DE19904650A1 - cDNA-Sequenz eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A - Google Patents
cDNA-Sequenz eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe AInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNA eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FAA) sowie das davon codierte Protein. Weitere Gegenstände sind das entsprechende Gen, gegen das Protein gerichtete Antikörper, FANCIP1-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP1 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäure, des Proteins und der Antikörper.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNA eines Interaktors (FANCIP1) des Fanconi-
Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FANCA) sowie das davon codierte
Protein. Weitere Gegenstände sind das entsprechende Gen, gegen das Protein
gerichtete Antikörper, FANCIP1-transgene Organismen und Zellen sowie die
Verwendung von FANCIP1 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische
Anwendung der Nukleinsäure, des Proteins und der Antikörper.
Fanconi-Anämie (im folgenden als "FA" bezeichnet) ist eine autosomal rezessiv
erbliche Erkrankung, die sich klinisch mit Symptomen wie progressive Pancytopenie,
angeborenen Mißbildungen und erhöhtem Risiko für Krebserkrankungen manifestiert
(Glanz und Fraser, 1982). Mindestens 15% der FA-Patienten entwickeln myeloische
Leukämien (Auerbach und Allen, 1991).
Cytogenetisch sind FA-Zellen durch eine Hypersensitivität gegenüber DNA
quervernetzenden Agenzien, wie z. B. Mitomycin C (MMC) und Diepoxybutan (DEB),
charakterisiert, die sich in Chromosomenbrüchen und -aberrationen manifestiert
(Auerbach, 1993). FA-Lymphozyten und -Fibroblasten weisen nach Behandlung mit
MMC eine Verzögerung bzw. einen Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus auf (Kubbies
et al., 1985; Seyschab et al., 1995). Zudem ist bei FA-Zellen eine erhöhte
Sauerstoffempfindlichkeit zu beobachten (Joenje et al. 1981; Schindler und Hoehn,
1988; Poot et al., 1996).
Anhand somatischer Zellfusionsstudien konnten für FA mindestens acht verschiedene
Komplementationsgruppen (A bis H) unterschieden werden (Joenje et al., 1997).
Bisher wurden die Gene für drei Komplementationsgruppen identifiziert: FANCC
(Strathdee et al., 1992; WO93/22435), FANCA (Lo Ten Foe et al., 1996; The Fanconi
anaemia/Breast cancer consortium, 1996; WO98/14462) und FANCG (Saar et al.,
1998; De Winter et al., 1998). Obwohl die molekulare Wirkungsweise der FA-Proteine
immer noch unbekannt ist, deutet der zelluläre Phänotyp und das erhöhte Krebsrisiko
bei einem Gendefekt auf eine Beteiligung bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklus-
Regulation und/oder der Hämatopoiese hin. Die Ähnlichkeit des klinischen und
zellulären Phänotyps der verschiedenen Komplementationsgruppen und die
Erkenntnis, daß das FANCA- und das FANCC-Protein unter FANCA-Phosphorylierung
interagieren und als Komplex in den Zellkern transportiert werden (Kupfer et al., 1997a,
Yamashita et al., 1998), lassen auf eine Protein-Kaskade oder ein funktionelles
Zusammenwirken in einem Komplex schließen.
Entscheidende Fortschritte bei der Entschlüsselung der molekularen Ursachen der FA-
Pathogenese können über die Identifikation der beteiligten Gene bzw. Proteine erzielt
werden. Als FANCC-Interaktoren sind bislang die Cyclin-abhängige Kinase cdc2
(Kupfer et al., 1997b), das Chaperon GRP94 (Hoshino et al., 1998) und die
NADPH: Cytochrom c-Reduktase (Kruyt et al., 1998) veröffentlicht, als potentiell
Pathogenese-relevant wurden die Fanconi-Gene 1 und 2 eingestuft (Planitzer et al.,
1998; WO98/16637 und WO98/45428).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Interaktoren der Fanconi-
Anämie-Proteine FANCA und FANCC zu finden. Auf Grundlage der FA-Pathogenese
als Modellsystem für Mechanismen zur Aufrechterhaltung genetischer Stabilität war
das Ziel, Bestandteile eines Proteinkomplexes bzw. einer Proteinkaskade zu
identifizieren, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklusregulation und/oder
der Onkogenese spielen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung einer cDNA, die für ein neues
Protein codiert und mit FANCIP1 bezeichnet wurde. Die cDNA-Sequenz wurde unter
Verwendung einer Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und
Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) gefunden, wobei das Protein der
Komplementationsgruppe A (FANCA) als Köder diente. Das durch die FANCIP1-cDNA
codierte Protein interagiert mit FANCA und kann somit Teil des Komplexes bzw. der
Signaltransduktionskaskade sein, die bei Defekt zur FA-Pathogenese führt. Die
FANCIP1-cDNA und das davon codierte Protein, aber auch das entsprechende Gen
und gegen das Protein gerichtete Antikörper sind daher als diagnostische,
therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit DNA-
Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder
Tumorprogression assoziiert sind. Sie können weiterhin als Targets für Verfahren zum
Effektor-Screening dienen, um neue Medikamente zur Behandlung der zuvor
genannten Erkrankungen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, welche
- a) die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein codierenden Abschnitt davon,
- b) eine der Sequenz aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz,
- c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder
- d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.
Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen, der
einem Protein mit einer Länge von 308 Aminosäuren entspricht. Die
Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 2 dargestellt.
In der EST-Sequenzdatenbank am National Center for Biotechnology Information
(NCBI) finden sich humane cDNA-Klone, die Teilbereiche der in Fig. 1 angegebenen
Nukleotidsequenz enthalten. Folgende homologe humane ESTs wiesen einen
statistischen Wahrscheinlichkeitswert von weniger als 0,5 auf: Zugangsnummern
AA165403, AA455594, AA314472, AA452340, N34087, AA182700, N41615,
AA470049, AA463289, AA132459, W31487, R56355, H58271, H16122, W77956,
AA193332, AA323923, AA370209, AA296758, W72757, AA093971, AA385544,
AA165402, H42806, AA093977, AA370011, Al161152, R71215, AA386175,
AA885343, T79297, R81567, Al082713, N29615, WO4568, N40176, AA862385,
AA953985, AA761084, AA416877, AA452117, Al143379, AA576229, W16851,
AA993074, AA569223, AA074872, AA463198, AA857004, H58663, H15819,
AA206059, AA961068, T84789, AA507257, AA707515, AA132458, T79211,
AA179262, N25699, T99574, T99363, AA713668, T91119, AA370208, R81568,
W1505, A1038899, AA885960, R56263, AA825431, T99147, AA194115, HUML1488,
C21420, AF049564, Al198414 und W31868. Unter diesen Zugangsnummern finden
sich jedoch keine Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen oder über
eine mögliche biologische Funktion.
Die vorliegende Erfindung umfaßt neben der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz und
einer dieser Sequenz im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes
entsprechenden Nukleotidsequenz auch noch eine Nukleotidsequenz, die mit einer der
zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß
vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (1989) verwendet.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure umfaßt einen Protein-codierenden Abschnitt der
in Fig. 1 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von
mehr als 65%, vorzugsweise mehr als 80% oder einen vorzugsweise mindestens 15
Nukleotide langen Abschnitt davon aufweist. Weiterhin kann die erfindungsgemäße
Nukleotidsequenz auch eine RNA oder ein Nukleinsäureanalogon, z. B. eine Peptid-
Nukleinsäure, umfassen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können aus Säugern nach bekannten Techniken
unter Verwendung kurzer Abschnitte der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz als
Hybridisierungssonden und/oder Primer nach bekannten Methoden isoliert werden.
Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese
hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nukleotidbausteine auch modifizierte
Nukleotidbausteine (z. B. methylierte oder 2'-O-alkylierte Nukleotide oder
Phosphorthioate) eingesetzt werden können. Nukleinsäuren, die teilweise oder
vollständig aus modifizierten Nukleotidbausteinen bestehen, können beispielsweise als
therapeutische Mittel, z. B. als Antisense-Nukleinsäuren oder als Ribozyme, eingesetzt
werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der mindestens eine Kopie
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger
prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße
DNA-Sequenz befindet und/oder der die Expression der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für prokaryotische
Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie Bakteriophagen, und extrachromosomale
Vektoren, wie zirkuläre Plasmidvektoren. Beispiele für eukaryotische Vektoren sind
Hefevektoren oder für höhere Zellen geeignete Vektoren, wie Plasmidvektoren oder
virale Vektoren.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der vorzugsweise mindestens einen 15
Nukleotide langen Abschnitt der in Fig. 1 dargestellten Sequenz enthält. Vorzugsweise
besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein-codierenden
Bereich der in Fig. 1 dargestellten Sequenz oder einem für die Expression des Proteins
wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren eignen sich besonders zur
Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense-Nukleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Zelle, die mit einer erfindungsgemäßen
Nukleinsäure oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann
sowohl eine eukaryotische als auch eine prokaryotische Zelle sein. Beispiele
eukaryotischer Zellen sind insbesondere Säugerzellen. Ebenfalls Gegenstand sind
FANCIP1-transgene Organismen, wie z. B. knock in- oder knock out-Tiermodelle.
Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure stabil exprimieren, werden als knock-in-
Tiermodelle, jene, deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde, als
knock-out-Tiermodelle bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein von einer wie oben angegebenen Nukleinsäure
codiertes Protein. Dieses Protein weist die in Fig. 2 dargestellte Aminosäuresequenz
oder eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70% zu der in Fig. 2
dargestellten Aminosäuresequenz auf. Die Erfindung betrifft auch Varianten und
Fragmente des in Fig. 2 dargestellten Proteins. Unter Varianten sind Sequenzen zu
verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner
Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in Fig. 2 dargestellten
Aminosäuresequenz unterscheiden. Hierunter fallen sowohl natürlich vorkommende
allelische Variationen oder Spleißvariationen des FANCIP1 als auch durch
rekombinante DNA-Technologie, insbesondere durch in vitro-Mutagenese mit Hilfe von
chemisch synthetisierten Oligonukleotiden erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer
biologischen und/oder immunologischen Aktivität dem in Fig. 2 dargestellten Protein im
wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch
modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an
reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung oder Amidierung modifiziert sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen
Proteins führen und sowohl die Kultivierung entsprechend transformierter Zellen als
auch die Isolierung des erfindungsgemäßen Proteins umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des erfindungsgemäßen Polypeptids
oder Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung
von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und
anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach
bekannten Methoden können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die
vorliegende Erfindung umfaßt somit auch Antikörper gegen FANCIP1 oder eine
Variante davon.
Das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure codierte FANCIP1 kann als Target für
eine gezielte Suche nach Effektoren eingesetzt werden. Substanzen, die auf das
erfindungsgemäße Protein inhibitorisch oder aktivierend wirken, sind in der Lage, die
durch das Protein gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können
sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder, wie z. B. Cytopenien oder
Tumoren, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein
Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des FANCIP1, wobei man Zellen, die das
Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiellen Effektorsubstanzen, in Kontakt
bringt und die Zellen auf Veränderungen, z. B. zellaktivierende, zellinhibierende,
zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Zudem können auf
diese Weise Bindedomänen des FANCIP1 identifiziert werden. Gegenstand der
Erfindung sind auf obengenannte Weise ermittelte pharmazeutisch wirksame Effektor-
Substanzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die
als aktive Komponente Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Antikörper
und/oder Effektor-Substanzen wie zuvor angegeben enthält und weiterhin
pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls
weitere aktive Komponenten enthalten kann. Die pharmazeutische Zusammensetzung
kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen
eingesetzt werden, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen,
Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Dies gilt auch
für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen,
insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Cytopenien und/oder
Tumorerkrankungen. Weiterhin wird eine gezielte Diagnostik von Krankheiten
ermöglicht, die mit Veränderungen der Aktivität des FANCIP1 direkt oder indirekt
verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer
Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z. B. auf Gen- oder
Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen FANCIP1 zum Nachweis auf
Proteinebene durchgeführt werden.
Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des FANCIP1 zurückzuführen sind, kann
eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für das
FANCIP1 codierenden Nukleinsäure mittels Vektoren, z. B. viralen Vektoren, in das
entsprechende Zielgewebe umfaßt. Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf
eine unkontrollierte Expression des FANCIP1 zurückzuführen sind, eine
gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser
Expression führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnostik der oben
genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem Patienten
stammende Probe, z. B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit
einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringt und
die Nukleotidsequenz und/oder die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure
qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können
beispielsweise auf Nukleinsäureebene durch Verwendung von Nukleinsäure-
Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene
durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann als Marker für das Auftreten von
Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer
Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Veränderungen verwendet
werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder
Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten eine
erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive
Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische
Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische
Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper-
Toxine bzw. Antikörper-Enzymkonjugate. Weitere bevorzugte pharmazeutische
Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Antisense-Nukleinsäuren,
gentherapeutische Vektoren oder Effektor-Substanzen, z. B. in Form niedermolekularer
Aktivatoren oder Inhibitoren.
Zur Klonierung von cDNAs, deren Genprodukte mit dem Fanconi-Anämie-Protein
FANCA interagieren und damit eine Rolle bei der FA-Pathogenese spielen können,
wurde eine Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song,
1989; Finley Jr. et al., 1996) eingesetzt.
Für die Konstruktion des FANCA-Köderproteins wurde die komplette codierende
Sequenz des FANCA-Proteins in den Vektor pEG202 über die EcoRl-Schnittstelle im
Leserahmen mit der für die LexA-DNA-bindende Domäne codierenden Region kloniert.
Für die Expression des Beuteproteins wurde der Vektor pJG4-5 verwendet, der die
Konstruktion von Fusionsproteinen mit der B42-transaktivierenden Domäne erlaubt. Mit
dem FANCA-Köderprotein wurde eine in diesen Vektor als Fusionsgenbank klonierte
HeLa-cDNA-Bibliothek durchmustert.
Als Wirtsorganismus diente der Hefestamm EGY48. Der Nachweis einer positiven
Interaktion erfolgte durch Trankriptionsaktivierung des LEU2-Gens, woraus Wachstum
der Hefen auf Leucin-freiem Medium resultiert.
Vor Durchführung des Interaction Traps wurde durch Ausplattieren pEG202FANCA
transformierter EGY48-Hefen auf Glucose-Medium ohne Histidin und Leucin
sichergestellt, daß keine intrinsische transaktivierende Eigenschaft des FANCA-Köder-
Fusionskonstruktes vorliegt.
Mit pEG202FANCA und der B42-Fusionsgenbank cotransformierte EGY48 wurden auf
Leucin-haltigem Medium auf Erhalt beider Vektoren vorselektiert und aufgenommen.
Für die Suche nach interagierenden Hefeklonen wurden Aliquots auf Leucin-freiem
Medium ausplattiert und 3 bis 5 Tage bei 30°C inkubiert. Insgesamt wurden Aliquots
entsprechend einer Menge von 1 × 106 Transfektanten durchmustert. Die Abhängigkeit
der Transkriptionsaktivierung positiver Klone von der Expression des Beuteproteins
wurde auf Leucin-freiem Glucose-Medium überprüft. Die Isolierung der Interaktor-
Plasmide erfolgte nach Aufzucht der Hefen in Glucose-Medium ohne Tryptophan,
Elektroporation des Nukleinsäure-Isolats im E.coli-Stamm XL1blue (Stratagene) und
Plasmidpräparation aus den Bakterienzellen. Zur Bestätigung der Interaktionen wurden
Retransformationen des isolierten Beute-Interaktors in Kombinationen mit
unterschiedlichen Köderkonstrukten durchgeführt. In Kombination mit pEG202FANCA
wurde die zuvor beobachtete Interaktion bestätigt. Außerdem wurden mögliche
Interaktionen mit dem LexA-Fusionspartner ausgeschlossen, indem einerseits mit dem
pEG202-Leervektor co-retransformiert wurde und andererseits mit einem LexA-DNA-
Ligase-Köderfusionskonstrukt als Negativkontrolle.
Sequenzanalyse der FANCIP1-cDNA
Die Länge der Genbank-cDNAs der isolierten Interaktorklone wurde durch EcoRl/Xhol-
Restriktionshydrolyse bestimmt. Die Ansequenzierung der cDNAs erfolgte durch eine
automatisierte Cycle Sequencing-Methode (Applied Biosystems) unter Verwendung
des Nukleinsäureprimers Bco I (5'- ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3').
Die vollständige Sequenzierung des Vektors mit inseriertem FANCIP1-cDNA-Fragment
erfolgte mit den Nukleinsäureprimern Bco I und Bco II (5'-GAC AAG CCG ACA ACC
TTG ATT GGA G-3') durch die Firma Sequence Laboratories Göttingen.
Zur Ermittlung der 5'-Bereich-Teilsequenz der gefundenen Nukleotidsequenz wurde der
5'/3' RACE Kit (Boehringer-Roche) verwendet. Hierbei kamen die sequenzspezifischen
Primer FANCIP1-SP1 (5'-GGG GGC AGG AAT ATG AGA GG-3') und FANCIP1-SP2
(5'-TTT AGG GGG AAG TGT ACC TG-3') zum Einsatz. Das erhaltene PCR-Produkt
wurde elektrophoretisch gereinigt (JETquick Gel Extraction Kit, GENOMED) und unter
Verwendung des T7 Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit (Amersham-
Pharmacia) und des oben genannten Primers FANCIP1-SP2 direkt sequenziert. Die
Zugehörigkeit des erhaltenen Nukleotidfragments zum Plasmid-inserierten Interaktor-
Fragment wurde durch einen überlappenden Sequenzbereich von 38 Nukleotiden
bestätigt. Die zusammengesetzte Nukleotidsequenz ergab einen 1553 Nukleotide
langen cDNA-Bereich, der einen Teil der 5'-untranslatierten Region, den gesamten
offenen Leserahmen von 924 Nukleotiden bzw. 308 Codons und nahezu den
kompletten 3'-untranslatierten Bereich bis über das Polyadenylierungssignal (AATAAA)
hinaus umfaßt.
Um ähnliche Nukleotidsequenzen in der Sequenzdatenbank des National Center of
Biotechnology Information (NCBI) zu finden, wurde die cDNA-Sequenz von FANCIP1
unter Verwendung des Blast-Programms am NCBl (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi
bin/BLAST/nph-newblast?Jform = 1) analysiert. Nur in der EST-Datenbank ergaben sich
signifikante Homologien zu humanen Klonen, die allerdings weder einen vollständigen
offenen Leserahmen noch Angaben zu einer möglichen biologischen Funktion
enthielten.
Fig. 1 (SEQ ID NO. 1) eine Nukleotidsequenz, die den für FANCIP1 codierenden
offenen Leserahmen enthält,
Fig. 2 (SEQ ID NO. 2) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig.
1 gezeigten Nukleotidsequenz,
Fig. 3 (SEQ ID NOs. 3 und 4) die Nukleinsäureprimer, die zur Sequenzierung der
Plasmid-inserierten FANCIP1-Nukleotidsequenz verwendet wurden,
Fig. 4 (SEQ ID NOs. 5 und 6) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse
verwendet wurden.
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Claims (22)
1. Nukleinsäure, die
- a) die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Protein codierenden Abschnitt davon,
- b) eine der Sequenz aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz,
- c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder
- d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, die einen vorzugsweise mindestens 30
Nukleotide umfassenden Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1
dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.
3. Nukleinsäure, die eine Homologie von mehr als 65% zu der Nukleotidsequenz
gemäß Anspruch 1 oder einem Abschnitt davon aufweist.
4. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukleinsäureanalogon, die eine
Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
5. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.
6. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 5, der die Expression der Nukleinsäure
in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.
7. Mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor
gemäß Anspruch 5 oder 6 transformierte Zelle, ein entsprechender transgener
Organismus oder Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 3 stabil exprimieren (knock-in) oder deren entsprechendes
natürliches Gen gezielt zerstört wurde (knock-out).
8. Polypeptid oder dessen Salz, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, das
- a) die in Fig. 2 dargestellte Aminosäuresequenz oder
- b) eine Homologie von mehr als 60% zu der in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder dessen Salz.
10. Fragment des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 mit mindestens 100
Aminosäuren oder dessen Salz.
11. Modifiziertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder
9 umfaßt.
12. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9, das die
Kultivierung von Zellen gemäß Anspruch 7 umfaßt sowie die Isolierung des
Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9.
13. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten
dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
14. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 8 oder 9.
15. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Proteins gemäß Anspruch 8
oder 9, mit dessen Hilfe verschiedene potentielle Effektorsubstanzen an Zellen
getestet werden können, die das Protein exprimieren.
16. Substanz, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Anspruch 15 erhalten wurde und
die mit mindestens einem Bereich des Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9
reagiert und/oder dieses verändert.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente
- a) eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4,
- b) einen Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6,
- c) eine Zelle gemäß Anspruch 7,
- d) ein Polypeptid gemäß Anspruch 8, 9, 10 oder 11,
- e) einen Antikörper gemäß Anspruch 14 umfaßt oder
- f) eine Substanz gemäß Anspruch 16 und pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.
18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Diagnostik von
Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen,
Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, oder
einer Prädisposition solcher Erkrankungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Therapie oder
Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-
Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert
sind.
20. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Gentherapie von
Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen,
Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten,
Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression
assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, bei dem man
einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 in Kontakt bringt und die
Nukleotidsequenz und/oder die Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch
1 bestimmt.
22. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-
Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder
Tumorprogression assoziiert sind, bei dem man einem Patienten eine
Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 verabreicht, die die aktive Komponente
in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904650A DE19904650A1 (de) | 1999-02-05 | 1999-02-05 | cDNA-Sequenz eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A |
| PCT/EP2000/000506 WO2000046244A1 (de) | 1999-02-05 | 2000-01-24 | cDNA-SEQUENZ EINES INTERAKTORS FANCIP1 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A |
| AU26663/00A AU2666300A (en) | 1999-02-05 | 2000-01-24 | Cdna sequence of an interactor fancip1 of the fanconi anaemia protein of complementation group |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19904650A DE19904650A1 (de) | 1999-02-05 | 1999-02-05 | cDNA-Sequenz eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A |
Publications (1)
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|---|---|
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Family
ID=7896511
Family Applications (1)
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| DE19904650A Withdrawn DE19904650A1 (de) | 1999-02-05 | 1999-02-05 | cDNA-Sequenz eines Interaktors FANCIP1 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1497461A2 (de) * | 2002-04-15 | 2005-01-19 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Verfahren zum testen auf zellzyklusmodulatoren |
Family Cites Families (1)
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|---|---|---|---|---|
| EP1007671B1 (de) * | 1997-04-07 | 2002-02-13 | Roche Diagnostics GmbH | Fanconi-gen ii |
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1999
- 1999-02-05 DE DE19904650A patent/DE19904650A1/de not_active Withdrawn
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2000
- 2000-01-24 AU AU26663/00A patent/AU2666300A/en not_active Abandoned
- 2000-01-24 WO PCT/EP2000/000506 patent/WO2000046244A1/de active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| Gene 210, S. 297-306, 1998 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP1497461A2 (de) * | 2002-04-15 | 2005-01-19 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Verfahren zum testen auf zellzyklusmodulatoren |
| EP1497461A4 (de) * | 2002-04-15 | 2007-06-06 | Rigel Pharmaceuticals Inc | Verfahren zum testen auf zellzyklusmodulatoren |
Also Published As
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|---|---|
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| WO2000046244A1 (de) | 2000-08-10 |
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