JP3379952B2 - オーレオバシジン感受性遺伝子 - Google Patents
オーレオバシジン感受性遺伝子Info
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、アスペルギルス属
を始めとする糸状菌より得られる抗真菌剤オーレオバシ
ジンの感受性蛋白質、及び該蛋白質をコードする遺伝
子、すなわち糸状菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝
子に関する。
を始めとする糸状菌より得られる抗真菌剤オーレオバシ
ジンの感受性蛋白質、及び該蛋白質をコードする遺伝
子、すなわち糸状菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝
子に関する。
【0002】
【従来の技術】オーレオバシジン〔特開平2−1382
96号、同3−22995号、同3−220199号、
同5−279384号、同6−65291号、ジャーナ
ル オブ アンチバイオチクス(J. Antibiotics)、第
44巻、第9号、第919〜924頁、同第44巻、第
9号、第925〜933頁、同第44巻、第11号、第
1187〜1198頁(1991)〕は、オーレオバシ
ジウム プルランス(Aureobasidium pullulans) No.R
106株の発酵生産物として得られる、環状のデプシペ
プチドであり、他の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。
更に、オーレオバシジンの中で代表的な化合物であるオ
ーレオバシジンAは、病原性真菌であるカンジダ アル
ビカンス(Candida albicans、以下、C.アルビカンス
と略記する)を始めとする種々のカンジダ属酵母、クリ
プトコッカス ネオホルマンス(Cryptococcus neoform
ans)、ヒストプラズマ カプスラタム(Histoplasma ca
psulatum) 、ブラストマイセス デルマチチジス(Blas
tomyces dermatitidis) 、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、ペニシリウム(Penicillium)属真菌に対して、強
い抗真菌活性を有する(特開平2−138296号)
が、毒性が非常に弱く、優れた選択毒性を有する抗真菌
剤として期待されている。従来の毒性の弱い抗真菌剤は
すべて静菌的な作用しか示さず、臨床上問題となってい
たが、オーレオバシジンの作用は殺菌的である。これら
の点から、オーレオバシジンの選択毒性の機構の解明が
待たれているが、現在のところ全く知られていない。
96号、同3−22995号、同3−220199号、
同5−279384号、同6−65291号、ジャーナ
ル オブ アンチバイオチクス(J. Antibiotics)、第
44巻、第9号、第919〜924頁、同第44巻、第
9号、第925〜933頁、同第44巻、第11号、第
1187〜1198頁(1991)〕は、オーレオバシ
ジウム プルランス(Aureobasidium pullulans) No.R
106株の発酵生産物として得られる、環状のデプシペ
プチドであり、他の抗真菌剤とは構造的に全く異なる。
更に、オーレオバシジンの中で代表的な化合物であるオ
ーレオバシジンAは、病原性真菌であるカンジダ アル
ビカンス(Candida albicans、以下、C.アルビカンス
と略記する)を始めとする種々のカンジダ属酵母、クリ
プトコッカス ネオホルマンス(Cryptococcus neoform
ans)、ヒストプラズマ カプスラタム(Histoplasma ca
psulatum) 、ブラストマイセス デルマチチジス(Blas
tomyces dermatitidis) 、アスペルギルス(Aspergillu
s)属、ペニシリウム(Penicillium)属真菌に対して、強
い抗真菌活性を有する(特開平2−138296号)
が、毒性が非常に弱く、優れた選択毒性を有する抗真菌
剤として期待されている。従来の毒性の弱い抗真菌剤は
すべて静菌的な作用しか示さず、臨床上問題となってい
たが、オーレオバシジンの作用は殺菌的である。これら
の点から、オーレオバシジンの選択毒性の機構の解明が
待たれているが、現在のところ全く知られていない。
【0003】本発明者らは、既にカナダ国特許出願公開
公報第2124034号に記載のようにサッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae、以下、S.
セレビシエと略記する)、及びシゾサッカロミセス ポ
ンベ(Schizosaccharomycespombe 、以下、Schiz
o.ポンベと略記する)がオーレオバシジンに感受性を
示すことを見出し、S.セレビシエ、及びSchiz
o.ポンベの感受性細胞に変異処理を施すことにより耐
性細胞に変え、その耐性細胞よりオーレオバシジン耐性
を付与する遺伝子(耐性遺伝子)、更に感受性細胞より
対応するオーレオバシジン感受性を付与する遺伝子(感
受性遺伝子)の単離に成功した。更にオーレオバシジン
感受性関連遺伝子又はその一部をプローブとして用いる
ことにより、C.アルビカンスよりオーレオバシジン感
受性関連遺伝子を単離した。しかしながら、真菌類の内
でもアスペルギルス属を含む糸状菌類からはオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子は見出されていなかった。
公報第2124034号に記載のようにサッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae、以下、S.
セレビシエと略記する)、及びシゾサッカロミセス ポ
ンベ(Schizosaccharomycespombe 、以下、Schiz
o.ポンベと略記する)がオーレオバシジンに感受性を
示すことを見出し、S.セレビシエ、及びSchiz
o.ポンベの感受性細胞に変異処理を施すことにより耐
性細胞に変え、その耐性細胞よりオーレオバシジン耐性
を付与する遺伝子(耐性遺伝子)、更に感受性細胞より
対応するオーレオバシジン感受性を付与する遺伝子(感
受性遺伝子)の単離に成功した。更にオーレオバシジン
感受性関連遺伝子又はその一部をプローブとして用いる
ことにより、C.アルビカンスよりオーレオバシジン感
受性関連遺伝子を単離した。しかしながら、真菌類の内
でもアスペルギルス属を含む糸状菌類からはオーレオバ
シジン感受性関連遺伝子は見出されていなかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】糸状菌としてはアスペ
ルギルス属、ペニシリウム属などの多くの種類が存在し
ており、酒類、醤油及び味噌の醸造やチーズの熟成など
の食品製造に古くから広く利用されているものや、酵素
剤や抗生物質の生産にとって重要なものが多い。一方、
糸状菌には有用菌ばかりでなく、植物病原菌のように有
害な菌や、ヒトに対しても深在性真菌症のような重篤な
病気を引き起こすものも存在する。近年の遺伝子操作工
学の進展により、有用菌株の育種だけでなく、異種蛋白
質の生産などの新しい利用法も可能となってきた。ま
た、糸状菌の生命現象の解析も進められている。本発明
の目的は、アスペルギルス属を始めとする糸状菌より糸
状菌の遺伝子操作や生命現象の解析に有用なオーレオバ
シジンの感受性に関連する蛋白質をコードする遺伝子又
はその機能的誘導体を見出すことにある。すなわち、本
発明はオーレオバシジンの感受性蛋白質又はその機能的
誘導体をコードする遺伝子を明らかにし、該遺伝子のク
ローニング方法、該遺伝子のコードするオーレオバシジ
ンの感受性蛋白質又はその機能的誘導体を提供するこ
と、更に該遺伝子のアンチセンスDNA及びアンチセン
スRNAを提供すること、該遺伝子にハイブリダイズ可
能な核酸プローブ、及びその核酸プローブを用いた該遺
伝子の検出方法を提供すること、該遺伝子を用いるオー
レオバシジン感受性蛋白質又はその機能的誘導体の製造
方法を提供することを目的とする。
ルギルス属、ペニシリウム属などの多くの種類が存在し
ており、酒類、醤油及び味噌の醸造やチーズの熟成など
の食品製造に古くから広く利用されているものや、酵素
剤や抗生物質の生産にとって重要なものが多い。一方、
糸状菌には有用菌ばかりでなく、植物病原菌のように有
害な菌や、ヒトに対しても深在性真菌症のような重篤な
病気を引き起こすものも存在する。近年の遺伝子操作工
学の進展により、有用菌株の育種だけでなく、異種蛋白
質の生産などの新しい利用法も可能となってきた。ま
た、糸状菌の生命現象の解析も進められている。本発明
の目的は、アスペルギルス属を始めとする糸状菌より糸
状菌の遺伝子操作や生命現象の解析に有用なオーレオバ
シジンの感受性に関連する蛋白質をコードする遺伝子又
はその機能的誘導体を見出すことにある。すなわち、本
発明はオーレオバシジンの感受性蛋白質又はその機能的
誘導体をコードする遺伝子を明らかにし、該遺伝子のク
ローニング方法、該遺伝子のコードするオーレオバシジ
ンの感受性蛋白質又はその機能的誘導体を提供するこ
と、更に該遺伝子のアンチセンスDNA及びアンチセン
スRNAを提供すること、該遺伝子にハイブリダイズ可
能な核酸プローブ、及びその核酸プローブを用いた該遺
伝子の検出方法を提供すること、該遺伝子を用いるオー
レオバシジン感受性蛋白質又はその機能的誘導体の製造
方法を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第1の発明は、配列表の配列番号4で表されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質、若しくは該配列の275位
に相当する部位以外に1〜数個のアミノ酸残基の置換、
挿入及び欠失の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有
する蛋白質をコードするオーレオバシジン感受性遺伝子
に関する。第2の発明は、配列表の配列番号3で表され
る塩基配列を有する、第1の発明の遺伝子に関する。第
3の発明は、第2の発明の遺伝子に特定の条件下でハイ
ブリダイズする、オーレオバシジン感受性遺伝子に関す
る。第4の発明は、第2の発明の塩基配列の15塩基以
上の配列よりなる核酸プローブに関する。第5の発明
は、第2の発明の遺伝子、又は第4の発明の核酸プロー
ブを用いる、オーレオバシジン感受性遺伝子のクローニ
ング方法に関する。第6の発明は第2の発明の遺伝子の
全長のアンチセンスDNAに関する。第7の発明は、上
記遺伝子の全長のアンチセンスRNAに関する。第8の
発明は第1の発明の遺伝子を含有させた組換体プラスミ
ドに関し、第9の発明は第8の発明のプラスミドを導入
させた形質転換体に関する。第10の発明は上記の形質
転換体を使用したオーレオバシジン感受性蛋白質の製造
方法に関する。第11の発明は、第1又は第3の発明の
遺伝子がコードするオーレオバシジン感受性蛋白質に関
する。第12の発明は、第2の発明の遺伝子、又は第4
の発明の核酸プローブを用いる、オーレオバシジン感受
性蛋白質をコードする遺伝子の検出方法に関する。
発明の第1の発明は、配列表の配列番号4で表されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質、若しくは該配列の275位
に相当する部位以外に1〜数個のアミノ酸残基の置換、
挿入及び欠失の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有
する蛋白質をコードするオーレオバシジン感受性遺伝子
に関する。第2の発明は、配列表の配列番号3で表され
る塩基配列を有する、第1の発明の遺伝子に関する。第
3の発明は、第2の発明の遺伝子に特定の条件下でハイ
ブリダイズする、オーレオバシジン感受性遺伝子に関す
る。第4の発明は、第2の発明の塩基配列の15塩基以
上の配列よりなる核酸プローブに関する。第5の発明
は、第2の発明の遺伝子、又は第4の発明の核酸プロー
ブを用いる、オーレオバシジン感受性遺伝子のクローニ
ング方法に関する。第6の発明は第2の発明の遺伝子の
全長のアンチセンスDNAに関する。第7の発明は、上
記遺伝子の全長のアンチセンスRNAに関する。第8の
発明は第1の発明の遺伝子を含有させた組換体プラスミ
ドに関し、第9の発明は第8の発明のプラスミドを導入
させた形質転換体に関する。第10の発明は上記の形質
転換体を使用したオーレオバシジン感受性蛋白質の製造
方法に関する。第11の発明は、第1又は第3の発明の
遺伝子がコードするオーレオバシジン感受性蛋白質に関
する。第12の発明は、第2の発明の遺伝子、又は第4
の発明の核酸プローブを用いる、オーレオバシジン感受
性蛋白質をコードする遺伝子の検出方法に関する。
【0006】本発明者らは、アスペルギルス ニドラン
ス(Aspergillus nidulans、以下、A.ニドランスと略
記する)、アスペルギルス フミガタス(Aspergillus
fumigatus 、以下、A.フミガタスと略記する)等の糸
状菌がオーレオバシジンに感受性を示すことを見出し
た。そして、A.ニドランスの感受性細胞に変異処理を
施すことにより耐性細胞に変え、その耐性細胞より対応
するオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子(耐性遺伝
子)の単離に成功した。更に、本発明者らは該遺伝子の
コードする蛋白質の存在を明らかにした。更に、該遺伝
子のDNA断片をプローブとして用いることによって、
オーレオバシジンに感受性のA.ニドランス及びA.フ
ミガタスより、新たにオーレオバシジン感受性に関連す
る遺伝子を発見することに成功した。更に、この遺伝子
を検出することにより、その細胞が原因となって生じて
いる疾患、例えば真菌によって引き起こされている真菌
症の診断が可能であること、更にその細胞に特有のオー
レオバシジン感受性関連遺伝子の発現を阻害するアンチ
センスDNA又はアンチセンスRNAはその細胞が原因
となって生じている疾患の治療薬、例えば真菌による真
菌症に対する抗真菌剤となることを見出し、本発明を完
成した。
ス(Aspergillus nidulans、以下、A.ニドランスと略
記する)、アスペルギルス フミガタス(Aspergillus
fumigatus 、以下、A.フミガタスと略記する)等の糸
状菌がオーレオバシジンに感受性を示すことを見出し
た。そして、A.ニドランスの感受性細胞に変異処理を
施すことにより耐性細胞に変え、その耐性細胞より対応
するオーレオバシジン耐性を付与する遺伝子(耐性遺伝
子)の単離に成功した。更に、本発明者らは該遺伝子の
コードする蛋白質の存在を明らかにした。更に、該遺伝
子のDNA断片をプローブとして用いることによって、
オーレオバシジンに感受性のA.ニドランス及びA.フ
ミガタスより、新たにオーレオバシジン感受性に関連す
る遺伝子を発見することに成功した。更に、この遺伝子
を検出することにより、その細胞が原因となって生じて
いる疾患、例えば真菌によって引き起こされている真菌
症の診断が可能であること、更にその細胞に特有のオー
レオバシジン感受性関連遺伝子の発現を阻害するアンチ
センスDNA又はアンチセンスRNAはその細胞が原因
となって生じている疾患の治療薬、例えば真菌による真
菌症に対する抗真菌剤となることを見出し、本発明を完
成した。
【0007】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明におけるオーレオバシジン感受性蛋白質と
は、オーレオバシジンに対して感受性を示す糸状菌に含
有される蛋白質であり、その蛋白質はオーレオバシジン
に対して感受性を示すために必要とされる。オーレオバ
シジン感受性遺伝子とは、これらのオーレオバシジン感
受性蛋白質をコードする遺伝子であり、感受性遺伝子が
含まれる。これらオーレオバシジン感受性蛋白質又は遺
伝子はその分子の構造的変化や、量的変化によってその
分子をもつ生物のオーレオバシジンに対する感受性は変
化する。
る。本発明におけるオーレオバシジン感受性蛋白質と
は、オーレオバシジンに対して感受性を示す糸状菌に含
有される蛋白質であり、その蛋白質はオーレオバシジン
に対して感受性を示すために必要とされる。オーレオバ
シジン感受性遺伝子とは、これらのオーレオバシジン感
受性蛋白質をコードする遺伝子であり、感受性遺伝子が
含まれる。これらオーレオバシジン感受性蛋白質又は遺
伝子はその分子の構造的変化や、量的変化によってその
分子をもつ生物のオーレオバシジンに対する感受性は変
化する。
【0008】本発明のオーレオバシジン感受性蛋白質又
は遺伝子の機能的誘導体とは、オーレオバシジン感受性
蛋白質又はDNAの生物学的活性と実質上、類似の生物
学的活性をもつものであり、断片や変異体、変性変異
体、類似体、相同体、化学的誘導体を含む。変異体とは
全蛋白質、又はそれ由来の断片において構造的及び/又
は機能的に、実質上類似のものを示している。すなわ
ち、もし2つの分子が本質的に類似の活性をもっている
ならば、それらはたとえ一方の分子の構造が、他方の分
子にみられなくとも、又はたとえ2つの分子のアミノ酸
配列が同一でなくとも、変異体であると考えられる。機
能的誘導体にはアミノ酸残基の置換、挿入、及び欠失の
少なくとも一つを含むアミノ酸配列を示し、類似の生物
活性を有する蛋白質、及びそれをコードする遺伝子も含
まれる。オーレオバシジン感受性蛋白質へのアミノ酸残
基の置換、挿入及び欠失は遺伝子の部位特異的変異誘発
により実施することができる。単離したオーレオバシジ
ン感受性蛋白質をコードするDNAを、ヌクレオチドの
置換、挿入、及び欠失の少なくとも一つによって修飾す
るのは容易であり、オーレオバシジン感受性蛋白質及び
その機能的誘導体をコードしている新規なDNAを得る
ことができる。
は遺伝子の機能的誘導体とは、オーレオバシジン感受性
蛋白質又はDNAの生物学的活性と実質上、類似の生物
学的活性をもつものであり、断片や変異体、変性変異
体、類似体、相同体、化学的誘導体を含む。変異体とは
全蛋白質、又はそれ由来の断片において構造的及び/又
は機能的に、実質上類似のものを示している。すなわ
ち、もし2つの分子が本質的に類似の活性をもっている
ならば、それらはたとえ一方の分子の構造が、他方の分
子にみられなくとも、又はたとえ2つの分子のアミノ酸
配列が同一でなくとも、変異体であると考えられる。機
能的誘導体にはアミノ酸残基の置換、挿入、及び欠失の
少なくとも一つを含むアミノ酸配列を示し、類似の生物
活性を有する蛋白質、及びそれをコードする遺伝子も含
まれる。オーレオバシジン感受性蛋白質へのアミノ酸残
基の置換、挿入及び欠失は遺伝子の部位特異的変異誘発
により実施することができる。単離したオーレオバシジ
ン感受性蛋白質をコードするDNAを、ヌクレオチドの
置換、挿入、及び欠失の少なくとも一つによって修飾す
るのは容易であり、オーレオバシジン感受性蛋白質及び
その機能的誘導体をコードしている新規なDNAを得る
ことができる。
【0009】アミノ酸残基の置換、挿入、及び欠失に関
し、1又は複数のアミノ酸残基の変換は遺伝子工学的に
作成可能なものであり、生物活性を破壊することなく行
われたものが選抜されうる。更に、特定の位置の残基で
の突然変異を適切に行うためには標的コドンに無作為な
変異誘発を行い、発現された変異体を所望の活性につい
てスクリーニングすればよい。挿入には、オーレオバシ
ジン感受性蛋白質又はその機能的誘導体又はそれらのフ
ラグメントと他の蛋白質又はポリペプチドとがオーレオ
バシジン感受性蛋白質又はその機能的誘導体又はそれら
のフラグメントのアミノ末端及び/又はカルボキシ末端
において、ペプチド結合を介して結合している融合蛋白
質を含む。更に、アミノ酸残基を欠失させる方法とし
て、ギャップド デュプレックス(gapped duplex)法に
よりアミノ酸配列の任意のアミノ酸コドンを終止コドン
に置換することにより、置換したアミノ酸残基よりカル
ボキシ末端側を欠失させることができる。別の方法とし
ては、コードするDNAをアミノ酸配列のアミノ末端及
び/又はカルボキシ末端に対応する部分より分解するデ
ィレーション法〔ジーン(Gene) 、第33巻、第103
〜119頁、(1985)〕により欠失する方法や、開
始コドン及び/又は終止コドンを含むプライマーを用い
たPCR法により任意の長さのアミノ末端及び/又はカ
ルボキシ末端を欠失させた蛋白質をコードするDNAを
得ることができる。なお、部位特異的変異誘発はオリゴ
ヌクレオチドを用いたギャップド デュプレックス法
〔メソッズイン エンザイモロジー(Methods in Enzym
ology)、第154巻、第350〜367頁(198
7)〕や、オリゴヌクレオチドを用いたウラシルDNA
法〔メソッズ イン エンザイモロジー、第154巻、
第367〜382頁(1987)〕、亜硝酸法〔プロシ
ーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシーズ オブ ザ USA(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA)、第79巻、第7258〜7262頁
(1982)〕、更にカセット変異法〔ジーン、第34
巻、第315〜323頁(1985)〕が知られてい
る。
し、1又は複数のアミノ酸残基の変換は遺伝子工学的に
作成可能なものであり、生物活性を破壊することなく行
われたものが選抜されうる。更に、特定の位置の残基で
の突然変異を適切に行うためには標的コドンに無作為な
変異誘発を行い、発現された変異体を所望の活性につい
てスクリーニングすればよい。挿入には、オーレオバシ
ジン感受性蛋白質又はその機能的誘導体又はそれらのフ
ラグメントと他の蛋白質又はポリペプチドとがオーレオ
バシジン感受性蛋白質又はその機能的誘導体又はそれら
のフラグメントのアミノ末端及び/又はカルボキシ末端
において、ペプチド結合を介して結合している融合蛋白
質を含む。更に、アミノ酸残基を欠失させる方法とし
て、ギャップド デュプレックス(gapped duplex)法に
よりアミノ酸配列の任意のアミノ酸コドンを終止コドン
に置換することにより、置換したアミノ酸残基よりカル
ボキシ末端側を欠失させることができる。別の方法とし
ては、コードするDNAをアミノ酸配列のアミノ末端及
び/又はカルボキシ末端に対応する部分より分解するデ
ィレーション法〔ジーン(Gene) 、第33巻、第103
〜119頁、(1985)〕により欠失する方法や、開
始コドン及び/又は終止コドンを含むプライマーを用い
たPCR法により任意の長さのアミノ末端及び/又はカ
ルボキシ末端を欠失させた蛋白質をコードするDNAを
得ることができる。なお、部位特異的変異誘発はオリゴ
ヌクレオチドを用いたギャップド デュプレックス法
〔メソッズイン エンザイモロジー(Methods in Enzym
ology)、第154巻、第350〜367頁(198
7)〕や、オリゴヌクレオチドを用いたウラシルDNA
法〔メソッズ イン エンザイモロジー、第154巻、
第367〜382頁(1987)〕、亜硝酸法〔プロシ
ーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オ
ブ サイエンシーズ オブ ザ USA(Proc. Natl.
Acad. Sci. USA)、第79巻、第7258〜7262頁
(1982)〕、更にカセット変異法〔ジーン、第34
巻、第315〜323頁(1985)〕が知られてい
る。
【0010】本発明の第1の発明は、アスペルギルス属
を始めとする糸状菌より得られるオーレオバシジン感受
性遺伝子又はその機能的誘導体である。本遺伝子を単離
するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細胞よ
り変異処理により耐性株を誘導し、この耐性株の染色体
DNA又はcDNAからDNAライブラリーを作製し、
このライブラリーの中から耐性を付与する遺伝子(耐性
遺伝子)をクローニングする。また、感受性株のDNA
ライブラリーを作製し、このライブラリーの中に、耐性
遺伝子とハイブリダイズするDNA分子を単離、クロー
ニングすれば、感受性遺伝子を単離することができる。
変異処理の方法としては、エチルメタンスルホネート
(EMS)、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジン(NTG)などの薬剤処理による方法、紫外
線又は放射線により処理する方法などがある。耐性を獲
得した変異体を選択するためには、変異処理した細胞を
適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養培地で、
適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を選択する
ことができる。変異処理の方法、条件により、得られる
耐性株は異なる可能性がある。また、選択の際、オーレ
オバシジンの濃度を変えることにより耐性度の異なる株
を分離したり、温度を変化させることにより温度感受性
耐性株を分離することができる。オーレオバシジンに対
する耐性の機構は複数存在するため、これらの種々の耐
性株を遺伝学的に分類していくことにより、複数の耐性
遺伝子を単離することができる。
を始めとする糸状菌より得られるオーレオバシジン感受
性遺伝子又はその機能的誘導体である。本遺伝子を単離
するためには、まずオーレオバシジンに感受性の細胞よ
り変異処理により耐性株を誘導し、この耐性株の染色体
DNA又はcDNAからDNAライブラリーを作製し、
このライブラリーの中から耐性を付与する遺伝子(耐性
遺伝子)をクローニングする。また、感受性株のDNA
ライブラリーを作製し、このライブラリーの中に、耐性
遺伝子とハイブリダイズするDNA分子を単離、クロー
ニングすれば、感受性遺伝子を単離することができる。
変異処理の方法としては、エチルメタンスルホネート
(EMS)、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジン(NTG)などの薬剤処理による方法、紫外
線又は放射線により処理する方法などがある。耐性を獲
得した変異体を選択するためには、変異処理した細胞を
適当な濃度のオーレオバシジンを含有する栄養培地で、
適当な条件で培養すれば、耐性を獲得した株を選択する
ことができる。変異処理の方法、条件により、得られる
耐性株は異なる可能性がある。また、選択の際、オーレ
オバシジンの濃度を変えることにより耐性度の異なる株
を分離したり、温度を変化させることにより温度感受性
耐性株を分離することができる。オーレオバシジンに対
する耐性の機構は複数存在するため、これらの種々の耐
性株を遺伝学的に分類していくことにより、複数の耐性
遺伝子を単離することができる。
【0011】本発明のアスペルギルス属糸状菌のオーレ
オバシジン感受性遺伝子はA.ニドランスの耐性変異株
より単離したanaur1R 、及び感受性株より単離したanau
r1S、及びA.フミガタスの感受性株より単離したafaur
1Sがある。なお、添付図面の図1にアスペルギルス属糸
状菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝子のanaur1Rの
ゲノムDNAの制限酵素地図を、図2にanaur1SのcD
NAの制限酵素地図を、図3にafaur1SのcDNAの制
限酵素地図をそれぞれ示す。
オバシジン感受性遺伝子はA.ニドランスの耐性変異株
より単離したanaur1R 、及び感受性株より単離したanau
r1S、及びA.フミガタスの感受性株より単離したafaur
1Sがある。なお、添付図面の図1にアスペルギルス属糸
状菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝子のanaur1Rの
ゲノムDNAの制限酵素地図を、図2にanaur1SのcD
NAの制限酵素地図を、図3にafaur1SのcDNAの制
限酵素地図をそれぞれ示す。
【0012】オーレオバシジンに感受性であるA.ニド
ランスを紫外線により変異処理し、得られた耐性菌のゲ
ノムライブラリーを作製し、その中から耐性遺伝子 (an
aur1 R) を含有する、図1の制限酵素地図を有するDN
A断片を単離した。本遺伝子の塩基配列は配列表の配列
番号1のとおりである。この塩基配列より予想される本
遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配
列番号2のとおりである。この耐性遺伝子を用いたハイ
ブリダイゼーションにより、感受性株のcDNAライブ
ラリーより感受性遺伝子(anaur1S) を含有する、図2
の制限酵素地図を有するcDNA断片を単離した。この
感受性遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号3のとおり
であり、この塩基配列より予想される本遺伝子のコード
する蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号4のとお
りである。配列番号3と配列番号1の比較によりゲノム
DNAには配列番号1の1508番目から1563番目
までのイントロン(介在配列)が1箇所存在しているこ
とが明らかとなった。更に、配列番号1の1965番目
の塩基がGからTへの突然変異が起こり、配列番号4と
配列番号2の比較によりアミノ酸レベルで275番目の
アミノ酸がグリシンからバリンへ変化し、これが耐性の
原因となっていることが明らかとなった。本発明の糸状
菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝子の一部を化学
的、物理的方法により変異させた遺伝子も本発明の第1
の発明に含まれる。
ランスを紫外線により変異処理し、得られた耐性菌のゲ
ノムライブラリーを作製し、その中から耐性遺伝子 (an
aur1 R) を含有する、図1の制限酵素地図を有するDN
A断片を単離した。本遺伝子の塩基配列は配列表の配列
番号1のとおりである。この塩基配列より予想される本
遺伝子のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配
列番号2のとおりである。この耐性遺伝子を用いたハイ
ブリダイゼーションにより、感受性株のcDNAライブ
ラリーより感受性遺伝子(anaur1S) を含有する、図2
の制限酵素地図を有するcDNA断片を単離した。この
感受性遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号3のとおり
であり、この塩基配列より予想される本遺伝子のコード
する蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号4のとお
りである。配列番号3と配列番号1の比較によりゲノム
DNAには配列番号1の1508番目から1563番目
までのイントロン(介在配列)が1箇所存在しているこ
とが明らかとなった。更に、配列番号1の1965番目
の塩基がGからTへの突然変異が起こり、配列番号4と
配列番号2の比較によりアミノ酸レベルで275番目の
アミノ酸がグリシンからバリンへ変化し、これが耐性の
原因となっていることが明らかとなった。本発明の糸状
菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝子の一部を化学
的、物理的方法により変異させた遺伝子も本発明の第1
の発明に含まれる。
【0013】本発明の第5の発明は、アスペルギルス属
を始めとする糸状菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝
子又はその機能的誘導体のクローニング方法に関し、本
発明の第1の発明の糸状菌由来のオーレオバシジン感受
性遺伝子又はその機能的誘導体又はそれらの一部をプロ
ーブとして用いることを特徴とする。すなわち、上記の
ようにして得られた遺伝子の一部(15オリゴヌクレオ
チド以上)又は全部を用いて、ハイブリダイゼーション
法、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PC
R)法により探索すれば、同様の機能を有する蛋白質を
コードする遺伝子を単離することができる。
を始めとする糸状菌由来のオーレオバシジン感受性遺伝
子又はその機能的誘導体のクローニング方法に関し、本
発明の第1の発明の糸状菌由来のオーレオバシジン感受
性遺伝子又はその機能的誘導体又はそれらの一部をプロ
ーブとして用いることを特徴とする。すなわち、上記の
ようにして得られた遺伝子の一部(15オリゴヌクレオ
チド以上)又は全部を用いて、ハイブリダイゼーション
法、又はポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PC
R)法により探索すれば、同様の機能を有する蛋白質を
コードする遺伝子を単離することができる。
【0014】本発明者らは上記のプローブとして用いる
のに好適な領域を検討するために、本発明のanaur1S 遺
伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番
号4)、及びafaur1S遺伝子がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列(配列表配列番号5)を、本発明者らが既に単
離している、カナダ国特許出願公開公報2124034
号記載のS.セレビシエ由来のオーレオバシジン感受性
遺伝子(scaur1S)がコードする蛋白質のアミノ酸配列
(配列表配列番号6)、Schizo.ポンベ由来のオ
ーレオバシジン感受性遺伝子(spaur1S)がコードする
蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番号7)、及C.ア
ルビカンス由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子
(caaur1)がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表
配列番号8)と比較したところ、全体ではホモロジーは
ない。しかしながら、これら異種のオーレオバシジン感
受性関連遺伝子間で特有の保存配列が存在していること
が初めて明らかとなった。この保存配列はホモロジーが
80%以上と極めて保存性が高く、またプローブとして
用いるのに十分なアミノ酸8残基以上の長さを持ってい
る。図4は配列表の配列番号4〜8でそれぞれ表される
アミノ酸配列を比較した図であり、図中に示す本発明者
らがボックス(Box)配列と命名した3種類の配列(Box-
1〜3)はこの保存配列を示している。これに基づいて
配列表の配列番号9〜11でそれぞれ示されるBox
1、2、又は3のアミノ酸配列より作成したプライマー
若しくはプローブを使用することにより、糸状菌由来の
オーレオバシジン感受性遺伝子又はその機能的誘導体を
クローニングすることができる。なお図4における5段
の塩基配列は、上段から下段に向かって順番にそれぞれ
配列表の配列番号4(最上段)、配列番号5(第2
段)、配列番号6(第3段)、配列番号7(第4段)、
配列番号8(最下段)に相当する。
のに好適な領域を検討するために、本発明のanaur1S 遺
伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番
号4)、及びafaur1S遺伝子がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列(配列表配列番号5)を、本発明者らが既に単
離している、カナダ国特許出願公開公報2124034
号記載のS.セレビシエ由来のオーレオバシジン感受性
遺伝子(scaur1S)がコードする蛋白質のアミノ酸配列
(配列表配列番号6)、Schizo.ポンベ由来のオ
ーレオバシジン感受性遺伝子(spaur1S)がコードする
蛋白質のアミノ酸配列(配列表配列番号7)、及C.ア
ルビカンス由来のオーレオバシジン感受性関連遺伝子
(caaur1)がコードする蛋白質のアミノ酸配列(配列表
配列番号8)と比較したところ、全体ではホモロジーは
ない。しかしながら、これら異種のオーレオバシジン感
受性関連遺伝子間で特有の保存配列が存在していること
が初めて明らかとなった。この保存配列はホモロジーが
80%以上と極めて保存性が高く、またプローブとして
用いるのに十分なアミノ酸8残基以上の長さを持ってい
る。図4は配列表の配列番号4〜8でそれぞれ表される
アミノ酸配列を比較した図であり、図中に示す本発明者
らがボックス(Box)配列と命名した3種類の配列(Box-
1〜3)はこの保存配列を示している。これに基づいて
配列表の配列番号9〜11でそれぞれ示されるBox
1、2、又は3のアミノ酸配列より作成したプライマー
若しくはプローブを使用することにより、糸状菌由来の
オーレオバシジン感受性遺伝子又はその機能的誘導体を
クローニングすることができる。なお図4における5段
の塩基配列は、上段から下段に向かって順番にそれぞれ
配列表の配列番号4(最上段)、配列番号5(第2
段)、配列番号6(第3段)、配列番号7(第4段)、
配列番号8(最下段)に相当する。
【0015】目的のオーレオバシジン感受性蛋白質又は
その機能的誘導体をコードする遺伝子をハイブリダイゼ
ーションにより得る方法としては、例えば以下の方法が
適用できる。まず目的の遺伝子源から得た染色体DN
A、あるいはmRNAより逆転写酵素により作製したc
DNAを常法に従いプラスミドやファージベクターに接
続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのラ
イブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又
はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取
り、変性処理によりDNAを膜に固定する。この膜をあ
らかじめ32Pなどで標識したプローブ(使用するプロー
ブとしては、配列表の配列番号4に記載したアミノ酸配
列、又はその一部をコードする遺伝子であればよく、例
えば、配列表の配列番号3に記載した遺伝子、又はその
一部を使用することができる。好適には配列表の配列番
号9〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又は一部
をコードする15塩基以上の塩基配列を使用することが
できる)を含む溶液中で保温し、膜上のDNAとプロー
ブとの間でハイブリッドを形成させる。例えばDNAを
固定化した膜を、6×SSC、1%ラウリル硫酸ナトリ
ウム、100μg/mlのサケ精子DNA、5×デンハ
ルツ(ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フ
ィコールをそれぞれ0.1%の濃度で含む)を含む溶液
中で65℃で20時間、プローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着
を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブ
とハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作
をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰返
す。こうして得られたクローンの中には、目的の蛋白質
をコードする遺伝子が挿入されている。
その機能的誘導体をコードする遺伝子をハイブリダイゼ
ーションにより得る方法としては、例えば以下の方法が
適用できる。まず目的の遺伝子源から得た染色体DN
A、あるいはmRNAより逆転写酵素により作製したc
DNAを常法に従いプラスミドやファージベクターに接
続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのラ
イブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又
はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取
り、変性処理によりDNAを膜に固定する。この膜をあ
らかじめ32Pなどで標識したプローブ(使用するプロー
ブとしては、配列表の配列番号4に記載したアミノ酸配
列、又はその一部をコードする遺伝子であればよく、例
えば、配列表の配列番号3に記載した遺伝子、又はその
一部を使用することができる。好適には配列表の配列番
号9〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又は一部
をコードする15塩基以上の塩基配列を使用することが
できる)を含む溶液中で保温し、膜上のDNAとプロー
ブとの間でハイブリッドを形成させる。例えばDNAを
固定化した膜を、6×SSC、1%ラウリル硫酸ナトリ
ウム、100μg/mlのサケ精子DNA、5×デンハ
ルツ(ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フ
ィコールをそれぞれ0.1%の濃度で含む)を含む溶液
中で65℃で20時間、プローブとハイブリダイゼーシ
ョンを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着
を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブ
とハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作
をハイブリッド形成したクローンが単一になるまで繰返
す。こうして得られたクローンの中には、目的の蛋白質
をコードする遺伝子が挿入されている。
【0016】得られた遺伝子は、例えば次のように塩基
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のオーレオバシジ
ン感受性蛋白質及びその機能的誘導体をコードする遺伝
子であるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリダ
イゼーションにより得られたクローンの場合、組換体が
大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常
法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断
片を取り出し、M13ファージベクター等にサブクロー
ニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組
換体がファージの場合も基本的に同様のステップにより
塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基
配列決定までの基本的な実験法については、例えば、モ
レキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュ
アル〔Molecular Cloning,A Laboratory Manual、19
82年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発
行、T.マニアティス(T. Maniatis)ほか著〕等に記載
されている。
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のオーレオバシジ
ン感受性蛋白質及びその機能的誘導体をコードする遺伝
子であるかを確認する。塩基配列の決定は、ハイブリダ
イゼーションにより得られたクローンの場合、組換体が
大腸菌であれば試験管等で培養を行い、プラスミドを常
法に従い抽出する。これを制限酵素により切断し挿入断
片を取り出し、M13ファージベクター等にサブクロー
ニングし、ジデオキシ法により塩基配列を決定する。組
換体がファージの場合も基本的に同様のステップにより
塩基配列を決定することができる。これら培養から塩基
配列決定までの基本的な実験法については、例えば、モ
レキュラー・クローニング・ア・ラボラトリー・マニュ
アル〔Molecular Cloning,A Laboratory Manual、19
82年、コールドスプリングハーバーラボラトリー発
行、T.マニアティス(T. Maniatis)ほか著〕等に記載
されている。
【0017】得られた遺伝子が目的のオーレオバシジン
感受性蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子
であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を
配列表の配列番号4に記載したアミノ酸配列と比較して
その遺伝子構造及びアミノ酸配列を知ることができる。
また、得られた遺伝子がオーレオバシジン感受性又は耐
性を保持しているかどうかを調べるために、得られた遺
伝子を感受性細胞に形質転換し、得られた形質転換細胞
のオーレオバシジンに対する感受性を測定することによ
り、遺伝子の活性を明らかにすることができる。又は、
オーレオバシジン感受性関連遺伝子を破壊又は変異させ
ることにより、その活性をもたない細胞へ得られた遺伝
子を形質転換することによっても、活性を測定すること
ができる。上記の形質転換される遺伝子は形質転換され
る細胞内で発現可能とするために、遺伝子上流及び/又
は下流に発現のために必要な配列(プロモーター、ター
ミネーターなど)を含んだ状態が望ましい。
感受性蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子
であるかどうかを確認するには、決定された塩基配列を
配列表の配列番号4に記載したアミノ酸配列と比較して
その遺伝子構造及びアミノ酸配列を知ることができる。
また、得られた遺伝子がオーレオバシジン感受性又は耐
性を保持しているかどうかを調べるために、得られた遺
伝子を感受性細胞に形質転換し、得られた形質転換細胞
のオーレオバシジンに対する感受性を測定することによ
り、遺伝子の活性を明らかにすることができる。又は、
オーレオバシジン感受性関連遺伝子を破壊又は変異させ
ることにより、その活性をもたない細胞へ得られた遺伝
子を形質転換することによっても、活性を測定すること
ができる。上記の形質転換される遺伝子は形質転換され
る細胞内で発現可能とするために、遺伝子上流及び/又
は下流に発現のために必要な配列(プロモーター、ター
ミネーターなど)を含んだ状態が望ましい。
【0018】得られた遺伝子がオーレオバシジン感受性
蛋白質又はその機能的誘導体をコードする領域のすべて
を含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成D
NAプライマーを作製し、PCRにより足りない領域を
増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、
更にDNAライブラリー又はcDNAライブラリーをス
クリーニングすることにより、本発明のオーレオバシジ
ン感受性蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝
子にハイブリダイズするオーレオバシジン感受性蛋白質
又はその機能的誘導体の全コード領域の塩基配列を決定
することができる。例えば、図2のPstI−EcoR
I断片(921bp)のDNA断片をプローブとして病
原性真菌であるA.フミガタスのcDNAライブラリー
をスクリーニングすることにより、anaur1S 遺伝子と同
様の機能を有するA.フミガタスの遺伝子(afaur1S )
を含有する図3の制限酵素地図を有するcDNA分子が
得られた。本遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号12
のとおりであり、この塩基配列より予想される本遺伝子
のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号
5のとおりである。anaur1S 遺伝子とafaur1S 遺伝子と
を比較すると、アミノ酸レベルで87%のホモロジーが
あった。更に、anaur1S 遺伝子のDNA断片をプローブ
として、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger
、以下、A.ニガーと略記する)、及びアスペルギル
ス オリゼー(Aspergillus oryzae、以下、A.オリゼ
ーと略記する)より調製したゲノムDNAを用いてサザ
ンブロット解析を行った結果、A.ニガーやA.オリゼ
ーにも同様のオーレオバシジン感受性遺伝子が存在する
ことが明らかとなった。アスペルギルス属以外の糸状
菌、例えばペニシリウム属などからも同様の方法により
オーレオバシジン感受性遺伝子を単離することができ
る。
蛋白質又はその機能的誘導体をコードする領域のすべて
を含まない場合には、得られた遺伝子を基にして合成D
NAプライマーを作製し、PCRにより足りない領域を
増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、
更にDNAライブラリー又はcDNAライブラリーをス
クリーニングすることにより、本発明のオーレオバシジ
ン感受性蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝
子にハイブリダイズするオーレオバシジン感受性蛋白質
又はその機能的誘導体の全コード領域の塩基配列を決定
することができる。例えば、図2のPstI−EcoR
I断片(921bp)のDNA断片をプローブとして病
原性真菌であるA.フミガタスのcDNAライブラリー
をスクリーニングすることにより、anaur1S 遺伝子と同
様の機能を有するA.フミガタスの遺伝子(afaur1S )
を含有する図3の制限酵素地図を有するcDNA分子が
得られた。本遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号12
のとおりであり、この塩基配列より予想される本遺伝子
のコードする蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番号
5のとおりである。anaur1S 遺伝子とafaur1S 遺伝子と
を比較すると、アミノ酸レベルで87%のホモロジーが
あった。更に、anaur1S 遺伝子のDNA断片をプローブ
として、アスペルギルス ニガー(Aspergillus niger
、以下、A.ニガーと略記する)、及びアスペルギル
ス オリゼー(Aspergillus oryzae、以下、A.オリゼ
ーと略記する)より調製したゲノムDNAを用いてサザ
ンブロット解析を行った結果、A.ニガーやA.オリゼ
ーにも同様のオーレオバシジン感受性遺伝子が存在する
ことが明らかとなった。アスペルギルス属以外の糸状
菌、例えばペニシリウム属などからも同様の方法により
オーレオバシジン感受性遺伝子を単離することができ
る。
【0019】本発明の第4の発明は、上記の核酸プロー
ブであり、オーレオバシジン感受性遺伝子、例えば、図
1、図2又は図3に示した制限酵素地図を有するDNA
断片と選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以上のオ
リゴヌクレオチドである。この核酸プローブはイン シ
トゥ(in situ)ハイブリダイゼーション、上記遺伝子を
発現する組織の確認、各種生体組織における遺伝子やm
RNAの存在の確認などに利用可能である。該核酸プロ
ーブは上記遺伝子又は遺伝子断片を適当なベクターにつ
なぎ、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液からフェノ
ール等により抽出、そしてベクターとつないだ部位を認
識する制限酵素で切断、電気泳動後、ゲノムより切り出
せば調製できる。また、該核酸プローブは配列表の配列
番号1、3、12のそれぞれの塩基配列に基づき、DN
A合成機による化学合成やPCRによる遺伝子増幅技術
によっても調製できる。該核酸プローブとしての使用に
好適な配列としては、配列表の配列番号9〜11でそれ
ぞれ示されるアミノ酸配列、又はその一部をコードする
15塩基以上の塩基配列が挙げられる。該核酸プローブ
は使用時の検出感度を上げるために放射性同位体や蛍光
で標識することもできる。
ブであり、オーレオバシジン感受性遺伝子、例えば、図
1、図2又は図3に示した制限酵素地図を有するDNA
断片と選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以上のオ
リゴヌクレオチドである。この核酸プローブはイン シ
トゥ(in situ)ハイブリダイゼーション、上記遺伝子を
発現する組織の確認、各種生体組織における遺伝子やm
RNAの存在の確認などに利用可能である。該核酸プロ
ーブは上記遺伝子又は遺伝子断片を適当なベクターにつ
なぎ、細菌に導入し、複製させ、菌体破砕液からフェノ
ール等により抽出、そしてベクターとつないだ部位を認
識する制限酵素で切断、電気泳動後、ゲノムより切り出
せば調製できる。また、該核酸プローブは配列表の配列
番号1、3、12のそれぞれの塩基配列に基づき、DN
A合成機による化学合成やPCRによる遺伝子増幅技術
によっても調製できる。該核酸プローブとしての使用に
好適な配列としては、配列表の配列番号9〜11でそれ
ぞれ示されるアミノ酸配列、又はその一部をコードする
15塩基以上の塩基配列が挙げられる。該核酸プローブ
は使用時の検出感度を上げるために放射性同位体や蛍光
で標識することもできる。
【0020】本発明の第6の発明は、上記の糸状菌由来
のオーレオバシジン感受性遺伝子のアンチセンスDNA
であり、本発明の第7の発明はアンチセンスRNAであ
る。これらのアンチセンスDNA又はアンチセンスRN
Aを細胞に導入することによりオーレオバシジン感受性
遺伝子の発現を制御することが可能である。導入するア
ンチセンスDNAとしては、例えば、配列表の配列番号
3、12の各オーレオバシジン感受性遺伝子の、それぞ
れの対応するアンチセンスDNA又はその一部を用いる
ことができる。アンチセンスDNAとしては、例えば、
これらのアンチセンスDNAの一部を適当に切断して得
た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスDNA
配列に基づいて合成したDNAを用いてもよい。導入す
るアンチセンスRNAとしては、例えば、配列表の配列
番号3、12の各オーレオバシジン感受性遺伝子の、そ
れぞれの対応するアンチセンスRNA又はその一部を用
いることができる。アンチセンスRNAとしては、例え
ば、これらのアンチセンスRNAの一部を適当に切断し
て得た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスR
NA配列に基づいて合成したRNAや、例えば、配列表
の配列番号3のオーレオバシジン感受性遺伝子の、それ
ぞれの対応するアンチセンスRNA又はその一部を用い
て、イン ビトロ転写系でRNAポリメラーゼを作用さ
せて作製したRNAを用いてもよい。また、アンチセン
スDNA及びアンチセンスRNAは、生体内で分解され
にくいように、更に、細胞膜を通過できるように化学的
な修飾を施しておくことができる。mRNAを不活化で
きるような物質、例えば、リボザイム(ribozyme) を結
合させてもよい。このようにして調製したアンチセンス
DNA及びアンチセンスRNAは、真菌症を始めとする
オーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はその機
能的誘導体をコードするmRNA量が増大している各種
疾患の治療に使用することができる。
のオーレオバシジン感受性遺伝子のアンチセンスDNA
であり、本発明の第7の発明はアンチセンスRNAであ
る。これらのアンチセンスDNA又はアンチセンスRN
Aを細胞に導入することによりオーレオバシジン感受性
遺伝子の発現を制御することが可能である。導入するア
ンチセンスDNAとしては、例えば、配列表の配列番号
3、12の各オーレオバシジン感受性遺伝子の、それぞ
れの対応するアンチセンスDNA又はその一部を用いる
ことができる。アンチセンスDNAとしては、例えば、
これらのアンチセンスDNAの一部を適当に切断して得
た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスDNA
配列に基づいて合成したDNAを用いてもよい。導入す
るアンチセンスRNAとしては、例えば、配列表の配列
番号3、12の各オーレオバシジン感受性遺伝子の、そ
れぞれの対応するアンチセンスRNA又はその一部を用
いることができる。アンチセンスRNAとしては、例え
ば、これらのアンチセンスRNAの一部を適当に切断し
て得た断片を用いてもよいし、これらのアンチセンスR
NA配列に基づいて合成したRNAや、例えば、配列表
の配列番号3のオーレオバシジン感受性遺伝子の、それ
ぞれの対応するアンチセンスRNA又はその一部を用い
て、イン ビトロ転写系でRNAポリメラーゼを作用さ
せて作製したRNAを用いてもよい。また、アンチセン
スDNA及びアンチセンスRNAは、生体内で分解され
にくいように、更に、細胞膜を通過できるように化学的
な修飾を施しておくことができる。mRNAを不活化で
きるような物質、例えば、リボザイム(ribozyme) を結
合させてもよい。このようにして調製したアンチセンス
DNA及びアンチセンスRNAは、真菌症を始めとする
オーレオバシジンの感受性に関連する蛋白質又はその機
能的誘導体をコードするmRNA量が増大している各種
疾患の治療に使用することができる。
【0021】本発明の第8の発明は、本発明の第1の発
明である糸状菌由来のオーレオバシジンの感受性蛋白質
又はその機能的誘導体をコードする遺伝子を適当なベク
ターに組込んだ、組換体プラスミドである。例えば、酵
母の適当なベクターにオーレオバシジン感受性遺伝子を
組込んだプラスミドは、オーレオバシジンを用いた薬剤
耐性により容易に形質転換体を選択できるため、選択マ
ーカー遺伝子として有用性が高い。また、組換体プラス
ミドは大腸菌などに安定に保持させることが可能であ
り、その際、ベクターとして使用可能なものとして、p
UC118、pWH5、pAU−PS、Traplex
119、pTV118等がある。
明である糸状菌由来のオーレオバシジンの感受性蛋白質
又はその機能的誘導体をコードする遺伝子を適当なベク
ターに組込んだ、組換体プラスミドである。例えば、酵
母の適当なベクターにオーレオバシジン感受性遺伝子を
組込んだプラスミドは、オーレオバシジンを用いた薬剤
耐性により容易に形質転換体を選択できるため、選択マ
ーカー遺伝子として有用性が高い。また、組換体プラス
ミドは大腸菌などに安定に保持させることが可能であ
り、その際、ベクターとして使用可能なものとして、p
UC118、pWH5、pAU−PS、Traplex
119、pTV118等がある。
【0022】また、本発明の第1の発明である糸状菌由
来のオーレオバシジンの感受性蛋白質又はその機能的誘
導体をコードする遺伝子を適当なベクターにつなぎ、糸
状菌を形質転換することができる。pDHG25等〔ジ
ーン、第98巻、第61〜67頁(1991)〕のプラ
スミドをベクターとして使用すれば、導入したDNAは
糸状菌内でプラスミド状態で存在しうる。更にpSa2
3等〔アグリカルチュラル アンド バイオロジカル
ケミストリー(Agricultural and BiologicalChemistr
y)、第51巻、第2549〜2555頁(1987)〕
のプラスミドをベクターとして使用すれば、糸状菌内の
染色体内に組込まれた状態で安定に維持できる。また、
本発明の遺伝子を必要に応じて適当な制限酵素などで蛋
白質に翻訳される領域(open reading frame、ORF)にだ
け切り縮めた後、適当なベクターにつなぎ、発現用組換
体プラスミドとすることができる。発現用プラスミドと
しては、宿主が大腸菌の時はpTV118等のプラスミ
ド、宿主が酵母の時は、pYE2等のプラスミド、宿主
が哺乳類細胞の時は、pMAMneo等のプラスミド、
宿主が糸状菌の時は、pTAex3等のプラスミドをベ
クターとして使用すればよい。
来のオーレオバシジンの感受性蛋白質又はその機能的誘
導体をコードする遺伝子を適当なベクターにつなぎ、糸
状菌を形質転換することができる。pDHG25等〔ジ
ーン、第98巻、第61〜67頁(1991)〕のプラ
スミドをベクターとして使用すれば、導入したDNAは
糸状菌内でプラスミド状態で存在しうる。更にpSa2
3等〔アグリカルチュラル アンド バイオロジカル
ケミストリー(Agricultural and BiologicalChemistr
y)、第51巻、第2549〜2555頁(1987)〕
のプラスミドをベクターとして使用すれば、糸状菌内の
染色体内に組込まれた状態で安定に維持できる。また、
本発明の遺伝子を必要に応じて適当な制限酵素などで蛋
白質に翻訳される領域(open reading frame、ORF)にだ
け切り縮めた後、適当なベクターにつなぎ、発現用組換
体プラスミドとすることができる。発現用プラスミドと
しては、宿主が大腸菌の時はpTV118等のプラスミ
ド、宿主が酵母の時は、pYE2等のプラスミド、宿主
が哺乳類細胞の時は、pMAMneo等のプラスミド、
宿主が糸状菌の時は、pTAex3等のプラスミドをベ
クターとして使用すればよい。
【0023】本発明の第9の発明は、上記の組換体プラ
スミドを適当な宿主に導入した形質転換体である。宿主
としては、大腸菌、酵母、哺乳類細胞が使用可能であ
る。anaur1S 遺伝子を組込んだプラスミドpANAR1
で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia co
li JM109/pANAR1 と命名、表示され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−518
0として寄託されている。
スミドを適当な宿主に導入した形質転換体である。宿主
としては、大腸菌、酵母、哺乳類細胞が使用可能であ
る。anaur1S 遺伝子を組込んだプラスミドpANAR1
で形質転換された大腸菌JM109は、Escherichia co
li JM109/pANAR1 と命名、表示され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所にFERM BP−518
0として寄託されている。
【0024】本発明の第10の発明は、オーレオバシジ
ンの感受性蛋白質又はその機能的誘導体の製造方法であ
り、該蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子
を含有させた、本発明の第8の発明の組換体プラスミド
を導入した発現用形質転換体を適当な栄養培地で培養
し、該蛋白質を発現させ、その細胞又は培地より該蛋白
質を回収、精製すればよい。該蛋白質をコードする遺伝
子を発現させるために、宿主として大腸菌、酵母、哺乳
類細胞が使用される。
ンの感受性蛋白質又はその機能的誘導体の製造方法であ
り、該蛋白質又はその機能的誘導体をコードする遺伝子
を含有させた、本発明の第8の発明の組換体プラスミド
を導入した発現用形質転換体を適当な栄養培地で培養
し、該蛋白質を発現させ、その細胞又は培地より該蛋白
質を回収、精製すればよい。該蛋白質をコードする遺伝
子を発現させるために、宿主として大腸菌、酵母、哺乳
類細胞が使用される。
【0025】本発明の第11の発明は、オーレオバシジ
ンの感受性蛋白質又はその機能的誘導体であり、上記の
anaur1R 、anaur1S 、及びafaur1S遺伝子のコードする
配列番号2、4、及び5に示されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質が挙げられる。当然これらの蛋白質は、化学
的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿入及び欠失の少な
くとも一つがなされていても良い。配列番号4、及び5
のアミノ酸配列を有する蛋白質やそのアミノ酸配列の一
部の領域のペプチド断片などを抗原として使用すれば、
オーレオバシジンの感受性蛋白質に対する抗体の作成も
可能である。
ンの感受性蛋白質又はその機能的誘導体であり、上記の
anaur1R 、anaur1S 、及びafaur1S遺伝子のコードする
配列番号2、4、及び5に示されるアミノ酸配列を有す
る蛋白質が挙げられる。当然これらの蛋白質は、化学
的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿入及び欠失の少な
くとも一つがなされていても良い。配列番号4、及び5
のアミノ酸配列を有する蛋白質やそのアミノ酸配列の一
部の領域のペプチド断片などを抗原として使用すれば、
オーレオバシジンの感受性蛋白質に対する抗体の作成も
可能である。
【0026】本発明と別の発明は、配列表の配列番号4
で表されるオーレオバシジン感受性を付与する蛋白質の
少なくとも275番目のアミノ酸Glyが他のアミノ酸
に置換されたオーレオバシジン耐性付与蛋白質に関し、
更に、その他のアミノ酸残基が生物活性を低下させるこ
となく化学的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つがなされている機能的誘導体を
も含む。本発明のオーレオバシジン耐性付与蛋白質は好
適には配列表の配列番号3及び配列番号12で表される
オーレオバシジン感受性付与蛋白質をコードするDNA
を用いることにより遺伝子工学的に作製することがで
き、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細胞に変換させ
る活性を測定することにより、その生物活性を測定する
ことができる。
で表されるオーレオバシジン感受性を付与する蛋白質の
少なくとも275番目のアミノ酸Glyが他のアミノ酸
に置換されたオーレオバシジン耐性付与蛋白質に関し、
更に、その他のアミノ酸残基が生物活性を低下させるこ
となく化学的、物理的、遺伝子工学的に置換、挿入、及
び欠失の少なくとも一つがなされている機能的誘導体を
も含む。本発明のオーレオバシジン耐性付与蛋白質は好
適には配列表の配列番号3及び配列番号12で表される
オーレオバシジン感受性付与蛋白質をコードするDNA
を用いることにより遺伝子工学的に作製することがで
き、オーレオバシジン感受性細胞を耐性細胞に変換させ
る活性を測定することにより、その生物活性を測定する
ことができる。
【0027】本発明と別の発明は、上記の発明のオーレ
オバシジン耐性付与蛋白質をコードするDNAに関し、
これらのDNAをヌクレオチドの置換、挿入及び欠失の
少なくとも一つによって修飾したDNAも含む。これら
の修飾は容易に遺伝子の部位特異的変異誘発により実施
可能である。これらの修飾を受けたDNAは変異体蛋白
質を生産するために用いられる。
オバシジン耐性付与蛋白質をコードするDNAに関し、
これらのDNAをヌクレオチドの置換、挿入及び欠失の
少なくとも一つによって修飾したDNAも含む。これら
の修飾は容易に遺伝子の部位特異的変異誘発により実施
可能である。これらの修飾を受けたDNAは変異体蛋白
質を生産するために用いられる。
【0028】本発明の第12の発明は核酸プローブを用
いる、ハイブリダイゼーションによるオーレオバシジン
感受性遺伝子の検出方法に関し、核酸プローブとして
は、配列表の配列番号3、12及びこれらDNA断片と
選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以上のオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。好適には配列表の配列番号9
〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又はその一部
をコードする15塩基以上の塩基配列が挙げられる。こ
れらの核酸プローブを用いて目的の生物より抽出、精製
されたDNA、又はRNAのサザンハイブリダイゼーシ
ョン、ノーザンハイブリダイゼーションにより、目的の
生物のオーレオバシジン感受性関連遺伝子を検出するこ
とができる。また、イン シトゥ ハイブリダイゼーシ
ョンにより、上記遺伝子を発現する組織の確認、各種生
体組織における遺伝子やmRNAの存在の確認などに利
用可能である。該核酸プローブは上記遺伝子又は遺伝子
断片を適当なベクターにつなぎ、細菌に導入し、複製さ
せ、菌体破砕液からフェノール等により抽出、そしてベ
クターとつないだ部位を認識する制限酵素で切断、電気
泳動後、ゲルより切り出せば調製できる。また、該核酸
プローブは配列表の配列番号1、3、12のそれぞれの
塩基配列に基づき、DNA合成機による化学合成やPC
Rによる遺伝子増幅技術によっても調製できる。該核酸
プローブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位
体や蛍光で標識することもできる。
いる、ハイブリダイゼーションによるオーレオバシジン
感受性遺伝子の検出方法に関し、核酸プローブとして
は、配列表の配列番号3、12及びこれらDNA断片と
選択的にハイブリダイズ可能な15塩基以上のオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。好適には配列表の配列番号9
〜11でそれぞれ示されるアミノ酸配列、又はその一部
をコードする15塩基以上の塩基配列が挙げられる。こ
れらの核酸プローブを用いて目的の生物より抽出、精製
されたDNA、又はRNAのサザンハイブリダイゼーシ
ョン、ノーザンハイブリダイゼーションにより、目的の
生物のオーレオバシジン感受性関連遺伝子を検出するこ
とができる。また、イン シトゥ ハイブリダイゼーシ
ョンにより、上記遺伝子を発現する組織の確認、各種生
体組織における遺伝子やmRNAの存在の確認などに利
用可能である。該核酸プローブは上記遺伝子又は遺伝子
断片を適当なベクターにつなぎ、細菌に導入し、複製さ
せ、菌体破砕液からフェノール等により抽出、そしてベ
クターとつないだ部位を認識する制限酵素で切断、電気
泳動後、ゲルより切り出せば調製できる。また、該核酸
プローブは配列表の配列番号1、3、12のそれぞれの
塩基配列に基づき、DNA合成機による化学合成やPC
Rによる遺伝子増幅技術によっても調製できる。該核酸
プローブは使用時の検出感度を上げるために放射性同位
体や蛍光で標識することもできる。
【0029】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例により限定されない。
明するが、本発明はこれら実施例により限定されない。
【0030】実施例1 A.ニドランス由来のオーレオ
バシジン感受性関連遺伝子anaur1のクローニング 1−a)A.ニドランスのオーレオバシジン耐性変異株
の分離 オーレオバシジンに対して5μg/mlで感受性を示す
A.ニドランスFGSC89株をSDスラント(1%ポ
リペプトンS、2%グルコース、2%寒天)へ植菌し、
30℃、7日間培養した。5mlの0.8%NaClを
含む0.1%ツイーン80(Tween 80)溶液に懸濁
後、ガラスフィルター(3G3タイプ)でろ過し、ろ液
を分生子懸濁液とした。分生子懸濁液を5分間の紫外線
照射により突然変異処理を施した。この条件で生存率は
約25%だった。30分以上の間、光遮断後、SDプレ
ートへまき、30℃、4日間培養した。生じた分生子を
ガラスフィルターで回収し、更に、5μg/mlのオー
レオバシジンを含むCz+bi培地〔4.9%ツアペッ
ク ソリュウション アガー{ CZAPEK SOLUTION AGAR
(ディフコ、Difco)}、200μg/mlアルギニン、
0.02μg/mlビオチン〕へまき、30℃で培養し
た。2〜3日後に8個のオーレオバシジン耐性コロニー
を得た。これらの細胞は80μg/mlのオーレオバシ
ジンに対しても耐性を示したが、アンホテリシンB、シ
クロヘキシミド、クロトリマゾールに対しては親株と同
じ感受性を持つことから多剤耐性変異ではなく、オーレ
オバシジンに特異的な耐性であると推定される。
バシジン感受性関連遺伝子anaur1のクローニング 1−a)A.ニドランスのオーレオバシジン耐性変異株
の分離 オーレオバシジンに対して5μg/mlで感受性を示す
A.ニドランスFGSC89株をSDスラント(1%ポ
リペプトンS、2%グルコース、2%寒天)へ植菌し、
30℃、7日間培養した。5mlの0.8%NaClを
含む0.1%ツイーン80(Tween 80)溶液に懸濁
後、ガラスフィルター(3G3タイプ)でろ過し、ろ液
を分生子懸濁液とした。分生子懸濁液を5分間の紫外線
照射により突然変異処理を施した。この条件で生存率は
約25%だった。30分以上の間、光遮断後、SDプレ
ートへまき、30℃、4日間培養した。生じた分生子を
ガラスフィルターで回収し、更に、5μg/mlのオー
レオバシジンを含むCz+bi培地〔4.9%ツアペッ
ク ソリュウション アガー{ CZAPEK SOLUTION AGAR
(ディフコ、Difco)}、200μg/mlアルギニン、
0.02μg/mlビオチン〕へまき、30℃で培養し
た。2〜3日後に8個のオーレオバシジン耐性コロニー
を得た。これらの細胞は80μg/mlのオーレオバシ
ジンに対しても耐性を示したが、アンホテリシンB、シ
クロヘキシミド、クロトリマゾールに対しては親株と同
じ感受性を持つことから多剤耐性変異ではなく、オーレ
オバシジンに特異的な耐性であると推定される。
【0031】1−b)オーレオバシジン耐性株のゲノム
ライブラリーの作製 オーレオバシジン耐性株の中で特に耐性度の高い株R1
からゲノムDNAを以下の方法により抽出、精製した。
すなわち、PD培地〔2.4%ポテトデキストロースブ
ロス{ POTATO DEXTROSE BROTH(ディフコ)}〕で30
℃、2日間振とう培養した菌糸をガラスフィルター(3
G1タイプ)により集菌し、蒸留水で洗浄した。菌体を
脱水し、プロトプラスト化溶液〔20mg/ml ヤタ
ラーゼ(大関酒造社製)、0.8M NaCl、10m
Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0〕20mlに懸
濁した。30℃でゆっくりかくはんしながら一晩、プロ
トプラストを形成させた。ガラスフィルター(3G2タ
イプ)でのろ過により、ろ液中にプロトプラストを回収
し、2000rpm、5分間の遠心により集菌した。
0.8M NaClで2回洗浄後、プロトプラストを2
mlのTE溶液〔10mMトリス(Tris) −HCl、p
H8.0、0.1mM EDTA〕に懸濁した後、溶菌
溶液(2%SDS、0.1M NaCl、10mM E
DTA、50mMトリス−HCl、pH7.0)を2m
l加えてゆっくりかくはんした。室温で15分間保温
後、3500rpm、10分間遠心して、上清を回収し
た。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール
(25/24/1)を等量加え、ゆっくりチューブを上
下にかくはんした後、3000rpm、5分間遠心し
て、上層を回収した。−20℃エタノールを2.5倍量
加えて、−80℃に10分間放置した後、3500rp
m、15分間遠心し、沈殿したDNAを乾燥させた。
0.5mlのTE溶液と2.5μlとRNaseA(2
0mg/ml)溶液を加え、37℃、30分間保温し
た。0.5mlのフェノール/クロロホルム/イソアミ
ルアルコールを加え、ゆっくりかくはんし10000r
pm、5分間遠心し、上層を回収した。この操作をもう
1回繰返した。0.5mlのクロロホルム/イソアミル
アルコール(24/1)を加え、ゆっくりかくはんし1
0000rpm、5分間遠心し、上清を回収した。0.
05mlの5M NaClと0.5mlのイソプロピル
アルコールを加え、−80℃に10分間放置後、100
00rpm、15分間の遠心によりDNAを回収した。
精製したゲノムDNA8μgを制限酵素BamHIの4
ユニットで37℃、15分間処理による部分分解後、フ
ェノール/クロロホルムにより除蛋白し、エタノール沈
殿した。部分分解DNAを0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、3〜15kb領域のDNAを抽出、精製し
た。得られたDNAとBamHIで完全分解したpDH
G25ベクター〔ジーン、第98巻、第61〜67頁
(1991)〕をDNAライゲーションキット(宝酒造
社製)により連結させた後、大腸菌HB101を形質転
換し、耐性株のゲノムライブラリーを作製した。このゲ
ノムライブラリーを含有させた大腸菌を100μg/m
lアンピシリンを含むLB培地(1%バクトトリプト
ン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%塩化ナト
リウム)50ml中で37℃、一夜培養後、大腸菌から
プラスミドを回収、精製した。
ライブラリーの作製 オーレオバシジン耐性株の中で特に耐性度の高い株R1
からゲノムDNAを以下の方法により抽出、精製した。
すなわち、PD培地〔2.4%ポテトデキストロースブ
ロス{ POTATO DEXTROSE BROTH(ディフコ)}〕で30
℃、2日間振とう培養した菌糸をガラスフィルター(3
G1タイプ)により集菌し、蒸留水で洗浄した。菌体を
脱水し、プロトプラスト化溶液〔20mg/ml ヤタ
ラーゼ(大関酒造社製)、0.8M NaCl、10m
Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0〕20mlに懸
濁した。30℃でゆっくりかくはんしながら一晩、プロ
トプラストを形成させた。ガラスフィルター(3G2タ
イプ)でのろ過により、ろ液中にプロトプラストを回収
し、2000rpm、5分間の遠心により集菌した。
0.8M NaClで2回洗浄後、プロトプラストを2
mlのTE溶液〔10mMトリス(Tris) −HCl、p
H8.0、0.1mM EDTA〕に懸濁した後、溶菌
溶液(2%SDS、0.1M NaCl、10mM E
DTA、50mMトリス−HCl、pH7.0)を2m
l加えてゆっくりかくはんした。室温で15分間保温
後、3500rpm、10分間遠心して、上清を回収し
た。フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール
(25/24/1)を等量加え、ゆっくりチューブを上
下にかくはんした後、3000rpm、5分間遠心し
て、上層を回収した。−20℃エタノールを2.5倍量
加えて、−80℃に10分間放置した後、3500rp
m、15分間遠心し、沈殿したDNAを乾燥させた。
0.5mlのTE溶液と2.5μlとRNaseA(2
0mg/ml)溶液を加え、37℃、30分間保温し
た。0.5mlのフェノール/クロロホルム/イソアミ
ルアルコールを加え、ゆっくりかくはんし10000r
pm、5分間遠心し、上層を回収した。この操作をもう
1回繰返した。0.5mlのクロロホルム/イソアミル
アルコール(24/1)を加え、ゆっくりかくはんし1
0000rpm、5分間遠心し、上清を回収した。0.
05mlの5M NaClと0.5mlのイソプロピル
アルコールを加え、−80℃に10分間放置後、100
00rpm、15分間の遠心によりDNAを回収した。
精製したゲノムDNA8μgを制限酵素BamHIの4
ユニットで37℃、15分間処理による部分分解後、フ
ェノール/クロロホルムにより除蛋白し、エタノール沈
殿した。部分分解DNAを0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、3〜15kb領域のDNAを抽出、精製し
た。得られたDNAとBamHIで完全分解したpDH
G25ベクター〔ジーン、第98巻、第61〜67頁
(1991)〕をDNAライゲーションキット(宝酒造
社製)により連結させた後、大腸菌HB101を形質転
換し、耐性株のゲノムライブラリーを作製した。このゲ
ノムライブラリーを含有させた大腸菌を100μg/m
lアンピシリンを含むLB培地(1%バクトトリプト
ン、0.5%バクトイーストエキス、0.5%塩化ナト
リウム)50ml中で37℃、一夜培養後、大腸菌から
プラスミドを回収、精製した。
【0032】1−c)オーレオバシジン耐性遺伝子anau
r1Rの発現及びクローニング 上記のようにして調製したオーレオバシジン耐性株のゲ
ノムライブラリー由来のプラスミドを以下の方法により
A.ニドランスFGSC89株に形質転換した。すなわ
ち、A.ニドランスをPD培地で30℃、2日間振とう
培養後、菌糸をガラスフィルター(3G1タイプ)でろ
過することにより回収し、滅菌水で洗浄した。十分に脱
水後、菌体を10mlのプロトプラスト化溶液に懸濁し
た。30℃でゆっくり振とうしながら約3時間反応させ
た。ガラスフィルター3G3でろ過したろ液中のプロト
プラストを2000rpm、5分間の遠心により回収
し、0.8M NaClで2回洗浄した。プロトプラス
トを2×108 /mlとなるようにSol1(0.8M
NaCl、10mM CaCl2 、10mMトリス−
HCl、pH8.0)に懸濁した後、0.2容量のSo
l2〔40%(W/V)PEG4000、50mM C
aCl2 、50mMトリス−HCl、pH8.0〕を加
えよく混合した。0.2mlのプロトプラスト懸濁液を
分注し、10μgのゲノムライブラリー由来のプラスミ
ドを加え、よく混合した。氷中で30分間放置後1ml
のSol2を加えよく混合した。室温で15分間放置
し、8.5mlのSol1を加え、よく混合後、200
0rpm、5分間の遠心によりプロトプラストを回収し
た。0.2mlのSol1を加え5μg/mlオーレオ
バシジンAを含む最小培地(4.9%ツアペック ソリ
ュウション アガー、0.8M NaCl、0.02μ
g/mlビオチン)の中央にのせた後、45℃に保温し
た軟寒天培地(3.5%ツアペック−ドックス ブロ
ス、0.8M NaCl、0.02μg/mlビオチ
ン、0.5%寒天)5mlを重層した。30℃、3〜5
日間培養した。このプレート上で増殖したコロニーはオ
ーレオバシジン耐性遺伝子を含むプラスミドを持ってい
ると考えられる。約70個のコロニーがオーレオバシジ
ン含有培地上に生じた。このコロニーをCz+bi培地
20mlへ植菌し、30℃、2日間培養し、増殖した細
胞より実施例1−b)に述べたDNAの抽出精製法に従
って、回収、精製した。このDNAで大腸菌HB101
を形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含むL
B培地へ塗布した。生じた大腸菌コロニーからプラスミ
ドDNAを調製した。このプラスミドは12kbのDN
Aを含んでおり、pR1−1と命名した。pR1−1中
の12kbDNAの制限酵素地図を図5に示す。更に耐
性遺伝子領域を限定するため、制限酵素により12kb
DNA断片を種々の大きさよりなる断片とした後、その
DNA断片をpDHG25ベクターへクローニングし
た。種々のDNAを含むプラスミドを正常細胞A.ニド
ランスFGSC89株へ形質転換しオーレオバシジン耐
性を獲得するかどうかを確認した。その結果、Bgl I
I 5.8kb断片にオーレオバシジン耐性を付与する活
性が存在していた。このことから、この断片にanaur1R
遺伝子が存在することが明らかとなった。このオーレオ
バシジン耐性遺伝子anaur1Rを含有するDNA断片の制
限酵素地図は図1に示すとおりである。この断片をpU
C118ベクターへサブクローニングしpUR1と命名
した。このプラスミドを用いてDNA塩基配列を決定し
た。その塩基配列は配列表の配列番号1に示すとおりで
あり、この塩基配列よりanaur1R遺伝子は1ヵ所のイン
トロンを含む2つのエキソン領域よりなる遺伝子であっ
た。この遺伝子は配列表の配列番号2に示したアミノ酸
配列を有する蛋白質をコードしていることが明らかとな
った。
r1Rの発現及びクローニング 上記のようにして調製したオーレオバシジン耐性株のゲ
ノムライブラリー由来のプラスミドを以下の方法により
A.ニドランスFGSC89株に形質転換した。すなわ
ち、A.ニドランスをPD培地で30℃、2日間振とう
培養後、菌糸をガラスフィルター(3G1タイプ)でろ
過することにより回収し、滅菌水で洗浄した。十分に脱
水後、菌体を10mlのプロトプラスト化溶液に懸濁し
た。30℃でゆっくり振とうしながら約3時間反応させ
た。ガラスフィルター3G3でろ過したろ液中のプロト
プラストを2000rpm、5分間の遠心により回収
し、0.8M NaClで2回洗浄した。プロトプラス
トを2×108 /mlとなるようにSol1(0.8M
NaCl、10mM CaCl2 、10mMトリス−
HCl、pH8.0)に懸濁した後、0.2容量のSo
l2〔40%(W/V)PEG4000、50mM C
aCl2 、50mMトリス−HCl、pH8.0〕を加
えよく混合した。0.2mlのプロトプラスト懸濁液を
分注し、10μgのゲノムライブラリー由来のプラスミ
ドを加え、よく混合した。氷中で30分間放置後1ml
のSol2を加えよく混合した。室温で15分間放置
し、8.5mlのSol1を加え、よく混合後、200
0rpm、5分間の遠心によりプロトプラストを回収し
た。0.2mlのSol1を加え5μg/mlオーレオ
バシジンAを含む最小培地(4.9%ツアペック ソリ
ュウション アガー、0.8M NaCl、0.02μ
g/mlビオチン)の中央にのせた後、45℃に保温し
た軟寒天培地(3.5%ツアペック−ドックス ブロ
ス、0.8M NaCl、0.02μg/mlビオチ
ン、0.5%寒天)5mlを重層した。30℃、3〜5
日間培養した。このプレート上で増殖したコロニーはオ
ーレオバシジン耐性遺伝子を含むプラスミドを持ってい
ると考えられる。約70個のコロニーがオーレオバシジ
ン含有培地上に生じた。このコロニーをCz+bi培地
20mlへ植菌し、30℃、2日間培養し、増殖した細
胞より実施例1−b)に述べたDNAの抽出精製法に従
って、回収、精製した。このDNAで大腸菌HB101
を形質転換し、100μg/mlアンピシリンを含むL
B培地へ塗布した。生じた大腸菌コロニーからプラスミ
ドDNAを調製した。このプラスミドは12kbのDN
Aを含んでおり、pR1−1と命名した。pR1−1中
の12kbDNAの制限酵素地図を図5に示す。更に耐
性遺伝子領域を限定するため、制限酵素により12kb
DNA断片を種々の大きさよりなる断片とした後、その
DNA断片をpDHG25ベクターへクローニングし
た。種々のDNAを含むプラスミドを正常細胞A.ニド
ランスFGSC89株へ形質転換しオーレオバシジン耐
性を獲得するかどうかを確認した。その結果、Bgl I
I 5.8kb断片にオーレオバシジン耐性を付与する活
性が存在していた。このことから、この断片にanaur1R
遺伝子が存在することが明らかとなった。このオーレオ
バシジン耐性遺伝子anaur1Rを含有するDNA断片の制
限酵素地図は図1に示すとおりである。この断片をpU
C118ベクターへサブクローニングしpUR1と命名
した。このプラスミドを用いてDNA塩基配列を決定し
た。その塩基配列は配列表の配列番号1に示すとおりで
あり、この塩基配列よりanaur1R遺伝子は1ヵ所のイン
トロンを含む2つのエキソン領域よりなる遺伝子であっ
た。この遺伝子は配列表の配列番号2に示したアミノ酸
配列を有する蛋白質をコードしていることが明らかとな
った。
【0033】1−d)オーレオバシジン感受性遺伝子an
aur1Sのクローニング 正常細胞A.ニドランスのポリ(A)+ RNAよりオー
レオバシジン感受性遺伝子のcDNAを得るため、初め
にA.ニドランスFGSC89株から全RNAを抽出し
た。すなわち、上記の菌を200mlPD培地で培養
後、ガラスフィルター(3G1タイプ)により集菌し、
十分に脱水した後、菌体を液体窒素により急速凍結し
た。乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した後、RNA
エクストラクションキット(RNA extraction kit 、
ファルマシア社製)により2.6mgの全RNAを回
収、精製した。この全RNA1mgからオリゴテックス
−dT30<スーパー>( Oligotex −dT30、宝酒
造社製)を用いることにより、12.8μgのポリ
(A)+ RNAを調製した。ポリ(A)+ RNA5μg
を用いて、タカラ(Takara) cDNA合成キット(宝酒
造社製)によりcDNAを合成した。合成されたcDN
AとラムダファージベクターλSHloxTM(ノヴァジ
ェン社製)と連結した後、ファージメーカーシステム、
ファージパック エクストラクト〔 Phage MakerTM Sys
tem 、(ノヴァジェン社製)〕によりインビトロパッケ
ージングを行いcDNAライブラリーを構築した。cD
NAライブラリーを宿主大腸菌ER1647株に接種
し、トップアガロース(0.7%アガロースを含むLB
培地)と混合後、LBプレート上に重層し、37℃一夜
培養することにより、プラークを形成させた。生じたプ
ラークをナイロンメンブレン(Hybond−N、アマシャム
社製)へ移し、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブとして、実施例1−c)で得られたpUR
1プラスミドをPstIとSalIにより切断すること
により得られた、2.6kbのDNA断片を用いた。こ
のDNA断片をランダムプライマーDNAラベリングキ
ット(宝酒造社製)と〔α−32P〕dCTPで標識しハ
イブリダイゼーションのプローブとして用いた。4×1
05 個のプラークをスクリーニングした結果、プローブ
とハイブリダイズする8個のファージクローンを得た。
次に、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングに
より、これらのファージからcDNAを含む領域を自動
的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌
を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、cD
NAの長さを比較し、最長の2.9kbのcDNAを含
むpS15を選び、cDNAをpUC118へサブクロ
ーニング後、塩基配列を決定した。このプラスミドをp
ANAR1と命名し、pANAR1で形質転換された大
腸菌JM109は Escherichia coli JM109/pANAR1と命
名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP−5180として寄託されてい
る。このcDNAの制限酵素地図は図2に示すとおりで
ある。そのDNA塩基配列は配列表の配列番号3に示す
とおりであり、この塩基配列よりanaur1S 遺伝子は配列
表の配列番号4に示したアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードしており、耐性遺伝子anaurlR と比較すると、配
列表配列番号3の1218番目の塩基のGが突然変異に
よりTに変換しており、アミノ酸レベルでは275番目
のアミノ酸がグリシンからバリンに変化していることが
明らかとなった。更に、ゲノムDNAには56bpのイ
ントロンが1ヵ所存在していることが明らかとなった。
ゲノムDNAとcDNAの関係を図5に示す。
aur1Sのクローニング 正常細胞A.ニドランスのポリ(A)+ RNAよりオー
レオバシジン感受性遺伝子のcDNAを得るため、初め
にA.ニドランスFGSC89株から全RNAを抽出し
た。すなわち、上記の菌を200mlPD培地で培養
後、ガラスフィルター(3G1タイプ)により集菌し、
十分に脱水した後、菌体を液体窒素により急速凍結し
た。乳鉢により凍結菌体を粉末状に破砕した後、RNA
エクストラクションキット(RNA extraction kit 、
ファルマシア社製)により2.6mgの全RNAを回
収、精製した。この全RNA1mgからオリゴテックス
−dT30<スーパー>( Oligotex −dT30、宝酒
造社製)を用いることにより、12.8μgのポリ
(A)+ RNAを調製した。ポリ(A)+ RNA5μg
を用いて、タカラ(Takara) cDNA合成キット(宝酒
造社製)によりcDNAを合成した。合成されたcDN
AとラムダファージベクターλSHloxTM(ノヴァジ
ェン社製)と連結した後、ファージメーカーシステム、
ファージパック エクストラクト〔 Phage MakerTM Sys
tem 、(ノヴァジェン社製)〕によりインビトロパッケ
ージングを行いcDNAライブラリーを構築した。cD
NAライブラリーを宿主大腸菌ER1647株に接種
し、トップアガロース(0.7%アガロースを含むLB
培地)と混合後、LBプレート上に重層し、37℃一夜
培養することにより、プラークを形成させた。生じたプ
ラークをナイロンメンブレン(Hybond−N、アマシャム
社製)へ移し、プラークハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブとして、実施例1−c)で得られたpUR
1プラスミドをPstIとSalIにより切断すること
により得られた、2.6kbのDNA断片を用いた。こ
のDNA断片をランダムプライマーDNAラベリングキ
ット(宝酒造社製)と〔α−32P〕dCTPで標識しハ
イブリダイゼーションのプローブとして用いた。4×1
05 個のプラークをスクリーニングした結果、プローブ
とハイブリダイズする8個のファージクローンを得た。
次に、大腸菌内でのオートマチックサブクローニングに
より、これらのファージからcDNAを含む領域を自動
的にサブクローニングされたプラスミドを有する大腸菌
を得た。これらの大腸菌からプラスミドを精製し、cD
NAの長さを比較し、最長の2.9kbのcDNAを含
むpS15を選び、cDNAをpUC118へサブクロ
ーニング後、塩基配列を決定した。このプラスミドをp
ANAR1と命名し、pANAR1で形質転換された大
腸菌JM109は Escherichia coli JM109/pANAR1と命
名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術
研究所にFERM BP−5180として寄託されてい
る。このcDNAの制限酵素地図は図2に示すとおりで
ある。そのDNA塩基配列は配列表の配列番号3に示す
とおりであり、この塩基配列よりanaur1S 遺伝子は配列
表の配列番号4に示したアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードしており、耐性遺伝子anaurlR と比較すると、配
列表配列番号3の1218番目の塩基のGが突然変異に
よりTに変換しており、アミノ酸レベルでは275番目
のアミノ酸がグリシンからバリンに変化していることが
明らかとなった。更に、ゲノムDNAには56bpのイ
ントロンが1ヵ所存在していることが明らかとなった。
ゲノムDNAとcDNAの関係を図5に示す。
【0034】実施例2 A.フミガタスの有するafaur1
S 遺伝子の確認及びクローニング 2−a)ノーザンハイブリダイゼーションによるafaur1
S 遺伝子の検出 A.フミガタスTIMM1776株より実施例1−d)
と同様の方法によりポリ(A)+ RNAを抽出、精製し
た。A.フミガタスとA.ニドランスのポリ(A)+ R
NA(1μg)をホルムアルデヒドを含む1.2%アガ
ロースゲルでの電気泳動により分離後、ナイロンメンブ
レンへ移し、固定後、〔α−32P〕dCTPで標識さ
れたanaur1S 遺伝子のcDNAのHindIII 断片74
1bpをプローブとして用いて、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーションの条件は60℃で
一夜、ハイブリダイズを行った後、60℃、0.5×S
SC、0.1%SDSで洗浄を行った。図5において、
レーン1はA.ニドランス、レーン2はA.フミガタス
より得られたポリ(A)+ RNAについてノーザンハイ
ブリダイゼーションを行った結果である。図6から明ら
かなようにハイブリダイゼーション後のオートラジオグ
ラフィーにより、A.フミガタスにもA.ニドランスと
同じ大きさのオーレオバシジン感受性遺伝子が存在する
ことが明らかとなった。しかし、バンドはA.フミガタ
スでは非常に弱いため、A.ニドランスとA.フミガタ
スのオーレオバシジン感受性遺伝子は相同性は高くない
ことが明らかとなった。
S 遺伝子の確認及びクローニング 2−a)ノーザンハイブリダイゼーションによるafaur1
S 遺伝子の検出 A.フミガタスTIMM1776株より実施例1−d)
と同様の方法によりポリ(A)+ RNAを抽出、精製し
た。A.フミガタスとA.ニドランスのポリ(A)+ R
NA(1μg)をホルムアルデヒドを含む1.2%アガ
ロースゲルでの電気泳動により分離後、ナイロンメンブ
レンへ移し、固定後、〔α−32P〕dCTPで標識さ
れたanaur1S 遺伝子のcDNAのHindIII 断片74
1bpをプローブとして用いて、ハイブリダイゼーショ
ンを行った。ハイブリダイゼーションの条件は60℃で
一夜、ハイブリダイズを行った後、60℃、0.5×S
SC、0.1%SDSで洗浄を行った。図5において、
レーン1はA.ニドランス、レーン2はA.フミガタス
より得られたポリ(A)+ RNAについてノーザンハイ
ブリダイゼーションを行った結果である。図6から明ら
かなようにハイブリダイゼーション後のオートラジオグ
ラフィーにより、A.フミガタスにもA.ニドランスと
同じ大きさのオーレオバシジン感受性遺伝子が存在する
ことが明らかとなった。しかし、バンドはA.フミガタ
スでは非常に弱いため、A.ニドランスとA.フミガタ
スのオーレオバシジン感受性遺伝子は相同性は高くない
ことが明らかとなった。
【0035】2−b)A.フミガタスの有するafaur1S
遺伝子のクローニング 実施例2−a)で精製したA.フミガタスのポリ(A)
+ RNAを用いて実施例1−d)で示したcDNAライ
ブラリー作製の方法に従ってA.フミガタスのcDNA
ライブラリーを作製した。A.ニドランスcDNAのP
stI−EcoRI断片(921bp)をプローブとし
て、上記のライブラリーを、実施例2−a)と同じハイ
ブリダイゼーション条件によりスクリーニングした。そ
の結果8個のファージクローンを得た。その中で最長の
長さである2.9kbのcDNAを含むファージクロー
ンより実施例1−d)で示した方法により、プラスミド
状態でcDNAを回収し、cDNAをpUC118へサ
ブクローニングし、DNA塩基配列を決定した。その塩
基配列は配列表の配列番号12のとおりであり、この塩
基配列より、この遺伝子は配列表の配列番号5に示した
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。A.フ
ミガタスTIMM1776株のafaur1S 蛋白質とA.ニ
ドランスFGSC89株のanaur1S蛋白質のアミノ酸配
列を比較すると87%のホモロジーがあり、相同性が高
かった。
遺伝子のクローニング 実施例2−a)で精製したA.フミガタスのポリ(A)
+ RNAを用いて実施例1−d)で示したcDNAライ
ブラリー作製の方法に従ってA.フミガタスのcDNA
ライブラリーを作製した。A.ニドランスcDNAのP
stI−EcoRI断片(921bp)をプローブとし
て、上記のライブラリーを、実施例2−a)と同じハイ
ブリダイゼーション条件によりスクリーニングした。そ
の結果8個のファージクローンを得た。その中で最長の
長さである2.9kbのcDNAを含むファージクロー
ンより実施例1−d)で示した方法により、プラスミド
状態でcDNAを回収し、cDNAをpUC118へサ
ブクローニングし、DNA塩基配列を決定した。その塩
基配列は配列表の配列番号12のとおりであり、この塩
基配列より、この遺伝子は配列表の配列番号5に示した
アミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。A.フ
ミガタスTIMM1776株のafaur1S 蛋白質とA.ニ
ドランスFGSC89株のanaur1S蛋白質のアミノ酸配
列を比較すると87%のホモロジーがあり、相同性が高
かった。
【0036】実施例3 A.ニガーとA.オリゼーの有
するオーレオバシジン感受性関連遺伝子の確認 A.フミガタスTIMM1776株とA.ニガーFGS
C805株とA.オリゼーIFO5710株より、実施
例1−b)で示した方法に従ってゲノムDNAを抽出、
精製した。更に、酵母S.セレビシエDKD−5D株及
びSchizo.ポンベJY745株よりP.フィリッ
プセン(P. Philippsen) らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第194巻、第169〜175頁
(1991)〕に従ってゲノムDNAを抽出、精製し
た。A.ニドランス、A.フミガタス、A.ニガー、
A.オリゼー、S.セレビシエとSchizo.ポンベ
のゲノムDNA5μgを制限酵素PstIで切断し、
0.8%アガロースゲルによる電気泳動により分離後、
ナイロンメンブレンへ移し、固定後、〔α−32P〕d
CTPで標識されたanaur1S遺伝子のcDNAのPst
I−EcoRI断片をプローブとして、サザンハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条
件は実施例2−a)で示した条件で行った。ハイブリダ
イゼーションのオートラジオグラムを図7に示す。図7
から明らかなように、A.ニガーやA.オリゼーにもオ
ーレオバシジン感受性関連遺伝子が存在することが明ら
かとなった。更にA.ニドランスのDNAの酵母S.セ
レビシエやSchizo.ポンベのオーレオバシジン感
受性遺伝子とハイブリダイズしないことが明らかとなっ
た。図7において、レーン1はA.ニドランス、レーン
2はA.フミガタス、レーン3はA.ニガー、レーン4
はA.オリゼー、レーン5はS.セレビシエ、レーン6
はSchizo.ポンベのゲノムDNAについてサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果である。
するオーレオバシジン感受性関連遺伝子の確認 A.フミガタスTIMM1776株とA.ニガーFGS
C805株とA.オリゼーIFO5710株より、実施
例1−b)で示した方法に従ってゲノムDNAを抽出、
精製した。更に、酵母S.セレビシエDKD−5D株及
びSchizo.ポンベJY745株よりP.フィリッ
プセン(P. Philippsen) らの方法〔メソッズ イン
エンザイモロジー、第194巻、第169〜175頁
(1991)〕に従ってゲノムDNAを抽出、精製し
た。A.ニドランス、A.フミガタス、A.ニガー、
A.オリゼー、S.セレビシエとSchizo.ポンベ
のゲノムDNA5μgを制限酵素PstIで切断し、
0.8%アガロースゲルによる電気泳動により分離後、
ナイロンメンブレンへ移し、固定後、〔α−32P〕d
CTPで標識されたanaur1S遺伝子のcDNAのPst
I−EcoRI断片をプローブとして、サザンハイブリ
ダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションの条
件は実施例2−a)で示した条件で行った。ハイブリダ
イゼーションのオートラジオグラムを図7に示す。図7
から明らかなように、A.ニガーやA.オリゼーにもオ
ーレオバシジン感受性関連遺伝子が存在することが明ら
かとなった。更にA.ニドランスのDNAの酵母S.セ
レビシエやSchizo.ポンベのオーレオバシジン感
受性遺伝子とハイブリダイズしないことが明らかとなっ
た。図7において、レーン1はA.ニドランス、レーン
2はA.フミガタス、レーン3はA.ニガー、レーン4
はA.オリゼー、レーン5はS.セレビシエ、レーン6
はSchizo.ポンベのゲノムDNAについてサザン
ハイブリダイゼーションを行った結果である。
【0037】
【発明の効果】本発明により、アスペルギルス属より得
られたオーレオバシジン感受性に関連する新規な蛋白質
及び該蛋白質をコードする遺伝子、オーレオバシジン感
受性遺伝子が提供された。これらは該遺伝子を有する生
物が原因で起こる、真菌症を始めとする疾患の診断、治
療に有用である。更に、本発明により、該遺伝子のアン
チセンスDNA及びアンチセンスRNA、該遺伝子にハ
イブリダイズ可能な核酸プローブ、その核酸プローブを
用いた該遺伝子の検出方法、該遺伝子を導入させた形質
転換体を用いたオーレオバシジン感受性蛋白質の製造方
法が提供された。これらも真菌症などの疾患の診断、治
療に有用である。
られたオーレオバシジン感受性に関連する新規な蛋白質
及び該蛋白質をコードする遺伝子、オーレオバシジン感
受性遺伝子が提供された。これらは該遺伝子を有する生
物が原因で起こる、真菌症を始めとする疾患の診断、治
療に有用である。更に、本発明により、該遺伝子のアン
チセンスDNA及びアンチセンスRNA、該遺伝子にハ
イブリダイズ可能な核酸プローブ、その核酸プローブを
用いた該遺伝子の検出方法、該遺伝子を導入させた形質
転換体を用いたオーレオバシジン感受性蛋白質の製造方
法が提供された。これらも真菌症などの疾患の診断、治
療に有用である。
【0038】
【0039】
配列番号:1
配列の長さ:4140
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
配列:
AGATCTGTGG CTTCCGGTTG GCTACTTGTA ACCAACTGAT GGTCAGATGG ATCTGCCGTC 60
TGTTTTGATT TGAATTTTCC CTGCTCATTC TGATTCTGTG AGAGGCTGCA TTCATTATCA 120
CATCTCATAC CCGGCGCCTG CGACTTCGGT CACCTCTGCG GTCTGGCGGT TACCGGGGTC 180
CGTCTGAGAC TCGTCAGTCA GCCATTCGAG TATGCGAACT CTGACTTTGC TCACCTAAGA 240
GTTTGCACGA GATGCCGAAA TCCTCCTCGA GTAGAGTTTG CAAGGCTTGA ACCTTGGTCC 300
TTGAAGCCCG AAAGTGGCTC AGTAGTGGGA TCGATAGTCT GGTTGTTGAA GATTTTCTCC 360
TCCACCTTAC CTATGGCCGC TGGCCTTCTC CACCTTTCAG GCTTTCAGGC ACCCTCGGCT 420
CGGATTCTGT ATCGTCCGGT ACCGAAGCTA GTCCTAGCTA GTCAAAGCTA GTCCAAGCTA 480
GTCTCGTCAA GGTTTGGCGC AGCGCGGTTC CGTGTAAAGT ACAAATTTGA AATACGAATA 540
CGCAGTACTC GCAGCCGGCA CTTCCGCTCA GCCCAGGCTC AGAGGCTAAG GGTGTTGGCG 600
CTTCCTCATC ATCTTCTTCT CGTCGACCTT TTCCTCTTTC TCTCCCTATC GGTGCTTCTC 660
TCCAACCTCA TTCTCAGTCG TTCGCCCATC AGGTTTATAC TCCGGCTCCG TGGCCATCTG 720
CCTCCCTCAC GACCTCCTCG TTCCAGGTTT TCCTCTCGAC TGCTGCGCCC TTGCACTTCG 780
CCTTGCATCA GTGAAACCCC CTGCAACGTG ACGGCTCAAA GACATCCTCG TTTGGCCGCT 840
GGAGACCGGA GCGTGCGCTT CGTTTCGTCT TCTTCGAACC GATCTCAATT TCCCCGCTCG 900
GGTTGACGCC GTCAGCACCC TGCTCGTTGC CTAACGGCTT GTTATTCAAG ACCCCTTTTC 960
TGCCGCTTCC GCGACCGATT TATTCGTCGC CTTCCAACTC TTGTACAATC GGGGGGAAAG 1020
AAAGCAGACG GAGTTCGATC TGGAGGAATT ATAGCTGAGT CTTGCCCGCA AGACTCGCCG 1080
CAACCATGAA TCAAACACTT CCCACGTGGA AGGACCGCAC GCAGAACCAG TTTGGAAAGC 1140
TTCAGATCCA GGTTCCATGG CGGTCCATCC AACTGCTCGT CCCGCATCGC ATGCGGCGGA 1200
AGTTAAGGTC CAAATTGCGC AGTAGAGCGT CTCCTACCTC GTCAATAGCC TCTTTACAGA 1260
CGTCGTTATC GCCTGCAGAC ACACTACGAT CGCTCCAAAG CCACCGATGG ACGGTTTACG 1320
ACTTCCAATA TCTGCTTCTG TTGATCGTGG GCATCTTCTC TTTGACCGTT ATCGAGTCGC 1380
CCGGGCCTTT GGGCAAAACG GCCATTTTCT CCATGCTCCT ATTCTCTCTC CTGATCCCTA 1440
TGACCCGCCA GTTCTTCCTC CCGTTTCTGC CGATTGCCGG ATGGCTTCTG TTTTTCTACG 1500
CCTGCCAGTG AGTTAAAAAC AACCCGCTAC CAGACCCCGT GCAGCAGTTA CTCACATATG 1560
CAGGTTCATC CCAAGCGATT GGCGCCCTGC GATTTGGGTT CGTGTCTTGC CTGCACTGGA 1620
GAATATTCTC TACGGCGCAA ACATCAGCAA CATCCTATCC GCTCACCAGA ACGTTGTGCT 1680
TGACGTGCTG GCGTGGCTAC CCTACGGTAT CTGCCACTAT GGCGCTCCGT TTGTGTGCTC 1740
GTTGATCATG TTCATCTTCG GTCCGCCCGG CACTGTTCCC CTTTTCGCGC GCACTTTCGG 1800
CTATATCAGT ATGACTGCGG TTACTATTCA GCTGTTTTTC CCTTGCTCTC CACCTTGGTA 1860
TGAGAATCGC TATGGTCTAG CTCCGGCAGA CTACTCCATC CAAGGTGATC CCGCAGGGCT 1920
TGCCCGCATT GACAAGCTTT TCGGCATCGA CCTTTACACG TCTGTTTTCC ATCAGTCGCC 1980
TGTTGTGTTC GGCGCTTTTC CGTCGCTGCA TGCTGCCGAC TCAACCCTGG CCGCACTTTT 2040
CATGAGTCAT GTTTTCCCCC GCATGAAGCC CGTCTTCGTG ACCTATACTC TATGGATGTG 2100
GTGGGCAACA ATGTACCTCT CACATCACTA TGCGGTCGAT TTGGTTGCGG GTGGTCTCCT 2160
GGCCGCCATT GCTTTCTACT TCGCCAAGAC CCGATTCCTT CCCCGTGTCC AGCTCGACAA 2220
GACCTTCCGT TGGGACTACG ACTATGTGGA ATTCGGCGAG TCTGCCCTGG AGTATGGGTA 2280
TGGTGCAGCT GGCTATGATG GAGACTTCAA TCTCGACAGC GATGAATGGA CTGTTGGTTC 2340
TTCATCCTCC GTCTCCTCAG GCTCCTTGAG TCCCGTTGAC GATCATTACT CATGGGAAAC 2400
CGAGGCACTG ACCTCCCCAC ATACTGATAT TGAGTCCGGC AGGCATACTT TCAGCCCTTG 2460
AGTAGCCACA AACCAAACTC GATACCTGCA TATAGCGATC TCGCTCCTCC TCCACTGCAT 2520
CTATTTACGA GACGGCGTTA GAACATTTCA CGACATTCTG GCTTTATTGC ATCGAGCACA 2580
TTTCGACACA TATATCTTTA ATACCCTTTC TTCGGTGTCC CAGATCATCG GTTCGACCTT 2640
AATGTACCTC GGTCCGAATC CGCCTGGGAT ACTGTTTCTC TTTCCGCCGC ACTTCACTGT 2700
ACATTGCTTG ACATTGCGAA ACCGGGTTGG GCTCGAACGT GGGATGGGTT ATCGCTCATC 2760
GCTACACGCC GTTGCTCCAT CATAATGTTA ATGGACACAA TGGGGCTACG CATCCTGGTG 2820
TTTAGTCCTG GAAGACCATC CGATAACCCC CGTCGGTAAC ACTCGCTTGT CTCGTGTCCA 2880
CCCAGACACT ACTTCAATTC TCACTTCTAT CGTCCGCTAT TACCTTGACC TGGTCGAACC 2940
CATCCTTATT ATTCGTTTCG ACTATGCTAT ATATTTATTT TTACCATTCG TGTCGATCGC 3000
TCATACTCTT GGCGCTTGGG ACTGGAAGCA TTTATATTGG AAAAAATCAC GGAATGGGGC 3060
GCCTTTTCTT CTTGCACTTC ACTCGCTGTG CATAGACGGT TTTACATTTC TGCTTTGCAA 3120
TGCATCACGA ACTCTGCATT AGCATATAGA AAGAGGGGAA GGATGGACCT TCTTCTTGAT 3180
TGCTCGCATG GTTTATCCAT TCGCTCAAAG TGGATTACGT CCACATATTA CCCGGGGGCT 3240
ATACACATGG CTACTGTGTT GCTTTCTGAC ATTCGCCGGA CGTGCAAGGT TGGGAGGAGA 3300
GTCTGACGCT GACGGGGCTT GTTGAAGGAT GTTCACGCGT CCCGATTTGA CCCGGCTTCG 3360
ACTAACCTCA GATTCTCGAC TTGTTGGACG GTGACTTGAC TTGCTTGCTA TGGTCTGACG 3420
CTCTCACACC TACCTATCAC ATCCTCCTCA CCTCACAAAT TCCGCTCATG GACACTATCC 3480
TCTTCTTTTC GTTTCCCTTG GATAGTGTGT GTGTGTGTGT GGTTGGGGCA AATTATCCAT 3540
AGCAGCAGTA TTATTAGTTA TAATCCGGTA GTGTTATGAT TTATGAAGGC AACTTGTATA 3600
CTATTGCCAC TTTGTCCATA TCTCTTGCTT GTAATAGAAC TGACATCGCG ACGCTTCGGC 3660
CACGATGCAT ATAAAAACTC TAGTCAACAC GATATTAACA AGCGAAACCA TTACGCTGTA 3720
AACTATTCAG GATCGCCGCG GGCCCATCTG GGACTTGACT GTACTAAATA TGTCCTAAAG 3780
CAAGCAGACT AAATATTTAA CGTGGGATAT TATTCATATA CGCATATGTA TACATAGTCA 3840
TAACAAGCCA AGGGGTGGGT AGGGGTGGGT AATTATTATT TTTTTTCGTC GATACAAGTA 3900
TCCATCCTTA AATGTCCGTG GTCTACTCTT CATAAATCTT AACCCGCTCC GCATACTCCT 3960
TTATCCTCGA GACAAAAGTG TCTTCAATTT CATCGCCACG GCCACCAGCA ACGCGGAGGA 4020
TAAGGTCGTT GAGAGAGGCG CGGCCGAGAA TGTCGACATG GTCGCCTTCA TATTGTTAGC 4080
ATGCGACGTC AGACTGGAAC CAGGAAGGGA AAGGAGAGAG GTACCTGTAT TTGGACCACC 4140
【0040】
配列番号:2
配列の長さ:439
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Met Asn Gln Thr Leu Pro Thr Trp Lys Asp Arg Thr Gln Asn Gln
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Gln Ile Gln Val Pro Trp Arg Ser Ile Gln Leu
20 25 30
Leu Val Pro His Arg Met Arg Arg Lys Leu Arg Ser Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Arg Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr Ser
50 55 60
Leu Ser Pro Ala Asp Thr Leu Arg Ser Leu Gln Ser His Arg Trp
65 70 75
Thr Val Tyr Asp Phe Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Val Gly Ile
80 85 90
Phe Ser Leu Thr Val Ile Glu Ser Pro Gly Pro Leu Gly Lys Thr
95 100 105
Ala Ile Phe Ser Met Leu Leu Phe Ser Leu Leu Ile Pro Met Thr
110 115 120
Arg Gln Phe Phe Leu Pro Phe Leu Pro Ile Ala Gly Trp Leu Leu
125 130 135
Phe Phe Tyr Ala Cys Gln Phe Ile Pro Ser Asp Trp Arg Pro Ala
140 145 150
Ile Trp Val Arg Val Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly
155 160 165
Ala Asn Ile Ser Asn Ile Leu Ser Ala His Gln Asn Val Val Leu
170 175 180
Asp Val Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Cys His Tyr Gly Ala
185 190 195
Pro Phe Val Cys Ser Leu Ile Met Phe Ile Phe Gly Pro Pro Gly
200 205 210
Thr Val Pro Leu Phe Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Ile Ser Met Thr
215 220 225
Ala Val Thr Ile Gln Leu Phe Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr
230 235 240
Glu Asn Arg Tyr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Ser Ile Gln Gly
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Ala Arg Ile Asp Lys Leu Phe Gly Ile Asp
260 265 270
Leu Tyr Thr Ser Val Phe His Gln Ser Pro Val Val Phe Gly Ala
275 280 285
Phe Pro Ser Leu His Ala Ala Asp Ser Thr Leu Ala Ala Leu Phe
290 295 300
Met Ser His Val Phe Pro Arg Met Lys Pro Val Phe Val Thr Tyr
305 310 315
Thr Leu Trp Met Trp Trp Ala Thr Met Tyr Leu Ser His His Tyr
320 325 330
Ala Val Asp Leu Val Ala Gly Gly Leu Leu Ala Ala Ile Ala Phe
335 340 345
Tyr Phe Ala Lys Thr Arg Phe Leu Pro Arg Val Gln Leu Asp Lys
350 355 360
Thr Phe Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Val Glu Phe Gly Glu Ser Ala
365 370 375
Leu Glu Tyr Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Asn
380 385 390
Leu Asp Ser Asp Glu Trp Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser
395 400 405
Ser Gly Ser Leu Ser Pro Val Asp Asp His Tyr Ser Trp Glu Thr
410 415 420
Glu Ala Leu Thr Ser Pro His Thr Asp Ile Glu Ser Gly Arg His
425 430 435
Thr Phe Ser Pro
【0041】
配列番号:3
配列の長さ:2856
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列:
GGTTTATACT CCGGCTCCGT GGCCATCTGC CTCCCTCACG ACCTCCTCGT TCCAGGTTTT 60
CCTCTCGACT GCTGCGCCCT TGCACTTCGC CTTGCATCAG TGAAACCCCC TGCAACGTGA 120
CGGCTCAAAG ACATCCTCGT TTGGCCGCTG GAGACCGGAG CGTGCGCTTC GTTTCGTCTT 180
CTTCGAACCG ATCTCAATTT CCCCGCTCGG GTTGACGCCG TCAGCACCCT GCTCGTTGCC 240
TAACGGCTTG TTATTCAAGA CCCCTTTTCT GCCGCTTCCG CGACCGATTT ATTCGTCGCC 300
TTCCAACTCT TGTACAATCG GGGGGAAAGA AAGCAGACGG AGTTCGATCT GGAGGAATTA 360
TAGCTGAGTC TTGCCCGCAA GACTCGCCGC AACCATGAAT CAAACACTTC CCACGTGGAA 420
GGACCGCACG CAGAACCAGT TTGGAAAGCT TCAGATCCAG GTTCCATGGC GGTCCATCCA 480
ACTGCTCGTC CCGCATCGCA TGCGGCGGAA GTTAAGGTCC AAATTGCGCA GTAGAGCGTC 540
TCCTACCTCG TCAATAGCCT CTTTACAGAC GTCGTTATCG CCTGCAGACA CACTACGATC 600
GCTCCAAAGC CACCGATGGA CGGTTTACGA CTTCCAATAT CTGCTTCTGT TGATCGTGGG 660
CATCTTCTCT TTGACCGTTA TCGAGTCGCC CGGGCCTTTG GGCAAAACGG CCATTTTCTC 720
CATGCTCCTA TTCTCTCTCC TGATCCCTAT GACCCGCCAG TTCTTCCTCC CGTTTCTGCC 780
GATTGCCGGA TGGCTTCTGT TTTTCTACGC CTGCCAGTTC ATCCCAAGCG ATTGGCGCCC 840
TGCGATTTGG GTTCGTGTCT TGCCTGCACT GGAGAATATT CTCTACGGCG CAAACATCAG 900
CAACATCCTA TCCGCTCACC AGAACGTTGT GCTTGACGTG CTGGCGTGGC TACCCTACGG 960
TATCTGCCAC TATGGCGCTC CGTTTGTGTG CTCGTTGATC ATGTTCATCT TCGGTCCGCC 1020
CGGCACTGTT CCCCTTTTCG CGCGCACTTT CGGCTATATC AGTATGACTG CGGTTACTAT 1080
TCAGCTGTTT TTCCCTTGCT CTCCACCTTG GTATGAGAAT CGCTATGGTC TAGCTCCGGC 1140
AGACTACTCC ATCCAAGGTG ATCCCGCAGG GCTTGCCCGC ATTGACAAGC TTTTCGGCAT 1200
CGACCTTTAC ACGTCTGGTT TCCATCAGTC GCCTGTTGTG TTCGGCGCTT TTCCGTCGCT 1260
GCATGCTGCC GACTCAACCC TGGCCGCACT TTTCATGAGT CATGTTTTCC CCCGCATGAA 1320
GCCCGTCTTC GTGACCTATA CTCTATGGAT GTGGTGGGCA ACAATGTACC TCTCACATCA 1380
CTATGCGGTC GATTTGGTTG CGGGTGGTCT CCTGGCCGCC ATTGCTTTCT ACTTCGCCAA 1440
GACCCGATTC CTTCCCCGTG TCCAGCTCGA CAAGACCTTC CGTTGGGACT ACGACTATGT 1500
GGAATTCGGC GAGTCTGCCC TGGAGTATGG GTATGGTGCA GCTGGCTATG ATGGAGACTT 1560
CAATCTCGAC AGCGATGAAT GGACTGTTGG TTCTTCATCC TCCGTCTCCT CAGGCTCCTT 1620
GAGTCCCGTT GACGATCATT ACTCATGGGA AACCGAGGCA CTGACCTCCC CACATACTGA 1680
TATTGAGTCC GGCAGGCATA CTTTCAGCCC TTGAGTAGCC ACAAACCAAA CTCGATACCT 1740
GCATATAGCG ATCTCGCTCC TCCTCCACTG CATCTATTTA CGAGACGGCG TTAGAACATT 1800
TCACGACATT CTGGCTTTAT TGCATCGAGC ACATTTCGAC ACATATATCT TTAATACCCT 1860
TTCTTCGGTG TCCCAGATCA TCGGTTCGAC CTTAATGTAC CTCGGTCCGA ATCCGCCTGG 1920
GATACTGTTT CTCTTTCCGC CGCACTTCAC TGTACATTGC TTGACATTGC GAAACCGGGT 1980
TGGGCTCGAA CGTGGGATGG GTTATCGCTC ATCGCTACAC GCCGTTGCTC CATCATAATG 2040
TTAATGGACA CAATGGGGCT ACGCATCCTG GTGTTTAGTC CTGGAAGACC ATCCGATAAC 2100
CCCCGTCGGT AACACTCGCT TGTCTCGTGT CCACCCAGAC ACTACTTCAA TTCTCACTTC 2160
TATCGTCCGC TATTACCTTG ACCTGGTCGA ACCCATCCTT ATTATTCGTT TCGACTATGC 2220
TATATATTTA TTTTTACCAT TCGTGTCGAT CGCTCATACT CTTGGCGCTT GGGACTGGAA 2280
GCATTTATAT TGGAAAAAAT CACGGAATGG GGCGCCTTTT CTTCTTGCAC TTCACTCGCT 2340
GTGCATAGAC GGTTTTACAT TTCTGCTTTG CAATGCATCA CGAACTCTGC ATTAGCATAT 2400
AGAAAGAGGG GAAGGATGGA CCTTCTTCTT GATTGCTCGC ATGGTTTATC CATTCGCTCA 2460
AAGTGGATTA CGTCCACATA TTACCCGGGG GCTATACACA TGGCTACTGT GTTGCTTTCT 2520
GACATTCGCC GGACGTGCAA GGTTGGGAGG AGAGTCTGAC GCTGACGGGG CTTGTTGAAG 2580
GATGTTCACG CGTCCCGATT TGACCCGGCT TCGACTAACC TCAGATTCTC GACTTGTTGG 2640
ACGGTGACTT GACTTGCTTG CTATGGTCTG ACGCTCTCAC ACCTACCTAT CACATCCTCC 2700
TCACCTCACA AATTCCGCTC ATGGACACTA TCCTCTTCTT TTCGTTTCCC TTGGATAGTG 2760
TGTGTGTGTG TGTGGTTGGG GCAAATTATC CATAGCAGCA GTATTATTAG TTATAATCCG 2820
GTAGTGTTAT GATTTATGAA GGCAACTTGT ATACTA 2856
【0042】
配列番号:4
配列の長さ:439
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Met Asn Gln Thr Leu Pro Thr Trp Lys Asp Arg Thr Gln Asn Gln
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Gln Ile Gln Val Pro Trp Arg Ser Ile Gln Leu
20 25 30
Leu Val Pro His Arg Met Arg Arg Lys Leu Arg Ser Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Arg Ala Ser Pro Thr Ser Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr Ser
50 55 60
Leu Ser Pro Ala Asp Thr Leu Arg Ser Leu Gln Ser His Arg Trp
65 70 75
Thr Val Tyr Asp Phe Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Val Gly Ile
80 85 90
Phe Ser Leu Thr Val Ile Glu Ser Pro Gly Pro Leu Gly Lys Thr
95 100 105
Ala Ile Phe Ser Met Leu Leu Phe Ser Leu Leu Ile Pro Met Thr
110 115 120
Arg Gln Phe Phe Leu Pro Phe Leu Pro Ile Ala Gly Trp Leu Leu
125 130 135
Phe Phe Tyr Ala Cys Gln Phe Ile Pro Ser Asp Trp Arg Pro Ala
140 145 150
Ile Trp Val Arg Val Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly
155 160 165
Ala Asn Ile Ser Asn Ile Leu Ser Ala His Gln Asn Val Val Leu
170 175 180
Asp Val Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Cys His Tyr Gly Ala
185 190 195
Pro Phe Val Cys Ser Leu Ile Met Phe Ile Phe Gly Pro Pro Gly
200 205 210
Thr Val Pro Leu Phe Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Ile Ser Met Thr
215 220 225
Ala Val Thr Ile Gln Leu Phe Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr
230 235 240
Glu Asn Arg Tyr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Ser Ile Gln Gly
245 250 255
Asp Pro Ala Gly Leu Ala Arg Ile Asp Lys Leu Phe Gly Ile Asp
260 265 270
Leu Tyr Thr Ser Gly Phe His Gln Ser Pro Val Val Phe Gly Ala
275 280 285
Phe Pro Ser Leu His Ala Ala Asp Ser Thr Leu Ala Ala Leu Phe
290 295 300
Met Ser His Val Phe Pro Arg Met Lys Pro Val Phe Val Thr Tyr
305 310 315
Thr Leu Trp Met Trp Trp Ala Thr Met Tyr Leu Ser His His Tyr
320 325 330
Ala Val Asp Leu Val Ala Gly Gly Leu Leu Ala Ala Ile Ala Phe
335 340 345
Tyr Phe Ala Lys Thr Arg Phe Leu Pro Arg Val Gln Leu Asp Lys
350 355 360
Thr Phe Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Val Glu Phe Gly Glu Ser Ala
365 370 375
Leu Glu Tyr Gly Tyr Gly Ala Ala Gly Tyr Asp Gly Asp Phe Asn
380 385 390
Leu Asp Ser Asp Glu Trp Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Val Ser
395 400 405
Ser Gly Ser Leu Ser Pro Val Asp Asp His Tyr Ser Trp Glu Thr
410 415 420
Glu Ala Leu Thr Ser Pro His Thr Asp Ile Glu Ser Gly Arg His
425 430 435
Thr Phe Ser Pro
【0043】
配列番号:5
配列の長さ:436
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Met Asn Thr Thr Leu Pro Ser Trp Lys Asp Arg Thr Gln Asn Gln
1 5 10 15
Phe Gly Lys Leu Gln Ile Gln Val Pro Trp Arg Thr Ile Gln Leu
20 25 30
Leu Val Pro His Arg Met Arg Arg Lys Ile Arg Ser Lys Leu Arg
35 40 45
Ser Arg Ile Ser Pro Thr Ser Ser Ile Ser Ser Leu Gln Thr Ser
50 55 60
Phe Ser Pro Val Asp Thr Leu Arg Ser Leu Gln Ser His Arg Trp
65 70 75
Thr Leu Tyr Asp Phe Gln Tyr Leu Leu Leu Leu Ile Val Gly Ile
80 85 90
Phe Ser Leu Ser Val Met Glu Ser Pro Gly Pro Leu Ala Lys Thr
95 100 105
Ala Ala Phe Thr Leu Leu Leu Val Ser Leu Leu Leu Pro Ile Thr
110 115 120
Arg Gln Phe Phe Leu Pro Phe Leu Pro Ile Ala Gly Trp Leu Ile
125 130 135
Phe Phe Tyr Ala Cys Gln Phe Ile Pro Ser Asp Trp Arg Pro Ala
140 145 150
Ile Trp Val Arg Val Leu Pro Ala Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly
155 160 165
Ala Asn Ile Ser Asn Ile Leu Ser Ala His Gln Asn Val Val Leu
170 175 180
Asp Val Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Ile Cys His Tyr Gly Ala
185 190 195
Pro Phe Val Cys Ser Ala Ile Met Phe Ile Phe Gly Pro Pro Gly
200 205 210
Thr Val Pro Leu Phe Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Ile Ser Met Ala
215 220 225
Ala Val Thr Ile Gln Leu Phe Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr
230 235 240
Glu Asn Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Ala Asp Tyr Ser Met Pro Gly
245 250 255
Asn Pro Ala Gly Leu Ala Arg Ile Asp Glu Leu Phe Gly Ile Asp
260 265 270
Leu Tyr Thr Ser Gly Phe Arg Gln Ser Pro Val Val Phe Gly Ala
275 280 285
Phe Pro Ser Leu His Ala Ala Asp Ser Thr Leu Ala Ala Leu Phe
290 295 300
Met Ser Gln Val Phe Pro Arg Leu Lys Pro Leu Phe Val Ile Tyr
305 310 315
Thr Leu Trp Met Trp Trp Ala Thr Met Tyr Leu Ser His His Tyr
320 325 330
Ala Val Asp Leu Val Gly Gly Gly Leu Leu Ala Thr Val Ala Phe
335 340 345
Tyr Phe Ala Lys Thr Arg Phe Met Pro Arg Val Gln Asn Asp Lys
350 355 360
Met Phe Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Val Glu Tyr Gly Asp Ser Ala
365 370 375
Leu Asp Tyr Gly Tyr Gly Pro Ala Ser Phe Glu Gly Glu Phe Asn
380 385 390
Leu Asp Ser Asp Glu Trp Thr Val Gly Ser Ser Ser Ser Ile Ser
395 400 405
Ser Gly Ser Leu Ser Pro Val Asp Asp His Tyr Ser Trp Glu Gly
410 415 420
Glu Thr Leu Ala Ser Pro Ala Thr Asp Ile Glu Ser Gly Arg His
425 430 435
Phe
【0044】
配列番号:6
配列の長さ:401
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro
1 5 10 15
Asn Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln
20 25 30
Thr Leu Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp
35 40 45
Val His Tyr Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile
50 55 60
Thr Asn Pro Ala Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe
65 70 75
Leu Gly Thr Leu Phe Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe
80 85 90
Asn Ala Leu Pro Ile Leu Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser
95 100 105
Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val
110 115 120
Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp
125 130 135
Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Phe Gly Ala Pro Phe Val Val Ala
155 160 165
Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val Leu Gln Gly Tyr
170 175 180
Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Ile Met Gln
185 190 195
Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu Tyr Gly
200 205 210
Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ser Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe
260 265 270
Pro Lys Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp
275 280 285
Trp Ser Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met
290 295 300
Ala Gly Ser Val Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr
305 310 315
Thr His Leu Pro Ile Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser
320 325 330
Tyr Thr Ser Ile Glu Lys Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu
335 340 345
Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu
350 355 360
Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser
365 370 375
Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser Val Ser Arg Ser Ser Ala
380 385 390
Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg Ala
395 400
【0045】
配列番号:7
配列の長さ:422
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Met Ser Ala Leu Ser Thr Leu Lys Lys Arg Leu Ala Ala Cys Asn
1 5 10 15
Arg Ala Ser Gln Tyr Lys Leu Glu Thr Ser Leu Asn Pro Met Pro
20 25 30
Thr Phe Arg Leu Leu Arg Asn Thr Lys Trp Ser Trp Thr His Leu
35 40 45
Gln Tyr Val Phe Leu Ala Gly Asn Leu Ile Phe Ala Cys Ile Val
50 55 60
Ile Glu Ser Pro Gly Phe Trp Gly Lys Phe Gly Ile Ala Cys Leu
65 70 75
Leu Ala Ile Ala Leu Thr Val Pro Leu Thr Arg Gln Ile Phe Phe
80 85 90
Pro Ala Ile Val Ile Ile Thr Trp Ala Ile Leu Phe Tyr Ser Cys
95 100 105
Arg Phe Ile Pro Glu Arg Trp Arg Pro Pro Ile Trp Val Arg Val
110 115 120
Leu Pro Thr Leu Glu Asn Ile Leu Tyr Gly Ser Asn Leu Ser Ser
125 130 135
Leu Leu Ser Lys Thr Thr His Ser Ile Leu Asp Ile Leu Ala Trp
140 145 150
Val Pro Tyr Gly Val Met His Tyr Ser Ala Pro Phe Ile Ile Ser
155 160 165
Phe Ile Leu Phe Ile Phe Ala Pro Pro Gly Thr Leu Pro Val Trp
170 175 180
Ala Arg Thr Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val Leu Ile Gln
185 190 195
Met Ala Phe Pro Cys Ser Pro Pro Trp Tyr Glu Asn Met Tyr Gly
200 205 210
Leu Glu Pro Ala Thr Tyr Ala Val Arg Gly Ser Pro Gly Gly Leu
215 220 225
Ala Arg Ile Asp Ala Leu Phe Gly Thr Ser Ile Tyr Thr Asp Gly
230 235 240
Phe Ser Asn Ser Pro Val Val Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
245 250 255
Ala Gly Trp Ala Met Leu Glu Ala Leu Phe Leu Ser His Val Phe
260 265 270
Pro Arg Tyr Arg Phe Cys Phe Tyr Gly Tyr Val Leu Trp Leu Cys
275 280 285
Trp Cys Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Val
290 295 300
Gly Gly Met Cys Leu Ala Ile Ile Cys Phe Val Phe Ala Gln Lys
305 310 315
Leu Arg Leu Pro Gln Leu Gln Thr Gly Lys Ile Leu Arg Trp Glu
320 325 330
Tyr Glu Phe Val Ile His Gly His Gly Leu Ser Glu Lys Thr Ser
335 340 345
Asn Ser Leu Ala Arg Thr Gly Ser Pro Tyr Leu Leu Gly Arg Asp
350 355 360
Ser Phe Thr Gln Asn Pro Asn Ala Val Ala Phe Met Ser Gly Leu
365 370 375
Asn Asn Met Glu Leu Ala Asn Thr Asp His Glu Trp Ser Val Gly
380 385 390
Ser Ser Ser Pro Glu Pro Leu Pro Ser Pro Ala Ala Asp Leu Ile
395 400 405
Asp Arg Pro Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ile Phe Asp Ala Ser His
410 415 420
Leu Pro
【0046】
配列番号:8
配列の長さ:471
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Met Ala Ser Ser Ile Leu Arg Ser Lys Ile Ile Gln Lys Pro Tyr
1 5 10 15
Gln Leu Phe His Tyr Tyr Phe Leu Ser Glu Lys Ala Pro Gly Ser
20 25 30
Thr Val Ser Asp Leu Asn Phe Asp Thr Asn Ile Gln Thr Ser Leu
35 40 45
Arg Lys Leu Lys His His His Trp Thr Val Gly Glu Ile Phe His
50 55 60
Tyr Gly Phe Leu Val Ser Ile Leu Phe Phe Val Phe Val Val Phe
65 70 75
Pro Ala Ser Phe Phe Ile Lys Leu Pro Ile Ile Leu Ala Phe Ala
80 85 90
Thr Cys Phe Leu Ile Pro Leu Thr Ser Gln Phe Phe Leu Pro Ala
95 100 105
Leu Pro Val Phe Thr Trp Leu Ala Leu Tyr Phe Thr Cys Ala Lys
110 115 120
Ile Pro Gln Glu Trp Lys Pro Ala Ile Thr Val Lys Val Leu Pro
125 130 135
Ala Met Glu Thr Ile Leu Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asn Val Leu
140 145 150
Ala Thr Ile Thr Thr Gly Val Leu Asp Ile Leu Ala Trp Leu Pro
155 160 165
Tyr Gly Ile Ile His Phe Ser Phe Pro Phe Val Leu Ala Ala Ile
170 175 180
Ile Phe Leu Phe Gly Pro Pro Thr Ala Leu Arg Ser Phe Gly Phe
185 190 195
Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Leu Gly Val Leu Ile Gln Met Ala
200 205 210
Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Asn Leu His Gly Leu Glu
215 220 225
Pro Ala Asn Tyr Ser Met His Gly Ser Pro Gly Gly Leu Gly Arg
230 235 240
Ile Asp Lys Leu Leu Gly Val Asp Met Tyr Thr Thr Gly Phe Ser
245 250 255
Asn Ser Ser Ile Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His Ser Gly
260 265 270
Cys Cys Ile Met Glu Val Leu Phe Leu Cys Trp Leu Phe Pro Arg
275 280 285
Phe Lys Phe Val Trp Val Thr Tyr Ala Ser Trp Leu Trp Trp Ser
290 295 300
Thr Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Ile Gly Gly
305 310 315
Ala Met Leu Ser Leu Thr Val Phe Glu Phe Thr Lys Tyr Lys Tyr
320 325 330
Leu Pro Lys Asn Lys Glu Gly Leu Phe Cys Arg Trp Ser Tyr Thr
335 340 345
Glu Ile Glu Lys Ile Asp Ile Gln Glu Ile Asp Pro Leu Ser Tyr
350 355 360
Asn Tyr Ile Pro Val Asn Ser Asn Asp Asn Glu Ser Arg Leu Tyr
365 370 375
Thr Arg Val Tyr Gln Glu Ser Gln Val Ser Pro Pro Gln Arg Ala
380 385 390
Glu Thr Pro Glu Ala Phe Glu Met Ser Asn Phe Ser Arg Ser Arg
395 400 405
Gln Ser Ser Lys Thr Gln Val Pro Leu Ser Asn Leu Thr Asn Asn
410 415 420
Asp Gln Val Ser Gly Ile Asn Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly
425 430 435
Asp Glu Ile Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Phe Glu Asp Glu Pro
440 445 450
Gln Gly Ser Thr Tyr Ala Ala Ser Ser Ala Thr Ser Val Asp Asp
455 460 465
Leu Asp Ser Lys Arg Asn
470
【0047】
配列番号:9
配列の長さ:10
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列の特徴:3番目のXaa は、Val 又はIle である。
7番目のXaa は、Leu 又はVal である。
配列:
Leu Asp Xaa Leu Ala Trp Xaa Pro Tyr Gly
1 5 10
【0048】
配列番号:10
配列の長さ:8
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列:
Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His
1 5
【0049】
配列番号:11
配列の長さ:12
配列の型:アミノ酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列の特徴:5番目のXaa は、Ser 又はThr である。
9番目のXaa は、Ala 又はPhe である。
配列:
Thr Met Tyr Leu Xaa His His Tyr Xaa Val Asp Leu
1 5 10
【0050】
配列番号:12
配列の長さ:2935
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
配列:
ATTTTCTTCC CCATAACAAC TCTTCTCGCC CTTCCTCCGG CTCCGTGGCC AAATTGTTTT 60
ATGCAGCGCC TCCTAGCGAT TTAACCTCGT TCTCGTTGCC CTTGCCTGTC CGCCTTGCGT 120
CAGTACGACC CTTGCAACGT GACCTTCCCC AGAGTATCCT CGTTTGGCCG CTGGAGACCG 180
GAGCTTGCAC CCTCATAAAC TAGCTCTTCG AAATCAATTC TCCGTTCTCC AGAGATTATC 240
GGATCGAATC TCTCCGCTGT CGACACCTTT CGTCTCTCGG TGATCCTCGC CCTTGGAGTC 300
TCGTCACGTT GACGCCTTGA ACCCCTGGCC GCCAACTCCA CATAGGAGAC CACACTTCAT 360
TCTTCCCCCG CCATAATTGC AGCACCCTCC GTCTCCCTTC GAGCTCCTCC TGGATCATCA 420
AGTCCGAAAG GATTAGACTC GTCGCAGCGA TGAATACCAC CCTTCCATCC TGGAAGGATC 480
GGACGCAAAA CCAGTTCGGC AAGCTCCAGA TCCAAGTCCC ATGGCGCACC ATACAACTTC 540
TCGTGCCGCA CCGTATGCGA CGGAAGATTC GGTCCAAGCT GCGCAGTCGG ATCTCGCCTA 600
CCTCATCGAT ATCCTCGTTG CAGACGTCAT TCTCACCTGT CGATACACTC AGGTCGCTGC 660
AAAGTCATAG ATGGACGCTC TATGACTTTC AGTATCTTTT GCTGCTGATT GTCGGCATAT 720
TCTCGCTGAG CGTTATGGAA TCACCTGGAC CATTGGCAAA GACCGCCGCG TTTACGCTAC 780
TTCTCGTCTC TCTCCTTCTC CCGATTACGC GCCAGTTCTT CTTGCCATTC CTCCCGATTG 840
CAGGATGGCT TATATTTTTC TACGCTTGCC AGTTCATCCC GAGCGACTGG CGCCCTGCAA 900
TCTGGGTTCG CGTGCTGCCG GCTCTGGAAA ACATTCTCTA CGGTGCTAAT ATCAGTAACA 960
TCCTTTCCGC TCACCAAAAT GTGGTGCTTG ACGTTTTGGC GTGGCTTCCC TACGGAATCT 1020
GCCATTATGG CGCGCCATTT GTGTGCTCAG CGATCATGTT CATCTTTGGT CCTCCCGGCA 1080
CCGTCCCCCT TTTCGCTCGA ACTTTTGGAT ACATCAGCAT GGCTGCAGTC ACCATTCAGC 1140
TGTTTTTCCC CTGCTCTCCT CCGTGGTACG AAAATCTGTA TGGTTTGGCT CCGGCTGATT 1200
ACTCCATGCC GGGTAATCCT GCGGGCCTTG CTCGCATCGA TGAGCTTTTT GGGATAGACT 1260
TGTACACATC GGGCTTCAGA CAATCTCCCG TCGTGTTTGG CGCATTTCCT TCCCTACATG 1320
CCGCTGATTC GACACTTGCA GCTCTATTTA TGAGCCAAGT GTTCCCACGG TTGAAGCCCT 1380
TGTTTGTCAT CTATACTCTC TGGATGTGGT GGGCTACAAT GTATCTTTCG CACCACTACG 1440
CTGTTGATCT GGTCGGTGGT GGCCTCTTGG CAACTGTCGC GTTCTACTTT GCTAAAACGC 1500
GGTTCATGCC TCGCGTCCAG AATGATAAGA TGTTCCGCTG GGACTACGAT TATGTTGAGT 1560
ACGGCGATTC CGCACTCGAC TATGGGTACG GTCCAGCCAG CTTCGAAGGC GAATTCAACC 1620
TTGATAGCGA TGAGTGGACC GTTGGTTCTT CGTCATCCAT TTCGTCCGGC TCCCTCAGTC 1680
CAGTTGACGA CCACTACTCT TGGGAGGGCG AGACTCTTGC CTCTCCTGCC ACCGACATCG 1740
AGTCTGGAAG GCATTTCTGA TCCTGCTCAA TGAGCCTTGA TACGTACTAC ACTGTGTACG 1800
TGCTACTGCA TTGACTAATG AGACGGCGTT TTCAAACAAA TTTTAACGAC ATGCTTGGTT 1860
ATCGCATTGA GCTGATTTCG ACACATATAT ATGTTTAATA CGTTTTGGGG ACACTCCAGG 1920
GATTCATGAC GGTTGCTTCA TATCCCGACC TGGGGATGGA TTGACCTGGT TGTGCCCAAT 1980
TTTCTTCTGC CTAACGTTTT GATTATACAT GCATTTTTCA CGAAACCAGC CGGCCCGCCA 2040
TGATCGTGAC CTCAATTTGA GCTCGAATCT TCCTGGGGCC TCCAGCGATA ATTCTTAATG 2100
CTCGTTCCGA GGGTGCCACA TCGGACATTC GCTTGTACAA CTTTTGCAGA ACGAACATTT 2160
TCACCGATTC CAACTTGAGT CATTCGCTTA CTACTTTCAA CTGGTCGAGA AACTTCGCTT 2220
CTTTTCAGCT CGGCTAGGTG CATAAATATT TTACATTCGT GTCGATCGCT CACATTTCAC 2280
GGCGCCTGGA AACTTGGGGG TTTCGATTTC ATTGGAAAGG ATAAACAACA TGGGCTGGGC 2340
GCCTTTTACA CGCACTACAT TCGCTTAGAA AAGTTCTGAT GCTTTTAATG ATTCTTGCAT 2400
TGGCATATAG AAAGGGGTCC TCCAGACTCG CTACTGTGGT CCTCTCTCAA CCCCACACTC 2460
GCTTGCTTTT AACAGTGGAC ACCCCGTGGA GCTACGTCTC CATCAAATAT TTGGCATCAA 2520
CCGGAATCGA TGCCAGGAGG ACTGAGCTTA CTCACGGTGA CCGTCGGGTA AAAGGCGTTC 2580
ATACAGAACA TCTCCTCTAT CCTCCTGTCC CATCTCGATT CTCTGGCTGC TGGACGCAAC 2640
ACACCTCGCT GCACGTTTTC GACTTCCTAA TACGACCTAA TATCATTCTC GGTTTTCTTT 2700
GCTCTGGCTC GCGGCCGCCA TTTATATGGC GTGTCGGCTC GAGTCTGAAG TGAACTTTTT 2760
TCTCCTTTCT GGCCTCCACA ACTTTCCGAT CCCTAGCAGC TTCCCGTGCA CAGCGAGGTG 2820
TTGTTGGATG ATTGTTCCAT AGCATTATCA TTATTCCTAA TCCGGTAGCG TTATGATTTA 2880
TGAAGAACAG TGATGTACAT TATTATGCGG TGATCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2935
【0051】
配列番号:13
配列の長さ:2856
配列の型:核酸
鎖の数:2本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:Genomic DNA
アンチセンス:YES
配列:
TAGTATACAA GTTGCCTTCA TAAATCATAA CACTACCGGA TTATAACTAA TAATACTGCT 60
GCTATGGATA ATTTGCCCCA ACCACACACA CACACACACT ATCCAAGGGA AACGAAAAGA 120
AGAGGATAGT GTCCATGAGC GGAATTTGTG AGGTGAGGAG GATGTGATAG GTAGGTGTGA 180
GAGCGTCAGA CCATAGCAAG CAAGTCAAGT CACCGTCCAA CAAGTCGAGA ATCTGAGGTT 240
AGTCGAAGCC GGGTCAAATC GGGACGCGTG AACATCCTTC AACAAGCCCC GTCAGCGTCA 300
GACTCTCCTC CCAACCTTGC ACGTCCGGCG AATGTCAGAA AGCAACACAG TAGCCATGTG 360
TATAGCCCCC GGGTAATATG TGGACGTAAT CCACTTTGAG CGAATGGATA AACCATGCGA 420
GCAATCAAGA AGAAGGTCCA TCCTTCCCCT CTTTCTATAT GCTAATGCAG AGTTCGTGAT 480
GCATTGCAAA GCAGAAATGT AAAACCGTCT ATGCACAGCG AGTGAAGTGC AAGAAGAAAA 540
GGCGCCCCAT TCCGTGATTT TTTCCAATAT AAATGCTTCC AGTCCCAAGC GCCAAGAGTA 600
TGAGCGATCG ACACGAATGG TAAAAATAAA TATATAGCAT AGTCGAAACG AATAATAAGG 660
ATGGGTTCGA CCAGGTCAAG GTAATAGCGG ACGATAGAAG TGAGAATTGA AGTAGTGTCT 720
GGGTGGACAC GAGACAAGCG AGTGTTACCG ACGGGGGTTA TCGGATGGTC TTCCAGGACT 780
AAACACCAGG ATGCGTAGCC CCATTGTGTC CATTAACATT ATGATGGAGC AACGGCGTGT 840
AGCGATGAGC GATAACCCAT CCCACGTTCG AGCCCAACCC GGTTTCGCAA TGTCAAGCAA 900
TGTACAGTGA AGTGCGGCGG AAAGAGAAAC AGTATCCCAG GCGGATTCGG ACCGAGGTAC 960
ATTAAGGTCG AACCGATGAT CTGGGACACC GAAGAAAGGG TATTAAAGAT ATATGTGTCG 1020
AAATGTGCTC GATGCAATAA AGCCAGAATG TCGTGAAATG TTCTAACGCC GTCTCGTAAA 1080
TAGATGCAGT GGAGGAGGAG CGAGATCGCT ATATGCAGGT ATCGAGTTTG GTTTGTGGCT 1140
ACTCAAGGGC TGAAAGTATG CCTGCCGGAC TCAATATCAG TATGTGGGGA GGTCAGTGCC 1200
TCGGTTTCCC ATGAGTAATG ATCGTCAACG GGACTCAAGG AGCCTGAGGA GACGGAGGAT 1260
GAAGAACCAA CAGTCCATTC ATCGCTGTCG AGATTGAAGT CTCCATCATA GCCAGCTGCA 1320
CCATACCCAT ACTCCAGGGC AGACTCGCCG AATTCCACAT AGTCGTAGTC CCAACGGAAG 1380
GTCTTGTCGA GCTGGACACG GGGAAGGAAT CGGGTCTTGG CGAAGTAGAA AGCAATGGCG 1440
GCCAGGAGAC CACCCGCAAC CAAATCGACC GCATAGTGAT GTGAGAGGTA CATTGTTGCC 1500
CACCACATCC ATAGAGTATA GGTCACGAAG ACGGGCTTCA TGCGGGGGAA AACATGACTC 1560
ATGAAAAGTG CGGCCAGGGT TGAGTCGGCA GCATGCAGCG ACGGAAAAGC GCCGAACACA 1620
ACAGGCGACT GATGGAAAAC AGACGTGTAA AGGTCGATGC CGAAAAGCTT GTCAATGCGG 1680
GCAAGCCCTG CGGGATCACC TTGGATGGAG TAGTCTGCCG GAGCTAGACC ATAGCGATTC 1740
TCATACCAAG GTGGAGAGCA AGGGAAAAAC AGCTGAATAG TAACCGCAGT CATACTGATA 1800
TAGCCGAAAG TGCGCGCGAA AAGGGGAACA GTGCCGGGCG GACCGAAGAT GAACATGATC 1860
AACGAGCACA CAAACGGAGC GCCATAGTGG CAGATACCGT AGGGTAGCCA CGCCAGCACG 1920
TCAAGCACAA CGTTCTGGTG AGCGGATAGG ATGTTGCTGA TGTTTGCGCC GTAGAGAATA 1980
TTCTCCAGTG CAGGCAAGAC ACGAACCCAA ATCGCAGGGC GCCAATCGCT TGGGATGAAC 2040
TGGCAGGCGT AGAAAAACAG AAGCCATCCG GCAATCGGCA GAAACGGGAG GAAGAACTGG 2100
CGGGTCATAG GGATCAGGAG AGAGAATAGG AGCATGGAGA AAATGGCCGT TTTGCCCAAA 2160
GGCCCGGGCG ACTCGATAAC GGTCAAAGAG AAGATGCCCA CGATCAACAG AAGCAGATAT 2220
TGGAAGTCGT AAACCGTCCA TCGGTGGCTT TGGAGCGATC GTAGTGTGTC TGCAGGCGAT 2280
AACGACGTCT GTAAAGAGGC TATTGACGAG GTAGGAGACG CTCTACTGCG CAATTTGGAC 2340
CTTAACTTCC GCCGCATGCG ATGCGGGACG AGCAGTTGGA TGGACCGCCA TGGAACCTGG 2400
ATCTGAAGCT TTCCAAACTG GTTCTGCGTG CGGTCCTTCC ACGTGGGAAG TGTTTGATTC 2460
ATGGTTGCGG CGAGTCTTGC GGGCAAGACT CAGCTATAAT TCCTCCAGAT CGAACTCCGT 2520
CTGCTTTCTT TCCCCCCGAT TGTACAAGAG TTGGAAGGCG ACGAATAAAT CGGTCGCGGA 2580
AGCGGCAGAA AAGGGGTCTT GAATAACAAG CCGTTAGGCA ACGAGCAGGG TGCTGACGGC 2640
GTCAACCCGA GCGGGGAAAT TGAGATCGGT TCGAAGAAGA CGAAACGAAG CGCACGCTCC 2700
GGTCTCCAGC GGCCAAACGA GGATGTCTTT GAGCCGTCAC GTTGCAGGGG GTTTCACTGA 2760
TGCAAGGCGA AGTGCAAGGG CGCAGCAGTC GAGAGGAAAA CCTGGAACGA GGAGGTCGTG 2820
AGGGAGGCAG ATGGCCACGG AGCCGGAGTA TAAACC 2856
【0052】
配列番号:14
配列の長さ:2856
配列の型:核酸
鎖の数:1本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:mRNA
アンチセンス:YES
配列:
UAGUAUACAA GUUGCCUUCA UAAAUCAUAA CACUACCGGA UUAUAACUAA UAAUACUGCU 60
GCUAUGGAUA AUUUGCCCCA ACCACACACA CACACACACU AUCCAAGGGA AACGAAAAGA 120
AGAGGAUAGU GUCCAUGAGC GGAAUUUGUG AGGUGAGGAG GAUGUGAUAG GUAGGUGUGA 180
GAGCGUCAGA CCAUAGCAAG CAAGUCAAGU CACCGUCCAA CAAGUCGAGA AUCUGAGGUU 240
AGUCGAAGCC GGGUCAAAUC GGGACGCGUG AACAUCCUUC AACAAGCCCC GUCAGCGUCA 300
GACUCUCCUC CCAACCUUGC ACGUCCGGCG AAUGUCAGAA AGCAACACAG UAGCCAUGUG 360
UAUAGCCCCC GGGUAAUAUG UGGACGUAAU CCACUUUGAG CGAAUGGAUA AACCAUGCGA 420
GCAAUCAAGA AGAAGGUCCA UCCUUCCCCU CUUUCUAUAU GCUAAUGCAG AGUUCGUGAU 480
GCAUUGCAAA GCAGAAAUGU AAAACCGUCU AUGCACAGCG AGUGAAGUGC AAGAAGAAAA 540
GGCGCCCCAU UCCGUGAUUU UUUCCAAUAU AAAUGCUUCC AGUCCCAAGC GCCAAGAGUA 600
UGAGCGAUCG ACACGAAUGG UAAAAAUAAA UAUAUAGCAU AGUCGAAACG AAUAAUAAGG 660
AUGGGUUCGA CCAGGUCAAG GUAAUAGCGG ACGAUAGAAG UGAGAAUUGA AGUAGUGUCU 720
GGGUGGACAC GAGACAAGCG AGUGUUACCG ACGGGGGUUA UCGGAUGGUC UUCCAGGACU 780
AAACACCAGG AUGCGUAGCC CCAUUGUGUC CAUUAACAUU AUGAUGGAGC AACGGCGUGU 840
AGCGAUGAGC GAUAACCCAU CCCACGUUCG AGCCCAACCC GGUUUCGCAA UGUCAAGCAA 900
UGUACAGUGA AGUGCGGCGG AAAGAGAAAC AGUAUCCCAG GCGGAUUCGG ACCGAGGUAC 960
AUUAAGGUCG AACCGAUGAU CUGGGACACC GAAGAAAGGG UAUUAAAGAU AUAUGUGUCG 1020
AAAUGUGCUC GAUGCAAUAA AGCCAGAAUG UCGUGAAAUG UUCUAACGCC GUCUCGUAAA 1080
UAGAUGCAGU GGAGGAGGAG CGAGAUCGCU AUAUGCAGGU AUCGAGUUUG GUUUGUGGCU 1140
ACUCAAGGGC UGAAAGUAUG CCUGCCGGAC UCAAUAUCAG UAUGUGGGGA GGUCAGUGCC 1200
UCGGUUUCCC AUGAGUAAUG AUCGUCAACG GGACUCAAGG AGCCUGAGGA GACGGAGGAU 1260
GAAGAACCAA CAGUCCAUUC AUCGCUGUCG AGAUUGAAGU CUCCAUCAUA GCCAGCUGCA 1320
CCAUACCCAU ACUCCAGGGC AGACUCGCCG AAUUCCACAU AGUCGUAGUC CCAACGGAAG 1380
GUCUUGUCGA GCUGGACACG GGGAAGGAAU CGGGUCUUGG CGAAGUAGAA AGCAAUGGCG 1440
GCCAGGAGAC CACCCGCAAC CAAAUCGACC GCAUAGUGAU GUGAGAGGUA CAUUGUUGCC 1500
CACCACAUCC AUAGAGUAUA GGUCACGAAG ACGGGCUUCA UGCGGGGGAA AACAUGACUC 1560
AUGAAAAGUG CGGCCAGGGU UGAGUCGGCA GCAUGCAGCG ACGGAAAAGC GCCGAACACA 1620
ACAGGCGACU GAUGGAAAAC AGACGUGUAA AGGUCGAUGC CGAAAAGCUU GUCAAUGCGG 1680
GCAAGCCCUG CGGGAUCACC UUGGAUGGAG UAGUCUGCCG GAGCUAGACC AUAGCGAUUC 1740
UCAUACCAAG GUGGAGAGCA AGGGAAAAAC AGCUGAAUAG UAACCGCAGU CAUACUGAUA 1800
UAGCCGAAAG UGCGCGCGAA AAGGGGAACA GUGCCGGGCG GACCGAAGAU GAACAUGAUC 1860
AACGAGCACA CAAACGGAGC GCCAUAGUGG CAGAUACCGU AGGGUAGCCA CGCCAGCACG 1920
UCAAGCACAA CGUUCUGGUG AGCGGAUAGG AUGUUGCUGA UGUUUGCGCC GUAGAGAAUA 1980
UUCUCCAGUG CAGGCAAGAC ACGAACCCAA AUCGCAGGGC GCCAAUCGCU UGGGAUGAAC 2040
UGGCAGGCGU AGAAAAACAG AAGCCAUCCG GCAAUCGGCA GAAACGGGAG GAAGAACUGG 2100
CGGGUCAUAG GGAUCAGGAG AGAGAAUAGG AGCAUGGAGA AAAUGGCCGU UUUGCCCAAA 2160
GGCCCGGGCG ACUCGAUAAC GGUCAAAGAG AAGAUGCCCA CGAUCAACAG AAGCAGAUAU 2220
UGGAAGUCGU AAACCGUCCA UCGGUGGCUU UGGAGCGAUC GUAGUGUGUC UGCAGGCGAU 2280
AACGACGUCU GUAAAGAGGC UAUUGACGAG GUAGGAGACG CUCUACUGCG CAAUUUGGAC 2340
CUUAACUUCC GCCGCAUGCG AUGCGGGACG AGCAGUUGGA UGGACCGCCA UGGAACCUGG 2400
AUCUGAAGCU UUCCAAACUG GUUCUGCGUG CGGUCCUUCC ACGUGGGAAG UGUUUGAUUC 2460
AUGGUUGCGG CGAGUCUUGC GGGCAAGACU CAGCUAUAAU UCCUCCAGAU CGAACUCCGU 2520
CUGCUUUCUU UCCCCCCGAU UGUACAAGAG UUGGAAGGCG ACGAAUAAAU CGGUCGCGGA 2580
AGCGGCAGAA AAGGGGUCUU GAAUAACAAG CCGUUAGGCA ACGAGCAGGG UGCUGACGGC 2640
GUCAACCCGA GCGGGGAAAU UGAGAUCGGU UCGAAGAAGA CGAAACGAAG CGCACGCUCC 2700
GGUCUCCAGC GGCCAAACGA GGAUGUCUUU GAGCCGUCAC GUUGCAGGGG GUUUCACUGA 2760
UGCAAGGCGA AGUGCAAGGG CGCAGCAGUC GAGAGGAAAA CCUGGAACGA GGAGGUCGUG 2820
AGGGAGGCAG AUGGCCACGG AGCCGGAGUA UAAACC 2856
【図1】オーレオバシジン感受性関連遺伝子anaurlR
のゲノムDNAの制限酵素地図を示す図である。
のゲノムDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図2】オーレオバシジン感受性関連遺伝子anaurlS の
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図3】オーレオバシジン感受性関連遺伝子afaurlS の
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
cDNAの制限酵素地図を示す図である。
【図4】オーレオバシジン感受性関連遺伝子がコードす
る蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す図である。
る蛋白質のアミノ酸配列の比較を示す図である。
【図5】オーレオバシジン感受性関連遺伝子anaurlのゲ
ノムDNAとcDNAと蛋白質との関係を示す図であ
る。
ノムDNAとcDNAと蛋白質との関係を示す図であ
る。
【図6】A.ニドランスとA.フミガタスのオーレオバ
シジン感受性遺伝子のノーザンハイブリダイゼーション
の結果を示す図である。
シジン感受性遺伝子のノーザンハイブリダイゼーション
の結果を示す図である。
【図7】A.ニガーや、A.オリゼーのオーレオバシジ
ン感受性関連遺伝子の検出を示すサザンハイブリダイゼ
ーションの結果を示す図である。
ン感受性関連遺伝子の検出を示すサザンハイブリダイゼ
ーションの結果を示す図である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 FI
// A61K 38/00 C12R 1:19
A61P 31/10 1:66
(C12N 1/21 C12N 15/00 ZNAA
C12R 1:19) A61K 37/02
(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:66)
(56)参考文献 特開 平8−322578(JP,A)
特開 平8−322574(JP,A)
欧州特許出願公開644262(EP,A
1)
Mol.Gen.Genet.,1999
年,261,290−296
(58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名)
C12N 15/31
C07K 14/38
C12Q 1/68
BIOSIS(DIALOG)
CA(STN)
WPI(DIALOG)
Claims (12)
- 【請求項1】 配列表の配列番号4で表されるアミノ酸
配列を有する蛋白質、若しくは該配列の275位に相当
する部位以外に1〜数個のアミノ酸残基の置換、挿入及
び欠失の少なくとも1つを含むアミノ酸配列を有する蛋
白質をコードするオーレオバシジン感受性遺伝子。 - 【請求項2】 配列表の配列番号3で表される塩基配列
を有する請求項1記載の遺伝子。 - 【請求項3】 請求項2記載の遺伝子に下記条件におい
てハイブリダイズするオーレオバシジン感受性遺伝子;
6×SSC、1%ラウリル硫酸ナトリウム、100μg
/サケ精子DNA、5×デンハルツ(ウシ血清アルブミ
ン、ポリビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ0.
1%の濃度で含む)を含む溶液中、65℃で20時間イ
ンキュベートする。 - 【請求項4】 配列表の配列番号3で表される塩基配列
の15塩基以上の配列よりなる核酸プローブ。 - 【請求項5】 請求項2記載の遺伝子、又は請求項4記
載の核酸プローブをプローブとして用いることを特徴と
する、オーレオバシジン感受性遺伝子のクローニング方
法。 - 【請求項6】 請求項2記載の遺伝子の全長のアンチセ
ンスDNA。 - 【請求項7】 請求項2記載の遺伝子の全長のアンチセ
ンスRNA。 - 【請求項8】 請求項1記載の遺伝子を含有させた組換
体プラスミド。 - 【請求項9】 請求項8記載の組換体プラスミドを導入
させた形質転換体。 - 【請求項10】 請求項9記載の形質転換体を培養し、
該培養物からオーレオバシジン感受性蛋白質を採取する
ことを特徴とする、オーレオバシジン感受性蛋白質の製
造方法。 - 【請求項11】 請求項1又は3記載の遺伝子がコード
するオーレオバシジン感受性蛋白質。 - 【請求項12】 請求項2記載の遺伝子、又は請求項4
記載の核酸プローブをプローブとして用いることを特徴
とするオーレオバシジ憾受性蛋白質をコードする遺伝子
の検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001395647A JP3379952B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | オーレオバシジン感受性遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001395647A JP3379952B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | オーレオバシジン感受性遺伝子 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP27992195A Division JP3276050B2 (ja) | 1993-05-24 | 1995-10-04 | オーレオバシジン感受性関連遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002281971A JP2002281971A (ja) | 2002-10-02 |
JP3379952B2 true JP3379952B2 (ja) | 2003-02-24 |
Family
ID=19189015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001395647A Expired - Fee Related JP3379952B2 (ja) | 2001-12-27 | 2001-12-27 | オーレオバシジン感受性遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3379952B2 (ja) |
-
2001
- 2001-12-27 JP JP2001395647A patent/JP3379952B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Mol.Gen.Genet.,1999年,261,290−296 |
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---|---|
JP2002281971A (ja) | 2002-10-02 |
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