DE69233399T2

DE69233399T2 - Menschliches cyclin e

Info

Publication number: DE69233399T2
Application number: DE69233399T
Authority: DE
Inventors: M. James ROBERTS; Motoaki Ohtsubo; C. Andrew KOFF; Frederick Cross
Original assignee: Fred Hutchinson Cancer Research Center
Current assignee: Fred Hutchinson Cancer Center
Priority date: 1991-09-20
Filing date: 1992-09-16
Publication date: 2005-08-04
Anticipated expiration: 2012-09-17
Also published as: EP0604560A4; JP2004222728A; EP0604560A1; US5645999A; US5861259A; CA2119443C; JPH07502164A; AU676137B2; WO1993006123A1; US5783661A; CA2119443A1; EP0604560B1; DE69233399D1; AU2666392A; US5449755A; ATE273386T1; US5807698A

Description

Menschliches Cyclin E
Diese Anmeldung ist eine Teilfortführung der Anmeldung Serien-Nr. 07/764 309, eingereicht am 20. September 1991.
Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter dem Zuschuß CA 48718, erteilt von den "National Institutes of Health", bewerkstelligt. Die Regierung hat gewisse Rechte an der Erfindung.
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Gentechnik, beinhaltend rekombinante DNA-Technologie, und insbesondere die Identifizierung einer Nukleotidsequenz, codierend für humanes Cyclin E, welches die Rate des Zellwachstums durch Steuerung des Fortschreitens bei der G1-Phase des Zellzyklus und des Eintritts in die S-Phase reguliert.
Hintergrund der Erfindung
Ein Hauptziel bei der Untersuchung des Wachstums und der Differenzierung von höheren eukaryotischen Zellen besteht darin, in biochemischer Hinsicht die Wege, Enzyme und Cofaktoren zu beschreiben, welche das Fortschreiten durch den Zellzyklus und insbesondere durch die Übergänge von der G1-Phase in die S-Phase und von der G2-Phase in die M-Phase regulieren. Proteine, heutezutage bekannt als Cycline, wurden in befruchteten Seeigel- und Muschel-Eiern als Mitglieder einer kleinen Zahl von Proteinen beschrieben, deren Synthese in großem Maße im Anschluß an die Befruchtung stimuliert wurde (in den beigefügten Zitaten: Evans et al., 1983), und deren Spiegel bei jeder Mitose abnahm. Von Cyclin A (Swenson et al., 1986) und Cyclin B (Pines und Hunt, 1987), wurde entdeckt, sich periodisch in mitotischen Zellen zu akkumulieren, und daher wurde eine Rolle im Vorgang der Mitose als möglich betrachtet (Evans et al., 1983), obwohl die biochemische Basis umklar war. Die Ergebnisse der genetischen und biochemischen Analyse unterstützen nun eine Rolle für bestimmte Cycline in Meiose und Mitose. Die Mikroinjektion von Muschel- oder Seeigel-Cyclin B1-mRNA in Xenopus-Oocyten (Pines und Hunt, 1987; Westendorf et al., 1989) ist berichtetermaßen ausreichend, um die Zelle durch die Meiose I und II zu lenken, und Cyclin B kann das einzige Protein sein, dessen Synthese für jeden mitotischen Zyklus in frühen Xenopus-Embryonen erfordert wird (Murray und Kirschner, 1989). Umgekehrt kann die Zerstörung von Cyclin-B1- und B2-mRNA verursachen, dass befruchtete Xenopus-Eier nach der DNA-Replikation aber vor der Mitose anhalten bzw. arretieren (Minshull et al., 1989). Neben Xenopus, spielt Cyclin B berichteterweise in den Hefen S. pombe und S. cerevisae eine Rolle bei der Regulierung des Durchgangs durch die Mitose (Hagan et al., 1988; Ghiara et al., 1991;) Surana et al., 1991; Booher und Beach, 1987; Booher et al., 1989; Hagan et al., 1988; Ghiara et al., 1991; Surana et al., 1991) durch Ausüben der mitotischen Kontrolle über die Aktivierung einer p34-CDC2-Proteinkinase (übersichtsmäßig zusammengefasst in Nurse, 1990; Cross et al., 1989). Im letztgenannten Fall ist die CDC2-Kinase berichtetermaßen als ein Monomer nicht katalytisch aktiv, aber im Anschluß an die Bindung an das Cyclin B und eine Reihe von Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungs-Schritten wird die Kinaseaktivität hervorgebracht (Simanis und Nurse, 1986; Draetta und Beach, 1988; Pondaven et al., 1990; Solomon et al., 1990; Gould und Nurse, 1989; Enoch und Nurse, 1990; Solomon et al., 1992).
Die Cyclin-B-abhängige Aktivierung einer p34-CDC2-Kinase kann auch notwendig sein, um die Mitose in bestimmten somatischen Zellen zu initiieren (Nurse, 1990; Cross, 1989; Maller et al.,1991), aber die Aktivierung allein kann nicht das einzige erforderte Ereignis sein (Lamb et al.,1990 Osmani et al., 1991; Amon et al., 1992; Sorger et al., 1992). S. cerevisiae besitzt scheinbar ein CDC2-Homolog, welches als CDC28 bezeichnet wird. Die CDC2- und CDC28-Genprodukte scheinen strukturell ähnlich (Lorincz & Reed, 1984; Hindley & Phear, 1984) und funktionell homolog zu sein (Beach et al., 1982; Booher & Beach, 1987). Sie codieren eine Serin/Threonin-Proteinkinase, welche das Homolog der 34-kDa-Proteinkinase in Wirbeltier- und Wirbellosen-"Mitosis-Promoting-Factor" ist (MPF; Lee & Nurse, 1987; Arion et al., 1988; Dunphy et al., 1988; Gautier et al., 1988; Labbe et al., 1988). CDC28 kann verschiedene Cycline für die Zellzyklus-Übergänge bei G2/M und bei G1/S erfordern: Bei G2/M bindet CDC28 nämlich berichtetermaßen an B-Typ-Cycline und wird von diesen aktiviert (Ghiara et al., 1991; Surana et al., 1991), wohingegen CDC28 berichtetermaßen bei G1/S durch CLN-Typ-Cycline aktiviert wird (d.h. CLN1, CLN2 und CLN3; Sudbery et al., 1980; Nash et al., 1988; Cross, 1988, 1990; Hadwiger et al., 1989; Richardson et al., 1989; Wittenberg et al., 1990).
CLN1- und i CLN2-Cycline werden während des Zellzyklus periodisch exprimiert, wobei der Gipfel der Häufigkeit am G1/S-Übergangspunkt erreicht wird (Wittenberg et al., 1990; Cross und Tinke enberg, 1991), und die Akkumulierung der CLN-Proteine in Hefezellen kann geschwindigkeitsbegrenzend für den Übergang von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus sein.
Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung wird der Begriff "CDC-Proteinkinase" synonym mit der kürzlich angenommenen "cell division kinase (CDK)"-Nomenklatur verwendet.
Die p34-CDC2-Kinaseaktivität oszilliert scheinbar während des Zellzyklus (Mendenhall et al., 1987; Draetta & Beach, 1988; Labbe et al., 1989b; Moreno et al., 1989; Pines & Hunter, 1990), und diese Oszillation der Aktivität ist nicht auf Variationen in der Menge des in den Zellen vorhandenen CDC2-Genprodukts zurückführbar (Durkacz et al., 1986; Simanis & Nurse, 1986; Draetta & Beach, 1988). Vielmehr scheint die CDC2-Kinaseaktivität von Wechselwirkungen der Kinase mit anderen Proteinen beeinflußt zu sein, einschließlich (wie obenstehend erörtert) den Cyclinen (Rosenthal et al., 1980; Evans et al., 1983; Swenson et al., 1986; Draetta et al., 1989; Meijer et al., 1989; Minshull et al., 1989; Murray & Kirschner, 1989; Labbe et al., 1989a; Soloman et al., 1990; Gautier et al., 1990; übersichtsmäßig zusammengefasst von Murray & Kirschner, 1989; Hunt, 1989). Scheinbar ist eine Assoziation zwischen einem p34-CDC2-Protein und einem B-Typ-Cyclin für die Aktivierung der p34-Kinase am Beginn der Mitose in einer großen Vielzahl von Organismen notwendig, einschließlich Hefe (Booher & Beach, 1987; Hagan et al., 1988; Moreno et al., 1989; Soloman et al., 1988; Booher et al., 1989; Surana et al., 1991; Ghiara et al., 1991) und Menschen (Draetta & Beach, 1988; Pines & Hunter, 1989; Riabowol et al., 1989).
In knospenden Hefen tritt ein Haupt-Kontroll-Entscheidungspunkt in der Zellproliferation berichteterweise während der G1 auf, d.h. an einem als START bezeichneten Punkt, wo der Eintritt von Zellen in die S-Phase beschränkt ist, bis gewisse Bedingungen erfüllt worden sind (Hartwell, 1974). Der START-Übergang scheint ein CDC28- oder cdc2-Genprodukt zu erfordern (Hartwell et al., 1973, 1974; Nurse & Bisset, 1981), aber die biochemischen Wege, welche CDC28 beim START aktivieren, sind nicht vollständig verstanden. Die letztgenannten Wege können die CLN1-, CLN2- und CLN3-Cycline und die Aktivierung von CDC28 beteiligen, weil hinsichtlich aller dreier CLN-Proteine defiziente Zellen beim START anhalten; und sie, obwohl sie damit fortfahren, zu wachsen, nicht in der Lage sind, in die S-Phase einzutreten (Sudbery et al., 1980; Nash et al., 1988; Cross, 1988, 1990; Hadwiger et al., 1989; Richardson et al., 1989; Wittenberg et al., 1990). CLN2, und wahrscheinlich CLN1 und CLN3, können Komplexe mit der CDC28-Kinase vor oder beim START bilden (Wittenberg et al., 1990). Das CLN1 und CLN2 oszilliert während des Zellzyklus, aber Maximalspiegel werden berichteterweise in der späten G1 (d.h. eher als der späten G2; Wittenberg et al., 1990) beobachtet.
Derzeitig ist wenig über die biochemischen Wege bekannt, welche den Start der DNA-Synthese in höheren eukaryotischen Zellen regulieren, oder über das Ausmaß, zu welchem diese Wege denjenigen in Hefe ähneln. Allerdings scheint in menschlichen Zellen (wie in knospender Hefe) der vorherrschende Modus der Steuerung der Zellproliferation während der G1-Phase des Zellzyklus stattzufinden (Zetterberg & Larson, 1985; Zetterberg, 1990). Die Kinetik der Passage durch G1 in Säugerzellen legt einen einzelnen Entscheidungspunkt nahe, bezeichnet als der "Restriktions-Punkt", welcher die Anweisung einer Zelle zur Initiierung der DNA-Synthese reguliert (Pardee, 1974). Vor dem Restriktions-Punkt ist das Fortschreiten durch die G1 hinsichtlich des Wachstumszustandes der Zelle empfindlich (d.h. die Reduzierung der Rate der Proteinsynthese oder die Entfernung eines Wachstumsfaktors kann scheinbar den Eintritt in die S-Phase verzögern und kann sogar einen Zellzyklus-Arrest verursachen), allerdings wird der Zellzyklus nach dem Restriktionspunkt wesentlich weniger antwortfähig auf diese Signale (übersichtsmäßig zusammengefasst in Pardee, 1989). Anders als bei Hefen scheint das CDC2-Cyclin in Säugerzellen in eine kleine Proteinfamilie aufgeteilt zu sein (Paris et al., 1991; Elledge und Spotswood, 1991; Tsai et al., 1991; Koff et al., 1991), und die CDC2/28-Aktivitäten können ebenfalls unter mehreren verschiedenen Kinasefamilienmitgliedern aufgeteilt zu sein (Fang und Newport, 1991). Bestimmte Cycline können Rollen in der G1-Regulation in höheren Eukaryoten besitzen, ähnlich zu denjenigen, welche in Hefe berichtet sind. Beispielsweise beginnt die Cyclin-A-Synthese berichteterweise spät in der G1 und sie kann sowohl p34-CDC2- als auch gewisse verwandte p33-CDK2-Kinasen aktivieren (Giordano et al., 1989; Pines und Hunter, 1990; Marraccino et al., 1992; Tsai et al., 1991). Die Inhibition der Cyclin-A-Funktion kann berichteterweise auch eine START-ähnliche Funktion der S-Phase in gewissen Zellen blockieren (Girard et al., 1991), und Cyclin A ist berichtetermaßen in der Lage, mit gewissen transformierenden und Wachstums-unterdrückenden Faktoren zu assoziieren (Hunter und Pines, 1991). Trotz dieser scheinbaren Ergebnisse, welche eine Rolle für Cyclin A bei der Regulierung einer START-ähnlichen Funktion in höheren Eukaryoten unterstützen, gibt es jedoch auch einige Gründe, zu bezweifeln, dass Cyclin A funktionell homolog zu CLN-Proteinen von knospender Hefe ist. Mehrere Laboratorien haben vor kurzem zwei neue Cycline in Säugerzellen identifiziert, welche nicht in Hefen vorhanden sind, d.h. Cyclin C und Cyclin D. Das Cyclin-D-Gen wurde als ein Gen berichtet, welches in Maus-Makrophagen in der späten G1 von CFS-1 induziert wird (Matshushime et al., 1991), und das Gen kann eine chromosomale Lokalisierung an einem Bruchpunkt aufweisen, welcher einem möglichen Rearrangement bei humanem Parathyroid-Tumor unterworfen ist(Motokura et al., 1991). Cyclin C ebenso wie Cyclin D, sind ebenfalls berichtetermaßen in humanen und Drosophila-cDNA-Bibliotheken durch Screenen nach Genen identifiziert worden, welche in der Lage sind, Mutationen in S. cerevisae-CLN-Genen zu komplementieren (Laheu et al., 1991; Lew et al., 1991; Leopold und OFarrell, 1991; Xiong et al., 1991). Während die Ergebnisse mit G1-Funktionen für Cyclin C und Cyclin D konsistent sind, wurde von Cyclin B (einem mitotischen Cyclin) auch festgestellt, in der Lage zu sein, die letztgenannten S. cerevisae-CLN-Mutanten zu retten, was anzeigt, dass Hefe-Komplementierungs-Assays nicht notwendigerweise Cycline identifizieren müssen, welche ähnliche Funktionen in höheren eukaryotischen Zellen ausführen.
Die Ähnlichkeiten zwischen dem Restriktionspunkt in Säugerzellen und dem START in Hefe haben eine mögliche Rolle für eine p34-CDC2-Kinase nahegelegt. Unterstützend für diese Hypothese ist ein humanes CDC2-Gen gefunden worden, welches in der Lage sein kann, die Aktivität eines S. pombe-cdc2-Gens sowohl in dessen G1/S- als auch G2/M-Rolle zu substituieren (Lee & Nurse, 1987). Des weiteren bieten Zellfusionsexperimente Indizienbeweise zur Unterstützung der Hypothese (Rao & Johnson, 1970), weil ein diffundierbarer transwirksamer Faktor berichtetermaßen bei der Aktivierung der DNA-Synthese beteiligt ist, als S-Phase-Zellen mit G1-Zellen fusioniert bzw. verschmolzen wurden. Allerdings bleibt die Beziehung zwischen dem letztgenannten S-Phasen-Aktivator und der p34-CDC2-Kinase unklar. Vor kurzem sind berichtetermaßen Cyclin-CDC2-Komplexe aus humanen S-Phasen-Zellen isoliert worden, und von ihnen wurde gezeigt, bei der Induzierung der SV40-DNA-Replikation aktiv zu sein, als sie zu Extrakten von G1-Zellen zugesetzt wurden (D'Urso et al., 1990). Gegen die humane CDC2-mRNA gerichtete Antisense-Oligonukleotide sind berichtetermaßen inhibitorisch für humane PHA-aktivierte T-Zellen beim Eintritt in die S-Phase (Furakawa et al., 1990). In anderen höheren eukaryotischen Zellen ist es berichtet worden, dass eine Entziehung bzw. Depletion von CDC2-Protein aus Xenopus-Extrakten die DNA-Replikation blockieren kann (Blow & Nurse, 1990). Trotz jüngeren vielsagenden Berichten, wird der Weg, welcher p34-Kinase während der G1-Phase des humanen Zellzyklus aktiviert, derzeitig nicht verstanden.
In Analogie mit der CLN-abhängigen Aktivierung von CDC28 bei START in Hefe, ist es möglich, dass spezifische G1-Cycline eine Rolle bei der Regulierung der humanen p34-Kinase während des Übergangs von der G1- zur S-Phase spielen können. Um diese Idee zu überprüfen, wurden hierin Experimente ausgeführt, um zu bestimmen, ob menschliche Zellen spezifische Cycline enthalten, welche die Hefe-S.cerevisae-CLN-Proteine ersetzen können. Dieser Assay identifizierte ein neues humanes Cyclin, Cyclin E.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung sieht isolierte Nukleinsäuremoleküle vor, welche zur Hybridisierung an die Nukleotidsequenz, welche zwischen den Positionen 1 und 1185 der humanen Cyclin E-cDNA-Sequenz, gezeigt in 2, liegt, unter stringenten Bedingungen fähig ist. Derartige Nukleinsäuremoleküle codieren vorzugsweise Cyclin E-Polypeptide, fähig zur Bindung und Aktivierung einer Zellteilungs-Kinase (z. B. CDC2, CDC28, CDK2-XL, CDC2-HS und CDK2-HS). Das Cyclin-E-Polypeptid ist typischerweise ebenfalls in der Lage, die G1-Phase des Zellzyklus zu verkürzen. Die Erfindung sieht auch von den zuvor erwähnten Nukleinsäuremolekülen codierte Polypeptide vor, und immunologische Bindungspartner, welche in der Lage zur spezifischen Bindung der Polypeptide sind.
Cyclin E funktioniert spezifisch während der späten G1- und frühen S-Phase des Zellzyklus durch Bindung und Aktivierung einer CDC2-verwandten Proteinkinase, CDK2. Die Spiegel der Cyclin-E/CDK2-Polypeptidkomplexe sind Zellzyklus-reguliert, und ein Gipfel der Häufigkeit wird in der späten G1-Phase des Zellzyklus erreicht. Die konstitutive Expression von Cyclin E in Zellen ist allein ausreichend, um die G1-Phase des Zellzyklus zu verkürzen und das Zellwachstum zu fördern. Die Erhöhung oder Verringerung der Spiegel an Cyclin E in einer Zelle erhöhen bzw. verringern das Zellwachstum. Der Nachweis der Spiegel an Cyclin E in Zellen, wie Tumorzellen, kann Informationen über ihre Wachstumsgeschwindigkeit bereitstellen. Ein Rearrangement der Lokalisierung von Cyclin E an chromosomalen Bruchpunkten kann die Geschwindigkeit der Zellproliferation verändern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt die Komplementation der dreifachen cln-Deletion durch humanes cyclin E: Der S. cerevisae-Stamm 589-5 enthält Deletionen der chromosomalen CLN1-, -2-, und -3-Gene und enthält das GAL1-CLN3-Gen auf einem Mehrkopien-Episom. Er wurde mit dem pADNS-Expressionsvektor oder dem pADNS-Vektor, enthaltend eine humane Cyclin-E-cDNA, transformiert. Transformanten, und der Eltern-Stamm, wurden auf Galactose und Glucose ausgestrichen und 3 Tage lang bei 30°C wachsen gelassen.
2 (SEQ. ID. Nr. 1–2) zeigt die Sequenz von Cyclin E: DNA- und vorhergesagte Proteinsequenz der Cyclin-E-cDNA, welche die Dreifach-cln-Deletion komplementierte.
3 zeigt eine Parallel-Übereinanderstellung der Proteinsequenzen der humanen Cycline A, B und E: Die Proteinsequenzen der Cycline A, B und E wurden parallelgestellt bzw. aligniert, um die Homologie zu maximieren. Die Kästen zeigen identische Aminosäuren an. Aminosäuren, welche allen drei Cyclinen gemeinsam sind, werden oberhalb der drei Sequenzen in Fettdruck gezeigt. Der Bereich, welcher durch doppelte fette Linien hervorgehoben ist, ist eine unter allen bekannten Cyclinen hochkonservierte Domäne (die "Cyclin-Box"). Die durch einfache fette Linien hervorgehobene Domäne ist das mitotische Destruktions-Motiv, welches allen Cyclinen vom A- und B-Typ gemeinsam ist.
Die 4 zeigt die Effizienz eines Rescue bzw. einer Rettung der dreifachen cln-Defizienz durch humane Cycline E und B in CDC28- oder cdc28-13-Stämmen: Alle getesteten Stämme waren cln1-cln2^– cln3-(pGAL-CLN3); diese Stämme wurden mit den angegebenen Vektorplasmiden, pADNS oder pADANS, oder den Vektorplasmiden, enthaltend entweder humanes Cyclin E oder B, mittels Selektieren hinsichtlich Leucin-Prototrophie, transformiert. Der Vektor pADNS verwendet den Hefe-ADH-Promotor für die Expression der cDNA. Der Vektor pADANS ist identisch zu pADNS, außer dass das exprimierte Protein an seinem Aminoterminus an die ersten 10 Aminosäuren des ADH-Proteins fusioniert ist. Es konnten keine Transformanten mit dem Plasmid pADNS-CYC-B erhalten werden, was nahelegt, dass es letal war. Die Anzahl von lebensfähigen Kolonien in einem Inoculum der stationären Phase-Kultur in Galactose wurde durch eine Verdünnungsreihe, gefolgt von 4–5 Tagen Wachstum sowohl auf Galactose als auch Glucose enthaltendem Medium bei 30°C, bestimmt. Die Plattierungseffizienz ist als die Anzahl von Glucose-lebensfähigen Kolonien, dividiert durch die Anzahl von Galactose-lebensfähigen Kolonien, definiert. In der Berechnung werden lediglich Kolonien verwendet, welche aus Plasmid-tragenden Zellen resultieren. Sowohl YC- als auch YEP-Medien wurden mit vergleichbaren Ergebnissen verwendet. Die Werte für Vektor und pADNS-CYC-E wurden in vier Experimenten unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Paaren von CDC⁺- und cdc28-13-Stämmen bestimmt (ein CDC⁺- und ein cdc28-13-Stamm wurden parallel in jedem Experiment getestet). Die pADANS-CYC-E-Werte stammen aus einem Einzelexperiment. Die Cyclin-B-Werte wurden in zwei Experimenten, beide mit dem gleichen Paar von CDC⁺- und cdc28-13-Stämmen, bestimmt. Alle Stämme waren isogen. Die Bereiche der Werte für die CDC⁺-Stämme waren: für pADNS-CYC E 012–0,4; für pADANS-CYC B 0,19–0,33; für den cdc28-13-Stamm pADNS-CYC-E 0,0006–0,008; und für pADANS-CYC B 0,2–0,4. Mit beiden Cyclin-E-Plasmiden waren die Koloniegrößen für cdc28-13-Stämme auf Glukosemedium signifikant kleiner als die Koloniegrößen für CDC⁺-Stämme; für das Cyclin-B-Plasmid waren die Koloniegrößen in den Stämmen CDC⁺ und cdc28-13 ähnlich.
Die 5 zeigt die Konstruktion eines Hefestamms, in welchem CDC28 bezüglich START aber nicht G2/M defekt ist: Der Hefestamm 1238-14C-cycE besitzt den folgenden relevanten Genotyp: cln1^– cln2^– cln3^– cdc28¹³ (pADH-cycE-TRP1, pGAL-CLN3-URA3). Die vermeintlichen Cyclin-cdc28-13-Komplexe, welche die G1/S- und G2/M-Übergänge in diesem Stamm regulieren, sind angezeigt. Gezeigt werden Cyclin-cdc28-13-Komplexe, welche sich entweder auf Galactose oder Glucose bilden, und die funktionelle Aktivität dieser Komplexe entweder bei 30° oder 38°C. CLB ist die Nomenklatur, verwendet zur Bezeichnung der S. cerevisae-Homologe der B-Typ-Cycline. Auf Glucose bei 30°C ist dieser Stamm hinsichtlich START aber nicht G2/M defekt.
Die 6 zeigt die Effizienz der Rettung der Dreifach-cln-Defizienz in einem cdc28-13-Stamm durch humanes Cyclin E in Verbindung mit humanem CDC2 oder humanem CDK2: Ein Stamm des Genotyps cln1^– cln2^– cln3^– cdc28-13 (pGAL-CLN1/URA3) wurde entweder mit pMAC-TRP1-CYC E und pADNS-LEU2-CDC2-HS oder mit pMAC-TRP1-CYC E und pADNS-LEU2-CDK2-HS cotransformiert. Die Transformanten wurden hinsichtlich Leucin-, Tryptophan- und Uracil-Prototrophie auf Galactose selektiert. Zwei unabhängige Trans formanten wurden über Nacht nicht-selektiv herangezogen, und Plasmid-Verlust-Ereignisse wurden im Anschluss an die Kolonie-Reinigung identifiziert. Dies führte zur Erzeugung von isogenen Sätzen von Stämmen, entweder enthaltend sowohl Cyclin E als auch CDC2-HS (oder CDK2-HS) oder jedes Gen allein. Zwei derartige Sätze wurden für jede Cotransformation erzeugt. Die zwölf Stämme wurden in dem oben stehend beschriebenen quantitativen Plattierungs-Assay (siehe Legende zu 4) getestet, mit der Ausnahme, dass die Plattierungseffizienz sowohl bei 30° als auch 38°C gemessen wurden. Stämme, enthaltend die gleichen Plasmidkombinationen, verhielten sich sehr ähnlich, und ihre Daten sind in der Tabelle vereinigt. Man bemerke, dass, anders als die in den Experimenten in 4 verwendeten Cyclin-E-Plasmide, das in diesen Experimenten verwendete pMAC-TRP1-CYC E-Plasmid im wesentlichen keine Rettung des cln1^– cln2^– cln3^– cdc29-13-Stamms ergibt.
Die 7 zeigt, dass Cyclin E die p334-cdc2-Kinase in Extrakten aus humanen G1-Zellen binden und aktivieren kann: Extrakte aus humanen Neugeborenen-MANCA-G1-Zellen wurden mit GT-Cyclin-E-Sepharose-Perlen, GT-Sepharose, p13-Sepharose oder Leerproben-Sepharose-Perlen vermischt. In Tafel A wurden die gebundenen Proteine mit Anti-Peptid-Antiserum gegen den Carboxyterminus von humanem CDC2 immungeblottet. In mit "+" markierten Spuren waren die Sepharose-Perlen mit dem humanen G1-Extrakt inkubiert worden. In mit "–" markierten Spuren wurden Leer-Inkubationen mit Puffer durchgeführt. Der Pfeil zeigt das gebundene 34-kDA-Protein, welches mit den C-terminalen Antikörpern reagiert, an. In Tafel B wurden die Perlen hinsichtlich Histon-H1-Kinase-Aktivität getestet. Die Pfeile zeigen die Mobilität von Histon-H1- und GT-Cyclin-E-Fusionsproteinen-Markern an. In der mit "cycE-IP" markierten Spur wurden die mit den GT-Cyclin-E-Sepharoseperlen assoziierten Proteine mit freiem Glutathion freigesetzt und mit einem Cyclin-E-Antiserum immunpräzipitiert. In C wurden die Proteine, welche entweder von der GT-Sepharose- oder GT-Cyclin-E-Sepharose durch freies Glutathion freigesetzt worden waren, mit einem affinitätsgereinigten C-Terminus-spezifischen p34-CDC2-Anti-Peptid-Antiserum immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden hinsichtlich H1-Kinase-Aktivität getestet.
Die 8 zeigt die Immunpräzipitation einer H1-Kinase-Aktivität aus HeLa-Zellen unter Verwendung von Anti-Cyclin-E-Antikörpern: In Tafel A wurde ein Antiserum, herangezogen gegen das GT-Cyclin-E-Fusionsprotein in Kaninchen, verwendet, um in vitro translatierte humane Cycline E, A und B zu immunpräzipitieren. Spuren 1 – 3: in vitro-Translationsprodukte von humanen Cyclinen E, A bzw. B. Spuren 4 – 6: Immunpräzipitate unter Verwendung des Cyclin-E-Antiserums der humanen Cycline E, A bzw. B. In der Tafel B wurden Extrakte aus exponentiell wachsenden HeLa-Zellen mit normalem Kaninchenserum, Anti-Cyclin-E-Serum und Anti-Cyclin-A-Serum immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden auf H1-Kinase-Aktivität getestet. Man bemerke die Autophoshporylierung eines 45-kDa- Proteins innerhalb der Cyclin-E-Immunpräzipitate. Dieses Protein comigriert mit Cyclin-E-Protein, hergestellt durch in vitro-Transkription/Translation der Cyclin-E-cDNA.
Die 9 zeigt differentielle Spiegel an Cyclin-E-Kinase-Komplexen in verschiedenen Subpopulationen von exponentiell wachsenden MANCA-Zellen, welche durch zentrifugale Elutriation in unterschiedliche Stadien des Zellzyklus fraktioniert wurden, wie beschrieben in Beispiel 8.
9A zeigt grafisch den DNA-Gehalt (Ordinate) von exponentiell wachsenden MANCA-Zellen, welcher cytofluorometrisch in unterschiedlichen elutriatierten Fraktionen gemessen wurde (Abszisse).
Die 9B zeigt grafisch den Spiegel an Cyclin-E-H1-Histon-Kinase-Aktivität in den elutriatierten Fraktionen von 9A.
Die 9C zeigt grafisch den Spiegel an Cyclin-A-H1-Histon-Kinase-Aktivität in den elutriatierten Fraktionen der Zellen von 9A.
Die 9D zeigt grafisch den DNA-Gehalt (Ordinate) von MANCA-Zellen in verschiedenen elutriatierten Zellfraktionen, freigesetzt in die G1-Phase des Zellzyklus während 3, 4, 5, 6 oder 7 Stunden nach Nocodazol-induzierter Metaphase.
Die 9E zeigt eine Säulengrafik, welche die Spiegel an Cyclin-A- und Cyclin-E-assoziierter H1-Histon-Kinase-Aktivität wiedergibt.
10, erörtert in Beispiel 8, zeigt die Spiegel an Cyclin E, wie bestimmt durch Messen der H1-Kinase-Aktivität, in Immunpräzipitaten von ruhenden bzw. quieszenten, wachsenden oder sich differenzierenden Ratten-208F- und PC-12-Zellen.
Die 10A zeigt ein Autoradiogramm von ³²P-markiertem H1-Histon. Die Phosphorylierung von H1-Histon wurde durch Immunpräzipitate von 208F-Zellen, herangezogen in 10 oder 0,1 % Kälberserum, katalysiert. Der Spiegel an Cyclin-E-assoziierter Kinase-Aktivität war in quieszenten (0,1 % CS) Zellen im Vergleich zu wachsenden Zellen (10 % CS) merklich reduziert.
Die 10B zeigt ein Autoradiogramm von ³²P-markiertem H1-Histon. Die Phosphorylierung von H1-Histon, katalysiert durch Immunpräzipitate, wurde bestimmt für PC-12-Zellen, herangezogen in Gegenwart oder Abwesenheit von Nervenwachstumsfaktor. Der Spiegel an Cyclin-E-assoziierter Kinase-Aktivität war in differenzierten (ruhenden) Zellen (-NGF) im Vergleich zu rasch proliferierenden Zellen (+NGF) merklich reduziert.
11, erörtert in Beispiel 9, zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen, entworfen zur Überprüfung von erhöhten Spiegeln an konstitutiv exprimiertem Cyclin E in Rat-1-Zellen, welche entweder mit einem retroviralen Vektor, codierend cyclin E (LXSN-cyclin E), oder dem LXSN-Vektor als Negativkontrolle transduziert waren.
11A(a) zeigt eine Autoradiographie eines Western-Immunoblots von Rat-1-Zelllysaten, transduziert entweder mit LXSN-cyclin E (Spur 2) oder, als Negativkontrolle, dem LXSN-Vektor allein (Spur 1). Erhöhte Spiegel an Cyclin E, wie gemessen durch Histon-H1-Kinase-Aktivität, waren in LXSN-Cyclin E-transduzierten Zellen, relativ zur Kontrolle, sichtbar.
11A(b) zeigt ein Autoradiogramm von ³²P-markiertem Histon H1, katalysiert durch Cyclin E-assoziierte Kinase in zellulären Immunpräzipitaten von LXSN-cyclin E-transduzierten Rat-1-Zellen (Spur 2) oder LXSN-transduzierten Kontroll-Rat-1-Zellen (Spur 1). Eine erhöhte Expression von cyclin E war in zellulären Immunpräzipitaten von LXSN-cyclin E-transduzierten Rat-1 sichtbar.
Die 11B präsentiert graphisch die Ergebnisse einer flusszytrometrischen Messung des nukleären DNA-Gehalts in Rat-1-Zellen, transduziert entweder mit LXSN (Rat-1/Kontrolle) oder dem retroviralen LXSN-cyclin-E-Vektor (Rat-1/Cyclin E), sowie den berechneten Bruchteil der Zellen in jeder Zellsubpopulation, welcher sich in den Phasen G1, S oder G2/M des Zellzyklus befand.
Die 11C präsentiert graphisch die Ergebnisse des immunchemischen Nachweises des Einbaus von BrdU (5'-Bromdesoxyuridin) in nukleäre DNA von Rat-1-Zellen, transduziert mit LXSN-cyclin E (ausgefüllte Rauten) oder LXSN (offene Quadrate), als Funktion der Zeit nach Entfernung eines mitotischen Blocks. Nur DNA synthetisierende Zellen (S-Phase-Zellen) bauen BrdU ein und erhalten eine positive Bewertung in diesem Assay, und so misst der Assay die Geschwindigkeit, bei welcher Zellen vom Abschluss einer Mitose in die DNA-Synthese für die nächste Mitose-Runde übertreten. Die Ergebnisse zeigen, dass LXSN-cyclin E-transduzierte Zellen rascher von der Mitose in die S-Phase übertreten als LXSN-transduzierte Kontrollzellen.
Die 12, erörtert in Beispiel 10, zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung, welche Proteine analysiert, die mit Cyclin E in exponentiell wachsenden MANCA-Zellen bei unterschied lichen Stadien im Zellzyklus assoziiert sind. Die Cyclin-E-assoziierten Proteine wurden durch Immunpräzipitation mit Anti-Cyclin-E-Antikörpern und SDS-PAGE gereinigt.
Die 13, erörtert in Beispiel 10, zeigt Autoradiogramme von Western-Immunoblots hergestellt im Anschluss an SDS-PAGE von Immunpräzipitaten, hergestellt aus MANCA-Zell-Extrakten, welche mit Anti-CDC2 ("αCDC2"), Anti-CDK2 ("αCDK2") oder Kontrollserum ("--") immunpräzipitiert wurden. Die Ergebnisse zeigen die Spezifität der Anti-CDC2- und Anti-CDK2-Antikörper, welche obenstehend in den 9 – 12 verwendet wurden. Die Immunoblots wurden durch Reagieren der Gele mit Anti-CDC-2 oder Anti-CDK2, gefolgt von ¹²⁵I-Protein A, sichtbar gemacht. Die Immunpräzipitate in den Spuren 1 und 2 wurden unter Verwendung von Ganzzellextrakten hergestellt; diejenigen in Spur 3 und 4 waren Kontrollextrakte, welche von CDC2 vorgeklärt waren; diejenigen in den Spuren 5 und 6 waren von CDK2 vorgeklärt; und die Spur 7 war ein Extrakt von MANCA-Zellen, welche an der G1/S-Grenze arretiert waren. Die Wanderungspositionen gemäß Protein-Molekulargewichtsstandards sind wie angegeben.
14, beschrieben in Beispiel 10, zeigt Western-Immunoblots, welche Komplexe von CDC2 und CDK2 mit Cyclin E in exponentiell wachsenden MANCA-Zellen und an der G1/S-Grenze mit Aphidicolin durch in Beispiel 10 beschriebene Verfahren arretierten Zellen nachweisen.
Die 14A zeigt einen Immunoblot von gereinigten Cyclin E:CDC2-Komplexen, aufgetrennt in seine zwei Bestandteilproteine auf SDS-PAGE und sichtbar gemacht durch Immunoblotting mit Antikörpern, spezifisch für den C-Terminus von humanem p34-CDC2. Die Spuren 1 und 8 waren Negativ-Kontrollproben, hergestellt aus einer Inkubation von Zellextrakten mit αPI; Spuren 2 und 7 waren Negativkontrollen aus einer Inkubation von Zellextrakten mit Sepharoseperlen (SEPH); die Spuren 3 und 6 zeigen Cyclin E:CDC2-Komplexe, gereinigt mittels Affinitätschromatographie oder Anti-p34-CDC2-Sepharose; die Spuren 4 und 5 zeigen Cyclin E:CDC2-Komplexe, gereinigt durch Affinitätschromatographie auf Anti-Cyclin E-Sepharose; die Spuren 9–11, markiert mit "--", sind Negativkontrollproben, hergestellt in einer Weise, identisch zu den Spuren 1–8, jedoch ohne Zellextrakt.
Die 14B zeigt einen Immunoblot von gereinigtem Cyclin E:CDK2-Komplex, getrennt in seine zwei Bestandteil-Proteine und CDK2, visualisiert durch Immunblotting mit Antikörpern, spezifisch für den C-Terminus von humanem CDK2. Die verwendeten Abkürzungen sind wie in der 14A angegeben. Die Lokalisierung auf einer SDS-PAGE von CDK2 in nicht-affinitätsgereinigtem SDS-PAGE-gereinigtem Zellextrakt ("EX") aus Zellen an der G1/S-Grenze ist in Spur 8 gezeigt.
15, beschrieben in den Beispielen 11–12, zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen, entworfen zur Bestimmung des Expressionsspiegels von Cyclin E und der Häufigkeit des Cyclin-E;CDK2-Komplexes in verschiedenen Stadien im Zellzyklus.
Die 15A zeigt graphisch den DNA-Gehalt (Ordinate) in verschiedenen Fraktionen von elutriatierten MANCA-Zellen, wie bestimmt durch Flusszytometrie von Propidiumiodidgefärbten Zellkernen.
15B1 zeigt grafisch die CPM des ¹²⁵I-Protein A, gebunden durch die CDK2-Polypeptid-Banden, welche in 15B2 immungeblottet wurden.
Die 15B2 zeigt Western-Immunoblots, welche den Expressionsspiegel von Cyclin E in jeder elutriatierten Subpopulation von Zellen (aus 15A) messen, wie bestimmt durch Immunaffinitätsreinigung von Cyclin E:CDK2-Komplexen mit Anti-Cyclin E-Sepharose, gefolgt von SDS-PAGE, und Visualisierung der Proteine in dem Komplex durch Western-Immunblot-Analyse unter Verwendung von Anti-CDK2, ¹²⁵I-Protein A und Autoradiographie.
15B3 zeigt graphisch die CPM von ¹²⁵I-Protein A, gebunden durch die Cyclin E ("cycE")-Polypeptidbanden, immunogeblottet in der 15B4.
Die 15B4 zeigt Western-Immunoblots, welche den Expressionspiegel von Cyclin E in elutriatierten Subpopulationen von Zellen aus der 15A mittels der in 15B2 beschriebenen Verfahren messen, jedoch unter Verwendung von Anti-Cyclin E und ¹²⁵I-Protein A, um den Spiegel an Cyclin E zu visualisieren, anstelle von Anti-CDK2.
Die 15C zeigt graphisch den Spiegel an ¹²⁵I-Protein A, gebunden von Anti-Cyclin E:Cyclin-E-Banden in Western-Immunoblots als Funktion der Menge an Zellextrakt (elutriatierter Fraktion-3-Extrakt), eingesetzt in den Verfahren der 15B1–B4. Das Ergebnis zeigt, dass das Erhöhen der Menge an Cyclin E das Ausmaß des Signals in dem Immunoassay für Cyclin E erhöhte.
Die 16, beschrieben in Beispiel 13, zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen, entworfen zur Erforschung der molekularen Assoziation von Cyclin E mit CDC2 und CDK2; des Zusammenbaus von Cyclin-E:CDC2- oder Cyclin-E:CDK2-Komplexen in vitro; und der Aktivierung von Phosphorylase-Kinase-Aktivität im Anschluss an eine Assoziation der Kinasen mit Cyclin E.
Die 16A zeigt die Ergebnisse von Experimenten, welche Phosphorylase-Kinase-Aktivität in Cyclin-E:CDK2-Komplexen assayen, welche mit einem für CDK2 spezifischen Antikörper (Anti-CDK2) immunpräzipitiert wurden. Die Komplexe wurden in den Zellextrakten von Hydroxyharnstoff-arretierten Zellen (HU) und in Extrakten von G1-Phase-Zellen (G1-Extrakt) in Abwesenheit (0) oder Gegenwart verschiedener Mengen (5, 1, 0,2) von rekombinantem Cyclin E gebildet. Die Kinaseaktivität in den Immunpräzipitaten wurde unter Verwendung von Histon H1 als Substrat, SUS-PAGE und Phosphor-Bilderzeugung der ³²P-markierten Histon-H1-Banden in den Gelen bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Cyclin E zu G1-Zellextrakten die latente Kinaseaktivität in den Extrakten in einer dosisabhängigen Weise aktivierte, d. h. der Spiegel an gemessener Kinaseaktivität war von der Menge an zugesetztem Cyclin E abhängig.
16B zeigt die Ergebnisse von Experimenten, welche Phosphorylase-Kinaseaktivität in Cyclin-E-Komplexen assayen. Die Experimente wurden wie obenstehend in der 16A beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung von für Cyclin E spezifischen Antikörpern (Anti-Cyclin E) anstelle von Anti-CDK2. Die Ergebnisse bestätigen diejenigen, welche oben stehend in 16A präsentiert sind: nämlich dass Cyclin E eine latente CDC-Kinaseaktivität in Extrakten von G1-Zellen auf eine dosisabhängige Weise aktiviert.
Die 16C zeigt die Ergebnisse von Experimenten, entworfen, um einen Assay hinsichtlich der Phosphorylase-Kinaseaktivität in Cyclin-E:CDC2-Komplexen vorzunehmen. Die Experimente wurden ausgeführt, wie obenstehend in 16A beschrieben, jedoch unter Verwendung von für CDC2 spezifischen Antikörpern (Anti-CDC2). Die Ergebnisse zeigen minimale bis keine CDC2-Kinaseaktivität in G1-Extrakten von Zellen, sogar wenn Cyclin E zugesetzt wurde.
Die 17 zeigt graphisch die Ergebnisse, erhalten in den obenstehenden 16A, 16B und 16C. Die mit jedem einzelnen G1-Zellextrakt-Immunpräzipitat erhaltenen Ergebnisse (CDC2, gefüllte/am meisten links befindliche Balken im Satz von 3 Balken; CDK2, schraffierte Balken/Mitte jedes Satzes; oder Cyclin E, schattierte/am meisten rechts befindliche Balken in jedem Satz von drei), werden als ein Prozentsatz des Phosphor-Bilderzeugungssignals, welches mit der Kinase in dem HU-Zellextrakt-Immunpräzipitat erhalten wird (d.h. 100 %; % Hydroxyharnstoff H1-Kinase), ausgedrückt. Die Zahlen oben an jedem Balken bedeuten den Maximalwert, aufgezeichnet in Prozent (%). Die Ergebnisse zeigen, dass Cyclin E eine latente CDK2-Kinaseaktivität in den G1-Zellextrakten aktivierte, und dass die Aktivität der Kinase abhängig von der zugesetzten Menge an Cyclin E war (d.h. ausgedrückt als das Vielfache der Verdünnung des zu dem HU-Extrakt zugesetzten Cyclin E; "Vielfaches an Cyclin E in HU- Extrakt"). Die Ergebnisse zeigen an, dass die Verfügbarkeit von Cyclin E ein Faktor ist, der die Phosphorylase-Kinase-Aktivität während der G1-Phase des Zellzyklus steuert.
Die 18, beschrieben im Beispiel 14, repräsentiert graphisch die Effekte von Serumwachstumsfaktoren auf die Geschwindigkeit, bei welcher LXSN-cyclin E-transduzierte Rat-1-Zellen und LXSN-transduzierte Kontrollzellen eine DNA-Synthese im Anschluss an Nocodazol-arretierte Mitose initiieren. Der Einbau von BrdU in nukleäre DNA wurde in LXSN-cyclin E-transduzierten (RAT1/Cyclin E) oder LXSN-transduzierten (RAT 1/LX) Kontrollzellen als Funktion der Zeit nach der Nocodazol-Mitose-Blockierung gemessen. Lediglich DNA-synthetisierende Zellen (d. h. S-Phase-Zellen) bauen BrdU in DNA ein, und das Auswerten der Anzahl von Zellkernen in einer Zellkultur (d. h. % markierte Kerne) kann somit verwendet werden, um die Übertrittsgeschwindigkeit der Zellen von der G1 in die S-Phase auszuwerten.
Die 18A zeigt die Ergebnisse von Experimenten, entworfen zur Auswertung der Geschwindigkeit, bei welcher LXSN-cyclin E-transduzierte (RAT1/Cyclin E) oder LXSN-transduzierte (RAT1/LX) Kontroll-Zellen DNA-Synthese im Anschluss an die Freigabe einer Nocodazol-Blockierung initiieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die cyclin E-transduzierten Zellen DNA-Synthese mehr als 2–3 Stunden früher als kontroll-transduzierte Zellen initiierten, und die Rate der Zellkern-Markierung (d. h. Initiation der DNA-Synthese) war ebenfalls in den Cyclin E-transduzierten Zellen größer (wie verdeutlicht durch die unterschiedlichen Steigungen der zwei Kurven).
Die 18B zeigt die Ergebnisse von Experimenten, entworfen, um die Wachstumsfaktorabhängigkeit für die Initiierung von DNA-Synthese in LXSN-cyclin E-transduzierten und LXSN-transduzierten Kontroll-Zellen auszuwerten. Beide Typen von Zellen wurden in Medium kultiviert, enthaltend entweder 1 % oder 0,1 % Rinder-Kälberserum. Die Ergebnisse zeigen, dass a) LXSN-cyclin E-transduzierte Zellen die DNA-Synthese, im Anschluss an eine Freigebung des Nocodazol-Blocks, in entweder 1 % oder 0,1 % Serum schneller initiierten als Kontrollzellen, und b) die cyclin E-transduzierten Zellen weniger abhängig von Wachstumsfaktoren waren, als LXSN-transduzierte Kontrollzellen, wie verdeutlicht durch ihre schnellere Initiation der DNA-Synthese in niedrigem Serum (d. h. die LXSN-cyclin E-transduzierten Zellen initiierten die DNA-Synthese mehr als 6–8 Stunden früher als LXSN-transduzierte Zellen in 0,1 % Serum), und die Cyclin E-transduzierten Zellen proliferierten des Weiteren rascher bei den Niederserum-Bedingungen als die Kontrolle (d. h. wie bestimmt durch Vergleichen der Steigungen der zwei transduzierten Zelltypen, herangezogen in 0,1 % Serum).
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Ein neues humanes Cyclin, genannt Cyclin E, wurde isoliert durch Komplementierung einer dreifachen cln-Deletion in S. cerevisae. Das Cyclin E zeigte genetische Wechselwirkungen mit dem CDC28-Gen, was nahe legt, dass es am START durch Wechselwirken mit dem CDC28-Protein funktionierte. Es wurden zwei menschliche Gene identifiziert, welche mit Cyclin E wechselwirken konnten, um den START in Hefe, enthaltend eine cdc28-Mutation, zu vollführen. Eines war cdc2-HS, und das Zweite war das humane Homolog zu Xenopus-CDK2. In E. coli hergestelltes Cyclin E band und aktivierte das CDC-2-Protein in Extrakten aus humanen G1-Zellen, und Antikörper gegen Cyclin E immunpräzipitierten eine Histon-H1-Kinase aus HeLa-Zellen. Die Wechselwirkungen zwischen Cyclin E und CDC2, oder CDK2, können beim Übergang von G1 nach S in menschlichen Zellen bedeutsam sein.
Die Erfindung sieht Nukleinsäuremoleküle vor, fähig zur Hybridisierung an die humane Cyclin-E-cDNA, gezeigt in 2, von Position 1 bis 1185 unter stringenten Bedingungen. Obwohl nur ein einzelner (+)-Strang der cDNA in der 2 gezeigt ist, wird der Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass sein komplementärer (–)-Strang dadurch gleichfalls offenbart wird. Mit Nukleinsäuremolekül werden DNA-, RNA- und/oder synthetische Nukleotid-Sequenzen, wie Oligonukleotide, gemeint, welche gleich zur, homolog mit, oder komplementär zu mindestens einer Helixwindung (etwa 10 bis 15 Nukleotide) der veranschaulichten Cyclin E-Nukleotid-Sequenz sind. Die Erfindung sieht mehr als drei Cyclin E-cDNAs vor, resultierend aus dem alternativen Spleißen von Cyclin E-mRNAs, genetischem Polymorphismus und Translokation in der Krebsentstehung. Der Fachmann wird erkennen, dass Mitglieder dieser nahverwandten Gruppe von Cyclin E-Nukleinsäuren leicht durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, unter stringenten Bedingungen mit der Gesamtheit oder Abschnitten der Nukleotidsequenz von 2 oder ihrem komplementären (–)-Strang zu hybridisieren. Mit "fähig zum Hybridisieren unter stringenten Bedingungen" wird die Anlagerung eines Nukleinsäuremoleküls an wenigstens eine Region der offenbarten Cyclin E-Nukleinsäuresequenz (ob als cDNA, mRNA oder genomische DNA) oder an ihren komplementären Strang unter Standardbedingungen gemeint, z. B. hohe Temperatur und/oder niedriger Salzgehalt, welche dazu neigen, eine Hybridisierung von nicht-komplementären Nukleotidsequenzen nicht zu begünstigen. Ein geeignetes Protokoll (beinhaltend 0,1 × SSC, 68°C während 2 Stunden) wird beschrieben in Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982, auf den Seiten 387–389. Derartige hybridisierende Nukleinsäuremoleküle können mit der offenbarten Sequenz verwandt sein durch Deletion, Punktmutation, Basensubstitution, Rasterverschiebung, alternative ORFs, mRNA-Splicing und -Prozessierung oder posttranskriptionale Modifikation (z. B. Methylierung und dergleichen). Beispielsweise werden Antisense-Nukleinsäuren vorgesehen, aufweisend Nukleotidsequenzen, kom plementär zu der Cyclin E-Sequenz, und charakterisiert durch die Fähigkeit, die Expression eines Cyclin E-Gens zu inhibieren, z. B. durch Binden und Inhibieren der Translation einer Cyclin E-mRNA. Antisense-Nukleinsäuren können innerhalb einer Wirtszelle codiert werden, z. B. im Anschluss an Transduktion oder Transfektion der Zelle mit einer Vektor-DNA-oder RNA-Sequenz, codierend eine Antisense-Nukleinsäure, oder die Antisense-Nukleinsäuren können alternativ synthetische Oligonukleotide sein. Solche Antisense-Oligonukleotide werden durch eine Vielzahl von Mitteln in Zellen eingeführt, z. B. mit retroviralen Vektoren, codierend Antisense-mRNA in der Zelle, oder durch Fusionieren der Zelle mit Liposomen, enthaltend ein Antisense-Oligonukleotid, und dergleichen. Die vorliegenden Antisense-Nukleinsäuremoleküle sind durch ihre Fähigkeit gekennzeichnet, unter stringenten Bedingungen mit der veranschaulichten Cyclin-E-Nukleinsäure, ihrem komplementären Strang, 5'-transkriptionsregulatorischen Regionen eines Cyclin E-Gens oder translationsregulatorischen Regionen einer Cyclin E-mRNA zu hybridisieren.
Die isolierten Nukleinsäuren der Erfindung codieren vorzugsweise Cyclin E-Polypeptide. Solche Polypeptide werden nicht notwendigerweise von den zuvor erwähnten isolierten Nukleinsäuremolekülen codiert, da der Fachmann erkennen wird, dass die offenbarte Cyclin E-Nukleotidsequenz die Konstruktion einer Vielzahl von synthetischen Polypeptiden gestattet. Solche synthetischen Polypeptide können hinsichtlich der Länge variieren (z. B. von etwa 5 Aminosäuren bis zu vielen hunderten Aminosäuren) und können entsprechend zu ausgewählten Regionen des codierten Cyclin E-Polypeptids konstruiert sein. Die vorliegenden Cyclin E-Polypeptide umfassen somit isolierte Cyclin E-Polypeptide (d. h. gefunden in normalen Zellen), mutante Polypeptide (z. B. resultierend aus Mutagenese oder gefunden in Tumorzellen) und chemisch modifizierte Polypeptide (z. B. mit einer oder mehreren chemisch veränderten Aminosäuren, in welchem Fall eine bezeichnete Aminosäure in eine andere Aminosäure umgewandelt oder chemisch substituiert oder derivatisiert und dergleichen sein kann). Funktionelle Stellen in den Cyclin-E-Polypeptiden werden identifiziert z. B. durch Konstruieren von Mutanten der Cyclin-E-Nukleinsäure und Testen der Konstrukte hinsichtlich Expressionsprodukten mit veränderten funktionellen Eigenschaften, wie dem Versagen, eine CDC-Proteinkinase zu binden oder zu aktivieren, oder dem Versagen, den Zellzyklus voranzutreiben. Besonders nützlich zum Konstruieren derartiger Mutanten sind Regionen mit konservierter Nukleotid- oder Aminosäuresequenz, z. B. konserviert zwischen den Cyclinen A, B, C, D und E, oder konserviert unter den Mitgliedern der Cyclin-E-Familie. Konservierte Regionen von Cyclin E sind funktionelle und protein-strukturelle Regionen des Polypeptids.
In einem veranschaulichenden bevorzugten Aspekt gestattet die Expression eines Cyclin-E-Polypeptids in einer Zelle, dass die Spiegel an Cyclin E in der Zelle bis zu einem Punkt ansteigen, an welchem Cyclin E eine CDC-Proteinkinase bindet und aktiviert und bestimmte Wachstumsfaktor- und Serum-Anforderungen für das Fortschreiten der Zelle durch die G1-Phase des Zellzyklus eliminiert. Als Ergebnis wird die G1-Phase des Zellzyklus verkürzt. Die G1-Phase dauert üblicherweise etwa 8 bis etwa 12 Stunden, und die Expression eines CyclinE-Polypeptids in einer Zelle (oder die Exposition einer Zelle an ein Cyclin-E-Polypeptid) kann die G1-Phase um etwa 1 Stunde bis mehrere Stunden verkürzen. Dass ein Cyclin der Erfindung die G1-Phase des Zellzyklus verkürzt, kann vom Fachmann auf dem Gebiet leicht durch Anwendung eines Modelltestsystems bestimmt werden, wie demjenigen, welches nachstehend in den Beispielen vorgesehen wird, z. B. mittels der "598-5"- oder "1238-14C"-Stämme von Hefe. Alternativ dazu kann eine Säugerzelle, wie eine NIH3T3-Zelle, mit einem Expressionsvektor transfiziert oder transduziert werden, der eine Cyclin-E-hybridisierende Nukleinsäure enthält, und die Länge der G1-Phase des 3T3-Zellzyklus kann dann in kinetischen Zellzyklus-Assays bestimmt werden, wie denjenigen veranschaulichenden Beispielen, welche nachstehend vorgesehen sind. Zum Beispiel wird der Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass das Fortschreiten von Zellen von der M- in die S-Phase gemessen werden kann (d. h. in Stunden und Minuten) durch Bestimmen des Einbaus von tritiummarkiertem Thymidin oder Bromdesoxyuridin (BrdU. Cyclin-E-Nukleinsäure, wenn in Testzellen transfiziert oder transduziert, induziert entweder ein rascheres Fortschreiten der Zellen aus der M-Phase in die S-Phase; oder ein Fortschreiten der Zellen von M zu S ohne Erfordernis äußerer Reize, d. h. Serum- oder Wachstumsfaktoren und dergleichen. In jedem Fall führt das Einführen des vorliegenden Cyclins in die Testzellen zu einer Verkürzung der G1-Phase und einem schnelleren Fortschreiten von M zu S.
Repräsentative Beispiele von CDC-Proteinkinasen, an welche Cyclin E bindet, schließen CDC2, CDC28, CDCK2-XL, CDC2-HS und CDK2-HS ein. (Man bemerke, dass in dieser Terminologie "HS" für Homo sapiens und "XL" für Xenopus laevis steht.) Die Erfindung sieht auch Verfahren zum Identifizieren und Klonieren anderer CDC-Kinasen vor, welche von Cyclin E gebunden und aktiviert werden (siehe Beispiel 10 nachstehend). Der Fachmann wird verstehen, dass synthetische Cyclin-E-Polypeptide ohne weiteres durch Modifizieren der offenbarten Aminosäuresequenz und Testen hinsichtlich veränderter funktioneller Eigenschaften konstruiert werden können, d. h. veränderter Bindung, Aktivierung einer CDC-Proteinkinase und/oder veränderter Fähigkeit, die G1-Phase des Zellzyklus zu verkürzen. Solche synthetischen Cyclin-E-Polypeptide sind nützliche kompetitive und nicht-kompetitive Inhibitoren eines normalen oder mutanten Cyclin E (d. h. abgeleitet aus einer normalen oder mutanten Zelle) oder von dessen CDC-Proteinkinase-Bindungspartner. Solche synthetischen Polypeptide schließen auch Polypeptid-Antagonisten oder -Agonisten ein, welche nützlich zur Änderung der funktionellen Eigenschaften des Cyclin-E:CDC-Proteinkinase-Komplexes sind, z. B. durch Erhöhen, Verringern oder sonstiges Modifizieren oder Modulieren: a) der Phosphorylaseaktivität, welche von der CDC-Proteinkinase aktiviert wird; b) der Aktivität von Cyclin E, z. B . z um A ktivieren der CDC-Proteinkinase; c) der Zellzyklus-beschleunigenden Aktivität des Cyclin-E: Zellteilungskinase-Komplexes; und/oder d) von transkriptionsregulatorischen Faktoren, welche an die 5'-Region des Cyclin E-Gens binden.
Der Fachmann wird fernerhin verstehen, dass die hierin beschriebene Offenbarung von r ekombinanten Cyclin E-Nukleinsäuren, Zellen und in vitro-Assays Möglichkeiten bereitstellt, um nach Verbindungen zu screenen, welche die funktionelle Aktivität eines Cyclin E-Proteins oder einer Cyclin E-Nukleinsäure in einer Zelle modulieren oder völlig verändern. In diesem Kontext wird mit "Modulieren" beabsichtigt, zu bedeuten, dass die vorliegende Verbindung eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten) eines Cyclin-E-Proteins oder -Nukleinsäure erhöht oder verringert, wohingegen mit "Verändern" beabsichtigtermaßen gemeint wird, dass die vorliegende Verbindung die funktionelle Aktivität des Cyclin-E-Proteins oder – Nukleinsäure vollständig zu einer unterschiedlichen funktionellen Aktivität verändert. In diesem Kontext ist ein Beispiel einer Verbindung, welche die Aktivität eines Cyclin-E-Proteins "moduliert", ein Inhibitor, fähig zum Senken des Spiegels der CDC-Kinaseaktivität im Anschluss an die Bindung eines Cyclin E an die CDC-Kinase; und ein Beispiel einer Verbindung, welche die Aktivität eines Cyclin-E-Proteins "verändert" ist ein Mittel, welches Cyclin E dazu veranlasst, an CDC anstelle von CDK2 zu binden.
Die in den Beispielen (nachstehend) veranschaulichten Screening-Assays schließen biochemische Assays (z. B. das Messen der Effekte von Cyclin-E-Protein auf CDC- und CDK2-Phosphorylase-Aktivität) und zelluläre in vitro-Assays (z. B. das Messen der Effekte von Cyclin E-Expression auf die Zellproliferation) ein. Die beispielhaften veranschaulichenden biochemischen Assays können besonders nützlich beim Screening nach Verbindungen sein, welche eine Cyclin-E-Molekularaktivität modulieren, wohingegen die zellulären Assays besonders nützlich beim Screening nach Verbindungen sein können, welche eine Aktivität von Cyclin E in einer Zelle verändern. Beispielsweise nimmt Cyclin E in proliferierenden Zellen mit anderen Cyclinen, CDC-Kinasen, Wachstumsfaktor-"Second Messengers", transkriptionsregulierenden Faktoren und dergleichen an der Regulierung der proliferativen Antwort einer Zelle auf ihre Umgebung teil. Der Fachmann wird verstehen, dass die Bindung eines Liganden an eine molekulare Bindungsstelle auf eine direkte Weise moduliert (z. B. durch Blockieren der Stelle) sowie auf eine indirekte Weise (z. B. durch Konformationsänderungen, herbeigeführt im Anschluss an die Bindung eines zweiten (anderen) Liganden an einer andernorts gelegenen Stelle) verändert werden kann. In dieser Hinsicht ist es wahrscheinlich, dass die Bindungsstellen-Spezifität von Cyclin E für eine besondere CDC-Kinase (oder irgendeinen anderen zellulären Kontrollfaktor, wie untenstehend erörtert) vollständig verändert werden kann (d.h., um einen unterschiedlichen Liganden zu binden) durch Mittel, welche an andernorts gelegenen Stellen in dem Cyclin-E-Polypeptid binden. Beispiele von Verbindungen, welche in den letztgenannten mehreren Assays gescreent werden können, schließen wenigstens Nukleinsäuren (z. B. DNA-Oligonukleotid-Aptamere, welche Proteine binden und ihre Funktionen verändern), Proteine, Kohlenhydrate, Lectine, organische Chemikalien und dergleichen ein.
Derartige Screening-Assays können zur Idetifizierung von therapeutischen Kandidatenmitteln nützlich sein, welche in Tieren und Menschen nützliche Arzneimittel vorsehen können.
Es versteht sich noch weiterhin, dass aufgrund der Bedeutung von Cyclin E und der Cyclin-E:CDC-Proteinkinase im Zellzyklus angeborene regulatorische Mechanismen in der Zelle zur Regulierung ihrer Aktivität durch Bindung an Cyclin E oder an Cyclin E enthaltende Komplexe existieren. Solche regulatorischen Faktoren können mindestens: a) Cofaktoren, welche an den Komplex binden und eine regulatorische Wirkung durch Destabilisieren oder Stabilisieren des Komplexes ausüben; b) Mittel, welche die Aktivität des Komplexes modulieren oder verändern durch Herbeiführen von Konformationsänderungen in der CDC-Protein-Kinase und/oder Cyclin-E-Polypeptiden, wenn sie in dem Komplex miteinander gebunden werden; c) Enzyme, welche ein oder beide Mitglieder des Komplexes inaktivieren; und d) zelluläre Kontrollfaktoren (z. B. "Second Messengers" in der Signaltransduktion, Transkriptionsregulationsfaktoren und dergleichen), welche Cyclin E oder Cyclin-E-Komplexe binden und die funktionelle Aktivität modulieren oder verändern, einschließen. Somit können künstliche Polypeptide konstruiert werden, welche die Aktivität der Cyclin-E:CDC-Proteinkinase-Kinase-Komplexe in der Zelle durch Inhibieren oder Fördern der Aktivitäten solcher regulatorischer Faktoren steuern. Der Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass die funktionellen Regionen von Cyclin E besonders attraktive Ziele für die dreidimensionale Molekülmodell-Erzeugung und für die Konstruktion von Nachahmer-Verbindungen darstellen, z. B. organischen Chemikalien, konstruiert, um die dreidimensionalen Wechselwirkungen zwischen dem Cyclin E und seinem CDC-Proteinkinase-Bindungspartner nachzuahmen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle vor, welche künstliche Cyclin-E-Polypeptide codieren, die an CDC-Proteinkinasen binden, aber sie nicht aktivieren.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Polypeptide vorgesehen, welche von Nukleinsäuren codiert werden, entsprechend den folgenden Regionen der Cyclin-E-Nukleotidsequenz (d. h. Regionen, welche zwischen den Cyclinen A, B und E konserviert sind): nämlich a) einer carboxyterminalen Leucin-Wiederholungs-Sequenz (d. h. lokalisiert zwischen den Positionen 640 und 1185, und genauer gesagt zwischen den Positionen 631 und 936 der in 2 gezeigten Cyclin-E-cDNA); b) einer MRAIL-Sequenz (d. h. lokalisiert zwischen den Positionen 385 und 645 der in 2 gezeigten Cyclin-E-cDNA); und c) einer C-terminalen Sequenzregion (d. h. lokalisiert zwischen den Positionen 1048 und 1080 der in 2 gezeigten Cyclin-E-cDNA). Die MRAIL-Sequenz ist notwendig, aber nicht hinreichend, für eine Bindung an eine Zellteilungskinase.
Es versteht sich weiterhin, dass mutante Cyclin E-Nukleotidsequenzen aus der in 2 gezeigten Sequenz konstruiert werden können. Die vorliegenden, mutanten Cyclin-E-Nukleotidsequenzen werden durch ihre Fähigkeit erkannt, für mutante Cyclin-E-Polypeptide zu codieren, welche eine Bindungsaffinität für ein CDC-Kinase(z. B. CDK2)-Polypeptid besitzen können, die höher oder niedriger als diejenige ist, welche von einem Cyclin-E-Polypeptid für eine CDC-Kinase in einer nicht-transformierten Säugerzelle aufgezeigt wird. Die vorliegenden mutanten Polypeptide können des Weiteren die Enzymaktivität der CDK2-Kinase ändern (d. h. erhöhen oder erniedrigen), wenn das vorliegende mutante Cyclin-E-Polypeptid und CDK2 gemeinsam in einem Komplex vorliegen. Veranschaulichende Beispiele für die veränderte Enzymaktivität beinhalten: a) erhöhte oder verringerte enzymatische Aktivität (z. B. Km, Vmax, kcat, und dergleichen); b) veränderte Stabilität der Kinase in dem Komplex (z. B. gegenüber dem zeitabhängigen Abbau des Komplexes oder der enzymatischen Aktivität); c) veränderte Anfälligkeit der Kinase gegenüber proteolytischer Inaktivierung; d) veränderte Anfälligkeit von CDK2 gegenüber Dissoziation aus dem Cyclin-E:CDK2-Komplex in Antwort auf die Bindung von regulatorischen Faktoren (obenstehend erörtert) durch den Komplex; oder e) veränderte Empfindlichkeit der Kinase in dem Komplex gegen kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren. Der Fachmann wird eine Vielzahl von Verfahren erkennen, mittels derer die Sequenz in 2 mutiert werden kann (z. B. mit chemischen Mitteln oder Strahlung) und mittels derer Klone von Zellen, welche die mutierten Cyclin-E-Nukleotidsequenzen enthalten, identifiziert und/oder selektiert werden können. Die vorliegenden mutanten Cyclin E-Nukleotidsequenzen sind nützlich zur Modulierung oder Veränderung der Aktivität eines Cyclin-E:CDK2-Komplexes in einer Zelle, z. B. in einer Tumorzelle, um CDK2-Kinaseaktivität zu verringern und die Zellproliferation zu verlangsamen, oder in einer enddifferenzierten Zelle, um CDK2-Kinase zu erhöhen und das Wachstum zu stimulieren. Die vorliegenden, mutanten Cyclin E-Nukleotidsequenzen können unter Verwendung von Vektoren, wie den beispielhaften retroviralen Vektoren in Beispiel 9, eingeführt werden.
Künstliche Cyclin-E-Polypeptide, organische chemische Nachahmerstoffe, Antisense-RNA und Oligonukleotide und dergleichen finden ein weites Anwendungsfeld als selektive Inhibitoren der Zellproliferation, welche durch Wachstumsfaktoren, Mitogene, Cytokine und ähnliche Mittel ausgelöst wird, ohne die laufende mitotische Reparatur-Aktivität in einem Gewebe zu inhibieren. Somit wird es richtig einzuschätzen sein, dass die synthetischen Polypeptide, Mimetika und Antisense-Ausführungsformen der Erfindung vorzugsweise differenzielle inhibierende Aktivitäten aufzeigen werden; wenn z. B. der vorliegende Inhibitor in zwei Zellen eingeführt wird, eine, welche von einem Cytokin zur Proliferierung gebracht wurde, und eine Zweite, welche eine Mitose durchläuft, wird die erste Zelle inhibiert, aber die zweite Zelle nicht. Die vorliegenden synthetischen Cyclin-E-Polypeptide der Erfindung inhibieren nur Zellen, welche von G1 zu S übertreten, und nicht jene Zellen, welche bereits aktiv eine Mitose durchlaufen. Somit wird der Fachmann auf dem Gebiet erkennen, dass repräsatative Anwendungsbeispiele das Inhibieren der Induktion von Immunantworten; das Unterbrechen einer klonalen Expansion (d.h. entweder T- oder B-Lymphozyt) einer laufenden Immunantwort; das Inhibieren der wachstumsfaktor-induzierten Proliferation von Tumorzellen oder Metastasen-Zellen, welche von G1 nach S übertreten; und das Inhibieren einer wachstumsfaktorinduzierten Gewebe-Hypertrophie (z. B. vaskuläre Proliferation der glatten Muskelzellen, wie in arteriosklerotischen Plaques, mesenchymale Hypertrophie von Fibroblasten und Bindegewebszellen, wie in rheumatischen Gelenken, und dergleichen) einschließen. Die vorliegenden selektiven Inhibitoren werden beispielsweise zweckdienlich erkannt durch ihre Fähigkeit: a) die Spiegel an Cyclin-E-Polypeptid oder -mRNA in einer Testzelle in vitro zu senken (oder zu erhöhen) (d. h. verglichen mit einer Kontrollzelle des gleichen Typs); b) den Spiegel von Cyclin E zu senken (oder zu erhöhen), welches einen Komplex mit CDK2 bilden kann; oder c) die Bindungsaffinität von Cyclin-E-Polypeptiden für Mitglieder der CDK2-Familie von zellzyklus-abhängigen Kinasen in Säugerzellen zu senken (oder zu erhöhen). Der Fachmann wird erkennen, dass das Messen einer verringerten (oder erhöhten) Aktivität eines vorliegenden selektiven Inhibitors unter Anwendung von asynchronisierten oder synchronisierten Zellkulturen erfolgen kann; z. B. werden in synchronisierten Kulturen von Zellen die Cyclin-E-Spiegel und -Aktivitäten während der G1-Phase des Zellzyklus untersucht.
Aspekte der Erfindung schließen rekombinante Expressionsvektoren, wie virale Vektoren für Säugerzellen (z. B. Retroviren, ähnlich zu jenen, veranschaulicht in Beispiel 9, Vaccinia-Virus, Adenoviren, CMV und dergleichen) und Plasmid- oder Cosmid-Vektoren, nützlich zum Transfizieren und Transduzieren von Nukleinsäure in prokaryotische und eukaryotische Zellen, ein. Rekombinante Expressionsvektoren der Erfindung werden beispielsweise konstruiert durch funktionstüchtiges Verknüpfen einer Cyclin E-Nukleinsäure an geeignete Kontrollsequenzen. "Funktionstüchtiges Verknüpfen" wird hierin verwendet, um das Ligieren einer Cyclin E-Nukleinsäure an eine Expressions-Vektor-Nukleinsäure in einer zur Transkription und Translation von Cyclin E geeigneten Weise zu bedeuten, vorzugsweise unter einer vorherbestimmten positiven (oder negativen) regulatorischen Steuerung, ausgeübt durch Kontrollsequenzen in dem Expressionsvektor (d. h. enthaltend regulatorische Sequenzen, fähig zur Steuerung von Expression, Überexpression und konstitutiver Expression des Cyclin E-Gens, z. B. Promoter-, Enhancer-, Operatorsequenzen und dergleichen). Selektierbare Marker werden im Allgemeinen in dem Expressionsvektor eingeschlossen sein. Repräsentative Beispiele derartiger selektierbarer Marker schließen Enzyme, Antigene, Arzneimittelresistenzmarker oder Marker, welche die Wachstumsanforderungen der Zelle erfüllen, ein. Es wird ebenfalls richtig eingeschätzt werden, dass in bestimmten Zellen die Transfektion oder Transduktion mit Cyclin E-Nukleinsäure einen selektiven Proliferations/Wachstums-Vorteil vorsehen wird, welcher als ein Typ von selektierbarem Marker dienen wird (z. B. in hinsichtlich der Progression des Zellzyklus blockierten Mutanten, wie den repräsentativen Hefestämmen "598-5" oder "1238-14C", welche nachstehend in den Beispielen beschrieben werden). Die vorliegenden Expressionsvektoren sind nützlich zum Transfizieren und Transduzieren von Zellen unter Herstellung von Cyclin-E-Polypeptiden, Mutanten-Cyclin-E-Polypeptiden und Antisense-Nukleinsäuren. Beispielsweise schließen Aspekte der Erfindung Verfahren zur Verwendung der transfizierten und transduzierten Zellen zur Herstellung von Polypeptiden ein, welche zur Aktivierung einer CDC-Proteinkinase und zum Vorantreiben des Zellzyklus am Restriktionspunkt von der G1-Phase zur S-Phase fähig sind. Es sind mehrere Verfahren zum Bestimmen verfügbar, dass ein von einer Cyclin E-Nukleinsäure codiertes Polypeptid fähig zum Vorantreiben des Zellzyklus ist. Repräsentative Beispiele, welche Hefezellen und Säugerzellen beteiligen, sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Die Erfindung sieht ebenfalls einen Zelltyp vor, welcher mit einem Cyclin (z. B. Cyclin E)-Expressionsvektor transduziert oder transfiziert worden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform proliferiert eine Zelle, welche Cyclin E konstitutiv überexprimiert, bei einer schnelleren Geschwindigkeit als ihre Elternzelle. Cyclin E-transduzierte humane diploide Fibroblasten, nachstehend veranschaulicht in Beispiel 14, waren um 20 – 50 % kleiner hinsichtlich Länge und Breite als kontroll-transduzierte oder normale Zellen. Der Fachmann wird die Vorteile in der Gentherapie von kleinen, rasch wachsenden Zellen verstehen, z. B. Zellen, welche auf eine kostengünstige Weise gezüchtet werden können und welche eine programmierte Alterung bzw. Seneszenz schneller durchlaufen können als ihre normalen Gegenstücke. Es wird ebenfalls verstanden werden, dass transgene Tiere (z. B. Versuchs- und Haustiere) aus derartigen kleinen, rasch wachsenden Zellen konstruiert werden können. Der Fachmann wird erkennen, dass die von den vorliegenden Zellen gebotenen Vorteile beinhalten: a) verbessertes Wachstum in Gewebekultur von enddifferenzierten Zelltypen, welche normalerweise schwierig oder unmöglich zu kultivieren sein würden (z. B. Stammzellen); und b) verringerte (oder gar keine) Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren für das Zellwachstum (z. B. für Zellen, welche in vitro schwierig zu vermehren sind, wie Muskel- oder Nervenzellen), was ein schnelleres Wachstum von Kulturen von Säugerzellen in Niedrigserum- (oder serumfreien) Medium zulässt (z. B. in Produktionskulturen von Zellen, welche biotherapeutische Mittel erzeugen). Die hierin beschriebene Offenbarung identifiziert die einzigartige Bedeutung eines Cyclins bei der Bestimmung des Fortschreitens des Zellzyklus an jedem von mehreren Entscheidungspunkten. Der Begriff "Entscheidungspunkt" ist auf dem Fachgebiet gut akzeptiert, und zwar in der Bedeutung eines Punkts im Zellzyklus, an dem eine Zelle ihr Wachstum bis zu einem solchen Zeitpunkt anhalten kann, an dem ein passendes Signal empfangen wird, um den Zellzyk lus voranzutreiben. Die im nachstehenden Beispiel 14 präsentierten Ergebnisse veranschaulichen die Bedeutung von Cyclin E bei der Aktivierung einer latenten CDK2-Kinaseaktivität an einem Entscheidungspunkt in der G1-Phase des Zellzyklus. Es existieren mehrere Entscheidungspunkte während der verchiedenen Phasen des Zellzyklus. Die Offenbarung hierin weist weist darauf hin, dass eine kleine Anzahl von Cyclinen im Zellzyklus wirksam sein kann, d. h. ein Cyclin, um den Zellzyklus an jedem Entscheidungspunkt voranzutreiben. Somit kann die Überexpression einer relativ kleinen Zahl an Cyclinen in einer Zelle ausreichend sein, um die Zelle fast vollständig von exogenen Wachstumsfaktoren unabhängig zu machen.
In anderen Ausführungsformen sieht die Erfindung immunologische Bindungspartner für Cyclin-E-Polypeptide, wie polyklonale und monoklonale Antikörpermoleküle, und verschiedene antigenbindende Fragmente hiervon, fähig zur spezifischen Bindung des Cyclin-E-Polypeptids, vor. Solche immunologischen Bindungspartner können hergestellt werden durch Hybridom- oder rDNA-Expressionstechniken und finden Anwendung in therapeutischen, reinigenden und diagnostischen Anwendungen. Therapeutische Anwendungen schließen Bindungspartner ein, welche die Bindung eines Cyclin E an dessen CDC-Proteinkinase inhibieren; Bindungspartner, welche CDC-Proteinkinase modulieren; und Bindungspartner, welche die regulatorische Kontrolle von Cyclin E in einer Zelle verändern. Repräsentative Beispiele von Reinigungsanwendungen schließen immunchemische Verfahren und Immunaffinitätschromatografie ein. Repräsentative Beispiele von diagnostischen Anwendungen schließen "Enzym-Linked"- und Radioisotopen-Immunassays, Immunfluoreszenz, Fluoreszenzimmunoassay, zeitaufgelösten Fluoreszenzimmunoassay und dergleichen ein. Die in diesen Assays verwendeten spezifischen Bindungspartner können fähig sein, zwischen freiem Cyclin-E-Polypeptid und im Komplex mit CDC-Proteinkinasen gebundenem Cyclin E zu unterscheiden. Der Fachmann wird erkennen, dass "neo"- (neue) Antigene durch konformationsmäßig veränderte Polypeptide gewonnen werden, und wird ferner erkennen, dass die Bindung zwischen Cyclin E und einer CDC-Proteinkinase eine derartige Konformationsänderung in beiden Polypeptiden induziert. Die Cyclin-E-spezifischen Bindungspartner finden allgemeine Anwendbarkeit in diagnostischen Assays zum Nachweisen und Quantifizieren von Spiegeln (z. B. Protein oder Antigen) und funktionellen Aktivitäten (z. B. Phosphorylasekinase-Aktivierung) von freiem Cyclin E (oder Komplex-assoziiertem Cyclin E) in einer Zelle, wie einer Tumorzelle. Die vorliegenden diagnostischen Assays schließen Assays ein, für das: a) Nachweisen der absoluten Spiegel und Aktivitäten von Cyclin E in nicht-synchronisierten Zellpopulationen (z. B. in Tumor-Biopsieproben); b) Vergleichen der Spiegel und Aktivitäten von Cyclin E in synchronisierten Zellpopulationen bei verschiedenen Phasen des Zellzyklus (z. B. Zellpopulationen, synchronisiert durch Thymidin-Block); und c) Assays zum Bestimmen der Spiegel und Aktivitäten von Cyclin E in biologischen Fluiden (d. h. Blut, Serum, Plasma, Schleimsekretionen, ZNS-Fluid, Zellextrakten und dergleichen). Die absoluten Spie gel und Aktivitäten von Cyclin E, exprimiert in malignen biologischen Fluiden (z. B. Tumorzellextrakten, Serum aus Krebspatienten und dergleichen), sowie die Spiegel und Aktivitäten, exprimiert in Zellextrakten, hergestellt an verschiedenen Stadien im Zellzyklus, können Informationen über die Geschwindigkeit des Zellwachstum liefern. In dieser Hinsicht können die im Assay festgestellten Spiegel und Aktivitäten von Cyclin E als diagnostische Marker dienen für:

a) Das Einstufen bzw. Staging von Tumoren, da differenzierte Zellen langsamer wachsen als transformierte; geringere Spiegel an Cyclin-E-Protein und -Aktivität exprimieren als transformierte Zellen; und differenzierte Zellen (im Gegensatz zu transformierten) Cyclin E nur währerd der G1-Phase des Zellzyklus exprimieren;
b) Festlegen einer Prognose, d. h. Vorhersagen der Überlebenschance eines Patienten und der Zeit bis zum Wiederauftreten eines Tumors, weil schnell wachsende maligne Zellen, die zu Metastasen befähigt sind, im Allgemeinen schneller wachsen können als differenzierte Zellen; exponentiell wachsende Zellen höhere absolute Spiegel (oder Aktivitäten) an Cyclin E exprimieren können, oder alternativerweise die höheren Spiegel (oder Aktivitäten) von Cyclin E während einer besonderen Phase des Zellzyklus vorhanden sein können, z. B. während der S-, G1- oder G2-Phase; und/oder
c) Vorhersagen des therapeutischen Erfolgs, d. h. eines besonderen Therapie-Plans, weil langsamer wachsende Zellen niedrigere Spiegel (oder Aktivitäten) von Cyclin E exprimieren können (d.h. als schneller wachsende, metastatische Zellen) und ebenfalls auf weniger drastische und längere Therapiepläne responsiver sein können.

Die vorliegenden Assays zur Bestimmung des Spiegels (oder der Aktivitäten) von Cyclin E in Zellen können auch die Antwortfähigkeit eines Patiententumors auf ein jeweiliges therapeutisches Mittel, welches seine Wirkung auf die Zellen während der G1-Phase des Zellzyklus ausübt, anzeigen. Der Fachmann wird erkennen, dass die vorliegenden diagnostischen Assays Ergebnisse liefern können, welche für einen Arzt potenziell nützlich sind, um zu entscheiden, wie ein Tumor einzustufen ist, wie ein geeigneter Therapieplan auszuwählen ist, wie der Erfolg einer Therapie zu bewerten ist, und wie das Risiko oder die Überlebenschancen eines Patienten zu bewerten sind.
In anderen Ausführungsformen sieht die Erfindung diagnostische Assays z um Messen der absoluten Spiegel (oder funktionellen Aktivitäten) von Cyclin E:CDK2-Polypeptidkomplexen in asynchronen Zellen und der Spiegel (oder Aktivitäten) der Cyclin E:CDK2-Komplexe in verschiedenen Stadien des Zellzyklus vor. In nichttransformierten Zellen tritt der Häufigkeits gipfel der Cyclin E:CDK2-Komplexe spät in der G1-Phase des Zellzyklus auf, z. B. bei 4fach bis 6fach höheren Spiegeln als in anderen Phasen des Zellzyklus. In transformierten Zellen kann die konstitutive Überexpression von Cyclin E und/oder CDK2 zu Unterschieden in den Spiegeln der Cyclin E:CDK2-Komplexe führen, welche während der G1-, G2-, M- und S- Phase des Zellzyklus nachweisbar verschieden sind. Die vorliegenden Assays, welche die Spiegel von Cyclin E/CDK2-Komplexen in Zellen bestimmen, können bei der Einschätzung von malignen Zellen aus Patienten, z. B. wie oben stehend beschrieben, nützlich sein.
In anderen Ausführungsformen sieht die Erfindung diagnostische Assays zum Bestimmen des chromosomalen Rearrangements von Cyclin E- und CDK2-Genen in einer Zelle vor. Die chromosomale Lokalisierung von Cyclin E- und CDK2-Genen wird zweckmäßigerweise in chromosomalen Schmiers mittels in situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden oder cDNA und dergleichen bestimmt. Die Translokation eines Cyclin E-Gens oder CDK2-Gens, d.h. von einer in einer normalen Zelle gefundenen chromosomalen Stelle an eine in einer transformierten Zelle gefundene Stelle, kann zu einem Phänotyp des unregulierten Zellwachstums durch Entfernung der normalen transkriptionsregulatorischen Steuerung entweder der Genexpression eines Cyclins, z. B. Cyclin E, oder einer CDC-Kinase, z. B. CDK2, beitragen. Die hierin offenbarten Befunde zeigen bislang unerkannte gemeinsame Verbindungspunkte, an welchen "Second Messenger"-Signale von mehreren Wachstumsfaktoren sich auf eine kleine Anzahl von verschiedenen Cyclin:CDC-Kinase-Komplexen hin konvergieren. Das Ergebnis der molekularen Wechselwirkung dieser Second Messenger mit den Cyclin:CDC-Kinase-Komplexen bestimmt, ob die Zelle im Zellzyklus voranschreitet. Somit kann das Rearrangement eines Cyclin-Gens in einer Zelle dramatische Resultate besitzen. In dem Fall, wo das Rearrangement eine Überexpression herbeiführt, kann die Zelle einen malignen (d. h. unregulierten) Wachstums-Phänotyp erwerben, und in dem Fall, wo das Rearrangement eine Unterexpression herbeiführt, kann die Zelle einer verfrühten Seneszenz erliegen. Das Screening von Zellproben aus Individuen hinsichtlich des Potenzials für ein Cyclin E- oder CDK2-Chromosomen-Rearrangement kann einen relativen Risikofaktor für die Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung von Krebs anzeigen. In dem Fall, dass derartige Rearrangements nachgewiesen werden, kann die Wiederherstellung der normalen Regulierung eines Cyclin-Gens (z. B. Cyclin E) oder eines CDC-Kinase-Gens (z. B. CDK2) an einer translozierten chromasomalen Lokalisierung den malignen Phänotyp einer transformierten Zelle umkehren. Beispielsweise können das Cyclin-E-Gen (oder CDK2-Gen) und seine regulatorischen Elemente als Ziele für Gentherapie-Vektoren dienen, entworfen, um das rearrangierte Gen zu inaktivieren, z. B. unter Verwendung von in situ-gerichteter Rekombination/Mutagenese oder zielgelenkter Integration, um das translozierte Gen zu zerstören.
Die Erfindung sieht ebenfalls transgene Stämme von Hefezellen vor, welche manipuliert sind, um ein Genom zu enthalten, welchem die Gene cln1, cln2 und cln3 fehlen, die für die Zellzyklus-Progression erforderlich sind, welche jedoch eine episomale Nukleinsäure aufweisen, die zum Codieren von CLN3 fähig ist. Eine repräsentative Ausführungsform ist der Hefestamm "589-5", welcher nützlich zur Identifizierung von Säuger-Cyclingenen ist. Der Stamm "589-5" ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter der Zugangs-Nr. 74098 hinterlegt worden. Wenn Cyclin E-Nukleinsäure in die transgenen Hefezellen dieses Stamms eingeführt wird, schreiten die Zellen durch den Zellzyklus von START zur S-Phase voran. Während Andere früher gezeigt haben, dass etwas ähnliche transgene Hefekonstruktionen nützlich zum Identifizieren und Klonieren von Hefe-cdc-Genen sind, sind die vorliegenden Stämme nützlich zum Identifizieren und Klonieren von Säuger-Cyclin E-cDNA und ebenfalls zum Identifizieren und Klonieren von Säuger-cdc-Proteinkinase-cDNAs.
Die Erfindung sieht auch andere transgene Stämme von Hefezellen vor, bei welchen ein cdc28-13-Gen, ein endogenes G1 CLN (z. B. CLN3), unter der Kontrolle eines bedingten Promotors (z. B. GAL), ein mitotisches CLB-Cyclin (z. B. CBC) und ein Cyclin E-Gen vorhanden sind, wie den repräsentativen Hefestamm "1238-14C-Cyclin E". In diesem Fall steuert der bedingte Promotor die Expression des G1-Cyclins in Gegenwart eines Faktors ("die Bedingung"), welcher für Stoffwechsel oder Wachstum erfordert wird. Das G1-Cyclin, seinerseits, bindet und aktiviert die Zellteilungskinase, codiert von dem cdc28-13-Gen, und die Aktivierung der CDK ermöglicht, dass die Zellen herangezüchtet und passagiert werden. Der Stamm "1238-14C-Cyclin E" ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter der Zugangs-Nr. 74099 hinterlegt worden. Der Zellzyklus wird in diesen Zellen blockiert, bis eine cdc-Proteinkinase-Nukleinsäure eingeführt wird. Somit ist dieser Stamm von transgenen Zellen nützlich zum Identifizieren und Klonieren von cdc-Proteinkinasen, welche mit einem Cyclin E assoziieren und den Zellzyklus von der G1- zur S-Phase in einer eukaryotischen Wirtszelle vorantreiben.
Die Erfindung sieht ebenfalls Verfahren zum Klonieren regulatorischer Mittel vor, wie Polypeptiden, welche an Cyclin-E:CDC-Proteinkinase-Komplexe binden und die Aktivität des Komplexes inhibieren oder fördern, oder welche die Halbwertzeit des Komplexes ändern, und dergleichen. Für derartige regulatorische Mittel codierende Nukleinsäuren werden identifiziert durch Einführen eines Kandidaten-Nukleinsäuremoleküls in einen transgenen Stamm von Hefezellen oder eine Säugerzelle, in welcher das Fortschreiten der Zelle von der G1- in die S-Phase von der Aktivität einer Cyclin-E:CDC-Proteinkinase abhängig ist. Ein repräsentatives Beispiel eines in dieser Weise nützlichen, transgenen Hefestamms wird vorgesehen von dem Stamm 598-5, transfiziert oder transduziert mit einem Cyclin E-Gen, wie dem in den nachstehenden Beispielen ausführlicher beschriebenen Stamm HU4. Für regulatorische Mittel codie rende Nukleinsäuren werden durch ihre Fähigkeit erkannt, das Fortschreiten der Zelle von G1 zu S zu inhibieren. Im Falle des beschriebenen transgenen Hefestamms können replikative Screening-Techniken somit zur Identifizierung von Klonen von Zellen angewandt werden, welche darin versagen, den Zellzyklus am START voranzutreiben, nachdem sie mit jedweder Kandidaten-cDNA, z. B. von Säugern, Insekten, Vögeln, Reptilien, Amphibien etc., transfiziert oder transduziert worden sind.
Beispiele
Die nachstehend dargestellten Daten zeigen, dass Cyclin E die S. cerevisae-CLN-Gene substituierte und mit CDC28 wechsehvirkte, um den START auszufürren. Mindestens zwei verschiedene Mitglieder der humanen CDC2-Genfamilie konnten mit Cyclin E interagieren, um den START in knospender Hefe zu regulieren, und zwar CDC2-HS und CDK2-HS. Wir haben ebenfalls gezeigt, dass das Cyclin E-Protein das p34-CDC2-Protein in Extrakten aus humanen Lymphoid-G1-Zellen bindet und aktiviert, und dass Cyclin E mit einer H1-Kinaseaktivität in HeLa-Zellen assoziiert war. Andere haben festgestellt, dass die Cyclin-E-mRNA spezifisch während der späten G1-Phase des HeLa-Zellzyklus vorhanden war (Lew et al., 1991). Zusammengenommen, begründen diese Ergebnisse, dass Cyclin E als ein Regulator der p34-CDC2-Kinase beim Übertritt von der G1 in die S im humanen Zellzyklus wirken kann.
Die Interpretation unseres Ergebnisses, das Cyclin E die 3fache cln-Deletion rettete, wurde durch die Tatsache erschwert, dass humanes Cyclin B, welches ein mitotisches Cyclin ist, ebenfalls für die Hefe-CLN-Gene substituierte. Ungeachtet des Mechanismus, durch welchen Cyclin B als ein CLN-Protein wirkte, implizierte die Tatsache, dass es diese Rolle spielte, dass unser Komplementations-Assay CLN-Typ-Cycline nicht spezifisch identifiziert hat. Deshalb muss ein vollständigeres Verständnis der Funktion von Cyclin E die Analysen der Häufigkeit von Cyclin-E-Protein und seiner Assoziation mit CDC2 oder CDC2-verwandten Proteinen während des Zellzyklus von normalen humanen Zellen abwarten.
In Hefe und wahrscheinlich in den meisten Organismen fungiert das CDC2-Protein auf mindestens zwei Weisen während des Zellzyklus: bei G1/S und erneut bei G2/M. An jedem Punkt assoziiert das CDC2-Protein mit einem einzigen Typ an Cyclin: den B-Typ-Cyclinen bei G2/M und den CLNs (zumindest in knospender Hefe) an G1/S. Deshalb ist es erwartet worden, dass der einzigartige Cyclin-CDC2-Komplex, welcher an jedem Kontrollpunkt zusammengebaut wird, die Spezifität verleihen würde, erforderlich für die CDC2-Kinase, um entweder die S-Phase oder mitotische Ereignisse zu aktivieren. Beispielsweise würde die Substratspezifität oder subzelluläre Lokalisierung der CDC2-Kinase von ihrem jeweiligen Cyclin-Partner bestimmt werden. Die Fähigkeit von humanem Cyclin B, für die CLN-Proteine zu substituieren, scheint oberflächlich dieser einfachen Hypothese zu widersprechen. Als eine Alternative ist es möglich, dass die Spezifität der p34-CDC2-Wirkung an verschiedenen Punkten im Zellzyklus wenigstens teilweise von dem CDC2-Protein selbst bestimmt werden könnte. Dies könnte auf zellzyklus-spezifischer Modifikation des CDC2-Proteins (Simanis & Nurse, 1986; Lee et al., 1988; Gould & Nurse, 1989; Krek & Nigg, 1991) oder, in höheren Eukaryoten, auf der Aktivierung verschiedener Mitglieder der CDC2-Genfamilie an verschiedenen Punkten im Zellzyklus (Paris et al., 1991; Pines & Hunter, 1990) beruhen. Unsere Beobachtung, dass mindestens zwei unterschiedliche Mitglieder der CDC2-Genfamilie den START in Hefe ausführen können, steht in Übereinstimmung mit dieser Idee. In diesem Modell würde die periodische Akkumulation und Zerstörung der Cyclinproteine die Zeitgebung der p34-Kinase-Aktivierung aber nicht ihre Spezifität bestimmen. Ein zu diesem ähnliches Modell ist früher vorgeschlagen worden, basierend auf den Phänotypen bestimmter cdc2-Mutanten in S. pombe (Broek et al., 1991). Eine Alternative ist, dass die jeweiligen Substrate, notwendig für CDC2 oder CDC28, um den S- oder M-Zustand zu induzieren, auf eine zellzyklus-abhängige Weise zugänglich werden. Wir betonen jedoch, dass die Auslegung unserer Experimente nicht zugelassen haben kann, alle normalen Kontrollen auf die Cyclin-Spezifität zu beobachten. Beispielsweise könnte die Expression eines humanen Cyclin B von dem starken ADH-Promoter aus bestimmte regulatorische Prozesse überwältigt haben, welche üblicherweise die Cyclin-B-CDC28-Aktivität an dem G2/M-Übergang beschränkt.
Humanes Cyclin E ist mit den humanen Cyclinen A und B näher verwandt als mit den CLN-Proteinen von knospender Hefe. Innerhalb der Cyclin-Box beläuft sich der Anteil der Identität zu CLN1 auf 21 % und zu CLN3 auf 17 %. Dies sei verglichen mit 49 % Identität zu humanem Cyclin A und 44 % zu humanem Cyclin B. Außerhalb der Cyclin-Box-Region zeigt Cyclin E keine umfangreiche Homologie entweder zu den humanen Cyclinen oder den Hefe-CLN-Proteinen. Auf dieser Basis scheint Cyclin E nicht ein direktes Homolog der Hefe-CLN-Gene zu sein. Dieser Vergleich muss jedoch mit Vorsicht angestellt werden, weil die genauen Regionen innerhalb der verschiedenen Cycline, welche ihre funktionellen Differenzen bestimmen, nicht identifiziert worden sind. Darüber hinaus kann die Ähnlichkeit zwischen den humanen Cyclinen in einem gewissen Ausmaß ihre Co-Evolution mit gemeinsamen Zielen, wie dem humanen CDC2-Protein widerspiegeln.
Zwei andere Merkmale der Cyclin-E-Sequenz sollten bemerkt werden. Unserem Klon von Cyclin E fehlt eine N-terminale Sequenz, die sowohl in Cyclin A als auch B gefunden wird, welche angenommenermaßen ein Erkennungsmotiv für das Ubiquitinylierungs-Enzym ist, welches deren Zerstörung in der Mitose vermittelt (Glotzer et al., 1991). Darüber hinaus enthält Cyclin E eine C-terminale Verlängerung, wenn es mit den Cyclinen A und B verglichen wird. Diese C-terminale Region wird von basischen Resten flankiert und ist reich an den Res ten P (Pro), E (Glu), S (Ser) und T (Thr). Derartige "PEST"-Regionen sind bei der Regulierung des Protein-Turnovers impliziert worden (Rogers et al., 1986). Tatsächlich kann die Stabilität der Hefe-CLN-Proteine durch ihre C-terminalen Domänen bestimmt werden, welche ebenfalls reich an den Resten P, E, S und T sind (Nash et al., 1988; Cross, 1990; Hadwiger et al., 1989). Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Stabilität von Cyclin E während des Zellzyklus anders reguliert werden könnte als die mitotischen Cycline.
In höheren Eukaryoten ist die Rolle des CDC2-Proteins während des Fortschreitens durch die G1-Phase des Zellzyklus nicht gut verstanden. Eine Anzahl von unabhängigen Beobachtungen legt nahe, dass das CDC2-Protein eine wesentliche Funktion während dieses Teils des Zellzyklus hat. Die Depletion des CDC2-Proteins in menschlichen Zellen in vivo unter Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden (Furakawa et al., 1990) oder in vitro in Xenopus-Extrakten durch Immunpräzipitation (Blow & Nurse, 1990) kann den Start der DNA-Synthese blockieren. Die Zugabe von Cyclin-CDC2-Komplexen aus humanen S-Phasen-Zellen zu Extrakten aus G1-Zellen kann die DNA-Synthese aktivieren (D'Urso et al., 1990). Allerdings blockiert eine thermolabile Mutation des Maus-CDC2-Gens den Eintritt in die Mitose, aber nicht in die S-Phase, bei der nicht-permissiven Temperatur (Th'ng et al., 1990). Des Weiteren blockiert eine Mikroinjektion von Antikörpern gegen das Hefe-CDC2-Protein in humane Zellen den G2/M aber nicht den G1/S-Übergang (Riabowol et al., 1989). Unsere Beobachtung, dass mindestens zwei verschiedene Mitglieder der CDC2-Genfamilie den G1/S-Übergang in S. cerevisae regulieren können, kann dabei helfen, diese scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse aufzuklären. Eines von diesen, das humane CDK2-Gen, könnte preferentiell bei G1/S im Gegensatz zu G2/M funktionieren. In höheren Eukaryoten können deshalb, im Gegensatz zu der Situation in Hefe, mehrere Mitglieder der CDC2-Genfamilie an der G1/S-Regulation teilnehmen. Unter manchen Umständen könnten ihre Rollen redundant sein, wohingegen sie in anderen Situationen alle essentiell sein können.
Die Aktivierung der CDC2-Kinase während des G1- bis S-Intervalls erfordert wahrscheinlich ihre Assoziation mit einem Cyclin. In S. cerevisae ist die Akkumulation eines Cyclins vom CLN-Typ der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt für den Durchgang durch START (Nash et al., 1988; Cross, 1988; Hadwiger et al., 1989). In humanen Zellen korreliert die Aktivierung der p34-Kinase am Beginn der S-Phase mit ihrem Zusammenbau zu einem höhermolekulargewichtigen Komplex (D'Urso et al., 1990; Marraccino et al., unveröffentlichte Daten), was impliziert, dass die Assoziation von p34 mit einem Cyclinprotein ihre Aktivität während dieses Teils des Zellzyklus reguliert. Wir haben ebenfalls festgestellt, dass die Zugabe von gereinigtem rekombinanten Muschel-Cyclin-A zu einem humanem G1-Zellextrakt ausreichend war, um SV40-DNA-Replikation zu aktivieren, was nahe legt, dass die Akkumulierung eines Cyclins der limitierende Schritt für die Aktivierung der p34-Kinase am Beginn der S-Phase ist.
Von mindestens vier verschiedenen humanen Cyclinen ist vorgeschlagen worden, Rollen während der G1- oder S-Phasen des Zellzyklus zu spielen. Diese schließen die Cycline A (Giordano et al., 1989; Wang et al., 1990), C (Lew et al., 1991), D (oder prad1; Motokura et al., 1991; Xiong et al., 1991; Matsushimi et al., 1991) und E (diese Offenbarung; Lew et al., 1991) ein. In Hefe kann humanes Cyclin E entweder mit CDC2-HS oder CDK2-HS assoziieren, um den START durchzuführen. Cyclin E kann CDC2-HS in vitro binden und aktivieren, aber seine Fähigkeit, CDK2 aus G1-Zellen zu aktivieren, ist noch nicht getestet worden. Von humanem Cyclin A ist ebenfalls gefunden worden, mit zwei verschiedenen Mitgliedern der CDC2-Genfamilie zu assoziieren, CDC2-HS und einem 33-kDa-Protein, bei welchem es sich um CDK2 handeln kann (Giordano et al., 1989; Pines & Hunter, 1990; R. Marraccino & J. R., unveröffentlichte Beobachtungen). Im Gegensatz dazu ist das mitotische Cyclin B in Assoziation nur mit p34-CDC2 gefunden worden (siehe Hunt, 1989).
Mehrere Cycline und CDC2-artige Proteine können erforderlich sein, um die vielfältige Ansammlung intrazellulärer und extrazellulärer Signale vorzusehen, welche zur G1-Regulierung beitragen. Verschiedene Mitglieder der CDC2-Proteinfamilie können präferenziell mit besonderen Cyclinen interagieren (Pines & Hunter, 1990). Des Weiteren kann jeder Cyclin-CDC2-Komplex nur eine Untergruppe der Ereignisse ausführen, welche notwendig sind, damit der START stattfindet. Schließlich ist es möglich, dass die CDC2-Familie von Proteinen an mehr als einem Punkt während der G1 wirken kann. Die START-Entscheidung in Hefe ist der einzige klar definierte Exekutionspunkt für CDC28 während der G1-Phase des Zellzyklus. START trägt gewisse Ähnlichkeiten zum Restriktionspunkt im Zellzyklus von höheren Eukaryoten; allerdings kann der Restriktionspunkt Stunden vor dem Beginn der S-Phase stattfinden. Unsere in vitro-Replikationsexperimente zeigen, dass die CDC2-Kinase direkt DNA-Synthese aktivieren kann (D'Urso et al., 1990). Deshalb können CDC2, oder verwandte Proteine, zweimal während der G1 wirken, zuerst an dem Punkt der Überweisung zur Zellproliferation und erneut am Beginn der DNA-Synthese. Jeder Kontrollpunkt kann einen einzigartigen Satz von Cyclin-Proteinen erfordern; beispielsweise können die Cycline vom CLN-Typ am Restriktionspunkt wirken, und andere Cycline, wie Cyclin E, könnten am G1/S-Übergang wirken.
Beispiel 1
Komplementierung eines Hefestamms, welchem CLN1, -2 und -3 fehlen, mit einer humanen cDNA-Bibliothek
Unser anfängliches Ziel bestand darin, humane cDNAs zu identifizieren, welche für Proteine codierten, die die Hefe-CLN-Proteine substituieren könnten. E in Hefestamm, 589-5, wurde konstruiert, in welchem alle drei chromosomalen CLN-Gene deletiert waren, und welcher das CLN3-Gen unter der Kontrolle des GAL1-Promotors auf einem Episom enthielt. Da CLN-Protein für die Passage durch START erforderlich ist, wird dieser Stamm auf Galactose wachsen, auf welcher der GAL1-Promotor induziert wird; wenn dieser Stamm auf Glukose herangezogen wird, ist der GAL1-Promotor reprimiert, kein CLN3-Protein wird hergestellt, und die Zellen arretieren bei START (Cross, 1990). Eine cDNA-Bibliothek (Geschenk von J. Colicelli and M. Wigler), unter Verwendung von m RNA, hergestellt aus der humanen Glioblastom-Zelllinie U118, wurde in einem S. cerevisae-Vektor konstruiert, enthaltend den konstitutiven Hefe-ADH-Promotor für die Expression der humanen cDNAs (Colicelli et al., 1989). Die Bibliothek wurde in den Stamm 589-5 transfiziert, und 10⁵ unabhängige Transformanten wurden, durch Replika-Platierung, hinsichtlich ihrer Fähigkeit, auf Glukose zu wachsen, gescreent. Eine Transformante, HU4, wurde isoliert, deren Wachstum auf Glukose von der Expression einer humanen cDNA abhängig war (1). Für weitere experimentelle Details siehe den beigefügten Abschnitt Materialien und Methoden.
Beispiel 2
HU4 codiert ein neues Mitglied der Cyclin-Proteinfamilie
Die DNA-Sequenz der 1,7 kb großen HU4-cDNA ist in der 2 gezeigt, und ihre Homologie, auf der Proteinebene, zu den humanen Cyclinen A und B wird in der 3 veranschaulicht. Die DNA-Sequenz sagt ein Protein mit 395 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 45 120 Daltons vorher. In-vitro-Transkription/Translation der HU4-cDNA ergibt ein Protein mit dem vorhergesagten Molekulargewicht (siehe 8). Alle bekannten Cycline besitzen eine hoch konservierte zentrale Domäne aus ungefähr 87 Aminosäuren. HU4 ist zu 49 % identisch zu humanem Cyclin A und zu 44 % identisch zu humanem Cyclin B innerhalb dieser Domäne. Auf dieser Grundlage plazierten wir das HU4-Protein innerhalb der Cyclin-Familie. N-terminal zu dieser konservierten Region fällt die Homologie zu Cyclin A auf 5 % Identität, und auf 4 % Identität zu Cyclin B. C-terminal zu dieser Domäne ist die Identität zu Cyclin A 14 %, und die Identität zu Cyclin B beträgt 10 %. Dieser niedrige Spiegel an Homologie sowohl N- als auch C-terminal zu der zentralen konservierten Domäne legt nahe, dass HU4 eine neue Klasse von Cyclinproteinen repräsentiert, und wir haben diese Klasse als Cyclin E bezeichnet. Wir können uns nicht sicher sein, dass unser Cyclin-E-cDNA-Klon die gesamte für das Cyclin E-Protein codierende Sequenz enthält, weil sich das offene Leseraster zum 5'-Ende der sequenzierten cDNA weiter ausdehnt. Allerdings zeigte ein Cyclin-E-cDNA-Klon, erhalten aus einer MANCA-Zellbibliothek, ein 5'-Ende, welches identisch zu demjenigen ist, welches hierin beschrieben wird.
Beispiel 3
Humanes Cyclin B komplementiert die dreifache cln-Deletion
Wir verglichen die Fähigkeit von humanen Cyclin A-, B- und E-cDNAs, die dreifache cln-Deletion in dem Stamm 589-5 zu komplementieren. Volllängen-cDNA-Klone, codierend für humane Cycline A (Pines & Hunter, 1990) und B1 (Pines & Hunter, 1989), wurden in den ADH-Expressionvektor kloniert, der in der Konstruktion der obenstehend beschriebenen Bibliothek verwendet wurde. Die verschiedenen Cyclin-E-Expressionsplasmide wurden mittels Selektieren hinsichtlich Leucin-Prototrophie in Hefe transfiziert. Die Transformanten wurden abgepickt, und die Fähigkeit des humanen Cyclins, die Abwesenheit der CLN-Proteine zu komplementieren, wurde durch Wachstum auf Glukose getestet. Unter Verwendung des Cyclin A-Vektors wurden keine Leucin-Prototrophen erhalten, was nahe legt, dass die Expression von humanem Volllängen-Cyclin-A in S. cerevisae lethal war. Die 4 zeigt die relative Plattierungseffizienz von 589-5 auf Glucose gegenüber Galactose, bei Enthalten von entweder Cyclin-B- oder -E-Expressionsplasmiden. Überraschenderweise komplementierte das mitotische Cyclin B die Abwesenheit der CLN-Proteine. Dieses Experiment zeigte, dass die Komplementierung der CLN-Funktion nicht auf Cycline vom CLN-Typ beschränkt war.
Beispiel 4
Wechselwirkung zwischen Cyclin E und CDC28
Wir verglichen die Fähigkeit von Cyclin E, die dreifache cln-Deletion in isogenen Stämmen zu retten, welche entweder das CDC28- oder das cdc28-13-Allel bei der permissiven Temperatur von 30°C enthielten. Die 4 zeigt, dass Cyclin E die CLN-Proteine bedeutend weniger gut in dem cdc28-13-Hintergrund substituierte. Diese genetische Wechselwirkung zwischen den Cyclin-E- und CDC28-Genen legte nahe, dass das Cyclin-E-Protein seine Funktion durch Interagieren mit dem CDC28-Protein ausführte. Cyclin B war in etwa genauso effektiv in cdc28-13- wie in CDC28-Stämmen, was nahe legt, dass Cyclin B mit CDC28 anders wechselwirken könnte als Cyclin E.
Beispiel 5
Humanes Cyclin E und humanes CDC2 können den START in S. cerevisae vollführen
Stämme, welche cdc28-13 und die endogenen G1-(CLN) und mitotischen (CLB) Cycline enthalten, sind bei 30°C lebensfähig. Deshalb muss das cdc28-13-Protein fähig zu funktionellen Wechselwirkungen mit beiden Cyclintypen sein. Wie obenstehend beschrieben, wuchs ein cdc28-13-Stamm, welcher Cyclin E anstelle der CLN-Gene enthielt, nicht bei 30°C. Wir haben spekuliert, dass dieser Stamm spezifisch bezüglich der START-Funktion des CDC28-Proteins und nicht bezüglich seiner G2/M-Rolle defekt war, vermutlich weil die cdc28-13-Mutation seine Fähigkeit, produktiv mit Cyclin E wechselzuwirken, vermindert hatte. Diese Eigenschaften des Cyclin E-cdc28-13-Stamms sind in der 5 gezeigt. Wir verwendeten diesen Stamm als Wirt, um hinsichtlich humaner Gene zu screenen, welche mit Cyclin E unter Vollführung des START wechselwirken könnten. Anders als Screens, welche humane Gene erfordern, um CDC28 vollständig zu substituieren, muss dieser Screen nicht erfordern, dass humane Gene bei G2/M funktionieren. Wir transfizierten diesen Stamm mit der obenstehend beschriebenen humanen cDNA-Expressionsbibliothek, und 10⁵ unabhängige Kolonien wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, auf Glukose zu wachsen, getestet. Wir identifizierten fünf Hefeklone, deren Wachstum von der Expression beider humanen cDNAs (Cyclin E und die neue) abhing (6). Die humane cDNA innerhalb jedes dieser Klone wurde restriktionskartiert (Daten nicht gezeigt). Vier von diesen (S2-6a2, S2-103, S2-112, S2-227) enthielten das CDC2-HS-Gen (Lee & Nurse, 1987). Das cdc⁺-Gen von S. pombe vollführte ebenfalls den START zusammen mit humanem Cyclin E in diesem Stamm (F.C. & A. Tinkelenberg, unveröffentlichte Beobachtungen). Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Beweis, dass das Cyclin-E-Protein den START durch seine Wechselwirkung mit dem CDC2- oder CDC28-Protein reguliert. Die Tatsache, dass die CDC28- und CLN-Gene von S. cerevisae gleichzeitig durch humane Proteine ersetzt werden können, unterstreicht ebenfalls das Ausmaß, zu welchem die grundlegende Zellzyklus-Maschinerie in der Evolution konserviert worden ist.
Beispiel 6
Durchtritt durch START in Hefe enthaltend humanes Cyclin E und humanes oder Xenopus-CDK2, ein Mitglied der CDC2-Genfamilie
Die Restriktionskarte des fünften Klons, S2-124, passte nicht zu derjenigen von CD2-HS. Kürzlich wurde das humane Homolog des Xenopus-CDK2-Gens (früher bezeichnet als Eg-1; Paris et al., 1991) kloniert (S. Elledge, persönliche Mitteilung), und die Restriktionskarte von S2-124 entsprach jener von CDK2-HS. Zusätzlich haben wir festgestellt, dass das Xenopus-CDK2-Gen auch für CDC28 substituierte und den START in Verbindung mit Cyclin E vollführte. Deshalb enthalten Menschen und Xenopus mindestens zwei Mitglieder der CDC2- Genfamilie, welche den G1/S-Übergang in Hefe regulieren können. Um zu testen, ob das humane CDC2-Gen, oder das CDC2-Homolog CDK2, vollständig cdc28-13 komplementierten, ließen wir diese Transformanten bei 38°C wachsen (5). Bei 38°C ist cdc28-13, verglichen zum Wildtyp-CDC28, sowohl hinsichtlich G1/S als auch G2/M defekt (Reed & Wittenberg, 1990). Wie erwartet (Wittenberg & Reed, 1989) wuchsen Zellen, welche das CDC2-HS-Gen enthielten, bei 30° oder 38°C gleich gut, was zeigt, dass das CDC2-HS-Gen in der Lage war, sowohl die G1/S- als auch G2/M-Funktionen von cdc28-13 zu komplementieren. Kurioserweise versagten bei 38°C die Stämme, enthaltend das humane oder Xenopus-CDK2-Gen und humanes Cyclin E darin, zu wachsen. Unter diesen experimentellen Bedingungen substituierten die humanen oder Xenopus-CDK2-Gene deshalb lediglich teilweise für CDC28. Darüber hinaus zeigten anfängliche Versuche, einen G4L-CDC28-Stamm mit CDK2-HS (auf Glukose) zu komplementieren, dass die Komplementierung äußerst schlecht war, verglichen mit der Komplementierung durch CDC2-HS. Das Versagen von CDK2-HS, entweder cdc28-13 oder GAL-CDC28 vollständig zu komplementieren, steht in Übereinstimmung mit einem früheren Bericht, der zeigt, dass das Xenopus-CDK2-Gen weder die temperatursensitiven cdc28- noch cdc2-Allele komplementierte (Paris et al., 1991). Die Erklärung für die partielle Rettung von cdc28-13 durch CDK2 ist unklar, aber eine Möglichkeit ist, dass das CDK2-Protein die G1/S- aber nicht die G2/M-Funktion von CDC28 komplementieren kann. Um diese Fragestellung definitiv zu lösen, wäre es wesentlich, die Zellzyklus-Arrestpunkte der obenstehend beschriebenen Stämme zu bestimmen. Dies ist nicht möglich gewesen, weil die Instabilität der Plasmide, selbst auf selektivem Medium, nur zu einer Minderheit der Zellen führte, welche alle drei Plasmide enthielten (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 7
Aktivierung von humanem p34-CDC2 durch Cyclin E
Das Mischen von Cyclin-E-Protein mit G1-Zellextrakten zeigte direkt, dass Cyclin E das humane CDC2-Protein in vitro binden konnte, und dass diese Assoziation zur Aktivierung der CDC2-Kinase führte. Wir haben früher gezeigt, dass humane G1-Zellen keine aktive p34-CDC2-Kinase enthalten; das gesamte in der Zelle vorhandene P34-Protein liegt monomer, nicht-assoziiert mit jedwedem Cyclin vor (Draetta & Beach, 1988; D'Urso et al., 1990). G1-Extrakte wurden aus MANCA-Zellen, einer humanen Burkitt-Lymphom-Zelllinie, hergestellt. Wir bestätigten, dass diese G1-Extrakte keine nachweisbare CDC2-Kinase enthielten. Die Extrakte wurden mit einem großen Überschuss an p13-Sepharose im Verhältnis zum CDC2-Protein gemischt, Bedingungen, welche eine quantitative Bindung von CDC2-Protein an p13-Sepharose gewährleisten. Es konnte keine Histon-H1-Kinaseaktivität nachgewiesen werden, welche spezifisch mit den p13-Sepharose-Perlen assoziiert war (siehe 7B). Auch wa ren diese G1-Extrakte in einem Kinase-Assay unter Verwendung eines spezifischen Peptidsubstrats der CDC2-Kinase inaktiv (Marshak et al., 1991).
Um die Wechselwirkung zwischen Cyclin E und CDC2 zu untersuchen, wurde Cyclin E in E. coli als ein Glutathiontransferase-Fusionsprotein (GT-Cyclin E) exprimiert und durch Affinitätschromatographie auf Glutathion-Sepharose gereinigt. Wir inkubierten den G1-Zellektrakt mit GT-Cyclin-E-Sepharose-, GT-Sepharose-, p13-Sepharose- und Leerproben-Sepharose-Perlen. GT-Cyclin-E-Sepharose und p13-Sepharose banden äquivalente Mengen an p34-CDC2-Protein, wie nachgewiesen durch Immunoblotting unter Verwendung eines C-Terminus-spezifischen p34-CDC2-Antiserums (7A). Wir detektierten keine Bindung von p34-CDC2 an GT-Sepharose oder Leerproben-Sepharose.
Nach Inkubation in dem G1-Extrakt wurden die Sepharose-Perlen hinsichtlich Histon-H1-Kinaseaktivität getestet. Nur die GT-Cyclin-E-Sepharose-Perlen enthielten Histon-H1-Kinaseaktivität, selbst obwohl die p13-Sepharose- und GT-Cyclin-E-Sepharose-Perlen gleiche Mengen an p34-CDC2-Protein gebunden hatten (7B). Wir beobachteten ebenfalls, dass das Cyclin-E-Fusionsprotein durch die gebundene Kinase phosphoryliert wurde. Ein Protein, welches exakt mit dem Cyclin-E-Fusionsprotein comigrierte, wurde während der H1-Kinase-Reaktion phosphoryliert, und dieses Phosphoprotein wurde durch ein Cyclin-E-Antiserum immunpräzipitiert (7B). Die Spaltung des phosphorylierten GT-Cyclin-E-Fusionsproteins mit Thrombin zeigte, dass der Cyclin-E-Abschnitt des Fusionsproteins phosphoryliert war (Daten nicht gezeigt). Die Phosphorylierung des GT-Cyclin-E-Fusionsproteins beruhte wahrscheinlich auf der gebundenen CDC2-Kinase (siehe unten), weil die Autophosphorylierung der Cyclin-Untereinheit charakteristisch für Cyclin-CDC2-Komplexe ist (Draetta & Beach, 1988; Pines & Hunter, 1989).
Die obenstehend beschriebenen Experimente zeigten nicht direkt, dass die GT-Cyclin-E-assoziierte Kinase die p34-CDC2-Kinase war. Um dies zu testen, setzten wir die GT-Cyclin E-assoziierten Proteine von den Sepharoseperlen durch Inkubation mit freiem Glutathion frei. Das freigesetzte p34-CDC2-Protein wurde mit einem C-Terminus-spezifischen p34-CDC2-Antiserum immunpräzipitiert, und von ihm wurde gezeigt, eine Histon-H1-Kinaseaktivität zu besitzen (7C). Als Kontrolle zeigten wir, dass keine Kinase aus dem Protein immunpräzipitiert wurde, welches aus den GT-Sepharoseperlen freigesetzt wurde (7C). Wir wissen nicht, welche Fraktion der GT-Cyclin-E-gebundenen Kinase mit dem p34-CDC2-Antiserum immunpräzipitiert werden konnte, und können deshalb nicht ausräumen, dass andere Kinasen (wie CDK2) zu der GT-Cyclin E-gebundenen Kinaseaktivität beigetragen haben.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass Cyclin E die p34-CDC2-Kinase gebunden hat, und unterstützen die Idee, dass diese durch Cyclin E aktiviert wurde. Die Tatsache, dass keine CDC2-Kinase im anfänglichen G1-Extrakt nachgewiesen wurde, legt nahe, dass die Assoziation des CDC2-Proteins mit der GT-Cyclin-E-Sepharose zur Aktivierung des zuvor inaktiven Proteins führte. Da diese Experimente an rohen Zellextrakten ausgeführt wurden, konnten sie nicht überprüfen, ob die Assoziation von Cyclin E mit CDC2-Protein ausreichend für eine Aktivierung der CDC2-Kinase war. Zusätzliche Modifikationen entweder des CDC2- oder des Cyclin-Proteins können notwendige Schritte in dem Aktivierungsweg sein.
Antikörper wurden in Kaninchen gegen das GT-Cyclin-E-Fusionsprotein herangezogen. Diese Antikörper erkannten spezifisch Cyclin E, da sie in vitro translatiertes Cyclin E immunpräzipitierten, jedoch nicht humanes Cyclin A oder B (8A). Dieses Antiserum immunpräzipitierte eine H1-Kinase-Aktivität aus HeLa-Zellen (8B). Dies legte nahe, dass Cyclin E mit einer Kinase in vivo assoziierte, obwohl wir nicht wissen, welche Mitglieder der CDC2-Familie in diesen Komplexen vorhanden waren.
Beispiel 8
Zellzyklus-abhängige Aktivierung von mit Cyclin E und Cyclin A assozierten Proteinkinasen
Die vorausgehenden Beispiele zeigen, dass Immunpräzipitate von Cyclin E aus exponentiell wachsenden MANCA-Zellen (eine humane B-Zelllinie) eine Zellteilungskinase enthalten. Cyclin E-assoziierte Kinaseaktivität während des Zellzyklus wurde unter Verwendung von Zentrifugal-Elutriation, um exponentiell wachsende MANCA-Zellen in 8 Fraktionen zu trennen, untersucht. Die Zentrifugal-Elutriation trennt Zellen physikalisch in verschiedene Zellzyklus-Fraktionen, wodurch potentielle Artefakte vermieden werden, welche bekanntermaßen mit induzierten Synchronisations-Vorgehensweisen assoziiert sind. Wir bestimmten die Position einer elutriatierten Fraktion durch Messen des nukleären DNA-Gehalts durch flusszytometrische Analyse von mit Propidiumiodid gefärbten Zellkernen (9A). Zellextrakte aus jeder der acht unterschiedlichen Zellzyklus-Fraktionen wurden unter Verwendung eines polyklonalen Anti-Cyclin-E-Antiserums immunpräzipitiert. Prä-Immunserum (αPI) aus demselben Tier wurde als Negativkontrolle verwendet. Für jede Fraktion wurde die Kinaseaktivität in den Kontroll-Immunpräzipitaten von der Aktivität subtrahiert, welche in den spezifischen Anti-Cyclin-E-Immunpräzipitaten beobachtet wurde. Die in der 9B präsentierten Daten zeigen den Expressionsspiegel von Cyclin-E-Kinase-Komplexen in den elutriatierten Fraktionen der Zellen (9A), wie bestimmt durch Messen des Spiegels an Histon-H1-Phosphorylierung, katalysiert durch Cyclin-E-assoziierte H1-Kinaseaktivität. Gleiche Anzahlen an Zellen aus jeder Fraktion wurden lysiert, und Cyclin E in den Lysaten wurde mit affinitätsgereinigten Anti-Cyclin-E-Antikörpern (αcycE) immunpräzipitiert. Die Ergebnisse, quantifiziert durch Phosphor-Bilderzeugung, zeigen, dass die mit Cyclin E assoziierte Kinaseaktivität zellzyklusabhängig war und, in drei Experimenten, während des Zellzyklus um das zwischen 4- und 8-fache fluktuierte. Der Gipfel der mit Cyclin E assoziierten Kinaseaktivität entsprach elutriatierten Fraktionen von Zellen mit der größten Zahl von Zellen in der späten G1- und frühen S-Phase. In manchen Experimenten beobachteten wir auch einen kleineren zweiten Peak der mit Cyclin E assoziierten Kinaseaktivität in der G2/M-Fraktion von elutriatierten Zellen (Daten nicht gezeigt).
Die Aktivität der mit Cyclin E assoziierten Kinase während des Zellzyklus ist merklich unterschiedlich von den mit Cyclin A assoziierten Kinasen. Monoklonale C160-Anti-Cyclin-A-Antikörper wurden verwendet, um Cyclin A und seine assoziierten Proteine aus den gleichen Zellextrakten zu immunpräzipitieren, welche verwendet worden waren, um Cyclin-E-assoziierte Kinaseaktivität zu messen (9C). Wie früher beschrieben, wird Cyclin-A-assoziierte Kinaseaktivität zuerst am Beginn der S-Phase nachgewiesen (Pines und Hunter, 1990; Marraccino et al., 1992). Im Gegensatz zu Cyclin-E-assoziierter Kinaseaktivität fährt die Cyclin-A-assoziierte Kinaseaktivität damit fort, über die S-Phase hinweg anzusteigen und erreicht einen Peak in der G2. Diese Ergebnisse weisen ebenfalls darauf hin, dass Peak-Spiegel der Cyclin-A-assoziierten Kinase ungefähr 5- bis 10fach größer als die Peak-Aktivitätsspiegel der Cyclin-E-assoziierten Kinase sind (Daten nicht gezeigt) sind. Allerdings können die absoluten Spiegel variieren, da die hier präsentierten Spiegel von zwei Antikörpern abhängen, welche geringfügig unterschiedliche Assoziationskonstanten (K_a) besitzen können. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Aufeinanderfolge getrennter Cyclinabhängiger Kinaseaktivitäten während des Zellzyklus aktiviert wird; die Kinaseaktivität von Cyclin E steigt an, gefolgt von einem Anstieg in der Cyclin-A- und dann Cyclin-B-assoziierten Kinaseaktivität.
Die Kinetik, mit der die Cyclin-E-assoziierte Kinaseaktivität sich während der G1-Phase des Zellzyklus akkumuliert, wurde als ein relatives Maß der Häufigkeit des enzymatisch aktiven Cyclin-E:Kinase-Komplexes untersucht. MANCA-Zellen wurden 3 Stunden lang im Metaphasen-Stadium des Zellzyklus mit Nocodazol arretiert, wobei zu diesem Zeitpunkt 75 % der Zellen die Cytokinese abgeschlossen hatten. Mittels Elutriation aus restlichen mitotischen Zellen abgetrennte Zellen wurden dann während 3, 4, 5, 6 oder 7 Stunden in die G1-Phase des Zellzyklus freigegeben. Sie schritten synchron nach etwa 6 oder 7 Stunden in die S-Phase fort, wie bestimmt sowohl durch flusszytrometrische Messung des nukleären DNA-Gehalts (9D) als auch durch den Einbau von tritiummarkiertem Thymidin in chromosomale DNA (Daten nicht gezeigt). Dann wurden Zellen durch Zentrifugal-Elutriation in Subpopulationen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus fraktioniert. Es wurde festgestellt, dass mit Cyclin E assoziierte Kinaseaktivität während der G1-Periode erhöht war, wobei sie eine Peakaktivität gerade dann erreichte, als die Zellen in die S-Phase eintraten (9D). Im Gegensatz dazu stellten wir fest, dass Cyclin A-assoziierte Kinasen in der G1 nicht vorhanden waren und zuerst nachgewiesen wurden, als die Zellen in die S-Phase eintraten (9E). In diesem Experiment wurde die Cyclin-A-assoziierte H1-Kinaseaktivität unter Verwendung monoklonaler C160-Anti-Cyclin-A-Antikörper, um Cyclin-A-assoziierte Kinaseaktivität immunzupräzipitieren, bestimmt. Die elutriatierte G1-Fraktion der Zellen (Fraktion 2) wurde bei 32,5°C kultiviert, um die G1-Phase des Zellzyklus zu verlängern. Aliquots von Zellen wurden stündlich für die Messung des Gehalts an nukleärer DNA und der mit Cyclin A und Cyclin E assoziierten Kinaseaktivitäten geerntet, bis zu dem Punkt, an welchem die Zellen sich der S-Phase näherten und in diese eintraten.
Cyclin-E-assoziierte Kinase ist ohne weiteres in proliferierenden Ratten-208F-Zellen nachweisbar, verschwindet aber, wenn sie nach Serumentzug in die Quieszenz eintreten (10A). Als Ratten-PC12-Zellen durch Exposition an NGF dazu veranlasst wurden, sich zu Neuronen zu differenzieren, fiel in ähnlicher Weise die Cyclin-E-assoziierte Kinase auf niedrige Spiegel (10B). In diesen Experimenten testeten wir H1-Kinase-Aktivität in Lysaten aus wachsenden und quieszenten Ratten-208F-Zellen und wachsenden Ratten-PC 12-Zellen. Immunpräzipitate wurden unter Verwendung von affinitätsgereinigten Antikörpern gegen Cyclin E (αE), den C-Terminus von humanem p34-CDC2 (αp34) oder als ein Kontroll-Präimmun-Anti-Cyclin-E-Antiserum (αPI) hergestellt. Die Zellen wurden unter Verwendung von 10%igem Kälberserum (10 % CS, A) zum Wachstum, und unter Verwendung von NGF (+NGF, 10B) zur Differenzierung veranlasst. Quieszente Kontrollen wurden in 0,1 %igem Kälberserum herangezogen (0,1 % CS, 10A). Nicht-differenzierende Kontrollen wurden in Abwesenheit von NGF herangezogen (-NGF, 10B). Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Cyclin-E-assoziierte Kinaseaktivität wachstumsreguliert ist, wie es die Spiegel der Cyclin-E-Expression sind.
Beispiel 9
Konstitutive Expression von Cyclin E verkürzt G1
Das Muster der Cyclin-E-assoziierten Kinaseaktivität während des Zellzyklus legte nahe, dass die von Cyclin E vermittelte physiologische Funktion während der G1-Phase des Zellzyklus stattfindet. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden stabile Zelllinien konstruiert, welche humanes Cyclin E von einem retroviralen LTR-Promotor aus konstitutiv exprimierten. Die Effekte der konstitutiven Cyclin E-Expression auf Zellen und auf die Zellzyklus-Kinetik wurden getestet.
Eine humane Cyclin-E-cDNA wurde in den retroviralen Expressionsvektor LXSN (Miller & Rosman, 1989) kloniert, der die inserierte cDNA von dem 5'-LTR aus exprimiert und das Neomycin-Phosphotransferase-Gen als einen selektierbaren Marker enthält. Das Konstrukt gestattet die Herstellung von retroviralen Vektorpartikeln mit entweder amphotroper oder ecotroper Wirtsbereich-Spezifität. Wir verwendeten einen ecotropischen Ausgangsvorrat an Vektorpartikeln zur Infektion der Rat-1-Fibroblastenzelllinie und selektierten einen Pool von über 10000 unabhängig infizierten Zellen mittels zwei Wochen langem Wachstum in G-418 enthaltenden Selektionsmedien. Zur gleichen Zeit wurde ein Pool von LXSN-Kontrollvektorinfizierten Zellen erzeugt. Pools von infizierten Zellen wurden eher untersucht als einzelne selektierte Zellklone, um jedwede mögliche klonale Variation zu minimieren, welche innerhalb der Zelllinie Rat-1 vorhanden sein könnte. Die Ergebnisse, präsentiert in der 11A(a), zeigen, dass die LXSN-Cyclin E-infizierten Zellen ungefähr 5- bis 10-mal mehr Cyclin-E-Protein enthielten, als in den Zellen nachgewiesen werden konnte, welche mit den viralen Kontroll-LXSN-Vektoren infiziert worden waren. Zwei Cyclin-E-Banden, bei 45 kDa (der Größe von Volllängen-Cyclin-E) und 40 kDa, wurden spezifisch in Cyclin-E-transduzierten Zellen exprimiert. Eine erhöhte Cyclin-E:Kinase-Aktivität wurde ebenfalls in den LXSN-Cyclin-E-transduzierten Zellen beobachtet. Die Ergebnisse in der 11A(b) zeigen eine 3- bis 5-fache Erhöhung im Spiegel der Cyclin-E-assoziierten Histon-H1-Kinaseaktivität in exponentiell wachsenden Kulturen von Rat-1-Zellen. Die in den Kontrollzellen nachgewiesenen niedrigeren Spiegel an Cyclin E und Cyclin-E-assoziierter Kinase beruhten vermutlich auf endogenem Ratten-Cyclin E. Um die Effekte von Cyclin E auf den Zellzyklus auszuwerten, wurden exponentiell wachsende LXSN-Cyclin E-transduzierte Zellen durch Zentrifugal-Elutriation gesammelt. Die Verteilung von transduzierten Zellen innerhalb des Zellzyklus wurde durch Flusszytometrie nach DNA-Färbung mit Propidiumiodid bestimmt (11B). Mit LXSN-Cyclin E transduzierte Zellen zeigten eine Verringerung der Fraktion von Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus im Vergleich zu Kontrollzellen, welche mit dem Kontrollvektor LXSN transduziert worden waren. Die Cyclin E-transduzierten Zellen zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Fraktion von Zellen in der S-Phase des Zellzyklus. Diese beobachteten Änderungen in den Fraktionen von Cyclin E-transduzierten Zellen in den unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus stehen in Übereinstimmung mit einem beschleunigten Durchgang der Zellen durch die G1-Phase des Zellzyklus. Dies wurde bestätigt durch direktes Messen der Länge der G1-Phase in Cyclin-E-infizierten Zellen. Cyclin-E-infizierte Zellen wurden durch Exposition an Nocodazol in der Pseudometaphase synchronisiert, und mitotische Zellen wurden abgesammelt. Die mitotischen Zellen wurden erneut in Kultur gebracht, und der Eintritt in die S-Phase wurde durch Pulsmarkierung mit BrdU (5'-Bromdesoxyuridin) verfolgt. Das BrdU wurde unter Anwendung immunochemischer Verfahren nachgewiesen. Die in der 11C präsentierten Ergebnisse zeigen, dass die Länge der G1-Phase in den LXSN-Cyclin-E-infizierten Zellen (d. h. vom Abschluss der Mitose bis zur Wiederaufnahme der DNA- Synthese in der S-Phase) wesentlich kürzer als in Zellen war, welche mit LXSN transduziert worden waren.
In 5 getrennten Experimenten, unter Verwendung von zwei unabhängigen Paaren von transfizierten Zellpopulationen, war die Dauer der G1 durchschnittlich um 33 % kürzer in mit dem retroviralen LXSN-Cyclin E-Vektor infizierten Zellen als in Zellen, welche mit dem LXSN-Kontrollvektor infiziert waren. Gleichermaßen bestätigten Untersuchungen, durchgeführt zur Messung der Rate des Eintritts von Cyclin-E-transduzierten Zellen in die S-Phase unter Anwendung des immunchemischen Nachweisens von in nukleäre DNA eingebautem BUDR eine Verkürzung der S-Phase in LXSN-Cyclin-E-transduzierten Zellen (Daten nicht gezeigt). Aufgrund der beschränkten Anzahl von Zellen, welche durch mitotische Abschüttelverfahren erhalten werden kann, war es nicht möglich, den Spiegel an Cyclin-E-assozierter Kinaseaktivität zu jedem Zeitpunkt während des Fortschreitens von der Mitose zur S-Phase in den infizierten Rat-1-Zellpopulationen zu messen.
Beispiel 10
Cyclin-E-assoziierte Proteine
Vorhergehende Beispiele haben gezeigt, dass Cyclin E humanes p34-CDC2 und humanes oder Xenopus-p33-CDK2 aktivieren kann, wenn die Proteine zusammen in knospender Hefe exprimiert werden. Ferner haben die Ergebnisse gezeigt, dass Cyclin E in vitro (d. h. in zellfreien Systemen) sowohl humane CDC2 als auch humane CDK2 binden und aktivieren kann. Die Assoziation von Kinasen mit Cyclin E wurde in in-vivo-Untersuchungen (d. h. in Zellen) untersucht, wobei Zellextrakte aus elutriatierten Zellzyklusfraktionen von exponentiell wachsenden MANCA-Zellen hergestellt wurden, welche 3 Stunden lang biosynthetisch mit [³⁵S]-Methionin radioaktiv markiert wurden. Extrakte wurden in SDS-RIPA-Puffer hergestellt, und die spezifischen Proteine wurden unter Verwendung von affinitätsgereinigten Anti-Cyclin-E-Antikörpern (hergestellt gegen GST-Cyclin-E-Fusionsprotein) und einem Antiserum gegen den C-Terminus von humanem CDC2 (p34) immunpräzipitiert. Immunpräzipitate wurden gesammelt, gewaschen und in dem SDS-Puffer gekocht, bevor eine Auftrennung auf 12 % SDS-Polyacrylamid-Gelen erfolgte. Der Nachweis von radioaktiv markierten Polypeptiden in den Gelen wurde unter Verwendung von Natriumsalicylat erleichtert; und die Gele wurden dann für eine Autoradiographie getrocknet. Die 12 zeigt die p34-assoziierten Proteine (Spur 1) und die mit Cyclin E assoziierten Proteine (Spuren 2–11) in exponentiell wachsenden Zellen (Spur 2), während der G1-Phase (Spur 3), G1/S- (Spur 4), S- (Spuren 5–8), S/G2-(Spuren 9 – 10) und M-Phase (Spur 11). Die Molekulargewichte der Proteine, welche mit den Cyclin-E:CDC-Kinase-Komplexen assoziierten, in dem Assay von 12 sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefasst. Das 13Kd-Polypeptid war mit dem Komplex während der Mitte der S-Phase assoziiert; das 17Kd während des gesamten Zellzyklus; die 32Kd-Doublette hauptsächlich spät in G1 und S; das 36Kd lediglich in G1 und G2/M; das 70Kd vorwiegend in S; das 85Kd (d.h. die unterste Bande in dem Triplet) während des gesamten Zellzyklus, und das 107Kd in der S-Phase und direkt vor und nach der S-Pchase. Der Unterschied im Expressionsmuster der 32Kd-Doublette legte nahe, dass es sich bei ihr nicht um CDK2 oder CDC2 handelte, und dies wurde durch Kartierung der tryptischen Fragmente von CDK2, CDC2 und der 32kD-Bande, gekennzeichnet als Bande "x", assoziiert mit den immunpräzipitierten Komplexen, bestätigt.
Tabelle 1 Molekulare Größen von akzessorischen Cyclin-E:CDC-Kinase-Proteinen
Eine Reihe von Kontroll-Immunpräzipitations-Reaktionen wurde durchgeführt, um die Spezifität von Anti-CDC2- und Anti-CDK2-Antikörpern zu charakterisieren. Lysate aus exponentiell wachsenden MANCA-Zellen wurden unter Verwendung von affinitätsgereinigten Antikörpern, gerichtet gegen die 7 C-terminalen Aminosäuren von humanem p34-CDC2, (αCDC2) oder Antiserum, gerichtet gegen die 15 C-terminalen Aminosäuren von humanen p33-CDK2, (αCDK2) immungeblottet. In der 13 sind die Spuren 1 und 2 Immunoblots von Ganzzellextrakten; in den S puren 3 und 4 wurden Ganzzellextrakte zuerst mit affinitätsgereinigten Anti-p34-CDC2-Antikörpern immunpräzipitiert und dann mit den angegebenen Antikörpern geblottet; in den Spuren 5 und 6 wurden die Extrakte zuerst mit einem Antiserum gegen den C-Terminus von p33-CDK2 immunpräzipitiert und dann mit den angegebenen Antikörpern geblottet. Man bemerke das Vorhandensein eines nicht-spezifischen Signals, herrührend von dem immunpräzipitierenden Antikörper, zwischen 50 und 80 kDa. Ein Extrakt aus MANCA-Zellen, arretiert an der G1/S-Grenze mit Aphidicolin, wurde unter Anwendung von affinitätsgereinigten Antikörpern gegen humanes Cyclin E immunpräzipitiert und dann unter Verwendung der gleichen Antikörper geblottet. Eine einzelne Proteinbande bei 45 kDa wurde nachgewiesen. Deshalb waren die assoziierten Proteine in Cyclin-E-Immunopräzipitaten am wahrscheinlichsten an Cyclin E gebunden und wurden nicht wegen einer nichtspezifischen Kreuzreaktivität mit diesem Antikörper nachgewiesen.
Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurde Immunoblotting angewandt, um die Assoziation zwischen Cyclin E und sowohl p33-CDK2 als auch p34-CDC2 in Extrakten zu untersuchen, hergestellt aus MANCA-Zellen, welche exponentiell wuchsen oder mit Aphidicolin an der G1/S-Grenze arretiert worden waren. Die Aphidicolin-blockierten Zellen wurden gewählt, weil die Aktivität der Cyclin-E-assoziierten Kinase am Übergang von G1 nach S maximal ist. Zellextrakte wurden unter Vewendung von affinitätsgereinigten Anti-Cyclin-E-Antikörpern immunpräzipitiert, und die Immunpräzipitate wurden sowohl unter Verwendung von CDC2-als auch CDK2-spezifischen Antiseren western-geblottet. Für alle Immunpräzipitationen waren die Antikörper an Sepharose vernetzt worden. Immunpräzipitationen wurden mit Prä-Immun-Serum ("αPI"), Leerproben-Sepharoseperlen ("SEPH"), affinitätsgereinigtem Anti-p34-CDC2-C-Terminus ("αp34") und affinitätsgereinigtem Anti-Cyclin-E ("αE") durchgeführt (14A). Die Gruppe von Spuren, markiert mit "--" enthielt keinen Zellextrakt. Beide Antiseren wurden gegen Peptide herangezogen, entsprechend den C-Termini der jeweiligen Proteine. Der C-Terminus der CDC2-verwandten Proteine ist nicht hochkonserviert. Die Ergebnisse zeigen, dass das Anti-C-Terminus-CDC2-Antiserum CDC2 und nicht CDK2 erkannte, und umgekehrt, dass das Anti-C-Terminus-CDK2-Antiserum CDK2 und nicht CDC2 erkannte (13).
Immunoblots von Ganzzellextrakten zeigen zwei Formen von CDK2 (Rosenblatt et al., 1992; siehe auch 14A). Sowohl in mit Aphidicolin arretierten Zellen (14A) als auch in exponentiell wachsenden Zellen (nicht gezeigt; siehe 15) assoziierte Cyclin E präferentiell mit einer schneller wandernden Form von CDK2. Die Identifikation von CDK2 in Cyclin-E-Immunpräzipitaten ist unter Verwendung von 3 verschiedenen Antiseren bestätigt worden, unabhängig herangezogen gegen den C-Terminus von humanem CDK2. Alle drei Antiseren erkennen CDK2 und nicht CDC2 (Rosenblatt et al., 1992; Elledge et al., 1992; 13). Die schneller wandernden Formen von CDK2 sind nach der derzeitigen Annahme höher phosphoryliert (Rosenblatt et al., 1992). Dies steht in Übereinstimmung mit unserer Beobachtung, dass alle Cyclin-E-assoziierten Isoformen von CDK2, nachgewiesen in [³⁵S]-Methionin-markierten Zellextrakten, auch in Anti-Cyclin-E-Immunpräzipitaten aus [³²P]-Orthophosphat-markierten Zellextrakten nachgewiesen wurden.
Die Ergebnisse zeigen, dass p34-CDC2 auch in den Cyclin-E-Immunpräzipitaten nachgewiesen wurde, obwohl seine Häufigkeit wesentlich geringer war als jene von CDK2. In exponentiell wachsenden Zellen wurde eine vorwiegend hypophosphorylierte Form von p34-CDC2 nachgewiesen, wohingegen in Aphidicolin-arretierten Zellen ebenfalls höher phosphorylierte Formen von p34-CDC2, welche mit Cyclin E assoziiert waren, vorkamen (14B). In beiden Fällen war es möglich, nur sehr kleine Mengen an p34-CDC2, assoziiert mit Cyclin E, nachzuweisen.
Beispiel 11
Zellzyklus-abhängige Bildung eines Cyclin-E:CDK2-Komplexes
Die Phase im Zellzyklus, bei welcher Cyclin E und CDK2 einen enzymatisch aktiven Komplex bilden, wurde untersucht. Exponentiell wachsende MANCA-Zellen wurden durch zentrifugale Elutriation in 8 Zellzyklus-Fraktionen getrennt, und Zellextrakte wurden hergestellt. Die Zellzyklus-Position der Zellen in jeder Fraktion wurde durch flusszytrometische Messung des nukleären DNA-Gehalts (15A) bestimmt. Cyclin E und seine assoziierten Proteine wurden unter Verwendung affinitätsgereinigter Anti-Cyclin-E-Antikörper immunpräzipitiert. Wir visualisierten das Vorhandensein von CDK2 durch Western-Blotting unter Verwendung eines Antiserums, welches für den C-Terminus von CDK2 spezifisch war (15B1–B4). Die Ergebnisse zeigen, dass der Spiegel an enzymatisch aktivem Cyclin-E:CDK2-Komplex einen Gipfel während der späten G1 und frühen S-Phase erreichte und hinsichtlich der Häufigkeit abnahm, als die Zellen durch den Rest des Zellzyklus voranschritten. Die Häufigkeit des Cyclin-E:CDK2-Komplexes entsprach in naher Weise der Zellzyklus-Periodizität der Cyclin-E-assoziierten Kinase (wie in früheren Beispielen beschrieben). Darüber hinaus legen die vorliegenden Ergebnisse nahe, dass in exponentiell wachsenden Zellen Cyclin-E:CDK2-Komplexe sich nicht in einer inaktiven Form ihrer Aktivierung in der späten G1 akkumulierten. Dieses Muster des Erscheinens und der Aktivierung war beobachtetermaßen ähnlich zu dem Muster, welches für Cyclin-A-assoziierte Kinaseaktivität berichtet wurde, d. h. die Aktivität hiervon stieg berichtetermaßen in direkter Proportion zur Häufigkeit von Cyclin A an (Pines und Hunter, 1990; Marraccino et al., 1992). Allerdings waren die vorliegenden Ergebnisse unterschiedlich von denjenigen, welche mit dem Cyclin-B:p34-CDC2-Komplex erhalten wurden, dahingehend, dass sich der Cyclin-B:CDC2-Komplex berichtetermaßen während S und G2 akkumuliert, inaktiv und hochphosphoryliert, vor deren Aktivierung beim Beginn der Mitose (Gould und Nurse, 1989; Pondaven et al., 1990; Solomon et al., 1990).
Beispiel 12
Die Häufigkeit von Cyclin E ist Zellzyklus-reguliert
Die Häufigkeit des Cyclin-E-Proteins wurde in verschiedenen Phasen des Zellzyklus bestimmt. MANCA-Zellen wurden durch zentrifugale Elutriation in Fraktionen getrennt, repräsentierend jedes Stadium des Zellzyklus. Wir analysierten Zelllysate aus jeder Fraktion mittels Immunpräzipitation unter Verwendung von affinitätsgereinigten Anti-Cyclin-E-Antikörpern, welche wir auch verwendeten, um die Häufigkeit von Cyclin E in den Immunpräzipitaten zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Cyclin-E-Spiegel in der späten G1 maximal waren und in S, G2 und M abnahmen (15B1–B4). Es wurde festgestellt, dass das Immunoassay-Vorgehen akkurat die relativen Spiegel an Cyclin E in jeder Zellzyklus-Fraktion widerspiegelt, da die nachgewiesene Menge an Cyclin-E-Protein linear abhängig von der Menge des in der Immunpräzipitation verwendeten Zellextrakts war (15C). Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass die Häufigkeit des Cyclin-E:CDK2-Komplexes und somit die Periodizität der Cyclin-E-assoziierten Kinaseaktivität direkt durch den Spiegel an Cyclin E reguliert werden können.
Beispiel 13
Zusammenbau von Cyclin-E:CDC2- und Cyclin-E:CDK2-Komplexen in vitro
Wie gezeigt, assoziiert Cyclin E präferentiell eher mit p33-CDK2 als mit p34-CDC2 in humanen Zellen. Eine mögliche Erklärung hierfür besteht darin, dass die Affinität von Cyclin E für CDK2 anders ist als für CDC2. Diese Möglichkeit wurde in einem zellfreien System aus rekombinantem Cyclin E und Zellextrakten, enthaltend CDC2- und CDK2-Kinasen, ausgewertet. Cyclin E wurde unter Verwendung von Baculovirus-Vektoren in Sf9-Insektenzellen exprimiert. Cyclin-E-Protein wurde in den transduzierten Insektenzellen überexprimiert, die intrazellulären Konzentrationen beliefen sich auf ungefähr 5–10 μM nach 48 Stunden (Desai et al., 1992), und diese Zellen wurden abgeerntet und die Proteine für eine Analyse extrahiert.
Die Bindung zwischen Cyclin E, CDC2 und CDK2 wurde unter Verwendung verdünnter Insektenzellextrakte als Quelle für Cyclin E und von Extrakten aus G1-Zellen als Quelle für CDC2 und CDK2 ausgewertet. Um vom Zellzyklus abhängige Unterschiede in den Effekten von Cyclin E auf die CDC2- und CDK2-Kinasen zu bestimmen, wurden Zellextrakte hergestellt aus Zellen, deren Wachstum 12 Stunden lang (d. h. vor der S-Phase) in Medien arretiert wurde, welche 2 mM Hydroxyharnstoff enthielten (was die Zellen dazu bringt, in der S-Phase anzuhalten, und alle anderen Zellen dazu bringt, sich nahe der S-Phase anzustauen), gefolgt von Freigabe des Wachstums während 3,5 Stunden, um allen Zellen zu gestatten, in die S-Phase einzutreten ("HU" 16A–16B); sowie aus mit Nocodazol blockierten Zellen, welche während drei Stunden in die G1 freigegeben und dann weiter mittels Zentrifugal- Elutriation selektiert wurden ("G1", 16A und 16B). Alle Zellextrakte wurden in hypotonischem Puffer hergestellt. Die Inkubationsmischungen waren ausgelegt, um die Konzentration der drei Proteine nahe zu den normalen physiologischen Spiegeln bei ungefähr 0,2 μM zu bringen. Verdünnte Lysate, enthaltend die angegebenen Cyclin-E-, CDC2- und CDK2- Proteine, wurden allein oder in Kombination 30 Minuten lang bei 37°C unter Bedingungen inkubiert, geeignet für die in vitro-Replikation von Plasmiden mit SV40-Ursprung (D'Urso et al, 1990). Die Bildung von Cyclin-E:CDC2- und Cyclin-E:CDK2-Komplexen in den Inkubationsmischungen wurde unter Anwendung von Immunpräzipitation entweder mit Antiseren gegen CDC2 (Anti-CDC2), den C-Terminus von CDK2 (Anti-CDK2) oder Cyclin E (Anti-Cyclin E), gefolgt von SDS-PAGE und Autoradiographie bestimmt (16A, 16B, 16C). Die mit den unterschiedlichen jeweiligen Immunpräzipitaten assoziierte Kinaseaktivität wurde in dem H1-Kinase-Assay bestimmt (wie beschrieben in den obenstehenden Beispielen).
Die Immunpräzipitate wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Phosphorylierung von Histon H1 (d.h. H1-Kinaseaktivität) zu vermitteln, durch Mischen der Immunpräzipitate mit Histon H1 und γ-³²P-Orthophosphat getestet. ³²P-radiomarkiertes Histon H1 wurde mittels SDS-PAGE und Phosphor-Bilderzeugung nachgewiesen (16A, 16B, 16C). (Die Phosphor-Bildgebung in den 16A–16C wurde quantifiziert und die Resultate sind graphisch in der 17 präsentiert.) Die CDC-Kinaseaktivität, obgleich bei niedrigen Spiegeln in Immunpräzipitaten ersichtlich, welche aus HU-arretierten Zellen hergestellt wurden (16C, "HU"), war während der G1-Phase auf fast nicht nachweisbare Spiegel verringert (16C, G1-Extrakt, "0"), und der Spiegel an Kinaseaktivität wurde nicht durch Zugabe verschiedener Mengen an Cyclin E zum Zellextrakt verändert (d. h., 16A, 16B, 16C; "5, 1, 0,2"). Im Gegensatz dazu sank die CDK2-Kinaseaktivität, welche bei niedrigen Spiegeln in HU-arretierten Zellextrakten vorhanden war (16A "HU"), auf nichtnachweisbare Spiegel in G1 (16A, G1-Extrakt "0"), aber als Cyclin E zu dem G1-Zellextrakt zugegeben wurde (16A, "5, 1, 0,2"), wurde die CDK2-Kinaseaktivität wiederhergestellt. Die Ergebnisse zeigen eine Aktivierung einer latenten CDK2-Kinaseaktivität in den G1-Phasen-Zellextrakten im Anschluss an die Zugabe von Cyclin E und legen nahe, dass die Kinaseaktivität von der Häufigkeit von Cyclin E reguliert wird. Quantitative Aspekte dieser Untersuchungen sind in der 17 präsentiert, worin der Spiegel der Cyclin-E-vermittelten Aktivierung der CDK2-Kinaseaktivität gemessen wurde (d. h. unter Anwendung von Phosphorbilderzeugung der SDS-PAGE-Gele, präsentiert in den 16A, 16B und 16C, obenstehend) als eine Funktion der Menge an Cyclin E, welche dem G1-Phasen-Zellextrakt zugesetzt wurde ("Vielfaches an Cyclin E in HU-Extrakt"; 17). (Die unterschiedlichen Mengen von Sf9-Lysat, enthaltend Cyclin E, in der 17 entsprechen den Mengen "5, 1 und 0,2" in 16A, 16B und 16C.) Die Phosphorbilderzeugungs-Daten für die Kinaseaktivität von jedem der CDC2-, CDK2- und Cyclin-E-Immunpräzipitate wurde durch Berechnen der Aktivität als Prozentsatz der in Zelllysaten von HU-arretierten Kontrollzellen beobachteten Aktivität normiert (d. h. 100 %; "%Hydroxyharnstoff H1-Kinase"; 17). Die in der 17 präsentierten Ergebnisse zeigen, dass der Spiegel der CDK2-Kinaseaktivität abhängig von der zum G1-Extrakt zugesetzten Menge an Cyclin E war, und dass Spiegel an CDK2-Kinaseaktivität erzielt wurden, welche mehr als 22-mal größer waren als diejenigen, welche in den HU-arretierten Zellextrakten beobachtet wurden (d. h. Cyclin-E-Immunpräzipitat bei 5-fach Cyclin E; 17). Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die mit den Cyclin-E-Immunopräzipitaten assoziierte Kinaseaktivität konsistent größer war als jene, welche mit den CDC2-Immunpräzipitaten assoziiert war. Die Ergebnisse bestätigen ebenfalls die vorhergehenden (obenstehenden) Befunde, dass nur geringe Spiegel an CDC2-Aktivität in den G1-Phasen-Zellextrakten vorhanden sind, und dass jedwede latente CDC2, welche in diesen Extrakten vorhanden sein könnte, durch die Zugabe von Cyclin E nicht merklich aktiviert wird.
Diese kombinierten Ergebnisse legen eine Aktivierung der Kinaseaktivität durch Cyclin E nahe, welche aus der Bildung eines Cyclin-E:CDK2-Komplexes resultiert. In anderen Untersuchungen (nicht gezeigt) wurde die Assoziation von Cyclin E mit CDC2 oder CDK2 unter Verwendung von Molekularsieb-Gelchromatographie auf Superose 12 verifiziert. p34-CDC2- und p33-CDK2-Monomere eluierten bei 30–40 kDa und hatten eine vernachlässigbare Histon-H1-Kinaseaktivität. Als rekombinantes Cyclin E enthaltende Insektenzellextrakte mit dem CDK2-haltigen Lysat gemischt wurden, eluierte der Hauptteil des CDK2-Proteins bei einer ungefähren molekularen Größe von 160 kDa, was die Bildung eines Cyclin-E:CDK2-Komplexes nahelegt. Als Extrakte, welche eine ähnliche Menge an CDC2 enthielten, mit dem Cyclin-E-Lysat vermischt wurden, assoziierte im Gegensatz dazu nur ein kleiner Bruchteil des CDC2-Proteins auf stabile Weise mit Cyclin E. Die Cyclin-E:CDC2- und Cyclin-E:CDK2-Komplexe, welche aus der Molekularsiebsäule eluierten, zeigten Kinaseaktivität auf.
Diskussion der Beispiele 8–13
Cyclin E ist ein G1-Cyclin.
Die Proliferation eukaryotischer Zellen wird hauptsächlich von einer einzelnen Entscheidung reguliert, welche während der G1-Phase des Zellzyklus stattfindet – entweder in den Zellzyklus einzutreten und sich zu teilen, oder aus dem Zellzyklus auszuscheiden und in einen ruhenden Zustand einzutreten (übersichtsmäßig zusammengefasst in Baserga, 1985; Pardee, 1989). In Hefe ist der biochemische Prozess, welcher dieser zellulären Entscheidung zugrunde liegt, der Zusammenbau und die Aktivierung eines Komplexes zwischen der CDC8-Proteinkinase und den CLN-Typ-Cyclinen (übersichtsmäßig zusammengefasst in Nurse, 1990; Hartwell, 1992). Kürzliche Experimente in einer Vielzahl von Modellsystemen unterstützen die Idee, dass die Rolle der CDC2-verwandten Kinasen evolutionär konserviert worden ist (D'Urso et al., 1990; Blow- & Nurse, 1990; Furakawa et al., 1990; Fang- & Newport, 1991). Die hier vorgestellten Beobachtungen zeigen, dass humanes Cyclin E spezifisch eine CDC2-verwandte Kinase während der späten G1-Phase des Zellzyklus aktiviert, und dass die Cyclin-E-Akkumulation für den G1-Transit geschwindigkeitsbegrenzend ist. Deshalb schlagen wir vor, dass in allen Eukaryoten ein kritischer Schritt im biochemischen Weg, der die Zellproliferation steuert, der Zusammenbau eines Cyclin/CDK-Komplexes ist (der Begriff CDK wird verwendet, um eine Cyclin-abhängige Kinase in der CDC2-Proteinfamilie zu bezeichnen).
Der Beweis, dass Cyclin E während der G1-Phase des humanen Zellzyklus wirkt, kann wie folgend zusammenfasst werden: Cyclin E kann die G1-START-Funktionen der Hefe-CLN-Proteine ausführen, da es Mutationen in den Hefe-CLN-Genen komplementieren kann (Koff et al., 1991; Lew et al., 1991). Fernerhin haben wir gezeigt, dass Cyclin E in Kombination mit entweder humanem CDC2 oder humanem CDK2 Hefestämme retten könnte, welche doppelt sowohl hinsichtlich der CLN- als auch CDC28-Funktion mutiert worden waren (Koff et al., 1991). Allerdings war die Spezifität des Assays suspekt, weil humanes Cyclin B, welches in klarer Weise während der Mitose und nicht während der G1 wirkt, CLN-Mutationen ebenfalls retten konnte (Koff et al., 1991; Lew et al., 1991; Xiong et al., 1991). Wie hierin berichtet, assoziiert Cyclin E mit einer Proteinkinase in humanen Zellen, und diese Kinase ist zellzyklus-reguliert. Die Aktivität der mit Cyclin E assoziierten Proteinkinase, sowie die Häufigkeit des Cyclin-E-Proteins, gipfeln während der späten G1- und frühen S-Phase und nehmen dann ab, wenn die Zellen durch S, G2 und Mitose schreiten. Diese Kinase ist ebenfalls wachstumsreguliert, da sie bei Zellen abwesend ist, welche den Zellzyklus verlassen haben und differenzierten oder quieszent wurden. Die relative Zeitgebung der Cyclin-E- und Cyclin-A-Aktivität ist bedeutend. Cyclin-A-Protein und Cyclin-A-assoziierte Kinaseaktivität sind nachweisbar, sobald die S-Phase beginnt (Marraccino et al., 1992), und die Cyclin-A-Funktion ist notwendig für das Auftreten der S-Phase (Girard et al. 1991). Wir haben ebenfalls gezeigt, dass sich Cyclin E vor Cyclin A akkumuliert, und dass die mit Cyclin E assoziierte Kinase früher im Zellzyklus erscheint als die mit Cyclin A assoziierte Kinase. Diese biochemische Funktion von Cyclin E während G1 legte nahe, dass sein physiologische Funktion der S-Phasen-Rolle von Cyclin A vorausgehen würde. Dies wurde direkt gezeigt durch konstitutives Exprimieren von humanem Cyclin E in der Ratten-Fibroblasten-Zelllinie Rat-1. Wir haben festgestellt, dass eine 5- bis 10-fache Überexpression von Cyclin E einen 3- bis 5-fachen Anstieg im Spiegel der Cyclin-E-assoziierten Kinaseaktivität verursachte. Dieser Spiegel der Cyclin E-Überexpression verursachte eine 30–35%ige Verringerung in der Länge der G1-Phase des Zellzykluses.
Die Häufigkeit des Cyclin-E-Proteins ist normalerweise Zellzyklus-reguliert – sie zeigt einen scharfen Peak in der späten G1. Dies beruht wahrscheinlich auf der Regulierung des Cyclin-E-mRNA-Spiegels (Lew et al., 1991), da er während des Zellzyklus parallel mit dem Spiegel des Cyclin-E-Proteins schwankt. Die für Cyclin E, A und B codierenden mRNA's sind zellzyklusreguliert und sagen das Akkumulierungsmuster der jeweiligen Cyclin-Proteine vorher (Pines und Hunter, 1989, 1990). In knospender Hefe steht die Akkumulation der CLN-mRNA's unter einer positiven Rückkopplungs-Steuerung und führt zu einem raschen Anstieg der CLN-mRNA- und -Proteinspiegel beim START (Cross und Tinkelenberg, 1991; Dirick & Nasmyth, 1991). Die Assoziation von Cyclin-Proteinen mit Transkriptionsfaktoren in Säugerzellen kann Teil eines analogen Mechanismus sein, welcher die Zeitgebung der Cyclin-Genexpression während des Zellzyklus reguliert (Bandara et al., 1991; Mudryj et al., 1991; DeVoto et al., 1992; Shirodkar et al., 1992). Während die Cyclin-Akkumulierung teilweise durch die Spiegel der jeweiligen mRNA's bestimmt wird, kann die Cyclin-Häufigkeit auch durch den Protein-Turnover gesteuert werden (Murray & Kirschner, 1989; Glotzer et al., 1991). Es ist nicht bekannt, ob die Stabilität des Cyclin-E-Proteins während des Zellzyklus reguliert wird, aber dem Protein fehlt die Konsensus-Sequenz, welche von dem ubiquitinylierenden Enzym erkannt wird, welches den mitotischen Turnover der Cycline A und B vermittelt (Glotzer et al., 1991).
Der Cyclin-E:CDK2-Komplex
Die Daten legen nahe, dass die hauptsächliche Cyclin-E-assoziierte Proteinkinase CDK2 ist. Zweidimensionale Gelanalysen von ³²P- oder ³⁵S-met-markierten Proteinen zeigen, dass das hauptsächliche CDC2-verwandte Protein, welches mit Cyclin E in humanen Zellen assoziiert ist, CDK2 ist. Obgleich es keinen direkten Beweis gibt, dass der Cyclin-E:CDK2-Komplex eine aktive Kinase in vivo ist, ist dies die wahrscheinlichste Schlussfolgerung. Die Häufigkeit des Cyclin-E:CDK2-Komplexes ist zellzyklusreguliert und in enger Weise parallel zu den Spiegeln der Cyclin-E-assoziierten Kinase. Darüber hinaus liegt das an Cyclin E gebundene CDK2-Protein hauptsächlich in der schneller wandernden der zwei Formen vor, welche durch eindimensionale PAGE nachweisbar sind. Diese abwärts gerichtete Mobilitäts-Verschiebung korreliert bekanntermaßen sowohl mit der Bindung von CDK2 an Cyclin als auch der Aktivierung der CDK2-Kinase (Rosenblatt et al., 1992). Von ihr wird angenommen, für die Phosphorylierung von Threonin 160 kennzeichnend zu sein, welche eine Voraussetzung für die Aktivierung der CDK2-Kinase ist (Y. Gu und D . M ., unveröffentlichte Beobachtungen). Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass der Cyclin-E:CDK2-Komplex für den CLN/CDC28-Komplex in S. cerevisae substituieren kann (Koff et al., 1991), und dass der Cyclin-E:CDK2-Komplex eine aktive Kinase in vitro ist.
Die periodische Akkumulierung des Cyclin-E-Proteins in Zellen scheint derjenigen des Cyclin-E:CDK2-Komplexes zu entsprechen, wohingegen das CDK2-Protein bei invarianten Spiegeln während des Zellzyklus vorhanden ist (Rosenblatt et al., 1992). Deshalb scheint es so, dass die Häufigkeit des Cyclin-E:CDK2-Komplexes hauptsächlich durch den Spiegel des Cyclin-E-Proteins reguliert wird. Allerdings könnte der Phosphorylierungszustand von Cyclin E ebenfalls den Zusammenbau des Komplexes steuern.
Mindestens sechs phosphorylierte Isoformen von CDK2 sind mit Cyclin E assoziiert. Diese Komplexität war überraschend, da nur zwei dieser Isoformen gebunden an Cyclin A nachgewiesen worden waren. Vorläufige Beweise zeigen, dass CDK2 an drei Resten phosphoryliert wird, welche homolog zu denjenigen sind, welche in CDC2 phosphoryliert werden (Y. Gu & D. M., unveröffentlichte Beobachtungen) – T14, Y15 und T160. Die kombinatorische Phosphorylierung dieser Stellen könnte für die sechs CDK2-Isoformen verantwortlich sein. Es scheint allerdings wahrscheinlicher, dass auch andere Phosphorylierungsstellen vorhanden sind, da Immunpräzipitate mit Anti-CDK2-Antikörpern zwei weitere phosphorylierte Isoformen von CDK2 enthielten, was die nachgewiesene Gesamtzahl auf acht bringt (11D). Eine Interpretation ist, dass der Cyclin-E:CDK2-Komplex die von den vielen Signalen, welche Zellproliferation steuern, vorgesehene Information integriert, z. B. durch Binden von Second Messengern, welche an der Signaltransduktion beteiligt sind. Die mehrfachen phosphorylierten Formen von CDK2 können den Einfluss diverser mitogener Signale auf die Aktivierung des Cyclin-E:CDK2-Komplexes reflektieren. Die mehreren CDK2-Phosphate könnten sowohl positive als auch negative Effekte auf die CDK2-Aktivität besitzen, und ein besonderer phosphorylierter Zustand kann für spezifische Funktionen erfordert werden. Die Stromabwärts-Aktivierung des Cyclin-A:CDK2-Komplexes, welche stattfindet, nachdem die Überweisung an den Zellzyklus vorgenommen worden ist, kann auf viel weniger Faktoren responsiv und daher biochemisch weniger kompliziert sein.
Andere Beweise haben angezeigt, dass CDK2 eine Rolle während der G1- oder S-Phase des Zellzyklus spielen könnte. In zyklierenden Zellen geht die CDK2-Kinaseaktivität der CDC2-Kinaseaktivität voraus (Rosenblatt et al., 1992). Unsere Experimente in S. cerevisae zeigten, dass in bestimmten genetischen Hintergründen CDK2 die G1/S-Funktion von CDC28 und nicht seine G2/M-Funktionen komplementieren kann (Koff et al., 1991). Des Weiteren verhindert eine Depletion von CDK2 aus Extrakten von aktivierten Xenopus-Eiern den Beginn der DNA-Replikation (Fang und Newport, 1991). Alle diese Ergebnisse sind konsistent mit einer Rolle von CDK2 bei der Überweisung der Zelle an den Zellzyklus.
Der Cyclin-E:CDC2-Komplex
Cyclin E kann sowohl mit humanem CDK2 als auch humanem CDC2 wechselwirken, wenn die Proteine zusammen in Hefe exprimiert werden, und Cyclin E kann sowohl die CDK2- als auch CDC2-Kinase in vitro aktivieren (obenstehende Beispiele). Wir haben gezeigt, dass obwohl der Cyclin-E:CDK2-Komplex in humanen Zellen häufiger ist, auch der Cyclin-E:CDC2-Komplex vorhanden ist. Darüber hinaus wurden Komplexe Cyclin E und anderen Proteine beobachtet (12; Tabelle 1), welche die Cyclin-E-Aktivität potenziell modulieren oder verändern können. Das Muster der Cyclin-E-assoziierten Kinaseaktivität während des Zellzyklus zeigte einige Unterschiede zur Häufigkeit des Cyclin-E:CDK2-Komplexes. Diese Unterschiede können auf den Cyclin-E:CDC2- oder die anderen Cyclin-E-Komplexe zurückführbar sein.
Der niedrige Spiegel des Cyclin-E:CDC2-Komplexes in vivo scheint eine Folge der relativ geringen Affinität von Cyclin E für CDC2 zu sein. Die hier präsentierten Rekonstitutionsexperimente zeigen, dass der Cyclin-E:CDK2-Komplex sich unter Bedingungen leicht bildete, unter denen sehr wenig Cyclin E an CDC2 bindet. Wir haben jedoch festgestellt, dass Cyclin E in vivo in mehreren phosphorylierten Zuständen vorhanden ist. Deshalb besteht eine andere Möglichkeit darin, dass nur bestimmte, relativ seltene Isoformen von Cyclin E an CDC 2 binden können.
Wir haben früher beobachtet, dass eine Mutation im Hefe-CDC28-Gen in großem Maße die Fähigkeit von Cyclin E, jedoch nicht Cyclin B, beschneidet, CLN-Funktion zu retten, und folglich schlugen wir vor, dass Cyclin E mit CDC28 anders als Cyclin B wechselwirken könnte (Koff et al., 1991). In-vitro-Rekonstitutionsexperimente unterstützen diese Idee, indem sie zeigten, dass Cyclin B effektiv an CDC2 bindet (Desai et al., 1992), während nur kleine Mengen an Cyclin-E:CDC2-Komplex nachgewiesen werden konnten.
Andere Cyclin-E:CDC-Komplexe.
Die obenstehend in 12 und Tabelle 1 präsentierten Ergebnisse können auch interpretiert werden, dass sie die mögliche Existenz anderer Zellteilungskinasen, welche früher unerkannt waren, anzeigen, die mit Cyclin E assoziieren. Das 32Kd-Banden-"x"-Protein (Tabelle 1, 12) ist sicherlich ein Kandidat für ein solches neues Kinaseprotein, sowohl basierend auf der Ähnlichkeit hinsichtlich der Größe mit den bekannten CDC2- und CDK2-Kinasen als auch hinsichtlich seiner scheinbaren Assoziation mit Cyclin E.
G1-Regulierung in Säugerzellen
Im Jahre 1974 schlug Pardee vor, dass die Proliferation von Säugerzellen durch extrazelluläre mitogene Signale an einem Punkt während der G1-Phase des Zellzyklus reguliert wird, welcher als der Restriktionspunkt bezeichnet wird (Pardee, 1974). Wenn diese Signale nicht vorhanden waren, oder wenn die Zelle nicht in der Lage war, auf diese angemessen zu antworten (z. B. wenn die Proteinsynthese inhibiert ist), dann würde die Zelle den Restriktionspunkt nicht überschreiten und tritt in einen quieszenten Zustand ein, welcher G₀ genannt wird (übersichtsmäßig zusammengefasst in Zetterberg, 1990). Obgleich Zellen auf eine große Auswahl an extrazellulären mitogenen Signalen antworten können, bekommt man den Eindruck, dass es viel weniger Diversität in den durch diese Signale ausgelösten intrazellulären Ereignissen gibt (siehe Cantley, 1991; Chao, 1992). Tatsächlich ist es unvernünftig, zu erwarten, dass es einen gemeinsamen Endpunkt geben könnte, durch welchen die diversen mitogenen Wege hindurchlaufen müssen, und dass dies der Restriktionspunkt ist (Pardee, 1974).
Es gibt wenig molekulare Details über die Restriktionspunkt-Regulierung. In normalen Zellen ist das Fortschreiten durch den Restriktionspunkt sehr empfindlich gegenüber der Rate der Proteinsynthese (Rossow et al., 1979, Schneiderman et al., 1971; Brooks, 1977). Vor dem Restriktionspunkt (aber nicht danach) verursachen kleine und vorübergehende Verringerungen in der Proteinsynthese wesentlich längere Erhöhungen der Länge von G1 (Zetterberg & Larson, 1985). Die Entfernung von extrazellulären mitogenen Stimuli und die Inhibition der zellulären Proteinsynthese verhindern in der Tat angenommenermaßen das gleiche Zellzyklus-Ereignis (Pardee et al., 1981). Um für den disproportional großen Effekt auf die G1-Länge durch relativ geringe Änderungen in der Rate der Proteinsynthese verantwortlich zu sein, wurde vorgeschlagen, dass sich ein labiles Protein während der G1 akkumulieren muss, damit die Zelle den Restriktionspunkt überschreitet (übersichtsmäßig zusammengefasst in Pardee, 1989).
Es wirkt ansprechend, zu spekulieren, dass ein Cyclin dieser labile Regulator des Restriktionspunkts ist und dass die Bildung und/oder Aktivierung eines Cyclin/CDK-Komplexes ein geschwindigkeitsbeschränkendes Ereignis in der G1-Progression ist. Die periodische Akkumulierung von Cyclin E während des Zellzyklus zeigt, dass es ein relativ kurzlebiges Protein ist, und sein G1-Peak hinsichtlich der Häufigkeit kann konsistent mit einer Rolle am Restriktionspunkt sein. Des Weiteren legt die Verringerung der G1-Länge durch konstitutive Cyclin-E-Expression nahe, dass der Eintritt in die S-Phase durch die Häufgkeit des Cyclin E limitiert sein kann. Es ist jedoch wichtig, sich daran zu erinnern, dass nicht die gesamte G1 durch konstitutive Cyclin-E-Expression eliminiert wird. Am wahrscheinlichsten gibt es einige essentielle G1-Ereignisse, deren Dauer nicht von der Häufigkeit von Cyclin E beeinflusst wird. Bei spiele hierfür könnten Chromosomen-Dekondensation und Zellkernmembran-Zusammenbau einschließen. Fernerhin ist es berichtet worden, dass unter manchen Umständen der G1-Restriktionspunkt weniger als eine Stunde vor Beginn der S-Phase stattfindet (Wynford-Thomas et al., 1985), wohingegen in anderen Fällen der Restriktionspunkt viel früher in der G1 stattfinden kann (Pardee, 1974). Unsere Messungen zeigen, dass die maximalen Cyclin-E-assoziierten Kinasespiegel relativ spät in der G1 erreicht werden. Dies ist besonders offensichtlich in serumstimulierten Z eilen, in welchen ein großer Teil der G1 abgeschlossen ist, bevor die Cyclin-E-assoziierte Kinase nachgewiesen wird (A. K. und J. R., unveröffentlichte Beobachtungen). Andere Cycline, wie Cyclin D und Cyclin C, können ebenfalls während der G1 exprimiert werden (Matsushime et al., 1991; Motokura et al., 1991; Lew et al., 1991), und es ist möglich, dass die aufeinanderfolgende Bildung mehrerer Cyclin:CDK-Komplexe erforderlich ist, damit die Zelle G1 durchläuft. In diesem Fall könnte eine konstitutive Cyclin-E-Expression nur die späteren Stadien von G1 verkürzen.
In S. cerevisae können Faktoren, welche die Passage durch START regulieren, die CLN-Funktion anscheinend auf mehreren Ebenen beeinflussen bzw. bewirken (Change & Herskowitz, 1990; Cross und Tinkelenberg, 1991). In Analogie hierzu könnten wir erwarten, dass die G1-Cyclinfunktion in Säugerzellen von Proteinen reguliert wird, welche die Zellproliferation modulieren. Beispielsweise wäre es nicht überraschend, direkte Wechselwirkungen zwischen Cyclin E und Mitgliedern der Rb-Proteinfamilie zu beobachten (Bandara et al., 1991; Mudryj et al., 1991; Shirodkar et al., 1992; DeVoto et al., 1992). Des Weiteren könnte die Expression des Cyclin-E-Gens von einem oder mehreren onkogenen Transkriptionsfaktoren reguliert werden.
Beispiel 14
Wachstumsfaktor-Abhängigkeit von Zellen welche Cyclin E konstitutiv exprimieren
Der Zellteilungszyklus aller normalen höheren eukaryotischen Zellen wird durch spezifische extrazelluläre Wachstumsfaktoren gesteuert, welche für die Zellteilung erforderlich sind. Die Familien der bekannten Wachstumsfaktoren sind vielfältig und schließen solche Proteine, wie Insulin, PDGF, IGF, EGF, GM-CSF, G-CSF, TGF, Erythropoeitin und andere Stammzell-Faktoren, ein. Verschiedene Zelltypen zeigen jeweilige Wachstumsfaktor-Anforderungen, welche zum Teil durch die auf ihren Zelloberflächen exprimierten Wachstumsfaktor-Rezeptoren und von ihrem Differenzierungszustand bestimmt werden. Typischerweise erfordern Zellen in Gewebekultur exogene Wachstumsfaktoren in einem Tierserum (d. h. fötales Rinderserum), um zu wachsen; oder spezifische Wachstumsfaktoren müssen in einem chemisch definierten, serumfreien Medium zugesetzt werden. In Abwesenheit der erforderlichen Wachstumsfaktoren) hören die Zellen mit der Teilung auf und halten in der G1 an. Die in den obenstehenden Beispielen präsentierten Ergebnisse zeigten, dass der Spiegel an Cyclin E und/oder die Aktivität des Cyclin-E:Zellteilungskinase-Komplexes für den Transit von Zellen durch die G1 geschwindigkeitsbeschränkend sein können. Deshalb wurde es erwogen, dass die Zellproliferation durch Schritte reguliert sein könnte, welche Cyclin-Aktivierung erfordern (z. B. erhöhte Cyclin-Gen-Transkription oder -Translation; oder erhöhte Cyclin:Kinasekomplex-Aktivität), und dass Wachstumsfaktoren auf Zellen durch Aktivieren von Cyclinen wirken könnten. Unter der Annahme, dass die Cyclinaktivierung für die Proliferation erforderlich ist, wurden zwei Hypothesen betrachtet: eine unitäre Hypothese, in welcher eine Zelle bei einer jeweiligen Stufe der Differenzierung ein einzelnes Cyclin aufweist, welches von einem einzigen Wachstumsfaktor ausgelöst werden kann; und eine multiforme Hypothese, in welcher ein einziger Wachstumsfaktor mehrere Cycline aktiviert, und die vereinigte Wirkung aller Cycline in der Zelle erforderlich ist, um eine Zellproliferation auszulösen. Es wurde erwogen, dass, wenn die einfache Ursache-und-Wirkung-Logik der unitären Hypothese wahr wäre, das Modifizieren von Cyclin-E-Spiegeln in einer Zelle demnach die Wachstumsfaktor-Anforderungen der Zelle für eine Proliferation in vitro verändern könnte; wohingegen, wenn die multiforme Hypothese wahr wäre, jedwede Änderung in einem einzelnen Cyclin demnach durch die Wirkung all der anderen Cycline in der Zelle maskiert werden könnte. Um diese zwei Hypothesen zu testen, wurden Zellen mit den LXSN-Cyclin E-Vektorsequenzen transduziert.
Primäre Kulturen von humanen Fibroblasten und Ratten-Rat-1-Zellen wurden mit LXSN-Cyclin-E-Vektorpartikeln oder als Kontrolle mit LXSN (wie beschrieben in Beispiel 9) infiziert. Die transduzierten Zellen wurden hinsichtlich Expression von Cyclin E (wie oben stehend beschrieben) getestet, und es wurde festgestellt, dass mit LXSN-Cyclin E transduzierte Rat-1 und humane Fibroblasten 3- bis 5-fach höhere Spiegel an Cyclin-E-Protein exprimieren, als die Zellen, aus denen sie abgeleitet wurden (und 3- bis 5-mal mehr als Kontroll-LXSN-transduzierte Zellen). Die Wachstumsfaktorabhängigkeit von LXSN-Cyclin E-transduzierten humanen Zellen wurde durch Messen des Einbaus von tritiummarkiertem Thymidin in DNA in serumfreiem Medium (D-MEM) oder Medium, supplementiert mit 10 %, 1 %, 0,1 % oder 0,01 % (v/v) fötalem Rinderserum (Tabelle 2), bestimmt, und die Wachstumsfaktorabhängigkeit von Rat-1-Zellen wurde durch Messen des BrdU-Einbaus in 10 %, 1,0 % oder 0,1 % Serum bestimmt (18A – 18B). Im BrdU-Assay bauen lediglich Zellen, welche DNA synthetisieren (d.h. S-Phasen-Zellen), BrdU in DNA ein und erhalten eine positive Bewertung in dem Assay. Deshalb kann die Rate der Akkumulierung von BrdU-positiven Zellen als ein relatives Maß der Rate herangezogen werden, bei welcher Zellen vom Abschluss einer Mitose durch die G1-Phase und in die nächste Runde der DNA-Synthese (d.h. S-Phase) übergehen. Die in den 18A und 18B präsentierten Ergebnisse zeigen den Prozentgehalt der gesamten Zellkerne, welche in Kulturen von LXSN-transduzierten Kontroll-Rat-1-Zellen ("RAT1/LX", offene Kreise) und LXSN-Cyclin-E-transduzierten Zellen ("RAT1/Cyclin E", gefüllte Kreise) als Funktion der Zeit nach Freigeben des durch Nocodazol-Behandlung herbeigeführten mitotischen Arrests mit BrdU markiert wurden. Die Wachstumsfaktorabhängigkeit der Zellen wurde durch Kultivieren der Zellen in 10 % Rindskälberserum (18A) oder in 1 % oder 0,1 % Serum (18B) ausgewertet. Die Ergebnisse in den 18A und 18B zeigen, dass a) ungeachtet des Prozentsatzes an Serum im Kulturmedium die LXSN-Cyclin-E-transduzierten Zellen DNA-Synthese rascher initiierten als Kontrollzellen; und b) die LXSN-Cyclin-E-transduzierten Zellen eine erhöhte Beständigkeit gegenüber niedrigem Serum (d.h. 0,1 %) aufzeigten und die DNA-Synthese etwa 10 – 12 Stunden früher als die Kontrollzellen initiierten (18B).
In einer ähnlichen Weise zeigen die in Tabelle 2 präsentierten Ergebnisse, dass LXSN-Cyclin-E-transduzierte humane Fibroblasten und Rat-1-Zellen verringerte Wachstumsfaktor-Anforderungen für die Proliferation aufzeigen. In Kontrollzellen (d. h. LXSN-transduzierten Zellen) fuhren die Zellen, als das Serum von 10 % auf 0,1 % reduziert wurde, damit fort, zu proliferieren und Thymidin in DNA einzubauen, wenngleich mit einer verringerten Rate bei Spiegeln von 11 % von denjenigen, beobachtet in Gegenwart von Optimalspiegeln der Wachstumsfaktoren (d. h. 10 % Serum). Im Gegensatz dazu war das Wachstum von LXSN-Cyclin-E-transduzierten Zellen auf 19 % der Maximalspiegel (ersichtlich bei 10 % Serum) reduziert, aber dieser Spiegel war mehr als zweimal höher als der Spiegel, welcher in den Kontroll-LXSN-transduzierten Zellen beobachtet wurde. Wenn PDGF (10 ng/ml) zu Cyclin-E-transduzierten Zellen zugesetzt wurde, welche in 0,1 % Serum wuchsen, beliefen sich darüber hinaus die Spiegel der Proliferation auf 50 % des Maximalspiegels, der in Gegenwart von 10 % Serum auftrat (Tabelle 2). Wenn, im Gegensatz dazu, PDGF zu humanen Kontroll-Fibroblasten, welche in 0,1 % Serum wuchsen, zugesetzt wurde, wurde keine Stimulation des Thymidin-Einbaus beobachtet.
Tabelle 2 Wachstumsfaktorabhängigkeit von Vektor-transduzierten humanen Fibroblasten
(Die flusszytometrische Analyse bestätigte die fortwährende Präsenz von cyclierenden Zellen in LXSN-Cyclin-E-transduzierten Rat-1- und humanen Fibroblastenzellen in Gegenwart von 0,1 % Serum.) Die kombinierten Ergebnisse zeigen, dass die LXSN-Cyclin-E-transduzierten Rat-1-Zellen eine verringerte Wachstumsfaktorabhängigkeit für das Durchlaufen der G1-Phase des Zellzyklus besitzen.
Diese kombinierten Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass eine 3-5fache Überexpression eines einzelnen Cyclins, d. h. Cyclin-E, partiell (aber nicht vollständig) die Fähigkeit von Zellen, in Abwesenheit von Wachstumsfaktoren zu proliferieren, wiederherstellen kann, und vollständig die Proliferation in Gegenwart eines einzigen Wachstumsfaktors, PDGF, wiederherstellen kann. Somit neigen die Ergebnisse dazu, eine unitäre Hypothese zu begünstigen, in welcher ein Cyclin und ein Wachstumsfaktor das Wachstum einer Zelle bei einer jeweiligen Stufe der Differenzierung regulieren; allerdings wird diese Interpretation nicht von den quantitativen Aspekten der Daten unterstützt, d. h. die Überexpression machte die Zellen nicht vollständig wachstumsfaktor-unabhängig. Deswegen besteht auch die Möglichkeit, dass von Cyclin E verschiedene Cycline an der Stimulation der Zellproliferation in Gegenwart von PDGF teilnehmen. (Die Ergebnisse könnten somit interpretiert werden als unterstützend für ein multiformes Modell der Zellproliferation, worin die Aktivität mehrerer Cycline und Wachstumsfaktoren kombiniert wird, um die Zellproliferation zu fördern.)
Zusammenfassend können die Ergebnisse als unterstützend für entweder ein unitäres oder muliformes Modell der Zellproliferation interpretiert werden. Neben jeglichen Interpretationen sind die Ergebnisse bedeutsam zur Verdeutlichung, dass die genetische Manipulation eines einzelnen Cyclins in einer Zelle und die Behandlung mit einem einzigen Wachstumsfaktor ausreichend sind, um die für das Züchten der Zelle in vitro erforderlichen Bedingungen drastisch zu verändern. Aus den Ergebnissen wird augenscheinlich, dass mit der richtigen Kombination von G1-Cyclin-Expression in einer jeweiligen Zelle: a) eine Zelllinie hergestellt werden kann, deren Proliferation in großem Maße in Abwesenheit von exogenen Wachstumsfaktoren unbeschränkt ist; und b) eine Zelllinie hergestellt werden kann, deren Proliferation in großem Maße von einem oder mehreren ausgewählten Wachstumsfaktoren abhängig ist. Im Hinblick auf die potenzielle langfristige Bedeutung der vorliegenden Befunde kann es durchaus angemessen sein, sich zu erinnern, dass Sam Hanks fast 10 Jahre Forschungsarbeit brauchte, um 'Hank's Balanced'-Salzlösung (HBSS) zu entwickeln; weitere 3–5 Jahre für Eagle nötig waren, um "Eagle's Minimal Essential Medium" (MEM) zu entwickeln; und Rene Dulbecco noch länger brauchte, um eine D-MEM-Formulierung zu erzielen (Medien wie RPMI 1640 und M199, tragen noch eine Nummer, welche beschreibt, wie viele Formulierungen ihrer Entwicklung vorausgingen). Die hierin beschriebenen Feststellungen sind daher in hohem Maße bedeutend, um aufzuzeigen, dass eine einfach Manipulation eines einzelnen Proteins in einer Zelle ausreichend ist, um die Vermehrung der Zelle in vitro bei nahezu vollständiger Abwesenheit von Serumwachstumsfaktoren zu beschleunigen.
Materialien und Methoden
Plasmide und Bibliotheken:
Die humane cDNA-Bibliothek war eine Geschenk von J. Colicelli und M. Wigler. Sie wurde aus der humanen Glioblastom-Zelllinie U118 in dem Vektor pADNS hergestellt (Colicelli et al., 1988). Der in diesen Experimenten verwendete Teil der Bibliothek enthielt cDNA-Inserts, welche selektriert worden waren, um > 2kb zu sein. In den Experimenten, welche die Isolierung humaner CDC2-Homologe beinhalteten, wurde die Cyclin E-cDNA in den Vektor pMAC überführt. Dieser 2μ-basierende Vektor verwendet den ADH-Promotor, um die Expression der humanen cDNA zu lenken, und enthält den selektierbaren TRP1-Marker. Für die Expression von Cyclin E in E. coli wurde ein SmaI-PvuII-Fragment, enthaltend die gesamte Cyclin E-codierende Region, in die einmalige SmaI-Stelle im Vektor pGEX-3T (Amgen) kloniert. Für in vitro-Transkriptions-/Translations-Reaktionen wurde das SmaI-NotI-Fragment von Cyclin E in die MscI-Stelle im Vektor pCITE-1 (Novagen) kloniert. Für die in vitro-Translation der humanen Cycline A und B wurden cDNAs mit gentechnisch eingebrachten NcoI-Stellen am initiierenden Methionin freundlicherweise v on Jonathan Pines und Tony Hunter zur Verfügung gestellt. Der PCITE-Vektor wurde mit SaII gespalten, mit Klenow-Enzym glattendig gemacht und an der einmaligen NcoI-Stelle gespalten. Cyclin-cDNAs wurden durch Spaltung mit EcoRI (für Cyclin A) oder BamHI (für Cyclin B) isoliert, mit Klenow glattendig gemacht und dann mit NcoI gespalten. Der Xenopus-CDK2-Klon, pEMBLYe30/2 ist früher beschrieben worden (Paris et al., 1991). Für einige Assays in Hefe wurden die Cyclin-A-, -B- und -E-cDNAs in den Vektor pADANS subkloniert, welcher identisch zu pADNS ist, mit der Ausnahme, dass die ersten 10 Aminosäuren des ADH-Proteins an des exprimierte Protein fusioniert sind.
Antikörper:
Das Peptid YLDNQIKKM (SEQ. ID. Nr. 3), entsprechend dem C-Terminus von humanem CDC2, wurde chemisch synthetisiert und für eine Injektion in Kaninchen kovalent über den Tyrosinrest an BSA gekoppelt. Für die Affinitätsreinigung wurde Kaninchenserum mit 50 % Ammoniumsulfat präzipitiert, in 10 mM Natriumphosphat (pH 8,0) resuspendiert und gründlich mit 10 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,2 (PBS), dialysiert. Affinitätssäulen wurden durch Koppeln des Peptids an CNBr-aktivierte Sepharose unter Anwendung der von Pharmacia empfohlenen Bedingungen hergestellt. Das Dialysat wurde auf die in PBS äquilibrierte Affinitätssäule aufgetragen. Der Durchfluss wurde anschließend zweimal erneut aufgetragen. Die Säule wurde mit 10 Säulenvolumina PBS + 2 M KCl gewaschen, und anschließend wurde Protein mit 10 Säulenvolumina 5 M NaI + 1 mM Natriumthiosulfate (vor Verwendung frisch hergestellt) eluiert. Immunglobulin enthaltende Fraktionen wurden durch Extinktion bei 290 bestimmt, vereinigt und gründlich gegen PBS dialysiert. Das Peptid CEGVPSTAIREISLLKE (SEQ. ID. Nr. 4), entsprechend der konservierten "PSTAIRE"-Domäne der CDC2-Genfamilie, wurde chemisch synthetisiert und über den Cysteinrest an "Keyhole Limpet"-Hämocyanin (KLH) gekoppelt, und Antikörper wurden in Kaninchen hergestellt und affinitätsgereinigt, wie obenstehend beschrieben. Das Peptid YDEAEKEAQKKPAESQKIERE (SEQ. ID. Nr. 5), entsprechend den Resten 104–123 von humanem Cyclin A wurde chemisch synthetisiert und an BSA gekoppelt, und Antikörper wurden in Kaninchen hergestellt und affinitätsgereinigt, wie obenstehend beschrieben.
Gegen CDK2 gerichtete Antikörper wurden gegen ein Peptid herangezogen, entsprechend den 15 C-tenninalen Aminosäuren von humanem CDK2, gekoppelt an Keyhole-Limpet-Hämocyanin. Zwei andere Antiseren gegen die 9 C-terminalen Aminosäuren von humanem CDK2 wurden im Verlauf dieser Experimente ebenfalls verwendet (Elledge et al., 1992; Rosenblatt et al., 1992). Die polyklonalen Anti-Cyclin-E-Antiseren sind beschrieben worden (Koff et al., 1991).
Für die Herstellung von Cyclin E-Antikörpern wurden E. coli, enthaltend GEX-cycE (siehe nachstehend), zu einer OD₆₀₀ von 0,4 – 0,6 wachsen gelassen, und die Fusionsproteinexpression wurde mit 10 mM IPTG induziert. Nach 3 Stunden weiterem Wachstum bei 30°C wurden die E. coli pelletiert, einmal mit PBS und erneut mit GEX-Puffer A (60 mM Tris-HCl pH 8,0, 25 % Saccharose, 10 mM EDTA) gewaschen und bei –75°C aufbewahrt. Die Zellen wurden in 1/30 des Ursprungskulturvolumens in GEX-Puffer A resuspendiert, welcher 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 10 μg/ml Leupeptin, 100 μg/ml Sojabohnen-Typsininhibitor (SBTI), und 10 μg/ml N-Tosyl-L-phenylalaninchlormethylketon (TPCK) enthielt. In allen nachfolgenden Schritten wurden Proteaseinhibitoren verwendet. SDS wurde zu 0,03 % zugegeben, und Zellen wurden durch Schallbehandlung lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation hei 13.000 × g geklärt und zu einer 1:1-Aufschlämmung von Sepharose CL4B in GEX-Puffer C (0,02 M HEPES-KOH (pH 7,6), 100 mM KCl, 1,2 mM EDTA, 20 % Glycerol und 1 mM DTT) mit 0,03 % SDS zugegeben, eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert und die Sepharose wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt. Die geklärten Lysate wurden mit Glutathion-Agaroseperlen (SIGMA #G4510) (ungefähr 360 μg GEX-Cyclin E pro ml Glutathion-Agaroseperlen) 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Die Agaroseperlen wurden pelletiert und fünfmal mit 10 Volumina GEX-Puffer C mit 0,03 % SDS gewaschen, und das Cyclin-E-Fusionsprotein (GEX-E) eluierte mit Puffer C mit 0,03 % SDS plus 5 mM Glutathion. GEX-E erhaltende Fraktionen wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese und Coomassie-Blau-Färbung identifiert. 400 μg Gesamt-Gex-E-Protein in vollständigem Freund'schem Adjuvans wurden in Kaninchen injiziert; 320 μg wurden subkutan injiziert und 80 μg intramuskulär. Die Kaninchen wurden alle 3 Wochen mit einem identischen Dosierungsschema geboostert, außer dass unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet wurde. Blutentnahmen wurden 7 Tage nach der Injektion erhalten und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Immunpräzipitierung von Cyclin E, hergestellt in einem Kaninchen-Reticulocyten-Lysat (Promega), analysiert.
Die Spezifität des Cyclin E-Antiserums wurde durch Immunpräzipitation des in vitro translatierten Cyclin E, A und B demonstriert. In vitro translatierte Cycline wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Kurz gesagt, wurden Plasmide entweder mit NheI (Cyc-lin B/Cylin E) oder PstI (Cyclin A) linearisiert. Cyclin A wurde anschließend mit dem Klenow-Enzym vor der Transkriptionsreaktion glattendig gemacht. Die Transkription wurde unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase durchgeführt, und RNA wurde durch Ethanolfällung isoliert. Kaninchen-Reticulocyten-Lysate wurden mit der RNA programmiert und 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Das programmierte Lysat (5 μl) wurde mit 10 μl Cyclin-E-Antiseren in 500 μl 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM CaCl und 0,1 % NP-40 eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Protein A-Sepharose wurde zugegeben, und die Inkubation 1 Stunde lang fortgesetzt. Protein-A-Perlen wurden pelletiert und viermal mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT und 0,1 mg/ml BSA gewaschen. Die Immunpräzipitate wurden in Probenpuffer resuspendiert und auf 12%igen SDS-PAGE-Gelen laufen gelassen. Die Gele wurden fixiert und mit 1 M Natriumsalicylat vor dem Trocknen und der Autoradiographie verstärkt.
Cyclin-E-Antikörper wurden auf Säulen von GST-Cyclin-E-Fusionsprotein affinitätsgereinigt. Ungefähr 100 ml Kaninchenseren wurden mit 50 % Ammoniumsulfat präzipitiert. Das Präzipitat wurde bei 8000 × g gesammelt und in 10 mM Natriumphosphat, pH 8,0, resuspendiert und gegen PBS dialysiert. Das Dialysat wurde auf 10 % Glycerin eingestellt und über eine Glutathion-S-Transferase(GST)-Säule vorgeklärt. Durchflussfraktionen wurden gesammelt, und die Säule mittels Waschen mit 0,2 M Glycin pH 2,2 regeneriert. Die Säule wurde mit PBS erneut äquilibriert, und dieses Vorgehen wurde dreimal wiederholt.
Die geklärten Seren wurden anschließend auf eine GST-Cyclin-E-Säule aufgetragen. Im Anschluss an die Absorption wurde die Säule zuerst mit PBS und dann mit 2 M KCl-PBS gewaschen, und gebundener Antikörper wurde mit NaI-Natriumthiosulfat eluiert, wie beschrieben (Koff et al., 1991). Das Eluat wurde gegen Kopplungspuffer (0,1 M NaHCO₃ pH 8,3, 0,5 M NaCl) dialysiert und 5- bis 10-fach unter Verwendung von Centricon-10-Konzentratoren (A-micon) konzentiert.
DNA-Sequenzierung:
Verschachtelte bzw. "Nested" Deletionen der Cyclin E-cDNA wurden auf beiden Strängen unter Anwendung von Didesoxy-Ketten-Terminations-Verfahren sequenziert.
Kinase-Assays:
GEX-Cyclin-E (GEX-E) wurde wie beschrieben bis zum Waschen des an Glutathion-Agarose gebundenen GEX-E gereinigt. Für dieses Experiment wurden die Perlen dreimal mit 5 Volumina GEX-Puffer C mit 0,03 % SDS, fünfmal mit 10 Volumen Puffer C mit 0,5 % Triton X-100, fünfmal mit 10 Volumen Puffer D (30 mM HEPES-KOH pH 7,6, 7 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 1 mM DTT) gewaschen. 100 μl GT-Cyclin-E-Sepharoseperlen, p13-Sepharose (5 mg p13 pro ml Sepharose), GT-Sepharose oder Leerproben-Sepharose wurden mit 100 μg S-100-Extrakt aus humanen M ANCA-G1-Zellen ( Robert & D'Urso, 1988) unter Bedingungen inkubiert, welche für die in vitro-Replikation von SV40-DNA angewandt wurden (Puffer D plus 3 μg Kreatin-Phosphokinase, 40 mM Phosphokreatin, 0,25 mM dNTPs, 0,5 mM CTP, UTP und GTP, 3 mM ATP). Die Perlen wurden dann pelletiert und fünfmal in Kinasepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT) plus 0,1 mg/ml BSA gewaschen. Für Kinase-Assays wurden die Perlen in 50 μl Kinasepuffer plus 30 μM ATP, 5 μCi γ-³²P-ATP und 1 μg Histon H1 resuspendiert und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Produkte wurden durch SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie, analysiert.
Für die Untersuchung der an die SDS-GT-Cyclin-E-Sepharoseperlen gebundenen Kinase wurden die GT-Cyclin-E-Perlen und GT-Perlen hergestellt und mit G1-Extrakten inkubiert und gewaschen, wie beschrieben. Die Inkubation der Perlen bei 37°C während 30 Minuten in TNT (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween-20) und 5 mM Glutathion (reduzierte Form) war ausreichend, um die an die Perlen gebundenen Proteine durch Wechselwirkung mit Glutathion freizusetzen. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt und mit affinitätsgereinigten Antiseren, gerichtet gegen den C-Terminus von p34-cdc2, immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate (mit Protein-A-Sepharose) wurden dreimal in TNT gewaschen und in einem Histon-H1-Kinaseassay wie beschrieben eingesetzt.
Um die die Phosphorylierung des GT-Cyclin-E-Proteins durch die gebundene CDC2-Kinase zu zeigen, wurden GT-Cyclin-E-Perlen hergestellt und mit G1-Extrakten inkubiert und in einem Kinase-Assay verwendet, wie führer für Histon-H1 beschrieben; allerdings wurde Histon H1 nicht in den Assay eingeschlossen. Nach der Inkubation wird das Pellet mit H1-Kinasepuffer + 0,1 mg/ml BSA, dann mit 30 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 7 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 0,2 M NaCl und schließlich mit TNT gewaschen. Die Perlen wurden dann mit 1 ml TNT und 5 mM Glutathion (pH 7,5) bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert, um das GT-Cyclin-E-Fusionsprotein freizusetzen. Der Überstand wurde dann aufgefangen und mit Antiseren immunpräzipitiert, welche gegen Cyclin E gerichtet waren. Immunkomplexe wurden anschließend durch Adhäsion an Protein-A-Sepharose gesammelt. Die Immunpräzipitate wurde dreimal mit TNT gewaschen und die Produkte wurden auf 12%igen SDS-PAGE-Gelen, gefolgt von Autoradiographie, analysiert.
Für die Immunpräzipitation von Cyclin E aus HeLa-Zellextrakten wurden 2 × 10⁶ Zellen in 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 250 mM NaCl und 0,1 % NP-40 lysiert und mittels Ultrazentrifugation bei 100.000 × g 30 Minuten lang geklärt. Die Proben wurden unter Verwendung von Protein-A-Sepharose mit 15 μl normalen Kaninchenseren oder gegen das Cyclin-E-Fusions-Protein erzeugten Seren immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitate wurden mit Kinasepuffer und 0,1 mg/ml BSA gewaschen, und der Kinase-Assay wurde wie obenstehend beschrieben ausgeführt.
T-Peptid-Kinase-Assays wurden wie früher beschrieben durchgeführt (D'Urso et al., 1990).
Hefestämme:
Die verwendeten Hefestämme waren isogen mit dem Stamm YH110 (Richardson et al., 1989). Nicht-markierte Deletionen von CLN1, CLN2 und CLN3 wurden in diesem Stammhintergrund konstruiert. Diese Deletionen entfernten signifikante Abschnitte der Cyclin-Homologie in CLN1 und CLN2 (Hadwiger et al., 1989; Cross & Tinklenberg, 1991) und deletierten vollständig die CLN3-codierende Sequenz (Cross, 1990). Alle die Deletions-Allele waren Null-Allele bei den früher beschriebenen Assays (Richardson et al., 1989). Diese Deletions-Allele waren ungemarkert, anders als die ursprünglich beschriebenen cln-Disruptionen (Richardson et al., 1989), und waren deshalb mit den hier durchgeführten Plasmid-Transformationsexperimenten kompatibel. Der cln-defiziente Stamm wurde durch das früher beschriebene GAL-CLN3-Plasmid (Cross, 1990) lebendig gehalten. Das cdc28-13-Allel in diesem isogenen Stammhintergrund wurde von D. Lew bereitgestellt und wurde mit den drei cln-Deletionen mittels "Mating"- und Tetradenanalyse kombiniert.
Hefe-Transfektionen:
Transfektionen wurden unter Anwendung des Lithiumacetat-Vergehens gemäß des Verfahrens von Schiestl und Gietz (1989) durchgeführt. In Galactose herangezogene Hefezellen wurden mit 2 μg Bibliotheks-DNA in jedem von 50 unabhängigen Aliquots transfiziert. Transformanten wurden auf Galactose hinsichtlich Leucin-Prototrophie selektiert, und beliefen sich typischerwiese auf Zahlen von 1000–2000 je Platte. kolonien wurde 2, Tage lang wachsen gelassen und dann auf YEP-Glucose replikaplattiert. Kolonien, welche auf Glucose wuchsen, wurden auf FOA-Medium als Flicken übertragen bzw. gepatcht (Boeke et al., 1984), um Kolonien zu identifizieren, welche ohne das GAL-CLN3-Plasmid wachsen konnten. Plasmid-DNA wurde in E. coli durch Elektroporation aus Kolonien, welche diesen Screen überlebten, gerettet, und Minipreps wurden in 589-5-Stamm-Hefezellen retransfiziert, um die plasmidabhängige Komplementation der dreifachen cln-Deletion zu bestätigen. Für den Screen zur Identifizierung von humanen CDC2-Homologen wurden auf Glukose wachsende Kolonien hinsichtlich Cosegregation von Glukosewachstum und Beibehaltung der transfizierten Plasmide getestet.
Konstruktion von retroviralem Cyclin-E-Vektor
Der retrovirale Cyclin-E-Vektor (LXSN-Cyclin E) wurde durch Inserieren eines glattendigen HindIII-Fragments der humanen Cyclin-E-cDNA HU4 (Koff et al., 1991) (welche das gesamte offene Leseraster enthält) in die HpaI-Stelle von LXSN, einem murinen retrovirusbasierenden Vektor (Mill und Rosmann, 1989), in der Sinn-Orientierung konstruiert.
Zellen
MANCA-Zellen wurden bei 2–5 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI plus 10 % Kälberserum in einer Atmosphäre gehalten, welche 5 % CO₂ enthielt. Die Zellen wurden aus exponentiell wachsenden Populationen durch Zentrifugal-Elutriation fraktioniert (Marraccino et al., 1992). Für eine Synchronisation an der G1/S-Grenze wurden ungefähr 1 × 10⁸ G1-Zellen aus exponentiell wachsenden Populationen von MANCA-Zellen mittels Elutriation gesammelt und in RPMI, enthaltend 10 % Kälberserum und 5 μg/ml Aphidicolin, angeimpft und 8 Stunden lang wachsen gelassen. Eine flusszytometrische Messung des zellulären DNA-Gehalts wurde angewandt, um die Synchronität der Zellpopulation aufzuzeigen. In der G1 synchronisierte MANCA-Zellen wurden genau so hergestellt wie früher beschrieben (Marraccino et al., 1992).
Ratten-PC-12-Zellen wurden in DMEM, enthaltend 5 % fötales Kälberserum und 10 % Pferdeserum, in einer 10 % CO₂ enthaltenden Atmospäre, gehalten. Um neuronale Differenzierung zu induzieren, wurden konfluente Zellen 1 : 20 aufgeteilt, und am zweiten Tag wurde das Medium mit serumfreiem Medium ersetzt. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium 24 Stunden lang inkubiert, und dann wurde das Medium zu Vollmedium, enthaltend 50 ng/ml NGF, geändert. NGF wird alle zwei Tage zugesetzt, und die Zellen wurden nach 4 – 5 Tagen geerntet.
Ratten-208F-Zellen wurden in DMEM plus 10 % Kälberserum in einer 5 % CO₂ enthaltenden Atmosphäre gehalten. Um quieszente Zellen zu erzeugen, wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und anschließend in DMEM mit 0,1 % Kälberserum 48 Stunden lang wachsen gelassen.
Um die G1-Länge in Rat-1-Zellen zu messen, wurden die Zellen in der Pseudometaphase durch die Zugabe von Nocodazol bei 100 ng/ml während 4 Stunden synchronisiert. Die mitotischen Zellen wurden durch vorsichtiges Pipettieren abgesammelt. Die Zellen wurden dann mit DMEM gespült und bei 2 × 10⁴/35-mm-Schale mit DMEM plus 10 % Rinder-Kälberserum ausplattiert. Die Zellen wurden mit tritiummarkiertem Thymidin (80 Ci/mMol; 2 μCi/ml) 30 Minuten lang an jedem Zeitpunkt pulsmarkiert. Der Einbau von Thymidin in DNA wurde gemessen, wie beschrieben (Roberts & D'Urso, 1988).
Rat-1-Zellen, welche Cyclin E konstitutiv exprimierten, wurden hergestellt, wie beschrieben (Miller und Rosmann, 1989). Amphotrope PA317-Retrovirus-Verpackungszellen wurden bei 5 × 10⁵ Zellen pro 60-mm-Schale am Tag 1 ausplattiert. Am Tag 2 wurde 1 μg LXSN-Cyclin E, oder die Kontroll-DNA LXSN, unter Anwendung einer Abwandlung des Calciumphosphat-Vorgehens in die Zellen transfiziert (Ohtsubo et al., 1991). Am Tag 3 wurde das Kulturmedium m it frischem Medium ersetzt, und die ecotropischen PE501-Verpackungszellen wurden bei 10⁵ Zellen pro 60-mm-Schale ausplattiert. Am Tag 4 wurden die PE501-Zellen mit 4 ml frischem Medium, enthaltend Polybrene, gefüttert. Virus wurde aus den PA317-Zellen geerntet, und 5 μl bis 1 ml dieses Materials wurden verwendet, um PE501-Zellen zu infizieren. Am Tag 5 wurden die PE501-Zellen trypsinisiert und in 10-cm-Schalen in Medium ausplattiert, enthaltend 0,8 mg/ml G-418. Schalen mit kleinen Anzahlen an Kolonien wurden für die Isolierung einzelner Klone durch Verwendung von Klonierungs-Ringen verwendet. Diese klonalen Linien wurden dann durch Soutern-Blot-Analyse analysiert und hinsichtlich des Vektor-Titers getestet, und geeignete klonale Linien, enthaltend nicht-rearrangierte retrovirale Genome wurden als virus-produzierende Zelllinien vermehrt. Die LXSN- und LXSN-Cyclin E-Viren wurden verwendet, um Rat-1-Zellen zu infizieren, und G-418-resistente Zellpopulationen wurden für weitere Untersuchungen verwendet.
Herstellung von GST- und GST-E-Säulen
E. Coli, enthaltend die Plasmide pGEX-2T oder pGEX-2TcycE (GEN-Cyclin E), wurden zu einer OD₆₀₀ = 0,4 herangezogen und mit 0,4 mM IPTG 4 Stunden lang bei 30 °C induziert. Die Zellen wurden geerntet und einmal in PBS gewaschen und bei –70 °C aufbewahrt. Von pGEX-2T codiertes GST wurde hergestellt, wie früher beschrieben (Koff et al., 1991). Fusionsprotein GT-Cyclin E (GT-cycE), codiert von pGEX-2TcycE, wurde unter Anwendung einer Abwandlung des Verfahrens von Glotzer et al. (1991) hergestellt. Das Zellpellet aus einer 500-ml-Kultur wurde in 7 ml 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,1 M NaCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM DTT mit Proteaseinhibitoren sonifiziert. Der Extrakt wurde durch Zentrifugation bei 13000 × g geklärt, und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 7 ml TND-Puffer (0,2 M Tris-HCl, pH 8,2, 0,5 M NaCl, 5 mM DTT) resuspendiert und erneut pelletiert. Nach Verwerfen des Überstands wurde das Pellet in 8 M Harnstoff, enthaltend 5 mM DTT, resuspendiert und 4 Stunden lang vorsichtig bei 4 °C gemischt. Der resultierende Extrakt wurde 10 Minuten lang bei 13 000 × g geklärt, und der Überstand wurde gegen TN-Puffer dialysiert (d. h. TND-Puffer, enthaltend 1 mM DTT anstelle von 5 mM DTT).
Mindestens 2,5 mg entweder von GT oder GT-cycE wurden mit 1 ml Glutathion-Agaroseperlen 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert und anschließend bei 1 000 × g gesammelt und dreimal mit TN-Puffer, enthaltend 1 mM DTT, gewaschen. Die Kopplung des GT- oder GT-Fusions-Proteins an den Glutathion-Agarose-Träger wurde unter Anwendung des folgenden Protokolls durchgeführt. Der Träger wurde in eine Säule überführt und mit 0,1 M Boratpuffer, pH 8,0, gefolgt von 0,2 M Triethanolamin, pH 8,2, gewaschen. Dimethylpimelimidat (DMP)-Vernetzungsmittel (40 mM DMP, 0,2 M Triethanolamin, pH 8,2) wurde in die Säule einlaufen gelassen, wobei nur ein Meniskus zurückblieb. Die Kopplung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Nach der Kopplung wurde die Säule auf 4 °C gebracht und mit 40 mM Ethanolamin, pH 8,2, gefolgt von 0,1 M Boratpuffer, pH 8,0, gewaschen. Um ungekoppeltes Protein zu eluieren, wurde die Säule mit PBS, enthaltend 20 mM Gluthation, pH 7,5, gewaschen und anschließend in PBS mit 0,5 % Azid aufbewahrt.
H1-Kinase-Assay
8,3 × 10⁶ Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung in 100 μl H1-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,25 M NaCl, 0,5 % NP40), enthaltend Proteaseinhibitoren (1 mM PMSF, 20 μg/ml TPCK, 20 μg/ml SBTI, 10 μg/ml Leupeptin), lysiert. Schallbehandelte Lysate wurden bei 13 000 × g 10 Minuten lang bei 4°C geklärt, und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt und mit frischem H1-Lysepuffer zweifach verdünnt.
50 μl Extrakt wurde mit 2 μl polyklonalen Antiseren gegen Cyclin E oder den C-Terminus von p34-CDC2 eine Stunde lang immunpräzipitiert. Für Cyclin-Immunprezipitationen wurden Lysate mit 5 μl des monoklonalen C160-Antikörpers 30 Minuten lang inkubiert, und weitere 30 Minuten lang nach Zugeben von 2 μl Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper. Immunkomplexe wurden auf Protein-A-Sepharose gesammelt, zweimal mit Lyse-Puffer und viermal mit H1-Kinase-Puffer (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 7,5 mM MgCl₂, 1 mM DTT) gewaschen. H1-Kinase-Reaktionen wurden durchgeführt, wie früher beschrieben (Koff et al., 1991).
Herstellung von Lysaten für Immunpräzipitation-Western-Blot-Analyse
Zellen (8,3 × 10⁶/100 μl) wurden durch Schallbehandlung in SDS-RIPA (1 % Desoxycholat, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,3 M NaCl, 0,1 mM Orthovanadat, 50 mM NaF), enthaltend Protease-Inhibitoren, lysiert. In diesen Experimenten wurden ungefähr 1 mg affinitätsgereinigter Antikörper oder 1 ml Cyclin-E-Präimmun-Seren gemäß den Empfehlungen des Herstellers an 1 ml CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt. In den Experimenten unter Verwendung von an der G1/S-Grenze arretierten Zellen wurden Immunpräzipitationen mit affinitätsgereinigten Antikörpern, gekoppelt an CNBr-aktivierte Sepharose, unter Verwendung von 2,5 × 10⁷ Zellen und 100 μl Antikörper-verknüpfter Sepharose durchgeführt. Für Untersuchungen von Zellzyklus-Fraktionen, welche durch Zentrifugal-Elutriation erhalten worden waren, verwendeten wir 1 × 10⁷ Zellen mit 30 μl Anti-Cyclin-E-Sepharose.
Immunkomplexe wurden sich 3 Stunden lang bei 4°C bilden gelassen und wurden dann zweimal mit SDS-RIPA, enthaltend 5 mg/ml BSA, und dreimal mit SDS-RIPA gewaschen. Proben wurden in Laemmli-Probenpuffer suspendiert und auf 12%igen PAGE-Gelen aufgetrennt. Die Gele wurden mittels Halbtrocken-Elektroblotting auf Nitrozellulose überführt, und die Membranen wurden entweder mit 2 % Milch in TNT (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,05 % Tween-20) für CDC2 oder CDK2 oder mit 1 % Gelatine in TNT für Cyclin E geblockt. Die Blots wurden über Nacht bei Raumtemperatur entweder mit einer 1:300-Verdünnung von affinitätsgereinigtem Anti-CDC2 oder einer 1:1000-Verdünnung von Anti-CDK2-Serum oder einer 1:1 000-Verdünnung von affinitätsgereinigtem Cyclin-E-Antikörper sondiert. Gebundener Antikörper wurde anschließend mit ¹²⁵I-Protein A nachgewiesen.
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Während die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht und beschrieben worden ist, wird davon ausgegangen, dass verschiedene Änderungen daran vorgenommen werden können, ohne vom Sinn und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

Polynukleotid, welches zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an die gesamte Nukleotidsequenz, welche zwischen den Resten 1 und 1185 der, in 2 gezeigten, humanen Cyclin-E-cDNA-Sequenz liegt, oder an ihren komplementären Strang in der Lage ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein Polynukleotid von Anspruch 1 in funktionstüchtiger Verknüpfung an eine Steuerungssequenz.
Zelle, transfiziert oder transduziert mit einem rekombinanten Expressionsvektor von Anspruch 2.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, fähig zur Aktivierung einer Zellteilungskinase, welche die G1-Phase des Zellzyklus verkürzt, umfassend das Kultivieren von Zellen von Anspruch 3 zur Herstellung eines von dem Polynukleotid codierten Polypeptids.
Verfahren zur Verkürzung des Zellzyklus in einer Säugerzelle in vitro, umfassend das Transfizieren oder Transduzieren der Zelle mit einem rekombinanten Expressionsvektor von Anspruch 2.
Polypeptid, codiert durch ein Polynukleotid von Anspruch 1.
Immunologischer Bindungspartner, fähig zur spezifischen Bindung eines Polypeptids von Anspruch 6.
Assay zum Nachweis des Spiegels eines Cyclins E in einem biologischen Fluid in vitro, umfassend das Inkubieren eines immunologischen Bindungspartners von Anspruch 7 mit dem Fluid unter Bedingungen, geeignet zur Bildung eines Komplexes zwischen dem immunologischen Bindungspartner und Cyclin E, das Abrennen des Komplexes von dem freien Bindungspartner oder dem Fluid und das Nachweisen des Cyclin E oder des Bindungspartners in dem getrennten Komplex.
Assay zur Messung des Vorliegens bzw. der Häufigkeit von Cyclin-E:Zellteilungskinase-Komplexen in einem biologischen Fluid in vitro, umfassend das Inkubieren eines immunologischen Bindungspartners von Anspruch 7 mit dem Fluid unter für die Bildung eines Komplexes zwischen dem immunologischen Bindungspartner und den Cyclin-E:Zellteilungskinase-Komplexen geeigneten Bedingungen, das Abtrennen der Komplexe von dem Fluid und das Assayen der getrennten Komplexe zur Bestimmung der Menge des Cyclin E oder der Zellteilungskinase.
In-vitro-Verwendung eines Polynukleotids, welches zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an die Nukleotidsequenz, welche zwischen den Positionen 1 und 1185 der humanen Cyclin-E-cDNA, wie gezeigt in 2A, liegt, oder an ihren komplementären Strang in der Lage ist, als Antisinn-Polynukleotid zum Inhibieren der Expression von humanem Cyclin E.
Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 10, umfassend das Transfizieren oder Transduzieren einer Säugerzelle mit einem Antisinn-Polynukleotid, wie definiert in Anspruch 10, wobei die Länge des Zellzyklus der Zelle erhöht wird.
Transgene Hefezelle mit einem Genom, dem cln1, cln2 und cln3 fehlen, und aufweisend eine episomale CLN3-codierende Nukleotidsequenz und eine Säuger-Cyclin-Nukleinsäuresequenz in funktionstüchtiger Verknüpfung mit einem selektierbaren Marker und Kontrollelementen, wobei die Säuger-Cyclin-Nukleinsäuresequenz die Sequenz von Position 1 bis Position 1185 der in 2A gezeigten Cyclin-E-cDNA-Sequenz ist und in der Lage zur Verkürzung der G1-Phase des Zellzyklus ist.
Verfahren zur Klonierung eines Inhibitors eines Säuger-Cyclin-Nukleinsäuremoleküls, umfassend das Einbringen eines Kandidaten-Nukleinsäuremoleküls in die transebene Hefezelle von Anspruch 12 und das Screenen nach einer Wiederherstellung der Dauer der G1-Phase des Zellzyklus.
Hefestamm 1238-14C-cycE (ATCC Nr. 74099).
Verwendung eines isolierten Polynukleotids, welches zur Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an die Nukleotidsequenz, welche zwischen den Positionen 1 und 1185 einer humanen Cyclin-E-cDNA, wie gezeigt in 2A, liegt, oder an ihren komplementären Strang in der Lage ist, als Sonde für humanes Cyclin E.
Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 15, wobei das Polynukleotid ein Polypeptid mit Cyclin E-Aktivität dahingehend codiert, dass das Polypeptid in der Lage zur Bindung und Aktivierung einer Zellteilungskinase ist.
Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 16, wobei die Zellteilungskinase aus CDC2, CDC28, CDK2-XL, CDC2-HS und CDK2-HS gewählt wird.
Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 16, wobei das Cyclin-E-Polypeptid in der Lage zur Verkürzung der G1-Phase des eukaryotischen Zellzyklus ist.
Verwendung, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Polynukleotid ein Polypeptid codiert, fähig zur Bindung an einen Antikörper, der an ein Cyclin-E-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, wie gezeigt in Figur 2B/2C, bindet.
Verwendung, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei das Polynukleotid ein Antisinn-Polynukleotid ist.
Verwendung eines immunologischen Bindungspartners für Cyclin E mit einer Aminosäuresequenz von Figur 2A/2B oder Polypeptidfragmenten davon für den spezifischen in vitro-Nachweis von Cyclin E.
Verwendung wie beansprucht in Anspruch 21, wobei das Cyclin E oder ein Polypeptidfragment davon in der Lage zur Bindung und Aktivierung einer Zellteilungskinase ist.
Verwendung wie beansprucht in Anspruch 22, wobei die Zellteilungskinase aus CDC2, CDC28, CDK2-XL, CDC2-HS und CDK2-HS gewählt wird.
Verwendung, wie beansprucht in Anspruch 22, wobei das Cyclin-E-Polypeptid in der Lage zur Verkürzung der G1-Phase des eukaryotischen Zellzyklus ist.
Verwendung, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei der Spiegel an Cyclin-E-Polypeptid in einer isolierten Probe von biologischem Fluid nachgewiesen wird, wobei das Nachweisverfahren das Inkubieren des immunologischen Bindungspartners mit dem Fluid unter Bedingungen, geeignet zur Bildung eines Komplexes zwischen dem immunologischen Bindungspartner und dem Polypeptid, das Trennen des Komplexes von dem freien Bindungspartner oder dem Fluid und das Nachweisen des Polypeptids oder des Bindungspartners in dem abgetrennten Komplex umfasst.
Verwendung, wie beansprucht in mindestens einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Häufigkeitsvorkommen von Cyclin-E-Polypeptid:Zellteilungskinase-Komplexen in einer isolierten Probe eines biologischen Fluids gemessen wird, wobei das Messverfahren das Inkubieren des immunologischen Bindungspartners mit dem Fluid unter für die Bildung eines Komplexes zwischen dem immunologischen Bindungspartner und den Cyclin-E-Polypeptid:Zellteilungskinase-Komplexen geeigneten Bedingungen, das Abtrennen der Komplexe von dem Fluid und das Assayen der abgetrennten Komplexe zur Bestimmung der Menge des Polypeptids oder der Zellteilungskinase umfasst.