JPH11512930A - グルコース抑制の修飾法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換えＤＮＡ技術、特に菌類における基本的代謝プロセスの調節に関与する遺伝子に関する。本発明は、特に、糸状菌の天然グルコースレプレッサー遺伝子creの突然変異型を提供するもので、当該突然変異はＣ末端ドメインに位置し、Ｎ末端の第１ジンクフィンガーは無傷であり、Ｃ末端領域は、該突然変異遺伝子を有する株が生存力を維持し、グルコース抑制を緩和するように突然変異されている第２ジンクフィンガーを包含している。

Description

【発明の詳細な説明】 グルコース抑制の修飾法 発明の分野 本発明は、組換えＤＮＡ技術、特に菌類における基本的な代謝プロセスの調節 に関与する遺伝子に関する。本発明は、とりわけ、株の生存力を減少させずに分 泌タンパク質量の上昇を生じる能力を株に与えるために、菌株へ形質転換される べき突然変異グルコースレプレッサー遺伝子を提供する。 発明の背景 炭素異化代謝産物抑制は、原核および真核微生物の両方の代謝プロセスを調節 する主要なメカニズムである。グルコースのような容易に代謝可能な炭素源の存 在下では、他の異なる炭素源の利用を要する構造遺伝子の発現が減少する。セル ラーゼおよび他の分泌加水分解酵素は、その生産がグルコースによって抑制され るタンパク質である。一般に、グルコース抑制は、標的遺伝子のプロモーター配 列を結合することによる転写を調節する特異的タンパク質の作用によって媒介さ れる(Trumbly，1992)。 糸状菌アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）のcreA遺伝子 は、炭素異化代謝産物抑制を媒介するよく特徴付けられた調節遺伝子である(Ars tおよびBailey，1977)。炭素異化代謝産物抑制におけるエー・ニードランス（A ．nidulans）のＣＲＥＡタンパク質の中心的役割は、遺伝学的（Arstら、1990） および分子的分析（MathieuおよびFelenbok，1994）によって、広範囲にわたり 証明された。creA遺伝子の突然変異は、野生型遺伝子に対して劣性である。突然 変異体のいくつかは、異常な形態を有し(Arstら、1990)、遺伝学的操作によって 構築されたcreA遺伝子の全タンパク質コーディング領域を欠く一倍体エー・ニー ドランスcreA^-株（DowzerおよびKelly，1991）は、極度に生存力を減少した。そ の上、突然変異株における炭素代謝は、別の方法において変化する。生育障害に 関するin vivo単離creA突然変異体の最も極端なものは、さら に異常な小型コロニーの形成を生じるcreA30突然変異である。creA30遺伝子配列 の分子分析は、該遺伝子が、３’末端で切断され、２個の無傷ジンクフィンガー を有するが、Ｃ末端からＤＮＡ結合領域までの配列を欠損しているタンパク質に 相当することを明らかにした(DowzerおよびKelly，1991)。これは、ここまで記 載したcreAの最も極端な突然変異である。 ＣＲＥＡタンパク質は、塩基認識に関与するＣ₂Ｈ₂型の２個のジンクフィンガ ーを有する。ＣＲＥＡフィンガーは、著しく、サッカロミセス・セレビシエ（Sa ccharomyces cerevisiae）のグルコースレプレッサーＭＩＧＩのジンクフィンガ ーに類似する。さらに、２個のフィンガーのＣ末端側の１つは、発達調節に関与 する哺乳類初期成長応答タンパク質においてみられるフィンガーと有意な類似性 を有する。しかしながら、該タンパク質の他の部分における明らかな配列類似性 は無い（NehlinおよびRonne，1990)。別の酵母遺伝子ＲＧＲ１もまた、グルコー ス抑制に関与する。rgr1−１突然変異の表現型の効果は、多少creA突然変異体対 立遺伝子の表現型に似ており、ＲＧＲ１^-株は、生存力が無い(Sakaiら，1990)。 従って、炭素異化代謝産物抑制における類似性は、酵母および糸状菌の間に見 られ、グルコース抑制の基本的特徴のいくつかは、おそらく真核微生物において 普遍的である。creAが、アスペルギルス（Aspergillus）において炭素異化代謝 産物抑制を被る異なる遺伝子セットのレギュレーターのような中心的役割を有す ることを考慮に入れると、おそらくグルコース抑制を媒介する類似のメカニズム が同類の生物においてみられる。エー・ニードランスの他に、creA遺伝子は、こ れまでに同類の種、エー・ニガー（A．niger）から単離された(Drysdaleら，199 3)。 発明の記載 他の糸状菌における、および特にセルラーゼ発現に関するcreAの役割を扱うた めに、発明者らは、最も多く研究されているセルロース分解性生物の１つである 糸状菌トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）からcreA等価cre1を る)。セルラーゼの生産は、利用できる炭素源に依存し、グルコース抑制は非常 に厳しい。主なセロビオヒドロラーゼ１(cbh1)の発現レベルは、グルコース含有 培地と比較してセルロースまたはソホロースのような誘導炭素源含有培地上で数 価物がティー・リーセイ（T．reesei）におけるセルラーゼ発現のグルコース抑 cre1遺伝子に加えて、発明者らは、同類の種ティー・ハージアナム（T.harzianu m）から同じ遺伝子を単離した。ティー・リーセイcre1遺伝子の発現研究は、自 己調節の予期しない兆候を明らかにした。さらに、高セルロース分解性ティー・ リーセイ株を見つけ、予期しない構造および特性を有するcre1遺伝子の先端切断 型（truncated form）を発現させた。ティー・リーセイRut-C30株の先端切断cre 1遺伝子をcre1-1と称した。 従って、本発明は、菌株を形質転換したとき、グルコース存在下でも、該株が 完全な生存力を有し、分泌タンパク質量の上昇を生じる能力を示す突然変異した 菌類のグルコースレプレッサー遺伝子を提供する。さらに、該株は、グルコース 取り込みを変化させ、同様に、ある特定の窒素源での生育特徴を変化させた。 従って、本発明のさらなる目的は、本発明に従う先端切断cre1遺伝子の適当な 菌宿主内への形質転換および現存するcre1遺伝子の置換、形質転換した宿主のグ ルコースを含む適当な生育培地における培養、および生産されたタンパク質の回 収を特徴とする、菌宿主における分泌タンパク質の生産を増加させる方法におけ る該遺伝子の使用である。 本発明に従って、培地中の窒素源のタイプおよびグルコース量を調節すること によって、菌類の生育速度を調節することも可能である。 先端切断cre1遺伝子を用いて形質転換した菌株もまた、提供する。 予期しない結果は、ティー・リーセイcre1遺伝子の発現を研究するときに得ら れた。ＣＲＥＩによって媒介されるグルコース抑制がcre1転写のレベルで調節さ れたならば、グルコース存在下での転写における増加を予期したであろう。 しかしながら、cre1の高発現は、明確にグルコース抑制との相互関係を明らかに せず、実際、グルコースが抑制量で存在するとき、cre1転写産物のレベルは比較 的低く、天然炭素源ソルビトールおよびグリセロール上ならびにセルロース上で より高い。さらに、天然炭素源上で行われる培養へのグルコースの添加は、cre1 転写産物レベルを減少させ、それは、自己調節を示した。 さらに自己調節の示唆は、グルコースレプレッサー遺伝子creの突然変異型、 すなわち高セルロース分解性ティー・リーセイ株Rut-C30のcre1-1の発現を研究 するときに得られた。２個のジンクフィンガーの１個を包含するおよそ８０％の タンパク質コーディング領域は、ティー・リーセイQM9414の「天然の」cre1遺伝 子と比較すると、欠失している。ティー・リーセイcre1-1突然変異は、Ｎ末端側 のジンクフィンガーがＤＮＡ結合に十分であり、従って菌の生存能力のほとんど を保持することができる事を示した。しかしながら、Rut-C30株は、QM9414株と 比べて、比較的高レベルのcre1-1ｍＲＮＡをグルコース培地上でも生産する。グ ルコース培地上で生育するときＣＲＥＩがその自身の発現をダウンレギュレート すると仮定すると、豊富なcre1-1ｍＲＮＡは、ＣＲＥＩ−１タンパク質がその自 身のプロモーターにおける標的配列に結合する能力が無いことによって、または タンパク質の先端切断型が該遺伝子の抑制を与える能力が無いことによって、説 明され得る。これは、cre1によって調節される他の遺伝子にも有効であるはずで 、本明細書では、セルラーゼ遺伝子cbh1の抑制解除によって示される。 cre1の先端切断型をもたらす突然変異と組み合わせて、グルコースの存在下で 検出された高セルラーゼcbh1ｍＲＮＡレベルは、該株における真実の炭素異化代 謝産物抑制解除を支持する。Rut-C30で得られた結果は、現在さらに、セルラー ゼ発現がＣＲＥＩによって少なくとも部分的に媒介される炭素異化代謝産物抑制 の調節下にあるという示唆を支持する。類似の状況が他の糸状菌に有効であり、 さらに植物高分子基質の利用に伴う他の加水分解酵素もまた、ＣＲＥＩ／ＣＲＥ Ａタンパク質によって調節され得るようである。 ティー・リーセイQM9414におけるcre1遺伝子を突然変異遺伝子cre1-1で置 換することによって、cre1-1を発現する株を構築し、Rut-C30のグルコース抑制 解除表現型を別のトリコデルマ株へ転移することが可能である。該方法において 構築された株は完全に生存力があり、さらにグルコース存在下で分泌タンパク質 を生産することができる。該特性は、分泌タンパク質を生産するときの、バイオ テクノロジー的方法において非常に有効である。 発明者らは、また、天然の全長cre1遺伝子をRut-C30株へ形質転換した。得ら れた新規な株の特徴は、Rut-C30の突然変異遺伝子cre1-1が部分的にcre1およびc re1-1遺伝子産物間の競合を示唆するセルラーゼ遺伝子の転写を可能にする機能 を有することを示した。別法で、Rut-C30における付加的な突然変異は、cre1の ほかに、部分的にグルコース抑制解除に貢献している。 他のあまり予期しない結果もまた記載する。培地からのグルコース消費がcre 調節下にあり、特にその結果、いくつかの残存グルコースが、creにおいて突然 変異した株で完全に利用されないままであり得ることを第一に示す。この結果は 、creのいくつかの突然変異型がその時生じ、菌株へ転移され得、その結果、該 株のグルコース消費を変化させるであろうことを示す。注目すべきは、グルコー ス含有培養および例えばグルコース量の注意深い調節を要するfed-batch培養が 、一般にタンパク質生産のためのバイオテクノロジー的方法に使用されることで ある。cre突然変異を有する株の使用は、新規なタイプのプロセス調節を与える 。示される別の予期しない結果は、生育速度調節がcre調節下で多少、菌類のた めに供給される窒素源のタイプに依存することである。これは、バイオテクノロ ジー的方法において調節されるべき生育速度を与えるが、該株の完全な生存力は 保持している。 図の簡単な説明 図１．３つのティー・リーセイＣＲＥＩタンパク質（Rut-C30、VTT-D-80133お よびQM9414）ならびにティー・ハージアナムT3のアミノ酸配列。T3配列において 、２個のジンクフィンガーを含有するドメインに下線を付す。 図２．２％ソルビトール、５％グルコース、または３％Solka floc セルロー スのいずれかで補った最小限の培地上、示した培養時間で培養したティー・リー セイ株QM9414におけるcre1の発現。2μgの全ＲＮＡをゲル上にロードした。 ブロッティングおよびハイブリダイゼーションの前に、ゲルをアクリジンオレン ジ（ＡＯ）で染色して、ロードしたＲＮＡ量を視覚化した。ハイブリダイゼーシ ョンプローブは、cre1の６００ｂｐ長の内部ＰＣＲフラグメントであった（実験 参照）。 図３．ティー・リーセイQM9414のcre1およびcbh1の発現における異なる炭素源 の効果。培養を示したように７２〜９２時間、２％ソルビトールまたは２％グリ セロールのいずれかで補った最小限の培地上で行った。７２時間で、グルコース を２％、該ソルビトールおよびグリセロール培養に加え、インキュベーションを １時間（全培養時間７３時間）または１５時間(全培養時間８７時間)続けた。同 様に、７２時間および８２時間で、１ｍＭソホロースをグリセロール培養に２回 加え、インキュベーションを１５時間（全培養時間８７時間）または２０時間（ 全培養時間９０時間）続けた。図２の説明における記載のようにノーザンブロッ トを調製し、ハイブリダイズした。 図４．７２時間、５％グルコースまたは２％solca floc セルロース培地上で 培養したティー・リーセイ株Rut-C30およびQM9414におけるcre1およびcbh1の発 現の比較。ノーザン分析を図２の説明における記載のように行った。使用したcr e1プローブは、cre1遺伝子のヌクレオチド−１５８〜＋１３６に特異的な２９４ ｂｐ長のフラグメントであった。 図５．Rut-C30のQM9414cre1のcre1-1による置換のためのベクターの構築。ク ローニング工程において使用した適切な制限酵素認識部位を星印（＊）で示した 。 図６．トリコデルマ・リーセイ形質転換株による培養培地へのＣＢＨＩの生産 。培養培地の４０μｌおよび２００μｌアリコートを最初５％グルコースおよび ０．２％プロテオースペプトンを含有するトリコデルマ最小限培地中で培養３日 後、ニトロセルロース膜へドットブロットした。ＣＢＨＩに対して生じたモノク ローナル抗体ＣＩ−２５８を使用して、ＣＢＨＩを検出した。形質転換株４１− ５３ Ａおよび４１−１１２Ａ、４１−１０８Ａ、４１−１９Ａおよび４１−２１Ａは 、ＡｍｄＳ⁺およびcre1⁺であり、４１−５３Ａおよび４１−９ＡはＡｍｄＳ⁺で ある。宿主株Rut-C30およびQM9414株は、対照として示す。 図７．トリコデルマ株Rut-C30(左)、ｐMI-41で形質転換されたRut-C30(中央) 、および２％グリセロール(最上列)、２％グリセロール＋０．２％ペプトン(第 ２列)、２％グルコース＋０．２％ペプトン(第３列)、および２％グルコース(最 下列)で補ったトリコデルマ最小限プレートで生育したQH9414。 図８．最初２％グルコースおよび０．２％プロテオースペプトンを含有するト リコデルマ最小限培地における培養の間のcre1形質転換株４１−６６Ａによるcb h-1およびcre1ｍＲＮＡの発現におけるノーザン分析。全ＲＮＡを１、２および ３日間生育させた菌糸体から単離し、全ＲＮＡの2μｇをゲル上にロードした。 宿主株Rut-C30およびQM9414株を対照として示す。 実験 使用した材料および方法 菌株 ティー・リーセイ株QM9414（VTT-D-74075、ATCC26921）(Mandelsら、1971)を 遺伝子発現研究、ＲＮＡの単離、およびプローブとして使用したＰＣＲフラグメ ントの調製用のＤＮＡ源として使用した。ティー・リーセイ株VTT-D-80133(Bail ey & Nevalainen 1981)、セルロース分解活性を増加させたQM9414の突然変異株 のＤＮＡを染色体遺伝子ライブラリーの構築に使用した。ティー・リーセイRut- C30(ATCC56765)、高セルロース分解性突然変異株（MontenecourtおよびEveleigh 1979）をＤＮＡおよびＲＮＡの単離のために培養した。ティー・ハージアナム 単離物T3（Wolffhechel，H.，1989）から抽出したＤＮＡをゲノムラムダライブ ラリーの構築に使用した。 培養条件 ＲＮＡ単離の場合、２５０ｍｌ三角フラスコ中の各培養培地５０ｍｌを１０⁷ 胞子で感染させ、２８℃にて２００ｒｐｍでロータリー振盪器内でインキュベー トした。ＫＨ₂ＰＯ₄１５ｇ／ｌ、(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ₄ｘ７Ｈ₂Ｏ ５ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ₄ｘＨ₂Ｏ１．６ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ₄ｘＨ₂Ｏ１．４ｍｇ／ ｌ、ＣｏＣｌ₂ｘ６Ｈ₂Ｏ３．７ｍｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ₂０ ．６ｇ／ｌを含有したトリコデルマ最小限培地（ＴＭＭ）をｐＨ４．８に調整し た。プロテオースペプトン２g／ｌを本明細書に示すように、該培養培地へ加え た。該培地を適当な炭素源、２０ｇ／ｌ（ソルビトール、グリセロール、グルコ ース）または５０ｇ／ｌ（グルコース）のいずれかを補って研究に使用した。該 ソルビトールまたはグリセロール培養において、生育７２時間後に、４ｍｌの２ ５％グルコースを５０ｍｌの培養培地へ加えることによって、グルコースを最終 濃度２％で加えた。同様に、１ｍＭα−ソホロース(Serva)を生育７２および８ ２時間で、培養培地に２回加えた。セルロース培地は、Solka flocセルロース３ ０ｇ／ｌおよび蒸留して効力を失った穀類（distiller's spent grain）１５ｇ ／ｌを補ったＴＭＭであり、ｐＨを５．０に調整した。菌糸体をＧＦ／Ｂガラス ミクロファイバーフィルター(Whatman)による濾過によって培養培地から回収し 、滅菌水で洗浄し、−７０℃で保存した。 ＤＮＡ単離の場合、培養は、ＴＭＭを２％グルコースおよび０．２％プロテオ ースペプトン(Difco)で補い、菌糸体を回収後に凍結乾燥させ、−２０℃で保存 したことを除いて前記の通りであった。固形培地の調製の場合、ＴＭＭのｐＨを ５．５に調整し、２％寒天を加えた。０．１％TritonX-100を使用して、コロニ ーの広がりを制限した。 遺伝子クローニングのためのcre1プローブの調製および発現研究 トリコデルマのcre1遺伝子をクローン化するために、いくつかの重複するオリ ゴデオキシリボヌクレオチドをアスペルギルスＣＲＥＡタンパク質配列に基づい て設計し、合成して、トリコデルマ染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ反応 において、プライマーとして使用した。ティー・リーセイのために使用した機能 的プライマー対は、５’ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴ（Ｃ，Ｔ）ＴＧＧＮＧＴ（Ｇ， Ａ）ＴＣＮＧＧ（アンチセンス）および５’ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＮＣＡ（Ｃ ，Ｔ）ＡＣＮＧＧＮＧＡ（Ａ，Ｇ）ＡＡ（Ａ，Ｇ）ＣＣ（センス）であり、 ティー・ハージアナムの場合、５’ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴ（Ｃ，Ｔ）ＴＧＧＮＧ Ｔ（Ｇ，Ａ）ＴＣＮＧＧ（アンチセンス）および５’ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＮ ＧＧ（Ｇ，Ａ）ＴＴ（Ｇ，Ａ）ＴＡ（Ａ，Ｇ）ＴＡ（Ｔ，Ｇ）ＴＴＮＧＧ（セン ス）であった。増幅フラグメントのクローニングを容易するために、BamHI切断 部位をプライマーの５’末端に包含させた。両方の反応に使用したＰＣＲサイク ルは：変性９６℃１分−アニーリング３７℃３０秒−重合７２℃１分を繰り返し ４サイクル、次いで変性９６℃１分−アニーリング５５℃１分−重合７２℃１分 を繰り返し２５サイクルであった。 予想したサイズ、約６００〜７００ｂｐのＰＣＲ産物をBamHIで切断し、 BamHI線状化ｐUC19ベクター中へライゲートして、イー・コリDH5αへ形質転換し た。生じるプラスミドを標準法を用いて単離し、トリコデルマcre1フラグメント のクローニングを行うために配列決定した。ハイブリダイゼーションのために、 cre1フラグメント（ティー・リーセイでは６００ｂｐ、ティー・ハージアナムで は６６０ｂｐ）をBamHI消化によってプラスミドから除去し、フェノール抽出に よってアガロースゲルから精製し、Random Primed DNA Labeling Kit（Boehring er Mannheim）およびα−³²P-dCTP(Amersham)を用いて１０⁸ｃｐｍ／μgの特異 的活性に対して標識化した。 ティー・リーセイcre1遺伝子の全長タンパク質コーディング領域に対応するプ ローブフラグメントをティー・リーセイcre1ｃＤＮＡクローンを鋳型として用い るＰＣＲによって調製した。使用したプライマー、５’ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴ ＧＣＡＡＣＧＡＧＣＡＣＡＧＴＣＴＧＣＣ（センス）および５’ＧＧＣＧＧＡＴ ＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣ(アンチセンス)は、cre1遺伝 子のタンパク質コーディング領域の５’および３’末端に対して相補的であり、 クローニングを容易にするために、末端にBamHI切断部位を含有する。ＰＣＲサ イクルは：９４℃４５秒−５５℃３０秒−７２℃２分を２５回繰り返した。 ティー・リーセイcre1のヌクレオチド−１５８〜＋１３６に対応する２９４ ｂｐの長いプローブフラグメントをｃＤＮＡクローンを鋳型として用い、プライ マー５’ＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＣＴＣ（センス）および５’ＡＣＴＧＴ ＧＴＩＣＣＴＧＧＡＡＴＧ（アンチセンス）を用いるＰＣＲによって合成した。 ＰＣＲサイクルは：９５℃４５秒−４２℃３０秒−７２℃４５秒を２５回繰り返 した。 DynaZyme(登録商標)ＤＮＡ−ポリメラーゼを製造者（Finnzymes Oy，Espoo，F inland）によって推薦された反応条件において、前記の各ＰＣＲ反応に使用した 。 ら、1988）から得、プローブを前記のように調製した。 ゲノムライブラリーの構築およびcre1遺伝子の単離 ティー・リーセイ染色体cre1遺伝子をクローン化するために、ティー・リー シリンプレートに塗布し、一晩インキュベーション後、細菌コロニーをニトロセ ルロース膜へ移し、コロニーハイブリダイゼーションを用いて６００ｂｐの長い ティー・リーセイcre1プローブで選抜した。正のハイブリダイゼーションシグナ ルを与えるコロニーを精製し、コスミドＤＮＡを標準的なプラスミド単離法を用 いて調製した。cre1遺伝子を有するコスミドＤＮＡを部分的に制限位置決定し、 サザンハイブリダイゼーションを用いて分析した。フランキング領域を有する全 タンパク質コーディング領域を含む６．４ｋｂSalI-HindIII制限フラグメントを 配列決定のために、SalI-HindIIIで消化したｐSP73プラスミドベクター（Promeg a）中でサブクローン化した。該プラスミドをｐMI-41と称した。 ティー・ハージアナム単離物T3のcre1遺伝子をクローン化するために、染色体 ＤＮＡをRaeder ＆ Broda(1985)に従って調製し、Sau3Aで部分的に消化し、スク ロース濃度勾配遠心分離（Sambrookら、1989）によってサイズ分画し、約２２ｋ ｂのＤＮＡフラグメントをBamHI消化し、リン酸処理したラムダＤＡＳＨ（登録 商標）ベクターアーム(arm)にライゲートし、ライゲーション混合物を Gigapack II Gold Packaging Extract(Stratagene)を用いて、ラムダ粒子にパッ ケージした。ラムダ粒子は、適当なイー・コリ宿主細胞を感染するために使用し 、ライブラリーを６６０ｂｐの長いティー・ハージアナムcre1フラグメントをプ ローブとして用いてスクリーンし、正のクローンを単離し、製造者の説明書（St ratagene）に従って精製した。バクテリオファージを以下の修飾：ＤＮＡseI処 理を省略し、溶菌した宿主細胞から除去したファージ粒子をPEG6000を用いて沈 殿させ、SM中に溶解して、クロロホルムで抽出し、Kontron TST 41.14ローター で２５０００ｒｐｍで２時間の遠心分離によってペレット化し、再びSM中に溶解 することを伴ったSambrookら(1989)における記載の一般的方法に基づく方法を用 いて精製した。ラムダＤＮＡを、ファージ粒子をプロテイナーゼＫで消化するこ とによって単離し、次いでフェノール抽出およびエタノール沈殿を行った。ティ ー・ハージアナムcre1遺伝子を含有するラムダクローンのＤＮＡを部分的に制限 位置決定し、サザンハイブリダイゼーションによって分析した。どちらもcre1プ ローブで正のハイブリダイゼーションシグナルを与える２個のEcoRV制限フラグ メント、１方は５’末端を含む３ｋｂ、他方はフランキング領域を有する３’末 端を含む４．９ｋｂを配列決定のために、EcoRV切断し、リン酸処理したプラス ミドベクターpSP73（Promega）中でサブクローン化した。 cre1ｃＤＮＡクローンを単離するために、ラムダuniZAP XRベクター（Nakari ら、1993）中へ構築したティー・リーセイ株QM9414のｃＤＮＡライブラリーを前 記のように調製した６００ｂｐの長いティー・リーセイcre1プローブでスク ら、1995）を全長cre1タンパク質コーディング領域をプローブとして用いてスク リーンした。正のクローンのバクテリオファージＤＮＡをin vivoで切り出し、S tratageneの説明書に従ってプラスミド型へ変化させた。 サザン、ドットブロットおよびコロニーハイブリダイゼーション コロニーハイブリダイゼーションの場合、１分間プレート上に膜を置くことに よって、細菌コロニーまたはラムダプラークを寒天プレートからニトロセルロー ス膜（Schleicher ＆ Schuell BA85）へ移した。該膜を変性溶液（０．５Ｍ Ｎ ａＯＨ−１．５ＭＮａＣｌ）中に浸したろ紙上に７分間、次いで中和溶液（１． ５ＭＮａＣｌ−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）中に浸したろ紙上に２ ｘ３分間置き、その後、膜を２ｘＳＣＣ中に浸し、８０℃で２時間膜を熱するこ とによって、ＤＮＡを固定した。過剰の細菌破片を除去するために、ハイブリダ イゼーションの前に膜を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８−１Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭＥ ＤＴＡ−０．１％ＳＤＳ中で４２℃１時間洗浄した。ハイブリダイゼーションを ５０％ホルムアミド−５ｘデンハーツ(Denhardt's)溶液-５ｘＳＳＰＥ−０．１ ％ＳＤＳ−１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ−１μｇ／ｍｌポリＡＤＮＡ中で ４２℃で一晩、ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたり１０⁶ｃｐｍのプロー ブを用いて行った。ハイブリダイゼーション後、膜を２ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤ Ｓ中で室温で洗浄し、次いで１ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤＳ中で６８℃１時間洗浄 して、Kodak XAR−5Ｘ線フィルムに−７０℃で暴露した。 サザン分析の場合、２μgのトリコデルマ染色体ＤＮＡを制限酵素（Boehringe r Mannheim）で完全に消化し、生じるＤＮＡフラグメントを０．８％アガロース ゲル中の電気泳動によって分離し、ＤＮＡをHybond Nナイロン膜上へキャピラリ ーブロットした。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション後の 洗浄が２ｘＳＳＣ中で室温２ｘ５分で行われ、次いで１ｘＳＳＣ−０．１％ＳＤ Ｓ中で６８℃６０分間洗浄する以外は、コロニーハイブリダイゼーションの記載 の通りである。 ＤＮＡドットブロットハイブリダイゼーションの場合、１μgの染色体ＤＮＡ を０．４Ｍ ＮａＯＨ中で１０分間変性させ、等量の２Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ ７を加えることによって中和して、Hybond Nナイロン膜上へドットブロットした 。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、サザン分析の記載の通りに行った。 ノーザン分析 全ての菌ＲＮＡをChirgwinら(1979)に従って単離し、Maniatisら（1982）に 従ってグリオキシル化して１０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液ｐＨ７．０中の１％ア ガロースゲルで電気泳動した。長さが既知なＲＮＡ分子を含むＲＮＡはしご（Ｂ ＲＬ）を分子量マーカーとして使用した。ゲルをアクリジンオレンジ(１５μｇ ／ｍｌ)を用いて１５分間、１０ｍＭリン酸緩衝液中で染色し、ＲＮＡを視覚化 し、３時間１０ｍＭリン酸緩衝液中で脱色した。従って、ＲＮＡをHybond(登録 商標)Nナイロン膜（Amersham）上に、２０ｘＳＣＣ中でキャピラリーブロッティ ングによってブロットした。ハイブリダイゼーションを５０％ホルムアミド−１ ０％硫酸デキストラン−１％ＳＤＳ−１Ｍ ＮａＣｌ−１２５μｇ／ｍｌ変性ニ シン精子ＤＮＡ中で４２℃で一晩、ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたり１ ０⁶ｃｐｍのプローブを用いて行った。膜を４２℃で５ｘＳＳＰＥ中、１ｘＳＳ ＰＥ−０．１％ＳＤＳ中で２回、０．１ｘＳＳＰＥ−０．１％ＳＤＳ中で２回、 それぞれ１５分続けて洗浄し、Kodak XAR-5Ｘ線フィルムへ−７０℃で暴露した 。 プラスミド構築 ティー・リーセイQH9414のcre1のティー・リーセイRut-C30の突然変異遺伝子c re1-1による置換の場合、発現ベクターpMI-62をプラスミドpBluescript SK^-にお いて構築した(図５も参照)。pHI-62を以下のように構築した：cre1の５'-配列を pMI-41から３ｋｂEcoRI−BstEIIフラグメントとして得て、プラスミドｐMI-42由 来のcre1-1ｃＤＮＡのBstEII-EcoRIフラグメントとフレーム内で連結し、その結 果プラスミドｐMI-60を生じた。転写終止コドンの５０ｂｐ下流で開始し、天然 のHindIII部位で終止するcre1ターミネーターの１．４ｋｂフラグメントを、鋳 型としてのpMI-41およびフラグメントのクローニングを容易にするためのEcoRI 部位を末端に有する配列特異的プライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。cr e1タンパク質コーディング領域の５０ｂｐ下流から開始するヌクレオチドおよび 唯一のHindIII部位の周囲のベクター配列に対応するＰＣＲプライマー配列は、 各々５’ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧお よび５’ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡ ＧＡＣＣＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴであった。ＰＣＲ増幅cr e1ターミネーターフラグメントをEcoRI切断し、EcoRIを用いて線状にしたプラス ミドp3SR2中でクローン化し、その結果、プラスミドpMI-61を生じた。 pMI-60をXhoIを用いて切断し、およびpMI-61をSaII-XhoIで切断し、amdS遺伝子 およびcre1ターミネーターを含有するフラグメントをXhoI線状化pMI-60にライゲ ートして、プラスミドpMI-62を生じた。 トリコデルマの形質転換 ＣＢＨＩの免疫学的検出 ＣＢＨＩの培養培地への生産を抗体を用いて検出した。培養培地の２００μｌ および４０μｌアリコートをニトロセルロース膜上へドットブロットした。該膜 を３％脱脂粉乳−ＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８−１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ）中３７℃にて１０分間インキュベートし、ＴＢＳ中で３ｘ１０分洗浄し た。該膜をモノクローナル抗ＣＢＨＩ抗体CI-258（Ahoら、1991）を含有するＴ ＢＳ中で、室温にて１時間インキュベートし、ＴＢＳ中で洗浄した。次いで、膜 をアルカリホスファターゼ（Sigma A-0162）と結合した抗マウス多価免疫グロブ リンを含有するＴＢＳへ移し、室温で１時間インキュベートした。結合抗体をＮ ＢＴおよびＢＣＩＰ試薬(Promega)を用いて、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐ Ｈ９．５−１００ｍＭ ＮａＣｌ−５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する溶液中で検出し た。 他の方法 ゲノムcre1遺伝子をSangerのジデオキシヌクレオチド法、配列特異的プライマ ーおよびSequenaseバージョン２ポリメラーゼ（USB）を用いて、両鎖から配列決 定した。cre1ｃＤＮＡクローンを１つの鎖から配列決定した。詳細に記載されな い全ての他の技術は、標準法（例えば、Sambrookら、1989）を用いて行わ れた。ＰＣ/遺伝子核酸およびタンパク質配列分析ソフトウェア・リリース6.80( Intelligenetics Inc.)を配列操作に使用した。 実施例１ ティー・リーセイおよびティー・ハージアナムcre1遺伝子の単離およ び特徴付け ティー・リーセイおよびティー・ハージアナムのcre1遺伝子のフラグメントを 染色体ＤＮＡから、アスペルギルスＣＲＥＡ配列情報に基づいて設計した変性オ リゴデオキシリボヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ Ｒ）によって増幅した。エー・ニードランスcreA遺伝子に類似した挿入を生じる プライマーは、ジンクフィンガー領域または２個のフィンガーを連結するリンカ ー領域を有する５’末端、および酵母のＲＧＲ１タンパク質に対して類似性を示 すプロリン豊富領域を有する３’末端で相補的であった(下記参照)。cre1フラグ メントをハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ティー・リーセイ株 VTT-D-80133およびティー・ハージアナムT3のcre1遺伝子の染色体コピーを単離 した。該クローンを制限位置決定し、サブクローン化フラグメントから配列決定 した。 ティー・リーセイcre1遺伝子は、長さ４０２アミノ酸のタンパク質へ転写され 得る１２０６ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、 ティー・ハージアナム遺伝子（配列番号１）は、４０９アミノ酸をコードする１ ２２７ｂｐのＯＲＦを含む。これら２つのトリコデルマcre1遺伝子のヌクレオチ ド配列は、予測したタンパク質コーディング領域内で８９％の同一性を示す。 ティー・リーセイ株VTT-D-80133（配列番号３）から単離した染色体コピーの ほかに、ｃＤＮＡコピーをティー・リーセイ株QM9414（配列番号４）から単離し た。これら２株間で観察されるcre1ヌクレオチド配列における唯一の差異は、VT T-D-80133におけるＴの代わりにＣがQM9414において見られる１４０位置であり 、アミノ酸番号４７がスレオニン(QM9414)からイソロイシン(VTT-D-80133)に変 化した。ティー・ハージアナムＣＲＥＩにおいて、スレオニンが該位置で見られ る。ｃＤＮＡコピーの配列決定は、ティー・リーセイcre1遺伝子において イントロンが存在しないことを確かにした。 ９個のティー・リーセイcre1ｃＤＮＡクローンの３’末端の配列決定は、ｍＲ ＮＡが均一にしばしば、cre1転写産物の３’末端で約１７０ｂｐによって分けら れる２個の異なる領域で切断されたことを示した。切断部位、ｃＤＮＡ末端２８ １〜２８８ｂｐの短い型、およびタンパク質コーディング領域後の４５０〜４５ ４ｂｐの長い型には、いくつか不均一がある。染色体コピーの配列は、タンパク 質コーディング領域後のティー・リーセイcre1遺伝子における２６３、４９４お よび６６５ｂｐに、ティー・ハージアナムcre1における２３４、４４５および７ ３５ｂｐに位置する数個の推定ポリアデニル化シグナル、ＡＡＡＴＡＴまたはＴ ＡＡＴＡＴを示す。 トリコデルマcre1遺伝子のコドン使用は、第３位におけるＡに偏りがあり、そ れは糸状菌に典型的である(Unkles1992)。該コドン選択は、ティー・リーセイの セルラーゼ遺伝子のコドン選択よりも偏りがあるが、例えば、転写伸長因子tef1 （Nakariら、1993）またはホスホグリセレートキナーゼ遺伝子pgk1（Vanhanenら 、1989）のコドン選択と同様な偏りではない。 実施例２ ＣＲＥＩアミノ酸配列比較 ティー・リーセイおよびティー・ハージアナムの推定ＣＲＥＩアミノ酸配列は 、９５％の類似性を（９２．５％同一性）示す(図１)。エー・ニードランスおよ びエー・ニガーのＣＲＥＡタンパク質配列と比較したとき、７２％の全体の類似 性（４６％同一性）が得られる。 トリコデルマおよびアスペルギルス間の２つの最も良く保持された領域の１つ は、５７個のアミノ酸の長い領域を通してほとんど完璧に保持されたＤＮＡ結合 モチーフ、Ｃ₂Ｈ₂型ジンクフィンガーに位置する。興味深いことに、ジンクフィ ンガードメインの周囲のアミノ酸配列は、アスペルギルスとトリコデルマタンパ ク質間で異なる。フィンガーのアミノ末端側において、１３アミノ酸がアスペル ギルス配列と比較した両方のトリコデルマタンパク質において失われている。カ ルボキシ末端側では、アスペルギルスＣＲＥＡタンパク質に見られる８〜９ア ミノ酸の長いアラニン領域が、トリコデルマにおいてヒスチジンおよびグルタミ ン残基によって置換される。 他の等しく良く保持された領域は、さらに下流に見られる。該領域内で、３９ 〜４１アミノ酸は、トリコデルマおよびアスペルギルスＣＲＥＩ／ＣＲＥＡタン パク質間で同一である。ＣＲＥＩ／ＣＲＥＡタンパク質のこの部分の特徴は、約 ２５％プロリン、２５％セリンおよび１２％スレオニンを含有することである。 該配列は、酵母のグルコースレプレッサータンパク質ＲＧＲＩ(Sakaiら、1990) に対して類似性を示す。 実施例３ ティー・リーセイcre1の発現は、利用可能な炭素源に依存する。 ノーザン分析は、ティー・リーセイQM9414が１．８５ｋｂおよび２ｋbの２個 の主要なcre1転写産物、および暴露を長くした後にのみ見ることができる２．６ ｋｂのかすかな転写産物を生産することを示す(図２)。これらは、およそ同じ比 較量で研究された全培養条件において検出された。これらの特徴は、分析したｃ ＤＮＡクローンの１７０ｂｐの観察サイズ差とよく相関し(前記参照)、サザン分 析とともに、２個の主要な転写産物の両方が１つの遺伝子の産物であることを実 証する。 ティー・リーセイセルラーゼ遺伝子は、グルコース抑制を受けやすいので、セ ルラーゼ発現に適した条件においてcre1の発現を研究することは、興味深い。培 養は、セルラーゼ発現に関して、グルコース、有効な誘導物質であるSolka floc セルロース、または天然炭素源であるソルビトールのいずれかを含有する培地上 で、振盪フラスコ中で行った(Penttilaら、1993)。ノーザン分析は、cre1転写産 物の安定状態レベルが、くり返し実験におけるこれらの異なる培養条件において 、明白な変化を示すことを明らかにした。予想に反して、cre1ｍＲＮＡレベルは 、誘導炭素源セルロースにおいて驚くほど高かった。さらに、それらは、セルロ ースまたはソルビトール培地上よりもグルコース上で低かった(図2)。従って、c re1の発現は、利用できる炭素源によって調節される。 結果として、cre1転写でのグルコースの効果は、より詳細に研究され、新た な一連の培養が行われた。菌類は、ソルビトールまたはグリセロールのいずれか 、セルラーゼ発現に関する両方の天然炭素源を含む培地上で７２時間生育し、そ の後２％までグルコースを加えた。培養のこの時点で、菌類は、まだ全部のソル ビトールまたはグリセロールを利用していなかった。グルコース添加後１時間お よび５時間で、ＲＮＡ単離のために菌糸体を回収した。グルコース添加無しのグ リセロールまたはソルビトール培地上で生育した対照菌糸体において、cre1ｍＲ ＮＡは、培養の間の異なる時点で等しく豊富であった(図３)。cre1ｍＲＮＡのレ ベルは、ソルビトールおよびグリセロール培養へのグルコース添加後１時間でも 変化しないままであった。しかしながら、グルコース存在下で一晩インキュベー ション後、cre1ｍＲＮＡレベルは、グルコースを添加しなかったソルビトールお よびグリセロール培養体と比べて有意に減少した。比較のための、セルラーゼ発 現の有効な誘導因子であるソホロースのソルビトールまたはグリセロール培養へ の添加は、調べた時間で、cre1転写産物レベルに影響しなかった(図３)。 実施例４ 高セルロース分解性ティー・リーセイ株Rut-C30によって発現されたc re1の先端切断型 cre1遺伝子の中央部分に特異的なＰＣＲ増幅６００ｂｐ長プローブを用いるRu t-C30のために行われたノーザン分析は、いかなる発現も与えなかった。制限酵 素EcoRI、SalI、AccI、PvuIIおよびSphIで切断したゲノムＤＮＡのサザン分析を cre1の完全なタンパク質コーディング領域をプローブとして用いて行ったとき、 該プローブに対する弱いハイブリダイゼーションおよびQM9414株とは異なるパタ ーンを示した(データに示さない)。その後、全長cre1プローブを用いて、Rut-C3 0株のcre1ｃＤＮＡを単離した。 Rut-C30ｃＤＮＡの配列分析は、cre1の５’末端が、第二ジンクフィンガーの 最初のシステイン、Ｃｙｓ₈₇に対応するヌクレオチド２６１まで、以前に配列決 定されたティー・リーセイのcre1に一致し(図１参照)、その後２つの配列が異る ことを示した。終止コドンを伴った８個の付加アミノ酸（ＴＳＩＴＣＦＦＦ）を コードする先端切断cre1（以後cer1-1と称する）のリーディングフレー ムは、Ｃｙｓ₈₇の後に続く。１．３ｋｂcre1-1ｃＤＮＡ挿入を含有する記載のプ ラスミドをpMI-42と称し、ドイッチェ・サムルンク・フォン・ミクロオルガニズ メン・ウント・ツェルクルツレン、ブラウンシュヴェイク、ドイツにＤＳＭ受託 番号１０１９０で寄託し、また、ＶＴＴカルチャー・コレクション、エスポー・ フィンランドに受託番号ＶＴＴ−Ｆ−９５０５５で保存した。cre1-1のＤＮＡ配 列は、配列番号６に示す。cre1-1ｍＲＮＡは短く、ノーザン分析において２本の バンド（１．１および１．３ｋｂ）として現れる(図４参照)。これは、４個のｃ ＤＮＡクローンの配列決定によって実証されたように、２つの異なる領域でのポ リＡ尾部の付加に起因する。cre1-1の３’末端は、全既知トリコデルマ遺伝子配 列と異なる。 cre1の先端切断型の発現を研究すため、およびQM9414株のcre1の発現と比較す るために、野生型cre1およびRut-C30のcre1-1の両方に存在する、従って類似の ハイブリダイゼーション条件を確立しているcre1転写産物の５’末端配列に特異 的なプローブを用いて、ノーザン分析を行った。Rut-C30のcre1-1ｍＲＮＡは、Q M9414株のcre1ｍＲＮＡよりも、特にcre1-1の発現レベルが著しく上昇されるグ ルコース培地上で、豊富であるようである(図４)。 Rut-C30株は本来、高セルロース分解性株として、炭素異化代謝産物抑制解除 のためのスクリーニングによって単離され(MontenecourtおよびEveleigh 1979) 、その結果、該株におけるセルラーゼ発現の可能なグルコース抑制解除の程度を 研究することが興味深い。ティー・リーセイ株Rut-C30およびQM9414をグルコー ス上で、Solka flocセルロースでの誘導条件において培養した。主要なセルラー ゼ、セロビオヒドロラーゼＩ(cbh1)の発現が研究された(図4、中央パネル)。cbh 1ｍＲＮＡは、予想通り、セルロース含有培地上で両方の株によって生産された 。グルコース培地上でのcbh1の発現は、以前に示されたように 抑制解除を示す比較的高レベルのcbh1ｍＲＮＡを生産した。 実施例５ cre1をcre1-1で置換するための、Rut-C30の突然変異遺伝子cr1-1 のQM9414株への形質転換 トリコデルマ・リーセイQM9414の内生cre1遺伝子をRut-C30の突然変異遺伝子c re1-1によって置換した。この目的のために、発現ベクターpMI-62をフレーム内 でcre1-1ｃＤＮＡに結合したcre1の５’末端、次いでamdS遺伝子およびcre1ター ミネーターを含有するプラスミドpBluescript SK^-において構築した(図５)。該 構築物をQM9414株へ形質転換し、アセトアミドを唯一の窒素源として用いて形質 転換株を選抜した。形質転換ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションによって分 析して、相同組換えが起きたこと、および内生のcre1部位が形質転換された構築 物によって置換されたことを明らかにした。形質転換株は生存能力があり、使用 した生育培地に依存している生育速度で良く生育する。従って、形質転換株は、 倍地中のグルコース存在下でセルラーゼを生産する。 該方法において、突然変異遺伝子cre1-1を発現する株を構築すること、および Rut-C30のグルコース抑制解除表現型を別のトリコデルマ株へ転移させることが 可能であった。 実施例６ 全長cre1遺伝子を有するトリコデルマ・リーセイ株Rut-C30の形質転 換 cre1遺伝子を有するコスミドクローンpCOS11を、VTT-D-80133株の染色体ティ ー・リーセイＤＮＡのコスミド遺伝子ライブラリーから単離した。正のクローン （pCOS11）からcre1遺伝子のフランキング領域を有するタンパク質コーディング 領域を含有する６．４ｋｂSalI-HindIII切断フラグメントを単離し、SalI-HindI II切断ベクターpSP73中でクローン化し、その結果プラスミドpMI-41を生じた。 形質転換株に唯一の窒素源としてアセトアミドを使用する能力を提供する選択マ ーカーとして、アセトアミダーゼ遺伝子を有するプラスミド C30株に同時形質転換した。アセトアミド利用形質転換株のゲノムにおけるcre1 遺伝子の統合は、Rut-C30における内生突然変異体cre1-1において見られた配列 を欠く６００ｂｐの長いcre1プローブへの染色体ＤＮＡのドットブロットハ イブリダイゼーションによって証明された。 cre1形質転換株コロニーにおけるセルラーゼの生産を研究するために、宿主株 Rut-C30およびQM9414株をミクロタイタープレートウェル中、５％グルコースを 含有する最小限の培地中で３日間培養した。培養のこの時点で、グルコースは、 まだ倍地中に（抑制量で）検出できた。培養培地をニトロセルロース膜上にドッ トブロットした。倍地中に生産されたセルラーゼを抗体を用いて免疫学的に検出 した(図６)。主要なセルラーゼＣＢＨＩに対して生じたモノクローナル抗体CI-2 58を使用した(Ahoら、1991)。分析は、QM9414株がいかなる検出可能なＣＢＨＩ も生産せず、セルラーゼ発現のグルコース抑制を示したが、Rut-C30およびcre1 形質転換株は生産し、抑制解除を示したことを明らかにした。これは、Rut-C30 の突然変異遺伝子cre1-1が、形質転換株において形質転換cre1以上に優勢（また は共優勢）である機能を有する、またはRut-C30における付加突然変異がcre1の ほかにグルコース抑制解除に部分的に貢献していることを示す。 ６．１ 固形培地上でのコロニー生育での形質転換cre1の効果 cre1形質転換株の胞子および選択マーカーのみを有する形質転換株を固形培地 に塗布して、単一胞子から誘導されたコロニーを得た。使用した培地は、コロニ ーの広がりを制限するために０．１％Triton X-100を加えたポテトデキストロー ス寒天（Difco）であった。２８℃で４〜５日インキュベーション後、生育の違 いがcre1形質転換株および選択マーカーのみを有する株間で見られ、cre1形質転 換株は、菌類の生育／生存力に対してcre1の正の効果を示す他のコロニーよりも 大きなコロニーを形成した。 形質転換コロニーを異なる炭素源、例えば２％グルコース、２％グリセロール または２％Solka flocセルロースおよび０．１％Triton X-100を加えた０．２％ ペプトンを含有する固形トリコデルマ最小限培地上で培養したとき、コロニーの 形態および直径における差異が、各々の場合で、宿主株とcre1形質転換株間で見 られ、形質転換株の方が大きかった(図７)。比較のために、ペプトンを培地から 削除すると、形質転換株および宿主株間に著しい違いは見られなかった。 さらにポテトデキストロース寒天培地（Difco）上で生育したコロニーにおいて 、コロニー生育における差異もまた見られた。発明者らは、幾分か培養条件、特 に有機窒素源の存在に依存するコロニーの生育に、cre1が影響すると結論づける 。 ６．２ Rut-C30におけるcbh1発現での形質転換cre1の効果 形質転換株コロニーpMI-41-66AならびにpMI-41-112Aおよび宿主株Rut-C30を最 初にグルコース２０ｇ／ｌおよび０．２％プロテオースペプトン(Difco)を含有 する液体トリコデルマ最小限培地中で培養した。培養１、２および３日後、菌糸 体を回収し、全ＲＮＡを単離した。主要なセルラーゼセロビオヒドロラーゼＩ（ ＣＢＨＩ）をコードするcbh1ｍＲＮＡのノーザン分析は、Rut-C30株が豊富なcbh 1ｍＲＮＡを生産したのに対して、形質転換株において、cbh1プローブに対する ハイブリダイゼーションは有意に減少されたことを示した(図８)。cre1プローブ を用いる同じ試料のノーザン分析は、形質転換cre1遺伝子が形質転換株において 発現されたことを示した。発明者らは、形質転換cre1が宿主株においてcbh1発現 を調節し得ると結論づけた。 ６．３ 培養培地由来のグルコースの利用における形質転換cre1の効果 Rut-C30を前記のようにcre1遺伝子を含有するpMI-41で形質転換した。２個の 独立した形質転換株コロニーpMI-41-66AおよびpMI-41-112Aを、最初に唯一の炭 素源としてグルコース２０ｇ／ｌおよび唯一の窒素源として硫酸アンモニウムを 含有するトリコデルマ最小限培地中で、形質転換の宿主株Rut-C30と同時に２８ ℃で６日間ロータリー振盪器中で培養した。４つの平行振盪フラスコに各株を接 種した。培地中のグルコース量をGOD-Perid法（Boehringer Mannheim）を用いて 毎日モニターした(表１)。 非形質転換Rut-C30の生育培地におけるグルコース量は、培養開始後３日間、 最初の２０g／ｌから３〜４ｇ／ｌへ減少し、６日目までそのレベルを維持した 。cre1形質転換株の培養培地中のグルコース量は、４日目および６日目に測定し たとき、Rut-C30株の生育培地中で検出されたレベル以下に減少し、いくつかの フ ラスコではグルコースを検出できなかった。さらに、同時に培養されたQM9414株 の培養培地において、６日目でグルコースをより検出できなかった。 これらの結果に基づいて、発明者らは、cre1遺伝子が、特にグルコースレベル が低い、３ｇ／ｌ以下のとき、培養培地からのグルコースの消費を増進すると結 論づける。 微生物の寄託 以下のプラスミドをブダペスト条約に従って、ＤＳＭ寄託機関（ドイッチェ・ サムルンク・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲゼ ルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング、ドイツ、デー−３８１２ ４ブラウンシュヴェイク、マシェロデル・ヴェグ１ベー番）に寄託した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:885） (72)発明者 ペンッティレ，メルヤ フィンランド、エフイーエン−00390ヘル シンキ、ヴェヘントゥヴァンティエ９アー ６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．突然変異がＣ末端ドメインに位置し、Ｎ末端の第１ジンクフィンガーは無 傷であり、Ｃ末端領域は、突然変異遺伝子を有する株が生存力を維持し、グルコ ース抑制を緩和するように突然変異されている第２ジンクフィンガーを包含して いる糸状菌の天然グルコースレプレッサー遺伝子creの突然変異型遺伝子。 ２．配列番号７に示したアミノ酸配列をコードする請求項１記載の突然変異cr e遺伝子。 ３．２個のジンクフィンガーのうち１個だけが保持された請求項１記載の突然 変異cre遺伝子。 ４．株の生存力を維持するが、培地からの不完全なグルコース取り込みを導く 請求項１記載の突然変異cre遺伝子。 ５．請求項１〜４のいずれか１つに記載の突然変異cre遺伝子で突然変異され た菌株。 ６．タンパク質の生産における請求項５記載の菌株の使用。 ７．株の生育速度が倍地中の窒素源によって調節されるタンパク質生産方法に おける請求項５記載の菌株の使用。 ８．受託番号ＤＳＭ１０１９０を有するプラスミドpMI-42。 ９．菌宿主において分泌タンパク質の生産を増強する方法であって、 請求項１〜４のいずれか１つに記載の突然変異cre遺伝子を適当な菌宿主中へ 形質転換すること、 形質転換宿主をグルコースを含有む適当な生育培地中で培養すること、 および 生産されたタンパク質を回収すること からなる方法。 １０．菌宿主がトリコデルマ属に属する請求項９記載の方法。