KR100524261B1

KR100524261B1 - 멜라닌 합성을 조절하는 방법

Info

Publication number: KR100524261B1
Application number: KR1019980707686A
Authority: KR
Inventors: 바바라 에이. 길치레스트; 희-영 박
Original assignee: 트러스티스 오브 보스턴 유니버시티
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2006-05-09
Also published as: KR20000005059A

Abstract

본원에 기술된 본 발명의 방법을 사용하게 되면 척추 동물의 피부, 모발, 울 또는 모피는 멜라닌 형성시에 속도 제한 효소인 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 중재된 활성화를 조절하는 펩티드를 코딩시키는 물질, 예를 들어, 펩티드, 항체, 항체 단편 또는 DNA 서열의 투여에 의해 색을 밝아지거나 어두워질 수 있다.

Description

멜라닌 합성을 조절하는 방법

배경 기술

멜라닌 세포내의 증가된 멜라닌 함량 및 주위의 각질 세포로 인한, 미용에 부적합한 피부의 과색소침착은 화상, 또는 그 밖의 상해로부터 일어날 수 있으며, 또한 점 및 일부 피부 질환의 특징이다. 일반적으로, 이들 상태의 교정은 화상을 입은 피부를 대체시키기 위한 동통성 이식, 또는 수술, 예를 들어 레이저 수술 또는 원치 않은 착색 부위의 절제를 종종 포함한다.

때로는, 털(hair), 울(wool), 퍼(fur)의 색을 밝게 하는 것도 바람직하다. 예를 들어, 몇몇 사람들은 미용 목적으로 얼굴 또는 머리의 털을 밝게 하거나 "표백"시킨다. 털을 표백시키기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 털 주위의 민감한 피부를 자극하고 모간(hair shaft)을 손상시키며, 때로는 파손시킬 수 있는 독한 화학물질을 사용한다. 더욱이, 모간의 상부는 상기 처리에 의해 영향을 받아서 피부 표면 및 그 아래에 암근(dark root)이 남는다. 이들 암근은 결국 자라서, 이들 표백용 화학물질의 반복 적용이 필요하게 된다.

수술 절차 또는 독한 화학물질을 필요로 하지 않으면서, 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 감소시키거나 억제시키는 유용한 방법이 유리할 것이다.

발명의 요약

본 발명은 멜라닌 생성시의 속도 제한 효소(rate-limiting enzyme)인 티로시나아제의 활성화가 티로시나아제의 세포질 도메인의 세린 및 트레오닌 잔기의 단백질 키나아제 C-베타(본원에서 PKC-β로도 지칭) 매개 포스포릴화로부터 초래된다는 본 발명자들의 발견에 토대를 두고 있다.

티로시나아제는 멜라닌 세포(색소 세포)에서만 발견된다. 이들 세포는 표피의 기저층 및 모근구에 위치한다. 멜라닌 색소는 멜라노좀(melanosome)이라 불리는 멜라닌 세포 특이적 소기관에 침착되며, 멜라노좀은 멜라닌 세포로부터 주위 각질 세포로 이동하여, 색소가 피부의 표피(외층) 또는 모간을 통해 광범위하게 분산된다. 척추 동물의 피부, 털, 울 및 퍼의 색(색소침착)은 주로 멜라닌 색소 함량에 의해 결정된다.

멜라노좀에 국재하는 구리 결합 막투과 당단백질인 티로시나아제는, 멜라닌 생합성 순서의 처음 두 반응인 티로신 하이드록실화 및 후속적인 산화를 촉매하는 능력으로 인해, 멜라닌 합성시에 주된 속도 제한 효소이다. 트랜스펙션 실험은 티로시나아제만으로 그 밖의 다른 비멜라닌 생성 세포가 멜라닌 색소를 생성시킬 수 있음을 입증하였고[참조: Bouchard, B, et al., J. Exp. Med., 169: 2029-2042 (1989)]; 사람 및 쥐의 티로시나아제 유전자의 클로닝은 백색증, 즉 착색 능력의 유전성 손상을 초래하는 많은 돌연변이의 맵핑을 가능케하였다[참조: King, R.A., et al., PIGMENTATION AND PIGMENTARY DISORDERS, Levine, N., (ed.), CRC Press, Boca Raton. FL, pp. 297-336 (1993)].

수개의 다른 효소가 멜라닌 생합성에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 이들은 티로시나아제 관련 단백질 1 및 2(TRP 1 및 TRP 2)를 포함한다[참조: Cohen, T., et al., Nucleic Acids Res., 18:2807-2808 (1990); Jackson, I.J., et al., EMBO J., 11:527-535 (1992)]. 이들의 명칭이 의미하는 바와 같이, TRP는 구조적으로 티로시나아제와 관련이 있다. 특히, 이들의 구조 및 기능에 중요한 영역인, 구리 결합 부위 및 시스테인이 많은 도메인에서 유전자가 일치한다[참조: Hearing, V.J. and King, R.A., PIGMENTATION AND PIGMENTARY DISORDERS, Levine, N.,(ed.), CRC Press, Boca Raton. FL, pp. 3-32 (1993)]. TRP의 특정 기능은 공지되어 있지 않다. 그러나, 최근의 데이터는 티로시나아제, TRP 1 및 TRP 2가 생체내에서 상호 작용하여 복합체를 형성하고 이러한 복합체내에서 티로시나아제 활성이 감소되는 것으로 시사하고 있으며, 이는 TRP가 티로시나아제 활성의 억제제로서 작용할 수 있다는 것을 의미한다[참조: Orlow, S.J., et al., J Invest. Dermatol., 103:196-201 (1994)].

특히, 본 발명자들은 PKC-β에 의해 포스포릴화되는 티로시나아제의 세포질 도메인에서 특정 세린 잔기를 확인하였다. 본 발명자들의 발견의 결과로서, 척추 동물 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 활성화를 조절하는 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 "조절하다"는 활성화를 방지하거나 억제(감소)함으로써, 또는 활성화를 증대시키거나 지속시킴으로써 티로시나아제의 활성화를 변화시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 티로시나아제의 활성화는 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화를 실질적으로 감소시키거나 완전히 차단함으로써 조절될 수 있다. 역으로, 티로시나아제 활성화는 활성화를 증대시킴으로써, 예를 들어 티로시나아제의 포스포릴화를 촉진시킴으로써, 또는 활성화를 지속시킴으로써, 예를 들어 티로시나아제의 탈포스포릴화를 방지함으로써 조절되어 멜라닌 생성을 증가시킬 수 있다.

표피, 털, 울, 및 퍼 모근에 함유된 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 활성화를 조절한 결과로서 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 변화시키는 방법이 또한 제공된다.

본원에서 사용되는 용어 표피 멜라닌 세포는 피부 및, 털, 울 및 퍼의 모근 또는 소낭에 함유된 멜라닌 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 색소침착의 변화는 표피 멜라닌 세포내 색소침착이 멜라닌 생성의 증가를 초래하는 티로시나아제의 활성화의 결과로서 증가되거나, 대안적으로 색소침착이 멜라닌 생성의 감소를 초래하는 티로시나아제의 활성화 억제의 결과로서 감소되는 것을 의미한다.

본 발명의 하나의 구체예는 척추 동물 표피 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 활성화를 방해하거나 억제하는 방법에 관한 것이다. 티로시나아제는 내부 도메인, 짧은 막투과 도메인 및 세포질 도메인을 갖는 모노머 단백질이다. 티로시나아제의 세포질 도메인은 세린 잔기를 함유한다. 이들 세린 아미노산 잔기는 PKC-β에 의한 포스포릴화에 적합한 기질이다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 티로시나아제 아미노산 서열[참조: Shibahara, S., et al., Tohoku J. Exp. Med., 156:403-411 (1988)]의 505 및 509 위치에 있는 세린이 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화 부위라는 것을 입증하였다. 세린 505 및/또는 509의 포스포릴화를 억제하는 것은 티로시나아제의 활성화를 억제한다.

티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화의 억제는 표피 멜라닌 세포내 티로시나아제의 활성화를 억제하여, 멜라닌 세포내 멜라닌 색소의 생성을 감소시킨다. 이와 같이, 본 발명의 또 다른 구체예는 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 감소시키거나 완전히 억제하는 것에 관한 것이다.

역으로, 예를 들어 활성화된 티로시나아제의 탈포스포릴화를 억제함으로써 티로시나아제 활성화를 증대시키거나 지속시키면, 표피 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성을 지속시키거나 연장시켜서 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼의 색소침착이 증가된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 색소침착을 감소시키거나 완전히 억제하는 물질을 확인하는 방법이 제공된다. PKC-β와 티로시나아제의 상호작용 또는 결합을 특이적으로 방해하는 물질, 예를 들어 펩티드는 티로시나아제 포스포릴화 부위의 서열/구조를 모방하고(예를 들어, 펩티드 모방물(peptide mimic)), PKC-β에 결합함으로써, PKC-β가 티로시나아제를 포스포릴화시키지 못하도록 하여 티로시나아제 활성화를 억제한다.

역으로, 척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 색소침착을 증가시키는 물질을 확인하는 방법이 또한 제공된다. 티로시나아제의 탈포스포릴화와 관련된 포스파타아제를 특이적으로 방해하는 물질, 예를 들어, 펩티드는 티로시나아제 탈활성화를 억제한다. 본원에 기술된 방법에 의해 확인된 물질은 본 발명에 또한 포함된다.

본 발명자들이 멜라닌 생성시 속도 제한 효소인 티로시나아제상의 특정 포스포릴화 부위를 발견한 결과로서, 본 발명의 방법은 척추 동물의 표피 멜라닌 세포에서 티로시나아제 활성화 및 색소침착을 조절하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 현재 피부, 털, 울 및 퍼의 색소침착을 증가시키는데 유용하다. 특이적으로, 본 발명의 방법은 수술 또는 독한 화학물질 없이도 피부, 털, 울 및 퍼의 색소침착을 감소시키거나 부분적으로 또는 완전하게 억제하는데 유용하다.

도면의 간단한 설명

도 1은 사람 티로시나아제의 포스포릴화 부위와 유사하도록 구성된 합성 펩티드가, 배양된 사람 멜라닌 세포내에서 티로시나아제 활성을 억제하는 것을 나타내는 실험 결과의 그래프이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 멜라닌 생성시 속도 제한 효소인 티로시나아제의 활성화가 티로시나아제의 세포질 도메인의 세린 및 트레오닌 잔기의 단백질 키나아제 C-베타(본원에서 PKC-β로도 지칭) 매개 포스포릴화로부터 초래된다는 본 발명자들의 발견에 기초를 두고 있다. 티로시나아제는 멜라닌 세포에 함유된 멜라노좀에 국재하는 막 투과 단백질이다. 사람 티로시나아제에 대한 cDNA 클론의 누클레오티드 서열은 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Shibahara, S., et al. Tohoku. J. Exp. Med., 156:403-414 (1988); Chinatamaneni, C,D., et al. Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A., 88:5272-5276 (1991) and Kown, B.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7473-7477(1987)]에 보고되어 있다. 추정되는 사람 티로시나아제는 약 511개의 아미노산으로 구성된다[참조: Shibahara, S., et al. Tohoku. J. Exp. Med., 156:403-414 (1988)], 세포질 도메인은 쉬바우하에르(Shibauhaer) 등 및 키나타마네, 씨. 디.(Chinatamanei, C.D.) 등의 아미노산 서열의 505 및 509 위치에서 두 개의 세린 잔기를 포함한다.

티로시나아제는 단백질 키나아제 C의 베타 이소형(PKC-베타)에 의해 활성화된다. PKC-베타가 없으면, 어떠한 멜라닌 색소도 형성되지 않는다[참조: Park, H-Y, et al., J. Biol. Chem., 268:11742-11749(1993)]. 역으로, 기본 수준 이상의 PKC-베타의 활성화는 배양된 사람의 멜라닌 세포, 쥐의 흑색종 세포 및 기니아 피그 피부에서 색소침착을 증가시킨다. PKC-베타(PKC-β)는 세린/트레오닌 키나아제이고 이들 아미노산 잔기의 포스포릴화에 의해 단백질을 활성화시킨다[참조: Park, H-Y. and Gilchrest, B.A., J. Dermatol. Sci., 6:185-193 (1993)]. 전장(full length) 티로시나아제는 22p 포스파아제의 혼입을 나타내지만, 내부 도메인만은 그렇지 않으며, 이는 PKC-β가 단지 세포질 도메인만을 포스포릴화시킨다는 것을 시사한다[참조: Park, H-Y., et al., J. Invest Dermatol., 104:585 Abstract 186 (1995)].

본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 멜라닌 세포에서 PKC-β의 활성화가 티로시나아제의 포스포릴화, 특이적으로 티로시나아체의 세포질 도메인에서 위치 505 및 509의 세린 잔기를 포스포릴화시킨다는 것을 입증하였다. 본 발명자들은 단백질 분해에 의한 티로시나아제의 세포질 도메인의 제거가 PKC-β에 의한 포스포릴화를 억제한다는 것을 추가로 입증하였다. 이와 같이, 본 발명자들은 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화를 억제하는 것이 멜라닌 생성시 속도 제한 효소의 활성화를 억제하고 결과적으로 표적 조직, 예를 들어 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 감소시키거나 완전히 억제한다는 것을 입증하였다.

PKC-β와 티로시나아제의 상호작용 또는 결합을 특이적으로 방해하거나 차단하는 분자 또는 물질은 티로시나아제의 활성화를 특이적으로 억제하거나 실질적으로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 세린 잔기 505 및 509, 또는 둘 모두의 포스포릴화를 특이적으로 방해하는 분자는 티로시나아제 활성화를 억제시킬 수 있다. 티로시나아제가 활성화되지 않으면, 멜라닌 생성은 현저하게 억제되어 표피 멜라닌 세포에서 색소침착을 감소시키거나, 색소침착을 완전히 억제시킨다.

단백질, 펩티드, 항체 및 항체 단편과 같은 분자는 PKC-β와 티로시나아제 사이의 상호작용을 방해할 수 있다. 유기 및 무기 분자도 이러한 상호작용을 방해할 수 있다. 이러한 분자는 천연에 존재할 수 있고, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 천연 환경으로부터 정제되거나 분리될 수 있다. 이러한 분자는 화학 수단에 의해 합성될 수 있거나, 당분야에서 공지된 기술을 사용하여 재조합적으로 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 표현 "PKC-β와 티로시나아제간의 상호작용의 특이적 방해"는 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화의 방해 또는 차단을 지칭한다. 차단은 표피 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성의 완전한 억제 또는 실질적인 감소를 초래하는 완전한 차단 또는 부분적인 차단일 수 있다. 표피 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성의 완전한 억제 또는 실질적인 감소는 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 감소시키거나 완전하게 억제한다.

PKC-β와 티로시나아제간의 상호작용 부위를 모방하는 펩티드 또는 펩티드 단편은 본 발명에 특이적으로 포함된다. 이들 "펩티드 모방물"은 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화의 부위, 즉 PKC-β매개 포스포릴화를 위한 티로시나아제의 기질 서열을 포함하는 아미노산 잔기를 모방한다. 티로시나아제 모방물의 기질 서열은 전형적으로 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함한다. 티로시나아제 모방물의 아미노산 서열은, 예를 들어 세린 잔기 505 및 509, 및 이들 각각의 주위 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 티로시나아제 펩티드 모방물은 PKC-β가 티로시나아제에 결합하는 것과 유사한 방식으로 PKC-β에 직접 결합함으로써, PKC-β가 티로시나아제에 결합하는 것을 방해하여, 티로시나아제의 활성화 및 후속적인 멜라닌 생성을 방지하거나 감소시키거나 완전히 제거한다.

본원에 기술된 방법에 사용된 티로시나아제 모방물은, 예를 들어 단백질, 펩티드(천연 및 비천연 아미노산으로 구성) 또는 펩티드 유사체(펩티드 및 비펩티드 부분으로 구성)일 수 있다. 상기 펩티드 모방물은 아미노산의 천연 L-이성질체 보다는 D-이성질체로 구성되어 살아있는 세포내에서 단백질 분해에 대한 이들의 내성을 증가시킨다. 이들 방법에서 사용된 모든 티로시나아제 모방물은 생물학적인 활성에 속하는 특성을 갖는다. 이들 특성은 PKC-β에 결합하는 이들 모방물의 능력 및 생물학적 활성 형태의 유지를 포함한다.

본원에 기술된 방법에서 사용된 티로시나아제 펩티드 모방물은 5개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 일반적으로 약 10 내지 약 30개의 아미노산 잔기를 가지며 전형적으로는 약 20개의 잔기를 갖는다. 그러나, 보다 긴 모방물(예를 들어, 전체 세포질 도메인의 길이, 또는 약 60 내지 65개의 아미노산 잔기의 길이)이 상기 원하는 특성을 갖는 경우에 사용될 수 있다. 전형적으로, 티로시나아제 펩티드 모방물 잔기 중의 한 잔기는 세린 또는 트레오닌이다. 예를 들어, 서열번호 1 및 서열번호 4와 같은 티로시나아제 모방물은 본원에 기술된 방법에 특히 유용하다.

PKC-β의 활성 부위를 모방하는 분자가 본원에 기술된 방법에 또한 사용될 수 있다. 그러한 PKC-β모방 분자는 티로시나아제 기질 서열에 결합하지만 티로시나아제를 활성화시키지는 않을 것이다. 그러나, 기질에 결합되는 PKC-β모방물은 PKC-β가 티로시나아제에 결합하지 못하도록 한다. 이와 같이, PKC-β모방물은 또한 경쟁적 길항제로서 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화를 차단하여 티로시나아제의 활성화를 억제하고 색소침착을 감소시킬 것이다. 그러한 PKC-β모방물은, 예를 들어 단백질, 펩티드, 유기 또는 무기 분자를 포함할 수 있다.

티로시나아제 모방물 및 PKC-β모방물은, 예를 들어 문헌[참조: Jameson, B.A., et al., Nature, 368:744-746 (1994)]에 기술된 바와 같이 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 합리적으로 설계되고 합성적으로 생성될 수 있다. 티로시나아제 모방물 및 PKC-β모방물은 당분야에 널리 공지된 시험관내 검정법을 사용하여 생물학적 활성(즉, 티로시나아제와 PKC-β와의 상호작용을 차단하는 능력)에 대해 확인되고 스크리닝될 수 있다.

예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 하나의 방법은 ³²P-오르토포스페이트와 같은 방사성 표지의 존재하에 티로시나아제를 함유하는 멜라닌 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 멜라닌 세포는 피부 생검, 신생아 포피 또는 흑색종 세포주로부터 수득될 수 있다[참조: Park, H-Y, et al., J. Biol. Chem., 268:11742-11749 (1993)]. 멜라닌 세포를 테트라포르볼 아세테이트(TPA)와 같은 포르볼 에스테르와 접촉시켜 PKC-β를 활성화시킨다. 당업자에게 공지된 그 밖의 적합한 PKC-β 활성화제가 사용될 수 있다. 동시에, 또는 후속하여, 배양된 멜라닌 세포를 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화에 적합한 조건하에서 시험하려는 물질과 접촉시킨다. 그 다음, 티로시나아제 함유 멜라노좀을 TPA 처리된 멜라닌 세포로부터 정제시키고 티로시나아제를 멜라노좀으로부터 분리시킨다. 분리는 표준 실험 기술에 의해 수행될 수 있다. 특히, 티로시나아제에 특이적인 항체와의 면역침전에 의한 분리는 본 발명에 포함된다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다[참조: Jimenez, M. et al., J. Biol. Chem., 266:147-1156 (1991); Bouchard, B. et al., J. Invest. Dermatol., 102:291-295 (1994); or EPO 679,660 A1 02/11/95].

면역침전 검정법은 예를 들어 문헌[참조: Park, H-Y. et al., J. Biol. Chem., 268:11742-11749 (1993)]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 면역침전된 티로시나아제에 혼입된 ³²P-오르토포스페이트의 양을 표준 실험 기술을 사용하여 측정하고, 시험 물질의 존재하에 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제내로 혼입된 ³²P-오르토포스페이트의 양을 시험 물질의 부재하에 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제내로 혼입된 ³²P-오르토포스페이트의 양과 비교한다. 티로시나아제내로 혼입된 ³²P-오르토포스페이트량의 감소는 시험 물질이 티로시나아제의 포스포릴화(즉, 활성화)를 억제한다는 것을 나타내는 것이다. 시험 물질은 티로시나아제의 활성화를 억제하고, 티로시나아제는 멜라닌 생성 및 색소침착에 필수적이므로, 척추 동물 표피의 멜라닌 세포에서 색소침착은 완전히 억제되거나 실질적으로 감소된다.

대안적으로, 티로시나아제 활성은 이외 널리 공지된 실험 기법을 사용하여 직접적으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 참고로 인용된 문헌[참조: Pomerantz, S.H., J. Biol. Chem., 241:161-168 (1966)]에는 티로시나아제의 활성을 측정하는 검정법이 기술되어 있다. 요약하면, 5 x 10⁶ 세포를 1% 티톤(Titon) X-100을 함유하는 80mM PO₄ ^2-(pH 6.8) 중에서 초음파 처리시키고, 티로시나아제를 4℃에서 60분 동안 추출한다. 10 내지 50㎍의 세포 단백질을 37℃에서 30 내지 60분 동안 250nM L-티로신, 25nM L-데옥시페닐알라닌, 12.5㎍의 클로르암페니콜 및 5μCi의 L-[3,5-³H]티로신과 함께 인큐베이션시킨다. 0.2% BSA를 함유하는 10% 트리클로로아세트산 500㎍를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 트리클로로아세트산 가용성 물질을 노리트(Norit) A와 반응시키고, 방출된 ³H₂O를 섬광 계수기를 사용하여 측정한다. 활성은 30분 동안 끓인 용해질을 사용하여 측정된 비특이적 방사능 혼입(백그라운드)을 뺀 카운트/분 방출된 ³H₂O/㎍ 단백질/h로 표시된다.

추가로, 멜라닌 세포의 멜라닌 함량은 예를 들어, 본원에서 참고로 인용된 문헌[참조: Gordon, P.R. and Gilchrest, B.A., J. Invest. Dermatol., 93:700-702 (1989)]에 기술된 바와 같이 직접 측정될 수 있다. 요약하면, 사람 흑색종 세포를 표준 실험 조건하에서 배양시킨다. 1 x 10⁵ 세포를 통상적으로 사용하여 멜라닌 함량을 측정한다. 세포를 15분 동안 2,500rpm에서 회전시키고, 형성된 펠릿을 0.5㎖의 1N NaOH중에서 용해시킨다. 멜라닌 농도는 OD₄₇₅ 및 합성 멜라닌의 표준 곡선과의 비교에 의해 계산된다.

시험관내 활성을 나타내는 티로시나아제 모방물 및 PKC-β모방물은, 예를 들어 본원에 참고로 인용된 문헌[참조: Eller, M. et al., Nature, 372:413-414 (1994) or Allen et al., J. Invest. Dermatol.,(1995)]에 기술된 바와 같이 기니아 피그 피부 또는 털에 국소 적용하여 추가로 생체내 시험할 수 있다.

역으로, 멜라닌 생성시 속도 제한 효소인 티로시나아제의 PKC-β활성화에 관한 본 발명자들의 발견은 멜라닌의 합성을 증가시켜서, 피부, 털, 울 및 퍼의 색을 짙게 하는 방법을 제공한다. 본원에서는 또한 세포에서 관련 포스포릴라아제에 대한 가기질(false substrate)을 제공함으로써 티로시나아제의 세포질 도메인의 세린 및 트레오닌 잔기의 탈포스포릴화를 차단한 결과, PKC-β에 의한 티로시나아제의 포스포릴화의 항정 상태 수준(steady state level)을 개선시키거나 유지시키는 방법이 제공된다.

구체적으로, 멜라닌 세포에서의 멜라닌 합성율은 티로시나아제의 활성화 상태에 의해 측정되는 것으로 공지되어 있다. 이러한 활성화 상태는 세포내 멜라노좀과 관련된 효소의 활성화(포스포릴화) 및 탈활성화(탈포스포릴화)간의 동적 평형 상태이다. 포스포릴화는 PKC-β에 의해 매개되며, 탈포스포릴화는 하나 이상의 포스파타아제에 의해 매개된다. 다수개의 PKC 기질이 정상적인 세포 기능을 위해 독립적으로 조절되어야 하는 상황에서 요구되는 바와 같이, 상이한 포스파타아제가 상이한 PKC-β기질을 탈포스포릴화시키는 것으로 가정하는 것이 타당하다.

PKC-β활성화된 티로시나아제의 탈포스포릴화를 초래하는 포스파타아제의 촉매 도메인에 특이적인 펩티드 서열을 구성하여, 피부, 털, 울 또는 퍼, 또는 멜라닌 생성 증가를 목적으로 하는 또 다른 부위의 멜라닌 세포로 전달할 수 있다. 포스파타아제에 대한 이러한 "가기질"은 그의 활성 부위에 대해 티로시나아제 상의 포스포릴화된 부위와 경쟁하고, 이에 따라 생리적 기질인 티로시나아제에 대한 포스파타아제의 유효성을 감소시킨다. 이러한 방법은 멜라닌 함량 증가를 목적으로 하는 경우, 예를 들어 낮은 정도의 습진성 피부염이 있는 환자에서 일상적으로 발생하는 피부의 후염증성 저색소증 부위에 사용되거나, 사람의 털색 또는 동물의 퍼 또는 울의 색을 짙게 하는데 사용될 수 있다.

따라서, 세포에 티로시나아제의 활성화를 조절하는 물질을 제공하여 표피 멜라닌 세포중의 멜라닌의 합성을 조절할 수 있다. 구체적으로, 세포 또는 조직에 티로시나아제 펩티드 모방물의 제공은 첨가된 펩티드와 PKC-β와의 경합적 상호작용을 초래하여, 정상적인 세포내 기질, 이 경우 멜라닌 세포내에 함유된 티로시나아제의 세포질 도메인과 상호작용하는 PKC-β의 유효성을 감소시킨다. 이러한 기질 서열은 다른 PKC 이성질체가 티로시나아제 단백질을 활성화시키지 않기 때문에 다른 PKC 이성질체와 상호작용하기 보다는 특이적으로 또는 우선적으로 PKC-β와 상호작용할 수 있다. PKC 이성질체는 세포 및 조직에 편재하며, 광범위하게 다양한 중요한 세포 기능을 매개하는 것으로 공지되어 있지만, PKC-β가 피부에서 다른 중요한 세포 타입인 각질 세포 또는 섬유아세포에서는 최소한으로 발현되기 때문에, PKC-β에 특이적인 기질 서열은 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성 경로에 대해 우선적으로 작용한다[참조: Park, H-Y. et al., Clin. Res., 39:148A (1991)].

또한, PKC-β가 완전히 결여된 사람 흑색종 세포주는 멜라닌 색소가 부족하다는 사실을 제외하고는 이러한 PKC 이소형을 발현시키는 부계와는 구분할 수 없다[참조: Park, H.E. et al., J. Biol. Chem., 268(16):11742-11749 (1993)]. 이러한 사실은 PKC-β가 멜라닌 생성에서의 역할을 제외하고는 멜라닌 세포/흑색종 세포에서 또 다른 주요 기능을 하지 않는다는 사실을 강력하게 시사하고 있다.

본 발명의 방법은 티로시나아제의 활성화를 조절함으로써 척추 동물의 멜라닌 세포의 색소침착을 변화시키는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본원에 기재된 방법은 척물 동물 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 감소시키거나 완전히 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 물질이 기저층 멜라닌 세포를 포함하는 세포에 유입되도록(예를 들어, 그 안에 도입, 전달 또는 투여), 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 활성화를 감소시키거나 억제시킴으로써 색소침착을 감소시키거나 억제시키는 유효량의 물질을 표피 세포에 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 물질은 피부, 또는 털, 울 또는 퍼 모근 주위의 피부에 국소적으로 도포되는 생리적으로 적합한 조성물에 함유될 수 있다.

역으로, 본 발명의 방법은 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 척추 동물에서 멜라닌 세포의 티로시나아제의 활성화를 증대시키거나 유지시킴으로써 색소침착을 증가시키는 유효량의 물질을 표피 멜라닌 세포(피부 또는 털, 울 또는 퍼 모근에 위치한 멜라닌 세포)에 접촉시키거나 전달하는 것을 포함한다.

이러한 확인된 물질의 유효량은 표피 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 PKC-β매개 포스포릴화를 조절하는데(예를 들어, 실질적으로 감소시키거나 완전히 억제하거나 실질적으로 증대시키거나 유지시키는 데) 효과적인 양이다. 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 포스포릴화의 조절은 하기 기재된 방법을 사용하여 평가될 수 있다.

본 발명에 사용하기에 적합한 다양한 전달 시스템은 당업자들에게 공지되어 있으며, 티로시나아제 펩티드 모방물과 같이, 멜라닌 세포에서 티로시나아제의 활성화를 억제시키는 물질의 유효량을 투여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 리포좀, 마이크로파티클 또는 마이크로캡슐내로 단백질 캡슐화; 재조합 세포에 의한 발현, 수용체 매개 엔도사이토시스, 레트로바이러스 또는 기타 벡터의 일부로서 천연 또는 유사 리간드 코드화 핵산의 구성이 사용될 수 있다.

한 구체예에서, 리포좀 제제가 사용될 수 있다. 리포좀 제제는 각질층을 통과하여 세포막과 융합하는 리포좀으로 이루어져, 리포좀의 내용물을 세포내로 전달시킬 수 있다. 리포좀은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,077,211호, 제 4,621,023호, 제 4,880,635호 또는 제 5,147,652호에 기재된 것들과 같은 리포좀이 사용될 수 있다. 또한, 문헌[참조: Yarosh, D., et al., J. Invest. Dermatol., 103(4):461-468 (1994) or Caplen, N.J., et al., Nature Med., 1(1):39-46 (1995)]들이 참고로 인용된다.

리포좀은 적합한 세포(예를 들어, 표피 멜라닌 세포)를 특이적으로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 멜라닌 세포 자극 호르몬(MSH) 수용체와 같이 멜라닌 세포상에서 우선적으로부터 발현되는 막 마아커가 티로시나아제의 활성화를 억제하는 펩티드 모방물을 함유하는 리포좀에 혼입될 수 있다. 리포좀은 또한 본원 발명에 참고로 인용된 리. 엘(Li, L.)과 호프만 알. 엠.(Hoffman, R.M.) 등의 문헌에 기재된 바와 같이 물질을 모낭에 특이적으로 표적화하고 전달할 수 있다. 이러한 리포좀 전달 시스템은 물질을 울 및 퍼 모근에 전달하는데 사용될 수도 있다.

예를 들어, 펩티드 모방물, 또는 펩티드 모방물을 코드화하는 DNA 구성물은 당업자들에게 널리 공지된 기법에 의해 리포좀내로 캡슐화될 수 있다. DNA 구성물은 펩티드를 코드화하는 DNA 서열 및 척추 동물 세포에서 펩티드를 발현시키는 데 요구되는 다른 핵산 서열을 포함할 것이다[참조: Li, L. and Hoffman, R.M., Natured Med., 1:705-706 (1995) or Yarosh, D. et al., J. Invest. Dermatol., 103:461-468 (1994)]. 리포좀-DNA 구성물 또는 리포좀-펩티드 조성물(펩티드 모방물 함유)는, 예를 들어 피부, 털, 울 또는 퍼에 또는 털, 울 또는 퍼 모근 주위의 피부에 국소적으로 적용시킴으로써 척추 동물에 투여될 수 있다. 리포좀-DNA 구성물 또는 리포좀-펩티드 조성물은 멜라닌 세포에 접촉하며, 그 결과 리포좀의 내용물(DNA 또는 펩티드)이 멜라닌 세포로 유입되고, 펩티드 모방물이 발현되거나 방출되어 티로시나아제 활성화를 조절한다.

본 방법에 사용되는 물질은, 생리학적으로 적합한 담체로 직접적으로 투여될 수도 있다. 예를 들어, 티로시나아제의 PKC-β 포스포릴화 반응을 경쟁적으로 억제하는데 필요한 펩티드의 크기는 현재의 기술을 이용하여 상기 펩티드가 표피 및 털, 울 또는 퍼 모근내의 멜라닌 세포로 경피 전달될 수 있을 정도로 충분히 작다. 상기 펩티드는 겔, 연고, 로션, 크림 또는 포움, 또는 샴푸와 같은 국소용 담체와 혼합될 수 있으며, 물, 글리세롤, 알코올, 프로필렌 글리콜, 지방산 알코올, 트리글리세라이드, 지방산 에스테르 또는 광유와 같은 담체를 포함할 것이다. 다른 가능한 국소용 담체는 예를 들어, 유동 바셀린, 이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올(95%), 수중 폴리옥시에틸렌 모노라우리에이트(5%), 수중 소듐 라우릴 설페이트(5%)를 포함한다. 산화 방지제, 습윤제, 점도 안정화제와 같은 물질 및 유사 약제들이 필요에 따라 첨가될 수 있다.

또한, 특정한 경우, 물질은 피부 위, 피부 안 또는 피부 아래에 위치한 장치 내에 배치될 수 있을 것으로 예측된다. 이러한 장치는 피부 또는 모낭과 접촉하는 방식으로 물질을 수동적 또는 능동적 방출 메카니즘에 의해 방출시키는 경피 패치, 이식물 및 주입물을 포함한다.

전달용 비히클은 또한 향료, 색소, 안정화제, 선스크린 또는 다른 성분을 함유할 수 있다. 상기 물질은, 예를 들어 적합한 비히클 중에서 유효 농도로 일일 1회 또는 2회와 같이 일정한 간격으로 표피에 국소적으로 도포될 수 있다.

티로시나아제의 활성화를 조절하는 유효량의 모방물은 상기에 설명된 방법 중 하나를 이용하여 사람을 포함한 척추 동물에 투여될 수 있다. 투여하고자 하는 물질의 실질적으로 바람직한 양은 사용될 특이적 모방물, 제형화된 특정 조성물, 투여 방식, 및 치료하려는 특정 부위 및 척추 동물에 따라 변할 것이다. 사람과 같은 척추 동물에서 티로시나아제 활성화를 방해하는데 효과적인 모방물의 농도는 공지된 통상적인 약물학적 프로토콜을 이용하여 측정될 수 있다.

본 발명은 또한 척추 동물 표피의 멜라닌 세포에서 색소침착을 변화시킬 수 있는 물질을 확인하는 방법 및 이러한 방법에 의해 확인되는 물질을 포함한다. 이러한 방법은 물질이 표피의 멜라닌 세포중의 티로시나아제의 단백질 키나아제-C-β매개 활성화에 미치는 효과를 기초로 물질을 확인하는 것이다.

예를 들어, 척추 동물 표피의 멜라닌 세포를 멜라닌 세포의 성장 및 생존을 유지하는데 적합한 조건하에서 배양시켜 성장시킨다. 그 후, 시험될 물질(즉, 시험 물질)을 배양물에 넣어, 배양된 세포에 도입시킨다. 시험 물질을 함유하는 배양물을 물질이 티로시나아제 활성화에 영향을 미치는데 적합한 조건, 예를 들어 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-β매개 포스포릴화를 억제시키는데 적합한 조건하에 유지시킨다. 멜라닌 세포의 대조군 배양물을 시험될 물질이 존재하지 않는다는 것만 제외하고는 유사한 조건하에 유지시킨다. 적합한 기간 후, 예를 들어 원심분리에 의해, 멜라닌 세포를 배양물로부터 옮기거나 분리하고, 티로시나아제에 특이적인 항체와의 면역침전에 의해 티로시나아제를 멜라닌 세포로부터 분리시킨다. 또한, 면역침전은 티로시나아제의 단편, 예를 들어 티로시나아제 세포질 도메인을 인식하는 특이적 항체를 이용하여 수행될 수 있다.

그 후, 티로시나아제의 포스포릴화 반응을 평가한다. 통상적으로 포스포릴화 반응의 평가는 멜라닌 세포가 시험 물질과 함께 배양되는 동안 일어나는 포스포릴화 반응의 양 또는 정도를 정량화하는 것을 포함한다. 정량화의 표준 방법은 티로시나아제내로 혼입된 방사성 표지된 포스페이트, 예를 들어 ³²P-오르토포스페이트의 양을 측정하는 방법이다. 그 후, 시험 물질의 존재하에 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화 반응을 시험 물질 없이 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화 반응과 비교한다. 물질이 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-β매개 포스포릴화를 억제하는 효과를 갖는 경우, 시험 물질의 존재하에 성장한 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화 반응의 양은 대조군 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화 반응의 양보다 더 적을 것이다.

본 방법은 또한 척추 동물 표피의 멜라닌 세포에서 색소침착을 증가시키는 효과를 갖는 물질을 확인하는 데 이용될 수 있다. 이러한 물질은 티로시나아제의 포스포릴화 반응을 증대시키거나 티로시나아제의 포스포릴화된 상태를 유지하는 효과를 갖는다. 상기 방법의 단계들은, 시험 물질이 포스포릴화 반응을 증대시키는 원하는 특징을 갖는다는 점을 제외하고는, 시험 물질 없이 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화 반응의 정도 등 상기 논의된 방법과 유사하다. 시험 물질이 티로시나아제의 포스포릴화 반응의 상태를 유지시키거나 연장시키는(따라서, 티로시나아제의 활성화를 유지 또는 연장시키는) 효과를 갖는지 측정하기 위해서, 멜라닌 세포 배양물을 장기간 시험 물질의 존재 또는 부재하에 유지시킨 후, 멜라닌 세포를 분리하고, 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화 반응을 평가할 수 있다.

시험관내 방법에 의해 확인된 물질은 본원에 참고로 인용된 엘러, 엠.에스(Eller, M.S.) 등의 문헌[참조: Nature, 372:413-414 (1944)]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 기니아 피그와 같은 생체내에서 추가로 시험될 수 있다. 생체내에서 효과적인 물질은 상기에 설명된 바와 같이 척추 동물 표피의 멜라닌 세포의 색소침착을 변화시키는 방법에 이용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 명확하게 설명할 것이며, 어떤 방법으로도 본 발명을 한정하는 것이다.

실시예 1: 단백질 키나아제 C-β가 티로시나아제를 포스포릴화시킨다.

다른 이소형이 아닌 PKC-β만이 생체내에서 티로시나아제를 포스포릴화하는지를 시험하기 위해, PKC-β를 발현시키는 멜라닌 세포, 및 티로시나아제를 동등하게 발현시키지만, PKC-β의 발현이 부족한 비착색된 MM4 사람 흑색종 세포를 90분동안 ³²P-오르토포스페이트와 함께 예비인큐베이션하였다[참조: J. Invest. Derm., Vol. 100, No.4: Abst. #37 (April 1993)]. 세포를 모든 PKC 이소형의 활성화제로 알려진 10^-7M TPA로 30분 동안 처리하여 PKC를 활성화시켰다. 대조군 세포는 비히클만으로 처리하였다. 그 후, 티로시나아제를 사람 티로시나아제에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 면역침전시키고, 티로시나아제로의 ³²P-오르토포스페이트 혼입을 자동방사선 사진법으로 시각화하였다. 자동방사선 사진법으로 시각화된 PKC를 발현시키는 TPA 처리된 멜라닌 세포 중의 티로시나아제만이 포스포릴화되었다. 단지, PKC-β를 발현하는 TPA 처리된 멜라닌 세포 중의 티로시나아제가 포스포릴화되었을 뿐이며, 이는 다른 PKC 이소형이 아닌, 단지 PKC-β만이 생체내에서 티로시나아제를 포스포릴화시킬 수 있음을 나타낸다.

실시예 2: 티로시나아제 활성은 포스포릴화에 의해 상향조절된다.

티로시나아제의 활성이 포스포릴화에 의해 상향조절될 수 있는지를 결정하기 위해, 정제된 버섯 티로시나아제를 정제된 활성화된 PKC-β와 함께 예비인큐베이션하였다[참조: Park, H-Y, et al., J. Invest Dermtrol., 100:607 (1993) and Park, H-Y. et al., J. Biol. Chem., 268:11742-11749 (1993)]. 그 후, 비변성 7.5% 아크릴아미드 겔 전기영동에서 티로시나아제 및 PKC-β를 분리한 후, L-도파와 반응시켜서 티로시나아제 활성을 시각화하였다. 티로시나아제가 이동한 갈색으로 착색된 밴드(멜라닌)는 효소적 활성에 대응하는 이들의 세기를 나타낸다. 정제된 티로시나아제는 단독으로 상당한 활성을 나타내며, 그 활성은 티로시나아제를 정제 및 활성화된 PKC-β와 함께 예비인큐베이션한 경우 10배 넘게 증가되었다. 이러한 증가는 PKC-β와 L-도파간의 가능한 상호작용에 기인한 것이 아닌데, 그 이유는 PKC-β 단독으로는 L-도파와 반응하지 않기 때문이다. 이러한 데이터는 PKC-β에 의한 티로시나아제의 직접적인 포스포릴화가 효소의 활성화를 초래함을 명백하게 나타낸다.

실시예 3: 단백질 키나아제 C-β가 티로시나아제의 세포질 도메인을 포스포릴화시킨다.

사람 티로시나아제의 아미노산 서열은 이미 공지되어 있다. 티로시나아제는 세포질 도메인의 위치 505 및 509에서 두 개의 세린 잔기를 갖는다[참조: Shibahara, S., et al. Tohoku J. Exp. Med., 156:403-414 (1988)].

티로시나아제 단백질의 약 90%가 멜라닌 세포내의 막 결합 소기관인 멜라노좀내에 존재하며, 여기에서 멜라닌 색소가 합성되고 침착된다. PKC-β는 일반적으로 세포질에 존재한다. 티로시나아제의 세포질 도메인만이 PKC에 의해 포스포릴화되는지를 조사하기 위하여, 멜라닌 세포 배양물을 ³²P-오르토포스페이트와 함께 예비인큐베이션시키고, PKC를 10^-7M의 TPA로 60분간 처리하여 활성화시키고, 멜라노좀(티로시나아제를 함유함)을 수크로오스 구배 원심분리를 사용하여 정제하였다.

정제된 멜라노좀을 2개 군으로 나누고, 한 군은 대조군으로서 처리하지 않았고, 나머지 군은 세포질 도메인을 방출시키기 위해 0.25% 트립신으로 37℃에서 60분간 처리하였다. 이어서, 트립신 처리 및 비처리 티로시나아제(전장)를, 0.1% 트리톤 X-100 중에서 60분간 인큐베이션하여 멜라노좀으로부터 추출하고, 처리 또는 비처리 티로시나아제를, 각각 내부(멜라노좀내) 도메인에 특이적으로 반응하는 폴리클로날 항체 또는 전장 티로시나아제에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 면역침전시켰다.

³²P-오르토포스페이트는 처리되지 않은 티로시나아제 또는 전장 티로시나아제내로만 혼입되었다[참조: Park, H-Y., et al., J. Invest. Dermatol., 1041, 585 Abstract 186 (April 1995)]. 세포질 도메인이 결핍된 트립신 처리된 티로시나아제는 ³²P-오르토포스페이트의 혼입을 나타내지 못했는데, 이는 세포질 도메인만이 PKC에 의해 포스포릴화됨을 입증한다. 비교 실험에서, 티로시아나제의 포스포릴화를 방사성 표지된 포스페이트의 부재하에서 수행한 것을 제외하고는, 멜라닌 세포 배양물을 상기한 바와 같이 처리하였다. 비처리 및 트립신 처리 티로시나아제에 있어서 2가지 상이한 항체를 사용한 면역블롯 분석에 의해 유사한 양의 티로시나아제가 면역침전되었음이 확인되었다.

실시예 4: 단백질 키나아제 C-베타는 세린 및 트레오닌 잔기를 포스포릴화시킨다.

세린 및 트레오닌 잔기 둘 모두가 공지된 세린/트레오닌 키나아제인 PKC에 의해 포스포릴화되는지를 조사하기 위하여, 멜라닌 세포를 ³²P-오르토포스페이트와 함께 예비인큐베이션시킴으로써 티로시나아제를 생체내 포스포릴화시킨 다음, 실시예 1에 기술된 바와 같이 TPA를 사용하여 PKC를 활성화시켰다. 이어서, 티로시나아제를 면역침전시키고, 겔로부터 전기용리(electroelute)시키고, 완전히 가수분해시켰다. 방사성 표지된 아미노산을 표준 기법을 이용하는 2차원 박층 크로마토그래피를 이용하여 분리하고, 표지되지 않은 포스포릴화된 세린, 트레오닌 및 티로신 표준에 대해 맵핑하였다.

결과는 90%를 초과하는 방사성 표지된 포스페이트가 세린과 관련이 있는 것으로 나타났다. 티로신과 관련이 있는 방사성 표지된 포스페이트는 검출되지 않았다. 이러한 데이터는 티로시나아제가 PKC 의존성 경로를 통해 포스포릴화되며, 세린 잔기가 우선적으로 포스포릴화됨을 추가로 입증한다.

실시예 5: 세린 505 및 509가 포스포릴화된다.

PKC-β에 의해 주로 포스포릴화되는 정확한 세린 또는 트레오닌 잔기를 확인하기 위하여, 멜라닌 세포를 방사성 표지된 포스페이트와 인큐베이션시키고 PKC를 활성화시킴으로써 티로시나아제를 ³²P-오르토포스페이트로 표지하였다. 이어서, 멜라노좀을 정제하고, 전장 티로시나아제를 면역침전시켰다. 그 다음, 티로시나아제를 트립신으로 처리한 후, 더마라이신(thermalysin)으로 처리하였다. 세포질 도메인만이 포스포릴화되기 때문에, 전장 티로시나아제를 소화시키면 포스포릴화된 세포질 도메인만이 생성되어야 한다.

시바하라(Sibahara)에 의한 사람 티로시나아제의 아미노산 서열을 기초로 하여, 사람 티로시나아제의 세포질 도메인이 트립신에 의해 소화된 경우 3개의 단편이 생성될 것으로 예측되었다. 합성 펩티드를 세린 잔기 상에 포스페이트기가 있거나 없는 상태로 제조하였다. 3가지 독립적인 실험에서, 모든 방사성 표지된 포스페이트를 합성 펩티드 3에 대해 맵핑시켰는데, 이는 2개의 세린 잔기 모두가 PKC-β에 의해 포스포릴화됨을 나타낸다.

티로시나아제의 세포질 도메인

합성 펩티드:

실시예 6: 합성 펩티드는 티로시나아제 활성을 억제한다.

사람 멜라닌 세포의 쌍을 이룬 배양물을, 아미노산 위치 505 및 509에 세린 잔기를 함유하는 사람 티로시나아제의 일부와 서열이 동일한 합성 펩티드 5, 10 또는 20ug/디쉬(dish)로 처리하거나 처리하지 않았다. 합성 펩티드의 특정 서열은 Glu-Asp-Tyr-His-(Ser)₅₀₅-Leu-Tyr-Gln-(Ser)₅₀₉-His-Leu(서열번호 4)이다. 세포 내로의 전달을 강화시키기 위해 합성 펩티드를 10ul의 리포펙타민으로 전처리하였다. 대조군은 처리되지 않았음을 나타내고, 0은 리포펙타민 단독으로 처리되었음을 나타낸다. 멜라닌 세포를 리포펙타민 처리된 합성 펩티드에 22시간 동안 노출시키고, 수거하여 티로시나아제 활성을 측정하였다.

[표 1]

표 1 및 도면에 나타난 바와 같이, 배양된 사람 멜라닌 세포 중의 티로시나아제 활성은, 사람 티로시나아제상의 포스포릴화 부위를 모방하도록 구성된 합성 펩티드 2ug/ml와 등량인 20ug/디쉬로 처리한 배양물에서 50%가 넘게 억제된다. 그 다음으로 낮은 용량인 1ug/ml에서는 약 40% 억제가 관찰되었다.

실시예 7: 단백질 키나아제 C-베타와 TRP 1 및 TRP 2의 상호작용

PKC가 티로시나아제 관련 단백질(TPR 1 및 TPR 2)과 같은 다른 멜라닌 생성 단백질을 조절하는지를 조사하기 위하여, PKC를 고갈시키는 것으로 공지된 조건하에서 멜라닌 세포를 2주 동안 10^-7M의 TPA로 처리하고, TRP 1 및 TRP 2 단백질 수준을 특이적 항체를 사용하는 면역블롯 분석을 이용하여 측정하였다. PKC 고갈은 TPR 1에 대해 효과를 나타내지 않았지만, 글리코실화된 성숙한 형태의 TRP 2(80kd)의 수준은 50 내지 70%로 감소되었다. 65kd의 글리코실화되지 않은 TRP 2 전구체는 PKC 고갈에 의해 영향을 받지 않았다. 실제로 글리코실화된 TRP 2만이 영향을 받는지를 확인하기 위하여, 멜라닌 세포를 TPA로 2주 동안 처리하고, ³H-글리코사민으로 표지하였다. TRP 1 및 TRP 2를 면역침전시키고, ³H-글리코사민이 이들 단백질 내로 혼입되었는지를 조사하였다. PKC 고갈은 글리코실화되거나 글리코실화되지 않은 형태의 TRP 1 둘 모두에 영향을 미치지 못했지만, TRP 2 내로의 ³H-글리코사민의 혼입은 50%가 넘게 감소되었다. 이러한 결과는 PKC가 티로시나아제의 세포질 도메인 상의 세린 잔기를 우선적으로 포스포릴화시키고 성숙한 TRP 2의 수준을 조절함으로써 멜라닌 생성을 조절함을 시사한다.

균등물

당업 분야의 숙련자들은 단지 통상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 설명된 본 발명의 특정 구체예의 많은 균등범위를 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등 범위를 하기의 청구의 범위에 포함시키고자 한다.

Claims

척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 색소침착을 감소시키는 물질을 확인하기 위해, 멜라닌 세포내 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 억제하는 상기 물질의 효과를 결정하는 것을 포함하여, 상기 물질을 확인하는 방법으로서,

a) 물질이 억제 특성을 갖는 경우 티로시나아제의 포스포릴화를 억제시키기에 충분한 양의 시험 물질을 ³²P-오르토포스페이트의 존재하에 배양된 척추 동물 멜라닌 세포내로 도입시키는 단계;

b) 단계 a)의 배양된 멜라닌 세포로부터 티로시나아제를 분리시키고, 분리된 티로시나아제의 포스포릴화를 분리된 티로시나제내로 혼입된 ³²P-오르토포스페이트의 양을 측정함으로써 평가하는 단계; 및

c) 단계 a)의 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화를 시험 물질 부재하에 유사한 조건하에서 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화와 비교하여, 물질이 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화의 억제에 미치는 효과를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 비교는 ³²P-오르토포스페이트의 양을 시험 물질 부재하의 ³²P-오르토포스페이트의 양과 비교함으로써 수행되고,

포스포릴화가 감소되는 경우 상기 물질이 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 억제시킴으로써 멜라닌 세포내 색소침착을 감소시키는 물질임을 나타내는,

척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 색소침착을 감소시키는 물질을 확인하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 b)에서, 배양된 멜라닌 세포로부터의 티로시나아제의 분리가 티로시나아제에 특이적인 항체의 면역침전에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 억제하고 서열번호 1 및 서열번호 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 색소침착을 증가시키는 물질을 확인하기 위해, 멜라닌 세포내 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 증대시키는 상기 물질의 효과를 결정하는 것을 포함하여, 상기 물질을 확인하는 방법으로서,

a) 물질이 증대 특성을 갖는 경우 티로시나아제의 포스포릴화를 증대시키기에 충분한 양의 시험 물질을 ³²P-오르토포스페이트의 존재하에 배양된 척추 동물 멜라닌 세포내로 도입시키는 단계;

b) 단계 a)의 배양된 멜라닌 세포로부터 티로시나아제를 분리시키고, 분리된 티로시나아제의 포스포릴화를 분리된 티로시나제내로 혼입된 ³²P-오르토포스페이트의 양을 측정함으로써 평가하는 단계; 및

c) 단계 a)의 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화를 시험 물질 부재하에 유사한 조건하에서 배양된 멜라닌 세포로부터 분리된 티로시나아제의 포스포릴화와 비교하여, 물질이 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화의 증대에 미치는 효과를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 비교는 ³²P-오르토포스페이트의 양을 시험 물질 부재하의 ³²P-오르토포스페이트의 양과 비교함으로써 수행되고,

포스포릴화가 증가되는 겨우 상기 물질이 티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 증대시킴으로써 멜라닌 세포내 색소침착을 증가시키는 물질임을 나타내는,

척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 색소침착을 증가시키는 물질을 확인하는 방법.
척추 동물 표피 멜라닌 세포내 티로시나아제의 세포질 도메인의 세린/트레오닌 잔기의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 특이적으로 억제하고 서열번호 1 및 서열번호 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하며, 상기 펩티드를 멜라닌 세포내로 도입시킴으로써 척추 동물 표피 멜라닌 세포내 티로시나아제의 활성화를 억제시킴에 의해 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼에서 색소침착을 감소시키는 약제 조성물.
제 5항에 있어서, 펩티드가 국소 투여에 의해 표피 멜라닌 세포내로 도입되기에 적합한 형태로 제형화됨을 특징으로 하는 약제 조성물.
척추 동물의 피부 또는 털, 울 또는 퍼 모근으로 국소 투여하기 위한 리포좀내에 캡슐화된 DNA 구성물을 포함하고, 상기 DNA 구성물이 서열번호 1 및 서열번호 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코드화하여, DNA 구성물이 멜라닌 세포내로 도입되는 경우, 펩티드가 멜라닌 세포내에서 발현되어 티로시나아제의 포스포릴화를 억제시키는 약제 조성물로서, 피부 또는 털, 울 또는 퍼 모근에 함유된 척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 티로시나아제의 포스포릴화를 억제시킴으로써 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼의 색소침착을 감소시키는 약제 조성물.
척추 동물의 피부 또는 피부 주위 털, 울 또는 퍼 모근으로 국소 투여하기 위한 리포좀내에 캡슐화된 펩티드를 포함하고, 상기 펩티드가 서열번호 1 및 서열번호 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어져서, 펩티드가 멜라닌 세포내로 도입되는 경우 티로시나아제의 포스포릴화가 억제되는 약제 조성물로서, 피부 또는 털, 울 또는 퍼 모근에 함유된 척추 동물의 표피 멜라닌 세포내 티로시나아제의 포스포릴화를 억제시킴으로써 척추 동물의 피부, 털, 울 또는 퍼의 색소침착을 감소시키는 약제 조성물.
티로시나아제의 단백질 키나아제 C-베타 매개 포스포릴화를 억제하고 서열번호 1 및 서열번호 4로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 포함하는 색소침착을 감소시키는 미용 조성물.