DE69636470T2

DE69636470T2 - Ein die Aureobasidinempfindlichkeit regulierendes Gen

Info

Publication number: DE69636470T2
Application number: DE69636470T
Authority: DE
Inventors: Takashi Soraku-gun Okado; Kazutoh Otsu-shi TAKESAKO; Ikunoshin Uhi-shi Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-10-04
Filing date: 1996-10-01
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2016-10-02
Also published as: EP0768380A3; EP0768380A2; DE69636470D1; JP3276050B2; CN1158357A; KR100452393B1; KR970021306A; JPH0998784A; EP0768380B1; CN1110559C

Description

Diese Erfindung betrifft ein Protein, das eine Empfindlichkeit auf ein antimykotisches Aureobasidin reguliert und aus einem Pilz erhalten wird, wie einem, der zur Gattung Aspergillus gehört, und ein Gen, das für dieses Protein kodiert, nämlich ein Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und von einem Pilz stammt.
Stand der Technik
Aureobasidin [Japanische Offenlegungsschrift Nr. 138296/1990, Nr. 22995/1991, Nr. 220199/1991, Nr. 279384/1993 und Nr. 65291/1994; J. Antibiotics, 44, (9), 919-924; ibid., 44, (9) 925-933; und ibid,. 44 (11), 1187-1198 (1991)] ist ein cyclisches Depsipeptid, das als Fermentationsprodukt eines Stammes Aureobasidium pullulans Nr. R106 erhalten wird. Es unterscheidet sich in der Struktur vollkommen von anderen Antimykotika. Aureobasidin A, das eine typische Aureobasidinverbindung ist, übt eine starke antimykotische Aktivität auf verschiedene Hefen der Gattung Candida aus, darunter Candida albicans (nachfolgend einfach als C. albicans bezeichnet), das an pathogener Pilz ist, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis und Pilze, die zu den Gattungen Aspergillus und Penicillium gehören (Japanische Patentoffenlegungsschrift Nr. 138296/1990), weist aber eine äußerst geringe Toxizität auf. Daher wird erwartet, dass diese Verbindung als Antimykotikum ausgezeichnete selektive Toxizität zeigt.
Jedes der vorhandenen Antimykotika mit geringer Toxizität zeigt nur eine fungistatische Wirkung, was klinische Probleme bereitet. Hingegen zeigt Aureobasidin eine germizide Wirkung. Obwohl es erforderlich ist, den Mechanismus der selektiven Toxizität von Aureobasidin unter diesen Gesichtspunkten zu klären, bleibt dieser Mechanismus noch vollständig unbekannt.
Wie in der kanadischen Patentoffenlegungsschrift Nr. 2124034 beschrieben ist, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung zuvor herausgefunden, dass Saccharomyces cerevisiae (nachfolgend einfach als S. cerevisiae bezeichnet) und Schizosaccharomyces pombe (nachfolgend einfach als Schizo. pombe bezeichnet) auf Aureobasidin empfindlich sind. Es wurden ferner empfindliche Zellen von S. cerevisiae oder Schizo. pombe in resistente Zellen mutiert und erfolgreich ein Gen isoliert, das in der Lage ist, eine Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen (ein Resistenzgen). Es wurde außerdem erfolgreich ein Gen, das in der Lage ist, Aureobasidinempfindlichkeit zu verleihen (ein Empfindlichkeitsgen) aus den entsprechenden empfindlichen Zellen isoliert.
Ebenso wurde ein Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, aus C. albicans unter Verwendung des Gens, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder eines Teils davon als Sonde isoliert. Es wurde jedoch kein Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, in Pilzen gefunden, die zur Gattung Aspergillus gehören.
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
Es gibt eine Reihe von Pilzen, wie die der Gattungen Aspergillus und Penicillium. Einige dieser Pilze werden seit langem bei der Nahrungsmittelherstellung eingesetzt (zum Beispiel beim Brauen von Getränken, Sojasauce und Miso, dem Reifen von Käse usw.), während eine Reihe davon bei der Produktion von Enzympräparaten oder Antibiotika von Bedeutung sind. Pilze beinhalten jedoch nicht nur die oben beschriebenen nützlichen, sondern auch schädliche, wie jene die Pflanzenkrankheiten auslösen und jene, die beim Menschen ernsthafte Erkrankungen auslösen, wie eine tief sitzende Mykose. Die jüngste Entwicklung in Genverfahrenstechniken hat es ermöglicht, nicht nur nützliche Stämme zu züchten, sondern auch Pilze zu neuen Zwecken einzusetzen, zum Beispiel der Produktion eines heterogenen Proteins. Ebenso werden Analysen der vitalen Phänomene von Pilzen unternommen.
Die vorliegende Erfindung kann ein Gen zur Verfügung stellen, das für ein Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und das bei Genverfahrenstechniken nützlich ist und in Analysen der vitalen Phänomene von Pilzen, bei Pilzen, wie jenen, die zur Gattung Aspergillus gehören und ihren funktionellen Derivaten. Das heißt, die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein Gen aufzuzeigen, das für ein Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon; ein Verfahren zum Klonen dieses Gens zur Verfügung zu stellen und ein Protein, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, für das dieses Gen kodiert oder ein funktionelles Derivat davon; die Antisense-DNA und die Antisense-RNA dieses Gens zur Verfügung zu stellen; eine Nukleinsäuresonde zur Verfügung zu stellen, die mit diesem Gen hybridisierbar ist und ein Verfahren zum Nachweis dieses Gens unter Verwendung dieser Nukleinsäuresonde; und einen Prozess zum Herstellen eines Proteins, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder eines funktionellen Derivats davon, unter Verwendung dieses Gens zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung kann wie folgt zusammengefasst werden. Der erste Aspekt der Erfindung betrifft ein Gen, das von einem Pilz stammt, das für ein Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon. Sie betrifft nämlich ein Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, das von einem Pilz erhalten ist oder ein funktionelles Derivat davon.
Der zweite Aspekt der Erfindung betrifft Antisense-DNA eines Gens, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, das durch SEQ ID Nr. 13 dargestellt ist.
Der dritte Aspekt der Erfindung betrifft Antisense-RNA eines Gens, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, das durch SEQ ID Nr. 14 dargestellt ist.
Der vierte Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes Plasmid, das ein Gen enthält, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und von einem Pilz stammt oder ein funktionelles Derivat davon. Der fünfte Aspekt der Erfindung betrifft eine Transformante, die das Plasmid des vierten Aspekts darin eingeführt aufweist. Der sechste Aspekt der Erfindung betrifft einen Prozess zur Herstellung eines Proteins, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon, unter Verwendung der oben genannten Transformante. Der siebte Aspekt der Erfindung betrifft ein Protein, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und von einem Pilz stammt oder ein funktionelles Derivat davon. Der achte Aspekt der Erfindung betrifft ein Protein, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen, worin mindestens die Aminosäure Gly an der Position 275 des Proteins, das Aureobasidinempfindlichkeit verleiht, das durch die SEQ ID Nr. 4 in der Sequenzliste dargestellt ist, durch eine andere Aminosäure ersetzt ist, oder ein funktionelles Derivat davon. Der neunte Aspekt der Erfindung betrifft eine DNA, die für das Protein des achten Aspekts kodiert, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass Pilze wie Aspergillus nidulans (nachfolgend einfach als A. nidulans bezeichnet) und Aspergillus fumigatus (nachfolgend einfach als A. fumigatus bezeichnet) auf Aureobasidin empfindlich sind. Daher haben sie empfindliche Zellen von A. nidulans zu resistenten Zellen mutiert und aus den entsprechenden resistenten Zellen erfolgreich ein Gen isoliert, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen (ein Resistenzgen). Ferner offenbaren sie die Existenz eines Proteins, für das dieses Gen kodiert. Sie haben auch erfolgreich neue Gene, die Aureobasidinempfindlichkeit regulieren, aus aureobasidinempfindlichen A. nidulans und A. fumigatus unter Verwendung eines DNA-Fragments des oben genannten Gens als Sonde gefunden. Außerdem haben sie herausgefunden, dass der Nachweis dieses Gens die Diagnose von Krankheiten ermöglicht, die durch diese Zellen verursacht sind (zum Beispiel durch Pilze bedingte Mykose) und dass die Antisense-DNA oder Antisense-RNA, die die Expression des Gens inhibiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, die für die Zellen charakteristisch ist, als Heilmittel für Krankheiten verwendbar ist, die durch diese Zellen verursacht sind (zum Beispiel ein Antimykotikum für Mykose), was damit die vorliegende Erfindung abschließt.
Der hier verwendete Ausdruck "ein Protein, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert" bedeutet ein Protein, das in einem Pilz enthalten ist, der eine Empfindlichkeit auf Aureobasidin zeigt. Dieses Protein ist erforderlich, um eine Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Aureobasidin zu erreichen. Der Ausdruck "ein Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert" bedeutet ein Gen, das für ein solches Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und ein Empfindlichkeitsgen und ein Resistenzgenz fallen in diese Kategorie. Die Aureobasidinempfindlichkeit eines Organismus schwankt in Abhängigkeit von der Molekularstruktur oder Menge eines solchen Proteins oder Gens, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, das der Organismus trägt.
Der hier verwendete Ausdruck "ein funktionelles Derivat des Proteins oder Gens, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert" bedeutet eines, das eine biologische Aktivität aufweist, die im Wesentlichen mit der des Proteins oder der DNA vergleichbar ist, das/die Aureobasidinempfind lichkeit reguliert. Es beinhaltet Fragmente, Varianten, Mutanten, Analoge, Homologe und chemische Derivate. Eine Variante bedeutet eine, die im Wesentlichen zum ganzen Protein oder einem davon stammenden Fragment in Struktur und/oder Funktion analog ist. Das heißt, ein Molekül, das zu einem anderen in der Aktivität im Wesentlichen analog ist, wird als Mutante betrachtet, obwohl diese beiden Moleküle sich in der Molekularstruktur oder Aminosäuresequenz voneinander unterscheiden. Die funktionellen Derivate beinhalten Proteine, die eine Aminosäuresequenz zeigen mit mindestens einer Modifikation ausgewählt aus Ersetzen, Insertion und Deletion von Aminosäurerest(en) und mit einer vergleichbaren biologischen Aktivität und Gene, die dafür kodieren. Das Protein, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, kann Ersetzen, Insertion und Deletion von Aminosäureresten durch ortsspezifische Mutagenese erfahren. Die isolierte DNA, die für das Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, kann einfach mindestens einer Modifikation unterzogen werden, die ausgewählt ist aus Ersetzen, Insertion und Deletion von Nukleotiden und damit kann eine neue DNA erhalten werden, die für das Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und funktionelle Derivate davon.
Bezüglich Ersetzen, Insertion und Deletion von Aminosäureresten können eine oder mehrere Aminosäuren durch gentechnische Verfahrensweisen umgewandelt werden und die, die keine Beeinträchtigung der biologischen Aktivität erleiden, sollten ausgewählt werden. Zur effektiven Durchführung einer Mutation am Rest an einer speziellen Stelle, wird Mutagenese beliebig am Zielkodon vorgenommen und eine Mutante mit der gewünschten Aktivität wird durch Screening aus den so exprimierten Produkten ermittelt. Die durch Insertion erhaltene Mutante beinhaltet ein fusioniertes Protein, worin das Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Protein oder ein funktionelles Derivat oder ein Fragment davon über eine Peptidbindung an ein anderes Protein oder Polypeptid an der Aminoendgruppe und/oder der Carboxyendgrupe des Aureobasidinempfind lichkeit regulierenden Proteins oder funktionellen Derivats oder Fragments davon gebunden ist. Zur Deletion von Aminosäurerest(en) kann ein beliebiges Aminosäurekodon in der Aminosäuresequenz durch ein Terminationskodon durch ortsspezifische Mutagenese ersetzt werden. Auf diese Weise kann die Region auf der Seite der Carboxyendgruppe des ersetzten Aminosäurerests von der Aminosäuresequenz deletiert werden. Alternativ kann eine DNA, die für ein Protein kodiert, von dem die Aminoendgruppen- und/oder Carboxyendgruppenregionen in einer beliebigen Länge deletiert sind, durch das Deletionsverfahren erhalten werden, das Abbau einer kodierenden DNA aus der/den Region(en) umfasst, die der Aminoendgruppe und/oder Carboxyendgruppe der Aminosäuresequenz entspricht [Gene, 33, 103-119 (1985)] oder ein PCR-Verfahren unter Verwendung von Primern, die ein Initiationskodon und/oder ein Terminationskodon enthalten. Bekannte Beispiele des ortsspezifischen Mutageneseverfahrens beinhalten das Gapped-Duplex-Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotid(en) [Methods in Enzymology, 154, 350-367 (1987)], das Uracil-DNA-Verfahren unter Verwendung von Oligonukleotid(en) [Methods in Enzymology, 154, 367-382 (1987)], das Mutationsverfahren mit Salpetriger Säure [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7258-7262 (1982)] und das Kassetten-Mutationsverfahren [Gene, 34, 315-323 (1985)].
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft ein Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, erhalten aus einem Pilz, der als Beispiel der Gattung Aspergillus angehört oder ein funktionelles Derivat davon. Zum Isolieren dieses Gens werden zunächst aureobasidinempfindliche Zellen einer Mutagenese unterzogen, so dass dadurch ein resistenter Stamm erhalten wird. Dann wird eine DNA-Bibliothek aus den Chromosomen-DNAs oder cDNAs dieses resistenten Stamms hergestellt und ein Gen, das in der Lage ist, die Resistenz zu verleihen (Resistenzgen) wird aus dieser Bibliothek geklont. Gleichermaßen wird eine DNA-Bibliothek eines empfindlichen Stamms aufgestellt und DNA-Moleküle, die mit dem Resistenzgen hybridisierbar sind, werden isoliert und geklont. Auf diese Weise kann ein Empfindlichkeitsgen isoliert werden.
Die Mutagenese wird zum Beispiel durch Behandlung mit einer Chemikalie wie Ethylmethansulfonat (EMS) oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder durch Ultraviolettstrahlung oder andere Strahlung durchgeführt. Eine Mutante, die die Resistenz erworben hat, kann durch Kultivieren der mutagenisierten Zellen in einem Nährmedium gescreent werden, das Aureobasidin in einer geeigneten Konzentration unter geeigneten Bedingungen enthält. Der so erhaltene resistente Stamm kann in Abhängigkeit vom Verfahren und den gewählten Bedingungen für die Mutagenese variieren. Es ist ferner möglich, Stämme auszuwählen, die sich im Ausmaß der Resistenz unterscheiden, indem die Aureobasidinkonzentration beim Screening variiert wird. Es ist auch möglich, einen temperaturempfindlichen resistenten Stamm auszuwählen, indem beim Screening die Temperatur variiert wird. Da es zwei oder mehr Mechanismen der Resistenz gegen Aureobasidin gibt, können zwei oder mehr Resistenzgene durch genetisches Klassifizieren dieser resistenten Stämme isoliert werden.
Die Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gene der vorliegenden Erfindung von Pilzen, die zur Gattung Aspergillus gehören, beinhalten ein Gen anaur1^R, das aus einer resistenten Mutante von A. nidulans isoliert ist, ein Gen anaur1^S, das aus einem empfindlichen Stamm von A. nidulans isoliert ist und ein Gen afaur1^S, das aus einem empfindlichen Stamm von A. fumigatus isoliert ist.
Die beigefügte 1 zeigt die Restriktionsenzymkarte der genomischen DNA des Gens anaur1^R, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und von einem Pilz Aspergillus stammt, 2 zeigt die Restriktionsenzymkarte der cDNA des Gens anaur1^S und 3 zeigt die Restriktionsenzymkarte der cDNA des Gens afaur1^S.
Gegen Aureobasidin empfindliche A. nidulans werden durch UV-Bestrahlung mutagenisiert und eine Genombibliothek des so erhaltenen resistenten Stamms angelegt. Aus dieser Bibliothek wird ein DNA-Fragment isoliert, das ein Resistenzgen (anaur1^R) enthält und die Restriktionsenzymkarte von 1 aufweist. Dieses Gen weist eine DNA-Sequenz auf, die in SEQ ID NR. 1 im Sequenzprotokoll dargestellt ist. Die Aminosäuresequenz eines durch dieses Gen kodierten Proteins, die auf Grundlage dieser DNA-Sequenz geschätzt ist, ist in SEQ ID NR. 2 im Sequenzprotokoll dargestellt. Durch Hybridisierung unter Verwendung dieses Resistenzgens wird ein cDNA-Fragment aus einer cDNA-Bibliothek eines empfindlichen Stamms isoliert, das ein Empfindlichkeitsgen (anaur1^S) enthält und die Restriktionsenzymkarte von 2 aufweist. Dieses Empfindlichkeitsgen weist eine DNA-Sequenz auf, die in SEQ ID NR. 3 im Sequenzprotokoll dargestellt ist. Die Aminosäuresequenz eines durch dieses Gen kodierten Proteins, die auf Grundlage dieser Basensequenz geschätzt ist, ist in SEQ ID NR. 4 im Sequenzprotokoll dargestellt. Ein Vergleich zwischen den Sequenzen von SEQ ID NR. 3 und SEQ ID NR. 1 zeigt, dass die genomische DNA ein Intron (Intervening Sequence) aufweist, die von der Base an der Position 1508 zu der an der Position 1563 in SEQ ID NR. 1 reicht. Ferner wurde G an der Position 1965 in SEQ ID NR. 1 zu T mutiert. Ein Vergleich zwischen den Sequenzen von SEQ ID NR. 4 und SEQ ID NR. 2 zeigt, dass im Aminosäurebereich die Aminosäure Glycin an der Position 275 zu Valin mutiert ist, was auf diese Weise Resistenz ergibt. Der erste Aspekt der Erfindung beinhaltet auch Gene, die durch chemische oder physikalische Veränderung eines Teils der Gene der vorliegenden Erfindung konstruiert sind, die Aureobasidinempfindlichkeit regulieren und von Pilzen stammen.
Das Gen des ersten Aspekts der Erfindung, seine funktionellen Derivate oder ein Teil davon können als Sonde in einem Verfahren zum Klonen eines Gens verwendet werden, das Aureobasidinempfindlichkeit regu liert und von einem Pilz stammt, wie einem der Gattung Aspergillus oder ein funktionelles Derivat davon. Das heißt, ein Gen, das für ein Protein kodiert, das eine vergleichbare Funktion aufweist, kann nach dem Hybridisierungsverfahren oder der Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) unter Verwendung des ganzen oder eines Teils des Gens (das aus mindestens 15 Oligonukleotiden besteht), das oben erhalten ist, als Sonde isoliert werden.
Zur Untersuchung einer Region, die in geeigneter Weise als die oben genannte Sonde verwendbar ist, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Aminosäuresequenz des durch das Gen anaur1^S der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste) kodierten Proteins und die Aminosäuresequenz des durch das Gen afaur1^S der vorliegenden Erfindung (SEQ ID NR. 5 in der Sequenzliste) kodierten Proteins mit der Aminosäuresequenz des durch das Aureobasidinempfindlichkeitsgen (scaur1^S) kodierten Proteins, das von S. cerevisiae stammt (SEQ ID NR. 6), der Aminosäuresequenz des durch ein anderes Aureobasidinempfindlichkeitsgen (spaur1^S) kodierten Proteins, das von Schizo. pambe stammt (SEQ ID NR. 7) und der Aminosäuresequenz des durch ein Aureobasidinempfindlichkeit regulierendes Gen (caaur1) kodierten Proteins, das von C. albicans stammt (SEQ ID NR. 8) verglichen, die alle im kanadischen Patent Nr. 2124034 beschrieben sind. Als Ergebnis wurde insgesamt keine Homologie beobachtet. Es wurde jedoch zum ersten Mal gezeigt, dass es eine charakteristische Sequenz gibt, die gemeinsam in diesen heterogenen Genen konserviert ist, die Aureobasidinempfindlichkeit regulieren. Diese konservierte Sequenz ist sehr gut konserviert (Homologie: 80 % oder mehr) und ist gebildet aus mindestens acht Aminosäureresten, was einer ausreichend langen Strecke entspricht, die als Sonde verwendet werden kann. 4 zeigt einen Vergleich zwischen den in den SEQ ID NR. 4 und 8 dargestellten Aminosäuresequenzen, wobei drei Sequenzen (Box-1 bis Box-3) von den Erfindern als "Box-Sequenzen" bezeichnet, der konservierten Sequenz entsprechen. Auf diese Weise kann ein Aureobasidinempfindlichkeit regulierendes Gen, das von einem Pilz stammt oder ein funktionelles Derivat davon unter Verwendung eines Primers oder einer Sonde geklont werden, die aus der Aminosäuresequenz von Box 1, 2 oder 3 konstruiert ist, die entsprechend in den SEQ ID NR. 9, 10 oder 11 in der Sequenzliste dargestellt sind.
Die in fünf Reihen in 4 angegebenen Aminosäuresequenzen entsprechen jeweils der SEQ ID NR. 4 (obere Reihe), SEQ ID NR. 5 (zweite Reihe), SEQ ID NR. 6 (dritte Reihe), SEQ ID NR. 7 (vierte Reihe) und SEQ ID NR. 8 (untere Reihe).
Das Zielgen (Targetgen), das für das Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon, kann durch Hybridisierung erhalten werden, zum Beispiel auf die folgende Weise. Zunächst werden Chromosomen-DNAs aus der Zielgenquelle erhalten oder cDNAs, die aus mRNAs unter Verwendung einer reversen Transkriptase konstruiert sind, nach einem herkömmlichen Verfahren mit einem Plasmid oder einem Phagenvektor verbunden und in einen Wirt eingeführt, um dadurch eine Bibliothek zu erstellen. Nach Inkubieren dieser Bibliothek auf einer Platte, werden die so gebildeten Kolonien oder Plaques auf eine Nitrocellulose- oder Polyamidmembran überführt und die DNAs denaturiert und so auf der Membran immobilisiert. Diese Membran wird in einer Lösung inkubiert, die eine Sonde enthält, die zuvor mit Radioisotop ³²P markiert ist usw. (Die hier zu verwendende Sonde kann ein Gen sein, das für die in SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste dargestellte Aminosäuresequenz kodiert oder einen Teil davon. Zum Beispiel kann das in SEQ ID NR. 3 in der Sequenzliste dargestellte Gen oder ein Teil davon verwendet werden. Es ist zweckmäßig, hierfür eine Basensequenz zu verwenden, die aus mindestens 15 Basen gebildet ist und für eine der in SEQ ID NR. 9 bis 11 in der Sequenzliste dargestellten Aminosäuresequenzen kodiert oder ein Teil davon.) Auf diese Weise werden Hybride zwischen den DNAs auf der Membran und der Sonde gebildet. Zum Beispiel wird die Membran mit darauf immobilisierten DNAs mit der Sonde in einer Lösung, die 6 × SSC, 1 % Natriumlaurylsulfat, 100 μg/ml Lachssperm-DNA und 5 × Denhardt-Lösung (mit Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll jeweils in einer Konzentration von 0,1 %) enthält, bei 65 °C 20 Stunden lang hybridisiert. Nach Beendigung der Hybridisierung werden unspezifisch adsorbierte Stoffe abgewaschen und mit der Sonde Hybride bildende Klone durch Autoradiographie usw. identifiziert. In dem so erhaltenen Klon ist ein Gen enthalten, das für das Zielprotein kodiert.
Es wird bestätigt, ob das erhaltene Gen dasjenige ist, das für das Zielprotein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon, nachdem die DNA-Sequenz des erhaltenen Gens zum Beispiel nach der folgenden Methode identifiziert ist.
Ein durch Hybridisierung erhaltener Klon kann auf folgende Weise sequenziert werden. Wenn die Rekombinante Escherichia coli ist, wird sie in einem Reagenzglas inkubiert usw. und das Plasmid nach einem herkömmlichen Verfahren extrahiert. Dann wird es mit Restriktionsenzymen gespalten und ein so ausgeschnittenes Insert davon in einen M13 Phagenvektor subkloniert, usw. Danach wird die Basensequenz nach dem Dideoxyverfahren identifiziert. Wenn die Rekombinante ein Phage ist, kann die Basensequenz fundamental durch die selben Schritte identifiziert werden. Diese fundamentalen experimentellen Verfahrensweisen, die von der Zellkultur zur DNA-Sequenzierung angewendet werden, sind zum Beispiel in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982) beschrieben.
Zur Bestätigung, ob das erhaltene Gen dasjenige ist, das für das Zielprotein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon, wird die so identifizierte Aminosäuresequenz mit der in SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste dargestellten Aminosäuresequenz verglichen, so dass dadurch die Proteinstruktur und Aminosäuresequenzhomologie bekannt wird.
Zur Untersuchung, ob das erhaltene Gen eine Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Aureobasidin unterhält, wird das erhaltene Gen in empfindliche Zellen transformiert und die Aureobasidinempfindlichkeit der so erhaltenen transformierten Zellen bestimmt, um dadurch die Aktivität des Gens aufzuzeigen. Alternativ kann die Aktivität durch Transformieren des erhaltenen Gens in Zellen bestimmt werden, deren Aktivität durch Unterbrechen oder Mutieren des Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gens eliminiert ist. Es ist bevorzugt, dass das oben genannte zu transformierende Gen Sequenzen, die zur Expression erforderlich sind (Promotor, Terminator usw.) vor und/oder nach dem Gen enthält, so dass Expression in den transformierten Zellen ermöglicht ist.
Wenn das erhaltene Gen nicht die gesamte Region enthält, die für das Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Protein oder ein funktionelles Derivat davon kodiert, kann die Basensequenz der gesamten Region, die für das Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Protein oder ein funktionelles Derivat davon kodiert, die mit dem Gen der vorliegenden Erfindung hybridisierbar ist, das für das Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Protein oder ein funktionelles Derivat davon kodiert, durch Herstellung von synthetischen DNA-Primern auf Grundlage des so erhaltenen Gens, Amplifizieren der fehlenden Region durch PCR oder ferner Screening einer DNA-Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Fragments des erhaltenen Gens als Sonde erhalten werden.
Zum Beispiel kann ein cDNA-Molekül, das die Restriktionsenzymkarte von 3 aufweist, das ein Gen (afaur1^S) von A. fumigatus enthält, das in der Funktion mit dem Gen anaur1^S vergleichbar ist, durch Screening einer cDNA-Bibliothek eines pathogenen Pilzes A. fumigatus unter Verwendung eines DNA-Fragments des PstI-EcoRI-Fragments (921 bp) von 2 als Sonde erhalten werden. Dieses Gen weist eine Basensequenz auf, die durch SEQ ID NR. 12 im Sequenzprotokoll dargestellt ist, und die Aminosäuresequenz eines Proteins, für das dieses Gen kodiert, das auf Grundlage dieser Basensequenz abgeschätzt ist, ist die von SEQ ID NR. 5 im Sequenzprotokoll dargestellte. Wenn die Gene anaur1^S und afaur1^S verglichen werden, wird eine Homologie von 87 % bei den Aminosäuren beobachtet. Ferner werden die genomischen DNAs, die aus Aspergillus niger (nachfolgend einfach als A. niger bezeichnet) und Aspergillus oryzae (nachfolgend einfach als A. oryzae bezeichnet) der Analyse durch Southern Blotting unterzogen, wobei ein DNA-Fragment des Gens anaur1^S als Sonde verwendet wird. Als Ergebnis wird gefunden, dass Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Gene in A. niger und A. oryzae vorkommen. Es ist auch möglich, Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Gene aus anderen Pilzen zu isolieren, als jenen, die zur Gattung Aspergillus gehören, zum Beispiel jene der Gattung Penicillium.
Der dritte Aspekt der Erfindung betrifft die oben genannte Nukleinsäuresonde, d. h. ein Oligonukleotid, das aus mindestens 15 Basen gebildet ist und mit einem Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gen hybridisierbar ist, zum Beispiel ein DNA-Fragment mit einer Restriktionsenzymkarte wie in 1, 2 oder 3.
Diese Nukleinsäuresonde ist bei der Hybridisierung in situ anwendbar, der Bestätigung eines Gewebes, worin das oben genannte Gen exprimiert ist, der Bestätigung des Vorhandenseins eines Gens oder mRNA in verschiedenen lebenden Geweben, usw. Diese Nukleinsäuresonde kann durch Ligation des oben genannten Gens oder eines Fragments an einen geeigneten Vektor hergestellt werden, Einführen in ein Bakterium gefolgt von Replikation, Extrahieren mit Phenol usw. aus einer zerstör ten Zelllösung, Spalten mit Restriktionsenzymen, die in der Lage sind, die Ligationsstelle mit dem Vektor zu erkennen, Elektrophorese und Ausschneiden aus den Elektrophoresegelen.
Alternativ kann diese Nukleinsäuresonde durch eine chemische Synthese unter Verwendung einer DNA-Syntheseeinrichtung oder Genamplifizierungstechniken durch PCR auf Grundlage jeder der Basensequenzen, die von den SEQ ID Nr. 1, 3 und 12 in der Sequenzliste dargestellt sind, hergestellt werden. Beispiele von Sequenzen, die zur Verwendung als Nukleinsäuresonde geeignet sind, beinhalten Basensequenzen, die aus mindestens 15 Basen gebildet sind und die in den SEQ ID Nr. 9 bis 11 in der Sequenzliste dargestellten Aminosäuresequenzen kodieren oder einen Teil davon. Zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit kann die Nukleinsäuresonde mit einem Radioisotop oder einer fluoreszierenden Substanz markiert sein.
Der vierte Aspekt der Erfindung betrifft die Antisense-DNA des oben genannten Gens, das in SEQ ID Nr. 13 dargestellt ist, während der fünfte Aspekt die Antisense-RNA davon betrifft, die in SEQ ID Nr. 14 dargestellt ist. Durch Einführen dieser Antisense-DNA oder Antisense-RNA in Zellen, kann die Expression des Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gens gesteuert werden.
Als die einzuführende Antisense-DNA können zum Beispiel die entsprechenden Antisense-DNAs von Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Genen verwendet werden, die in den SEQ ID Nr. 1, 3 und 12 in der Sequenzliste dargestellt sind, oder ein Teil davon. SEQ ID Nr. 13 in der Sequenzliste zeigt ein Beispiel einer solchen Antisense-DNA, die der Sequenz von Antisense-DNA des Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gens entspricht, das in SEQ ID Nr. 1 in der Sequenzliste dargestellt ist. Es ist auch möglich, als Antisense-DNA Fragmente zu verwenden, die durch geeignete Spaltung dieser Antisense-DNAs oder auf Grundlage der Sequenzen dieser Antisense-DNAs synthetisierter DNAs erhalten sind.
Als die einzuführende Antisense-RNA können zum Beispiel die entsprechenden Antisense-RNAs von Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Genen verwendet werden, die in den SEQ ID Nr. 1, 3 und 12 in der Sequenzliste dargestellt sind, der ein Teil davon. SEQ ID Nr. 14 in der Sequenzliste zeigt ein Beispiel einer solchen Antisense-RNA, die der Sequenz von Antisense-RNA des Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gens entspricht, das in SEQ ID Nr. 1 in der Sequenzliste dargestellt ist. Es ist auch möglich, als Antisense-RNA Fragmente zu verwenden, die durch geeignete Spaltung dieser Antisense-RNAs oder auf Grundlage der Sequenzen dieser Antisense-RNAs synthetisierter RNAs erhalten sind. Zum Beispiel kann eine RNA verwendet werden, die unter Verwendung der entsprechenden Antisense-RNA des in SEQ ID Nr. 1 oder 3 in der Sequenzliste dargestellten Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gens und Behandeln mit RNA-Polymerasen in einem Transkriptionssystem in vitro hergestellt ist.
Die Antisense-DNA und Antisense-RNA kann chemisch modifiziert werden, um sie in vivo schwer abbaubar zu machen und zu ermöglichen, dass sie Zellmembranen passieren. Eine Substanz, die in der Lage ist, mRNA zu inaktivieren, wie ein Ribozym kann daran gebunden sein. Die so hergestellte Antisense-DNA und Antisense-RNA ist bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen verwendbar, wie einer Mykose in Verbindung mit einer Zunahme des Gehalts an mRNA, die für das Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Gen oder ein funktionelles Derivat davon kodiert.
Der sechste Aspekt der Erfindung betrifft ein rekombinantes Plasmid, worin das Gen des ersten Aspekts, das für ein Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, oder ein funktionelles Derivat davon und von einem Pilz stammt, in einen geeigneten Vektor integriert ist. Zum Beispiel ist ein Plasmid, worin ein Aureobasidin resistentes Gen in einen geeigneten Hefevektor integriert ist, als selektives Markergen geeignet, da es die Auswahl einer Transformante erleichtert, die die Wirkstoffresistenz gegen Aureobasidin zeigt.
Ebenso kann ein rekombinantes Plasmid stabil von Escherichia coli usw. getragen sein. Beispiele von Vektoren, die. dafür geeignet sind, beinhalten pUC118, pWHS, pAU-PS, Traplex119 udn pTB118.
Es ist auch möglich, einen Pilz durch Ligation des Gens aus dem ersten Aspekt, der für ein Protein kodiert, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, oder ein funktionelles Derivat davon und von einem Pilz stammt, an einen geeigneten Vektor zu transformieren. Wenn ein Plasmid wie pDHG25 [Gene 98, 61-67 (1991)] als Vektor eingesetzt wird, kann die in den Pilz eingeführte DNA darin im Zustand des Plasmids gehalten werden. Wenn ein Plasmid wie pSa23 [Agricultural and Biological Chemistry, 51, 2549-2555 (1987)] als Vektor eingesetzt wird, kann die DNA darin im Zustand der Integration in das Chromosom des Pilzes stabil gehalten werden. Es ist ferner möglich, ein rekombinantes Plasmid zur Genexpression durch Reduzieren des Gens der vorliegenden Erfindung in den offenen Leserahmen (ORF, open reading frame) zu erhalten, indem es einfach mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten und Ligation mit einem geeigneten Vektor vorgenommen wird. Zur Konstruktion des Plasmids zur Expression kann ein Plasmid wie pTV118 usw. (wenn Escherichia coli als Wirt verwendet wird), pYE2 usw. (wenn eine Hefe als Wirt verwendet wird), pMAMneo usw. (wenn Säugerzellen als Wirt verwendet werden) oder pTAex3 usw. (wenn ein Pilz als Wirt verwendet wird) als Vektor verwendet werden.
Der siebte Aspekt der Erfindung betrifft eine Transformante, die durch Einführen des oben genannten rekombinanten Plasmids in einen geeig neten Wirt erhalten wird. Als Wirt können Escherichia coli, Hefen, Pilze und Säugerzellen verwendet werden. Durch ein Plasmid pANAR1 transformierte Escherichia coli JM109, die das Gen anaur1^S darin integriert tragen, werden Escherichia coli JM109/pANAR1 genannt und sind beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM BP-5180 hinterlegt.
Der achte Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen des Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Proteins oder eines funktionellen Derivats davon. Dieses Verfahren umfasst Inkubieren einer Transformante mit dem rekombinanten Expressionsplasmid des sechsten Aspekts, das ein Gen enthält, das für dieses Protein oder ein funktionelles Derivat davon kodiert, in einem geeigneten Nährmedium, Abtrennen und Reinigen des so exprimierten Proteins von den Zellen oder dem Medium. Zum Exprimieren des für dieses Protein kodierenden Gens werden Escherichia coli, eine Hefe, ein Pilz oder Säugerzellen als Wirt verwendet.
Der neunte Aspekt der Erfindung betrifft ein Protein, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert oder ein funktionelles Derivat davon. Beispiele davon beinhalten die durch die oben genannten Gene anaur1^R, anaur1^S und afaur1^S kodierten, und die die Aminosäuresequenzen aufweisen, wie sie jeweils in den SEQ ID NR. 2, 4 und 5 dargestellt sind.
Selbstverständlich können diese Proteine mindestens eine Modifikation aufweisen, die ausgewählt ist aus Ersetzen, Insertion und Deletion durch chemische, physikalische oder genetische Verfahrenstechniken. Es ist auch möglich, einen Antikörper gegen ein Aureobasidinempfindlichkeit regulierendes Protein zu konstruieren, indem die Proteine mit den in den SEQ ID NR. 2, 4 und 5 dargestellten Aminosäuresequenzen oder ein Peptidfragment oder eine Region, die einem Teil einer solchen Aminosäuresequenz entspricht, als Antigen verwendet wird.
Der zehnte Aspekt der Erfindung betrifft ein Protein, das in der Lage ist, Aureobasidinresistenz zu verleihen, worin mindestens die Aminosäure Gly an der Position 275 im Gen, das Aureobasidinempfindlichkeit verleiht, dargestellt durch SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste durch eine andere Aminosäure ersetzt ist. Diese Erfindung umfasst auch funktionelle Derivate davon, die durch Einführen mindestens einer Modifikation ausgewählt aus Ersetzen, Insertion und Deletion durch chemische, physikalische oder genetische Verfahrenstechniken darin ohne irgendeine Beeinträchtigung der biologischen Aktivität, erhalten sind. Das Protein der vorliegenden Erfindung, das in der Lage ist, Aureobasidinresistenz zu verleihen, kann in geeigneter Weise durch Gentechnik ausgebildet werden, indem DNAs verwendet werden, die für die Proteine kodieren, die in der Lage sind, Aureobasidinresistenz zu verleihen, die durch SEQ ID NR. 3 und 12 in der Sequenzliste dargestellt sind. Die biologische Aktivität kann durch Messen der Aktivität bestimmt werden, indem aureobasidinempfindliche Zellen in aureobasidinresistente Zellen umgewandelt werden.
Der elfte Aspekt der Erfindung betrifft eine DNA, die für das Protein des zehnten Aspekts kodiert, das in der Lage ist, Aureobasidinresistenz zu verleihen. Er beinhaltet auch DNAs, die durch Einführen mindestens einer Modifikation ausgewählt aus Ersetzen, Insertion und Deletion von Nukieotid(en) in die oben genannte DNA erhalten sind. Eine solche Modifikation kann leicht durch eine ortsspezifische Mutagenese bewirkt werden. Diese modifizierten DNAs werden eingesetzt, um mutierte Proteine herzustellen.
Die Nukleinsäuresonde kann auch in einem Verfahren zum Nachweis eines Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gens durch Hybridisie rung verwendet werden. Beispiele der hier verwendbaren Nukleinsäuresonde beinhalten Oligonukleotide, die aus mindestens 15 Basen gebildet sind und selektiv mit den in den SEQ ID NR. 1, 3 und 12 in der Sequenzliste oder Fragmenten davon hybridisierbar sind. Es ist zweckmäßig, hierfür Basensequenzen zu verwenden, die für die Aminosäuresequenzen kodieren, die in den SEQ ID NR. 9 bis 11 der Sequenzliste dargestellt sind, oder einen Teil davon und aus mindestens 15 Basen bestehen. Unter Verwendung einer solchen Nukleinsäuresonde werden aus dem Zielorganismus extrahierte DNAs oder RNAs einer Southern-Hybridisierung oder Northern-Hybridisierung unterzogen, um dadurch das Gen des Zielorganismus zu ergeben, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert. Die Nukleinsäuresonde ist auch bei der Bestätigung eines Gewebes verwendbar, in dem das oben genannte Gen exprimiert werden kann oder der Bestätigung des Vorhandenseins von Gen oder mRNA in verschiedenen lebenden Geweben durch Hybridisierung in situ.
Diese Nukleinsäuresonde kann durch Ligation des oben genannten Gens oder seines Fragments mit einem geeigneten Vektor, Einführen in ein Bakterium gefolgt von Replikation, Extrahieren mit Phenol usw. aus einer zerstörten Zelllösung, Spalten mit Restriktionsenzymen, die in der Lage sind, die Ligationsstelle mit dem Vektor zu erkennen, Elektrophorese und Ausschneiden aus dem Gel hergestellt werden. Alternativ kann diese Nukleinsäuresonde durch eine chemische Synthese unter Verwendung einer DNA-Syntheseanlage oder Genamplifizierungstechniken mit PCR auf Basis jeder der Basensequenzen, die durch SEQ ID NR. 1, 3 und 12 in der Sequenzliste dargestellt sind, hergestellt werden. Um die Nachweisempfindlichkeit bei der Anwendung zu erhöhen, kann die Nukleinsäuresonde mit einem Radioisotop oder einer fluoreszierenden Substanz markiert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 Diagramm, das die Restriktionsenzymkarte der genomischen DNA eines Gens anaur1^R zeigt, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert.
2 Diagramm, das die Restriktionsenzymkarte der cDNA eines Gens anaur1^S zeigt, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert.
3 Diagramm, das die Restriktionsenzymkarte der cDNA eines Gens afaur1^S zeigt, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert.
4 Diagramm, das einen Vergleich von Aminosäuresequenzen von Proteinen zeigt, die von den Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Genen kodiert werden.
5 Diagramm, das eine Beziehung zwischen der genomischen DNA, cDNA und Protein eines Gens anaur1 zeigt, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert.
6 Diagramm, das die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung von Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Genen von A. nidulans und A. fumigatus zeigt.
7 Diagramm, das die Ergebnisse der Northern-Hybridisierung zeigt, die den Nachweis von Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Genen von A. niger und A. oryzae angibt.
Beispiele
Zur weiteren ausführlicheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung, jedoch nicht als Einschränkung, werden die folgenden Beispiele angeführt.
Beispiel 1
Klonen des Gens anaur1, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und von A. nidulans stammt
1-a) Isolation einer aureobasidinresistenten Mutante von A. nidulans
Ein Stamm A. nidulans FGSC89, der eine Empfindlichkeit auf Aureobasidin bei 5 μg/ml zeigt, wird in ein SD-Slant (mit 1 % Polypepton S, 2 Glucose und 2 % Agar) eingeimpft und darin bei 30 °C 7 Tage lang inkubiert. Nach Suspendierung in 5 ml einer 0,1 % Lösung von Tween 80, die 0,8 % NaCl enthält, wird die Suspension durch einen Glasfilter (3G3 Typ) filtriert und das erhaltene Filtrat als Konidie-Suspension verwendet. Diese Konidie-Suspension wird 5 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt, was Mutagenese bewirkt. Unter diesen Bedingungen beträgt die Überlebensrate ungefähr 25 %. Nach Lichtausschluss über 30 Minuten oder länger, werden die Konidien in eine SD-Platte überimpft und bei 30 °C 4 Tage lang inkubiert. Die so gebildeten Konidien werden mit einem Glasfilter gesammelt, dann in Cz+bi-Medium überimpft (mit 4,9 % Czapek-Lösungagar (hergestellt von Difco), 200 μg/ml Arginin und 0,02 μg/ml Biotin), das 5 μg/ml Aureobasidin enthält und darin bei 30 °C inkubiert. Nach 2 oder 3 Tagen werden acht aureobasidinresistente Kolonien erhalten. Obwohl diese Zellen eine Resistenz gegen 80 μg/ml Aureobasi din zeigen, sind sie gleich dem Elternstamm bei den Empfindlichkeiten gegen Amphotericin B, Cycloheximid und Clotrimazol. Auf diese Weise wurde geschätzt, dass die so erworbene Resistenz keine Mehrfachwirkstoffresistenz ist, sondern eine spezifische Resistenz gegen Aureobasidin.
1-b) Aufstellen einer Genombibliothek des aureobasidinresistenten Stamms
Aus einem Stamm R1, der eine besonders hohe Resistenz unter den aureobasidinresistenten Stämmen zeigt, wird genomische DNA auf folgende Weise extrahiert und gereinigt. Nach Inkubation in einem PD-Medium (mit 2,4 % Kartoffeldextrosebrühe (hergestellt von Difco)) 2 Tage lang unter Schütteln bei 30 °C, werden Hyphen mit einem Glasfilter (3G1 Typ) gesammelt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann werden die Zellen entwässert und in 20 ml einer Protoplastenbildungslösung suspendiert (mit 20 mg/ml Yatalase (hergestellt von Ozeki Shuzo), 0,8 M NaCl und 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,0). Dann wird die Suspension bei 30 °C über Nacht langsam gerührt, so dass Protoplasten gebildet werden. Die Suspension wird durch einen Glasfilter filtriert (3G2 Typ) und auf diese Weise die Protoplasten in das Filtrat gesammelt und dann durch Zentrifugieren bei 2000 Upm über 5 Minuten geerntet. Nach zweimal Waschen mit 0,8 M NaCl, werden die Protoplasten in 2 ml TE-Lösung suspendiert (mit 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA, pH 8,0) und 2 ml einer Lysislösung (mit 2 % SDS, 0,1 M NaCl, 10 mM EDTA und 50 mM Tris-HCl, pH 7,0) hinzugefügt. Nach langsamem Rühren wird die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten und dann mit 3500 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert, gefolgt von Gewinnung des Überstands. Dann wird eine äquivalente Menge einer Mischung von Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1) hinzugegeben und die Mischung im Röhrchen sanft vermischt und bei 3000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert, gefolgt von Gewinnung der oberen Flüssigkeitsschicht. Da nach wird 2,5-mal das Volumen an Ethanol bei –20 °C hinzugegeben. Die erhaltene Mischung wird bei –80 °C 10 Minuten lang stehen gelassen und dann bei 3500 Upm 15 Minuten lang zentrifugiert. Die dadurch ausgefällten DNAs werden getrocknet. Dann werden 0,5 ml einer TE-Lösung und 2,5 μl einer RNase-A-Lösung (20 mg/ml) hinzugegeben und die Mischung 30 Minuten lang bei 37 °C gehalten.
Nach Zugabe von 0,5 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol, wird die erhaltene Mischung sanft vermischt und bei 10000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert, gefolgt vom Gewinnen der oberen Schicht. Diese Vorgehensweise wird einmal wiederholt.
Nach Zugabe von 0,5 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24/1), wird die erhaltene Mischung sanft vermischt und bei 10000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert, gefolgt vom Gewinnen des Überstands. Dann werden 0,05 ml 5 M NaCl und 0,5 ml Isopropylalkohol hinzugegeben und die Mischung bei –80 °C 10 Minuten lang stehen gelassen und bei 10000 Upm 15 Minuten lang zentrifugiert, so dass dadurch DNAs gesammelt werden.
Acht μg der so gereinigten DNAs werden durch Behandeln mit 4 U eines Restriktionsenzyms BamHI bei 37 °C 15 Minuten lang teilweise verdaut. Nach Deproteinisierung mit Phenol/Chloroform wird die DNA durch Ethanolfällung gewonnen. Die DNAs werden auf einem 0,8 % Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und DNAs in einer Region von 3 bis 15 kb werden extrahiert und gereinigt. Die so erhaltenen DNAs werden unter Verwendung eines DNA-Ligationskit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) durch Ligation mit einem Vektor pDHG25 verknüpft [(Gene 98, 61-67 (1991)], der mit BamHI vollständig verdaut ist. Dann werden Escherichia coli HB101 damit transformiert, so dass eine Genombibliothek des Resistenzstamms aufgestellt wird. Die Zellen von E. coli, die diese Genombibliothek enthalten, werden in 50 ml eines LB- Medium (mit 1 % Bactotrypton, 0,5 % Bactohefeextrakt und 0,5 % Natriumchlorid), das 100 μg/ml Ampicillin enthält, bei 37 °C über Nacht kultiviert. Danach werden von den E. coli Zellen Plasmide gewonnen und gereinigt.
1-c) Expression und Klonen des Aureobasidinresistenzgens anaur1^R
Das so erhaltene von der Genombibliothek des aureobasidinresistenten Stamms stammende Plasmid wird nach dem folgenden Verfahren in einen Stamm A. nidulans FGSC89 transformiert. A. nidulans wird in einem PD-Medium unter Schütteln bei 30 °C 2 Tage lang inkubiert. Dann werden Hyphen durch Filtern der Kulturbrühe durch einen Glasfilter (3G1 Typ) gesammelt und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Nach ausreichendem Entwässern werden die Zellen in 10 ml einer Protoplastenbildungslöung suspendiert. Nach Umsetzen durch langsames Schütteln bei 30 °C über ungefähr 3 Stunden, wird die Zellsuspension durch einen Glasfilter 3G3 filtriert. Dann wird das Filtrat bei 2000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert, um dadurch die Protoplasten abzutrennen. Die gesammelten Protoplasten werden mit 0,8 M NaCl zweimal gewaschen und in Sol 1 suspendiert (mit 0,8 M NaCl, 10 mM CaCl₂ und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) in einer Weise, dass eine Protoplastenkonzentration von 2 × 10⁸/ml erhalten wird. Dann werden 0,2-mal das Volumen an Sol 2 (mit 40 Gew./Vol. PEG4000, 50 mM CaCl₂ und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugegeben und gut vermischt.
10 μg des Plasmids aus der Genombibliothek werden zu einem 0,2 ml Anteil der Protoplastensuspension zugegeben. Nach gründlichem Vermischen wird die Mischung 30 Minuten lang in Eis stehen gelassen und dann 1 ml Sol 2 hinzugegben. Nach gründlichem Vermischen wird die Mischung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann 8,5 ml Sol 1 hinzugegeben. Nach gründlichem Vermischen wird die Mischung bei 2000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert, so dass die Protoplasten gesammelt werden. 0,2 ml Sol 1 werden hinzugegeben und die erhaltene Mischung in die Mitte einer Minimalmediumplatte platziert (mit 4,9 % Czapek-Lösungagar, 0,8 M NaCl und 0,02 μg/ml Biotin), das 5 μg/ml Aureobasidin enthält. Danach werden 5 ml eines Softagarmedium (mit 3,5 % Czapek-Dox-Brühe, 0,8 M NaCl, 0,02 μg/ml Biotin und 0,5 % Agar) darauf geschichtet, gefolgt von 3 bis 5 Tagen Inkubation bei 30 °C. Es wird angenommen, dass die auf dieser Platte wachsenden Kolonien ein Plasmid tragen, das ein Aureobasidinresistenzgen enthält.
Auf diese Weise werden ungefähr 70 Kolonien auf dem Aureobasidin enthaltenden Medium gebildet. Diese Kolonien werden in 20 ml eines Cz+Bi-Mediums überführt und bei 30 °C 2 Tage lang inkubiert. Dann wird aus den so fortgepflanzten Zellen gemäß dem Verfahren zur Extraktion und Reinigung von DNA wie in Beispiel 1-b) beschrieben, DNA gewonnen und gereinigt. Ein Stamm E. coli HB101 wird durch diese DNA transformiert und auf einer LB-Platte verteilt, die 100 μg/ml Ampicillin enthält. Dann wird eine Plasmid-DNA aus den so gebildeten Kolonien von E. coli hergestellt. Dieses Plasmid enthält eine DNA von 12 kb und wird pR1-1 genannt. 5 zeigt die Restriktionsenzymkarte der 12 kb DNA, die in pR1-1 enthalten ist. Zur weiteren Spezifizierung der Resistenzgenregion wird das DNA-Fragment von 12 kb mit Restriktionsenzymen in Fragmente unterschiedlicher Größe verdaut. Danach werden diese Fragmente in einen Vektor pDHG25 geklont. Plasmide, die verschiedene DNAs enthalten, werden in einen Stamm A. nidulans FGSC89 transformiert, um zu bestätigen, ob die Aureobasidinresistenz auf diese Weise erworben werden kann oder nicht. Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Aktivität zur Verleihung von Aureobasidinresistenz in einem Fragment Bg1 II (5,8 kb) liegt. Auf diese Weise wurde geklärt, dass das Gen anaur1^R in diesem Fragment gelegen ist. 1 zeigt die Restriktiosnenzymkarte dieses DNA-Fragments, das das Aureobasidinresistenzgen anaur1^R enthält. Dieses Fragment wird in einen Vektor pUC118 subkloniert und das erhaltene Plasmid wird pUR1 genannt. Unter Verwendung dieses Plasmids wird die DNA-Sequenz der DNA identifiziert. SEQ ID NR. 1 im Sequenzprotokoll zeigt diese Basensequenz. Wie diese DNA-Sequenz angibt, ist das Gen anaur1^R eines, das aus zwei Exonregionen gebildet ist, die ein Intron enthalten. Es wurde gefunden, dass dieses Gen für ein Protein kodiert, das die in SEQ ID NR. 2 im Sequenzprotokoll dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
1-d) Klonen des Aureobasidinempfindlichkeitsgens anaur1^S
Zum Erhalten der cDNA des Aureobasidinempfindlichkeitsgens aus normalen Zellen von A. nidulans, werden zunächst die gesamten RNAs aus einem Stamm A. nidulans FGSC89 extrahiert. Dieser Stamm wird in 200 ml eines PD-Mediums inkubiert und die Zellen unter Verwendung eines Glasfilters (3G1 Typ) gesammelt. Nach ausreichendem Entwässern werden die Zellen schnell mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Dann werden die gefrorenen Zellen in einem Mörser pulverisiert und die gesamten RNAs (2,6 mg) unter Verwendung eines RNA-Extraktionskits (hergestellt von Pharmacia) extrahiert und gereinigt. Aus 1 mg dieser RNAs werden 12,8 μg Poly(A)⁺RNAs unter Verwendung von Oligotex-dT30 <Super> (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gebildet. Unter Verwendung von 5 μg der Poly(A)⁺RNAs werden cDNAs unter Verwendung eines Takara cDNA-Synthesekits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) synthetisiert. Die so synthetisierten cDNAs erfahren Ligation mit einem λ-Phagenvektor λSH1ox^TM (hergestellt von Novagen, Inc.) und werden einer in vitro Verpackung unter Verwendung des Systems Phage Maker^TM, Phage Pack Extract (hergestellt von Novagen, Inc.) unterzogen, so dass dadurch eine cDNA-Bibliothek aufgestellt wird. Diese cDNA-Bibliothek wird in einen Wirtstamm E. coli ER1647 infiziert. Nach Vermischen mit Topagarose (ein LB-Medium mit 0,7 % Agarose) wird es auf eine LB-Platte aufgeschichtet und bei 37 °C über Nacht in kubiert, so dass Plaques gebildet werden. Die so gebildeten Plaques werden auf eine Polyamidmembran überführt (Hybond-N, hergestellt von Amersham) und einer Plaquehybridisierung unterzogen. Als Sonde wird ein DNA-Fragment von 2,6 kb verwendet, das durch Spalten des in Beispiel 1-c) erhaltenen Plasmids pUR1 mit PstI und SalI gebildet wird. Dieses DNA-Fragment wird mit [α-³²P]dCTP unter Verwendung eines Primer-DNA-Markierungskit markiert (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) und als Sonde bei der Hybridisierung verwendet. Als Ergebnis des Screening von 4 × 10⁵ Plaques werden 8 Phagenklone erhalten, die mit der Sonde hybridisierbar sind. Danach werden diese Phagen einer automatischen Subklonierung in E. coli unterzogen, so dass dadurch Stämme von E. coli mit Plasmiden gebildet werden, worin eine cDNA enthaltende Region automatisch subkloniert ist. Die Plasmide werden aus diesen Stämmen gereinigt und die cDNAs in der Länge verglichen. Auf diese Weise wird pS15 mit der längsten cDNA (2,9 kb) ausgewählt und in pUC118 subkloniert, gefolgt von Identifizierung der DNA-Sequenz. Dieses Plasmid wird pANAR1 genannt. Ein Stamm von E. coli transformiert mit pANAR1 wird Escherichia coli JM109/pANAR1 genannt und ist beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology unter der Zugangsnummer FERM BP-5180 hinterlegt. 2 zeigt die Restriktionsenzymkarte dieser cDNA. Die DNA-Basensequenz davon ist in SEQ ID NR. 3 in der Sequenzliste dargestellt. Wie diese Basensequenz angibt, kodiert das Gen anaur1^S für ein Protein mit der Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID NR. 4 in der Sequenzliste dargestellt ist. Ein Vergleich mit dem Resistenzgen anaur1^R zeigt, dass die Base G an der Position 1218 in SEQ ID NR. 3 zu T mutiert ist und bei den Aminosäuren die Aminosäure Glycin an der Position 275 zu Valin konvertiert ist. Es wurde ferner geklärt, dass die genomische DNA ein Intron (56 bp) aufweist. 5 zeigt die Beziehung zwischen der genomischen DNA und cDNA.
Beispiel 2
Bestätigung und Klonen des von A. fumigatus getragenen Gens afaur1^S
2-a) Nachweis des Gens afaur1^S durch Northern-Hybridisierung
Aus einem Stamm A. fumigatus TIMM1776 werden Poly(A)⁺RNAs nach dem selben Verfahren wie bei Beispiel 1-d) extrahiert und gereinigt. Die Poly(A)⁺RNAs (1 μg) von A. fumigatus und A. nidulans werden durch Elektrophorese auf einem 1,2 % Agarosegel, das Formaldehyd enthält, getrennt und auf eine Polyamidmembran überführt. Nach Fixieren wird Hybridisierung unter Verwendung eines HindIII-Fragments (741 bp) der cDNA des Gens anaur1^S markiert mit [α-³²P]dCTP als Sonde vorgenommen. Nach Hybridisierung über Nacht bei 60 °C wird die Mischung bei 60 °C mit 0,5 × SSC und 0,1 % SDS gewaschen. In 5 zeigen die Streifen 1 und 2 die Ergebnisse der Hybridisierung von Poly(A)⁺RNAs erhalten von A. nidulans bzw. A. fumigatus. 6 zeigt deutlich, dass bei Autoradiographie der Hybridisierung sowohl A. fumigatus und A. nidulans die Aureobasidinresistenzgene in der selben Größe aufweisen. Die Bande von A. fumigatus ist jedoch sehr schwach, was angibt, dass die Homologie zwischen den Genen nicht so hoch ist.
2-b) Klonen des von A. fumigatus getragenen Gens afaur1^S
Unter Verwendung der in Beispiel 2-a) gereinigten Poly(A)⁺RNAs von A. fumigatus wird eine cDNA-Bibliothek von A. fumigatus gemäß dem Verfahren für die Aufstellung einer cDNA-Bibliothek wie in Beispiel 1-d) beschrieben aufgestellt. Die oben genannte Bibliothek wird unter den selben Hybridisierungsbedingungen gescreent wie in Beispiel 2-a), unter Verwendung eines PstI-EcoRI-Fragments (921 bp) der cDNA von A. nidulans als Sonde. Auf diese Weise werden acht Phagenklone erhalten. Aus diesem Phagenklon wird nach dem in Beispiel 1-d) beschriebenen Verfahren die cDNA in Form eines Plasmids gewonnen. Die Plasmide werden gereinigt und die cDNAs nach der Länge verglichen. Auf diese Weise wird das Plasmid mit der längsten cDNA (2,9 kb) daraus ausgewählt. Diese cDNA wird in pUC118 subkloniert und die DNA-Sequenz identifiziert. Diese Basensequenz, die in SEQ ID NR. 12 der Sequenzliste dargestellt ist, gibt an, dass dieses Gen für ein Protein kodiert, das die in SEQ ID NR. 5 der Sequenzliste dargestellte Aminosäuresequenz aufweist. Ein Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz des afaur1^S-Proteins des Stamms A. fumigatus TIMM1776 mit der des anaur1^S-Proteins des Stamms A. nidulans FGSC 89 zeigt an, dass sie eine hohe Homologie aufweisen (87 %).
Beispiel 3
Bestätigung der von A. niger und A. oryzae getragenen Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Gene
Genomische DNAs wurden aus Stämmen A. fumigatus TIMM1776, A. niger FGSC805 und A. oryzae IFO5710 nach dem in Beispiel 1-b) beschriebenen Verfahren extrahiert und gereinigt. Ferner werden genomische DNAs aus Hefestämmen S, cerevisiae DKD-5D und Schizo. pombe JY745 nach dem Verfahren von P. Philippsen et al. [Methods in Enzymology, 194, 169-175 (1991)] extrahiert und gereinigt. Anteile von 5 μg der genomischen DNAs von A. nidulans, A. fumigatus, A. niger, A. oryzae, S. cerevisiae und Schizo. pombe werden mit einem Restriktionsenzym PstI gespalten, durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel getrennt, auf eine Polyamidmembran überführt und fixiert. Danach wird Southern-Hybridisierung unter Verwendung eines PstI-EcoRI-Fragments der cDNA des Gens anaur1^S markiert mit [α-³²P]dCTP als Sonde vorgenommen. Die Hybridisierung wird unter den selben Bedingungen vorgenommen wie es in Beispiel 2-a) beschrieben ist. 7 zeigt das Autoradiogramm der Hybridisierung. Wie 7 deutlich zeigt, treten Aureobasidinempfindlichkeit regulierende Gene auch in A. niger und A. oryzae auf. Es wird ebenfalls aufgezeigt, dass die DNA von A. nidulans mit den Aureobasidinempfindlichkeitsgenen der Hefen S. cerevisiae und Schizo. pombe nicht hybridisierbar ist. In 7 zeigen die Streifen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 die Ergebnisse der Southern-Hybridisierung der genomischen DNAs von A. nidulans, A. fumigatus, A. niger, A. oryzae, S. cerevisiae bzw. Schizo. pombe.
Effekte der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Protein zur Verfügung, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert und von einem Pilz der Gattung Aspergillus stammt, und ein Gen, das für dieses Protein kodiert, d. h. ein Aureobasidinempfindlichkeit regulierendes Gen. Diese Substanzen sind bei der Diagnose und Behandlung von Erkrankungen nutzvoll, wie Mykose, die durch Organismen ausgelöst sind, die das Gen tragen. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Antisense-DNA und Antisense-RNA des oben genannten Gens zur Verfügung, und ein Verfahren zur Herstellung eines Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Proteins unter Verwendung einer Transformante, die dieses Gen darin eingeführt aufweist. Diese Substanzen sind auch bei der Diagnose und Behandlung von Erkrankungen nutzvoll, wie beispielsweise bei Mykose. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Aureobasidinempfindlichkeit regulierendes Gen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (1) einem Gen, das für eine Aminosäuresequenz kodiert, wie sie durch SEQ. ID Nr. 2, 4 oder 5 dargestellt ist; (2) einem Gen, das eine Basensequenz aufweist, wie sie durch SEQ ID Nr. 1, 3 oder 12 dargestellt ist; (3) einem Gen, das mit einem Gen von (2) unter Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, worin eine Hybridisierung in einer Lösung, die 6 × SSC, 1 % Natriumlaurylsulfat, 100 μg/ml Lachssperm-DNA und 5 × Denhardt-Lösung (die Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficol jeweils in einer Konzentration von 0,1 % enthält) enthält, bei 65 °C über 20 Stunden vorgenommen wird.
Gen nach Anspruch 1, das von einem Pilz erhalten wird, der zur Gattung Aspergillus gehört.
Gen nach Anspruch 1 oder 2, das für ein Protein kodiert, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen.
Gen nach Anspruch 3, das durch SEQ ID Nr. 1 in der Sequenzliste dargestellt ist.
Antisense-DNA eines Gens nach Anspruch 4, dargestellt durch SEQ ID Nr. 13 in der Sequenzliste.
Antisense-RNA eines Gens nach Anspruch 4, dargestellt durch SEQ ID Nr. 14 in der Sequenzliste.
Rekombinantes Plasmid, das ein Gen enthält, wie es in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht ist.
Transformante, bei der ein rekombinantes Plasmid, wie in Anspruch 7 beansprucht, eingeführt ist.
Protein, das Aureobasidinempfindlichkeit reguliert, kodiert durch ein Gen wie in Anspruch 1 oder 2 beansprucht.
Protein, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen, worin mindestens die Aminosäure Gly an der Position 275 des Proteins, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen, dargestellt durch SEQ ID Nr. 4 in der Sequenzliste, durch eine andere Aminosäure ersetzt ist.
Protein, das in der Lage ist, Resistenz gegen Aureobasidin zu verleihen wie in Anspruch 10 beansprucht, worin die Aminosäure Gly an der Position 275 durch Val ersetzt ist.
Verfahren zum Herstellen des Aureobasidinempfindlichkeit regulierenden Proteins nach Anspruch 9, 10 oder 11, das umfasst: Inkubieren einer Transformante wie in Anspruch 8 beansprucht und Gewinnen des Proteins.