DE69734817T2

DE69734817T2 - Neuartige amp-aktivierte proteinkinase

Info

Publication number: DE69734817T2
Application number: DE69734817T
Authority: DE
Inventors: E. Bruce KEMP; I. David STAPLETON; I. Kenneth MITCHELHILL; A. Lee WITTERS
Original assignee: St Vincents Institute of Medical Research; Dartmouth College
Current assignee: St Vincents Institute of Medical Research; Dartmouth College
Priority date: 1996-01-08
Filing date: 1997-01-07
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2017-01-08
Also published as: ES2251015T3; AUPN745096A0; AU1693697A; JP2000503202A; CA2241786A1; EP0873354B1; WO1997025341A1; DE69734817D1; AU714905B2; EP0873354A4; JP4448201B2; CA2241786C; EP0873354A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die 5'-AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) wurde ursprünglich als Proteinkinase identifiziert, die HMG-CoA-Reduktase reguliert (Ferrer et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 132, 497–504). Anschließend wurde gezeigt, dass AMPK Leber-Acetyl-CoA-Carboxylase (Carling et al. (1987) (FEBS Lett. 223, 217–222) und adipöse, hormonempfindliche Lipase (Garton et al. (1989) Eur. J. Biochem. 179, 249–254) phosphoryliert. Es wird daher davon ausgegangen, dass AMPK eine Schlüsselregulatorrolle bei der Synthese von Fettsäuren und Cholesterin spielt.
Es wird angenommen, dass AMPK als metabolische, stressempfindliche Proteinkinase wirkt, die biosynthetische Wege ausschaltet, wenn zelluläre ATP-Gehalte entfernt werden, und wenn 5'-AMP als Reaktion auf einen Brennstoffmangel und/oder Sauerstoffmangel zunimmt (Corton et al. (1994) Current Biology 4, 315–324). Die partielle Aminosäuresequenzierung von Leber-AMPK (Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361–2364); Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343–29346) zeigte, dass diese aus 3 Untereinheiten, der katalytischen Untereinheit α (63 kDa) und zwei nichtkatalytischen Untereinheiten, β (40 kDa) und γ (38 kDa), besteht.
Die AMPK ist ein Mitglied der Hefe-SNF1-Proteinkinase-Unterfamilie, die Proteinkinasen, die in Pflanzen, Nematoden und Menschen vorhanden sind, umfasst. Die katalytische AMPK-Untereinheit α hat eine starke Sequenzidentität zur katalytischen Domäne der Hefeproteinkinase SNF1, welche an der Induktion der Invertase (SUC2) unter Bedingungen von Nahrungsstress aufgrund von Glucosemangel beteiligt ist (Celenza J. L. und Carlson, M. (1986) Science 233, 1175–1180). Sowohl snf1p als auch AMPK benötigen die Phosphorylierung durch eine aktivierte Proteinkinase für die vollständige Aktivität. Das Sequenzverhältnis zwischen snf1p und AMPK führte zu dem Ergebnis, dass diese Enzyme funktionelle Ähnlichkeiten gemeinsam haben, wobei beide die Hefe-Acetyl-CoA-Carboxylase (Woods et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 19509–19516; Witters L. A. und Watts, T. D. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 169, 369–376) phosphorylieren und inaktiveren. Die nichtkatalytischen β- und γ-Untereinheiten von AMPK sind auch mit Proteinen verwandt, die mit snf1p wechselwirken; die β-Untereinheit ist mit der SIP1/SIP2/GAL83-Familie der Transkriptionsregulatoren und die γ-Untereinheit mit SNF4 (auch CAT-3 genannt) verwandt (Yang et al. (1994) EMBO J. 13, 5878–5886).
Eine Isoform der katalytischen Untereinheit der Säugetier-AMPK wurde vorher kloniert (Carling et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11442–11448) und wird hier als AMPK-α₂ bezeichnet. Die Sequenz von AMPK ist in WO 94/28116 beschrieben. Die AMPK-α₂ ist nicht komplementär zur SNF1 in Hefe, was zeigt, dass der vollständige Funktionsbereich nicht identisch ist.
Eine neuartige Isoform der katalytischen Untereinheit von Säugetier-AMPK wurde nun identifiziert und wird hier als AMPK-α₁ bezeichnet. Darüber hinaus wurden cDNAs in ihrer vollständigen Länge für die Säugetier-AMPK-β- und AMPK-α-Untereinheiten, kloniert und Polypeptide, die dadurch kodiert wurden, wurden gereinigt.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Nukleinsäuresequenz, die Säugetier-AMPK-α₁ kodiert, zur Verfügung gestellt, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ.-ID.-NR.: 44 umfasst.
Weiterhin wird ein Vektor bereitgestellt, der die Nukleinsäuresequenz umfasst.
Eine Wirtszelle, die den Vektor umfasst, wird ebenfalls zur Verfügung gestellt.
In einer anderen Ausführungsform wird ein rekombinantes Polypeptid zur Verfügung gestellt, das durch die Nukleinsäuresequenz kodiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Säugetier-AMPK-α₁ zur Verfügung gestellt, das umfasst:

(a) Züchten der Zellen unter Bedingungen, die das Exprimieren der Nukleinsäuresequenz, die Säugetier-AMPK-α₁ kodieren, ermöglichen und
(b) Gewinnung von exprimierter AMPK-α₁ aus der Zelle.

Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Oligonukleotidsonde zur Verfügung gestellt, die mindestens 10 Nukleotide umfasst, wobei die Oligonukleotidsonde in der Lage ist, mit der Nukleinsäuresequenz SEQ.-ID.-NR: 67 zu hybridisieren, welche die Aminosäuren 352–366 von AMPK-α₁ kodiert, aber nicht mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die ein Säugetier-AMPK-α₁-Polypeptid kodiert, das durch die Nukleinsäuremoleküle mit den Sequenzen SEQ.-ID.-NR: 65 oder 66 kodiert wird.
Weiterhin wir ein gereinigtes Polypeptid oder dessen biologisch aktives Fragment, das von der Nukleinsäuresequenz kodiert wird, zur Verfügung gestellt, wobei das biologisch aktive Fragment nicht in der Säugetier-AMPK-α₂ enthalten ist, die von Nukleinsäuremolekülen mit den Sequenzen der SEQ.-ID.-Nr.: 65 oder 66 kodiert wird, und umfasst:

(a) mindestens einen Teil der SEQ.-ID.- NRn.: 1–12, 15–32, 35–38, 40 oder 43
(b) SEQ.-ID.-NRn.: 14, 34, 39, 41 oder 42
(c) Beibehalten der Fähigkeit, die Phosphorylierung von Proteinmolekülen zu stimulieren oder
(d) Beibehalten der Fähigkeit, die Bindung von natürlichem AMPK-α₁-Polypeptid an mindestens einen Antikörper oder an ein Substratmolekül nachzuahmen.

Demgemäss betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid, das Säugetier-AMPK-α₁ kodiert, oder eine Sequenz, die damit hybridisiert, mit der Maßgabe, dass die Sequenz nicht mit Säugetier-AMPK-α₂ hybridisiert, wie in Tabelle 1 (SEQ.-ID.-NR: 65) oder Tabelle 5 (SEQ.-ID.- NR.: 66) von WO 94/28116 definiert ist.
Es wird für Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein, dass die Oligonukleotidsonden gemäss der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Verfahren verwendet werden können. Diese umfassen die Analyse von Genregulatorelementen, die Analyse von Genexpression in vivo-, und die Identifizierung von homologen Säugetier- und Nichtsäugetier-cDNAs, einschließlich der damit verbundenen Kinase-Kinase.
Mit "biologisch aktives Fragment" wird ein Fragment bezeichnet, das mindestens eine Aktivität der nativen AMPK-α₁ beibehält, wobei die Aktivitäten (i) die Fähigkeit, die Phosphorylierung der Proteinmoleküle zu stimulieren, und (ii) die Fähigkeit, die Bindung von nativem AMPK-α₁ an mindestens einen Antikörper oder an ein Substratmolekül nachzuahmen, umfasst.
Es wird für die Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich sein, dass eine Anzahl von Modifikationen an den Polypeptiden und Fragmenten der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne die biologische Aktivität der Polypeptide oder Fragmente nachteilig zu beeinflussen. Dies kann durch verschiedene Veränderungen, wie beispielsweise Sulfatieren, Phosphorylieren, Nitrieren und Halogenieren oder durch Aminosäureinsertionen, -deletionen und -substitutionen entweder konservativ oder nicht-konservativ (beispielsweise D-Aminosäuren, Desaminosäuren) in den Peptidsequenzen erreicht werden, in denen solche Veränderungen die gesamte biologische Aktivität der Peptide nicht wesentlich verändern. Bei den konservativen Substitutionen sind die beabsichtigten Kombinationen: G, A; V, I, L, M; D, E; N, Q; S, T; K, R, H; F, Y, W, H; und P, Nα-Alkylaminosäuren.
Es ist auch möglich, verschiedene Gruppen zu den Polypeptiden oder Fragmenten der vorliegenden Erfindung hinzuzufügen, um Vorteile, wie beispielsweise erhöhte Wirksamkeit der verlängerten Halbwertszeit in vivo zu verleihen, ohne die gesamte biologische Aktivität der Peptide wesentlich zu verändern.
Das Säugetier-AMPK-α₁-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Wirkungen dieser Kinase regulieren. Solche Verbindungen sind wünschenswert, da sie beispielsweise verwendet werden können, um die Biosynthese von Cholesterin und Fettsäuren zu reduzieren. Sie können auch verwendet werden, um deren Freisetzung aus intrazellulären Vorräten durch HSL zu inhibieren. Darüber hinaus können sie verwendet werden, um die zellulären Malonyl-CoA-Gehalte zu reduzieren und die β-Oxidation von Fettsäuren durch die Mitochondrien zu fördern.
Diese Verbindungen können auf Säugetier-AMPK-α₁-Antagonisten oder -Agonistenaktivität gescreent werden, indem die Säugetier-AMPK-α₁ der vorliegenden Erfindung den Verbindungen ausgesetzt und die Aktivität der Säugetier-AMPK-α₁ bewertet wird. Geeignete Screening-Verfahren zur Identifizierung der Verbindungen, die die Aktivität der Säugetier-AMPK-α₁ regulieren, umfassen jedes herkömmliche Assay-System zur Bestimmung solcher Effekte.
Darüber hinaus können Verbindungen auf die Fähigkeit gescreent werden, das Exprimieren von Säugetier-AMPK-α₁ in einer Zelle zu regulieren, indem die Zellen, die mit dem Polynukleotid SEQ.-ID.-NR: 44 transformiert wird, der Verbindung ausgesetzt wird, und den Expressionsgehalt des Polynukleotids zu bestimmen.
Geeignete Screening-Verfahren zur Identifizierung der Verbindungen, die die Expression von Säugetier-AMPK-α₁ regulieren, umfassen diejenigen, die den Nachweis und/oder die Bestimmung der Menge an Säugetier-AMPK-α₁ oder der Messenger-RNA, die Säugetier-AMPK-α₁ kodiert, oder ein Protein in Gegenwart der relevanten Testverbindungen beinhalten.
Wie oben gezeigt, werden die Verbindungen, welche die Aktivität von Säugetier-AMPK-α₁ regulieren als wirksam betrachtet bei der Verwendung zur Behandlung beispielsweise von erhöhtem Cholesteringehalt, Hyperlipämie, Fettsucht, klinischen Syndromen mit Hypoxie oder Ischämie (beispielsweise Herzinfarkt, Schlaganfall), Essstörungen und Diabetes mellitus).
Es wurden cDNAs mit vollständiger Länge in Säugetier-AMPK-β und -AMPK-γ-Einheiten kloniert. Diese Klone wurden verwendet, um die Gewebeverteilung der Untereinheit-mRNA zu charakterisieren und das Untereinheitsprotein sowohl in bakteriellen als auch Säugetierzellen zu exprimieren. Die Identifikation ihrer vollständigen Sequenzen hat zur Identifizierung der Proteinfamilien für jede dieser nichtkatalytischen Untereinheiten geführt.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Hinblick auf die folgende genaue Beschreibung erläutert. In diesem Zusammenhang betrifft die vorliegende Erfindung nur den Gegenstand, der von den Ansprüchen umfasst wird.
Säugetier-AMPK, die aus Ratten- und Schweineleber isoliert wurde, enthält drei Polypeptiduntereinheiten, die als AMPK-α, AMPK-β und AMPK-γ bezeichnet werden. Die α-Untereinheit enthält die katalytische Kinase-Domänesequenz und ist gegenüber einigen Mitgliedern der SNF1-Kinasefamilie hoch homolog. Mehrfache Isoformen der α-Untereinheit wurden nun identifiziert, wobei α₁ für etwa 90% der AMPK-Aktivität, die in Leberextrakten nachgewiesen wurde, verantwortlich ist. Darüber hinaus wurde nun festgestellt, das AMPK-β- und AMPK-γ-Untereinheiten mit voller Länge genauso zu zwei Klassen von Proteinen in S. cerevisiae homolog sind. Dies erweitert die Information, die früher aus eingeschränkten Peptidsequenzanalysen und aus kleineren cDNAs, die von PCR abstammen, verfügbar waren (Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343–29346). Weiterhin wurde durch cDNA-Klonieren und direktes Peptidsequenzieren gezeigt, welche Isoformen der AMPK-β- und AMPK-γ-Untereinheiten mit der katalytischen α₁-Untereinheit in der Leber wechselwirken. Somit wurde nun festgestellt, dass diese nicht-katalytischen Untereinheiten, ebenso wie die α-Untereinheit-Isoformen, eine breitere Gewebeverteilung aufweisen, was durch den mRNA-Gehalt verschiedener Rattengewebe nachgewiesen wurde, als aus der AMPK-Aktivitätsverteilung erwartet wurde, über die früher von Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73–82 und Davies et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 123–128, berichtet wurde, erwartet wurde.
Eine Isoform der katalytischen Säugetier-AMPK-Untereinheit wurde identifiziert und wird hier als AMPK-α₁ bezeichnet. Die α₁- (548 Reste) und α₂-(552 Reste) Isoformen von AMPK weisen im katalytischen Kern 90% Aminosäuresequenzidentität und nur 61% an anderen Stellen auf. Die Hauptunterschiede in den α₁- und α₂-Sequenzen treten in ihren COOH-endständigen Enden auf, was zu der Annahme führt, dass sie mit verschiedenen Proteinen in dieser Region wechselwirken.
Es wurde nun festgestellt, dass die α₂-8,5 kb mRNA am häufigsten in den Skelettmuskeln und mit niedrigeren Gehalten in Leber, Herz und Nieren vorhanden ist. Im Gegensatz dazu wurden sehr niedrige Gehalte an α₁-6 kb mRNA in allen Geweben, außer den Hoden gefunden, in denen ein niedriger Gehalt einer uncharakterisierten 2,4 kb-mRNA beobachtet wurde. Die niedrigen Gehalte an α₁-mRNA erklären, warum die α₁-Isoform schwieriger zu klonieren war als die α₂-Isoform. Die α₁-Isoform der katalytischen AMPK-Untereinheit macht fast 94% oder mehr der SAMS-Peptid-Phosphotransferaseaktivität der Rattenleber aus, und ist daher die vorherrschende exprimierte, aktive hepatische Isoform.
Eine Reihe von synthetischen Peptiden, einschließlich Analogen der Proteine, von denen nicht bekannt ist, dass sie Substrate für die AMPK sind, wurden mit partiell gereinigten Enzymen (gereinigt am DE-52-Schritt) gescreent. Diese umfassen die Myosin-Leichtketten, ADR1, Glycogensynthase und Phospholemman. Die getesteten Phospholemmanpeptide sind schlechte Substrate und wurden nicht weiter untersucht. Das Glycogensynthasepeptid PLSRTLSVAAKK (SEQ.-ID.-NR.: 46) wurde in AMP-abhängiger Weise bei etwa 40% der Rate des SAMS-Peptids phosphoryliert, wobei jedoch dieses Peptid ein hervorragendes Substrat für eine Anzahl von Proteinkinasen, einschließlich Proteinkinase C und Calmodulin-abhängiger Proteinkinase II ist (Kemp, B. E. und Pearson, R. B. (1991) in Protein Phosphory-lation, Hunter, T. und Sefton, B. M. (Herausg.) Methods in Enzymology, 200, 121–134). Die getesteten Myosin-Leichtkettenpeptide wurden mit Raten von etwa 15% des SAMS-Peptids phosphoryliert. Es wurde festgestellt, dass die ADR1-Peptide ADR1(225–234) und ADR1(222–234)^P229 mit Raten von etwa 50% des SAMS-Peptids phosphoryliert wurden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass das ADR1(222–234)^P229-Peptid mit einer offensichtlichen Km von etwa 3 μM im Vergleich zu 33 μM beim SAMS-Peptid phosphoryliert wird.
Im Hinblick auf die niedrige Km des ADR1(222-234)^p229-Peptids als Substrat für die AMPK wurde die Affinitätsreinigung des Enzyms mit diesem Peptid versucht. Zunächst wurde das Peptid an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt. Obgleich die peptidgebundene Sepharose die AMPK-haltigen Fraktionen band, konnte das Enzym nicht differentiell von kontaminierenden Proteinen mit Salzgradienten eluiert werden. Wenn im Gegensatz dazu das ADR1(222–234)^P229-Peptid an die Pharmacia HiTrap-Säule gekoppelt wurde, wurde die AMPK sehr fest gebunden und benötigte 2 M NaCl plus 30% Ethylenglycol, um eluiert zu werden. Da das Enzym so fest an diese Substrataffinitätsäule gebunden war, ist es möglich, das Enzym in Puffer mit 0,5 M NaCl zu beladen. Die erhaltene gereinigte AMPK bestand aus einer katalytischen 63 kDa-Untereinheit sowie 40 kDa- und 38 kDa-Untereinheiten, die mit sip2 bzw. snf4 im Zusammenhang stehen. In einigen Präparaten war die AMPK mit Material mit hoher Molmasse assoziiert, das nichtmuskulärem Myosin entspricht, was durch tryptische Peptidsquenzierung nachgewiesen wurde. Eine sichtbare Reinigung bis zu 38000 mit einer Ausbeute von 15% und einer Gewinnung von 90 μg Enzym wurde erzielt. Die mehrfache Reinigung kann aufgrund des Vorliegens uncharakterisierten Inhibitormaterials in den frühen Fraktionen eine Überschätzung sein. Das Enzym war auf SDS-PAGE bis zum Endschritt der Reinigung nicht sichtbar. Die Anziehungskraft des Enzyms für das Peptid, das an Pharmacia Hitrap-Harz gebunden war, war größer als es vom freien Peptid, das an das Enzym (Km 3 μM) gebunden wird, erwartet werden könnte. Da das Peptid, das an Sepharose gebunden ist, das Enzym nicht so fest bindet, erscheint es vernünftig, dass die stärkere Bindung größtenteils an dem Aminohexansäurelinker zwischen dem Peptid und dem Harz liegt. Im Falle der cAMP-unabhängigen Proteinkinase befindet sich eine hydrophobe Tasche zwischen den D- und G-Helices, die verantwortlich ist für die hohe Affinitätsbindung des Peptidinhibitors PKI. Das ADR1(222–234)P229-Peptid, LKKLTLRASFSAQ (SEQ.-ID.-NR.: 47) durch die Aminreste an seinem N-Ende oder Lys-Reste gebunden ist, ist es möglich, dass die hydrophobe Linkergruppe zufälligerweise neben einer hydrophoben Tasche an der AMPK liegt.
Im Verlauf der Sequenzierung der Schweine-AMPK wurde festgestellt, dass die Aminosäuresequenz einiger Peptide, die von der AMPK-α-Untereinheit der Schweineleber abstammen, nicht denjenigen entsprachen, die aus der cDNA-Sequenz der Rattenleber abstammen (Carting et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11442–11448; Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73–82). Deshalb wurde die katalytische AMPK-Untereinheit der Rattenleber α gereinigt, und Peptide, die 40% des Proteins (Reste 222/548, SEQ.-ID.-NRn.: 27–43) ausmachen, sequenziert. Acht der 16 Peptide enthielten Reste, die mit der veröffentlichten AMPK-cDNA-Sequenz nicht übereinstimmten, wobei sie aber mit der Sequenz des Schweineleberenzyms (SEQ.-ID.-NRn.: 13–26) übereinstimmten. Unter Verwendung von RT-PCR- und cDNA-Genbank-Screening wurde eine cDNA-Sequenz des Rattenhypothalamusenzyms erhalten, die die gesamten Peptidsequenzen der gereinigten katalytischen AMPK-Untereinheit der Rattenleber ausmacht, die Fehlanpassungen enthielten. Die cDNA-Sequenz dieser katalytischen AMPK-Untereinheit wurde α₁ genannt, da diese dem gereinigten Enzym entspricht und eindeutig aus einem anderen Gen abstammt, als die vorher klonierte α-Sequenz (hier als α₂ bezeichnet). Die α-Isoform der katalytischen AMPK-Untereinheit macht fast 94% oder mehr der SAMS-Peptid-Phosphotransferaseaktivität der Rattenleber aus und ist deshalb die hauptsächlich exprimierte aktive hepatische Isoform. Obgleich mehrere Präparate der katalytischen AMPK-Untereinheit sowohl aus der Schweine- als auch aus der Rattenleber (SEQ.-ID.-NRn: 13–26 bzw. 27–43) sequenziert wurde, wurden keine Peptide erhalten, die der α₂-Isoform-Sequenz entsprechen.
In den katalytischen Kernen der α₁- und α₂-Isoformen sind 90% Aminosäureidentität vorhanden, wobei aber außerhalb des katalytischen Kerns nur 61% Identität vorhanden sind. Die starke Homologie zwischen den α₁- und α₂-Sequenzen in der Nähe der Substratbindungsfurche, hergeleitet aus der Kristallstruktur der Proteinkinase für die Positionen P₅ bis P₊₅, legen nahe, dass die spezifischen Substrateigenschaften verwandt sind. Die Substratverankerungsschleife (auch als Lippen- oder Aktivierungsschleife bezeichnet) enthält ein Insert FL¹⁷⁰ für α₁, α₂ und snf1p, das eine hydrophobe Verankerung für einen hydrophoben P₊₃- oder P₊₄-Rest im Peptidsubstrat zur Verfügung stellen kann. Es sind auch E¹⁰⁰ (E¹²⁷ in der cAMP-abhängigen Proteinkinase) und D¹⁰³ für eine P_–3-basische Restspezifitätsdeterminante sowohl für das α₁, α₂ und snf1p verfügbar. Beide Isoformen enthalten in der cAMP-abhängigen Proteinkinase einen Thr-172-Rest, der dem Thr-197 äquivalent ist, und der wahrscheinlich phosphoryliert wird und für eine optimale Aktivität erforderlich ist. Da die Hauptunterschiede in den α₁- und α₂-Sequenzen an ihren COOH-terminalen Enden auftreten, können sie mit verschiedenen Proteinen innerhalb dieser Region wechselwirken.
Eine Northern Blot-Analyse der β- und γ-Untereinheiten zeigte ein komplexes Expressionsmuster. Bei ähnlichen Gehalten über einen Bereich von Geweben, außer dem Gehirn, war die mRNA der β-Untereinheit am wenigsten häufig, während die mRNA der γ-Untereinheit in Herz, Lunge, Skelettmuskeln, Leber und Niere häufig vorkam. Ein früherer Bericht über die Gewebeverteilung der AMPK-Aktivität hatte behauptet, dass es vorwiegend ein Leberenzym ist (Davis et al. (1989) Eur. J. Biochem., 186, 123–128). Im Hinblick auf die mRNA-Verteilung der α₁- und β-Untereinheit wurde die Gewebeverteilung der AMPK-Aktivität erneut bestimmt. Die Niere enthielt die höchste spezifische Aktivität bei vergleichbaren Werten in der Leber, in der Lunge und im Herzen und wenig Aktivität im Skelettmuskel, falls überhaupt. Es wird deutlich, dass die AMPK-Aktivität eine breitere Gewebeverteilung als vorher angenommen hat, und gut vergleichbar mit der Verteilung von α₁-mRNA und nicht mit der von α₂-mRNA ist. Unter Verwendung von peptidspezifischen Antiseren gegen α₁ (Reste 339–358) und α₂ (Reste 352–366) wurde festgestellt, dass die α₂-Immunreaktivität im Herzen, in der Leber und im Skelettmuskel vorherrschend war, wo es auch die höchsten Konzentrationen an α₂-mRNA gibt. Im Gegensatz dazu ist die α₁-Immunreaktivität weit verteilt, wie auch die weniger häufige α₁-mRNA. Der Antikörper gegen α₂ erkannte auch eine Nebenkomponente im gereinigten α₁-Präparat, aber es wurden keine ausreichenden Mengen davon erhalten, um zu bestimmen, ob es eine schwache Kreuzreaktivität mit einer Form von α₁, einer zusätzlichen Isoform des AMPK, oder einer geringen Verunreinigung des α₁-Präparats durch die α₂-Isoform darstellt. Der Antikörper gegen α₂ gibt keine Immunfällung mit der α₁-Aktivität aus affinitätsgereinigtem α₁-AMPK. Sowohl α₁ als auch α₂ wandern auf SDS-PAGE bei ungefähr 63 kDa. Es wurde auch festgestellt, dass die Leber-α₂-Immunreaktivität nicht von der Peptidsubstrat-Affinitätssäule gebunden wurde. Diese Säule bindet spezifisch die α₁-Isoform. Unter Verwendung von Immunfällung der ablaufenden Flüssigkeit aus der Peptidsubstrat-Affinitätssäule mit α₂-spezifischem Antikörper wurde festgestellt, dass das α₂-Isoenzym β- und γ-Untereinheiten enthielt und die Phosphorylierung des SAMS-Peptids katalysierte. Immunniederschläge von α₁ und α₂ zeigten unterschiedliche Aktivierung durch 5'-AMP im Bereich des 2–3-fachen bzw. 3–4-fachen. Es gibt auch eine Bande bei ungefähr 60 kDa, die durch den α₁-spezifischen Antikörper in Gewebeextrakten aus Herz und Lunge erkannt wird. Diese Bande ist im gereinigten Leberenzym nicht vorhanden, und ihre Beziehung zur α₁-Isoform ist noch unbekannt.
Der Anteil der SAMS-Peptid-Phosphotransferaseaktivität, die an die Peptidaffinitätssäule gebunden war, variierte bei einem einzelnen Durchgang (im Bereich von 90–92%, n = 7 und 74–86%, n = 6, Rattenleberpräparate). Bei erneutem Durchlaufen wurden etwa 94% der Aktivität an die Säule gebunden. Die restliche Aktivität konnte aufgrund der Immunfällung mit dem α₂-spezifischen Antikörper der α₂-Isoformaktivität zugeordnet werden. Die Menge an immungefälltem Protein, basierend auf Coomassie-Blau-Färbung, zeigte, dass erheblich mehr α₂-Protein vorhanden war, als aus nur 6% der Gesamt-SAMS-Peptidaktivität erwartet wurde. Die offensichtliche spezifische Aktivität der isolierten Rattenleber-AMPK-α₂-Isoform sowohl mit dem SAMS-Peptid als auch Acetyl-CoA-Carboxylase als Substrat war mehr als 20-fach niedriger als bei der AMPK-α₁-Isoform. Diese Abschätzung beruht auf Messungen unter Verwendung der α₂-angereicherten Fraktion (α₁-abgereichert) und Quantifizierung durch Immunblotting im Vergleich zu bakteriell exprimiertem α₂.
Die spezifische Aktivität der gereinigten α₂-Isoform in Abwesenheit von gebundenem Antikörper ist noch nicht bekannt. Auf der Grundlage der α₂-cDNA-Sequenz berichteten Carling et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 11442–11448, dass mit einem peptidspezifischen Antikörper praktisch die gesamte partiell gereinigte AMPK-Aktivität aus der Leber immungefällt wurde. Das in diesen Experimenten verwendete Peptid, PGLKPHPERMPPLI (SEQ.-ID.-NR.: 48), enthält 8/15 Reste, die zwischen α₁ und α₂ identisch (unterstrichen) sind, so dass es logisch erscheint, dass ihre polyklonalen Antiseren beide Isoformen erkennen können. Diese Experimente machen deutlich, dass es eine Isoenzymfamilie von AMPK-α-katalytischen Untereinheiten gibt, wodurch die Komplexität der Aktivitätsanalyse erhöht wird. Dies wirft auch die Frage auf, welche Funktion die α₂-Isoform hat, und ob α₂ mit einer spezifischen Teilmenge von β- und γ-Untereinheiten assoziiert. Eine signifikante Fraktion der α₂-Isoform-mRNA hat eine 142 bp-out-of-frame-Deletion in ihrer katalytischen Domäne, die ein abgeschnittenes, nicht-funktionelles Protein kodieren würde (Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73–82; Verhoeven et al. (1995) Eur. J. Biochem. 228, 236–243). Die enge Sequenzbeziehung zwischen den α₁-Isoformen aus Schweinen, Ratten und Menschen bedeutet, dass es eine starke Konservierung zwischen den Spezies untereinander gibt. Früher war berichtet worden, dass menschliche Leber keine AMPK-mRNA enthält (Aguan et al. (1994) Gene 149, 345–350). Jetzt ist jedoch klar, dass α₂-mRNA analysiert worden war und nicht die dominante α₁-Isoform-mRNA. Das Gen, von dem berichtet wurde, dass es auf Chromosom 1 die katalytische AMPK-Untereinheit der menschlichen Leber kodiert, ist somit das Gen für die α₂-Isoform, während das Gen für die α₁-Isoform auf dem Chromosom 5 lokalisiert ist. Die Gene der AMPK-Untereinheit wurden nun vorwiegend auf den folgenden Chromosomstellen lokalisiert: α₁, 5p12; β, 5q24.1; und γ, 12q13.1.
Eine kürzlich durchgeführte Genomsequenzierung zeigte multiple Isoformen der nicht-katalytischen γ- und β-Untereinheiten von AMPK. Offensichtlich gibt es mindestens drei Isoformen der γ-Untereinheit im Gehirn, wo γ₂ und γ₃ vorliegen, die sich von der Rattenleber γ₁-Isoform unterscheiden. Das menschliche Gehirn enthält auch multiple β-Untereinheits-Isoformen, die sich von der Rattenleber-β1-Isoform unterscheiden. Die Zugangsnummern für die mutmaßlichen AMPK-β- und -γ-Untereinheits-Isoformen sind γ₂, M78939; γ₃, R52308; β₂, R20494 und β₃, R14746. Somit ist offenbar eine potentiell große Unterfamilie von heterotrimeren AMPK's, basierend auf verschiedenen Kombinationen aller drei AMPK-Untereinheiten, vorhanden.
Die strukturellen Beziehungen zwischen der AMPK und SNF1-Kinase, sowie auch das Vorliegen multipler Isoformen, lenkt die Aufmerksamkeit auf mögliche Fragen hinsichtlich der diversen physiologischen Funktionen dieser neuen Unterfamilie der Proteinkinasen. Während die AMPK den Lipidmetabolismus in Hepatozyten unter Bedingungen von metabolischem Stress reguliert, ist ihre Rolle in anderen Geweben, einschließlich Herz und Niere, unbekannt. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass die AMPK bei Herz-Ischämie aktiviert wird, und dass die Aktivierung während der Reperfusion fortdauert, was möglicherweise zur ischämieverursachten Entkopplung von Metabolismus und mechanischer Herzfunktion beiträgt (Kudo et al. (1995) J. Biol. Chem. 270, 17513–17520).
Die Regulierung der Herz-Acetyl-CoA-Carboxylase durch AMPK spielt eine wichtige Rolle beim Schalten des Herzmetabolismus zwischen der Verwendung von Glucose und Fettsäuren als oxidativem Brennstoff. In der β-Zelle des Pankreas, wo AMPK-Untereinheiten in Inselzellen stark exprimiert werden, reguliert die Verfügbarkeit von Glucose rasch die Acetyl-CoA-Carboxylase durch Änderungen der auf AMPK gerichteten Phosphorylierung, was eine wesentliche Rolle von AMPK bei der Stimulus-Sekretionskopplung zur Insulinfreisetzung nahelegt. Zusätzlich zu diesen Stoffwechselfunktionen spielen Mitglieder der SNF1-Proteinkinase-Unterfamilie offenbar wichtige Rollen bei der Entwicklung, wobei das par-1-Gen von C. elegans eine entscheidende Rolle bei der Embryogenese spielt.
PCR-Verstärkung von Schweine- und Rattenleber-cDNA mit degenerierten Oligonukleotiden, die ausgewählten AMPK-Peptidsequenzen entsprechen, lieferte zwei hauptsächliche PCR-Produkte (Stapleton et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343–29346). Ein Produkt, eine 309 bp-Teillängen-cDNA aus der Ratte, wurde für das Screening einer Rattenleber-cDNA-Genbank verwendet, was zu einem 1107 bp-Klon führte (SEQ.-ID.-NR.: 61). Die PCR-Sonde beim Screening entsprach den nt-Resten 279–588 dieser Sequenz. Dieser Klon enthält ein offenes Leseraster, das ein 270-Aminosäurepeptid (SEQ.-ID.-NR.: 62) kodiert, der alle 15 unabhängigen Peptidsequenzen enthält (einige überlappend), die aus einer umfangreichen Sequenzanalyse des gereinigten Proteins erhalten wurden. Der Translationsstart-Methionincodon wird aus der typischen Kozak-Sequenz für einen Initialcodon und das Fehlen von anderen Strangaufwärts-in-frame-Methionincodons zugeordnet. Während in dieser 5'-Strangaufwärtssequenz kein in-frame-Stopcodon vorhanden ist, enthält eine menschliche expressed-sequence-tag (EST)-cDNA (GenBank-Zugangs-Nr. T78033) in der Datenbank einen solchen Stopcodon, der dem gleichen zugeordneten Methioninstart vorangeht. Dieses Leseraster führt jedoch zu einem Protein mit 30464 Dalton, weit unterhalb der auf Grundlage von SDS-Gelelektrophorese abgeschätzten Molmasse von 40 kDa.
Um die Größe des Proteinprodukts, das aus dieser cDNA synthetisiert werden kann, aufzuklären, wurde der AMPK-β-Klon sowohl in Bakterien als auch in Säugetierzellen exprimiert. In beiden Expressionssystemen wandert das Proteinprodukt bei einer höheren Molmasse als vorhergesagt. Bei der Reinigung als ein His⁶-tagged Fusionsprotein aus E. coli. wandert das isolierte Protein auf SDS-Gelen mit einer scheinbaren Molmasse von etwa 43000 Da (genauso wie der Ovalbumin-Standard).
Dies entspricht einem AMPK-β-Polypeptidprodukt von 40 kDa mit zusätzlichen 3 kDa Dalton der Fusions-tag-Sequenz aus dem pET-Vektor. Beim Exprimieren in Säugetierzellen aus einem HA-tagged Expressionsvektor zeigen sich zwei Polypeptide mit dem Produkt, entsprechend einer 40 kDa-Spezies (nach Korrektur für die Größe des HA-Epitop-tags). Unter Verwendung dieses Expressionssystems zeigt sich auch ein zweites Produkt mit 42–43 kDa. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Proteinprodukt dieses AMPK-β auf SDS-PAGE mit einer ungewöhnlich hohen Molmasse wandert.
Ein Vergleich der Rattenleber-AMPK-β-Sequenz mit der Datenbank zeigt, dass es zu drei Hefeproteinen (Sip1p, Sip2p und Gal83p) und zu zwei kürzlich geklonten menschlichen EST-cDNA-Sequenzen hoch homolog ist. Diese Ausrichtung gemäß der Sequenz des S. cerevisiase-Proteins Sip1p (Young et al. (1992) Science, 257, 680–682) ist am auffälligsten am C-Terminus des AMPK-β und der Hefeproteine.
Die AMPK-β-Untereinheit ist ein Säugetierhomologes einer Klasse von Proteinen in Hefe, dargestellt durch Sip1p/Sip2p/Gal83p. Vom GAL83-Genprodukt ist bekannt, dass es die Glucoserepression der GAL-Gene beeinflusst. Für alle diese Proteine wurde gezeigt, dass sie mit der Snf1p-Proteinkinase entweder im 2-Hybridsystem oder durch Immunfällung wechselwirken. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Proteine als Adaptoren dienen, die die Aktivität von Snf1p gegenüber spezifischen Zielen fördern. Auf Grundlage einer Analyse von Hefemutanten wurde vorgeschlagen, dass diese Proteine die Wechselwirkung von Snf1p mit einzelnen und unterschiedlichen Zielen erleichtern. Interessant ist der Nachweis einer hoch konservierten Domäne von etwa 80 Aminosäuren im Zielterminus von Sip1p/Sip2p/Gal83p, die als ASC-Domäne bezeichnet wird (Verknüpfung mit dem Snflp-Komplex) (Young et al. (1994) EMBO J. 13, 5878–5886). Wie auch im 2-Hybridsystem untersucht, wechselwirkt die ASC-Domäne sowohl von Sip1p als auch von Sip2p stark mit Snf1p. Die Wechselwirkung von Sip2p mit Snf1p geht jedoch bei Deletion dieser Domäne nicht vollständig verloren, was nahelegt, dass die ASC-Domäne nicht allein für diese Protein-Protein-Wechselwirkung verantwortlich ist. Eine mutmaßliche ASC-Domäne ist auch im C-Terminus von Rattenleber-AMPK-β (aa-Reste 203–270) hoch konserviert, was nahelegt, dass diese Region teilweise für die Bindung an die AMPK-α-Untereinheit verantwortlich ist.
Ähnlich wie Sip2p und Gal83p wird AMPK-β in vitro phosphoryliert, wenn es mit einer katalytischen Untereinheit (AMPK-α bzw. Snf1p) verbunden ist. Mutationen von Gal83p können die meiste Snf1p-Kinaseaktivität, die in Immunkomplexen, gefällt mit Anti-Snf1p-Antikörper, nachweisbar ist, beseitigen. Eine Sip2p/E-gal83/E-Mutante zeigt eine verringerte Snf1p-Proteinkinaseaktivität, die nach Expression von Sip2p- oder Gal83p-LexA-Fusionsproteinen im Mutantenstamm wiederhergestellt wird (Young et al. (1994) EMBO J. 13, 5878–5886). Zusammengenommen legen diese Daten die Möglichkeit nahe, dass AMPK-β auch als ein Adaptormolekül für die katalytische AMPK-α-Einheit dienen kann und die AMPK-Aktivität positiv reguliert.
AMPK-β zeigt anscheinend eine ungewöhnliche Wanderung auf SDS-Gelen, wobei das Polypeptid bei einer M_r wandert, die ungefähr 10 kDa größer ist, als die Größe, die aus der cDNA vorhergesagt wurde. Diese langsamere Wanderung zeigt sich sowohl beim bakteriell exprimierten His⁶-Fusionsprotein und bei dem Protein, das in COS7-Zellen exprimiert wurde. Diese Beobachtungen legen nahe, dass höhere Ordnungen der Struktur verantwortlich sind für die ungewöhnliche Wanderung auf SDS-PAGE. Die AMPK-β-Untereinheit wird in vitro autophosphoryliert; dies legt nahe, dass die zwei AMPK-β-Banden, die bei der Transfektion von Säugetierzellen mit AMPK-β-cDNA exprimiert werden, aus einer ähnlichen Post-Translationsmodifikation resultieren, was zu kleineren Mobilitäts-Shifts Anlass gibt. Interessanterweise ist dieses abweichende Wanderungsverhalten von AMPK-β vergleichbar dem seines Hefehomologen Gal83p. Wenn sie in Hefe exprimiert werden, wandern die LexA-Fusionsproteine von Gal83 auch bei einer höheren Molmasse als erwartet, und sie zeigen mehr als eine Bande auf SDS-Gelen, was mit der bekannten Phosphorylierung von Gal83p durch Snf1p übereinstimmt. Die massenspektrometrische Analyse der β-Untereinheit zeigt, dass das aminoterminale Glycin myristyliert ist, und dass die Untereinheit in mono- und di-phosphorylierten Formen isoliert ist.
Unter Verwendung des MOPAC-Verfahrens und anderer PCR-Amplifikationsmethoden wurde eine 192 bp-cDNA erhalten, die der Rattenleber-AMPK-γ-Sequenz entspricht, und für ein Genbank-Screening verwendet wurde, um eine Teillängen-Rattenleber-cDNA mit ungefähr 1,3 kb zu erhalten. Diese Sequenz enthielt nicht ein Start-Methionincodon oder alle Peptidsequenzen, die aus dem gereinigten Protein erhalten wurden. Versuche, diese Sequenz durch Verwendung einer Primer-Extensions-Genbank und 5'-RACE um das 5'-Ende zu verlängern, führten lediglich zur Hinzufügung von etwa 200 nt zu dieser Sequenz ohne Identifizierung des Startcodons. Eine Teillängen-Ratten-cDNA wurde dann verwendet, um eine menschliche Fötuslebergenbank zu screenen, was zu dem Klon mit voller Länge führte, der in SEQ.-ID.-NR.: 63 gezeigt ist. Dieser Klon enthält eine abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ.-ID.-NR: 64), die allen 22 unabhängigen (einige davon überlappend) Peptidsequenzen entspricht, die aus dem gereinigten Ratten- und Schweineleber-AMPK-γ erhalten wurden, was die klonale Identität bestätigt.
Eine typische Kozak-Translations-Initiationssequenz umgibt den zugeordneten Methionin-Startcodon; dieser Start ist auch in-frame mit einem 5'-Strangaufwärts-Stoppcodon. Dem zugeordneten Startmethionin folgt ein offenes Leseraster, das ein Protein aus 331 Aminosäuren mit 37546 Da vorbestimmt, was der Molmasse entspricht, die bei der SDS-Gelelektrophorese des gereinigten Proteins aus Ratten- und Schweineleber beobachtet wurde. Die Expression einer beschnittenen Ratten-AMPK-γ-cDNA (aa-Reste 33 bis 331) und des menschlichen AMPK-γ mit voller Länge (331 aa) in COS7-Zellen liefert Produkte in Übereinstimmung mit der Molmasse, die für jede cDNA vorbestimmt wurde (34081 bzw. 37577 Dalton). Das in Bakterien exprimierte Rattenleber-AMPK-γ-Produkt zeigte auch die Molmasse, die durch die cDNA vorbestimmt war. Anders als bei AMPK-β gibt es somit keine ungewöhnliche Wanderung des Proteinprodukts aus AMPK-γ-cDNA.
Ein Vergleich der menschlichen und Rattenleber-AMPK-γ-Aminosäuresequenzen mit der Datenbank liefert eine signifikante Ausrichtung dieses Proteins mit der S. cerevisiae-Snf4p. Weiterhin gibt es eine Ausrichtung der menschlichen cDNA der vorliegenden Erfindung mit gesamter Länge mit verschiedenen anderen menschlichen Teillängen-EST-cDNA-Sequenzen aus Gehirn, weiblicher Brust, Plazenta, Leber und Herz, die kürzlich in der Datenbank veröffentlicht wurden. Eine Überprüfung dieser Sequenzen ergibt, dass es multiple Isoformen des menschlichen AMPK-γ-Proteins gibt. Vermutlich gibt es auch ähnliche AMPK-γ-Isoformfamilien, die in der Ratte und im Schwein exprimiert werden. Die letztere Annahme basiert auf einer Sequenzanalyse von 14 anderen MOPAC-abgeleiteten partiellen AMPK-γ-cDNA-Sequenzen, identifiziert bei der Koloniehybridisierung der APMPK-γ-MOPAC-Produkte mit ³²P-markierten, degenerierten Oligonukleotiden. Diese Produkte zeigten mindestens zwei reproduzierbare Muster von Nukleotid-Heterogenität im nicht-degenerierten Kern.
Ratten- und menschliche Leber-AMPK-γ ist ein Säugetierhomologes des S. cerevisiae-Snf4p (CAT3) (Selenza et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9, 5045–5054; Schulter, H. J. und Entian K. D. (1988) Gene, 67, 247–257; Fields, S. und Song, O. K. (1989) Nature 340, 245–246). In der ersten veröffentlichten Verwendung des 2- Hybridsystems wurde gezeigt, dass Snf4p mit dem Snf1p-Protein wechselwirkt und damit auch eine Co-Immunfällung liefert (Haygood, M. G. (1993) Biotechniques 15, 1084–1089). Tatsächlich erfolgt bei der Isolierung der Snf1p-Kinase aus Hefe eine gemeinsame Reinigung von Snf4p in einer 1:1-Stöchiometrie mit dem Snf1p-Polypeptid, aber nicht mit den anderen mit Snf1p wechselwirkenden Proteinen. Eine Analyse von Snf4-Mutanten in Hefe legt nahe, dass Snf4p auch positiv die Aktivität der damit verbundenen katalytischen Untereinheit Snf1p reguliert. Durch Analogie ist unsere Vorhersage die, dass AMPK-γ ebenfalls einen solchen positiven Einfluss auf die AMPK-α-Untereinheit hat.
Eine Überprüfung der Datenbank zeigt, dass es zusätzlich zur Homologie von AMPK-γ mit Snf4p 2 oder 3 verschiedene menschliche Proteine gibt, die mit unseren menschlichen und Rattenleber-AMPK-γ-Sequenzen hoch homolog oder identisch sind. Einige dieser Datenbanksequenzen sind jedoch, wie aus EST-cDNAs in Gehirn, Herz, weiblicher Brust und Plazenta vorhergesagt, untereinander und von unseren Klonen verschieden; einige haben beispielsweise eine C-terminale Verlängerung. Dies zeigt, dass es eine Säugetier-Isoformfamilie von potentiellen AMPK-γ-Untereinheiten gibt, jede davon möglicherweise mit unterschiedlichen Gewebeexpressions- und -regulationsfunktionen. Es wird vorgeschlagen, dass diese verschiedenen γ-Isoformen mit γ₁, γ₂, γ₃ ... γ_n bezeichnet werden, da ihre Sequenzen mit gesamter Länge aufgezeichnet sind. Die Rattenleber/menschliche Leber-AMPK-γ-Sequenz der vorliegenden Erfindung wird hier als AMPK-γ₁ bezeichnet.
Die katalytische AMPK-α-Einheit wird in großem Umfang in verschiedenen Rattengeweben exprimiert. AMPK-β- und AMPK-γ-Seguenzen haben eine ähnlich breite Gewebeexpression. In Gesamt-mRNA-Präparaten zeigen sich zwei Spezies von AMPK-γ-mRNA mit 2,7 und 1,9 kb; nur das letztere ist in PolyA+-RNA aus Rattenleber vorhanden, was nahelegt, dass die größere mRNA eine unverarbeitete Vorstufe ist. Für AMPK-β ist nur eine einzelne mRNA-Spezies von 1,9 kb vorhanden. Sowohl AMPK-γ- als auch AMPK-β-mRNAs werden in der Niere, weißem Fettgewebe, Lunge und Milz stark exprimiert, wobei AMPK-γ-mRNA offensichtlich noch stärker in Herz und Gehirn exprimiert wird. Der mRNA-Gehalt für jede Untereinheit ist zwar nachweisbar, aber vergleichsweise niedriger in Skelettmuskeln, milchproduzierenden Brustdrüsen und Leber. In anderen Studien wurde festgestellt, dass hohe Konzentrationen an mRNA für beide Untereinheiten in der Ratten-Fao-Hepatomzelle und der Insulin-produzierenden HITt-Zelle des syrischen Hamsters gefunden wurden, also Zelllinien, die beide wesentliche Gehalte an AMPK-Aktivität exprimieren.
AMPK wurde zuerst als eine Proteinkinase erkannt, die auf Enzyme des Lipidstoffwechsels wirkt (Acetyl-CoA-Carboxylase, NMG-CoA-Reduktase und hormonempfindliche Lipase). Wie bereits bei der AMPK-α-Untereinheit beobachtet wurde, haben jedoch die AMPK-β- und AMPK-γ₁-Untereinheiten eine breitere Gewebeverteilung, als man für ein Protein erwarten würde, das nur bei der Regulierung des Lipidmetabolismus wirksam ist. Während mRNAs in allen Fällen in "klassischen" lipogenen Geweben, wie beispielsweise Leber, weißem Fettgewebe und milchproduzierenden Brustdrüsen nachweisbar sind, legen hohe Konzentrationen von mRNA in nicht-lipogenen Geweben, wie beispielsweise Herz, Gehirn, Milz und Lunge nahe, dass diese Proteine Funktionen haben, die über die Regulierung der Biosynthese von Fettsäuren und Sterinen sowie der Fettsäureoxidation hinausgehen.
Die bemerkenswerte Homologie aller drei Untereinheiten gegenüber Hefeproteinen, die an Nährstoff(Glucose)-Reaktionen beteiligt sind, legt beispielsweise nahe, dass die drei Säugetierproteine an der Glucose(oder anderer Nährstoff-)Regulierung der Genexpression in Säugetiergeweben oder bei anderen adaptiven Reaktionen auf wechselnde Nährstoffumgebung beteiligt sind. Darüber hinaus kann AMPK ein wichtiger "Stoffwechselsensor" sein, der mit der oxidativen Brennstoffauswahl im Herzen und der Glucoseerkennung in den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse verbunden und möglicherweise für die Insulinausscheidung wichtig ist.
Die folgenden nicht-einschränkenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Reinigung der katalytischen AMPK-Untereinheit (α1)
Enzymreinigung
AMPK aus Schweineleber wurde gereinigt. Die Leber (1 kg) wurde in 4000 ml Puffer homogenisiert. Eine Fraktion mit 2,5 bis 7,0% (Gew./Vol.) PEG 6000 wurde hergestellt, und die erhaltene Fraktion wurde chargenweise auf 1500 ml DEA-Cellulose (Whatman, Clifton, NJ) gegeben und mit Puffer eluiert, der 0,25 M NaCl enthielt (2000 ml). Das Eluat wurde an 150 ml Blue Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) chromatographiert, und das AMPK wurde mit Puffer eluiert, der 1 M NaCl enthielt. Die Enzymfraktion wurde konzentriert und durch Fällung mit 10% (Gew./Vol.) PEG 6000 entsalzt, bevor sie mittels Peptidsubstrat-Affinitätschromatographie chromatographiert wurde. Die Peptidsubstrat-Affinitätssäule wurde mit dem gleichen Puffer, der 0,1% (Vol./Vol.) Triton X-100 und 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen, und das AMPK wurde mit diesem Puffer, der 2 M NaCl und 30% (Vol./Vol.) Ethylenglycol enthielt, eluiert.
Proteinkinase-Assays
Das AMPK wurde nach Verfahren, die von Davis et al. (1989) Eur. J. Biochem. 186, 123–128, beschrieben wurden, unter Verwendung des SAMS-Peptidsubstrats HMRSAMSGLHLVKRR-Amid (SEQ.-ID.-NR.: 49) analysiert. Vor der Analyse wurde das Enzym mit Verdünnungspuffer (20 mM HEPES, pH 7,0, 0,1% (Vol./Vol.) Triton X-100) verdünnt, und die Reaktionen wurden gestartet, indem 10 ml verdünntes Enzym zum Reaktionsgemisch, das das Peptidsubstrat enthielt, zugegeben wurden. Die Reaktionen wurden unterbrochen durch Entnehmen von 30 ml-Aliquots und Aufbringen auf P81-Papiere gemäß Verfahren, die von Pearson, R. B., Mitchelhill, K. I., und Kemp, B. E. (1993) in Protein Phosphorylation: A Practical Approach, Hardie, G. D. (Herausg.) Oxford University Press, Seiten 265–291, beschrieben wurden.
Peptidsynthese
Peptide wurden unter Verwendung einer Applied Biosystems 430-Syntheseapparatur gemäss Verfahren synthetisiert, die von Pearson, R. B., Mitchelhill, K. E., und Kemp, B. E. (1993) in Protein Phosphorylation: A Practical Approach, Hardie, G. D. (Herausg.) Oxford University Press, Seiten 265–291, beschrieben wurden. Alle Peptide wurden mittels Kationenaustauschchromatographie und nachfolgender Reversphasenchromatographie gereinigt. Die Peptide wurden durch quantitative Aminosäureanalyse unter Verwendung eines Beckman 6300 Aminosäureanalysators analysiert. Die Peptidsubstrat-Affinitätssäule wurde durch Koppeln des Peptids ADR1 (222–234)^P229 an eine mit N-Hydroxysuccinamidester aktivierte Pharmacia HiTrap Superose-Säule hergestellt. Dieses Harz enthält einen 6-Aminohexansäure-Spacer-Arm. Die Bedingungen, unter denen die Kopplung durchgeführt wurde, entsprachen den Anweisungen des Herstellers mit 10 mg Peptid pro 5 ml Säule, und die Peptidkopplung wurde mittels Reversphasen-HPLC überwacht.
Beispiel 2: Isolierung der cDNA-kodierenden katalytischen AMPK-Untereinheit (α₁)
Peptidsequenzierung
Die Peptide wurden durch in situ-Proteolyse aus Ratten- und Schweine-α₁-Untereinheit der AMPK nach Verfahren erhalten, die von Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361–2364, beschrieben wurden, und auf einem Applied Biosystems 471A Proteinsequencer oder einem Hewlett Packard G1000A Protein Sequencer sequenziert.
Gewebeverteilungs-Aktivitätsuntersuchungen
Für jedes Gewebe wurde eine 35%-ige gesättigte Ammoniumsulfatfraktion hergestellt und anschließend in AMPK-Homogenisierungspuffer homogenisiert (HB, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 250 mM Saccharose, 5 mM Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumfluorid, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM Benzamidin, 1 μg/ml Sojabohnen-Trypsininhibitor und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid). Das erhaltene Pellet wurde erneut in 5 ml HB suspendiert und auf die Proteinkonzentration analysiert. Die AMPK wurde nach Verfahren analysiert, die von Mitchelhill et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2361–2364 beschrieben wurden, mit den folgenden Modifikationen: Ein endgültiges Reaktionsvolumen von 120 μl wurde verwendet; Enzymaliquots (30 μl) mit 1 μg Protein, das in 50 mM Tris-HCl bei pH 7,5 und 0,05% (Vol./Vol.) Triton X-100 vorverdünnt war, wurden verwendet, um die Reaktion zu starten. Drei Aliquots (30 μl) wurden nach 2, 4 und 6 Minuten entnommen. Die Reaktionen wurden doppelt mit ± 5'-AMP (200 μM) durchgeführt, mit einem Minus-Peptidsubstrat als Vergleichsprobe. Die spezifische Aktivität des Enzyms wurde unter Verwendung linearer Phosphorylierungsraten mit dem spezifischen, synthetischen Peptidsubstrat SAMS bestimmt. Das AMPK aus Ratten- oder Schweineleber wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, mittels Substrat-Affinitätschromatographie gereinigt.
Isolierung von AMPK-cDNA
Eine radiomarkierte cDNA (774 bp), die Schweine-AMPK-α₁ kodiert, wurde verwendet, um gemäß den Herstellerangaben (Stratagene, La Jolla, CA) eine Ratten-Hypothalamus-Zap-II-cDNA-Genbank zu screenen. Positive wurden in nachfolgenden Screening-Runden plaque-gereinigt, und Phagemide aus positiven Klonen wurden mit Helferphagen isoliert (Stratagene). Das Screening von 7 × 10⁶ Plaques lieferte drei einzelne Klone, von denen der größte aus einem offenen Leseraster bestand, das AMPK-α₁ entsprach (2–549).
Das AMPK-α₁-5'-Ende wurde unter Verwendung eines Gibco 5'-RACE-Kit (Life Technologies, Grand Island, USA) mit einem α₁-spezifischen Primer für die Reste 41–48 sowie Rattenleber-cDNA isoliert. Menschliche AMPK-α₁ (14–270) wurde aus fötaler menschlicher Leber-cDNA mit partiell degenerierten Sense- und Anti-Sense-Primed Olinukleotiden für die α₁-Peptidsequenz mittels RT-PCR isoliert. Menschliche AMPK-α, (Reste 291–448) ist ein Teillängen-cDNA-Klon aus menschlicher Leber, erhalten vom Lawrence Livermore National Laboratory (Klon 78297, Zugangsnummer T50799).
Northern Blotting
Ein Ratten-Mehrfachgewebe-Northern-(MTN)-Blot (Klontech, Palo Alto, CA, USA) mit 2 mg Poly(A)+ RNA aus einzelnen Geweben wurde mit ³²P-markierten Ratten-AMPK-α₁- und -α₂-cDNAs gemäß den bereitgestellten Anweisungen analysiert.
Herstellung von Anti-AMPK-Antikörpern
Polyklonale Antikörper gegen AMPK-α₁ und -α₂ wurden folgendermaßen hergestellt. Peptide auf Grundlage der vorbestimmten Aminosäuresequenzen von AMPK-α₁ für die Reste 339–358 (DFYLATSPPDSFLDDHHLTR (SEQ.-ID.-NR.: 50)) und AMPK-α₂ für die Reste 352–366 (MDDSAMHIPPGLKPH (SEQ.-ID.-NR.: 51)) wurden synthetisiert und über einen Cysteinrest, der unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagens N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (Pharmacia, Uppsala, Schweden) an den N-Terminus des Peptids addiert war, an Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, H-2133) gekoppelt. Weiße Neuseeland-Hasen wurden zuerst mit 2 mg Peptidkonjugat in 50%-igem (Vol./Vol..) komplettem Freund-Adjuvans und bei nachfolgenden Immunisierungen in 50%-igem (Vol./Vol.) inkomplettem Freund-Adjuvans immunisiert. Die Hasen wurden alle 14 Tage mit 2 mg Peptidkonjugat zur Auffrischung geimpft und 7 Tage nach den Auffrischungsimpfungen durch Ausbluten getötet. Die Anti-AMPK-α₁- und -α₂-Peptidantikörper wurden durch Peptidaffinitätschromatographie gereinigt.
Western Blotting
Mehrfache Rattengewebe-Western-Blots wurden folgendermaßen hergestellt. Rattengewebe wurde in AMPK-HB homogenisiert, und eine 2,5–7%-Fraktion in Polyethylenglycol 6000 wurde hergestellt. Das erhaltene Pellet wurde erneut in 5 ml HB suspendiert und auf die Proteinkonzentration analysiert. Einhundert μg einer jeden Gewebefraktion wurden mittels SDS-PAGE (13% Acrylamidgele) analysiert, auf Nitrocellulose transferiert (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland), und mit 3 μg/ml bzw. 6 μg/ml affinitätsgereinigten AMPK-α₁- und -α₂-Antikörpern analysiert. Der primäre Antikörper wurde unter Verwendung von Anti-Hasen-IgG-Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (DAKO Carpinteria, CA, USA) und 0,032% 3,3'-Diaminobenzidin (D-5637, Sigma) zusammen mit 0,064% H₂O₂, nachgewiesen.
Reinigung von AMPK-α₂
Affinitätsgereinigter AMPK-α₂-Antikörper (2 mg) wurde nach Angaben des Herstellers an CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gekoppelt. Die ungebundene Fraktion aus der Substrataftinitätssäule wurde direkt auf die AMPK-α₂-Antikörpersäule aufgetragen, mit 5 Volumen PBS gewaschen und mit 200 mM Glycinpuffer, pH 2,5, eluiert und sofort neutralisiert.
BEISPIEL 3: Isolierung von cDNAs, die nicht-katalytische AMPK-Untereinheiten kodieren
AMPK-Isolierung und Peptidsequenzperung
AMPK aus Schweine- und Rattenleber wurde isoliert. Peptidsequenzen aus den Rattenleber-Beta-(40 kDa)- und Gamma-(38 kDa)-Untereinheiten wurden nach Trennung der Untereinheiten mittels SDS-Gelelektrophorese, Bandenelution und in situ-Proteasedigestion nach Verfahren erhalten, die von Mitchelhill et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2361–2364 und Stapleton et al., (1994) J. Biol. Chem. 269, 29343–29346 beschrieben wurden.
AMPK-β-Untereinheit-cDIVA-Isolierung
Peptidsequenzen aus der AMPK-β-Untereinheit wurden verwendet, um Teillängen-AMPK-β-Untereinheit-cDNAs durch Polymerasekettenreaktion (PCR, = polymerase chain reaction) gemäß Verfahren zu erhalten, die von Gao et al. (1995) Biochem. Biophys. Acta. 1200, 73–82, beschrieben wurden. Ein Produkt, eine 309 bp-cDNA, wurde verwendet, um eine Rattenleber-λZap-II-cDNA-Genbank (Stratagene) zu screenen. Filter wurden mit ³²P-cDNA hybridisiert und mit Alpha ³²P-CTP (3000 mCi/mmol, New England Nuclear) durch Random Priming (Random Primer cDNA Labeling System, Gibco/BRL) in 50% Formamid, 10 × Denhardt's, 1 M NaCl, 50 mM Tris-Cl (pH 7,5) und 100 μg/ml Lachssperma-DNA 18 Stunden lang bei 42°C markiert. Sie wurden dann bei Raumtemperatur 3 × 10 Minuten und dann bei 55°C 15 Minuten lang gewaschen. Eine Autoradiographie wurde über Nacht bei –80°C durchgeführt. Alle Platten wurden doppelt angehoben, und positive Plaques wurden durch drei weitere Runden von Auftragen auf Platten und erneutem Screening gereinigt.
AMPK-γ-Untereinheit-cDNA-Isolierung
Bei Peptidsequenzen, die hier aufgelistet sind, geben die Buchstaben Y, H, N und R Regionen der Degeneration an. Für die AMPK-γ-Untereinheit wurde eine 67 bp-cDNA durch MOPAC-Technik erzeugt, wie beschrieben von Lee, C. C. und Caskey, C. T., (1990) in PCR Protocols, (Innis, MA, Gelfand, G. H., Srinsky J. J. und White T. J., Herausgeber), Seiten 46–53, Academic Press, Inc., London. Degenierte PCR-Primer wurden entsprechend den N- und C-terminalen Sequenzen eines 17-Aminosäure-Rattenleber-AMPK-γ-Peptids synthetisiert (VVDIYSKFDVINLAAEK (SEQ.-ID.-NR.: 52)). Die Sequenz des Sense-Primers war GCGGATCCGTNGAYATHTA (SEQ.-ID.-NR.: 53)), und die Sequenz des Antisense-Primers war CGGAATTCYTTYTCNGCNGCNA (SEQ.-ID.-NR.: 54)). An die 5'-Enden dieser Primer wurden BamHI- und EcoRI-Stellen angefügt. Die Strategie bestand darin, eine nicht-degenerierte Nukleotidsequenz entsprechend dem Mittelteil der Peptidsequenz zu erzeugen, die im Genbank-Screening verwendet werden sollte. Die gesamte Rattenleber-cDNA, hergestellt mit Oligo-dT und Random-Hexameren (Gibco/BRL Pre-Amplification-Kit) wurde zusammen mit PCR verwendet, um ein 67-mer (einschließlich der Primer)-Oligonukleotid zu amplifizieren, das einem Teil der AMPK-γ-cDNA entspricht. Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit BamHI und EcoRI digestiert und zur Transformation von DHS α-Bakterien in pBluescript-Plasmid ligiert. Koloniehybridisierung wurde angewendet, um interessierende Klone zu identifizieren; Kolonien wurden aus Plattenkopien auf Nitrocellulosefilter angehoben. Nach bakterieller Lyse und DNA-Denaturierung wurden die Filter mit einem Gemisch aus zwei ³²P-endmarkierten, degenerierten Oligonukleotid-Gensonden entsprechend der Aminosäuresequenz (KFDVINLA (SEQ.-ID.-NR.: 55)) innen zu der der zwei PCR-Primer analysiert. Diese Oligonukleotide (Nr. 1: AARTTYGAYGTNATHAAYCTNGC (SEQ.-ID-NR.: 56); Nr. 2 AARTTYGAYGTNATHAAYTTRGC (SEQ.-ID.-NR.: 57)) wurden in einem Verhältnis von zwei Teilen Oligo Nr. 1 zu einem Teil Oligo Nr. 2 zugegeben, um die Degeneration des Leu-Codons zu reflektieren. Positive Kolonien wurden identifiziert und Plasmid-DNA zur Sequenzanalyse aus jeder isoliert. Eine solche cDNA wurde ausgewählt, und die nicht-degenerierte "Kern"-23-mer-Oligonukleotidsequenz wurde dann zur Verwendung im Genbank-Screening synthetisiert (CTCCAAGTTTGATGTTATCAACC (SEQ.-ID.-NR: 58)). Screening von ungefähr 10⁶ Plaques mit dieser Gensonde lieferte jedoch keine positiven Klone.
Die nicht-degenerierte 23-mer-cDNA wurde dann in Konjugation mit degenerierten Primern, die aus zwei anderen Peptidsequenzen konstruiert waren, verwendet, um eine größere AMPK-γ-cDNA mittels PCR zu erzeugen. Sowohl die Sense- als auch die Antisense-degenerierten Oligonukleotid-Primer, entsprechend den Peptidsequenzen EELQIG (SEQ.-ID.-NR.: 59) und FPKPEFM (SEQ.-ID.-NR.: 60) wurden zusammen mit der Sense-MOPAC-abstammenden, nicht-degenerierten Sequenz verwendet, um unter Verwendung von Rattenleber-cDNA als Templat alle möglichen PCR-Produkte zu erzeugen. Das größte erhaltene Produkt (192 bp) wurde in pCR-Script (Stratagene) subkloniert und sequenziert. Diese Sequenz, die tatsächlich eine vorhergesagte Aminosäuresequenz entsprechend allen drei AMPK-γ-Peptiden hatte, die in der PCR-Strategie verwendet wurden, wurde dann, wie oben beschrieben, für das Genbank-Screening verwendet. Screening von 2 × 10⁶ Plaques mit diesem größeren PCR-Produkt lieferte mehrere positive Klone; keine der isolierten Ratten-cDNAs (1 bis 1,3 kb) entsprach jedoch einem offenen Leseraster mit voller Länge. In einem Versuch, die Sequenz zum 5'-Ende des ORF zu verlängern, wurde eine Primer-Verlängerungsdatenbank unter Verwendung eines AMPK-γ-spezifischen Antisense-Primers konstruiert (Stragene; λZAPII). Weiteres Screening dieser Datenbank lieferte zwar einige 5'-verlängerte Sequenzen, aber nicht das Met-Startcodon. Die Anwendung einer 5'-RACE-Strategie mit Rattenleber-cDNA war bei Versuchen zur Sequenzverlängerung ebenfalls erfolglos, obgleich ein 5'-RACE-Produkt aus Schweineleber erhalten wurde. Der Hauptteil der 5'-Ratten-cDNA-Sequenz (520 bp) wurde dann verwendet, um eine menschliche fötale Leber-Genbank zu screenen, was eine AMPK-γ-cDNA mit voller Länge lieferte.
Plasmidherstellung und DNA-Sequenzierung
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Qiagen Mini- oder Midi-Säulen (Chatsworth, CA) nach den Angaben des Herstellers hergestellt. DNA wurde mit vektor- oder genspezifischen Primern unter Verwendung eines Applied Biosystems Prism(tm) (Foster City, CA) Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Fertigreaktions-Kit sequenziert und in einem Perkin-Elmer-PCR-Thermocycler gemäß den Angaben des Herstellers durchlaufen gelassen. Farbstoffterminatoren wurden aus den erhaltenen Sequenzreaktionen unter Verwendung einer Centri-Step-Säule (Princeton Separations, Inc.) abgetrennt. Die gereinigten Sequenzierungsreaktionen wurden dann in einem Speed-Vac getrocknet und in einem automatisierten DNA-Sequencer analysiert (Applied Biosystems Model 373).
Bakterielle Expression von cDNAs
Eine Ratten-AMPK-β-Untereinheit-cDNA mit voller Länge und eine Teillängen-Ratten-AMPK-γ-(aa 33–331)-Untereinheit-cDNA wurden in E. coli unter Verwendung des pET-Vektorsystems exprimiert, welches Polyhistidin (His6) und T7-Fusionsepitop-tag-Sequenzen einführt (Novagen, Madison, WI). Die bakterielle Expression wurde mit 1,0 mM IPTG über 2 Stunden bei 37°C induziert. Das exprimierte Gen wurde sowohl durch Coomassie-Blau-Färbung und Immunblotting mit einem Anti-T7-monoklonalen Antikörper (Novagen) nachgewiesen. Die Fusionsproteine wurden aus den Einschlusskörpern der Bakterien mittels Nickel-Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen gereinigt. His6-AMPK-β oder His6-AMPK-γ wurden aus den Einschlusskörpern in 6 M Harnstoff gemäß den Angaben des Herstellers löslich gemacht. Nach Aufbringen der Probe wurde die Säule ausgiebig mit Tris-Cl (20 mM; pH 7,9), 0,5 M NaCl (0,5 M), Imidazol (20 mM) und Harnstoff (6 M) gewaschen. Das His6-Protein wurde mit dem gleichen Puffer, der 300 mM Imidazol enthielt, eluiert.
Zelluläre Expression der cDNAs
Ratten-AMPK-β-cDNA mit voller Länge, ein Teillängen-Ratten-AMPK-γ (aa 33–331) und menschliche AMPK-γ-Untereinheit-cDNAs mit voller Länge wurden ebenfalls in COS7-Zellen exprimiert. cDNAs wurden in-frame in einen pMT2-Vektor mit einem Hämagglutinin (HA)-Epitop-tag (pMT2-HA) kloniert. Die Transfektion wurde unter Verwendung von Lipofectamin-Reagens (Gibco/BRL) gemäß den allgemeinen Angaben des Herstellers durchgeföhrt. Die Zellen wurden bei 3 × 10⁵/Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen in DMEM, das 10% fötales Kalbsserum und Penicillin/Streptomycin enthielt, aufgetragen. Am folgenden Tag wurden die Zellen in serumfreies, antibiotikafreies DMEM überführt, und anschließend wurden Lipofectamin-DNA-Konjugate (2 μg DNA, 10 μl Lipofectamin pro Vertiefung), verdünnt im gleichen Medium, zugegeben. Nach 5-stündiger Inkubation bei 37°C wurde das gleiche Volumenmedium, das 20% fötales Kalbsserum enthielt, in jede Vertiefung gegeben. Am nächsten Morgen wurde das Medium gegen das Original-Zellmedium ausgetauscht. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen gesammelt. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen in einem Puffer, der Tris-Cl (50 mM; pH 7,5), NaCl (100 mM), NaF (50 mM), NaPP_i (5 mM), EDTA (1 mM), DTT (2 mM) und NP-40 (0,5%) enthielt, mit verschiedenen Proteaseinhibitoren lysiert.
Zur vollständigen Lyse wurden die Zellen 15 Minuten lang auf Eis gegeben, gefolgt von Abkratzen und heftigem Verwirbeln (15 Sekunden) des Lysats. Nach Abtrennen von Zellresten durch kurzes Zentrifugieren wurde dieses Lysat für die SDS-Gelelektrophorese und das Immunblotting verwendet. Die Blots wurden mit einem Anti-HA-monoklonalen Antikörper (abstammend aus der 12CA5-Hybridomlinie) analysiert. Nach Sekundäruntersuchung mit einem Anti-Maus-IgG-Peroxidaseantikörper wurden die Blots mittels ECL (Amersham) entwickelt.
Northern Blot-Analyse
Die Gesamt-RNA wurde aus den Geweben von männlichen Sprague-Dawley-Ratten (150 bis 200 g Körpergewicht; Charles River) oder aus den milchproduzierenden Brustdrüsen weiblicher Ratten nach der Guanidiniumisothiocyanat-Lithiumchlorid-Methode isoliert. Die RNAs wurden auf 1% Agarose/Formaldehydgelen mit Kapillartransfer auf Nitrocellulose (MSI) fraktioniert. cDNA-Gensonden wurden mittels Random Priming markiert.
Die Hybridisierung wurde 20 Stunden lang bei 42°C in 5 × Denhardt's, 0,2 M Tris (pH 7,4,) 1 M NaCl und 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA durchgeführt. Die Filter wurden nacheinander mit 2 × SSPE/0,1% SDS (Raumtemperatur; 2 × 15 Minuten), 0,2 × SSPE/0,1% SDS (Raumtemperatur, 2 × 15 Minuten) und mit 0,2 × SSPE/0,1% SDS (55°C; 2 × 15 Minuten) gewaschen. Autoradiographie auf Kodak XAR-Film mit Verstärkerscreens wurde über 18 bis 48 Stunden bei –80°C durchgeführt.
DNA-Sequenzanalyse und DNA-Sequenzen
Die DNA-Sequenz wurde unter Verwendung eines MacVektor(r) und dem GCG-Softwarepaket analysiert. Die Sequenzen wurden unter Verwendung von BLAST und GCG mit der Datenbank verglichen; Aminosäureabgleiche wurden unter Verwendung des Pileup-Programms von GCG durchgeführt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung eines Excel(r)-Makros formatiert. Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen wurden in der Genbank unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: Rattenleber-AMPK-β (U42411), Rattenleber-AMPK-γ (U42413) und menschliches fötales Leber-AMPK-γ (U42412).
SEQUENZLISTE

Claims

Nukleinsäuresequenz, die Säugetier-AMPK-α₁ kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz SEQ ID-NR. 44 umfasst.
Vektor, der eine Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 umfasst.
Wirtszelle, die einen Vektor aus Anspruch 2 umfasst.
Rekombinantes Polypeptid, das durch die Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 kodiert wird.
Verfahren zur Herstellung von Säugetier-AMPK-α₁, umfassend: (a) Züchten der Zellen aus Anspruch 3, unter Bedingungen, die das Exprimieren der Nukleinsäuresequenz, die Säugetier-AMPK-α₁ kodiert, ermöglichen; und (b) Gewinnung von exprimiertem AMKP-α₁ aus der Zelle.
Oligonukleotidsonde, umfassend mindestens 10 Nukleotide, wobei diese Oligonukleotidsonde in der Lage ist, mit einer Nukleinsäursequenz aus Anspruch 1 mit der SEQ ID-NR. 67 zu hybridisieren, welche die Aminosäuren 352–366 von AMPK-α₁ kodiert, aber nicht mit einer Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die ein Säugetier-AMPK-α₂-Polypeptid kodiert, das durch Nukleinsäuremoleküle mit den Sequenzen SEQ ID-NR. 65 oder 66 kodiert wird.
Gereinigtes Polypeptid oder dessen biologisch aktives Fragment, das von einer Nukleinsäuresequenz aus Anspruch 1 kodiert wird, wobei das biologisch aktive Fragment nicht in einem Säugetier-AMPK-α₁-Polypeptid vorliegt, das von Nukleinsäuremolekülen mit Sequenzen der SEQ ID-NRn. 65 oder 66 kodiert wird, und umfasst: (a) mindestens einen Teil der SEQ ID-NRn. 1–12, 15–32, 35–38, 40 oder 43 (b) SEQ ID-Nrn. 14, 34, 39, 41 oder 42; (c) Beibehalten der Fähigkeit, die Phosphorylierung von Proteinmolekülen zu stimulieren; oder (d) Beibehalten der Fähigkeit, die Bindung von natürlichem AMPK-α₁-Polypeptid an mindestens einen Antikörper oder an ein Substratmolekül nachzuahmen.