KR100535782B1 - 발기 부전을 완화시키기 위한 유전자 치료제 - Google Patents

발기 부전을 완화시키기 위한 유전자 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열이 함유된 재조합 벡터를 평활근 세포내에 전달시키고 발현시킴으로써, 발기 부전을 완화시키기 위한 유전자 치료법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을, 피검자에게서 음경 발기를 유도시키기에 충분한 갯수의 피검자의 세포내에 도입시키고 발현시키는 것을 포함하여, 피검자에게서 음경 발기를 유도시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 바이러스의 DNA 또는 DNA 서열의 발현을 유도시킬 수 있는 바이러스의 게놈의 일부 또는 전부에 상응하는 DNA, 및 바이러스 DNA에 작동적으로 결합되어 있고, 표적 세포에서 작용성 유전자 생성물로서 발현될 수 있는, 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 유전자를 발현시키는 평활근 세포를 제공한다.

Description

발기 부전을 완화시키기 위한 유전자 치료제 {MEDICAMENT FOR GENE THERAPY FOR ALLEVIATING ERECTILE DYSFUNCTION}
발기 부전은 미국 남성 1천만명 내지 3천만명이 겪는 것으로 추정되는 보편적인 질환이다 [참조: Feldman, et al. Journal of Clinical Epidemiology 47.5 (1994) 457-67; Anonymous, International Journal of Impotence Research 5.4 (1993) 181-284]. 발기 부전의 1차적인 질환 관련 원인으로는 아테롬성경화증, 당뇨병, 노화, 고혈압 및 항고혈압제 투약, 만성 신증, 골반 수술 및 방사선 치료, 및 심리학적 불안이 있다 [참조: Feldman, et al. Journal of Clinical Epidemiology 47.5 (1994) 457-67]. 이러한 다양하고 다면적인 질병의 혈관 파괴에 대한 직접적인 치료법은 가까운 장래에는 나타날 것 같지 않기 때문에, 지난 10년간 감소된 발기 능력을 직접 회복시키기 위한 몇몇 치료 양상이 개발되어 왔다. 그러나, 현재 이용가능한 모든 치료법은 비특이적(호르몬 치료)이거나, 전반적인 성공율이 제한적(예를 들어, 진공 발기 장치)이거나, 침입성(예를 들어, 음경해면체내 주사 치료)이거나 또는 비가역적이고 고가(예를 들어, 음경 보철 이식 수술)이다. 이들 치료적 제한에도 불구하고, 최근 FDA가 발기 부전의 음경해면체내 치료를 위한 카버젝트(Caverject)(프로스타글란딘 E1)를 승인한 것은 진일보하였음을 나타낸다. 본질적으로, 연방 정부의 이러한 행위에 의해, 상기 발기부전 문제의 의학적 성질이 공식적으로 인식되었으며, 또한, 이것의 임상적 치료가 합법화되었다.
미국내에서의 현재의 문화 패턴의 최근 변화로 인해 성 및 성 기능장애에 대한 자유롭고, 보다 공개적인 논의가 가능해졌다. 이러한 문화적 경향에 의해 문제의 심각성이 강조되었고, 동시에 발기 부전의 개선된 임상 치료에 대한 필요성이 강조되었다. 발기부전 문제의 논의 및 치료와 관련된 광고 및 대중매체의 범람으로 인해 남성 및 이들의 성교 상대는 발기 부전이 합법적인(연방정부의 승인을 받은) 임상 치료를 받을 수 있는 보편적인 문제임을 인식하게 되었다. 이러한 일련의 사건으로 인해, 보다 다수의 남성이 다음 10년간 의사로부터 발기 부전에 대한 치료법을 계속 구하게 될 것이다. 따라서, 전체 조직, 세포, 및 가장 최근에는 아세포 수준에서 음경해면체 평활근 및 동맥 평활근의 기능을 연구함으로써 연령 및 질병이 사람 발기에 미치는 영향을 보다 잘 이해할 필요가 있다. 또한, 실험실 연구의 결과가 임상 환경에 직접 적용될 수 있고, 생물체 발기 부전에 대한 신규한 치료법이 보다 비용 효율적이고, 매우 효능있고, 부작용이 거의 없음을 보장할 수 있는 연구 방법이 필요하다.
실험을 통해, 증가된 수축성 또는 손상된 이완을 초래하는 변화된 음경해면체 평활근 긴장이 대다수의 발기 부전 남성의 발기 부전의 근접한 원인인 것으로 입증되었다. 이들 실험을 통해, 심각한 동맥 질환 또는 선천적 구조 이상이 존재하지 않는 한은(이는 소수의 환자에 대해 사실임), 음경해면체 평활근의 완전한 이완이 발기력을 회복하기 위한 필요 충분 조건인 것으로 나타났다. 평활근 이완제인 PGE1의 음경해면체내 주사제에 대한 FDA의 승인은 이러한 가정의 타당성을 입증한다.
전술한 바와 같이, 발기 작용에서의 음경해면체 평활근 세포에 의해 수행되는 중요한 역할로 인해, 이들 세포는 발기 부전의 치료에서 분자 개입을 위한 우수한 표적이 된다. 종래의 실험은 몇몇 심혈관 질병의 잠재적인 치료를 위한 기초로서 혈관 평활근 세포내에 유전자를 전달시키는 기술에 집중되어 왔다. 이들 실험으로는 아테롬성경화증, 혈관염 및 기구 혈관성형술 후의 재발협착증이 있다. 이들 초기 실험에 의해, 평활근 세포에서의 유전자 전달 방법의 효율 및 일관성에 대한 중요한 정보가 제공되었다 [참조: Finkel, et al. FASEB Journal 9 (1995) 843-51].
따라서, 발기 부전은 변화된 평활근 긴장에 의해 주로 발생하기 때문에, 평활근 긴장의 변화에 관여하는 유전자를 표적화하는 유전자 치료법이 매우 바람직하다. 또한, 작용을 받아야 하는 표적 세포의 백분율, 및 원하는 세포 유형(들)에만 작용하는 상대적 효율은, 생리적으로 관련된 치료 효과를 관찰하기 위해 모든 생체내 유전자 치료법에 대해 매우 중요하다. 따라서, 조직 기능의 전반적인 변화에 영향을 주기 위해 소수의 세포만이 유전적으로 변형될 필요가 있는 유전자 치료법이 필요하다. 최종적으로, 발기 부전을 완화시키기 위한 성공적인 유전자 치료법은, 현재 사용되는 방법에 대한 바람직한 대안이 될 것이기 때문에 절실히 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터를 평활근 세포내에 전달시키고, 발현시킴으로써, 발기 부전을 완화시키기 위한 유전자 치료법에 관한 것이다.
상세하게는, 본 발명은, 평활근 세포의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열이, 혈관이완을 조절함으로써 음경해면체 평활근 세포내의 음경해면체 평활근 긴장을 조절하는 단백질을 엔코딩하는 유전자 치료법을 제공한다. 이들 단백질은 해면체 평활근 이완을 증강시켜 발기를 보다 용이하게 달성시킬 것이다. 또한, DNA 서열이 평활근의 혈관수축을 억제시키는 단백질을 엔코딩하는 유전자 치료법이 숙고된다.
또한, 본 발명은 음경해면체 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을, 피검자에게서 음경 발기를 유도시키기에 충분한 갯수의 피검자의 세포내에 도입시키고 발현시키는 것을 포함하여, 피검자에게서 음경 발기를 유도시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 유전자 치료법은 발기 부전을 완화시키기 위해 사용된다.
또한, 본 발명은 DNA 서열의 발현을 유도시킬 수 있는 바이러스 게놈의 일부 또는 전부의 DNA 또는 상응하는 DNA, 및 상기 바이러스 DNA에 작동적으로 결합되어 있고, 표적 세포에서 작용성 유전자 생성물로서 발현될 수 있는, 음경해면체 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 평활근 세포, 예를 들어 음경해면체 또는 동맥 평활근 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: 도 1은 맥시(maxi)-K 채널의 선택적 차단이 단리된 사람 음경해면체 조직 스트립에서 NTG에 의해 유도된 이완 반응이 어떻게 변화시키는 가를 도시하고 있다. 종래에 간행된 역학 프로토콜의 변법을 이용하여 [참조: Christ, et al., American Journal of Physiology 263:H15-H19 (1992)], 두 개의 파라미터를 유도하였다; τ1/2: NTG를 첨가한 후 항정 상태(steady state) 이완 반응이 50% 달성될 때까지의 경과 시간; RSS: NTG에 의해 유도된 이완 반응의 항정 상태 세기. 단리된 음경해면체 조직 스트립을 예비인큐베이션시킨 결과 NTG에 의해 유도된 이완 반응의 세기가 현저하게 감소되었다(100nM). PE = 페닐에프린; NTG = 니트로글리세린.
도 2: 도 2에는 K 채널 작용 및 음경해면체 평활근 긴장의 조절이 도시되어 있다. K+ 이온 플럭스 (flux)는 3가지 주요 이펙터 경로에 의해 조절되며, 첫 번째 두 가지는 각각 PGE1 및 NO_에 의해 활성화되는 cAMP/PKA(PKA: 단백질 키나아제 A) 및 cGMP/PKG(단백질 키나아제 G) 경로이며, 이들 경로는 맥시-K 채널의 활성을 명확하게 조절하지만, KATP 채널에 대한 이들의 효과는 입증되지 않았다. 세 번째 경로는 KATP 채널의 활성을 조절하는 칼륨 채널 모듈레이터이다. 이들 이온이 세포내 및 세포외 공간에 배치되어 있기 때문에, Ca2+ 채널이 열리면 Ca2+가 이것의 전기화학적 구배를 따라 유입된 후, 세포내 탈분극이 유도되는 반면에, K 채널이 열리면 K+가 이것의 전기화학적 구배를 따라 세포로부터 유출된 후, 세포내 과분극이 유도된다. 막 전위 및 음경해면체 평활근 긴장의 레벨에 대한 이들 대상적 경로의 효과는, 수축되면 세포내 칼슘이 증가하고, 이완되면 세포내 칼슘이 감소하는 세포내 칼슘 농도의 조절을 통해 최소한 부분적으로 나타난다. (+)는 포지티브 또는 자극 효과를 나타내고; (-)는 네거티브 또는 억제 효과를 나타내고; ? 는 알려지지 않은 작용을 나타내고; PIP2는 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트이고; DAG는 디아실글리세롤이고; IP3는 이노시톨트리스포스페이트이고; NO-는 산화질소이고; NTG는 니트레이트 공여체 니트로글리세린이고; ET-1은 엔도텔린-1이고; PE는 페닐에프린이고; L 타입 Ca2+는 L 타입의 전압 의존성 칼슘 채널이다.
도 3: 도 3은 수술 준비 및 압력 모니터링 캐뉼러의 배치를 도시한다. 도시된 바와 같이, 래트를 마취시키고, 반듯이 눕힌다. 좌측 경동맥내의 동맥선을 변환기 및 변환기 증폭기를 통해 MacLab 데이터 포착판에 연결시켜서, 혈압을 계속 모니터한다. 우측 외 경정맥선을 이용하여 정맥 유체 수혈하거나 혈액 샘플링하였다. 도시된 바와 같이, 전립선을, 하부 중심선 절개에 의해 노출시켰다. 해면 신경은, 하복 신경과 골반 신경을 결합시킴으로써 형성되는 골반 신경절로부터 발생하는 후측방 전립선에 나타난다. 두 개의 음경해면체를, 음경을 디글러빙(degloving)하면서, 양쪽에서 서혜음낭 절개에 의해 노출시켰다. 하나의 선을 우측 음경해면체에 삽입시켜서, MacLab 장치에 의해 음경해면체내 압력을 계속 모니터링한다. 또 다른 선을 좌측 음경해면체에 삽입시켜서, 음경해면체내에 약물을 주사한다. 마지막으로, 신경 자극제 프로브를 해면의 주위에 배치하여, 전류 자극시켰다.
도 4: 도 4는 신경자극에 반응하는 음경해면체내 압력(ICP)의 부분 변화를 측정하는 실험의 결과를 도시하는 도면이다.
도 5: 도 5는 음경해면체 평활근 긴장을 조절하는 주요 메카니즘을 나타내는 다이아그램을 도시하는 도면이다. 측방 경계에서 갭 정션(gap junction) 플라크에 의해 상호연결된 2개의 음경해면체 평활근 세포가 도시되어 있다. 또한, 전압 의존성 Ca 채널과 K 채널이 도시되어 있다. 좌측 세포는 음경해면체 평활근 수축(세포내 칼슘 농도의 상승)과 연관된 일련의 세포내 작용을 도시하는 반면에, 우측 세포는 음경해면체 평활근 이완(세포내 Ca2+ 농도의 감소)과 연관된 일련의 세포내 작용을 도시한다. + 는 자극성, 포지티브 또는 증가 효과를 의미하고, - 는 억제성 또는 네거티브 효과를 의미한다.
본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터를 평활근 세포에 전달하고, 발현시킴으로써, 발기 부전을 완화시키기 위한 유전자 치료법을 제공한다. DNA 서열은 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다.
또한, 본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질이 혈관이완을 조절하는 유전자 치료법을 제공한다. 혈관이완을 조절하는 단백질의 예로는 산화질소 신타아제, 구아닐레이트 사이클라아제, 아데닐레이트 사이클라아제, 단백질 키나아제 G, 단백질 키나아제 A, 칼륨 채널, 칼슘 채널 및 이들의 임의의 조합물이 있다. 이들 단백질은 평활근 이완을 증강시킴으로써, 발기를 보다 용이하게 한다.
또한, 평활근의 혈관수축을 조절하는 단백질을 억제하는 작용을 하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 본 발명의 방법에 사용하는 것이 숙고된다. 음경해면체 평활근의 혈관수축을 조절하는 단백질의 예로는 단백질 키나아제 C가 있다. 평활근 세포의 혈관수축에 관여하는 이들 단백질을 억제하는 단백질은 궁극적으로 음경해면체 평활근 이완을 증가시켜서, 발기를 보다 용이하게 하며; 이들의 효과는 세포내 Ca 농도의 감소 및 변화된 근육미세섬유 감수성에 의해 최소한 부분적으로 나타난다.
유전자 치료법이 이용될 수 있는 평활근 세포의 예로는 음경해면체 평활근 세포 및 동맥 평활근 세포가 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 음경해면체 평활근 세포와 그 밖의 혈관 조직 간의 다수의 조직학적 및 생리학적 유사성을 고려하면, 유사한 원리가 음경의 동맥 평활근 세포에 적용되는 것이 당연하다.
DNA 서열은 당업자에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란(Dextran), 일가양이온성 리포솜 융합, 다가양이온성 리포솜 융합, 원형질 융합, DNA 코팅된 마이크로프로젝틸 밤바드먼트 (microprojectile bombardment), 생체내 전기장의 생성, 재조합 복제 결함 바이러스를 사용한 주입, 상동 재조합 및 네이키드 (naked) DNA 전달에 의해 평활근 세포에 도입될 수 있다. 당업자라면 상기 DNA 전달 방법들 중의 임의의 방법이 조합될 수 있음을 인식할 것이다.
또한, 본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을, 음경 발기를 유도하기에 충분한 갯수의 평활근 세포에 도입시키고, 발현시키는 것을 포함하여, 피검자에게서 음경 발기를 유도시키는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 발기 부전을 완화시키기 위해 사용된다. 발기 부전은 신경원성, 동맥성 및 정맥폐색성 기능부전 뿐만 아니라 평활근의 불완전한 이완을 야기하는 기타 질환을 포함하여 다양한 질환으로부터 발생할 수 있다. 피검자는 동물 또는 사람이고, 바람직하게는 사람이다.
DNA 서열은, 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란(Dextran), 일가양이온성 리포솜 융합, 다가양이온성 리포솜 융합, 원형질 융합, DNA 코팅된 마이크로프로젝틸 밤바드먼트, 생체내 전기장의 생성, 재조합 복제 결함 바이러스를 사용한 주입, 상동 재조합 및 네이키드 DNA 전달에 의해 피검자의 세포에 도입될 수 있다. 당업자라면 상기 DNA 전달 방법들 중의 임의의 방법이 조합될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, DNA 전달이 바람직한 방법이다.
네이키드 DNA를 평활근 세포에 전달하기 위해, 발현용 유전자가 함유된 본 발명의 재조합 벡터가 바람직하게는 투여대상자의 혈액과 등장인 멸균 수용액과 배합될 수 있다. 이러한 제형은, 재조합 벡터를 생리적으로 적합한 물질, 예를 들어 염화 나트륨, 글리신 등을 함유하고, 생리적 조건에 적합한 완충된 pH를 갖는 물에 현탁시킴으로써 수용액을 생성시키고, 이러한 수용액을 멸균시킴으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 재조합 벡터는 식염수 중에서 20 내지 25% 수크로오스와 배합된 상태로 제조되어, 평활근 세포내로 도입된다.
또한, 발현용 DNA 서열이 함유된 본 발명의 재조합 벡터는 양이온성 리포솜에 혼입되어, 피검자의 평활근 세포내로 직접 주입될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열의 전달은 네이키드 DNA 전달에 의해 이루어진다.
또한, 본 발명은, (1) DNA 서열의 발현을 유도시킬 수 있는 바이러스의 게놈의 일부 또는 전부의 핵산 또는 상응하는 핵산, 및 (2) 바이러스 핵산에 작동적으로 결합되고 표적 세포에서 작용성 유전자 생성물로서 발현될 수 있는 평활근 긴장에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 바이러스 벡터는 당업자에게 알려진 다양한 바이러스 핵산, 예를 들어 HSV, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 세밀리키 포레스트 (Semiliki Forest) 바이러스, 왁찐 바이러스 및 RNA와 DNA 바이러스를 포함하는 기타 바이러스의 게놈으로부터 유래될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 벡터 구성물을 적당한 숙주 세포에서 발현시키기 위해 적당한 조절 엘레먼트를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 함유한다. 본원에 사용된 용어 "발현"은 삽입된 DNA 서열을 mRNA로 전사시켜서, 삽입된 핵산에 의해 엔코딩되는 단백질의 합성이 일어날 수 있게 하는 벡터의 능력을 의미한다. 당업자라면 다양한 인핸서 및 프로모터가 본 발명의 구성물에 사용하기에 적합하고, 구성물은, 재조합 벡터 구성물이 숙주 세포에 도입된 경우에 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열의 적절한 전사 및 프로세싱에 필요한 개시, 종결 및 조절 서열을 함유한다는 것을 인식할 것이다.
평활근 세포에서 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 발현시키기에 적당한 벡터는 당업자에게 널리 알려져 있으며, 하기 열거된 벡터가 있다: pET-3d (Novagen); pProEx-1 (Life Technologies), pFastBac 1 (Life Technologies), pSFV (Life Technologies), pcDNA II (Invitrogen), pSL301 (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pSE380 (Invitrogen), pSE420 (Invitrogen), pTrcHis A,B,C (Invitrogen), pRSET A,B,C (Invitrogen), pYES2 (Invitrogen), pAC360 (Invitrogen), pVL1392 및 pVll392 (Invitrogen), pCDM8 (Invitrogen), pcDNA I (Invitrogen), pcDNA I(amp) (Invitrogen), pZeoSV (Invitrogen), pcDNA 3 (Invitrogen), pRc/CMV (Invitrogen), pRc/RSV (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pREP7 (Invitrogen), pREP8 (Invitrogen), pREP9 (Invitrogen), pREP10 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pEBVHis (Invitrogen) 및 λPop6. 그 밖의 벡터가 당업자에게 명백할 것이다.
적당한 프로모터로는, 구성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 및 유도성 프로모터가 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 한 가지 구체예에 있어서, 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열의 발현은, DNA 서열이 도입되는 특정 벡터에 의해 조절되고, 작용을 받는다. 몇몇 진핵생물 벡터가, 삽입된 핵산을 숙주 세포내에서 고수준으로 발현시킬 수 있도록 공학처리되었다. 이러한 벡터는 다수의 강력한 프로모터 중의 하나를 이용하여, 고수준의 발현을 유도시킨다. 진핵생물 벡터는 바이러스 유전자, 특히 종양 바이러스 유전자의 프로모터-인핸서 서열을 사용한다. 본 발명의 이러한 특정한 구체예는 유도성 프로모터를 사용하여 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 것을 제공한다. 유도성 프로모터의 예로는 메탈로티오닌 프로모터 및 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터가 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 벡터에 따라, 평활근 세포에서의 DNA 서열의 발현은 세포의 성장 주기의 특정한 시점에서 특정 화합물을 첨가함으로써 유도될 것이다. 본 발명의 재조합 벡터에 사용하기에 효과적인 프로모터 및 인핸서의 그 밖의 예로는, CMV (사이토메갈로바이러스), SV40 (시미안 바이러스 40), HSV (단순 포진 바이러스), EBV (엡스타인-바르 바이러스), 레트로바이러스, 아데노바이러스 프로모터 및 인핸서, 및 평활근 특이적 프로모터 및 인핸서가 있다.
또한, 본 발명은 평활근 긴장의 조절에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열을 발현시키는 평활근 세포를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "외인성"은 DNA 서열이 생물체 외부로부터 도입됨을 의미한다. DNA 서열을 함유하는 재조합 벡터는 당업자에게 공지된 다수의 방법, 예를 들어 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란, 양이온성 리포솜 융합, 원형질 융합, DNA 코팅된 마이크로프로젝틸 밤바드먼트, 재조합 복제 결함 바이러스를 사용한 주입, 상동 재조합 및 네이키드 DNA 전달에 의해 평활근 세포에 도입될 수 있다. 당업자라면 상기 DNA 전달 방법들 중의 임의의 방법이 조합될 수 있음을 인식할 것이다.
생리적으로 관련된 치료 효과를 관찰하기 위한 원하는 세포 유형(들)에만 작용하는 상대적 효율 및 작용을 받아야 하는 표적 세포의 백분율은 모든 생체내 유전자 치료법에 대해 매우 중요하다. 이와 관련하여, 발기 부전의 유전자 치료가, 그 밖의 보다 전신적인 심혈관 질환, 예를 들어 상기 열거된 질환에 이용되는 것 보다 본래 더욱 성공적일 수 있는 두 가지 주된 이유가 있다.
음경해면체 및 동맥 평활근 세포가 생체내 및 생체외 둘 모두에서 갭 정션으로서 공지된 세포간 채널의 편재적으로 분포된 집단에 의해 상호연결되어 있다는 것은 널리 입증된 사실이며 [참조: Christ, G.J., et al. Life Sciences 49.24 (1991) PL195-200; Christ, G.J., et al. International Journal of Impotence Research 5.2 (1993) 77-96; Christ, G.J., et al. Journal of Pharmacology & Experimental Therapeutics 266.2 (1993) 1054-65; Christ, G.J., Urological Clinic of North America, 22.4 (1995) 727-745; Christ, G.J., World Journal of Urology (1997) (in press); Christ, et al., Circulation Research, 79 (1996) 631-646; Christ & Melman, Molecular Urology (1997) (in press)], 이것의 메카니즘이 도 5에 도시되어 있다.
음경해면체에서, 평활근 수축(즉, 세포내 칼슘 농도의 증가)은 노르에피네프린에 의한 α1-아드레날린성 수용체의 활성화 후에 달성되거나, ET A 수용체의 엔도텔린-1 활성화에 의해 달성될 수 있다. 두 가지 모두의 경우, 수용체가 활성화되면 Ca2+가 이동한다. 상세하게는, 노르에피네프린 또는 ET-1에 의해 이들 수용체가 활성화되면, 막 결합된 포스파티딜 이노시톨 (PIP2)을 IP3와 디아실글리세롤(DAG)로 분해시키는 포스포리파아제 C가 활성화된다. 도 2에 도시된 바와 같이, DAG와 IP3가 증가되면, 적어도 부분적으로 세포내 Ca2+ 농도의 증가를 통해 이들의 효과를 궁극적으로 나타낸다. 반대로, 트랜스멤브레인 Ca2+ 플럭스의 감소 또는 세포내 Ca2+의 격리를 초래하는 임의의 생리학적 사건, 예를 들어 막 과분극은 평활근 이완을 일으킬 것이다. 그자체로, PGE1는 PGE1 수용체를 활성화시켜서, 아데닐레이트 사이클라아제 효소를 자극시키며, 이것은 ATP의 cAMP로의 전환을 촉매한다. 그 후, cAMP가 증가되면 단백질 키나아제 A(PKA)를 자극한다. 대안적으로, 평활근 이완은 내피세포성 또는 신경세포성 공급원으로부터 방출된 산화 질소에 의해 달성될 수 있다. 산화 질소는 평활근 세포내로 확산되어, 가용성 구아닐레이트 사이클라아제를 활성화시키며, 이것은 GTP의 cGMP로의 전환을 촉매한다. cGMP 농도가 증가되면 단백질 키나아제 G(PKG)를 활성화시킨다. 갭 정션, K 채널 및 Ca2+ 채널에 대한 PKA, PKG 및 PKC의 효과는 표적 단백질(갭 정션, K 채널 및 Ca2+ 채널)상의 특정 아미노산 잔기의 인산화를 통해 매개되는 것으로 생각된다. 도 5는 이들 추정 작용의 결과를 다음과 같이 도시하고 있다: + 는 자극성, 포지티브 또는 증가 효과를 의미하고, - 는 억제성 또는 네거티브 효과를 의미한다. 이 간략화된 모델에 의해, 이러한 중요한 2차 메신저 시스템의 상호작용이 갭 정션, K 및 Ca2+ 채널에 작용하여, 시험관내 또는 생체내에서 음경해면체 평활근 긴장을 조절하는 방식이 예시된다.
콘넥신(Connexin)43은 사람 음경에서 발현되는 주된 아이소폼(isoform)이다. 이러한 세포간 채널은 인접 평활근 세포 간에 부분적인 세포질 연속성을 제공함으로써, 생리적으로 관련된 이온(K+ 및 Ca2+) 및 2차 메신저 분자(IP3, cAMP, cGMP)의 세포간 교환을 가능하게 한다. 이것은 건강한 남성의 경우에도, 음경해면체실질의 자율 신경분포가 비교적 희박하다는 것을 고려해 볼때 매우 중요한 점이다. 따라서, 갭 정션의 존재로 인해, 정상적인 음경 발기 뿐만 아니라 발기감퇴를 위해 요구되는 음경해면체 평활근 세포의 빠른 합포체성 수축 및 이완 반응에 필요한 해부학적 기질이 제공된다. 이 방식으로, 건강한 남성의 경우에도, 갭 정션이 존재하면, 관련된 뉴런 신호에 의해 직접 활성화되지 않은 평활근 세포가, 이러한 중요한 세포간 경로에 의해 수축 또는 이완 반응에 간접적이긴 하지만 신속하게 동원될 수 있게 해준다. 이 가정의 타당성을 증명하는 실험 및 임상 증거가 최근 간행물에 약술되어 있으며 [참조: Christ, G.J. et al., Circulation Research, 79:631-646 (1996); Christ, G.J., World Journal of Urology, (1997) (발행중)], 이러한 거동을 설명하는 수학적 모델이 구성되었다 [참조: Christ, G.J., et al., Journal of Urology 155:620A (Abstract) (1996); Christ, G.J., et al., FASEB J. 9:A914 (1995)]. 이들 갭 정션 채널의 존재는, 음경해면체 평활근 긴장의 보다 전반적인 변화를 유도시키기 위해 음경해면체 평활근 세포의 소분획만이 유전적으로 변형될 필요가 있을 것임을 주로 암시한다.
유전자 치료법을 가능하게 만드는 사람 음경의 두 번째 주요 특징은, 다수의 발기불능 남성에서의 약리학적으로 유도된 발기가 존재한다는 것은 다수의 이러한 환자에서 정맥폐색성 메카니즘이 적절하게 작용한다는 것을 나타낸다는 데에 있다. 이러한 환자의 경우, 발기는, 목적 유전자(들)을 동시에 주입하면서 통상적인 음경해면체내 제제에 의해 약리학적으로 유도될 수 있다. 그자체로, 주입된 유전자(들)은, 정상적인 발기 도중의 정맥 유출량이 매우 적기 때문에 음경해면체실질에 주로 한정될 것으로 예상된다 [참조: Carrier, et al. J. Urol. 42.4 (1993) J. Urol. 149.5 Pt 2 (1993) 1246-55; Lue, et al. J. Urol. 137 (1987) 829]. 이러한 시나리오에 있어서, 전신적인 혈관 부작용의 위험은 거의 없을 것이다.
본 발명의 유전자 치료법은, 수축 및 이완 자극 간의 균형의 비교적 미세한 변화에 의해 발기 생리학 및 작용의 중대한 변화가 야기될 수 있다는 사실을 이용하도록 고안되었다 [참조: Lerner, et al. J. Urol. 149.5 pt 2(1993) 1246-55; Azadzoi, et al. J. Urol. 148.5 (1992) 1587-91; Christ, et al. British Journal of Pharmacology 101.2 (1990) 375-81; Christ, G.J., Urological Clinics of North America 22.4 (1995) 727-745; Taub, et al. J. Urol. 42 (1993) 698]. 유전자 치료법의 목적은, 음경해면체 평활근에서 생리적으로 관련된 단백질을 코딩하는 외인성 유전자의 발현 후에 수축 및 이완 자극 간의 보다 정상적인 균형을 회복하는 데에 있다. 이들 외인성 유전자의 발현이 수 주일 내지 수 개월간 유지될 수 있는 경우 (본원에 기재된 래트 모델), 환자는, 이 기간 동안에는 임의의 다른 외인성 조작 없이 "정상적인" 발기를 할 수 있을 것이다. 이것은 현재 이용가능한 모든 치료법에 비해 더욱 진보된 것임이 명백할 것이다.
후술되는 논의에는 발기 부전의 유전자 치료법의 두 가지 특이적인 방법이 약술되어 있다. 첫 번째 경우, 평활근 세포의 "감수성"은, 세포를 사람 맥시(maxi)-K cDNA로 트랜스펙션시킴으로써 내인성 뉴런 자극에 대해 근소하게 증강될 것이다. 두 번째 경우, 발기에 대한 뉴런 "구동력"은, 음경해면체 평활근 세포를 구성적으로 발현되는 산화 질소 신타아제 cDNA인 bNOS로 트랜스펙션시킴으로써 증가된다. 이러한 유전자 치료 방법은 제안된 트랜스펙션의 효능 및 안정성 둘 모두에 정확하게 의존적이다. 두 가지 방법 모두에 대한 증거를 하기에 나타내었다.
본 발명은 하기 상세한 실험 섹션에 의해 설명되며, 이 섹션은 본 발명의 이해를 돕고자 함이지, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니며, 본 발명은 하기 특허청구의 범위에 의해서만 제한된다.
상세한 실험 섹션
A. 재료 및 방법
1. 플라스미드 및 유전자
pCMVβ 및 pcDNA3 플라스미드를 인비트로겐(Invitrogen, San Diego, CA)로부터 구입하였다. 사람 맥시 K cDNA (hslo)를 살코프(Salkoff) 박사 (Washinton University School of Medicine, St. Louis, MO)로부터 입수하였다 [참조: McCobb, D. P., et al. American Journal of Physiology 269 (1995) H67-H77]. 뉴런 NOS cDNA를 에스. 스나이더 (S. Snyder) 박사 (Johns Hopkins University)와 디. 브레트 (D. Bredt) 박사 (Univ. Calif. San Francisco)로부터 입수하였다 [참조: Bredt, et al., Nature 351 (1991) 714-8]. 사람 맥시 K 채널 cDNA (약 3.9 kb)[참조: McCobb, et al. American Journal of Physiology 269 (1995) H767-H777]과 뉴런 NOS cDNA (Bredt/Snyder 91287795)[참조: Bredt, et al. Nature 351 (1991) 714-8] 둘 모두를 pcDNA3 벡터의 XhoI-XbaI 클로닝 부위내로 삽입시켰으며, 여기에서, 발현은 CMV 프로모터(Invitogen)로 유도된다. 플라스미드 DNA 100㎍을 20% 수크로오스가 함유된 멸균 PBS 200㎕에 현탁시키고, 마취된 래트의 CC에 주입하였다.
2. 다양한 기법을 사용한 Lac Z의 음경해면체로의 유전자 전달.
네이키드 DNA. 포스페이트 완충 식염수(20% 수크로오스를 함유함) 200㎕ 중의 pCMVβ 플라스미드 100㎍(Clonetech, CA)(CMV 프로모터의 조절하에 LacZ 유전자를 함유함)을 3개월령 피스처(Fischer) 래트의 음경해면체에 주입하였다 (마취 하에). 10일 후, CC 조직을 절개하고, 염색하여, β-갈락토시다아제 활성을 조사하였다.
리포솜. PBS 100㎕ 중의 pCMVβ 플라스미드 5㎍을 리포펙틴 시약(Gibco) 100㎕와 혼합시키고, 생성되는 리포솜 복합체(200㎕)를 3개월령 피스처(Fischer) 래트의 음경해면체에 주입하였다 (마취 하에). 10일 후, CC 조직을 절개하고, 염색하여, β-갈락토시다아제 활성을 조사하였다.
아데노바이러스 벡터. lacZ cDNA를 함유하는 아데노바이러스 벡터 200㎕ (> 1010 pfu/㎖)를 로이 코우드허리 (Roy Chowdhury) 박사 (AECOM gene therapy core)로부터 입수하고, 3개월령 피스처(Fischer) 래트의 CC 내에 주사하였다 (마취 하에). 3일 후, CC 조직을 절개하고, 염색하여, β-갈락토시다아제 활성을 조사하였다.
3. β-갈락토시다아제 활성을 위한 염색
CC 조직을 주입 후 다양한 시점에서 래트로부터 절제하고, 4% 파라포름알데히드/ 0.1% 글루타르알데히드로 3시간 동안 고정시키고, X-Gal로 37℃에서 15시간 동안 염색시켰다 [Vitadello, M., et al. Human Gene Therapy 5 (1994) 11-8].
동물. 10주 내지 20주령이고 체중이 200 내지 250g인 62 마리의 스프라그 돌리(Sprague Dawley) (Taconic Farms, Germantown, NY)를 본 실험에 사용하였다. 모든 래트에 임의로 퓨리나(Purina) 실험실 설치류 먹이를 공급하고, 오전 7시부터 오후 7시까지의 광 주기를 주면서 개별적으로 수용하였다. 래트를 표 1에 나타난 그룹으로 분할하였다.
표 1 : 유전자 전달 및 시간 경과 실험
그룹 래트 연령 유전자 치료 유전자 전달 방법 시간 경과 실험
A n = 12 10주 LacZ (n=9) 대조표준 (n=3) 아데노바이러스 (n=3)리포솜 (n=3)네이키드 DNA (n=3)
B n = 24 10주 LacZ (n=12) 대조표준 (n=12) 네이키드 DNA (허위) 2주 (n=3)4주 (n=3)8주 (n=3)12주 (n=3) 2주 (n=3)4주 (n=3)8주 (n=3)12주 (n=3)
C n = 20 20주 NOS (n=12) 대조표준 (n=8) 네이키드 DNA (허위 대조표준) 1개월 (n=2)2개월 (n=4)3개월 (n=4)4개월 (n=2) 1개월 (n=2)2개월 (n=2)3개월 (n=2)4개월 (n=2)
D n = 18 20주 맥시 K (n=10) 대조표준 (n=8) 네이키드 DNA (허위 대조표준) 1개월 (n=2)2개월 (n=4)3개월 (n=2)4개월 (n=2) 1개월 (n=2)2개월 (n=2)3개월 (n=2)4개월 (n=2)
4. 생체내 발기 실험을 위한 동물의 준비
마취의 유도. 래트를 나트륨 펜토바르비탈(Anpro Pharmaceuticals)의 복강내 주입(35㎎/㎏)에 의해 마취시켰다. 마취를 유지시키기 위해 필요한 펜토바르비탈 (5 내지 10㎎/㎏)을 45분 내지 60분 마다 후속 주사시킴으로써, 마취를 실험 프로토콜 동안(2 내지 3시간) 유지시켰다.
수술 준비 및 압력 모니터링 캐뉼러의 배치. 도 3에는 전체 실험 과정이 도시되어 있다. 동물을 반듯한 자세로 눕히고, 방광 및 전립선을 중심선 복부 절개를 통해 노출시켰다. 하위 하복신경총(즉, 골반총 또는 주 골반 신경절), 골반 신경 및 해면 신경을 양쪽에서 전립선에 대해 후측방적으로 확인하고, 스테인레스 강 쌍극 와이어 전극봉을 전기적 자극을 위해 이들 구조 주위에 배치하였다. 음경의 표피를 벗기고, 양쪽 각(crura)을, 덮어진 좌골해면체 근육의 일부를 제거시킴으로써 노출시켰다. 음경해면체내 압력(ICP)을 모니터하기 위해, 23 게이지 캐뉼러를, 헤파린 용액 250U/㎖로 충전시키고, PE-50 튜브(Intramedic, Becton Dickinson;)에 연결시키고, 우측 음경해면체에 삽입시켰다. 그 후, 튜브를 7-0 더말론(Dermalon) 봉합으로 튜니카(tunica)에 고정시켜서, ICP의 측정 동안의 안정성을 보장하였다. 또 다른 23 게이지 캐뉼러를 1㎖ 주사기에 연결시키고, 음경해면체내 약물 주입을 위해, 좌측 음경해면체내로 삽입시켰다. 전신 동맥 혈압(BP)을 경동맥내에 배치된 25 게이지 캐뉼러에 의해 모니터링하였다.
두 압력선 (BP) 및 (ICP)를 압력 변환기에 연결시킨 후, 변환기 증폭기(ETH 400 CB Sciences, Inc)를 통해 데이터 포착판(Mac Lab/8e7, ADI Instruments, MA)에 연결시켰다. 압력 측정치의 실시간 디스플레이 및 기록을 매킨토시 컴퓨터(Mac Lab software V3.4)로 수행하였다. 압력 변환기 및 AID판을 H2O의 cm로 눈금을 정하였다.
음경해면체 신경의 신경자극 및 음경해면체내 압력의 기록. 음경해면체 신경의 직접적 전기자극을 이음매가 다수인 클램프에 부착된 정밀한 스테인레스 강 쌍극 훅 전극봉으로 수행하였다. 각각의 프로브의 직경은 0.2mm 였고; 두 개의 극은 1mm 만큼 떨어져 있었다. 단일상 직각 펄스를 신호 발생기(주문 제작되고, 일정한 전류 증폭기로 조립됨)에 의해 전달하였다. 자극 파라미터는 다음과 같았다: 주파수; 20 Hz, 펄스 폭; 0.22 msec, 지속 시간; 1분. 전류 프로토콜은 전류를 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 및 10 mA의 간격으로 증가시키면서 적용시켰다. 음경해면체내 압력 및 전신 혈압의 변화를 각각의 신경 자극 수준에서 기록하였다.
5. 조직 획득과 고정 및 면역조직화학 분석
조직 회수. 신경자극 실험의 완결 후, 유전자 치료 및 연령 매치된(matched) 대조 동물 둘 모두의 음경을 수거하고, 음경의 원위 말단을 메틸렌 블루로 마킹하여, 원위 말단과 근위 말단의 적당한 사후 확인을 보장하였다. 모든 음경 조직을 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중의 4% 파라포름알데히드에 즉시 옮겨서, 20℃에서 4시간 동안 고정시킨 후, 면역염색을 위해, 0.1M 포스페이트 완충액(PBS; 4℃에서 하룻밤 이상 동안)(pH 7.4) 중의 저온 30% 수크로오스 중에서 동결방지시켰다. 동물의 음경의 일부를 액체 질소 중에서 동결시키고, 분자 생물학적 실험을 위해 80℃로 보관하였다. 간단하게는, 조직을 저온유지장치에서 14㎛로 절개하고, 절개물을 슬라이드상으로 건조시키고, 파라핀에 묻었다. 슬라이드를 -20℃로 저장한 후, 이들을 보통 2 내지 4주내에 염색시켰다.
조직학. 절개물의 조직학적 검사를 수행하여, 신경 및 평활근을 확인하였다. 일련의 슬라이드에 올려진 절개물을 10% 포르말린으로 고정시키고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 모든 슬라이드 준비 표본을 차이스(Zeiss) 현미경으로 관찰하였다.
산화 질소 신타아제 면역조직화학. 슬라이드에 올려진 조직 절개물을 크실렌으로 탈파라핀화시키고, 고급 알코올로 재수화시키고, 3% 과산화수소로 내인성 퍼옥시다아제 활성에 대해 차단시켰다. 표본에 대한 항체의 비특이적 결합을 포스페이트 완충 식염(PBS) 중의 1.5% 정상 염소 혈청과 실온에서 30분간 인큐베이션시킴으로써 차단시켰다. 그 후, 슬라이드를 배수시키고, 1차 항체와 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 사용된 항체는 뇌 NOS에 대해 유도된 토끼 다클론성 항체 (Transduction Laboratories, Lexington Kentucky) 였다. 1.0㎍/㎖의 항체 농도가 면역염색을 위해 최적인 것으로 밝혀졌다. 항원 결합을, 벡타스테인 엘리트 (VectaStain Elite) ABC 킷을 사용하여, 아비딘-바이오틴 면역퍼옥시다아제 방법에 의해 검출하였다. 발색 반응을 과산화수소로 활성화된 디아미노벤지딘 (색원체로서의 디아미노벤지딘)으로 전개시킨 후, 헤마톡실린 용액으로 역염색시켰다. 염색은 1차 항체 대신 PBS를 사용하는 네거티브 대조군에서는 명백하지 않았고, 이는 본 실험에 사용된 1차 항체의 특이성을 뒷받침한다.
통계 분석. 모든 통계 분석을 스탯-뷰(Stat-View) 4.5 소프트웨어 (Abacus Concepts, Berkeley, CA)를 사용하여 수행하였다. 무관한 샘플에 대한 2-테일 스튜던트 t 테스트(two-tailed Student t test)를 이용하여, 유전자 치료 래트(NOS 또는 맥시-K)와 연령 매치된 대조 동물 간의 관심 파라미터에 대한 그룹 평균치를 비교하였다. 모든 차이는 p<0.05로 유의 수준인 것으로 간주되었다. 별 다른 명시가 없는 한은 모든 데이터는 평균 S.E.M.으로서 표현된다.
신경자극 데이터의 분석. 자극 반응 곡선을, 대조 래트와 유전자 치료 래트 둘 모두에 대해, 음경해면체 압력의 부분 변화를 전류의 단계적 증가(1,2,4,6,8,10 mA) (Sigma Plot Mac V5.0 Jandel Scientific, San Rafael, CA)에 따른 평균 전신 혈압의 함수로서 플롯팅함으로써 작도하였다.
6. 래트 음경해면체의 평활근 세포내로의 Lac Z의 유전자 전달. 혈관 평활근 세포내로의 유전자 전달을 다양한 기법, 예를 들어 레트로바이러스, 아데노바이러스, 양이온성 리포솜 또는 네이키드 DNA 전달을 이용하여 달성하였다. 생체내 음경해면체내 유전자 전달을 위한 이들 기법의 효율을 결정하기 위해, 플라스미드 pCMβ를 네이키드 DNA로서 또는 양이온성 리포솜 또는 LacZ cDNA (β-갈락토시다아제를 코딩함)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 통합시켜, 3 마리 래트의 CC 조직에 주입시켰다. 유전자 전달의 모든 3 가지 기법은 긍정적인 결과를 나타내었지만, β-갈락토시다아제의 활성에 의해 색원체 기질인 X-Gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌일-b-D-갈락토시드)이 청색 분해 생성물로 전환되는 것으로 증명된 바와 같이, 모든 조직 수준에서 아데노바이러스 매개 유전자 전달이 가장 효과적이었다.
β-갈락토시다아제를 발현하는 세포의 상대적인 수 및 조직학적 타입을 결정하기 위해, 포스페이트 완충 식염수 (20% 수크로오스를 함유함) 200㎕ 중의 pCMVβ 플라스미드 100㎍을 3개월령 피스처(Fischer) 래트의 CC 내로 주입시켰다 (마취 하에). 30일 후, 주입시킨 래트 및 대조 동물로부터 CC를 절제하고, 4% 파라포름알데히드/0.1% 글루타르알데히드로 3시간 동안 고정시키고, X-Gal과 37℃에서 15시간 동안 반응시키고, 파라핀에 묻고, 절개하였다 [참조: Vitadello, M., et al. Human Gene Therapy 5 (1994) 11-8]. 도 2에 도시된 바와 같이, β-갈락토시다아제 활성은 DNA를 주입한 지 30일 후에 다수의 평활근 세포에서 명백하였다.
7. 뉴런 NOS 또는 칼륨 채널 맥시-K에 대한 cDNA의 주입 후 음경해면체내 압력의 증가
사람 맥시-K cDNA (hSlo) (약 3900개 누클레오티드) (McCobb) 및 뉴런 NOS cDNA (약 5000 누클레오티드) (Bredt/Snyder 91287795)를 발현이 사이토메갈로바이러스 프로모터로 구동되는 pcDNA3 벡터의 XhoI-XbaI 클로닝 부위에 삽입시켰다. 포스페이트 완충 식염수 200㎕ (20% 수크로오스를 함유함) 중의 각각의 플라스미드의 100㎍을 4개월령 피스처(Fischer) 래트의 CC에 주입하였다 (마취 하에). 대조 래트를 허위 조작하거나, 20% 수크로오스를 함유하는 PBS 200㎕를 음경해면체내 주입하여 허위 조작하거나, 20% 수크로오스 및 pCDNA 벡터 DNA 100㎍을 함유하는 PBS 200㎕를 음경해면체내 주입하여 허위 조작하였다. 기저 및 신경 자극된 음경해면체내 압력(ICP)를 주사 후 2주 내지 4개월 사이에 측정하였다. 조사된 기간내에서 음경해면체내 압력의 유의할 만한 차이는 관찰되지 않았으며, 각각의 그룹내의 모든 동물로부터의 결과를 풀링시켰다. 이와 같이, 유의할 만한 차이는 다양한 대조군 중에서 관찰되지 않았고, 모든 대조군 데이터를 풀링시켰다.
도 4 및 하기 표 2와 3에 도시된 데이터는 NOS 또는 맥시-K cDNA가 주입되면 기저 ICP 및 신경 자극된 ICP가 현저하게 증가된다는 것을 나타낸다. ICP의 평균 기저 분율 변화는, 약 8 (H2O의 cm)의 대조 수준이 NOS 주입 래트에서는 약 14로, 맥시 K 주입 래트에서는 약 13으로 증가하였다. 유사한 방식으로, ICP의 신경 자극된 분율 변화는 2 내지 10 mA 자극의 범위에 걸쳐, NOS 및 맥시 K 주입 래트 둘 모두에서 약 30% 더 높다.
표 2. NOS 및 대조 그룹에서의 신경 자극 후 음경해면체내 압력(ICP) 반응
해면체 신경 자극★*
ICP♣ (기저) ICP◆ 0.5mA♥ M±SEM♠ ICP1mAM±SEM ICP2mAM±SEM ICP4mAM±SEM ICP6mAM±SEM ICP8mAM±SEM ICP10mAM±SEM
NOS 유전자 치료(n=12) 14.62 ± 0.64 60.02 ± 5.9 102.50 ± 3.89 110.49 ± 4.65 113.93 ± 2.17 117.72 ± 2.80 121.26 ± 3.26 129.03 ± 5.4
비히클만이 주입된 허위 래트(n=8) 8.1 ± 0.37 45.81 ± 3.63 75.242 ± 3.59 83.93 ± 3.23 83.59 ± 4.52 85.67 ± 3.75 87.94 ± 4.45 92.23 ± 3.62
P 값 0.0001 0.0085 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0003
★ 양쪽에서 수행한 음경해면체 신경 자극 (결과 x 2 래트의 마리 수)
◆ ICP 음경해면체내 압력 (H2O cm)
♣ 신경자극 전의 BCP 기저 음경해면체 압력 (H2O cm)
♥ 신경에 대한 자극의 mA-밀리 암페어
♠ M±SEM - 평균 및 평균의 표준 오차
표 3. 맥시-K 및 대조 그룹에서의 신경 자극 후 음경해면체내 압력(ICP) 반응
음경해면체 신경 자극★*
ICP♣ (기초) ICP◆ 0.5mA♥ M±SEM♠ ICP1mAM±SEM ICP2mAM±SEM ICP4mAM±SEM ICP6mAM±SEM ICP8mAM±SEM ICP10mAM±SEM
맥시-K 유전자 치료 (n=10) 13.13 ± 0.60 65.21 ± 3.35 99.81 ± 3.19 103.21 ± 3.05 108.12 ± 3.97 112.67 ± 3.50 115.45 ± 7.99 129.50 ± 4.83
비히클만이 주입된 허위 래트(n=8) 8.16 ± 0.37 45.81 ± 3.63 75.24 ± 3.59 80.99 ± 3.25 83.97 ± 3.23 85.67 ± 3.75 87.94 ± 4.45 92.23 ± 3.62
P 값 0.0001 0.0030 0.0001 0.0002 0.0001 0.002 0.0003 0.0002
★ 양쪽에서 수행한 음경해면체 신경 자극 (결과 x 2 래트의 마리 수)
◆ ICP 음경해면체내 압력 (H2O cm)
♣ 신경자극 전의 BCP 기저 음경해면체 압력 (H2O cm)
♥ 신경에 대한 자극의 mA-밀리 암페어
♠ M±SEM - 평균 및 평균의 표준 오차
B. 결과
칼륨 채널 및 음경해면체 평활근 기능: K 채널 작용이 변화되면 이완에 대한 "감수성"을 증가시킬 수 있다는 증거. 본 발명자들의 최근 실험에 의해, 칼륨 채널의 활성화에 의한 음경해면체 평활근 세포의 과분극이 음경해면체 평활근 긴장을 조절하기 위한 중요한 메카니즘을 나타낸다는 것이 밝혀졌다 [참조: Holmquist, F., et al., J. Urol. 144 (1990) 146; Christ, G.J., et al., Journal of Andrology 14.5 (1993) 319-28; Fan, S.F., et al., J. Urol. 153 (1995) 818; Christ, G.J., Urological Clinics of North America 22.4 (1995) 727-745]. 이 결과는 이완(방대한 시간인 상태)을 특징으로 하는 사람 음경해면체 평활근의 지속된 수축이 전압 작동성(voltage-gated) Ca2+ 채널을 통한 연속적인 트랜스멤브레인 Ca2+ 플럭스에 주로 의존한다는 사실을 반영한다. 음경해면체 평활근 세포에서의 이러한 전압 의존성 칼슘 채널의 활성은 K 채널에 의해 주로 개시되고 운반되는 과분극 전류에 의해 정밀하게 조절된다. K+ 채널의 서브타입 중에서, 약 180 pS Ca2+ 감수성 맥시-K 채널은 음경해면체 평활근 세포내의 가장 유력한 채널 중의 하나이다 [참조: Fan, S.F., et al., J. Urol. 153 (1995) 818]. K 채널의 활성화 후의 음경해면체 평활근 세포의 막 과분극은 신경세포성 공급원 뿐만 아니라 내피세포성 공급원으로부터 유래하는 두 수용체 매개(예를 들어, PGE 또는 NO-) 및 비수용체 매개(예를 들어, NO- 또는 cGMP) 자극에 의해 달성될 수 있다. 이들 데이터를 도 2 및 표 5에 요약하였다.
작용의 추정 메카니즘은 다음과 같을 것으로 생각된다: 내인성 음경해면체 혈관이완제, 예를 들어 산화 질소가 방출되면, 비정션 (nonjunctional) 이온 채널, 예를 들어 K 및 Ca2+ 채널을 포함하여, K 채널을 직접 활성화시키거나, 가용성 구아닐레이트 사이클라아제의 활성화, 세포내 cGMP 농도의 증가, G 키나아제의 활성화 및 세포성 단백질의 인산화에 2차적인 K 채널 활성을 조절하는 것으로 생각된다. 키나아제 활성이 증가되면 (A 또는 G) Ca2+ 및 K 채널에 대해 반대 작용을 함으로써, Ca2+ 채널의 활성을 감소시키고, K 채널의 활성을 증가시킨다. 따라서, 세포내 NO- 및/또는 cGMP 농도가 증가하면, K 채널이 활성화될 수 있고, Ca2+ 채널이 억제될 수 있다. 이러한 두 가지 반대 효과의 대수학적 합은 트랜스멤브레인 칼슘 플럭스를 현저하게 감소시킴으로써, 음경해면체 평활근 긴장을 감소시켜서, 음경해면체 평활근을 이완시킨다는 것이다.
맥시-K 채널의 활성이 PGE (참조: Zhang, et al., Journal of UROLOGY, 155:678A (1996); Zhao, et al., J. Urol. 154 (1995) 1571-1579; Zhao, et al, Journal of Urology, 155:678A (1996) 뿐만 아니라 NO- (참조: Christ, et al., 미발표된 결과)를 포함하여 음경해면체 평활근 긴장의 모든 생리적으로 관련된 내인성 조절자에 의해 조절되는 것으로 여겨지기 때문에 (도 2), 이것이 음경해면체 평활근 긴장의 정도의 중요한 최종적인 공통 매개체임이 명백하다. 이 가설과 일관되게, 본 발명자들은 이 채널의 조절/기능의 변화가 사람 음경해면체 평활근에서의 생물체 발기 부전의 존재의 중요한 특징을 나타낼 수 있다는 예비적인 증거를 갖고 있다 [참조: Fan, S.F., et al., J. Urol. 153 (1995) 818; Christ, G.J., Urologic Clinics of North America, 22.4:727-745 (1995); Christ, G.J., et al., Journal of Urology, 155:620A (1996)]. 이들 모든 이유에 대해, 본 발명자들은 사람 평활근 맥시-K 채널 cDNA에 의한 음경해면체 평활근 세포의 비교적 안정한 트랜스펙션이 발기력을 조절하기 위한 중요하고, 매력있는 방법을 나타낸다고 생각한다.
산화 질소 및 음경해면체 평활근 기능: 음경해면체 조직에서 발현되는 NO - 의 양이 증가되면 이완을 위한 "구동력"을 증가시킬 수 있다는 증거. 다수의 최근 실험 증거에 의해 동맥 및 음경해면체 평활근 이완, 즉, 음경 발기에서 산화 질소(NO-)에 의해 수행되는 중요한 역할이 입증된다 [참조: Argiolas, et al., Neuropharmacology 33.11 (1994) 1339-44; Burnett, et al., Science 257.5068 (1992) 401-3; Trigo-Rocha, et al., J. of Physiology 264.2 Pt2 (1993) H419-22; Burnett, et al. Biology of Reproduction 52.3 (1995) 485-9]. 예를 들어, 사람 (참조: Saenz de Tejada, et al., New England Journal of Medicine 320.16 (1989) 1025-30) 및 토끼 (참조: Ignarro, et al., Biochem Biophys Res Commun 170 (1990) 843-850) 음경해면체 근육 스트립 둘 모두의 전기 자극은 평활근 이완을 유도시킨다. 이들 반응은 산화 질소의 방출에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 이 가정과 일관되게, 이들 이완 반응은 NO- 형성을 차단시키는 L-아르기닌의 니트로글리세린 치환된 유사체에 의해 억제될 수 있다 [참조: Ignarro, et al., Biochem Biophys Res Commun 170 (1990) 843-850; Holmquist, et al., Acta Physiol Scand 141 (1991) 441-442; Kim, et al., J. Clin. Invest. 88 (1991) 112-118]. 또한, 토끼 및 사람 음경해면체 평활근 모두의 이완은 NO를 방출시키는 화합물을 통해 유도될 수 있다 [참조: Ignarro, et al., Biochem Biophy Res Commun 170 (1990) 843-850; Raifer, et al., New England Journal of Medicine 326 (1992) 90-94; Christ, G.J., et al. Urological Clinics of North America 22.4 (1995) 727-745]. 더우기, 사람 음경해면체 평활근의 이완에 대한 NO- 의존성 경로의 중요성이 또한 입증되었다 [참조: Bush, et al., J. Urol. 147 (1992) 1650-1655; Trigo-Rocha, et al., Neurology & Urodynamics 13.1 (1994) 71-80; Christ, et al., Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, 7.:714-726 (1995)].
산화 질소는 효소인 산화 질소 신타아제(NOS)에 의해 L-아르기닌의 L-시트룰린으로의 촉매 전환의 생성물로서 생성된다. NO-는 콜린성 자극시 또는 신경세포성 공급원에 의해 내피 세포에서 생성된다(NANC 신경 말단으로부터 방출). 신경세포성 공급원에 의한 생성과 관련하여, NO-는, 신경 말단의 시냅스 소낭에 저장되지 않지만 필요할 때 합성되는 신규한 신경전달물질이다. 토끼 및 래트 음경에서의 생화학적 및 조직화학적 증거는 음경 발기에서 작용하는 NOS 이소자임이 cNOS 타입에 속한다는 것을 암시한다 [참조: Burnett, et al., Science 257.5068 (1992) 401-3]. 래트 음경에서의 NOS에 대한 신경세포성 공급원은, NOS를 래트 cNOS 항체에 의한 면역조직화학 및 NADPH 다이아포라아제 조직화학 둘 모두에 의해 래트 및 사람 음경의 자율 신경에 제한시킴으로써, 키이스트(Keast)에 의해 입증되었다 [참조: Keast, J.R., Neurosciences Letter 143 (1992) 69-73; Burnett, et al., J. Urol. 150.1 (1993) 73-6; Burnett, et al., Science 257.5068 (1992) 401-3]. NO-의 작용 메카니즘은 다음과 같다고 생각된다: 생성 후, 매우 친지성 물질인 NO-는 음경해면체 평활근 세포내에 3차원적으로 신속하게 확산되며 (참조: Christ, et al., Biophysical Journal 67:1335-1344 (1994)), 여기에서, 가용성 구아닐레이트 사이클라아제를 활성화시킴으로써, GTP의 cGMP로의 전환을 촉매한다. cGMP의 이러한 증가는 단백질 키나아제 G를 활성화시키며, 이는 도 2에 도시된 바와 같이, 세포내 Ca2+를 감소시켜서, 음경해면체 평활근 이완을 초래한다 [참조: Moncada, S., Acta Physiol Scand 145 (1992) 201-227]. 전술한 바와 같이, 적어도 일부 혈관 평활근 세포의 경우, NO-가 K 채널과 직접 상호작용하여, 과분극 및 평활근 이완을 유도시킬 수 있는 것으로 또한 최근에 입증되었다.
이완 상태에서, NOS 활성은 최소인 것으로 생각된다 [참조: Ignarro, et al., Biochem Biophys Res Commun 170 (1990) 843-850; Rajfer, et al., New England Journal of Medicine 326 (1996) 90-94; Azadozi, et al., J. Urol. 147.1 (1992) 220-225; Brock, et al., Urology 42.3 (1993) 412-417; Hellstrom, et al., J. Urol. 151.6 (1994) 1723-7; Pickard, et al., British Journal of Urology 75.4 (1995) 516-22; Carrier, et al., J. Urol. 153.5 (1995) 1722-7; Garban, et al., American Journal of Physiology (1995) H467-H475; Burnett, et al., Biology of Reproduction 52.3 (1995) 485-9]. 음경해면체 조직내의 NADPH 다이아포라아제의 조직화학적 검출의 세기는 음경해면체 신경이 손상됨에 따라 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 NOS 활성이 감소되었음을 의미한다 [참조: Brock, et al., Urology 42.3 (1993) 412-417]. 또한, 당뇨병에 걸린 남성의 음경해면체 신경의 손상된 이완 반응 (전기 자극에 대한)은 NOS 생성의 감소에 또한 기인할 수 있음이 암시된다 [참조: Saenz de Tejada, I., New England Journal of Medicine 320.16 (1989) 1025-30; Taub, et al., Urology 42 (1993) 698; Christ, G.J., Urologic Clinics of North America 4 22.4 (1995) 727-745; Vernet, et al., Endocrinology 136 (1995) 5709-5717]. 따라서, 산화 질소 신타아제에 대한 구성적으로 발현된 cDNA의 도입은 음경해면체 평활근 이완 및 보다 양호한 휴지 및 신경 자극된 압력 반응을 초래시키는 것으로 예측될 수 있다. 후술되는 바와 같이, 뉴런 NOS에 대한 cDNA를 래트의 음경해면체내에 삽입시켜서, 통계적으로 현저하고, 생리적으로 관련된 변화를 음경해면체 신경의 전기 자극에 대한 음경해면체내 압력 반응에서 관찰하였다 (표 2).
래트 모델의 선택. 래트 음경이 조직학적으로 및 약리학적으로 사람 음경과 유사한 것으로 밝혀졌기 때문에, 래트를 유전자 치료 실험을 위해 선택하였다 [참조; Lesson, et al., Investigative Urology 3.2 (1965) 144-145]. 다수의 공지된 모델 중에서, 래트가 음경 발기 (참조: Lesson, et al., Investigative Urology 3.2 (1965) 14-145; Quinlan, et al., J. Urol. 141.3 (1989) 656-61; Chen, et al., J. Urol. 147 (1992) 1124-1128; Martinez-Pineiro, et al., European Urology, 25 (1994) 62-70) 및 신경원성 및 당뇨병성 발기부전 (참조: Rehman, et al., Am J Physiol (1997) 발행중)의 실험에 대해 우수하다.
맥시-K 채널 결과:
K 채널이 음경해면체 평활근 이완을 조절한다는 증거: 사람 음경해면체에서 NTG 및 PGE1 유도된 이완 반응을 매개하는 데에 있어서 맥시-K의 추정 역할. 세포성 및 단리된 조직 실험으로부터의 증거는 이 조직에서의 이완 반응을 조절하는 데에 있어서 맥시-K 채널의 중요한 역할을 입증한다.
NTG & 맥시-K: 도 1에 대표적인 예에 의해 도시된 바와 같이, PE 유도된 수축 반응에 대한 전술한 효과 이외에, 1mM TEA에 의한 맥시-K 채널의 선택적인 차단에 의해 NTG 유도된 이완 반응의 현저한 감쇄가 또한 초래된다 (100nM). 5개의 기타 음경해면체 조직 스트립에 대한 실험 결과, 100nM NTG에 의해 유도된 평균 ±S.E.M. %이완 반응은 20.3 ± 3.2% 였고; 이 값은 또 다른 최근 간행물에서 결정된 예상값 50.1%과 비교된다. 이러한 결과는 맥시-K 채널의 활성화가 NTG 유도된 이완 반응의 중요한 성분일 것으로 또한 여겨진다는 것을 입증한다. 이러한 가설과 일관되게, NTG 농도가 훨씬 높긴 하지만 (100μM), 배양된 음경해면체 평활근 세포에 대한 예비 패치 클램프 실험 세포 (즉, 부착된 패치 기록 모드)는 배양된 음경해면체 평활근에 대한 맥시-K 채널 활성의 NTG 유도된 증가를 입증한다.
PGE1 & 맥시-K: 모든 4가지 기록 모드를 사용하는 최근 전기생리학적 실험은 PGE1가 맥시-K 채널의 활성의 농도 의존적 증가를 야기시킨다는 것을 입증하며, 동일한 농도 범위에 걸쳐, 본 발명자들은 배양된 세포에서의 cAMP 및 사전수축된 단리된 사람 음경해면체 평활근 스트립의 이완을 관찰하였다 [참조: Zhang, et al., J. Urol. 155:678A (1996)]. 또한, 맥시-K 채널 활성의 증가는 푸라(fura)-2 로딩된 배양된 음경해면체 평활근 세포에서 나타나는 ET-1 유도된 세포내 칼슘 과도현상의 현저한 변화와 상호관련되어 있다. 특히, 배양된 사람 음경해면체 평활근 세포를 500nM PGE1과 예비인큐베이션하면, 161.5 ± 19.5 nM 내지 102.6 ± 9.5 nM의 기선 (즉, 약 70 nM) 보다 높은 ET-1 유도된 (50nM) 칼슘 과도현상의 피크 크기의 유의할 만한 약 40% 감소를 초래하였다 [참조: Zhao, et al., J. Urol. 155:678A (1996)]. 이 감소가, 세포외 Ca2+의 부재하에 (2mM EGTA) 또는 세포가 니페디핀(nifedipine) (참조: Zhao & Christ, J. Urol. 154:1571-1579 (1995)) (또는 베라파밀(verapamil) (참조: Christ et al., 미간행된 결과); 둘 모두는 L-타입 전압 의존성 칼슘 채널의 차단제임)과 예비인큐베이션되는 경우에 관찰되는 감소와 식별할 수 없음이 주목된다.
표 4. 음경해면체 평활근의 생리학에 대한 맥시-K 채널의 입증된 시험관내 효과의 요약
PE 유도된 수축 증가 휴지 음경해면체 평활근 긴장 증가 휴지 세포내 칼슘 농도 감소 ET-1 유도된 칼슘 반응 감소 완화 반응 감소 채널 활성 증가
예(1mM TEA) 예(10 내지 100mM TEA) 예(hSlo cDNA)에 의한 트랜스펙션 예(hSlo cDNA)에 의한 트랜스펙션 또는 PGE1 (500nM)과의 예비인큐베이션 예(1mM TEA) 예100μM NTG 또는 30nM 내지 30μM PGE1
최종적으로, 사람 평활근 맥시-K cDNA인 hSlo에 의한 사람 음경해면체 평활근 세포의 트랜스펙션에 의해 평균 휴지 세포내 칼슘 농도의 현저한 감소 (약 25%) 뿐만 아니라 ET-1 유도된 세포내 칼슘 과도현상의 감소 (약 45%)가 초래되는 것으로 본원에 나타나 있다 (표 6). 이전의 결과의 생리학적 중요성이 불확실하다고 하더라도, ET-1 유도된 세포내 칼슘 과도현상에 대한 트랜스펙션의 효과 (표 5)가 PGE, 니페디핀 및 베라파밀의 존재하 또는 세포외 칼슘의 부재하에 관찰되는 효과와 매우 유사하다. 종합해 보면, 이러한 모든 데이터는, 다수의 맥시-K 채널의 존재 (확실하게 정립된 것은 아니지만 아마도 트랜스펙션의 효과) 또는 예를 들어, PGE1에 의한 세포 활성화 후 맥시-K 채널 활성의 증가가 세포 과분극, L 타입 전압 의존성 칼슘 채널을 통한 트랜스멤브레인 칼슘 플럭스의 감소 및 ET-1 유도된 칼슘 과도현상의 피크 크기의 상응하는 감소과 관련되어 있다는 가설과 완전히 일치한다. 더우기, 배양된 음경해면체 평활근 세포에 대해 측정된 세포내 칼슘 과도현상의 피크 크기가 단리된 음경해면체 조직 스트립에 대해 측정된 정상 상태 수축 반응의 크기를 정확하게 추적하기 때문에 (참조: Christ, et al., J. Urol. 153:1998-2003 (1995)), 이들 데이터는, 맥시-K 채널의 활성 증가가 트랜스멤브레인 칼슘 플럭스를 변화시킴으로써 적어도 부분적으로 음경해면체 평활근 수축 반응의 크기를 조절한다는 강제적인 증거를 제공한다. 수축 및 이완의 크기 둘 모두를 조절하는 데에 있어서의 맥시-K 채널의 이중적 역할은, 트랜스멤브레인 칼슘 플럭스의 맥시-K 유도된 억제가 세포내 칼슘의 작용제(PE 또는 ET-1) 유도된 증가 또는 맥시-K 채널의 인산화의 PGE1 (아마도 PKA) 또는 NTG 유도된 (아마도 PKG) 증가 후에 일어날 수 있다는 사실을 이용한다는 것을 주지하는 것이 중요하며, 이러한 견해는 기타 혈관 평활근 세포 타입에 대한 문헌과 일치한다 (하기 표 5 및 도 2 참조).
표 5. 이온 채널 활성, 막 전위 및 음경해면체 평활근 긴장에 대한 혈관작용성 화합물의 효과
막 전위 -30mV (탈분극; 즉, 수축)
작용제 작용받는 채널 타입 추정 메카니즘 평활근 긴장에 대한 효과
ET-1PEKCl L 타입 Ca2+ 증가 전압 또는 인산화 긴장 증가
KCa 증가 Ca2+-감수성 긴장의 증가를 조절
KATP 증가 ATP 감소 긴장의 증가를 조절
TEA KCa 감소 채널 차단 긴장 증가
글리벤클라미드 (Glibenclamide) KATP 감소 채널 차단 긴장 증가
↑-40 내지 -50mV (휴지 전위)↓
PGE1NTG KCa 증가 인산화 긴장 감소
L 타입 Ca2+ 감소 전압 또는 인산화 긴장 감소
피나시딜(PINACIDIL) KATP 증가 평균 개방 시간의 증가 긴장 감소
막 전위 -60mV (과분극; 즉, 이완)
표 6. Cai의 휴지 및 ET-1 유도된 변화에 대한 hSlo cDNA에 의한 트랜스펙션의 효과
대조 세포 (n=17) TT 트랜스펙션된 세포 (n=32)
휴지상태 Cai ET-1 (50 nM) 휴지상태 Cai ET-1 (50 nM)
74.7±4.0 nM 164.1±17.8 nM *56.7±2.5 nM *90.8±6.6 nM
* 는 대조값과 통계적으로 현저한 차이를 보임을 의미한다; p<0.001, 쌍을 이루지 않은 샘플에 대한 스튜던트 t 테스트. Cai는 세포내 칼슘 농도를 나타낸다. ET-1 유도된 증가에 대해 주어진 값은 짜오(Zhao) 및 크라이스트(Christ)의 문헌에 기재된 세포내 칼슘 과도현상의 피크 크기를 나타낸다 [참조: J. Urol. 154 (1995) 1571-1579].
발기 부전의 치료에 대한 K 채널 활성을 조절하는 전위 이용의 첫 번째 시험으로서, 예비 실험을 생체내 래트 모델로 수행하였다. 간단하게, 사람 평활근 맥시-K 채널을 엔코딩하는 네이키드 cDNA (즉, hSlo; 워싱톤 대학의 살코프 박사로부터 입수)를 래트 음경해면체에 주입시키면, 현저한 흡수 및 유전자 발현이 초래되는 것으로 밝혀졌다. 이것은 맥시-K cDNA를 주입시킨 8개월령 스프라그 돌리 래트에서 관찰되는 신경 자극된 음경해면체내 압력 증가가 연령 매치된 대조군인 허위 조작된 동물에서 관찰되는 음경해면체내 압력 반응 보다 현저하게 높다는 사실에 의해 입증되었다 (도 3 및 표 5). 더우기, 이 유전자의 통합 (다시 한번, 대조 동물에 비해 음경해면체내 압력의 현저한 증가에 의해 판단됨)은 3개월을 넘는 동안 안정하였다. 이들 생체내 실험은 본 발명자들에 의해 구성된 모든 시험관내 결과와 완전히 일치하며, 이는 음경해면체 평활근 긴장의 조절에 대한 K 채널의 중요성을 또한 입증한다. 최종적으로, 사람 음경해면체 조직내의 사람 평활근 맥시-K의 기타 서브유닛이 존재할 수 있다는 것이 인식된다고 하더라도 (L. Salkoff, 비공식 정보), 이들 실험은 발기 생리학에 대한 맥시-K 채널의 역할을 평가하기 위한 합리적인 출발점을 나타낸다. 요약하면, 이들 실험은, K 채널이 다양한 환자 집단에서 평활근 긴장을 조절하는 방식을 보다 상세한 이해한 후, 분자 유전학의 강력한 도구를 사용하여, 수축과 이완 간의 균형을 보다 정밀하게 변화시킬 수 있다는 가망성을 제공하는 것으로 여겨지며; 이로써, 남성은 현재의 치료법과 관련된 임의의 제한에 의지할 필요 없이, 보다 일관되게 스스로 강력한 발기를 할 수 있게 된다.

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  36. 약제학적으로 허용되는 담체, 및 맥시-K(maxi-K) 칼륨 채널 단백질을 엔코딩하는 DNA 분자를 생체내에서 음경 평활근의 이완을 증가시키기에 유효한 양으로 포함하는, 생체내에서 음경 평활근의 이완을 증가시키기 위한 유전자 치료제.
  37. 제36항에 있어서, DNA 분자가 음경해면체 평활근 또는 동맥 평활근에 도입됨을 특징으로 하는 유전자 치료제.
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  39. 제36항에 있어서, DNA 분자가 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란, 양이온성 리포솜 융합, 원형질 융합, DNA 코팅된 마이크로프로젝틸 밤바드먼트(microprojectile bombardment), 재조합 복제-결함 바이러스를 사용한 주입, 상동 재조합 및 네이키드(naked) DNA 전달로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 도입됨을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  40. 제36항에 있어서, DNA 분자가 네이키드 DNA 전달에 의해 도입됨을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  41. 제36항에 있어서, DNA 분자가 게놈 DNA 또는 cDNA임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  42. 약제학적으로 허용되는 담체, 및 맥시-K(maxi-K) 칼륨 채널 단백질을 엔코딩하는 DNA 분자를 피검자에서 음경 발기를 유도하기에 유효한 양으로 포함하는, 피검자에서 음경 발기를 유도하기 위한 유전자 치료제.
  43. 제42항에 있어서, DNA 분자가 음경해면체 평활근 또는 동맥 평활근에 도입됨을 특징으로 하는 유전자 치료제.
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  45. 제42항에 있어서, 피검자가 발기 부전에 걸려 있음을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  46. 제45항에 있어서, 발기 부전이 평활근의 불완전한 이완으로 인한 것임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  47. 제45항에 있어서, 발기 부전이 신경성 기능부전으로 인한 것임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  48. 제45항에 있어서, 발기 부전이 동맥성 기능부전으로 인한 것임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  49. 제45항에 있어서, 발기 부전이 정맥폐색성 기능부전으로 인한 것임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  50. 제42항에 있어서, DNA 분자가 일렉트로포레이션, DEAE 덱스트란, 양이온 리포솜 융합, 원형질 융합, 생체내 전기장의 생성, DNA 코팅된 마이크로프로젝틸 밤바드먼트, 재조합 복제-결함 바이러스를 사용한 주입, 상동 재조합 및 네이키드 DNA 전달로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 도입됨을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  51. 제42항에 있어서, DNA 분자가 네이키드 DNA 전달에 의해 도입됨을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  52. 제42항에 있어서, DNA 분자가 게놈 DNA 또는 cDNA임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  53. 제36항에 있어서, DNA 분자가 맥시-K(maxi-K) 칼륨 채널 단백질을 엔코딩하는 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  54. 제42항에 있어서, DNA 분자가 맥시-K(maxi-K) 칼륨 채널 단백질을 엔코딩하는 분자에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함함을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  55. 제53항에 있어서, 프로모터가 평활근 특이적 프로모터임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
  56. 제54항에 있어서, 프로모터가 평활근 특이적 프로모터임을 특징으로 하는 유전자 치료제.
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