KR100452393B1 - 오레오바시딘감수성조절유전자 - Google Patents

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Abstract

[구성]
Aspergillus 속 또는 이의 기능적 유사체에 속하는 몰드로 부터 얻어진 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 암호화하는 유전자. 적어도 이의 일부분을 탐침으로 사용한 클로닝 방법. 이 유전자의 안티센스 DNA 또는 RNA. 앞서 언급된 유전자의 재조합 플라즈미드, 형질전환체, 단백질등의 생산 방법. 앞서 언급된 유전자와 혼성화 가능한 핵산 탐침 및 이를 이용한 유전자의 감지 방법.
[효과]
진균증과 같은 질환의 진단 및 치료에 유용함.

Description

오레오바시딘(auredabsidin) 감수성 조절 유전자
오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 유전자를 밝히고, 이 유전자와 관계된 여러 물질 또는 방법을 제공한다.
본 발명은 항진균성 오레오바시딘에 대한 감수성을 조절하며 Aspergillus 속에 속하는 것과 같은 몰드(mold)로 부터 얻어진 단백질 및 이 단백질을 암호화하는 유전자 즉, 오레오바시딘 감수성을 조절하며 몰드로 부터 기원한 유전자에 관한 것이다.
오레오바시딘 [공개된 일본 특허 제138296호/1990, 제22995호/1991, 제 220199호/1991, 제279384호/1993 및 제65291호/1994; J. Antibiotics, 44, (9), 919-924 ; 동일문헌, 44, (9) 925-933; 및 동일문헌, 44, (11), 1187-1198 (1991)]은 Aureobasidium pullulans No. R106 균주의 발효 산물로서 얻어지는 시클릭뎁시펩타이드이다. 이것은 다른 항진균제와는 구조가 현격히 다르다. 전형적인 오레오바시딘 화합물인 오레오바시딘 A는 병원성 진균인 Candida albicans(본원에서 이후에 간단히 C. albicans로 지칭)를 포함하는 Candida 속의 여러 이스트, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dernatitis 및 Aspergillus 및 Penicillium(공개된 일본 특허 제 138296/1990 호) 속에 속하는 진균에 대해 강력한 항진균 활성을 보이나 극도로 낮은 독성을 갖는다. 따라서, 이 화합물은 선택적 독성에 있어 탁월한 항진균제로서 예견된다.
낮은 독성을 가진 기존의 항진균제는 치료적 문제를 일으키는 제균작용만을 보였다. 이와는 반대로, 오레오바시딘은 생식세포 살균 효과를 보인다. 이러한 관점에서 오레오바시딘의 선택적 독성 기작의 명확화가 요구되어 왔음에도 불구하고 기작은 아직까지 전혀 밝혀지지 않았다.
공개된 캐나다 특허 제 2124034 호에 기술된 바와 같이, 본 발명자는 Saccharomyces cerevisiae(본 원에서 이후에 간단히 C. cerevisiae로 지칭) 및 Schizosaccharomyces pombe(본 원에서 이후에 간단히 Schizo. pombe로 지칭)이 오레오바시딘에 감수성을 가진다는 것을 앞서 발견하였다. 우리는 S. cerevisiae 또는 Schizo. pombe의 감수성 세포를 내성 세포로 돌연변이를 유발시켜 이들로 부터 오레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있는 유전자(내성 유전자)를 성공적으로 분리하였다. 우리는 상응하는 감수성 세포로 부터 오레오바시딘 감수성을 부여할 수 있는 유전자(감수성 유전자)를 성공적으로 분리하였다.
우리는 또한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 일부분을 탐침으로 사용하여 C. albicans로 부터 오레오바시딘 감수성 조절 유전자를 분리하였다. 그러나, Aspergillus 속에 속하는 몰드에서는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자가 발견되지 않았다.
Aspergillus 및 Penicillium 속과 같은 많은 몰드가 있다. 이 몰드 중 일부는 식품 제조(예를 들면, 술, 콩 원료 및 miso의 양조, 치즈 숙성등)에 다년간 사용되어 왔으며, 이들중 다수는 효소 제조나 항생제 생산에 중요하다. 그러나 몰드는 앞서 언급한 유용한 것 뿐 아니라 식물에 병을 일으키고 심부 진균증과 같은 심각한 인간의 질환을 일으키는 것도 포함한다. 유전공학 기술에 있어서의 최근의 발전으로 유용한 균주를 교배시킬 뿐 아니라, 예를 들면 이질 단백질을 생산하는 것과같은 새로운 목적을 위해 몰드를 사용하는 것도 가능하게 되었다. 또한 몰드의 생명 현상 분석이 진행중이다.
본 발명의 목적은 Aspergillus 속 및 이의 기능적 유사체에 속하는 것들을 포함하는 몰드로 부터 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 암호화하며, 유전 공학 기술과 몰드의 생명 현상을 연구하는데 유용한 유전자를 발견하는 것이다.
말하자면 본 발명은 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 유전자를 밝히고; 이 유전자 및 이 유전자 또는 이의 기능적 유사체에 의해 암호화된 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 클로닝하는 방법을 제공하며; 이 유전자의 안티센스 DNA 및 안티센스 RNA를 제공하고; 이 유전자와 혼성화 가능한 핵산 탐침 및 핵산 탐침을 이용하여 이 유전자를 감지하는 방법을 제공하며; 이 유전자를 이용하여 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 및 이의 기능적 유사체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
[문제를 해결하기 위한 수단]
본 발명은 하기와 같이 요약될 수 있다. 제 1 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 이것은 몰드로 부터 수득된 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체에 관한 것이다. 제 2 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체를 클로닝하는 방법에 관한 것이며 여기서 제 1 발명의 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체가 완전하게 또는 부분적으로 탐침으로서 사용된다. 제 3 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체와 혼성화 가능한 적어도 15개 염기로 구성된 서열을 포함하는 핵산 탐침에 관한 것이다. 제 4 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체의 안티센스 DNA에 관한 것이다. 제 5 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체의 안티센스 RNA에 관한 것이다. 제 6 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성을 조절하는 유전자 또는 이의 기능적 유사체를 포함하는 재조합 플라즈미드에 관한 것이다. 제 7 발명은 제 6 발명의 플라즈미드가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다. 제 8 발명은 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 앞서 언급한 형질 전환체를 이용하여 생산하는 방법에 관한 것이다. 제 9 발명은 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체에 관한 것이다. 제 10 발명은 오레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있는 단백질에 관한 것이며 여기서 적어도 서열 목록에서 SEQ ID NO. 4로 나타내지는 오레오바시딘에 대한 감수성을 부여하는 단백질의 275 위치 아미노산 글리신이 다른 아미노산 또는 이의 기능적 유사체로 치환된다. 제 11 발명은 오레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있는 제 10 발명의 단백질을 암호화는 DNA에 관한 것이다. 제 12 발명은 제 3 발명의 핵산 탐침을 이용한 혼성화 반응으로 오레오바시딘 감수성 조절 유전자를 감지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명자는 Aspergullus nidulans(본 원에서 이후에 간단히 A. nidulans 로 지칭) 및 Aspergillus fumigatus(본 원에서 이후에 간단히 A. fumigatus로 지칭)와 같은 몰드가 오레오바시딘에 감수성을 가짐을 밝혔다. 그래서, 우리는 A. nidulans의 감수성 세포를 내성 세포로 돌연변이를 일으켜 상응하는 내성 세포로부터 오레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있는 유전자(내성 유전자)를 분리하는데 성공하였다. 더구나, 우리는 이 유전자에 의해 암호화된 단백질의 존재를 공개하였다. 우리는 또한 앞서 언급한 유전자 DNA 절편을 탐침으로 사용하여 오레오바시딘에 감수성을 갖는 A. nidulans 및 A. fumifatus로 부터 새로운 오레오바시딘 감수성 조절 유전자를 성공적으로 발견하였다. 더구나, 우리는 이 유전자의 감지가 이 세포에 의해 일어나는 질환(예를들면 진균류에 의해 일어나는 진균증)의 진단을 가능하게 하며, 이 세포의 특징인 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA가 이러한 세포에 의해 유발되는 질환의 치료제(예를 들면 진균증을 위한 항진균제)로서 사용될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완결하였다.
[발명의 양태]
본 원에서 사용된 "오레오바시딘 감수성 조절 단백질"이란 용어는 오레오바시딘에 대해 감수성을 보이는 몰드가 가지는 단백질을 의미한다. 이 단백질은 오레오바시딘에 대한 감수성 또는 내성을 획득하기 위해 요구된다. "오레오바시딘 감수성 조절 유전자"란 용어는 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 암호화하는 유전자를 의미하며 감수성 유전자와 내성 유전자가 이 범주에 해당된다. 생물체의 오레오바시딘 감수성은 생물체가 보유하는 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 유전자의 분자 구조와 양에 따라 다양하다.
본 원에서 사용된 "오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 유전자의 기능적 유사체"란 용어는 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 DNA에 실질적으로 필적할만한 생물학적 활성을 가진 것을 의미한다. 이것에는 절편, 변종, 돌연변이, 유사체, 동족체 및 화학적 유도체가 포함된다. 변종이란 그로 부터 기원한 전체 단백질 또는 절편이 구조적 및/또는 기능적으로 실질적으로 유사함을 의미한다. 두 분자가 서로 분자 구조나 아미노산 서열에 서로 차이가 있더라도, 활성에 있어서 다른 것과 근본적으로 유사한 분자를 돌연변이라 한다. 기능적 유사체에는 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및 결손중에서 선택된 적어도 하나의 변형을 갖는 아미노산 서열을 보이며 필적할 만한 생물학적 활성을 갖는 단백질 및 이를 암호화 하는 유전자가 포함된다. 오레오바시딘 감수성 조절 단백질은 위치-특이적 돌연변이화에 의해 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및 결손이 이루어질 수 있다. 분리된 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 암호화하는 유전자는 누클레오타이드의 치환, 삽입 및 결손중에서 선택된 적어도 하나의 변형이 쉽게 적용될 수 있으며 따라서 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 및 이의 기능적 유사체를 암호화하는 새로운 유전자 가 수득될 수 있다.
아미노산 잔기의 치환, 삽입 및 결손에 있어서, 유전공학 기술에 의해 하나 이상의 아미노산이 전환될 수 있으며 생물학적 활성에 손상을 입지 않은 것이 선택되어야 한다. 특정된 위치의 잔기에 적절하게 돌연변이를 일으키기 위해 돌연변이화는 목표 코돈상에서 무작위적으로 수행되며 원하는 활성을 가진 돌연변이가 발현된 것들로 부터 탐색된다. 삽입에 의한 돌연변이는 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체 또는 이의 절편이 펩타이드 결합에 의해 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체 또는 이의 절편의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에서 다른 단백질 또는 폴리펩타이드와 연결된 융합 단백질과 관련된다. 아미노산 잔기를 결손시키기 위해 아미노산 서열내의 임의적 아미노산 코돈이 위치-특이적 돌연변이화에 의해 종결 코돈으로 치환될 수 있다. 따라서, 치환된 아미노산 잔기의 카르복시 말단쪽 부위는 아미노산 서열로 부터 결손될 수 있다. 대안적으로, 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 부위로 부터 임의적 길이로 결손된 단백질을 암호화하는 DNA는 아미노산 서열의 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 해당하는 부분으로 부터 암호화하는 DNA를 분해하는 것을 포함하는 결손 방법[Gene, 33, 103-119 (1985)] 또는 개시 코돈 및/또는 종결 코돈을 포함하는 프라이머를 사용하는 PCR 기법에 의해 수득될 수 있다. 위치-특이적 돌연변이화 방법의 공지된 예에는 올리고누클레오타이드를 이용하는 gapped duplex 방법[Methods in Enzymology, 154, 350-367 (1987)], 올리고누클레오타이드를 이용한 우라실 DNA 방법[Methods in Enzymology, 153, 367-382 (1987)], 질산 돌연변이 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7258-7262 (1982)] 및 카셋트 돌연변이 방법[Gene, 34, 315-323 (1985)]가 포함된다.
몰드로부터 얻은 오레오바시딘 감수성 조절 유전자에 관한 1 발명은 Aspergillus 속 및 이의 기능적 유사체에 속하는 것에 의해 예시된다. 이 유전자를 분리하기 위해 오레오바시딘 감수성 세포를 우선 돌연변이화 시킴으로써 이들로 부터 내성 균주를 유도해낸다. 이후 내성 균주의 크로모좀 DNA 또는 cDNA로 부터 DNA 라이브러리가 제조되고 내성을 부여할 수 있는 유전자(내성 유전자)가 이 라이브러리로 부터 클로닝된다. 이와 유사하게, 감수성 균주의 DNA 라이브러리가 제조되고 내성 유전자와 혼성화 가능한 DNA 분자가 분리 및 클로닝된다. 이렇게 하여 감수성 유전자가 분리될 수 있다.
돌연변이화는 예를 들면 에틸메탄 설포네이트(EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)와 같은 화학약품 또는 자외선 또는 다른 조사를 처리함으로써 수행될 수 있다. 내성을 획득한 돌연변이는 적절한 배양조건하, 적당한 농도의 오레오바시딘을 포함한 영양 배지에서 돌연변이된 세포를 배양함으로써 탐색될 수 있다. 이렇게 얻어진 내성 균주는 돌연 변이 선택의 방법 및 조건에 따라 다양하다. 탐색시 오레오바시딘의 농도에 변화를 줌으로써 내성 정도가 다른 균주를 선택하는 것 또한 가능하다. 탐색시 온도에 변화를 줌에 의해 온도-감수성 내성 균주를 선택하는 것 또한 가능하다. 오레오바시딘에 대한 내성 기작이 2개 이상 존재하기 때문에, 이 내성 균주를 유전적으로 분류함에 의해 2개 이상의 내성 유전자가 분리될 수 있다.
본 발명의 Aspergillus 속에 속하는 몰드의 오레오바시딘 감수성 조절 유전자에는 A. nidullans의 내성 돌연변이로 부터 분리된 anaurlR 유전자, A. nidullans의 감수성 균주로 부터 분리된 anaurls 유전자 및 A. fumigatus의 감수성 균주로 부터 분리된 afaurls 유전자가 포함된다.
첨부된 도 1 에서는 Aspergillus 몰드로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 anaurlR의 게놈 DNA의 제한효소 지도를 보여주며, 도 2 에서는 anaurls 유전자 cDNA의 제한효소 지도를 보여주고 도 3 에서는 afaurls 유전자 cDNA의 제한효소 지도를 보여준다.
오레오바시딘에 감수성을 갖는 A. nidulans는 UV 조사에 의해 돌연변이화되고 얻어진 내성 균주의 게놈 라이브러리가 제조된다. 이 라이브러이로 부터 내성 유전자(anaurlR)를 포함하며 도 1 의 제한효소 지도를 갖는 DNA 절편이 분리된다. 이 유전자는 서열 목록에 SEQ ID NO. 1으로 나타낸 DNA 서열을 갖는다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 DNA 서열을 기본으로 생각했을때 서열 목록의 SEQ ID NO. 2로 나타내어진다. 이 내성 유전자를 사용하여 혼성화 함으로써 감수성 유전자 (anaurls)를 포함하며 도 2 의 제한효소 지도를 갖는 cDNA 절편이 감수성 균주의 cDNA 라이브러리로부터 분리된다. 이 감수성 유전자는 서열 목록에 SEQ ID NO. 3으로 나타내어진 DNA 서열을 갖는다. 이 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 염기 서열을 기본으로 생각했을때 서열 목록의 SEQ ID NO. 4로 나타내어진다. SEQ ID NO. 3과 SEQ ID NO. 1의 서열을 비교함으로써 게놈 DNA에는 SEQ ID NO.1의 1508 위치 부터 1563 염기위치 까지의 범위에 1개의 인트론(중간 사이서열)이 존재함이 밝혀졌다. 더구나, SEQ ID NO. 1의 1965 위치의 G가 T로 돌연변이 되었다. SEQ ID NO. 4와 SEQ ID NO. 2의 서열의 비교로 아미노산 수준에서 275 위치의 아미노산 글리신이 발린으로 돌연변이 되어 내성을 부여함이 밝혀졌다. 제 1 발명은 또한 몰드에서 기원되었고 오레오바시딘 감수성을 조절하는 본 발명의 유전자의 일부를 화학적 또는 물리적으로 변형시킴으로써 제작된 유전자에 관한 것이다.
제 2 발명은 오레오바시딘 감수성을 조절하고 Aspergillus 속 또는 이의 기능적 유사체와 같은 몰드로 부터 기원한 유전자를 클로닝하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 오레오바시딘 감수성을 조절하고 몰드로 부터 기원한 제 1 발명의 유전자, 이의 기능적 유사체 또는 이의 일부를 탐침으로 사용하는 것을 포함한다. 즉, 필적할 만한 기능을 가진 단백질을 암호화하는 유전자가 앞서 얻어진 유전자의 전체 또는 일부(적어도 15개 올리고누클레오타이드로 구성됨)를 탐침으로 사용하여 혼성화 방법 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 분리될 수 있다.
앞서 언급된 탐침으로 적절히 사용가능한 위치를 조사하기 위해, 본 발명자들은 본 발명의 anaurls 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열(서열 목록의 SEQ ID NO. 4)과 본 발명의 afaurls 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO. 5)을 각각 캐나다 특허 제 2124034 호에 기재된 S. cerevisiae로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자(scaurls)에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO. 6), Schizo. pombe로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자(spaurl2)에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO. 7), C. albicans로 부터 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자(caaurl)에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO. 8)과 비교하였다. 이 결과, 전체적으로 상동성이 발견되지 않았다. 그러나, 오레오바시딘 감수성을 조절하는 이 이질적 유전자내에 공통적으로 보존된 특징적인 서열이 존재함을 최초로 밝혔다. 이 보존된 서열은 매우 잘 보존되었고(상동성 : 80% 이상) 적어도 8개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며 이것은 탐침으로 사용되기에 충분한 길이이다. 도 4 에서는 SEQ ID NO. 4 부터 8까지로 나타내어진 아미노산 서열간의 비교를 보여주며 여기서 발명자에 의해 "상자 서열"이라 호칭된 3개의 서열(상자-1 부터 상자-3)이 보존된 서열에 해당된다. 따라서, 오레오바시딘 감수성을 조절하고 몰드 또는 이의 기능적 유사체로 부터 기원한 유전자는 서열 목록에 각각 SEQ ID NO. 9, 10 또는 11로 나타내어진 상자 1, 2 또는 3의 아미노산 서열로 부터 제작된 프라이머 또는 탐침을 사용함으로써 클로닝될 수 있다.
도 4 에서 5줄로 주어진 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO. 4(첫번째 줄), SEQ ID NO. 5(두번째 줄), SEQ ID NO. 6(세번째 줄), SEQ ID NO. 7(네번째 줄) 및 SEQ ID NO. 8(아래 줄)에 해당된다.
오레오바시딘 감수성을 조절하는 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 목표 유전자는 예를 들면 하기의 방법으로 혼성화 함으로써 수득될 수 있다. 우선, 목표 유전자 공급원으로 부터 얻어진 크로모조말 DNA 또는 mRNA로 부터 역전사 효소를 사용하여 제작한 cDNA를 일반적인 방법에 따라 플라즈미드 또는 파이지 벡터에 연결시키고 호스트에 도입함으로써 라이브러리를 제작한다. 이 라이브러리를 평판상에서 배양한 후 형성된 콜로니 또는 플라크를 니크로셀룰로즈 또는 나일론 막에 옮기고 DNA를 변성시킨 후 막에 고정시킨다. 이 막은 미리 방사성 동위원소 32P 등로 표지된 탐침을 포함한 용액내에 항온유지된다(본 원에서 사용될 탐침은 서열 목록에서 SEQ ID NO. 4로 나타내어진 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 이의 일부분일 수 있다. 예를 들면, 서열 목록에서 SEQ ID NO. 3으로 나타내어진 유전자 또는 이의 일부분을 사용할 수 있다. 적어도 15개의 염기로 구성되며 서열 목록 SEQ ID NO. 9 부터 11까지로 나타내어진 아미노산 서열 중 하나를 암호화하는 염기서열 또는 이의 일부분을 사용하는 것이 적절하다). DNA 혼성물은 막상의 DNA와 탐침사이에 형성된다. 예를 들면, 고정된 DNA를 가진 막은 6×SSC, 1% 나트륨 라우릴 설페이트, 100㎍/㎖의 연어 정자 DNA 및 5×Denhardt's 용액(각각 0.1% 농도로 소 혈청 알부민, 폴리비닐피롤리돈 및 Ficoll 포함)을 포함한 용액내의 탐침과 65℃에서 20시간 동안 혼성화된다. 혼성화가 완결된 후 비특이적으로 흡착된 물질들을 세척하고 탐침과 혼성물을 형성한 클론을 오토래디오그램 등을 이용하여 선별한다. 이렇게 얻어진 클론내에는 목표 단백질을 암호화하는 유전자가 포함되어 있다. 예를 들면 하기의 방법에 의해 얻어진 유전자의 DNA 서열이 결정된 후, 얻어진 유전자가 오레오바시딘 감수성을 조절하는 목표 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 것인지가 확인된다.
혼성화 반응에 의해 얻어진 클론은 하기의 방법으로 염기서열이 결정될 수 있다. 재조합체가 모두 Escherichia coli인 경우, 시험관 등에서 배양된후 플라즈미드가 일반적인 방법에 의해 추출된다. 그후 제한 효소로 절단하고 이로부터 잘라져 나온 삽입부를 M13 파이지 벡터 등에 서브클로닝한다. 그 다음에는 디데옥시 방법으로 염기 서열을 결정한다. 재조합체가 파아지인 경우, 염기 서열은 기본적으로 동일한 단계를 통해 결정될 수 있다. 세포 배양부터 DNA 염기서열의 결정까지에 사용된 기본적인 실험방법은 예를 들면, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(T. Maniatis 일동, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1982))에 기술되어 있다.
얻어진 유전자가 오레오바시딘 감수성을 조절하는 목표 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 것인지를 확인하기 위해, 확인된 아미노산 서열을 서열목록의 SEQ ID NO. 4로 나타내어진 아미노산 서열과 비교함으로써 단백질 구조 및 아미노산 서열의 상동성을 알게되었다.
얻어진 유전자가 오레오바시딘에 대한 감수성 또는 내성을 부여하는지 알아보기 위해, 얻어진 유전자를 감수성 세포로 형질전환시켰으며 이렇게 얻어진 형질전환된 세포의 오레오바시딘 감수성을 결정함으로써 유전자의 활성을 밝혔다. 대안적으로, 오레오바시딘 감수성을 조절하는 유전자를 파괴시키거나 돌연변이를 일으킴으로서 제거한 세포에 얻어진 유전자를 형질전환 시킴으로써 활성을 결정할 수 있다. 형질전환될 앞서 언급된 유전자는 형질전환된 세포내에서의 발현이 가능하도록 유전자의 업스트림 및/또는 다운스트림에 발현을 위해 요구되는 서열(프로모터, 터미네이터 등)을 포함한다.
얻어진 유전자가 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 전체 부분을 포함하지 못한 경우, 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 본 발명의 유전자와 혼성화 가능한 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 전체 부분의 염기서열은 얻어진 유전자에 기본한 합성 DNA 프라이머를 제작하고 손실된 부분을 PCR로 증폭시키거나 또는 얻어진 유전자의 절편을 탐침으로 사용하여 DNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 더 탐색함으로써 얻어질 수 있다.
예를 들면, 도 3의 제한효소 지도를 가지며 anaurls 유전자의 기능과 비교될만한 A. fumigatus의 (afaurls) 유전자를 포함하는 cDNA 분자는 도 2의 PstI-EcoRI 절편의 DNA 절편(921 bp)을 탐침으로 사용하여 병원성 진균인 A. fumigatus의 cDNA 라이브러리를 탐색함으로써 얻어질 수 있다. 이 유전자는 서열목록 SEQ ID NO.12에 의해 나타내어지는 염기 서열을 가지며 이 염기서열을 기본으로 산출되는 이 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열은 서열목록의 SEQ ID NO.5로 나타내어진다. anaurls 와 afaurls 유전자를 비교했을때, 아미노산 수준에서 87%의 상동성이 관찰된다. Aspergillus niger(본원에서 이후에 간단히 A. niger로 지칭)와 Aspergillus oryzae(본원에서 이후에 간단히 A. oryzae로 지칭)로 부터 준비된 게놈 DNA를 anaurls 유전자의 DNA 절편을 탐침으로 사용하여 Southern Blotting 분석을 수행하였다. 이 결과, 오레오바시딘 감수성 조절 유전자가 A. niger와 A. oryzae에 존재함을 밝혔다. 예를 들면, Penicillium 속과 같이 Aspergillus 속 이외의 몰드로 부터 오레오바시딘 감수성 조절 유전자를 분리하는것 또한 가능하다.
제 3 발명은 예를 들면 도 1, 2 또는 3의 제한효소 지도를 갖는 DNA 절편과 같은, 적어도 15개 염기로 구성되어 있고, 오레오바시딘 감수성 조절 유전자와 혼성화 가능한 앞서 언급된 핵산 탐침에 관한 것이다.
이 핵산 탐침은 위치 특이적 혼성화 반응(in situ hybridization), 앞서 언급된 유전자가 발현되는 조직의 확인, 여러 생조직내 유전자 또는 mRNA 존재의 확인등에 적용될 수 있다. 이 핵산 탐침은 앞서 언급된 유전자 또는 이의 절편을 적절한 벡터에 라이게이션하고, 이것을 세균에 도입시킨후 복제, 파괴된 세포 용액으로부터 페놀 등을 이용한 추출, 벡터와의 라이게이션 위치를 인지할 수 있는 제한효소로의 절단, 전기영동 및 전기영동 겔로부터의 절제를 통하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이 핵산 탐침은 DNA 합성기를 이용한 화학적 합성 또는 서열목록의 SEQ ID NO.1, 3 및 12로 나타내어지는 각 염기서열에 기본한 PCR에 의한 유전자 증폭기술을 사용함으로써 제조될 수 있다. 이 핵산 탐침으로 적절히 사용가능한 서열의 예에는 적어도 15개 염기로 구성되어있으며 서열 목록 SEQ ID NO.9 내지 11로 나타내어진 아미노산 서열 또는 이의 일부를 암호화하는 염기서열이 포함된다. 감지 감도를 높이기 위해, 핵산 탐침은 방사성 동위원소 또는 형광물질로 표지될 수 있다.
제 4 발명은 오레오바시딘 감수성을 조절하며 몰드로 부터 기원한 앞서 언급한 유전자의 안티센스 DNA에 관한 것이며, 제 5 발명은 이들의 안티센스 RNA에 관한 것이다. 세포내로 이 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA를 도입함으로써, 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 발현이 조절될 수 있다.
도입될 안티센스 DNA로서, 예를들면 서열목록의 SEQ ID NO. 1, 3 및 12로 나타내어지는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 일부분의 해당 안티센스 DNA가 사용될 수 있다. 서열목록의 SEQ ID NO.13은 서열목록의 SEQ ID NO.1로 나타내어지는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 안티센스 DNA 서열에 해당하는 안티센스 DNA의 예를 보여준다. 이러한 안티센스 DNA 또는 이 안티센스 DNA의 서열을 기본으로 합성된 DNA를 적절히 절단함으로써 수득되는 절편을 안티센스 DNA로 사용하는것 또한 가능하다.
도입될 안티센스 RNA로서 예를 들면, 서열목록의 SEQ ID NO. 1, 3 및 12로 나타내어지는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 또는 이의 일부분의 해당 안티센스 RNA가 사용될 수 있다. 서열목록의 SEQ ID NO. 14는 서열목록의 SEQ ID NO. 1로 나타내어지는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 안티센스 RNA 서열에 해당하는 안티센스 RNA의 예를 보여준다. 이러한 안티센스 RNA 또는 이 안티센스 RNA의 서열을 기본으로 합성된 RNA를 적절히 절단함으로써 수득되는 절편을 안티센스 RNA로 사용하는것 또한 가능하다. 예를들면, 서열 목록의 SEQ ID NO. 1 또는 3으로 나타내어지는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 해당 안티센스 RNA를 이용하고 시험관내 전사 시스템내에서 RNA 중합효소를 처리함으로써 제조된 RNA를 사용할 수 있다.
안티센스 DNA 및 안티센스 RNA는 생체내에서 잘 분해되지 않고 세포막을 통과할 수 있게 하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 라이보자임과 같이 mRNA를 불활화 시킬 수 있는 물질이 여기에 결합될 수 있다. 이렇게 제조된 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA는 오레오바시딘 조절 유전자 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 mRNA 함량의 증가와 관계있는 진균증과 같은 여러 질환의 치료에 이용가능하다.
제 6 발명은 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하며 몰드로 부터 기원한 제 1 발명의 유전자를 적절한 벡터에 삽입시킨 재조합 플라즈미드에 관한 것이다. 예를들면, 오레오바시딘 감수성 조절 유전자를 적절한 이스트 벡터에 삽입시킨 플라즈미드는 오레오바시딘에 대한 약물 내성을 보이는 형질 전환체를 선별하기 쉽기 때문에 선별표지인자 유전자로서 매우 유용하다.
또한, 재조합 플라즈미드는 Escherichia coli등에 의해 안정하게 보유된다. 이러한 목적으로 사용가능한 벡터의 예에는 pUC118, pWH5, pAU-PS, Traplex119 및 pTB118이 포함된다.
오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하며 몰드로 부터 기원한 제 1 발명의 유전자를 적절한 벡터에 라이게이션 시킴으로써 몰드를 형질전환시키는 것 또한 가능하다. pDHG25(Gene, 98, 61-67 (1991))과 같은 플라즈미드가 벡터로 사용되었을때, 몰드로 도입되는 DNA는 이 안에서 플라즈미드 상태로 유지될 수 있다. pSa23[Agriculthral and Biological Chemistry, 51, 2549-2555 (1987)]과 같은 플라즈미드가 벡터로서 사용되었을 경우, DNA는 몰드의 크로모좀내로 삽입된 상태로서 안정하게 유지될 수 있다. 적절한 제한효소로 절단하고 적절한 벡터에 라이게이션 시킴으로써 본 발명의 유전자를 개방 해독틀만으로 감소시켜 유전자 발현을 위한 재조합 플라즈미드를 제조하는 것 또한 가능하다. 발현을 위한 벡터를 제조하기 위해 pTV118 등(Escherichia coli가 호스트로서 사용될 경우), pYE2 등(이스트가 호스트로서 사용될 경우), pMAMneo 등(포유동물세포가 호스트로 사용될 경우) 또는 pTAex3 등(몰드가 호스트로 사용될 경우)과 같은 플라즈미드가 벡터로서 사용될 수 있다.
제 7 발명은 앞서 언급된 재조합 플라즈미드를 적절한 호스트에 도입함으로써 얻어지는 형질전환체에 관한 것이다. 호스트로서, Escherichia coli, 이스트, 몰드 및 포유동물 세포가 사용될 수 있다. anaurls 유전자가 삽입된 pANAR1 플라즈미드에 의해 형질전환된 Escherichia coli JM109는 Escherichia coli JM109/pANAR1으로 이름 붙여졌으며 기탁번호 FERM BP-5180으로 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 기탁되었다.
제 8 발명은 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 단백질 또는 이의 기능적 유사체를 암호화하는 유전자를 포함하는 제 6 발명의 재조합 발현 플라즈미드를 갖는 형질전환체를 적절한 영양 배지에 배양하고 세포로 부터 발현되거나 또는 배지로부터 단백질을 회수 및 정제하는 것으로 구성된다. 이 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시키기 위해 Escherichia coli, 이스트, 몰드 및 포유동물 세포가 호스트로서 사용될 수 있다.
제 9 발명은 오레오바시딘 감수성 조절 단백질 또는 이의 기능적 유사체에 관한 것이다. 이것의 예로는 앞서 언급된 유전자 anaurlR, anaurls 및 afaurls 에 의해 암호화되며 각각 SEQ ID NO. 2, 4 및 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 것들이 포함된다.
당연히, 이 단백질은 화학적, 물리적 또는 유전공학적 기술에의한 치환, 삽입 및 결손 중에서 선택된 적어도 하나의 변형을 가질 수 있다. SEQ ID NO. 2, 4 및 5로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 항원에 해당하는 이러한 아미노산 서열 일부분의 펩타이드 절편을 사용함으로써 오레오바시딘 감수성 조절 단백질에 대한 항체를 제작하는것 또한 가능하다.
제 10 발명은 적어도 서열 목록의 SEQ ID NO. 4로 나타내어지는 오레오바시딘 감수성을 부여하는 유전자내 275 위치 Gly 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 오레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들의 생물학적 활성에 어떤 손상도 주지 않으면서 화학적, 물리적 또는 유전공학적 기술에 의해 치환, 삽입 및 결손 중에서 선택된 적어도 하나의 변형이 도입됨으로써 얻어진 이의 기능적 유사체에 관한 것이다. 오레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 본 발명의 단백질은 서열목록에서 SEQ ID NO.3 및 12로 나타내어지는 오레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 단백질을 암호화하는 DNA를 사용함으로써 유전공학적으로 적절하게 제조될 수 있다. 이의 생물학적 활성은 오레오바시딘 감수성 세포를 오레오바시딘 내성 세포로 전환시키는 이들의 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다.
제 11 발명은 오레오바시딘 내성을 부여할 수 있는 제 10 발명의 단백질을 암호화하는 DNA에 관한 것이다. 이것은 또한 앞서 언급된 DNA에 누클레오타이드의 치환, 삽입 및 결손 중에서 선택된 적어도 하나의 변형을 도입함으로써 얻어지는 DNA에 관한 것이다. 이러한 변형은 위치-특이적 돌연변이화에 의해 쉽게 수행될 수 있다. 이러한 변형된 DNA는 돌연변이된 단백질을 생산하기 위해 사용된다.
제 12 발명은 핵산 탐침을 사용하여 혼성화함으로써 오레오바시딘 감수성 조절 유전자를 감지하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용가능한 핵산 탐침의 예에는 적어도 15개 염기로 구성되며 서열목록의 SEQ ID NO. 1, 3 및 12로 나타내어지는 DNA 및 이들의 절편과 선택적으로 혼성화 가능한 올리고누클레오타이드가 포함된다. 따라서 서열목록의 SEQ ID NO. 9 부터 11까지에 의해 나타내어지는 아미노산 서열 또는 이들의 일부분을 암호화하며 적어도 15개 염기로 구성된 염기 서열을 이용하는 것이 적절하다. 이러한 핵산 탐침을 사용함으로써, 목표 생물체로 부터 추출한 DNA 또는 RNA는 목표 생물체의 오레오바시딘 감수성 조절 유전자을 찾기 위해 Southern 혼성화 또는 Northern 혼성화가 수행될 수 있다. 핵산 탐침은 또한 앞서 언급된 유전자가 발현될 수 있는 조직을 확인하거나 위치특이적 혼성화에 의해 여러 생조직내에서 유전자 또는 mRNA의 존재를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
이 핵산 탐침은 앞서 언급된 유전자 또는 이의 절편을 적절한 벡터에 라이게이션시키고, 이것을 세균에 도입한 후 복제, 파괴된 세포 용액으로부터 페놀 등을 이용한 추출, 벡터의 라이게이션 위치를 인지할 수 있는 제한효소로의 절단, 전기영동 및 전기영동 겔로부터의 절제를 통하여 제조될 수 있다. 대안적으로, 이 핵산 탐침은 DNA 합성기를 이용한 화학적 합성 또는 서열목록의 SEQ ID NO. 1, 3 및 12로 나타내어지는 각 염기서열에 기본한 PCR에 의한 유전자 증폭 기술을 사용함으로써 제조될 수 있다. 감지 감도를 높이기 위해, 핵산 탐침은 방사성 동위원소 또는 형광물질로 표지될 수 있다.
[실시예]
본 발명을 제한하기 위한 방법이 아니라 보다 상세히 설명하기 위해 하기의 실시예가 주어질 것이다.
실시예 1 : A. nidulans에서 기원한 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 anaurl의 클로닝
1-a) A. nidulans의 오레오바시딘 내성 돌연변이 분리
5㎍/㎖의 오레오바시딘에 감수성을 보이는 A. nidulans FGSC89균주를 SD 경사면(1% 폴리펩톤 S, 2% 글루코즈, 2% 아가로즈 포함)에 접종하고 30℃에서 7일간 배양한다. 0.8% NaCl을 포함한 5㎖의 0.1% Tween 20 용액에 현탁시킨 후 현탁액을 유리필터(3G3 유형)에 통과시키고 수득된 여과물을 분생자 현탁액으로 사용한다. 이 분생자 현탁액은 5분간 UV 조사되어 돌연변이를 유발시킨다. 이러한 조건하에서, 생존율은 약 25% 이다. 30분 이상 빛을 차단시킨 후 분생자를 SD 평판에 접종하고 30℃에서 4일간 배양한다. 형성된 분생자는 유리필터를 이용하여 수거하고 5㎍/㎖의 오레오바시딘을 포함한 Cz+bi 배지[4.9% Czapek 용액 아가(Difco 제조), 200 ㎍/㎖의 아르기닌 및 0.02㎍/㎖의 바이오틴 포함]에 추가접종 한 다음 30℃에서 배양한다. 2 또는 3일 후 8개의 오레오바시딘 내성 콜로니를 수득하였다. 이 세포들이 80㎍/㎖의 오레오바시딘에 내성을 보임에도 불구하고, 이들은 앰포테리신 B, 사이클로헥사마이드 및 클로트리마졸에 대한 감수성은 모 균주와 동일하였다. 따라서, 획득된 내성은 다약물 내성이 아니라 오레오바시딘에 특이적인 것으로 추측된다.
1-b) 오레오바시딘 내성 균주의 게놈 라이브러리 제작
오레오바시딘 내성 균주 중에서 특히 높은 내성을 보이는 R1 균주로 부터 게놈 DNA를 추출한 후 하기의 방식에 따라 정제한다. 30℃에서 교반하며 PD배지[2.4% 감자 덱스트로즈 브로스(Difco 제조) 포함]내에서 2일간 배양한 후, 균사를 유리필터(3G1 유형)로 수거하여 증류수로 세척한다. 세포를 탈수시키고 20㎖의 원형질체 형성 용액[ 2Omg/㎖의 야탈레즈(Ozeki Shuzo 제조), 0.8M의 NaCl 및 10mM의 인산 나트륨 완충용액(pH 6.0) 포함]에 현탁시킨다. 현탁액을 30℃에서 서서히 밤새 교반함으로써 원형질체를 형성시킨다. 현탁액을 유리필터(3G2 유형)에 통과시켜 원형질체를 여과액으로 수거한 다음 2,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 수거한다. 0.8 M NaCl로 2회 세척한 후 원형질체를 2㎖의 TE 용액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 8.0) 포함)에 현탁시키고 2㎖의 붕해 용액(2% SDS, 0.1M NaCl, 10mM EDTA 및 50mM Tris-HCl(pH 7.0)포함)을 첨가한다. 천천히 교반한 후 혼합물을 상온에서 15분간 유지시킨 다음 3,500 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수한다. 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25/24/1) 혼합액을 가하고 튜브내의 혼합물을 가볍게 혼합한 후 3,000 rpm에서 5분감 원심분리하여 상부 액체층을 회수한다. 그후 2.5배 부피의 -20℃ 에탄올을 가한다. 결과의 혼합물을 -80℃에서 10분간 두고 3,500 rpm에서 15분간 원심분리한다. 침전된 DNA를 건조시킨다. 0.5㎖ TE 용액과 2.5㎕의 RNase A 용액 (20mg/㎖)을 가하고 혼합물을 37℃에서 30분간 유지시킨다.
0.5㎖의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜을 가한후, 수득된 혼합물을 가볍게 섞고 10,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층을 회수한다. 이 단계를 1회 반복한다. 0.5㎖의 클로로포름/이소아밀 알콜(24:1)을 가한후 수득된 혼합물을 가볍게 섞고 10,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 회수한다. 그후 0.05㎖의 5M NaCl과 0.5㎖의 이소프로필 알콜을 첨가하여 혼합물을 -80℃에서 10분간 두고 10,000rpm에서 15분간 원심분리하여 DNA를 회수한다.
이렇게 정제된 8㎍의 게놈 DNA를 BamHI 제한효소 4U를 이용하여 37℃에서 15분간 처리함으로써 부분적으로 분해한다. 페놀/클로로포름을 이용하여 단백질을 제거한후 DNA는 에탄올 침전에 의해 수거된다. DNA를 0.8% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하고 3 내지 15kb 영역내의 DNA를 추출하여 정제한다. 이렇게 수득된 DNA는 DNA 라이게이션 키트(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 이용하여 BamHI으로 완전히 절단된 pDHG25 벡터[Gene, 98, 61-67 (1991)]에 라이게이션 한다. 그후, Escherichia coli HB 101에 형질전환 시킴으로써 내성 균주의 게놈 라이브러리를 제조한다. 게놈 라이브러리를 함유하는 E. coli 세포는 37℃에서 100㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 50㎖의 LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 박토 이스트 추출물 및 0.5% 염화나트륨)내에서 밤새 배양된다. 그다음, E. coli 세포로 부터 플라즈미드를 회수하고 정제한다.
1-c) 오레오바시딘 내성 유전자 anaur 1R의 발현 및 클로닝
오레오바시딘 내성 균주의 게놈 라이브러리로 부터 기원한 플라즈미드는 하기의 방법에 따라 A. nidulans FGSC89 균주로 형질전환된다. A. nidulans는 30℃에서 2일간 PD 배양액 내에서 교반하며 배양된다. 그후 배양 브로스를 유리 필터(3G1 유형)를 통해 여과함으로써 균사를 수거하고 멸균수로 세척한다. 충분히 탈수시킨 후, 세포를 10㎖의 원형질체 형성 용액에 현탁시킨다. 30℃에서 약 3시간 동안 서서히 교반함으로써 반응시킨 후, 세포 현탁액을 유리 필터 3G3을 통해 여과한다. 여과액을 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 함으로써 그안의 원형질체를 수거한다. 수거된 원형질체는 0.8 M NaCl로 2회 세척하고 원형질체의 농도가 2×108/㎖이 되도록 Sol I(0.8M NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl(pH 8.0))에 현탁시킨다. 0.2배 부피의 Sol 2[ 40%(w/v)의 PEG 4000, 50mM CaCl2, 50mM Tris-HCl(pH 8.0)]를 가하고 잘 혼합한다.
게놈 라이브러리로부터 기원한 플라즈미드 10㎍을 0.2㎖의 원형질체 현탁액에 가한다. 잘 혼합한 후, 혼합물을 얼음에 30분간 둔 다음 1㎖의 Sol 2를 가한다. 잘 혼합한 후 혼합물을 상온에서 15분간 둔 다음 8,5㎖의 Sol 1을 가한다. 잘 혼합한 후, 혼합물을 2,000 rom에서 5분간 원심분리함으로써 원형질체를 수거한다. 0.2㎖의 Sol 1을 첨가하고 결과의 혼합물을 52㎍/㎖의 오레오바시딘을 함유하는 최소 배양 평판(4.9% Czapek 용액 아가, 0.8M NaCl 및 0.02㎍/㎖ 바이오틴)의 중앙에 놓는다. 그다음, 5㎖의 연성 아가 배지(3.5% Czapek-Dox 브로스, 0.8M NaCl, 0.02㎍/㎖ 바이오틴 및 0.5% 아가)로 덮고 30℃에서 3 내지 5일간 배양한다. 이 평판상에서 생장하는 콜로니는 오레오바시딘 내성 유전자를 포함하는 플라즈미드를 가지는 것으로 간주된다.
약 70개의 콜로니가 오레오바시딘-함유 배지상에 형성되었다. 이 콜로니는 20㎖의 Cz+Bi 배지에 이식되어 30℃에서 2일간 배양된다. 이렇게 증식된 세포로 부터 실시예 1-b)에서 설명된 DNA 추출 및 정제 방법에 따라 DNA를 회수하고 정제한다. E. coli HB 101 균주는 이 DNA로 형질전환되고 100㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 LB 평판에 도말된다. 그후 형성된 E. coli 콜로니로 부터 플라즈미드 DNA를 얻는다. 12kb의 DNA를 포함하는 플라즈미드를 pR1-1이라 호칭한다. 도 5에서는 pR1-1내에 포함된 12kb DNA의 제한 효소 지도를 보여준다. 내성 유전자 부위를 보다 상세히 하기 위해 12kb DNA 절편을 여러 효소를 이용하여 다양한 크기를 갖는 절편으로 분해하였다. 그후 이 절편들을 pDHG25 벡터에 클로닝하였다. 오레오바시딘 내성이 획득되는지 안되는지를 확인하기 위해 다양한 DNA를 포함하는 플라즈미드를 A. nidulans FGSC89 균주에 형질전환 시켰다. 이 결과, 오레오바시딘 내성을 부여하는 활성은 Bgl Ⅱ 절편(5.8 kb)내에 존재함이 밝혀졌다. 따라서, anaurlR 유전자가 이 절편내에 위치함이 명확해졌다. 도 1은 오레오바시딘 내성 유전자 anaurlR를 포함하는 DNA 절편의 제한효소 지도를 보여준다. 이 절편은 벡터 pUC118에 서브클로닝 되었으며 수득된 플라즈미드는 pUR1이라 한다. 이 플라즈미드를 이용하여 DNA 서열이 확인되었다. 서열 목록의 SEQ ID NO.1는 이 염기서열을 보여준다. 이 DNA 서열이 지적하는 바와 같이 anaurlR 유전자는 하나의 인트론을 포함하는 2개의 엑손으로 이루어져 있다. 이 유전자는 서열 목록의 SEQ ID NO.2로 나타내어진 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화함이 밝혀졌다.
1-d) 오레오바시딘 감수성 유전자 anaurlS의 클로닝
A. nidulans의 정상 세포로 부터 오레오바시딘 감수성 유전자의 cDNA를 얻기위해, 우선 A. nidulans FGSC89 균주로 부터 전체 RNA를 추출하였다. 이 균주를 200㎖의 PD 배지에서 배양하고 유리필터(3G1 유형)을 이용하여 세포를 수거하였다. 충분히 탈수시킨 후, 세포를 재빨리 액체 질소로 동결시킨다.
그후 동결된 세포를 막자사발내에서 분쇄하고 RNA 추출 키트(Pharmacia 제조)를 이용하여 전체 RNA(2.6mg)를 추출 및 정제한다. Oligotex-dT30(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 이용하여 1mg의 RNA로 부터 12.8㎍의 폴리(A)+RNA를 얻는다. Takara cDNA 합성 키트(Takara Shuzo Co. Ltd. 제조)를 이용하여 5㎍의 폴리(A)+RNA로 cDNA를 합성한다. 이렇게 합성된 cDNA는 λ 파아지 벡터 λSH1oxTM(Novagen Inc. 제조)에 라이게이션 한 다음 Phage MarkerTM시스템, Phage Pack Extract(Novagen Inc. 제조)를 이용하여 시험관내 팩킹을 함으로써 cDNA 라이브러리를 제작한다. 이 cDNA 라이브러리는 E. coli ER1647 호스트 균주에 감염된다. 상부 아가(0.7% 아가로즈를 포함한 LB 배지)와 혼합한후 LB 평판에 깔고 37℃에서 밤새 배양하여 플라크가 형성되게 한다. 이렇게 형성된 플라크는 나일론 막(Hybond-N, Amersham 제조)으로 옮겨져 플라크 혼성화된다. 실시예 1-c)에서 수득된 플라즈미드 pUR1을 Pst I과 Sal I으로 절단하여 얻은 2.6kb DNA 절편이 탐침으로서 사용된다. 이 DNA 절편은 임의 시발 DNA 표지 키트(random primer DNA labeling kit)(Takara Shuzo Co., Ltd. 제조)를 이용하여 [α-32P]dCTP로 표지한후 혼성화 반응의 탐침으로서 사용된다. 4×105개의 플라크를 검색한 결과 탐침과 혼성화 가능한 8개의 파아지 클론을 수득하였다. 이후에 이 파이지들은 E. coli에 자동 서브클로닝되어 자동적으로 서브클로닝된 cDNA-포함 부위를 가지는 플라즈미드를 갖는 E. coli 균주가 된다. 이 균주로 부터 플라즈미드가 정제되고 cDNA의 길이가 비교된다. 가장 긴 cDNA(2.9 kb)를 갖는 pS15가 선택되어 pUC118에 서브 클로닝되고 DNA 서열이 확인된다. 이 플라즈미드를 pANAR1이라 한다. pNANR1으로 형질전환된 E. coli 균주를 Escherichia coli JM109/pANAR1이라 하며 번호 FERM BP-5180으로 National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology에 기탁되었다. 도 2 는 이 cDNA의 제한효소 지도를 보여준다. 이의 DNA 염기서열은 서열 목록에 SEQ ID NO. 3으로 나타내었다. 이 염기서열은 서열 목록에 SEQ ID NO. 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 anaurls 유전자를 나타낸다. 내성 유전자 anaurlR과 비교한 결과 SEQ ID NO. 3의 1218번 위치 G 염기가 T로 돌연변이 되었으며, 아미노산 수준에서는 275 위치의 아미노산 글리신이 발린으로 전환되었음이 밝혀졌다. 게놈 DNA가 하나의 인트론(56 bp)을 가짐이 또한 명확해졌다. 도 5는 게놈 DNA와 cDNA간의 관계를 보여준다.
실시예 2 : A. fumigatus가 보유하는 afaurls 유전자의 확인 및 클로닝
2-a) Northern 혼성화 반응에 의한 afaurls 유전자의 탐지
A. fumigatus TIMM1776 균주로 부터 폴리(A)+RNA를 추출한 후 실시예 1-d)와 동일한 방법을 이용하여 정제한다. A. fumigatus 및 A. nidulans의 폴리(A)+RNA (1㎍)을 포름알데하이드를 포함하는 1.2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동한 후 나일론 막에 옮긴다. 고정시킨 후, [α-32P]dCTP로 표지된 anaurlR 유전자 cDNA의 HindⅢ 절편(741bp)을 탐침으로 이용하여 혼성화 반응을 수행한다. 60℃에서 밤새 혼성화시킨 후, 혼합물을 60℃에서 0.5×SSC와 0.1% SDS로 세척한다. 도 5에서, 1열과 2열이 각각 A. fumigatus 및 A. nidulans로부터 얻은 폴리(A)+RNA의 혼성화 반응 결과를 나타낸다. 도 6에서 혼성화 반응 오토래디오그램은 A. fumigatus 및 A. nidulans 모두가 동일한 크기의 오레오바시딘 감수성 유전자를 가짐을 분명히 보여준다. 그러나, A. fumigatus의 밴드가 매우 약하다는 것은 이 유전자간의 상동성이 크지 않음을 지적한다.
2-b) A. fumigatus가 보유하는 afaurlS 유전자의 클로닝
2-a)에서 정제된 A. fumigatus의 폴리(A)+RNA를 사용하여, 실시예 1-d)에서 기술된 cDNA 라이브러리 제조방법에 따라 A. fumigatus의 cDNA 라이브러리가 제조된다. 앞서 언급된 라이브러리는 A. nidulans cDNA의 PstI-EcoRI 절편(921 bp)을 탐침으로 사용하여 실시예 2-a)과 동일한 혼성화 조건하에서 탐색된다. 8개의 파아지 클론이 수득되었다. 이 파아지 클론으로부터 실시예 1-d)에서 기술한 방법에 의해 cDNA가 플라즈미드의 형태로 회수된다. 플라즈미드는 정제되고 cDNA의 길이가 비교된다. 이들 중 가장 긴 cDNA(2.9kb)를 가진 플라즈미드가 선택된다. 이 cDNA는 pUC118에 서브클로닝되고 DNA 서열이 확인된다. 이 염기서열은 서열 목록에서 SEQ ID NO. 12로 나타내어지며 서열 목록에서 SEQ ID NO. 5로 나타내어진 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이다. A. fumigatus TIMM1776 균주의 afaurls 단백질의 아미노산 서열과 A. nidulans FGSC 89의 anaurls 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과 이들은 높은 상동성(89%)을 가짐이 밝혀졌다.
실시예 3 : A. niger 및 A. oryzae가 보유하는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 확인
실시예 1-b)에서 기술된 방법에 따라 A. fumigatus TIMM1776, A. niger FGSC805 및 A. oryzae IFO5710 균주로 부터 게놈 DNA를 추출하고 정제한다. 또한 이스트 균주 S. cerevisiae DKD-5D 및 Schizo. pombe JY747로 부터 P. Phillippsen 일동에 의해 기술된 방법[Method in Enzymology, 194, 169-175(1991)]에 따라 게놈 DNA를 추출하고 정제한다. A. nidulans, A. fumigatus, A. niger, A. oryzae, S. cerevisiae 및 Schizo. pombe의 게놈 DNA 5㎍을 제한효소 PstI으로 절단하고 0.8% 아가로즈 겔 상에서 전기영동으로 분리하여 나일론 막에 옮기고 고정시킨다. 그 다음, [α-32P]dCTP로 표지된 anaurls 유전자 cDNA의 PstI-EcoRI 절편을 탐침으로 이용하여 Southrn 혼성화 반응을 수행한다. 혼성화 반응은 실시예 2-a)에서 기술된 것과 동일한 조건하에서 수행된다. 도 7은 혼성화 반응의 오토래디오그램을 보여준다. 도 7 에서는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자가 A. niger와 A. oryzae에도 존재함을 분명히 보여준다. 이것은 또한 A. nidulans의 DNA가 이스트 S. cerevisiae 및 Schizo. pombe의 오레오바시딘 감수성 유전자와 혼성화되지 않음을 보여준다. 도 7의 1, 2, 3, 4, 5 및 6열에서는 각각 A. nidulans, A. fumigatus, A. niger, A. oryzae, S. cerevisiae 및 Schizo. pombe의 게놈 DNA Southern 혼성화 반응의 결과를 보여준다.
본 발명은 Aspergillus 속의 몰드로 부터 기원하고 오레오바시딘 감수성을 조절하는 새로운 단백질 및 이 단백질을 암호화하는 유전자 즉, 오레바시딘 감수성 조절 유전자를 제공한다. 이것은 이 유전자를 보유하는 생물체에 의해 유발되는 진균증과 같은 질병의 진단과 치료에 유용하다. 본 발명은 또한 앞서 언급한 유전자의 안티센스 DNA 및 안티센스 RNA, 이 유전자와 혼성화 가능한 핵산 탐침, 이 핵산 탐침을 이용한 유전자의 탐치 방법 및 이 유전자가 도입된 형질전환체를 이용하여 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이것 또한 진균증과 같은 질병의 진단 및 치료에 유용하다.
도 1 은 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 anaurlR의 게놈 DNA 제한효소 지도를 보여주는 다이아그램이다.
도 2 는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 anaurls의 cDNA 제한효소 지도를 보여주는 다이아그램이다.
도 3 은 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 afaurls의 cDNA 제한효소 지도를 보여주는 다이아그램이다.
도 4 는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열들간의 비교를 보여주는 다이아그램이다.
도 5 는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자 anaurl의 게놈 DNA, cDNA 및 단백질간의 관계를 보여주는 다이아그램이다.
도 6 은 A. nidulans 및 A. furnigatus의 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 Northern 혼성화 반응의 결과를 보여주는 다이아그램이다.
도 7 은 A. niger 및 A. oryzae의 오레오바시딘 감수성 조절 유전자의 감지를 지적하는 Southern 혼성화 반응의 결과를 보여주는 다이아그램이다.

Claims (11)

  1. SEQ ID NO. 2, 4 및 5 중 어느 하나로 표현되는 아미노산 서열을 암호화하는 오레오바시딘 감수성 조절 유전자.
  2. 제 1 항에 있어서, 핵산서열이 SEQ ID NO. 1, 3 및 12 중 어느 하나로 표현되는 유전자.
  3. 제 1 항에 있어서, 도 1 내지 도 3 중 어느 하나의 제한효소 지도로 표현되는 DNA 단편에 포함되는 유전자.
  4. 제 1 항에 따른 유전자를 탐침으로 사용하는 것을 포함하는 제 1 항에 따른 유전자의 분리 방법.
  5. 제 1 항에 따른 유전자의 안티센스 DNA.
  6. 제 1 항에 따른 유전자의 안티센스 RNA.
  7. 제 1 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 플라즈미드.
  8. 제 7 항의 재조합 플라즈미드가 도입된 형질전환체.
  9. 제 8 항의 형질전환체를 배양하고 배양 배지로부터 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 회수하는 것을 포함하는 오레오바시딘 감수성 조절 단백질을 생산하는 방법.
  10. 제 1 항에 따른 유전자에 의해 암호화된 오레오바시딘 감수성 조절 단백질.
  11. 서열목록의 SEQ ID NO. 4로 표현되는 오레오바시딘 감수성을 부여하는 단백질의 275 위치의 아미노산 Gly이 Val으로 치환된 오레오바시딘에 대한 내성을 부여할 수 있는 단백질.
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