DE19929887A1 - cDNA-Sequenzen von zwei Interakoren FANCIP2 und FANCIP3 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A - Google Patents
cDNA-Sequenzen von zwei Interakoren FANCIP2 und FANCIP3 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe AInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP2 und FANCIP3) des Fanconi-Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FANCA) sowie die davon codierten Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Proteine gerichtete Antikörper; FANCIP1- bzw. FANCIP3-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP2 bzw. FANCIP3 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Proteine und der Antikörper.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP2 und
FANCIP3) des Fanconi-Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FANCA)
sowie die davon codierten Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden
Gene, gegen die Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP2- bzw. FANCIP3-transgene
Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP2 bzw. FANCIP3 zum
Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der
Proteine und der Antikörper.
Fanconi-Anämie (im folgenden als "FA" bezeichnet) ist eine autosomal rezessiv
erbliche Erkrankung, die sich klinisch mit Symptomen wie progressive Pancytopenie,
angeborenen Mißbildungen und erhöhtem Risiko für Krebserkrankungen manifestiert
(Glanz und Fraser, 1982). Mindestens 15% der FA-Patienten entwickeln myeloische
Leukämien (Auerbach und Allen, 1991).
Cytogenetisch sind FA-Zellen durch eine Hypersensitivität gegenüber DNA-
quervernetzenden Agenzien, wie z. B. Mitomycin C (MMC) und Diepoxybutan (DEB),
charakterisiert, die sich in Chromosomenbrüchen und -aberrationen manifestiert
(Auerbach, 1993). FA-Lymphozyten und -Fibroblasten weisen nach Behandlung mit
MMC eine Verzögerung bzw. einen Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus auf (Kubbies
et al., 1985; Seyschab et al., 1995). Zudem ist bei FA-Zellen eine erhöhte
Sauerstoffempfindlichkeit zu beobachten (Joenje et al. 1981; Schindler und Hoehn,
1988; Poot et al., 1996).
Anhand somatischer Zellfusionsstudien konnten für FA mindestens acht verschiedene
Komplementationsgruppen (A bis H) unterschieden werden (Joenje et al., 1997).
Bisher wurden die Gene für drei Komplementationsgruppen identifiziert: FANCC
(Strathdee et al., 1992; WO 93/22435), FANCA (Lo Ten Foe et al., 1996; The Fanconi
anaemia/Breast cancer consortium, 1996; WO 98/14462) und FANCG (Saar et al.,
1998; De Winter et al., 1998). Obwohl die molekulare Wirkungsweise der FA-Proteine
immer noch unbekannt ist, deutet der zelluläre Phänotyp und das erhöhte Krebsrisiko
bei einem Gendefekt auf eine Beteiligung bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklus-
Regulation und/oder der Hämatopoiese hin. Die Ähnlichkeit des klinischen und
zellulären Phänotyps der verschiedenen Komplementationsgruppen und die
Erkenntnis, daß das FANCA- und das FANCC-Protein unter FANCA-Phosphorylierung
interagieren und als Komplex in den Zellkern transportiert werden (Kupfer et al., 1997a,
Yamashita et al., 1998), lassen auf eine Protein-Kaskade oder ein funktionelles
Zusammenwirken in einem Komplex schließen.
Entscheidende Fortschritte bei der Entschlüsselung der molekularen Ursachen der FA-
Pathogenese können über die Identifikation der beteiligten Gene bzw. Proteine erzielt
werden. Als FANCC-Interaktoren sind bislang die Cyclin-abhängige Kinase cdc2
(Kupfer et al., 1997b), das Chaperon GRP94 (Hoshino et al., 1998) und die
NADPH : Cytochrom c-Reduktase (Kruyt et al., 1998) veröffentlicht, als potentiell
Pathogenese-relevant wurden die Fanconi-Gene 1 und 2 eingestuft (Planitzer et al.,
1998; WO 98/16637 und WO 98/45428).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Interaktoren der Fanconi-
Anämie-Proteine FANCA und FANCC zu finden. Auf Grundlage der FA-Pathogenese
als Modellsystem für Mechanismen zur Aufrechterhaltung genetischer Stabilität war
das Ziel, Bestandteile eines Proteinkomplexes bzw. einer Proteinkaskade zu
identifizieren, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklusregulation und/oder
der Onkogenese spielen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung von zwei cDNAs, die für
Proteine codieren und mit FANCIP2 bzw. FANCIP3 bezeichnet wurden. Die cDNA-
Sequenzen wurden unter Verwendung einer Interaction Trap-Version des Hefe-Two
Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) gefunden, wobei das
Protein der Komplementationsgruppe A (FANCA) als Köder diente. Die durch die
FANCIP2- bzw. FANCIP3-cDNA codierten Proteine interagieren mit FANCA und
können somit Teil des Komplexes bzw. der Signaltransduktionskaskade sein, die bei
Defekt zur FA-Pathogenese führt. Die FANCIP2- bzw. FANCIP3-cDNA und die davon
codierten Proteine, aber auch die entsprechenden Gene und gegen die Proteine
gerichtete Antikörper sind daher als diagnostische, therapeutische oder präventive
Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-
Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Sie
können weiterhin als Targets für Verfahren zum Effektor-Screening dienen, um neue
Medikamente zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft zwei Nukleinsäuren, welche
- a) die in Fig. 1 (FANCIP2) bzw. Fig. 3 (FANCIP3) dargestellten Nukleotidsequenzen oder einen Protein-codierenden Abschnitt davon,
- b) eine der Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen,
- c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen oder
- d) zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenzen umfaßt.
Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz (FANCIP2) enthält einen offenen
Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 393 Aminosäuren entspricht. Die
Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 2 dargestellt. Die in Fig. 3 dargestellte
Nukleotidsequenz (FANCIP3) enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit
einer Länge von 407 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins
ist in Fig. 4 dargestellt.
Für FANCIP2 finden sich in der EST-Sequenzdatenbank am "National Center for
Biotechnology Information" (NCBI) humane cDNA-Klone, die Teilbereiche der in Fig. 1
angegebenen Nukleotidsequenz enthalten. Als Beispiele sind 50 homologe humane
ESTs genannt: Zugangsnummern AA314911, AA160629, AA308155, AA486624,
AA158242, AA314255, AA307167, AA112543, AA429442, F30767, AI499075,
AA101431, A1081177, AA456789, AA693961, AA160534, W26750, AA224150,
AA112544, AA159975, AA160357, AA158709, AI559262, AA812340, AA160839,
H22161, AA164642, AA129629, AA232104, AI344118, AA317504, AA211632,
AA187009, Z24816, AI471019, AI608829, AI656832, AA136251, AI672592, AA776385,
AA078891, AA159976, F26758, T69152, T69213, AA320584, AA157101, AA580993,
AA232580 und AA157125. Unter diesen Zugangsnummern finden sich jedoch keine
Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen oder über eine mögliche
biologische Funktion. Eine humane cDNA-Sequenz unter der Zugangsnummer
AF151813 enthält einen möglichen offenen Leserahmen, der für ein abgeleitetes, CGI-55
genanntes Protein codieren soll, dessen biologische Funktion nicht erläutert ist.
Dieser offene Leserahmen unterscheidet sich an fünf Nukleotidpositionen vom offenen
Leserahmen der FANCIP2-Sequenz, was zu vier Unterschieden in der abgeleiteten
Aminosäuresequenz führt. Zudem besitzt die hier dargestellte FANCIP2-Sequenz am
5'-Ende weitere 34 Nukleotide.
Für FANCIP3 findet sich in der EST-Sequenzdatenbank ein humaner cDNA-Klon mit
der Zugangsnummer AA504104, der eine signifikante Homologie zu einem Teilbereich
innerhalb des offenen Leserahmens der in Fig. 3 angegebenen Nukleotidsequenz
zeigt. Unter dieser Zugangsnummer finden sich jedoch keine Angaben über einen
vollständigen offenen Leserahmen oder über eine mögliche biologische Funktion. Das
3'-Ende der in Fig. 3 angegebenen Nukleotidsequenz zeigt Homologien zu "Repeat"-
enthaltenden Sequenzen. Als Beispiele sind 20 humane ESTs genannt:
Zugangsnummern AI282488, AA601360, T80647, AI160964, AA704051, AA167656, F18885, AA226474, H46910, AA226251, N72678, AA669165, AA455202, H53546, AA600127, AA720531, AA769977, AI678468, R01556 und R68708.
Zugangsnummern AI282488, AA601360, T80647, AI160964, AA704051, AA167656, F18885, AA226474, H46910, AA226251, N72678, AA669165, AA455202, H53546, AA600127, AA720531, AA769977, AI678468, R01556 und R68708.
Die vorliegende Erfindung umfaßt neben der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten
Nukleotidsequenz und einer dieser Sequenzen im Rahmen der Degeneration des
genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen auch noch
Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der
Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al.
(1989) verwendet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen einen Protein-codierenden Abschnitt
der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine
Homologie von mehr als 65%, vorzugsweise mehr als 80% oder einen vorzugsweise
mindestens 15 Nukleotide langen Abschnitt davon aufweist. Weiterhin können die
erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen auch RNAs oder Nukleinsäureanaloga, z. B.
Peptid-Nukleinsäuren, umfassen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können aus Säugern nach bekannten Techniken
unter Verwendung kurzer Abschnitte der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten
Nukleotidsequenz als Hybridisierungssonden und/oder Primer nach bekannten
Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch
durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen
Nukleotidbausteine auch modifizierte Nukleotidbausteine (z. B. methylierte oder 2'-O-
alkylierte Nukleotide oder Phosphorthioate) eingesetzt werden können. Nukleinsäuren,
die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nukleotidbausteinen bestehen, können
beispielsweise als therapeutische Mittel, z. B. als Antisense-Nukleinsäuren oder als
Ribozyme, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der mindestens eine Kopie
einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger
prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein, auf dem sich eine erfindungsgemäße
DNA-Sequenz befindet und/oder der die Expression einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für prokaryotische
Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie Bakteriophagen, und extrachromosomale
Vektoren, wie zirkuläre Plasmidvektoren. Beispiele für eukaryotische Vektoren sind
Hefevektoren oder für höhere Zellen geeignete Vektoren, wie Plasmidvektoren oder
virale Vektoren.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der vorzugsweise mindestens einen 15
Nukleotide langen Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Sequenzen enthält.
Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein-
codierenden Bereich der in Fig. 1 bzw. Fig. 2 dargestellten Sequenzen oder einem für
die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren
eignen sich besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense-
Nukleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Zelle, die mit einer der
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einem erfindungsgemäßen Vektor
transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryotische als auch eine
prokaryotische Zelle sein. Beispiele eukaryotischer Zellen sind insbesondere
Säugerzellen. Ebenfalls Gegenstand sind FANCIP2- bzw. FANCIP3-transgene
Organismen, wie z. B. knock in- oder knock out-Tiermodelle. Tiermodelle, die das
Produkt der Nukleinsäure stabil exprimieren, werden als knock-in-Tiermodelle, jene,
deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde, als knock-out-
Tiermodelle bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt von den oben angegebenen Nukleinsäuren codierte
Proteine. Diese Proteine weisen die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte
Aminosäuresequenz oder eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als
70% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz auf. Die Erfindung
betrifft auch Varianten und Fragmente des in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Proteins.
Unter Varianten sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion
und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der
in Fig. 2 bzw. Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Hierunter fallen
sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen von
FANCIP2 bzw. FANCIP3 als auch durch rekombinante DNA-Technologie,
insbesondere durch in vitro-Mutagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten
Oligonukleotiden erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder
immunologischen Aktivität den in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Protein im
wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch
modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an
reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung oder Amidierung modifiziert sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Proteine führen und sowohl die Kultivierung entsprechend transformierter Zellen als
auch die Isolierung der erfindungsgemäßen Proteine umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide oder
Fragmente dieser Polypeptide als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern. Die
Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von
Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und
anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach
bekannten Methoden können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die
vorliegende Erfindung umfaßt somit auch Antikörper gegen FANCIP2 bzw. FANCIP3
oder eine Variante davon.
Das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierte FANCIP2 bzw. FANCIP3
kann als Target für eine gezielte Suche nach Effektoren eingesetzt werden.
Substanzen, die auf erfindungsgemäße Proteine inhibitorisch oder aktivierend wirken,
sind in der Lage, die durch diese Proteine gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu
beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder, wie
z. B. Cytopenien oder Tumoren, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist
somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des FANCIP2 bzw.
FANCIP3, wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen
potentiellen Effektorsubstanzen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen,
z. B. zellaktivierende, zellinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische
Veränderungen, analysiert. Zudem können auf diese Weise Bindedomänen des
FANCIP2 bzw. FANCIP3 identifiziert werden. Gegenstand der Erfindung sind auf
obengenannte Weise ermittelte pharmazeutisch wirksame Effektor-Substanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
als aktive Komponente Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Antikörper
und/oder Effektor-Substanzen wie zuvor angegeben enthält und weiterhin
pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls
weitere aktive Komponenten enthalten kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen
eingesetzt werden, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen,
Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Dies gilt auch
für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen,
insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Cytopenien und/oder
Tumorerkrankungen. Weiterhin wird eine gezielte Diagnostik von Krankheiten
ermöglicht, die mit Veränderungen der Aktivität des FANCIP2 bzw. FANCIP3 direkt
oder indirekt verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer
Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z. B. auf Gen- oder
Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen FANCIP2 bzw. FANCIP3 zum
Nachweis auf Proteinebene durchgeführt werden.
Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des FANCIP2 bzw. FANCIP3
zurückzuführen sind, kann eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die
Übertragung einer für das FANCIP2 bzw. FANCIP3 codierenden Nukleinsäure mittels
Vektoren, z. B. viralen Vektoren, in das entsprechende Zielgewebe umfaßt.
Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf eine unkontrollierte Expression des
FANCIP2 bzw. FANCIP3 zurückzuführen sind, eine gentherapeutische Behandlung
erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser Expression führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnostik der oben
genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem Patienten
stammende Probe, z. B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit
einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringt und
die Nukleotidsequenz und/oder die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure
qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können
beispielsweise auf Nukleinsäureebene durch Verwendung von Nukleinsäure-
Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene
durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann als Marker für das Auftreten von
Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer
Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Veränderungen verwendet
werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder
Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten eine
erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive
Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische
Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische
Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper-
Toxine bzw. Antikörper-Enzymkonjugate. Weitere bevorzugte pharmazeutische
Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Antisense-Nukleinsäuren,
gentherapeutische Vektoren oder Effektor-Substanzen, z. B. in Form niedermolekularer
Aktivatoren oder Inhibitoren.
Zur Klonierung von cDNAs, deren Genprodukte mit dem Fanconi-Anämie-Protein
FANCA interagieren und damit eine Rolle bei der FA-Pathogenese spielen können,
wurde eine Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song,
1989; Finley Jr. et al., 1996) eingesetzt.
Für die Konstruktion des FANCA-Köderproteins wurde die komplette codierende
Sequenz des FANCA-Proteins in den Vektor pEG202 über die EcoRI-Schnittstelle im
Leserahmen mit der für die LexA-DNA-bindende Domäne codierenden Region kloniert.
Für die Expression des Beuteproteins wurde der Vektor pJG4-5 verwendet, der die
Konstruktion von Fusionsproteinen mit der B42-transaktivierenden Domäne erlaubt. Mit
dem FANCA-Köderprotein wurde eine in diesen Vektor als Fusionsgenbank klonierte
HeLa-cDNA-Bibliothek durchmustert.
Als Wirtsorganismus diente der Hefestamm EGY48. Der Nachweis einer positiven
Interaktion erfolgte durch Trankriptionsaktivierung des LEU2-Gens, woraus Wachstum
der Hefen auf Leucin-freiem Medium resultiert.
Vor Durchführung des Interaction Traps wurde durch Ausplattieren pEG202FANCA-
transformierter EGY48-Hefen auf Glucose-Medium ohne Histidin und Leucin
sichergestellt, daß keine intrinsische transaktivierende Eigenschaft des FANCA-Köder-
Fusionskonstruktes vorliegt.
Mit pEG202FANCA und der B42-Fusionsgenbank cotransformierte EGY48 wurden auf
Leucin-haltigem Medium auf Erhalt beider Vektoren vorselektiert und aufgenommen.
Für die Suche nach interagierenden Hefeklonen wurden Aliquots auf Leucin-freiem
Medium ausplattiert und 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Insgesamt wurden Aliquots
entsprechend einer Menge von 1 × 106 Transfektanten durchmustert. Die Abhängigkeit
der Transkriptionsaktivierung positiver Klone von der Expression des Beuteproteins
wurde auf Leucin-freiem Glucose-Medium überprüft. Die Isolierung der Interaktor-
Plasmide erfolgte nach Aufzucht der Hefen in Glucose-Medium ohne Tryptophan,
Elektroporation des Nukleinsäure-Isolats im E. coli-Stamm XL1blue (Stratagene) und
Plasmidpräparation aus den Bakterienzellen. Zur Bestätigung der Interaktionen wurden
Retransformationen des isolierten Beute-Interaktors in Kombinationen mit
unterschiedlichen Köderkonstrukten durchgeführt. In Kombination mit pEG202FANCA
wurde die zuvor beobachtete Interaktion bestätigt. Außerdem wurden mögliche
Interaktionen mit dem LexA-Fusionspartner ausgeschlossen, indem einerseits mit dem
pEG202-Leervektor co-retransformiert wurde und andererseits mit einem LexA-DNA-
Ligase-Köderfusionskonstrukt als Negativkontrolle.
Die Länge der Genbank-cDNAs der isolierten Interaktorklone wurde durch EcoRI/XhoI-
Restriktionshydrolyse bestimmt. Die Ansequenzierung der cDNAs erfolgte durch eine
automatisierte Cycle Sequencing-Methode (Applied Biosystems) unter Verwendung
des Nukleinsäureprimers Bco I (5'-ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3').
Die vollständige Sequenzierung der Vektor-inserierten FANCIP2- bzw. FANCIP3-
cDNA-Fragmente erfolgte mit den Nukleinsäureprimern Bco I und Bco II (5'-GAC AAG
CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3') durch die Firma Sequence Laboratories
Göttingen.
Zur Ermittlung der 5'-Bereich-Teilsequenzen der gefundenen Nukleotidsequenzen
wurde der 5'/3' RACE Kit (Boehringer-Roche) verwendet. Hierbei kamen für FANCIP2
die sequenzspezifischen Primer FANCIP2-SP1 (5'-CTT CGT TCA CGA GGT GGT CG-3')
sowie FANCIP2-SP2 (5'-CTT CCA ACT CGT CTT ATT CC-3') und für FANCIP3 die
sequenzspezifischen Primer FANCIP3-SP1 (5'-CAC ATG ACA CTC TTC AGG AG-3')
sowie FANCIP3-SP2 (5'-CCT TTG GGA ACA TCT ATG TGC-3') zum Einsatz. Die
erhaltenen PCR-Produkte wurden elektrophoretisch gereinigt (JETquick Gel Extraction
Kit, GENOMED) und unter Verwendung des T7 Sequenase Version 2.0 DNA
Sequencing Kit (Amersham-Pharmacia) und der oben genannten Primer FANCIP2-SP2
bzw. FANCIP3-SP3 direkt sequenziert. Das FANCIP3-PCR-Produkt wurde zudem über
die SmaI-Schnittstelle in den Vektor pUC19 kloniert und durch die Firma Sequence
Laboratories Göttingen sequenziert. Die Zugehörigkeit der erhaltenen
Nukleotidfragmente zu den Plasmid-inserierten Interaktor-Fragmenten wurde jeweils
durch überlappende Sequenzbereich bestätigt. Die zusammengesetzte
Nukleotidsequenz ergab für FANCIP2 einen 1426 Nukleotide langen cDNA-Bereich mit
einem möglichen offenen Leserahmen von 1179 Nukleotiden bzw. 393 Codons, für
FANCIP3 einen 1612 Nukleotide langen cDNA-Bereich mit einem möglichen offenen
Leserahmen von 1221 Nukleotiden bzw. 407 Codons.
Um ähnliche Nukleotidsequenzen in der Sequenzdatenbank des "National Center of
Biotechnology Information" (NCBI) zu finden, wurden die cDNA-Sequenzen von
FANCIP2 bzw. FANCIP3 unter Verwendung des Blast-Programms am NCBI
(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jform=1) analysiert.
Es zeigen:
Fig. 1 (SEQ ID NO. 1) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIP2 codierenden
offenen Leserahmen enthält,
Fig. 2 (SEQ ID NO. 2) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 1
gezeigten Nukleotidsequenz,
Fig. 3 (SEQ ID NO. 3) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIP3 codierenden
offenen Leserahmen enthält,
Fig. 4 (SEQ ID NO. 4) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 3
gezeigten Nukleotidsequenz,
Fig. 5 (SEQ ID NOs. 5 und 6) die Nukleinsäureprimer, die zur Sequenzierung der
Plasmid-inserierten FANCIP2- bzw. FANCIP3-Nukleotidsequenzen verwendet wurden,
Fig. 6 (SEQ ID NOs. 7 und 8) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse von
FANCIP2 verwendet wurden,
Fig. 7 (SEQ ID NOs. 9 und 10) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse von
FANCIP3 verwendet wurden.
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Claims (22)
1. Nukleinsäure, die
- a) die in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein codierenden Abschnitt davon,
- b) eine den Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz,
- c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder
- d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, die einen vorzugsweise mindestens 30
Nukleotide umfassenden Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3
dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.
3. Nukleinsäure, die eine Homologie von mehr als 65% zu der Nukleotidsequenz
gemäß Anspruch 1 oder einem Abschnitt davon aufweist.
4. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukleinsäureanalogon, die eine
Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.
5. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.
6. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 5, der die Expression der Nukleinsäure
in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.
7. Mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor
gemäß Anspruch 5 oder 6 transformierte Zelle, ein entsprechender transgener
Organismus oder Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 3 stabil exprimieren (knock-in) oder deren entsprechendes
natürliches Gen gezielt zerstört wurde (knock-out).
8. Polypeptid oder dessen Salz, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, das
- a) die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder
- b) eine Homologie von mehr als 60% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder dessen Salz.
10. Fragment des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 mit mindestens 100
Aminosäuren oder dessen Salz.
11. Modifiziertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder
9 umfaßt.
12. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9, das die
Kultivierung von Zellen gemäß Anspruch 7 umfaßt sowie die Isolierung des
Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9.
13. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten
dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
14. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 8 oder 9.
15. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Proteins gemäß Anspruch 8
oder 9, mit dessen Hilfe verschiedene potentielle Effektorsubstanzen an Zellen
getestet werden können, die das Protein exprimieren.
16. Substanz, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Anspruch 15 erhalten wurde und
die mit mindestens einem Bereich des Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9
reagiert und/oder dieses verändert.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente
- a) eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
- b) einen Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6,
- c) eine Zelle gemäß Anspruch 7,
- d) ein Polypeptid gemäß Anspruch 8, 9, 10 oder 11,
- e) einen Antikörper gemäß Anspruch 14 umfaßt oder
- f) eine Substanz gemäß Anspruch 16
18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Diagnostik von
Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen,
Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, oder
einer Prädisposition solcher Erkrankungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Therapie oder
Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-
Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert
sind.
20. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Gentherapie vor
Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen,
Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten,
Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression
assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, bei dem man
einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 in Kontakt bringt und die
Nukleotidsequenz und/oder die Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch
1 bestimmt.
22. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-
Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder
Tumorprogression assoziiert sind, bei dem man einem Patienten eine
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 verabreicht, die die aktive Komponente
in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.
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- 2000-06-26 JP JP2001506815A patent/JP2003503053A/ja active Pending
- 2000-06-26 WO PCT/EP2000/005878 patent/WO2001000822A2/de not_active Application Discontinuation
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WO2001000822A2 (de) | 2001-01-04 |
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WO2001000822A3 (de) | 2001-07-05 |
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