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Diese Erfindung betrifft das Gebiet
der Genmanipulation von Pflanzen und speziell die Regulation der Genexpression
unter Verwendung einer die Genexpression regulierenden Region des
ADP-Ribosylierungsfaktor-Gens in Pflanzen.
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Aufgrund von neuen Fortschritten
bei der Genmanipulation wird die Erforschung der Pflanzenzüchtung auf
genetischer Ebene (die sogenannte molekulare Pflanzenzüchtung)
jetzt sehr intensiv vorangetrieben. Um Erfolge in der Pflanzenzüchtung unter
Verwendung von Genmanipulationstechniken zu erzielen, müssen die nützlichen
Gene in den Pflanzen exprimiert und zur Funktion gebracht werden,
um einen spezifischen Zweck effizient zu erfüllen. Im Allgemeinen wird daher
zur Regulation der Genexpression und zur Erfüllung des gewünschten
Zwecks eine die Genexpression regulierende Region der Pflanze für die Verwendung
isoliert.
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Typische, die Genexpression regulierende
Regionen, die bisher auf diese Art verwendet wurden, sind z. B.
der 35S-Promotor des Tabakmosaikvirus (Guilley, H., et al (1982),
Cell 30, 763–773)
und der Aktin-Genpromotor aus Reispflanzen (Mc Elroy, D. et al.,
(1990), The Plant Cell, 2, 163–171).
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Die Anzahl der gebräuchlichen
Mehrzweck-Promotoren in Pflanzen ist jedoch immer noch begrenzt und
bedenkt man, dass Zeit, Ort und Grad der Expression in einer beliebigen
Pflanze, die verändert
werden soll, ebenfalls wichtig sind, so gibt es sehr wenige tatsächliche
Fälle,
in denen die die Genexpression regulierende Region einer Pflanze
wirklich verwendet werden kann. Dies beruht auf der Tatsache, dass
das Verfahren, wodurch nützliche
Gene, die für
die Pflanzenzüchtung
isoliert oder hergestellt wurden, in der Pflanze reichlich exprimiert
und zur Funktion gebracht werden können noch nicht sehr weit fortgeschritten
ist.
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Die Einführung und die Anhäufung von
Verfahren für
die Regulation der Genexpression in Pflanzen im Hinblick darauf,
nützliche
Gene effizient zur Funktion zu bringen, um einem spezifischen Zweck
zu dienen, wurde daher lange erwartet.
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Diese Erfindung wurde dazu ersonnen
die oben genannten Probleme zu lösen
und zielt auf die Konstruktion eines genetischen Expressionsvektors,
welcher Gene in einer gewebespezifischen, effizienten Art und Weise
exprimieren kann. Genauer ausgedrückt zielt sie auf die Bereitstellung
eines Genexpressionsvektors, der unter Verwendung von Genmanipulationsverfahren
nützliche
Gene effizient exprimieren kann, um einem spezifischen Zweck bei
der Pflanzenzüchtung
oder bei der Herstellung von Substanzen mittels Pflanzengeweben
oder -zellen zu dienen.
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Um die oben genannten Ziele zu erreichen,
zeigt diese Erfindung die Verwendung des von einem ADP-Ribosylierungsfaktor-Gen
abgeleiteten Promotors als Pflanzenpromotor auf.
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Im Sinne der vorliegenden Erfindung
bezieht sich der Ausdruck „von
einem ADP-Ribosylierungsfaktor-Gen
abgeleitet" auf
Promotorsequenzen oder Sequenzen einer die Genexpression regulierenden
Region des ADP-Ribosylierungsfaktor-Gens einschließlich Nucleotidsubstitutionen,
-deletionen oder -additionen im Hinblick auf die Wildtyp-Sequenzen, ohne die
in den Expressionsanalysen bestimmte funktionelle Aktivität der Elemente
zu verändern.
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Noch genauer ausgedrückt umfasst
diese Erfindung ein DNA-Fragment mit den Basenpaaren 1 bis 3027
wie in SEQ ID No: 1, oder ein DNA-Fragment, das einen Teil dieses
Fragments mit gewebespezifischer Promotoraktivität beinhaltet.
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Diese Erfindung umfasst weiterhin
einen Expressionsvektor, der ein beliebiges der vorher erwähnten DNA-Fragmente
beinhaltet.
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Außerdem umfasst diese Erfindung
einen Transformanten, der einen beliebigen der vorher erwähnten Expressionsvektoren
beinhaltet.
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Durch die Verwendung der die Genexpression
regulierenden Region dieses ADP-Ribosylierungsfaktor(nachfolgend
als ARF bezeichneten)-Gens für
die Genexpression, kann ein gewünschtes
Gen effizient in einer beliebigen Pflanze von Interesse exprimiert
werden und für
die Pflanzenzüchtung
und die Herstellung von nützlichen
Substanzen mittels Pflanzenzellkulturen verwendet werden.
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ARF wurde zuerst als ein Verstärkungsfaktor
für Choleratoxin
entdeckt. In Säugern
ist er in besonders großen
Mengen im Hirn vorhanden und macht dort 1% des Gesamtproteins aus
(Kahn, R. und Gilman, A. G (1984), The Journal of Biological Chemistry,
259, 6228–6234).
Laut neueren Forschungsarbeiten ist ARF ein Protein mit einem Molekulargewicht
von etwa 20 kD, das gemeinhin in Eukaryonten vorkommt und als eine
Art G-Protein mit niedrigem Molekulargewicht bekannt ist, das am
intrazellulären
Transport beteiligt ist (Serafini, T. et al. (1991) Cell, 67, 239–253). Seine
Genstruktur wurde für
Hefe, Säuger
und Dicotyledonen berichtet (Sewell, J. L., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1988) 85, 4620–4624).
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Die Forschungsarbeiten, die zu der
vorliegenden Erfindung führten,
hatten die Konstruktion von gewebespezifischen Genexpressionssystemen
in Gerste zum Ziel. Die Erfinder entdeckten, dass das ARF-Gen insofern
charakteristisch ist, als es aktiv in Gerstensamen, -wurzeln und
-kallus exprimiert wird, aber in den Blättern stark unterdrückt oder
nahezu nicht exprimiert wird.
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Die Forschungsarbeiten der Erfinder
waren die ersten ihrer Art, den ARF unter dem Gesichtspunkt der Genexpression
zu untersuchen anstatt unter dem der Funktion und es waren auch
die ersten, die zeigen konnten, dass die Expressionsregion des ARF-Gens
als Vektor mit industrieller Verwendung benutzt werden kann. Es
wird erhofft, dass der von der Genexpressionsregion des ARF gemäß dieser
Erfindung konstruierte Expressionsvektor, eine breite Anwendung
als charakteristisches Genexpressionssystem für die Pflanzenzüchtung und
für die
Herstellung von Substanzen mittels Pflanzengeweben oder -zellen
unter Verwendung von Verfahren der Genmanipulation finden wird.
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Isolierung der cDNA des
ARF
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Die Erfinder haben mittels differentieller
Durchmusterungsverfahren erfolgreich die cDNA des ARF-Gens, das
gewebespezifisch und auf einem Niveau exprimiert wird, kloniert
und eine cDNA in voller Länge
isoliert. Daraufhin haben sie durch Klonierung der Region stromaufwärts der
ARF-Region seine Promotor-Aktivität bestätigt und einen Genexpressionsvektor
unter Verwendung der die Genexpression regulierenden Region dieses
Gens geschaffen.
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Beschaffung des Expressionsvektors
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Die Erfinder haben die Genbank von
Gerste durchmustert, ein DNA-Fragment in der stromaufwärts liegenden
Region dieses Gens isoliert und dieses Fragment mit einem Reportergen
kombiniert, um einen Expressionsvektor zu konstruieren.
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Genauer ausgedrückt kann ein Genexpressionsvektor
unter Verwendung des Promotors des ARF-Gens gemäß dieser Erfindung durch die
folgenden Verfahren erhalten werden.
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Differentielles Durchmustern
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Im Allgemeinen können expressionsspezifische
Gene von Zellen und Geweben, die verschiedene genetische Expressionen
aufweisen, nach dem Verfahren von Takahashi et al kloniert werden
(Takahashi, Y, Kuroda, H. et al (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86, 9279– 9283).
Zum Beispiel wird die cDNA nach der Extraktion der polyA+-RNA aus den Wurzeln synthetisiert und die
cDNA-Fragmente werden in einen Lambda-Phagenvektor oder Plasmidvektor
kloniert, um eine cDNA-Genbank herzustellen. Ein Teil der Genbank
wird ausplattiert, auf einen Nylonfilter überführt und mit einer radioaktiven
Sonde von Blättern
und Wurzeln hybridisiert. Der Klon, der spezifisch in den Wurzel
exprimiert wird, wird dann durchmustert. Die Sequenz der Basen des
Klons kann mittels üblicher
Verfahren bestimmt werden.
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Klonierung des Promotors
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Allgemeine Verfahren zur Klonierung
von Fragmenten in der stromaufwärts
liegenden Region von Genen werden genau beschrieben bei Sambrook,
J., Frisch, E. F., Maniatis, T., Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Gemäß dieser Erfindung können zum
Beispiel geeignete Restriktionsenzyme verwendet werden, um die chromosomale
DNA zu spalten, da die Basensequenz der cDNA wohlbekannt ist, und
das genomische Southern-Verfahren angewendet werden, um die Größe der Fragmente,
die in der stromaufwärts
liegenden Region erhalten werden, zu bestimmen. Als nächstes wird
die chromosomale DNA der Gerste abgetrennt, mit diesen Enzymen gespalten
und diese DNA wird verwendet, um eine chromosomale Genbank zu konstruieren.
Wenn eine radioaktive cDNA-Sonde synthetisiert und diese Genbank
durchmustert wird, kann eine gewünschte
stromaufwärts
liegende Region kloniert werden.
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Nachweis der Funktion
des Genexpressionsvektors
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Um zu überprüfen, ob die so erhaltene stromaufwärts liegende
Region als Promotor fungiert, ist es üblich die stromaufwärts liegende
Region an ein Reportergen zu ligieren, es in eine geeignete Zelle
oder ein Gewebe einzubringen und die Expression des Reportergens über die
Enzymaktivität
nachzuweisen. Das genaue Verfahren wird zum Beispiel bei Draper,
J., et al, Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory
Manual (1988), Blackwell Scientific Publications, beschrieben.
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Die Funktion des Vektors gemäß dieser
Erfindung wurde nachgewiesen, indem er in einen Kulturzellenprotoplasten
der Gerste eingebracht wurde und die resultierende Genexpression
analysiert wurde.
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Gemäß dieser Erfindung wurde ein
DNA-Fragment aus der stromaufwärts
liegenden Region abgetrennt, an das β-Glucuronidasegen ligiert und
in einen Kulturzellenprotoplasten der Gerste eingebracht. Nach einigen
Tagen der Züchtung
wurde die Promotorfunktion durch Extraktion des Gesamtproteins nachgewiesen und
die Enzymaktivität
im Gesamtprotein unter Verwendung von 4-Methyl-Umbelliferyl-Glucuronid
(4-MUG) als Substrat gemessen. Als Ergebnis wurde gefunden, dass
dieses DNA-Fragment als Genexpressionsvektor verwendet werden kann.
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Isolierungsverfahren für DNA-Fragmente,
welche den ARF-Promotor codieren
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Ein DNA Fragment mit der Basensequenz
SEQ ID NO: 1 konnte durch ein unten beschriebenes Verfahren erhalten
werden. Zunächst
werden synthetische PCR-Primer mit der Sequenz, die den Basen 1
bis 50 entspricht und synthetische PCR-Primer, die komplementär zu 2976
bis 3027 sind, mit einem DNA-Synthesizers synthetisiert, zum Beispiel
dem 391 DNA-Synthesizer (ABI inc.) oder dem Gene Assembler (Pharmacia inc.).
Eine genomische DNA aus Gerste wird durch CTAB-Verfahren oder SDS-Phenol-Verfahren
(ausführlich beschrieben
in Plant Genetic Transformation and Gene Expression, Draper et al)
gereinigt. Schließlich
werden DNA-Fragmente mit der Basensequenz des ARF-Promotors durch
Polymerase-Kettenreaktion beispielsweise unter Verwendung des LA
PCR-Kits (Takara inc.) oder XL-Wax100 (Perkin Elmer inc.) synthetisiert.
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Alternativ werden DNA-Fragmente mit
der Basensequenz des ARF-Promotors direkt synthetisiert. Zum Beispiel
wird eine synthetische DNA mit der Basensequenz 1 bis 110 der SEQ
ID NO: 1 und eine synthetische DNA mit der zu 1 bis 16 komplementären Basensequenz
synthetisiert.
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Doppelsträngige DNA mit der Basensequenz
1 bis 110 von SEQ ID NO: 1 wird durch eine Klenow-Auffüllreaktion
mit diesen Primern erhalten. Mit demselben Verfahren wird ein DNA-Fragment
mit der Basensequenz von 100 bis 190 erhalten. Als nächstes werden
diese beiden DNA-Fragmente durch ein allgemeines molekulares Klonierverfahren
ligiert, unter Verwendung des Restriktionsenzyms ApaI, dessen Erkennungsstelle
in der Sequenz 104 lokalisiert ist. Schließlich wird ein DNA-Fragment
in voller Länge
mit der Basensequenz 1 bis 3027 von SEQ ID NO: 1 durch Wiederholung
des oben beschriebenen Verfahrens erhalten.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 ist
eine Zeichnung, welche die Ergebnisse einer Computersuche nach Homologie
zwischen Klon R151 und dem ARF-Gen in Mensch, Rind und Hefe auf
Aminosäureebene
zeigt. In der Figur zeigt „-" gemeinsame Aminosäuresequenzen
an, während
die Schattierung die Aminosäuren
markiert, von denen angenommen wird, dass sie GTP-Bindestellen sind.
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2 ist
ein Diagramm der Restriktionsenzym-Karte des Klons λR15.
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3 ist
ein Diagramm, das den Vorgang der Konstruktion eines Genexpressionsvektors
zeigt.
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4 ist
eine Zeichnung, welche die Ergebnisse einer Untersuchung der Aktivität des Promotors
(R15 Promotor (pSBG418)) gemäß dieser
Erfindung zeigt.
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Wie vorstehend beschrieben, wurde
gemäß dieser
Erfindung eine cDNA in voller Länge
durch differentielles Durchmustern isoliert. Die Genbank aus Gerste
wurde durchmustert, um ein DNA-Fragment im stromaufwärts liegenden
Bereich des Gens zu isolieren und dieses Fragment wurde mit einem
Reportergen kombiniert, um einen Genexpressionsvektor zu konstruieren.
Dieser Vektor wurde dann in Protoplasten von kultivierten Gerstenzellen
eingeführt
und seine Funktion wurde durch Analyse der genetischen Expression
bestätigt.
Die Erfindung wird nun unter Verweis auf spezifische Beispiele genauer
beschrieben, wobei jedoch klargestellt wird, dass die Erfindung
nicht so aufgefasst werden soll, dass sie sich in irgendeiner Art
und Weise darauf beschränkt.
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Beispiel 1
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Konstruktion der in Wurzeln
exprimierten cDNA-Genbank
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Die Wurzeln (10 g) von jungen Gerstenpflanzen
(Züchter
Haruna Nija), bei denen sich die ersten und zweiten Blätter geöffnet hatten,
wurden abgetrennt, in flüssigem
Stickstoff eingefroren und in einem Mixgerät in flüssigem Stickstoff zu Pulver
zermahlen. Nachdem der flüssige
Stickstoff verdampfen lassen wurde, wurden 100 ml 4 M Guanidiniumisocyanat
in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,0) und 100 ml eines Gemischs aus Phenol
: Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) zugegeben und das erhaltene
Gemisch in einem Mixgerät
für einige
Minuten vermengt. Die Suspension wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt, bei
4000 × g
für 20 Min.
zentrifugiert und die wässrige
Schicht abgenommen. Hierzu wurde ein gleiches Volumen des Gemischs
aus Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) gegeben,
das erhaltene Gemisch zentrifugiert und die wässrige Schicht abgenommen.
Diese Prozedur wurde wiederholt bis die Zwischenschicht zwischen
der Phenolschicht und der Wasserschicht verschwunden war, dann wurde
1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina Ethanol zu der Wasserschicht
gegeben, so dass die Gesamtheit der Nucleinsäuren ausgefällt wurde. Nachdem der Niederschlag
in 10 ml 10,5 M KCl/10 mM Tris-HCl (pH 8) gelöst wurde, wurde die polyA+-RNA unter Verwendung einer oligo-dT-Cellulosesäule (Boehringer
Inc.) gereinigt.
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cDNA wurde aus 2 μg dieser polyA+-RNA unter Verwendung
eines cDNA-Synthesekits (Amersham Inc., cDNA Synthesis System Plus)
synthetisiert. Eine λgt10-Genbank
wurde dann mit dieser cDNA und dem cDNA-Kloniersystem λgt10 (Amersham
Inc.) konstruiert.
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Beispiel 2
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Differentielles Durchmustern
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PolyA+-RNA
wurde aus Blättern
von jungen Gerstenpflanzen, bei denen sich die ersten und zweiten Blätter geöffnet hatten,
unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 1 gereinigt. Nachdem
die in Beispiel 1 konstruierte λgt10-Genbank
mit 103 PFU/Platte ausplattiert wurde, wurde
sie auf Highbond-N+-Filter (Amersham Inc.) überführt und
mit Alkali fixiert. Dieses wurde zweimal wiederholt, so dass zwei
Filter präpariert wurden.
Die Filter wurden mit einer radioaktiven cDNA-Sonde (105 CPM/μg polyA+-RNA), die aus 2 μg polyA+-RNA aus Wurzeln beziehungsweise
Blättern
als Matrize synthetisiert wurde, in 20 ml Hybridisierungslösung (6 × SSC, 1%
SDS) bei 65°C
für 24
Std. hybridisiert und viermal mit einer Waschlösung (2 × SSC, 1% SDS) bei 65°C gewaschen.
Nach dem Trocknen der Filter wurde eine Autoradiographie durchgeführt und
die Signalstärke
eines jeden Phagenklons verglichen. Klone, die ein starkes Signal
in Wurzeln zeigten wurden von der Originalplatte zurückgewonnen.
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Beispiel 3
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Strukturelle Analyse der
cDNA-Klone
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Verschiedene Phagenklone wurden angezogen
und die DNA daraus gewonnen. Die cDNA-Insertion wurde von dieser
DNA abgetrennt und mit pUC118 oder pUC119 (Takarashuzo Inc.) kloniert.
Die Basensequenz wurde mit dem Didesoxy-Verfahren unter Verwendung
eines ABI Inc. 373 ADNA-Sequenzierer bestimmt.
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Beispiel 4
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Analyse des cDNA-Klons
R151
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Mehrere cDNA-Basensequenzen wurden
bestimmt und eine Computersuche wurde durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine
etwa 90%-ige Homologie auf Aminosäureebene zwischen einer von
diesen, cDNA-Klon R151, und dem ARF-Gen von Mensch, Rind und Hefe
gefunden (1). Wenn dieser
cDNA-Klon als Sonde für
die Durchführung
einer Northern Blot-Analyse verwendet wurde, wurde gefunden, dass
dieses Gen in Samen, Wurzeln und Kulturzellen von Gerste sehr stark
exprimiert war, jedoch beinahe überhaupt
nicht in Blättern.
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Beispiel 5
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Klonierung des stromaufwärts liegenden
DNA-Fragments
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Ein genomischer Southern wurde mit
der durch das Restriktionsenzym HindIII gespaltenen chromosomalen
DNA aus Gerste unter Verwendung eines stromaufwärts liegenden, die N-terminale
Region des ARF-Gens enthaltenden DNA-Fragments als Sonde durchgeführt, welche
durch HindIII-Spaltung dieses cDNA-Klons R151 erhalten wurde. Als
Ergebnis wurde eine 5 kb-Bande detektiert, die kloniert werden konnte
und von der man annimmt, dass sie die Promotorregion enthält. Chromosomale
DNA aus Gerste wurde daher mit HindIII gespalten, DNA-Fragmente
im Bereich von 5 kb wurden durch Elektrophorese getrennt und an
die HindIII-Erkennungsstelle von „Lambda Blue MidTM" (Clontech Inc.)
ligiert, um eine Genbank zu konstruieren. Diese Genbank wurde mit
der obigen Sonde durchmustert und der Klon λR15 wurde erhalten. In anderen
Worten, wurde gemäß dieser
Erfindung eine genomische Genbank unter Verwendung der stromaufwärts liegenden HindIII-Sonde R151 durchmustert,
um λDNA
zu isolieren.
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Beispiel 6
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Strukturelle Analyse von
stromaufwärts
liegenden DNA-Fragmenten
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Nach der Klonierung der obigen Fragmente
in die HindIII-Erkennungsstelle von pUC118 wurde eine Restriktionskarte
konstruiert (2). Enzyme,
die λR15
nicht spalten, sind EcoRI, ClaI, SalI, KpnI, NaeI, SacII, SmaI.
Als Ergebnis aus der Restriktionskarte von λR15 ist der N-Terminus des ARF-Proteins
wahrscheinlich effektiv in der Mitte lokalisiert und seine Orientierung
ist wahrscheinlich wie in 2 dargestellt.
Um die genaue Position des N-Terminus
zu bestimmen, wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung
des synthetischen Primers 5'-ACGAATTCATGGGG
CTCACGTTTACCAAGCTG-3' und
M13-Primer (Takarashuzo Inc.)
durchgeführt,
welche die den N-Terminus codierenden, in Sequenz-Tabelle 2 gezeigten
Basensequenzen erkennen, und die Größen der DNA-Fragmente nach
der Reaktion wurden bestimmt. Es wurde gefunden, dass der N-Terminus
etwa 2,3 kbp stromabwärts
gelegen ist. Das HindIII (1) – BamHI
(3070)-Fragment, entsprechend dem stromaufwärts liegenden Teil, der eine
Region in der Nähe
des N-Terminus enthält,
wurde daher in pUC118 kloniert und die Basensequenzen wurden mit
einem in den Beispielen gezeigten Verfahren bestimmt, so dass die
in der Sequenz-Tabelle 1 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden.
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Beisipiel 7
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Konstruktion eines Genexpressionsvektors
und Expressionsanalyse (Konstruktion eines Genexpressionsvektors)
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Das β-Glucuronidasegen, das ein Reportergen
ist, wurde an das ARF-Promotorfragment ligiert und die Promotoraktivität wurde
gemessen. pBI101 (Toyobo Inc.), gezeigt in 3(a), wurde durch die Restriktionsenzyme
HindIII und EcoRI gespalten, ein 2280 bp-Fragment durch Elektrophorese
gewonnen und dann in pUC 118 über
die HindIII und EcoRI-Erkennungsstellen
kloniert, um pSBG419 (3(b))
zu konstruieren. Als nächstes
wurde pSBG419 durch das Restriktionsenzym PstI gespalten und mit
sich selbst ligiert, nachdem mit dem Takarashuzo DNA-Blunting-Kit
glatte Enden geschaffen wurden, um pSBG420 zu konstruieren (3(c)). Mit demselben Verfahren
wurde das stromaufwärts
gelegene, in Beispiel 5 gezeigte DNA-Fragment in die HindIII-Erkennungstelle
von pSBG420 kloniert, um pSBG421 (3(d))
zu konstruieren. pSBG421 wurde dann in E. coli DHS (Toyobo Inc.)
mit dem üblichen
Verfahren eingeführt.
pSBG421 wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und SphI gespalten
und mit dem in der Sequenztabelle I gezeigten Fragment XhoI (2700) – NiaIII
(3010) kloniert, um pSBG418 zu konstruieren (3(e)). pSBG418 hat eine Struktur worin
ein mit β-Glucuronidase
fusioniertes Gen verknüpft
ist, welches die Codons für
die Aminosäuren
Methionin, Prolin, Valin, Asparagin, Serin, Arginin, Glycin, Serin,
Prolin, Glycin, Glycin, Glutamin, Serin und Leucin beinhaltet, die an
den N-Terminus stromabwärts
des ARF-Promotors angeheftet sind. Die Transkription des mit β-Glucoronidase
fusionierten Gens wird durch die Aktivität des ARF-Promotors induziert.
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Expressionsanalyse
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Als nächstes wurde ein transienter
Expressionstest unter Verwendung der Protoplasten einer B53-Suspensionskultur
aus einem unreifen Embryo von wilder Gerste (aus Hordeum bulbosum)
durchgeführt und
die Promotor-Aktivität
wurde untersucht (4).
Mit Enzymlösungen
wurden etwa 108 Protoplasten aus der Zellsuspension
am 5ten oder 7ten Tag der Subkultur isoliert. Um die Protoplasten
(2 × 106) zu resuspendieren, wurden 2 nmol pSBG418,
pBI221 (Toyobo Inc.) und Kalbsthymus-DNA als Träger-DNA zugefügt, so dass
die Gesamtmenge 60 μg
war und die Elektroporation wurde mit einem Biorad Genpulser bei
900 V/cm und 125 μF
durchgeführt.
Nach der Wiedergewinnung der Protoplasten wurden sie in 15 ml MSD4,
0,6 M Mannitol suspendiert und in 9 cm Petrischalen bei 25°C für 3 Tage
gezüchtet.
Nach der Kultur wurden die Zellen wiedergewonnen, in Gus-Extraktpuffer
(50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 10 mM EDTA (pH 7,0), 0,1% Triton X-100,
0,1% Natrium-Laurylsarcosin,
10 mM Mercaptoethanol) solubilisiert und ein GUS-Assay wurde mit
100 μg löslichem
Protein mit dem Substrat 4MUG durchgeführt.
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Die Proben zeigten spezifische Aktivitäten von
8,9 nmol 4-MUmg–1Std.–1 lösliches
Protein beziehungsweise 0,3 nmol 4-MUmg–1Std.–1 lösliches
Protein. Es wird daher deutlich, dass der Promotor dieser Erfindung (R15-Promotor
(pSBG418)) sowohl für
die Subkulturen des 5ten als auch des 7ten Tages eine höhere Aktivität zeigt
als der 35S-Promotor (pBI221), der üblicherweise benutzt wurde.
Insbesondere die Subkultur des 7ten Tages zeigt eine etwa 30-fache Aktivität gegenüber dem
35S-Promotor.
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Wenn es gewünscht wird, andere nützliche
Gene zu exprimieren, können
diese nützlichen
Gene anstelle des β-Glucuronidasegens
eingeführt
werden. Dies kann einfach erreicht werden, indem bekannte, übliche Verfahren
durch den Fachmann angewendet werden.
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Wie obenstehend beschrieben hat der
unter Verwendung der ARF-Genexpressionsregion gemäß dieser
Erfindung konstruierte Genexpressionsvektor eine breite Anwendung
als charakteristisches Genexpressionssystem in der Pflanzenzüchtung und
in der Herstellung von
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Substanzen mittels Pflanzengeweben
oder -zellen unter Verwendung von Genmanipulationsverfahren. Der
Genexpressionsvektor, der sich der die Genexpression regulierenden
Region des ARF-Gens gemäß dieser
Endung bedient, leistet daher einen signifikanten Beitrag zur effizienten
Expression eines gewünschten Gens
in einer Pflanze zu einem spezifischen Zweck, zur Verbesserung der
Pflanzenspezies und zur Herstellung von nützlichen Substanzen unter Verwendung
von pflanzlichen Kulturzellen.
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