WO2014104310A1 - セルロース製造用発現ベクター、形質転換体およびセルロースの製造方法 - Google Patents

セルロース製造用発現ベクター、形質転換体およびセルロースの製造方法 Download PDF

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WO2014104310A1
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vector
cellulose
sequence
cesb
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PCT/JP2013/085138
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友也 今井
淳司 杉山
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国立大学法人京都大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1059—Cellulose synthases (2.4.1.12; 2.4.1.29)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to an expression vector for cellulose production, a transformant, and a method for producing cellulose.
  • Cellulose has been used for many years as a useful raw material in various industries.
  • Cellulose is a linear polymer in which glucose is polymerized, and can be classified into crystal structures such as type I and type II depending on the aggregation form of the molecular chain.
  • Natural cellulose is called cellulose I having a crystal structure of type I, and is generally used as a material for paper and clothes.
  • regenerated cellulose is called cellulose II having a type II crystal structure, and has a unique texture and high hydrophilicity, and thus has high added value and is generally used as a material for cellophane and rayon.
  • an object of the present invention is to provide a method for easily and inexpensively producing cellulose having various physical properties.
  • the cellulose production vector of the present invention has a promoter, a CesA gene and a CesB gene, It has an upstream sequence of the 5 ′ gene in an organism derived from the 5 ′ gene between the promoter and the start codon of the 5 ′ gene upstream of the CesA gene and the CesB gene. To do.
  • the transformant of the present invention is characterized by including the above-described cellulose production vector of the present invention.
  • the method for producing cellulose of the present invention is characterized by including a step of culturing a transformant containing the cellulose production vector of the present invention and a dgc gene.
  • the cellulose of the present invention is obtained by the method for producing cellulose of the present invention.
  • cellulose can be easily produced by co-expressing the cellulose production vector and the dgc gene in a transformant obtained by introducing the cellulose production vector of the present invention into a host. Moreover, since cellulose can be produced by biosynthesis of the transformant, it is not necessary to use pulp as a raw material as in the prior art, and the environmental burden due to the use of natural raw materials can be avoided. Therefore, the present invention can be said to be a useful technique for various industries using cellulose as a raw material.
  • Example 1 it is the schematic which shows the expression system structure of a CesABCD gene.
  • Example 1 it is a figure which shows the procedure of construction
  • Example 1 it is a figure which shows the procedure of construction
  • Example 1 it is a photograph which shows the result of the negative dyeing
  • Example 1 it is a photograph which shows the result of the electron diffraction of a sample.
  • Example 3 it is a photograph which shows the result of the negative dyeing
  • Example 4 it is a figure which shows the length of the upstream sequence and spacer sequence of a Ces expression system. In Example 4, it is a photograph which shows the result of Western blotting. In Example 5, it is a photograph which shows the result of Western blotting.
  • the cellulose production vector of the present invention has a promoter, a CesA gene and a CesB gene as described above, It has an upstream sequence of the 5 ′ gene in an organism derived from the 5 ′ gene between the promoter and the start codon of the 5 ′ gene upstream of the CesA gene and the CesB gene. To do.
  • the upstream gene of the CesA gene and the CesB gene is also referred to as a 5′-side gene
  • the downstream gene is also referred to as a 3′-side gene.
  • the lower limit of the length of the upstream sequence is, for example, 13 bases long, preferably 16 bases long, more preferably 21 bases long
  • the upper limit is, for example, 100 bases long, preferably 70 bases long.
  • the base length is more preferably 24 bases
  • the range is, for example, 13 to 100 bases, preferably 13 to 70 bases, more preferably 13 to 24 bases.
  • description of a numerical range also means disclosure of values included in the range. Thus, for example, 1-3 descriptions mean 1, 2, and 3 disclosures.
  • the upstream sequence may be linked directly to the start codon of the 5'-side gene, for example, or indirectly via a spacer sequence, preferably the former.
  • the upstream sequence may be directly linked to the 3 ′ end of the promoter, for example, or indirectly via a spacer sequence.
  • the upstream sequence is not particularly limited as long as it is a sequence upstream of the 5 'gene in an organism derived from the 5' gene.
  • the upstream sequence is, for example, an upstream sequence linked to the start codon of the 5 ′ gene in the organism derived from the 5 ′ gene, and specifically, an upstream sequence linked directly to the start codon. preferable.
  • the upstream sequence may include a functional sequence involved in the expression of the CesA gene and the CesB gene, for example.
  • examples of the upstream sequence include a sequence having a ribosome binding site (RBS) or a partial sequence thereof.
  • RBS ribosome binding site
  • the upstream sequence may be, for example, a sequence consisting only of RBS, a sequence including RBS, a sequence consisting only of the partial sequence, or a sequence including the partial sequence.
  • RBS examples include the base sequence of SEQ ID NO: 16 (GGACGAGCTATT).
  • the upstream sequence may be, for example, a sequence consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 16 or a sequence containing the base sequence.
  • the base sequence is preferably a 3 ′ region sequence in the upstream sequence.
  • the upstream sequence is, for example, the base sequence. Is preferably linked to the start codon of the 5 ′ gene.
  • the length between the promoter and the start codon is not particularly limited.
  • the lower limit of the length is, for example, 13 bases, preferably 27 bases, more preferably 29 bases
  • the upper limit of the length is, for example, 100 bases, preferably 86
  • the base length, more preferably 70 base length, still more preferably 30 base length, and the length range is, for example, 13 to 100 base length, preferably 13 to 86 base length, more preferably Is 13 to 86 bases long, more preferably 27 to 86 bases long or 29 to 86 bases long.
  • the length of the spacer sequence is not particularly limited, and the lower limit is, for example, 1 base length, preferably 6 bases, and the upper limit. Is, for example, 100 bases long, preferably 16 bases long, and the range is, for example, 1-100 bases long, preferably 6-16 bases long.
  • the spacer sequence is provided between the promoter and the upstream sequence, the length of the spacer sequence is, for example, in such a range.
  • the order of the CesA gene and the CesB gene is not particularly limited.
  • the cellulose production vector of the present invention may have the both genes in the following order, for example, from the upstream side.
  • [A] represents the CesA gene
  • [B] represents the CesB gene (hereinafter the same).
  • [A]-[B] [B]-[A] the present invention preferably has [A]-[B], that is, in the order of CesA gene-CesB gene from upstream.
  • the CesA gene and the CesB gene may be linked directly or indirectly, for example.
  • it is preferred that the promoters located upstream are functionally linked so that the expression of both genes is controlled together.
  • the CesA gene and the CesB gene are one An operon may be formed.
  • the cellulose production vector of the present invention may further have, for example, at least one of a CesC gene and a CesD gene, specifically, may have both or only one of them. Also good.
  • the cellulose production vector of the present invention may have the genes in the following order, for example, from upstream. [C] represents the CesC gene, and [D] represents the CesD gene (hereinafter the same).
  • the CesA gene, the CesB gene, the CesC gene, and the CesD gene may be linked directly or indirectly, respectively.
  • the genes are functionally linked so that expression of each gene is controlled by the promoter located upstream.
  • each gene forms one operon. Also good.
  • the CesA gene, the CesB gene, the CesC gene, and the CesD gene are known as cellulose synthase genes. For example, in bacteria such as acetic acid bacteria, these genes form one operon. It has been known.
  • the CesA gene, the CesB gene, the CesC gene, and the CesD gene are also referred to as Ces genes.
  • the origin of the Ces gene is not limited.
  • all of the Ces genes may be derived from the same, or all or a part thereof may be derived from different sources.
  • the origin include organisms such as bacteria, and examples of the bacteria include acetic acid bacteria, Salmonella bacteria, phytopathogenic bacteria, plant symbiotic bacteria, and photosynthetic bacteria.
  • the acetic acid bacterium is, for example, Acetobacter genus, Acidiphyllium genus, Acidifera spp.
  • gluconoacetobacter genus preferably the gluconoacetobacter genus.
  • the acetic acid bacteria belonging to the genus Gluconacetobacter are not particularly limited, and examples thereof include Gluconacetobacter xylinus.
  • the Ces gene may be prepared by a genetic engineering technique or a chemical technique, for example. In the former case, for example, it may be cloned from the derived organism or may be prepared by a gene amplification method such as PCR. In the latter case, it may be chemically synthesized. The preparation can be performed, for example, based on the base sequence information of each Ces gene or the amino acid sequence information of the protein encoded by each gene.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence that is modified in a range in which the encoded protein maintains an equivalent function in the nucleotide sequence of a known Ces gene can be used as the Ces gene.
  • the operon base sequences of CesA gene, CesB gene, CesC gene and CesD gene derived from Gluconacetobacter xylinus are shown below.
  • the Ces gene is not limited to these sequences.
  • CesA gene (SEQ ID NO: 2, positions 71 to 2335 in the operon) CesA protein (SEQ ID NO: 3) MSEVQSPVPTESRLGRISNKILSLRGASYIVGALGLCALIAATTVTLNNNEQLIVAAVCVVIFFVVGRGKSRRTQIFLEVLSALVSLRYLTWRLTETLDFNTWIQGILGVILLMAELYALYMLFLSYFQTIQPLHRAPLPLPDNVDDWPTVDIFIPTYDEQLSIVRLTVLGALGIDWPPDKVNVYILDDGVRPEFEQFAKDCGALYIGRVDSAHAKAGNLNHAIKRTSGDYILILDCDHIPTRAFLQIAMGWMVADRKIALMQTPHHFYSPDPFQRNLAVGYRTPPEGNLFYGVIQDGNDFWDATFFCGSCAILRREAIESIGGFAVETVTEDAHTALRMQRRGWSTAYLRIPVASGLATERLTTHIGQRMRWARGMIQIFRVDNPMLGRGLKLGQRLCYLSAM
  • CesB gene (SEQ ID NO: 4, positions 2337-4745 in the operon) CesB protein (SEQ ID NO: 5) MKMVSLIALLVFATGAQAAPVASKAPAPQPAGSDLPPLPAAPPQAAPPAAASAAPPATTPAADASAASAADAVVDNAENAIAGSDVATVHTYSLRELGAQSALKMQGAATLQGLQFGIPADQLVTSARLVVSGAMSPSLQPDTSAVTITLNEQFIGTLRPDPTHPTFGPLSFDINPIFFISGNRLNFSFASSSKGCTDPSNGLLWASVSEHSELQITTIPLPPHRQLSRLPQPFFDKNVKQKIVIPFVLAQTFDPEVLKATGILASWFGQQTDYRGVTFPVFSTIPQTGNAVVVGVADELPSALGRQAVSGPTLMEVANPSDPNGTILLVTGRDRDEVITASKGIGFGSSTLPTANRMDVAPIEVGARVANDAPSFIPTNRPVRLGELVPDSALQAEGYAPGALAVPFRVSPDLYTWRDRPY
  • CesC gene (SEQ ID NO: 6, positions 4748-8728 in the operon) CesC protein (SEQ ID NO: 7) MNRRYALSLSGALLASSCMTVLVAVPVARAQQASTAVTSTAASPAAAPRQILLQQARFWLQQQQYDNARQALQNAQRIAPDAPDVLEVEGEYQAAVGNREAAADTLRHLQQVAPASTAVSNLSDLLSERAISQSDLSQIRSLAGSGQNAQAVAGYQKLFHGGKPPRSLAVEYYQTMAGVPTQWDQARAGLAGIVASNPQNYRAQLAFAQALTYNTSTRMEGLTRLKDLQSFQSQAPVEAAAATQSYRQTLSWLPVNPDTQPLMEQWLSAHPNDAALREHMLHPPGGPPDKAGLARQAGYQQLNAGRLSAAEQSFQSALQINSHDADSLGGMGLVSMRQGDTAEAHRYFEEAMAADPKTADRWRPALAGMAVSGDYAAVRQLIAAHQYTE
  • CesD gene (SEQ ID NO: 8, positions 8728-9198 in the operon) atgacaactttgaacgcaaaaccggacttttcgcttttcctgcaggcactgtcctgggagatcgatgatcaggccgggatcgaggtcaggaatgacctgttgcgcgaggtcggccggggtatggctggtcgtttccagcccgctgtgcaacaccatccaccaccagctccagatcgagctgaacgccctgctggccatgatcaactggggctacgtaaagctggacctgctggcggaagaacaggccatgcgcatcgtgcatgaagacctgccgcaggtgggcagcgcgaacccgccggcaggcgaacccgccggcacatggcttgcccggt
  • the vector for producing cellulose of the present invention can be prepared, for example, by inserting the Ces gene into a vector serving as a backbone (hereinafter also referred to as “basic vector”) so as to satisfy the above conditions.
  • the promoter may be, for example, a promoter of the basic vector, or may be a promoter inserted into the basic vector separately. In the former case, for example, the upstream sequence and the Ces gene may be inserted downstream of the promoter with respect to the basic vector.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in the host into which the cellulose production vector of the present invention is introduced, for example.
  • the high expression promoter include TDH3p, TPI1p, PGK1p, PGI1p, PYK1p, ADH1p and the like.
  • the type of the basic vector is not particularly limited, and examples thereof include a plasmid derived from E. coli and a plasmid derived from yeast.
  • the plasmid derived from E. coli is, for example, pQE system (pQE-80L, pQE-60 and pQE-30L etc.), pEX system, pBR system (pBR322 etc.), pUC system (pUC18, pUC19, pUC118 and pUC119 etc.), pBAD PGEX, pFLAG, pBluescript, pET vector, pCold vector, and the like.
  • yeast-derived plasmid examples include a multicopy type (YEp type), a single copy type (YCp type), a chromosome integration type (YIp type), and the like.
  • the YEp type vector is, for example, YEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983), and the YCp type vector is, for example, YCp50 (M.D. Rose et al., Gene, 60, 237, 1987),
  • YIp type vectors include, for example, YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the basic vector is preferably a plasmid derived from E. coli, more preferably the pQE plasmid, and further preferably pQE-80L.
  • the cellulose production vector of the present invention may further have, for example, a regulatory sequence that regulates the expression of the Ces gene.
  • the regulatory sequence only needs to function in the host into which the cellulose production vector of the present invention is introduced. Examples thereof include a terminator, an enhancer, a polyadenylation signal sequence, and an origin of replication sequence (ori).
  • a regulatory sequence for example, a sequence provided in advance in the basic vector may be used, or the regulatory sequence may be further inserted into the basic vector, or the regulatory sequence provided in the basic vector may be changed to another sequence. It may be replaced with a regulatory sequence.
  • the arrangement of the regulatory sequence is not particularly limited as long as it is arranged so that the expression of the Ces gene can be functionally controlled, and is performed based on a known method. Can do.
  • the cellulose production vector of the present invention may further have a selection marker coding sequence, for example.
  • the selection marker include an auxotrophic marker, a resistance marker such as drug resistance, a fluorescent protein marker, an enzyme marker, and a cell surface receptor marker.
  • the auxotrophic marker include URA3 gene and LEU2 gene.
  • the drug resistance marker include markers such as hygromycin resistance, zeocin resistance, and geneticin resistance.
  • CUP1 copper resistance gene (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the transformant of the present invention includes the cellulose production vector of the present invention.
  • the transformant of the present invention is not particularly limited as long as the cellulose production vector of the present invention is introduced so that the Ces gene can be expressed.
  • the transformant of the present invention can easily produce cellulose by expressing the cellulose production vector of the present invention together with the dgc gene. Therefore, the transformant of the present invention preferably further has a dgc gene, and specifically, preferably further includes a vector having the dgc gene.
  • the dgc gene may be, for example, included in the cellulose production vector of the present invention, but is preferably included in a vector independent of the cellulose production vector of the present invention.
  • the vector having the dgc gene is also referred to as a dgc gene expression vector.
  • the dgc gene is a gene known as a cyclic-di-guanylmonophosphate (c-di-GMP) synthase gene.
  • the organism from which the dgc gene is derived is not particularly limited. Examples of the organism include archaea and eubacteria, thermophilic bacteria belonging to any of these. Examples of the eubacteria include Escherichia coli, Salmonella, Vibrio cholerae and the like.
  • thermophile is not particularly limited, and examples thereof include Pyrococcus genus, Methanopyrus genus, Thermococcus genus, Thermotoga genus, Pyrolovus genus, Brucanisaeta genus, Haloacula genus, Methanocera genus, Thermus genus, etc., preferably The genus Thermotoga.
  • the thermophile belonging to the genus Thermotoga is not particularly limited, and examples thereof include Thermotoga maritima.
  • the base sequence of the dgc gene and the amino acid sequence of the protein encoded by these are shown in SEQ ID NOs: 10-15.
  • the dgc gene is not limited to this sequence.
  • the SoDGC shown below is a c-di-GMP synthase derived from Shewanella oneidensis
  • tDGC is a c-di-GMP synthase derived from Thermotoga maritima , tDGC / K82 + R158A. Is a tDGC lacking the N-terminal 1-81th amino acid and having a point mutation of R158A.
  • SoDGC gene (SEQ ID NO: 10) SoDGC protein (SEQ ID NO: 11) MSRDLLQTAALNLKKAVPLMLKHQIPTTPINYALWYTYVGEQNLALNAQLDTVIAHYNTCPPVSSELLYRQYVADPVELNVRDMRLNLEAMATELSQSIKDTSLDTTEFQTCINSNFSKLNGIEEGALSVEQVLDLVRNLVKESDNIRSSTEFLTTQLQKAQTEIDALKQKLEKTEKDVLYDALTGCLNRRAFDADIAGMIAQAPEGTCLILVDIDHFKAFNDNYGHQLGDQVLKAVAKRLQEACRDGSKLYRFGGEEFAIIVPKSQLRITRQLAEAMRRGLEKLCLKDRRKDQLVDNITASFGVAQWQERQSVVQLIEKTDKLLYEAKRLGRNRVMPINN
  • tDGC gene SEQ ID NO: 12
  • tDGC protein SEQ ID NO: 13
  • the transformant of the present invention can be obtained, for example, by introducing the cellulose production vector of the present invention into a host.
  • the transformant of the present invention can be obtained, for example, by introducing the dgc gene, specifically, the dgc gene expression vector.
  • the order in which the cellulose production vector of the present invention and the dgc gene expression vector are introduced is not particularly limited, and either may be the first or simultaneous.
  • the host is not particularly limited and can be appropriately selected.
  • Examples of the host include microorganisms, animal cells, insect cells, plant cells, or cultured cells thereof.
  • Examples of the microorganism include prokaryotes and eukaryotes.
  • the prokaryotes for example, E. coli (Escherichia coli) Escherichia genus such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) Bacillus such as, Pseudomonas such as Pseudomonas putida (Pseudomonas putida), Rhizobium meliloti (Rhizobium meliloti), such as Examples include bacteria of the genus Rhizobium.
  • Examples of the eukaryote include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe .
  • Examples of the animal cells include COS cells and CHO cells, and examples of the insect cells include Sf9 cells and Sf21 cells.
  • Said host is preferably E. coli.
  • the method for introducing a vector or gene into the host is not particularly limited, and can be performed by a known method.
  • the introduction method can be appropriately set depending on, for example, the type of the host.
  • Examples of the introduction method include introduction method using gene gun such as particle gun, calcium phosphate method, polyethylene glycol method, lipofection method using liposome, electroporation method, ultrasonic nucleic acid introduction method, DEAE-dextran method, micro glass tube, etc.
  • Examples include a direct injection method using a hydrogel, a hydrodynamic method, a cationic liposome method, a method using an introduction aid, and a method using Agrobacterium.
  • Examples of the liposome include lipofectamine and cationic liposome, and examples of the introduction aid include atelocollagen, nanoparticles, and polymers.
  • a method for confirming whether or not the vector has been introduced into the host is not particularly limited, and a known method can be used.
  • Known methods include, for example, a method using each of the selection markers possessed by the vector, a PCR method, a Southern hybridization method, a Northern hybridization method, and the like.
  • the method for producing cellulose of the present invention includes a step of culturing a transformant containing the vector for producing cellulose of the present invention and the dgc gene.
  • the present invention is characterized by using the transformant of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited. According to the present invention, for example, cellulose can be easily synthesized without using a special substrate.
  • the cellulose to be produced is not particularly limited, and examples thereof include cellulose I, cellulose II, and cellulose III, and cellulose II is preferable.
  • the transformant of the present invention described above can be used as the transformant, and specific examples include a transformant having the cellulose production vector of the present invention and the dgc gene.
  • the dgc gene may be introduced as the dgc gene expression vector as described above.
  • the type of the medium is not particularly limited and can be appropriately selected according to the host of the transformant.
  • the host is Escherichia coli
  • examples thereof include media such as LB, 2xYT, and TB.
  • the transformant of the present invention can synthesize cellulose even under a condition where a substrate such as glucose is not added as a foreign substrate.
  • biomass can also be used as a raw material for the medium.
  • the culture conditions in the culture step are not particularly limited and can be appropriately selected according to the host.
  • the host is Escherichia coli
  • known conditions for culturing Escherichia coli can be employed.
  • the culture temperature is, for example, 4 to 40 ° C., preferably 4 to 30 ° C.
  • the culture time is not particularly limited, and is, for example, 2 to 24 hours, preferably 5 to 12 hours.
  • the cellulose production method of the present invention may further include an extraction step of extracting cellulose from the culture obtained by the culture step.
  • the extraction step may include, for example, a separation step of a solid fraction and a liquid fraction, a purification step of cellulose from the solid fraction or the liquid fraction, and the like.
  • the cellulose synthesized by culturing the transformant of the present invention is insoluble, for example, in the purification step, it is preferable to purify the cellulose using the solid fraction, and in the case of water solubility, the purification step In the above, it is preferable to purify cellulose using the liquid fraction.
  • the synthesized cellulose is, for example, released to the outside of the cells, but the cellulose retained in the cells is recovered and purified by destroying the transformed transformant contained in the solid fraction. May be.
  • the separation step can be performed, for example, by centrifugation, filtration, or the like.
  • the purification step include a step of acid-treating the solid fraction collected in the separation step.
  • purification process may also include the process of further alkali-treating the solid fraction after the said acid treatment, for example.
  • the present invention is expected to be used as a platform that enables the production of cellulose having completely different properties, such as cellulose having extremely high hydrophobicity, by using the above-described cellulose production vector. it can.
  • the cellulose of the present invention is obtained by the method for producing cellulose of the present invention as described above.
  • the cellulose of the present invention is characterized by being obtained by the method for producing cellulose of the present invention, and other configurations are not particularly limited.
  • Example 1 (1) CesA gene, CeSb gene, from subcloning RIKEN BRC of CesC gene and CesD genes were obtained Gluconacetobacter xylinus (Gluconacetobacter xylinus) JCM9730 strain.
  • the strain corresponds to the BPR2001 strain whose sequence of the cellulose synthase gene group has been identified (Nakai T .; Moriya A .; Tonouchi N .; Tsuchida T .; Yoshinaga F .; Horinouchi S .; Sone Y. Mori H .; Sakai F .; Hayashi T., "Control of expression by the cellulose synthase (bcsA) promoter region from Acetobacter xylinum BPR 2001" Gene 213, 93-100 (1998)).
  • the strain is cultured in SH medium (Schramm M .; Hestrin S., “Factors affecting production of cellulose at the air / liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum” J. Gen. Microbiol. 11, 123-129 (1954)).
  • genomic DNA was extracted from the obtained cells using a commercially available kit (manufactured by Invivogene).
  • the target gene was amplified by PCR using a kit.
  • AmpliTaq Gold Applied Biosystems
  • LA Taq Takara
  • PrimeStar GXL Takara
  • the obtained amplification product was inserted into the pGEM-T easy vector (Promega) by TA-ligation.
  • TA-ligation was performed after A-tailing with Taq (Takara).
  • Table 1 below shows the relationship between the primers used in PCR and the prepared subcloning vector.
  • Vector # a13 was prepared by ligating fragments from vector # a10 and vector # a12 to vector # a8.
  • FIG. 1 shows the region of the CesABCD gene derived from glucone Acetobacter xylinus JCM9730 introduced into each vector.
  • the DNA sequence of the target gene was confirmed, and the DNA fragment was excised from the subcloning vector by restriction enzyme treatment and inserted into an expression vector by ligation reaction.
  • agarose gel electrophoresis is performed after the restriction treatment, the gel is stained with Mupid Blue (advanced), a band of a desired size is cut out, and a gel extraction kit (Qiagen) is used to obtain a DNA fragment of the target gene. Isolated.
  • Ligation reaction of the obtained DNA fragment was performed using DNA Ligation kit ver. 2.1 (Takara) or DNA ligation kit LONG (Takara) was used.
  • FIG. 2 shows a procedure for constructing a CesAB expression system that expresses CesA and CesB.
  • EV # 20 was treated with AgeI and KpnI, and the AgeI-XhoI fragment of vector # a4 (about 1400 bp) and the XhoI-KpnI fragment of vector # a7 (about 1050 bp) were ligated simultaneously. Thereby, CesAB expression system EV # 21 expressing CesA and CesB was produced.
  • EV # 21 was treated with EcoRI, and the resulting vector fragment (about 9000 bp) was dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment, and then the EcoRI fragment (about 600 bp) of vector # a1 was ligated.
  • the CesA gene (SEQ ID NO: 2) and the CesB gene (SEQ ID NO: 4) were introduced, and a CesAB expression system EV # 51 expressing CesA and CesB was produced.
  • the fragment insertion direction was confirmed by PCR.
  • EV # 51 was treated with BamHI and HindIII, and the BamHI-HindIII fragment (about 500 bp) of EV # 32 was ligated to the obtained vector fragment (about 9000 bp).
  • the CesA gene (SEQ ID NO: 2) and the CesB gene (SEQ ID NO: 4) were introduced, and a CesAB expression system EV # 53 that expresses CesA and CesB with a His tag at the C-terminus was prepared.
  • the CesA gene was located upstream of the CesB gene, and the length between the T5 promoter derived from pQE-80L and the CesA gene was 29 bases long.
  • the sequence from the promoter to the 5 'region of the CesA gene is shown below.
  • the underlined portion on the 5 ′ side is the promoter region
  • the ununderlined region is a sequence derived from pGEM-T easy brought from the EcoRI site and the subcloning vector # a1.
  • the enclosed region is the upstream sequence (13 base length) upstream of the start codon of CesA gene derived from gluconacetobacter xylinus
  • the underlined portion on the 3 ′ side is the start codon of CesA gene.
  • Vector # a8 was treated with XmaI and SpeI, and this was treated with an XmaI-AgeI fragment (about 1600 bp) of vector # a10 and an AgeI-SpeI fragment (about 1800 bp) of vector # 12. And ligated at the same time. Thereby, vector # a13 was produced. Vector # a13 contains from the 3 ′ region of CesB to the full length of CesC and the 3 ′ end of CesD.
  • EV # 53 was treated with BamHI and HindIII, and the resulting vector fragment (about 9000 bp) was combined with a BamHI-SacII fragment (about 2150 bp) of vector # a13 and a SacII-HindIII fragment (about 2300 bp) of EV # 59. And ligated at the same time.
  • the CesA gene SEQ ID NO: 2
  • the CesB gene SEQ ID NO: 4
  • the CesC gene SEQ ID NO: 6
  • CesABC expression system that expresses CesA, CesB, and CesC with a His tag at the C-terminus.
  • EV # 63 was produced.
  • the BamHI-SacII fragment of the vector a # 13 instead of the BamHI-SacII fragment of the vector a # 13, the BamHI-XhoI fragment (about 2700 bp) of the vector a # 13, the XhoI-HindIII fragment of the vector a # 16 instead of the SacII-HindIII fragment of the EV # 59 ( Ligation was performed in the same manner except that about 1700 bp) was used.
  • the CesA gene SEQ ID NO: 2
  • the CesB gene SEQ ID NO: 4
  • the CesC gene SEQ ID NO: 6
  • the CesA gene, the CesB gene, and the CesC gene were arranged from the upstream side, and the length between the T5 promoter derived from pQE-80L and the CesA gene was 29 bases long.
  • the sequence from the promoter to the 5 'region of the CesA gene is the same as in EV # 53.
  • the CesA gene (SEQ ID NO: 2), the CesB gene (SEQ ID NO: 4), the CesC gene (SEQ ID NO: 6) and the CesD gene (SEQ ID NO: 8) are introduced, and CesABCD expressing CesA, CesB, CesC and CesD An expression system EV # 79 was produced.
  • ligation was performed in the same manner except that the vector # a15 was used instead of the vector # a14.
  • the CesA gene SEQ ID NO: 2
  • the CesB gene SEQ ID NO: 4
  • the CesC gene SEQ ID NO: 6
  • the CesD gene SEQ ID NO: 8
  • the His tag at the CesA, CesB, CesC, and C-terminus.
  • a CesABCD expression system EV # 80 that expresses CesD marked with is prepared.
  • a CesA gene, a CesB gene, a CesC gene, and a CesD gene are arranged from the upstream side, and the length between the TQ promoter derived from pQE-80L and the CesA gene is 29 bases long It became.
  • the sequence from the promoter to the 5 'region of the CesA gene is the same as in EV # 53.
  • dgc gene Thermotoga maritime MSB8 (NBRC 100826) was obtained from NBRC (NITE, Japan).
  • the dgc gene has an accession number TM1788 (Gene ID: 897742) (Rao F .; Pasunooti S .; Ng Y .; Zhuo W .; Lim L .; Liu A.W .; Liang Z.-., “Enzymatic synthesis of c-di-GMP using a thermophilic diguanylate cyclase "Anal. Biochem. 389, 138-142 (2009)). The obtained amplification product was inserted into the pGEM-T easy vector by TA-ligation to prepare vector # b1.
  • a point mutation R158A was introduced by PCR (using Takara, PrimeStar GXL) by the QuikChange (Qiagen) protocol to prepare a vector # b2 into which the dgc gene (SEQ ID NO: 14) was introduced.
  • FIG. 3 shows a procedure for constructing a dgc expression system that expresses DGC.
  • PCR using Takara, PrimeStar GXL
  • the obtained amplification product was inserted into pBAD202 / D-TOPO (Invitrogen) by TOPO cloning reaction to prepare pBAD202 / D-tDGC.
  • Primer SEQ ID NO: 47
  • oligonucleotides shown below were inserted into the pBAD202 / D-TOPO by the TOPO reaction to obtain pBAD202 / R. Then, pBAD33 distributed from BBRP (NIG, Japan) was treated with MluI and HindIII, and the resulting vector fragment was ligated with the MluI-HindIII fragment (about 600 bp) of pBAD202 / R and DNA ligation kit ver2.1. And ligated. This produced pBAD33 / 202R. Oligonucleotide 5'-CACCGAATTCGTCGACGGTACCGCTAGC-3 '(SEQ ID NO: 48) 5'-GCTAGCGGTACCGTCGACGAATTC-3 '(SEQ ID NO: 49)
  • the pBAD33 / 202R was treated with MluI and SacI, and the resulting vector fragment was ligated with the MluI-SacI fragment (about 1100 bp) of pBAD202 / D-tDGC using Takara DNA ligation kit ver2.1.
  • the dgc gene SEQ ID NO: 14 was introduced, and pBAD33 / 202-tDGC expressing DGC was prepared.
  • Each transformant was cultured in a 2 ⁇ YT medium (pH 7) medium containing 0.2% L-arabinose and 0.4 mmol / L isopropylthiogalactoside (IPTG) at a temperature of 28 ° C. for 5 hours. .
  • the obtained culture solution was subjected to the following treatment to prepare a sample, and the cellulose analysis described later was performed.
  • the culture solution was centrifuged under conditions of 7,500 g, and the precipitate containing the bacterial cells was collected. After suspending the precipitate in water, a 4-fold volume of a mixed solution of acetic acid 8: nitric acid 1 was added to the suspension and treated at 100 ° C. for 30 minutes. This treatment solution was centrifuged to collect the precipitate, and the precipitate was washed until the supernatant after centrifugation became neutral.
  • FIG. 4 shows the result of negative staining observation
  • (A) shows the result of low magnification observation
  • (B) shows the result of high magnification observation.
  • the scale bar indicates 10 ⁇ m
  • the scale bar indicates 100 nm.
  • 5 is a photograph of an electron diffraction pattern
  • FIG. 6 is an infrared spectrum
  • Native BC is a cellulose I type standard sample
  • Mercerized BC is a cellulose II type standard sample
  • EC-Synthesized is an example. The result of the sample is shown.
  • FIG. 4 an aggregate having a size of 10 to 20 nm was confirmed.
  • the diffraction rings of 110 and 020 characteristic to the cellulose II crystal were confirmed.
  • the sample (EC-Synthesized) was confirmed to have the same pattern as type II cellulose (Mercerized BC). From these results, it was confirmed that type II cellulose was contained in the sample, that is, type II cellulose was biosynthesized by culturing the transformant. Similar results were obtained for samples obtained from transformants into which other Ces expression vectors were introduced. It was also found that when the expression vector into which the Ces gene was inserted did not satisfy the conditions of the present invention, protein expression could hardly be confirmed, so that cellulose synthesis could not be performed.
  • Example 2 In the present Example, it confirmed that the transformant which introduce
  • the transformant was cultured under the condition of a temperature of 28 ° C. using a 2 ⁇ YT medium (pH 7) medium.
  • L-arabinose and IPTG were added so as to give 0.2% L-arabinose and 0.4 mmol / L IPTG, and further cultured at a temperature of 28 ° C. for 6-7 hours.
  • a precipitate containing the cells was collected at 5000 g.
  • the liquid mixture whose volume ratio is acetic acid 8: nitric acid 1 was added to the precipitation containing the said microbial cell, and it processed at 100 degreeC for 30 minutes.
  • the treatment liquid was centrifuged to recover the cellulose precipitate, and the cellulose precipitate was washed until the centrifuged supernatant became neutral. After the washing, the cellulose precipitate was freeze-dried and the presence or absence of cellulose was visually confirmed.
  • Control 1 was the same except that the CesA expression system EV # 98 was used instead of the CesAB expression system EV # 51, and Control 2 was the same except that only the dgc expression system vector was used. The presence or absence of cellulose was confirmed visually.
  • the CesA expression system EV # 98 was prepared by treating EV # 20 with EcoRI and ligating the EcoRI fragment (about 600 bp) of the vector a # 01.
  • Example 3 the culture solution of the transformant introduced with the CesAB expression system was subjected to cellulase treatment, and it was confirmed that cellulose was synthesized.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a culture solution of the transformant was produced. Next, the culture solution was used as a sample and mounted on a nickel grid covered with a carbon film. The nickel grid after mounting was washed with TBS (Tris buffered Saline) and water, and dried for 5 minutes. Further, the nickel grid was floated on a buffer solution (50 mmol / L MES-NaOH, pH 5.6) containing 0.5% cellulase (trade name: Celluclast 1.5 L, Novozyme), and the mixture was incubated at 45-50 ° C. for 1 hour. Processed. The nickel grid after the treatment was washed with water, and negative staining observation with 2% uranium acetate was performed in the same manner as in Example 1. The same sample was subjected to negative staining observation in the same manner except that the buffer solution containing no cellulase was used instead of the buffer solution containing the cellulase.
  • TBS Tris buffered Saline
  • FIG. 7 shows the result of negative staining observation.
  • the upper row is the result of the cellulase-untreated sample
  • the lower row is the result of the cellulase-treated sample
  • the left row is the result of low magnification observation
  • the right row is the result of high magnification observation. is there.
  • the scale bar indicates 2000 nm
  • the scale bar indicates 200 nm.
  • the cellulose fiber structure was observed at any magnification in the cellulase-untreated sample, while on the other hand, as shown in the lower photograph, at any magnification, the cellulase-treated sample. Also, the fiber structure of cellulose was not observed. From these results, it was found that cellulose was synthesized by culturing the transformant.
  • FIG. 8 shows the Ces expression system used in this example.
  • the control expression system EV # 43 is a comparative expression vector having no upstream sequence
  • the CesAB expression system EV # 49-EV # 52 is an example expression vector having an upstream sequence. It is.
  • the lengths of the upstream sequences of the control expression system EV # 43 and the CesAB expression systems EV # 49-EV # 52 are 0, 21, 24, 13, and 70 base lengths, respectively, and the spacer sequences are respectively long.
  • the lengths are 27, 6, 6, 16, 16 bases, and the lengths between the promoter and the CesA gene (start codon) are 27, 27, 30, 29, and 86 bases, respectively.
  • a control expression system EV # 43 and a CesAB expression system EV # 49, EV # 50 and EV # 52 were prepared.
  • the CesAB expression system EV # 51 of Example 1 was used as the CesAB expression system EV # 51.
  • a DNA fragment amplified by PCR was ligated to pGEM-T easy in the same manner as in Example 1 (1) except that primer # a4 and primer # a26-29 described below were used, and vector # a17- # a20 was produced.
  • the primers used for PCR are shown below.
  • a control expression system EV # 43 was prepared in the same manner as in Example 1 (2-4) except that the EcoRI fragment (about 600 bp) of vector # a17- # a20 was used instead of the EcoRI fragment of vector # a1. And CesAB expression system EV # 49, 50 and 52 were produced.
  • the CesA gene is located upstream of the CesB gene, and T5 derived from pQE-80L.
  • the length between the promoter and the CesA gene was 27, 27, 30, 29 and 86 bases in length, respectively.
  • the sequence from the promoter to the 5 'region of the CesA gene is shown below.
  • the underlined portion on the 5 ′ side is the promoter region
  • the ununderlined region is the pQE-80L vector, EcoRI site, or EcoRI site and pGEM brought from the subcloning vector pGEM-T easy -A sequence derived from T easy
  • the region surrounded by a square is the upstream sequence (lengths of 0, 21, 24, 13 and 70 bases, respectively) upstream of the start codon of the CesA gene derived from Gluconacetobacter xylinus
  • the underlined part on the 3 ′ side is the start codon of the CesA gene.
  • the cultured transformant is collected and suspended in a lysis buffer (10 mmol / L Tris-HCl (pH 8), 5 mmol / L EDTA, 0.02% NaN 3 , 50 ⁇ g / mL chloramphenicol).
  • SDS-PAGE sample buffer was added to prepare a sample for SDS-PAGE having a final concentration of 50 mM Tris-HCl (pH 8), 10% glycerin, 0.5% SDS, and this was subjected to SDS-PAGE.
  • CesA protein and CesB protein were detected using the polyclonal anti-CesA antibody and the polyclonal anti-CesB antibody described in Reference 1, respectively.
  • the negative control detected CesA protein and CesB protein similarly except collect
  • Reference 1 Carbohydrate Research 346, 2760-2768 (2011)
  • FIG. 9 is a photograph of Western blotting showing the expression of CesB protein.
  • the left side of the photograph shows the molecular weight of the molecular weight marker, and the upper side of the photograph shows the expression vector used for transformation and the type of sample.
  • Example 5 In this example, a CesB expression system, a control expression system, and a CesAB expression system are used. For normal CesB protein expression, co-expression of CesA protein and CesB protein and the upstream sequence of the 5′-side gene are required. It was confirmed.
  • a sample (- ⁇ ME sample) was prepared in the same manner as in Example 4 (2) except that only the CesAB expression system # 51 was used as the Ces expression system vector and IPTG was added to 0.2 mmol / L. . Further, ⁇ mercaptoethanol was added to the sample to 1% to prepare a + ⁇ ME sample in which disulfide bonds were reduced. And the expression of CesB protein was detected like the said Example 4 (2).
  • Control 1 uses acetic acid bacteria that express normal CesA protein and normal CesB protein instead of transformants
  • control 2 uses CesB expression system # 32 instead of CesAB expression system # 51.
  • the control 3 was prepared by using the control expression system EV # 43 instead of the CesAB expression system # 51, and preparing a - ⁇ ME sample and a + ⁇ ME sample in the same manner. Detected.
  • FIG. 10 is a photograph of Western blotting
  • A is a photograph showing the expression of CesB protein in the ⁇ ME sample
  • B is a photograph showing the expression of CesB protein in the + ⁇ ME sample.
  • 10 (A) and (B) the left side of the photograph shows the molecular weight of the molecular weight marker, and each lane shows, from the left, acetic acid bacteria, CesB expression system # 32, control expression system EV # 43, CesAB expression system #. 51 results are shown.
  • cellulose is easily produced by co-expressing the cellulose production vector and the dgc gene in a transformant obtained by introducing the cellulose production vector of the present invention into a host. it can. Moreover, since cellulose can be produced by biosynthesis of the transformant, it is not necessary to use pulp as a raw material as in the prior art, and the environmental burden due to the use of natural raw materials can be avoided. Therefore, the present invention can be said to be a useful technique for various industries using cellulose as a raw material.

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Abstract

　セルロースを簡便かつ廉価に製造する方法を提供する。　プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５'側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５'側遺伝子の由来生物における前記５'側遺伝子の上流配列を有するセルロース製造用ベクターを使用する。そして、前記セルロース製造用ベクターを導入した形質転換体を培養し、前記ベクターとｄｇｃ遺伝子とを共発現させることによって、前記形質転換体によりセルロースを生合成できる。

Description

セルロース製造用発現ベクター、形質転換体およびセルロースの製造方法
　本発明は、セルロース製造用発現ベクター、形質転換体およびセルロースの製造方法に関する。
　セルロースは、様々な産業における有用な原材料として、長年利用されている。セルロースは、グルコースが重合した直鎖の高分子であり、その分子鎖の凝集形態によって、Ｉ型およびII型等の結晶構造に分類できる。天然セルロースは、Ｉ型の結晶構造を有するセルロースＩと呼ばれ、一般に、紙および衣服の材料として使用されている。また、再生セルロースは、II型の結晶構造を有するセルロースIIと呼ばれ、独特の風合いおよび高親水性を有することから、付加価値が高く、一般に、セロファンおよびレーヨンの材料として使用されている。しかし、天然セルロースは、通常、天然木材から得られるパルプを原料とするため、森林等の天然資源の保存の観点から、パルプ原料を使用しない方法の開発が求められている。さらに、再生セルロースは、前記天然セルロースを高濃度のアルカリ溶液に浸漬して製造されるため、環境への負荷およびコストが高いという問題もある。
　一方、遺伝子工学の発展に伴い、セルロースの製造方法として、前述のような天然物からの調製ではなく、組換え技術によって、微生物にセルロースを合成させる方法が研究されている。具体例として、例えば、酢酸菌のセルロース合成酵素遺伝子ｂｃｓＡＢをシアノバクテリアに導入し、その形質転換体によってセルロースを製造する方法が、報告されている（非特許文献１）。しかしながら、この方法では、前記遺伝子をシアノバクテリアのゲノムＤＮＡに導入するため、手間と時間を要し、収量が低いという問題もある。したがって、セルロースを簡便かつ廉価に製造する方法の提供が、強く求められている。
Transgenic　expression　of　Gluconacetobacter　xylinus　strain　ATCC　53582　cellulose　synthase　genes　in　the　cyanobacterium　Synechococcus　leopoliensis　strain　UTCC　100"，　Cellulose　15，　691－701(2008)
　そこで、本発明は、様々な物性を持つセルロースを簡便かつ廉価に製造する方法の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明のセルロース製造用ベクターは、プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有することを特徴とする。
　本発明の形質転換体は、前記本発明のセルロース製造用ベクターを含むことを特徴とする。
　本発明のセルロースの製造方法は、前記本発明のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする。
　本発明のセルロースは、前記本発明のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする。
　本発明によれば、前記本発明のセルロース製造用ベクターを宿主に導入した形質転換体において、前記セルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを共発現することによって、簡便にセルロースを製造できる。また、前記形質転換体の生合成によってセルロースを製造できるため、従来のように、パルプを原料として使用する必要がなく、天然原料の使用による環境への負荷も回避できる。したがって、本発明は、セルロースを原料とする様々な産業に有用な技術といえる。
実施例１において、ＣｅｓＡＢＣＤ遺伝子の発現系構成を示す概略図である。 実施例１において、ＣｅｓＡＢ発現系の構築の手順を示す図である。 実施例１において、ｄｇｃ発現系の構築の手順を示す図である。 実施例１において、サンプルの負染色観察の結果を示す写真である。 実施例１において、サンプルの電子回折の結果を示す写真である。 実施例１において、サンプルの赤外スペクトルを示すグラフである。 実施例３において、サンプルの負染色観察の結果を示す写真である。 実施例４において、Ｃｅｓ発現系の上流配列およびスペーサー配列の長さを示す図である。 実施例４において、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。 実施例５において、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
（１）セルロース製造用ベクター
　本発明のセルロース製造用ベクターは、前述のように、プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有することを特徴とする。以下、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の遺伝子を、５’側遺伝子、下流側の遺伝子を、３’側遺伝子ともいう。
　前記上流配列の長さは、下限が、例えば、１３塩基長であり、好ましくは１６塩基長であり、より好ましくは２１塩基長であり、上限が、例えば、１００塩基長であり、好ましくは７０塩基長であり、より好ましくは２４塩基長であり、その範囲は、例えば、１３～１００塩基長であり、好ましくは１３～７０塩基長であり、より好ましくは１３～２４塩基長である。なお、本発明において、数値範囲の記載は、その範囲内に含まれる値の開示も意味する。すなわち、例えば、１～３個の記載は、１個、２個および３個の開示を意味する。
　前記上流配列は、例えば、前記５’側遺伝子の開始コドンに、直接的に連結してもよいし、スペーサー配列を介して間接的に連結してもよく、好ましくは前者である。また、前記上流配列は、例えば、前記プロモーターの３’末端に、直接的に連結してもよいし、スペーサー配列を介して間接的に連結してもよい。
　前記上流配列は、前述のように、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流の配列であればよく、特に制限されない。前記上流配列は、例えば、前記５’側遺伝子の由来生物において、前記５’遺伝子の開始コドンに連結する上流配列であり、具体的には、前記開始コドンに直接連結する上流配列であることが好ましい。
　前記上流配列は、例えば、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子の発現に関与する機能的な配列を含んでもよい。具体例として、前記上流配列は、例えば、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはその部分配列を有する配列があげられる。前記上流配列は、例えば、ＲＢＳのみからなる配列でもよいし、ＲＢＳを含む配列でもよいし、前記部分配列のみからなる配列でもよいし、前記部分配列を含む配列でもよい。
　前記ＲＢＳの部分配列は、例えば、配列番号１６の塩基配列（GGACGAGCTATT）があげられる。前記上流配列は、例えば、配列番号１６の塩基配列からなる配列でもよいし、前記塩基配列を含む配列でもよい。
　前記上流配列が、例えば、配列番号１６の塩基配列を含む場合、前記塩基配列は、前記上流配列における３’領域の配列であることが好ましく、この場合、前記上流配列は、例えば、前記塩基配列の３’末端が、前記５’側遺伝子の開始コドンと連結していることが好ましい。
　前記プロモーターと前記開始コドンとの間の長さは、特に制限されない。前記長さの下限は、例えば、１３塩基長であり、好ましくは２７塩基長であり、より好ましくは２９塩基長であり、前記長さの上限は、例えば、１００塩基長であり、好ましくは８６塩基長、より好ましくは７０塩基長であり、さらに好ましくは３０塩基長であり、前記長さの範囲は、例えば、１３～１００塩基長であり、好ましくは１３～８６塩基長であり、より好ましくは１３～８６塩基長であり、さらに好ましくは２７～８６塩基長または２９～８６塩基長である。
　前記プロモーターと前記開始コドンとの間に前記スペーサー配列を有する場合、前記スペーサー配列の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１塩基長であり、好ましくは６塩基長であり、上限は、例えば、１００塩基長であり、好ましくは１６塩基長であり、その範囲は、例えば、１～１００塩基長であり、好ましくは６～１６塩基長ある。前記プロモーターと前記上流配列との間に前記スペーサー配列を有する場合、前記スペーサー配列の長さは、例えば、このような範囲があげられる。
　本発明において、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子の順序は、特に制限されない。本発明のセルロース製造用ベクターは、前記両遺伝子を、例えば、上流側から、以下の順序で有してもよい。［Ａ］は、ＣｅｓＡ遺伝子を示し、［Ｂ］は、ＣｅｓＢ遺伝子を示す（以下、同様）。
［Ａ］－［Ｂ］
［Ｂ］－［Ａ］
本発明は、中でも、［Ａ］－［Ｂ］すなわち、上流から、ＣｅｓＡ遺伝子－ＣｅｓＢ遺伝子の順で有することが好ましい。前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子は、例えば、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。本発明は、例えば、上流に位置する前記プロモーターによって両遺伝子の発現が共に制御されるように、機能的に連結されていることが好ましく、具体例として、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子が一つのオペロンを形成してもよい。
　本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、さらに、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子の少なくとも一方を有してもよく、具体的には、両方を有してもよいし、いずれか一方のみを有してもよい。本発明のセルロース製造用ベクターは、前記各遺伝子を、例えば、上流から、以下の順序で有してもよい。［Ｃ］は、ＣｅｓＣ遺伝子を示し、［Ｄ］は、ＣｅｓＤ遺伝子を示す（以下、同様）。
［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］
［Ａ］－［Ｂ］－［Ｃ］－［Ｄ］
［Ａ］－［Ｂ］－［Ｄ］
［Ａ］－［Ｂ］－［Ｄ］－［Ｃ］
［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］
［Ｂ］－［Ａ］－［Ｃ］－［Ｄ］
［Ｂ］－［Ａ］－［Ｄ］
［Ｂ］－［Ａ］－［Ｄ］－［Ｃ］
前記ＣｅｓＡ遺伝子、前記ＣｅｓＢ遺伝子、前記ＣｅｓＣ遺伝子および前記ＣｅｓＤ遺伝子は、例えば、隣接する遺伝子がそれぞれ、直接的に連結してもよいし、間接的に連結してもよい。本発明は、例えば、上流に位置する前記プロモーターによって各遺伝子の発現が共に制御されるように、機能的に連結されていることが好ましく、具体例として、各遺伝子が一つのオペロンを形成してもよい。
　前記ＣｅｓＡ遺伝子、前記ＣｅｓＢ遺伝子、前記ＣｅｓＣ遺伝子および前記ＣｅｓＤ遺伝子は、セルロース合成酵素遺伝子として公知の遺伝子であり、例えば、酢酸菌等の細菌において、これらの遺伝子が一つのオペロンを形成していることが知られている。前記ＣｅｓＡ遺伝子、前記ＣｅｓＢ遺伝子、前記ＣｅｓＣ遺伝子および前記ＣｅｓＤ遺伝子は、以下、Ｃｅｓ系遺伝子ともいう。
　本発明において、前記Ｃｅｓ系遺伝子の由来は、何ら制限されない。前記Ｃｅｓ系遺伝子は、例えば、全て同じ由来でもよいし、全てまたは一部が異なる由来であってもよい。前記由来は、例えば、細菌等の生物があげられ、前記細菌は、例えば、酢酸菌、サルモネラ菌、植物病原菌、植物共生菌、光合成細菌等があげられる。前記酢酸菌は、例えば、アセトバクター属、アシディフィリウム属、アシディスフェラ属、アシドセラ属、アシドモナス属、アサイア属、クラウロコッカス属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、コザキア属、ムリコッカス属、パラクラウロコッカス属、ロドピラ属、ロゼオコッカス属、ルブリテピダ属、ステラ属、テイココッカス属またはザヴァルジニア属等があげられ、好ましくは、前記グルコンアセトバクター属である。前記グルコンアセトバクター属に属する酢酸菌は、特に制限されず、例えば、グルコンアセトバクター・キシリナス等があげられる。
　前記Ｃｅｓ系遺伝子は、例えば、遺伝子工学的手法により調製してもよいし、化学的手法により調製してもよい。前者の場合、例えば、前記由来生物からクローニングしてもよいし、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法により調製してもよい。後者の場合、化学的に合成してもよい。前記調製は、例えば、前記各Ｃｅｓ系遺伝子の塩基配列情報、または各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列情報に基づいて、行うことができる。また、前記Ｃｅｓ系遺伝子として、例えば、公知のＣｅｓ系遺伝子の塩基配列において、コードするタンパク質が同等の機能を維持する範囲で改変された塩基配列からなるポリヌクレオチドも使用できる。
　具体例として、グルコンアセトバクター・キシリナス由来のＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子のオペロンの塩基配列、前記各遺伝子の塩基配列およびコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、以下に示す。本発明において、前記Ｃｅｓ系遺伝子は、これらの配列に制限されない。
Ｃｅｓ遺伝子オペロン（配列番号１、Ｆｒｏｍ－７０）
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ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２、前記オペロンにおける７１－２３３５番目）
atgtcagaggttcagtcgccagtacccacggagagtaggctaggccgcatctccaacaagatactgtcactgcgtggggccagctatatagttggagcgctggggctttgtgcacttattgccgcgaccacggttacgctgaacaataatgagcagctaattgtggcagctgtatgtgttgtcatcttttttgttgtcgggcgtggcaagagccggcgcacccagatttttctcgaggtgctctccgcgctggtttccctgcgttacctgacatggcgcctgaccgaaacgctcgacttcaatacatggattcagggcatactgggcgtaatcctgctcatggccgagctgtatgccctgtacatgctgtttctcagctatttccagacaatccagccgcttcatcgtgcgccgctgcccctgcctgacaatgttgacgactggccgactgtcgatatcttcatcccgacctatgatgagcagctgagcatcgtgcgcctgaccgtgctgggcgcgctcggcatcgactggccgcccgataaagtgaatgtctatatccttgatgacggtgtgcggcccgaattcgagcagttcgccaaggattgcggcgccctgtatatcgggcgtgtcgacagcgcgcacgccaaggcgggtaacctcaaccacgccattaagcggacttccggcgattacattctcatcctggattgtgaccatattccgacacgcgcgttcctgcagatcgccatggggtggatggtcgctgaccgcaagatcgccctgatgcagacgccgcatcacttctactctcccgatccgttccagcgtaacctggccgtgggctaccgcaccccgccggaaggcaacctgttctacggcgtcatccaggatggcaacgacttctgggatgccaccttcttctgcggctcatgcgccatcctgcggcgtgaggccattgaatcgatcggcggctttgcggttgaaaccgtgacggaagatgcccataccgccctgcgcatgcagcgccgcggctggtccaccgcttacctgcgcattcccgttgccagtggtctggccaccgagcgactgaccacccatatcggccagcgcatgcgctgggcgcgcggcatgatccagatcttccgcgtggataacccgatgctcgggcgcggcctgaagttgggccagcggctttgctatctttcggccatgacgtcgttcttcttcgccattccgcgcgttatcttccttgcctcgccgctggcgttcctgtttgcgggccagaacatcatcgccgccgcgccactggccgtggcggcctatgccctcccgcacatgttccactccattgcaaccgccgccaaggtgaacaagggctggcgctattcgttctggagtgaggtgtacgaaaccaccatggcgctgttcctggtgcgcgtgaccatcgtcaccctgctgttcccctccaagggcaaattcaacgtgacggaaaagggcggcgtgcttgaggaggaagagttcgatcttggggcgacctaccccaacatcattttcgccaccatcatgatgggtggcctgctgatcggtctgttcgagttgatcgtgcgtttcaatcagctcgatgtcattgccaggaacgcttatctcctgaactgcgcctgggcgctgatcagtctcatcatccttttcgctgccattgccgtggggcgcgagaccaagcaggtccgttacaaccatcgtgtcgaagcgcatatcccggtaacggtttacgatgcgcctgccgaagggcagccccatacctattataatgcgacgcacggcatgacccaggatgtttccatgggtggtgttgccgtgcacatccccttgcccgatgtcaccacggggcctgtcaagaaacgtatccatgccgtgcttgatggcgaggaaatcgatattcccgccaccatgctgcgctgcacgaatggcaaggccgtgttcacatgggacaataatgaccttgatacggaacgcgatattgtccgcttcgtgttcgggcgggctgatgcctggctgcaatggaacaattatgaggatgacagaccgctacgcagcctgtggagcctgctgctcagcattaaggcgctgttccgcaaaaaaggcaaaataatggccaatagtcgtccaaaaaagaaaccacttgcactaccggttgagcgcagggagcccacaaccatccacagtggacagacacaagaaggaaagatcagccgtgcggcctcgtga
ＣｅｓＡタンパク質（配列番号３）
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ＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４、前記オペロンにおける２３３７－４７４５番目）
atgaaaatggtgtccctgatcgcgctgctggtctttgcaacgggggcacaggctgcgcctgttgcttccaaggcgccagctccgcagcccgcaggttcagacctgccacctctccctgccgcaccgccgcaggctgctccgcccgcagccgcgagtgccgccccgcccgccacaaccccggcggcggatgcctcagcagccagcgcggctgatgcggtcgtggacaatgccgagaacgccatcgccgggtctgacgtggcgacggtgcatacatattccctcagggaacttggtgcgcagagtgccctcaaaatgcagggcgctgctacgctgcagggcctgcagttcggtattccggccgaccagctcgtgacttcggcgcggcttgtcgtgtcgggtgcgatgtcgcccagcctccagcctgacaccagcgcggtcacgatcacgctgaacgaacagttcatcggcacgctgcggcctgaccccacacaccctacatttgggccgctctcgtttgatatcaaccccatcttcttcatcagtggcaaccggctgaatttcagcttcgcttcaagctcgaagggctgcacggaccccagcaacgggttgctctgggccagcgtgtccgaacattccgagctgcagatcaccaccatcccgcttcccccgcatcgccagctgtcgcgtctgccccagccgttcttcgacaagaacgtaaagcagaagatcgtcattccgttcgttctcgcacagacatttgatcccgaagtgctgaaggcgacgggcatcctggcatcgtggttcggccagcagaccgattaccgtggcgtcaccttcccggtcttctccaccattccgcaaacgggcaacgccgttgttgtcggcgtggctgacgagctgccttccgccctcgggcgccaggcggtcagtggccccacgcttatggaagtggccaatccatccgaccccaacggcacgatcctgctcgtaaccgggcgcgaccgtgatgaagtcatcaccgcgagcaagggcatcggttttggttcgagcaccctgccgacagccaaccgcatggacgtggcgccgatcgaggtcggggcccgcgtggcgaatgacgcgccctccttcattccgaccaaccgcccggtccgcctgggcgaactggtgccagacagcgccctgcaggctgaaggttacgcccctggcgcgctggcggtgccattccgtgtctcgcctgacctgtatacgtggcgcgatcggccgtacaagctgaacgtccgtttccgcgcgccgccggggccgatcgtggatgtgtcgcgctcgtcgctcaatgtaggcatcaacgatacctatctcgaggcctatccgctgcgtgagccggattcaccgctggaccagctcctgcatggggtgggccttggccatcgtaataatgacagcgtgcagcagcacaccatgcccatcccgacctaccgggtctttggccagaaccagctgctgttctatttcgagatggcggcgatggtcgagccgggctgcaaacccggcccgagcacgttccatatgggcattgatcccaattcgacgatcgatctgtccaactcctatcacatcacccagatgcccaacctcgccttcatggccagtgcgggctttccgttcaccacctatgccgacctgtcgcgctcggccgtggtgctgcccgaacaccccaatggcatgattgtcagcgcctatctcgacctcatgggcttcatgggggcgacgacatggtatccggtgtctggcgttgatgtggtctccagcgaccatgtgaatgacgtggcggaccggaacctgattgtcctgtccacgctggccaatagcggtgatgtttcgcagctgctgagcaattcggcctatcagatttccgatgggcggctgcacatggccctgcgttcgacgctgagcggcgtgtggaaccttttccaggatcccatgtcggccatcaacagcacggccccgaccgatgtcgagagcacgctgaccggtggcgtggccgcgatggtcgaggcggaatcgccgctggcatcgggtcggaccgttctcgcgctgctttcgggtgacgggcaggggctcaacaaccttgtgcagatcctggcgcagcggaaaaaccaggccaagatccagggtgatctggtgctggcacatggggatgacctgacctcctaccgcagctcgccgctgtatacggttggcaccgtgccgctgtggctcaagcctgactggtatatgcacaaccatcccagccgcgtggtcgtggttggcctgttcggttgccttctggtggtggctgtcctgatgcgcgccctgaccaagcatgctctgcgccgccgtcgggagttgcaggaagaaaggcagagaacgtga
ＣｅｓＢタンパク質（配列番号５）
MKMVSLIALLVFATGAQAAPVASKAPAPQPAGSDLPPLPAAPPQAAPPAAASAAPPATTPAADASAASAADAVVDNAENAIAGSDVATVHTYSLRELGAQSALKMQGAATLQGLQFGIPADQLVTSARLVVSGAMSPSLQPDTSAVTITLNEQFIGTLRPDPTHPTFGPLSFDINPIFFISGNRLNFSFASSSKGCTDPSNGLLWASVSEHSELQITTIPLPPHRQLSRLPQPFFDKNVKQKIVIPFVLAQTFDPEVLKATGILASWFGQQTDYRGVTFPVFSTIPQTGNAVVVGVADELPSALGRQAVSGPTLMEVANPSDPNGTILLVTGRDRDEVITASKGIGFGSSTLPTANRMDVAPIEVGARVANDAPSFIPTNRPVRLGELVPDSALQAEGYAPGALAVPFRVSPDLYTWRDRPYKLNVRFRAPPGPIVDVSRSSLNVGINDTYLEAYPLREPDSPLDQLLHGVGLGHRNNDSVQQHTMPIPTYRVFGQNQLLFYFEMAAMVEPGCKPGPSTFHMGIDPNSTIDLSNSYHITQMPNLAFMASAGFPFTTYADLSRSAVVLPEHPNGMIVSAYLDLMGFMGATTWYPVSGVDVVSSDHVNDVADRNLIVLSTLANSGDVSQLLSNSAYQISDGRLHMALRSTLSGVWNLFQDPMSAINSTAPTDVESTLTGGVAAMVEAESPLASGRTVLALLSGDGQGLNNLVQILAQRKNQAKIQGDLVLAHGDDLTSYRSSPLYTVGTVPLWLKPDWYMHNHPSRVVVVGLFGCLLVVAVLMRALTKHALRRRRELQEERQRT
ＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６、前記オペロンにおける４７４８－８７２８番目）
atgaacaggcgatacgccctttcgctttctggtgccctgctggccagcagttgcatgacggtgctggtggcggttcctgttgcgcgggcgcagcaggcttccactgccgtgacttccacagccgcgagtccggctgcggccccacggcagatcctgttgcagcaggcacgcttctggcttcagcagcagcaatatgacaatgcccgccaggccctgcagaatgcgcagcgcatcgcccccgatgcccctgacgtgctggaagtggagggtgaataccaggcggccgttggcaaccgcgaagccgctgccgataccctgcgccacctgcagcaggtggccccggccagcacggcggtcagcaacctgagcgatctgctcagcgagcgggccatttcccaaagcgacctgtcacagatccgttcgctggcgggttcgggccagaacgcgcaggcggtggcggggtaccagaagctgttccacggtggcaagccgccccgttcgcttgcggtggaatactaccagaccatggcgggcgtgccgacccagtgggaccaggcgcgcgcggggctggccgggatcgttgcgtccaacccgcagaattaccgcgcccagctcgcctttgcccaggccctgacctataatacctcgacccgcatggaaggcctgacccggctcaaggatctgcaatccttccagagtcaggccccggtcgaagctgccgccgcgacgcagtcctatcgccagaccctgagctggctgccggtcaatcccgatacgcagcccctcatggagcagtggctttccgcccaccccaatgatgccgcgctgcgcgaacacatgcttcacccccccggcggcccgccggacaaggcggggcttgcgcggcaggccggttaccagcagctcaacgcgggccgtctttccgctgccgaacagtccttccagtcggcgttgcagatcaactcccatgatgctgattcactgggtggcatgggcctcgtgagcatgcggcagggcgataccgccgaggcgcaccgctattttgaagaggcgatggccgccgaccccaagactgccgatcgctggcgcccggcgcttgcgggcatggcggtcagcggggactatgccgccgttcgccagttgattgccgcccatcagtataccgaggccaagcagaagcttgccacgctggcccgccagcccgggcagtacaccggcgcgaccctcatgctggccgacctgcagcgctcgaccgggcaggttgccgccgccgagcaggaatatcgtggcatcctgtcgcgtgagcccaataaccagctggcccttatggggctggcgcgggtggacatggcgcagggcaacacggcggaagcacgccagctcctgtcgcgtgtgagcccgcaatatgccagccaggtcggggaaatcgaggtttccggccttatggcggcagcgtcgcagacatcggattcagcgcgcaaggtttccatcctgcgcgaagcgatggcccaggccccgcgtgacccgtgggtgcgcatcaaccttgccaatgcgctgcagcagcagggcgatgtggctgaagccgggcgcgtgatgcagcccatcctggccaatcctgtcaccgcgcaggaccgccaggccggtatcctgtatacctatggcagtggcaatgatgcgatgacccgccagcttctggccggtctgtcgcccgcggattattcccccgcgatccgttccattgccgaggaaatggaaatcaagcaggacctggccagccgcctgtcgatggtatccaacccggtgccgctgatccgcgaggccctttcccagcctgatccgaccggcgcgcgtggcgtggcggtggccgacctgttccgccagcgtggcgacatggtgcatgcgcgcatggcgctgcgtatcgcctcgacgcgcaccatcgacctttcgcccgaccagcgcctgtcctacgccaccgaatacatgaagatcagcaacccggtggcagccgcacgcctgctggccccgctgggggatggcacgggttcgggcgcgggcaatgcgctgctgcccgagcagatgcagacattgcagcaactgcgcatgggcatctcggtggcgcagtccgatctgctcaaccagcgtggcgatcaggcgcaggcctacgatcatctggcgcccgccctgcaggccgacccggaggcgacatcgcccaagctggcgctcgcgcggctgtataacggccacggcaagccgggcaaggcgctcgagatcgaccttgcggtgctgcgccacaacccgcaggatcttgatgcgcggcaggcggcggtgcaggcggcggtcaacagcaaccacaacagtcttgccacccgtctcgcgatggatggcgtgcaggaaagcccgatggatgcccgcgcctggctggccatggccgtagctgaccaggccgatggccatggtcagcgcaccatcgaggacctgcgccgcgcctatgacctgcgcctgcagcaggtcgagggcacgcgggccgcgtctggtccggtcggggcgcaggaagaagcgcttgccccgccatcgaccaacccgttccagtcgcgtggctacgggcatcaggtggaactgggcgcgccggtgaccggtggctcctacagtgccgaggcggcatcgcccgatacgtcggaccagatgctctcctccattgctggccagatccacacgctgcgtgaaaaccttgcaccctccattgatggtgggctgggcttccggtcgcgttcgggcgagcatggcatgggccgcctgacggaagcgaacattcccatcgtgggccgcctgccgctgcaggccggtgcttccgccctgaccttctcgatcacgccaaccatgatctggtcgggccagctcaacacaggctccgtctatgatgtgccgcgttatggcacgttcatggcaacgcaggctgccaaccagtgcgcgggccacagttcgtgtggcgggcttgatttcctgagcgccaaccatacccagcgcatcgcggctggtgcaggcgaggccgggtttgcgccggatgtgcagttcggcaatagctgggtgcgcgctgatgtcggcgcctcgcccatcggcttccccattaccaacgtgctgggcggggtcgagttctcgccgcgcgtggggccggtcacgttccgtgtcagcgccgagcgccggtcgatcaccaacagcgtgctgtcctatggtggcctgcgtgatccgaactacaacagcgaggtcggtcgttacgcgcgtcaggtctatggtcatgacctgaccaagcagtggggtagcgaatggggtggggtggtgaccaaccacttccacggtcaggtcgaggcgacgctgggcaacaccatcctgtatggtggtggcggctacgcgatccagaccggcaagaacgtgcagcgcaacagcgagcgcgaagccggcatcggcgccaatacgctggtgtggcataacgccaacatgctggtgcgcattggcgtgagcctgacctatttcggttatgcccataacgaggatttctatacctatgggcagggcggctacttctcgccgcagtcctattatgcggcaaccgtgccggtgcgttatgcgggccagcacaagcggctggactgggatgtgacgggtagcgtgggctaccaggtgttccatgaacacgcggcgcccttcttccccacgtcatcgctgctgcagtccggtgccaattacgttgcatcgaactttgtgcagaatgccctgccaacggattatctgtcgcaggaaacggtgaacagcgcctactatcccggggatagtattgctggtcttacgggcggctttaatgctagggtgggctatcgctttacacgcaatgttcgtcttgatctctcggggcgctatcagaaggccggtaactggactgaaagcggcgccatgatttccgcacactatcttattatggaccagtaa
ＣｅｓＣタンパク質（配列番号７）
MNRRYALSLSGALLASSCMTVLVAVPVARAQQASTAVTSTAASPAAAPRQILLQQARFWLQQQQYDNARQALQNAQRIAPDAPDVLEVEGEYQAAVGNREAAADTLRHLQQVAPASTAVSNLSDLLSERAISQSDLSQIRSLAGSGQNAQAVAGYQKLFHGGKPPRSLAVEYYQTMAGVPTQWDQARAGLAGIVASNPQNYRAQLAFAQALTYNTSTRMEGLTRLKDLQSFQSQAPVEAAAATQSYRQTLSWLPVNPDTQPLMEQWLSAHPNDAALREHMLHPPGGPPDKAGLARQAGYQQLNAGRLSAAEQSFQSALQINSHDADSLGGMGLVSMRQGDTAEAHRYFEEAMAADPKTADRWRPALAGMAVSGDYAAVRQLIAAHQYTEAKQKLATLARQPGQYTGATLMLADLQRSTGQVAAAEQEYRGILSREPNNQLALMGLARVDMAQGNTAEARQLLSRVSPQYASQVGEIEVSGLMAAASQTSDSARKVSILREAMAQAPRDPWVRINLANALQQQGDVAEAGRVMQPILANPVTAQDRQAGILYTYGSGNDAMTRQLLAGLSPADYSPAIRSIAEEMEIKQDLASRLSMVSNPVPLIREALSQPDPTGARGVAVADLFRQRGDMVHARMALRIASTRTIDLSPDQRLSYATEYMKISNPVAAARLLAPLGDGTGSGAGNALLPEQMQTLQQLRMGISVAQSDLLNQRGDQAQAYDHLAPALQADPEATSPKLALARLYNGHGKPGKALEIDLAVLRHNPQDLDARQAAVQAAVNSNHNSLATRLAMDGVQESPMDARAWLAMAVADQADGHGQRTIEDLRRAYDLRLQQVEGTRAASGPVGAQEEALAPPSTNPFQSRGYGHQVELGAPVTGGSYSAEAASPDTSDQMLSSIAGQIHTLRENLAPSIDGGLGFRSRSGEHGMGRLTEANIPIVGRLPLQAGASALTFSITPTMIWSGQLNTGSVYDVPRYGTFMATQAANQCAGHSSCGGLDFLSANHTQRIAAGAGEAGFAPDVQFGNSWVRADVGASPIGFPITNVLGGVEFSPRVGPVTFRVSAERRSITNSVLSYGGLRDPNYNSEVGRYARQVYGHDLTKQWGSEWGGVVTNHFHGQVEATLGNTILYGGGGYAIQTGKNVQRNSEREAGIGANTLVWHNANMLVRIGVSLTYFGYAHNEDFYTYGQGGYFSPQSYYAATVPVRYAGQHKRLDWDVTGSVGYQVFHEHAAPFFPTSSLLQSGANYVASNFVQNALPTDYLSQETVNSAYYPGDSIAGLTGGFNARVGYRFTRNVRLDLSGRYQKAGNWTESGAMISAHYLIMDQ
ＣｅｓＤ遺伝子（配列番号８、前記オペロンにおける８７２８－９１９８番目）
atgacaactttgaacgcaaaaccggacttttcgcttttcctgcaggcactgtcctgggagatcgatgatcaggccgggatcgaggtcaggaatgacctgttgcgcgaggtcggccggggtatggctggtcgtttccagccgccgctgtgcaacaccatccaccagctccagatcgagctgaacgccctgctggccatgatcaactggggctacgtaaagctggacctgctggcggaagaacaggccatgcgcatcgtgcatgaagacctgccgcaggtgggcagcgcgggcgaacccgccggcacatggcttgccccggtgctggaagggctttatggccgctggatcacgtcgcagcccggcgccttcggtgattatgtcgtgacgcgtgatatcgacgcggaagacctgaactcggtcccggcccagacggtcatcctgtacatgcgcacccgcagcgccgcgacctga
ＣｅｓＤタンパク質（配列番号９）
MTTLNAKPDFSLFLQALSWEIDDQAGIEVRNDLLREVGRGMAGRFQPPLCNTIHQLQIELNALLAMINWGYVKLDLLAEEQAMRIVHEDLPQVGSAGEPAGTWLAPVLEGLYGRWITSQPGAFGDYVVTRDIDAEDLNSVPAQTVILYMRTRSAAT
　本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記条件を満たすように、前記Ｃｅｓ系遺伝子を挿入することで作製できる。本発明のセルロース製造用ベクターにおいて、前記プロモーターは、例えば、前記基本ベクターが有するプロモーターでもよいし、別途、前記基本ベクターに挿入したプロモーターでもよい。前者の場合、例えば、前記基本ベクターに対して、プロモーターの下流側に、前記上流配列および前記Ｃｅｓ系遺伝子を挿入してもよい。
　前記プロモーターは、例えば、本発明のセルロース製造用ベクターを導入する宿主内で機能すればよく、その組合せは特に制限されない。前記プロモーターは、例えば、Ｔ５プロモーター（ＰＴ５）、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＴＤＨ３ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＧＡＬ１ｐ＝ＧＡＬ１０ｐ、ＡＤＨ２ｐ、ＰＨＯ５ｐ、ＣＵＰ１ｐ、ＭＦα１ｐ等があげられる。また、高発現プロモーターは、ＴＤＨ３ｐ、ＴＰＩ１ｐ、ＰＧＫ１ｐ、ＰＧＩ１ｐ、ＰＹＫ１ｐ、ＡＤＨ１ｐ等があげられる。
　前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等があげられる。前記大腸菌由来のプラスミドは、例えば、ｐＱＥ系（ｐＱＥ－８０Ｌ、ｐＱＥ－６０およびｐＱＥ－３０Ｌ等）、ｐＥＸ系、ｐＢＲ系（ｐＢＲ３２２等）、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８およびｐＵＣ１１９等）、ｐＢＡＤ、ｐＧＥＸ、ｐＦＬＡＧ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＥＴベクターおよびｐＣｏｌｄベクター等があげられる。前記酵母由来のプラスミドは、例えば、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）等があげられる。前記ＹＥｐ型ベクターは、例えば、ＹＥｐ２４(J．　R．　Broach　et　al．，　Experimental　Manipulation　of　Gene　Expression，　Academic　Press，　New　York，　83，　1983)、前記ＹＣｐ型ベクターは、例えば、ＹＣｐ５０(M．　D．　Rose　et　al．，　Gene，　60，　237，　1987)、前記ＹＩｐ型ベクターは、例えば、ＹＩｐ５(K．　Struhl　et　al．，　Proc．　Natl．　Acad．　Sci．　USA，　76，　1035，　1979)、等が報告されている。この他にも、例えば、ｐＹＥ２２ｍ（Biosci．　Biotech．　Biochem．，　59，　1221－1228，　1995）、ＹＩｐ１(X70480）等があげられる。前記基本ベクターは、中でも、前記大腸菌由来のプラスミドが好ましく、より好ましくは前記ｐＱＥ系プラスミドであり、さらに好ましくはｐＱＥ－８０Ｌである。
　本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、さらに、前記Ｃｅｓ系遺伝子の発現を調節する調節配列を有してもよい。前記調節配列は、本発明のセルロース製造用ベクターを導入する宿主内で機能すればよく、例えば、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を他の調節配列に置き換えてもよい。本発明のセルロース製造用ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されず、前記Ｃｅｓ系遺伝子の発現を機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて行うことができる。
　本発明のセルロース製造用ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性等の耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。前記栄養要求性マーカーは、例えば、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子等があげられる。前記薬剤耐性マーカーは、例えば、ハイグロマイシン耐性、ゼオシン耐性、ジェネティシン耐性等のマーカーがあげられる。この他にも、例えば、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Marin　et　al．，　Proc．　Natl．　Acad．　Sci．　USA，　81，　337　1984）、セルレニン耐性遺伝子として、ｆａｓ２ｍ遺伝子（猪腰淳嗣ら，　生化学，　64，　660，　1992）、ＰＤＲ４遺伝子（Hussain　et　al．，　gene，　101，　149，　1991）等が利用可能である。
（２）形質転換体
　本発明の形質転換体は、前述のように、本発明のセルロース製造用ベクターを含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記Ｃｅｓ系遺伝子が発現可能なように、本発明のセルロース製造用ベクターが導入されていればよく、その他の構成は、特に制限されない。
　本発明の形質転換体は、前記本発明のセルロース製造用ベクターを、前記ｄｇｃ遺伝子と共に発現させることによって、簡便にセルロースを製造できる。そこで、本発明の形質転換体は、さらに、ｄｇｃ遺伝子を有することが好ましく、具体的には、さらに、前記ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを含むことが好ましい。前記ｄｇｃ遺伝子は、例えば、前記本発明のセルロース製造用ベクターが有してもよいが、前記本発明のセルロース製造用ベクターとは別個独立したベクターが有することが好ましい。前記ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを、以下、ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターともいう。
　前記ｄｇｃ遺伝子は、cyclic－di－guanylmonophosphate（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）合成酵素遺伝子として公知の遺伝子である。本発明において、前記ｄｇｃ遺伝子の由来となる生物は、特に制限されない。前記生物は、例えば、古細菌および真正細菌、これらのいずれかに属する好熱菌等があげられる。前記真正細菌は、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、コレラ菌等があげられる。前記好熱菌は、特に制限されず、例えば、パイロコッカス属、メタノパイラス属、サーモコッカス属、サーモトーガ属、パイロロバス属、ブルカニサエタ属、ハロアキューラ属、メタノセラ属、またはサーマス属等があげられ、好ましくは、前記サーモトーガ属である。前記サーモトーガ属に属する好熱菌は、特に制限されず、例えば、サーモトーガ・マリティマ等があげられる。
　具体例として、前記ｄｇｃ遺伝子の塩基配列およびこれらがコードするタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１０～１５に示す。本発明において、前記ｄｇｃ遺伝子は、この配列に限定されない。以下に示すＳｏＤＧＣは、シェワネラ・オネイデンシス（Shewanella　oneidensis）由来のｃ－ｄｉ－ＧＭＰ合成酵素であり、ｔＤＧＣは、サーモトーガ・マリティマ（Thermotoga　maritima）由来のｃ－ｄｉ－ＧＭＰ合成酵素であり、ｔＤＧＣ／Ｋ８２＋Ｒ１５８Ａは、Ｎ末の１－８１番目のアミノ酸を欠損し、Ｒ１５８Ａの点変異を持ったｔＤＧＣである。
ＳｏＤＧＣ遺伝子（配列番号１０）
atgtcacgagatttattacaaaccgctgccttgaatcttaaaaaagcggttcccttaatgctcaaacatcagatccccacgactcccattaattatgccctttggtatacctatgtgggtgaacaaaatctggcattaaatgcacagctcgataccgttatcgcacattacaatacttgcccacccgtgagcagtgagctgttgtatcgccaatatgtggccgatcccgttgaacttaatgtgcgcgatatgcgcctcaatctcgaggcgatggccacagagttatcgcaatcgattaaggacactagccttgatacaaccgagtttcaaacctgtatcaatagcaatttttccaaacttaatggcatagaagaaggtgctctcagtgtcgagcaagtgctagatttagttcgcaatttagtgaaggagtctgacaatattcgttcgagcactgagtttttgaccacacagttgcaaaaagcccagacagagatcgatgcgctaaaacaaaagctcgaaaaaacagaaaaagatgtgctttatgatgcccttacaggctgtttaaaccgccgcgcctttgatgcagatatcgctggcatgatagcgcaggctccggaagggacctgcctaatcttagtcgatatcgatcattttaaagcctttaatgataactatggccaccaactgggcgatcaagtcctaaaggctgtggccaaacgcctacaggaagcatgccgagatggcagcaaactatatcgttttggcggtgaagaatttgcgattatcgtgcccaagagccaactgcggatcacaaggcaattggctgaggctatgcgccgcgggcttgaaaaactgtgcctaaaagaccgacgtaaagaccaacttgttgataatattaccgcttcttttggtgttgcccaatggcaagaaaggcaatctgttgtgcagctgatagagaaaacagataagctgctttacgaagctaaacgcctaggccgtaatcgggttatgccgataaacaactaa
ＳｏＤＧＣタンパク質（配列番号１１）
MSRDLLQTAALNLKKAVPLMLKHQIPTTPINYALWYTYVGEQNLALNAQLDTVIAHYNTCPPVSSELLYRQYVADPVELNVRDMRLNLEAMATELSQSIKDTSLDTTEFQTCINSNFSKLNGIEEGALSVEQVLDLVRNLVKESDNIRSSTEFLTTQLQKAQTEIDALKQKLEKTEKDVLYDALTGCLNRRAFDADIAGMIAQAPEGTCLILVDIDHFKAFNDNYGHQLGDQVLKAVAKRLQEACRDGSKLYRFGGEEFAIIVPKSQLRITRQLAEAMRRGLEKLCLKDRRKDQLVDNITASFGVAQWQERQSVVQLIEKTDKLLYEAKRLGRNRVMPINN
ｔＤＧＣ遺伝子（配列番号１２）
gtgaaagtttccgggggggaagttcctccctttttcaaggaggggtttttctttacttcagaggaactgactcatcttatcaatgtatgtagtagcacatctgcaattatctcagtattgaaagacagtaagtatagaaggtctttggtcttatatctaaaaaggcctttgagcaaagatgctcttcttttgattcagactctgctaactacccttgaaagggaagatctttcgtttggtgtaaaagaactggaatacatggcctatcacgatccactgacagggcttccaaacaggcgttatttctttgaactgggaaacagatatctggacttagcaaagcgcgagggaaaaaaggtattcgttcttttcgtagatcttgctgggtttaaggcgataaatgacacatacggccatctgtcaggtgatgaggtattgaagacagtttcaaaaaggattctggacagggttagaagaagcgatgtggtggctcgatacggcggtgatgagtttaccattctcctctacgatatgaaagaagagtatctgaaatccctcctggaaaggattctttccaccttcagagaacccgtcagagtggaaaataaacacttatctgtcacaccgaacataggagttgccagattccctgaagatggggaaaatcttgaagaacttctgaaagtagcggatatgaggatgtacaaagcaaaggaaatgaaagtgccttatttcagtctctcataa
ｔＤＧＣタンパク質（配列番号１３）
MKVSGGEVPPFFKEGFFFTSEELTHLINVCSSTSAIISVLKDSKYRRSLVLYLKRPLSKDALLLIQTLLTTLEREDLSFGVKELEYMAYHDPLTGLPNRRYFFELGNRYLDLAKREGKKVFVLFVDLAGFKAINDTYGHLSGDEVLKTVSKRILDRVRRSDVVARYGGDEFTILLYDMKEEYLKSLLERILSTFREPVRVENKHLSVTPNIGVARFPEDGENLEELLKVADMRMYKAKEMKVPYFSLS
ｔＤＧＣ／Ｋ８２＋Ｒ１５８Ａ－遺伝子（配列番号１４）
aaagaactggaatacatggcctatcacgatccactgacagggcttccaaacaggcgttatttctttgaactgggaaacagatatctggacttagcaaagcgcgagggaaaaaaggtattcgttcttttcgtagatcttgctgggtttaaggcgataaatgacacatacggccatctgtcaggtgatgaggtattgaagacagtttcaaaaaggattctggacagggttgcaagaagcgatgtggtggctcgatacggcggtgatgagtttaccattctcctctacgatatgaaagaagagtatctgaaatccctcctggaaaggattctttccaccttcagagaacccgtcagagtggaaaataaacacttatctgtcacaccgaacataggagttgccagattccctgaagatggggaaaatcttgaagaacttctgaaagtagcggatatgaggatgtacaaagcaaaggaaatgaaagtgccttatttcagtctctcataa
ｔＤＧＣ／Ｋ８２＋Ｒ１５８Ａ－タンパク質（配列番号１５）
KELEYMAYHDPLTGLPNRRYFFELGNRYLDLAKREGKKVFVLFVDLAGFKAINDTYGHLSGDEVLKTVSKRILDRVARSDVVARYGGDEFTILLYDMKEEYLKSLLERILSTFREPVRVENKHLSVTPNIGVARFPEDGENLEELLKVADMRMYKAKEMKVPYFSLS
　本発明の形質転換体は、例えば、宿主に、本発明のセルロース製造用ベクターを導入することによって得られる。また、本発明の形質転換体は、例えば、さらに、前記ｄｇｃ遺伝子、具体的には、前記ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターを導入することによって得られる。前記本発明のセルロース製造用ベクターと前記ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターの導入の順序は、特に制限されず、いずれが先でもよいし、同時であってもよい。
　前記宿主は、特に制限されず、適宜選択できる。前記宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはこれらの培養細胞等があげられる。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Escherichia　coli）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Bacillus　subtilis）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas　putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium　meliloti）等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces　cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces　pombe）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等があげられる。前記宿主は、好ましくは大腸菌である。
　本発明において、前記宿主にベクターまたは遺伝子を導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
　前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。
　本発明において、前記ベクターが前記宿主に導入されたか否かを確認する方法は、特に制限されず、公知の方法が利用できる。公知の方法としては、例えば、前記ベクターが有する前記各選択マーカーを利用する方法、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等があげられる。
（３）セルロースの製造方法
　本発明のセルロースの製造方法は、前述のように、本発明のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を、培養する工程を含むことを特徴とする。本発明は、本発明の形質転換体を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明によれば、例えば、特別な基質を使用することなく、簡便にセルロースを合成することができる。
　本発明において、製造する前記セルロースは、特に制限されず、例えば、セルロースＩ、セルロースIIおよびセルロースIII等があげられ、好ましくはセルロースIIである。
　本発明において、前記形質転換体は、前述した本発明の形質転換体が使用でき、具体的には、前記本発明のセルロース製造用ベクターと前記ｄｇｃ遺伝子とを有する形質転換体があげられる。前記形質転換体において、前記ｄｇｃ遺伝子は、前述のように、前記ｄｇｃ遺伝子発現用ベクターとして導入されてもよい。
　前記培養工程において、前記培地の種類は、特に制限されず、前記形質転換体の宿主等に応じて、適宜選択できる。前記宿主が大腸菌の場合、例えば、ＬＢ、２ｘＹＴ、ＴＢ等の培地があげられる。また、本発明の形質転換体は、例えば、グルコース等の基質を、外来基質として添加しない条件においてもセルロースを合成できる。
　また、前記培養工程において、前記培地の原料として、バイオマスを使用することもできる。
　前記培養工程における培養条件は、特に制限されず、前記宿主に応じて、適宜選択できる。前記宿主が大腸菌の場合、例えば、大腸菌培養時の公知の条件が採用できる。培養温度は、例えば、４～４０℃であり、好ましくは４～３０℃である。培養時間は、特に制限されず、例えば、２～２４時間であり、好ましくは５～１２時間である。
　本発明のセルロースの製造方法は、さらに、前記培養工程により得られた培養物からセルロースを抽出する抽出工程を含んでもよい。前記抽出工程は、例えば、固体画分と液体画分との分離工程、前記固体画分または前記液体画分からのセルロースの精製工程等を含んでもよい。前記本発明の形質転換体の培養により合成されるセルロースが、例えば、不溶性の場合、前記精製工程において、前記固体画分を用いてセルロースを精製することが好ましく、水溶性の場合、前記精製工程において、前記液体画分を用いてセルロースを精製することが好ましい。また、合成されたセルロースは、例えば、菌体外に放出されるが、菌体内に保持されたセルロースは、前記固体画分に含まれる培養後の前記形質転換体を破壊して、回収および精製してもよい。
　前記分離工程は、例えば、遠心分離、ろ過等により行うことができる。前記精製工程は、例えば、前記分離工程において回収した固体画分を、酸処理する工程があげられる。また、前記精製工程は、例えば、前記酸処理後の個体画分を、さらにアルカリ処理する工程を含んでもよい。
　また、例えば、本発明は、前記セルロース製造用ベクターの利用により、例えば、著しく疎水性の高いセルロース等、従来とは全く異なる性質を持つセルロースの生産を可能とするプラットフォームとして、利用することも期待できる。
（４）セルロース
　本発明のセルロースは、前述のように、本発明のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする。本発明のセルロースは、本発明のセルロースの製造方法により得られることが特徴であり、その他の構成は、特に制限されない。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）ＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子のサブクローニング
　理研ＢＲＣより、グルコンアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter　xylinus）　ＪＣＭ９７３０株を入手した。前記株は、そのセルロース合成酵素遺伝子群の配列が同定されているＢＰＲ２００１株に相当する（Nakai　T．；　Moriya　A．；　Tonouchi　N．；　Tsuchida　T．；　Yoshinaga　F．；　Horinouchi　S．；　Sone　Y．；　Mori　H．；　Sakai　F．；　Hayashi　T．，　"Control　of　expression　by　the　cellulose　synthase　(bcsA)　promoter　region　from　Acetobacter　xylinum　BPR　2001"　Gene　213，　93－100　(1998)）。
　前記株をＳＨ培地（Schramm　M．；　Hestrin　S．，　"Factors　affecting　production　of　cellulose　at　the　air/liquid　interface　of　a　culture　of　Acetobacter　xylinum"　J．　Gen．　Microbiol．　11，　123－129　(1954)）で培養し、得られた菌体より、市販キット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅ社製）を使ってゲノムＤＮＡを抽出した。前記ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、キットを用いたＰＣＲにより、目的遺伝子を増幅した。前記キットは、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＬＡ　Ｔａｑ（タカラ）またはＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬ（タカラ）を使用した。そして、得られた増幅産物を、ＴＡ－ライゲーションによりｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。前記キットとしてＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬを使用した場合、Ｔａｑ（タカラ）によるＡ－ｔａｉｌｉｎｇ後に、ＴＡ－ライゲーションを行った。
　前記ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
＃ａ１（配列番号１７）
5'-ATATAAGGACGAGCTATTGATGTCAGAGGTTCAGTCGCCAGTACCC-3'
＃ａ２（配列番号１８）
5'-ATAGGATCCCGAGGCCGCACGGCTGATCTTTCC-3'
＃ａ３（配列番号１９）
5'-ATGAGCTCATGTCAGAGGTTCAGTCG-3'
＃ａ４（配列番号２０）
5'-GGATCCCAGGGCGATCTTGCGGTCAGC-3'
＃ａ５（配列番号２１）
5'-GCTAGCCACCATGTCAGAGGTTCAGTCG-3'
＃ａ６（配列番号２２）
5'-GGTACCTCATCACGAGGCCGCACGGCTGATCTT-3'
＃ａ７（配列番号２３）
5'-ACCGGTTGAGCGCAGGGAGCC-3'
＃ａ８（配列番号２４）
5'-CATATGGAACGTGCTCGGGCC-3'
＃ａ９（配列番号２５）
5'-GCCACCATGGCAATGGTGTCCCTGATCG-3'
＃ａ１０（配列番号２６）
5'-CATATGGAACGTGCTCGG-3'
＃ａ１１（配列番号２７）
5'-CTCGAGGCCTATCCGCTGCGT-3'
＃ａ１２（配列番号２８）
5'-AGATCTCGTTCTCTGCCTTTCTTCCTG-3'
＃ａ１３（配列番号２９）
5'-GGTACCTCACGTTCTCTGCCTTTCTTC-3'
＃ａ１４（配列番号３０）
5'-ATGGATCCCTTGCGCGCTGAATCCGATG-3'
＃ａ１５（配列番号３１）
5'-GCCACCATGGCAAGGCGATACGCCCTTTC-3'
＃ａ１６（配列番号３２）
5'-GGTGCGCGTCGAGGCGATAC-3'
＃ａ１７（配列番号３３）
5'-CATATGGGTTACCAGCAGCTCAACG-3'
＃ａ１８（配列番号３４）
5'-AAGGATCCCGTGCCATAACGCGGCACATC-3'
＃ａ１９（配列番号３５）
5'-AAGGATCCCAGGCCGACCCGGAGGCGAC-3'
＃ａ２０（配列番号３６）
5'-GGATCCCTGGTCCATAATAAGATAG-3'
＃ａ２１（配列番号３７）
5'-ATGAGCTCCCGGTCGCGGCGCTGCGGGTG-3'
＃ａ２２（配列番号３８）
5'-ATAACCATGGCAACTTTGAACGCAAAAC-3'
＃ａ２３（配列番号３９）
5'-ATAAGCTTCAGGTCGCGGCGCTGCGGGTG-3'
＃ａ２４（配列番号４０）
5'-AAGCTTAATGATGATGATGATGATGGGTCGCGGCGCTGCG-3'
＃ａ２５（配列番号４１）
5'-ATAAAAGCTTACTGGTCCATAATAAGATAG-3'
　ＰＣＲに使用した前記プライマーと、作製したサブクローニングベクターとの関係を、下記表１に示す。ベクター＃ａ１３は、ベクター＃ａ１０およびベクター＃ａ１２由来の断片を、ベクター＃ａ８にライゲーションすることによって作製した。また、図１に、各ベクターに導入したグルコンアセトバクター・キシリナスＪＣＭ９７３０由来のＣｅｓＡＢＣＤ遺伝子の領域を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　目的遺伝子のＤＮＡ配列を確認し、上記のサブクローニングベクターから、制限酵素処理により前記ＤＮＡ断片を切り出し、ライゲーション反応で発現ベクターへ挿入した。ついで、制限処理後にアガロースゲル電気泳動を行い、ゲルをＭｕｐｉｄ　Ｂｌｕｅ（アドバンス）で染色し、目的の大きさのバンドを切りだし、Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることで、目的遺伝子のＤＮＡ断片を単離した。得られたＤＮＡ断片のライゲーション反応は、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ．２．１（タカラ）あるいはＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ＬＯＮＧ（タカラ）を用いて行った。
（２）Ｃｅｓ発現系の構築
（２－１）ＣｅｓＡ発現系の構築
　ｐＱＥ－８０Ｌ（Ｑｉａｇｅｎ）をＳａｃＩおよびＫｐｎＩで処理し、これに、ベクター＃ａ２のＳａｃＩ－ＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）と、ベクター＃ａ３のＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ断片（約１７００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）が導入され、Ｎ末端にＨｉｓタグ（Ｈｉｓ６タグ）の付いたＣｅｓＡを発現するＣｅｓＡ発現系ＥＶ＃２０を作製した。
（２－２）ＣｅｓＢ発現系の構築
　ｐＱＥ－６０をＮｃｏＩおよびＢｇｌIIで処理し、これに、ベクター＃ａ５のＮｃｏＩ－ＸｈｏＩ断片（約１３５０ｂｐ）と、ベクター＃ａ６のＸｈｏＩ－ＢｇｌII断片（約１０５０ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）が導入され、Ｃ末端にＨｉｓタグの付いたＣｅｓＢを発現するＣｅｓＢ発現系ＥＶ＃３２を作製した。
（２－３）ＣｅｓＣ発現系の構築
　ｐＱＥ－６０をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで処理し、これに、ベクター＃ａ９のＮｃｏＩ－ＫｐｎＩ断片（約５００ｂｐ）と、ベクター＃ａ１０のＫｐｎＩ－ＡｇｅＩ断片（約２２００ｂｐ）と、ベクター＃１１のＡｇｅＩ－ＢａｍＨＩ断片（約１３５０ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）が導入され、ＣｅｓＣを発現するＣｅｓＣ発現系ＥＶ＃５９を作製した。
（２－４）ＣｅｓＡＢ発現系の構築
　ＣｅｓＡおよびＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系の構築の手順を、図２に示す。ＥＶ＃２０をＡｇｅＩおよびＫｐｎＩで処理し、これに、ベクター＃ａ４のＡｇｅＩ－ＸｈｏＩ断片（約１４００ｂｐ）と、ベクター＃ａ７のＸｈｏＩ－ＫｐｎＩ断片（約１０５０ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡおよびＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃２１を作製した。
　ＥＶ＃２１をＥｃｏＲＩで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）をアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理し、これに、ベクター＃ａ１のＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）をライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を作製した。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とが導入され、ＣｅｓＡおよびＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を作製した。なお、断片の挿入方向の確認は、ＰＣＲにより行った。
　ＥＶ＃５１をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）に、ＥＶ＃３２のＢａｍＨＩ－ＨｉｎｄIII断片（約５００ｂｐ）をライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とが導入され、ＣｅｓＡおよびＣ末端にＨｉｓタグの付いたＣｅｓＢを発現するＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３を作製した。
　ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３において、ＣｅｓＡ遺伝子は、ＣｅｓＢ遺伝子の上流側に位置し、ｐＱＥ－８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、２９塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列を以下に示す。下記配列において、５’側の下線部が前記プロモーターの領域であり、下線を付していない領域が、ＥｃｏＲＩサイトおよびサブクローニングベクター＃ａ１より持ち込まれたｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ由来の配列であり、四角で囲んだ領域が、グルコンアセトバクター・キシリナス由来のＣｅｓＡ遺伝子の開始コドン上流の上流配列（１３塩基長）であり、３’側の下線部がＣｅｓＡ遺伝子の開始コドンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２－５）ＣｅｓＡＢＣ発現系の構築
　ベクター＃ａ８をＸｍａＩおよびＳｐｅＩで処理し、これに、ベクター＃ａ１０のＸｍａＩ－ＡｇｅＩ断片（約１６００ｂｐ）と、ベクター＃１２のＡｇｅＩ－ＳｐｅＩ断片（約１８００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ベクター＃ａ１３を作製した。ベクター＃ａ１３は、ＣｅｓＢの３’側領域から、ＣｅｓＣ全長およびＣｅｓＤの３’末端までを含む。ついで、ＥＶ＃５３をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）に、ベクター＃ａ１３のＢａｍＨＩ－ＳａｃII断片（約２１５０ｂｐ）と、ＥＶ＃５９のＳａｃII－ＨｉｎｄIII断片（約２３００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とが導入され、ＣｅｓＡ、ＣｅｓＢおよびＣ末端にＨｉｓタグを付けたＣｅｓＣを発現するＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３を作製した。
　また、ベクターａ＃１３のＢａｍＨＩ－ＳａｃＩＩ断片に代えて、ベクターａ＃１３のＢａｍＨＩ－ＸｈｏＩ断片（約２７００ｂｐ）、ＥＶ＃５９のＳａｃＩＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ断片に代えてベクターａ＃１６のＸｈｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約１７００ｂｐ）を使用した以外は、同様にして、ライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とが導入され、Ｈｉｓタグが付されないＣｅｓＡ、ＣｅｓＢおよびＣｅｓＣを発現するＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃１００を作製した。
　ＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３において、上流側からＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子およびＣｅｓＣ遺伝子が配置され、ｐＱＥ－８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、２９塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列は、前記ＥＶ＃５３と同様である。
（２－６）ＣｅｓＡＢＣＤ発現系の構築
　ＥＶ＃５３をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片（約９０００ｂｐ）に、ベクター＃ａ１３のＢａｍＨＩ－ＳａｃII断片（約２４００ｂｐ）と、ベクター＃ａ１３のＳａｃII－ＥａｇＩ断片（約２１５０ｂｐ）と、ベクター＃ａ１４のＥａｇＩ－ＨｉｎｄIII断片（約４００ｂｐ）とを、同時にライゲーションした。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とＣｅｓＤ遺伝子（配列番号８）とが導入され、ＣｅｓＡ、ＣｅｓＢ、ＣｅｓＣおよびＣｅｓＤを発現するＣｅｓＡＢＣＤ発現系ＥＶ＃７９を作製した。
　また、前記ベクター＃ａ１４に代えて、ベクター＃ａ１５を使用した以外は、同様にして、ライゲーションを行った。これによって、ＣｅｓＡ遺伝子（配列番号２）とＣｅｓＢ遺伝子（配列番号４）とＣｅｓＣ遺伝子（配列番号６）とＣｅｓＤ遺伝子（配列番号８）とが導入され、ＣｅｓＡ、ＣｅｓＢ、ＣｅｓＣおよびＣ末端にＨｉｓタグの付いたＣｅｓＤを発現するＣｅｓＡＢＣＤ発現系ＥＶ＃８０を作製した。
　ＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３および＃８０において、上流側からＣｅｓＡ遺伝子、ＣｅｓＢ遺伝子、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子が配置され、ｐＱＥ－８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、２９塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列は、前記ＥＶ＃５３と同様である。
（３）ｄｇｃ遺伝子のクローニング
　ＮＢＲＣ（ＮＩＴＥ，　Ｊａｐａｎ）よりサーモトーガ・マリティマ（Thermotoga　maritime）　ＭＳＢ８（ＮＢＲＣ　１００８２６）を入手した。前記菌体の水懸濁液をテンプレートとして、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＰＣＲにより、ＤＧＣ（Ｄｉｇｕａｎｙｌ　ｃｙｃｌａｓｅ）をコードするｄｇｃ遺伝子を増幅した。前記ｄｇｃ遺伝子は、アクセッション番号ＴＭ１７８８（Ｇｅｎｅ　ＩＤ：８９７７４２）（Rao　F．；　Pasunooti　S．；　Ng　Y．；　Zhuo　W．；　Lim　L．；　Liu　A．W．；　Liang　Z．－．，　"Enzymatic　synthesis　of　c－di－GMP　using　a　thermophilic　diguanylate　cyclase"　Anal．　Biochem．　389，　138－142　(2009)）に登録されている。そして、得られた増幅産物を、ＴＡ－ｌｉｇａｔｉｏｎによりｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙベクターに挿入し、ベクター＃ｂ１を作製した。さらに、ベクター＃ｂ１をテンプレートとして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコルによるＰＣＲ（タカラ，　ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬを使用）により、点変異Ｒ１５８Ａを導入し、ｄｇｃ遺伝子（配列番号１４）を導入したベクター＃ｂ２を作製した。
　前記ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
＃ｂ１（配列番号４３）
5'-GCTAGCAAAGAACTGGAATACATGG-3'
＃ｂ２（配列番号４４）
5'-GAATTCTTATGAGAGACTGAAATAAGGC-3'
＃ｂ３（配列番号４５）
5'-CTGGACAGGGTTGCAAGAAGCGATGTGG-3'
＃ｂ４（配列番号４６）
5'-CCACATCGCTTCTTGCAACCCTGTCCAG-3'
　ＰＣＲに使用した前記プライマーと、作製したベクターとの関係を、下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（４）ｄｇｃ発現系の構築
　ＤＧＣを発現するｄｇｃ発現系の構築の手順を、図３に示す。ベクター＃ｂ２をテンプレートとし、下記プライマーと前記プライマー＃ｂ２とを使用して、ＰＣＲ（タカラ，　ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　ＧＸＬを使用）を行った。得られた増幅産物を、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ－ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯクローニング反応で挿入し、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ－ｔＤＧＣを作製した。
プライマー（配列番号４７）
5’-CACCAAAGAACTGGAATACATGG-3’
　前記ｐＢＡＤ２０２／Ｄ－ＴＯＰＯに、以下に示す２つのオリゴヌクレオチドをＴＯＰＯ反応で挿入し、ｐＢＡＤ２０２／Ｒを得た。そして、ＢＢＲＰ（ＮＩＧ，　Ｊａｐａｎ）より分譲されたｐＢＡＤ３３を、ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄIIIで処理し、得られたベクター断片に、ｐＢＡＤ２０２／ＲのＭｌｕＩ－ＨｉｎｄIII断片（約６００ｂｐ）を、ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ２．１を用いてライゲーションした。これによって、ｐＢＡＤ３３／２０２Ｒを作製した。
オリゴヌクレオチド
5’-CACCGAATTCGTCGACGGTACCGCTAGC-3’（配列番号４８）
5’-GCTAGCGGTACCGTCGACGAATTC-3’（配列番号４９）
　前記ｐＢＡＤ３３／２０２ＲをＭｌｕＩおよびＳａｃＩで処理し、得られたベクター断片に、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ－ｔＤＧＣのＭｌｕＩ－ＳａｃＩ断片（約１１００ｂｐ）を、タカラ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　ｖｅｒ２．１を用いてライゲーションした。これによって、ｄｇｃ遺伝子（配列番号１４）が導入され、ＤＧＣを発現するｐＢＡＤ３３／２０２－ｔＤＧＣを作製した。
（５）セルロース合成
　得られたＣｅｓ発現系ベクター（ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３、ＣｅｓＡＢＣ発現系ＥＶ＃６３またはＣｅｓＡＢＣＤ発現系ＥＶ＃８０）と、ｄｇｃ発現系ベクター（ｐＢＡＤ３３／２０２－ｔＤＧＣ）とを、ルビジウム法によって大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ株に導入して、前記両発現系ベクターを共発現する形質転換体を製造した。
　そして、各形質転換体を、０．２％　Ｌ－アラビノースおよび０．４ｍｍｏｌ／Ｌ　イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含む２×ＹＴ培地（ｐＨ７）培地を、温度２８℃の条件下、５時間培養した。
　得られた培養液について、以下のような処理を施し、サンプルを調製し、後述するセルロース分析を行った。まず、前記培養液を、７，５００ｇの条件で遠心分離にかけ、菌体を含む沈殿を回収した。前記沈殿を水に懸濁させた後、この懸濁液に対して、体積比が酢酸８：硝酸１の混合液を、４倍体積量加え、１００℃で３０分処理した。この処理液を遠心分離にかけ、沈殿を回収し、遠心後の上清が中性になるまで、前記沈殿の洗浄を行った。
　セルロース分析は、前記サンプルについて、透過型電子顕微鏡（正式名称　ＪＥＭ－２０００ＥＸＩＩ）を用いた２％酢酸ウランによる負染色観察および電子回折像撮影、およびＳｐｅｃｔｒｕｍ　Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を用いた赤外スペクトルの測定により行った。前記赤外スペクトルの測定は、I型のセルロースおよびII型のセルロースの標準品と共に解析を行った。これらの結果から代表して、Ｃｅｓ発現系ベクターとしてＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５３を導入した形質転換体から得られたサンプルの結果を、図４、図５および図６に示す。
　図４は、負染色観察の結果であり、（Ａ）が、低倍観察の結果であり、（Ｂ）が、高倍観察の結果である。（Ａ）において、スケールバーは１０μｍを示し、（Ｂ）において、スケールバーは、１００ｎｍを示す。また、図５は、電子回折パターンの写真であり、図６は、赤外スペクトルであり、Ｎａｔｉｖｅ　ＢＣはセルロースＩ型の標準サンプル、Ｍｅｒｃｅｒｉｚｅｄ　ＢＣはセルロースII型の標準サンプル、ＥＣ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄは実施例のサンプルの結果を示す。図４において、大きさが１０～２０ｎｍの凝集体が確認された。また、図５において、セルロースII結晶に特徴的な１１０と０２０の回折リングが確認された。さらに、図６に示すように、前記サンプル（ＥＣ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）は、II型のセルロース（Ｍｅｒｃｅｒｉｚｅｄ　ＢＣ）と同じパターンが確認された。これらの結果から、前記サンプルにII型のセルロースが含まれること、すなわち、前記形質転換体の培養によってII型のセルロースが生合成されたことが確認された。なお、その他のＣｅｓ発現系ベクターを導入した形質転換体から得られたサンプルについても、同様の結果であった。また、Ｃｅｓ系遺伝子を挿入した発現ベクターが、本発明の条件を満たさない場合、タンパク質の発現がほとんど確認できなかったことから、セルロース合成は行えないこともわかった。
［実施例２］
　本実施例では、前記ＣｅｓＡＢ発現系を導入した形質転換体が、セルロースを発現していることを確認した。
　前記実施例１と同様にして、Ｃｅｓ発現系ベクター（ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１）と、前記ｄｇｃ発現系ベクター（ｐＢＡＤ３３／２０２－ｔＤＧＣ）とを導入した形質転換体を製造した。
　前記形質転換体を、２×ＹＴ培地（ｐＨ７）培地を用いて、温度２８℃の条件下で培養した。つぎに、０．２％　Ｌ－アラビノースおよび０．４ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧとなるようＬ－アラビノースおよびＩＰＴＧを添加し、さらに、温度２８℃の条件下で６－７時間培養した。前記培養後、５０００ｇで菌体を含む沈殿を回収した。そして、前記菌体を含む沈殿に、体積比が酢酸８：硝酸１の混合液を加え、１００℃で３０分処理した。この処理液を遠心分離にかけ、セルロースの沈殿を回収し、遠心後の上清が中性になるまで、前記セルロースの沈殿の洗浄を行った。前記洗浄後、前記セルロースの沈殿を凍結乾燥し、セルロースの有無を目視で確認した。
　また、コントロール１は、前記ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１に代えて、前記ＣｅｓＡ発現系ＥＶ＃９８を用いた以外は同様にして、コントロール２は、前記ｄｇｃ発現系ベクターのみを用いた以外は同様にして、セルロースの有無を目視で確認した。なお、前記ＣｅｓＡ発現系ＥＶ＃９８は、ＥＶ＃２０をＥｃｏＲＩで処理し、これに、ベクターａ＃０１のＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）をライゲーションし、作製した。
　ＣｅｓＡＢ発現系を導入した形質転換体由来のサンプルでは、セルロースが確認できたのに対し、コントロール１およびコントロール２では、セルロースが確認できなかった。これらの結果から、セルロースの合成には、ＣｅｓＡＢ発現系がセルロースの合成に重要であることがわかった。
［実施例３］
　本実施例では、前記ＣｅｓＡＢ発現系を導入した形質転換体の培養液をセルラーゼ処理し、セルロースが合成されていることを確認した。
　前記実施例１と同様にして、形質転換体の培養液を製造した。つぎに、前記培養液をサンプルとして、カーボン膜を張ったニッケルグリッドにマウントした。前記マウント後のニッケルグリッドをＴＢＳ（Tris　buffered　Saline）および水で洗浄し、５分間乾燥させた。さらに、０．５％セルラーゼ（商品名：Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ　１．５Ｌ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社）を含む緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ、ｐＨ５．６）に、前記ニッケルグリッドを浮かべ、４５－５０℃で１時間処理した。そして、前記処理後のニッケルグリッドを水で洗浄し、前記実施例１と同様にして、２％酢酸ウランによる負染色観察を行った。また、同じサンプルについて、前記セルラーゼを含む緩衝液に代えて、セルラーゼを含まない前記緩衝液を用いた以外は、同様にして負染色観察を行った。
　これらの結果を図７に示す。図７は、負染色観察の結果である。図７において、上段は、セルラーゼ未処理のサンプルの結果であり、下段は、セルラーゼ処理したサンプルの結果であり、左段は、低倍観察の結果であり、右段が、高倍観察の結果である。左段の写真において、スケールバーは、２０００ｎｍを示し、右段の写真において、スケールバーは、２００ｎｍを示す。図７において、上段の写真に示すように、セルラーゼ未処理サンプルでは、いずれの倍率においてもセルロースの繊維構造が観察され、他方、下段の写真に示すように、セルラーゼ処理サンプルでは、いずれの倍率においてもセルロースの繊維構造が観察されなかった。これらの結果から、前記形質転換体の培養によって、セルロースが合成されていることがわかった。
［実施例４］
　本実施例では、上流配列の塩基長およびスペーサー配列の塩基長が異なるＣｅｓＡＢ発現系を作製し、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の発現に上流配列が必要であることを確認した。
（１）Ｃｅｓ発現系の構築
　本実施例で用いたＣｅｓ発現系を図８に示す。図８に示すように、コントロール発現系ＥＶ＃４３は、上流配列を有さない比較例の発現ベクターであり、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９－ＥＶ＃５２は、上流配列を有する実施例の発現ベクターである。コントロール発現系ＥＶ＃４３およびＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９－ＥＶ＃５２の上流配列の長さは、それぞれ、０、２１、２４、１３、７０塩基長であり、スペーサー配列の長さは、それぞれ、２７、６、６、１６、１６塩基長であり、プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子（開始コドン）との間の長さは、それぞれ、２７、２７、３０、２９および８６塩基長である。本実施例では、コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０およびＥＶ＃５２を作製した。また、ＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１は、実施例１のＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃５１を用いた。
　前記プライマー＃ａ４および下記のプライマー＃ａ２６－２９を用いた以外は、前記実施例１（１）と同様にして、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片をｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙにライゲーションし、ベクター＃ａ１７－＃ａ２０を作製した。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す。
＃ａ２６（配列番号５０）
5'-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTACATATGTCAGAGGTTCAGTCGCCAGTA-3'
＃ａ２７（配列番号５１）
5'-GAATTCTTATTATCGGACGAGCTATTGATG-3'
＃ａ２８（配列番号５２）
5'-GAATTCTATTTATTATCGGACGAGCTATTGATG-3'
＃ａ２９（配列番号５３）
5'-ATGCGTCTGACGGTTTTCTTTTGAATATAT-3'
　また、ＰＣＲに使用した前記プライマーと、作製したサブクローニングベクターとの関係を、下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ベクター＃ａ１のＥｃｏＲＩ断片に代えて、ベクター＃ａ１７－＃ａ２０のＥｃｏＲＩ断片（約６００ｂｐ）をそれぞれ用いた以外は、前記実施例１（２－４）と同様にして、コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、５０および５２を作製した。
　コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、実施例１のＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２において、ＣｅｓＡ遺伝子は、ＣｅｓＢ遺伝子の上流側に位置し、ｐＱＥ－８０Ｌ由来のＴ５プロモーターとＣｅｓＡ遺伝子との間の長さは、それぞれ２７、２７、３０、２９および８６塩基長となった。前記プロモーターからＣｅｓＡ遺伝子の５’領域までの配列を以下に示す。下記配列において、５’側の下線部が前記プロモーターの領域であり、下線を付していない領域が、ｐＱＥ－８０Ｌベクター、ＥｃｏＲＩサイト、またはＥｃｏＲＩサイトおよびサブクローニングベクターｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙより持ち込まれたｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ由来の配列であり、四角で囲んだ領域が、グルコンアセトバクター・キシリナス由来のＣｅｓＡ遺伝子の開始コドン上流の上流配列（それぞれ、０、２１、２４、１３および７０塩基長）であり、３’側の下線部がＣｅｓＡ遺伝子の開始コドンである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（２）ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の発現の確認
　Ｃｅｓ発現系ベクター（コントロール発現系ＥＶ＃４３ならびにＣｅｓＡＢ発現系ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）をそれぞれ用いた以外は、前記実施例１（５）と同様にして、形質転換体を作製した。そして、各形質転換体を、２×ＹＴ培地培地を用いて、温度２８℃の条件下で培養した。さらに、０．５ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧを添加し、温度２８℃の条件下で５時間培養した。
　培養した形質転換体を集菌し、ライシスバッファー（１０　ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ８），５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，０．０２％　ＮａＮ３，５０　μｇ／ｍＬ　クロラムフェニコール）に懸濁し、さらに、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、終濃度５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％グリセリン、０．５％　ＳＤＳのＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルを作製し、これをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した。前記電気泳動後、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質は、それぞれ、参考文献１に記載のポリクローナル抗ＣｅｓＡ抗体およびポリクローナル抗ＣｅｓＢ抗体を用いて検出した。また、ネガティブコントロールは、ＩＰＴＧ添加前に各形質転換体を回収した以外は同様にして、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質を検出した。
参考文献１：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　３４６，２７６０－２７６８　（２０１１）
　これらの結果を図９に示す。図９は、ウエスタンブロッティングの写真であり、ＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真である。また、図９において、写真の左側は、分子量マーカーの分子量を示し、写真の上側は、形質転換に用いた発現ベクターおよびサンプルの種類を示す。
　図９に示すように、ネガティブコントロール（発現誘導前）では、いずれも、ＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドは観察されなかった。そして、図９に示すように、上流配列を有するＣｅｓＡＢ発現系（ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）では、８５ｋＤａ付近に正常なＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。しかし、上流配列を有さないコントロール発現系ＥＶ＃４３は、１００ｋＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これは、後述するように、ＣｅｓＢタンパク質が、正しいフォールディングを形成できなかったことによる。なお、図示していないが、ネガティブコントロールでは、いずれも、ＣｅｓＡタンパク質の発現を示すバンドは観察されなかった。また、上流配列を有するＣｅｓＡＢ発現系（ＥＶ＃４９、ＥＶ＃５０、ＥＶ＃５１およびＥＶ＃５２）および上流配列を有さないコントロール発現系ＥＶ＃４３では、いずれも７０ｋＤａ付近に正常なＣｅｓＡタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これらの結果から、プロモーターと５’側遺伝子の開始コドンとの間に、５’側遺伝子の前記上流配列を有することで、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質が発現することがわかった。また、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質が発現することで、セルロースが合成されることから、セルロース合成には、前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であるといえる。
［実施例５］
　本実施例では、ＣｅｓＢ発現系、コントロール発現系およびＣｅｓＡＢ発現系を用い、正常なＣｅｓＢタンパク質の発現には、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の共発現および前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であることを確認した。
　Ｃｅｓ発現系ベクターとして、ＣｅｓＡＢ発現系＃５１のみを用い、０．２ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧを添加した以外は、前記実施例４（２）と同様にしてサンプル（－βＭＥサンプル）を調製した。また、前記サンプルに、１％となるようにβメルカプトエタノール添加し、ジスルフィド結合を還元した＋βＭＥサンプルを調製した。そして、前記実施例４（２）と同様にして、ＣｅｓＢタンパク質の発現を検出した。また、コントロール１は、形質転換体に代えて、正常なＣｅｓＡタンパク質および正常なＣｅｓＢタンパク質を発現する酢酸菌を用い、コントロール２は、前記ＣｅｓＡＢ発現系＃５１に代えて、ＣｅｓＢ発現系＃３２を用い、コントロール３は、前記ＣｅｓＡＢ発現系＃５１に代えて、コントロール発現系ＥＶ＃４３を用い、それ以外は同様にして、－βＭＥサンプルおよび＋βＭＥサンプルを調製し、各サンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を検出した。
　これらの結果を図１０に示す。図１０は、ウエスタンブロッティングの写真であり、（Ａ）は、－βＭＥサンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真であり、（Ｂ）は、＋βＭＥサンプルにおけるＣｅｓＢタンパク質の発現を示す写真である。図１０（Ａ）および（Ｂ）において、写真の左側は、分子量マーカーの分子量を示し、各レーンは、左から、酢酸菌、ＣｅｓＢ発現系＃３２、コントロール発現系ＥＶ＃４３、ＣｅｓＡＢ発現系＃５１の結果を示す。
　図１０（Ａ）に示すように、酢酸菌およびＣｅｓＡＢ発現系＃５１の－βＭＥサンプルでは、１００ＫＤａ付近に正常なフォールディングを有するＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察されるのに対し、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３の－βＭＥサンプルでは、９０ＫＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。また、（Ｂ）に示すように、酢酸菌およびＣｅｓＡＢ発現系＃５１の＋βＭＥサンプルでは、８５ＫＤａ付近にジスルフィド結合が還元されたＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察されるのに対し、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３の＋βＭＥサンプルでは、９０ＫＤａ付近にＣｅｓＢタンパク質の発現を示すバンドが観察された。これらの結果から、ＣｅｓＢ発現系＃３２またはコントロール発現系ＥＶ＃４３で観察されたＣｅｓＢタンパク質は、ミスフォールディングしたＣｅｓＢタンパク質であることがわかった。また、以上の結果から、正常なフォールディングを有するＣｅｓＢタンパク質の発現には、ＣｅｓＡタンパク質およびＣｅｓＢタンパク質の共発現および前記５’側遺伝子の前記上流配列が必要であることがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１２年１２月２８日に出願された日本出願特願２０１２－２８８３３５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　以上のように、本発明によれば、前記本発明のセルロース製造用ベクターを宿主に導入した形質転換体において、前記セルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを共発現することによって、簡便にセルロースを製造できる。また、前記形質転換体の生合成によってセルロースを製造できるため、従来のように、パルプを原料として使用する必要がなく、天然原料の使用による環境への負荷も回避できる。したがって、本発明は、セルロースを原料とする様々な産業に有用な技術といえる。

Claims (22)

  1. プロモーター、ＣｅｓＡ遺伝子およびＣｅｓＢ遺伝子を有し、
    プロモーターと、前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子のうち上流側の５’側遺伝子の開始コドンとの間に、前記５’側遺伝子の由来生物における前記５’側遺伝子の上流配列を有することを特徴とする、セルロース製造用ベクター。
  2. 前記上流配列の長さが、１３～１００塩基長である、請求項１記載のセルロース製造用ベクター。
  3. 前記上流配列が、前記５’側遺伝子の開始コドンに連結している、請求項１または２記載のセルロース製造用ベクター。
  4. 前記上流配列が、前記５’側遺伝子の由来生物において、前記５’遺伝子の開始コドンに連結する上流配列である、請求項１から３のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  5. 前記上流配列が、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）またはその部分配列を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  6. 前記上流配列が、配列番号１６の塩基配列（GGACGAGCTATT）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  7. 前記配列番号１６の塩基配列が、前記上流配列における３’領域の配列であり、その３’末端が、前記５’側遺伝子の開始コドンと連結している、請求項６記載のセルロース製造用ベクター。
  8. 前記プロモーターと前記開始コドンとの間の長さが、１３～１００塩基長である、請求項１から７のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  9. 前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子を、上流側から、この順序で有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  10. さらに、ＣｅｓＣ遺伝子およびＣｅｓＤ遺伝子の少なくとも一方を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  11. 前記ＣｅｓＡ遺伝子および前記ＣｅｓＢ遺伝子が、酢酸菌由来である。請求項１から１０のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  12. 前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター属である、請求項１１記載のセルロース製造用ベクター。
  13. 前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター・キシリナスである、請求項１２記載のセルロース製造用ベクター。
  14. 前記プロモーターが、ｐＱＥベクターのプロモーターである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  15. 前記プロモーターが、ファージＴ５プロモーターである、請求項１から１４のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクター。
  16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクターを含むことを特徴とする、形質転換体。
  17. さらに、ｄｇｃ遺伝子を有するベクターを含む、請求項１６記載の形質転換体。
  18. 前記ｄｇｃ遺伝子が、サーモトーガ・マリティマ由来である、請求項１６または１７に記載の形質転換体。
  19. 前記形質転換体が、大腸菌である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
  20. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のセルロース製造用ベクターとｄｇｃ遺伝子とを含む形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする、セルロースの製造方法。
  21. 前記セルロースが、セルロースＩまたはセルロースIIである、請求項２０に記載の製造方法。
  22. 請求項２０または２１に記載のセルロースの製造方法により得られることを特徴とする、セルロース。
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