DE3752391T2

DE3752391T2 - Rattenproteinkinase C und Verfahren zur Herstellung

Info

Publication number: DE3752391T2
Application number: DE3752391T
Authority: DE
Inventors: Yoshitaka Ono; Tsutomu Kawanishi Kurokawa; Koichi Sakyo-ku Igarashi; Yasutomi Nishizuka
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-06-27
Filing date: 1987-06-26
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2007-06-27
Also published as: ATE347592T1; JPS642572A; DE3751893T2; JP2593476B2; CA1341288C; ATE142256T1; DE3751893D1; EP0251244A3; JP3146352B2; JPH11123084A; EP0251244A2; DE3752391D1; ES2093600T3; EP0251244B1; EP0686695A1; US5219748A; EP0686695B1

Description

Hintergrund der Erfindung
(a) Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Phosphorylierungsenzym eines calcium- und phospholipidabhängigen Proteins (hierin nachstehend kurz Proteinphosphorylierungsenzym C oder Proteinkinase C genannt) und auf eine Technik mit rekombinanter DNA zur Herstellung desselben, insbesondere auf Ratten-Kinase C.
(b) Beschreibung des Standes der Technik
Von zahlreichen Arten biologisch aktiver Substanzen, wie etwa Zellwachstumsfaktoren, Hormone und Neurotransmitter, ist bekannt, dass sie an der Ausübung verschiedener Funktionen und den Anpassungsphänomen lebender Organismen beteiligt sind. Diese extrazellulären Signale werden durch intrazelluläre Mediatoren wie etwa cyclisches AMP (cAMP), cyclisches GMP (cGMP), Diacylglycerin (DG) und Calcium (Ca⁺⁺) ausgeübt. Es ist erkannt worden, dass DG als Ergebnis eines Inositphospholipidabbaus in Zellmembranen durch eine Anzahl Hormone und Neurotransmitter erzeugt wird, welche für die Aktivierung von Zellfunktionen verantwortlich sind. Es wird angenommen, dass die Aktivierung verschiedener Zellfunktionen und der Zellvermehrung durch die Phosphorylierung verschiedener intrazellulärer Proteine mit einem Proteinkinase-C-Enzym erreicht wird, welches durch DG in Gegenwart von Ca⁺⁺ aktiviert wird. Somit ist Proteinkinase C ein Enzym, dass im Mechanismus der Hauptinformationsweiterleitung externer Signale eine wichtige Rolle spielt. Das aus Rattenhirnen isolierte Enzym ist ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von pH 5,6 und einem Molekulargewicht von ungefähr 77000. Dieses Enzym setzt sich aus einem einzelnen Peptid mit einer hydrophoben Region, die als Bindungsstelle zu Zellmembranen dient, und einer hydrophilen Region zusammen, in der das aktive Zentrum vorliegt. Die Proteinkinase C befindet sich normalerweise in einer inaktiven Form, wird aber durch Calcium, Phosphatidylserin und DG aktiviert. Von ATP ist bekannt, dass es als Phosphorsäuredonor dient.
So führt die Proteinkinase C die Weiterleitung extrazellulärer Signale in Zellen durch die Phosphorylierung von Proteinen als eine Proteinkinase aus und ist deshalb eines der unverzichtbaren Enzyme beim Untersuchen des Empfangs extrazellulärer Signale und dem Weiterleitungsmechanismus und ist ein sehr wertvolles Reagenz. Das Enzym wird auch durch tumorfördernde Phorbolester direkt aktiviert. Von Phorbolestern ist bekannt, dass sie nicht nur die Förderung der Karzinogenese bewirken, sondern auch an verschiedenen biologischen Reaktionen, wie etwa Zellmitose und -differenzierung, Enzyminduktion und Beschleunigung des Lipidstoffwechsels, teilnehmen. Unter diesen Umständen besteht die große Möglichkeit, dass die Proteinkinase C in erkrankten Zellen oder Tumorzellen, die sich aus Störungen beim Mechanismus der Weiterleitung von Zellsignalen ergeben, zu einem wichtigen Indexenzym wird und dass Antikörper auf die Proteinkinase C als diagnostische und Untersuchungsreagenzien verwendet werden. Zu diesen Zwecken ist es erforderlich, eine große Menge Human-Proteinkinase C bereitzustellen. Natürliche Human-Proteinkinase C kommt jedoch nur in geringer Menge vor. Der Erhalt der Human-Proteinkinase C aus menschlichem Gewebe umfaßt weiterhin verschiedene Probleme und ist äußerst schwierig. Deshalb sind die Aminosäurensequenz von Human-Proteinkinase C und die DNA-Sequenz des Human-Proteinkinase-C-Gens noch nicht bestimmt worden.
Andererseits wird im Hinblick auf Proteinkinase C, die aus verhältnismäßig leicht erhältlichen tierischen Materialien stammt, zum Beispiel eine Proteinkinase C aus Rattenhirnen gereinigt. Die Aminosäurensequenz und die Gen-DNA-Sequenz der Ratten-Proteinkinase C sind jedoch noch nicht bestimmt worden. Es ist auch sehr schwierig, Ratten-Proteinkinase C in großer Menge zu erhalten.
Wie vorstehend beschrieben, verbleibt eine Anzahl unbekannter Punkte hinsichtlich der Eigenschaften, der Aminosäurensequenz und des Ratten-Proteinkinase-C-Gens. Es ist deshalb äußerst erwünscht, das für die Proteinkinase C kodierende Gen aufzuklären und ein Herstellungsverfahren für das Protein als Reagenz und Untersuchungsmittel durch rekombinante Gentechniken bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Proteine von Tieren mit einer Ähnlichkeit zum Menschen zeigen auch bei der Aminosäurensequenz eine hohe Homologie. Der größere Teil der Unterschiede bei den Aminosäuren wird nur durch eine Punktmutation der Kodons eingeführt. So haben die Erfinder eine aus Rattenhirn stammende Proteinkinase C, die ein leicht erhältliches Material ist, gereinigt, deren Aminosäurensequenz bestimmt und die DNA-Sequenz des Ratten-Proteinkinase-C-Gens aufgeklärt: Die DNA-Sequenz des Ratten-Proteinkinase-C-Gens wird in Beispiel 1, 2 und 4 im Einzelnen beschrieben, und die RNA-Squenz und die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz werden in 2 und 8 dargestellt.
Obschon eine Anzahl DNA-Sequenzen für die DNA-Sequenz des klonierten Ratten-Proteinkinase-C-Gens durch Kodondegenerierung möglich ist, wird von einem Teil der DNA-Sequenz angenommen, dass er der DNA-Sequenz von Human-Proteinkinase C ziemlich ähnlich ist. Auf der Grundlage dieser Annahme haben die Erfinder zuerst das Ratten-Proteinkinase-C-Gen kloniert und haben das Human-Proteinkinase-C-Gen aus menschlichen Zellen mittels einer cDNA kloniert, die aus dem klonierten Ratten-Proteinkinase-C-Gen als DNA-Sonde erhalten wurde. Durch Aufbauen einer rekombinanten DNA mit dem Human-Proteinkinase-C-Gen und durch Kultivieren einer Transformante, die mit der rekombinanten DNA transformiert wurde, wird Human- Proteinkinase C erzeugt. Im Hinblick auf die vorangehenden Befunde haben die Erfinder eine weitere Untersuchung angestellt und haben die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
Die vorliegende Erfindung stellt Folgendes bereit:

(1) Eine Rattenproteinkinase C, bei der es sich um ein Polypeptid handelt, das die in 4 dargestellte Sequenz von 673 Aminosäuren umfasst,
(2) eine rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die für eine Rattenproteinkinase C codiert, bei der es sich um ein Polypeptid handelt, das die in 4 dargestellte Sequenz von 673 Aminosäuren umfasst,
(3) eine Transformante, die mit einem Vektor mit einer DNA transformiert ist, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine Rattenproteinkinase C codiert, bei der es sich um ein Polypeptid handelt, das die in 4 dargestellte Sequenz von 673 Aminosäuren umfasst,
(4) ein Verfahren zur Herstellung einer Rattenproteinkinase C, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transformante (3) in einem Kulturmedium kultiviert wird, wodurch die Rattenproteinkinase C in der Kultur akkumuliert wird, und diese isoliert wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen:
1 zeigt die Aminosäurensequenzen der vier Peptidfraktionen, die aus Ratten-Proteinkinase C in Beispiel 1(1) erhalten wurden;
2 zeigt die Nukleotidsequenz von Ratten-Proteinkinase-C-cDNA und die aus der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäurensequenz;
3 ist eine schematische Darstellung, in der die Art der Überlappung der in Beispiel 3 erhaltenen beiden Typen von Rattenproteinkinase-C-Klonen veranschaulicht ist;
4 zeigt die gesamte Nucleotidsequenz der cDNA für Rattenhirn-Proteinkinase C vom Typ I (β-1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz, wobei der Bereich im Kästchen eine zusätzliche Nucleotidsequenz zeigt, die zum Typ I (β-1) hinzugefügt wurde, und die so hinzugefügte Nucleotidsequenz ist die gesamte Nucleotidsequenz vom Typ II (β-2),
5 ist ein Schema zur Konstruktion des Plasmids zur Expression der Rattenhirn-Proteinkinase C in tierischen Zellen,
6 zeigt ein Aktivitätsmuster von Proteinkinase C in einer Mono-Q-Säulenchromatographie von Zellplasmafraktionen, die von transfizierten und nichttransfizierten Zellen stammen, wobei A von mit pTB652 transfizierten Zellen stammt, B von mit pTB653 transfizierten Zellen stammt, C von nicht transfizierten Zellen stammt,
7 zeigt ein Autoradiogramm des Antikörperproteins, das mittels Gelelektrophorese an SDS-Polyacrylamid isoliert und mit einem Antiproteinkinase-C-Antikörper umgesetzt wurde, wobei a aus Rattenhirnen isolierte Proteinkinase C ist, b von nicht transfizierten Zellen stammt, c von mit pTB652 transfizierten Zellen stammt, d von mit pTB653 transfizierten Zellen stammt, und
8 zeigt ein Muster der Proteinkinase-C-Aktivität bei einer an Hydroxylapatit erfolgenden Säulenchromatographie einer aktiven Fraktion aus einer an einer Mono-Q-Säule erfolgenden Chromatographie von zytoplasmischen Fraktionen, die von transfizierten und nicht transfizierten Zellen stammen, wobei A von mit pTB707 transfizierten Zellen stammt, B von mit pTB708 transfizierten Zellen stammt, C von nicht transfizierten Zellen stammt, D Rattenhirn-Proteinkinase C ist.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die oben beschriebene DNA (2') zur Expression von Rattenprotein-Kinase C kann vorzugsweise die in 4 gezeigte DNA-Sequenz haben.
Ein Expressionsvektor, der eine DNA enthält, die eine Nucleotidsequenz aufweist, welche für das Polypeptid einer Rattenprotein-Proteinkinase C gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte einschließt:

(a) das Abtrennen einer für eine Rattenproteinkinase C codierenden RNA,
(b) die Herstellung einer einsträngigen komplementären DNA (cDNA) und dann einer doppelsträngigen DNA aus der RNA,
(c) das Insertieren der komplementären DNA in ein Plasmid,
(d) das Transformieren eines Wirts mit dem rekombinanten Plasmid,
(e) nach dem Kultivieren der so erhaltenen Transformante das Isolieren eines Plasmids, das die gewünschte DNA enthält, aus der Transformanten durch ein beliebiges geeignetes Verfahren wie ein Koloniehybridisierungsverfahren unter Verwendung einer Ratten-cDNA als Sonde,
(f) das Ausschneiden der gewünschten geklonten DNA aus dem Plasmid und
(g) das Ligasieren der geklonten DNA an ein Vehikel in einer Position stromabwärts vom Promotor.

Die für die Rattenproteinkinase C codierende RNA kann aus verschiedenen Rattenproteinkinase C erzeugenden Zelllinien wie von Rattenhirn stammenden Zellen und Rattenfibroblasten erhalten werden.
Als Verfahren zum Herstellen von RNA aus einer Ratten-Proteinkinase C produzierenden Zellinie kann das Guanidinthiocyanat-Verfahren [Chirgwin, J.M., Biochemistry 18, 5294 (1979)] angeführt werden.
Mittels der auf diese Weise erhaltenen RNA als Matrize wird mit einem reversen Transkriptionsenzym gemäß einem Verfahren zum Beispiel von Okayama, H. et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1982); ibid. 3, 280 (1980] eine cDNA hergestellt. Die resultierende cDNA wird in ein Plasmid insertiert.
Das Plasmid, in das die cDNA inseriert werden soll, kann zum Beispiel von E. coli stammendes pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene 19, 259 (1982)] und von Bacillus subtilus stammendes pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication 112, 678 (1983)] sein. Andere Plasmide können verwendet werden, so lang sie in einem Wirt repliziert werden können.
Als Verfahren zum Inserieren der cDNA in ein Plasmid kann das in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 239 (1982), erwähnte Verfahren von Maniatis, T. et al. angeführt werden.
Das Plasmid, in das eine cDNA inseriert wurde, kann eines sein, das unter Verwendung einer cDNA-Bank (von Dr. Okayama, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, USA, erhältlich) mittels E. coli x1776 als Wirt erhalten wurde und durch Inserieren einer cDNA, die aus normaler mRNA diploider Rattenzellen hergestellt wurde, in einen pCD-Vektor erhalten wurde [Okayama et al., Molecular Cell. Biology 3, 280 (1983)].
Mit dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid wird anschließend ein geeigneter Wirt wie etwa ein der Gattung Escherichia oder Bacillus angehörender Mikroorganismus transfiziert.
Beispiele der Gattung Escherichia angehörender Mikroorganismen schließen Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39, 440 (1954)] ein.
Beispiele der Gattung Bacillus angehörender Mikroorganismen schließen Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Molecular Biology 95, 87 (1984)] ein.
Ein Verfahren zur Transformation kann zum Beispiel das Calciumchloridverfahren oder Calciumchlorid/Rubidiumchloridverfahren von Maniatis, T. et al. ["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 249 (1982)] sein.
Aus den auf diese Weise erhaltenen Transformanten werden die gewünschten Klone durch irgendein bekanntes Verfahren, zum Beispiel ein Koloniehybridisierungsverfahren [Gene 10, 63 (1980)] und ein DNA-Basensequenz-Bestimmungsverfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977); Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] ausgelesen.
Auf die vorstehende Weise kann ein Mikroorganismus erhalten werden, der einen Vektor trägt, der eine klonierte DNA mit einer Nukleotidsequenz enthält, die für die Ratten-Proteinkinase C kodiert.
Anschließend wird das Plasmid aus dem Mikroorganismus isoliert.
Als Isolierungsverfahren kann das Alkaliverfahren [Birmboim, H. C. et al., Nucleic Acids Research 1, 1513 (1979)] angeführt werden.
Das Plasmid mit der klonierten DNA mit einer Nukleotidsequenz, die für die Ratten-Proteinkinase C kodiert, wird so wie sie ist isoliert oder wird gewünschtenfalls mit einem Restriktionsenzym ausgeschnitten.
Das klonierte Gen wird mit einem zu dessen Exprimierung geeigneten Träger (Vektor) an einer Stelle stromabwärts seiner Promotorregion ligiert, um dadurch einen Exprimierungsvektor zu erhalten.
Als Vektor können von E. coli stammende Plasmide wie etwa pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, von Bacillus subtilis stammende Plasmide wie etwa pUB110, pTP5 und pC194, aus Hefe stammende Plasmide wie etwa pSH19 und p5H15, Bakteriophagen wie etwa der λ-Phage und tierische Viren wie etwa Retroviren und Vacciniaviren angeführt werden.
Das Gen kann am 5'-Terminus ATG, das als Translationsstartkodon dient, und am 3'-Terminus TAA, TGA oder TAG besitzen, das als Translationsabbruchkodon dient. Zum Exprimieren des Gens wird ein Promotor stromaufwärts gebunden. Jeder Promotor kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so lang er als Wirt geeignet ist, der zur Expression des Gens verwendet wird.
Beispielhaft für geeignete Promotoren sind der trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λPL-Promotor und Ipp-Promotor, wenn der Wirt ein der Gattung Escherichia angehörender Mikroorganismus ist, der SPO1-Promotor, SPO2-Promotor und penP-Promotor, wenn der Wirt Bacillus angehört, und der PHO5-Promotor, PGK-Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor, wenn der Wirt eine Hefe ist. Besonders bevorzugt ist eine Kombination eines der Gattung Escherichia angehörenden Mikroorganismus als Wirt und der trp-Promotor oder λPL-Promotor als Promotor.
Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, kann ein aus SV40 stammender Promotor oder ein Promotor eines Retrovirus verwendet werden. Der erste Promotor ist besonders bevorzugt.
Mittels des auf diese Weise aufgebauten, DNA(2) enthaltenden Vektors wird eine Transformante hergestellt.
Als Wirt kann ein der Gattung Escherichia oder Bacillus angehörender Mikroorganismus, eine Hefe oder eine tierische Zelle verwendet werden.
Als der Gattung Escherichia oder der Gattung Bacillus angehörender Mikroorganismus kann der vorstehend beschriebene verwendet werden. Beispiele geeigneter Hefen schließen Saccharomyces cerevisiae AH22R^-, NA87-11A und DKD-5D ein. Beispiele geeigneter tierischer Zellen schließen Affenzellen COS-7, Vero, CHO-Zellen des chinesischen Hamsters, Maus-L-Zellen und menschliche FL-Zellen ein.
Ein der Gattung Escherichia coli angehörender Mikroorganismus kann gemäß einem zum Beispiel in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2110 (1972), oder Gene 17, 107 (1982), offenbarten Verfahren transformiert werden. Ein der Gattung Bacillus angehörender Mikroorganismus kann gemäß einem zum Beispiel in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979), offenbarten Verfahren transformiert werden. Eine Hefe kann gemäß einem zum Beispiel in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978), offenbarten Verfahren transformiert werden. Eine tierische Zelle kann gemäß einem zum Beispiel in Virology 52, 456 (1973), offenbarten Verfahren transformiert werden.
Auf die vorstehend beschriebene Weise wird eine mit einem DNA(2) enthaltenden Vektor transformierte Transformante erhalten.
Als Medium, in dem eine Transformante eines der Gattung Escherichia oder Bacillus angehörenden Wirts kultiviert wird, ist ein flüssiges Medium geeignet. Das flüssige Medium kann mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einer für das Wachstum der Transformante erforderlichen organischen Substanz ergänzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann zum Beispiel Glucose, Dextrin, lösliche Stärke oder Sucrose sein. Die Stickstoffquelle kann zum Beispiel eine anorganische oder organische Substanz wie etwa ein Ammoniumsalz, ein Nitrat, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen oder Kartoffelextrakt sein. Die anorganische Substanz kann zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat oder Magnesiumchlorid sein. Eine Hefe, ein Vitamin und ein Wachstumsförderungsfaktor können dem Medium ebenfalls zugesetzt werden. Der pH des Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 6 bis 8.
Ein bevorzugtes Medium zum Kultivieren eines der Gattung Escherichia angehörenden Mikroorganismus ist M9-Medium, das zum Beispiel Glucose, Casaminosäure enthält [Miller, "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Dieses Medium kann mit einem geeigneten Mittel wie etwa 3/3-Indolylacrylsäure zum Zweck des Verbesserns der Promotorwirkung ergänzt werden.
Wenn ein der Gattung Escherichia angehörender Mikroorganismus als Wirt verwendet wird, wird das Kultivieren im allgemeinen 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43°C nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt. Wenn ein der Gattung Bacillus angehörender Mikroorganismus als Wirt verwendet wird, wird das Kultivieren im allgemeinen 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40°C nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt.
In Fall, wenn eine Transformante eines Wirts, der eine Hefe ist, kultiviert wird, kann Burkholders Minimalmedium [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4505 (1980)] als Beispiel eines Kulturmediums angeführt werden. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Das Kultivieren wird im allgemeinen 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35°C nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt.
Das Medium zum Kultivieren einer Transformante einer tierischen Zelle als Wirt kann zum Beispiel MEM-Medium, das etwa 5 bis 20% fetales Rinderserum enthält [Science 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)] und 199-Medium sein [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73, 1 (1950)]. Der pH des Mediums ist vorzugsweise 6 bis 8. Das Kultivieren wird im allgemeinen 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40°C nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt.
Aus der vorstehenden Kultur kann das Ratten-Proteinkinase-C-Protein in der folgenden Weise abgetrennt und gereinigt werden.
Zum Extrahieren der Ratten-Proteinkinase C aus dem kultivierten Mikroorganismus oder der Zelle kann geeigneterweise ein Verfahren gewählt werden, bei dem der Mikroorganismus oder die Zelle aus der Kultur durch irgendein herkömmliches Verfahren gesammelt wird und in einem Puffer suspendiert wird, der ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Guanidin-Salzsäure enthält. Der suspendierte Mikroorganismus oder die Zelle werden anschließend durch Ultraschallwellen, ein Lysozym (und/oder Einfrieren und Auftauen) aufgebrochen, gefolgt vom Zentrifugieren unter Erhalten des Ratten-Proteinkinase-C-Proteins.
Bekannte Trenn- und Reinigungsverfahren können zur Reinigung des Ratten-Proteinkinase-C-Proteins aus dem vorstehend beschriebenen Überstand geeigneterweise kombiniert werden. Derartige bekannte Trenn- und Reinigungsverfahren schließen zum Beispiel Verfahren, welche die Löslichkeit ausnützen, wie etwa Aussalzen und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich den Molekulargewichtsunterschied ausnützen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Verfahren, die den Ionisierungsunterschied ausnützen wie etwa Ionenaustauschchromatographie, Verfahren, die den Unterschied bei den Hydrophobieeigenschaften ausnützen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und Verfahren ein, die den Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnützen, wie etwa Elektrophorese am isoelektrischen Punkt.
Ein Beispiel des durch das Genrekombinationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ratten-Proteinkinase-C-Proteins ist das Protein, welches das Polypeptid mit der in 1 gezeigten Aminosäurensequenz enthält. Das Polypeptid kann an seinem N-Terminus Met besitzen.
Die Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Ratten-Proteinkinase-C-Aktivität kann als bekannte Proteinphosphorylierungsaktivität gemessen werden.
Verschiedene Arten von Zellen, die ursprünglich nur eine geringe Menge Ratten-Proteinkinase C produzieren oder die überhaupt keine Ratten-Proteinkinase C produzieren, erwerben die Fähigkeit, eine große Menge Ratten-Proteinkinase C zu produzieren, durch die Transfizierung mit der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung und sie können eine große Menge Ratten-Proteinkinase C produzieren.
Das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung, welches das Gen enthält, das für das Ratten-Proteinkinase-C-Protein kodiert, kann zur Transformierung in verschiedene Zellarten eingeführt werden, was es ermöglicht, die sich daraus ergebenden Zellen Ratten-Proteinkinase C produzieren zu lassen. Deshalb kann eine große Menge Ratten-Proteinkinase C erhalten werden.
Die auf diese Weise hergestellte Ratten-Proteinkinase C kann als Reagenz oder als Diagnose- oder Untersuchungsmaterial (zum Beispiel die in 0,001 bis 10 μg in einem Versuch verwendete Menge Proteinkinase C) zusammen mit einem daraus hergestellten Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel kann die Proteinkinase C gemäß der vorliegenden Erfindung als Reagenz zum Untersuchen zellulärer Signalübertragungsmechanismen, als Reagenz zur Diagnose oder Untersuchung von Erkrankungen (wie etwa Tumor), die sich aus einer Störung des zellulären Signalübertragungsmechanismus ergeben, oder als bei der Verhinderung und Heilung der Erkrankungen wirksames Durchmusterungsmittel verwendet werden.
In der vorliegenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnungen beruhen die Abkürzungen für Basen, Aminosäuren und Chemikalien auf denjenigen gemäß der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur oder den gebräuchlicherweise in der Technik verwendeten. Beispiele der Abkürzungen sind wie folgt. Aminosäuren mit optischen Isomeren beziehen sich, so lange nicht anders besonders angegeben, auf L-Formen.

DNA:: Desoxyribonukleinsäure
cDNA:: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
A:: Adenin
T:: Thymin
G:: Guanin
C:: Cytosin
RNA:: Ribonukleinsäure
dATP:: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP:: Desoxythymidintriphosphat
dGTP:: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP:: Desoxycytidintriphosphat
ATP:: Adenosintriphosphat
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS:: Natriumdodecylsulfat
Gly:: Glycin
Ala:: Alanin
Val:: Valin
Leu:: Leucin
Ile:: Isoleucin
Ser:: Serin
Thr:: Threonin
Cys:: Cystein
Met:: Methionin
Glu:: Glutaminsäure
Asp:: Asparaginsäure
Lys:: Lysin
Arg:: Arginin
His:: Histidin
Phe:: Phenylalanin
Tyr:: Tyrosin
Trp:: Tryptophan
Pro:: Prolin
Asn:: Asparagin
Gln:: Glutamin

Beispiel
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch Beispiele genauer beschrieben.
Die in Beispiel 2 erhaltene Transformante E. coli K12DH1/pTB638 ist seit dem 20. Juni 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14514 beim IFO und seit dem 28. Juni 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8829 beim FRI hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag geändert worden und unter der Zugangsnummer FERM BP-1372 aufbewahrt worden.
Die in Beispiel 3 erhaltene Transformante E. coli K12DH1/pTB652 ist seit dem 29. August 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14539 beim IFO und seit dem 5. September 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8958 beim FRI hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1373 geändert worden.
Die in Beispiel 3 erhaltene Transformante E. coli K12DH1/pTB653 ist seit dem 29. August 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14540 beim IFO und seit dem 5. September 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8959 beim FRI hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1374 geändert worden.
Beispiel 1
(1) Aufklärung der Aminosäurensequenz von Ratten-Proteinkinase C
Aus Rattenhirnen wurde eine Ratten-Proteinkinase C gemäß dem Verfahren von Kikkawa [J. Biol. Chem. 257, 13341 (1982)] extrahiert. Aus den Gehirnen von 240 Ratten wurden 2,0 mg gereinigte Proteinkinase-C-Probe erhalten. Die Proteinkinase-C-Probe (1,9 mg) wurde in 1,9 ml 6 M Harnstoff enthaltender 50 mM Tris-HCI-Lösung (pH 9,0) gelöst, welcher Lysylendopeptidase zu einer Konzentration von 25 μg/ml zugesetzt wurde, und das Gemisch wurde 21 Stunden bei 37°C verdaut. Die auf diese Weise hergestellten Peptide wurden auf eine Umkehr-HPLC-Säule (Micro pak Protein C-18-10, 0,4 × 30 cm) aufgebracht und danach erfolgte eine Acetonitril-Gradientenelution unter Erhalten von Fraktionen mit etwa 50 Peptiden. Davon wurden vier Peptide (Peptid Nr. 24, 37, 49 und 51) dem automatisierten Edman-Abbau mittels eines Dampfphasen-Proteinsequenzers (Model 470A, Applied Biosystems, Inc.) zur Bestimmung ihrer Aminosäurensequenzen unterzogen.
Die als Ergebnis des Edman-Abbaus freigesetzten Phenylhydantoinderivate der Aminosäuren wurden durch HPLC mittels einer Micro pak SPC 18-3-Säule (Varian Associates, Inc.) analysiert. Die Aminosäurensequenz jedes der vier Peptide war wie in 1 dargestellt.
Beispiel 2
(1) Herstellung einer aus Rattenhirn-mRNA stammenden cDNA-Bank
Eine RNA wurde aus Rattenhirn durch das Guanidinisothiocyanatverfahren [Chirgwim et al., Biochemistry 18, 5294 (1978)] extrahiert. Poly(A)-RNA wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Säulenchromatographie [Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)] gereinigt.
Mittels dieser poly(A)-RNA als Matrize wurde eine cDNA-Bank mit dem pcDV1-Vektor und pL1-Linker gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg [Okayama & Berg, Mol. Cell. Biol. 2, 161 (1982)] aufgebaut. Das die ringgeschlossene cDNA enthaltende Vektorplasmid wurde in E. coli DH1 transfiziert. Ausgehend von 5 μg Poly(A)-RNA wurde eine cDNA-Bank erhalten, die aus etwa 5 × 10⁵ Klonen bestand und E. coli als Wirt verwendete.
(2) Isolierung eines Ratten-Proteinkinase-C-cDNA enthaltenden Plasmids und Aufklärung seiner DNA-Sequenz
Die vorstehend mittels E. coli DH1 beschriebene Ratten cDNA-Bank wurde auf 10 Nitrocellulosefilter (Milipore, HATF-Filter) zu etwa 3 × 10⁴ Klone/Filter aufgebracht. Anschließend wurden 20 Filterdoppel (jeweils zwei paarweise) mittels dieser Filter als Stammfilter hergestellt. Die E. coli auf jedem Filterdoppel wurde mit 0,5 N NaOH-Lösung unter Freisetzen und Denaturieren der Plasmid-DNA lysiert, gefolgt vom Trocknen zum Fixieren der DNA auf dem Filter [Grustein, M. & Hogness, D. 5., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)].
Auf der Grundlage der Aminosäurensequenz der Peptide, die in Beispiel 1(1) bestimmt wurde, wurden den Aminosäurensequenzen entsprechende Oligonukleotide chemisch synthetisiert. Auf diese Weise wurden
die den Aminosäureresten 7-12 des Peptids Nr. 24 (Tyr-Ile-Asp-Trp-Glu-Lys) entspricht,
die den Aminosäureresten 3-8 des Peptids Nr. 51 (Asp-Trp-Trp-Ala-Phe-Gly) entspricht, und
die den Aminosäureresten 24-29 des Peptids Nr. 51 (Glu-Asp-Glu-Asp-Glu-Leu) entspricht, jeweils zur Verwendung als Durchmusterungssonde für Ratten-Proteinkinase-C-cDNA chemisch synthetisiert.
Der 5'-Terminus jeder Oligonukleotidsonde wurde mittels
[γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase mit ³²P markiert.
Die markierten Sonden Nr. 2 und 3 wurden getrennt mit den Filterdoppeln hybridisiert, auf denen die Plasmid-DNA fixiert war. Die Hybridisierungsreaktion wurde 16 Stunden bei 42°C in 10 ml 5xSSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 5x Denhardts, 0,1% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA-Lösung ausgeführt, die 10 μCi der markierten Sonde enthielt. Auf die Reaktion folgend wurden die Filter mit einer 6xSSC- und 0,1%igen SDS-Lösung drei Mal 30 Minuten bei Raumtemperatur und zwei Mal 60 Minuten bei 47°C im Fall von Sonde Nr. 2 und 60 Minuten bei 43°C im Fall von Sonde Nr. 3 gewaschen [Maniatis, M. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 309 (1982)]. Von jedem gewaschenen Filter wurde anschließend ein Radioautogramm aufgenommen. Radioautogramme eines jeden Paars Filterdoppel wurden zum Ausfindigmachen eines Stammes übereinandergelegt, welcher mit beiden der zwei Sonden reagieren konnte. Durch dieses Verfahren wurde aus 3 × 10⁵ Kolonien ein Stamm E. coli K12DN1/pTB638 (IFO 14514, FERM-BP 1372) entnommen, der mit beiden Sonden reagieren kann.
Anschließend wurde aus diesem Stamm durch das Alkaliverfahren [Birnboim, H. C. & Doly, J., Nucleic Acids Res. 1, 1513 (1979)] eine Plasmid-DNA (pTB638) extrahiert. Nach der Reinigung wurde die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) gespalten und das Produkt wurde der Elektrophorese an einem Agarosegel unterzogen. DNA-Fragmente in dem Gel wurden gemäß dem Southern-Blotting-Verfahren [Maniatis, M. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 382 (1982)] auf ein Nitrocellulosefilter (BA85, 5 & S Inc.) überführt. Von dem Plasmid-DNA-Fragment auf dem Filter wurde gefunden, dass es mit allen vorstehend beschriebenen Oligonukleotidsonden reagiert.
Die Nukleotidsequenz einer cDNA-Region dieser Plasmid-DNA wurde durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchsverfahren [Messing, J. et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)] bestimmt. Die DNA-Sequenz und die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz werden in 2 dargestellt.
Aus den dargestellten Sequenzen ist zu erkennen, dass die in Referenzbeispiel 1(1) bestimmten Aminosäurensequenzen der Peptide Nr. 24 und 51 den Nukleotidsequenzen an Nr. 445-480 beziehungsweise 220-312 genau entsprechen. Auf diese Weise wurde bestätigt, dass das Plasmid pTB638 Ratten-Proteinkinase-C-cDNA war. Da die cDNA eine poly(A)-Struktur enthielt, wurde gefunden, dass die cDNA Kodons der C-terminalen Region von Proteinkinase C und einen nicht-translatierten Abschnitt der 3'-terminalen Region der mRNA enthielt. Die Ratten-Proteinkinase C enthält die in 2 dargestellte Aminosäurensequenz als Teil derselben.
Beispiel 3
(1) Herstellung einer aus Rattenhirn-mRNA stammenden cDNA-Bank
Ein RNA-Fragment wurde durch das Guanidinisothiocyanatverfahren [Chirgwim et al., Biochemistry 18, 5294 (1978)] aus Rattenhirn extrahiert. Poly(A)-RNA wurde durch oligo-dT-Cellulose-Säulenchromatographie [Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)] gereinigt.
Mittels dieser poly(A)-RNA als Matrize wurde mit dem Phagenvektor λgt10 [Huynh, T. V. et al., "DNA-Cloning, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 5. 49 (1985)] gemäß dem Verfahren von Watson und Jackson [Watson, C. J. & Jackson, J. F., "DNA Cloning, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, S. 49 (1985)] eine cDNA-Bank aufgebaut. Ausgehend von 10 μg poly(A)RNA wurde eine cDNA-Bank erhalten, die aus etwa 1,5 × 10⁶ Klonen bestand und die E. coli C600, HflA (Huynh, T. V. et al., oben) als Wirt verwendete.
(2) Isolierung eines Ratten-Proteinkinase-C-cDNA enthaltenden Phagen und Aufklärung seiner DNA-Basensequenz
Die vorstehend beschriebene, E. coli C600, HflA als Wirt verwendende Phagen-cDNA-Bank wurde zu etwa 1 × 10⁵ Klone/Platte auf 10 Weichagarplatten aufgebracht und auf Nitrocellulosefilter überführt (HATF-Filter, Milipore Inc.) und mit 0,5 N NaOH-Lösung lysiert. Die sich daraus ergebende freigesetzte und denaturierte Phagen-DNA wurde zur Fixierung auf den Platten getrocknet [Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 5. 320 (1982)].
In Beispiele 2(2) erhaltene E. coli K12DH1/pTB638 (IFO 14514, FERM BP-1372) wurde mit dem Restriktionsenzym PstI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit 0,7 kb verdaut. Das DNA-Fragment wurde durch das Nick-Translationsverfahren (Maniatis et al., oben, 5. 109) unter Ergeben einer Sonde mit ³²P markiert.
Die auf den Filtern fixierte DNA wurde durch Reaktion in 10 ml die markierte Sonde enthaltendem 5xSSPE (0,9 M NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 5 mM EDTA), 50% Formamid, 5xDenhardts, 0,1% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA-Lösung mit der markierten Sonde hybridisiert. Auf die Reaktion folgend wurden die Filter zwei Mal 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 2xSSC- (1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS- und zwei Mal 30 Minuten bei 68°C mit einer 1xSSC- und 0,1% SDS-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden getrocknet und der Radioautographie zum Selektieren von Klonen unterzogen, die mit der Sonde reagieren können. Aus dem Klon λCKR107 wurde gemäß dem Verfahren von Davis et al. [Davis et al., "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory (1980)] eine Phagen-DNA extrahiert. Diese wurde mit dem Restriktionsenzym BglII und EcoRI unter Erhalten eines DNA- Fragments mit etwa 0,5 kb gespalten. Das DNA-Fragment wurde in derselben Weise wie vorstehend beschrieben mit ³²P markiert. Unter Verwenden des markierten DNA-Fragments als Sonde wurde die Hybridisierung in derselben Weise wie vorstehend ausgeführt. Zum Reagieren mit der Sonde befähigte Klone wurden ausgesondert. Die Nukleotidsequenzen von cDNA-Regionen mehrerer Arten bei dem vorstehenden Durchmustern erhaltener Klone wurden durch das Didesoxynukleotidketten-Terminationsverfahren [Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)] bestimmt.
Auf diese Weise kann durch Kombinieren der cDNA-Regionen der so erhaltenen Phagenklone die gesamte Kodierungsregion der Rattenhirn-Proteinkinase C abgedeckt werden. Eine Untersuchung der aus der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäurensequenz zeigt, dass in der Rattenhirn-Proteinkinase C wenigstens zwei Molekültypen vorliegen, die 671 [Typ I (β-1)] und 673 [Typ II (β-2)] Aminosäuren besitzen und die sich nur in ihren C-terminalen Regionen unterscheiden.
Das Überlappen der auf diese Weise erhaltenen Klone wird in 3 veranschaulicht. Die gesamte DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäurensequenz werden in 4 dargestellt.
(3) Aufbau des Rattenhirn-Proteinkinase-C-Expressionsplasmid für eine tierische Zelle
Die in 3 dargestellte DNA des Phagenklons λCKR152 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI unter Erhalten einer cDNA mit 1,4 Kb teilverdaut. Die DNA wurde mit Plasmid pTB389 vermischt, das mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten worden war und das zum Entfernen seiner 5'-terminalen Phosphorsäuregruppen mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Plasmid pTB389 wird durch Überführen jeder PstI-Spaltungsstelle in der 5'-terminalen Region und der BamHI-Spaltungsstelle in der 3'-terminalen Region der Interleukin-2-Genregion von Plasmid pTB106 (offenbart in JP-A-61-63282, die EP-B-172 619 entspricht) in EcoRI unter Entfernen der Interleukin-2- Genregion erhalten. Das Gemisch wurde zum Aufbauen von Plasmid pTB648 mit T4-DNA-Ligase umgesetzt. Das Plasmid pTB648 wurde anschließend mit EcoRI unter Erhalten einer DNA mit 4,0 kb mit 937 bp der 5'-terminalen Region der cDNA teilverdaut, gefolgt vom Entfernen der 5'-terminalen Phosphorsäuregruppe. Die sich daraus ergebende DNA wurde mit einer cDNA mit 2,5 kb, die durch Teilverdauen des in 3 dargestellten Phagenklons λCKR107 mit dem Restriktionsenzym EcoRI erhalten wurde, oder mit einer cDNA mit 2,3 kb gemischt, die durch Verdauen des Phagenklons λCKR108 mit EcoRI erhalten wurde. Die Gemische wurden zum Aufbauen der Plasmide pTB651 beziehungsweise pTB650, wovon jedes zum Transformieren tierischer Zellen verwendet wird und die gesamte, für Rattenhirn-Proteinkinase C kodierende Region abdeckt, jeweils mit T4-DNA-Ligase umgesetzt.
Der Interleukin-2-Genexpressionsvektor pTB106 für eine tierische Zelle (JP-A 61-63282, die EP-B-172 619 entspricht) wurde mit dem Restriktionsenzym HgiAI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit 1,0 kb verdaut, das eine Interleukin-2-Gen-Leadersequenz enthält. Das kohäsive Ende des DNA-Fragments wurde durch Reaktion mit T4-DNA-Polymerase in ein glattes Ende überführt, an das mit T4-DNA-Ligase der EcoRI-Linker CCGGAATTCCGG gebunden wurde, gefolgt von der vollständigen Verdauung mit EcoRI und HindIII unter Abtrennen einer von SV40-DNA stammenden Sequenz (Promotor- und Spleißabschnitt) und eines ersten DNA-Fragments mit 0,64 kb, das aus der IL-2-Gen-Leadersequenz bestand. Das vorstehend beschriebene Plasmid pTB106 wurde unter Abtrennen einer DNA-Replikationsstartregion zum Replizieren einer aus dem Plasmid pBR322 stammenden DNA in E. coli und eines zweiten DNA-Fragments mit 2,6 kb mit einer Sequenz, die ein Ampicillin-resistentes Gen und eine aus SV40-DNA stammende Polyadenylierungsregion enthielt, mit BamHI und HindIII verdaut. Weiter wurde aus Plasmid pTB361 (JP-A-61-88881, die EP-B-Nr. 177 915 entspricht) das klonierte Synthesegen des menschlichen Epidermiszellen-Wachstumsfaktors (EGF), ein drittes EcoRI-BamHI-DNA-Fragment mit 0,18 kb hergestellt, das für Human-EGF kodiert. Das erste bis dritte DNA-Fragment werden durch die T4-DNA-Ligasereaktion unter Aufbauen von Plasmid pTB406 ligiert. Das Plas mid pTB406 wurde an stromaufwärts des SV40-Promotors gelegenen ClaI- und HindIII-Stellen gespalten, in die ein gereinigtes ClaI-HindIII-DNA-Fragment mit 1,1 kb inseriert wurde, das aus pTB314 (JP-A-61-63282, die EP-B-172 619 entspricht) abgetrennt wurde und eine Abelson-Maus-Leukämievirus-LTR-Region (A-MuLV) besitzt, wodurch Plasmid pTB505 aufgebaut wurde.
Das Plasmid pTB505 wurde mit ClaI und BamHI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit 1,5 kb weiter verdaut, das ein MuLV-LTR enthielt. Diese DNA wurde mit einem aus dem Plasmid pTB650 oder pTB651 erhaltenen ClaI-BamHI-DNA-Fragment gemischt und das Gemisch wurde zum Aufbauen der zum Transformieren tierischer Zellen brauchbaren Plasmide pTB652 beziehungsweise pTB653 mit einem MuLV-LTR an ihren stromaufwärts gelegenen Regionen mit 4-DNA-Ligase umgesetzt (siehe 5).
(4) Mit jedem vorstehend in (2) erhaltenen Plasmid pTB652 und Plasmid pTB653 wurde E. coli K12DH1 gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972), offenbarten Verfahren unter Erhalten einer Transformante E. coli K12DH1/pTB652 (IFO 14539, FERM BP-1373) beziehungsweise einer Transformante E. coli K12DH1/pTB653 (IFO 14540, FERM BP-1374) transformiert.
(5) Exprimierung von Rattenhirn-Proteinkinase C in tierischen Zellen
Affen-COS-7-Zellen [Cell 27, 279-288 (1981)] wurden auf einer Einzelschicht (5 Plastikschalen mit einem Falcon-Durchmesser von 100 mm) in mit 5% fetalem Rinderserum ergänztem DMEM-Medium kultiviert. Nach dem Ersetzen durch dasselbe Medium wurde die Kultur 4 Stunden weiter fortgesetzt. Anschließend wurden den Zellen in herkömmlicher Weise hergestellte [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] Calciumphosphatfällungen, die 30 μg/Schale Plasmid pTB652 oder pTB653 enthielten, unter Erhalten mit pTB652 und pTB653 transfizierter Zellen zugesetzt. Weitere vier Stunden später wurden die Zellen mit Glycerin behandelt und die Kultivierung der pTB652-transfizierten und pTB653-transfizierten COS-7-Zellen wurde 70-72 Stunden weiter fortgesetzt. Danach wurde der Kulturüberstand verworfen und die Zellen wurden in 1,5 ml eines Puffers [0,25 M Sucrose, 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 10 mM EGTA, 2 mM EDTA und 20 μg/ml Leupeptin] suspendiert und mittels eines Teflon-Homogenisators homogenisiert. Das Homogenisat wurde unter Erhalten einer Cytoplasmafraktion mit einer Beckmann 100.2-Zentrifuge 60 Minuten bei 55000 Upm zentrifugiert. Die Fraktion wurde gemäß dem herkömmlichen Verfahren [Kikkawa et al., J. Biol. Chem. 257, 13341 (1982)] unter Erhalten des Aktivitätswerts von 1 mg Protein auf Proteinkinase-C-Aktivität untersucht. Wie nachstehend in Tabelle 1 dargestellt, zeigten die Cytoplasmafraktionen der pTB652-transfizierten und pTB653-transfizierten COS-7-Zellen eine etwa drei Mal so starke Proteinkinase-C-Aktivität wie die der nicht-transfizierten Zellen.
Tabelle 1
(6) Analyse aus transfizierten Zellen erhaltener Proteinkinase C
Die in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Cytoplasmafraktionen wurden jeweils mit 6 Volumina 20 mM Tris-HCI-Puffer (Puffer A, pH 7,5) verdünnt, der 0,5 mM EGTA, 0,5 mM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, und wurde auf eine Pharmacia FPLC-Mono-Q-Säule (0,5 × 5 cm, Pharmacia HR5/5) aufgebracht. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer A wurde Proteinkinase C mit 20 ml eines Puffer A enthaltenden linearen NaCl-Gradienten (0-0,6 M) eluiert. Wie in 6 dargestellt, wurde in den Testproben aus pTB652-transfizierten und pTB653-transfizierten Zellen verglichen mit den nicht-transfizierten Zellen eine merklich höhere Enzymaktivität nachgewiesen.
Die aus der Mono-Q-Säule eluierten aktiven Fraktionen wurden an 8,5%igem SDS-Polyacrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli [Laemmli, U. K., Nature 227, 680-685 (1970)] der Elektrophorese unterzogen und gemäß dem Verfahren von Towbin et al. [Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)] auf Nitrocellulosefilter überführt. Man ließ die Filter jeweils über Nacht bei 4°C in einem 10 mM Tris-HCI-Puffer (pH 7,5), der 150 mM NaCl, 5% Casein und 20% normales Pferdeserum enthielt, stehen und ließ sie anschließend 1 Stunde bei Raumtemperatur in einem 10 mM Tris-HCI-Puffer (pH 7,5) stehen, der 150 mM NaCl, 1% Casein und anti-Proteinkinase-C-Antikörper enthielt [von Dr. P. J. Parker, Coussens, L. S., Science 233, 859-866 (1986)]. Die Filter wurden mit einem 10 mM Tris-HCI-Puffer (pH 7,5) gewaschen, der 0,05% Tween 20 und 150 mM NaCl enthielt, und man ließ 1,5 Stunden in einem Tris-HCI-Puffer stehen, der 1% Casein, 150 mM NaCl, 0,1 μCi/ml ¹²⁵I-Protein A enthielt. Nach dem Waschen der Filter in derselben Weise wie vorstehend wurden Röntgenfilme mit den Filtern belichtet, um die Proteinbanden sichtbar zu machen, die mit dem Antikörper reagierten. Wie in 7 dargestellt, ergab die aus den transfizierten Zellen stammende Probe die Proteinbande, die mit dem Antikörper in derselben Position wie diejenige von aus Rattenhirn isolierter Proteinkinase C reagierte.
(7) Reinigung aus transfizierten Zellen erhaltener Proteinkinase C
Ähnliche Ergebnisse wurden auch im Fall von COS-7-Zellen erhalten, die mit pTB707 (mit einer 5'-untranslatierten Region aus 55 Basenpaaren), das durch Verkürzen der 5'-untranslatierten Region von pTB652 erhalten wurde, und mit pTB708 (das eine 5'-untranslatierte Region aus 55 Basenpaaren trug), das durch Verkürzen der 5'-untranslatierten Region von pTB653 erhalten wurde, transfiziert wurden.
So wurden in derselben Weise wie vorstehend beschrieben aus pTB707- und pTB708-transfizierten Zellen (jeweils in einer 50 Schalen mit 100 mm Durchmesser entsprechenden Menge) Cytoplasma-Fraktionen erhalten und auf die präparative Chromatographie mittels einer Mono-Q-Säule (1 × 10 cm, Pharmacia HR10/10) angewandt. Die aktiven Fraktionen wurden mit einer Hydroxyapatitsäule teilweise gereinigt. Die aktiven Fraktionen wurden anschließend mit demselben Volumen eines 20 mM Kaliumphosphatpuffers (Puffer B, pH 7,5) verdünnt, der 0,5 mM EGTA, 0,5 mM EDTA, 10% Glycerin und 10 mM Mercaptoethanol enthielt, und auf eine Hydroxylapatitsäule (Typ KOKEN S, 0,78 × 10 cm) des Pharmacia FPLC-Systems aufgebracht. Die Proteinkinase-C-Aktivität wurde mit dem linearen Gradientenpuffer B eluiert, der 20-280 mM Kaliumphosphat enthielt. Wie in 8 dargestellt, ergab die aus Rattenhirnen isolierte Proteinkinase C drei Peaks (Peak 1, 2 und 3 links in D in 8) und die aus den nicht-transfizierten Zellen stammende Probe zeigte eine Peak 3 entsprechende Aktivität.
Auf der anderen Seite zeigte die aus den transfizierten Zellen stammende Probe Aktivitäten, die Peak 2 und 3 entsprachen. Dies legt nahe, dass die Peak 2 entsprechende Proteinkinase-C-Aktivität durch die mit der Plasmid-DNA transfizierten Zellen exprimiert wird.

Claims

Rattenproteinkinase C, bei der es sich um ein Polypeptid handelt, das die in 4 dargestellte Sequenz von 673 Aminosäuren umfasst.
Rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz enthält, die für eine Rattenproteinkinase C codiert, bei der es sich um ein Polypeptid handelt, das die in 4 dargestellte Sequenz von 673 Aminosäuren umfasst.
Transformante, die mit einem Vektor mit einer DNA transformiert ist, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine Rattenproteinkinase C codiert, bei der es sich um ein Polypeptid handelt, das die in 4 dargestellte Sequenz von 673 Aminosäuren umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Rattenproteinkinase C, umfassend die folgenden Schritte: Kultivierung einer Transformanten nach Anspruch 3 in einem Kulturmedium, Akkumulierung von Rattenproteinkinase C in der Kultur und Isolierung derselben.