CZ310798A3 - Způsob tlumení aktivace tyrosinasy, upravování pigmentace a identifikace látky, látka zesilující fosforylaci tyrosinasy, látka tlumící fosforylaci tyrosinasy, použití činidla tlumícího fosforylaci tyrosinasy, použití peptidu a použití DNA - Google Patents

Description

1 lUTnw-<ig • ··· · ·

Způsob tlumení aktivace tyrosinasy, upravování pigmentace a identifikace látky, látka ze sřttrjTtí*

fosforylaci tyrosinasy, látka tlumící fosforylaci tyrosinasy, použití činidla tlumícího fosforylaci tyrosinasy, použití peptidu a použití DNA

OBLAST TECHNIKY

Tato přihláška je částečným pokračováním předchozí série Č. 08/623, 364 zaregistrované 28 března 1996, jejíž principy jsou zde obsaženy v referencích a citovány zcela.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Kosmeticky nepěkná hyperpigmentace, kůže způsobená zvýšeným obsahem melaninu v melanocytech a obklopujících keratinocytech může být výsledkem popálení nebo jiných zranění a je charakteristická také pro některá mateřská znaménka a některé kožní choroby Současně náprava tohoto stavu často zahrnuje bolestivé transplantace, za účelem nahrazení spálené kůže, nebo chirurgické zákroky, např.: laserovou chirurgii nebo vyříznutí oblastí nežádoucího zbarvení. Někdy je to také touha zesvětlit vlasy, vlnu nebo srst. Například někteří lidé si zesvětlují nebo "odbarvují" lícní ochlupení nebo vlasy pro kosmetické účely. Některé v současnosti dostupné metody odbarvovaní vlasů standardně užívají hrubé chemikálie, které mohou dráždit citlivou pokožku obklopující vlasy a způsobit poškození vlasového vlákna, někdy až do stádia lámání vlasů. Kromě toho pouze nadkožní část vlasového vlákna je podrobena této úpravě, kořínky pod povrchem pokožky a v ní zůstávají tmavé. Tyto tmavé kořínky nakonec vyrostou ven a aplikaci odbarvovacích chemikálií je nutno opakovat.

Bylo by výhodné mít k dispozici metody snížení nebo potlačení pigmentace kůže, vlasů, vlny nebo srsti bez potřeby chirurgických postupů či hrubých chemikálií.

PODSTATA VYNÁLEZU Předkládaný vynález je založen na přihlašovatelově objevu, že aktivace tyrosinasy, rychlost-limitujícího enzymu melanogenese, je výsledkem činnosti protein kinasy C-beta (zmiňována na tomto místě také jako PKC-β), která zprostředkovává fosforylaci serinového a threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy. * · * · Ťyto kuňky jsou umístěny

Tyrosinasa se nachází výlučně v melanocytech (pigmentové bun¥y)* v základní vrstvě epidermu a ve vlasových kořínkových cibulkách. Melaninové barvivo je uloženo v organelách nazývaných melanosomy, organelách specifických pro melanocyty, které jsou následně přemístěny z melonocytu do obklopujících keratinocytů, takže barvivo je široce rozprostřeno přes epidermis (vnější vrstva) pokožky nebo vlasových vláken. Barva (pigmentace) pokožky, vlasů, vlny a srsti obratlovců je z velké části podmíněna obsahem melaninového barviva.

Tyrosinasa, měď vázající transmembránový glykoprotein lokalizovaný v melanosomu, je hlavním a rychlost-limitujícím enzymem syntézy melaninu vzhledem ke své schopnosti katalyzovat hydroxylaci tyrosinu a následující oxidaci, první dvě reakce biosyntetické dráhy. Experimenty s použitím transfekce prokázaly, že tyrosinasa sama umožňuje jinak nemelanogením buňkám produkovat melaninové barvivo (Bouchard, B, eí al., J. Exp. Med.. 169:2029-2042 (1989)); a klonování lidských a myších tyrosinasových genů umožnilo mapování řady mutací zodpovědných za albinismus, dědičnou ztrátu tvorby pigmentu (King, R.A., eí a/., PIGMENTATION AND PIGMENTARY DISORDERS, Levine, N„ (ed), CRC Press, Boča Raton. FL, pp. 297-336 (1993)).

Je známo několik dalších enzymů, které se účastní biosyntesy melaninu. Patří sem Tyrosinase příbuzné proteiny - Proteiny 1 a 2 (TRP 1 a TRP 2) (Cohen, T., eí al., Nucleic Acids Res.. 18:2807-2808 (1990); Jackson, IJ, et al, EMBO J.. 11:527-535 (1992)). Jak vyplývá z jejich jména TRP proteiny jsou strukturně příbuzné s tyrosinasou. Geny jsou homologní zejména v oblastech vazebného místa pro měď a na cystein bohatých domén, tedy v oblastech, které jsou důležité pro strukturu a funkci těchto proteinů (Hearing, V.J. a King, R.A., PIGMENTATION AND PIGMENTARY DISORDERS, Levine, N., (ed.), CRC Press, Boča Raton. FL, pp. 3-32 (1993)). Specifická funkce TRP proteinů není známa. Nicméně z nedávných údajů lze předpokládat, že tyrosinasa, TRP 1 a TRP 2 in vivo vzájemně reagují za vzniku komplexu, a že uvnitř tohoto komplexu se tyrosinasová aktivita snižuje. Předpokládá se tedy, že TRP proteiny mohou působit jako inhibitory tyrosinasové aktivity (Orlow, S.J., et al., J, Invest, Dermatol. 103:196-201 (1994)). Přihlašovatel především identifikoval specifické serinové zbytky v cytoplasmatické doméně tyrosinasy, které jsou prostřednictvím PKC-β fosforylovány Výsledkem přihlašovatelova objevu jsou metody umožňující regulovat aktivaci tyrosinasy v melanocytech obratlovců. Regulace, tak jak je definována na tomto místě, znamená změnu aktivace tyrosinasy buď zamezením nebo inhibicí (snížením) aktivace, nebo zesílením či podporováním aktivace. Například aktivace tyrosinasy může být regulována značným snížením nebo úplným zablokováním fosforylace 3 tyrosinasy, kterou zprostředkovává PKC- β, což vede k snížení melanogenese. Ňa druhé straně aktivace tyrosinasy může být regulována zesílením aktivace, například usnadněním fosforylace tyrosinasy nebo podporováním aktivace, například zamezením defosforylace tyrosinasy, což vede k zvýšení melanogenese.

Jsou také připraveny metody úpravy pigmentace pokožky, vlasů, vlny a srsti obratlovců, jejichž výsledkem je regulace aktivace tyrosinasy v melanocytech obsažených v epidermu a ve vlasech, a v kořínkových cibulkách vlny a srsti. Termín epidermální melanocyty, jak je užit zde, odkazuje na melanocyty obsažené v pokožce a v kořínkových cibulkách nebo ve folikulách vlasů, vlny a srsti. Změna pigmentace, jak je chápána zde, znamená, že pigmentace v epidermálníeh melanocytech je buď zvýšena, jako výsledek aktivace tyrosinasy, což vede k zvýšení melanogenese nebo je alternativně pigmentace snížena vlivem inhibice aktivace tyrosinasy , což vede k poklesu melanogenese.

Jedna část předkládaného vynálezu se týká metod zamezení nebo inhibice aktivace tyrosinasy v epidermálníeh melanocytech obratlovců Tyrosinasa je monomerní protein s vnitřní doménou, krátkou transmembránovou doménou a cytoplasmatickou doménou. Cytoplasmatická doména tyrosinasy obsahuje serinové zbytky. Tyto serinové aminokyselinové zbytky jsou pravděpodobnými substráty pro PKC- β při fosforylaci. Jak je zde popsáno, žadatel prokázal, že šeřiny v pozicích 505 a 509 aminokyselinové sekvence tyrosinasy (Shibahara, S., eí al., Tohoku J.Exp. Med.. 356.403-411 (1988)) jsou místy, kde PKC-β zprostředkovává fosforylaci tyrosinasy. Inhibice fosforylace šeřinu 505 a (resp. nebo) 509 zabraňuje aktivaci tyrosinasy. Inhibice fosforylace tyrosinasy, kterou zprostředkovává PKC-β, zabraňuje aktivaci tyrosinasy v epidermálníeh melanocytech, což vede k snížení produkce melaninového barviva v melanocytech. Tedy ještě jedna část předkládaného vynálezu se vztahuje k snížení nebo kompletnímu potlačení pigmentace v pokožce,vlasech, vlně nebo srsti obratlovců.

Na druhé straně zesílení či podpora tyrosinasové aktivity, například zabráněním defosforylace aktivované tyrosinasy, podporuje nebo prodlužuje melanogenesy v epidermálníeh melanocytech, což vede k zvýšení pigmentace pokožky, vlasů, vlny nebo srsti. V jiné části předkládaného vynálezu jsou popsány metody umožňující identifikovat látku, která snižuje nebo zcela potlačuje pigmentaci epidermálníeh melanocytech obratlovců. Látky, například peptidy, které specificky zasahují do interakce nebo asociace PKC-β a tyrosinasy, napodobují sekvenci/strukturu míst, která jsou na tyrosinase fosforylována (např.: peptidové napodobeniny), váží se na PKC-β a tím zabraňují PKC-β ve fosforylaci tyrosinasy a tedy brání v aktivaci tyrosinasy. • · • » t · · · · ··· ···· «I ··· ··« ♦· ··

Na druhé straně jsou také metody poskytující možnost identifikovat látku, která zvyšuje pigmentaci v epidermálních melanocytech obratlovců. Látky, například peptidy, které specificky působí na fosfatasy, které se účastní defosforylace tyrosinasy, zamezují deaktivaci tyrosinasy. Látky identifikované metodami, které jsou zde popsány, jsou také zahrnuty v předkládaném vynálezu. Výsledkem přihlašovatelova objevu specifických fosforylovaných míst tyrosinasy, rychlost-limitujícího enzymu melanogenese, jsou nyní metody použitelné k regulaci aktivace tyrosinasy a pigmentace v epidermálních melanocytech obratlovců. Metody jsou nyní použitelné k zvýšení pigmentace pokožky, vlasů, vlny a srsti. Přesněji, jsou k dispozici metody umožňující snížit nebo potlačit (částečně nebo zcela) pigmentaci pokožky, vlasů, vlny a srsti bez použití chirurgických zákroků nebo hrubých chemikálií.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obrázek je grafickou prezentací experimentálních výsledků, které ukazují, že syntetický peptid zkonstruovaný k napodobení fosforylovaných míst lidské tyrosinasy inhibuje tyrosinasovou aktivitu v pěstovaných lidských melanocytech. Předkládaný vynález je založen na přihlašovatelově objevu, že aktivace tyrosinasy, rychlost-limitujícího enzymu melanogenese, je výsledkem činnosti protein kinasy C-beta (zmiňována na tomto místě také jako PKC-Β), která zprostředkovává fosforylaci serinového a threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy. Tyrosinasa je transmembránový protein umístěný v melanosomech, které jsou obsaženy v melanocytech. Nukleotidová sekvence klonů cDNA lidské tyrosinasy byla publikována v Shibahara, S., et al., Tohoku J. Exp. Med., 156:403-414 (1988); Chinatamaneni, C.D., et al., Proč. Nati. Sci, U.S.A.. 88:5272-5276 (1991) aKown, B.S., et al., Proč. Nati. Sci. U.S.A.. 84:7473-7477 (1987), principy jsou zde obsaženy v odkazech. Předpokládaná lidská tyrosinasa je složena přibližně z 511 aminokyselinových zbytků (Shibahara, S., et al, Tohoku J. Exp. Med,. 156:403-414 (1988)). Cytoplasmatická doména obsahuje dva serinové zbytky v pozicích 505 a 509 aminokyselinové sekvence Shibauhaer et al. A Chinatamanei, C.D., etal.

Tyrosinasa je aktivována beta isoformou enzymu protein kinasa C (PKC-beta). V případě nepřítomnosti PKC-beta nedochází k vzniku pigmentu (Park, H-Y, et al., J, Biol. Chem,, 268:11742-11749 (1993)). Naopak aktivace PKC-Β nad základní úroveň zvyšuje pigmentaci v pěstovaných lidských melanocytech, myších nádorových buňkách a v pokožce morčat. PKC- beta (PKC-β) je serin/threoninová kinasa a aktivuje proteiny fosforylací těchto aminokyselinových zbytků. Park, H-Y. a Gilchrest, B.A., J. Dermatol. Sci.. 6:185-193 (1993)). Celý řetězec tyrosinasy vykazuje začlenění 32p fosfátů, nikoliv však samotná vnitřní doména, což vyvolává předpoklad, že PKC-β fosforyluje pouze cytoplasmatickou doménu (Park, H-Y., et al., J, Invest Dermatol.. 104:585 Abstract 186 (1995)).

Jak je zde popsáno, žadatel právě ukázal, že aktivace PKC-β v melanocytech vede k fosforylací tyrosinasy a specificky k fosforylací serinových zbytků v pozicích 505 a 509 cytoplasmatické domény tyrosinasy. Přihlašovatel ukázal, že odstranění cytoplasmatické domény tyrosinasy proteolysou zabraňuje fosforylací tyrosinasy prostřednictvím PKC-β. Žadatel tedy prokázal, že zabránění fosforylace tyrosinasy, kterou zprostředkovává enzym PKC-β, vede k zamezení aktivace rychlost-limitujícího enzymu melanogenese a tím k snížení nebo kompletnímu potlačení pigmentace v cílové tkáni, například v pokožce, vlasech, vlně a srsti obratlovců.

Molekuly či látky, které specificky zasahují nebo blokují interakci nebo asociaci PKC-β a tyrosinasy mohou specificky inhibovat nebo značně snižovat aktivaci tyrosinasy. Například molekuly, které specificky zasahují do fosforylace buď serinových zbytků 505 a 509 nebo obou, mohou zabránit aktivaci tyrosinasy. Jestliže tyrosinasa je neaktivovaná, melanogenese je podstatně inhibovaná, což vede ke snížení pigmentace nebo kompletnímu potlačení pigmentace v epidermálních melanocytech.

Takové molekuly, jako proteiny, peptidy, protilátky a části protilátek mohou zasahovat do interakce mezi PKC-β a tyrosinasou. Organické a anorganické molekuly také mohou zasahovat do této interakce. Takové molekuly se mohou vyskytovat přírodně a být poté čištěny nebo mohou být izolované z jejich přirozeného prostředí s využitím technik dobře známých těm, kteří se danou problematikou zabývají. Tyto molekuly mohou být také syntetizovány chemicky nebo produkovány pomocí rekombinací, také s využitím technik dobře známých těm, kteří mají zkušenost se stavem techniky.

Jak je zmiňováno zde, specifický zásah do interakce mezi PKC-β a tyrosinasou vede k zabránění nebo blokování fosforylace tyrosinasy, kterou PKC-β zprostředkovává. Může se jednat buď o kompletní nebo částečné blokování, které vede ke kompletní inhibici nebo značné redukci melanogenese v epidermálních melanocytech Úplná inhibice nebo značná redukce melanogenese v epidermálních melanocytech vede ke snížení pigmentace nebo úplnému potlačení pigmentace v pokožce, vlasech, vlně či srsti obratlovců.

Zvláště jsou v předkládaném vynálezu zahrnuty peptidy nebo fragmenty peptidů, které napodobují místa interakce mezi PKC-β a tyrosinasou. Tyto „peptidové napodobeniny'1 se podobají místům na nichž PKC-β zprostředkovává fosforylací tyrosinasy, to jest ·· ·· • · «·

> · · I » · «· ► ··· «· aminokyselinovým zbytkům, které slouží jako substrát pro PKC-B při zprostředkovávání fosforylace tyrosinasy. Substrátové sekvence tyrosinasových napodobenin typicky obsahují serinový a threoninový zbytek. Aminokyselinové sekvence tyrosinasových napodobenin například obsahují serinové zbytky 505 a 509 a další aminokyselinové zbytky, které je obklopují. Tyto tyrosinasové peptidové napodobeniny se váží přímo s PKC-B podobným způsobem jako se PKC-B váže na tyrosinasu, tím zabraňují PKC-B ve vazbě s tyrosinasou a tak zabraňují, redukují nebo zcela eliminují aktivaci tyrosinasy a následnou melanogenesy.

Tyrosinasovými napodobeninami užívanými v metodách zde popsaných mohou být například proteiny, peptidy (obsahující přírodní i modifikované aminokyseliny) nebo peptidové analogy (obsahující peptidové i nepeptidové části). Takové peptidové napodobeniny mohou být konstruovány s využitím D-isomerů spíše, než přírodních L-isomerů aminokyselin, aby se zvýšila jejich rezistence k proteolytické degradaci uvnitř živých buněk. Všechny tyrosinasové napodobeniny užívané v těchto metodách mají specifické charakteristiky týkající se biologické aktivity. Tyto charakteristiky zahrnují schopnost napodobenin vázat se na PKC-β a udržet biologicky aktivní konformaci.

Tyrosinasové peptidové napodobeniny použité v metodách popsaných zde obsahují nejméně pět aminokyselinových zbytků, obecně mají sekvenci v rozpětí od deseti do třiceti aminokyselinových zbytků, nejčastěji mají okolo dvaceti zbytků. Nicméně mohou být použity i delší napodobeniny (např.: délky celé cytoplasmatické domény nebo do velikosti okolo 60 - 65 aminokyselinových zbytků), pokud mají vhodné charakteristiky, které jsou popsány výše. Typicky je jedním z aminokyselinových zbytků tyrosinasových peptidových napodobenin serin nebo threonin. Například tyrosinasové napodobeniny jako SEQ ID NO.:l a SEQ ID NO.:4 jsou obzvláště použitelné v metodách popsaných zde.

Molekuly, které napodobují aktivní místa PKC-B, mohou být také použity v metodách zde popsaných. Molekuly napodobující PKC-B by se tak vázaly na substrátové sekvence tyrosinasy, ale tyrosinasu by neaktivovaly. Nicméně napodobenina PKC-B vázající se na substrát brání samotné PKC-B vázat se na tyrosinasu. Tak by napodobenina PKC-B také blokovala fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávanou PKC-B a působila tak jako kompetetivní antagonísta inhibující aktivaci tyrosinasy a snižující pigmentaci. Mezi takové PKC-B mohou patřit například proteiny, peptidy a organické a anorganické molekuly.

Napodobeniny tyrosinasy a PKC-B mohou být racionálně konstruovány a synteticky připraveny s využitím technik dobře známých těm, kteří mají zkušenost se stavem techniky, jak je například popsáno v Jameson, B.A., eí aL, Nátuře, 368:744-746 (1994). Látky vhodné jako napodobeniny tyrosinasy a PKfc-β mohou byt identifikovány a vyhledávány podle biologické aktivity (to jest podle schopnosti blokovat interakci PKC-β s tyrosinasou) s využitím in-vitro testování, které je dobře známo těm, kteří mají zkušenost s daným stavem techniky.

Například, jak je zde popsáno, jedna metoda se skládá z kultivace melanocytů obsahujících tyrosinasu v přítomnosti radioaktivně značeného 32P-orthofosfátu. Melanocyty mohou být získávány z kožních biopsií, novorozenecké předkožky nebo z nádorových buněčných linií (např.: Park, H-Y. et al., J. Biol, Chem.. 268:11742-11749 (1993)). Melanocyty jsou kontaktovány za účelem aktivace PKC-β s forbolovým esterem, s takovým jakým je například tetraforbol acetát (TPA). Další vhodné aktivátory PKC-β známé těm, kteří mají s zkušenost s daným stavem techniky. Zároveň, nebo následně, jsou kultivované melanocyty kontaktovány s látkou testovanou za podmínek vhodných pro fosforylaci tyrosinasy, kterou zprostředkovává PKC-β. Melanosomy obsahující tyrosinasu jsou pak purifikovány z melanocytů, upravených pomocí TPA, a tyrosinasa je isolována z melanosomů. Isolace může být provedena standardními laboratorními technikami. Především izolace za použití imunoprecipitace s protilátkou specifickou pro tyrosinasu je uváděna v předkládané metodě. Protilátka může být polyklonální nebo monoklonální. (Např.: Jimenez, M. et al, J, Biol. Chem,. 266:147-1156 (1991); Bouchard, B. et al., J. lnvest. Dermatol.. 102:291-295 (1994); nebo EPO 679, 660 Al 02/11/95). Imunoprecipitační testy mohou být prováděny jak je popsáno např. v Park, H-Y. et al., J. Biol. Chem,. 268:11742-11749 (1993). Množství 32P-orthofosfátu začleněného do imunoprecipitované tyrosinasy je určeno za použití standardních laboratorních technik a množství 32P-orthofosfátu začleněného do tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných za přítomnosti testované látky ΛΛ 4 t je porovnáno s množstvím P-orthofosfátu začleněného do tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných při absenci testované látky. Snížené množství 32P-orthofosfátu začleněného do tyrosinasy je údajem o tom, že testovaná látka zabraňuje fosforylaci (to jest aktivaci) tyrosinasy. Jestliže testovaná látka brání aktivaci tyrosinasy, a tyrosinasa je nezbytná pro melanogenesi a pigmentaci, pak pigmentace v epidermálních melanocytech obratlovců je zcela inhibována nebo je značně snížena.

Aktivita tyrosinasy může být měřena přímo s využitím známých laboratorních technik. Například Pomerantz, S.H. popsal test jak měřit aktivitu tyrosinasy (J. Biol. Chem.. 241:161-168 (1966), princip je zde obsažen v odkazech). Ve stručnosti, 5 x 106 buněk je krátce ultrazvukováno v 80 mM PO42' (pH 6.8) obsahujícím 1% Triton X-100 a tyrosinasa je extrahována 60 minut při 4 °C. 10-50 pg buněčných proteinů je inkubováno s 250 nM L-tyrosinem, 25 nM L-deoxyfenylalaninem, 12.5 pg chloramfenikolu a 5 pCi L-[3,5- H] tyrosmem « · · * po dobu 30-60 minut při 37 °C. Reakce je zastavena přidáním 500 μΐ 10% trichloroctové kyseliny obsahující 0.2% BSA. Materiál rozpuštěný v trichloroctové kyselině pak reaguje s Noritem A a uvolněná H2O je měřena scintilaČním detektorem. Aktivita uvolněné H2O je vyjádřena jako podíl naměřeného počtu impulsů za minutu a množství extrahovaného proteinu v pg za hodinu (impulsy/minutu uvolněné 3H20/pg proteinu/h) minus nespecifická inkorporace radioaktivity stanovená vařením lyzátu po dobu 30 minut (pozadí).

Navíc obsah melaninu v melanocytech může být měřen přímo tak, jak je například popsáno v Gordon, P.R. a Gilchrest, B.A., J. Invest. DermatoL 93:700-702 (1989), princip je zde také obsažen v citaci. Stručně, lidské melanomní buňky jsou kultivovány za standardních laboratorních podmínek. K měření obsahu melaninu je obvykle použito 1 x 105 buněk. Buňky jsou stáčeny 15 minut při 2 500 ot/min. a výsledná peleta je rozpuštěna v 0,5 ml 1 N NaOH. Koncentrace melaninu je vypočítávána při OD475 (optická denzita při 475 nm) a porovnávána se standardní křivkou syntetického melaninu.

Napodobeniny tyrosinasy a PKC-B, které vykazují aktivitu in viíro mohou být dále testovány in-vivo, například lokální aplikací na pokožku či srst morčat, jak je popsáno v Eller, M. et al. Nátuře. 372:413-414 (1994) nebo Allen eí al, J. Invest. DermatoL. (1995), ), principy jsou obsaženy v citacích.

Na druhé straně přihlašovatelův objev s ohledem na aktivaci tyrosinasy, rychlost-limitujícího enzymu melanogenese, prostřednictvím PKC-β poskytuje metody zvýšení syntézy melaninu a z toho důvodu tmavnutí pokožky, vlasů, vlny a srsti. Metody zde uvedené také umožňují zesílit nebo udržet stálou stavovou hladinu fosforylace tyrosinasy, jako výsledek blokování defosforylace serinových a threoninových zbytků cytoplasmatické domény tyrosinasy poskytováním umělého substrátu pro příslušnou fosforylasu v buňkách.

Zvláště rychlost syntézy melaninu v melanocytech je určena stavem aktivace tyrosinasy. Tento aktivovaný stav je dynamickou rovnováhou mezi aktivací (fosforylace) enzymu a deaktivací (defosforylace) enzymu, který je spojen s vnitrobuněčnými melanosomy. Fosforylace je zprostředkovávána PKC-B a defosforylace prostřednictvím jedné nebo více fosfatas. Zdá se racionální předpokládat, že různé fosfatasy jsou odpovědné za defosforylaci různých PKC-B substrátů, jak by bylo vyžadováno v situaci, v které by četné PKC substráty musely být regulovány nezávisle na normální buněčnou funkci.

Peptidová sekvence specifická pro katalytickou doménu fosfatasy, která je odpovědná za defosforylaci tyrosinasy, aktivované PKC-B, může být zkonstruována a dopravena do melanocytů v pokožce, vlasech, vlně nebo srsti či na nějaké další místo, kde je požadována zvýšená melanogenese. Tento „umělý substrát" pro fosfatasu soutěží s fosforylovaným místem

··· ···

• · Μ·· Μ ·· · · tyrosinasy ο aktivní místo fosfatasy a tak redukuje přístupnost fosfatasy k fyziologickému substrátu - tyrosinase. Tato metoda může být použita v případech, kdy je požadováno zvýšení obsahu melanin, například v místech pozánětové hypopigmentace pokožky obecně se vyskytující u pacientů s nízkým stupněm popálení pokožky nebo pro ztmavení odstínu lidských vlasů či barvy srsti a vlny u zvířat. Látky, které jsou takto poskytnuty buňkám, a které regulují aktivaci tyrosinasy, mohou regulovat syntézu melaninu v epidermálních melanocytech. Zvláště poskytování peptidových tyrosinasových napodobenin buňkám nebo tkáním může vést ke kompetetivní interakci přidaného peptidu s PKC-B, což snižuje přístupnost PKC-B k interakci s normálním vnitrobuněčným substrátem, v tomto případě s cytoplasmatickou doménou tyrosinasy, která je obsažena uvnitř melanocytu. Taková substrátová sekvence může interagovat specificky nebo přednostně s PKC-β, raději než s ostatními PKC isomery, protože ostatní PKC isomery neaktivují tyrosinasový protein. Ačkoliv PKC izomery jsou v buňkách a tkáních nacházeny všudypřítomně a je známa jejich schopnost zprostředkovávat široké a rozmanité množství kritických buněčných funkcí, substrátová sekvence specifická pro PKC-B působí přednostně na melanogení metabolickou cestu v melanocytech, protože PKC-B je minimálně exprimována v keratinocytech nebo fibroblastech, dalších hlavních typech buněk pokožky (Park, H-Y. eí ai, Clin. Res.. 39:148A (1991)).

Kromě toho je známo, že lidské nádorové buněčné linie postrádající kompletně PKC-B jsou nerozeznatelné od parentálních linií exprimujících tuto PKC isoformu, kromě faktu, že postrádají melaninové barvivo (Park, H.E. et al., J, Biol, Chem,. 286(16):11742-11749 (1993)). Toto silně naznačuje, že PKC-B neslouží k žádné jiné důležité funkci v melanocyt/melanomních buňkách, mimo role v melanogenesi.

Metody popsané v předkládaném vynálezu mohou být užity k úpravě pigmentace v melanocytech obratlovců cestou tlumení aktivace tyrosinasy. Zvláště metody popsané zde mohou být použity ke snížení nebo úplnému potlačení v pokožce, vlasech, vlně nebo srsti obratlovců. Tyto metody zahrnují dotýkání nebo dopravování účinného množství látky do epidermálních melanocytu (melanocytu umístěných v pokožce nebo ve vlasech, nebo kořínkových cibulkách vlny nebo srsti), látky, která zvyšuje pigmentaci zesilováním nebo podporováním aktivace melanocytů u obratlovců. Účinné množství takto označené látky je takové množství, umožňující regulovat (např.: značně redukovat nebo zcela inhibovat, nebo značně zesilovat či podporovat) fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávanou PKC-B v epidermálních melanocytech. Regulace fosforylace tyrosinasy v melanocytech může být zhodnocena použitím metod zde popsaných. • · 10 • · « « · ···· • · · · · · ···· · ··· · ·· «··· ·· «·· · · · ·« ·· Různé dopravní systémy, vhodné pro použití v předkládaném vynálezu, jsou dobře známé těm, kteří mají zkušenost s daným stavem techniky a mohou být použity k uplatnění účinných množství látek, takových jako jsou tyrosinasové peptidové napodobeniny, a inhibovat tak aktivaci tyrosinasy v melanocytech. Například protein opouzdřený v liposomech, mikročásticích nebo mikrokapsulích, exprese v rekombinantních buňkách, endocytosa zprostředkovávaná receptorem, nebo může být použito nukleové kyseliny, ať přírodně se vyskytující nebo kódující pseudo-ligand, jako část retrovirálního nebo jiného vektoru. V jedné části může být použito liposomové preparace. Liposomová preparace může zahrnovat jakýkoliv Iiposom, který proniknul skrz stratům corneum a splynul s buněčnou memránou, výsledkem čehož bylo dopravení obsahu liposomu do buňky. Liposomy mohou být preparovány metodami dobře známými pro tyto případy. Například mohou být použity liposomy jak jsou popsány v U S. Patent No. 5, 077, 211; No. 4, 621, 023; No. 4, 880, 635 nebo No. 5, 147, 652. Nebo také v Yarosh, D., et al., J. Invest. Dermatol.. 103 (4) :461-468 (1994) nebo Caplen, N.J., et al., Nátuře Med.. 1 (1) :39-46 (1995).

Liposomy mohou specificky zasahovat příslušné buňky (např.: epidermální melanocyty). Například membránový markér přednostně se exprimující v melanocytech, jako receptor melanocyt stimulujícího hormonu (MSH), může být začleněn do liposomu obsahujícího peptidovou napodobeninu, která zabraňuje aktivaci tyrosinasy. Liposomy mohou také specificky zasahovat a dopravovat látky do vlasových folikul, jak je popsáno níže v Li, L. a HofFman, R.M., et cil., principy jsou obsaženy zde v citacích. Takovýto liposomový dopravní systém může být také použit k transportu látek vlny a srsti.

Například peptidová napodobenina nebo zkonstruovaná DNA kódující peptidovou napodobeninu mohou být zapouzdřeny do liposomu technikami dobře známými těm, kteří mají zkušenost s daným stavem techniky. Zkonstruovaná DNA bude obsahovat DNA sekvenci kódující peptid a další sekvence nukleové kyseliny nezbytné pro expresi peptidu v buňkách obratlovců, (například Li, L. a Hoffman, R.M., Nátuře Med., 1:705-706 (1995) nebo Yarosh, D., et al., J, Invest. Dermatol.. 103:461-468 (1994)). Konstrukt liposom-DNA nebo spojení liposom-peptid (obsahující peptidovou napodobeninu) může být zaveden do obratlovců, například místním nanesením na pokožku, vlasy, vlnu či srst, nebo na pokožku obklopující vlasy, nebo kořínkové cibulky vlny či srsti. Konstrukt liposom-DNA nebo spojení liposom-peptid kontaktuje melanocyty, což vede k tomu, že obsah liposomu (DNA nebo peptid) je zaveden do melanocytů, v kterých je peptidová napodobenina exprimována nebo uvolněna a tím dochází k regulaci aktivace tyrosinasy. 4· «· 11 Látky používané v uvedených metodách se mohou také přímo uplatňovat *ve fyziologicky kompatibilním nosiči. Například peptidy, které mají velikost nezbytnou pro kompetetivní inhibici fosforylace (jíž zprostředkovává PKC-B) tyrosinasy, jsou dostatečně malé, aby byla umožněna jejich transepidermální doprava do melanocytů v epidermu a vlasech, vlně nebo kořínkových cibulkách srsti s využitím současné technologie. Peptid může být smíšen v aktuální nosič jako je gel, mast, pleťová voda, krém, pěna nebo šampon a bude obsahovat takové nosiče jako je voda, glycerol, alkohol, propylen, glykol, etanol (95%), polyoxyetylen monolauritát (5%) ve vodě, lauryl síran sodný (5%) ve vodě. Další látky jako jsou antioxidanty, zvlhčovadla, stabilizátory viskozity a podobná činidla smí být přidána, pokud je to nezbytné.

Vedle toho se v jistých případech předpokládá, že látky mohou být rozmístěny na požadovaném místě nad, v nebo pod pokožkou. Takové požadavky se týkají transdermálních náplastí, implantátů a injekcí, které uvolňují látky takovým způsobem, jako je kontaktování pokožky nebo vlasových folikul buď pasivním nebo aktivním uvolňovacím mechanismem.

Tyto dopravní prostředky mohou obsahovat také parfémy, odbarvovače, tužidla, opalovací krémy nebo jiné přísady. Látka může být aplikována například místně do epidermu v pravidelných intervalech jednou nebo dvakrát denně ve vhodném prostředku a v účinné koncentraci. Účinné množství napodobující látky, která reguluje aktivaci tyrosinasy může být použito u obratlovců, včetně člověka, s využitím výše popsaných metod. Aktuální předkládaná množství látky, která se uplatní, se budou obměňovat podle toho jak bude specifická napodobenina využívána, podle vyjádření přesného složení, podle způsobu aplikace, podle jednotlivých míst a užití u obratlovců. Koncentrace napodobeniny účinná k zabránění aktivace tyrosinasy u obratlovců, tak jako u lidí, může být určena použitím známých, obecných farmakologických protokolů. Předkládaný vynález také zahrnuje metody identifikace látky schopné měnit pigmentaci v epidermálních melanocytech obratlovců a látky těmito metodami identifikované. Tyto metody identifikují látky na základě účinku jaký látka má na aktivaci tyrosinasy, zprostředkovávanou protein kinasou C-B, v epidermálních melanocytech.

Například epidermální melanocyty obratlovců jsou kultivovány v kultuře za podmínek vhodných pro udržování růstu a životaschopnosti melanocytů. Testovaná látka (to jest test-látka) je pak zavedena do kultury melanocytů a takto do kultivovaných buněk. Kultura obsahující testovanou látku je udržována za podmínek vhodných pro tuto látku, aby mohla působit na tyrosinasovou aktivitu, např. inhibovat fosforylaci tyrosinasy, kterou zprostředkovává protein kinasa C-B. Kontrolní kultury melanocytů jsou také udržovány za podobných podmínek, ale bez přítomnosti 12 ♦ · 12 ♦ · ·· ·· testované látky. Po uplynutí přiměřené doby jsou melanocyty odstraněny nebo izolovány z kultury, např.: centrifugací, a tyrosinasa je z melanocytů izolována, např.: imunoprecipitací s protilátkou specifickou pro tyrosinasu. Imunoprecipitace může být také provedena s použitím specifické protilátky, která rozpoznává fragment tyrosinasy, například cytoplasmatickou doménu tyrosinasy.

Fosforylace tyrosinasy je poté hodnocena. Hodnocení fosforylace typicky zahrnuje stanovení množství nebo velikosti fosforylace, která se stala, zatím co byly melanocyty kultivovány s testovanou látkou. Standardní metodou kvantifikace je určení množství radioaktivně značeného fosfátu inkorporovaného do tyrosinasy, například 32P-orthofosfátu. Fosforylace tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných v přítomnosti testované látky je pak porovnána s fosforylací tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných bez testované látky. Jestliže látka má inhibiční vliv na protein kinasu C-β, která zprostředkovává fosforylací tyrosinasy, pak množství fosforylace tyrosinasy izolované z kultivovaných melanocytů pěstovaných v přítomnosti testované látky bude nižší než množství fosforylace tyrosinasy izolované z kontrolních melanocytů. Předkládaná metoda může být také užita k identifikaci látky, která má vliv na zvýšení pigmentace v epidermálních melanocytech obratlovců. Takové látky by mohly mít účinek zesílení fosforylace nebo podporování tyrosinasy ve fosforylovaném stavu. Jednotlivé kroky této metody jsou podobné jako kroky výše diskutované metody, kromě toho, že testovaná látka měla chtěné vlastnosti zesilování fosforylace, míry fosforylace tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných bez testované látky. Pro určení zda testovaná látka svým účinkem podporovala nebo prodlužovala u tyrosinasy fosforylovaný stav (tedy podporovala nebo prodlužovala aktivaci tyrosinasy) mohou být melanocytové kultury udržovány s nebo bez testovací látky prodloužené období, které předchází izolaci melanocytů a hodnocení fosforylace tyrosinasy izolované z melanocytů. Látky určené těmito in vítr o metodami mohou být dále testovány in vivo, například na morčatech, jak je popsáno vEller, M.S. et al., Nátuře. 372:413-414 (1944), principy jsou obsaženy v citacích. Látky, které jsou účinné in vivo mohou být použity v metodách upravování pigmentace epidermálních melanocytů obratlovců, jak bylo popsáno výše. Následující příklady více specificky vysvětlují vynález a nejsou nijak úmyslně omezovány. 13 13 »··· % ·

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU Příklad 1: Protein kinasa C-B fosforyluje tyrosinasu K prověření zda pouze PKC-B, a ne i jiné izoformy, fosforyluje tyrosinasu in vivo, byly melanocyty, které exprimují PKC-B, a nepigmentované MM4 lidské nádorové buňky, které srovnatelně exprimují tyrosinasu, ale mají nedostatečnou expresi PKC-B, preinkubovány s 32P-orthofosfátem po dobu 90 minut. (J. Invest. Perm.. Vol. 100, No. 4: Abst. #37 (April 1993) PKC-B byla aktivována úpravou buněk s použitím ΙΟ'7 Μ TPA, což je dobře známý aktivátor všech izoforem PKC, po dobu 30 minut. Kontrolní buňky obdržely pouze dopravní prostředek. Následně byla tyrosinasa imunoprecipitována s použitím polyklonální protilátky proti lidské tyrosinase a inkorporace 32P-orthofosfátu do tyrosinasy byla vizualizována autoradiografií Tyrosinasa byla fosforylována pouze v melanocytech upravených TPA, které exprimují PKC-B, což naznačuje, že pouze PKC-B, a ne jiné izoformy, může fosforylovat tyrosinasu in vivo. Příklad 2: Aktivita tyrosinasy je regulována fosforylací K určení zda aktivita tyrosinasy může být regulována fosforylací, byla tyrosinasa, která byla purifikována z hub, preinkubována s purifikovanou a aktivovanou PKC-B (Park, H-Y. et al., 1 Invest DermatoL 100:607 (1993) a Park, H-Y. el al., J. Biol. Chem.. 268:11742-11749 (1993)). Následně byla aktivita tyrosinasy vizualizována separací tyrosinasy a PKC-B na nedenaturující 7.5% akrylamidové gelové elektroforese, kterou následovala reakce s L-dopa. V místě, kde migruje tyrosinasa, se objevuje hnědě zbarvený pruh (melanin), jehož intenzita odpovídá enzymatické aktivitě. Samotná purifikovaná tyrosinasa vykazovala jistou aktivitu a aktivita vzrostla více než desetkrát, když byla tyrosinasa preinkubována s purifikovanou a aktivovanou PKC-B. Toto zvýšení není způsobeno díky možné interakci mezi PKC-B a L-dopa, protože samotná PKC-B s L-dopa nereagovala. Tato data jasně ukazují, že přímá fosforylace tyrosinasy prostřednictvím PKC-B vede k aktivaci tohoto enzymu. Příklad 3. Protein kinasa C-beta fosforyluje cytoplasmatickou doménu tyrosinasy

Aminokyselinová sekvence lidské tyrosinasy byla dříve popsána. Tyrosinasa má dva serinové zbytky v pozicích 505 a 509 v cytoplasmatické doméně (Shibahara, S., et al. Tohoku J. Exp.

Med.. 156:403-414 (1988) 14 • · • ·

• ·· · · ·· · · · I • · · · I ··· ···· ·· ··· ··· ·· ι· Přibližně 90 % tyrosinasového proteinu je uvnitř melanosomů, membránově vázaných organel uvnitř melanocytů, v kterých je syntetizováno a ukládáno melaninové barvivo. PKC-β se obvykle vyskytuje v cytoplasmě. K prověření, zda je prostřednictvím PKC fosforylována pouze cytoplasmatická doména tyrosinasy, byly melanocytové kultury preinkubovány s 32P-orthofosfátem, PKC byla aktivována úpravou s 10 '7 Μ TPA po dobu 60 minut a melanosomy (které obsahují tyrosinasu) byly purifikovány použitím sacharosové gradientově centrifugace. Purifikované melanosomy byly rozděleny do dvou skupin: vjedné zůstaly neupravené melanosomy, jako kontrola, a druhá skupina melanosomů byla upravena 0.25% trypsinem po dobu 60 minut při 37 °C, aby se z nich uvolnila cytoplasmatická doména. Následně byla trypsinem upravená i neupravená (celá délka) tyrosinasa extrahována z melanosomů inkubací v 0.1% Tritonu X-100 po dobu 60 minut a upravená resp. neupravená tyrosinasa byla imunoprecipitována s použitím polyklonální protilátky specificky reagující na vnitřní (intra-melanosomální) doménu resp. s použitím polyklonální protilátky proti celodélkové tyrosinase. 32P-orthofosfát byl inkorporován pouze do neupravené nebo celodélkové tyrosinasy (Park, H-Y., el al., J. Invest. Dermatol.. 1041, 585 Abstract 186 (April 1995)). Trypsinem upravená tyrosinasa, postrádající cytoplasmatickou doménu, nevykazovala inkorporaci 32P-orthofosfátu, což ukazuje, že pouze cytoplasmatická doména je fosforylována prostřednictvím PKC. V paralelním experimentu byly melanocytové kultury zpracovány stejně, jako je výše popsáno, kromě toho, že fosforylace byla prováděna bez radioaktivně značeného fosfátu. Analysa imunoblotem s neupravenou a trypsinem upravenou tyrosinasou potvrdila, že porovnatelné množství tyrosinasy bylo imunoprecipitováno použitím dvou různých protilátek. Příklad 4: Protein kinasa C-beta fosforyluje serinové a threoninové zbytky K prověření zda oba, serinový a threoninový, zbytky jsou fosforylovány prostřednictvím PKC, což je známá serin/threoninové kinasa, byla tyrosinasa fosforylována in vivo preinkubací melanocytů s 32P-orthofosfátem s následnou aktivací PKC s TPA, jak je popsáno v Příkladu 1. Následně byla tyrosinasa imunoprecipitována, elektroeluována z gelu a podrobena úplné hydrolyse Radioaktivně značené aminokyseliny byly separovány s použitím dvoudimensionální tenkovrstevné chromatografické standardní techniky a porovnány proti neznačeným a fosforylovaným serinovým, threoninovým a tyrosinovým standardům. Výsledky ukázaly, že >90 % radioaktivně značeného fosfátu bylo asociováno se serinem. Radioaktivně značený fosfát asociovaný s tyrosinem nebyl detekován. Tyto údaje kromě toho 15 ukazují, že tyrosinasa je fosforylována metabolickým dějem závislým na PKC, a že serinové zbytky jsou fosforylovány přednostně. Příklad 5: Šeřiny 505 a 509 jsou fosforylovány K přesné identifikaci, které serinové nebo threoninové zbytky jsou hlavně fosforylovány prostřednictvím PKC-β, byla tyrosinasa označena radioaktivním 32P-orthofosfátem tak, že melanocyty byly inkubovány s radioaktivně značeným fosfátem a tyrosinasa poté aktivována prostřednictvím PKC. Melanosomy byly následně purifikovány a celodélková tyrosinasa imunoprecipitována. Tyrosinasa byla pak upravena trypsinem, a pak thermolysinem. Protože pouze cytoplasmatická doména je fosforylována, tak štípáním celodélkové tyrosinasy by měla vzniknout pouze fosforylovaná cytoplasmatická doména

Na základě Sibaharovy aminokyselinové sekvence lidské tyrosinasy bylo předpovězeno, že vzniknou tři fragmenty, když bude cytoplasmatická doména lidské tyrosinasy štěpena trypsinem. Byly připraveny syntetické peptidy s nebo bez fosfátové skupiny navázané na serinových zbytcích. Při třech nezávislých experimentech byl všechen radioaktivně značený fosfát zjištěn na syntetickém peptidu 3, což naznačuje, že oba serinové zbytky jsou fosforylovány prostřednictvím PKC-β.

Cytoplasmatická doména tyrosinasy

Gln-Leu-Pro-Glu-Glu-Lys-Gln-Pro-Leu-Leu-Met-Glu-Lys-Glu-Tyr-His-(Ser)505-Leu-Tyr-Gln-(Ser)5o9-His-Leu (SEQ ID NO: 1)

Trypsin

Fragmentl: Gln-Leu-Pro-Glu-Glu-Lys (SEQ ID NO: 2)

Fragment 2: Gln-Pro-Leu-Leu-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO: 3)

Fragment 3: Glu-Asp-Tyr-His-(Ser)505-Leu-Tyr-Gln-(Ser)509-His-Leu (SEQ ID NO: 4)

Syntetické peptidy:

Peptid 1:: Glu-Asp-Tyr-His-p(Ser)505-Leu-Tyr-Gln-(Ser)509-His-Leu (SEQIDNO: 4)

Peptid2:: Glu-Asp-Tyr-His-(Ser)505-Leu-Tyr-Gln-p(Ser)509-His-Leu (SEQIDNO: 4)

Peptid 3:: Glu-Asp-Tyr-His-p(Ser)505-Leu-Tyr-Gln-p(Ser)509-His-Leu (SEQIDNO: 4) Příklad 6: Syntetický peptid inhibuje aktivitu tyrosinasy Párové kultury lidských melanocytů byly také neupravovány nebo upravovány 5, 10 nebo 20 pg/misku syntetického peptidu, jehož sekvence je shodná s částí lidské tyrosinasy, obsahující serinové zbytky v aminokyselinových pozicích 505 a 509. Specifická sekvence syntetického peptidu je Glu-Asp-Tyr-His-(Ser)505-Leu-Tyr-Gln-(Ser)5o9-His-Leu (SEQ ID NO: 4). Syntetický peptid byl předupraven 10 μΐ Lipofektaminu, aby byla zesílena doprava do buněk. Kontrola označuje neupravený peptid a 0 označuje samotný Lipofektamin. Melanocyty byly vystaveny Lipofektaminem upravenému syntetickému peptidu po dobu 22 hodin, poté byly sklizeny a byla určena aktivita tyrosinasy. TABULKA I Tyr Aktiv/ pg Proteinu CPM 1 CPM 2 CPM negl CPM neg2 Kontrola 14679,2 118490 119159 50443 40414 0 14807,4 126917 119698 50248 48203 5 17152,6 148889 119059 47579 48843 10 9536,9 96566 93442 46135 48504 20 7811,3 90265 84051 46312 49891

Jak ukazuje Tabulka I a Obrázek je aktivita tyrosinasy v kultivovaných lidských melanocytech inhibována z více než 50 % v těch kulturách, které byly upraveny 20 pg/misku (což odpovídá 2 pg/ml) syntetického peptidu, zkonstruovaného tak, aby napodobil místo lidské tyrosinasy na němž probíhá fosforylace. Přibližně 40 % inhibice bylo pozorováno při další nižší dávce odpovídající 1 pg/ml.

17 Příklad 7: Interakce protein kinasy C-Beta s TRP

• · · · · · · l’afRP2 ........

Pro zjištění, zda PKC reguluje také ostatní melanogení proteiny, jako jsou tyrosinase příbuzné proteiny (TRP 1 a TRP 2), byly melanocyty upraveny ΙΟ'7 Μ TPA po dobu 2 týdnů (podmínka známá k spotřebování PKC) a proteinové hladiny TRP 1 a TRP 2 byly určeny použitím imunoblotové analýzy se specifickými protilátkami. Spotřeba PKC neměla vliv na TRP 1, ale hladina glykosylované zralé formy TRP 2 (80 kd) byla redukována na 50 až 70 %. 65 kd neglykosylovaný TRP 2 prekursor nebyl ovlivněn spotřebováním PKC. K potvrzení, že opravdu pouze glykosylovaný TRP 2 je ovlivňován, byly melanocyty upraveny TPA po dobu 2 týdnů a označeny 3H-glykosaminem. TRP 1 a TRP 2 byly imunoprecipitovány a začlenění 3H-glykosaminu do těchto proteinů bylo prověřeno. Spotřeba PKC nepůsobila buď na glykosylovanou nebo neglykosylovanou formu TRP 1, ale začlenění 3H-glykosaminu do TRP 2 bylo zredukováno na méně než 50 %. Tyto výsledky společně naznačují, že PKC reguluje melanogenezi přednostní fosforylací serinových zbytků cytoplasmatické domény tyrosinasy a regulací hladiny zralého TRP 2 proteinu.

PRŮMYSLOVÁ VYUŽITELNOST

Ti, kteří mají zkušenosti s daným stavem techniky rozpoznají nebo budou schopni zjistit použití ne více než běžného experimentování, mnoho ekvivalentů specificky určujících vynález zde bylo popsáno. V následujících nárocích je zamýšleno zahrnout takovéto ekvivalenty.

Claims (25)

1« 4 · · · Ιο · · · PATENTOV É’N’Átt Ο K? 1 Způsob tlumení aktivace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců vyznačující se tím, že se skládá z tlumení fosforylace serinového a threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta.

2. Způsob zabránění aktivace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců vyznačující se tím, že se skládá z inhibování protein kinasy C-beta, která zprostředkovává fosforylaci serinového a threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy.

3. Způsob podle nároků 1 a 2 vyznačující se tím, že je zde inhibována fosforylace serinových zbytků 505, 509 nebo obou 505 a 509.

4. Způsob zabránění aktivace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců vyznačující se tím, že je do melanocytů zaveden peptid, který specificky zasahuje do fosforylace, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, serinových/threoninových zbytků cytoplasmatické domény tyrosinasy.

5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že je zde inhibována fosforylace serinových zbytků 505, 509 nebo obou 505 a 509. 6 Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že je zde peptid skládající se z aminokyselinové sekvence homologní k té, jakou obsahuje místo na cytoplasmatické doméně tyrosinasy, kde dochází k fosforylaci zprostředkovávané protein kinasou C-beta.

7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že je zde peptid, který se skládá z 5 až 30 aminokyselinových zbytků a nejméně jedním ze zbytků je serin nebo threonin

8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že je zde peptid zahrnující aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny skládající se z SEQ ID NO.. 1 a SEQ ID NO.: 4.

9. Způsob upravování pigmentace v pokožce, vlasech, vlně nebo srsti obratlovců vyznačující se tím, že se skládá z regulace fosforylace, zprostředkovávané protein 19 * 19 * ·· ·· ► ♦ · 4 » · ♦· ♦ ·· ♦ 4 • · kinasou C-beta, serinového nebo threomnov*eho z&ýtkú* *cytop*lasm*atické domény tyrosinasy, která je obsažena v epidermálních melanocytech.

10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že pigmentace v pokožce, vlasech, vlně nebo srsti obratlovců je zde snižována, což zahrnuje inhibici fosforylace zprostředkovávané protein kinasou C-beta, serinového nebo threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy, která je obsažena v epidermálních melanocytech.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že je zde inhibována fosforylace serinového zbytku 505, 509 nebo obou 505 a 509.

12. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že peptid, který zde specificky zasahuje do fosforylace, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, serinového nebo threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy, je zaváděn do epidermálních melanocytů.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že je zde peptid skládající se z aminokyselinové sekvence homologní k té, jakou obsahuje místo na cytoplasmatické doméně tyrosinasy, kde dochází k fosforylaci, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta.

14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že je zde peptid, který se skládá z 5 až 30 aminokyselinových zbytků a nejméně jedním ze zbytků je serin nebo threonin.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že je zde peptid zahrnující aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny skládající se z SEQ ID NO.: 1 a SEQ ID NO.: 4.

16. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že peptid je zde zaváděn do epidermálních melanocytů lokálním podáváním farmaceutické látky, která obsahuje peptid. 17 Způsob snižování pigmentace v pokožce, vlasech, vlně nebo srsti obratlovců vyznačující se tím, že zahrnuje inhibici fosforylace tyrosinasy v epidermálních melanocytech, které jsou obsaženy v pokožce nebo vlasech, v kořínkových cibulkách vlny nebo srsti obratlovců vyznačující se lokálním aplikováním na pokožku nebo vlasy, na kořínkové 20 * i ! cibulky vlny nebo srsti obratlovců. DNA konstrukt je zapouzdřeny do íiposomu. DNA konstrukt kóduje peptid skládající se z aminokyselinové sekvence homologní k té, jakou obsahuje místo na cytoplasmatické doméně tyrosinasy, kde dochází k fosforylaci, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, to znamená, že DNA konstrukt je zaváděn do melanocytů a peptid je exprimován v melanocytech, což vede k inhibici fosforylace tyrosinasy a tím snížení pigmentace.

18. Způsob identifikace látky, která mění pigmentaci v epidermálních melanocytech obratlovců, vyznačující se tím, že zahrnuje určení vlivu, který látka má na aktivaci tyrosinasy zprostředkovávané protein kinasou C-beta, v epidermálních melanocytech Pokud je aktivace tyrosinasy, zprostředkovávaná protein kinasou C-beta, změněna, je změněna i pigmentace v melanocytech obratlovců.

19. Způsob identifikace látky, která snižuje pigmentaci v epidermálních melanocytech obratlovců, vyznačující se tím, že zahrnuje určení vlivu, který látka má na inhibici fosforylace tyrosinasy, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, v melanocytech, což se skládá z těchto kroků: a) zavedení látky do kultivovaných melanocytů obratlovců, aby bylo zjištěno množství látky postačující k inhibici fosforylace tyrosinasy, jestliže látka má inhibiční vlastnosti; b) izolování tyrosinasy z melanocytů kultivováných v kroku a) a zhodnocení fosforylace izolované tyrosinasy; c) porovnání fosforylace tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných v kroku a) s fosforylaci tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných za stejných podmínek, ale bez účasti testované látky, čímž je určen vliv, jaký látka má na inhibici fosforylace tyrosinasy, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, což znamená, že jestliže látka inhibuje fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávánou protein kinasou C-beta, je pigmentace v melanocytech snižována.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že jsou zde melanocyty kultivovány v přítomnosti P-orthofosfátu; v kroku b) je určeno množství ' P-orthofosfátu začleněného do izolované tyrosinasy, a v kroku c) je množství P-orthofosfátu začleněného do tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných v kroku a) porovnáno * izolované z melanocytů s množstvím 32P-orthofosfátu začleněného* *dó* tyrosinasy* kultivovaných za stejných podmínek, ale bez účasti testované látky. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že izolace tyrosinasy zkultivovaných melanocytů je zde prováděna imunoprecipitací s protilátkou specifickou pro tyrosinasu nebo její fragment. Látka, vyznačující se tím, že inhibuje fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávanou protein kinasou C-beta a identifikována nebo identifikovatelná způsobem podle nároku 19 a je použitelná například pro terapii. Způsob identifikování látky, která zvyšuje pigmentaci v epidermálních melanocytecli obratlovců vyznačující se tím, že zahrnuje určení vlivu, který látka má na zesílení fosforylace tyrosinasy v melanocytech, kterou zprostředkovává protein kinasa G-beta, což se skládá z těchto kroků: a) zavedení látky do kultivovaných melanocytů obratlovců, aby bylo zjištěno množství látky postačující k zesílení fosforylace tyrosinasy, jestliže látka má inhibiční vlastnosti; b) izolování tyrosinasy z melanocytů kultivováných v kroku a) a zhodnocení fosforylace izolované tyrosinasy; c) porovnání fosforylace tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných v kroku a) s fosforylaci tyrosinasy izolované z melanocytů kultivovaných za stejných podmínek, ale bez účasti testované látky, čímž je určen vliv, jaký má látka na zesílení fosforylace tyrosinasy, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, což znamená, že jestliže látka inhibuje fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávánou protein kinasou C-beta, je pigmentace v melanocytech zvyšována. Látka, vyznačující se tím, že zesiluje fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávanou protein kinasou C-beta a identifikována nebo identifikovatelná způsobem podle nároku 23 a je použitelná například pro terapii. Použití činidla, vyznačující se tím, že tlumí fosforylaci, zprostředkovávanou protein kinasou C-beta, serinového nebo threoninového zbytku cytoplasmatické domény 44 44 · · ·· • · 22 • · · · «* ·· · ··· · · 4 4 44 • · · * · · · ·«» · · • 4 · 4 · ··· tyrosinasy, která je obsažena v epidermáhiích* melanocytech obratlovců,*pro výrobu léku z důvodu tlumení aktivace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců.

26. Použití činidla, vyznačující se tím že inhibuje fosforylaci, zprostředkovávanou protein kinasou C-beta, serinového nebo threoninového zbytku cytoplasmatické domény tyrosinasy, která je obsažena v epidermálních melanocytech obratlovců, pro výrobu léku z důvodu zamezení aktivace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců

27. Použití peptidu, vyznačujícího se tím, že specificky zasahuje do fosforylace serinových/threoninových zbytků zprostředkováváné protein kinasa C-beta, v cytoplasmatické doméně tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců, pro výrobu léku z důvodu zamezení aktivace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců zavedením peptidu do melanocytů.

28. Použití podle nároku 27 vyznačující se tím, že je zde lék pro měnění pigmentace v pokožce, vlasech, vlně a srsti obratlovců. 29 Použití podle nároku 28 vyznačující se tím, že je zde lék pro snižování pigmentace v pokožce, vlasech, vlně a srsti obratlovců.

30. Použití podle některého z nároků 27, 28 a 29 vyznačující se tím, že je zde inhibována fosforylace serinového zbytku 505 nebo 509.

31. Použití podle nároku 29 nebo nároku 30 vyznačující se tím, že je zde činidlo obsahující peptid, který specificky zasahuje do fosforylace serinového nebo threoninového zbytku, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, v cytoplasmatické doméně tyrosinasy, poté co vstoupil do epidermálních melanocytů.

32. Použití podle nároku 27 nebo nároku 31 vyznačující se tím, že je zde peptid skládající se z aminokyselinové sekvence homologní k té, jakou obsahuje místo na cytoplasmatické doméně tyrosinasy, kde dochází k fosforylaci, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta. Použití podle nároku 32 vyznačující se tím**ze je zde peptičf,* který* se skládá z 5 až 30 aminokyselinových zbytků a nejméně jedním ze zbytků je serin. Použití podle nároku 33 vyznačující se tím, že je zde peptid zahrnující aminokyselinové sekvence vybrané z SEQ ID NO.: 1 a SEQ ID NO.: 4. Použití podle nároku 35 vyznačující se tím, že je zde lék farmaceutického složení obsahující peptid, který je zaváděn do epidermálních melanocytů lokálním podáváním. Použití DNA konstruktu pro výrobu léku na snižování pigmentace v pokožce, vlasech, vlně nebo srsti obratlovců, vyznačující se tím, že je inhibována fosforylace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců, které jsou obsaženy v pokožce nebo vlasech, v kořínkových cibulkách vlny nebo srsti; lék pro lokální aplikaci na pokožku nebo vlasy, kořínkové cibulky vlny nebo srsti obratlovců obsahující DNA konstrukt zapouzdřený v liposomu; DNA konstrukt kódující peptid, který se skládá z aminokyselinové sekvence homologní k té, jakou obsahuje místo na cytoplasmatické doméně tyrosinasy, kde dochází k fosforylaci, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, což znamená, že když je DNA konstrukt zaveden do melanocytů, peptid se exprimuje v melanocytech a výsledkem pak je inhibice fosforylace tyrosinasy. Použití peptidu k výrobě léku pro snížení pigmentace v pokožce, vlasech, vlně a srsti vyznačující se inhibicí fosforylace tyrosinasy v epidermálních melanocytech obratlovců, které jsou obsaženy v pokožce nebo vlasech, v kořínkových cibulkách vlny nebo srsti; lék obsahující peptid zapouzdřený do liposomu pro lokální aplikaci na pokožku či na pokožku, která obklopuje vlasy, nebo kořínkové cibulky vlny nebo srsti obratlovců; peptid skládající se z aminokyselinové sekvence homologní k té, jakou obsahuje místo na cytoplasmatické doméně tyrosinasy, kde dochází k fosforylaci, kterou zprostředkovává protein kinasa C-beta, což znamená, že když je peptid zaveden do melanocytů, je fosforylace tyrosinasy inhibována. Látka, vyznačující se tím, že tlumí fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávanou protein kinasou C-beta a je použitelná pro terapii zahrnující například úpravu pigmentace. 24

39. Použití pro kosmetické účely, jako je napříklacf úprava pigmentace, vyznačující se tím, že je zde látka, která tlumí fosforylaci tyrosinasy zprostředkovávané protein kinasou C-beta.