DE69935247T2

DE69935247T2 - Arzneimittel-ziele in candida albicans

Info

Publication number: DE69935247T2
Application number: DE69935247T
Authority: DE
Inventors: Roland H. Contreras; Bart Nelissen; Marianne Denise De Backer; Walter Herman Maria Louis Luyten; Jasmine Elza Viaene; Marc George Logghe; Jorge Eduards Vialard
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1998-12-04
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2019-12-07
Also published as: ES2283147T3; NZ511410A; IL143494A0; WO2000034481A3; DE69935247D1; AU773378B2; US20070010448A1; WO2000034481A2; ATE354658T1; JP2004500016A; EP1135503A2; AU2282700A; EP1135503B1; US7125970B1; CA2353525A1; DK1135503T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung eines Gens von Candida albicans, welches für das Wachstum und die Zellteilung kritisch ist und welches Gen als ein selektives Arzneimittelziel zur Behandlung von mit Candida albicans assoziierten Infektionen verwendet werden kann. Eine Nukleinsäuresequenz von Candida albicans wird ebenfalls bereitgestellt und codiert für das Polypeptid, welches für das Wachstum von Candida albicans kritisch ist.
Opportunistische Infektionen in abwehrgeschwächten Wirten stellen eine zunehmend verbreitete Ursache von Sterblichkeit und Morbidität dar. Candida-Spezies gehören zu den am häufigsten identifizierten pilzlichen Pathogenen, die mit solchen opportunistischen Infektionen assoziiert sind, wobei Candida albicans die am meisten verbreitete Spezies ist. Solche pilzlichen Infektionen sind damit zum Beispiel in AIDS-Populationen zusätzlich zu normalen gesunden Frauen problematisch, wo Candida albicans-Hefen die häufigste Ursache von Vulvovaginitis darstellen.
Obwohl Verbindungen für die Behandlung solcher Erkrankungen existieren, wie Amphotericin, sind diese Arzneimittel allgemein in ihrer Therapie begrenzt aufgrund ihrer Toxizität und Nebenwirkungen. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf an neuen Verbindungen, welche zur Behandlung von mit Candida assoziierten Infektionen zusätzlich zu Verbindungen verwendet werden können, welche in ihrer Wirkung gegen Candida albicans selektiv sind.
Klassische Ansätze zur Identifizierung antipilzlicher Verbindungen beruhten nahezu ausschließlich auf der Inhibierung des pilzlichen oder Hefewachstums als einem Endpunkt. Bibliotheken von natürlichen Produkten, halbsynthetischen oder synthetischen Chemikalien werden auf ihre Fähigkeit zum Abtöten oder Hemmen des Wachstums des Zielpathogens oder eines verwandten nicht-pathogenen Modellorganismus gescreent. Diese Tests sind umständlich und liefern keine Informationen über die Wirkungsweise einer Verbindung. Die viel versprechenden Bleiverbindungen, die aus solchen Screens zum Vorschein kommen, müssen dann auf eine mögliche Wirt-Toxizität getestet werden, und ausführliche Studien der Wirkungsweise müssen anschließend durchgeführt werden zur Identifizierung des betroffenen Molekülziels.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben nun eine Nukleinsäuresequenz von Candida albicans identifiziert, die für ein Polypeptid codiert, welches für deren Überleben und Wachstum kritisch ist. Diese Sequenz stellt ein neues Ziel dar, welches in ein Assay aufgenommen werden kann, um selektiv Verbindungen zu identifizieren, die zur Inhibierung der Expression solcher Polypeptide und ihrer potenziellen Verwendung bei der Linderung von mit einer Candida albicans-Infektion assoziierten Erkrankungen oder Zuständen fähig sind.
Aus diesem Grund wird gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das für ein Polypeptid codiert, das für das Überleben und das Wachstum der Hefe Candida albicans kritisch ist und wobei das Nukleinsäuremolekül die in der SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenzen von Nukleotiden umfasst.
Während die hierin definierten Moleküle als kritisch für das Wachstum und den Metabolismus von Candida albicans nachgewiesen wurden, wurde für einige der Moleküle keine offenkundige Funktionalität zugewiesen aufgrund der Tatsache, dass keine funktionell verwandten Sequenzen in einem anderen prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus in den betreffenden Datenbanken zu finden sind. Somit können vorteilhafter Weise diese Sequenzen Spezies-spezifisch sein, wobei sie in diesem Fall als selektive Ziele für die Behandlung von durch Candida Albicans vermittelte Infektion verwendet werden können.
Die in der Sequenz gemäß der Erfindung verwendeten Buchstaben, die nicht als Buchstaben des genetischen Codes erkennbar sind, bezeichnen eine Position in der Nukleinsäuresequenz, wo eine oder mehrere Basen A, G, C oder T die Nukleotid-Position einnehmen können. Repräsentative Buchstaben, die zur Identifizierung des Bereichs von Basen verwendet werden, die verwendet werden können, sie die folgenden:
M: A oder C
R: A oder G
W: A oder T
S: C oder G
Y: C oder T
K: G oder T
V: A oder C oder G
H: A oder C oder T
D: A oder G oder T
B: C oder G oder T
N: G oder A oder T oder C
In einer Ausführungsform von jedem der oben bezeichneten Aspekte der Erfindung kann die Nukleinsäure ein mRNA-Molekül oder alternativ eine DNA und vorzugsweise ein cDNA-Molekül umfassen.
Ebenfalls wird durch die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das zum Hybridisieren zu den in 1 dargestellten Nukleinsäuremolekülen unter den Bedingungen einer hohen Stringenz fähig ist und wobei die Bedingungen Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt sind.
Die Stringenz der Hybridisierung, wie hierin verwendet, bezieht sich auf Bedingungen, unter welchen Polynukleinsäuren stabil sind. Die Stabilität von Hybriden spiegelt sich in der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride wieder. Tm kann durch die folgende Formel angenähert werden: 81,5°C+16,6 (Log10 (Na+) +0,41 (%G&C)-600L/Lworin L die Länge der Hybride in Nukleotiden ist. Tm nimmt ungefähr um 1–1,5°C mit jeder 1%-Abnahme in der Sequenzhomologie ab.
Der Ausdruck "Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen, unter denen sich eine einzelsträngige Nukleinsäure mit einem komplementären Strang verbindet, wenn sich die Purin- oder Pyramidinbasen darin mit ihrer entsprechenden Base durch Wasserstoffbindung paaren. Bedingungen einer hohen Stringenz begünstigen eine homologe Basenpaarung, wohingegen Bedingungen einer geringen Stringenz die nicht-homologe Basenpaarung nicht begünstigen.
Bedingungen einer "geringen Stringenz" umfassen zum Beispiel eine Temperatur von etwa 37°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 50 und eine mäßige bis geringe Salz-(SSC-)Konzentration; oder, alternativ, eine Temperatur von etwa 50°C oder weniger und eine mäßige bis hohe Salz-(SSPE-)Konzentration, zum Beispiel 1M NaCl.
Bedingungen einer "hohen Stringenz" umfassen zum Beispiel eine Temperatur von etwa 42°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 20 und eine geringe Salz-(SSC-)Konzentration; oder, alternativ, eine Temperatur von etwa 65°C oder weniger und eine geringe Salz-(SSPE-)Konzentration. Zum Beispiel umfassen Bedingungen einer hohen Stringenz die Hybridisierung in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C (Ausubel, F.M. et al. Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, 1989; Green Inc. New York, in 2.10.3).
"SSC" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 20X-SSC-Stammlösung enthält 3M Natriumchlorid, 0,3M Natriumcitrat, pH-Wert 7,0.
"SSPE" umfasst eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 1X-SSPE-Lösung enthält 180 mM NaCl, 9 mM Na₂HPO₄ und 1 mM EDTA, pH-Wert 7,4.
Die Nukleinsäure, die zur Hybridisierung an Nukleinsäuremolekülen gemäß der Erfindung fähig ist, ist allgemein mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80 oder 90% und stärker bevorzugt mindestens 95% homolog zu den in 1 dargestellten Nukleotidsequenzen.
Die DNA-Moleküle gemäß der Erfindung können vorteilhafter Weise in einem geeigneten Expressionsvektor eingeschlossen werden, um davon codierte Polypeptide in einem geeigneten Wirt zu exprimieren, welche für das Wachstum und das Überleben von Candida albicans kritisch sind.
Ein Expressionsvektor gemäß der Erfindung schliesst einen Vektor mit einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung ein, der funktionell mit regulatorischen Sequenzen, wie Promotorregionen, verknüpft ist, die zur Bewirkung der Expression der DNA-Fragmente fähig sind. Der Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung, bei der die beschriebenen Komponenten sich in einem Verhältnis befinden, das diese in der gewünschten Weise ihre Funktion erfüllen lässt. Solche Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, um für die Expression eines Polypeptids gemäß der Erfindung zu sorgen. Mithin stellt die Erfindung gemäß einem weiteren Aspekt ein Verfahren für die Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung bereit, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, transformiert, transfiziert oder infiziert mit einem Expressionsvektor wie weiter oben beschrieben, unter Bedindungen, um die Expression durch den Vektor einer für die Polypeptide codierenden Codierungssequenz vorzusehen, und das Gewinnen der exprimierten Polypeptide umfasst.
Die Vektoren können zum Beispiel Plasmid-, Virus- oder Phagevektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, gegebenenfalls einem Promotor für die Expression des Nukleotids und gegebenenfalls einem Regulator des Promotors versehen sind. Die Vektoren können einen oder mehrere selektierbare Marker, wie zum Beispiel Ampicillin-Resistenz, enthalten.
Regulatorische Elemente, die für die Expression erforderlich sind, schließen Promotorsequenzen, um RNA-Polymerase zu binden, und Transkriptionsinitiierungssequenzen für die Ribosom-Bindung ein. Zum Beispiel kann ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor wie den lac-Promotor und für die Translationsinitiierung die Shine-Dalgarno-Sequenz und den Start-Codon AUG einschließen. Ebenso kann ein eukaryontischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für die RNA-Polymerase II, ein Downstream-Polyadenylierungssignal, den Start-Codon AUG und ein Terminationscodon für die Loslösung des Ribosoms einschließen. Solche Vektoren können kommerziell erhalten werden oder aus beschriebenen Sequenzen, durch allgemein im Fachbereich bekannte Verfahren zusammengebaut werden.
Polynukleotide gemäß der Erfindung können in die beschriebenen Vektoren in einer Antisense-Orientierung inseriert werden, um für die Bildung von Antisense-RNA zu sorgen. Antisense-RNA oder andere Antisense-Nukleinsäuren können durch Synthesemethoden gebildet werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung schliesst eine definierte Nukleinsäure nicht nur die identische Nukleinsäure, sondern auch jegliche andere kleinere Basenvariationen ein, darin eingeschlossen insbesondere Substitutionen in Basen, die zu einem synonymen Codon (einem unterschiedlichen Codon, welcher den gleichen Aminosäurerest spezifiziert) infolge des degenerierten Codes führen. Der Ausdruck "Nukleinsäuresequenz" schliesst auch die komplementäre Sequenz zu jeglicher angegebenen einzelsträngigen Sequenz, was Basenvarianten angeht, ein.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch innerhalb ihres Umfangs Proteine oder Polypeptide, die durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder einen Biovorläufer davon exprimiert werden.
Nukleinsäuresequenzen von mindestens etwa 10 benachbarten Nukleotiden einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung und vorzugsweise von 10 bis etwa 120 Nukleotiden und Nukleotidsequenzen, die von 10 bis 50 Nukleotiden vorgesehen werden, können in vorteilhafter Weise als Sonden oder Primer verwendet werden, um die Replikation oder dergleichen zu initiieren. Solche Nukleinsäuresequenzen können gemäß den im Fachbereich wohlbekannten Techniken erzeugt werden, wie durch rekombinante oder Synthesemethoden. Diese können ebenfalls in Diagnosekits oder dergleichen zum Detektieren des Vorhandenseins einer Nukleinsäure gemäß der Erfindung verwendet werden. Diese Tests umfassen allgemein das Inkontaktbringen der Sonde mit der Probe unter Hybridisierungsbedingungen und das Detektieren auf das Vorhandensein jedweder Duplex- oder Triplexformation zwischen der Sonde und jeglicher Nukleinsäure in der Probe.
Diese Sonden können an einem festen Träger verankert sein. Vorzugsweise liegen sie auf einem Array vor, so dass Mehrfachsonden gleichzeitig an einer einzelnen biologischen Probe hybridisieren können. Die Sonden können auf das Array ausgetupft werden oder in situ auf dem Array synthetisiert werden; siehe Lockhart et al., Nature Biotechnology, Bd. 14, Dezember 1996, "Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays" (Expressions-Monitoring durch Hybridisierung zu hochdichten Oligonukleotid-Arrays). Ein einzelner Array kann mehr als bis zu über einer Million unterschiedliche Sonden an diskreten Stellen enthalten.
Vorteilhafterweise können die Nukleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung unter Verwendung solcher rekombinanter oder Synthesemethoden erzeugt werden, wie zum Beispiel mit Hilfe von PCR-Klonierungsmechanismen, die allgemein die Bildung eines Paars von Primern, die zwischen etwa 10 bis 120 Nukleotide bis zu einer Region des Gens liegen können, die geklont werden soll, das In-Kontakt-Bringen der Primer mit mRNA, cDNA oder genomischer DNA von einer Zelle, die Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion unter Bedingungen, welche eine Ampflifikation der gewünschten Region bewirken, das Isolieren der amplifizierten Region oder eines Fragments und das Gewinnen der amplifizierten DNA beinhalten. Allgemein sind solche Techniken wie hierin definiert im Fachbereich wohlbekannt, wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989) beschrieben.
Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide gemäß der Erfindung können einen enthüllenden Marker tragen.
Geeignete Marker schließen Radioisotope wie ³²P oder ³⁹S, Enzym-Marker oder andere Protein-Marker, wie Biotin oder fluoreszierende Marker, ein. Solche Marker können den Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden der Erfindung hinzugefügt werden und können mit Hilfe bekannter Techniken per se detektiert werden.
Das Polypeptid oder Protein gemäß der Erfindung schliesst alle möglichen Aminosäurevarianten ein, die durch das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung codiert werden, darin eingeschlossen ein durch das Molekül codiertes Polypeptid und welches konservative Aminosäureabänderungen aufweist. Polypeptide gemäß der Erfindung schließen weiter Varianten solcher Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommender allelischer Varianten, die im Wesentlichen homolog zu den Polypeptiden sind, ein. In diesem Zusammenhang wird eine beträchtliche Homologie als eine Sequenz angesehen, welche mindestens 70%, vorzugsweise 80 oder 90% Aminosäurehomologie mit den durch die Nukleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung codierten Polypeptiden aufweist.
Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind besonders vorteilhaft als selektive therapeutische Ziele zur Behandlung von mit Candida albicans assoziierten Infektionen. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäure, die zum Binden an die in 1 dargestellte Nukleinsäuresequenz fähig ist, zur selektiven Inhibierung der Expression der entsprechenden Polypeptide verwendet werden, was zu einem beeinträchtigten Wachstum des Candida albicans mit einer Verringerung der assoziierten Krankheiten oder Erkrankungen führt.
Das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid gemäß der Erfindung kann als ein Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments, zum Behandeln von mit Candida albicans-Infektion assoziierten Erkrankungen oder Zuständen führen.
Vorteilhafter Weise können das Nukleinsäuremolekül oder das Polypeptid gemäß der Erfindung in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür bereitgestellt werden.
Die Antisense-Technologie kann zur Steuerung der Genexpression durch Tripelhelixbildung von Antisense-DNA oder -RNA angewandt werden, wobei beide Verfahren auf dem Binden eines Polynukleotids an DNA oder RNA basieren. Ein DNA-Oligonukleotid ist so konstruiert, um zu einer Region des an der Transkription beteiligten Gens komplementär zu sein (Tripelhelix – siehe Lee et al. Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); und Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991), wodurch die Transkription und die Produktion des entsprechenden Proteins verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonukleotid hybridisiert an der mRNA in vivo und blockiert die Translation eines mRNA-Moleküls zu dem entsprechenden Protein (Antisense – Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991)); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (Oligodesoxynukleotide als Antisense-Inhibitoren der Genexpression), CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).
Antikörper gegen das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung können vorteilhafter Weise durch Techniken hergestellt werden, wie sie im Fachbereich bekannt sind. Zum Beispiel können polyklonale Antikörper durch Inokulieren eines Wirtstiers, wie einer Maus, mit dem Polypeptid gemäß der Erfindung oder einem Epitop davon und Gewinnen von Immunserum hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können gemäß den bekannten Techniken hergestellt werden, wie sie von Kohler R. und Milstein C., Nature (1975) 256, 495-497, beschrieben sind.
Antikörper können ebenfalls in einem Verfahren zum Detektieren auf das Vorhandensein eines Polypeptids gemäß der Erfindung verwendet werden, wobei das Verfahren das Umsetzen des Antikörpers mit einer Probe und das Identifizieren jeglichen an den Antikörper gebundenen Proteins umfasst. Ein Kit kann ebenfalls für die Durchführung des Verfahrens bereitgestellt werden, welches einen Antikörper gemäß der Erfindung und Mittel zum Umsetzen des Antikörpers mit der Probe umfasst.
Proteine, die mit dem Polypeptid der Erfindung wechselwirken, können durch Untersuchen der Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Anwendung des Zwei-Hybrid-Vektorsystems, das zuerst von Chien et al. (1991) vorgeschlagen wurde, identifiziert werden.
Diese Technik basiert auf der funktionellen Rekonstitution in vivo eines Transkriptionsfaktors, welcher ein Reportergen aktiviert. Insbesondere umfasst die Technik das Vorsehen einer geeigneten Wirtszelle mit einem DNA-Konstrukt, welches ein Reportergen unter der Kontrolle eines durch einen Transkriptionsfaktor mit einer DNA-Bindungsdomäne und einer aktivierenden Domäne regulierten Promotors umfasst, das Exprimieren in der Wirtszelle einer ersten Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine erste Fusionierung eines Fragments oder aller aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß der Erfindung und entweder der DNA-Bindungsdomäne oder der aktivierenden Domäne des Transkriptionsfaktors codiert, das Exprimieren in dem Wirt von mindestens einer zweiten Hybrid-DNA-Sequenz, wie einer Bibliothek oder dergleichen, das Codieren von putativen Bindungsproteinen, die zusammen mit der DNA-Bindung oder der aktivierenden Domäne des Transkriptionsfaktors untersucht werden, welcher nicht in der ersten Fusionierung eingebunden ist; das Detektieren jeglicher Bindung der zu untersuchenden Proteine mit einem Protein gemäß der Erfindung durch Detektieren auf das Vorhandensein jeglichen Reportergenprodukts in der Wirtszelle; gegebenenfalls Isolieren von zweiten Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das Bindungsprotein codieren.
Ein Beispiel für eine solche Technik nutzt das GAL4-Protein in Hefe. GAL4 ist ein Transkriptionsaktivator von Galactose-Metabolismus in Hefe und besitzt eine eigene Domäne zum Binden an Aktivatoren stromaufwärts der Galactose metabolisierenden Gene sowie eine Protein-Bindungsdomäne. Nukleotidvektoren können konstruiert werden, von denen eine die Nukleotidreste umfasst, die für die DNA-Bindungsdomäne von GAL4 codieren. Diese Bindungsdomänereste können zu einer bekannten, für Protein codierenden Sequenz fusioniert werden, wie zum Beispiel die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung. Der andere Vektor umfasst die Reste, die für die Protein-Bindungsdomäne von GAL4 codieren. Diese Reste werden zu Resten fusioniert, die für ein Testprotein codieren. Jede Wechselwirkung zwischen Polypeptiden, die durch die Nukleinsäure gemäß der Erfindung codiert werden, und dem zu testenden Protein, führt zur Transkriptionsaktivierung eines Reportermoleküls in einer GAL4-Transkriptionsdefizienten Hefezelle, in welcher die Vektoren tranformiert wurden. Vorzugsweise wird ein Reportermolekül, wie β-Galactosidase, bei Wiederherstellung der Transkription der Hefe-Galactose-Metabolismusgene aktiviert.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen vor, welche die Expression, die Funktionalität von Polypeptiden, die von den in 1 dargestellten Nukleotidsequenzen exprimiert werden, oder die metabolischen Wege, an welchen diese Polypeptide beteiligt sind und welche für das Wachstum und Überleben von Candida albicans kritisch sind, selektiv inhibieren oder stören, wobei man in dem Verfahren (a) eine zu testende Verbindung mit einer oder mehreren Candida albicans-Zellen in Kontakt bringt, die eine zur Überexpression oder Unterexpression der Polypeptide führende Mutation in einem Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung aufweisen, und darüber hinaus mit einer oder mehreren Candida-Wildtypzellen in Kontakt bringt, (b) das Wachstum und/oder die Aktivität der mutierten Zelle im Vergleich zum Wildtyp beobachtet, wobei ein unterschiedliches Wachstum bzw. eine unterschiedliche Aktivität der einen oder mehreren mutierten Candida-Zellen eine selektive Wirkung der Verbindung auf das Polypeptid oder ein anderes Polypeptid im gleichen oder in einem parallelen Weg anzeigt.
Verbindungen, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß der Erfindung identifizierbar sind oder identifiziert wurden, können in vorteilhafter Weise als ein Arzneimittel oder bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit Candida albicans-Infektion assoziierten Erkrankungen oder Zuständen verwendet werden. Diese Verbindungen können auch in vorteilhafter Weise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem unbedenklichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür eingeschlossen werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren von DNA-Sequenzen von einer Zelle oder einem Organismus bereit, wobei die DNA für Polypeptide codiert, die für das Wachstum oder Überleben kritisch sind, wobei in dem Verfahren (a) eine cDNA oder genomische Bibliothek von der Zelle oder dem Organismus in einem geeigneten Expressionsvektor hergestellt wird, wobei der Vektor so beschaffen ist, dass er sich entweder in das Genom in der Zelle integrieren lässt oder dass er die Transkription von Antisense-RNA von den Nukleotidsequenzen in der cDNA oder genomischen Bibliothek zulässt, (b) Transformanten ausgewählt werden, welche ein beeinträchtigtes Wachstum zeigen, und die Nukleotidsequenz der cDNA oder genomischen Sequenz von der in dem Vektor von dem Transformanten eingeschlossenen Bibliothek bestimmt wird. Vorzugsweise kann die Zelle oder der Organismus jegliche Hefe oder faseriger Pilz sein, wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oder Candida albicans.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, welche ein Nukleinsäuremolekül als ein Polypeptid gemäß der Erfindung zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür umfasst.
Bevorzugte Zusammensetzungen schließen ein pharmazeutisch unbedenkliches Vehikel oder Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel, wie zum Beispiel eine physiologische Kochsalzlösung, ein. Andere pharmazeutisch unbedenkliche Träger, die andere nichttoxische Salze, steriles Wasser oder dergleichen einschließen, können ebenfalls verwendet werden. Ein geeigneter Puffer kann ebenfalls vorhanden sein, welcher eine Lyophilisierung und Aufbewahrung der Zusammensetzungen in sterilen Zuständen vor der Rekonstitution durch die Zugabe von sterilem Wasser für die anschließende Verabreichung zulässt. Die Einbindung der Polypeptide der Erfindung in eine feste oder eine halbfeste biologisch verträgliche Matrix kann durchgeführt werden, welche in behandlungsbedürftige Gewebe implantiert werden kann.
Der Träger kann auch andere pharmazeutisch unbedenkliche Hilfsmittel zum Modifizieren anderer Bedingungen, wie dem pH-Wert, der Osmolarität, Viskosität, Sterilität, Lipophilie, Löslichkeit oder dergleichen enthalten. Pharmazeutisch unbedenkliche Hilfsmittel, welche eine anhaltende oder verzögerte Freisetzung im Anschluss an die Verabreichung erlauben, können ebenfalls eingeschlossen werden.
Das Polypeptid- oder das Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung kann oral verabreicht werden. In dieser Ausführungsform können diese eingekapselt werden und mit geeigneten Trägern in festen Dosierungsformen kombiniert werden, welche Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt sein dürften.
Wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sein dürfte, kann das spezifische Dosierungsschema entsprechend der Körperoberfläche des Patienten oder dem Volumen des einzunehmenden Körperhohlraums in Abhängigkeit von der speziellen Verabreichungsroute, die zur Anwendung kommt, berechnet werden. Die tatsächlich verabreichte Menge der Zusammensetzung wird dagegen durch einen medizinischen Praktiker auf Basis der Umstände, die sich auf das zu behandelnde Leiden beziehen, wie der Schwere der Symptome, der zu verabreichenden Zusammensetzung, dem Alter, Gewicht und der Antwortreaktion des einzelnen Patienten und der gewählten Verabreichungsroute bestimmt.
Die vorliegende Erfindung kann ganz klar unter Bezugnahme auf das beigefügte Beispiel verstanden werden, welches reinen Beispielcharakter hat, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Die 1 von Candida albicans isolierte Nukleotidsequenz ist und welche eine identifizierte Funktion besitzt auf Basis der Sequenzhomologie mit Proteinen von anderen Organismen und wobei die Sequenz nicht in der öffentlichen Domäne vorhanden ist;
die 2 eine schematische Darstellung von Plasmid pGAL1PNiST-1 ist;
die 3 eine Nukleotidsequenz von Plasmid pGAL1PNiST-1 von 10 ist;
die 4 eine schematische Darstellung von Plasmid pGAL1PSiST-1 ist;
die 5 eine Nukleotidsequenz von Plasmid pGAL1PSiST-1 von 12 ist;
die 6 eine Aminosäuresequenz der in 1 dargestellten, passend korrespondierenden DNA-Sequenzen unter Bezugnahme auf Tabelle 1 ist;
die 7 und 8 Wachstumskurven von Candida albicans-Stämmen sind, welche eine Antisense-induzierte Reduzierung des Wachstums zeigen;
die 9 bis 12 Wachstumskurven von Candida albicans-Stämmen sind, welche Knock-outs bei dem identifizierten relevanten Gen einschließen.
Beispiel 1
Identifizierung neuer Arzneimittel-Ziele in C. albicans durch eine Antisense- und aufbrechende Integration
Das Prinzip des Ansatzesbasiert auf der Tatsache, dass sich, wenn eine bestimmte C. albicans mRNA durch die Herstellung der komplementären Antisense-RNA inhibiert wird, das entsprechende Protein verringern wird. Wenn dieses Protein für das Wachstum oder das Überleben kritisch ist, wird die Zelle, die die Antisense-RNA produziert, langsamer wachsen oder wird sterben.
Da die Antisense-Inhibierung auf der Ebene der mRNA stattfindet, ist die Anzahl der Genkopien irrelevant, wodurch Anwendungen der Strategie sogar bei diploiden Organismen möglich gemacht wird.
Antisense-RNA wird endogen aus einem integrativen oder episomalen Plasmid mit einem induzierbaren Promotor hergestellt; die Induktion des Promotors führt zur Produktion einer RNA, die durch das Insert des Plasmids codiert wird. Dieses Insert wird sich von einem Plasmid zu einem anderen in der Bibliothek unterscheiden. Die Inserts werden von genomischen DNA-Fragmenten oder von cDNA abgeleitet werden, um – in dem Umfang, der möglich ist – das gesamte Genom abzudecken.
Der Vektor ist ein proprietärer Vektor, der eine Integration durch eine homologe Rekombination an entweder dem homologen Insert oder der Promotor-Sequenz im Candida-Genom ermöglicht. Nach dem Einführen von Plasmiden aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken in C. albicans werden Transformanten nach einem verschlechterten Wachstum nach der Promotor- (und damit Antisense-) Induktion in der Gegenwart von Lithiumacetat gescreent. Lithiumacetat verlängert die G1-Phase und ermöglicht damit, dass der Antisense während eines verlängerten Zeitraums während des Zell-Zyklus einwirkt. Transformanten, die ein verschlechtertes Wachstum sowohl in induzierten als auch in nicht induzierten Medien aufweisen und damit einen Wachstumsdefekt auf Grund des integrativen Aufbrechens zeigen, werden ebenso ausgewählt.
Man nimmt an, dass Transformanten, die ein gehindertes Wachstum zeigen, Plasmide enthalten, die Antisense-RNA zu mRNAs erzeugen, die für das Wachstum oder das Überleben kritisch sind. Das Wachstum wird beobachtet, indem Wachstums-Kurven über einen Zeitraum in einer Vorrichtung (Bioscreen Analyzer, Labsystems) gemessen werden, die die gleichzeitige Messung der Wachstums-Kurven von 200 Transformanten erlaubt.
Anschließend können Plasmide aus den Transformanten gewonnen und die Sequenz ihrer Inserts bestimmt werden, wodurch offenbart wird, welche mRNA sie inhibieren. Um das genomische oder cDNA-Insert, welches in das Candida-Genom integriert hat, gewinnen zu können, wird genomische DNA isoliert, mit einem Enzym geschnitten, das nur einmal in den Bibliotheks-Vektor (und geschätzt etwa alle 4096 bp im Genom) schneidet, und erneut ligiert. Eine PCR mit Primern, die das Insert flankieren, wird (zum Teil) genomische oder cDNA-Inserts als PCR-Fragmente ergeben, die direkt sequenziert werden können. Diese PCR-Analyse (bei der Ligationsreaktion) wird uns auch zeigen, wie viele Integrationen stattgefunden haben. Alternativ wird die Ligationsreaktion zu E. coli transformiert, und die PCR-Analyse wird an Kolonien oder an davon abgeleiteter Plasmid-DNA durchgeführt.
Dieses Verfahren wird für eine genom-weite Suche nach neuen C. albicans-Genen verwendet, die für das Wachstum oder das Überleben wichtig sind.
Materialien und Methoden
Konstruktion von pGal1PNiST-1
Beim Grundgerüst des Vektors pGAL1PNiST-1 (ein integrativer Antisense-SfiI-NotI-Vektor) handelt es sich um pGEM11Zf(+) (Promega Inc.). Zuerst wurde das Promotorfragment CaMAL2 EcoRI/SalI aus pDBV50 (D. H. Brown et al. 1996) in das durch EcoRI/SalI geöffnete pGEM11Zf(+) ligiert, was das Zwischen-Konstrukt pGEMMAL2P-1 zur Folge hatte. In das letztere (MscI/CIP) wurde der Selektionsmarker CaURA3 als ein von pRM2 abgeleitetes Eco47III/XmnI-Fragment kloniert. Der resultierende Vektor pGEMMAL2P-2 wurde mit NotI/HindIII geöffnet, um die NotI-Füller (stuffer)-SfiI-Kassette von pPCK1NiSCYCT-1 (EagI/HindIII-Fragment) aufzunehmen: pMAL2PNiST-1. Schließlich wurde das Plasmid pGAL1PNiST-1 konstruiert, indem der SalI/Ecl136II MAL2-Promotor in pMAL2PNiST-1 durch das von pRM2GAL1P abgeleitete Promotorfragment XhoI/SmaI GAL1 ersetzt wurde.
Konstruktion von pGal1PSiST-1
Der Vektor pGAL1PSiST-1 wurde für das Klonieren der kleinen genomischen DNA-Fragmente (flankiert durch SfiI-Stellen) hinter den GAL1-Promotor erzeugt. Der einzige Unterschied zu pGAL1PNiST-1 besteht darin, dass das Insertfragment hIFNβ (Füller-Fragment) bei pGAL1PSiST-1 durch zwei SfiI-Stellen flankiert wird an Stelle von einer SfiI- und einer NotI-Stelle wie bei pGAL1PNiST-1. Um pGAL1PSiST-1 zu konstruieren, wurde das EcoRI-HindIII-Fragment, welches das hIFNβ, flankiert von einer SfiI- und einer NotI-Stelle, enthielt, von pMAL2pHiET-3 (unveröffentlicht) durch das EcoRI-HindIII-Fragment ersetzt, welches das hIFNβ, flankiert von zwei SfiI-Stellen, enthielt, aus YCp50S-S (einem von dem Plasmid YCp50 abgeleiteten E. coli/S. cerevisiae-Shuttle-Vektor, welcher in der ATCC-Sammlung hinterlegt ist (Nummer 37419; Trash et al., 1985); ein EcoRI-HindIII-Fragment, das das Gen hIFNβ enthielt, welches von zwei SfiI-Stellen flankiert wird, wurde in YCp50 inseriert, wodurch YCp50S-S erzeugt wurde), was zum Plasmid pMAL2PSiST-1 führt. Der MAL2-Promotor aus pMAL2PSiST-1 (durch einen NaeI-balI-Verdau) wurde ferner durch den GAL1-Promotor aus pGAL1PNiST-1 ersetzt (über einen XhoI-FSPI-Verdau), wodurch der Vektor pGAL1PSiST-1 erzeugt wurde.
Genomische Bibliothek von Candida albicans
* Herstellung von den genomischen DNA-Fragmenten
Eine genomische DNA-Bibliothek von Candida albicans mit kleinen DNA-Fragmenten (400 bis 1 000 bp) wurde erstellt. Genomische DNA von Candida albicans B2630 wurde isoliert, nach einem modifiziertem Protokoll von Blin und Stafford (1976). Die Qualität der isolierten genomischen DNA wurde durch Gelelektrophorese überprüft. Unverdaute DNA wurde auf dem Gel oberhalb der Marker-Bande von 26 282 bp gefunden. Ein geringfügiges Schmieren, verursacht durch Fragmentierung der DNA, war vorhanden. Um eine Anreicherung für genomische DNA-Fragmente der gewünschten Größe zu erhalten, wurde die genomische DNA teilweise verdaut. Mehrere Restriktionsenzyme (AluI, HaeIII und RsaI; alle verursachen stumpfe Enden) wurden ausprobiert. Die geeigneten Bedingungen des Verdaus wurden durch eine Titration des Enzyms bestimmt. Eine Anreicherung von kleinen DNA-Fragmenten wurde mit 70 Einheiten von AluI auf 10 μg genomischer DNA während 20 min erhalten. T4 DNA-Polymerase (Boehringer) und dNTPs (Boehringer) wurden hinzugegeben, um die DNA-Enden zu glätten. Nach der Extraktion mit Phenol-Chloroform wurde der Verdau auf einem Agarose-Gel der Größe nach fraktioniert. Die genomischen DNA-Fragmente mit einer Länge von 500 bis 1 250 bp wurden vom Gel durch eine zentrifugale Filtration eluiert (Zhu et al., 1985). Die SfiI-Adaptoren (5' GTTGGCCTTTT) oder (5' AGGCCAAC) wurden an die (stumpfen) DNA-Enden angebracht, um das Klonieren der Fragmente in den Vektor zu erleichtern. Dafür wurden ein 8-mer- und ein 11-mer-Oligonukleotid (umfassend die SfiI-Stelle) mit einer Kinase behandelt und reassoziiert. Nach der Ligation dieser Adaptoren an die DNA-Fragmente wurde eine zweite Größen-Fraktionierung auf einem Agarose-Gel durchgeführt. Die DNA-Fragmente von 400 bis 1150 bp wurden aus dem Gel durch eine zentrifugale Filtration eluiert.
* Herstellung des Vektor-Fragments pGALIPSiST-1
Die kleinen genomischen DNA-Fragmente wurden nach dem GAL1-Promotor in den Vektor pGAL1PSIST-1 kloniert. Qiagen-aufgereinigte Plasmid-DNA von pGAL1PSiST-1 wurde mit SfiI verdaut und das größte Vektor-Fragment aus dem Gel durch zentrifugale Filtration eluiert (Zhu et al., 1985). Eine Ligation mit einem Kontroll-DNA-Fragment, flankiert durch SfiI-Stellen, wurde als eine Kontrolle durchgeführt. Die Ligations-Mischung wurde in MC1061 E. Coli-Zellen elektroporiert. Die Plasmid-DNA von 24 Klonen wurde analysiert. In allen Fällen wurde das Kontroll-Fragment in das Vektorfragment pGAL1PSiST-1 insertiert.
* Hochskalierung
Alle genomischen DNA-Fragmente (450 ng) wurden in den Vektor pGAL1PSiST-1 (20 ng) ligiert. Nach einer Elektroporation bei 2500 V, 40 μF, wurden circa 400 000 Klone erhalten. Diese Klone wurden zu drei Gruppen vereinigt und als Glycerin-Schrägkulturen (slants) gelagert. Qiagen-aufgereinigte DNA wurde aus diesen Klonen ebenfalls präpariert. Eine Klon-Analyse wies eine durchschnittliche Insert-Länge von 600 bp und einen Prozentsatz von 91 für Klone mit einem Insert auf. Die Größe der Bibliothek entspricht 5 Mal dem diploiden Genom. Die genomischen DNA-Inserts sind im Vektor sense- oder antisense-orientiert.
cDNA-Bibliothek von Candida albicans
Gesamt-RNA wurde aus Candida albicans B2630 extrahiert, die auf Minimal-(SD) bzw. reichem (YPD) Medium wachsen gelassen wurden, wie durch Chirgwin et al. in Sambrook et al. 1996 beschrieben. mRNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung der Fast-Track-Prozedur von Invitrogen präpariert.
Die Erststrang-cDNA wurde mit der Superscript Reverse Transcriptase (BRL) und mit einem oligo-dT-NotI-Primeradapter synthetisiert. Nach der Zweitstrang-Synthese wurde die cDNA mit einem Klenow-Enzym geglättet und über eine Sephacryl S-400 Spin-Säule gereinigt. Phosphorylierte SfiI-Adapter wurden dann an die cDNA ligiert, gefolgt von einem Verdau mit dem NotI-Restriktions-Enzym. Die SfiI/NotI-cDNA wurde dann gereinigt und auf einer Biogel-Säule A150M der Größe nach sortiert.
Eine erste Fraktion enthielt ungefähr 38 720 Klone durch die Transformation, die zweite Fraktion nur 1540 Klone. Klon-Analyse:
Fr. I: 22/24 Inserts, 16³ 1000 bp, 4³ 2000 bp, durchschnittliche Größe: 1500 bp.
Fr. II: 9/12 Inserts, 3³ 1000 bp, durchschnittliche Größe: 960 bp, cDNA wurde in einen durch NotI/SfiI geöffneten pGAL1PNiST-1-Vektor (Anti-Sense)ligiert.
Candida-Transformation
Der für die Transformation verwendete Wirts-Stamm ist ein Mutanter von C. albicans ura3, der CAI-4, der eine Deletion in der Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase enthält und wurde von William Fonzi, Georgetown Universität (Fonzi und Irwin) erhalten. CAI-4 wurde mit der oben beschriebenen cDNA-Bibliothek oder genomischen Bibliothek unter Verwendung des Pichia Sphäroplastenmoduls (Invitrogen) transformiert. Die resultierenden Transformatten wurden auf Platten mit Minimal-Medium, ergänzt mit Glucose (SD, 0,67% oder 1,34% Hefe-Stickstoff-Base ohne Aminosäuren + 2% Glucose) plattiert und 2–3 Tage lang bei 30°C inkubiert.
Screenen nach Mutanten
Starterkulturen wurden angelegt, indem jede Kolonie in 1 ml SD-Medium geimpft und bei 30°C und 300 U/min über Nacht inkubiert wurde. Zell-Dichten wurden unter Verwendung eines Coulter-Zählers bestimmt (Coulter Z1; Coulter electronics limited). 250 000 Zellen/ml wurden in 1 ml SD-Medium geimpft und die Kulturen wurden 24 Stunden lang bei 30°C und 300 U/min inkubiert. Die Kulturen wurden im Minimal-Medium ohne Glucose (S) gewaschen, und das Pellet wurde in 650 μl S-Medium resuspendiert. 8 μl dieser Kultur wurde für das Animpfen von 400 μl Kulturen in einer Honeywell-100-Platte (Bioscreen Analysator; Labsystems) verwendet. Jeder Transformant wurde während drei Tagen in S-Medium, das LiAc; pH 6,0, mit 2% Glucose/2% Maltose bzw. 2% Galactose/2% Maltose enthielt, wachsen gelassen, wobei alle 3 Minuten 20 Sekunden lang geschüttelt wurde. Optische Dichten wurden jede Stunde während drei aufeinander folgenden Tagen gemessen und Wachstumskurven wurden erstellt (Bioscreen Analysator; Labsystems).
Die Wachstumskurven der Transformanten, die in Antisense nicht-induzierendem (Glucose/Maltose) bzw. induzierendem (Galactose/Maltose) Medium wachsen gelassen wurden, wurden verglichen und jene Transformanten, die ein gehindertes Wachstum nach der Antisense-Induktion aufwiesen, wurden für die weitere Analyse ausgewählt. Transformanten, die ein gehindertes Wachstum aufgrund der Integration in ein kritisches Gen aufwiesen, wurden ebenfalls ausgewählt.
Isolierung der genomischen oder cDNA-Inserts
Mutmaßlich interessante Transformanten wurden in 1,5 ml SD über Nacht -wachsen gelassen und die genomische DNA wurde unter Verwendung des Nucleon-MI-Hefe-Kits (Clontech) isoliert. Die Konzentration der genomischen DNA wurde abgeschätzt, indem eine Probe auf einem Agarose-Gel analysiert wurde.
20 ng der genomischen DNA wurde drei Stunden lang mit einem Enzym verdaut, das einmalig in den Bibliotheksvektor schneidet (SacI für die genomische Bibliothek; PstI für die cDNA-Bibliothek) und mit RNAse behandelt. Die Proben wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und unter Verwendung von NaOAc/Ethanol gefällt.
Das resultierende Pellet wurde in 500 μl Ligations-Mischung (1 × Ligations-Puffer und 4 Einheiten T4-DNA-Ligase; beide von Boehringer) resuspendiert und über Nacht bei 16°C inkubiert.
Nach Denaturierung (20 min, 65°C), Aufreinigung (Phenol/Chloroform-Extraktion) und Fällung (NaOAc/-Ethanol) wurde das Pellet in 10 μl MilliQ-Wasser (Millipore) resuspendiert.
PCR-Analyse
Eine inverse PCR wurde an 1 μl der gefällten Ligations-Reaktion unter Verwendung von für den Bibliotheks-Vektor spezifischen Primern (Oligo23 5' TGC-AGC-TCG-ACC-TCG-ACT-G 3' und Oligo25 5' GCG-TGA-ATG-TAA-GCG-TGA-C 3' für die genomische Bibliothek; 3pGALNistPCR-Primer: 5' TGAGCAGCTCGCCGTCGCGC 3' und 5pGALNistPCR-Primer: 5' GAGTTATACCCTGCAGCTCGAC 3' für die cDNA-Bibliothek; beide von Eurogentec) 30 Zyklen lang, die jeweils aus (a) 1 Minute bei 95°C, (b) 1 Minute bei 57°C und (c) 3 Minuten bei 72°C bestanden, durchgeführt. In der Reaktionsmischung wurden 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Boehringer) mit TagStart-Antikörper (Clontech) (1:1) verwendet und die End-Konzentrationen betrugen 0,2 μM von jedem Primer, 3mM MgCl2, (Perkin Elmer Cetus) und 200 μM dNTPs (Perkin Elmer Cetus). Die PCR wurde in einem Robocycler (Stratagene) durchgeführt.
Sequenzbestimmung
Die resultierenden PCR-Produkte wurden unter Verwendung eines PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) gereinigt und wurden durch Vergleich der Bandenintensität auf mit EtBr gefärbtem Agarose-Gel mit der Intensität von DNA-Markerbanden quantitativ bestimmt. Die Menge des PCR-Produktes (ausgedrückt in ng), die bei der Sequenzierungs-Reaktion verwendet wurde, wurde berechnet als die Länge des PCR-Produkts in Basenpaaren geteilt durch 10. Die Sequenzierungs-Reaktionen wurden unter Verwendung des ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits nach den Anweisungen des Herstellers (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) mit Ausnahme der folgenden Modifikationen durchgeführt.
Das gesamte Reaktionsvolumen wurde auf 15 μl reduziert. Das Reaktionsvolumen der einzelnen Reagenzien wurde dementsprechend geändert. 6,0 μl Terminator Ready Reaction Mix wurde durch eine Mischung von 3,0 μl Terminator Ready Reaction Mix + 3,0 μl Half Term (GENPAK Limited, Brighton, UK) ersetzt. Nach dem Sequenzier-Zyklus wurden die Reaktionsmischungen über Sephadex G50-Säulen gereinigt, auf trüben Multiscreen HV Mikrotiterplatten (Millipore, Molsheim, Fr) präpariert, und wurden in einer SpeedVac getrocknet. Die Reaktionsprodukte wurden in 3 μl Lade-Puffer resuspendiert. Nach der Denaturierung während 2 Minuten bei 95°C wurde 1 μl der Probe auf einem 5% Long-Ranger-Gel (36 cm well-to-read) aufgetragen, das aus Singel-Packs entsprechend den Anweisungen des Vertreibers (FMC BioProducts, Rockland, ME) hergestellt wurde. Die Proben wurden 7 Stunden lang in einem 2X-Lauf auf einem ABI 377XL DNA-Sequenzierer laufen gelassen. Softwarepakete der Datenerfassung Version 2.0 und der Sequenzier-Analyse Version 3.0 (für die Basenzuordnung) waren von PE Applied Biosystems. Die resultierenden Sequenz-Textdateien wurden auf einen Server für die weitere Analyse kopiert.
Sequenz-Analyse
Die Nukleotidsequenzen wurden in das Softwarepaket VectorNTI (InforMax Inc, North Bethesda, MD, USA) importiert und der Vektor und die Insertbereiche der Sequenzen wurden identifiziert. Suchen nach Sequenzähnlichkeit gegen öffentliche und kommerzielle Sequenz-Datenbanken wurden mit dem BLAST-Softwarepaket (Altschul et al., 1990) der Version 1.4 durchgeführt. Sowohl die ursprüngliche Nukleotidsequenz als auch die konzeptionellen Six-Frame-Translationen der Insertregion wurden als Abfrage-Sequenzen verwendet. Die verwendeten öffentlichen Datenbanken waren die EMBL Nukleotidsequenz-Datenbank (Stoesser et al., 1998), die SWISS-PROT Proteinsequenz-Datenbank und ihre Ergänzung TrEMBL (Bairoch und Apweiler, 1998) und die ALCES Candida albicans-Sequenz-Datenbank (Stanford Universi tät, Universität von Minnesota). Die verwendeten kommerziellen Sequenz-Datenbanken waren die LifeSEQ^® humanen und die PathoSegÔ mikrobiellen genomischen Datenbanken (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA, USA) und die GENESEQ Patentsequenz-Datenbank (Derwent, London, Großbritannien). Drei wichtige Ergebnisse wurden auf der Grundlage der Sequenzähnlichkeitssuchen erhalten: Funktion, Neuheit und Spezifität. Eine mutmaßliche Funktion wurde auf der Grundlage der Ähnlichkeit mit Sequenzen mit einer bekannten Funktion abgeleitet, die Neuheit basierte auf dem Fehlen oder dem Vorhandensein der Sequenzen in den öffentlichen Datenbanken, und die Spezifität basierte auf der Ähnlichkeit mit Wirbeltier-Homologen.
Verfahren
Blastx der Nukleinsäuresequenzen gegen die geeigneten Proteindatenbanken: Swiss-Prot für Klone, von denen die komplette Sequenz im öffentlichen Bereich vorhanden ist, und paorfp (PathoSeq^TM) für Klone, von denen die komplette Sequenz im öffentlichen Bereich nicht vorhanden ist.
Das Protein, dem die translatierte Nukleinsäuresequenz entspricht, wurde als ein Ausgangspunkt verwendet. Die Unterschiede zwischen diesem Protein und unseren translatierten Nukleinsäuresequenzen sind mit einer doppelten Linie markiert und oberhalb der Proteinsequenz vermerkt. Die folgenden Symbole werden verwendet:
ein Einbuchstaben-Aminosäurecode oder der Mehrdeutigkeits-Code X wird verwendet, wenn unsere translatierte Nukleinsäuresequenz eine andere Aminosäure an einer bestimmten Position aufweist,
das Stop-Codon-Zeichen * wird verwendet, wenn unsere translatierte Nukleinsäuresequenz ein Stop-Codon an einer bestimmten Position aufweist,
Die Buchstaben fs (Rasterverschiebung) werden verwendet, wenn eine Rasterverschiebung in unserer translatierten Nukleinsäuresequenz auftritt und ein anderes Leseraster verwendet wird,
die Wörter Mehrdeutigkeit oder Mehrdeutigkeiten werden verwendet, wenn ein Teil unserer translatierten Nukleinsäuresequenz in den Proteinen vorhanden, aber in den Ausrichtungen der Blast-Ergebnisse nicht sichtbar ist,
Der Ausdruck "fehlende Sequenz" wird verwendet, wenn die translatierte Nukleinsäuresequenz jenen Teil des Proteins nicht umfasst.
Blastx: vergleicht die konzeptionellen Six-Frame-Translationsprodukte einer Nukleotidabfrage-Sequenz (beide Stränge) gegen eine Proteinsequenz-Datenbank.
Gen-Knock-outs
Um zu verifizieren, dass der Wachstumseffekt an der Interferenz mit dem identifizierten Gen lag, und um die Spezifität des Antisense-Effektes zu unterstützen, wurden Knock-outs einzelner Allele bei den identifizierten Genen (28 bis 31) unter Verwendung der URA-Blaster-Methode (Fonzi und Irwin 1993) vorgenommen.
Screenen nach Verbindungen, die die Expression von für das Wachstum und das Überleben von C. albicans kritischen Polypeptiden modulieren
Das vorgeschlagene Verfahren basiert auf Beobachtungen (Sandbaken et al., 1990; Hinnebusch und Liebman 1991; Ribogene PCT WO 95/11969, 1995), die nahe legen, dass eine Unterexpression oder eine Überexpression irgendeiner Komponente eines Verfahrens (z. B. der Translation) zu einer veränderten Sensitivität gegen einen Inhibitor eines relevanten Schrittes in diesem Verfahren führen könnte. Solch ein Inhibitor sollte wirksamer gegen eine Zelle sein, welche durch einen Mangel an dem Makromolekül, welches jenen Schritt katalysiert, beschränkt ist, und/oder weniger wirksam gegen ein Zelle sein, die einen Überschuss jenes Makromoleküls enthält, verglichen mit der Wildtyp(WT)-Zelle.
Mutante Hefestämme, zum Beispiel, haben gezeigt, dass einige Schritte der Translation gegenüber der Stöchiometrie der beteiligten Makromoleküle sensitiv sind. (Sandbaken et al. 1996). Solche Stämme sind sensitiver gegen Verbindungen, die spezifisch die Translation stören (indem sie auf eine Komponente wirken, die an der Translation beteiligt ist), aber gleich sensitiv gegen Verbindungen mit anderen Wirkungsmechanismen sind.
Dieses Verfahren stellt daher nicht nur ein Mittel zur Verfügung, um zu identifizieren, ob eine Testverbindung ein bestimmtes Verfahren stört, sondern auch einen Hinweis auf die Stelle, an der sie ihren Effekt ausübt. Die Komponente, die in geänderter Form oder Menge in einer Zelle, deren Wachstum durch ein Testverbindung beeinflußt wird, vorhanden ist, ist möglicherweise die Stelle der Wirkung der Testverbindung.
Das aufzubauende Assay schließt eine Messung des Wachstums eines isogenen Stamms ein, der nur in einem bestimmten spezifischen Allel modifiziert worden ist, bezüglich eines Wildtyp(WT) C. albicans-Stamms, in der Gegenwart von R-Verbindungen. Die Stämme können welche sein, in denen die Expression eines spezifischen essentiellen Proteins nach der Induktion von Antisense behindert ist, oder Stämme, die Brüche in einem essentiellen Gen tragen. Ein in silico-Ansatz zum Auffinden von neuen essentiellen Genen bei C. albicans wird durchgeführt werden. Eine Anzahl von auf diesem Weg identifizierten essentiellen Genen wird gebrochen sein (in einem Allel), und die resultierenden Stämme können für das vergleichende Wachstums-Screenen verwendet werden.
Assay für ein Hochdurchsatz-Screenen nach Arzneimitteln
35 μl Minimal-Medium (S-Medium + 2% Galactose + 2 Maltose) wurde in eine transparente 96-Mulden-Platte mit flachem Boden unter Verwendung eines automatisierten Pipettier-Systems (Multidrop, Labsystems) transferiert. Ein 96-Kanal-Pipettierer (Hydra, Robbins Scientific) übertrug 2,5 μl der R-Verbindung in 10^-3 M in DMSO von einer Vorrats-Platte in die Assay-Platte.
Die ausgewählten C. albicans-Stämme (mutanter und parentaler (CAI-4) Stamm) wurden als Glycerinvorräte (15%) bei -70°C gelagert. Die Stämme wurden auf selektive Platten (SD-Medium) ausgestrichen und zwei Tage lang bei 30°C inkubiert. Für den Elternstamm, CAI-4, wurde das Medium immer mit 20 μg/ml Uridin ergänzt. Eine einzelne Kolonie wurde aufgenommen und in 1 ml Minimal-Medium (S-Medium + 2% Galactose + 2% Maltose) resuspendiert. Die Zellen wurden bei 30°C 8 Stunden lang unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert. Eine 10 ml große Kultur wurde auf 250 000 Zellen/ml angeimpft. Die Kulturen wurden bei 30°C 24 Stunden lang unter Schütteln bei 250 U/min inkubiert. Die Zellen wurden in einem Coulter-Zähler gezählt und die endgültige Kultur (S-Medium + 2% Galactose + 2% Maltose) wurde auf 20 000 bis 50 000 Zellen/ml angeimpft. Die Kulturen wurden bei 30°C unter Schütteln bei 250 U/min wachsen gelassen, bis eine End-OD von 0,24 (+/- 0,04) 600 nM erreicht worden war.
200 μl dieser Hefesuspension wurde zu allen Mulden der MW96-Platten hinzugefügt, die die R-Verbindungen in einem 450 (oder 250) μl Gesamtvolumen enthielten. Die MW96-Platten wurden (statisch) bei 30°C 48 Stunden lang inkubiert.
Die optischen Dichten wurden nach 48 Stunden gemessen.
Das Testwachstum wird als ein Prozentsatz des Wachstums der positiven Kontrolle sowohl für mutante (x) als auch für Wildtyp (y)-Stämme ausgedrückt. Das Verhältnis (x/y) dieser abgeleiteten Variablen wird berechnet.
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Tabelle 1
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Nukleinsäuremolekül, bestehend aus für ein Polypeptid, das für das Überleben und Wachstum der Hefe Candida albicans kritisch ist, codierender mRNA oder cDNA, wobei das Nukleinsäuremolekül wenigstens 70% Homologie zu der in der SEQ ID Nr. 1 dargestellten Nukleotidsequenz aufweist.
Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, das für das Überleben und Wachstum der Hefe Candida albicans kritisch ist, wobei das Nukleinsäuremolekül aus der in der SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenz von Nukleotiden besteht.
Polypeptid mit wenigstens 70% Aminosäurehomologie mit der SEQ ID Nr. 10.
Polypeptid nach Anspruch 3, bestehend aus der SEQ ID Nr. 10.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder in der SEQ ID Nr. 1 dargestellte Nukleotidsequenz zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder der in der SEQ ID Nr. 1 dargestellten Sequenz bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit Candida albicans assoziierten Krankheiten.
Polypeptid nach Anspruch 3 oder 4 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 3 oder 4 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von mit Candida albicans assoziierten Infektionen.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder ein Polypeptid nach Anspruch 3 oder 4 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerverdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür.
Rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 10, wobei das Nukleinsäuremolekül in Antisense-Orientierung inseriert wird.
Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 10 oder 11, wobei es sich bei dem rekombinanten DNA-Konstrukt um einen Expressionsvektor handelt.
Konstrukt nach Anspruch 12, das einen induzierbaren Promotor umfaßt.
Konstrukt nach Anspruch 12 oder 13, das eine für ein Reportermolekül codierende Sequenz umfaßt.
Zellen, enthaltend ein rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei es sich bei den Zellen um Bakterienzellen oder eukaryontische Zellen handelt.
Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Expression oder Funktionalität von Polypeptiden oder metabolischen Wegen, an denen diese Polypeptide beteiligt sind und die für das Wachstum und Überleben von Candida albicans kritisch sind, selektiv modulieren, wobei man in dem Verfahren: a. eine zu testende Verbindung mit einer oder mehreren Candida albicans-Zellen in Kontakt bringt, die eine zur Überexpression oder Unterexpression der Polypeptide führende Mutation in einem Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2 aufweisen, und darüber hinaus eine oder mehrere Candida albicans-Wildtypzellen mit der Verbindung in Kontakt bringt, b. das Wachstum und/oder die Aktivität der mutierten Zelle im Vergleich zum Wildtyp beobachtet, wobei ein unterschiedliches Wachstum bzw. eine unterschiedliche Aktivität der einen oder mehreren Candida albicans-Zellen eine selektive Wirkung der Verbindung auf ein Polypeptid oder ein anderes Polypeptid im gleichen oder in einem parallelen Weg anzeigt.