JP5730462B2 - 白髪を処理するための、メラニン形成細胞内のグルタチオンレベルを増大させることが可能な化合物の使用 - Google Patents
白髪を処理するための、メラニン形成細胞内のグルタチオンレベルを増大させることが可能な化合物の使用 Download PDFInfo
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Description
a. メラニン形成細胞の培養、例えばCommo et al.Pigment Cell Res.2004;17:488-497の文献に記載されるようにして得られる皮膚または毛髪のメラニン形成細胞の一次培養
b. GSHレベルを増大させる特性を試験することが望ましい化合物の培地への添加
c. この化合物を活性にさせるためにメラニン形成細胞を十分に長い期間のインキュベーション
d. GSHレベルの測定
e. GSHレベルを増大させる化合物の選択
・皮膚細胞の分化および/または増殖および/または色素沈着を調節する薬剤であって、例えばレチノールとそのエステル、ビタミンDとその誘導体、エストラジオールなどのエストロゲン、POMC誘導体などのcAMP調節因子、アデノシンもしくはフォルスコリンとその誘導体、プロスタグランジンとその誘導体、トリヨードトリオニンとその誘導体などの薬剤、
・抽出物がイソフラボンを含むことも含まないこともあり得るが、アヤメ科または大豆の抽出物などの植物抽出物、
・微生物抽出物、
・αトコフェロールまたはそのエステル、スーパーオキシドジスムターゼまたはその擬似体、ある種の金属キレート剤またはアスコルビン酸とそのエステルなどの抗フリーラジカル薬剤、
・ある種の含硫アミノ酸、13-cis-レチノイン酸、酢酸シプロテロンなどの抗脂漏剤、
・頭皮の落屑状態に対処するための、ピリチオン亜鉛、二硫化セレン、クリンバゾール、ウンデシレン酸、ケトコナゾール、ピロクトンオラミン(オクトピロクス)またはシクロピロクトン(シクロピロクス)などの他の薬剤、
を挙げることができ、特に、毛髪再成長を刺激し、および/または毛髪損失の低速化を促進する活性薬剤であってもよく、限定はされないが特に、
・ニコチン酸のエステルであって、特にニコチン酸トコフェロール、ニコチン酸ベンジル、およびニコチン酸メチルもしくはヘキシルなどのC1〜C6ニコチン酸アルキルを含むエステル、
・米国特許第4139619号および米国特許第4596812号に記載された2,4-ジアミノ-6-ピペリジノピリミジン3-オキシドまたは「ミノキシジル」、国際公開第96/09048号に記載されたアミネキシルまたは2,4-ジアミノピリミジン3-オキシドなどのピリミジンの誘導体、
・欧州特許出願公開第0648488号に本出願者によって記載されたようなリポキシゲナーゼ阻害剤または毛髪の再生育を促進するシクロオキシダーゼ誘発剤、
・マクロライド、ピラノシドおよびテトラサイクリン、および特にエリスロマイシンといった抗菌剤、
・シンナリジン、ニモジピン、およびニンフェジピンなどのカルシウム拮抗物質、
・エストリオールまたは類似体、またはチロキシンとその塩といったホルモン、
・オキセンドロン、スピロノラクトン、ジエチルスチルベストロール、およびフルタミドなどの抗男性ホルモン物質、
・本出願者によって欧州特許出願公開第0964852号および欧州特許出願公開第1068858号に記載されたような5-α-レダクターゼのステロイド系または非ステロイド系阻害剤または場合によってフィナステロイド、
・クロマカリムおよびニコランジルなどのATP依存性カリウムチャンネル作用物質、
・色素沈着促進活性を備えた植物抽出物であって、例えば仏国特許出願公開第2768343号に記載されたキクの抽出物および仏国特許出願公開第2782920号に記載されたワレモコウ属植物の抽出物、
を挙げることができる。
(A.TRP-2陽性およびTRP-2陰性のメラニン形成細胞系の産生)
A1:TRP-2タンパク質のクローニング
Genebank D17547配列に従いプローブ5'-GGAGATGGTGAGAAGCGCTAC-3'および5'-GCGGAAACTACAGCTAAGCAT-3'を用いて、TRP-2タンパク質をコードするメッセンジャーRNAの全領域を、皮膚のメラニン形成細胞の一次培養物から抽出されたメッセンジャーRNAからRT-PCR技術によってクローンニングする。得られたPCR産物を、真核細胞発現ベクター中へのクローニングのための制限部位に相当するヌクレオチド配列を含むプローブ: 5'-AGGGATCCATGAGCCCCCTTTGGTGGGGGTTT-3'および5'-GGAATTCAGCACCCTAGGCTTC-3'を用いて、再びクローニングする。使用される発現ベクターはpCDNA3.1(+)である。次いで、TRP-2タンパク質をコードする領域を含むベクターをコンピテント細菌から産生し、次いで精製し、このベクターをpCDNA-TRP2と呼ぶ。
A2:TRP-2陽性のメラノーマ系の産生
in vitroで構成的にTRP-2タンパク質を弱く発現するメラノーマ型WM35(Pak BJ et al.Melanoma Res.2000;10:499)の細胞(野生型の系)にプラスミドpCDNA-TRP2をトランスフェクトする。次いで、安定にトランスフェクトした細胞をジェネテシン(G418)による処理で選択する。次いで、得られたクローンを単離および増幅する。
各々のクローンの培養物を、タンパク質抽出およびウェスタンブロット法に適した同じ溶解緩衝剤で溶解する。様々な抽出物中のTRP-2レベルを8μgのタンパク質抽出物からウェスタンブロット法によって判定する。ウェスタンブロット(Maniatis et al.のプロトコール参照)を、以下の抗体、すなわちDr VJ Hearing(NIH,Bethesda,USA)によって提供されたポリクローナル抗体αPEP8hおよびモノクローナル抗体Vim3B4(Cymbus,UK)αビメンチンで作製する。図1は、クローンC2、C4およびC8がクローン7および野生型(wt)の系に比べてより多くのTRP-2タンパク質を発現することを示している。
試験された各々のクローンに関して、細胞を2×104cells/cm2の割合で播種する。次いで、細胞培養物をpH2の溶解緩衝剤を用いて溶解する。抽出された遊離アミノ酸(AA)を自動式HITACHI L-8500アミノ酸分析装置を用いて分析する。このようにして、遊離のAAを、リチウム塩をベースとする溶離液によりイオン交換カラムで分離し、次いで、ニンヒドリンとの反応の後に比色法によってアッセイする。各々の抽出物において、測定されたGSHレベルを、AAの合計(プロリン(P)、グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、システイン(C)、メチオニン(M)、イソロイシン(I)、ロイシン(L)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、リジン(K)、ヒスチジン(H)、アルギニン(R))に対して表して、サンプルを正規化した。図2は、クローンC2、C4およびC8がクローンC7および野生型の系より高いGSHレベルを有することを示している。
この分析の原理は以下の通りである。
a. TRP-2を発現する細胞型とTRP-2を発現しない細胞型の2つの細胞型の培養。実施例1Aで使用された方法と類似の方法に従ってTRP2(+)細胞とTRP2(-)細胞をそれぞれ作り出した。これらは任意の細胞型、好ましくはメラニン形成細胞であってよい。
b. GSHの蓄積を促進することが可能な化合物のTRP2(-)細胞培地への添加。
c. 細胞内のGSHレベルの増大を可能にするのに十分長い期間の培養物のインキュベーション。
d. アポトーシスまたは老化を誘発する条件への細胞の曝露。
e. アポトーシスまたは老化の測定。
f. GSHの蓄積を促進し、TRP2(-)細胞を保護することを可能にする化合物の選択。
・アポトーシス応答は細胞のアポトーシスを明らかにすることを可能にする任意の方法によって判定することができ、例えば、アガロースゲル電気泳動の後のDNAの断片の同定、「TUNNEL」法(Gavrieli Y et al.J Cell Biol 1992;119:493-501)によるDNA断片の標識、アネキシンV(ApoAlertアネキシンVアポトーシスキット(1996)CLONTECHniques XI(3);9-11(BD Biosciences,Belgium))の露呈、細胞質内ヌクレオソームの分析(細胞死検出キットElisaPlus(1-774-425,Roche,Germany))、細胞の生存率の測定である。
・老化応答は細胞の老化を明らかにすることを可能にする任意の方法によって判定することができ、例えば、テロメアの短縮の判定、テロメラーゼの活性の測定(TRAPese kit,Intergen)、サイクリンEのレベルの低下の判定、リン酸化タンパク質Rbのレベルの低下の判定(Bandyopadhyay D et al.Experimental Gerontology 2001;36:1265-1275)、ベータガラクトシダーゼ活性の測定(Dimri GP et al.PNAS 1995;92:9363-9367)である。
a. カフェストールとカーウェオールを4μg/ml含む1:1の混合物、
b. 50μMのオルティプラッツ、
で処理する。24時間後、これらの細胞をH2O2により誘発されるストレスに曝露する。2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(H2DCFDA:D399,Molecular Probes)を用いて、ストレスの24時間後に細胞の生存率を測定する。
・毛髪ローション
ドーパクロムトウトメラーゼの代謝経路に作用することが可能な化合物:0.5g、
プロピレングリコール:20g、
95%エタノール:30g、
水:(適量)100g。
ドーパクロムトウトメラーゼの代謝経路に作用することが可能な化合物:1.5g、
ポリグリセリル3-ヒドロキシアリールエーテル:26g、
Hercules社によりKlucell Gの品名で売られているヒドロキシプロピルセルロース:2g、
防腐剤:(適量)、
95%エタノール:50g、
水:(適量)100g。
ドーパクロムトウトメラーゼの代謝経路に作用することが可能な化合物:0.75g、
ユーカリのエッセンシャルオイル:1g、
エコノゾール:0.2g、
ラウリルポリグリセリル6セテアリルグリコエーテル:1.9g、
防腐剤:(適量)、
BF Goodrich社により売られているカルボポル934P:0.3g、
中和剤:(適量)pH7、
水:(適量)100g。
Claims (9)
- 白髪の進展を抑制および/または制限および/または阻止するための、ケルセチンを除き、リポ酸、オルティプラッツ、カーウェオール、カフェストール、カフェストール/カーウェオール混合物、アンジェリカラクトン、硫化ジアリル、およびイソチオシアン酸ベンジルから選択される、GSHのレベルを増大させることが可能な化合物の化粧品としての使用。
- 白髪混じりの頭髪および/または体毛の自然な色素沈着を維持および/または再生するための、請求項1に記載の使用。
- GSHレベルを増大させることが可能な前記化合物の使用が局所または経口経路で投与されることを特徴とする、請求項1または2に記載の使用。
- 白髪の進行を抑制、制限または阻止すること、および頭髪および/または体毛の自然な再色素沈着を維持および/または促進するための化粧品組成物であって、ケルセチンを除き、リポ酸、オルティプラッツ、カーウェオール、カフェストール、カフェストール/カーウェオール混合物、アンジェリカラクトン、硫化ジアリル、およびイソチオシアン酸ベンジルから選択される、GSHのレベルを増大させることが可能な少なくとも1つの化合物を、頭皮の落屑状態に対処するための薬剤および/または色素沈着促進活性を有する植物抽出物から選択される他の活性薬剤と組み合わせて化粧品として許容可能な媒体中に含む組成物。
- 前記化合物がリポ酸、オルティプラッツ、カーウェオール、カフェストール、アンジェリカラクトン、硫化ジアリル、およびイソチオシアン酸ベンジルから選択されることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- オルティプラッツ、カーウェオール、カフェストール、アンジェリカラクトン、およびイソチオシアン酸ベンジルから選択され、GSHのレベルを増大させることが可能な少なくとも1つの化合物を、毛髪の再生育を促進する薬剤と組み合わせて化粧品として許容可能な媒体中に含む、白髪の進行を抑制、制限または阻止すること、および頭髪および/または体毛の自然な再色素沈着を維持および/または促進するための化粧品組成物。
- GSHレベルを増大させることが可能な前記化合物がミクロスフィア、ナノスフィア、オレオソーム、またはナノカプセルなどのコーティング中にカプセル化されることを特徴とする、請求項4から6のいずれか一項に記載の組成物。
- 頭皮および/または毛髪で覆われた皮膚の領域への局所適用に適していることを特徴とする、請求項4から7のいずれか一項に記載の組成物。
- 白髪の進行を抑制、制限または阻止すること、および頭髪および/または体毛の自然な再色素沈着を維持および/または促進するための白髪の美容処理の方法であって、GSHレベルを増大させることが可能な化合物を含む請求項4から8のいずれか一項に記載の組成物が経口投与されるかまたは処理対象の領域に局所適用されることを特徴とする方法。
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