精製タンパク質あるいは該タンパク質を含有する培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素と、同RHM2-C精製タンパク質あるいは該タンパク質を含有する培養物、培養処理物、酵素抽出液を順次または同時に接触させることにより、同位体元素でラベルされたUDP-ラムノ-スを得てもよい。
好ましい同位体元素としては、たとえばC13あるいはC14同位体が挙げられる。このような同位体元素でラベルされたUDP-ラムノ-スは、糖鎖合成系の解明あるいはこの糖鎖合成系に影響を及ぼす物質等の探索等に有用である。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例にのみ限定されるものではない。
〔実施例1〕RHM1遺伝子(配列番号1)、RHM2遺伝子(配列番号3)およびRHM3遺伝子(配列番号19)の単離
RHM1遺伝子およびRHM2遺伝子に関してはシロイヌナズナのcDNAライブラリを鋳型として用いてPCR法により遺伝子のクロ-ニングを行った。cDNAライブラリはCLONTECH社のQUICK-Clone cDNAを用いた。また、RHM3遺伝子に関しては理化学研究所バイオリソ-スセンタ-よりcDNAクロ-ンを入手し(Resouce Number: pda08705)、鋳型として用いた。プライマ-の設計においては、制限酵素でタンパク質をコ-ドしている部分が容易に切り出せるようにRHM1の場合は、N-末端Sac Iサイト、C-末端部分にKpn Iサイトに位置させ、RHM2およびRHM3の場合は、N-末端Eco RIサイト、C-末端部分にSal Iサイトに位置させた。また、N-末端には、あらかじめ標識抗原であり、ニッケルアガロ-ス結合配列をコ-ドする6 x ヒスチジン配列を付加せしめた。それぞれのプライマ-の配列を以下に示す(配列番号13と14は、RHM1用、同15と16はRHM2用、同23と24はRHM3用)。
AAGAGCTCATGCATCACCATCACCATCACATGGCTTCGTACACTCCCAAGAAC(配列番号13)
AAAGGTACCTCAGGTTTTCTTGTTTGGCCCGTATG(配列番号14)
AGAATTCATGCATCACCATCACCATCACATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAGAAC(配列番号15)
AAAAAGTCGACTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGAC(配列番号16)
AGAATTCATGCATCACCATCACCATCACATGGCTACATATAAGCCTAAGAACATCCTC(配列番号23)
AAAAAGTCGACTTACGTTCTCTTGTTAGGTTCGAAGACG(配列番号24)
PCRの条件は以下の通り。
95度 30秒
57度 30秒
72度 2分15秒
30サイクル
この条件で得られたそれぞれ約2.0 kbpのDNA増幅断片をアガロ-ス電気泳動で分離した後、制限酵素Sac IとKpn IもしくはEco RIとSal Iで切断し、pBluescript II-SK+ベクタ-のEco RIサイトとSal Iサイト部位に挿入した。このクロ-ニングされた遺伝子をダイデオキシ法を用いたシ-クエンスキットにより塩基配列を確認し、配列番号1、3および19に示した塩基配列であることを確認した。
pBluescript II-SK+ベクタ-に挿入されているRHM1遺伝子、RHM2遺伝子およびRHM3遺伝子をSac IおよびKpn IもしくはEco RIおよびSal Iで切り出し、酵母の解糖系のプロモ-タ-であるGAPDHとそのタ-ミネ-タ-の間にpUC18のマルチクロ-ニングサイトのうちEco RIからSal Iまでの部分を持ち選択マ-カ-としてURA3遺伝子を持つ発現用ベクタ-YEp352GAP-IIのSacIおよびKpnIサイトもしくはEcoRI およびSal Iサイトに挿入しYEp352-GAP-II-6xHIS-RHM1、YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2およびYEp352-GAP-II-6xHIS-RHM3を構築した。この発現ベクタ-は、酵母のW303-1B株(ura3, lue2, his3, trp1, ade2)に導入し、形質転換体、すなわち、RHM1遺伝子導入株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM1株)、RHM2遺伝子導入株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株)およびRHM3遺伝子導入株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM3株)を得た。なお、W303-1B株は、ATCC (American Type Culture Collection)から入手可能である(ATCC Number: 201238TM)。
〔実施例2〕で得られた形質転換体より細胞質中のタンパク質を抽出した。まず、〔W303/YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM1株〕、〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株〕、〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM3株〕およびW303株をSD培地にて24時間30度で培養し、得られた酵母細胞をガラスビ-ズで破砕した。得られた破砕物より遠心操作を用いて細胞壁画分及びミクロソ-ム画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。
〔実施例2〕で得られた形質転換体について、それぞれの細胞内でタンパク質が発現されていることをウエスタンブロッティング法を用いて確認した。まず、上記2種の形質転換体〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM1株〕、〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株〕、〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM3株〕およびW303株をSD培地にて30℃で24時間培養し、得られた酵母細胞をガラスビ-ズで破砕した。得られた破砕物より遠心操作を用いて細胞画分及びミクロソ-ム画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。このタンパク質を含む細胞質画分を50mM Tris-HCl pH6.8に溶かし、SDS-PAGEを行った後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、抗-penta-HIS抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図2)。その結果、RHM1遺伝子導入株〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM1株〕、RHM2遺伝子導入株〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株〕およびRHM3遺伝子導入株〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM3株〕でタンパク質が発現していることが確かめられた。
〔実施例3〕で得られた酵母細胞質タンパク質画分のUDP-ラムノ-ス合成活性を検出した。活性測定は基質としてUDP-グルコ-スを、補助因子として1 mM NAD+及び3 mM NADPHを用い、100 mM Tris-HCl、pH 8.0という条件で30度、2時間反応を行い、フェノ-ル:クロロホルム溶液 (24: 1) を加え撹拌した後、遠心分離を行い、上清を回収した。上清を逆相カラムを装備したHPLCに供与しよりUDP-ラムノ-スとUDP-グルコ-スの検出を行った。HPLCはC30カラムを用いて1%アセトニトリルを含む20 mMトリエチルアミン(pH 7.0) 溶液を0.7 ml/minで流して分離を行い、検出はUV260 nmで行った。その結果、RHM1タンパク質を発現させたW303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM1株とRHM2タンパク質を発現させたW303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株およびRHM3タンパク質を発現させたW303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM3株でUDP-ラムノ-ス合成活性を検出した(図3)。さらに、合成したUDP-ラムノ-スについてESI-MS測定を行い分子量を測定した結果、予想される分子量と一致した(図4)。
〔実施例3〕で得られた酵母細胞質画分よりUDP-ラムノ-スを分離精製した。まず、〔W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株〕をSD(-ウラシル)培地にて24時間30度で培養し、得られた酵母細胞O.D.600=10当り1mlの1-ブタノ-ル飽和1 Mギ酸を添加し、十分に撹拌し、氷上にて1時間安置した。この試料より遠心操作を用いて細胞壁画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。上清を凍結乾燥し、純水に再懸濁することによって糖ヌクレオチドを抽出した。抽出した糖ヌクレオチドをC30カラムにより1%アセトニトリルを含む20 mMトリエチルアミン(pH 7.0) 溶液を0.7 ml/minで流して分離を行い溶出時間からUDP-ラムノ-スを分離した。分離したUDP-ラムノ-スを数度同条件で再分離することによりUDP-ラムノ-スを精製した(図5)。
〔実施例2〕で得られたYEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2を用いてPCR法によりRHM2遺伝子中のUDP-グルコ-ス4、6-デヒドラタ-ゼドメイン(RHM2-N)とUDP-4-ケト-6-デオキシグルコ-ス3,5-エピメラ-ゼ/UDP-4-ケト-ラムノ-ス4-ケト-レダクタ-ゼドメイン(RHM2-C)のクロ-ニングを行った。プライマ-の設計においては、制限酵素でタンパク質をコ-ドしている部分が容易に切り出せるようにRHM2-N、RHM2-C共に、N-末端Eco RIサイト、C-末端部分にSal Iサイトに位置させた。また、N-末端には、あらかじめ標識抗原であり、ニッケルアガロ-ス結合配列をコ-ドする6 x ヒスチジン配列を付加せしめた。プライマ-は、〔実施例1〕で用いたプライマ-の内、配列番号15と配列番号16を流用した。その他のプライマ-の配列を以下に示す(配列番号15と17は、RHM2-N用、同16と18はRHM2-C用)。
AAAAAGTCGACTTAAGCTTTGTCACCAGAATCACCATT(配列番号17)
AGAATTCATGCATCACCATCACCATCACACACCTAAGAATGGTGATTCTGGTG(配列番号18)
PCRの条件は以下の通り。
95度 30秒
57度 30秒
72度 1分30秒
30サイクル
この条件で得られた約1.2
kb (RHM2-N) と約0.9 kb (RHM2-C)の断片をそれぞれアガロ-ス電気泳動で分離した後、制限酵素Eco RIとSal Iで切断し、YEp352GAP-IIのEcoRI およびSal Iサイトに挿入しYEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-NおよびYEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-Cを構築した。このクロ-ニングされた遺伝子をダイデオキシ法を用いた塩基配列解析により塩基配列を確認し、それぞれ配列番号9及び11に示した塩基配列(対応するタンパク質のアミノ酸配列は10及び12に示す。)であることを確認した。さらに、YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-Cベクタ-からGAPDHプロモ-タ-、6 x HIS-RHM2-C、GAPDHタ-ミネ-タ-の3つの部分を含む断片を制限酵素Bam HIを用いて切り出し、酵母のプラスミドベクタ-でありLEU2マ-カ-を持つYEp351のBam HIサイトに挿入しYEp351-GAP-II-6xHIS-RHM2-Cを構築した。この発現ベクタ-は、酵母のW303-1B株(ura3, lue2, his3, trp1, ade2)に導入し、形質転換体、すなわち、RHM2-N遺伝子導入株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-N株)とRHM2-C(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-C株)およびRHM2-N遺伝子、RHM2-C遺伝子共発現株を同時に導入したRHM2-N+RHM2-C株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2, YEp351-GAP-II-6xHIS-RHM2-C株)を得た。
〔実施例7〕で得られた形質転換体(RHM2-N株、RHM2-C株、RHM2-N+RHM2-C株)より〔実施例3〕に示す方法に従って細胞質中のタンパク質を抽出した。まず、形質転換株及びW303株をSD培地にて24時間30度で培養し、得られた酵母細胞をガラスビ-ズで破砕した。得られた破砕物より遠心操作を用いて細胞壁画分及びミクロソ-ム画分を取り除き、細胞質画分だけを分離した。
〔実施例7〕で得られた形質転換体について、それぞれの細胞内でタンパク質が発現されていることをウエスタンブロッティング法を用いて確認した。また、ウエスタンブロッティングの試料には〔実施例8〕で抽出した酵母細胞質タンパク質を用いた。このタンパク質を含む細胞質画分をSDS-PAGEを行った後、PVDF膜に電気的に転写し、それぞれ、抗-penta-HIS抗体を用いてタンパク質の発現を確認した(図6)。その結果、RHM2-N遺伝子導入株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-N株)とRHM2-C(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2-C株)およびRHM2-N遺伝子、RHM2-C遺伝子共発現株を同時に導入したRHM2-N+RHM2-C株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2, YEp351-GAP-II-6xHIS-RHM2-C株)でタンパク質が発現していることが確かめられた。
〔実施例3〕もしくは〔実施例8〕で得られた酵母細胞質タンパク質画分のUDP-ラムノ-ス合成活性を検出した。また、同時にW303株から抽出したタンパク質画分とW303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株から抽出したタンパク質画分についてもUDP-ラムノ-ス合成活性を検出した。活性測定は基質としてUDP-グルコ-スを、補助因子として1 mM NAD+及び3 mM NADPHを用い、100 mM Tris-HCl、pH 7.8という条件で37度、3時間反応を行い、フェノ-ル:クロロホルム溶液 (24: 1) を加え撹拌した後、遠心分離を行い、上清を回収した。上清を逆相カラムを装備したHPLCに供与しよりUDP-ラムノ-スとUDP-グルコ-スの検出を行った。HPLCはC30カラムを用いて1%アセトニトリルを含む20 mMトリエチルアミン(pH 7.0) 溶液を0.7 ml/minで流して分離を行い、検出はUV260 nmで行った。その結果、RHM2-N+RHM2-C株(W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2, YEp351-GAP-II-6xHIS-RHM2-C株)では、W303/ YEp352-GAP-II-6xHIS-RHM2株に比べて高いUDP-ラムノ-ス合成効率を示した(図7)。
Claims (9)
- 以下のA)に記載の蛋白質をコードするDNAにより組み換えられたベクター及び以下のB)に記載の蛋白質をコードするDNAにより組み換えられたベクターが同一の宿主細胞に導入されているか、又は以下のA)に記載の蛋白質をコードするDNAと以下のB)に記載のタンパク質をコードするDNAとをともに導入した組み換えベクターが宿主細胞に導入されていることを特徴とする、形質転換体。
A)(a)配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは(b)配列番号6で示されるアミノ酸配列において、1乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、UDP-グルコース4、6-デヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
B)(a)配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するか、あるいは(b)配列番号8で示されるアミノ酸配列において、1乃至数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、UDP-4-ケト-6-デオキシグルコース3、5-エピメラーゼ及びUDP-4-ケト-ラムノース4-ケト-レダクターゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1A)に記載のDNAが(a)配列番号5で示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする、請求項1に記載のDNA。
- 請求項1B)に記載のDNAが(a)配列番号7で示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする、請求項1に記載の形質転換体。
- 宿主細胞が、UDP-グルコースを細胞内に含有していることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の形質転換体。
- 宿主細胞が、酵母細胞であることを特徴とする、請求項1〜4に記載の形質転換体。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換体を培養し、培養物からUDP-ラムノースを採取することを特徴とする、UDP-ラムノースの製造方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素をUDP-グルコースと接触させることにより、UDP-グルコースをUDP-ラムノースに変換させることを特徴とする、UDP-ラムノースの製造方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換体を同位体元素により置換されたグルコースを炭素源として培養し、培養物から同位体元素でラベルされたUDPラムノースを採取することを特徴とする、標識UDP-ラムノースの製造方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の形質転換体を培地で培養することにより得られた培養物、培養処理物、酵素抽出液または精製酵素を同位体元素により置換されたUDP-グルコースと接触させ、同位体元素でラベルされたUDP-ラムノースを採取することを特徴とする、標識UDP-ラムノースの製造方法。
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