DE69635349T2

DE69635349T2 - Nukleotidsequenzen, proteine, medikamente und diagnoseagentien zur anwendung in krebsbehandlung

Info

Publication number: DE69635349T2
Application number: DE69635349T
Authority: DE
Inventors: Adam Telerman; Robert Amson; Daniel Cohen
Original assignee: Cerenis SA
Current assignee: Abionyx Pharma SA
Priority date: 1995-12-20
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2016-12-21
Also published as: CA2240449A1; WO1997022695A3; EP0868512B9; EP0868512B1; DE69635349D1; EP0868512A2; ATE307886T1; WO1997022695A2; JP2000502893A

Description

Die Erfindung betrifft den Nachweis von Genen, die an den molekularen Wegen der Tumorsuppression beteiligt sind, und die Verwendung der so nachgewiesenen Gene für die Behandlung von bestimmten genetisch bedingten Dysfunktionen, insbesondere Krebserkrankungen.
Die Erfindung wurde durch die Isolierung von cDNAs, welche während des durch das Suppressorgen p53 induzierten Apoptoseprozesses exprimierten oder reprimierten mRNAs entsprechen, möglich gemacht.
Eine globale Analyse der molekularen Ereignisse, welche im Verlauf des Zellzyklus während der Zellentwicklung und der zellulären Apoptose stattfinden, ist erforderlich, um die Bedeutung des Gens p53 in dem Prozess der Tumorsuppression oder, im Gegensatz dazu, der Kanzerisierung besser zu verstehen.
Die Transformation einer normalen Zelle zu einer Tumorzelle ist ein Prozess, der in mehreren Schritten abläuft und der eine Abfolge von molekularen Ereignissen erfordert. Auf physiologischer Ebene kommen diese Ereignisse in einer Unabhängigkeit der Tumorzelle gegenüber äußeren Signalen wie auch in einer internen Deregulation, welche zu einer unkontrollierten Vermehrung führt, zum Ausdruck.
Für diese sogenannte "maligne" Transformation sind zwei Gruppen von Genen verantwortlich, einerseits die Onkogene, andererseits die Suppressorgene oder Anti-Onkogene. Die Onkogene induzieren aufgrund ihrer Deregulation bei Krebs (welcher zumeist aus einer Mutation oder einer Translokation resultiert) ein positives Signal, welches die neoplastische Vermehrung begünstigen wird. Im Gegensatz dazu werden die Suppressorgene beispielsweise aufgrund von deren Deletion, des Fehlens von deren Expression durch Mutation des Promotors oder ferner von Mutationen, die die Struktur und die Funktion des Proteins modifizieren werden, bei Krebs nicht in der Lage sein, das Signal zu liefern, welches normalerweise diese abnormale Vermehrung bremsen müsste. Folglich trägt die Dysfunktion der Suppressorgene zu der neoplastischen Transformation bei.
Der Gegenstand der Erfindung ist die Isolierung von Genen, welche normalerweise eine Wirkung bei der Tumorsuppression aufweisen und denen es dann möglich sein wird, zu überleben und die etwaigen Dysfunktionen zu behandeln.
Die Isolierung dieser Gene erlaubt insbesondere, auf eine Gentherapie, welche in einer Ersetzung besteht, oder ebenso auf die Synthese von pharmakologischen, proteinartigen oder nicht-proteinartigen Mitteln, die direkt oder indirekt durch ihre Wirkung auf die Promotoren die Aktivierung und die Expression dieser Gene induzieren werden, oder ferner die Synthese von pharmakologischen Mitteln, die erlauben werden, die physiologische Wirkung dieser Suppressorgene nachzuahmen, zurückzugreifen.
Das Endziel besteht darin, entweder das Tumorwachstum zu inhibieren oder, noch besser, den Apoptoseprozess dieser Tumorzellen zu induzieren, d.h. die Tumorzellen dazu zu bringen, "Selbstmord zu begehen".
Die Erfindung betrifft den Nachweis von Genen, die an dieser Apoptose beteiligt sind. Tatsächlich weist jede Zelle in sich ein physiologisches Todesprogramm auf. Es handelt sich gleichfalls um einen physiologischen Prozess, der an der Entwicklung beteiligt ist, um die Homöostase des Körpers aufrechtzuerhalten und nicht abnormale zelluläre Proliferationen sich etablieren zu lassen, selbst wenn sie im übrigen keinen bösartigen Charakter haben.
Eines der bedeutendsten Suppressorgene, die an der Apoptose beteiligt sind, ist das Gen p53. In seiner normalen Funktion kontrolliert dieses Gen die Zellvermehrung und den Apoptoseprozess; insbesondere ist es dieses Gen, welches die Zellvermehrung blockiert und das den Apoptoseprozess induzieren muss, um die Entwicklung einer Krebserkrankung zu vermeiden. Es wurde beispielsweise nachgewiesen, dass hinsichtlich p53 nullizygote Mäuse viel empfindlicher gegenüber der Bildung von Tumoren waren. Es wurde gleichfalls die Tatsache nachgewiesen, dass bei Krebserkrankungen das Gen p53 sehr häufig verändert war und zu der Produktion von Proteinen führte, die nicht in der Lage waren, die Apoptose-Botschaft weiterzutragen.
Es ist diese Besonderheit, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt wurde.
Tatsächlich beruht die Erfindung auf der Feststellung, dass es nicht möglich ist oder dass es sich zumindest als sehr schwierig erweist, eine direkte Substitutionstherapie während einer Dysfunktion des p53-Gens auszuführen. Tatsächlich wird das mutierte p53, wie es dies bei Krebs ist, die physiologische Wirkung des normalen p53 zunichte machen.
Es war folglich erforderlich, zumindest zunächst, auf eine Substitutionstherapie, welche direkt auf der Ebene von p53 wirkt, zu verzichten.
Die Erfindung verfolgt folglich das Ziel, die abwärts von p53 befindlichen Gene zu untersuchen, um die zuvor erläuterte Schwierigkeit wie bei einem Bypass zu "umgehen".
Um die durch das normale p53 (Wildtyp-p53) aktivierten oder inhibierten Gene zu isolieren, führte man ein globales Screening der Expression der Gene in einer zu Apoptose induzierten Zelle und in der gleichen malignen Zelle, insbesondere in einer das normale p53 in seiner Funktion exprimierenden Zelle und in einer das mutierte p53, dessen Funktion onkogen ist, exprimierenden Zelle aus. Der Vergleich der exprimierten Gene (in den beiden Zelltypen exprimierte mRNAs) hat erlaubt, Gene nachzuweisen, die unterschiedlich exprimiert werden, d.h. die in einer der Zellen exprimiert werden, wohingegen sie dies in der anderen nicht werden (die Gene können aktiviert oder inhibiert werden).
Man leitet daraus leicht ab, dass diese Gene an dem Kanzerisierungsprozess beteiligt sind, in einem Falle durch deren Fehlen und in dem anderen Falle durch deren Anwesenheit.
Für diese Untersuchung der vorhandenen Unterschiede ist die eingesetzte Methode die 1992 von Liang und Pardee (Differential display of eucaryotic mRNA by mean of a polymerase chaine reaction) beschriebene Methode.
Bis heute war die Isolierung der an der Suppression beteiligten Gene ausgeführt worden entweder durch Positionsklonierung oder durch den Einsatz von doppelten Hybriden. Die erste Methode erlaubte, durch eine statistische Berechnung die höchste Wahrscheinlichkeit zu berechnen, wo auf chromosomaler Ebene ein Suppressorgen-Kandidat für eine ganz bestimmte Krebsart, vor allem jene von hereditärer Herkunft, sich befinden könnte. Das System von doppelten Hybriden erlaubt, nacheinander die Proteine zu isolieren, die mit einem gegebenen Gen Wechselwirken.
Der Ansatz für das Problem gemäß der Erfindung hat erlaubt, Sequenzen zu isolieren, die direkt mit einer Funktion in Verbindung stehen. Demzufolge sind im Gegensatz zu der zufallsgesteuerten Sequenzierung der EST die Sequenzen Sequenzen, deren Funktion bekannt ist und die an dem Apoptoseprozess, der durch das Suppressorgen p53 induziert wird, beteiligt sind.
Genauer wurde diese Methode bei einem Zellmodell, welches von Moshe Oren beschrieben worden ist, eingesetzt; es handelt sich um myeloische Tumorzellen von der Maus, die durch eine stabile Mutante des p53-Gens transfiziert worden sind. Tatsächlich ist die Expression dieses Gens wärmeempfindlich, d.h. unter Zellkulturbedingungen bei 37°C ist das produzierte Protein ein mutiertes Protein, d.h. dass dieses nicht die Rolle als Tumorsuppressor spielen kann und dass folglich die entsprechende Zelllinie sich in Form einer malignen Zelle entwickelt, wohingegen bei einer Temperatur von 32°C das exprimierte p53-Protein, wie das natürliche Protein, in der Lage ist, die Suppressorrolle zu spielen, und die entsprechende Zelllinie daran hindert, maligne zu werden.
Diese systematische Untersuchung hat erlaubt, die Gene nachzuweisen, die an der durch p53 induzierten Suppressionskaskade beteiligt sind.
Aus diesem Grunde haben die Erfinder neue Sequenzen und die diese umfassenden Gene nachgewiesen wie auch die Verwendung dieser Sequenzen im Bereich der Diagnostik wie im Bereich der Therapie, ebenso wie für die Realisierung von Modellen, welche dazu bestimmt sind, Antikrebsmittel zu testen.
Ihre Arbeiten betreffen die Sequenzen IND.SEQ. 1 bis 10 und deren Anwendung insbesondere bei der Suppression von Krebs wie auch bei der therapeutischen Nachsorge.
Außerdem haben sie gleichfalls ein humanes Gen identifiziert, welches an der durch p53 induzierten Suppressionskaskade beteiligt ist, wie auch die Verwendung der Sequenzen dieses Gens im Bereich der Diagnostik wie im Bereich der Therapie, ebenso wie für die Realisierung von Modellen, welche dazu bestimmt sind, Antikrebsmittel zu testen, wie auch deren Verwendung als antivirales Mittel.
Ihre Arbeiten haben sich so erstreckt auf eine Sequenz gemäß IND.SEQ 11, welche dem humanen Gen TSAP 3 oder HUMSIAH (Human Homologue of the Drosophila seven in absentia gene) entspricht, und deren Anwendung insbesondere bei der Suppression von Krebs wie auch bei der therapeutischen Nachsorge.
Unter "Sequenzen 1 bis 11" werden ebenso die Nukleotidsequenz, welche dem vollständigen Gen entspricht, wie Fragmente dieses Gens, insbesondere wenn sie ein äquivalente Protein wie jenes, das nachfolgend beschrieben wird, kodieren, verstanden.
Die Nukleotidsequenzen können ebenso DNA wie RNA oder Sequenzen, in denen bestimmte der Nukleotide nicht-natürlich sind, entweder um deren pharmakologische Eigenschaften zu verbessern oder um deren Identifizierung zu erlauben, sein.
Die unter (b) erwähnten Sequenzen (für die IND.SEQ 1 bis 11) sind im Wesentlichen die vollständigen oder partiellen komplementären Sequenzen (insbesondere für die zuvor aufgeführten Fälle).
Die Sequenzen (a) und (b) (für die IND.SEQ 1 bis 10) erlauben nicht nur den Zugang zu dem Mäuse-Gen, von dem sie stammen, sondern aufgrund von Homologie gleichfalls zu den entsprechenden humanen Genen.
Schließlich betrifft die Erfindung, wenn die Gene ein Protein kodieren, gleichfalls die Sequenzen, welche eben dieses Protein unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes, aber gleichfalls die äquivalenten Proteine, d.h. welche die gleichen Wirkungen erzeugen, insbesondere die Proteine mit Deletionen und/oder welche Punktmutationen unterzogen worden sind, kodieren.
Die oben erwähnten Sequenzen sind insbesondere die Sequenzen, die während der zellulären Apoptose induziert oder inhibiert werden, insbesondere jene, die durch p53 induziert werden.
Die Gene werden als TSAP oder "Tumor Suppressor Activated Pathway" eingruppiert und als TSAP 1 bis TSAP 8 und humanes TSAP 3 entsprechend den IND.SEQ 1 bis 8 bzw. 11 (HUMSIAH) bezeichnet und als TSIP oder "Tumor Suppressor Inhibited Pathway" eingruppiert und als TSIP 1 und TSIP 2 entsprechend den IND.SEQ 9 und 10 bezeichnet.
Die Merkmale der den IND.SEQ 1 bis 10 entsprechenden Sequenzen sind in der beigefügten Tabelle zusammengestellt.
Die den TSAP-Genen (einschließlich des humanen TSAP 3 oder HUMSIAH) entsprechenden Nukleotidsequenzen sind Sequenzen, welche während des Apoptoseprozesses exprimiert werden, wohingegen, wenn sie nicht exprimiert werden, der Onkogeneseprozess fortfährt. Es ist folglich interessant:

– eine jegliche Anomalie in dem entsprechenden Gen, welche zu einer größeren Anfälligkeit für eine Onkogenese führen kann, nachzuweisen und
– eine Ersetzungstherapie vorsehen zu können.

Man muss außerdem in Erinnerung rufen, dass diese Gene an anderen Prozessen als den onkogenen Prozessen beteiligt sein können; tatsächlich ist p53 gewissermaßen der Wächter über die Integrität des Genoms; unter diesen Bedingungen sind die TSAP- oder TSIP-Gene ohne Zweifel gleichermaßen an dieser Kontrollfunktion beteiligt; es ist folglich die Gesamtheit der möglichen Veränderungen des Genoms, denen die vorangegangene Detektion und Therapie zu verdanken sein können. Im Gegensatz dazu werden die TSIP-Gene während der Onkogenese und nicht während der Apoptose exprimiert; es ist hier folglich auch interessant, die etwaige Anomalie der TSIP zu detektieren und gleichfalls, eine Inhibitions/Blockierungstherapie vorzusehen.
Die eine Ersetzung beinhaltende Therapie oder Ersetzungstherapie könnte durch Gentherapie erfolgen, d.h. indem das TSAP-Gen mit den Elementen, die dessen Expression in vivo erlauben, eingeführt wird. Die Grundsätze der Gentherapie sind bekannt. Man kann spezielle, virale oder nicht-virale Vektoren, beispielsweise Adenoviren, Retroviren, Herpes-Viren oder Poxviren, einsetzen. Zumeist werden diese Vektoren in defekter Form eingesetzt, die als Expressionsvehikel von TSAP mit oder ohne Integration dienen sollen. Die Vektoren können gleichfalls synthetisch sein, d.h. virale Sequenzen nachahmen, oder ebenso aus nackter DNA oder RNA gemäß der insbesondere von der Firma VICAL entwickelten Technik bestehen.
In den meisten Fällen empfiehlt es sich, Screeningelemente vorzusehen, welche eine für Gewebe oder Organe spezifische Expression sicherstellen; tatsächlich ist es nicht möglich, ins Auge zu fassen, ein unkontrolliertes Apoptosephänomen zu aktivieren.
Die Expressionssysteme, um Proteine zu produzieren, können sowohl eukaryotische Systeme, wie die vorangegangenen Vektoren, als auch prokaryotische Systeme in Bakterienzellen sein.
Es wird der Nachweis einer Beteiligung von mehreren Genen an der Apoptose beschrieben; so kann die Überexpression des einen der Gene durch Gentherapie bei bestimmten von diesen lediglich zur Apoptose der Zellen, in denen bereits andere deregulierte Gene exprimiert werden, d.h von malignen Zellen führen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls als Arzneimittel eine Verbindung, welche die Inhibition der zellulären Expression von SEQ ID Nr. 10, wie sie zuvor beschrieben worden ist, wenn sie während der zellulären Apoptose inhibiert wird, nämlich TSIP 2, sicherstellt.
Es ist beispielsweise möglich, andere Ansätze als die Gentherapie vorzusehen, insbesondere die Verwendung von Nukleotidsequenzen in einer Sense- oder Antisense-Strategie, d.h. welche die Expression von TSIP 2 (SEQ ID Nr. 10) blockieren kann.
Man kann gleichfalls eine Strategie eines direkten Ersetzens durch Zugabe von inhibitorischen Antikörpern, welche TSIP 2 (SEQ ID Nr. 10) entsprechen, vorsehen.
Schließlich ist es möglich, die Verwendung von nicht-proteinartigen Molekülen, deren Aktivität sein wird, TSIP 2 zu inhibieren oder auch die Wirkung von dessen Expressionsprodukt zu blockieren, vorzusehen.
Diese Produkte können leicht an den modifizierten Zellen, die in den Beispielen beschrieben werden, getestet werden, indem die zu testenden Produkte der Zellkultur zugesetzt werden und indem das Auftreten des Apoptose-Phänomens detektiert wird. Im Rahmen der DNA-, RNA- oder Protein-Strategien werden die Produkte selbstverständlich abhängig von den Sequenzen, die beschrieben werden, hergestellt.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der vorangegangenen Arzneimittel als Antikrebs-Mittel.
Das Produkt des humanen TSAP 3-Gens (HUMSIAH) ist gleichfalls als antivirales Mittel nützlich, wie beim Lesen des Beispiels 2 ersichtlich wird.
Die Erfindung betrifft gleichfalls die Gesamtheit oder einen Teil von SEQ ID Nr. 10, welcher) als Nukleotidsonde oder als Amplifizierungsprimer einzusetzen ist, als Diagnose-Mittel für die Bestimmung der Krebs-Veranlagung, aber gleichfalls ein Antigen, welches der Gesamtheit oder einem Teil der durch die erfindungsgemäße Sequenz kodierten Proteine entspricht, als Diagnose-Mittel für die Bestimmung der Krebs-Veranlagung oder die Antikörper, insbesondere die entsprechenden monoklonalen Antikörper, gegebenenfalls nach einer Kultur.
Die Diagnose-Verfahren sind bekannt; es kann sich beispielsweise um Mikrosequenzierungstechniken der variablen Abschnitte nach Isolierung und etwaiger Amplifizierung oder um Detektionsverfahren vom RFLP-Typ oder insbesondere vom Typ einer einfachen Amplifizierung handeln. Die auf der Untersuchung von vorhandenen Unterschieden basierenden Techniken können insbesondere erlauben, den Unterschied zwischen dem normalen und abnormalen TSAP oder TSIP nachzuweisen.
Das humane TSAP 3-Gen (HUMSIAH) kann insbesondere isoliert werden, indem die PCR-Methode oder andere Amplifizierungsmethoden eingesetzt werden, indem die Struktur des Gens ausgenutzt wird. Es ist gleichfalls möglich, dieses Gen stückweise zu synthetisieren, sofern notwendig.
Schließlich haben die Erfinder eine Perfektionierung für die Methoden von Liang und Pardee (1) realisiert, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass man bei der Amplifizierung durch PCR eine schrittweise Verringerung ("touch down") ausführt, wie in Don et al. (2) beschrieben.
Andere Merkmale der Erfindung werden beim Lesen der nachfolgenden Beispiele, die insbesondere unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren erstellt worden sind, ersichtlich werden:
1 – Quantifizierung der unterschiedlichen Expression der mRNAs unter Einsatz des Imagers 1200 β. Hybridisierung mit den mRNAs, abgeleitet von LTR6-Zellen bei 37°C und LTR6-Zellen nach 4 h bei 32°C. Die Zahlen an der Ordinate von 0 bis 500 entsprechen der durch 0,15 mm detektierten Zählung und sind proportional zu dem Hybridisierungssignal.
C1: mRNA, welche gleichfalls unter Einsatz eines Klons ohne unterschiedliche Expression exprimiert wird;
C2: positive Kontrolle unter Verwendung von Cyclin G, und welche die Induktion der entsprechenden mRNAs bei 32°C zeigt;
MER-LTR: zeigt die Induktion dieser Sequenz bei 32°C;
TSAP 1 bis TSAP 8: unterschiedliche Expression der in den 4 ersten Stunden nach der Induktion der Apoptose aktivierten 8 mRNAs;
TSIP 1 und TSIP 2: unterschiedliche Expression der in den 4 ersten Stunden nach der Induktion der Apoptose inhibierten 2 mRNAs.
2 – Northern-Blot-Analyse
A: Hybridisierung mit der Sonde TSAP 3;
B: Hybridisierung mit der Sonde siah 1b von der Maus;
Bahnen 1 und 2: polyA+-mRNA von bei 37°C bzw. 32°C kultivierten myeloische Leukämie-Zellen M1 (Klon S6);
Bahnen 3 und 4: polyA+-mRNA von bei 37°C bzw. 32°C kultivierten LTR6-Zellen;
der Pfeil gibt die unterschiedliche Expression des 1,9 kb-Transkripts von TSAP 3 – siah 1 b aus der Maus an;
Untere Felder: GAPDH;
C: Gewebeverteilung unter Verwendung von TSAP 3 als Sonde;
1: Herz, 2: Gehirn, 3: Milz, 4: Lunge, 5: Leber, 6: Skelettmuskel, 7: Niere, 8: Hoden;
die Pfeile geben die Transkripte von 1,9 und 2,4 kb an;
Unteres Feld: β-Actin.
3 – Analyse der in situ-Hybridisierung mit der Sonde TSAP 3;
A: während 4 h bei 32°C inkubierte und mit einer TSAP 3-Antisinn-Sonde hybridisierte M1-Zellen;
B: während 4 h bei 32°C inkubierte und mit einer TSAP 3-Sinn-Sonde hybridisierte LTR6-Zellen;
C: bei 37°C inkubierte und mit einer TSAP 3-Antisinn-Sonde hybridisierte LTR6-Zellen;
D bis F: bei 32°C während 1, 2 bzw. 4 h kultivierte und mit einer TSAP 3-Antisinn-Sonde hybridisierte LTR6-Zellen;
der Balken in dem Feld A: 10 μm;
die Pfeile geben die Anhäufung der TSAP 3-mRNAs im Zytoplasma an.
4 – Vergleich zwischen der cDNA-Sequenz von TSAP 1 und der Phospholipose C beta 4 von der Ratte entsprechenden Nukleotidsequenz.
5 – Vergleich zwischen der cDNA-Sequenz von TSAP 2 und der dem in dem "Multiple Endocrine Neoplasia" (MEN 1)-Locus lokalisierten Zinkfinger-Protein (ZFM 1) entsprechenden Nukleotidsequenz.
6 – Vergleich zwischen der cDNA-Sequenz von TSAP 3 und der dem "Drosophila seven in absentia" (sina)-Gen entsprechenden Nukleotidsequenz.
7 – Vergleich zwischen dem Produkt der sina-Gene von verschiedenen Spezies, dem humanen (HUMSIAH), von der Maus (MMSIAH 1B) und aus Drosophila (DROSINA).
8 – Vergleich zwischen der cDNA-Sequenz von TSIP 2 und der cDNA-Sequenz des aus der Maus stammenden Transkripts S182 des AD3-Gens, welches an der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist.
MATERIALIEN UND METHODEN
Zellkulturen
Myeloische Leukämie-Zellen M1 (Klon S6) und M1-Zellen, die auf stabile Weise transfiziert worden sind mit einer temperaturempfindlichen Mutante val 135 p53 (LTR6) (3).
Diese Zellen werden auf RPMI 1640-Medium mit 10% FCS bei 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Für die Modifizierung der Temperatur werden die Kulturen in einen zweiten Brutschrank bei 32°C gestellt. Für alle im Rahmen dieser Untersuchung ausgeführten Assays werden die Zellen nach 12 und 24 h auf das Vorhandensein einer Apoptose hin getestet.
Untersuchung der unterschiedlichen cDNAs
Um die Tests unter experimentellen Standardbedingungen auszuführen und um eine totale Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erhalten, wurden die folgenden Modifikationen an dem Ursprungsprotokoll (1) vorgenommen.
Man setzt stets polyA+-mRNAs ein, welche zweimal an einer oligodT-Säule unter Verwendung von Fast Track (Invitrogen, San Diego, CA) gereinigt worden sind. Nach reverser Transkription (M-MLV Reverse Transkriptase, Gibco BRL) an 0,05 μg polyA+ unter Verwendung von 20 μM von jedem der dNTP (Boehringer-Mannheim) wird keinerlei hinzugegebenes dNTP zu der end gültigen PCR-Mischung zugesetzt. Vor der PCR (GeneAmp PCR system 9600, Perkin Elmer Cetus) wird ein "hot start" bei 94°C während 5 min ausgeführt. Die Proben werden in Eiswasser schnell abgekühlt. Es wird ein "touch down" (2) von 10 Zyklen von 50 bis 40°C ausgeführt (94°C 30 s–50°C 1 min–72°C 30 s), gefolgt von 35 Zyklen (94°C 30 s–40°C 1 min–72°C 30 s) und einer abschließenden Verlängerung von 5 min bei 72°C. Die Produkte der PCR werden auf 6%igen, nicht-denaturierenden Polyacrylamidgelen (4) aufgetrennt. Die Gele werden ohne Trocknung exponiert. Jede Darstellung der vorhandenen Unterschiede erfolgt, indem M1S6 und LTR6 bei 37°C und nach 4 h Inkubation der beiden Zelllinien bei 32°C verglichen werden.
Die Prozedur der Darstellung der vorhandenen Unterschiede wird in 3 unterschiedlichen Experimenten wiederholt, um eine perfekte Reproduzierbarkeit zu bestätigen.
Die unterschiedlich exprimierten Banden werden aus dem Gel ausgeschnitten, eluiert und erneut amplifiziert (1). Die PCR-Produkte werden unter Verwendung des TA-cloning-Systems (Invitrogen, San Diego, CA) subkloniert, indem den mitgelieferten Anweisungen gefolgt wurde.
Für jede Ligationsreaktion werden 10 rekombinante Klone unter Verwendung des automatischen ABI-Systems sequenziert.
Extraktion der RNAs, Analysen und Northern-Blot-Sonden
Die Gesamt-RNA wird mit Trizol (Life Technologies) extrahiert. Die polyA+-RNAs werden unter Verwendung des Kits OligotexdT (Qiagen, CA) präpariert. 30 μg Gesamt-RNA oder 2 μg polyA+-RNA werden auf einem 1% Agarose/1 × MOPS/2% Formaldehyd-Gel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran (Hybond N+, Appligene, Frankreich) transferiert, wie zuvor beschrieben (5). Die Northern-Blots werden mit mit ³²P markierten Sonden für die Inserts TSAP und TSIP hybridisiert und gewaschen, wie zuvor beschrieben (5). Um die Induktion der Wildtyp-p53-Funktion zu verifizieren, werden die Northern-Blots mit einer Cyclin G-Sonde (6) hybridisiert. Als Kontrolle für die aufgetragene mRNA-Menge werden die Blots mit einer GAPDH-Sonde hybridisiert. Unter identischen Bedingungen werden unterschiedliche Northern-Blots (Clontech, CA) verwendet und zur Kontrolle mit einer β-Aktin-Sonde hybridisiert. Die RT-PCR-Produkte für LTR6 werden amplifiziert unter Verwendung der folgenden siah 1b-Primer: 5'CAGTAAACCACTGAAAAACC3' und 5'CAAACCAAACCAAAACCAC3'. Das subklonierte PCR-Produkt wird als Kontrollsonde von siah 1b eingesetzt. Die Northern-Blots werden 10 Tage bei –80°C exponiert.
Slot-Blots
Die Reproduzierbarkeit der durch die Northern-Blot-Analysen erhaltenen Ergebnisse. Die Blots werden hergestellt (Bio-Rad, Hercules, CA), indem die PCR-Produkte (200 ng Zeta-Probe Blot ting Membranes, Bio-Rad, gemäß den Anweisungen des Herstellers) von TSAP-Klonen aufgetragen und mit einer mit ³²P markierten (Superscript II, Gibco-BRL, Life Technologies) cDNA-Sonde, entsprechend der RNA der LTR6-Zellen, die bei 37°C und dann 4 h bei 32°C inkubiert worden waren, hybridisiert werden. Das PCR-Produkt des Klons, welcher das Cyclin G enthält, wird gleichfalls auf die Membranen aufgetragen und als Positivkontrolle eingesetzt. Die Slot-Blots werden eine Nacht bei –80°C exponiert.
Quantitative Analyse der Bilder
Diese erfolgt unter Verwendung eines 1200 β-Imagers (Biospace Instruments, Paris, Frankreich) an den beiden Northern-Blots (für TSIP 1 und TSIP 2) und an den Slot-Blots für alle scDNA-Kontrollen und TSAP 1 bis 8. Für die in den Graphiken der 1 dargestellte quantitative Analyse zieht man eine konstante Zahl von jedem Peak ab. Diese Konstante wird berechnet, indem der Mittelwert des Grundrauschens in den Slots, die keine cDNA enthalten, gemessen wird. Die Ergebnisse des β-Imagers wurden erhalten, indem die Slot-Blots eine Nacht gezählt wurden und indem man diese durch Autoradiographie mit variablen Expositionszeiten bestätigte. Diese Autoradiogramme zeigen die gleichen relativen qualitativen Variationen zwischen den Aktivitäten bei 32°C und bei 37°C wie die mit dem β-Imager ausgeführten Messungen.
In situ-Hybridisierung (7, 8)
Die Zellen werden dreimal in einem Puffer aus Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, "cytospinned" und durch 4% Paraformaldehyd in PBS 10 min fixiert, dann in 70% Ethanol konserviert. Mit Digoxigenin-11-uridin-5'-triphosphat (DIG) und mit Biotin-11-UTP markierte RNA-Transkripte von TSAP 3 werden in den Analysen gemäß der zuvor beschriebenen Vorgehensweise (Boehringer-Mannheim) eingesetzt. Für die Detektion der mit dem hybridisierten Digoxigenin markierten Stämme werden die Scheiben in SAD-10 (10 nM anti-DIG-Antikörper vom Schaf, markiert mit Gold in einer Verdünnung von 1/1000, Biocell, Vereinigtes Königreich) inkubiert. Die Analyse erfolgt unter Verwendung von konfokaler Laser-Mikroskopie.
BEISPIEL 1
Die Untersuchung der vorhandenen Unterschiede der cDNAs durch die Methode von Liang und Pardee erlaubt, über ein sehr leistungsfähiges und wirkungsvolles Werkzeug (Tool) für die Detektion der Variationen bei der Expression von Genen zu verfügen. Nichtsdestotrotz empfiehlt es sich, das Ursprungsprotokoll zu modifizieren, wie dies zuvor angegeben worden ist, um bestimmte Reproduzierbarkeitsprobleme, die beobachtet werden, wenn man die Methode, wie sie ursprünglich beschrieben worden ist, anwendet, zu vermeiden.
Man konnte eine vollständige Reproduzierbarkeit nachweisen, wenn man in die PCR-Methode einen "hot start", gefolgt von einem "touch down", einführt.
Die unterschiedlich exprimierten Banden sind nach Isolierung und erneuter Amplifizierung nichtsdestotrotz oftmals durch Banden, welche von RNAs stammen, welche in den Regionen nahe der cDNA wandern, verunreinigt, wenn man diese Sonden direkt auf Northern-Blots einsetzt, was zu Fehlern führt. Die Produkte der zweiten PCR wurden folglich subkloniert und man ließ die Analysen der in Ermangelung eines Besseren verwendeten Northern-Blots von Rekombinanten mit einer einfachen Sonde ausführen. Die systematische Sequenzierung von wenigstens 10 rekombinanten Subklonen für jede ausgewählte Bande hat gezeigt, dass diese für die Selektierung der Klone von Interesse sehr wirksam war.
Das Gen p53 ist nach dem aktuellen Stand unserer Kenntnisse der Tumorsuppressor, der bei der größten Anzahl von Krebserkrankungen sehr unterschiedlicher Herkünfte mutiert ist, und es ist bereits zuvor gezeigt worden, dass die Verwendung der temperaturempfindlichen Mutante val-135-p53 sehr wichtige Informationen betreffend die Funktion des Wildtyp-p53 bei der Induktion entweder des Anhaltens der Zellvermehrung in der G-1-Phase oder der Initiation des Zelltod-Programms liefert.
Bis heute sind die molekularen Wege aufwärts und abwärts von p53 und welche zu der Tumorsuppression führen, noch wenig klar.
Bis heute wurde eine bestimmte Anzahl von Genen abwärts von p53 identifiziert; es handelt sich insbesondere um gadd 45, mdm 2, mck, "Mouse endogenous retrovirus" LTR, p21-waf und Cyclin G.
Die Erfindung hat erlaubt, die Existenz von 11 Genen nachzuweisen, die in den p53 in seiner aktiven Suppressor-Form exprimierenden Zellen oder ebenso in Tumorzellen, welche das nicht aktive p53-Gen exprimieren, unterschiedlich exprimiert werden.
Die 1 zeigt die Quantifizierung der Hybridisierungssignale entsprechend der unterschiedlichen Expression von 8 dieser Gene, die bei 32°C aktiviert sind, d.h. in denen die Wildtyp-p53-Funktion aktiviert ist und folglich zu der Apoptose der Zellen führt; diese Gene, die aktiviert sind, werden nachfolgend als TSAP (für "Tumor Suppressor Activated Pathway") bezeichnet; im Gegensatz dazu stellt man fest, dass in zwei Experimenten 2 bei 37°C exprimierte Gene bei 32°C teilweise inhibiert werden, was implizieren würde, dass sie während des programmierten Zell tods inhibiert werden; diese Gene werden als TSIP (für "Tumor Suppressor Inhibited Pathway") bezeichnet.
Die Analyse der Homologien der unterschiedlichen aktivierten Sequenzen von TSAP 1 bis TSAP 3 hat gezeigt, dass es sich hier um bereits bekannte Gene handelt. Im Gegensatz dazu zeigen die anderen TSAP 4- bis TSAP 8-cDNAs keinerlei signifikante Homologie zu bekannten Genen.
Hinsichtlich der TSIP 1-cDNA, die in ihrer Expression während der Apoptose gehemmt wird, zeigt diese keinerlei Homologie zu bekannten Genen.
Hinsichtlich der TSIP 2-cDNA, die gleichfalls in ihrer Expression während der Apoptose gehemmt wird, zeigt diese eine große Homologie mit dem Transkript S182 des AD3-Gens, welches an den Stoffwechselwegen der Alzheimer'-Krankheit beteiligt ist (Sherrington et al.) (8).
Es ist folglich möglich, auf die Stoffwechselwege der Alzheimer'-Krankheit einzuwirken, indem auf die p53-abhängigen Stoffwechselwege eingewirkt wird.
Die Erfindung hat folglich gleichfalls eine Verbindung, welche die zelluläre Expression von TSIP 2 sicherstellt, als Arzneimittel, welches für die Behandlung der Alzheimer'-Krankheit bestimmt ist, wie auch als diagnostisches Mittel für die Bestimmung der Veranlagung für die Alzheimer'-Krankheit, die Gesamtheit oder einen Teil der Sequenz von TSIP 2 zur Verwendung als Nukleotidsonde oder als Amplifizierungsprimer wie auch ein Antigen, welches der Gesamtheit oder einem Teil der durch TSIP 2 kodierten Proteine entspricht, oder die Antikörper, insbesondere die entsprechenden monoklonalen Antikörper, gegebenenfalls nach Kultur, zum Gegenstand.
Die Hypothese, die man bezüglich dieser in ihrer Expression durch das Wildtyp-p53 inhibierten Gene aufstellen kann, ist, dass sie onkogene Sequenzen kodieren können, die abwärts von dem Tumorsuppressionsprozess reguliert werden könnten, oder ferner, dass es sich um Strukturproteine oder Proteine des Zytoskeletts handelt, für welche die Regulation nachgeschaltet nach der Expression den Zelltod durch Apoptose begleitet.
TSAP 1 ist ein Homolog zu der Phospholipase C beta 4 von der Ratte. Die Sequenz von TSAP 1 weist 100% Identität mit der PLC zwischen den Nukleotiden 3967 und 3985, 82% zwischen den Nukleotiden 3986 und 4116 und 85% zwischen den Nukleotiden 4070 und 4220 auf (4). Die PLC ist dafür bekannt, dass sie an dem Signalweg der Rezeptoren der Tyrosinkinase beteiligt ist und dass sie die Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat zu Diacylglycerol und Inositol-1,4,5-triphosphat katalysiert. Gleichwohl legt die vorliegende Untersuchung nahe, dass die PLC bei der Apoptose mit p53-Vermittlung ein nachgeschaltet positioniertes Ziel darstellt.
TSAP 2 zeigt konservierte Sequenzen (92% Identität zwischen den Nukleotiden 259 und 299; 100% Identität zwischen den Nukleotiden 418 und 458 und 92% Identität zwischen den Nukleotiden 645 und 685) bezogen auf das Zink-Finger-Protein (ZFM 1), welches in dem Locus "Multiple Endocrine Neoplasia" (MEN 1) lokalisiert ist (5). MEN 1 ist eine dominante autosomale Störung, welche mit der Entwicklung von Tumoren, welche den Hypophysenvorderlappen und denjenigen der Nebenschilddrüse und die Langerhans'-Inseln befallen, in Verbindung steht. Es ist besonders interessant, nachgewiesen zu haben, dass ZFM und ein PLC-Isoenzym zugleich in der gleichen chromosomalen Region 11q13, welche das MEN1-Suszeptibilitätsgen enthält, kolokalisiert sind. Bei der Maus sind die homologen Regionen auf dem Chromosom 19B lokalisiert. Die Tatsache, festzustellen, dass TSAP 1 und TSAP 2 in Reaktion auf p53 aktiviert werden, kann nahe legen, dass diese Gene zu einem globaleren Weg der Tumorsuppression gehören und dass p53 mit MEN 1 kooperieren kann.
TSAP 3 ist identisch mit Siah 1b. Dieses Gen ist das Homolog des "Drosophila seven in absentia" (sina)-Gens bei den Vertebraten. Der beschriebene Klon weist 94% Identität mit dem Homolog aus der Maus (Nukleotide 1496 bis 1634) auf (6). Durch Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer TSAP 3-Sonde konnte man eine unterschiedliche Expression einer mRNA von 1,9 kb dieses Gens detektieren (2A). Dies wird bestätigt unter Verwendung einer zweiten Sonde, welche der gleichen Region der beschriebenen siah 1b-Sequenz entspricht (2B). Die 2C zeigt die Gewebeverteilung dieses Gens unter Verwendung einer TSAP 3-Sonde, die zugleich die mRNA von 1,9 und von 2,4 kb nachweist, was den zuvor erwähnten Ergebnissen, wenn eine siah-Sonde eingesetzt wird, entspricht. Die in situ-Hybridisierung zeigt, dass die mRNA von TSAP 3 1 h nach der Induktion der Apoptose schnell induziert wird (3D). Deren Expression nimmt nach 2 und 4 h zu (3E und 3F). In den Zellen, die in die Mitose eingetreten sind, wird keinerlei Signal detektiert.
Carthew und Rubin haben gezeigt, dass "seven in absentia" für die Entwicklung des Auges der Drosophila erforderlich ist. Andererseits zeigen Mutanten dieses Gens bei Drosophila eine viel allgemeinere Rolle im Rahmen der Entwicklung. Das Homolog aus der Maus wird in zwei Gruppen siah 1 und siah 2 unterteilt und diese Proteine zeigen ein bezogen auf "Drosophila seven in absentia" ganz und gar ungewöhnliches Konservierungsausmaß.
Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass TSAP 3/siah 1b beim programmierten Zelltod in den durch das Tumorsuppressorgen p53 induzierten M1-Zellen aktiviert ist. Da dieses Gen ein nukleäres Zink-Finger-Protein kodiert, könnte es ein regulierend wirkender Transkriptionsfaktor sein, der abwärts von dem p53-Signal wirksam wird. Die Ergebnisse zeigen gleichfalls eine direkte Verbindung zwischen den Genen, welche bei Drosophila die Entwicklung betreffen, und einem Hauptweg der Tumorsuppression.
BEISPIEL 2
Unter Verwendung des durch Analyse von vorhandenen Unterschieden bei den mRNAs erhaltenen cDNA-Fragments aus der Maus (TSAP 3), welches oben beschrieben worden ist, wurde eine Sonde gebildet, um aus einer humanen cDNA-Bibliothek ein 1,1 kb-Fragment zu isolieren, welches dann durch eine RACE-PCR bis zu der vollständigen kodierenden Region verlängert worden ist.
Die 7 zeigt die cDNA und die Aminosäuresequenz des humanen sina-Gens (TSAP 3).
Diese Sequenz kodiert ein Protein von 282 Aminosäuren mit einem C3HC4-Zinkfingermotiv. Dieses Protein weist gleichfalls Analogien zu Proteinen, die in der Lage sind, an RNA zu binden, auf. Die Aminosäuresequenz ist zwischen Drosophila, der Maus und dem humanen Gen sehr stark konserviert (7).
Die Gewebeverteilung gibt an, dass das humane sina ubiquitär exprimiert wird und eine mRNA von 2,3 kb kodiert und in der Placenta existiert ein zusätzliches Transkript von 2,5 kb.
Unter Analyse der YACs von CEPH und der BAC-Bibliotheken durch PCR unter Verwendung der spezifischen humanen sina-Primer konnte man 8 YACs (350–1000 kb) und 2 BACs (100 und 125 kb) isolieren.
Die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) unter Verwendung der YAC- und BAC-Klone zeigt, dass das "seven in absentia" auf dem Chromosom 16q12–13 lokalisiert ist, d.h. in einer Region, welche die Tumorsuppressorgen-Kandidaten bei verschiedenen Krebserkrankungen, insbesondere: Brustkrebs (9), Wilms-Tumor (10–12), Laurence-Moon-Bardet-Biedl-Syndrom (13), Beckwith-Wiedemann-Syndrom (14), enthält.
Wie in der französischen Patentanmeldung Nr. 95 15 146 angegeben wurde, wurde festgestellt, dass stabile Transfektanten von M1-Mäusezellen mit dem temperaturempfindlichen mutierten p53 die Aktivierung von "seven in absentia" nach Induktion der Apoptose bei 32°C zeigten. An gesichts der Tatsache, dass das TSAP 3 aus der Maus in einem Modell von durch das p53-Gen induzierter Apoptose isoliert worden ist, war es logisch, die Analyse des TSAP 3-Gens (HUMSIAH) in einem physiologischen humanen Apoptosemodell zu vertiefen.
Dieses Modell wird im Darm beschrieben, wo die Zellen vom Boden der Krypte in Richtung der apikalen Region der Zotten wandern, wo sie durch Apoptose sterben, bevor sie in das Lumen abgestoßen werden. Diese in Apoptose befindlichen Zellen werden spezifisch durch die TUNEL-Technik markiert.
Andererseits sind die gleichen Zellen bei einer in situ-Hybridisierung hinsichtlich des TSAP 3-Gens (HUMSIAH) bei der physiologischen Apoptose beim Menschen positiv.
Schließlich wurde, um die Beteiligung des humanen TSAP 3-Gens bei der Tumorsuppression zu untersuchen, ein Modell verwendet, welches auf der Gesamtheit der Gene anstatt auf einem einzelnen Gen basiert. Dieses Modell beruht auf den biologischen Eigenschaften des Parvovirus H-1.
Sehr umfassende Untersuchungen in diesem Gebiet haben im Verlauf der letzten 20 Jahre gezeigt, dass das Parvovirus präferentiell die Tumorzellen tötet, wohingegen es deren normales Gegenstück verschont.
Um ein Modell auszuarbeiten, wurde die folgende Hypothese aufgestellt: wenn es möglich wäre, ausgehend von einem Tumor, welcher gegenüber der zytopathischen Wirkung des Parvovirus H-1 empfindlich ist, die Zellen, die resistent sind, zu selektieren, könnte diese Resistenz auf eine Veränderung von deren malignem Phänotyp zurückzuführen sein. Dies konnte für die KS-Zellen, die ausgehend von humanen K562-Erythroleukämiezellen selektiert worden sind, gezeigt werden. Wohingegen die K562-Ausgangszellen gegenüber der zytopathischen Wirkung des Parvovirus H-1 empfindlich sind, sind die KS-Zellen ihrerseits resistent. Diese resistenten Zellen exprimieren erneut den Wildtyp von p53 und haben einen zugleich in vitro wie auch in vivo supprimierten Phänotyp.
Um diese Beobachtungen an anderen Zellen zu bestätigen, wurden ausgehend von einem Monoklon einer humanen U937-Monozytenleukämie die Tochterzellen US3 und US4 selektiert. Diese Klone sind gegenüber der zytopathischen Wirkung der H-1-Parvoviren resistent und zeigen in vivo eine Reversion des malignen Phänotyps. Die Analyse von Oberflächenmarkern für 20 Zellen zeigt an, dass es im Differenzierungsstadium zwischen U937 und den US-Klonen keine Verschiebung gibt, was anzeigt, dass die Suppression des malignen Phänotyps nicht auf eine terminate Differenzierung zurückzuführen ist.
Weder die K562-Zellen noch die U937-Zellen exprimieren p53. Im Gegensatz zu den KS-Zellen, die p53 erneut exprimieren, exprimieren die Zellen US3 und US4 p53 nicht erneut. Gleichwohl konnte die Tatsache nachgewiesen werden, dass die US3- und US4-Zellen bezogen auf die malignen U937-Ausgangszellen die Aktivierung von WAF-1 zeigten. Eine solche Aktivierung von WAF-1 bei einem von p53 unabhängigen alternativen Weg war zuvor beschrieben worden und die aktuellen Ergebnisse zeigen, dass die Klone US3 und US4 anscheinend diesen alternativen WAF-1-Weg benutzen.
Das sina-Gen wird aktiviert durch den p53-Wildtyp, welcher in den M1-Zellen induzierbar ist ebenso wie in den KS-Zellen, die den p53-Wildtyp erneut exprimieren.
Wohingegen die U937-Ausgangszellen die sina-mRNA sehr schwach exprimieren, ist diese in den Tochterklonen US3 und US4, die eine Reversion von deren malignem Phänotyp aufweisen und die erneut p21^waf-1 exprimieren, aktiviert.
Interessanterweise ist sina in den Zellen, die apoptotisch werden, aktiviert, wie dies durch eine doppelte Markierung unter Verwendung einer sina-Sonde für eine in situ-Hybridisierung kombiniert mit einem TUNEL-Assay gezeigt wird.
Dies erlaubt, zu zeigen, dass das humane sina-Gen, das in der Phylogenie sehr stark konserviert ist, eine Rolle bei der Apoptose und der Tumorsuppression spielt.
Noch wichtiger befindet sich sina an der Kreuzung der Wege von p53 und von WAF-1.
Außerdem konnte unter Verwendung des Modells von U937 und US3 und US4 eine funktionale Verbindung für die Suppressormoleküle unter Verwendung eines globalen biologischen Modells, welches den Vergleich zwischen den malignen Ausgangszellen und den direkt abgeleiteten Tochterzellen auf molekularer Ebene erlaubt, gezeigt werden. Diese Experimente zeigen, dass es nicht notwendig ist, die spezifischen humanen Tumorsuppressorgene derart zu transferieren, dass sie diesen den Suppressor-Phänotyp verleihen, sondern dass die Tumorreversion unter der Kontrolle eines Regulationssystems, welches in dem genetischen Material der Tumorzellen stets vorhanden ist, obgleich es notwendig sein wird, dieses zu reaktivieren, steht. TABELLE MERKMALE DER KLONE

* Die Zahlen und die Sequenzen der 5'-Primer entsprechen jenen, die von Bauer et al. (4) angegeben worden sind.
mRNA der Phospholipase C-beta 4 aus der Ratte (RATPHOSCB)
§ humane mRNAs (HUMMEN1C; HUMZFM1C; HUMZFM1A, HUMMEN1A)
✝ siah 1B-mRNA (MMSIAH1B)
^ë AD3, S182-mRNA-Transkript aus der Maus (humanes S182-mRNA-Homolog) (Sherrington et al.)

BIBLIOGRAPHISCHE REFERENZEN

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(15) Sherrington et al., Nature, Band 375, S. 754–760 (1995).

Claims

Verwendung einer Verbindung, die in der Lage ist, die Expression von SEQ ID Nr. 10 zu hemmen, ausgewählt in der Gruppe, umfassend eine Antisinn-Sequenz von SEQ ID Nr. 10 und einen gegen das durch SEQ ID Nr. 10 kodierte Protein gerichteten monoklonalen Antikörper, für die Herstellung eines Arzneimittels, welches für die Behandlung von Krebserkrankungen bestimmt ist.
Verwendung von Zellen, die durch einen Vektor für eine zelluläre Expression von SEQ ID Nr. 10 transformiert sind, für das Screening von antineoplastischen Arzneimitteln.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein viraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der virale Vektor von einem Adenovirus, einem Retrovirus, einem Herpes-Virus oder einem Poxvirus stammt.
Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Vektor mit nackter Nukleinsäure ist.
In vitro-Verwendung der Gesamtheit oder eines Teils von SEQ ID Nr. 10 als Nukleotidsonde oder als Amplifizierungsprimer für die Bestimmung der Veranlagung für und die Verfolgung von Krebserkrankungen.
In vitro-Verwendung eines gegen das durch SEQ ID Nr. 10 kodierte Protein gerichteten Antikörpers für die Bestimmung der Veranlagung für und die Verfolgung von Krebserkrankungen.