JPH10507068A

JPH10507068A - 新規ｔｎｆ受容体、デスドメインリガンド蛋白およびリガンド結合阻害剤

Info

Publication number: JPH10507068A
Application number: JP8504509A
Authority: JP
Inventors: リン，リー−リン; チェン，ジェニファー; スチーベラ，アンドレア・アール; グラハム，ジェイムズ
Original assignee: ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
Priority date: 1994-10-19
Filing date: 1995-10-12
Publication date: 1998-07-14
Also published as: US20060188957A1; US20090092613A1; AU698575B2; AU3826195A; US5843675A; US5852173A; WO1996012735A1; US5948638A; EP0787145A1; MX9702789A

Abstract

(57)【要約】新規ＴＮＦ受容体デスドメイン（「ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ」）リガンド蛋白を開示する。ベクター、宿主細胞、およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の製造方法とともに、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチドも開示する。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を含む医薬組成物、炎症症状の治療方法、およびＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害方法も開示する。ＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害剤の同定方法およびかかる方法により同定される阻害剤も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】新規ＴＮＦ受容体、デスドメインリガンド蛋白およびリガンド結合阻害剤本願は、１９９４年１０月１９日出願の第０８／３２７,５１４号の一部継続出願である１９９５年６月１９日出願の第０８／４９４,４４０号の一部継続出願である。発明の背景本発明は、腫瘍壊死因子受容体（以後「ＴＮＦ−Ｒ」という）、例えば、ｐ５５タイプ（またはＴＮＭＦ−Ｒ１）ＴＮＦ受容体の細胞内ドメインへの結合を阻害することにより作用する抗炎症物質および他の物質に関する。より詳細には、本発明は、ＴＮＦ−Ｒ細胞内ドメインに結合する新規リガンドおよびこの受容体によるシグナル変換に対する阻害もしくは転調に関する。腫瘍壊死因子（以後「ＴＮＦ」という）は、広範な細胞活性を発揮するサイトカインである。ＴＮＦは、例えば、病原体に対する免疫応答の準備において有益でありうる炎症応答を引き起こすが、過剰発現された場合には炎症の他の悪影響を引き起こす可能性がある。標的細胞表面上の受容体（ＴＮＦ−Ｒ）へのＴＮＦの結合によりＴＮＦの細胞での効果が開始される。ＴＮＦ−Ｒおよびかかる受容体の変種形態をコードしているポリヌクレオチドの単離が欧州特許出願ＥＰ３０８,３７８、ＥＰ３９３,４３８、ＥＰ４３３,９００、ＥＰ５２６,９０５およびＥＰ５６８,９２５；ＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／０３５５３およびＷＯ９３／１９７７７；ならびにScall et al.,Cell 61:361-370(1990)（ｐ５５タイプのＴＮＦ受容体を開示）に記載されている。またＴＮＦ−Ｒの精製方法は米国特許第５,２９６,５９２号に記載されている。ネイティブなＴＮＦ−Ｒは、独特な細胞外、トランスメンブランおよび細胞内ドマインによって特徴づけられている。細胞外ドメインの第１の目的は細胞の外側へのＴＮＦ結合部位を提供することである。ＴＮＦが結合部位に結合する場合、トランスメンブランおよび細胞内ドメインを通して「シグナル」が細胞内部に伝達され、結合が生じたことが示される。シグナルの細胞内部への伝達または「トランスダクション（transduction）」は、受容体のトランスメンブランおよび／または細胞内ドメインのコンホーメーション変化により起こる。受容体の細胞内ドメインへの蛋白および他の分子の結合によりこのシグナルが「受け取られ」、ＴＮＦ刺激に対する効果が生じる。〜５５ｋｄ（「ＴＮＦ−Ｒ１」）および〜７５ｋｄ（「ＴＮＦ−Ｒ２」）の２種の明確に異なるＴＮＦ受容体が同定されている。抗−ＴＮＦ受容体抗体に関する多くの研究は、ＴＮＦ−Ｒ１はＴＮＦの多面的効果の大部分をシグナリングすることを示している。最近、細胞毒性および他のＴＮＦにより伝達される応答のシグナリングに必要なドメインが、ＴＮＦ− Ｒ１のＣ末端近傍の８０アミノ酸のところにマッピングされた。それゆえ、このドメインは「デスドメイン（death domain）」と呼ばれる（以後、「ＴＮＦ−Ｒデスドメイン」および「ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ」という）（Tartaglia et al.,Cel l 74:845-853(1993)参照）。ＴＮＦ−ＲによるＴＮＦ結合は有益な細胞効果であるが、ＴＮＦ結合が他の悪い細胞効果を発揮しないようにすることがしばしば望ましい。ＴＮＦ−Ｒの細胞外ドメインへのＴＮＦの結合に対する阻害を調べるために多くの努力が払われているが、ＴＮＦ−Ｒの細胞内ドメインへの蛋白および他の分子の結合を調べることはあまり注意を引いていない。しかしながら、ＴＮＦ−Ｒ細胞内ドメインに結合するリガンドはまだ同定されていない。かかるリガンドを同定し単離してＴＮＦ−Ｒシグナルトランスダクションに対するそれらの効果ならびにＴＮＦにより誘導される症状の治療薬としてのそれらの使用について調べることが望ましいであろう。さらにそのうえ、かかるリガンドの同定は、抗−炎症剤としても有用であるＴＮＦ−Ｒ／細胞内リガンド結合に対する阻害剤のスクリーニング手段を提供するであろう。発明の概要出願人は、今回初めて新規ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を同定し、かかるリガンドをコードしているポリヌクレオチドを単離した。さらに出願人は、ＴＮＦ −Ｒのデスドメインに結合することのできる既知蛋白を同定した。１の具体例において、本発明は、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしている単離ポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。好ましい具体例において、該ポリヌクレオチドは下記のものからなる群から選択される。（ａ）配列番号：１のヌクレオチド２からヌクレオチド１２３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号：３のヌクレオチド２からヌクレオチド４１５までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｆ）配列番号：３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｈ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｉ）配列番号：９のヌクレオチド２からヌクレオチド９３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｊ）配列番号：９のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｋ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｌ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｍ）配列番号：１１のヌクレオチド２からヌクレオチド１８２２までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｎ）配列番号：１１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｏ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｐ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｑ）配列番号：１３のヌクレオチド３からヌクレオチド２８４６までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｒ）配列番号：１３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｓ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｔ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｕ）厳密な条件下で（ａ）−（ｔ）に示されたポリヌクレオチドのいずれか１つとハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチド。特定の好ましい具体例において、ポリヌクレオチドは発現制御配列に作動可能に連結される。また本発明は、かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換された細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞を包含する宿主細胞を提供する。（ａ）かかるポリヌクレオチド組成物で形質転換された宿主細胞を適当な培地中で増殖させ；次いで、（ｂ）培養物からＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を精製することを特徴とするＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の製造方法も提供される。かかる方法により製造されるリガンド蛋白も本発明により提供される。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白を含んでなる組成物も開示される。好ましい具体例において、該蛋白は、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント；（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメント；（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列のフラグメント；（ｇ）配列番号：１０のアミノ酸配列（ｈ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメント；（ｉ）配列番号：１２のアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメント；（ｋ）配列番号：１４のアミノ酸配列；および（ｌ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、該蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まない。かかる組成物はさらに医薬上許容される担体を含んでいてもよい。かかるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白と特異的に反応する抗体を含んでなる組成物も本発明により提供される。（ａ）ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白をＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白と混合し、該混合により第１の結合混合物を得て；（ｂ）第１の結合混合物中のＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白とＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白との間の結合量を測定し；（ｃ）化合物をＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白と混合して第２の結合混合物を得て；（ｄ）第２の結合混合物中の結合量を測定し；次いで、（ｅ）第１の結合混合物中の結合量を第２の結合混合物中の結合量と比較することを特徴とするＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害剤の同定方法であって、第２の結合混合物の結合量が減少した場合は、該化合物がＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうるものである方法も提供される。特定の好ましい具体例において、かかる方法に使用されるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白は下記のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる：（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント；（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメント；（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列のフラグメント；（ｇ）配列番号：８のアミノ酸配列；（ｈ）配列番号：８のアミノ酸配列のフラグメント；（ｉ）配列番号：１０のアミノ酸配列；（ｊ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメント；（ｋ）配列番号：１２のアミノ酸配列；（ｌ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメント；（ｍ）配列番号：１４のアミノ酸配列；（ｎ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメント。かかる方法により同定される阻害剤を含んでなる組成物も提供される。かかる組成物は医薬上許容される担体を含んでいてもよい。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白および医薬上許容される担体を含んでなる治療上有効量の組成物を投与することを特徴とする炎症症状の予防または改善のための方法も提供される。他の具体例は、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白および医薬上許容される担体を含んでなる治療上有効量の組成物を投与することを特徴とするＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害方法を提供する。医薬上許容される担体ならびにインスリン様増殖因子結合蛋白−５（「ＩＧＦＢＰ−５」）およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するそのフラグメントからなる群から選択される蛋白を含んでなる治療上有効量の組成物を哺乳動物対象に投与することを特徴とする炎症症状の予防または改善方法も提供される。治療上有効量のＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合阻害剤を哺乳動物対象に投与することを特徴とする、炎症症状の予防または改善、あるいはＴＮＦ−Ｒ阻害のための方法も提供される。（ａ）ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白をコードしている第１のポリヌクレオチド、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしている第２のポリヌクレオチド、および少なくとも１のレポーター遺伝子で細胞を形質転換し、第１のポリヌクレオチドによりコードされているＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白への第２のポリヌクレオチドによりコードされているＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の結合によってレポーター遺伝子の発現が調節されるものであり；（ｂ）化合物の存在下および不存在下で細胞を増殖させ；次いで、（ｃ）該化合物の存在下および不存在下でレポーター遺伝子の発現の程度を比較することを特徴とするＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害剤の同定方法であって、レポーター遺伝子の発現程度の低下が生じた場合は、該化合物がＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうるものである方法も本発明により提供される。好ましい具体例において、細胞は酵母細胞であり、第２のポリヌクレオチドは以下のものからなる群から選択される：（ａ）配列番号：１のヌクレオチド２からヌクレオチド１２３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号：３のヌクレオチド２からヌクレオチド４１５までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｆ）配列番号：３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｈ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｉ）配列番号：５のヌクレオチド２からヌクレオチド５５９までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｊ）配列番号：５のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｋ）配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｌ）配列番号：６のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｍ）配列番号：７のヌクレオチド５７からヌクレオチド８７５までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｎ）配列番号：７のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｏ）配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｐ）配列番号：８のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｑ）配列番号：９のヌクレオチド２からヌクレオチド９３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｒ）配列番号：９のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｓ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｔ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｕ）配列番号：１１のヌクレオチド２からヌクレオチド１８２２までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｖ）配列番号：１１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｗ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｘ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｙ）配列番号：１３のヌクレオチド３からヌクレオチド２８４６までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ｚ）配列番号：１３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ａａ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｂｂ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｃｃ）厳密な条件下で（ａ）−（ｂｂ）に示されたポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド。図面の簡単な説明図１および図２は、本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の発現を示すオートラジオグラフである。図３は、クローン１ＴＵ、１５ＴＵおよび２７ＴＵの発現を示すオートラジオグラフである。図４は、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤへの１ＴＵおよび２７ＴＵの結合を示す。１００ μｌの結合バッファー（０.２％ Triton、２０ｍＭ Tris ｐＨ７.５、１４０ｍＭＮａＣｌ、０.１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴおよび５％グリセロール）中、３μｇのＧＳＴまたはＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤのいずれかを含有するグルタチオンビーズとともにＭＢＰ、ＭＢＰ−１ＴＵまたはＭＢＰ−２７ＴＵがインキュベーションされた。４℃で２時間反応を行い、遠心分離して未結合フラクションを除去した（未結合）。次いで、ビーズを５００μｌの結合バッファーで４回洗浄し、ＳＤＳ−試料バッファーに再結合させた（結合）。抗−ＭＢＰ抗体（New England Biolab）を用いるウェスタンブロットにより、これらの試料を分析した。図５は、１５ＴＵおよび２７ＴＵのＪＮＫ経路活性化能を示す。ＨＡ−タグを付したＪＮＫ１およびクローン１５ＴＵまたは２７ＴＵを用いてＣＯＳ細胞を同時トランスフェクションした。５０ｎｇ／ｍｌＴＮＦで細胞を１５分間処理または未処理とし、ＨＡ−ＪＮＫ１を抗−ＨＡ抗体とともに免疫沈降させた。ＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎ（アミノ酸１−７９）を基質として用いるインビトロキナーゼアッセイにおいてＪＮＫ活性を測定し、反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動した。図６は、クローン３ＴＷでトランスフェクションしたＣＯＳ細胞により得られたならし培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフである。図７は、クローン３ＴＶの配列由来のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＴＮＦにより誘導されるｃＰＬＡ₂のホスホリレーションを阻害することを示すオートラジオグラフである。発明の詳細な説明本発明者らは、ＴＮＦ−Ｒデスドメインに結合する蛋白をコードしている新規ポリヌクレオチドを初めて同定し単離した。本明細書の用語「ＴＮＦ−Ｒ」は、腫瘍壊死因子に対するすべての受容体を包含する。Ｐ５５タイプのＴＮＦ−Ｒは本発明の実施にとり好ましい受容体である。かかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの配列を配列番号：１のヌクレオチド２から１２３１までに示す。このポリヌクレオチドは「クローン２ＤＤ」と同定された。クローン２ＤＤによりコードされるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。クローン２ＤＤはより長い全長のコーディング配列の部分ｃＤＮＡクローンであると考えられる。しかしながら、本明細書に示すように、クローン２ＤＤによりコードされる蛋白はＴＮＦ−Ｒのデスドメインに結合する（すなわち、本明細書で定義される「ＴＨＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性」を有する）。クローン２ＤＤは、１９９４年１０月１３日に American Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９７０６を付与された。クローン２ＤＤによりコードされる蛋白は長さ４１０アミノ酸である。ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＸまたはＦＡＳＴＡサーチャーを用いた場合、同一または密室に関連した配列は見いだされなかった。それゆえ、クローン２ＤＤは新規蛋白をコードしている。かかる蛋白をコードしているポリヌクレオチドの配列を配列番号：３のヌクレオチド２から４１５までに示す。このポリヌクレオチドを「クローン３ＤＤ」と同定した。クローン３ＤＤによりコードされるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。クローン３ＤＤはより長い全長のコーディング配列の部分ｃＤＮＡクローンであると考えられる。しかしながら、本明細書に示すように、クローン３ＤＤによりコードされる蛋白はＴＮＦ−Ｒのデスドメインに結合する（すなわち、本明細書で定義される「ＴＨＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性」を有する）。クローン３ＤＤは、１９９４年１０月１３日にAmer ican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９７０５を付与された。クローン３ＤＤによりコードされる蛋白は長さ１３８アミノ酸である。ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＸまたはＦＡＳＴＡサーチャーを用いた場合、同一または密室に関連した配列は見いだされなかった。それゆえ、クローン３ＤＤは新規蛋白をコードしている。クローン３ＤＤに対応する全長のクローンも単離し、「クローン３ＴＷ」と同定した。クローン３ＴＷのヌクレオチド配列を配列番号：１３として報告する。配列番号：１３のヌクレオチド３からヌクレオチド２８４６まではＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白をコードしており、そのアミノ酸配列を配列番号：１４として報告する。配列番号：１４のアミノ酸８１１から９４８までは配列番号：４のアミノ酸１から１３８まで（クローン３ＤＤ）に対応する。クローン３ＴＷは、１９９５年９月２６日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣを付与された。もう１つのかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチド配列を配列番号：５のヌクレオチド２から５５９までに示す。このヌクレオチドを「クローン２０ＤＤ」と同定した。クローン２０ＤＤによりコードされるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。クローン２０ＤＤはより長い全長のコーディング配列の部分ｃＤＮＡクローンであると考えられる。しかしながら、本明細書に示すように、クローン２０ＤＤによりコードされる蛋白はＴＮＦ−Ｒのデスドメインに結合する（すなわち、本明細書で定義される「ＴＨＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性」を有する）。クローン２０ＤＤは、１９９４年1０月１３日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９７０４を付与された。クローン３ＤＤによりコードされる蛋白は、インスリン様増殖因子結合蛋白− ５（「ＩＧＦＢＰ−５」）のアミノ酸８７から２７２までと同じであり、その配列については、ShimasakiらによりJ.Biol.Chem.266:10646-10653(1991)に開示されており、参照により本明細書に記載されているものとみなす。ＩＧＦＢＰ−５のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号:７および配列番号: ８に示す。クローン２０ＤＤおよびＩＧＦＢＰ−５の間の配列同一性に基づくと、ＩＧＦＢＰ−５およびその特定のフラグメントはＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド結合活性（本明細書にて定義）示すであろう。もう１つのかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチド配列を配列番号：９のヌクレオチド２から９３１までに示す。このポリヌクレオチドを「クローン１ＴＵ」と同定した。クローン１ＴＵによりコードされるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。クローン１ＴＵはより長い全長のコーディング配列の部分ｃＤＮＡクローンであると考えられる。しかしながら、しかしながら、本明細書に示すように、クローン１ＴＵによりコードされる蛋白はＴＮＦ−Ｒのデスドメインに結合する（すなわち、本明細書で定義される「ＴＨＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性」を有する）。クローン１ＴＵは、１９９５年６月７日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９８４８を付与された。クローン１ＴＵによりコードされる蛋白は長さ３１０アミノ酸である。ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＸまたはＦＡＳＴＡサーチャーを用いた場合、同一または密室に関連した配列は見いだされなかった。それゆえ、クローン１ＴＵは新規蛋白をコードしている。もう１つのかかる蛋白をコードしているポリヌクレオチド配列を配列番号：１１のヌクレオチド２から１８２２までに示す。このポリヌクレオチドを「クローン２７ＴＵ」と同定した。クローン２７ＴＵによりコードされるＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白のアミノ酸配列を配列番号：１２に示す。クローン２７ＴＵはより長い全長のコーディング配列の部分ｃＤＮＡクローンであると考えられる。しかしながら、しかしながら、本明細書に示すように、クローン２７ＴＵによりコードされる蛋白はＴＮＦ−Ｒのデスドメインに結合する（すなわち、本明細書で定義される「ＴＨＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性」を有する）。クローン２７ＴＵは、１９９５年６月７日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９８４６を付与された。クローン１ＴＵによりコードされる蛋白は長さ６０７アミノ酸である。ＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＸまたはＦＡＳＴＡサーチャーを用いた場合、同一または密室に関連した配列は見いだされなかった。それゆえ、クローン２７ＴＵは新規蛋白をコードしている。２７ＴＵはクローン２ＤＤの長いバージョンであるかもしれない。２ＤＤは、２７ＴＵ（配列番号：１２）によりコードされるアミノ酸１９８−６０７と同じアミノ酸配列（配列番号：２）をコードしている。２ＤＤおよび２７ＴＵのヌクレオチド配列も同一性のある領域内で同一である。２７ＴＵ配列の一部（大体、配列番号：１２のアミノ酸配列２８９−６０７）をコードしているさらなる「クローン１５ＴＵ」を単離した。クローン１５ＴＵは、１９９５年６月７日にAmerican Type Culture Collectionに寄託され、受託番号ＡＴＣＣ６９８４７を付与された。１５ＴＵは、このアミノ酸領域に２７ＴＵと同じ配列を含んでなる。厳密な条件下および高度に厳密な条件下で本発明ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドも本発明の一部である。本明細書の用語「高度に厳密な条件」は、例えば、６５℃における０.２ｘＳＳＣを包含し、「厳密な条件」は、例えば、６５℃における４ｘＳＳＣあるいは５０％ホルムアミドかつ４２℃における４ｘＳＳＣを包含する。本願の目的からすると、「ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白」は、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を示す蛋白を包含する。本願の目的からすると、ＴＮＦ−Ｒデスドメイン由来の蛋白に結合する場合、蛋白は「ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性」を有すると定義される。ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白への結合を検出するいずれのアッセイを用いても活性を測定することができる。かかるアッセイの例は、相互作用トラップアッセイ（interaction trap assay）およびＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白が結合の観察を可能にする様式で表面に固定されるアッセイを包含するがこれらに限らず、これらのアッセイは実施例１および３に記載されたアッセイを包含するがこれらに限らない。本明細書の用語「ＴＮＦ −Ｒデスドメイン蛋白」は、デスドメイン全体またはそのフラグメントを包含する。ＴＮＦ−Ｒデスドメインと相互作用しうる、あるいはＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうる（すなわち、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を示す）ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のフラグメントも本発明に包含される。ＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のフラグメントは直鎖状であってもよく、あるいは既知方法、例えば、H.U.Saragovi et al.,Bio/Technology 10,773-778(1992)およびR .S.McDowell et al.,J.Amer.Chem.Soc.114,9245-9253(1992)に記載された方法（これらの文献を参照により本明細書に記載されているものとみなす）を用いて環化してもよい。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白結合部位の結合価を増加させることを含む多くの目的で、かかるフラグメントを免疫グロブリンのごときキャリヤー分子に融合させてもよい。例えば、Ｔｎｆ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のフラグメントを「リンカー」を介して免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させてもよい。融合蛋白のごとき２価形態のＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を得るためには、例えば、ＩｇＧ分子のＦｃ部分との融合を行うことができる。他の免疫グロブリンイソタイプを用いてかかる融合物を得てもよい。例えば、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白−ＩｇＭ融合物は１０価形態の本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を生じるであろう。 Kaufman et al.,Nucleic Acids Res.19,4485-4490(1991)に開示されたｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターのごとき発現制御配列に本発明の単離ポリヌクレオチドを作動可能に連結してＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を組み換え法により得てもよい。多くの適当な制御配列が当該分野において知られている。組み換え蛋白を発現させる一般的方法も知られており、R.Kaufman,Methods in Enz ymology 185,537-566(1990)に説明されている。本明細書定義の「作動可能に連結」は、連結されたポリヌクレオチド／発現調節配列を用いて形質転換（トランスフェクション）された宿主細胞によりＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白が発現されるように、本発明の単離ポリヌクレオチドおよび発現制御配列がベクター中または細胞中で配置されていることを意味する。多くのタイプの細胞が、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白発現に適する宿主細胞として役立ちうる。宿主細胞は、例えば、サル・ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト・腎臓２９３細胞、ヒト・上皮Ａ４３１細胞、ヒト・Ｃｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞系、ＨｅＬａ細胞、マウス・Ｌ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット（Jurkat）細胞を包含する。本発明単離ポリヌクレオチドを１またはそれ以上の昆虫発現ベクター中の適当な制御配列に作動可能に連結し、昆虫の発現系を用いることによってもＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を製造することもできる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に用いる材料および方法は、例えば、Invitrogen.San Diego、California, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)（参照により本明細書に記載されているものとみなす）に記載されたようなかかる方法は当該分野においてよく知られている。別法として、酵母のごとき下等真核生物または細菌のごとき原核生物においてＴＮＲ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を製造することが可能である。潜在的に適性のある酵母株はサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（K luyveromyces）株、カンジダ（Candida）、あるいは異種蛋白発現能のある酵母株を包含する。潜在的に適性のある細菌株は、エシェリシア・コリ（Escherichi a coli）、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、あるいは異種蛋白発現能のある細菌株を包含する。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を酵母または細菌において製造する場合には、その中で産生された蛋白を、例えば、適当な部位におけるホスホリレーションまたはグリコシレーションにより修飾して機能的なＴＮＦ −Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を得ることが必要であるかもしれない。既知の化学的または酵素的方法を用いてかかる共有結合を行うことができる。本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をトランスジェニック動物の生産物として、例えば、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞により特徴づけられるトランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヤギの乳の成分として発現させてもよい。組み換え蛋白の発現に適した培養条件下で形質転換宿主細胞を培養することにより本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を製造してもよい。次いで、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーのごとき既知精製プロセスを用いて、かかる培養物（すなわち、培地または細胞抽出物）から得られた発現蛋白を精製することができる。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の精製は、ＴＮＦ−Ｒデスドメインまたは他のＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白を含有するアフィニティーカラムれ以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルまたはプロピルエーテルのごとき樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１またはそれ以上の工程；あるいは免疫アフィニティークロマトグラフィーを包含しうる。別法として、本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を、精製を容易にする形態で発現させてもよい。例えば、マルトース結合蛋白（ＭＢＰ）またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白のごとき融合蛋白として発現させてもよい。かかる融合蛋白の発現および精製用キットは、それぞれNew England BioLab(Beverly,MA)およびPharmacia(Piscataway,NJ)から市販されている。ＴＮＦ−Ｒリガンド蛋白にエピトープでタグを付して、次いで、かかるエピトープを特異的に指向する抗体を用いることにより精製を行ってもよい。１のかかるエピトープ（「フラッグ」）はKodak(New Haven,CT)から市販されている。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、懸垂したメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１またはそれ以上の逆相高品質液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いてＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をさらに精製することができる。上記精製工程のいくつかまたはすべてをさまざまに組み合わせて用いて実質的に均一な単離組み換え蛋白を得ることもできる。かくして得られたＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白は実質的に他の哺乳動物蛋白を含まず、本発明によれば「単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白」と定義される。既知の慣用的化学合成によりＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を製造してもよい。合成的手段による本発明蛋白の構築方法は当業者に知られている。ＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白に関する１次、２次もしくは３次構造および／またはコンホーメーション特性により、合成的に構築された蛋白配列は、ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤリガンド蛋白活性を包含する共通した生物学的特性を有しうる。よって、治療化合物のスクリーニングおよび抗体開発のための免疫学的プロセスにいおて、それらを天然型の精製ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の生物学的に活性のある代替物または免疫学的代替物として用いてもよい。本発明において提供されるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白は、精製ＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列によって特徴づけられる蛋白であって、該配列中への修飾が天然において存在しているかまたは人工的に誘導されている蛋白をも包含する。例えば、ペプチドまたはＤＮＡ配列における修飾を、既知方法を用いて当業者が行うことができる。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白配列中の興味ある修飾は、コーディング配列中の選択アミノ酸残基の置換、挿入または欠失を包含する。例えば、１またはそれ以上のシステイン残基が欠失または他のアミノ酸で置換されて分子のコンホーメーションを変化させるものであってもよい。かかる置換、挿入または欠失を行うための突然変異法は当業者によく知られている（例えば、米国特許第４,５１８,５８４号参照）。全体的または部分的にＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を保持していると考えられ、よってスクリーニングまたは他の免疫学的方法論に有用でありうるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の配列の他のフラグメントおよび誘導体も、本明細書開示から当業者により容易に製造されうる。かかる修飾は本発明の範囲内であると確信する。ＴＮＦ−ＲのデスドメインへのＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の結合を阻害または遮断しうる剤であって、よってＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合および／またはＴＮＦ活性の阻害剤として作用しうる剤を、本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を用いてスクリーニングしてもよい。固定化された、あるいはされていない所望結合蛋白を用いる結合アッセイは当該分野においてよく知られており、本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を用いてこの目的のために使用することができる。実施例１および３はかかるアッセイの例を説明する。適当なスクリーニングアッセイは細胞に基づくものであってもよく、あるいは無細胞で行うものであってもよい。別法として、精製蛋白に基づくアッセイを用いてかかる剤を同定してもよい。例えば、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を精製形態として担体に固定化してもよく、精製ＴＮＦ−Ｒデスドメインへの結合を、阻害剤である可能性のある剤の存在下または不存在下で測定することができる。別法として、適当な結合アッセイに担体において、固定化された精製ＴＮＦ−Ｒデスドメインならびに可溶性形態の本発明ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を使用してもよい。上記スクリーニングアッセイにいずれのＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を用いてもよい。かかるスクリーニングアッセイにおいて、ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を混合することにより第１の結合混合物を得て、第１の結合混合物中の結合量（Ｂ₀）を測定する。ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白およびスクリーニングすべき化合物または剤を混合することにより第２の結合混合物を得て、第２の結合混合物中の結合量（Ｂ）を測定する。例えば、Ｂ／Ｂ₀を計算することにより第１および第２の結合混合物中の結合量を比較する。第１の結合混合物中の結合量と比較して第２の結合混合物中の結合量の減少が観察された場合、化合物または剤はＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうると考えられる。結合混合物の処方および最適化は当業者のレベルの範囲内である。かかる結合混合物は、結合を促進または最適化するためにバッファーおよび塩類を含有していてもよく、さらなる対照アッセイが本発明スクリーニングアッセイに包含されてもよい。別法として、適当なスクリーニングアッセイは細胞に基づくものであってもよい。例えば、ＴＮＦ−Ｒリガンド蛋白とＴＮＦ−Ｒデスドメインとの間の結合または相互作用を、下記実施例１および３のごとく酵母において測定することができる。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のＴＮＦ−Ｒデスドメインへの結合を、好ましくは少なくとも１０％よりも多く、より好ましくは５０％よりも多く減少させることがわかった化合物をこのようにして同定し、次いで、インビボアッセイを包含する他の結合アッセイにおいて２次スクリーニングすることができる。これらの手段により、ＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合に対する阻害活性を有し、抗−炎症剤としての適性を有する可能性のある化合物を同定することができる。単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白は、炎症症状あるいは悪液質、自己免疫疾患、対宿主移植片反応、骨粗鬆症、大腸炎、骨髄性白血病、糖尿病、消耗性疾患およびアテローム性動脈硬化のごとき他の症状の治療、予防または改善に有用である可能性がある。単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を、それ自体ＴＮＦ −Ｒデスドメイン結合の阻害剤として用い、あるいはＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害剤の設計に用いることができる。ＴＮＦ−ＲデスドメインへのＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の結合に対する阻害剤（「ＴＮＦ−Ｒ細胞内結合阻害剤」）もまた、かかる症状の治療に有用である。本発明は、医薬組成物ならびに単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白および／またはＴＮＦ−Ｒ細胞内結合の結合阻害剤を用いる治療またはこれらの使用方法を包含する。医薬上許容される担体と混合した場合に、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤（組み換え細胞系から非組み換え細胞系（これらに限らない）に至るいかなる起源由来でもよい）を医薬組成物中に使用することができる。かかる組成物は（ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤および担体のほかに）希釈剤、充填剤、塩類、バッファー、安定化剤および当該分野においてよく知られた他の物質をさらに含有していてもよい。用語「医薬上許容される」は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない無毒の物質を意味する。担体の特性は投与経路に依存するであろう。本発明医薬組成物はサイトカイン、リンホカインまたはＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ −４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７,ＩＬ−８,ＩＬ−９、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ −ＣＳＦ；幹細胞因子およびエリスロポエチンのごとき他の造血因子を含有していてもよい。医薬組成物はさらに他の抗−炎症剤を含有していてもよい。かかるさらなる因子および／または剤を医薬組成物に含ませて単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤との相互作用を得てもよく、あるいは単離ＴＮＦ −Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤により引き起こされる副作用を最小にしてもよい。逆に、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を特定のサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗−炎症剤の処方中に含ませてサイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗−炎症剤の副作用を最小にしてもよい。本発明医薬組成物はリポソームの形態であってもよく、その中で、他の医薬上許容される担体のほかに、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤が脂質のごとき両親媒性剤と混合されており、該両親媒性剤は水溶液中のミセル、不溶性単層、液状結晶またはラメラ層として存在する。リポソーム処方に適する脂質はモノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレクチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸等を包含するが、これらに限らない。かかるリポソーム処方の調製は当業者のレベルの範囲内であり、例えば、米国特許第４,２３５,８７１号、米国特許第４,５０１,７２８号、米国特許第４,８３７,０２８号および米国特許第４,７３７,３２３号（参照によりそれらすべてを本明細書に記載されているものとみなす）に開示されているようなものである。本明細書の用語「治療上有効量」は、患者に有意な有益性を示す、すなわち、炎症性応答または症状の治療、治癒、予防または改善を示す、あるいはかかる症状の治療、治癒、予防または改善の速度を増加させる医薬組成物の各有効成分または方法の総量を意味する。単独で投与される個々の有効成分についていう場合、該用語は当該成分のみについて用いられる。有効成分の組み合わせについていう場合、該用語は、混合、逐次または同時投与にかかわらず、治療効果を生じる活性成分の総量について用いられる。本発明治療方法の実施において、治療上有効量の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を治療すべき症状を有する哺乳動物に投与する。本発明方法のみに従って、あるいはサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子を用いる治療のごとき他の療法と組み合わせて、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を投与することができる。１またはそれ以上のサイトカイン、リンホカインまたは他の造血因子と共投与する場合、単離ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗−血栓因子と同時または逐次投与することができる。逐次投与する場合、担当医は、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗−血栓因子と組み合わされた単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤の適当な投与順序を決定するであろう。医薬組成物に用いられる、あるいは本発明方法の実施に用いられる単離ＴＮＦ −Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤の投与を、経口摂食、吸入、または皮膚、皮下、または静脈注射のごとき種々の慣用的経路において行うことができる。患者への静脈投与が好ましい。治療上有効量の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を経口投与する場合、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤はカプセル、粉末、溶液またはエリキシルの形態であろう。錠剤形態で投与する場合、本発明医薬組成物はさらにゼラチンのごとき固体担体またはアジュバントを含有していてもよい。錠剤、カプセル、および粉末は、約５ないし９５％の単離ＴＮＦ −Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を含有し、好ましくは、約２５ないし９０％の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、ピーナッツ油、鉱油、大豆油もしくはゴマ油のごとき動植物起源の油脂、または合成油脂を添加してもよい。液体形態の医薬組成物はさらに生理学的セイライン溶液、デキストロースまたは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールのごときグリコール類を含有していてもよい。液体形態で投与する場合、医薬組成物は約０.５ないし９０重量％の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を含有し、好ましくは約１ないし５０％の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を含有する。治療上有効量の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を静脈注射、皮膚注射または皮下注射により投与する場合、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤はパイロジェン不含の非経口的に許容される水溶液の形態であろう。かかる非経口的に許容される蛋白溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性等に関して当業者の範囲内である。静脈、皮膚または皮下注射にとり好ましい医薬組成物は、単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤のほかに、注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル溶液、注射用デキストロースおよび注射用乳酸塩リンゲル溶液（Lactated Ringer's）のごとき等張性担体、または当該分野で知られた他の担体を含有すべきである。本発明医薬組成物は安定化剤、保存料、バッファー、抗酸化剤、または当業者に知られた他の添加物を含有していてもよい。本発明医薬組成物中の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤の量は、治療すべき症状の性質および重篤性、ならびに患者がすでに受けていた治療の性質に依存するであろう。最終的には、担当医が各患者を治療するための単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤の量を決定するであろう。最初は、担当医は低用量の単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を投与して患者の応答を観察するであろう。より高用量の単離ＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を投与していって、患者に対する最適効果を得ることができ、その時点では用量をさらに増加させない。本発明方法の実施に用いる種々の医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０.１μｇないし約１００ｍｇの単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤を含有すべきであると考えられる。本発明医薬組成物を用いる静脈投与療法の期間は、治療すべき疾病および症状の重篤性ならびに各患者の潜在的な特有の応答に依存するであろう。単離ＴＮＦ −Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白または結合阻害剤の各適用期間は１２ないし２４時間の範囲の連続静脈投与であろう。最終的には、担当医が、本発明医薬組成物を用いる静脈投与療法の適当な期間を決定するであろう。本発明単離ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を用いて動物を免疫し、ＴＮＦ− Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白に特異的に反応し、ＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうるポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得てもよい。ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤリガンド蛋白全体またはＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のフラグメントを免疫原として用いてかかる抗体を得ることができる。ペプチド免疫原はさらにカルボキシル末端にシステイン残基を含んでいてもよく、キーホール・リムペット（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）のごときハプテンに結合されている。かかるペプチドの合成方法は当該分野において知られており、例えば、R.P. Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85,2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky et al.,FE BS Lett.211,10(1987)に記載されている。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白またはＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド糖蛋白に特徴的な複合体炭水化物部分に結合するモノクローナル抗体は、ＴＮＦ−Ｒリガンド蛋白の免疫検出にとり有用な診断試薬でありうる。ＴＮＦ−Ｒ−１ＤＤリガンド蛋白またはＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド糖蛋白に特徴的な複合体炭水化物部分に結合する中和モノクローナル抗体は、炎症症状ならびにＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の異常な発現が関与するいくつかの形態の癌の治療に有用な治療剤でもありうる。これらの中和モノクローナル抗体はＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のシグナリング機能を遮断しうる。ＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白の結合を遮断することにより、ＴＮＦに対するある種の生物学的応答がなくなるかまたは著しく減少させられる。癌細胞または白血病細胞の場合、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白に対する中和モノクローナル抗体は、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白により媒介されうる癌細胞の転移拡張の検出および防止に有用でありうる。ＴＮＦ−Ｒデスドメインに結合するインスリン増殖因子結合蛋白（「ＩＧＦＢＰ−５」）およびそのフラグメントは、それらの配列の類似性により、本明細書に定義するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白である。結果として、それらは、炎症症状の治療ならびにＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白に関して上で一般的に説明したようなＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害のための医薬組成物において有用である。実施例１ＴＮＦ−Ｒデスドメインリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチドのクローニング酵母の遺伝学的選択方法である「相互作用トラップ（interaction trap）」［ Gyuris et al,Cell 75:791-803,1993（参照により本明細書に記載されているものとみなす）］を用いて、ｐ５５タイプ１のＴＮＦ受容体のデスドメイン（ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ）と相互作用する蛋白を求めてＷＩ３８細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。グラフティング（grafting）法を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりｐ５５タイプのＴＮＦ受容体であるＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤのアミノ酸３２６から４１３までをコードしているポリヌクレオチドを得た。次いで、このＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位によりｐＥＧ２０２中にクローンし、餌プラスミド（bait plasmid）ｐＥＧ−ＴＮＦ −Ｒ１−ＤＤを得た。このプラスミドはＨＩＳ３選択可能マーカーを含み、餌（ bait）の発現物であるＬｅｘ−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ融合蛋白は非常に構成的なＡＤＨ１プロモーターにより生じる。餌蛋白（bait protein）を担持しているレポーター株を作るために、染色体ＬＥＵ２のかわりにレポーター配列ＬｅｘＡｏｐ −Ｌｅｕ２を含んでいる酵母ＥＧＹ４８株を、ｐＥＧ２０２−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤならびにもう１つのレポーター配列ＬｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺを担持しているｐＳＨ１８−３４（Ｕｒａ＋）で形質転換した。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤと相互作用する蛋白をコードしているｃＤＮＡのスクリーニングのために、 Gietz et al.,Nucleic Acids Res.,20:1425(1992)により記載された方法に従ってＷＩ３８の細胞ｃＤＮＡライブラリー（ｃＤＮＡのライブラリーの構築については下記参照）を含んでいる発現ベクターｐＪＧ４−５（ＴＲＰ１）を上記株中に形質転換した。ｃＤＮＡライブラリーの構築ＷＩ３８細胞のｃＤＮＡライブラリー：Superscript Choice System(Gibco/BR L,Gaithersberg,MD)により提供された試薬を用い、以下の置き換えを行って、３ μｇのＷＩ３８ｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを調製した。オリゴｄＴ／ＸｈｏＩプライマーを用いて第１鎖の合成を行い、ｄＮＴＰミックスをメチルｄＣＴＰ含有ミックス（Stratagene,Lajolla,CA）と置き換えた。ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／ＳａｌＩアダプターリンカーを付加し、次いで、ＸｈｏＩで消化することにより両端においてｃＤＮＡを修飾した。これにより、遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ／ＳａｌＩオーバーハングを有し、３’末端にＸｈｏＩオーバーハングを有するｃＤＮＡ分子を得た。次いで、インフルエンザウイルスＨＡ１エピトープタグ、Ｂ４２酸性転写活性化ドメインおよびＳＶ４０核局在化シグナルをアミノ末端に有し、それらがすべてガラクトース−依存性ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある酵母発現／融合ベクターｐＪＧ４−５（Gyuris et al.,Cell,75, 791-803,1993）中にこれらのフラグメントを連結した。次いで、得られたプラスミドをＤＨ１０Ｂ細胞（Gibco/BRL）中に電気穿孔した。全部で７.１ｘ１０⁶個のコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に撒いた。これらのイー・コリ（E.coli）を掻き取り、プールし、次いで、Wizard Max i Prepキット（Promega,Madison,WI）を用いて大規模なプラスミド調製を行って３.２ｍｇのスーパーコイル状プラスミドＤＮＡを得た。ＷＩ３８細胞のｃＤＮＡスクリーニング結果：グルコースUra^-His^-Trp^-プレート上で１ｘ１０⁶個の形質転換体を得た。これらの形質転換体をプールし、６５％グリセロール、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂溶液に再懸濁し、１ｍＬの部分試料として −８０℃で保存した。スクリーニング目的には、ライブラリーにコードされた蛋白の発現を誘導するUra^-His^-Trp^-ＣＭドロップアウトgal/raff培地（２％ガラクトース、１％ラフィノースを含有）中にこれらの部分試料を１０倍希釈し、３０ ℃で４時間インキュベーションした。次いで、１２ｘ１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）を標準的な１０ｃｍのガラクトースX-Gal Ura^-His^-Leu^-プレート上に２ｘ１０⁵ＣＦＵ／プレートの密度で撒いた。３０℃で３日間置いた後、約１０００個のコロニー（Ｌｅｕ⁺）が生成し、それらのうち６４個のコロニーがＬａｃＺ⁺であった。Ｌｅｕ⁺／ＬａｃＺ⁺表現型がライブラリーによりコードされた蛋白によるものであるかどうかを試験するために、当該表現型のガラクトース依存性を試験した。ライブラリーによりコードされた蛋白の発現は、グルコースUra^- His^-Trp^-マスタープレート上での増殖によりスイッチオフされ、次いで、グルコースUra^-His^-Trp^-Leu^-、ガラクトースUra^-His^-Trp^-Leu^-、グルコースX-Gal Ura^- His^-Trp^-、およびガラクトースX-Gal Ura^-His^-Trp^-プレート上でガラクトース依存性について試験された。これらのうち３２個のコロニーが、Ｌｅｕ^-プレート上でのガラクトース依存的増殖ならびにＸ−Ｇａｌ含有培地上でのガラクトース依存的青色を示した（ＬａｃＺ⁺表現型）。以前に記載されている方法（Hoffman and Winston,1987）に従って、これらのコロニーから全酵母ＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡ配列を分析するために、上記酵母ＤＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡ挿入ポイントに隣り合っているベクターｐＪＧ４−５に特異的なオリゴプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ生成物を精製し（Qiagen PCR精製キット）、ＨａｅIIIでの制限的消化に供し、１.８％アガロースゲルで電気泳動し、次いで、制限パターンを比較した。類似および同一の制限パターンをグループ分けし、各グループの典型例を配列決定し、Genbankおよび他のデータベースを比較して配列相同性を同定した。ユニークな配列の１つのクローンおよび同一配列を有する３つのコロニーが単離され、Genbankおよび他のデータベースと比較して有意な配列相同性は示されなかった。さらに、ヒト・インスリン様増殖因子結合蛋白−５（Shunichi Shimazaki et al.,J.Biol.Chem.266:10646-10653(1991)）の一部分と同一配列を有する４つの他のクローン（「２０ＤＤ」）も単離した。クローン「２ＤＤ」、「３ＤＤ」および「２０ＤＤ」をさらなる分析のために選択した。全酵母ＤＮＡをイー・コリＫＣ８株中に形質転換し、Ｔｒｐ−アンピシリンプレート上での増殖に関してスクリーニングすることにより、これらのクローン配列を含んでいるライブラリーベクターｐＪＧ４−５を酵母からレスキュー（rescue）した。次いで、バイコイド（bicoid）、ＩＬ−１受容体の細胞質ドメインおよびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤを包含する異なる餌の一群を含んでいるＥＧＹ４８誘導体中にＪＧ４− ５クローンを再導入することにより、これらの推定上ＴＮＦＲ１と相互作用する蛋白を、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤとの相互作用特異性についてさらに試験した。上記クローンはＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤとのみ相互作用することがわかった。よって、これらのクローンとＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤとの間の相互作用が特異的であると判定された。Ｕ９３７ｃＤＮＡスクリーニング結果：上記のごとく、Ｕ９３７ｃＤＮＡライブラリーも構築し、スクリーニングした。１０２０個のＬｅｕ＋コロニーを見いだし、それらのうち３２６個のコロニーはＬａｃＺ＋でもあった。これらのＬｅｕ＋／ＬａｃＺ＋コロニーのうち６２個はガラクトース依存的表現型を示した。これらのクローンの１つである１ＴＵは新規配列をコードしている。興味深いことに、２７ＴＵが約８６４個のさらなるヌクレオチド（約２８８アミノ酸）をその５’末端に含んでいることがを除き、２つのクローン１５ＴＵおよび２７ＴＵは関連または同一配列をコードしている。１５／２７ＴＵも新規配列をコードしている。実施例２ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の発現適当な制限酵素を用いてＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンド蛋白をコードしているｃＤＮＡをｐＪＧ４−５ベクターから遊離させた。例えば、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩあるいはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを用いてクローン２ＤＤおよびクローン２０ＤＤからｃＤＮＡを遊離させた。制限部位がｃＤＮＡの内部配列中に存在する場合、ＰＣＲを行ってｃＤＮＡを得た。例えば、内部ＸｈｏＩ部位の存在のため、ＰＣＲにより「クローン３ＤＤ」をコードしているｃＤＮＡフラグメントを得た。次いで、これらのｃＤＮＡを種々の発現ベクター中にクローンした。これらは、イー・コリにおけるＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）またはＭＢＰ（マルトース結合蛋白）融合蛋白発現用のｐＧＥＸ（Pharmacia）またはｐＭＡＬ（New England Biolabs）、哺乳動物での発現用のｐＥＤに基づくベクター、およびバキュロウイルス／昆虫での発現用のｐＶＬまたはｐBlueBa cHis（Invitrogen）を包含していた。哺乳動物細胞におけるＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンド発現の免疫検出（immunodetection）のために、エピトープ配列「フラッグ（Flag）」をｐＥＤベクターの翻訳開始部位に挿入し、ｐＥＤ−フラッグベクターを得た。次いで、ｃＤＮＡをｐＥＤ−フラッグベクターに挿入した。かくして、ｐＥＤ−フラッグからのｃＤＮＡｃの発現により、アミノ末端のＭｅｔ、これに続く「フラッグ」配列（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ −Ａｓｐ−Ｌｙｓ）を有する蛋白を得た。標準的なＤＥＡＥ−デキストランまたはリポフェクタミン法を用いてＣＯＳまたはＣＨＯｄｕｋｘ細胞をトランスフェクションした。Ｍ２抗体（Kodak）を用いて、フラッグでタグを付した蛋白の免疫検出を行った。そのうえ、Ｍ２抗体を用いる免疫アフィニティーカラム、次いで、「フラッグ」ペプチドでの溶離を、フラッグでタグを付した蛋白の迅速精製に用いることができる。同様に、グルタチオン、アミロース、またはニッケルカラムを用いてＧＳＴ−またはＭＢＰ−またはＨｉｓタグを付した融合蛋白のアフィニティー精製を行うことができる。多くの融合蛋白については、スロンビン因子Ｘａの作用またはエンテロキナーゼ開裂によりＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンドを遊離させることができる。高度に精製された材料が必要な場合には、アフィニティー精製工程のほかにイオン交換、疎水性クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーのごとき標準的手順が適用されるであろう。図１および図２は、酵母および哺乳動物細胞におけるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の発現のオートラジオグラムを示す。図１は、酵母における本発明単離クローンの発現結果を示す。クローン２ＤＤ、３ＤＤまたは２０ＤＤを含むｐＪＧ４−５でＥＧＹ４８を形質転換した。次いで、細胞をガラクトース／ラフィノース培地中で一晩増殖させた。細胞溶解物を調製し、４−２０％ＳＤＳゲル電気泳動に供し、次いで、抗−ＨＡ抗体（12CA5,Boehringer Mannheim,Indianapolis ,IN）を用いるウェスタンブロット分析に供した。図２は、ＣＯＳ細胞におけるフラッグ−２ＤＤおよびフラッグ−２０ＤＤの発現結果を示す。リポフェクタミン法により、ｐＥＤ−フラッグ（ベクター対照）、フラッグ−２ＤＤまたはフラッグ−２０ＤＤプラスミドを用いてＣＯＳ細胞をトランスフェクションした。３０μｇの各細胞溶解物を調製し、４−２０％ＳＤＳゲル電気泳動に供し、次いで、Ｍ２抗体（Kodak）を用いるウェスタンブロット分析に供した。フラッグ−２ＤＤおよびフラッグ−２０ＤＤレーンにおけるバンドは、それぞれのＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の有意な発現を示す。実施例３ＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の分析２つの異なる方法を用いてＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性のアッセイを行った。第１のアッセイは「相互作用トラップ（interaction trap）」において酵母株における結合を測定するものであり、ここに用いた系はＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤと相互作用する蛋白をスクリーニングするためのものであった。この系において、ＬｅｘＡｏｐ−Ｌｅｕ２およびＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺ双方からのレポーター遺伝子の発現は、餌蛋白（この場合ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ）と獲物（pray）（ＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンド）との間の相互作用に依存する。よって、Ｌｅｕ２またはＬａｃＺ発現のレベルによって相互作用の強さを測定することができる。最も単純な方法はＬａｃＺによりコードされる蛋白であるβ−ガラクトシダーゼ活性を測定することである。Ｘ−Ｇａｌ含有培地またはフィルター上の青さの程度によってこの活性を判定することができる。β−ガラクトシダーゼ活性の定量的測定については、”Methods in Yeast Genetics”Cold Spring Harbor,New York,1990（Rose,M.D.、Winston,F.およびHieter,P.による）中に標準的アッセイが見いだされる。結合を測定するための第２のアッセイは無細胞系である。典型的なアッセイの例を下に説明する。精製ＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ融合蛋白（２μｇ）を、ＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ細胞内リガンドと結合したアミロース樹脂と４℃で２時間混合した。次いで、混合物を遠心分離して結合ＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ（ビーズとともに存在）と未結合ＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤ（上清中に存在）とを分離した。十分に洗浄後、マルトースを用いて結合ＧＳＴ−ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤを溶離し、ＧＳＴ抗体を用いるウェスタンブロット分析により検出した。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤまたは細胞内リガンドを、プレートまたはフルオロビーズのごとき他の固体支持体に固定化することもできる。次いで、ＥＬＩＳＡまたはＳＰＡ（シンチレーション近接アッセイ（scintillation proximity assay））を用いて結合を測定することができる。実施例４ＴＮＦ−Ｒデスドメインリガンド蛋白の特徴づけＴＮＦ−Ｒ１における相互作用部位のマッピングＴＮＦ−Ｒシグナリングについて鍵となる多くのアミノ酸が部位特異的突然変異法により決定されている（Tataglia et al.,Cell 74:845-853(1993)）。これらのアミノ酸はＴＮＦ−ＲとＦａｓ抗原との間で保存されており、Ｆａｓ抗原は細胞毒性および他の細胞応答に必要とされるものである。ＴＮＦ−Ｒ細胞内蛋白がこれらの残基と相互作用するかどうかを試験するために、以下の突然変異を構築した：Ｆ３４５Ａ（アミノ酸３４５におけるＰｈｅのＡｌａへの置換）、Ｒ３４７Ａ、Ｌ３５１Ａ、Ｆ３４５Ａ／Ｒ３４７Ａ／Ｌ３５１Ａ、Ｅ３６９Ａ、Ｗ３７８ＡおよびＩ４０８Ａ。「相互作用トラップ」系において変異蛋白が細胞内リガンドと相互作用する能力を試験した。ＴＮＦにより伝達される応答に対する影響リガンドを過剰発現している細胞において、ＴＮＦにより伝達される応答に対するＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンドの影響を評価することができる。一時的または長期の応答を包含する多くのＴＮＦにより伝達される応答を測定することができる。例えば、ＴＮＦにより誘導されるＭＢＰ（ミエリン塩基性蛋白）またはｃ−ｊｕｎのＮ−末端（アミノ酸１−７９）のいずれかに対するキナーゼ活性を、一時的または安定にクローン２ＤＤ、３ＤＤまたはクローン２０ＤＤを過剰発現するＣＯＳまたはＣＨＯ細胞において測定することができる。ＴＮＦにより伝達される細胞毒性および他の細胞応答におけるこれらのリガンド蛋白の重要性をＬ９２９またはＵ９３７過剰発現細胞において測定することができる。別法として、ＴＮＦとの長時間インキュベーション後の遺伝子発現またはＰＧＥ₂産生の誘導のごとき他の機能のアッセイを用いてＴＮＦにより伝達される応答を測定することもできる。逆に、ＴＮＦシグナリングにおけるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の重要性を、リガンド発現の低下または除去により確認することができる。アンチセンス発現またはトランスジェニックマウスを用いてこれらの実験を行うことができる。酵素または機能のアッセイ受容体へのＴＮＦ結合により開始されるシグナルトランスダクションについてはまだ大部分が不明である。しかしながら、ＴＮＦ結合の１の主要結果は、細胞のセリン／スレオニンキナーゼ活性の刺激である。さらに、ＴＮＦは、ＰＣ−ＰＬＣ、ＰＬＡ₂、およびスフィンゴミエリナーゼの活性を刺激することが示されている。それゆえ、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白のいくつかは、これらの活性の原因となる本質的な酵素活性を有している可能性がある。それゆえ、特に、既知酵素に対して相同的な配列を有する蛋白をコードしているクローンに関して酵素のアッセイを行ってこの可能性を試験することができる。酵素のアッセイのほかに、既知機能を有する蛋白に対する配列相同性に基づいて他の機能のアッセイを行うこともできる。実施例５全長のクローンの単離多くの場合、相互作用トラップ法により得られたｃＤＮＡは、それぞれが全長の蛋白の一部分のみをコードしている。例えば、同一性および配列および開始メチオニンコドンの欠落に基づくと、クローン２ＤＤ、３ＤＤおよび２０ＤＤは明らかに全長の蛋白をコードしていない。それゆえ、全長のクローンを単離することが望ましい。クローン２ＤＤのごときスクリーニングにより得られたｃＤＮＡをプローブとして用い、既知方法（例えば、Sambrookらによる"Molecular Cloni ng,A Laboratory Manual",1989 Cold Spring Harbor）に従って本明細書記載のｃＤＮＡライブラリー、あるいはまたファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして全長のクローンを得る。実施例６ＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンド蛋白に特異的な抗体実施例２記載のごとく、精製組み換え蛋白を抗原として用いてＴＮＦ−Ｒ細胞内リガンド蛋白に特異的な抗体を得ることができる。Ed HarlowおよびDavid Lan eによる"Antibodies,a Laboratory Manual"(1988),Cold Spring Harbor Laborat oryに記載されたような標準的方法を用いるとポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方が得られるであろう。実施例７クローン１ＴＵおよび１５／２７ＴＵの特徴づけ相互作用の特異性餌のパネルを用いてクローン１ＴＵ、１５ＴＵおよび２７ＴＵの特異性を試験した。これらのクローンのＴＮＦ−Ｒデスドメインへの結合能を、第２のＴＮＦ −Ｒの細胞内ドメイン（ＴＮＦ−Ｒｐ７５_IC）、ＴＮＦ−Ｒの細胞内ドメイン全体（ＴＮＦ−Ｒｐ５５_IC）、ｆａｓ抗原のデスドメイン（ＴＮＦ−Ｒ−ＤＤと２８％の相同性がある）（Ｆａｓ_DD）、ショウジョウバエの転写因子バイコイド、およびシグナリングにとり重要であることが知られているＩＬ−１受容体の領域（ＩＬ−１Ｒ_477-527）へのそれらの結合と比較した。表１に示すように、これらのクローンはＴＮＦ−Ｒｐ７５_ICまたはＦａｓ_DDと相互作用せず、１ＴＵのみがバイコイドと相互作用した。対照的に、１ＴＵおよび１５ＴＵは両方ともｐ５５ＴＮＦ−Ｒの細胞質ドメインならびにＩＬ−１Ｒの残基４７７−５２７に結合した。２７ＴＵはこれらの配列と比較的弱く相互作用した。シグナリングに重要なアミノ酸との相互作用各クローンがＴＮＦ−Ｒデスドメインの４種の単一部位変異体（それぞれはシグナリングを行わないことがわかっている）と反応する能力を測定した。表２に示すように、各クローンは、野生型デスドメインと比較するとデスドメイン変異体とはあまり強力に相互作用せず、これらのクローンはインビボにおいて重要な残基に結合しうることが示された。１ＴＵ、１５ＴＵおよび２７ＴＵの発現図３は、酵母（Ａ）およびＣＯＳ細胞（Ｂ）における１ＴＵ、１５ＴＵおよび２７ＴＵの発現を示すオートラジオグラフである。（Ａ）：クローン１ＴＵ、１５ＴＵまたは２７ＴＵを含むｐＪＧ４−５でＥＧＹ４８を形質転換した。次いで、細胞をガラクトース／ラフィノース培地で一晩増殖させた。細胞溶解物を調製し、４−２０％ＳＤＳゲル電気泳動に供し、次いで、抗−ＨＡ抗体（１２ＣＡ５,Boehringer Mannheim）を用いるウェスタンブロット分析に供した。（Ｂ）：クローン１ＴＵ、１５ＴＵまたは２７ＴＵを含むｐＥＤ−フラッグでＣＯＳ細胞を形質転換した。細胞溶解物を調製し、抗−フラッグ抗体（Ｍ２，Ko dak）を用いるウェスタンブロット分析に供した。ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤへの１ＴＵおよび２７ＴＵの特異的結合ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤとの１ＴＵおよび２７ＴＵの相互作用を、細菌で発現された精製融合蛋を用いて試験した。図４に示すように、１ＴＵまたは２７ＴＵを含むＭＢＰ融合蛋白は、ＧＳＴ融合蛋白として発現されたＴＨＦ−Ｒ１−ＤＤにのみ結合したが、ＧＳＴ蛋白のみには結合しなかった。対照実験において、ＭＢＰ蛋白はＧＳＴまたはＧＳＴ／ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤのいずれにも結合しなかった。これらの結果は、１ＴＵおよび２７ＴＵはインビトロにおいてＴＮＦ−Ｒ１デスドメインに特異的に結合することを示し、相互作用トラップにおいて得られたデータを確認するものである。ＪＮＫ活性に対する１５ＴＵおよび２７ＴＵ活性化通常はｊｕｎＮ末端キナーゼ（ＪＮＫ）はＣＯＳ細胞において、ＴＮＦ処理により１５分以内で活性化される。２並行系において、１５ＴＵおよび２７ＴＵを、エピトープタグを付したバージョンのＪＮＫ、ＨＡ−ＪＮＨで同時トランスフェクションした。ＴＮＦ処理後、ＪＮＫを抗−ＨＡ抗体とともに免疫沈降させ、基質としてＧＳＴ−ｃ−ｊｕｎ（アミノ酸１−７９）を用いる免疫沈降キナーゼアッセイにおいてＪＮＫ活性を測定した。反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動した。図５に示すように、ＣＯＳ細胞中への１５ＴＵおよび２７ＴＵのトランスフェクション（ベクターのみの場合を除く）によってＴＮＦ不存在下においてさえもＪＮＫが活性化され、これらのクローンが、インビボでのＴＮＦのシグナルトランスダクションおよびＪＮＫ活性化を引き起こす経路に関与していることが示される。実施例８クローン３ＴＷの単離、発現およびアッセイクローン３ＤＤをプローブとして用いてＷＩ３８ｃＤＮＡライブラリーからクローン３ＴＷを単離した。クローン３ＴＷを発現させた。図６は、３ＴＷの発現を示すオートラジオグラフである。アンチセンスオリゴヌクレオチドはクローン３ＴＷの配列由来のものであった。アンチセンスオリゴヌクレオチドをアッセイして、ＴＮＦにより誘導されるｃＰＬＡ₂ホスホリレーション阻害能をアッセイした。図７はその実験結果を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチド（３ＴＷＡＳ）の活性を全長のクローン（３ＴＷＦＬ）、フラッグ−３ＴＷ全長（３ＴＷＦＬフラッグ）およびｐＥＤ−フラッグベクター（Ｐｅｄフラッグ）と比較した。アンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホリレーションを阻害した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ (31)優先権主張番号０８／５３３，９０１ (32)優先日 1995年９月26日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ (72)発明者スチーベラ，アンドレア・アールアメリカ合衆国01890マサチューセッツ州ウィンチェスター、エドワード・ストリート39番 (72)発明者グラハム，ジェイムズアメリカ合衆国02144マサチューセッツ州サマービル、フォスケット・ストリート 28番

Claims

【特許請求の範囲】１．ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしている単離ポリヌクレオチドを含んでなる組成物。２．該ポリヌクレオチドが、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド２からヌクレオチド１２３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｅ）厳密な条件下で（ａ）−（ｄ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項１の組成物。３．該ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号：３のヌクレオチド２からヌクレオチド４１５までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｅ）厳密な条件下で（ａ）−（ｄ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項１の組成物。４．該ポリヌクレオチドが発現制御配列に作動可能に連結されているものである請求項１の組成物。５．請求項４の組成物で形質転換された宿主細胞。６．哺乳動物細胞である請求項５の宿主細胞。７．（ａ）請求項５の宿主細胞を適当な培地中で増殖させ；次いで、（ｂ）培養物からＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白を精製することを特徴とするＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の製造方法。８．ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白を含んでなる組成物。９．該蛋白が、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、実質的に他の哺乳動物蛋白を含まないものである請求項８の組成物。１０．該蛋白が、（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、実質的に他の哺乳動物蛋白を含まないものである請求項８の組成物。１１．該蛋白が、（ａ）配列番号：６のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、実質的に他の哺乳動物蛋白を含まないものである請求項８の組成物。１２．さらに医薬上許容される担体を含んでなる請求項８の組成物。１３．請求項８のＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白と特異的に反応する抗体を含んでなる組成物。１４．（ａ）ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白を請求項８の組成物と混合し、該混合により第１の結合混合物を得て；（ｂ）第１の結合混合物中のＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白とＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白との間の結合量を測定し；（ｃ）化合物をＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白と混合して第２の結合混合物を得て；（ｄ）第２の結合混合物中の結合量を測定し；次いで、（ｅ）第１の結合混合物中の結合量を第２の結合混合物中の結合量と比較することを特徴とするＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害剤の同定方法であって、第２の結合混合物の結合量が減少した場合は、該化合物がＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうるものである方法。１５．該ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白が、（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメント；（ｃ）配列番号：４のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメント；（ｅ）配列番号：６のアミノ酸配列；（ｆ）配列番号：６のアミノ酸配列のフラグメント；（ｇ）配列番号：８のアミノ酸配列；および（ｈ）配列番号：８のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである請求項１４の方法。１６．治療上有効量の請求項１２の組成物を投与することを特徴とする炎症症状の予防または改善方法。１７．請求項７の方法により製造されるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白。１８．治療上有効量の請求項１２の組成物を投与することを特徴とするＴＮＦ −Ｒデスドメイン結合の阻害方法。１９．医薬上許容される担体ならびにＩＧＦＢＰ−５およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するそのフラグメントからなる群から選択される蛋白を含んでなる治療上有効量の組成物を哺乳動物対象に投与することを特徴とする炎症症状の予防または改善方法。２０．医薬上許容される担体ならびにＩＧＦＢＰ−５およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するそのフラグメントからなる群から選択される蛋白を含んでなる治療上有効量の組成物を哺乳動物対象に投与することを特徴とするＴＨＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害方法。２１．請求項１４の方法により同定される阻害剤を含んでなる組成物。２２．さらに医薬上許容される担体を含んでなる請求項２１の組成物。２３．治療上有効量の請求項２２の組成物を哺乳動物対象に投与することを特徴とする炎症症状の予防または改善方法。２４．治療上有効量の請求項２２の組成物を哺乳動物対象に投与することを特徴とするＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合の阻害方法。２５．医薬上許容される担体ならびにＩＧＦＢＰ−５およびＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するそのフラグメントからなる群から選択される蛋白を含んでなる組成物。２６．（ａ）ＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白をコードしている第１のポリヌクレオチド、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしている第２のポリヌクレオチド、および少なくとも１のレポーター遺伝子で細胞を形質転換し、第１のポリヌクレオチドによりコードされているＴＮＦ−Ｒデスドメイン蛋白への第２のポリヌクレオチドによりコードされているＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白の結合によってレポーター遺伝子の発現が調節されるものであり；（ｂ）化合物の存在下および不存在下で細胞を増殖させ；次いで、（ｃ）該化合物の存在下および不存在下でレポーター遺伝子の発現の程度を比較することを特徴とするＴＮＦ−Ｒデスドメインの阻害剤の同定方法であって、レポーター遺伝子の発現程度の低下が生じた場合は、該化合物がＴＮＦ−Ｒデスドメイン結合を阻害しうるものである方法。２７．第２のポリヌクレオチドが、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド２からヌクレオチド１２３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号：３のヌクレオチド２からヌクレオチド４１５までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｆ）配列番号：３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｇ）配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｈ）配列番号：４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｉ）配列番号：５のヌクレオチド２からヌクレオチド５５９までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｊ）配列番号：５のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｋ）配列番号：６のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｌ）配列番号：６のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｍ）配列番号：７のヌクレオチド５７からヌクレオチド８７５までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｎ）配列番号：７のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｏ）配列番号：８のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｐ）配列番号：８のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１ −ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｑ）厳密な条件下で（ａ）−（ｐ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つとハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤリガンド蛋白活性をコードしているポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項２６の方法。２８．細胞が酵母細胞である請求項２６の方法。２９．該ポリヌクレオチド配列が（ａ）配列番号：９のヌクレオチド２からヌクレオチド９３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：９のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｅ）厳密な条件下で（ａ）−（ｄ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項１の組成物。３０．該ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号：１１のヌクレオチド２からヌクレオチド１８２２までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：１１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｅ）厳密な条件下で（ａ）−（ｄ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項１の組成物。３１．該蛋白が、（ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、実質的に他の哺乳動物蛋白を含まないものである請求項８の組成物。３２．該蛋白が、（ａ）配列番号：１２のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、実質的に他の哺乳動物蛋白を含まないものである請求項８の組成物。３３．該ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白が、（ａ）配列番号：１０のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメント；（ｃ）配列番号：１２のアミノ酸配列；および（ｄ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである請求項１４の方法。３４．第２のポリヌクレオチドが、（ａ）配列番号：９のヌクレオチド２からヌクレオチド９３１までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号：９のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性をコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：１０のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｅ）配列番号：１１のヌクレオチド２からヌクレオチド１８２２までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；（ｆ）配列番号：１１のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｇ）配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｈ）配列番号：１２のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｉ）厳密な条件下で（ａ）−（ｈ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つとハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項２６の方法。３５．該ポリヌクレオチド配列が、（ａ）配列番号：１３のヌクレオチド３からヌクレオチド２８４６までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ｂ）配列番号：１３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｅ）厳密な条件下で（ａ）−（ｄ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項１の組成物。３６．該蛋白が、（ａ）配列番号：１４のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、実質的に他の哺乳動物蛋白を含まないものである請求項８の組成物。３７．該ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白が、（ａ）配列番号：１４のアミノ酸配列；および（ｂ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである請求項１４の方法。３８．第２のポリヌクレオチドが、（ａ）配列番号：１３のヌクレオチド３からヌクレオチド２８４６までのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド（ｂ）配列番号：１３のヌクレオチド配列のフラグメントを含んでなるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなるＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号：１４のアミノ酸配列のフラグメントを含んでなりＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白活性を有するＴＮＦ−Ｒ１−ＤＤリガンド蛋白をコードしているポリヌクレオチド；および（ｅ）厳密な条件下で（ａ）−（ｄ）に示したポリヌクレオチドのいずれか１つにハイブリダイゼーションしうるポリヌクレオチドであって、ＴＮＦ−Ｒ１− ＤＤリガンド蛋白活性を有する蛋白をコードしているポリヌクレオチドからなる群より選択されるものである請求項２６の方法。