JPH07508172A - 毛細血管拡張性運動失調相補群ｄ（ａｔｄｃ）の遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 毛細血管拡張性運動失調相補群Ｄ　（ＡＴＤＣ）の遺伝子発明の分野 本発明は、医療遺伝学の一般領域にあるものである。更に詳しくは、これは新規 な遺伝子、すなわち毛細血管拡張性運動失調の群りの遺伝子（ＡＴＤＣ遺伝子） の同定に関するものである。

この発明は、エネルギー省によって授与された約定番号ＤＢ−ＡＣ０３−７６− ＳＦＯＩＯ＋２および）■−７・１０５−ＩＥＮＧ−１８に基く政府支援をもっ て成された。政府は、この発明において確実な権利を有する。

発明の背景 毛細血管拡張性運動失調（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ　、　 ＡＴ）は、進行性の神経筋肉の問題、免疫不全、リンパ細網ガンの高い出現率、 および電離放射線（ｉｏｎｉｚｉｎｇ　ｒａｄｉａｔｉｏｎ）に対する感受性を 示すヒト常染色体の劣性疾患である［Ｔａｙｌｏｒ、［毛細直管拡張ｆ［運動失 調の細胞遺伝学４　、Ｂｒｉｄｇｅｓと１ｌａｒｎｄｃｎ　（編）、「毛細血管 拡張ｆｌｉｔ’動失贋−ガン、神経病理学および免疫不全との間の細胞および分 子的関連Ｊ中、第５３〜８２頁（ライレイ・チチェスター、１９８Ｂ）　：Ｂｏ ｄｅｒ、［毛細血管拡張性運動失調のＩＱＩＩＪ　、Ｇａｔｌｉ　と５ｗ１ｆｔ 　（編）、［毛細血管拡張性運動失調幼児期の変性疾のの遺伝学、神経病理学お よび免疫学ｊ中、第１〜６３頁（アラン・アール・リス、ニューヨーク、＋９８ ５）　；およびＭｏｒｒｅｌ　ｌ　ら、Ｊ、　Ｎａｊｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　１ｎ ｓｔ、、　７７：　８９−９２　（１９８６）　］　、ヒトの人口の３％程を構 成するＡＴへテロ接合体ては、電離放射線に露呈された後にガンの危険性か増加 することがＩＩ告されている。

ＡＴの患者に由来する細胞は２つの顕著な特徴を示す。電離放射線の殺傷効果に 対する過敏性［Ｔａｙｌｏｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　２５８：　４２７−４２９　 （１９７５）　］　、およびＤＮＡ合成の速度に対する電離放射線の阻害効果に 対する耐性、すなわち放射線耐性のＤＮＡ合成［Ｙｏ＋＋ｎｇとＰａ１ｎｔｅｒ 、　Ｈｕｍ、　Ｇｃｎｅｔ、、　８２：　１１３−１１７　（１９８９）］であ る。よつて、これらの異常の原因となる遺伝子の同定により、ヒトの放射線感受 性および放射線て誘導されたＤＮＡの損傷の後のＤＮＡ複製の制御に関する理解 が大きく促進されよう。放射線耐性のＤＮＡ合成を示すＡＴ細胞の特徴を使用し て、この疾患の中には幾つかの相補群が存在することが確立されている［Ｊａｓ ｐｃｒｓとＢｏｏｔｓ＋ｎａ、ＰＮＡＳ　（ＩＪＳＡ）、７９：　２６４＋−２ ６４４（＋９８２）　；　Ｍｕｒｎａｎｅ　とＰａ１ｎｔｅｒ、ＰＮＡＳ　（Ｕ rＡ）、７ ９：　１９６０−１９６３　（１９８２）　；　Ｊａｓｐｅｒｓ　ら、Ｃｙｔｏ ｇｅｎｔ、Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、４９：　２５９−２６R　（１９ ８８）］。

広範囲の検討にも拘らず、ＡＴによって与えられる多面発現性の異常の原因をな す根元的な欠陥は未知のままである。遺伝連鎖解析［Ｇａｔｔｉ　ら、Ｎａｔｕ ｒｅ、　３３６：５７７−５８０　（１９８８）　；ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅら、 Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１８：　４３３５−４３４３　（１９９O ａ） ；　ＭｃＣｏｎｖ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｅら、Ｉｌｕｍ、　Ｇｅｎｊ、、８５：　２１ ５−２２０　（＋９９０ｂ）　；　５ａｎａｌ　ら、Ａｍ、i、　ｔ（ｕｍ。

Ｇｅｎｅｔ、、　４７：　８６０−８６６　（＋９９０）　：およびＺｉｖら、 Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、　９：　３７３−３７５　（１９９１）@］ および染色体転移の研究［Ｌａｍｂｅｒｔら、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　８８： 　５９０７−５９１１　（１９９１）］により、３つの相補性群に結び付く遺伝 子は全て染色体領域１１Ｑ２２−ｑ２３に位置することが示されている。

相補ＷＩＡ　（ＡＴ−Ａ）およびＣ（ＡＴ−Ｃ）は遺伝連鎖解析によってマツピ ングされているｒＧａＨｉ　ら、１９８８　；　ＭｃＣｏｎｖｉ　Ｉ　Ｉｅら、 ＋９９０ａおよび１９９０ｂ　；５ａｎａｌ　ら、１９９０　；　７ｉｖら、＋ ９９１　＋およびＦｏｒｏｕｄら、Ａｍ、　Ｊ、　ｌｌｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、、 　４９：　１２６３−＋２７９@（１ ９９１）］。混在した相補群に由来する系統群を使用し、２つのグループの研究 者が２つの別々の領域に対するＡＴ遺伝子の関連性を独立に報告しており、その １つはＹＨＹＩの近傍にある［ＭｃＣｏｎｖｉｌｌｅら、＋９９０ａおよび１９ ９０ｂ　；５ａｎａｌ　ら、１９９０：　Ｆｏｒｏｕｄら、＋９９１］　、その 後、ＡＴ−ＡおよびＡＴ−Ｃについての遺伝子は、これらの２つの領域のより動 原体側に位置することが決定されたものの［ＭｃＣｏｎｖｉ　ｌＩｅら、１９９ ０ａ　：５ａｎａｌ　ら、＋９９０　：　Ｆｏｒｏｕｄら、＋９９１］　、系統 群の小さなサブセット中のＡＴｉｌ伝子は、ＹＨＹｌの近傍の第２の遺伝子座に マツピングし得ると結論付けられた［５ａｎａｌ　ら、＋９９０］。相補群Ａお よびＣ中の系統群を排除したＧａｔｔｉらの研究では［ＡＡＣＲ（アメリカン・ アソソエーション・フォー・キャンサー・リサーチ）の特別会議、［環境による ＤＮＡ損傷に対する細胞応答Ｊ　（パンツ、アラバマ（カナダ）にて、１９９１ 年１２月１〜６日）で提示された［毛細血管拡張性運動失調、遺伝的不均質性に ついての関連性の証拠」と題された報告中］、追加的な相補群についての遺伝子 がＹＨＹＩ近傍の領域に対する関連性を実際に示すことか結論付けらた。相補群 Ｄ　（ＡＴ−Ｄ）についての遺伝子は、相補１！Ｔ　ＤがＡおよびＣの後のＡＴ について２番目に共通性の高い相補群であるため、’１’ＨＹ１近傍の関連性に 関する最も可能性の高い候補者とされた［Ｊａｐｅｒｓら、［８８］。

ｎ、化性相槌を使用し、種々のＤＮＡｔ員傷剤に対する耐性を与える幾つかの遺 伝子の同定が証明されている［ｖａｎ　Ｄｕｉｎら、Ｃｅ１ｌ、　４４：　９１ ３−９２３　（＋９８６）　；　Ｔｌ＋ｏｍｐｓｏｎら、％ｌｏ１．　Ｃｅ１ｌ 　Ｂｉｏｌ、、　１０：　６１６０−６１７１　（＋９９０）　；およびＷｅｅ ｄａら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂ■ ｏｆ、、１０：　２５７０−２５８１　（＋９９０）　コ　。

電離放射線に対するＡＴ細胞の感受性を使用し、ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ　［ ｌｎＬ　Ｊ、　Ｒａｄｉａｔ、　Ｂｉｏｌ、、　５６：　６６７−６７５　（１ ９８９）　］は、選択可能なｎｅｏ遺伝子を含むヒトコスミドライブラリーを用 いる形質移入によって、相補群Ｄ　（ＡＴ−Ｄ）由来のＡＴ細胞ライン（Ａ７５ ＢＴＶＡ）の欠陥を相補することを試みた。電離放射線と０４１８とを組合せた 選択の結果、電離放射線に対して部分的に耐性であり（通常の約５０％）、より 少ない放射線誘導染色体異常型を産生ずるが、放９（線画性ＤＮＡ合成のＡＴの 特徴を保持するＡｌｌ胞ライン（１８３）が単離された。サザンプロット解析に より、１８３細胞ラインは、タンデムに組込まれ共働して増幅されると認められ る少なくとも３つのコスミドを含むことが示された［にａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ 　、１９８９同上コ。これらの組込まれたコスミド配列を含む細胞ＤＮＡをＡＴ ５ＢＩＶＡ細胞に転移させることにより、ＩＢ３細胞に類似する放射線耐性を有 する細胞クローンが産生され、コスミド内の遺伝子がＡＴ−Ｄ群の欠陥を相補す ることが示された［ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ　、１９８９同上］。

その同し細胞ライン（ＡＴ５ＢＩＶＡ）の機能性相補は、マウス−ヒトハイブリ ッドからのミクロセル媒介染色体転移により達成された［Ｌａｍｂｅｒｔら、＋ ９９１１゜その研究により、ＡＴ−Ｄについての遺伝子は、ＡＴ−ＡおよびＡＴ −Ｃ関連領域に対して末端小粒側にあるヒト染色体＋　１Ｑ２３断片を含む組換 え染色体内にあることが示された。しかしながら、この報告は、そのマウス−ヒ トハイブリットか、ＴＨＹｌに対して末端小粒側にある染色体＋１ｑ２３も含む が否かについては宣明していない。

本発明者らは、相補群りについてのへＴ遺伝子の断片からＤＮＡをクローン化し た。そのＤＮＡは、相補群りについての全ＡＴ遺伝子、すなわちＡＴＤＣ遺伝子 を見出してクローン化すると共に、ＡＴＤＣ遺伝子が位置する＋１（１２３内の 領域を同定するためのプローブとして価値のあるものであった。ここに記載する クローン化以前には、ＡＴについて認島された特異的な遺伝子がなかったために 、ＡＴに関する基礎研究および臨床作業の進展は非常に遅いものであった。更に 、ＡＴ患者および／またはＡＴへテロ接合体を正確に同定するか、または患者を 種々の相補ｎｌに分類する単純な生物学的または実験室的試験がなかった。本発 明は、ＡＴの研究のための明確な方向、およびＡＴＤＣ遺伝子における変異を同 定する手段を提供するものである。この種の変異を同定することにより、ＡＴ、 好ましくはＡＴ−Ｄを診断し、ＡＴへテロ接合体、好ましくはΔＴ−Ｄへテロ接 合体を検出する方法が提供される。ＡＴへテロ接合体の検出は、これらが電離放 射線による処理に応答してガンの危険性が増加することが報告されていることか ら重要である［５ｗ１ｆｔ　ら、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３２５ ：　１８３１−１８３６　（＋９９１）］。

発明の要旨 ここに開示するのは、相補ＩＴＤについてのＡＴｉｊ！伝子、ＡＴＤＣ遺伝子で ある。

前記遺伝子の断片は、核酸プローブとして、およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　、　ＰＣＲ）のプライマー として有用である。前記ＡＴＤＣ遺伝子の１つの具体例は、それぞれＡＴＣＣ番 号７５２５０および７５２５１として１９９２年６月１６日にアメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション［ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ　（ＵＳＡ）］に 寄託したコスミドＫｌおよび４−１中のヒトＤＮＡを含むものである。よってこ の発明は、１つの態様では、単離したＡＴＤＣ遺伝子またはその１以上の断片を 含む組成物に関し、前記遺伝子またはその断片のヌクレオチド配列は、コスミド に１および／またはコスミド４−１に含まれるＡ　Ｔ　Ｄ　Ｃ遺伝子のヌクレオ チド配列、または前記コスミドの一方または両方に含まれる前記ヌクレオチド配 列の断片と実質的に相補的である。

更に開示するのは、前記ＡＴＤＣ遺伝子に由来するｃＤＮＡ、好ましくは３キロ ベース（ｋｂ）ｃＤＮＡおよび／またはその断片であり、その全ヌクレオチド配 列を図４Ａ〜４Ｃ［配列番号：１］に示す。更に開示するのは、前記ｃ　ＤＮＡ から、好ましくは前記３ｋｂｃＤＮＡから翻訳したＡＴ蛋白質および／またはポ リペプチドである。好適なＡＴ蛋白質についてのアミノ酸配列を図５Ａ〜５Ｄ［ 配列番号、３］に示す。前記アミノ酸配列の蛋白質、並びに前記アミノ酸配列の 相同の変形体および前記相同の変形体の一部もこの発明に含まれる。この発明の 範囲内にあるのは、組換えにより、化学的にがっ／または生物学的に製造された ＡＴＩ白質および／またはポリペプチド、好ましくはＡＴＤＣ蛋白質および／ま たはポリペプチドであり、前記蛋白質および／またはポリペプチドは実質的に純 粋な形等である。

１つのＢαでは、この発明は、ヒトＡＴ蛋白質／ポリペプチドをコードする単離 した核酸配列に関し、この配列は、図５Ａ〜５Ｄに示したアミノ酸配列または前 記アミノ酸配列の少なくとも一部をコードする核酸配列に対して実質的に相補的 である、すなわち標準的なストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るもの である。この種のヒトＡＴ蛋白質／ポリペプチドをコードする代表的な核酸配列 は、図４Ａ〜４Ｃ［配列番号・目および図５Ａ〜５Ｄ［配列番号：２コに示すよ うな核酸配列である。

更に、この発明は、ＡＴ蛋白質またはポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配 列またはｃＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子に関し、前記ＤＮＡまたはｃＤＮＡ 配列は、前記核酸分子中の発現調節配列に機能的に結合している。前記組換え核 酸分子の例示的な具体例には、ゲノムＤＮＡ配列が、コスミドＫｌおよびコスミ ド４−１に含まれるＡＴＤＣ遺伝子のＤＮＡ配列、これらのコスミドに含まれる ＤＮＡ配列に実質的に相補的なりＮＡ配列、これらのコスミドに含まれるＤＮＡ 配列の断片、および前記コスミドに含まれるＤＮＡ配列に実質的に相補的である ＤＮＡ配列の断片よりなる群から選択されるものが含まれる。前記組換え分子の 代表的な具体例には、ｃＤＮＡ配列か、図４Ａ〜４Ｃ［配列番号、１］に示す３ キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡ、前記３ｋｂｃＤＮＡに実質的に相補的なりＮＡ配 列、［Ｎ５Ａ〜５Ｄ［配列番号：２コに示すｃＤＮＡ配列、および図５Ａ〜５Ｄ に示すｃＤＮＡ配列に実質的に相補的なりＮＡ配列よりなる群から選択されるも のも含まれる。

更に開示するのは、前記３ｋｂｃＤＮＡの９つのエクソンのそれぞれを増幅する ためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーである。前記プライマーを図 ７「配列番号＝４〜３１］に示し、前記プライマーによって増幅された１４のＰ ＣＲ断片を図８Ａ〜８Ｎ［配列番号＝３２〜４５コに示す。

前記ＡＴＤＣ遺伝子、その断片および／または関連するｃＤＮＡは次の点で有用 である。１）ＡＴ蛋白質およびポリペプチド並びにその相同体または類似相同体 （好ましくはＡＴ相補群りのもの）を同定するため、２）ＡＴ−Ｄを導＜ＡＴＤ Ｃ遺伝子における変異を同定するため、３）種々のＡＴ細胞ラインのＡＴＤＣ遺 伝子から、および異なるヒト組織から転写された種々のｍＲＮＡを同定するため 、４）ＡＴを有しＡＴへテロ接合体である人について試験するためのプローブを 構成する手段を提供するため、および５）ＡＴ変異が放射線感受性、免疫不全お よび運動失調を導く機構を解明するため。

例えば、寄託したコスミドＫｌおよび４−１に含まれるＡＴＤＣ遺伝子の断片、 またはその断片、図４Ａ〜４Ｃに示す３ｋｂｃＤＮＡおよび／またはその断片、 または９つのエクソンのそれぞれについてのＰＣＲプライマーは、種々のＡＴ患 者からＡＴＤＣｉ！ｆＥ子を同定し単離するプローブとして使用することができ る。

ＡＴを有する人に由来するＡＴＤＣ遺伝子のヌクレオチド配列とＡＴを有さない ものとを比較することができ、ＡＴの多面発現的な異常の原因となる変異を同定 することかできる。ＡＴ変異を一旦同定したならば、変異した領域に渡る核酸プ ローブ、好ましくはＤＮＡプローブ、またはＰＣＲプライマーを構成することが できる。この欅のプローブまたはＰＣＲプライマーは、ＡＴを有する人および変 異したＡＴ遺伝子のへテロ接合体キャリヤーを同定するための試験、ハイブリダ イゼーションまたはＰＣＲ検定の開発のための基礎を提供し得る。

ＡＴＤＣ遺伝子および／またはその断片の配列およびその結果として得られるプ ローブにより、ＡＴの多面発現性の異常の根元をなす機構を解明する研究、およ びＡＴへテロ接合体において報告された高率で発生する幾つかの種類のガンの究 明か可能となる筈である。

この発明によるＡＴＤＣ遺伝子の変異を検出する代表的な方法は、同一または実 質的に同一のＰＣＲプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっ て、前記遺伝子および正常であると判っているＡＴＤＣ遺伝子の１以」二の断片 を増幅し、 前記遺伝子の増幅によるＰＣＲ生成物と正常な遺伝子の増幅によるものとを比較 することにより前記ＡＴＤＣ遺伝子が何らかの変異を含むか否かを決定し、変異 に伴うＰＣＲ生成物の間の差異を検出する工程を含む。この代表的な方法のため の好適なＰＣＲプライマーは、図７に示すプライマー［配列番号：４〜３１］お よびこれらに実質的に相補的な核酸配列よりなる群から選択する。前記方法によ って検出される差異は、例えば大きさおよび塩基配列の差異である。この発明に より変異を検出するための好適な方法には、ＰＣＲ一本鎖構造多形性検定または 変性勾配電気泳動検定の使用が含まれる。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、コスミドクローンＫｌおよびに４１の構造を示す。ヒトＤＮＡ　（太 い黒線）および組込まれたｐｃＶ１０Ｂコスミド配列（薄黒くないバー）の位置 を示す。ＳＶ４０プロモーターおよび三機能性終止配列を育するｎｅｏ遺伝子は 図示するように位置する。薄黒いバーは、ＨｅＬａｃＤＮＡライブラリーに由来 するｃＤＮＡに相補的な配列を含むに１およびに４１コスミド中の制限断片を示 す。ｃＤＮＡクローンの同定のためのプローブとして組合せる４つのＥｃｏＲＩ （Ｅ）断片の位置を、Ｂｇｌ　ＩＩ　（Ｂ）、Ｓｍａｌ　（Ｓｍ）、Ｓｓｔ　Ｉ 　（Ｓｓ）、Ｘｂａ　Ｉ　（Ｘｂ）およびＸｈｏ　Ｔ　（Ｘｈ）についての制限 酵素部位の位置と同様に示す。

図ＩＢは、全長長さ３．０キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡの構造を示す。

図２Ａは、ＡＴＤＣ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調相補群りの遺伝子）の３部 分を含む４−１および３−１コスミドの構造を示す。

図２Ｂは、Ｋｌ（左側）および４−１　（右（ＩＩＩ）コスミドの配列から再構 成したものとして無傷のＡＴＤＣ遺伝子の構造を示す。ＤＮＡ配列および制限部 位についての記号は、前記図ＩＡ−ＩＢの説明で定義したものと同様である。

図３は、次の細胞ライン：ＡＴ５ＢｒＶＡ（黒丸により示す）、ＩＢ３（白丸に より示す）およびＣ６（黒三角により示す）について、Ｘ線量の関数としての生 存のグラフを示す。

図４Ａ〜４Ｃは、全長長さ３ｋｂｃＤＮＡ［配列番号：ｌ］　（その制限地図は 図ＩＢに示す）のヌクレオチド配列を示す。

図５Ａ〜５Ｄは、３　ｋ　ｂ　ｃ　ＤＮＡの翻訳したオーブンリーディングフレ ームのヌクレオチド配列［配列番号・２］を示す。［アミノ酸配列は、配列番号 ＝３である。］ 図６は、３　ｋ　ｂ　ｃ　ＤＮＡの９つのエクソンを概略的に示す。１４のＰＣ Ｒ断片を示し、矢印はプライマーの位置を示す。プライマーは図７に示すもので あり、ＰＣＲ断片の配列は図８Ａ〜８Ｎに示す。白いボックスは非翻訳領域を示 すものであるのに対し、斜線のボックスはアルファへリックスの領域を示す。

図７は、３ｋｂｃＤＮＡについてＰＣＲプライマー［配列番号；４〜３１］のヌ クレオチド配列を示しており、その配置は概略的に図６に示し、詳細には図８Ａ 〜８Ｎに示す。

［ｍ８Ａ〜８Ｎは、図６に概略的に示した３ｋｂｃＤＮＡのＰＣＲ断片のヌクレ オチド配列［配列番号、３２〜４５］、並びに図７に列記したＰＣＲプライマー の配置’＆を示す。

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の記号ここでは図中のヌクレオチドを表すのに 以下の記号を使用する：標準的な慣用に従い、記号Ｙはシトシンまたはチミン／ ウラシルを表すのに対し、記号Ｎはアデニンまたはシトシンまたはグアニンまた はチミン／ウラツルを表す。

遺伝子コードの縮退、すなわち１以上のコドンが１つのアミノ酸をコードし得る ことのために［例えば、コドンＴＴＡＳＴＴＧ、ＣＴＴ１ＣＴＣ，ＣＴＡおよび ＣＴＧは、それぞれアミノ酸ロイシン（Ｉｅｕ）をコードする］、１つのコドン が他のものにより置換された場合に、例えば図４Ａ〜４Ｃのヌクレオチド配列の 変形体は、この発明により実質的に等価な蛋白質またはポリペプチドを産生じ得 ることか理解される。３　ｋ　ｂ　ｃ　ＤＮＡのヌクレオチド配列のこの種の変 形体の全ては、この発明の範囲内に含まれる。

ここに記載し１１４Ａ〜４Ｃに示すヌクレオチド配列は、この発明により単離し たｃＤＮＡヌクレオチド配列の正確な構造のみを表すことが更に理解される。僅 かに改変したヌクレオチド配列か見出だされようし、または当業界で公知の技術 により改変して、例えば類似するエピトープを有するもののような実質的に類似 するＡＴ蛋白質およびポリペプチドをコードするようにすることができると予期 され、この秤のヌクレオチド配列および蛋白質／ポリペプチドは、この発明の口 約について等価であると考えられる。等価なコドンを有するＤＮＡは、ＡＴ蛋白 質／ポリペプチドに対して相同または実質的に相同である蛋白質／ポリペプチド をコードする合成りＮＡ配列のように、この発明の範囲内であると考えられるだ けてはなく、遺伝子コードの縮退以外によるような配列が前記３ｋｂｃＤＮＡヌ クレオチド配列にハイブリダイズし得る。ここに示すようなりＮＡ配列の改変お よび変形は、ここにおけるＡＴＤＣ配列およびその断片と実質的に同一である配 列に帰着すると考えられる。

２０の主要なアミノ酸かあり、そのそれぞれは３つの隣接するＤＮＡヌクレオチ ド（トリプレットコードまたはコドン）の異なる配置によって特定され、これら は特定の順序で互いに結合して特徴的な蛋白質を形成する。ここでは慣用の３文 字を使用し、例えば図５Ａ〜５Ｄにおけるように、前記アミノ酸を次のように特 定するものとする アミノ醜名　記号 アスパラギン酸　Ａｓｐ ノステイン　Ｃｙｓ グルタミン酸　Ｇｌｕ フェニルアラニン　Ｐｈｅ バリン　Ｖａｔ 省略形 ここては次の省略形を使用する。

Ａ１４毛細血管拡張性運動失調 ＡＴ−Ａ　：毛細血管拡張性運動失調相補群ＡＡＴ−８毛細血管拡張性運動失調 相補群ＢＡＴ−Ｃ：毛細血管拡張性運動失調相補群ＣＡＴ−Ｄ　毛細血管拡張性 運動失調相補群ＤＡＴＣＣアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションＡＴ ＤＣ遺伝子　ＡＴ−Ｄ相補遺伝子 Ｂ：Ｂｇｌｌｌ ＤＡＰＩニジアミノ−２−フェニルインドールＥ：ＥｃｏＲ１ Ｆ　ＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネートＧｙ・プレイ、システム・イン ターナショナル・デイユナイト（Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　 ｄ’Ｕｎｉｔｅｓ　）による吸収放射線の単位ｍ１：ミリリソトル ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応 Ｓｍ：Ｓｍａｌ Ｓｓ：５ｓｔｌ ＳＶ・シミアンウィルス μｇ・マイクログラム Ｘｂ　：Ｘｂａ　Ｉ Ｘｈ　：　Ｘｈｏ　１ 詳細な説明 ここに開示するのは新規な遺伝子、ＡＴ遺伝子、更に詳しくはＡＴＤＣ遺伝子で ある。この遺伝子は、相補群りに由来するＡＴ細胞ラインにおける電離放射線感 受性の相補によって単離された。ここで請求の範囲に記載したのは、前記ＡＴＤ Ｃ遺伝子、および前記遺伝子またはその断片に実質的に相補的であるヌクレオチ ド配列である。前記遺伝子における欠陥は相補群りのＡＴ細胞の放射線感受性の 原因であることを示す強力な証拠をここに示す。

その遺伝子を単離するために、選択可能なｎｅｏ遺伝子を含むヒトコスミドライ ブラリーを用いて、ＡＴ５ＢＩＶＡ細胞ラインの放射線感受性ＡＴ細胞を最初に 形質移入し、その後に抗生物質Ｇ４１８および電離放射線の両者を用いて選Ｖを 行い、欠陥のある遺伝子を相補するヒト／ニスミドＤＮＡを含む細胞クローンを １１離した。電離放射線に対する耐性の部分的回復を示す細胞クローン（Ｉ８３ ）を単離した。そのクローンは、３つの組込まれたヒト／ニスミド配列を含むこ とが見出された。

最初に１１３細胞ＤＮＡからコスミドライブラリーを構成し、次にｎｅｏ遺仕子 を含むクローンについてカナマイシンを用いて選択することを含む方法によって 、組込まれたヒト／ニスミド配列を解放した。その後に選択したコスミドクロー ンを、正常なヒトリンパ球由来の染色体に対するその場でのハイブリダイゼーシ ョンのための染色体特異的ペイントプローブ（ｐａｉｎｊｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ） として使用した［Ｐｉｎｋｅｌら、ＰＮＡＳ　（ＬＩＳＡ）、　８５：　９１３ ８−９１４１　（１９８８年１２月）　ＨＧｒａｙら、ヨーロッパ特許出＠第４ ３０．４０２号（１９９１年６月５日公開）；およびＷａｒｄら、ＷＯ９０１０ ５７８９（１９９０年５月３１日公開）］。２つの関連するコスミドクローン（ Ｋｌおよびに４１）か、染色体領域］　１ｑ２３から由来したヒト配列を含むこ とが見出された。

前記「背景」において説明したように、ｌ　Ｉｑ２３領域は、先に遺伝連鎖解析 によって、３つの別々の相補ｎｌに由来するＡＴ遺伝子の位置であることが決定 さねている。

コスミドクターンの制限部位マツピングにより、これらは、細胞クローンＩＢ３ 中の組込まれたフスミド配列の１つの側に位置する３６キロベース（ｋｂ）に渡 るヒトＤＮＡを含むことが示された。全ヒトＤＮＡを用いたサザンプロット解析 により、３６ｋｂの大半が単コピーＤＮＡであることが明らかとなった。前記単 コピーＤＮＡの一部をプローブとして用いてｃＤＮＡライブラリーを検索し、ハ イブリダイズした２つのクローンを単離した。これはＡＴＤＣ遺伝子が比較的豊 富に転写されることを示す。フスミトの１つ（Ｋｌ）を放射線感受性の親ＡＴ細 胞ライン（ＡＴ５ＶＩＢＡ）に戻して形質移入した結果、１Ｂ３についての場合 と類似する放射耐性を示す１つの細胞クローンが単離された。

配列解析により、ＡＴＤＣはこれまで同定されていない遺伝子であることかがさ れた。ＡＴＤＣ遺伝子は単フビー遺伝子であるが、約１．　８キロベース（ｋｂ ）〜約５．７ｋｂの範囲で５つのｍＲＮＡが検出された。ｍＲＮＡの大きさの変 動は５′末端の差異に起因すると考えられる。これはＡＴＤＣ遺伝子が、幾つか の異なる蛋白質をコードし得る複合遺伝子であることを示す。したがって、ＡＴ ＤＣｉ！伝子は、ＡＴを有する個体に認められる多面発現性の異常と一貫する多 数の機能を有すると考えられる。

以下に記載するような放射線ハイブリッド細胞ラインによるＡＴＤＣ遺伝子の位 置の精密なマツピングによって、ΔＴＤＣ遺伝子はＴＨＹ１マーカーの直ぐ末端 小粒側に、すなわち連鎖解析によって相補群り由来のへＴ遺伝子を含むことが示 された領域に位置することが示された。

ＡＴＤＣ遺伝子および／またはその断片および／またはこれに由来するｃＤＮＡ は、他のＡＴ相？１群に由来する相同遺伝子を同定するためのプローブとして使 用することができる。連鎖解析により、種々の相補群に対するＡＴ遺伝子は互い に密集していることが示され、よってこれらは遠隔的に関連することが可能であ る。染色体１１特異的ライブラリー、好ましくは染色体１１ｑ２３特異的ライブ ラリー、更に好ましくは染色体１　］Ｑ２３特異的コ特異的ラスミドライブラリ して、ＡＴＤＣとクロスハイブリダイズするクローンを同定することができる。

更に、関連するマウス遺伝子についてＡＴＤＣプローブを用いてマウスｃＤＮＡ ライブラリーを検索することができる。マウス相同体を単離することにより、ト ランスジェニックマウスのＡＴモデルの開発が可能となろう。

この発明により確立されたプローブおよび検定は、ＡＴＤＣ遺伝子の欠陥がＡＴ −Ｄの原因であることを証明するのに宵月であろう。必要な証拠は、（１）他の ものの中でも、ＡＴ−Ｄ細胞中のＡＴＤＣ遺伝子における欠失、増幅、位置変位 、逆位、点変異のような遺伝的再配置が示されること、および／または（２）適 切なベクター、好ましくは当該遺伝子またはその断片を含むコスミドベクター、 または発現ベクター中のこれに由来するｃＤＮＡを用いた形質移入の後にＡＴ− Ｄ細胞において放射線感受性の機能的相補かあることであろう。へＴ５ＢＩＶＡ 細胞ラインのＡＴＤＣ遺伝子遺伝横内し得る再配置がないことは、他のヒトの遺 伝的疾患において観察されているように［Ｇｉｂｂｓら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、　 ７：　２３５−２４４　（＋９９０）　＋　Ｇｒｏｄｅｎら、Ｃｅ１１．６６： 　５８９−６００　（＋９９１））　、小さな再配置または点変異を示唆する。

未知の相補群からの他のＡＴ細胞ラインに由来するＤＮＡも、ＡＴＤＣ遺伝子に おける同定し得る変化を示さなかった。好ましくはＡＴ−Ｄの個体から専ら得ら れた細胞中のＡＴＤＣ遺伝子の配列解析を使用して、遺伝子のどの変異がＡＴに 結び（、ｔ　＜のかを決定し得る。

ＡＴＤＣ遺伝子の変異を検出する検定 本発明の重要な効用は、ＡＴ−Ｄの表現型症状に帰着するＡＴＤＣ遺伝子におけ る欠陥を生起する変異を検出することである。比較的大きな遺伝的再配置を検出 するためには、ハイブリダイゼーション試験、好ましくはサザンまたはノーザン 検定を使用することができる。例えば小さい欠失または増幅、または点変異のよ うな比較的小さい遺伝的再配置を検出するためには、ＰＣＲを組込んだ検定を好 ましくは使用する。

ＡＴＤＣ遺伝子内の変異を同定する好適な方法は、ＰＣＲを使用する検定を含む 。ＰＣＲの腹積は、５ａｉｋｉ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０：　１３５０　 （１９８５）並びに米国特許第４、８００．１５９号（１９８９年１月２４日発 行）、第４．６８３．１９５号および第４．６８３．２０２号（後者は双方とも １９８７年７月２８日発行）に記載されている。好ましくは、このようなＰＣＲ 検定によって細胞ＤＮＡを増幅して解析し、これにより適切なプライマーを使用 する場合に、スプライス部位内並びにコード領域内の変異を検出することかでき る。ただしｍＲＮＡを単離することもでき、これからｃＤＮＡを調製することが できる。その後に適切なＰＣＲプライマーを使用してｃＤＮＡを増幅することが でき、その後に正常およびＡＴ細胞由来のｃＤＮＡのＰＣＲ生成物を比較するこ とができる。

例示的なＰＣＲ検定は、図７［配列番号　４〜３１３に列記するＰＣＲプライマ ーを使用するものである。このような検定では、ＡＴを有するかＡＴを有さない 人々に由来する細胞ＤＮＡを中離し、ＰＣＲプライマーを用いて増幅する。正常 およびＡＴ細胞からのＰＣＲ生成物を、好ましくは最初に大きさ決定ゲルによっ て比較する。このようにしである種の遺伝的再配置を示す大きさの変化を決定す る。断片の大きさに変化が見出されない場合は、更なる比較を行ってこのような 大きさの比較では明らかとなり得ない遺伝的再配置、例えば数塩基対の欠失また は点変異を検出することができる。このような更なる比較を行うためには、好適 な方法には、ＰＣＲ一本鎖構造多形性（ＰＣＲ−ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ　 ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　、　ＰＣＲ−３ＳＣＰ ）検定、または変性勾配ゲル電気泳動検定を使用することか含まれる。ＰＣＲ− ３ＳＣＰ法は、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌ　１ｃａｌｉｏｎｓ。

１．３・ｌ−３８（＋９！’１１）中、ｒＰＣＲ−３ＳＣＰ　ニゲツムＤＮＡの 変異の検出のためのＪｌｊ純て高感度の方法」と題するにｃｎｓｈｉ　ｌ１ａｙ ａｓｈｉによる総説記事に記載されている。

変性勾配ゲル電気泳動は、Ｍｙｅｒｓら、「変性勾配ゲル電気泳動による単一塩 基変化の検出と位置決定Ｊ　、Ｍｅｊｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 　１５５：　５０１−５２７　（１９８７）に記載されている。

この発明の文脈において適用されるこの種の検定、例えばハイブリダイゼーショ ンおよびＰＣＲ検定、好ましくはＰＣＲ−３ＳＣＰを含むＰＣＲ検定または変性 勾配ゲル電気泳動検定を使用して、他の用途の中でも例えば電離放射線に関して 有意な危険因子となり得るＡＴへテロ接合性について、およびＡＴの胎児期の試 験および診断について人々を検索することができる。

ＡＴ蛋白質および／またはポリペプチドＦＡＴ蛋白質および／またはポリペプチ ド」という記載は、ここではＡＴＤＣ遺伝子および／またはその断片によりコー ドされる蛋白質および／またはポリペプチドを意味すべく定義する。例示的かつ 好適なＡＴ蛋白質は、そのアミノ酸配列かｌＮ５Ａ〜５Ｄ［配列番号、３］に示 されるものである。

「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸の鎖であり、こ こては５０以下のアミノ酸により構成されるものとする。「蛋白質」は、ここで は５０を越えるアミノ酸により構成されるポリペプチドと定義する。

ＡＴ蛋白質およびポリペプチドのアミノ酸配列は、遺伝的技術によって改変する ことかできることが理解されよう。１以上のアミノ酸を欠失または置換させるこ とかできる。この種のアミノ酸の変化は、蛋白質またはポリペプチドの生物学的 活性における測定し得る変化を何ら生起し得ず、この発明の範囲内である蛋白質 またはポリペプチドに帰着するものである。

この発明のＡＴ蛋白質およびポリペプチドは、この発明による種々の方法、例え ば組換えによって、合成によって、あるいは生物学的に、すなわちより長い蛋白 質およびポリペプチドを酵素的かつ／または化学的に開裂することによって調製 することができる。ＡＴ蛋白質を調製する好適な方法は組換え手段によるもの［ Ｊ５Ａ〜５Ｄに示すＡＴ蛋白質またはその断片を調製するための代表的な方法は 、図４Ａ〜４Ｃに示す３ｋｂｃＤＮＡの適切な断片を適切な発現ベクターに挿入 することである。広範な種類の宿主−クローン化ベクターの組合せを、ここに記 載するように単離したＡＴＤＣのＤＮＡをクローン化するのに有用に用いること がてきる。例えば、有用なりローン化運搬体には、染色体、非染色体および合成 りＮＡ配列、例えば種々の公知の細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、他のイ ー・コリのプラスミドおよびその誘導体、および広範な宿主範囲のプラスミド、 例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばファージλの多数の誘導体、例えばＮＢ ９８９、並びにプラスミドとファージＤＮＡとの組合せから誘導されるベクター 、例えばファージＤＮＡの発現調節配列を用いるよう改変されたプラスミドが含 まれる。

有用な宿主は真核生物および原核生物とすることができ、細菌宿主、例えばイー ・コリおよび池の細菌株、酵母および池のカビ、動物または植物宿主、例えば動 物または植物培養細胞、昆虫細胞および他の宿主が含まれる。勿論、全ての宿主 か同等に効率的であるわけではない。宿主−クローン化運搬体の組合せの特定の 選択は、この発明の範囲から逸脱することなく、ここに記載する原理の所定の考 事の後に当業者か行うことかてきる。

選択したＤＮＡ断片をクローン化運搬体に挿入して組換えＤＮＡ分子を形成する ために選択する特定の部位は、種々の因子によって決定される。これらには、発 現すべき蛋白質またはポリペプチドの大きさおよび構造、宿主細胞成分による内 生酵素的分解およびその蛋白質による汚染に対する所望の蛋白質またはポリペプ チドの感受性、開始および停止コドンの位置のような発現特性、および当業者に よって認識される他の因子か含まれる。

ＡＴＤＣ遺伝子、その断片またはそれに由来するｃＤＮＡを含む組換え核酸分子 を用いて宿主を形質転換し、宿主（形質転換体）が構造遺伝子またはその断片を 発現し、ハイブリッドＤＮＡがコードする蛋白質またはポリペプチドを生産する のを可能とすることができる。組換え核酸分子を用いて宿主を形質転換し、宿主 か復製に際してＡＴＤＣのＤＮＡおよびその断片の供給源として更なる組換え核 酸分子を生産するのを可能とすることもできる。これらの用途のいずれかのため の適切な宿主の選択は、当業界で認識される多数の因子によって調節される。

これらには、例えば選択したベクターとの和合性、同時生成物の毒性、所望の蛋 白質またはポリペプチドの回収の容易性、発現特性、生物学的安全性およびコス トか含まれる。

宿主細胞がイー・コリのような原核生物である場合、対数増殖期の後に回収した 細胞からＤＮＡの取込みが可能なコンピテント細胞を調製し、その後に周知の手 順によって（ａＣＬ法により処理する。宿主細胞のプロトプラストを形成した後 に形質転換を行うこともできる。

使用する宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム沈殿のようなりＮＡの形 質移入方法、マイクロインジエクソヨンのような従来の機械的な手順、赤血球細 胞宿主またはリポソームに封入したプラスミドの挿入、リソホスファチジルコリ ンまたはウィルスベクターの使用のような薬剤による細胞の処理等を使用するこ とができる。

蛋白質またはポリペプチドの生産のレベルは２つの主要な因子によって支配され る。すなわち細胞内でその遺伝子またはＤＮＡ配列をコードするもののコピーの 数、およびこれらの遺伝子および配列のコピーが転写され翻訳される効率である 。転写および翻訳の効率（この両者が発現を構成する）は、翻って通常は所望の コード配列の先頭に位置するヌクレオチド配列に依存する。これらのヌクレオチ ド配列または発現調節配列は、就中ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して転写を開 始しくプロモーター配列）、かつリポソームが結合しｍＲＮＡ　（転写の産物） と相互作用して翻訳を開始する位置を特定する。このような発現調節配列の全て か同等に効率的に機能するわけではない。よって、所望の蛋白質についての特定 のコード配列をそれらの隣接するヌクレオチド配列から分離し、その代りに公知 の発現調節配列とこれらを融合させ、より高いレベルの発現を促進するのが育生 である。これは既に達成されており、新たに操作されたＤＮＡ断片を多コピープ ラスミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入し、細胞内での遺伝子または配 列コピーの数の増加を図り、これにより発現される蛋白質の収率を更に改良する ことかできる。

幾つかの発現調節配列を用いることができる。これらには、イー・コリのラクト ースオペロンのすベレーター、プロモーターおよびリポソーム結合および相互作 用配列（シャイン・ダルガーノ配列のような配列を含む）Ｃｒｌａｃ系」）、イ ー・コリのトリプトファン合成系の対応する配列（ｒｔｒｐ系」）、ｔｒｐおよ びＩａｃプロモーターの融合体（ｒｔａｃ系」）、ファージλの主オペレーター およびプロモーター領域（ＯＬＰＬおよびｏ、Ｐａ　＞　、およびファージｆｄ コート蛋白質の調節領域が含まれる。これらの配列を含むＤＮＡ断片を、ｌａｃ またはｔｒｐオペロンを担持する形質導入ファージから、またはファージλまた はｆｄのＤＮＡから生能したＤＮＡから制限酵素を用いて開裂させることにより 切出す。その後にこれらの断片を操作して、必須の調節配列がコード配列の開始 コドンに対して極めて近接して、または近い位置で接続され得るよう、分子の限 定した集団の取得を図る。

その後に融合生成物を、適切な宿主の形質転換のだめのクローン化運搬体に挿入 し、抗原生産のレベルを測定する。このようにして最も効率的な発現を与える細 胞を選択することができる。代替的に、開始コドンに取付けたＩａｃ、ｔｒｐま たはλＰＬｖＡ節系を担持するクローン化運搬体を用い、遺伝子または配列がク ローン化運搬体の開始コドンから正確に翻訳されるよう、ＡＴ蛋白質またはポリ ペプチドをコードする配列を含む断片と融合させることができる。

ここで「組換え核酸分子」という記載は、少なくとも２つのヌクレオチド配列を 含むハイブリッドヌクレオチド配列を意味するよう定義し、第１の配列は通常は 自然界では第２のものと共に見出されることのないものである。

こ二で［発現調節配列」という記載は、遺伝子に対して機能的に結合連結されて いる場合に構造遺伝子の発現を調節し制画するヌクレオチドのＤＮＡ配列を意味 するよう定義する。

ＡＴ蛋白質およびポリペプチドの合成的および生物的生産この発明のＡＴ蛋白質 およびポリペプチドは、組換え手段によってのみならず、合成的および他の生物 的手段によっても調製することができる。所望のポリペプチドまたは蛋白質を調 製するための例示的な他の生物的手段は、所望のアミノ酸配列を含むより長いＡ Ｔポリペプチドまたは蛋白質の選択的蛋白質分解によるものであり、例えばより 長いポリペプチドまたは蛋白質は、化学的試薬または酵素を用いて切断すること ができる。ポリペプチドまたは蛋白質の合成による形成には、当業界て周知の方 法によって所望の鎖のアミノ酸を化学的に合成することが必要である。

ペプチドの化学的合成は当業界で慣用されたものであって、例えばＭｃｒｒｉｆ ｉｅｌｄの固相合成技術［Ｍｃｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ 、　Ｓｏｃ、、　８５：　２１４９−２１５４　（＋９６３）　；に■ ｎ＋ら、「生物学および医学における合成ペプチドＪ　、２９　ｆ、ｆ、　Ａ１ １ｔａｌｏら編（Ｅｌｓｃｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　 １９８５）　；およびＨａｕｇ、　ＡＢＬ、　４０−４７　（１９８７年１月７ ２月）コによって行うことができる。

化学的ペプチド合成の技術は、市販の保護されたアミノ酸を用いる自動ペプチド 合成装置を使用することを含む。例えば、バイオサーチ［Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ 、　ＣＡ　（ＵＳＡ）］モデル９５００および９６００、アプライド・バイオシ ステムス社［ＦｏｓｔｅｒＣＨｙ、　ＣＡ　（ＬＩＳＡ）　］モデル４３０、ミ リガン［Ｍｉ　ＩＩ　１ｐｏｒｅ社の一部門、Ｂｃｄｆｏｒｄ。

ＭＡ　（ＵＳＡ’）　］モデル９０５０、およびデュポンのＲＡＭＰ　（迅速自 動多重ペプチド合成）　［ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｏｍｐａｓｓ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｊ ｏｎ、　ＤＥ　（ＵＳＡ）コがある。

この発明を例示する実施例では以下の材料および方法を使用した。

細胞ライン ソミアンウイルス（ＳＶ）４０形質転換細胞ラインＬＭ２１７（ノーマル）およ びＡＴ２ＳＦ　（未知のＡＴ相補群）は、ｐＳＶｏｒｉプラスミド［Ｍｕｒｎａ ｎｅら、ＥＸｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１５８＋　１１９−１２６　（１９８ ５）　：Ｍｕｒｎａｎｅ　ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、６F　５４ ９−５５８　（１９８６）］を用いた一次ヒト繊維芽細胞の形質移入によって確 立した。

ＳＶ４０形質転換繊維芽細胞ラインＡ７３Ｂ　ＩＳＶ　（ＡＴ−八）は、Ａ、　 Ｍ、　Ｒ。

Ｔａｙｌｏｒ　（バーミンガム、英国）により提供されたものである。

細胞ライン１Ｂ３は、ＳＶ４０形質転換繊維芽細胞ラインＡＴ５ＢＩＶＡ（０Ｍ ５８４９）　［ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ　１９８９、前記］から誘導したもの であり、これはＮｌＧＭＳヒト遺伝的変異体細胞保管所（ＭＩＧＭＳ　Ｈｕｍａ ｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ。

５ｉｊｏｒｙ）　［カムデン、ＮＪ　（ＵＳＡ）］から取得した。ＨｅＬａ細胞 （ＨｅＬａＳ３、ＡＴＣＣＣＣｌ２．２）は、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション［ＡＴＣＣ、ロックビル、ＭＤ　（ＵＳＡ）］から取得した。

コスミＩ・ライブラリーの構成 １［１３からのロスミドライブラリーは標準的な手順によって構成した［Ｓａｍ ｂｒ。

ｏｋら、「分子クローン化：実験室マニュアル」第２版（コールド・スプリング ・ハーバ−・ラボラトリイ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク、 １９８９）］。ｌＢ３由来のＤＮＡをＭｂｏｌを用いて部分的に消化し、約３０ キロベース（ｋｂ）〜約５０ｋｂの断片をＢａｍＨＩて消化したｐＷＥ　Ｉ　６ 　コスミドＤＮＡ［ストラタジーン、う・ジョラ、ＣＡ　（ＵＳＡ）　；　Ｗａ ｈｌら、ＰＮＡＳ、　８４：　２１ＬｉＯ（１９８７）コに連結した。元は形質 移入［ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ　（１９８９）］のために使用された組込まれ たＩ）ＣＶＩ０８：ＩスミＦ　［ＬａｕとＫａｎ、　ＰＮＡＳ、　８０＋　５２ ２５　（１９８３）］　ＤＮ八中のｎｅｏ　（ネオマイノン耐性）遺伝子を含む クローンを、５０μｇカナマイシン／ｍｌを含む寒天プレート上で、ロスミドラ イブラリーを含むＸＬＩ−ブルー（ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ）細菌（ストラタジーン） の生育によって選択した。種々の組合せの酵素を用いる消化によって制限酵素マ ツピングを行い、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）プラスミド（スト ラタジーン）中にクローン化した個々のＥｃｏＲＩ断片を更にマツピングするこ とによって確認した。

コスミトおよびｃＤＮＡライブラリーの検索非反復配列のみを含むコスミト断片 よりなるプローブを用い、随所に記載されている方ａ：によって［Ｍｕｒｎａｎ ｅ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　６：　５４９−５５８　（１９８６ ）コ、バクテＩＩオフ７−シベクターＺＡＰ　Ｉ　Ｉ内の市販のＩ（ｅ　Ｌ　ａ 細胞ｃＤＮＡライブラリー（ストラタンーン）を検索しこ。その後そのベクター と共に礎供された手順（ストラタノーン）を使用することにより、ブルースクリ プトプラスミドの生体内切出しによってＺＡＰＩＩからｒ９性のｃＤＮＡクロー ンを解放した。プローブとして３，０ｋｂｃＤＮＡを使用しく図ＩＢ、４Ａ〜４ Ｃおよび８Ａ〜８Ｎ）、従来の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記）に よって、Ｌ、　Ｄｅａｖｅｎ　［０ス・アラモス・ナショナル・ラボラトリイ、 ロス・アラモス、ＮＭ　（ＵＳＡ）］から取得した染色体！１ｔｙ異的コスミド ライブラリーを検索した。

サザンおよびＲＮΔプロット解析 高分子量細胞ＤＮＡの調製およびサザンプロット解析は、随所に記載されている 通りとした（Ｍｕｒｎａｎｅ　１９８６、前記）。ｍＲＮＡ単離キット［ファス ト・トラック（Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ、商標名）、インビトロジエン、サンジエ ゴ、ＣＡ　（ＵＳＡ）］を使用してｍＲＮＡを調製した。ＲＮＡのアガロースゲ ル電気泳動およびＲＮＡのプロット解析は、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら １９８９、前記）によって実施した。

機能性相補 り〉酸カルシウム媒介形質移入（Ｍｕｒｎａｎｅら１９８５、前記）によって、 相補性について試験すべきＤＮＡをＡＴＳ１３１ＶＡ細胞に導入した。形質移入 の前に、ベクターとヒト配列との間を切断するＮｏｔｌを用いてコスミドクロー ンを線状化した。組込まれたＤＮＡを含む細胞クローンは、４００μｇ０４１８ ／＋η１を用いたインキュベートによって選択した。６０Ｇｙ（グレイ）のＸ線 に露呈したＨｅＬａ細胞よりなるフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）層のあるものと無 いものとについて、随所に記載されている方法によって（ＫａｐｐとＰａ１ｎｔ ｅｒ　１９８９、前記）Ｘ線による生存を決定した。

その場でのハイブリダイゼーション ５ｃｉｅｎｃｅ、　１９１：　１２６８−１２７０　（１９７６）にＹｕｎｉｓ によって記載された方法に従い、メタ相の展開物（ｓｐｒｅａｄ）を調製した。

その場での（ｉｎ　５ｉｊｕ　）ハイブリダイゼー’／ヨンの前に、２０１１ｇ ペプシン／ｍｌ　（０，ＩＭＨｃＩ中）を用いて３７°Ｃで１０分間スライドを 処理した。Ｐｉｎｋｅｌら［ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　８３：　２９３４−２９ ３８　（＋９８６）１およびＴｒａｓｋら［Ａｍ、　、１．　Ｉｌ−１ｕ、　Ｇ ｅｎｅｔ、、　４８：　ｌ−＋５　（１９９１）　］のものから、ハイブリダイ ゼーション条件および染色手順を改変した。その場でのハイブリダイゼーション のプローブ戦略は、特にＦＩＴＣ結合抗体を用いて検出するジ才キノゲニンｆｆ ｍ１くＩまたはに４１コスミドブローブ、およびテキサス１／ツド結合アビジン を用いて検出するビオチン標識染色体１１特異的α−サテライトＤＮＡプローブ の使用を含むものとした。染色体１１特異的α−サテライトＤＮＡプローブは、 ヒト染色体の領域＋　１ｑ２３に対してロスミドブローブの開始点を位置決定す るマーカーとして使用した。４′、６−ジアミツー２−フェニルインドール（Ｄ ＡＰ＋）を用いて染色体を対比染色した。

放射線ハイブリッドマツピング へＴＤＣ遺伝子の染色体地図位置は、放射線ハイブリッドマツピング（ｒａｄｉ ａｔｉｏｎ　ｈｙｂｒｉｄ　ｍａｐｐｉｎｇ）　技術　［Ｒｉｃｈａｒｄ　ら、 　Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、４９：　１１８９−＋１９U （１９９１）］によって決定した。ＡＴＤＣとマーカーｓｔｒｏｍｅｌｙ−ｓｉ ｎ　ｌ　（ＳＴＭＹＩ）、ＣＪ５２゜＋９３　ＣＤｌｌ３３８．１”ｌ　、ＣＪ ５２．７７　（ＤＩＩＳ４２４）　、ＣＤ３Ｄ、アポリボ蛋白質（ＡＰＯ）、Ｔ ＩＩＹＩ、ＤＩｌｓ５２８またはＥＴＳＩとの間の順序および距離は、１００の 放射線ハイブリッドにおけるマーカーの相互分離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ 　）の統計的解析によって確立し、積率（ｍｏｍｃｎＤの方法を使用してマーカ ー間の破断の頻度を決定した［ＣＯＸら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０：　２４５ −２５０　（１９９０）］。この解析では単一保持頻度を使用したため、またそ れぞれのハイブリッドを殆ど全てのマーカーについて評価したため、いずれかの マーカーの順序についての可能性は、マーカー間の対によるウッドスコア（ｐａ ｉｒｗｉｓｃ　Ｉｏｒｌ　５ｃｏｒｅ）の和として見積った。最高の可能性を有 する地図は、隣接する遺伝子座の間のロッドスコアの和を最大とした地図として 特定した。３．０ｋｂｃＤＮＡの３′末端に特異的なプライマー［図７に示すプ ライマー９Ｄ−５および９Ｄ−３（配列番号・３０および３１）］を用いるポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、どの放射線ハイブリッドがＡＴＤＣＴ伝 子を含むかを決定した。ＰＣＨの条件は、ヒト染色体＋１ｑ上の池のマーカーを マツピングするのに使用されたものと同一とした（Ｒｉｃｈａｒｄら＋９９１． 前記）。

以下の実施例は説明の目的のためのみのものであり、如何なる様式においてもこ の発明を限定することを意味するものではない。

組込まれたロスミドＤＮＡの単離 ＋１３３ＤＮＡからロスミドライブラリーを構成した後にカナマイシンを使用し て組込まれたｎｅｏ遺伝子を含むロスミドを有する細菌を選択することに上り、 細胞ラインＩ８３から組込まれたロスミド配列を単離した。この方法によって単 離したロスミドクローンをその場でのハイブリダイゼーションによって検索し、 ３つのＡＴ相相補ｎ−結び付く遺伝子の位置であると先に示された染色体領域１ １ｑ２３由来のヒトＤＮＡを含むロスミドを同定した。２つのロスミドクローン （Ｋｌおよびに４　＋）が染色体領域＋１ｑ２３にハイブリダイズした。前記示 したように、染色体１１特異的α−サテライトＤＮＡプローブを同時に使用して 動原体側の染色体１１領域が同定された染色体特異的ペイント実験において、ジ オキソゲニン標識したＩ＜ｌまたはに４１コスミドブローブはＩ　］ｑ２３に位 置決定された。

染色体領域１］Ｑ２３に由来するＤＮＡのＩｎ２における組込み部位からの解放 は、形質移入したＤＮＡ内の遺伝子が、ＡＴ−Ｄ由来の細胞における放射線感受 性を相補するという更なる強い証拠である。制限酵素マツピングによれば、Ｋ１ およびに４１は、組み込まれたｐｃＶ１０８コスミドおよび隣接するヒトＤＮＡ （図ＩＡ）の両者よりなる本復配列を含んでいた。

クローン化したヒトＤＮＡが何らかの発現した細胞遺伝子を含むか否かを決定す るために、ロスミドに１の断片をプローブとして使用してＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡ ライブラリーを検索した。非反復性の細胞ＤＮＡのみを含む４つの隣接するＥｃ ｏＲＩ断片（図ＩＡ）をこの目的のために組合せた。１．２Ｘ１０＠のｃＤＮＡ クローンに対するハイブリダイゼーションの後に、４０の陽性のプラークが同定 された。９つのこれらのｃＤＮＡクローンの制限酵素マツピングにより、これら は全て関連し、５つの最大のもの（３，０ｋｂ）はほぼ同一であることが示され た（図ＩＢ）。３．０ｋｂｃＤＮＡの末端の部分的配列解析により、ポリＡの束 の存在によって３′末端が同定され、５′末端が唯一の完全なオーブンリーディ ングフレーム内の最初のメチオニンコドンの前に２つの停止コドンを示すことか ら、これらは全長のものであることが示唆された。［３ｋｂＣＤＮＡの全ヌクレ オチド配列を図４Ａ〜４Ｃに示す。］これらのコロスド内に含まれる当該遺伝子 をここてはｒＡＴ−Ｄ相補性（ＡＴＤＣ）遺伝子」という用語で呼ぶ。

Ｋｌコロスド内のｃＤＮＡに相補的な配列のおよその位置をサザンプロット解析 によって決定した。全長の３．０ｋｂｃＤＮＡまたは５′末端からの断片を用い て、種々の制限酵素で消化したＫｌｌススドＤＮＡのサザンプロット物をハイブ リダイズさせた。標識した制限断片の位置によって、ハイブリダイゼーションの ２つの別々の領域を同定した（図ＩＡ）。ｃＤＮＡの５′末端からの断片とのハ イブリダイゼーションにより、ロスミト内の転写の方向は左側から右側であるこ とか示された（図ＩＡ）。これらの結果と一貫するのは、ｃＤＮＡとロスミドク ローンとの間の制限部位（Ｘｈｏｌ、５ｓｔｌおよびＳｍａｌ）の類似性（図１ ）、並びに左側に対するハイブリダイゼーションの領域（図ＩＡ）が転写体の５ ′末端をコートすることをやはり示した部分的配列解析である。

ｃＤＮＡ中に見出される全ての配列かに１およびに４１コスミド内に含まれてい るわけてはなかった。これはｃＤＮＡ内に見出されるものに対応する５ｓｔＩお よびＥｃｏＲＴ制限部位を含む更なるハイブリダイゼーション領域が存在しない ことから明らかであったし、またｃＤＮＡ内のコード配列の半分近くがこれらの ロスミド内に存在しなかったことを示すものである。Ｋｌおよびに４１コスミド クローンの両者において形質移入したｐｃＶ１０８配列がＡＴＤＣＴ伝子に隣接 して位置していたという事実は、截頭遺伝子が細胞ライン１８３に組込まれた形 態であることを示す。組込まれた配列の方向性によりＳＶ４０二方向性転写終止 配列か配置され、これらは截頭遺伝子の下流でｐｃＶ＋０８コスミド内のｎｅＯ 遺伝子に隣接して位置する（図ＩＡ）。したがって、細胞ラインＩＢ３に組込ま れたＡＴＤＣＴ伝子の形態は、３′末端の不存在に拘らず、機能的な転写単位で ある。

１８３においてＡＴＤＣＴ伝子が一部分のみ存在することから、Ｉｎ２の幾つか の性質を説明することができる。すなわち、（ａ）１８３における放射線感受性 は、正常な細胞［ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ　１９８９、前記］で認められるレ ベルまで完全には復帰しなかった。（ｂ）１８３は組込まれたＤＮＡを増幅した のに対し、組込まれたロスミト配列を増幅しなかった他の独立に誘導された関連 クローンは培養における放射線耐性［ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅｒ　１９８９］を 維持することはできなかった。

（ｃ）ｌＢ３細胞は、親ＡＴ５［３１ＶＡ細胞ライン［ＫａｐｐとＰａ１ｎｔｅ ｒ　１９８９１と類似する放射＃１ｉＩｉ４性ＤＮＡ合成を依然として示した。

ＡＴＤＣＴ伝子の欠落部分を取得するために、ｃＤＮＡをプローブとして使用し てヒトゲノム染色体１１のライブラリーを検索した。２つのロスミドクローン（ ３−１および４−１）が同定された。これらのクローンの制限マツピングにより 、これらが重複領域を含むことが示された（図２Ａ）。３．０ｋｂｃＤＮＡ（図 ＩＢおよび４Ａ〜４Ｃ）をプローブとして使用し、サザンプロット解析により、 フスミトＤＮＡ内の３つの別々のハイブリダイゼーションの領域が明らかとなっ た（［Ｎ２Ａ）。ロスミドクローン４−１には含まれていたが３−１には含まれ ていなかったこれらの領域の１つは、ロスミドクローンに１およびＩ＜４１と部 分的に１！復していた（図２Ａ）。これはｃＤＮＡ配列から誘導したプライマー を用いた配列解析によって決定された。重複領域を越える場合（図ＩＡおよび２ Ａを比較）、ＫＩと４−１との間の差異は、明らかに形質移入の際にＫｌに生起 して遺伝子の３′木端の喪失に帰着した再配置のためである。したがって、ロス ミトクローン４−１は、クローンに１およびに４１から欠落していたＡＴＤＣＴ 伝子の３′部分を含む。ロスミドクローンＫｌおよび４−１から誘導された複合 地図は、ＡＴＤＣＴ伝子の欠落する３′部分は長さにして３０ｋｂを越えること を示す（図２Ｂ）。

３．０ｋｂｃＤＮＡをプローブとして用いた正常細胞由来のヒトゲノムＤＮＡの サザンプロット解析は、ロスミドクローンの制限酵素マツピング解析から予期さ れた遺伝子の構造と一貫していた（図２Ｂ）。Ｂｇｌ　Ｉ　＋　（１，８，４５ ，８０および１５ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ　（４，Ｏ１６，０および２０ｋｂ）、お よびＸｂａ　Ｉ　（９，０，１２および２３ｋｂ）を用いたヒトＤＮＡの消化の 後に検出されたハントは、全て予期された断片に対応していた。［λＨ４ｎｄｌ ｌ＋制限断片をマーカーとして使用した。］　１．８ｋｂのＢｇｌｌ＋断片は、 小数の相補的配列のみを含み、検出するのか困難である。更なるバンドが存在し ないことは、ヒトゲノムにはＡＴＤＣ遺伝子に相補的な他の遺伝子は存在しない ことを示す。親ＳＶ４０形質転換ＡＴ繊維芽細胞ライン、八Ｔ５ＢＩＶＡ、並び に池の２つのＳＶ４０形質転換ＡＴ繊維芽紬胞ライン（ＡＴ３ＢＩＳＶ、ＡＴ− Ａ　；ＡＴ２３Ｆ、未知の相補ＩＴ）から単離したＤＮＡのサザンプロット解析 は、正常な細胞ＤＮＡからのらのと同一の結果を与えた。

ＡＴＤＣは甲コピー遺伝子であるが、明らかにＲＮＡ転写体の代替的なプロセシ ングのために、これは種々の大きさの幾つかのｍＲＮＡを生成する。ＳＶ４０形 質転換繊維芽細胞ライン（ＬＭ２１７）から単離したポリＡ選択ｍＲＮＡのＲＮ Ａプロット解析により、３．０ｋｂｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした２つ のｍＲＮＡ転写体（５，７および４．７ｋｂ）が示された。これに対して、ＲＮ Ａプロット解析に際して、ＨｅＬａ細胞から単離したｍＲＮＡは、最大のｍＲＮ Ａ転写体（より短い露光の場合により明瞭に認められた）を欠失し、その代りに 少なくとも２つの他のもの（３，０および１．８ｋｂ）を含んでいた。Ｈｅ　Ｌ ａ細胞においては３．０ｋｂｍＲＮＡ転写体が最も豊富であり、このｍＲＮＡに ついてのｃＤＮＡがＨｅＬａ細胞ライブラリーで同定された唯一のものであった という事実と一貫していた（ＩＮＩＢ）。

２つのＳＶ４０形質転換ＡＴ繊維芽細胞ライン（ＡＴ３ＢＩＳＶおよびＡＴ５Ｂ ＩＶＡ）は、ＲＮＡプロット解析に際して、ＬＭ２１７およびＨｅＬａ細胞に認 められる種々の量のｍＲＮＡ転写体を含んでいることが示された。これに対して 、１８３細胞ラインは、ｍＲＮＡの大きさの点でＳＶ４０形質転換正常ラインＬ Ｍ２１７と同一であると認められた。ｍＲＮＡ間の差異の有意性は、ＡＴ３ＢＩ ＳＶおよびＡＴ５１３１ＶＡ細胞ラインテ観察され、ＬＭ２＋７またｌ！１３３ Ｔ認められるものは知られていない。戴頭したＡＴＤＣ遺伝子由来の更なるｍＲ ＮＡ転写体は＋８３では明らかではなかった。これは検出のレベル以下であるか 、内生遺伝子から転写されたｍＲＮＡの１つと大きさが類似することを示す。

多数のｍＲＮＡの生産が池の哺乳動物遺伝子を用いた場合に認められており、こ れは多数のプロモーター、代替的なスプライシング、および／または代替的なポ リ八付加部位に起因し得るものである［Ｌｃｒｆら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、　５５：　１０９１−１１＋７　（１９８６）］、ポリＡ選択ｍ ＲＮＡのＲＮＡ解析によって示されたように、上皮（ＨｅＬａ）および繊維芽（ ＬＭ２１７、ＩＢ３、ＡＴ５ＢＩＶＡおよびＡＴ３ＢＴＳＶ）細胞ラインにおけ る異なるｍＲＮＡの存在は、ＡＴＤＣｍＲＮＡの組織特異的プロセシングを示し 得るものであり［Ｌｅｆｆら１９８６、同上］、これはＡＴの多面発現性の特徴 と一貫し得るものである。ＨｅＬａ細胞から単離されたｃＤＮＡを生産した３、 ０ｋｂｍＲＮＡは、ＬＭ２１７細胞ラインには見出されないことから、放射線耐 性の機能性相補には、ＨｅＬａおよびＬＭ２　＋　７の両者に存在する４、７ｋ ｂｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡが必要と考えられる。

Ｋ１コスミドを用いるＡ７５ＢＴＶＡ細胞の形質移入の後に、Ｘ線に対する感受 性について５０の６４１８耐性クローンを試験した。３つのクローンが増加した 放射線耐性を示し、それらの１つ（Ｃ６）は１８３細胞ラインと略同−の放射線 耐性を有していた（図３）。

よって、これらの最初の機能性相補の検討により、図３に示すように、ＡＴ５ｒ ３１ＶＡ＠胞ラインにおける数ライン性の部分的回復が達成された。Ｋｌロコス ドとの完全な相補がないことは、幾つかの因子に帰し得る。ＡＴＤＣ遺伝子の大 きさが大きいことは、ヒト細胞に大きな無傷のＤＮＡ断片を組込むことに随伴す る問題のために、相補を困難にしていると考えられる［Ｃｏ１ｂｅｒｅ−Ｇａｒ ａｐｉｎら、Ｇｅｎｅ、５０：　２７９−２８８　（１９８６）；　）ｌｏｅｉ ｊｍａｋｅｒｓ　ら、　Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、１６９：　ｌ１ｌ−１P ９（＋９ ８７）　：　Ｍａｙｎｅ　ら、Ｇｅｎｅ、６６：　６５−７６　（１９８８）　 （誤植：Ｇｅｎｅ、　８３：　３９５　（１９８９））　］B 更に、ＡＴＤＣ遺伝子はここで特徴付けた３、０ｋｂｍＲＮＡより大きいｍＲＮ Ａを生産することから、Ｋｌロコスドが１８３に形質移入した全てのコード配列 を含むか否かは明らかではない。

ΔＴＤＣ遺伝子の染色体位置の精密マツピングヒト染色体Ｉ　Ｉ　（Ｒｉｃｈａ ｒｄら＋９９１、前記）のマツプした断片を含む放射線ハイブリッドを使用して ＡＴＤＣ遺伝子の位置を決定した。１１ｑ２３内の既知のマーカーに対するＡＴ ＤＣ遺伝子の位１τは、どの放射線ハイブリッドが遺伝子を含むかを同定するＰ ＣＲを使用することにより確立した。１００の放射線ハイブリノ１−細胞ライン の統計的解析により、ＡＴＤＣ遺伝子はＴＨＹｌおよびＤＩ　ｌ５５２８と密接 に関連しており、ロッドスコアはそれぞれ１２．２および１７であることが示さ れた（表１）。ｌ１ｃｅｎ−ＡＰＯ−ＣＤ３Ｄ−ＴＨＹｌ　−ＡＴＤＣ−１１ｑ ｔｅｌの順序は、ＡＴＴ）Ｃ遺伝子をＴＨＹｌに対して動原体側に位置させるｌ 　ｌ　ｃ　ｅｎ−ＡＰＯ−ＣＤ３Ｄ−ＡＴＤＣ−ＴＨＹＩ　−１１ｑ　ｔ　ｅ　 Ｉの順序より１．０００倍高い可能性を有していた。

よって、ＡＴｒ）Ｃ遺伝子は、相）１ｆｆｉｌ！ＴＡおよびＣについてＡＴ遺伝 子を含むと予期された結合領域の外側にある。これは相補群り遺伝子について別 々の遺伝子座を示している。ここに記載した結果は、ＡＴＤＣ遺伝子がＡＴ−Ａ およびＡＴ−Ｃ遺伝子についての動原体側（ＳＴＭＹＩ）および末端小粒側（Ｄ ＩＩＳ４２４）の隣接マーカーに結合していないことを明らかに示す。しかしな がら、ＩＢ３から）ｔ’、１ｌｌＩｔされたＡＴＤＣ遺伝子がＴＨＹｌに対して 末端小粒側にあるという証拠は、その領域内の更なるＡＴ遺伝子についての証拠 と一貫するものである。この証拠から、ｌ　１Ｑ２３領域内の幾つかの遺伝子が ＡＴに関連していると認められ、他のヒトＤＮＡ配列に対するＡＴＤＣのハイブ リダイゼーションの欠如は、これらか密接には関連していないことを示唆する。

ＡＴＤＣＳＴλＩＹＩ　、５　７　＋３　１５　６４　９９ＡＴＤＣＤＩＩＳ３ ８４　１．４　９　１！　１４　６５　９９ＡＴＤＣＤＩＩＳ４２Ｊｌ　１．０ 　８　＋２　１３　６６　９９ＡＴＤＣＡＰＯ８１３，１１０＋０　８　７１　 ９９ＡＴＤＣＣＤ３Ｄ　３７　７．７　１３　７　３　７６　９９ＡＴＤＣＴＩ ＩＹ＋　１７　１２．２　１５　５　０　７９　９９ＡＴＤＣＤｌｌＳ５２８　 ６　１７．０　１８　２　０　７９　９９ＡＴＤＣＥＴＳ１　２．０　９　１１ 　１０　６９　９９ＡＰＯＣＤ３　２８　９．５　１４　５　３　７８　＋００ ＡＰＯＴＩＩＹＩ　５０　５．３　１＋　８　５　７６　１００ＣＤ３Ｄ　Ｔ階 ’１　１７　１１．７　１４　３　２　８１　１００“関連するマーカー（ＬＯ Ｄ＞３）についてのみ示される距離（センチレイ（ｃｅｎｔＩＲａｙｓ　）　） を表す。

２つのマーカーか関連する可能性。

゛マーカーＡおよびＢの両者（千十）を保持する、マーカーＡは保持するがマー カーＢは保持しない（＋−）　、マーカーＢは保持するがマーカーΔは保持しな い（−十）またはマーカーＡおよびＢの両者とも保持しない（−一）ハイブリッ ドの数。解析したハイブリットの合計数も示す。

以下に列記する←オ料は、ロックビル、ＶＤ　（ｔ、１ｓＡ）のアメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託した。この寄託は、特許手 続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の 規定の下で行った。生ｑする培養物の維持は、寄託の日付から３０年間保証され る。η物は、ブダペスト条約の規定によりＡＴＣＣによって利用可能となり、適 切な米国特許の発行の際に制限されない利用可能性を保証する出願人とＡＴＣＣ との間の同意にｆ！Ｅせられる。寄託した株の利用可能性は、いずれかの政府の 権威の下でその特許法に従って授与された増刊に違１１シてこの発明を実施する 実施権として解釈すべきものではない。

ロスミド　寄託日付　ＡＴＣＣ＃ Ｋ　ｌ　ｌ　９９２年６月１６日　７５２５０４−１　１９９２年６月１６日　 ７５２５１この発明の前記した具体例の説明は、例示および説明の目的のために 行ったものである。これらは、それに尽きるものでもなければ、開示した正確な 形態にこの発明を限定するものでもなく、前記教示に照らして多くの改変および 変形が可能であることは自明である。具体例は、この発明の原理およびその実際 的な適用ＨＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧ　ＧＴＧＴＧＴＣＴＣＴ　ＡＧＴＣＣＴＣＧＴ Ｇ　ＧＴＴＧＣＣ丁ＧＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧゴ５１　ＣＡＡＣ［；ＧＧＴＣ Ｇ　ＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧ　ＣＣＡＧＧＧＡＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＣＣＧ　ＴＣ ＧＧＧＣＣＣＣＡ２０１　ＧＴＧＧＣＡＧＣＣＴ　ＧＧＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＣ ＡＡＧＧＣＴＧ　ＡＣＧＧＣＡＡＧ［；Ａ　ＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣ２５１ＡＣＣ ＡＡＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＧＧＡ　ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧ　ＧＧＣＡＡＧＡ ＧＣＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＣ３０１ＣＣＴＧＡＡＧＣＣＡ　ＧＧＧＧＡＡＧＧＴ Ａ　ＧＧＡＧＣＧＣＣＣＴ　ＧＴＴＣＧＣＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＴＧＧＣ３５１ ＧＧＣＧＡＣＣＣＡＴ　ＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴ　ＧＴＣＧＡＧＴＣＣＧ　ＧＧＧ ＡＣＧＡＣＡＡ　ＧＡＡＣＴＣＣＡＡＣ６（ＩＩ　ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＡ　Ｃ［ ；ＧＴＣＣＡＡＧＴ　ＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡ　ＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧ　ＴＧＣＧ ＡＣ丁ＣＣＴ６５１　ＧＣＡＴＣ［；ＧＣＡＡ　ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧ　ＧＣＧ ＧＴＣＡＡＧＴ　ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴ　ＧＴＧＣＣＡＧＧＣＣ１０５１ＣＣＴ ＧＧＡＧＣＡＧ　ＡＡＣＴＴＣＣＧＧＧ　ＡＣＣＴＧＧＴにＣＧ　ＧＧＡＣＣＴ ＧＧＡＧ　ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＧｌｌｏｌ　ＡＧＧＡＡＧＴＧＡＧ　ＧＧＣＴＧ ＣＧＣＴｆ；　ＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧ　ＡＧＣＡＧＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣ ＡＡ＋３５１　ＡＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＴＧ Ｔ　Ａ丁ＧＣＡＴＧＣＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＧＡ１９０１　Ｇｉ；ＡＡＧＧＡＡ ＣＧ　ＡＧＧＣＧＣＣＡＣＡ　ＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴ　ＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣ ＣＴＧＣＴＧＣＴＣ２０５１ＣＴＣＣＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡ ＣＴＣＣＡＴＴ　ＣＡＧＡＣＴＣＣＴＴ　ＴＣＣＴＧＣＣｎＧ２１０１　ＴＧＡ ＣＣＴＣＡＧＡ　ＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴ　ＣＡＴＴＣＣＴＧＴＧ　ＣＴＣＡＧＡ ＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣ２＋５１　ＡＧＧＧＧＴＧＡＧＡ　ＴＡＧＧＴＴ ＧＧＧＧ　ＣＣＴＧＣＣＣＴＡＡ　ＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＣ ２２０１Ｇ［；ＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴＡＧ　ＣＡＧＴＧＡＧＴＡＣ ＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡ　ＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣ２２５１ＴＣＴＣＣＣＧＣＣＣＡ ＣＧＣＣＣＴＧＣＴ　ＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴ　ＴＴＣＴＣ ＴＣＣＡＡ２３０１　ＧＧＣＣＣＴＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＧＴＴＧ　ＴＣＡＧＣ ＡＧＡＴＧ　ＣＣＴＧＧＡＣＡ［；ＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣ２５０１ＣＣＡＧＧ ＣＧＧＴＧ　［；［；ＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡＣＴＴ　ＴＧＡＧＴＣＴ ＧＴＧ　ＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧ２６５１　ＣＡＡＡＴＡＧＣＴＡ　ＣＴＧＧＣＣ ＣＡＧＣ丁ＡＣＣＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＴＧＣＣＴＡ　ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡ２ ７０１　ＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＴＧＧＣＡＴ　ＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＧ ＡＴＧＧＡＧＴＧＴ　ＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧ２７５１　ＡＣＣ［；ＣＡＡＡＡＧ 　ＧＴＧＣＣＴＴＡＣＡ　ＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＴＧ ＣＣＣＣＡＴ２８０１　ＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴ ＡＣＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡ　ＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧ２８５１　ＣＴＣＡＡ ＧＧＡＴＴ　ＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡ　ＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧ　ＡＧＣＡＧＣＡＣ ＡＧ　ＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣ２９０１ＴＣＣＣＧＴＣＴＣＡ　ＡＣＡＧＣＣＣＣ ＡＧ　ＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧ　ＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧ　ＧＡＴＧＧＧＣＣＡＧＦ ＩＧ　４Ｃ ＋　２１　４１ ＦＩＧ　５Ａ。

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ＩＣ （配列決定した鎖　） ４１　ＴＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣＣＧＴＴＡＣＣＴＴＴＧ ＣＣＧＡＡＡＡ２０１ＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＴ ＧＣＧＡＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣ２４１ＧＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＭＧＧＣＧＧＴ ＣＡＡＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＧＣＣ３６１ＣＧＧＧＡＣＴＴＴＧＡＧＧ ＣＣＣＧＣＡＡＧＴＧＴＣＣＣＧＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＧＡ５２１　ＣＴＧＧＧ ＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＡＡＦ ＩＧ　８ｃ （西〒コシ１ｊ、ヌと：ｆＬＪこｆｆ）８１　ＡＴＴＧＡＧＧＡＴＧＡＡＧＣＴ ＧＡＧＡＡＧＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣ＋６１　ＣＴＴＡＣＣＣ ＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＧＣＡＧＧＣＣ丁ＴＧＧ（自己 グ１１．規し１こ鎖　） ８１　ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧ ＡＡＣＴＴＣＣ１２１ＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧ ＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴ＋Ｅｉ＋　ＧＡＧＧＧＣＴＧＤＧＣＴｔｌｉらＡ ＧＣＡＧＣθＧＧＡＧＣＡεＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣ２０１ＣＡＡＧＴＧＡＡ ＧＧＴＧＡＴＣＡ丁ＧＧＡＴＧＣＴＣＴＧＧＡＴＧＡＧＡＩ；ＡＧＣＣＡＦＩＧ 　ＢＥ （配列決定した鎖　） ８１　ＡＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＣＣＴＡＴＣ ＡＴＧＴＣＣＴ１２１　ＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＧ ＴＣＡＣＴＡＧＧＣＡＡＣＴＴＣＩｆ；Ｉ　ＡＡＧＧＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＣＡ ＡＴＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＧＮＣＡＣＧＴＴＧＡＧＡ２０１　Ａｔ；ＡＴＧＴＧ ＣＡＡＧＧＣＧＮＡＣＣＴＧＡＧＣＮＧ丁ＡＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧＡＧ２８１ 　ＣＣＣＣＡＡＧＧＣＮＡＴＡＧＡＣＣ丁■丁ＣＴＣＴＣＣＣＡＡＡＴＣＡＡＴ ＴＣＣＴＧ３２１　ＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧ ＡＧＣｎＣＴ丁ＣＴＣＡＦ１ａ　８Ｆ （西びり、歿した鎖　） ４１　ＧＴＧＡＣＴＣＡＴＣＴ［；Ａ［；ＣＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＧＴ ＧＧＣＴＧＧＣＴＣｆｌｉｔ　ＣＴＣＣｎＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧ ＣＴＧＡＣＣＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＣ２４１ＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＡＧＡＣＣ ＴＡＧＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＧＧ［。

２Ｂ１　ＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣＣＧＴＧＣＡＧＴＧＡＣＴ（配列決定した鎖 　） ＋ＥＩＩ　ＴＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＴＣＣ ＡＧＮＧＧＣＡＣＡ（配列決定した鎖　） ２０１　ＡＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴ ＣＡＣＡＣＣ丁Ｃ（配列、笑定した鎖　） ４１　ＴＡＣＡＣＴ丁ＴＧＧＡＧＡＡＧＮＡＧＣＴＧＴ［；ＣＴＧＣＴＣＴＧＧ ＧＩＩＣＣＧＧＧＮ＋６１　ＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＴ ＧＧＡＡＡＴＣＴ［、（、ＣＡＡＧＣＡＧ２４１　ＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＡＣＣ ＴＧＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧ［；ＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡ （■ラリ７歿した狛　） ２０１　ＧＣＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴに ＣＴＧＣＴＣＴＴＦ７６８に （翫ヲリ決定した鎖　ン Ｂ−５ １ＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＡＴＴＧＧＧＴＣＣＡＡＣＧＡＡＧＣＣＣＣＡ ＴＧＡＧＣ４ｆ　ＴＣＣＴＧ（、ＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＣＡ ＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＣ８１ＴＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣ ＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＴ１６１　ＣＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＣＡ ＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＧＣＡＧＴＴＣＣＧＧＣＣＴＣＴＣ２０１ＣＧＡＣＴＴ ＣＣＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣ丁ＣＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＣＴｎＣＣ２４１ ＴＧＣＣＴＴＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴ ＧＣＴＣ２８１ＡＧＡＧＧＣＣＡＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡ ＧＧＴＴＧＧＧＧＣＣＴ３２１　ＧＣＣＣＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴ ＣＣＴＣＴＣＧＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧ３６１　ＧＧＧＣＴＡＧＣＡＧＴＧＡ ＧＴＡＣＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＣＴ４０１　ＣＣＣＧＣ ＣＣＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴＡＧＡＣＧＴＴＴＣＦ ｌ（９，８Ｌ ９Ｃ （西己タ１１．規しプこｉｍ） ４１　ＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣ ＡＴＴＣＡＣＡ８１　ＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＡ ＣＴＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣ２０１にＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＣＣＣＡ ＧＧＣＧＧＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡＧ２４１　ＣＣＡＣＴＴＴＧＡＧＴ ＣＴＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧ２８１　ＡＣＴ ＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＣＣＴＴＡＧＣＣＡＡＧＡＴＡＴＴＣＣ丁ＣＴＧＴＴＣＣ ＣＦＩＧ、　８Ｍ。

Ｄ （配列決定した鎖　） ８１　ＣＡＡＡＴＡＧＣＴＡＣＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＣＡＴＴＴＡＣＣＡＴ 丁ＴＧＣＣＴＡ１２１　ＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＴ ＧＧＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣ１５１ＧＡＴＧＧＡＧＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＣ ＴＧＡＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＴＧＣＣＴＴＡＣＡ２０１　ＣＡＣＴＧＣＣＣＣＣ ＡＣＣＣＴＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣ２４１Ｃ丁Ｃ ＣＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＡＣＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＣＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴ Ｇ２８１　ＣＴＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＣＡＧＧＡ ＧＣＡＧＣＡＣＡＧ３２１　ＴＧＧＧＧＡＣＡＴＣＴＣＣＣＧＴＣＴＣＡＡＣＡ ＧＣＣＣＣＡＧＧＣＣＴＡＴＧＧＧＧ３６１　ＧＣ丁ＣＴＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧ ＧＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＡＧＧＧＦＩＧ、と？Ｎ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、　ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ 、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ 、ＰＴ、Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　ペインター、ロバート　ビー。

アメリカ合衆国　９４０１０　カリフォルニア州　バーリンゲイム　ドローレス 　ウェイ（７２）発明者　カップ、レオン　エン。

アメリカ合衆国　９４９０１　カリフォルニア州　サンラフアニル　ポイント　 サン　ペドロ　ロード　４９ （７２）発明者　ユ、ローーチュング アメリカ合衆国　９４０６１　カリフォルニア州　レッドウッド　シティ　アラ メダ　プラス　パルガス　１９１７

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．毛細血管拡張性運動失調の相補群Ｄ（ＡＴＤＣ）の単離した遺伝子またはそ の断片を含む組成物であって、前記遺伝子または前記断片のヌクレオチド配列が 、それぞれＡＴＣＣ番号７５２５０および７５２５１としてアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託したコスミドＫ１およびコスミ ド４−１に含まれるＡＴＤＣ遺伝子または当該ＡＴＤＣ遺伝子の断片のヌクレオ チド配列であるか、または前記コスミドに含まれる当該ＡＴＤＣ遺伝子配列また は前記ＡＴＤＣ遺伝子配列の断片に実質的に相補的である組成物。
2. ２．それぞれＡＴＣＣ番号７５２５０および７５２５１としてアメリカン・タイ プ・カルチヤー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託したコスミドＫｌおよび／ま たはコスミド４−１を含む組成物。
3. ３．図４Ａ〜４Ｃに示すｃＤＮＡ配列［配列番号：１］、前記ｃＤＮＡ配列［配 列番号：１］に実質的に相補的な配列、前記ｃＤＮＡ配列［配列番号：１］の断 片、および前記ｃＤＮＡ配列［配列番号：１］の断片に実質的に相補的な断片よ りなる群から選択されるヒトＡＴ蛋白質／ポリペプチドをコードする単離した核 酸配列を含む組成物。
4. ４．前記ｃＤＮＡ配列［配列番号：１］の前記１以上の断片が、図８Ａ〜８Ｎに 示す断片［配列番号：３２〜４５］であり、前記ｃＤＮＡ配列〔配列番号：１］ の断片に実質的に相補的である断片が、図８Ａ〜８Ｎに示す断片［配列番号：３ ２〜４５］に実質的に相補的な核酸配列である請求項３記載の組成物。
5. ５．図７に示すプライマー［配列番号：４〜３１］およびこれに実質的に相補的 な核酸配列よりなる群から選択されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマ ーを含む組成物。
6. ６．請求項１記載のＡＴＤＣ遺伝子またはその断片によってコードされる蛋白質 またはポリペプチドを含む組成物。
7. ７．図５Ａ〜５Ｄに示すアミノ酸配列［配列番号：３］、図５Ａ〜５Ｄに示すア ミノ酸配列の一部、図５Ａ〜５Ｄに示すアミノ酸配列の相同の変形体であるアミ ノ酸配列、および図５Ａ〜５Ｄに示すアミノ酸配列の相同の変形体であるアミノ 酸配列の一部よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する毛細血管拡張性運 動失調（ＡＴ）蛋白質またはポリペプチドを含む組成物。
8. ８．請求項７記載のＡＴ蛋白質またはポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡま たはｃＤＮＡ配列を含む組換え核酸分子であって、前記ゲノムＤＮＡまたはｃＤ ＮＡが、前記核酸分子中の発現調節配列に機能的に連結されている組換え核酸分 子。
9. ９．前記ゲノムＤＮＡ配列が、それぞれＡＴＣＣ番号７５２５０および７５２５ １としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に奇託し たコスミドＫ１およびコスミド４−１に含まれるＡＴＤＣ遺伝子のＤＮＡ配列、 前記コスミドに含まれる前記ＤＮＡ配列に実質的に相補的なＤＮＡ配列、前記コ スミドに含まれる前記ＤＮＡ配列の断片、および前記コスミドに含まれるＤＮＡ 配列の断片に実質的に相補的なＤＮＡ配列よりなる群から選択される請求項８記 載の組換え核酸分子。
10. １０．前記ｃＤＮＡ配列が、図４Ａ〜４Ｃに示す３キロベース（ｋｂ）ｃＤＮＡ 〔配列番号：１］、前記３ｋｂｃＤＮＡに実質的に相補的なＤＮＡ配列、図５Ａ 〜５Ｄに示すｃＤＮＡ配列［配列番号：２］、および図５Ａ〜５Ｄに示す前記ｃ ＤＮＡ配列に実質的に相補的なＤＮＡ配列よりなる群から選択される請求項１０ 記載の組換え核酸分子。
11. １１．ＡＴＤＣ遺伝子中の変異を検出する方法であって、同一または実質的に同 一のＰＣＲプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、前記 遺伝子および正常であると判っているＡＴＤＣ遺伝子の１以上の断片を増幅し、 前記遺伝子の増幅によるＰＣＲ生成物と正常な遺伝子の増幅に由来するものとを 比較することにより前記ＡＴＤＣ遺伝子が何らかの変異を含むか否かを決定し、 変異に伴うＰＣＲ生成物の間の差異を検出する工程を含むＡＴＤＣ遺伝子中の変 異を検出する方法。
12. １２．大きさの差異について前記ＰＣＲ生成物を比較する請求項１１記載の方法 。
13. １３．ＰＣＲ一本鎖構造多形性検定または変性勾配ゲル電気泳動検定を使用して 、前記ＡＴＤＣ遺伝子が何らかの変異を含むか否かを決定することを含む請求項 １１記載の方法。
14. １４．前記ＰＣＲプライマーを、図７に示すプライマー［配列番号：４〜３１］ およびこれに実質的に相補的な核酸配列よりなる群から選択する請求項１１記載 の方法。