JP2001503988A

JP2001503988A - Ａｐｐのエンドサイトーシスを阻害し得るペプチド及び対応するヌクレオチド配列

Info

Publication number: JP2001503988A
Application number: JP52222298A
Authority: JP
Inventors: メルケン，リユツク; フルニエ，アラン
Original assignee: ローヌ―プーラン・ロレ・エス・アー
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2001-03-27
Also published as: WO1998021327A1; CA2268018A1; EP0941319A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規なペプチド及びヌクレオチド配列とその医薬的使用に関する。より特定的には本発明は、ＦＥ６５タンパク質とＡＰＰの細胞質領域との相互作用のレベルに干渉することによってＡＰＰのエンドサイトーシス現象を少なくとも部分的に阻害し得る新規なペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＡＰＰのエンドサイトーシスを阻害し得るペプチド及び対応するヌクレオチド配列本発明は、新規なペプチド及びヌクレオチド配列とそれらの医薬的使用に関する。より特定的には本発明は、ＡＰＰのエンドサイトーシス現象を少なくとも部分的に阻害し得る新規なペプチドに関する。アミロイド斑の主要な構成成分であるアミロイドβペプチドは、ＡＰＰ（アミロイド前駆ペプチド）の開裂によって生成され、約４０個のアミノ酸から成る４ｋＤａのペプチドである。このペプチドはアルツハイマー病及びトリソミー２１症候群という通称のダウン症候群の患者の脳に大量に蓄積される。ＡＰＰはトランスメンブラン領域、細胞外ドメイン及び細胞質ドメインを含む複数のドメインを有する１００〜１４０ｋＤａの糖タンパク質である。アミロイドβペプチド発現に特に関与する分子の領域はトランスメンブランドメインに部分的にオーバーラップし、また細胞外ドメインの内部に伸びている。ＡＰＰは選択的スプライシングによって主として３つの形態で形成され、これらの形態は特性決定されている。ＡＰＰの遺伝子は染色体２１に局在し、家族性形態のアルツハイマー病患者の３〜５％で染色体２１の突然変異が同定されている。ＡＰＰの生理学的作用は現状ではまだ完全には解明されていない。しかしながら、ＡＰＰはシナプス接触に関与し、成長調節因子として作用し、ニューロン保護作用を有すると考えられている。最近の文献のデータは、ＡＰＰのエンドサイトーシスがアミロイドβペプチドの産生に重要な役割を果たすこと、及び、エンドサイトーシスシグナルとして使用される配列要素が細胞質領域の内部で同定されたことを示している。例えば、ＡＰＰのサイトゾルのＣ末端ドメインの欠失したｃＤＮＡの構築物がトランスフェクトされた細胞は、可溶性形態のＡＰＰを産生することはできるが、アミロイドβペプチドを産生することはできない。しかしながら、ＡＰＰのエンドサイトーシスの活性化とエンドサイトーシス関連シグナルの形質導入とを生じさせるｉｎｖｉｖｏイベントは未だ詳細には解明されていない。従って、アルツハイマー病及びより普遍的な神経変性疾患を理解しその治療方法を開発するためには、細胞内のエンドサイトーシスに関連する上記シグナルの正確な役割、それらの作用方法及び特性を解明することが最も重要である。出願人は、ＦＥ６５タンパク質が、脳内で転写活性タンパク質として作用するだけでなく、ＡＰＰの細胞質領域レベルにも相互作用してＡＰＰのエンドサイトーシスの調節に干渉することを知見し、本発明に到達した。より特定的には本発明は、ＡＰＰのエンドサイトーシスの活性化シグナルの形質導入に関与するＦＥ６５タンパク質の特定領域（いわゆるエフェクター領域）の同定及びキャラクタリゼーションに基づく。このような領域の存在が証明されたので、医薬として有用な新規なペプチドの製造が実現可能になったのである。本文中で使用した“ＦＥ６５タンパク質”なる用語は、ＦＥ６５タンパク質自体及びそのすべての相同形態を含む。“相同形態”なる用語は、種々の細胞、特にヒトまたは他の生物の細胞に由来するタンパク質であって、ＦＥ６５タンパク質と同じタイプの活性を有しているＦＥ６５タンパク質に等価のすべてのタンパク質を意味する。このような相同配列はハイブリダイゼーション実験によって得られる。ここで“等価の”と呼ばれるタンパク質は、請求の範囲に記載のＦＥ６５タンパク質と同等の生理的挙動を示すタンパク質を意味しており、同等の生理的挙動を示すために有効な値の相同性（％）を有していればよい。従って、本発明の第一の目的は、ＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用レベルに少なくとも部分的に干渉し得るペプチドを提供することである。本発明のペプチドによるこのような干渉は種々の形態で出現し得る。本発明のペプチドは、ＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用を少なくとも部分的に低減、阻害または刺激し得る。このような相互作用に少なくとも部分的に拮抗し得るペプチドが好ましい。本発明の特定実施態様によれば、ペプチドはＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用ドメインのレベルに関与し得る。より好ましくは、本発明のペプチドは、配列１、配列２またはその誘導体の１つに存在するＦＥ６５タンパクをコードするペプチド配列の全部または一部を含む。本発明で使用された“誘導体”なる用語は、１つまたは複数の遺伝的特性及び／または化学的特性の修飾によって遺伝コードが変性され、本発明の配列とは異なる配列をもつすべての配列を意味する。“誘導体”なる用語はまた、これらの配列またはそのフラグメントとハイブリダイズする配列であってＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用レベルに作用する能力を維持しているすべての配列を意味する。“遺伝的特性及び／または化学的特性の修飾”なる用語は、１つまたは複数の残基の突然変異、置換、欠失、付加及び／または修飾を意味する。“誘導体”なる用語はまた、他の細胞ソースに由来する配列、特にヒトまたは他の生物の細胞に由来する配列であって、本発明の配列と同じタイプの活性を有している本発明の配列に相同の配列を含む。このような相同配列は、ハイブリダイゼーション実験によって得られる。ハイブリダイゼーションは、核酸バンクを出発材料とし、天然型（ｎａｔｉｖｅ）配列またはそのフラグメントをプローブとして用い、種々のハイブリダイゼーション条件で行う(分子生物学の汎用技術に関しては、Ｍａｎｉａｔｉｓら，参照)。このような誘導体は種々の目的、特に、治療効率の向上、副作用の抑制、または、薬剤動態学的及び／または生物学的な新規な特性の付与、などの目的で製造される。ＦＥ６５タンパク質及びその相同形態に由来のペプチドとしては特に、ＡＰＰの細胞質領域と相互作用する能力を有しているか非機能のエフェクター領域を有しているペプチドがある。このようなペプチドは、ＦＥ６５タンパク質及びその相同形態のエフェクター領域の欠失、突然変異または破壊によって得られる。このような修飾は例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発、付加要素もしくは合成配列の導入、または、初期要素の欠失もしくは置換によって得られる。このようにして得られた誘導体は、ＦＥ６５タンパク質及びその相同形態がＡＰＰ結合部位に結合することを部分的に阻害する活性を有することが証明されている。勿論、このために当業者に公知のいかなる技術を使用してもよい。本発明のペプチドはまた、上記に定義の配列のフラグメントであってもよい。このようなフラグメントは種々の方法で作製できる。特に、当業者に公知のペプチドシンセサイザーを使用し本発明の配列に基づいて化学的方法で合成できる。また、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞宿主中で発現させる遺伝的方法で合成できる。このヌクレオチド配列は、本発明のペプチド配列及び遺伝コードに基づいてオリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用して化学的に合成できる。このヌクレオチド配列はまた、当業者に公知の技術を用いて本発明の配列を酵素的切断、結合、クローニングなどで処理することによって作製することもでき、または、本発明の配列から作製したプローブでＤＮＡバンクをスクリーニングすることによって作製することもできる。更に、本発明のペプチド、即ち、ＦＥ６５タンパク質及びその相同形態とＡＰＰの細胞質領域との相互作用を少なくとも部分的に低減または阻害し得るペプチドはまた、該ペプチドの配列がＦＥ６５タンパク質及びその相同形態の配列中のＡＰＰの細胞質領域に相互作用する部位の配列に一致するようなペプチドであってもよい。また、上記に定義のペプチドと競合的に標的細胞に相互作用し得るペプチドも本発明に包含される。本発明のペプチドの配列に基づいてこのようなペプチドを合成し、得られたペプチドと上記に定義のペプチドとの競合能力を測定する。本発明の別の目的は、上記に定義のペプチドに対するポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこれらの抗体のフラグメントを提供することである。このような抗体は当業者に公知の方法によって得られる。特に、動物を本発明のペプチドで免疫感作し、血液を採取し、抗体を単離することによって目的の抗体が得られる。また、当業者に公知の技術でハイブリドーマを調製することによって目的の抗体が得られる。より好ましくは、本発明の抗体または抗体フラグメントは、本発明のペプチドとＡＰＰの細胞質領域との相互作用を少なくとも部分的に阻害する能力を有している。従って、これらの抗体または抗体フラグメントは、ＡＰＰのエンドサイトーシスを変調するために使用できる。更に、これらの抗体はまた、生物サンプル中のＡＰＰの発現または超発現を検出及び／または定量するために使用でき、その結果としてＡＰＰの活性化状態に関する情報を得るために使用できる。本発明はまた、医薬として有用な非ペプチド化合物または非ペプチド単独化合物を提供する。実際、本発明に記載の活性タンパク質モチーフに基づいて、医薬用途に適性の非ペプチド単独化合物を、ＦＥ６５タンパク質依存性シグナル伝達経路の阻害分子として作製し得る。本発明の目的はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供することである。特に、配列１、配列２またはそれらの誘導配列の１つに存在する配列の全部または一部を含む配列を提供する。本文中で使用された“誘導配列 ”なる用語は、配列１または配列２またはそれらのフラグメントとハイブリダイズしており本発明のペプチドをコードしている配列、及び、これらの配列から遺伝コードの変性によって得られた配列を意味する。本発明の種々のヌクレオチド配列は人工配列でもよくそうでなくてもよい。配列はゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ハイブリッド配列、合成配列、半合成配列のいずれでもよい。これらの配列は、ＤＮＡバンク（ｃＤＮＡバンク、ゲノムＤＮＡバンク）のスクリーニング、化学的合成、バンクスクリーニングによって得られた配列の化学的または酵素的修飾を含む混成方法、などによって得られる。このようなヌクレオチド配列は本発明のペプチドを産生させるために使用できる。従って本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列を含む細胞を該配列の発現条件下で培養し、産生されたペプチドを回収するペプチドの製造方法を提供する。この方法では一般に、ペプチドをコードする部分が宿主細胞中で該ペプチドを発現させるシグナルのコントロール下に配置される。これらのシグナル（プロモーター、ターミネーター、分泌“リーダー”配列、など）の選択は、使用される宿主細胞次第で異なっている。更に、本発明のヌクレオチド配列が、自律複製型ベクターまたは一体型ベクターの構成要素となってもよい。自律複製型ベクターは例えば、選択された宿主体内の自律複製配列を利用することによって得られる。一体型ベクターは例えば、宿主のゲノムのいくつかの領域の相同配列を利用し、相同組換えによってベクターを組込むことによって得られる。組換え法によって本発明のペプチドを産生するために使用される宿主細胞は真核細胞でもよく原核細胞でもよい。適当な真核細胞宿主としては、動物細胞、酵母または菌類がある。酵母としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，ＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓまたはＨａｎｓｅｎｕｌａがある。動物細胞としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７などの細胞がある。菌類細胞としては特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ種がある。原核細胞宿主としてはＥ．ｃｏｌｉ、ＢａｃｉｌｌｕｓまたはＳｔｒｅＰｔｏｍｙｃｅｓのような細菌の使用が好ましい。本発明の核酸配列はまた、医薬として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンス遺伝子配列の作製に使用できる。アンチセンス配列は、所与の遺伝子のコーディング鎖に相補的であり従って転写されたｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズできその結果として該ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されることを阻害する短いオリゴヌクレオチドである。従って、ＡＰＰの細胞質領域とＦＥ６５タンパク質との相互作用を少なくとも部分的に阻害し得るアンチセンス配列を提供することも本発明の目的である。このような配列は上記に定義の核酸配列の全部または一部から成る。一般には、ＡＰＰの細胞質領域と相互作用するペプチドをコードする配列の相補的配列またはそのフラグメントから成る。このようなオリゴヌクレオチドは例えば、断片化などの方法または化学合成によって得られる。本発明の配列は遺伝子治療の分野で、ＡＰＰの細胞質領域とＦＥ６５タンパク質との相互作用を変調し得るアンチセンス配列またはペプチドをｉｎｖｉｖｏで導入するかまたは発現させるために使用され得る。このためにｉｎｖｉｖｏ投与が可能なウイルス性または非ウイルス性のベクターに配列を組込む（ＭｅｄｅｃｉｎｅｅｔＳｃｉｅｎｃｅｓ７（１９９１）７０５）。本発明に好適なウイルスベクターとしては特に、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウィルスまたはヘルペスウイルス型のベクターがある。本発明の目的はまた、本発明のポリペプチドをコードするヘテロロガス核酸配列を含む欠陥組換えウイルスを提供することである。本発明はまた、上記に定義のヌクレオチド配列とハイブリダイズでき遺伝子治療の分野で有用な合成または非合成のヌクレオチドプローブを提供し得る。このようなプローブは、ＡＰＰの発現または超発現を検出するため、あるいは、遺伝的異常（誤ったスプライシング、多形性、点突然変異、など）を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ診断ツールとして使用され得る。これらのプローブはまた、別の細胞ソース及び好ましくはヒト起原の細胞から上記に定義のペプチドをコードするホモロガス核酸配列を検出及び単離するために使用され得る。本発明のプローブは一般に、少なくとも１０個の塩基を含み、例えば上記配列の１つまたはその相補鎖全部を含み得る。好ましくはこれらのプローブを使用に先立って標識する。このために、当業者に公知の種々の技術（放射性標識、酵素標識、など）を使用し得る。本発明の目的は更に、少なくとも１つの上記に定義のペプチドを有効成分として含む医薬組成物を提供することである。本発明の目的はまた、少なくとも１つの上記に定義の抗体及び／または抗体フラグメントを有効成分として含む医薬組成物並びに、少なくとも１つの上記に定義のヌクレオチド配列を有効成分として含む医薬組成物を提供することである。更に、本発明の目的はまた、上記に定義のペプチド、抗体及びヌクレオチド配列が互いにまたは別の有効成分と共存している医薬組成物を提供することである。本発明の医薬組成物の使用目的は、ＡＰＰタンパク質の活性化を変調し、その結果としてそのエンドサイトーシスを変調しアミロイドβペプチドの産生を変調することである。より特定的にはこれらの医薬組成物は、ＦＥ６５タンパク質とＡＰＰの細胞質領域との相互作用を変調する。より好ましくはこれらの医薬組成物は、ＦＥ６５タンパク質とＡＰＰの細胞質領域との相互作用を少なくとも部分的に低減または阻害する。より好ましくはこれらの医薬組成物は、例えばアルツハイマー病及びトリソミー２１症候群のような神経変性疾患を治療する。本発明の目的は更に、ＡＰＰのエンドサイトーシスの活性化を変調するためまたは神経変性疾患の型別を判定するために上記に記載の分子を使用することである。本発明は特に、ＡＰＰのエンドサイトーシスの活性化を少なくとも部分的に阻害するためのこれらの分子の使用に関する。本発明の別の利点は、本発明の非限定的代表例である以下の記載及び実施例から明らかにされるであろう。図面の簡単な説明図１は、ベクターｐＧＡＬ４ＤＢ−ＣＡＰＰの構造を表す。図２は、実施例３で得られたゲル上のプラスミドＤＮＡを表す。図３は、異なる起原のＦＥ６５のヌクレオチドフラグメントの比較を示す。使用した材料及び方法（１）使用した酵母菌株：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属のＹＣＭ株（ＭＡＴａ，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ａｄｅ２−１０１，ｌｙｓ２−８０１，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｃａｎｒ，ｇａｌ４−５４２，ｇａｌ８０−５３８，ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１／１０−ｌａｃＺ，ＬＹＳ：：ＧＡＬ１／１０−ＨＩＳ３）は、２ハイブリッド系による脳の融合バンクのスクリーニングツールとして使用した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ属のＬ４０株（Ｍａｔａ，ｈｉｓ３Ｄ２００，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ａｄｅ２，ＬＹＳ２：:（ｌｅｘＡｏｐ）４−ＨＩＳ３，ＵＲＡ３：：（ｌｅｘＡｏｐ）８−ＬａｃＺ，ＧＡＬ４）は、一方のタンパク質がＬｅｘＡタンパク質から成る融合タンパク質が形成されるときのタンパク質−タンパク質相互作用を確認するために使用した。ＬｅｘＡタンパク質は、リポーター遺伝子ＬａｃＺ及びＨｉｓ３の発現をコントロールする応答要素ＬｅｘＡを認識し得る。これらの細胞を以下の培養培地で培養した。ＹＰＤ完全培地： −酵母抽出物（１０ｇ／リットル）(Ｄｉｆｃｏ); −バクトペプトン（２０ｇ／リットル）(Ｄｉｆｃｏ); −グルコース（２０ｇ／リットル）(Ｍｅｒｃｋ)。この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固体培地とした。ＹＮＢ最小培地： −酵母窒素塩基（アミノ酸非含有）(６．７ｇ／リットル）(Ｄｉｆｃｏ); −グルコース（２０ｇ／リットル）(Ｍｅｒｃｋ)。この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固体培地とした。酵母の栄養要求株がこの培地で増殖できるためには、培地にアミノ酸または該アミノ酸を与える窒素含有塩基を５０ｍｇ／ｍｌで添加する必要がある。細菌汚染を防止するために培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加える。（２）使用した細菌株：遺伝子型ｓｕｐＥ，ｈｓｄ△５，ｔｈｉ，△(ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ)，Ｆ’〔ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｌａｃＩｑｌａｃＺ△Ｍ１５〕の大腸菌ＴＧＩ株。使用した組換えプラスミドの増幅及び単離手段としてこの菌株を使用した。この菌株を以下の培地で培養した。ＬＢ培地： −ＮａＣｌ（５ｇ／リットル）(Ｄｉｆｃｏ); −バクトトリプトン（１０ｇ／リットル）(Ｄｉｆｃｏ); −酵母抽出物（５ｇ／リットル）(Ｄｉｆｃｏ)。この培地に２０ｇ／リットルの寒天（Ｄｉｆｃｏ）を加えて固体培地とした。アンピシリンは、アンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドを受容した細菌を選択するためにマーカーとして使用できるので、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えた。（３）使用したプラスミド：ベクターｐＧＢＴ１０（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、細菌及び酵母の複製起点を有している５．４ｋｂのシャトルプラスミドであり、細菌及び酵母の双方の体内で高いコピー数で複製され得る。このプラスミドは、融合タンパク質を形成するためにＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードする配列の下流でターミネーターの上流に存在する多重クローニング部位を含む。このプラスミドはまた、トリプトファン非含有の最小培地でｔｒｐ１遺伝子型の酵母を選択するために該遺伝子型を相補し得るＳ．ｓｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子を含む。このベクターは、アンピシリン含有培地でアンピシリン耐性遺伝子を有する細菌が選択されるようにアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。ベクターｐＧＡＤＩ１０は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから提供されるベクターであり、ＧＡＬ４のトランス作用転写活性ドメインとＥｃｏＲＩ部位に挿入された脳バンク由来のｃＤＮＡでコードされたタンパク質との融合タンパク質を酵母の体内で発現させ得る。ベクターｐＬｅｘ９（ｐＢＴＭ１１６）（Ｂａｒｔｅｌら，Ｄ．ＡＨａｒｔｌｅｙＥｄ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｐｒｅｓｓ，１５３頁）は、ｐＧＢＴ１０に相同の５ｋｂのベクターであり、融合タンパク質を形成するために細菌リプレッサーＬｅｘＡをコードする配列の下流でターミネーターの上流に存在する多重クローニング部位を含む。（４）使用した合成オリゴヌクレオチド：ＣＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣ(配列３); ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＣ(配列４)。これらのオリゴヌクレオチドから、ＥｃｏＲＩ部位及びＳａＩＩ部位をもつＣＡＰＰに対応するＰＣＲフラグメントが得られた。ＡｐｐｌｉｅｄＳｙｓｔｅｍＡＢＩ３９４−０８でオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドをアンモニアによって合成マトリックスから分離し、１０倍量のｎ−ブタノールによって２回沈殿させ、次いで水に戻す。光学密度の測定によって定量する(１ＯＤは３０μｇ／ｍｌに相当する)。（５）プラスミドＤＮＡの調製：大量のＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａの高速ＤＮＡ調製キットを使用して調製する。少量のＤＮＡは以下の手順で調装する。プラスミドを含む細菌を２ｍｌのＬＢ培地に入れ、撹拌振盪装置内で少なくとも４時間培養する。次いで細菌をエッペンドルフ管で１４，０００ｒｐｍで２分間遠心し、沈渣を１００μｌの溶液Ｉ（５０ｍＭのグルコース、２５ｍＭのトリス−ＨＣＩバッファ，ｐＨ８、１０ｍＭのＥＤＴＡ，ｐＨ８）に再度懸濁させ、２００μｌの溶液ＩＩ（０．２ＭのＮａＯＨ、１％のＳＤＳ）によって溶菌する。溶菌液を次に、１５０μｌの溶液ＩＩＩ（３Ｍの酢酸カリウム、１１．５％（ｖ／ｖ）の氷酢酸）で中和する。フレーク状沈殿物が得られるまで管を撹拌した後、１５０μｌのフェノール／クロロホルム混合物（水中に飽和した５０％フェノールと５０％クロロホルム）を添加し、全体を３０秒間撹拌する。１４，０００ｒｐｍで２分間遠心後、ＤＮＡを含有する水相を回収する。次に、０．５倍量のイソプロパノールを添加して沈殿させ、次いで１４，０００ｒｐｍで５分間遠心し、風乾し、最後に２０μｌのＴＥＲＮアーゼ（５０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼを含む１０ｍＭのトリス−ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡの溶液）に戻す。（６）ＤＮＡの酵素的増幅またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応): ＤＮＡマトリックス、ｄＮＴＰ(０．２ｍＭ)、ＰＣＲバッファ(１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＫＣｌ、０．０１％のゼラチン)、０．５μｇの各オリゴヌクレオチド及び２．５ＩＵのＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の存在下、ホルムアミド（５％）添加または非添加で、最終容量１００μｌでＰＣＲ反応を行う。サンプルの蒸発を防ぐために混合物を２滴のパラフィン油で被覆する。使用した装置はＡｐｐｌｉｇｅｎｅの“ＣｒｏｃｏｄｉｌｅＩＩ”である。マトリックスの変性温度として９０℃、オリゴヌクレオチドとマトリックスとのハイブリダイゼーション温度としてはオリゴヌクレオチドの分離温度よりも５〜１０℃低い温度、酵素による伸長温度として７２℃を使用した。（７）結合：すべての結合反応は、１００〜２００ｎｇのベクター、０．５〜２μｇのインサート、４０ＩＵの酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）及び結合バッファ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．８；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＤＴＴ；１ｍＭのＡＴＰ）の存在下、最終容量１０μ１で＋１４℃で一夜処理することによって行う。陰性対照として、インサート非存在のベクターを結合処理する。（８）プラスミドによる細菌の形質転換プロトコル：結合反応物全量（１０μｌ）を用いて、Ｃｈｕｎｇら（ＰＮＡＳ，１９８８８６，２１７２−２１７５）の方法によってコンピテントにした細菌ＴＧ１を形質転換させる。液体ＬＢ培地中の細菌ＴＧ１を撹拌器付きインキュベーターで６００ｎｍのＯＤが０．６になるまで３７℃で数時間培養する。次いで培地を６，０００ｒｐｍで１０分間遠心する。出発培養培地の十分の一の量に対応する量のＴＳＢ（ＬＢ培地＋１００ｇ／リットルのＰＥＧ４，０００、５％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのＭｇＳＯ４）に細菌沈渣を戻すことによってコンピテント細菌を得る。４℃で３０〜６０分間のインキュベーション後、２００μｌの細菌を結合産物に氷土で１５分間接触させる。２００μｌのＬＢを添加した後、細菌を３７℃で３０分間インキュベートし、次いでＬＢ培地＋アンピシリンで平板培養する。（９）ＤＮＡの分離及び抽出手順：電気泳動法を用いＤＮＡをサイズに基づいて分離する。このために、分離すべきフラグメントのサイズに応じて種々のゲルを使用する。 −ＤＮＡの小フラグメント（７５〜５００ｂｐ）の分離には６％、１０％及び２０％のプレキャストポリアクリルアミドゲル(Ｎｏｖｅｘ)、 −ＤＮＡの大フラグメント（５００ｂｐ以上）の分離にはＴＢＥバッファ（９０ｍＭのトリス塩基；９０ｍＭのホウ酸塩；２ｍＭのＥＤＴＡ）中の１％アガロースゲル（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、 −小フラグメント（５００ｂｐ以下）の分離にはＴＢＥバッファ中の２％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル(ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ)。アガロースゲル及びポリアクリルアミドゲルのいずれの場合にも電気泳動はＴＢＥバッファ中、分子量マーカー（１Ｋｂのｌａｄｄｅｒ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の存在下で行う。ＤＮＡをゲルに配置する前に、ＤＮＡを十分の一の量のデポーブルー（２００ｇ／リットルのフィコール、０．５ｇ／リットルのブロモフェノールフルー、５０ｍＭのＥＤＴＡ）と混合する。１００ボルトで泳動させ、臭化エチジウム（ゲル１ｍｌあたり０．５μｇの濃度）で染色した後、ＵＶランプでバンドを可視化する。アガロースゲルのバンドからＤＮＡを抽出するために以下の手順の電気溶出を行う。即ち、ＤＮＡフラグメントを含むゲル切片をメスで裁断し、１００〜５００μｌのＴＢＥを収容した透析バッグに入れ、２個のクリップで閉鎖する。全体を電気泳動槽に入れ、１００ボルトの電界を作用させる。ゲルから取り出したＤＮＡを次に、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出することによって精製し、０．３Ｍの酢酸ナトリウムと２．５倍量の無水エタノールとの存在下で沈殿させる。遠心後(１４，０００ｒｐｍで５分間)、ＤＮＡ沈渣を乾燥し、２０μｌの水に戻す。（１０）蛍光法によるプラスミドＤＮＡの配列決定異なる蛍光マーカーを有する４つのジデオキシリボヌクレオチドを用い、Ｓａｎｇｅｒ法に従って配列決定を行う。いずれか１つのジデオキシリボヌクレオチドが取り込まれると、配列決定すべきＤＮＡのＴａｑポリメラーゼによる複製が停止する。この反応によって種々のサイズのＤＮＡが得られる。どのＤＮＡも、４つのジデオキシリボヌクレオチドのいずれか１つから成る３’末端を有している。１μｇのプラスミドと４ピコモルのプライマーとを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからＰｒｉｓｍ（登録商標）として販売されている９．５μｌの“プレミックス”に添加する。９６℃で３０秒間の変性段階と５０℃で１５秒間のハイブリダイゼーション段階と６０℃で４分間の伸長段階とから成るサイクルを２５回繰返すことによってＰＣＲを行うために２０μｌの最終容量が必要である。増幅後に得られたＤＮＡフラグメントを、排除カラム（ＣｌｏｎｔｅｃｈのＣｈｒｏｍａｓｐｉｎ−３０）で精製し、次いでＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥する。全部のフラグメントを、２４μｌのＥＤＴＡ（５０ｍＭ）と１２０μｌの脱イオン化したホルムアミドとから成る混合物５μ１に戻す。９６℃で３分間変性した後、３〜５μｌを電気泳動ゲルに配置する。種々のＤＮＡフラグメントをサイズに従って分離し、順次にＡｐｐａｒｅｉｌ３７０ＤＮＡシークエンサー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のレーザー読取装置に通し、種々の蛍光を検出する。（１１）脳バンク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ(登録商標)）のプラスミドの調製: 脳のｃＤＮＡの融合バンクは細菌の形態で販売されている。これらの細菌は、ヒト脳のｃＤＮＡに対応するインサートを含むプラスミドｐＧＡＤ１０を含有している。このバンクのｃＤＮＡは、オリゴｄＴの技術及び変性オリゴヌクレオチドの技術によって得られる。後者の技術を用いると、オリゴｄＴの技術によって得ることが難しいｍＲＮＡの５’部分が得られる。これらのｃＤＮＡはベクターｐＧＡＤ１０のＥｃｏＲＩ部位のレベルにクローニングされている。脳の融合バンクの名称を確認し、バンクの２μｌの細菌を８ｍｌのＬＢ培地に予め導入し、バンクとしての適格性を維持するように固体培地で非集密的に平板培養する。即ち、ＬＢ培地＋アンピシリンを入れた７７０ｃｍ２容の１６個の容器で平板培養した。出現したコロニーを各容器あたり３０ｍｌの液体ＬＢ培地＋アンピシリンに戻す。次に、得られた懸濁液を三角フラスコ(Ｅｒｌｅｎ)に入れ、振盪装置内で３７℃で３時間インキュベートする。次にマキシプレップ(Ｍａｘｉｐｒｅｐ)の技術によってこれらの菌株からＤＮＡを抽出する。ＤＮＡの濃度を２６０ｎｍで測定する。（１２）プラスミドによる酵母の形質転換: １００ｍｌの液体培地で予め培養した酵母を、３，０００ｒｐｍで３分間遠心後に採取し、１ｍｌの無菌水に懸濁させる。３，０００ｒｐｍで３分間遠心した後、細胞沈渣を再度１ｍｌの無菌水に懸濁させ、次いで再度遠心する。培養培地を痕跡量まで除去するためにこの処理をもう一度繰返す。次に、酵母を１ｍｌの形質転換溶液Ｉ（０．１ＭのＬｉＡｃ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）に戻し、３，０００ｒｐｍで３分間遠心する。細胞沈渣を再度１ｍｌの形質転換溶液Ｉに戻す。５０μｌのこの酵母懸濁液を５０μｇのサケ精子ＤＮＡ及び１〜５μｇのプラスミドＤＮＡに接触させる。次に、３００ μｌの形質転換溶液ＩＩ（４０％のＰＥＧ４０００中の０．１ＭのＬｉＡｃ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ）を添加し、次いで全体を２８℃で３０分間インキュベートする。次に、形質転換混合物に４０℃の湯煎で熱ショックを１５分間作用させ、次いで全体を１５，０００ｒｐｍで１分間遠心して細胞沈渣を回収する。この沈渣を２００μｌの水に戻し、次いで形質転換プラスミドに含まれるマーカーアミノ酸を含まないゲル化最小培地で平板培養する。次に、酵母を２８℃で７２時間培養する。脳ｃＤＮＡバンクによって酵母を形質転換させるための処理手順：使用した酵母は、ＡＰＰのＣ末端部分をコードするＣＡＰＰがＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合したプラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＣＡＰＰを含む。この酵母を２５０ｍｌのＹＮＢ＋Ｈｉｓ＋Ｌｙｓ＋Ａｄ＋Ｌｅｕ最小培地中、撹拌下、２８℃で、１０７細胞／ｍｌの密度まで培養する。細胞を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって回収し、２５０ｍｌの水に戻す。再度遠心した後、細胞沈渣を１００ｍｌの水に戻し、遠心を繰返す。次に、沈渣を１０ｍｌの形質転換溶液Ｉに戻し、撹拌下に２８℃で１時間インキュベートする。遠心後、細胞を２．５ｍｌの形質転換溶液Ｉ、１００μｌの脳ｃＤＮＡバンク、２０ｍｌの形質転換溶液ＩＩに混合し、次いで撹拌下に２８℃で１時間インキュベートする。この形質転換混合物に４２℃で２０分間の熱ショックを与える。速心（３，０００ｒｐｍで５分間）を３回連続して繰返す。一回の遠心毎に、沈渣を１０ｍｌの無菌水に戻す。３回目の沈渣を２．５ｍｌのＰＢＳに戻す。このようにして細胞毒性ＰＥＧを除去した。得られた懸濁液の２．４ｍｌをアミノ酸Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｄを含有する２５０ｍｌの最小培地に播種するために使用し、２８℃の振盪装置で一夜培養する。残りの懸濁液の１００μｌを形質転換効率の測定に使用する。測定のために、懸濁液を１０^-2、１０^-3及び１０^-4に希釈し、アミノ酸Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｄを含有する最小培地で平板培養した。２８℃で２日間培養した後に得られたコロニーをカウントした。“コロニー数×希釈度”の式を用いて形質転換率を算出する。一夜培養物を遠心し（３，０００ｒｐｍで５分間）、無菌水で連続２回洗浄する。次に、沈渣を２．５ｍ１の水に戻す。２．４ｍｌを無菌水で１０ｍｌにし、ＹＮＢ＋Ｌｙｓ＋Ａｄ培地を入れた４３５ｃｍ²容の１０個の容器に播種し、３日間インキュベートする。残りの１００μｌを形質転換率の測定に使用した場合と同様に処理し、一夜培養によるコロニー数の増幅率を測定する。酵母からＤＮＡ（ゲノム及びプラスミド）を抽出するための処理手順：３ｇの４５０μｍ径のガラスビーズ及び２００μｌのフェノール／クロロホルムの存在下、２００μ１のＴＥＬＴ溶液（２％のトリトンＸ１００、１％のＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス，ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ）に、平均的な長さの酵母クローンを導入する。この混合物を渦流によって１５分間撹拌し、次いで１４，０００ｒｐｍで２分間遠心する。上清に含まれているタンパク質フレーク及びＤＮＡを除去しないで上清を収集し、２．５倍量の無水エタノールで沈殿させる。１４，０００ｒｐｍで２分間遠心した後、ＤＮＡ沈渣を乾燥し、２０μｌのＴＥＲＮアーゼに戻す。このＤＮＡ溶液はゲノムＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの混合物であり、細菌を形質転換させるために直接使用できる。プラスミドＤＮＡだけが細菌中で複製され、ミニプレップの技術で分析され得る。（１３）βガラクトシダーゼの活性試験：単離した酵母クローンを入れるシャーレにニトロセルロースシートを予め敷込む。クローンの位置が吸着現象によって正確に転写される。次に、ニトロセルロースシートを液体窒素に３０秒間浸漬させて酵母を破裂させ、βガラクトシダーゼ活性を遊離させる。解凍後、コロニー担持面を上にしたニトロセルロースシートを、１．５ｍｌのＰＢＳ溶液（６０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、４０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ₄、１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＳＯ４，ｐＨ７）とＮ，Ｎ−ジチメルホルムアミド中に５０ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれる１０〜３０μｌのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）とを予め含浸させたワットマンペーパーを敷いた別のシャーレに配置する。次いでシャーレを３７℃のインキュベータに入れ、乾燥しないように蓋を閉じる。青色が呈示されるまでの所要時間には極めてばらつきがあり、数分間から数時間の範囲にわたる。この試験は必ず、相互作用が認識されており迅速に青色を呈示する陽性対照の存在下で行う必要がある。実施例１：アミロイド前駆ペプチドのＣ末端部分（ＣＡＰＰ）とＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質を発現させ得るベクターの構築ダブルハイブリッド系を用いるバンクをスクリーニングするためには、ＡＰＰのＣ末端領域（ＣＡＰＰ）をトランス作用転写活性タンパク質ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合させる必要がある。この融合タンパク質を発現させるために、ベクターｐＧＢＴ１０（マトリックス及び方法参照）を使用し、このベクターに、配列１で示した配列中に存在するＣＡＰＰをコードする配列を、ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢ）のＤＮＡ結合ドメインに対応する配列と同じ読取り枠で導入した。ＡＰＰの最終４６個のアミノ酸に対応する１３８ｂｐのＤＮＡフラグメント配列は、末端にＥｃｏＲＩ部位及びＳａｌＩ部位を導入したオリゴヌクレオチド（配列３及び配列４）のＰＣＲによって得られた。ＧＡＬ４ＤＢに対応する配列の下流でプラスミドｐＧＢＴ１０の多重クローニング部位のＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位との間にＰＣＲフラグメントを導入し、ベクターｐＧＡＬ４ＤＢ−ＣＡＰＰ（図１）を形成した。所望の構築物が得られたか否かをＤＮＡの配列決定によって確認した。この配列決定によって、得られたフラグメントがＰＣＲ反応中に生じた突然変異を有していないこと、及び、このフラグメントがＧＡＬ４ＤＢに対応するフラグメントと同じ読取り枠に融合したことが確認された。実施例２：脳融合バンクのスクリーニング融合バンクのスクリーニングによって、本発明の有益なタンパク質と相互作用し得るＧＡＬ４のトランス作用転写活性ドメインに融合したタンパク質を産生するクローンを同定し得る。この相互作用は、ＹＣＭ菌株中のリポーター遺伝子Ｈｉｓ３及びＬａｃＺの発現を誘発できるようにトランス作用因子を再構成する。スクリーニングを行うために、ヒト脳由来のｃＤＮＡから得られた融合バンクを選択した。このバンクは細菌の形態で提供されたので、バンクから先ずプラスミドＤＮＡを精製した。（２．１）融合バンクのプラスミドＤＮＡの調製：脳ｃＤＮＡバンクのプラスミドＤＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈ（登録商標）プロトコル（材料及び方法の項１１参照）によって抽出した。この調製中には、バンクとしての適格性を維持すること、即ち、バンクを構成する独立プラスミドの数を１．２×１０⁶に維持することが重要であった。調製中のバンクのプラスミドの損失を配慮して、バンクとしての適格性を維持するコロニー数のほぼ２倍、即ち４×１０６コロニーに対応する数の単離細菌コロニーから得られたプラスミドＤＮＡのロットを構築した。（２．２）脳バンクによる形質転換及びβガラクトシダーゼ活性試験による選択スクリーニングのときには、融合バンクの各独立プラスミドが少なくとも１つの酵母体内でプラスミドＧＡＬ４ＤＢ−ＣＡＰＰと確実に共存していなければならない。このような共存を確実にするためには、酵母を十分な効率で形質転換する必要がある。従って、酵母の形質転換のために、ＤＮＡＩμｇあたり１０５の形質転換細胞という効率が得られるような形質転換プロトコルを選択した。更に、異なる２つのプラスミドによる酵母の同時形質転換は形質転換効率を低下させるので、使用する酵母をプラスミドｐＧＡＬ４ＤＢ−ＣＡＰＰによって予め形質転換しておくのが好ましい。表現型Ｈｉｓ−、Ｌｙｓ−、Ｌｅｕ−のＹＣＭ−ＣＡＰＰ菌株を、融合バンクの１００μｇのプラスミドＤＮＡによって形質転換した。この量のＤＮＡから算定すると(材料及び方法参照)、１０７個の形質転換細胞が得られた。これはバンクを構成する独立プラスミドの数よりもやや多い数である。この結果から、バンクのプラスミドのほぼ全部が酵母の形質転換に使用されたと考えることができる。機能性のＧＡＬ４トランス作用因子を再構成し得る形質転換細胞をＹＮＢ＋Ｌｙｓ＋Ａｄ培地で選択した。この選択によって、表現型Ｈｉｓ＋をもつ１，０００個のクローンが得られた。得られたクローンの数が有効であることを別のリポーター遺伝子ＬａｃＺの発現によって確認するためにこれらの形質転換体のβガラクトシダーゼ活性を試験した。得られた１，０００個のクローンのうちの６８個のクローンが、タンパク質−タンパク質相互作用に対応し得るダブル表現型Ｈｉｓ＋、βＧａｌ＋を有していた。実施例３：バンクのプラスミドの単離ＣＡＰＰと相互作用し得るタンパク質を同定するために、ダブルハイブリッドスクリーニングによって選択された酵母に含まれている融合バンクのプラスミドを抽出した。このプラスミドを大量に得るためには、単離に先立って大腸菌を陽性酵母菌株のＤＮＡ抽出物によって形質転換しておくことが必要であった。この抽出物に含まれていたバンクのプラスミドは酵母／大腸菌シャトルプラスミドなので、細菌中で容易に複製され得る。同じく酵母中に存在するプラスミドＧＡＬ４ＤＢ−ＣＡＰＰが単離されないように、該プラスミドを含まない菌株を使用した。ＤＮＡ抽出物による酵母の形質転換後に得られた細菌コロニーのプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化及びＤＮＡフラグメントノのアガロースゲル分離によって分析した。分析した５つのクローン（７Ｄ、３Ｅ、９Ａ、３Ｈ、３Ｇ）（図２）で３つの異なる制限プロフィルが得られた。これらの結果は、クローン７Ｄの異なる２つの酵母クローンとクローン３Ｈ及び３Ｇ中には少なくとも２つの等しいプラスミドが存在することを示した。クローン３ＥのＤＮＡは表現型Ｈｉｓ＋及びβＧＡＬ＋の菌株から得られる。実施例４：同定されたプラスミドのインサートの配列の決定脳ｃＤＮＡバンクの挿入部位の近傍のＥｃｏＲＩ部位から５２ｂｐ離れたＧＡＬ４ＴＡ領域に相補的なオリゴヌクレオチド（配列５）から配列決定を行った。３つの配列を所与のバンクＧＥＮＢａｎｋ及びＥＭＢＬ（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂ）に含まれている配列と比較すると、菌株９Ａ及び３Ｈに由来のプラスミド中に存在していた配列２で示すｃＤＮＡの配列がＦＥ６５タンパク質をコードするマウス遺伝子に核酸レベルで８７％の相同を有しており、菌株７Ｄに由来のプラスミドの配列が同じ遺伝子に６０％の相同を有していることが判明した(図３参照)。菌株９Ａ及び３Ｈに由来のプラスミドの配列を分析すると、これらのプラスミドが同一ｍＲＮＡに対応する２つのオーバーラップ領域を含むことが判明する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/28 25/28 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】１．ＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用のレベルに干渉し得ることを特徴とするペプチド。２．干渉が、前記相互作用の低減、阻害または刺激であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。３．ＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用ドメインの処に結合し得ることを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。４．配列１、配列２またはこれらの配列の誘導体の１つの全部または一部を含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。５．ＦＥ６５タンパク質またはその相同形態の１つとＡＰＰの細胞質領域との相互作用ドメインのレベルで請求項１から４のいずれか一項に記載のペプチドと競合し得るペプチド。６．請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドの活性モチーフを非ペプチド構造または非ペプチド単独構造で複製することによって得られたＦＥ６５タンパク質とＡＰＰの細胞質領域との相互作用を変調し得る非ペプチドまたは非ペプチド単独の化合物。７．請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列。８．配列１、配列２またはこれらの配列に由来の１つの配列の全部または一部を含む配列であることを特徴とする請求項７に記載のヌクレオチド配列。９．ウイルス性または非ウイルス性のベクターに導入された請求項７または８に記載の配列。１０．請求項７または８に記載の配列のアンチセンスオリゴヌクレオチド。１１．請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドを対象とすることを特徴とする抗体または抗体フラグメント。１２．請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸または対応するｍＲＮＡにハイブリダイズし得るヌクレオチドプローブ。１３．請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１１に記載の抗体もしくは抗体フラグメントまたは請求項７から９のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つを有効成分として含む医薬組成物。１４．請求項７または８に記載のヌクレオチド配列が組込まれたウイルス性または非ウイルス性の組換えベクターを含むことを特徴とする請求項１３に記載の医薬組成物。１５．ベクターがレトロウイルス及びアデノウイルスから選択されたウイルスベクターであることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。１６．ＦＥ６５タンパク質とＡＰＰの細胞質領域との相互作用を変調するために使用されることを特徴とする請求項１３から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。１７．ＦＥ６５タンパク質とＡＰＰの細胞質領域との相互作用のレベルに干渉するために使用されることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。１８．神経変性疾患を治療するために使用されることを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。１９．神経変性疾患の型別を判定するための請求項１１に記載の抗体または抗体フラグメント及び／または請求項７または８に記載のヌクレオチド配列の使用。２０．請求項７または８に記載のヌクレオチド配列を含む細胞を前記配列の発現条件下で培養し、産生されたペプチドを回収することを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。２１．請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヘテロロガス核酸配列を含む欠陥組換えベクター。