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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das als Indikator in der
Prophylaxe, Diagnose und Behandlung bei Erkrankungen bei Menschen
nützlich
ist. Genauer gesagt betrifft es u.a. neue menschliche Gen-Analoge
zu bekannten Ratten-, Maus-, Hefe-, Nematoden- und bekannten menschlichen
Genen und ist bei der cDNA-Analyse, der Kartierung der cDNA des
auf dem Chromosom und der funktionalen Analyse der cDNA in der Gendiagnostik
unter Verwendung dieses Gens, und bei der Entwicklung eines neuen
therapeutischen Verfahrens brauchbar.
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Technischer Hintergrund
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Die
genetische Information von Lebewesen ist als Sequenzen (DNA) aus
vier Basen, d.h. A, C, G und T, angehäuft, welche in dem Zellnuclei
vorhanden ist. Diese genetische Information ist bei jedem individuellen Lebewesen
zur Konservierung der Art und der Ontogenese konserviert worden.
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Im
Fall des Menschen wird vermutet, daß die Anzahl dieser Basen ungefähr 3 Billionen
(3 × 109) beträgt,
und vermutlich gibt es 50 bis 100 000 Gene darin. Diese genetische
Information dient der Bewahrung biologischer Phänomene, insofern als regulatorische
Proteine, strukturelle Proteine und Enzyme über den Weg hergestellt werden,
daß mRNA
von einem Gen (DNA) transkribiert wird und dann in ein Protein translatiert wird.
Abnormalitäten
in diesem Weg vom Gen zur Proteintranslatierung werden als verantwortlich
für Abnormalitäten der
lebenserhaltenden Systeme angesehen, beispielsweise bei der Zellproliferation
und -differenzierung, und sind daher verantwortlich für zahlreiche
Erkrankungen.
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Als
Ergebnis von Genanalysen, die bisher durchgeführt wurden, sind eine Anzahl
an Genen, von denen erwartet wurde, daß sie als nützliche Materialien bei der
Medikamentenentwicklung dienen, gefunden wurden, beispielsweise
Gene für
zahlreiche Rezeptoren wie den Insulin-Rezeptor und LDL-Rezeptor,
Gene die an der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt
sind und Gene für
Stoffwechselenzyme wie Proteasen, ATPase und Superoxiddismutasen.
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Jedoch
sind die Analysen der menschlichen Gene und die Untersuchungen der
Funktionen der Gene, die analysiert wurden, und der Beziehungen
zwischen den Genen, die analysiert wurden, und der zahlreichen Erkrankungen
gerade begonnen worden und viele Punkte bleiben noch unbekannt.
Weitere Analysen der neuen Gene, die Analysen der Funktionen davon,
die Studien der Beziehung zwischen den analysierten Genen und Erkrankungen,
und die Untersuchungen der Anwendung dieser Gene, die analysiert
wurden, auf Gendiagnostik oder beispielsweise medizinische Zwecke
werden daher auf dem jeweiligen Fachgebiet gewünscht.
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Wenn
ein neues menschliches Gen, das oben erwähnt wurde, bereitgestellt werden
kann, wird es möglich
sein, dessen Expressionsniveau in jeder Zelle zu analysieren, und
dessen Struktur und die Funktion, und durch die Analyse des Expressionsproduktes
und andere Studien kann es möglich
werden, die Pathogenese einer Erkrankung, die hiermit verbunden
ist, zu entschlüsseln,
beispielsweise eine genetische Erkrankung oder Krebs oder beispielsweise
die Diagnose und Behandlung dieser Erkrankung. Es ist ein Ziel der
vorliegenden Erfindung ein solches neues Gen des Menschen bereitzustellen.
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Um
das obige Ziel zu erreichen, haben die vorstelligen Erfinder intensive
Untersuchungen durchgeführt
und die unten erwähnten
Befunde erzielt. Auf der Grundlage davon ist die vorliegende Erfindung
vollendet worden.
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Offenbarung der Erfindung
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Das
bedeutet, daß die
vorstelligen Erfinder cDNAs synthetisiert haben, die auf mRNAs beruht,
die aus zahlreichen Geweben extrahiert wurde, einschließlich des
menschlichen fötalen
Hirns, adulter Blutgefäße und der
Plazenta, sie haben Bibliotheken durch Inserieren derselben in Vektoren
hergestellt, sie haben Kolonien von Escherichia coli, die mit diesen
Bibliotheken transformiert sind, ermöglicht sich auf Agarmedium
zu bilden, sie haben Kolonien zufallsgemäß herausgepickt und sie in
96 Well-Mikroplatten überführt und
eine große
Anzahl an E. coli-Klonen registriert, die menschliche Gene enthalten.
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Jeder
so registrierte Klon wurde in kleinem Maßstab kultiviert, die DNA wurde
extrahiert und gereinigt, und Vier-Basen-spezifische Terminationsextensionsreaktionen
wurden durchgeführt,
indem das Didesoxykettenabbruchverfahren unter Verwendung der cDNA,
die als Matrize extrahiert worden war, durchgeführt wird, und die Basensequenz
des Gens wurde vom 5'-Terminus
aus gesehen über
ungefähr
400 Basen unter Verwendung eines automatischen DNA-Sequenziergeräts bestimmt.
Auf Grundlage der so erhaltenen Basensequenzinformation, wurde ein
neues Familien-Gen, das analog zu bekannten Genen eines Tieres und
einer Pflanzenspezies, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Nematoden,
Mäusen
und Menschen ist, gesucht.
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Das
Verfahren der oben erwähnten
cDNA-Analyse wird detailliert in der Literatur von Fujiwara, einem der
vorstelligen Erfinder [Fujiwara, Tsutomu, Saibo Kogaku (Cell Engineering),
14, 645-654 (1995)] beschrieben.
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In
dieser Gruppe gibt es neue Rezeptoren, DNA-bindenden Domänenhaltige
Transkriptions-regulierende Faktoren, Signalübermittlungssystemfaktoren,
Stoffwechselenzyme usw. Auf Grundlage der Homologie des neuen Gens
der vorliegenden Erfindung, das durch Genanalyse gewonnen wurde,
zu Genen, die dazu analog sind, kann das Produkt des Gens, d.h.
die Funktion des Proteins ungefähr
durch Analogie abgeschätzt werden.
Außerdem
können
Funktionen wie die Enzymaktivität
und die Bindungsfähigkeit
durch Inserieren des Kandidatengens in einen Expressionsvektor untersucht
werden, um eine Rekombinante zu ergeben.
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Erfindungsgemäß wird ein
neues menschliches Gen bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß es
eine Nukleotidsequenz enthält,
die eine Aminosäuresequenz
codiert, welche in SEQ ID NO:28, 31 definiert ist, und ein menschliches
Gen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Nukleotidsequenz enthält, die
durch die SEQ ID NO:29, bzw. 32 definiert wird, welche jeweils für die oben
erwähnte
Aminosäuresequenz codieren,
und ein neues menschliches Gen, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß es
die Nukleotidsequenz hat, die in SEQ ID NO:30 und 33 angegeben ist.
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Die
hierin verwendeten Symbole zur Angabe der Aminosäuren, Peptide, Nukleotide,
Nukleotidsequenzen usw. sind solche, die von IUPAC und IUB oder
in den "Richtlinien
zum Entwurf von Beschreibungen etc., einschließlich der Nukleotidsequenzen
oder Aminosäuresequenzen" (herausgegeben vom
japanischen Patentamt) empfohlen sind, oder solche, die in dem relevanten
Fachgebiet konventioneller Weise verwendet werden.
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Als
spezifische Beispiele eines solchen Gens der vorliegenden Erfindung
können
Gene erwähnt
werden, die von der DNA-Sequenz der Klone abgeleitet werden, die
bezeichnet werden als "Gen-428B12", welche hierin später in den
Beispielen 1 bis 11 gezeigt werden. Die entsprechenden Nukleotidsequenzen
sind in der Sequenzliste gezeigt.
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Diese
Klone haben einen offenen Leserahmen, welcher Nukleotide (Nukleinsäuren) umfaßt, welche jeweils
die Aminosäuren
codieren, die in der Sequenzliste gezeigt sind. Ihre Molekulargewichte
wurden als die Werte, die nachfolgend hier in den entsprechenden
Beispielen gezeigt sind, berechnet. Nachfolgend werden die menschlichen
Gene manchmal unter der Bezeichnung verwendet, die in den Beispielen
1, 2 und 9 verwendet werden.
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Nachfolgend
wird das menschliche Gen der vorliegenden Erfindung im weiteren
Detail beschrieben.
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Wie
oben erwähnt
wurde, ist jedes menschliche Gen der vorliegenden Erfindung unter
anderem analog zu Genen der Ratte, Maus, Hefe, Nematoden und bekannten
menschlichen Genen, und kann in der Genanalyse des Menschen auf
Grundlage der Information über
diese Gen-Analoga, und beim Untersuchen der Funktion des analysierten
Gens und der Beziehung zwischen dem analysierten Gen und einer Erkrankung
benutzt werden. Es ist möglich
dieses Gen in der Gendiagnostik der Erkrankung, die hiermit assoziiert
ist, zu verwenden, und bei Untersuchungen zur Nutzung dieses Gens
für medizinische
Zwecke.
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Das
erfindungsgemäße Gen wird
in Form der einzelsträngigen
DNA-Sequenz dargestellt,
die in SEQ ID NO:29 gezeigt ist. Es ist anzumerken, daß die vorliegende
Erfindung jedoch auch eine DNA-Sequenz einschließt, die komplementär zu einer
derartigen einzelsträngigen
DNA-Sequenz ist sowie einen Bestandteil, der beide umfaßt.
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Das
erfindungsgemäße Gen ist
nicht hierauf beschränkt,
sondern kann natürlich
auch eine DNA-Sequenz haben, in der die Codons zufallsgemäß ausgewählt werden
und für
die entsprechenden Aminosäurereste
kombiniert werden. Die Codon-Auswahl kann in konventioneller Weise
durchgeführt
werden, beispielsweise indem die Codon-Benutzungshäufigkeiten
in dem zu verwendenden Wirt in Betracht gezogen werden [Nucl. Acids.
Res. 9, 43-74 (1981)].
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Das
erfindungsgemäße Gen schließt weiter
DNA-Sequenzen ein, die für
funktionale Äquivalente
codieren, die durch teilweise Aminosäure- oder Aminosäuresequenz-Substituierung,
-Deletion oder -Addition von der Aminosäuresequenz abstammen, die oben
erwähnt
wurde. Diese Polypeptide können
durch spontane Modifizierung (Mutation) hergestellt werden, oder
sie können
durch posttranslationale Modifizierung gewonnen werden oder indem
das natürliche
Gen (der vorliegenden Erfindung) durch eine Technik der rekombinanten Genetik
modifiziert wird, beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese
[Methods in Enzymology 154, S. 350, 367-382 (1987); ibid. 100, S.
468 (1983); Nucleic Acids Research 12, S. 9441 (1984); Zoku Seikagaku Jikken
Koza (Sequel to Experiments in Biochemistry) 1, "Idensi Kenkyu-ho (methods in Gene Research)
II", herausgegeben
von the Japan Biochemical Society, S. 105 (1986)), oder durch das
Synthetisieren mutierter DNAs durch chemische Synthesetechniken,
beispielsweise das Phosphotriester-Verfahren oder die Phosphoamidit-Methode
[J. Am. Chem. Soc., 89, S. 4801 (1967); ibid. 91, S. 3350 (1969);
Science 150, S. 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, S. 1859 (1981);
ibid. 24, S. 245 (1983)] oder durch Verwendung von Techniken, die
oben erwähnt
wurden, in Kombination.
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Das
Protein, das durch das erfindungsgemäße Gen codiert wird, kann leicht
und stabil durch die Verwendung des Gens exprimiert werden, beispielsweise
durch Inserieren desselben in einen Vektor zur Verwendung in einem
Mikroorganismus, und durch Kultivierung des so transformierten Mikroorganismus.
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Das
durch die Verwendung des Gens der vorliegenden Erfindung gewonnene
Protein kann in der Herstellung spezifischer Antikörper verwendet
werden. In diesem Fall kann das Protein, das in großen Mengen durch
rekombinante Gentechniken die oben erwähnt wurden herstellbar ist,
als Bestandteil verwendet werden, um als Antigen zu dienen. Der
gewonnene Antikörper
kann polyklonal oder monoklonal sein und kann vorzugsweise bei der
Reinigung, in einem Test, bei der Unterscheidung oder Identifizierung
des entsprechendes Proteins verwendet werden.
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Das
erfindungsgemäße Gen kann
leicht auf Grundlage der Sequenzinformation, die hier beschrieben sind,
unter Verwendung von allgemein rekombinanten Gentechniken hergestellt
werden [cf. z.B. Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Koza, "Idenshi Kenkyu-ho
I, II und III",
herausgegeben von the Japan Biochemical Society (1986)].
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Dies
kann beispielsweise durch Auswählen
eines gewünschten
Klons aus einer menschlichen cDNA-Bibliothek erreicht werden (hergestellt
in konventioneller Weise aus passenden Zellen, mit einem Ursprung,
in dem das Gen exprimiert wird) indem eine Sonde oder ein Antikörper verwendet
wird, der für
das Gen der vorliegenden Erfindung spezifisch ist [z.B. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)].
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Die
ursprünglichen
Zellen können
in dem oben erwähnten
Verfahren verwendet werden, und sind beispielsweise Zellen oder
Gewebe, in denen das fragliche Gen exprimiert wird, oder kultivierte
Zellen, die hiervon abstammen. Die Trennung der Gesamt-RNA, die
Auftrennung und Reinigung der mRNA und die Umwandlung (Synthese
von) cDNA, deren Klonierung usw. kann durch konventionelle Verfahren
durchgeführt
werden. cDNA-Bibliotheken sind ebenfalls kommerziell erhältlich und
solche cDNA-Bibliotheken, beispielsweise zahlreiche cDNA-Bibliotheken,
die von Clontech Lab. Inc. erhältlich
sind, können
ebenfalls in dem oben erwähnten Verfahren
verwendet werden.
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Die
Durchmusterung nach dem erfindungsgemäßen Gen in diesen cDNA-Bibliotheken kann
unter Verwendung des oben erwähnten
konventionellen Verfahrens durchgeführt werden. Diese Durchmusterungsverfahren
schließen
beispielsweise das Verfahren ein, das das Auswählen eines cDNA-Klons durch
immunologisches Durchmustern unter Verwendung eines spezifischen
Antikörpers
für das
produzierte Protein der entsprechenden cDNA ein, die Technik der
Plaque- oder Koloniehybridisierung unter Verwendung von Sonden, die
selektiv an die gewünscht
DNA-Sequenz binden, oder eine Kombination daraus. Im Hinblick auf
die hier zu verwendende Sonde, wird im allgemeinen eine DNA-Sequenz,
die chemisch auf der Grundlage der Information synthetisiert wurde,
die über
die erfindungsgemäße DNA-Sequenz
verfügbar
ist, verwendet. Es ist natürlich möglich das
Gen der vorliegenden Erfindung, oder Fragmente davon, als Sonde
zu verwenden.
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Außerdem können ein
Sense-Primer und ein Antisense-Primer, die auf Grundlage der Information über die
Teilaminosäuresequenz
eines natürlichen
Extrakts entworfen werden, welcher aus Zellen oder einem Gewebe
isoliert oder gereinigt wird, als Sonden zum Durchmustern verwendet
werden.
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Um
das Gen der vorliegenden Erfindung zu erhalten, kann die Technik
der DNA/RNA-Amplifizierung durch das PCR-Verfahren [Science 230,
1350-1354 (1984)] erwähnt
werden. Insbesondere, wenn die cDNA voller Länge kaum aus der Bibliothek
zu gewinnen ist, können
das RACE-Verfahren (rapid amplification of cDNA ends; Jikken Igaku
(Experimental Medicine), 12(6), 35-38 (1994)], insbesondere das
5'-RACE-Verfahren [Frohman,
M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)] vorzugsweise
verwendet werden. Die Primer, die in einem solchen PCR-Verfahren
zu verwenden sind, können
entsprechend auf der Grundlage der Sequenzinformation des erfindungsgemäßen Gens
entworfen werden, die hier offenbart ist, und sie können durch
ein konventionelles Verfahren synthetisiert werden.
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Das
amplifizierte DNA/RNA-Fragment kann isoliert und gereinigt werden,
indem ein konventionelles Verfahren, das oben erwähnt wurde,
verwendet wird, zum Beispiel die Gelelektrophorese.
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Die
Nukleotidsequenz des so erhaltenen erfindungsgemäßen Gens oder irgendeines der
zahlreichen DNA-Fragmente kann durch ein konventionelles Verfahren
bestimmt werden, zum Beispiel das Didesoxyverfahren [Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] oder durch das Maxam-Gilbert-Verfahren [Methods in
Enzymology, 65, 499 (1980)]. Eine derartige Nukleotidsequenzbestimmung
kann ebenfalls leicht unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen
Sequenzierkits durchgeführt
werden.
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Wenn
das erfindungsgemäße Gen verwendet
wird, und konventionelle Techniken der rekombinanten DNA-Technologie
[siehe z.B. Science, 224, S. 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res.
Comm., 130, S. 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, S. 5990
(1983) und die oben zitierten Referenzen] befolgt werden, kann ein
rekombinantes Protein gewonnen werden. Genauer gesagt kann dieses
Protein durch Herstellen einer rekombinanten DNA hergestellt werden,
was ermöglicht,
das erfindungsgemäße Gen in
Wirtszellen zu exprimieren, es in Wirtszellen für die Transformation derselben
einzuschleusen und die erhaltenen Transformanten zu kultivieren.
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In
diesem Fall können
die Wirtszellen eukaryontisch oder prokaryontisch sein. Die eukaryontischen Zellen
schließen
Wirbeltierzellen, Hefezellen usw. ein., und die Wirbeltierzellen
schließen
ein, sind aber nicht beschränkt
auf, Affenzellen, die als COS-Zellen bezeichnet werden [Cell, 23,
175-182 (1981)], Chinesische Hamster-Quarzellen und Dihydrofolatreduktase-defiziente
Zelllinien die davon abstammen [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77,
4216-4220 (1980)] und ähnliche,
die häufig
verwendet werden.
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Hinsichtlich
des Expressionsvektors, der in Wirbeltierzellen zu verwenden ist,
kann im allgemeinen ein Expressionsvektor mit einem Promotor, der
stromaufwärts
des zu exprimierenden Gens lokalisiert ist, RNA-Spleiß-Stellen,
eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptions-Terminierungs-Sequenz
verwendet werden. Dieser kann, falls notwendig ferner einen Replikationsursprung
haben. Als ein Beispiel eines derartigen Expressionsvektors kann
pSV2dhfr erwähnt
werden [Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)], der den SV40 Early-Promotor
aufweist. Hinsichtlich des eukaryontischen Mikroorganismus werden
allgemein und häufig
Hefen verwendet, und hierunter Hefen des Genus Saccharomyces, die
mit Vorteil zu verwenden sind. Hinsichtlich des Expressionsvektors
zur Verwendung in diesen Hefen und anderen eukaryontischen Mikroorganismen
kann beispielsweise pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)],
der den Saure Phosphatase-Genpromotor aufweist, verwendet werden.
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Des
weiteren kann ein prokaryontischer Gen-Fusionsvektor vorzugsweise
als Expressionsvektor des erfindungsgemäßen Gens verwendet werden.
Als spezifisches Beispiel für
diesen Vektor können
erwähnt
werden pGEX-2TK und pGEX-4T-2, die eine GST-Domäne haben (von S. japonicum
stammend) mit einem Molekulargewicht von 26 000.
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Escherichia
coli und Bacillus subtillis sind allgemein und vorzugsweise als
prokaryontische Wirte zu verwenden. Wenn diese als Wirte in der
Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird ein Expressionsplasmid,
das von einem Plasmidvektor abstammt, der in der Lage ist, sich
in diesen Wirtsorganismen zu replizieren, und vorausgesetzt, daß diese
Verbindung einen Promotor und die SD-Sequenz (Shine and Dalgarno)
stromaufwärts
dieses Gens zur Ermöglichung
der Expression des Gens der vorliegenden Erfindung, und ferner mit
einem Initiationscodon (z.B. ATG), der für die Initiierung der Proteinsynthese
notwendig ist, hat, vorzugsweise verwendet. Der Escherichia coli-Stamm
K12 ist u.a. vorzugsweise als Wirt Escherichia coli zu verwenden
und pBR322 und modifizierte Vektoren, die hiervon abstammen sind
allgemein und vorzugsweise als Vektoren zu verwenden, wenngleich
zahlreiche bekannte Stämme
und Vektoren ebenfalls verwendet werden können. Beispiele für den Promotor,
der verwendet werden kann, ist der Tryptophan-(trp)-Promotor, lpp-Promotor,
lac-Promotor und PL/PR-Promotor.
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Die
so gewonnene gewünschte
rekombinante DNA kann in Wirtszellen zur Transformation unter Verwendung
zahlreicher allgemeiner Verfahren eingeschleust werden. Die gewonnene
Transformante kann durch ein konventionelles Verfahren kultiviert
werden, und die Kultur führt
zur Expression und Produktion des gewünschten Proteins, das durch
das erfindungsgemäße Gen codiert
wird. Das zu verwendende Medium in dieser Kultur kann aus zahlreichen
Medien der konventionellen Verwendung entsprechend den benutzten
Wirtszellen ausgewählt
werden. Die Wirtszellen können
unter Bedingungen kultiviert werden, die für deren Wachstum geeignet sind.
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In
der oben angegebenen Weise wird das gewünschte rekombinante Protein
innerhalb der transformierten Zellen oder extrazellulär oder auf
der Zellmembran exprimiert und produziert und akkumuliert oder sezerniert.
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Das
rekombinante Protein kann nach Wunsch durch zahlreiche Trennverfahren
abgetrennt und gereinigt werden, indem physikalische, chemische
oder andere Eigenschaften davon verwendet werden [z.B. "Seikagaku (Biochemistry)
Data Book II", Seiten
1175-1259, 1. Auflage, 1. Druck, veröffentlicht am 23. Juni 1980 von
Tokyo Kagaku Dojin; Biochemistry 25, (25), 8274-8277 (1986); Eur.
J. Biochem., 163, 313-321 (1987)]. Genauer gesagt schließen diese
Verfahren u.a. die gewöhnlichen
Rekonstituierungsbehandlungen, die Behandlung mit einem Proteinpräzipitationsmittel
(Aus salzen), die Zentrifugierung, die osmotische Schockbehandlung,
die Beschallung, die Ultrafiltration, zahlreiche Flüssigchromatographie-Techniken wie die
molekulare Sieb-Chromatographie (Gelfiltration), die Adsorptions-Chromatographie,
die Innenaustausch-Chromatographie, die Affinitäts-Chromatographie und die
Hochleichtungsflüssig-Chromatographie
(HPLC), die Dialye und Kombinationen davon ein. Von diesen ist die
Affinitäts-Chromatographie
unter Verwendung einer Säule
mit dem gewünschten
Protein, das daran gebunden wird, besonders bevorzugt.
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Außerdem ist
es auf Grundlage der Sequenzinformation des erfindungsgemäßen Gens,
das in der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, beispielsweise
unter Verwendung eines Teils oder der gesamten Sequenz des Gens
möglich,
die Expression des Gens der vorliegenden Erfindung in zahlreichen
menschlichen Geweben nachzuweisen. Dies kann durch ein konventionelles
Verfahren, zum Beispiel durch die RNA-Amplifizierung mittels RT-PCR
(revers transkribierte Polymerasekettenreaktion) [Kawasaki, E.S.,
et al., Amplification of RNA, in PCR Protocol, A guide to methods
and applications, Academic Press, Inc., San Diego, 21,27 (1991)] oder
durch Northern-Blot-Analyse
[Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] mit guten
Ergebnissen durchgeführt
werden.
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Die
zu verwendenden Primer bei der Benutzung des oben erwähnten PCR-Verfahrens sind nicht
auf besondere beschränkt,
vorausgesetzt, daß sie
für das
Gen der vorliegenden Erfindung spezifisch sind und ermöglichen
daß allein
das erfindungsgemäße Gen spezifisch
amplifiziert wird. Sie können
auf Grundlage der Geninformation, die in der vorliegenden Erfindung
bereitgestellt wird, entworfen und entsprechend ausgewählt werden.
Sie können
eine Teilsequenz haben, die ungefähr 20 bis 30 Nukleotide umfaßt, entsprechend
der etablierten Praxis. Geeignete Beispiele sind in den Beispielen
gezeigt.
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Das
bedeutet, daß die
vorliegende Erfindung auch Primer und/oder Sonden bereitstellt,
die beim spezifischen Nachweisen eines derartigen neuen Gens nützlich sind.
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Unter
Verwendung des neuen Gens, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt
wird, ist es möglich,
die Expression dieses Gens in zahlreichen Geweben nachzuweisen,
die Struktur und die Funktion davon zu analysieren und des weiteren
das menschliche Protein, das durch dieses Gen codiert wird, mittels rekombinanter
Gentechnik herzustellen. Dies macht es möglich, das Expressionsprodukt
zu analysieren, die Pathologie einer Erkrankung, die hiermit verbunden
ist, zu offenbaren, beispielsweise eine genetische Erkrankung oder
Krebs, und die Erkrankung zu diagnostizieren und zu behandeln.
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Auf
die folgenden Zeichnungen wird in den Beispielen Bezug genommen.
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1 zeigt
das Ergebnis, das durch Testen der P24-Kinaseaktivität von NPIK
in Beispiel 9 gewonnen wurde. 2 zeigt
die Wirkung von Triton-X100 und Adenosin auf die NPIK-Aktivität.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung in weiteren
Details dar.
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Beispiel 1
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Nur
technischer Hintergrund des Beispiels 9.
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GDP-Dissoziationsstimulator-Gen (nicht
Teil der Erfindung)
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(1) Klonierung und DNA-Sequenzierung des
GDP-Dissozierungs-Stimulator-Gens
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mRNA,
die aus Geweben eines menschlichen fötalen Hirns, adulten Blutgefäßen und
Plazenta extrahiert wurden, wurde von Clontech bezogen und als Ausgangsmaterial
verwendet.
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Von
jeder mRNA wurde cDNA synthetisiert und in den Vektor λZAPII (Stratagene)
inseriert, um dadurch eine cDNA-Bibliothek herzustellen (Otsuka
GEN Gesearch Institute, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
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Den
das menschliche Gen enthaltenden Escherichia coli-Kolonien wurde
ermöglicht
auf Agarmedium durch die In-vivo-Exzisionstechnik Kolonien zu bilden
[Short, J.M., et al., Nucleic Acids Res. 16, 7583-7600 (1988)].
Die Kolonien wurden zufallsgemäß herausgepickt,
und die das menschliche Gen enthaltenden Escherichia coli-Klone
wurden in 96 Well-Mikroplatten registriert. Die Klone, die registriert
wurden, wurden bei –80°C gelagert.
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Jeder
der registrierten Klone wurde über
Nacht in 1,5 ml LB-Medium kultiviert, und die DNA wurde daraus extrahiert
und unter Verwendung eines PI-100-Modells zur automatischen Plasmid-Extraktion
(Kurabo) gereinigt. Kontaminierende Escherichia coli-RNAs wurden
zersetzt und durch RNase-Behandlung
entfernt. Die DNA wurde in einem Endvolumen von 30 μl gelöst. Ein
2 μl-Teil
wurde für
eine grobe Überprüfung der
Größe der DNA
und deren Menge unter Verwendung eines Minigels verwendet, und 7 μl wurden
für Sequenzreaktionen
verwendet, und der restliche Teil (21 μl) wurde als Plasmid-DNA bei
4°C gelagert.
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Dieses
Verfahren ermöglicht
nach leichten Änderungen
im Programm die Extraktion des Cosmids, welches ebenfalls als Sonde
für FISH
(Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierung)
nützlich
ist, wie in den Beispielen später
gezeigt wird.
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Dann
wurde das Didesoxy-Abbruchverfahren nach Sanger et al. [Sanger,
F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)] unter
Verwendung von T3, T7 oder einem synthetischen Oligonukleotidprimer oder
die Cyclussequenziermethode [Carothers, A.M., et al., Bio. Techniques,
7, 494-499 (1989)], umfassend das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren
plus PCR-Verfahren,
durchgeführt.
Diese sind Verfahren zur spezifischen Beendigung der Extensionsreaktion
an den vier Basen, unter Verwendung einer geringen Menge an Plasmid-DNA
(ungefähr
0,1-0,5 μg)
als Matrize.
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Die
verwendeten Sequenzierprimer waren FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-markiert.
Im allgemeinen wurden ungefähr
25 Reaktionszyklen unter Verwendung von Taq-Polymerase durchgeführt. Die
PCR-Produkte wurden auf einem Polyacrylamidharnstoff-Gel aufgetrennt,
und die Fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente wurden einem automatischen
DNA-Sequenziergerät
(ALFTM DNA Sequencer; Pharmacia) zugeführt, um
die Sequenz von ungefähr
400 Basen am 5'-Ende
der cDNA zu bestimmen.
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Da
die 3'-nicht-translatierte
Region jedes Gens hoch heterogen ist und daher für die Unterscheidung individueller
Gene voneinander geeignet ist, wurde eine Sequenzierung auf der
3'-Seite ebenfalls
abhängig von
der Situation durchgeführt.
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Die
enorme Anzahl der Nukleotidsequenzinformation, die durch das DNA-Sequenziergerät gewonnen wurde,
wurde in einem 64 bit DEC 3400-Computer für eine Homologieanalyse mittels
des Computers überführt. In
der Homologieanalyse wurde eine Datenbank (GenBank, EMBL) verwendet,
um gemäß dem UWGCG FASIA-Programm
[Pearson, W.R. und Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
2444-2448 (1988)] zu suchen.
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Als
Ergebnis einer willkürlichen
Auswahl des oben erwähnten
Verfahrens und der cDNA-Sequenzanalyse wurde ein Klon, der als GEN-501D08
bezeichnet wird und ein 0,8 Kilobasen-Insert trägt, gefunden, welches ein hohes
Niveau an Homologie mit dem C-terminalen Bereich des menschlichen
Ral-Guanidin-Nukleotid-Dissoziationsstimulator-(RalGDS)-Gen aufweist.
Da RalGDS vermutlich eine bestimmte Rolle in den Signaltransmissionswegen
spielt, wurde die gesamte Nukleotidsequenz des cDNA-Insertteils,
welches das menschliche Homologon bereitstellt, weiter bestimmt.
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(2) Northern-Blot-Analyse
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Die
Expression der RalGDS-Protein-mRNA in normalen menschlichen Geweben
wurde durch Northern-Blut unter Verwendung des menschlichen cDNA- Klons, welcher durch
eine Zufalls-Oligonukleotidpriming-Methode markiert wurde, als Sonde
begutachtet.
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Die
Northern-Blot-Analyse wurde mit einem menschlichen MTN-Blut (Human
Multiple Tissue Northern blot; Clontech, Palo Alto, CA, USA) nach
dem Protokoll des Herstellers durchgeführt.
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Auf
diese Weise wurde das PCR-Amplifikationsprodukt des oben erwähnten Klons
GEN-501D08 zur Verwendung als Sonde mit [32P]-dCTP
markiert (random-primed DNA labeling kit, Boehringer, Mannheim).
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Für das Blotten,
wurde eine Hybridisierung über
Nacht bei 42°C
in einer Lösung
durchgeführt,
die 50 % Formamid/5 × SSC/50 × Denhardt's-Lösung/0,1
% SDS (enthaltend 100 μg/ml
denaturierter Lachssperma-DNA) umfaßt. Nach dem Waschen mit 2
Anteilen 2 × SSC/0,01
% SDS bei Raumtemperatur wurde der Membranfilter weiter dreimal
mit 0,1 × SSC/0,05
% SDS bei 50°C
für 40
Minuten gewaschen. Ein Röntgenfilm (Kodak)
wurde dem Filter bei –70°C für 18 Stunden
ausgesetzt.
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Als
Ergebnis wurde gezeigt, daß ein
900 bp-Transkript in allen menschlichen Geweben, die untersucht wurden,
exprimiert wurde. Zusätzlich
wurde ein 3,2 kb-Transkript spezifisch im Herz und der Skelettmuskulatur beobachtet.
Die Expression dieser Transkripte, die sich in der Größe unterscheiden,
kann entweder aufgrund eines alternativen Spleißings oder einer Kreuzhybridisierung
mit homologen Genen begründet
sein.
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(3) Cosmid-Klon und Chromosomen-Lokalisierung
mittels FISH
-
FISH
wurde durch das Durchmustern einer Bibliothek menschlicher Chromosome
durchgeführt,
die in den Cosmid-Vektor pWE15 kloniert worden waren, in dem als
Sonde das 0,8 kb-Insert des cDNA-Klons verwendet wurde [Sambrook,
J., et al., Molecular Cloning, 2. Ausgabe, S. 3.1-3.58, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)].
-
Die
FISH für
die Chromosomen-Zuordnung wurde nach dem Verfahren von Inazawa et
al. durchgeführt,
welches den Vergleich der G-Bandenmuster zur Bestätigung umfaßt [Inazawa,
J. et al., Genomics, 17, 153-162 (1993)].
-
Zur
Verwendung als Sonde wurde die Cosmid-DNA (0,5 μg), welche durch das Chromosom-Durchmustern
gewonnen wurde und dem GEN-501D08 entspricht, mit Biotin-16-dUTP
durch Nick-Translatierung markiert.
-
Um
den Hintergrund aufgrund repetitiver Sequenzen zu eliminieren, wurden
0,5 μl beschallter menschlicher
Plazenta-DNA (10 mg/ml) zu 9,5 μl
der Sondenlösung
gegeben. Die Mischung wurde bei 80°C für 5 Minuten denaturiert und
mit einem gleichen Volumen an 4 × SSC enthaltend 20 % Dextransulfat
gemischt. Dann wurde ein denaturierter Glasobjektträger mit der
Hybridisierungsmischung bedeckt, und nach dem Abschließen mit
Paraffin in einer feuchten Kammer bei 37°C für 16 bis 18 Stunden inkubiert.
Nach dem Waschen mit 50 % Formamid/2 × SSC bei 37°C für 15 Minuten
wurde der Objektträger
mit 2 × SSC
für 15
Minuten gewaschen und dann weiter mit 1 × SSC für 15 Minuten.
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Der
Objektträger
wurde dann in 4 × SSC,
supplementiert durch "1
% Block Ace" (Handelsmarke,
Dainippon Pharmaceutical) enthaltend Avidin-FITC (5 μg/ml) bei
37°C für 40 Minuten
inkubiert. Dann wurde der Objektträger mit 4 × SSC für 10 Minuten gewaschen und
mit 4 × SSC
enthaltender 0,05 % Triton-X-100 für 10 Minuten und dann in einer
Antibleich-PPD-Lösung
getränkt
[hergestellt durch Einstellung von 100 mg PPD (Wako-Katalog Nr.
164-015321) und 10 ml PBS(–)
(pH 7,4) auf pH 8,0 mit 0,5 M Na2CO3/0,5 M NaHCO3 (9:1, V/V)-Puffer
(pH 9,0) und Zugabe von Glycerin, um ein Gesamtvolumen von 100 ml
zu ergeben], enthaltend 1 % DABCO [1 % DABCO (Sigma) in PBS(–):Glycerin
1:9 (V:V(], gefolgt von einer Gegenfärbung mit DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindol;
Sigma).
-
Bei
mehr als 100 getesteten Zellen in der Metaphase wurde ein spezifisches
Hybridisierungssignal auf dem Chromosom in der Bande 6p21.3 beobachtet,
ohne irgendein Signal auf anderen Chromosomen. Es wurde daher bestätigt, daß das RalGDS-Gen
auf Chromosom 6p21.3 lokalisiert ist.
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Beispiel 2
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(Für
darstellende Zwecke)
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Die
5'-RACE-Technik
[Frohman, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 8998-9002
(1988)] wurde verwendet.
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(2) 5'-RACE
(5' rapid amplification
of cDNA ends)
-
Ein
cDNA-Klon, der den 5'-Anteil
des Gens der vorliegenden Erfindung enthält wurde für die Analyse durch die 5'-RACE-Technik unter
Verwendung eines kommerziellen Kits (5'-Rapid AmpliFinder RACE kit, Clontech)
gemäß dem Protokoll
des Herstellers mit geringfügigen
Modifikationen wie folgt durchgeführt.
-
Die
Gen-spezifischen Primer P1 und Primer P2, die hier verwendet wurden,
wurden durch das konventionelle Verfahren synthetisiert, und ihre
Nukleotidsequenzen sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Der Ankerprimer,
der verwendet wurde, war der, der in dem kommerziellen Kit vorhanden
war. Tabelle 1
Primer | Nukleotidsequenz |
Primer
P1 | 5'-ACACCAATCCAGTAGCCAGGCTTG-3' |
Primer
P2 | 5'-CACTCGAGAATCTGTGAGACCTACATACATGACG-3' |
-
cDNA
wurde durch Reverse Transkription von 0,1 μg menschlicher fötaler Hirn-Poly(A)-RNA
durch die Zufalls-Hexamertechnik unter Verwendung von Reverser Transkriptase
(SuperscriptTM II, Life Technologies) gewonnen
und die cDNA wurde durch die erste PCR unter Verwendung des P1-Primers
und dem Ankerprimer gemäß Watanabe
et al. [Watanabe, T., et al., Cell Genet., in Druck) amplifiziert.
-
So
wurden zu 0,1 μg
der oben erwähnten
cDNA 2,5 mM dNTP/1 × Taq-Puffer (Takara Shuzo)/0,2 μM P1-Primer,
0,2 μM Adaptor-Primer/0,25
Einheiten ExTaq-Enzym (Takara Shuzo) gegeben, um ein Gesamtvolumen
von 50 μl
zu ergeben, gefolgt von der Zugabe des Ankerprimers. Die Mischung
wurde einer PCR unterworfen. So wurden 35 Zyklen der Amplifikation
unter den Bedingungen: 94°C
für 45
Sekunden, 60°C
für 45 Sekunden
und 72°C
für 2 Minuten
durchgeführt.
Zum Schluß wurde
das Gemisch für
5 Minuten bei 72°C
erwärmt.
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Dann
wurden 1 μl
des ersten 50 μl-PCR-Produktes
einer Amplifikation durch eine zweite PCR unter Verwendung des spezifischen
Nested-P2-Primers und des Ankerprimers unterworfen. Das zweite PCR-Produkt
wurde mit einer 1,5%igen Agarosegel-Elektrophorese analysiert.
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Bei
der Agarosegel-Elektrophorese wurde eine einzelne Bande einer Größe von ungefähr 650 Nukleotiden
nachgewiesen. Das Produkt dieser Bande wurde in den Vektor inseriert
(pT7Blue(R)T-Vektor, Novagen) und eine Vielzahl von Klonen mit dem
Insert mit entsprechender Größe wurden
ausgewählt.
-
6
der 5'-RACE-Klone,
die durch das PCR-Produkt gewonnen wurden, haben die gleiche Sequenz
aber verschiedene Längen.
Durch Sequenzieren von zwei überlappenden
cDNA-Klonen, GEN-080G01 und GEN-080G149 wurde die codierende Proteinsequenz
und die 5'- und
3'-flankierenden
Sequenzen, 1015 Nukleotide in Gesamtlänge, bestimmt.
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Beispiel 9
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Menschliches NPIK-Gen
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(1) Menschliches NPIK-Gen Klonierung und
DNA-Sequenzierung
-
Nach
den Verfahren des Beispiels 1 wurden cDNA-Klone zufallsgemäß aus einer
menschlichen fötalen
Hirn-cDNA-Bibliothek ausgewählt
und einer Sequenzanalyse unterworfen, und Datenbankenrecherchen wurden
durchgeführt.
Im Ergebnis wurden zwei cDNA-Klone, die hoch homolog zum Gen sind,
welches für eine
Aminosäuresequenz
codiert, die in Phosphatidylinositol 3- und 4-Kinasen konserviert ist [Kunz, J. et
al., Cell, 73, 585-596 (1993)], gewonnen. Diese wurden als GEN-428B12c1
und GEN-428B12c2 bezeichnet, und die gesamten Sequenzen derselben
wurden wie in den vorhergehenden Beispielen bestimmt.
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Im
Ergebnis wurde gefunden, daß der
GEN-428B12c1-cDNA-Klon und der GEN-428B12c2-Klon codierende Sequenzen
haben, die sich in 12 Aminosäureresten
am 5'-Terminus unterscheiden,
wobei der GEN-428B12c1 cDNA-Klon 12 Aminosäurereste länger ist.
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Die
GEN-428B12c1-cDNA-Sequenz des menschlichen NPIK-Gens enthielt ein
offenes Leseraster von 2487 Nukleotiden, wie in SEQ ID NO:32 gezeigt
ist, welche eine Aminosäuresequenz
codiert, die 829 Aminosäurerest
codiert, wie in SEQ ID NO:31 gezeigt ist. Die Nukleotidsequenz des
cDNA-Klons vollständiger
Länge umfaßte 3324
Nukleotide, wie in SEQ ID NO:33 gezeigt ist.
-
Der
geschätzte
Initiationscodon war, wie in SEQ ID NO:33 gezeigt, bei den Nukleotiden
Nrn. 115-117 lokalisiert, welches dem zweiten ATG-Triplett des cDNA-Klons
entsprach. Der Terminationscodon war bei den Nukleotiden Nrn. 2602-2604
lokalisiert, und das Polyadenylierungssignal (AATAAA) bei den Nrn.
3305-3310.
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Andererseits
enthielt die GEN-428B12c2-cDNA-Sequenz des menschlichen NPIK-Gens
ein offenes Leseraster aus 2451 Nukleotiden, wie in SEQ ID NO:29
gezeigt ist. Die Aminosäuresequenz,
die hierdurch codiert wurde, umfaßte 817 Aminosäurereste,
wie in SEQ ID NO:28 gezeigt ist. Die Nukleotidsequenz des vollständigen cDNA-Klons
umfaßte
3602 Nukleotide, wie in SEQ ID NO:30 gezeigt ist.
-
Der
geschätzte
Initiationscodon war wie in SEQ ID NO:30 gezeigt ist, bei den Nukleotiden
Positionen 429-431 zu finden, entsprechend dem 7. ATG-Triplett des cDNA-Klons.
Der Terminationscodon war bei den Nukleotiden mit den Positionen
2880-2882 zu finden und das Polyandenylierungssignal (AATAAA) an
den Positionen 3583-3588.
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(2) Northern-Blot-Analyse
-
Eine
Northern-Blot-Analyse wurde wie in Beispiel 1 (2) beschrieben durchgeführt. Das
heißt,
daß die gesamte
Sequenz des menschlichen NPIK-Gens durch PCR amplifiziert wurde,
das PCR-Produkt gereinigt wurde und mit [32P]-dCTP
(random-primed DNA labeling kit, Boehringer, Mannheim) markiert
wurde und normale menschliche Gewebe auf die Expression der menschlichen
NPIK-mRNA unter Verwendung der MTN-Blut-Membran mit dem markierten
Produkt als Sonde untersucht wurden.
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Im
Ergebnis wurde die Expression des menschlichen NPIK-Gens in 16 verschiedenen
menschlichen adulten Geweben, die untersucht wurden, beobachtet,
und ein ungefähr
3,8 kb-Transkript und ein ungefähr
5 kb-Transkript
konnten nachgewiesen werden.
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Unter
Verwendung von Primer A mit der Nukleotidsequenz, die in Tabelle
8 unten gezeigt ist, und den Initiationscodon des GEN-428B12c2 der
cDNA und des Primers B, welcher in Tabelle 2 gezeigt ist, und den Terminationscodon
enthält,
wurde eine PCR mit menschlicher fötaler Hirn-Marathon-Ready-cDNA (Clontech) als Matrize
durchgeführt,
und die Nukleotidsequenz des PCR-Produktes wurde bestimmt. Tabelle 2
Primer | Nukleotidsequenz |
Primer
A | 5'-ATGGGAGATACAGTAGTGGAGC-3' |
Primer
B | 5'-TCACATGATGCCGTTGGTGAG-3' |
-
Im
Ergebnis wurde gefunden, daß die
menschliche NPIK-mRNA, die exprimiert wurde, eine einschloß, der die
Nukleotide der Position 1060-1104 der GEN-428B12c1 cDNA (SEQ ID
NO:33) (Aminosäuren
Positionen 316-330 der Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO:31) fehlten sowie eine, der die Nukleotide der Position 1897-1911
der GEN-428B12c1-cDNA-Sequenz fehlten (SEQ ID NO:33) (Aminosäuren Position
595-599 der Aminosäuresequenz
in SEQ ID NO:31).
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Es
wurde weiter gezeigt, daß ein
Polymorphismus in diesem Gen vorhanden war (428B12cl.fasta), wie unten
in Tabelle 3 im Bereich der Basen mit den Positionen 1941-1966 der
GEN-428B12c1-cDNA-Sequenz gezeigt ist, die in SEQ ID NO:33 gezeigt
wird, wobei ein mutiertes Protein codiert wurde, welches aus der
Mutation von IQDSCEITT (Aminosäurereste-Positionen
610-618 in der Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO:31), welche durch das GEN-428B12c1 codiert wird) in YKILVISA
hervorging.
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-
(3) Chromosomale Kartierung des menschlichen
NPIK-Gens durch FISH
-
Chromosomale
Kartierung des menschlichen NPIK-Gens wurde durch FISH wie in Beispiel
1 (3) beschrieben, durchgeführt.
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Im
Ergebnis wurde gefunden, daß der
Lokus des menschlichen NPIK-Gens an der chromosomalen Position 1q21.1-q21.3
liegt.
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Das
menschliche NPIK-Gen, ein neues Gen, der vorliegenden Erfindung
schloß zwei
cDNAs ein, die sich in der 5'-Region
unterschieden und in der Lage waren, 829 bzw. 817 Aminosäurereste
zu codieren, wie oben erwähnt
wurde. Im Hinblick auf dies und weiter im Hinblick auf die Befunde,
daß die
mRNA, die diesen Gen entspricht zwei deletierbare Stellen einschließt und ein
Polymorphismus in einer spezifischen Region vorhanden ist, welcher
den Aminosäureresten
Nr. 610-618 der GEN-428B12c1 Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:31) entspricht,
wodurch ein mutiertes Protein codiert wird, ist es vorhersehbar,
daß das
menschliche NPIK Spezies einschließt, die aus einer bestimmten
Anzahl an Kombinationen hervorgehen, d.h. menschliches NPIK, Deletions-haltiges
menschliches NPIK, menschliche NPIK-Mutante und/oder Deletions-haltige
menschliches NPIK-Mutante.
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Kürzlich wurden
mehrere Proteine, die zur Familie gehören, die die oben erwähnten PI3-
und 4-Kinasen mit Proteinkinaseaktivität einschließt [Dhand, R. et al., EMBO
J., 13, 522-533 (1994); Stack, J.H. und Emr, S.D., J. Biol. Chem.
269, 31552-31562 (1994); Hartley, K.O. et al., Cell, 82, 848-856
(1995)].
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Es
wurde ebenfalls gezeigt, daß ein
Protein, das zu dieser Familie gehört, an der DNA-Reparatur beteiligt
ist [Hartley, K.O., et al., Cell, 82, 849-856 (1995)] und das verantwortliche
Gen für
eine Ataxie ist [Savitsky, K., et al., Science, 268, 1749-1753 (1995)].
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Es
kann vorhergesehen werden, daß das
vom menschlichen NPIK-Gen codierte Protein hochhomolog zur Familie
dieser PI-Kinasen ist und ein neues Enzym ist, das Lipide oder Proteine
phosphoryliert.
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Nach
diesem Beispiel wird das neue menschliche NPIK-Gen bereitgestellt.
Die Verwendung dieses Gens macht es möglich, die Expression dieses
Gens in zahlreichen Geweben nachzuweisen und das menschliche NPIK-Protein durch die
Gentechnik herzustellen, und dadurch wird es möglich Lipid- oder Protein-phosphorylierende
Enzyme, wie das oben erwähnte
zu untersuchen, DNA-Reparatur zu untersuchen, Erkrankungen zu untersuchen
oder zu diagnostizieren, an denen sie beteiligt sind, beispielsweise
Krebs und Medikamente zur Behandlung oder Prävention zur Begutachtung davon
auszumustern.
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(4) Konstruktion eines Expressionsvektors
für ein
Fusionsprotein
-
Um
die codierende Region eines menschlichen NPIK-Gens (GEN-428B12c2)
zu subklonieren, wurden zuerst zwei Primer C1 und C2 mit den unten
in Tabelle 4 gezeigten Sequenzen auf Grundlage der DNA-Sequenzen,
die in (1) oben gewonnen wurden, gebildet. Tabelle 4
Primer | Nukleotidsequenz |
Primer
C1 | 5'-CTCAGATCTATGGGAGATACAGTAGTGGAGC-3' |
Primer
C2 | 5'-TCGAGATCTTCACATGATGCCGTTGGTGAG-3' |
-
Sowohl
die Primer C1 als auch C2 haben BglII-Schnittstellen und der Primer
C2 ist ein Antisense-Primer.
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Unter
Verwendung dieser zwei Primer wurde cDNA, die aus menschlichen fötalen Hirn-mRNA
stammt, durch PCR amplifiziert, um ein Produkt mit einer Länge von
ungefähr
2500 Basen bereitzustellen. Die amplifizierte cDNA wurde mit Ethanol
präzipitiert
und in den pT7BlueT-Vektor (Produkt von Novagen) inseriert, und die
Subklonierung wurde beendet. Die gesamte Sequenz wurde in gleicher
Weise wie oben in den Beispielen bestimmt. Als Ergebnis wurde gezeigt,
daß dieses
Gen einen Polymorphismus hat, der oben in Tabelle 9 gezeigt ist.
-
Die
oben erwähnte
cDNA wurde mit BglII gespalten und einer Agarosegelelektrophoese
unterworfen. Die cDNA wurde dann aus einem Agarose-Gel ausgeschnitten
und unter Verwendung von GENECLEAN II KIT (Produkt von Bio 101)
eingesammelt. Die cDNA wurde in pBlueBacHis2B-Vektor inseriert (Produkt
von Invitrogen) an der BglII-Spaltstelle und die Subklonierung wurde
vollendet.
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Der
Fusionsvektor, der so erhalten wurde, hatte eine BglII-Spaltstelle
und war ein Expressionsvektor für
ein Fusionsprotein des vorhergesagten Genprodukts (ungefähr 91 kD)
und 38 Aminosäuren
stammten vom pBlueBachHis2B-Vektor und enthielten einen Polyhistidin-Bereich
und ein Epitop der vom Anti-ExpressTM-Antikörper erkannt
wird (Produkt von Invitrogen).
-
(5) Transfektion in die Insektenzelle
Sf-9
-
Das
menschliche NPIK-Gen wurde mit dem Baculovirus-Expressionssystem
exprimiert. Baculovirus ist ein cyclischer doppelsträngiger pathogener
Virus und kann große
Menge an Einschlußkörperchen,
die als Polyhedrin bezeichnet werden, in den Zellen der Insekten
herstellen. Unter Verwendung von Bac-N-BlueTM-Transfektions-Kit
unter Verwendung dieser Eigenschaften des Baculovirus, welcher von
Invitrogen entwickelt worden ist, wurde die Baculovirus-Expression
durchgeführt.
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Genauer
gesagt wurden 4 μg
des pBlueBacHis2B, welcher den Bereich des menschlichen NPIK-Gens enthält und 1 μg von Bac-N-BlueTM-DNA (Produkt von Invitrogen) in Sf-9-Zellen
in Gegenwart von InsectinTM-Liposomen (Produkt
von Invitrogen) co-transfiziert.
-
Vor
der Co-Transfektion wurde das LacZ-Gen in Bac-N-BluTM-DNA
inkorporiert, so daß LacZ
nur exprimiert werden würde,
wenn eine homologe Rekombination zwischen der Bac-N-BlueTM-DNA und pBlueBacHis2B stattgefunden hat.
Daher wurde, wenn die co-transfizierten Sf-9-Zellen auf Agarmedium
inkubiert wurden, die Plaques des Virus, welcher das vollständige Gen
exprimieren, als blaue Plaques leicht nachgewiesen.
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Die
blauen Plaques wurden aus jedem Agar ausgeschnitten und in 400 μl Medium
suspendiert, um das Virus darin zu dispergieren. Die Suspension
wurde einer Zentrifugation unterworfen, um einen Überstand zu
ergeben, der das Virus enthält.
Sf-9-Zellen wurden mit dem Virus erneut infiziert, um den Titer
zu erhöhen, und
um eine große
Menge infektiöser
Viruslösung
zu gewinnen.
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(6) Herstellung von menschlichem NPIK
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Die
Expression des vorhergesagten menschlichen NPIK-Gens wurde drei
Tage nach der Infektion mit dem Virus wie folgt bestätigt.
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Sf-9-Zellen
wurden eingesammelt und mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit
einem SDS-PAGE-Beladungspuffer für
5 Minuten gekocht und eine SDS-PAGE wurde durchgeführt. Gemäß der Western-Blut-Technik
unter Verwendung von Anti-Xpress als Antikörper wurde das vorhergesagte
Protein an der Position des vermuteten Molekulargewichts nachgewiesen.
Im Gegensatz dazu wurde im Fall von Kontrollzellen, die mit dem
Virus nicht infiziert wurden, im gleichen Test keine Bande nachgewiesen,
die dem menschlichen NPIK entsprach.
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Genauer
gesagt, wurden drei Tage nach der Infektion 15 Flaschen (175 cm2, FALCON) halb-konfluenter Sf-9-Zellen geerntet
und mit PBS gewaschen, gefolgt von einer Resuspendierung in einem
Puffer (20 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA und 1 mM DTT). Die suspendierten
Zellen wurden durch 4-maliges Beschallen für 30 Sekunden bei 4°C mit 30
Sekunden Intervallen suspendiert. Die beschallten Zellen wurden
einer Zentrifugation unterworfen und der Überstand wurde eingesammelt.
Das Protein im Überstand
wurde immunpräzipitiert,
indem ein Anti-Xpress-Antikörper
verwendet wurde und als Aufschlämmung
von Protein-A-Sepharose-Kügelchen
gewonnen. Die Aufschlämmung
wurde mit einem SDS-PAGE Beladungspuffer für 5 Minuten gekocht. SDS-PAGE
wurde für
die Identifizierung und Quantifizierung von NPIK durchgeführt. Die
Aufschlämmung
selbst wurde dem folgenden Test unterworfen.
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(7) Bestätigung der PI4-Kinaseaktivität
-
Von
NPIK wurde erwartet, daß es
die Aktivität
zum Einbau von Phosphorsäure
an der 4-Position des Inositol-Rings von Phosphatidylinositol (PI)
hat, d.h. PI4-Kinaseaktivität.
-
PI4-Kinaseaktivität von NPIK
wurde gemäß dem Verfahren
von Takenawa et al. (Yamakawa, A. und Tadenawa, T., J. Biol. Chem.,
263, 17555-17560 (1988)) wie unten gezeigt wird untersucht.
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Zuerst
wurde eine Mischung aus 10 μl
einer NPIK-Aufschlämmung
(20 mM Tris/HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 50 % Protein-A-Perlen),
10 μl einer
PI-Lösung
(hergestellt durch das Trocknen von 5 mg der PI-haltigen kommerziellen
Chloroform-Lösung
in einem Stickstofffluß auf
einer Glasröhrchenwand
unter Zugabe von 1 ml 20 mM Tris/HCl (pH 7,5)-Puffer und Bilden
von Mizellen durch Beschallung), 10 μl eines zugegebenen Puffers
(210 mM Tris/HCl (pH 7,5), 5 mM EGTA und 100 mM MgCl2)
und 10 μl
destilliertem Wassers hergestellt. Hierzu wurden 10 μl einer ATP-Lösung gegeben
(5 μl 500 μM ATP, 4,9 μl destilliertes
Wasser und 0,1 μl γ-32P ATP (6000 Ci/mmol, Produkt von NEN Co.,
Ltd.)). Die Reaktion wurde bei 30°C
gestartet und für
2, 5, 10 und 20 Minuten fortgesetzt. Der Zeitpunkt 10 Minuten wurde
als Inkubationszeit ausgewählt,
da ein gradliniger Anstieg bei ungefähr 10 Minuten bei Einbau der
Phosphorsäure
in PI beobachtet wird, indem das Verfahren, das unten beschrieben
wird, getestet wurde.
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Nach
der Beendigung der Reaktion wurde PI durch das Lösungsmittel-Extraktionsverfahren fraktioniert und
schließlich
in Chloroform resuspendiert. Die Suspension wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC)
entwickelt und die Radioaktivität
des Reaktionsproduktes an der PI4P-Position wurde unter Verwendung eines
Analysegeräts
untersucht (Warenname: Bio-Image;
Produkt von Fuji Photo Film Co., Ltd.).
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1 zeigt
die Ergebnisse. 1 ist ein anlytisches Diagramm
der Ergebnisse der Untersuchung der Radioaktivität auf Grundlage der oben erwähnten TLC.
Die rechte Spur (2) ist die Fraktion des Sf-9-Zell-Cytoplasmas, das
mit dem NPIK-haltigen Virus infiziert wurde, während die linke Spur (1) die
Fraktion nicht-identifizierten Sf-9-Zellcytoplasmas ist.
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Ferner
wurden vorherbestimmten Mengen an Triton X-100 und Adenosin zu dem
oben erwähnten
Reaktionssystem hinzugegeben, um zu überprüfen, wie eine derartige Zugabe
die PI4-Kinaseaktivität
beeinflussen würde.
Die PI4-Kinaseaktivität wurde
in gleicher Weise wie oben untersucht.
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2 zeigt
die Ergebnisse. Die Ergebnisse bestätigten, daß NPIK eine typische PI4-Kinaseaktivität hat, die
durch Triton X-100 beschleunigt wird und durch Adenosin inhibiert
wird.
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