DE102007023986A1

DE102007023986A1 - Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose und Enzym, das für dieses Verfahren verwendet wird

Info

Publication number: DE102007023986A1
Application number: DE102007023986A
Authority: DE
Inventors: Takuji Tsukuba Oka; Yoshifumi Tsukuba Jigami
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2006-05-23
Filing date: 2007-05-23
Publication date: 2008-01-03
Also published as: JP4258670B2; US20080064069A1; JP2008000124A

Abstract

Ein Protein mit (a) einer Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, oder (b) einer Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 8 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, wobei die Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität und/oder eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist, sowie ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Proteins.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das an der Synthese von UDP-Rhamnose beteiligt ist, einen rekombinanten Vektor, der dieses Gen aufweist, eine Transformante, die mit dem rekombinanten Vektor transformiert ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose unter Verwendung dieser Transformante.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es wurde gezeigt, dass Zuckerketten von Glykoproteinen und dergleichen eine sehr wichtige Rolle im lebenden Organismus spielen, und dass infolge dessen die Manipulation der Zuckerketten für die willkürliche Modifikation der Struktur einer Zuckerkette zu einer wichtigen Technologie wird. Derzeit umfasst das Verfahren zur Modifikation einer Zuckerkette ein chemisches Verfahren, bei dem eine chemisch synthetisierte, gewünschte Zuckerkette an ein Protein gebunden wird; und ein biologisches Verfahren, bei dem eine Zuckerkette in eine gewünschte Zuckerkette umgewandelt wird, indem ein genetisches Verfahren eingesetzt wird, das eine intrinsische Funktion der Zellen verwendet, um eine Zuckerkette zu synthetisieren, oder indem eine Glycosyltransferase selbst mit einem Protein umgesetzt wird, um dadurch das gewünschte Glykoprotein zu ergeben. Das chemische Verfahren eröffnet die Möglichkeit zur Synthese einer gewünschten Zuckerkette in einer großen Menge, aber aufgrund der Komplexität der Zuckerkette führt es nicht zu einer leichten Lieferbarkeit einer jeden Art von Zuckerkette oder es versagt dahin gehend, eine große Menge einer chemisch synthetisierten Zuckerkette in ergiebiger Weise an ein Protein zu binden. Bei dem biologischen Verfahren werden andererseits die Expression eines Gens, das mit der Synthese der Zuckerkette in Beziehung steht, und die Kontrolle der Funktion desselben durch die Entwicklung eines genetischen Verfahrens ermöglicht, und dieses Verfahren ermöglicht dadurch eine in vivo Modifikation der Zuckerkette durch den Einsatz von lebenden Zellen in einem lebenden Organismus. Darüber hinaus ist die Synthese einer Zuckerkette unter Verwendung einer Glycosyltransferase in vitro ebenso sehr nützlich und ermöglicht die Herstellung einer großen Menge von gleichförmigen Zuckerketten. Andererseits ist bei der Synthese einer Zuckerkette in vivo und in vitro unter Verwendung eines biologischen Verfahrens ein Zucker-Nukleotid wesentlich als ein Glycosyl-Donor (Saccharid-Donor) für die Glycosyltransferase, und dieses Zucker-Nukleotid ist zu teuer, um es in einer Massenproduktion einzusetzen. Dies liegt daran, dass das Zucker-Nukleotid eine labile und hochgradig reaktive Substanz darstellt, die über eine energiereiche Bindung gebunden ist, und dass es in einer sehr geringen Menge im lebenden Organismus gebildet wird, so dass die in lebenden Organismen hergestellten Mengen gering sind und es somit kaum ermöglichen, dass die Zuckerkette in einer großen Menge hergestellt wird.
In den letzten Jahren wurde ein System zur Herstellung von verhältnismäßig vielen Arten von Zucker-Nukleotiden zunehmend praktisch anwendbar, indem ein Produktionssystem unter Verwendung von Bakterien eingesetzt wird, welches damit die Lieferung von Zucker-Nukleotiden in zuverlässiger Weise ermöglicht. Jedoch werden in diesem System, welches Bakterien verwendet, die Zucker-Nukleotide durch Mischung zweier Arten von Bakterien und durch Aufschließen der Bakterien hergestellt, um das Rohmaterial, das in den Zellen von einer Art der Bakterien enthalten ist, für jene der anderen Art der Bakterien zugänglich zu machen, so dass die Menge der hergestellten Zucker-Nukleotide nicht so hoch ist, wenn das Reaktionsverfahren bis zu einem gewissen Ausmaß fortgeführt wird, und somit besteht eine Nachfrage für die Entwicklung von neuen Verfahren. Darüber hinaus gibt es keine Beschreibung für ein System zur Massenherstellung von UDP-Rhamnose in einem Produktionssystem, bei dem Bakterien eingesetzt werden.
Unter den Zucker-Nukleotiden ist UDP-Rhamnose wesentlich für die Synthese einer Rhamnose enthaltenden Zuckerkette als Glycosyl-Donor für eine Rhamnose-Transferase. Viele der Rhamnose enthaltenden Zuckerketten, für die Rhamnogalacturonan I (RG-I) oder Rhamnogalacturonan II (RG-II) als Beispiele stehen, erfüllen eine funktionell wichtige Rolle, und somit ist es erwünscht, den Glycosyl-Donor billig in einer großen Menge zu liefern. Darüber hinaus gibt es auch Rhamnose enthaltende, O-verknüpfte Zuckerketten, und die UDP-Rhamnose wird ebenso als Glycosyl-Donor für die Biosynthese solcher Zuckerketten verwendet. Dementsprechend schätzt man, dass eine neue Nachfrage hierfür entsteht, wenn Forschung und Entwicklung dieser Rhamnose enthaltenden Substanzen vorangetrieben werden, um ihre wichtigen Funktionen aufzuklären. Diese UDP-Rhamnose wird aus UDP-Glucose in einer dreistufigen Reaktion synthetisiert, die durch ein Enzym katalysiert wird (RHM2) (1). Das Enzym, welches diese dreistufige Reaktion katalysiert, wird durch ein einzelnes Gen codiert, dessen N-terminale Domäne und C-terminale Domäne sich voneinander in der Funktion unterscheiden. Das heißt der erste Schritt der Reaktion wird durch UDP-Glucose-4,6-dehydratase veranlasst, die in der N-terminalen Domäne des Proteins RHM2 codiert ist, um UDP-4-Keto-6-deoxyglucose zu ergeben. Der nachfolgende zweite bzw. dritte Schritt der Reaktion wird durch UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase bzw. UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase veranlasst, welche in der C-terminalen Domäne des Proteins RHM2 codiert sind, um UDP-Rhamnose zu ergeben.
Diese Enzyme sind universelle Enzyme, welche alle lebenden Organismen besitzen, die UDP-Rhamnose verwenden. Jedoch verbrauchen solche lebenden Organismen die synthetisierte UDP-Rhamnose, und daher wird UDP-Rhamnose in ihren Zellen nicht angereichert. Wenn UDP-Rhamnose aus lebenden Organismen isoliert wird, ist dementsprechend die Menge der hergestellten UDP-Rham nose sehr gering, und die UDP-Rhamnose ist teuer. Darüber hinaus gibt es kein Beispiel einer Synthese von UDP-Rhamnose mittels eines genetischen Verfahrens.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit (a) einer Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, oder mit (b) einer Aminosäuresequenz, die durch die SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, wobei in der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 20, SEQ ID NR. 6 oder SEQ ID NR. 8 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, wobei die Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität und/oder eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Proteins.
Andere und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden besser anhand der folgenden Beschreibung ersichtlich, die in geeigneter Weise auf die begleitenden Zeichnungen Bezug nimmt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt eine Ansicht dar, welche eine Kurzdarstellung eines Verfahrens zur Synthese von UDP-Rhamnose zeigt.
2 stellt eine Fotografie dar, bei welcher die Expression der Proteine RHM1, RHM2 und RHM3 durch die in Beispiel 2 erhaltenen Transformanten mittels Western-Blot bestätigt wurde.
3 stellt Profile dar, welche das Ergebnis der Synthese von UDP-Rhamnose unter Verwendung der cytoplasmatischen Fraktion aus jeder der Transformanten zeigen, die in Beispiel 5 erhalten wurden.
4 stellt ein Profil dar, welches das Ergebnis der Messung durch ESI-MS von einer Fraktion zeigt, die mittels HPLC in Beispiel 5 abgetrennt wurde.
5 stellt ein Profil dar, welches das Ergebnis des HPLC-Nachweises von UDP-Rhamnose zeigt, die aus dem Cytoplasma von Beispiel 6 abgetrennt wurde.
6 stellt eine Fotografie dar, in der die Expression der Proteine RHM2-N und RHM2-C durch die in Beispiel 7 erhaltenen Transformanten mittels Western-Blot bestätigt wurde.
7 stellt Profile dar, welche das Ergebnis der Synthese von UDP-Rhamnose unter Verwendung der cytoplasmatischen Fraktion aus jeder der Transformanten zeigen, die in Beispiel 10 erhalten wurden.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder machten ausführliche Studien zur Lösung der vorstehend beschriebenen Probleme, und als ein Ergebnis isolierten sie zunächst ein Gen, welches für UDP-Glucose-4,6-dehydratase, UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase und UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase codiert (nachfolgend auch als UDP-Glucose-4,6-dehydratase-3,5-epimerase/4-Ketoreduktase bezeichnet), welche die Synthese von UDP-Rhamnose in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) katalysieren, und sie klärten die Struktur dieses Gens auf. Darüber hinaus fanden sie, dass durch die funktionelle Expression dieses Gens die UDP-Rhamnose in ergiebiger Weise in vivo und in vitro synthetisiert werden kann. Darüber hinaus fanden die vorliegenden Erfinder in überraschender Weise, dass, wenn das vorstehende Gen in die UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Domäne sowie die UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase- und UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Domäne geteilt wird, und beide Domänen gleichzeitig exprimiert werden (getrennt exprimiert werden), die Ergiebigkeit bei der Herstellung von UDP-Rhamnose verbessert wird, im Vergleich mit dem Fall, wenn das Gen, das alle diese Domänen enthält, exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Befunde erreicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Mittel bereitgestellt:

(1) Ein Protein, welches umfasst:
(a) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, oder
(b) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in der SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
(2) Eine DNA, welche für das Protein codiert, das im vorstehenden Punkt (1) beschrieben wurde.
(3) Eine DNA, welche umfasst:
(a) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID Nr. 19 dargestellt wird, oder
(b) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in der SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität codiert.
(4) Ein rekombinanter Vektor, welcher die DNA umfasst, die in den vorstehenden Punkten (2) oder (3) beschrieben wurde.
(5) Eine Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (4) beschrieben in eine Wirtszelle erhalten wird.
(6) Ein Protein, welches umfasst:
(a) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, oder
(b) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in der SEQ ID NR. 6 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität aufweist.
(7) Eine DNA, welche für das Protein codiert, das in dem vorstehenden Punkt (6) beschrieben wurde.
(8) Eine DNA, welche umfasst:
(a) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, oder
(b) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 5 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität codiert.
(9) Ein rekombinanter Vektor, welcher die DNA umfasst, die in den vorstehenden Punkten (7) oder (8) beschrieben wurde.
(10) Eine Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (9) beschrieben in eine Wirtszelle erhalten wird.
(11) Ein Protein, welches umfasst:
(a) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, oder
(b) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in der SEQ ID NR. 8 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
(12) Eine DNA, welche für das Protein codiert, das in dem vorstehenden Punkt (11) beschrieben wurde.
(13) Eine DNA, welche umfasst:
(a) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, oder
(b) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 7 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität codiert.
(14) Ein rekombinanter Vektor, welcher die DNA umfasst, die in den vorstehenden Punkten (12) oder (13) beschrieben wurde.
(15) Eine Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (14) beschrieben in eine Wirtszelle erhalten wird.
(16) Ein rekombinanter, Vektor, der die DNA wie in den vorstehenden Punkten (7) oder (8) beschrieben und die DNA wie in den vorstehenden Punkten (12) oder (13) beschrieben umfasst.
(17) Eine Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (9) beschrieben und des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (14) beschrieben in dieselbe Wirtszelle erhalten wird.
(18) Eine Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (16) beschrieben in eine Wirtszelle erhalten wird.
(19) Ein Protein, das eine Aminosäure-Sequenz mit einer Homologie von 70% oder mehr mit der Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, umfasst, wobei diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
(20) Das Protein wie in dem vorstehenden Punkt (19) beschrieben, welches ein Protein ist, das aus einer Reispflanze (Oryza sativa) oder aus einer Tabakpflanze (Nicotiana tabacum) stammt.
(21) Eine DNA, welche für das Protein codiert, das in den vorstehenden Punkten (19) oder (20) beschrieben wurde.
(22) Ein rekombinanter Vektor, welcher die DNA umfasst, die in dem vorstehenden Punkt (21) beschrieben wurde.
(23) Eine Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors wie in dem vorstehenden Punkt (22) beschrieben in eine Wirtszelle erhalten wird.
(24) Die Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (17), (18) und (23) beschrieben, wobei die Wirtszelle UDP-Glucose in der Zelle enthält.
(25) Die Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (17), (18), (23) und (24) beschrieben, wobei die Wirtszelle kein Enzym aufweist, das UDP-Rhamnose verbraucht.
(26) Die Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (10), (15), (17), (18), und (23) bis (25) beschrieben, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
(27) Ein Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst:
– Kultivieren der Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (17), (18) und (23) bis (26) beschrieben, um eine Kultur zu ergeben, und
– Extrahieren der UDP-Rhamnose aus der Kultur.
(28) Ein Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst:
– Kultivieren der Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (17), (18) und (23) bis (26) beschrieben, in einem Medium, um eine Kultur zu ergeben, und
– in Kontakt bringen von mindestens einem aus einem Bestandteil der erhaltenen Kultur, einem Material, das durch Behandlung der Kultur erhalten wurde, einem Enzymextrakt und einem gereinigten Enzym mit UDP-Glucose, wobei dadurch UDP-Glucose in UDP-Rhamnose umgewandelt wird.
(29) Ein Verfahren zur Herstellung einer markierten UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst:
– Kultivieren der Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (17), (18) und (23) bis (26) beschrieben, mit einer Glucose, die mit einem Isotop substituiert ist, als Kohlenstoffquelle, um eine Kultur zu ergeben, und
– Extrahieren einer mit einem Isotop markierten UDP-Rhamnose aus der erhaltenen Kultur.
(30) Ein Verfahren zur Herstellung einer markierten UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst:
– in Kontakt bringen von mindestens einem aus einem Bestandteil einer Kultur, einem Material, das durch Behandlung der Kultur erhalten wurde, einem Enzymextrakt und einem gereinigten Enzym, welcher Bestandteil durch Kultivieren der Transformante, wie in einem der vorstehenden Punkte (5), (17), (18) und (23) bis (26) beschrieben, in einem Medium erhalten wird, mit einer UDP-Glucose, die mit einem Isotop substituiert ist, und
– Extrahieren einer mit einem Isotop markierten UDP-Rhamnose.
(31) Das Verfahren zur Herstellung einer markierten UDP-Rhamnose, wie in den vorstehenden Punkten (29) oder (30) beschrieben, wobei das Isotop ¹³C oder ¹⁴C ist.

Die vorstehende Erfindung wird nachfolgend in Einzelheiten erläutert.
Das Protein des ersten Enzyms der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, das von Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) stammt, und drei (3) Aktivitäten aufweist, das heißt eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität, und das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird (Nachfolgend werden die Enzymproteine, welche durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 und SEQ ID NR. 20 dargestellt werden, auch als Protein RHM1, Protein RHM2 bzw. Protein RHM3 bezeichnet). Jedoch ist das Protein des ersten Enzyms der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränkt und umfasst ein Protein mit einer Aminosäure-Sequenz, welche durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto- reduktase-Aktivität aufweist.
Das Gen des ersten Enzyms der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, welche für die vorstehend beschriebene Aminosäure-Sequenz codiert. Insbesondere wird die Nukleotid-Sequenz durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargestellt (nachfolgend werden die Gene, welche durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 und SEQ ID NR. 19 dargestellt werden, auch als Gen RHM1, Gen RHM2 bzw. Gen RHM3 bezeichnet), jedoch ist das Gen des ersten Enzyms in der vorliegenden Erfindung nicht darauf begrenzt, und es umfasst ebenso ein Gen mit einer Nukleotid-Sequenz, welche durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, welche in SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität codiert.
In der vorliegenden Erfindung können das Gen RHM1, das Gen RHM2, das Gen RHM3 oder das vorstehend beschriebene, mutierte Gen aus Arabidopsis thaliana dazu verwendet werden, um UDP-Rhamnose mittels eines genetischen Verfahrens in ergiebiger Weise herzustellen, wobei das Herstellungsverfahren grob in zwei Verfahren unterteilt wird, das heißt ein Verfahren zu dessen Herstellung in Zellen (Kulturverfahren), sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung außerhalb von Zellen (Verfahren zur Umsetzung mit dem Enzym).
Von diesen Verfahren umfasst das Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose in Zellen zum Beispiel die folgenden Schritte:

(1) Die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 aus Arabidopsis thaliana [UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Gen, UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase- Gen und UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Gen (UDP-Glucose-4,6-dehydratase-3,5-epimerase/4-Keto-reduktase-Gen)] werden erhalten;
(2) Die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 aus Arabidopsis thaliana werden in einen Vektor eingeführt, wie zum Beispiel ein Expressionsplasmid, um einen Vektor zu konstruieren, der die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 umfasst;
(3) Der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt, die UDP-Glucose in der Zelle aufweist, um die Wirtszelle zu transformieren; und
(4) Der rekombinante Vektor gemäß dem vorstehenden Punkt (3) wird in einem Medium kultiviert; und UDP-Rhamnose wird aus der erhaltenen Kultur oder aus einem Material gesammelt, das durch Behandlung der Kultur erhalten wird, wie zum Beispiel aufgeschlossenem Zellmaterial, und die UDP-Rhamnose wird darüber hinaus isoliert und/oder gereinigt.

In der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose außerhalb der Zellen die folgenden Schritte:

(1) Die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 aus Arabidopsis thaliana (UDP-Glucose-4,6-dehydratase-3,5-epimerase/4-Keto-reduktase-Gen) werden erhalten;
(2) Die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 aus Arabidopsis thaliana werden in einen Vektor eingeführt, wie zum Beispiel ein Expressionsplasmid, um einen Vektor zu konstruieren, der die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 umfasst;
(3) Der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingeführt, die UDP-Glucose in der Zelle aufweist, um die Wirtszelle zu transformieren; und
(4) Eine Kultur, ein Material, das durch die Behandlung der Kultur erhalten wird, wie zum Beispiel aufgeschlossenes Zellmaterial, ein intrazellulärer Extrakt, oder ein Enzym, das aus dem Extrakt isoliert und/oder gereinigt wurde, wird als eine Enzymquelle verwendet, und UDP-Glucose und NADPH werden hierzu gegeben und wandeln dadurch UDP-Glucose in UDP-Rhamnose um, welche anschließend isoliert und/oder gereinigt wird. Die UDP-Rhamnose ist wesentlich als ein Glycosyl-Donor für die Synthese einer Rhamnose enthaltenden Zuckerkette, und sie ist daher nützlich für das Hinzufügen von Rhamnose an eine Zuckerkette, die als funktionell wichtig angesehen wird.

In alternativer Weise werden zum Beispiel eine Kultur der Transformante, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, welcher die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3 aus Arabidopsis thaliana enthält, ein Material, das durch Behandlung der Kultur erhalten wurde, ein intrazellulärer Extrakt oder ein Enzym, das aus dem Extrakt isoliert und/oder gereinigt wurde, sowie eine Kultur einer Zelle, die inhärent UDP-Glucose herstellt, ein Material, das durch Behandlung der Kultur erhalten wird, ein intrazellulärer Extrakt oder ein Enzym, das aus dem Extrakt isoliert und/oder gereinigt wurde, getrennt hergestellt, und diese Materialien lässt man der Reihe nach oder gleichzeitig auf UDP-Glucose einwirken, um UDP-Glucose in UDP-Rhamnose umzuwandeln und dadurch UDP-Rhamnose herzustellen.
Das Protein RHM2, welches durch die SEQ ID NR. 4 dargestellt wird, und dessen Gen umfassen in ihrer Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Domäne, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Domäne und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Domäne.
Das Protein des zweiten Enzyms der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, wel ches der UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Domäne des Proteins RHM2 entspricht, das eine Aminosäure-Sequenz aufweist, welche durch die SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, oder eine Aminosäure-Sequenz, die durch die SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, wobei in der Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 6 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität aufweist (Nachfolgend wird das Protein des Enzyms, welches durch SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, auch als Protein RHM2-N bezeichnet).
Das zweite Gen der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, welche für das Protein RHM2-N oder ein mutiertes Protein desselben codiert. Insbesondere ist das zweite Gen ein Gen, das durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird (nachfolgend wird das Gen, das durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, auch als Gen RHM2 bezeichnet), jedoch ist das zweite Gen der vorliegenden Erfindung nicht darauf begrenzt und umfasst ebenso eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, wobei in der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 5 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt, und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer Enzymaktivität codiert, das heißt für eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität.
Das Protein des dritten Enzyms der vorliegenden Erfindung ist ein Protein, welches sowohl eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Domäne als auch eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Domäne des Proteins RHM2 enthält, welches Protein eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, oder eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in SEQ ID NR. 8 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz die zwei Enzymaktivitäten einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase aufweist (nachfolgend wird das Enzym-Protein, das durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, auch als Protein RHM2-C bezeichnet).
Das dritte Gen der vorliegenden Erfindung ist eine DNA, die für das Protein RHM2-C oder ein mutiertes Protein desselben codiert. insbesondere ist das dritte Gen eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird (nachfolgend wird das Gen, das durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, auch als Gen RHM2-C bezeichnet), jedoch ist das dritte Gen der vorliegenden Erfindung nicht darauf begrenzt und umfasst ebenso eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 7 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit den zwei Enzymaktivitäten codiert, das heißt der UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und der UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität.
Die Proteine des zweiten und dritten Enzyms können leicht durch übliche genetische Verfahren unter Verwendung der zweiten und dritten Gene erhalten werden. Die erhaltenen Proteine des zweiten und dritten Enzyms, wie in 1 gezeigt ist, katalysieren eine Reaktion der Umwandlung von UDP-Glucose in UDP-4-Keto-deoxyglucose bzw. eine Reaktion der Umwandlung von UDP-4-Keto-deoxyglucose in UDP-Rhamnose, und somit können diese Enzyme der Reihe nach oder gleichzeitig dazu verwendet werden, UDP-Rhamnose aus UDP-Glukose herzustellen.
Jedoch ist das ergiebigste Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren der Co-Expression des zweiten und dritten Gens in derselben Wirtszelle. Die Menge der hergestellten UDP-Rhamnose wird durch dieses Verfahren erheblich verbessert im Vergleich mit dem Verfahren, welches das Gen RHM2 verwendet.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in näheren Einzelheiten beschrie ben. Die Aminosäure-Sequenzen und die Nukleotid-Sequenzen in dieser Beschreibung, wenn sie als Abkürzung verwendet werden, sollen sich in Übereinstimmung mit den Regeln der IUPAC-IUB oder mit gewöhnlichen Namen oder mit der im Stand der Technik üblichen Praxis befinden.
Die Gene RHM1, RHM2 oder RHM3, das Gen RHM2-N und das Gen RHM2-C der vorliegenden Erfindung können durch Isolierung nach dem PCR-Verfahren erhalten werden, wobei eine cDNA-Bank, die in üblicher Weise aus Arabidopsis thaliana hergestellt wurde, als Templat verwendet wird. Für die PCR des Gens RHM2-N und des Gens RHM2-C kann das Gen RHM2 als Templat verwendet werden.
Eine cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana kann gemäß einem üblichen Verfahren hergestellt werden, wobei ein üblicherweise verwendeter Plasmid-Vektor oder ein Vektor aus einem λ-Phagen verwendet wird.
Das PCR-Verfahren ist ein Verfahren, bei dem ein bestimmter Bereich einer DNA vervielfältigt werden kann, insbesondere 100.000-fach bis 1.000.000-fach in etwa 2 bis 3 Stunden in vitro mit einer Kombination von Sens- und Antisens-Primern, einer thermostabilen DNA-Polymerase und einem DNA-Amplifikationssystem, und das Gen der vorliegenden Erfindung und sein Fragment können durch dieses PCR-Verfahren auf der Grundlage der Homologie der Nukleotid-Sequenz mit jener Sequenz für dieses Enzym aus einer anderen Spezies oder dergleichen vervielfältigt werden.
Der Vektor, in welchen das vorstehende Gen integriert wird, kann ein beliebiger Vektor sein, der zur Replikation und Retention in einem Wirt in der Lage ist. Beispiele eines Vektors umfassen die Plasmide pBR322 und pUC19, die aus E. coli stammen.
Das Verfahren zur Integration des Vektors kann zum Beispiel nach dem Verfahren von T. Maniatis et al. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborstory, p. 239, 1982) erfolgen.
Das klonierte Gen kann stromabwärts von einem Promotor in einen Vektor eingebunden werden, der für die Expression geeignet ist, um einen Expressionsvektor zu ergeben. Beispiele für den Vektor umfassen die aus der Hefe stammenden Plasmide YEp352GAP, YEp51, pSH19, und dergleichen.
Die Gene können das Codon ATG als Translations-Startcodon an ihrem 5'-Ende aufweisen, und sie können die Codons TAA, TGA oder TAG als Translations-Stoppcodons an ihrem 3'-Ende aufweisen. Die Gene können eine 6-fache Histidin-Sequenz, ein Gen zur Markierung eines Antigens als einen Teil des Hämagglutinin-Proteins, oder ein Gen zur Markierung eines Proteins, wie zum Beispiel das GST-Protein, an ihrem 5'- oder 3'-Ende aufweisen und exprimieren, um die Isolierung und/oder Reinigung des Proteins zu erleichtern. Insbesondere ist das Stoppcodon vorzugsweise am C-Terminus des Gens RHM2-N lokalisiert, das durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, und das Start-Codon (ATG) ist vorzugsweise am N-Terminus des Gens RHM2-C lokalisiert, welches durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, und die sich ergebenden Proteine weisen jeweils naturgemäß die Enzymaktivität auch ohne Methionin auf. Andererseits besitzen zum Beispiel die Proteine, welche einen Methionin-Histidin-Anhang aufweisen, der am N-Terminus angefügt wurde, ebenso eine Aktivität.
Zur Expression der Gene befindet sich ein Promotor stromaufwärts von den Genen, und der Promotor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, kann jeder beliebige, geeignete Promotor sein, der mit dem Wirt kompatibel ist, welcher Wirt für die Expression der Gene verwendet wird.
Wenn der zu transformierende Wirt eine Hefe darstellt, umfassen die Beispiele für den verwendeten Promotor den ENO1-Promotor, den GAL10-Promotor, den GAPDH-Promotor, den ADH-Promotor und den AOX-Promotor.
Der so konstruierte Vektor, welcher eine rekombinante DNA mit den Genen RHM1, RHM2 oder RHM3, dem Gen RHM2-N oder dem Gen RHM2-C umfasst, wird dazu verwendet, eine Transformante herzustellen, die den Vektor enthält. Wenn das Gen RHM2-N und das Gen RHM2-C co-exprimiert werden, werden zum Beispiel ein rekombinanter Vektor mit dem Gen RHM2-N und ein rekombinanter Vektor mit dem Gen RHM2-C in die gleiche Wirtszelle eingeführt; in alternativer Weise werden sowohl das Gen RHM2-N und das Gen RHM2-C in den gleichen Vektor eingeführt, und der erhaltene rekombinante Vektor wird dazu verwendet, eine Wirtszelle zu transformieren. Die so erhaltene Transformante trägt zwei Arten von rekombinanten Vektoren, das heißt, den rekombinanten Vektor mit dem Gen RHM2-N und den rekombinanten Vektor mit dem Gen RHM2-C, oder sie trägt eine Art eines rekombinanten Vektors, der sowohl das Gen RHM2-N als auch das Gen RHM2-C aufweist, um UDP-Glucose-4,6-dehydratase, UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase und UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase herzustellen. Dementsprechend ist die Transformante ein sehr ergiebiger Stamm, der in der Lage ist, UDP-Rhamnose aus UDP-Glucose als Ausgangsmaterial herzustellen, wie vorstehend beschrieben.
Beispiele für den Wirt umfassen Bäckerhefe (budding yeast) (Saccharomyces cerevisiae) und dergleichen, welche keine UDP-Rhamnose im lebenden Organismus verbrauchen, und es können ebenso eine andere Hefe (Pichia pastoris etc.) verwendet werden, welche keine UDP-Rhamnose verbrauchen. Der Wirt kann auch ein Wirt sein, der keine Hefe ist und kein Enzymsystem zum Verbrauch von UDP-Rhamnose aufweist.
Wenn UDP-Rhamnose in vitro durch Verwendung des aufgeschlossenen Zell materials, des Enzymextrakts oder dergleichen hergestellt wird, kann ein beliebiger Wirt verwendet werden, der in der Lage ist, das Genprodukt im Cytoplasma herzustellen.
Die Bildung der Transformante wird anhand eines Verfahrens durchgeführt, das im Allgemeinen für den vorgesehenen Wirt durchgeführt wird. Das Verfahren braucht kein allgemeines Verfahren zu sein, sofern das Verfahren anwendbar ist. Wenn zum Beispiel der Wirt eine Hefe ist, kann ein Vektor, welcher die rekombinante DNA enthält, durch das Lithium-Verfahren oder durch ein Elektroporations-Verfahren eingeführt werden.
Auf diese Weise kann eine Transformante, welche einen Vektor enthält, der die rekombinante DNA mit dem Gen der vorliegenden Erfindung enthält, erhalten werden, und die Transformante wird kultiviert, und dadurch werden UDP-Rhamnose sowie die Enzyme, die für die Herstellung von UDP-Rhamnose notwendig sind, hauptsächlich in den Zellen der Transformante erzeugt und angehäuft.
Wenn die Transformante kultiviert wird, ist das in der Kultur verwendete Medium ein allgemeines Medium, das für den vorgesehenen Wirt verwendet wird. Das Medium braucht kein allgemeines Medium zu sein, falls es verwendbar ist. Wenn der Wirt zum Beispiel eine Hefe ist, wird YPD-Medium, SD-Medium oder dergleichen im Allgemeinen verwendet. Die Kultur wird unter Bedingungen durchgeführt, die im Allgemeinen für den vorgesehenen Wirt verwendet werden. Die Bedingungen brauchen nicht allgemein zu sein, sofern die Bedingungen anwendbar sind. Wenn beispielsweise der Wirt eine Hefe ist, kann die Kultur bei etwa 25°C bis 37°C für etwa 12 Stunden bis 5 Tage durchgeführt werden, falls notwendig unter Belüften oder Rühren.
Wenn zum Beispiel UDP-Rhamnose oder das Enzym aus der Kultur extrahiert werden, werden die Wirtszellen von dem Medium durch Zentrifugation getrennt, und die Wirtszellen werden aufgeschlossen, um die UDP-Rhamnose oder das Enzym zu extrahieren. Wenn der Wirt zum Beispiel eine Hefe ist, werden die Zellen mit Glaskügelchen aufgeschlossen und anschließend zentrifugiert. In diesem Fall liegen das Enzym und die UDP-Rhamnose in der Fraktion des Überstandes vor. In alternativer Weise können die Hefen in 1 M Ameisensäure, die mit 1-Butanol gesättigt ist, suspendiert und anschließend auf Eis für etwa 30 Minuten bis 3 Stunden gekühlt und zentrifugiert werden, um UDP-Rhamnose zu extrahieren. In diesem Fall liegt UDP-Rhamnose ebenfalls in der Fraktion des Überstands vor.
Wenn UDP-Rhamnose aus der Fraktion des Überstands durch Zentrifugation abgetrennt wird, werden Fraktionen mit niedrigem Molekulargewicht durch Gelfiltration oder dergleichen gesammelt und überdies durch HPLC abgetrennt, um UDP-Rhamnose zu reinigen und/oder zu isolieren. In alternativer Weise kann UDP-Rhamnose durch eine Ionenaustausch-Säule oder eine Säule mit reverser Phase gereinigt und/oder isoliert werden.
Wenn UDP-Rhamnose durch eine Umsetzungsreaktion mittels eines Enzyms in vitro hergestellt wird, können das aufgeschlossene Zellmaterial oder die Fraktion des Überstands unmittelbar als Enzymquelle eingesetzt werden. In alternativer Weise wird, nachdem Ammoniumsulfat mit einer Konzentration von 75% in der Überstandsfraktion gelöst wurde, eine Proteinfraktion, die mit Ammoniumsulfat gefällt wurde, gesammelt und durch Dialyse oder dergleichen entsalzt, und die erhaltene Enzymfraktion kann ebenso als Enzymquelle verwendet werden.
UDP-Glucose als das Substrat, NAD⁺ und NADPH werden zu der Enzymquelle gegeben und damit umgesetzt, und somit kann UDP-Rhamnose durch HPLC isoliert und/oder gereinigt werden, um UDP-Rhamnose zu ergeben.
In der vorliegenden Erfindung können andererseits nicht nur Proteine aus Arabi dopsis thaliana (Protein RHM1, Protein RHM2 und Protein RHM3), die durch die SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 und SEQ ID NR. 20 dargestellt werden, sondern ebenso Proteine umfasst sein, die eine Homologie von 70% oder mehr mit dem Protein RHM1, dem Protein RHM2 oder dem Protein RHM3 aufweisen, als Proteine mit einer UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität, und die vorliegende Erfindung umfasst diese homologen Proteine sowie Gene, welche Nukleotid-Sequenzen aufweisen, die für die homologen Proteine codieren. Diese homologen Proteine umfassen Proteine, die aus Pflanzen stammen, wie zum Beispiel einer Reispflanze (Oryza Sativa) oder einer Tabakpflanze (Nicotiana tabacum), und die Aminosäure-Sequenz des homologen Proteins aus der Reispflanze und die Nukleotid-Sequenz des Gens, welches für diese codiert, werden durch die SEQ ID NR. 22 bzw. 21 dargestellt.
Diese homologen Proteine können durch Verwendung der DNA, welche für sie codieren, mit den gleichen Mitteln eines genetischen Verfahrens wie vorstehend mit Bezug auf das Protein RHM1, das Protein RHM2 und das Protein RHM3 beschrieben, hergestellt werden. Das heißt, die vorliegende Erfindung umfasst ebenso einen rekombinanten Vektor, der mit einer DNA rekombiniert ist, welche für das homologe Protein codiert, eine Transformante, welche den rekombinanten Vektor im eingeführten Zustand aufweist, ein Verfahren zur Herstellung des homologen Enzymproteins unter Verwendung der Transformante, und ein Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose unter Verwendung der Transformante oder des homologen Enzymproteins.
Bei der Kultur der Transformante der vorliegenden Erfindung in einem Medium wird die Transformante in einem Medium kultiviert, das als Kohlenstoffquelle Glucose enthält, deren Element bzw. ein oder mehrere Atome durch ein Isotop ersetzt wurde/wurden, wodurch eine mit einem Isotop markierte UDP-Rhamnose aus der Kultur gesammelt werden kann.
In alternativer Weise kann eine Kultur, die ein Enzymprotein enthält, ein Material, das durch die Behandlung der Kultur erhalten wurde, ein Enzymextrakt oder ein gereinigtes Enzym, das aus der Transformante der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, mit UDP-Glucose in Kontakt gebracht werden, in der ein oder mehrere Atome durch ein Isotop ersetzt wurden, um dadurch die UDP-Glucose in eine mit einem Isotop markierten UDP-Rhamnose umzuwandeln.
Bei solchen Verfahren einer Umsetzung mittels eines Enzyms kann das gereinigte Protein RHM2-N, eine Kultur, welche das Protein enthält, ein Material, das durch die Behandlung der Kultur erhalten wurde, ein Enzymextrakt oder ein gereinigtes Enzym, sowie das gereinigte Protein RHM2-C, eine das Protein enthaltende Kultur, ein Material, das durch die Behandlung der Kultur erhalten wurde, oder ein Enzymextrakt der Reihe nach oder gleichzeitig mit der vorstehenden, mit einem Isotop markierten UDP-Glucose in Kontakt gebracht werden, um eine mit einem Isotop markierte UDP-Rhamnose zu ergeben.
Bevorzugte Beispiele für ein solches Isotop umfassen ¹³C- und ¹⁴C-Isotope. Die UDP-Rhamnose, die mit einem solchen Isotop markiert wurde, ist nützlich für die Aufklärung des Systems zur Synthese der Zuckerketten oder für die Erforschung einer Substanz, die einen Einfluss auf das System zur Synthese der Zuckerketten ausübt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann UDP-Rhamnose, die wesentlich für das Anfügen von Rhamnose ist, welche sehr wichtige Funktionen in einer Zuckerkette ausübt, effizient in einer großen Menge hergestellt werden. Derzeit sind Verfahren zur gleichförmigen Synthese von Glykoprotein-Zuckerketten nicht etabliert, und es wird vorweggenommen, dass die Synthese von gleichförmigen Zuckerketten durch eine abschließende Modifikation der Zuckerketten in vitro ausgeführt werden kann, und dass in diesem Fall die Zucker-Nukleotide wesentlich sind als Glycosyl-Donor. In Bezug auf Rhamnose ist insbesondere UDP-Rhamnose sehr teuer, und somit ist eine Modifikations-Reaktion in vitro in großem Maßstab derzeit unrealistisch, jedoch können durch die Ermöglichung der Zufuhr einer großen Menge von UDP-Rhamnose gemäß der vorliegenden Erfindung hochgradig funktionelle Zuckerketten, an die Rhamnose angefügt wird, in vitro hergestellt werden. Dementsprechend trägt die vorliegende Erfindung erheblich zum Studium der Zuckerketten in Glykoproteinen bei.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr in näheren Einzelheiten aufgrund der folgenden Beispiele erläutert werden, jedoch ist die Erfindung nicht so zu betrachten, als sei sie darauf beschränkt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Isolierung der Gene RHM1 (SEQ ID NR. 1), RHM2 (SEQ ID NR. 3) und RHM3 (SEQ ID NR. 19)
Das Gen RHM1 und das Gen RHM2 wurden durch das PCR-Verfahren kloniert, wobei eine cDNA-Bank aus Arabidopsis thaliana als Templat verwendet wurde. Als cDNA-Bank wurde die cDNA-Bank „Quick-Clone" verwendet, die von Clontech hergestellt wurde. Mit Bezug auf das Gen RHM3 wurde ein cDNA-Klon (Quellen-Nummer: pda08705) von BioResource Center, Riken, Japan, erhalten und als Templat verwendet. Die Primer wurden so gestaltet, dass das Abspalten der Abschnitte, welche für das Protein codieren, mit Restriktionsenzymen erleichtert wurde; im Fall von RHM1 waren die Sac I-Schnittstelle im N-Terminus, und die Kpn I-Schnittstelle im C-Terminus gelegen, während im Falle von RHM2 und RHM3 die Eco RI-Schnittstelle im N-Terminus, und die Sal I-Schnittstelle im C-Terminus gelegen waren. Darüber hinaus war eine 6-fache Histidin-Sequenz, welche für eine Sequenz codiert, die an Nickel-Agarose bindet, das heißt ein markierendes Antigen, zuvor am N-Terminus angefügt worden. Die Sequenzen der jeweiligen Primer sind nachfolgend gezeigt (SEQ ID NR. 13 und 14 wurden für RHM1 verwendet; SEQ ID NR. 15 und 16 wurden für RHM2 verwendet; und SEQ ID NR. 23 und 24 wurden für RHM3 verwendet).
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
95°C: 30 Sek.
57°C: 30 Sek.
72°C: 2 Min. 15 Sek.
30 Zyklen
Amplifizierte DNA-Fragmente mit einer Größe von etwa 2,0 kbp, die unter diesen Bedingungen erhalten wurden, wurden durch Agarose-Elektrophorese isoliert und anschließend mit den Restriktionsenzymen Sac I und Kpn I bzw. Eco RI und Sal I geschnitten und danach zwischen die Sac I-Schnittstelle und die Kpn I-Schnittstelle bzw. die Eco RT-Schnittstelle und die Sal I-Schnittstelle des Vektors pBluescript II-SK+ insertiert. Die Nukleotid-Sequenzen dieser klonierten Gene wurden mit einem Sequenzier-Kit bestätigt, wobei ein Dideoxy-Verfahren verwendet wurde, und es wurde bestätigt, dass es sich um die Nukleotid-Sequenzen handelt, welche durch die SEQ ID NR. 1, 3 und 19 dargestellt werden.
Beispiel 2
Konstruktion von Expressionsvektoren für die Gene RHM1, RHM2 und RHM3, und Erzeugung von Hefe-Transformanten, welche die Plasmide enthalten Das Gen RHM1, das Gen RHM2 und das Gen RHM3, welche in den Vektor pBluescript II-SK+ insertiert wurden, wurden mit Sac I und Kpn I oder mit Eco RI und Sal I geschnitten und anschließend zwischen die Sac I-Schnittstelle und die Kpn I-Schnittstelle bzw. die Eco RT-Schnittstelle und die Sal I-Schnittstelle in den Expressionsvektor YEp352GAP-II insertiert, der ein URA3-Gen als Selektionsmarker und einen Bereich von der Schnittstelle des Enzyms Eco RI bis zu derjenigen des Sal I in der multiplen Klonierungsstelle des Vektors pUC18 aufweist, welcher Bereich zwischen GAPDH, das als Promotor im glycolytischen System der Hefe dient, und seinem Terminator liegt, und dadurch wurden die Vektoren YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM1, YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2 und YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM3 konstruiert. Diese Expressionsvektoren wurden in den Hefestamm W303-18 (ura3, lue2, his3, trp1, ade2) eingeführt, um Transformanten zu ergeben, das heißt den Stamm, in den das Gen RHM1 eingeführt wurde (W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM1), den Stamm, in den das Gen RHM2 eingeführt wurde (W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2), und den Stamm, in den das Gen RHM3 eingeführt wurde (W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM3). Der Stamm W303-1B (ATCC Nr. 201238^TM) war von ATCC erhältlich (American Type Culture Collection).
Beispiel 3
Extraktion des cytoplasmatischen Proteins der Hefe
Die cytoplasmatischen Proteine wurden aus den Transformanten extrahiert, die in Beispiel 2 erhalten wurden. Zunächst wurde der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM1, der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2, der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM3 und der Stamm W303 in SD-Medium für 24 Stunden bei 30°C kultiviert, und die erhaltenen Hefezellen wurden mit Glasperlen aufgeschlossen. Das erhaltene, aufgeschlossene Material wurde zentrifugiert, um die Zellwand-Fraktion und eine Mikrosomen-Fraktion zu entfernen, wodurch eine cytoplasmatische Fraktion abgetrennt wurde.
Beispiel 4
Bestätigung der Expression des Proteins RHM1, des Proteins RHM2 und des Proteins RHM3 in Hefen
Die in Beispiel 2 erhaltenen Transformanten wurden mittels Western-Blot überprüft und es wurde bestätigt, dass sie die Proteine in ihren Zellen exprimieren. Zunächst wurden die vorstehenden drei Arten von Transformanten, das heißt der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM1, der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2, der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM3, und der Stamm W303 in SD-Medium für 24 Stunden bei 30°C kultiviert, und die erhaltenen Hefezellen wurden mit Glasperlen aufgeschlossen. Das erhaltene, aufgeschlossene Material wurde zentrifugiert, um eine Zellwand-Fraktion und eine Mikrosomen-Fraktion zu entfernen, wodurch eine cytoplasmatische Fraktion abgetrennt wurde. Diese Protein enthaltende, cytoplasmatische Fraktion wurde in 50 mM Tris-HCl (pH 6,8) gelöst, anschließend einer SDS-PAGE unterzogen und elektrisch auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Expression der Proteine wurde mit einem anti-penta-HIS-Antikörper bestätigt (2). Als ein Ergebnis wurde es bestätigt, dass die Proteine in dem Stamm, in den das Gen RHM1 eingeführt wurde [W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM1], in dem Stamm, in den das Gen RHM2 eingeführt wurde [W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2] bzw. in dem Stamm, in den das Gen RHM3 eingeführt wurde [W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM3], exprimiert wurden.
Beispiel 5
Messung der Aktivität der UDP-Rhamnose-Synthese
Die Aktivität der UDP-Rhamnose-Synthese in der cytoplasmatischen Proteinfraktion der Hefe, die in Beispiel 3 erhalten wurde, wurde bestimmt. Die Aktivität wurde bei 30°C für 2 Stunden gemessen, indem UDP-Glucose als Substrat und 1 mM NAD⁺ und 3 mM NADPH als Cofaktoren unter den Bedingungen von 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) eingesetzt wurden. Nachdem eine Mischung von Phenol und Chloroform (24:1) zugegeben wurde, wurde die Mischung gerührt und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine HPLC aufgetragen, die mit einer Säule mit reverser Phase ausgestattet war, um UDP-Rhamnose und UDP-Glucose nachzuweisen. Die Probe wurde mit 20 mM Triethylamin (pH 7,0) abgetrennt, das 1% Acetonitril enthält, wobei die Probe mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,7 ml/Min. durch eine C30-Säule in der HPLC geleitet wurde und bei UV 260 nm detektiert wurde. Als ein Ergebnis wurde die Aktivität der Synthese von UDP-Rhamnose in dem Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM1, der das Protein RHM1 exprimiert, in dem Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2, der das Protein RHM2 exprimiert, und in dem Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM3, der das Protein RHM3 exprimiert (3), nachgewiesen. Das Molekulargewicht der synthetisierten UDP-Rhamnose, wie durch ESI-MS bestimmt, stimmte mit dem vorhergesagten Molekulargewicht überein (4).
Beispiel 6
Extraktion der UDP-Rhamnose aus Hefen, in die das Gen RHM2 eingeführt wurde
Aus der cytoplasmatischen Fraktion der Hefe, die in Beispiel 3 erhalten wurde, wurde UDP-Rhamnose abgetrennt und gereinigt. Zunächst wurde der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2 für 24 Stunden bei 30°C in SD-(Uracil^-)-Medium kultiviert, und anschließend wurde 1 ml 1 M Ameisensäure, die mit 1-Butanol gesättigt war, zu den Hefezellen, deren optische Dichte bei 600 nm gleich 10 betrug, gegeben, und die Mischung wurde in ausreichender Weise gemischt und auf Eis für 1 Stunde belassen. Eine Zellwand-Fraktion wurde aus dieser Probe durch Zentrifugation entfernt, wodurch die cytoplasmatische Fraktion abgetrennt wurde. Der so erhaltene Überstand wurde lyophilisiert und erneut in gereinigtem Wasser suspendiert, um die Zuckernukleotide zu extrahieren. Die extrahierten Zuckernukleotide wurden mit 20 mM Triethylamin (pH 7,0), das 1% Acetonitril enthielt, abgetrennt, indem die Probe mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,7 ml/Min. durch eine C30-Säule geleitet wurde, um UDP-Rhamnose auf der Grundlage der Elutionszeit abzutrennen. Die abgetrennte UDP-Rhamnose wurde erneut einige Male unter den gleichen Bedingungen abgetrennt, wodurch die UDP-Rhamnose gereinigt wurde (5).
Beispiel 7
Expression der UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Domäne und der UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase/UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Domäne durch das Gen RHM2
Die UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Domäne (RHM2-N) und die UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase/UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Domäne (RHM2-C) in dem Gen RHM2 wurden durch das PCR-Verfahren unter Verwendung des Vektors YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2 kloniert, der in Beispiel 2 erhalten wurde. Die Primer wurden so gestaltet, dass die Eco RT-Schnittstelle im N-Terminus gelegen war, und die Sal I-Schnittstelle am C-Terminus gelegen war, sowohl im Falle der Domäne RHM2-N als auch im Falle der Domäne RHM2-C, um die Spaltung der Bereiche, welche für die Proteine codieren, durch die Restriktionsenzyme zu erleichtern. Darüber hinaus war eine 6-fache Histidin-Sequenz, welche für eine Sequenz codiert, die an Nickel-Agarose bindet, das heißt für ein markierendes Antigen, zuvor an den N-Terminus angefügt worden. Die Primer waren die SEQ ID NR. 15 und 16, die in Beispiel 1 verwendet wurden. Die Sequenzen der anderen Primer sind nachfolgend gezeigt (SEQ ID NR. 15 und 17 wurden für RHM2-N verwendet, und SEQ ID NR. 16 und 18 wurden für RHM2-C verwendet).
AAAAAGTCGACTTAAGCTTTGTCACCAGAATCACCATT (SEQ ID NR. 17)
AGAATTCATGCATCACCATCACCATCACACACCTAAGAATGGTGATTCTGGT G (SEQ ID NR. 18)
Die PCR-Bedingungen waren wie folgt:
95°C: 30 Sek.
57°C: 30 Sek.
72°C: 1 Min. 15 Sek.
30 Zyklen
Die Fragmente von etwa 1,2 kb Länge (RHM2-N) und etwa 0,9 kb Länge (RHM2-C), welche unter diesen Bedingungen erhalten wurden, wurden durch Agarose-Elektrophorese isoliert, anschließend mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I geschnitten, zwischen die Eco RT-Schnittstelle und Sal I-Schnittstelle des Vektors YEp352GAP-II insertiert, um die Expressionsvektoren YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2-N und YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2-C zu konstruieren. Die Nukleotid-Sequenzen dieser klonierten Gene wurden anhand einer Nukleotid-Sequenzanalyse sequenziert, und es wurde bestätigt, dass es sich um die Nukleotid-Sequenzen handelt, welche durch die SEQ ID NR. 9 bzw. 11 dargestellt werden (Die Aminosäure-Sequenzen ihrer entsprechenden Proteine sind in SEQ ID NR. 10 bzw. 12 gezeigt). Aus dem Vektor YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2-C wurde ein Fragment, welches eine Sequenz von drei Bereichen enthielt, zum Beispiel den GAPDH-Promoter, 6×HIS-RHM2-C, und den GAPDH-Terminator, mit dem Restriktionsenzym Bam HI herausgeschnitten und zwischen die Bam HI-Schnittstellen des Hefe-Plasmidvektors YEp351 mit einem LEU2-Marker insertiert, um den Vektor YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C zu konstruieren. Diese Expressionsvektoren wurden in den Hefestamm W30318 (ura3, lue2, his3, trp1, ade2) eingeführt, um Transformanten zu ergeben, zum Beispiel den Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-N, in den das Gen RHM2-N eingeführt wurde, den Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C, in den das Gen RHM2-C eingeführt wurde, und den Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-N/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C, in den das Gen RHM2-N und das Gen RHM2-C gleichzeitig eingeführt wurden.
Beispiel 8
Extraktion von cytoplasmatischen Proteinen aus der Hefe
Aus den Transformanten (dem Stamm RHM2-N, dem Stamm RHM2-C und dem Stamm RHM2-N + RHM2-C), die in Beispiel 7 erhalten wurden, wurden die cytoplasmatischen Proteine gemäß dem in Beispiel 3 gezeigten Verfahren extrahiert. Zunächst wurden diese Transformanten und der Stamm W303 in SD-Medium für 24 Stunden bei 30°C kultiviert, und die erhaltenen Hefezellen wurden mit Glasperlen aufgeschlossen. Das erhaltene aufgeschlossene Material wurde zentrifugiert, um eine Zellwand-Fraktion und eine Mikrosomen-Fraktion abzutrennen, wodurch eine cytoplasmatische Fraktion abgetrennt wurde.
Beispiel 9
Bestätigung der Expression des Proteins RHM2-N und des Proteins RHM2-C in Hefen
Die in Beispiel 7 erhaltenen Transformanten wurden mittels eines Western-Blots überprüft und es wurde bestätigt, dass sie die Proteine in ihren Zellen exprimieren. Als Proben für den Western-Blot wurden die cytoplasmatischen Proteine aus der Hefe, die in Beispiel 8 extrahiert wurden, eingesetzt. Die Protein enthaltende, cytoplasmatische Fraktion wurde der SDS-PAGE unterzogen und anschließend elektrisch auf eine PVDF-Membran übertragen, und die Expression der Proteine wurde durch einen anti-penta-HIS-Antikörper (6) bestätigt. Als ein Ergebnis wurde es bestätigt, dass die Proteine in dem Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-N, in den das Gen RHM2-N eingeführt wurde, in dem Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C, in den das Gen RHM2-C eingeführt wurde, und in dem Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-N/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C, in den das Gen RHM2-N und das Gen RHM2-C gleichzeitig eingeführt wurden, exprimiert wurden.
Beispiel 10
Messung der Aktivität der UDP-Rhamnose-Synthese im Stamm RHM2-N + C (W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-N/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C)
Die Aktivität der UDP-Rhamnose-Synthese in der cytoplasmatischen Proteinfraktion aus der Hefe, die in Beispiel 8 erhalten wurde, wurde nachgewiesen. Gleichzeitig wurde auch die Aktivität der UDP-Rhamnose-Synthese in der Proteinfraktion, die aus dem Stamm W303 extrahiert wurde, und in der Proteinfraktion, die aus dem Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2 extrahiert und in Beispiel 3 erhalten wurde, nachgewiesen. Die Aktivitäten wurden bei 37°C für 3 Stunden mit UDP-Glucose als Substrat und 1 mM NAD⁺ und 3 mM NADPH als Cofaktoren unter der Bedingung von 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) gemessen. Nachdem eine Mischung von Phenol und Chloroform (24:1) zugegeben wurde, wurde die Mischung gerührt und zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde auf eine HPLC aufgetragen, die mit einer Säule mit reverser Phase ausgestattet war, um UDP-Rhamnose und UDP-Glucose nachzuweisen. Die Probe wurde mit 20 mM Triethylamin (pH 7,0) abgetrennt, das 1% Acetonitril enthielt, und mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,7 ml/Min. durch eine C30-Säule in der HPLC geleitet, sowie bei UV 260 nm detektiert. Als ein Ergebnis zeigte der Stamm W303/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-N/YEp351-GAP-II-6×HIS-RHM2-C mit den Genen RHM2-N + RHM2-C eine höhere Ergiebigkeit der Synthese von UDP-Rhamnose als der Stamm W303/YEp352-GAP-II-6×HIS-RHM2 (7).
Nachdem unsere Erfindung in Bezug auf die vorliegenden Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es unsere Absicht mitzuteilen, dass die Erfindung nicht auf irgendeine Einzelheit der Beschreibung begrenzt sei, falls nicht anders angegeben, sondern vielmehr breit innerhalb der technischen Lehre und des Umfangs aufzufassen sei, wie sie in den begleitenden Ansprüchen dargelegt ist.
Diese nicht-provisorische Anmeldung beansprucht die Priorität gemäß 35 U.S.C. § 119 (a) der Patent-Anmeldung Nr. 2006-142359 , die in Japan am 23. Mai 2006 eingereicht wurde, sowie der Patent-Anmeldung Nr. 2006-204421 , die in Japan am 27. Juli 2006 eingereicht wurde, von denen jede durch Bezugnahme vollständig aufgenommen wird.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Protein, welches umfasst: (a) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, oder (b) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
DNA, welche für das Protein nach Anspruch 1 codiert.
DNA, welche umfasst: (a) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID Nr. 19 dargestellt wird, oder (b) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 3 oder SEQ ID NR. 19 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität codiert.
Rekombinanter Vektor, welcher die DNA nach Anspruch 2 oder 3 umfasst.
Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 4 in eine Wirtszelle erhalten wird.
Protein, welches umfasst: (a) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, oder (b) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 6 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in SEQ ID NR. 6 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität aufweist.
DNA, welche für das Protein nach Anspruch 6 codiert.
DNA, welche umfasst: (a) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, oder (b) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 5 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 5 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität codiert.
Rekombinanter Vektor, welcher die DNA nach Anspruch 7 oder 8 umfasst.
Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 9 in eine Wirtszelle erhalten wird.
Protein, welches umfasst: (a) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, oder (b) eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 8 dargestellt wird, wobei in der Aminosäure-Sequenz, die in SEQ ID NR. 8 dargelegt wird, eine oder mehrere Aminosäuren entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
DNA, welche für das Protein nach Anspruch 11 codiert.
DNA, welche umfasst: (a) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, oder (b) eine Nukleotid-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 7 dargestellt wird, wobei in der Nukleotid-Sequenz, die in SEQ ID NR. 7 dargelegt wird, ein oder mehrere Nukleotide entfernt, ersetzt und/oder hinzugefügt werden, und diese Sequenz für ein Protein mit einer UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und einer UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität codiert.
Rekombinanter Vektor, welcher die DNA nach Anspruch 12 oder 13 umfasst.
Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 14 in eine Wirtszelle erhalten wird.
Rekombinanter Vektor, welcher die DNA nach Anspruch 7 oder 8 und die DNA nach Anspruch 12 oder 13 umfasst.
Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 9 und des rekombinanten Vektors nach Anspruch 14 in dieselbe Wirtszelle erhalten wird.
Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 16 in eine Wirtszelle erhalten wird.
Protein, welches eine Aminosäure-Sequenz mit einer Homologie von 70% oder mehr in Bezug auf eine Aminosäure-Sequenz, die durch SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 4 oder SEQ ID NR. 20 dargestellt wird, umfasst, wobei diese Sequenz eine UDP-Glucose-4,6-dehydratase-Aktivität, eine UDP-4-Keto-6-deoxyglucose-3,5-epimerase-Aktivität und eine UDP-4-Keto-rhamnose-4-keto-reduktase-Aktivität aufweist.
Protein nach Anspruch 19, welches ein Protein ist, das aus einer Reispflanze (Oryza sativa) oder aus einer Tabakpflanze (Nicotiana tabacum) stammt.
DNA, welche für das Protein nach Anspruch 19 oder 20 codiert.
Rekombinanter Vektor, welcher die DNA nach Anspruch 21 umfasst.
Transformante, welche durch Einführung des rekombinanten Vektors nach Anspruch 22 in eine Wirtszelle erhalten wird.
Transformante nach einem der Ansprüche 5, 17, 18 und 23, wobei die Wirtszelle UDP-Glucose in der Zelle enthält.
Transformante nach einem der Ansprüche 5, 17, 18, 23 und 24, wobei die Wirtszelle kein Enzym aufweist, welches UDP-Rhamnose verbraucht.
Transformante nach einem der Ansprüche 5, 10, 15, 17, 18, und 23 bis 25, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst: – Kultivieren der Transformante nach einem der Ansprüche 5, 17, 18 und 23 bis 26, um eine Kultur zu ergeben, und – Extrahieren der UDP-Rhamnose aus der Kultur.
Verfahren zur Herstellung von UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst: – Kultivieren der Transformante nach einem der Ansprüche 5, 17, 18 und 23 bis 26 in einem Medium, um eine Kultur zu ergeben, und – in Kontakt bringen von mindestens einem aus einem Bestandteil der erhaltenen Kultur, einem Material, das durch Behandlung der Kultur erhalten wurde, einem Enzymextrakt und einem gereinigten Enzym mit UDP-Glucose, wobei dadurch UDP-Glucose in UDP-Rhamnose umgewandelt wird.
Verfahren zur Herstellung einer markierten UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst: – Kultivieren der Transformante nach einem der Ansprüche 5, 17, 18 und 23 bis 26 mit einer Glucose, die mit einem Isotop substituiert ist, als Kohlenstoffquelle, um eine Kultur zu ergeben, und – Extrahieren einer mit einem Isotop markierten UDP-Rhamnose aus der erhaltenen Kultur.
Verfahren zur Herstellung einer markierten UDP-Rhamnose, welches die Schritte umfasst: – in Kontakt bringen von mindestens einem aus einem Bestandteil einer Kultur, einem Material, das durch Behandlung der Kultur erhalten wurde, einem Enzymextrakt und einem gereinigten Enzym, welcher Bestandteil durch Kultivieren der Transformante nach einem der Ansprüche 5, 17, 18 und 23 bis 26 in einem Medium erhalten wird, mit einer UDP-Glucose, die mit einem Isotop substituiert ist, und – Extrahieren einer mit einem Isotop markierten UDP-Rhamnose.
Verfahren zur Herstellung einer markierten UDP-Rhamnose nach Anspruch 29 oder 30, wobei das Isotop ¹³C oder ¹⁴C ist.