JP2004536103A - ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｈｅ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用 - Google Patents
ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｈｅ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004536103A JP2004536103A JP2003509100A JP2003509100A JP2004536103A JP 2004536103 A JP2004536103 A JP 2004536103A JP 2003509100 A JP2003509100 A JP 2003509100A JP 2003509100 A JP2003509100 A JP 2003509100A JP 2004536103 A JP2004536103 A JP 2004536103A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ache
- pharmaceutical composition
- mrna
- composition according
- muscle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01007—Acetylcholinesterase (3.1.1.7)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
- C12N2310/321—2'-O-R Modification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【課題】
進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防に有用な薬学的組成物を実現する。
【解決手段】
本発明の薬学的組成物は、活性成分として、ヌクレオチド配列：５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなり、ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するものである。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを優先的に破壊し、異種間特異性を有し、げっ歯類動物や霊長類動物において毒性を起こさないことが証明され、そしてｉ．ｖ．及びｐ．ｏ．投与により霊長類動物（サル）のＢＢＢに浸透することが出来る。
進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防に有用な薬学的組成物を実現する。
【解決手段】
本発明の薬学的組成物は、活性成分として、ヌクレオチド配列：５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなり、ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するものである。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを優先的に破壊し、異種間特異性を有し、げっ歯類動物や霊長類動物において毒性を起こさないことが証明され、そしてｉ．ｖ．及びｐ．ｏ．投与により霊長類動物（サル）のＢＢＢに浸透することが出来る。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防のため、ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）ｍＲＮＡの一般的なコーディング領域を対象とした合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及びその薬学的又は医学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
引例を含め、本明細書に引用されているすべての出版物は、言及することによりここに組み込まれている。
【０００３】
神経筋接合部（ＮＭＪ）は、とても特徴的で形態学的に異なったコリン作動性シナプスである（Ｈａｌｌ ａｎｄ Ｓａｎｅｓ（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２ Ｓｕｐｐｌ．， ９９−１２１）。ＮＭＪ活性の慢性障害は、筋肉構造及び機能の進行低下という神経筋疾患を引き起こす。ＮＭＪの活性低下から筋肉消耗までの分子及び細胞のメカニズムはまだ解明されていない。
【０００４】
疾患の１つとして重症筋無力症（ＭＧ）があり、これは、機能的なシナプス後筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の数を大幅に減少させる自己抗体が仲介する神経筋伝達の異常によって起こる（Ｄｒａｃｈｍａｎ Ｄ．Ｇ．（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ.Ｊ．Ｍｅｄ．３３０，１７９７−１８１０；Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２，５４５−５５１）。ＭＧは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の抑制剤により筋力が一時的に改善することが特徴である（Ｐｅｎｎ Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｗｌａｎｄ Ｌ．Ｐ．（１９９５） Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ Ｇｒａｖｉｓ Ｉｎ：Ｍｅｒｉｔｔ‘ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ｓｅｃｔｉｏｎ ＸＶII，７５４−７６１）。電気診断で見られる特徴的な異常性として、３又は５Ｈｚでの反復神経刺激により複合筋活動電位（ＣＡＭＰ）の振幅が進行的に、また急激に減衰してしまうことである。現在のところ、一般的なＭＧ治療は、ピリドスチグミン（Ｍｅｓｔｉｎｏｎ（登録商標））のような末梢ＡＣｈＥ阻害薬を１日数回、長期にって投与する等の免疫抑制療法である。ＡＣｈＥ阻害薬はＭＧ患者の筋肉を効果的に回復させるが、その効果は長く続かず、他の効果的な治療の開発が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アンチセンス技術は、従来のアンチコリンエステラーゼ療法に代わる、魅力的で遺伝子に基づくものである。アンチセンス技術は、長さが１５−２５残基で、対象のｍＲＮＡの配列を補う配列を持つ短いオリゴヌクレオチドをデザインするワトソン−クリック型対合の規則を生かしている（Ａｇｒａｗａｌ Ｓ．ａｎｄ Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ Ｅ．Ｒ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，６，７２−８１）。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）とそのターゲットとのハリブリダイゼーションにより形成される二重鎖ＲＮＡの伸縮性は、ＲＮＡｓｅＨを活性化させ（Ｃｒｏｏｋｅ Ｓ．Ｔ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，３−４５）、二本鎖ｍＲＮＡ特有の低下を促進させる。アンチセンス療法学は、プロテインよりもむしろＲＮＡを対象としているため、ナノモル程度の効率的な濃度で特に特定的な薬物をデザインする（Ｇａｌｙａｍ Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１１，５１−５７）。マウスＡＣｈｅ ｍＲＮＡを対象とした、ホスホロチオエート化され、３’末端が保護された２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト及びげっ歯類の培養細胞（Ｋｏｅｎｉｇｓｂｅｒｇｅｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９，１３８９−１３９７；ＷＯ ９８／２６０６２；Ｇｒｉｓａｒｕ Ｄ．ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７，９３−１０５）、及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて脳（Ｓｈｏｈａｍｉ Ｅ．ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８，２７８−２３６；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、ｉｎ ｐｒｅｓｓ）、筋肉（Ｌｅｖ−ＬｅｈｍａｎＥ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，９３−１０５）及び骨髄（Ｇｒｉｓａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｉｂｉｄ．）のＡＣｈＥ発現をブロックすることに効果的であることが示された。
【０００６】
発明者は、非可逆的コリンエステラーゼ阻害薬ジイソプロピル・フルオロ・ホスホネート（ＤＦＰ）での治療が、脳（Ｋａｕｆｅｒ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９３，３７３−３７７）及び腸（Ｓｈａｐｉｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９，１２７３−１２８２）において、ＡＣｈＥ、ＡＣｈＥ−Ｒの珍しい非シナプス的で代替的なスプライシング変異体を過剰発現させることを観察した。ＤＦＰで治療した動物の筋肉においてもまたＡＣｈＥ−Ｒが過剰発現し、神経突起の分岐増加、消耗性繊維の乱れ及びＮＭＪ障害を引き起こす。マウスＡＣｈＥ ｍＲＮＡをターゲットとした部分的に保護された２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥのフィードバックアップレギュレーションを抑制し、ＤＦＰが誘発したＮＭＪの障害を改善した（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｂｉｄ．）。これらの観察により、コリン作用性ストレスは筋肉においてＡＣｈＥ−Ｒを高発現させ、アンチセンスオリゴヌクレオチドはそのＡＣｈＥ−Ｒを抑制して、有害な結果を防止することが出来ると証明された。
【０００７】
上述したように、電気診断で見られる独特な異常性として、３又は５Ｈｚの反復神経刺激により複合筋活動電位（ＣＡＭＰ）の振幅が進行性に、また急激に減衰してしまうことである。この筋無力性の疲労び原因は、シナプス後部に局在するＡＣｈＲ分子の数が減少することである。抗ＡＣｈＲ抗体の抑制は、８５−９０％の患者において行われている（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．（１９９９）ｉｄ ｉｂｉｄ）。
【０００８】
先天的ではない、他の原因によるＭＧ患者（Ｔｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １５，２６７−７２）は、塩化エドロホニウムのようなＡＣｈＥ阻害薬に対して一時的な臨床反応をみせる。入手可能な抗ＡＣｈＥ薬剤は、治療において真っ先に使用されるものであるが、ほとんどの患者にはさらなるなにかが必要である。例えば、血漿交換、胸腺摘出術、免疫抑制などの思い切った治療である。不運にも、現在使用されているすべてのＭＧ薬物の投薬計画は、長期的で、有害な結果を伴う。例えば、神経筋伝達の障害、ＭＧ症状の悪化と誘発である。安全な抗感染薬、心臓脈管薬、抗コリン作用薬、抗痙攣薬、抗リウマチ剤などの一般的な薬物の使用もまた、ＭＧ患者の症状を悪化させるという報告がある（Ｗｉｔｔｂｒｏｄｔ（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５７，３９９−４０８）。
【０００９】
カルバミン酸塩アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害薬（例えば、ピリドスチグミン）の長期全身投与は、ＭＧと関係している神経筋の機能低下を一時的に緩和するが、発明者たちは、ピリドスチグミンがＡＣｈＥ過剰蓄積を導くフィードバック反応を引き起こすことを発見した（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，１３８２−１３８５；Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ；Ｍｅｓｃｈｏｒｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，５０８−１２）。この発見は、そのような阻害薬の長期使用が、患者の神経筋システムのコリン作用性バランスを変化させ、そのためにこれらの薬物の投与量を増やさなければならなくなること、；ＭＧ患者に適用される投与計画がとても変更されやすいこと、；また、アセチルコリン加水分解を抑制する他の方法の開発を求めることを示唆するものである。
【００１０】
エクソン１‐４及び６を有して”シナプス”（Ｓ）イソ型をコーディングするＥ６ ｍＲＮＡ、エクソン１−６を有して”赤血球”（Ｅ）イソ型をコーディングするＥ５ ｍＲＮＡ、そしてエクソン１−６と偽イントロンＩ４を有して、３’未スプライシング転写より生成された”リードスルー”ＡＣｈＥ−ＲをコーディングするＩ４ ｍＲＮＡを生じる３’選択的スプライシングをＡＣｈＥ−コーディングＲＮＡに行う。
【００１１】
筋肉ではなく、脊髄運動ニューロン内でヒトＡＣｈＥ−Ｓが過剰発現している遺伝子移植マウスは、ＮＭＪ超構造の変化に関係する進行性神経支配障害をもつ（Ａｎｄｒｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，８１７３−８１７８）。しかしながら、筋肉内におけるある程度の過剰発現ＡＣｈＥが、この深刻な筋病理学を仲介するのに十分であるかどうかは明らかになっていなかった。発明者たちはげっ歯動物において、外傷性ストレス及びコリンエステラーゼ阻害薬の両方が、コリン性作動薬及び抑制因子の両方に対する神経過敏症を伴う（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）ｉｄ ｉｂｉｄ）、カルシウム依存の深刻なＡＣｈＥ−Ｅの過剰発現を引き起こすことをあらかじめ発見していた（Ｋａｕｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ．）。
【００１２】
慢性的なＡＣｈＥ過剰は、遺伝子移植マウス及び両生類胚において進行性神経支配を低下させることがわかった（Ｂｅｎ Ａｚｉｚ−Ａｌｏｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，２４７１−２４７５；Ｓｅｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２，１６７０−１６８１；Ｓｅｉｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｏｉｌ．１５，２９９３−３００２；Ａｎｄｒｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，８１７３−８１７８；Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，１２４０−１２４９）。また、筋無力症患者は、年平均２．５％の発生率（Ｂｅｒｒｏｕｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２５，１２２８−３５）で、抗ＡＣｈＥ中毒を暗示させるような呼吸不全を伴う深刻なクリーゼを患う。
【００１３】
本発明の発明者たちは、ＡＣｈＥの共通コーディング領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＣｈＥ生成を抑制するために有用であることをあらかじめ発見していた（ＷＯ ９８／２６０６２）。この出願はまた、脳にヒトＡＣｈＥが過剰発現した遺伝子移植マウスを観察し、ヒトＡＣｈＥに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記憶欠乏症の治療に有用であることを記載している。この観察結果（ＷＯ ９８／２６０６２の表４−５参照）によると、同様の効果をもち、さらに従来のＡＣｈＥ阻害薬タクリンより大幅に作用時間が長い（ＷＯ ９８／２６０６２の図９Ｂ参照）。
【００１４】
以上からみて、ＭＧおよび神経筋伝達欠陥を含む他の症状に対し、さらなる治療方法の改善が望まれる。ＡＣｈＥ阻害薬を使用した従来の治療は、阻害薬がＡＣｈＥを誘発し神経筋も傷つけ、また精神状態の変化（ストレス）で効果が変わるために、良くない副作用がでる。
【００１５】
ＷＯ０１／３６６２７において、ＮＭＪ内の形態的で機能的変化は、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡの特定イソ型、つまり、成熟したｍＲＮＡの偽イントロンを含有する”リードスルー”イソ型の過剰発現と関係していると記載している。このＰＣＴ出願では、ＡＣｈＥの一般コーディング領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、特にＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを破壊することが出来ること、神経筋疾患の治療において、ＡＣｈＥアンチセンス薬剤が従来のＡＣｈＥ酵素阻害薬よりも優れていることも示している。これらのアンチセンス薬剤の優性は、従来の酵素阻害薬がＩ４ ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ過剰発現を活発に引き起こすという事実によるものである。ＷＯ０１／３６６２７によると、これはＮＭＪにおいて有害な変化をもたらす。この治療結果は、ＷＯ０１／３６６２７のアンチセンス薬剤を使用することによって完全に防止することが出来る。
【００１６】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）のホメオスタシス環境を維持する。血液を脳に供給する毛細血管は密着結合し、毛細血管内皮細胞の膜を通過する分子のほとんどをブロックする。脂溶性物質は細胞膜を通過するが、水溶性物質は一般的にＢＢＢを通過しない。仲介輸送機構は、水溶性グルコース及び必須アミノ酸がＢＢＢを通過するようにする。活性支援機構は、カリウムのような過剰になる分子を脳から取り除く（参考として、Ｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ−Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｂａｒｒｉｅｒｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３２，ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈｅｄ．，Ｅｄｓ Ｓｉｅｇｅｌ，Ａｌｂｅｒｓ Ａｇｒａｎｏｆｆ，Ｍｏｌｉｎｏｆｆ，ｐｐ．６８１−７０１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｅｔｚ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，ｐｐ．７４−８３）。
【００１７】
ＢＢＢは薬物がＣＮＳに到着するのを遅らせる。そのため、例えばオヤマリザーバーを利用した、鞘内輸送によるＣＮＳ内の直接輸送等、必要な薬物を輸送する方法が計画されている。Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，４５５，０４４は、拡散システムを利用したＣＮＳへの輸送について記載している（他のＣＮＳへの輸送機構については、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，５５８，８５２、Ｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｅｔｚ，ｉｂｉｄ）。Ｔａｖｉｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔａｖｉｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｍｅｄ４（４）：４６７−７１）は、２’−メチルオリゴヌクレオチドの脳内への浸透を観察した。他のシステムにおいては、ＢＢＢの構造と機能を考慮し、例えば、脂溶性薬物をデザインするか又はＢＢＢに浸透可能なペプチドと結合することにより特別に薬物をデザインし、薬物を輸送する。
【００１８】
ストレスがＢＢＢへの浸透性に影響を及ぼすことがわかっている（Ｓｈａｒｍａ Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９１，１８９−１９６；Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．４８９，１４９３−１５００）。さらに、哺乳類動物は急性ストレスにより神経興奮性が増加し、放出されたアセチルコリンが短時間で一時的に増加した（Ｉｍｐｅｒａｔｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５３８，１１１−１１７）。本発明の発明者たちは、ＡＣｈＥ−Ｒイソ型及びＡＣｈＥのＩ４ペプチドがストレスを擬態する薬剤として作用し、ＢＢＢを破ることをあらかじめ発見している。これらの発見は、ここに参照として組み込まれているＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１３２の基礎になっている。ＷＯ９８／２２１３２は、ＡＣｈＥ−Ｒスプライス変異体及び／又はペプチドＩ４からなる化合物のＢＢＢ通過を促進する組成物に関するものである。
【００１９】
部分的に人間の治療に役立つかもしれないヒトＡＣｈＥ領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究において、発明者たちは、本発明の目的でもある、ヌクレオチド配列：５’−ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ−３’（ここではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と指定する）を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発見した。これはＡＣｈＥ−Ｒイソ型の生成を選択的に抑制するのに有用なだけでなく、異種間の特異性を持ち、つまり様々な症状のげっ歯類動物モデルに使用可能であり、さらに明らかにＢＢＢに浸透するため、単独で又は他の治療薬と合わせて中枢神経疾患の治療に有用である。特にＢＢＢは大きな極性分子に対して不浸透性であると考えられていたため、本発明の新たなアンチセンスがＢＢＢに浸透するという発見は意外なものであった。
【００２０】
オリゴヌクレオチドを脳に輸送するシステムの欠乏により、神経系疾患の治療に適用されるアンチセンスの技術は最近まで限界があると考えられていた。それにもかかわらず、この難題を回避するためにいくつもの実験が行われた（Ｓｅｉｄｍａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ，９，３３３−３４０参照）。ＢＢＢとして知られている生体力学的バリアは、血中の化学薬物が脳の間質腔に進入するのを制限する。ホスホジエステルバックボーンの強力な陰イオン性は、ＢＢＢを通過時にオリゴヌクレオチドを特に弱めてしまう。ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物生態学において、全身投与により１％未満のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドが脳に到達しても、そこで６０分程度しかとどまっているいないことが証明されている。この問題に対する解決法は、オリゴヌクレオチドを頭蓋内に注入するという、ＢＢＢへの直接投与である。ラット及びマウスに対して公開された定位座標を用い、１回注射、埋め込み型カニューレによる反復投与、又はＡｌｚｅｔ（Ａｌｚａ，Ｐａｌｏ，Ａｌｔｏ，ＣＡ）のような浸透性ミニポンプを利用した継続注入により、オリゴヌクレオチドを輸送することが出来る。オリゴヌクレオチドはＣＳＦ内に輸送されるか、又は関係ある脳の領域に直接輸送される。一般的に、オリゴヌクレオチドは実質内投与後において比較的局在すると考えられている。ｃＡＭＰ反応性エレメント（ＣＲＥＢ）を目的とした２４μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドをラットの小脳扁桃へ１回投与すると、注射箇所の周りに０．７２±０．０４μｌ拡散し、条件性味覚嫌悪（ＣＴＡ）に局部的影響を及ぼすことが報告された。同じオリゴヌクレオチドを小脳扁桃上２ｍｍの大脳基底核へ注入してもＣＴＡに影響はない。同様に、ストレスに関わる転写因子ｃ−ｆｏｓに対するアンチセンスヌクレオチドを前頭葉に注入後（１回の投与；１０μｇ）、神経伝達物質の酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するオリゴヌクレオチドを視床下部腹内側部に輸送後（１回の投与；１μｇ）、及びｃＡＭＰ反応転写因子ＣＲＥＢをコーディングするｍＲＮＡをターゲットとしたオリゴヌクレオチドを青斑核へ５日間連続注入した後（１日２０μｇ）における、行動への影響が具体的に報告された。さらに、直接的で高流量な実質内ミクロ注入により、脳内のオリゴヌクレオチドを広げる（４８時間後、注入場所から４４３μｌまで）ことが可能と報告された。この場合、オリゴヌクレオチドの平均的な組織濃度は、生理的に有効だと考えられている３−１５μＭと計算された。神経細胞への取り込みに関し、ラットのストリアトゥムの神経細胞は、グリアに比べて優先的にオリゴヌクレオチドを取り込む。研究で報告された注入場所周辺のオリゴヌクレオチドの一般的な残留にもかかわらず、投射経路に沿って離れた場所へ移動したことが観察された。しかしながら、効果的な治療のためには、オリゴヌクレオチドを静脈注射、又はさらに好適には、経口投与で中枢神経内で安定させ自由に浸透させるようにすることである。本発明は、ヒトＡＣｈＥの共通コーディング領域に対する、新たな、そして好適にはヌクレアーゼ保護のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを目的としている。このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、選択的にＡＣｈＥ−Ｒの生成を抑制して、筋肉機能の臨床改善を短時間で、しかも持続させる。また、異種間特異性を有し、ＢＢＢに浸透し、中枢神経細胞内のＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを破壊する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、進行性神経筋疾患の治療及び／又は防止用の薬学的又は医学的組成物に関するものである。この組成物は、活性成分として、ヌクレオチド配列：５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなり、ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するものである。
【００２２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを優先的に破壊し、異種間特異性を有し、げっ歯類動物や霊長類動物において毒性を起こさないことが証明され、そしてｉ．ｖ．及びｐ．ｏ．投与により霊長類動物（サル）のＢＢＢに浸透することが出来る。
【００２３】
実施例において、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性である。ヌクレア−ゼ抵抗性は、部分的に不飽和脂肪族炭化水素系溶剤鎖、及びカルボン酸グループ、エステルグループ、及びアルコールグループを含む１つ以上の極性又は電荷グループからなるように本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを変化させることで達成される。
【００２４】
特に、本発明のヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデキシヌクレオチドは、最後３つの３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ−メチル化、好適には最後の３’末端ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル化されている。又は、本発明のヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、最後の３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つがフッ素化であることである。又は、本発明のヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、最後の３’末端ヌクレオチド塩基のうち少なくとも１つの結合がホスホロチエート結合であり、好適には最後４つの３’末端ヌクレオチド塩基がホスホロチエート結合であることである。又、さらに、ヌクレアーゼ抵抗性は、３’末端にヌクレオチドループを形成する配列、例えばヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である９−ヌクレオチドループを有する本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによって達成される。
【００２５】
本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、哺乳類のＡＣｈＥ生成を選択的に調節することが出来る。特に、介在ニューロンのヒトＡＣｈＥを含め、中枢神経系に在している神経細胞の霊長類ＡＣｈＥ生成を選択的に調節する。
【００２６】
更なる側面として本発明は、本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、さらに任意的に、薬学的に条件を満たした補助的キャリア又は希釈剤からなる薬学的組成物に関するものである。
【００２７】
実施例において、本発明の薬学的組成物は、最後の３’末端ヌクレオチドのうち少なくとも１つ、好適にはすべてが２’−Ｏ−メチル化されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の薬学的組成物は、スタミナの向上及び／又は慢性的筋肉疲労の減少のため、進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防において有用である。
【００２９】
本発明の薬学的組成物においては、毎日１回、約０．００１μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇ、好適には、約０．０１μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇ、さらに好適には、約０．１５μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇの活性成分の投与に使用される。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、特にＡＣｈＥ ｍＲＮＡ又はプロテインの過剰と関係している進行性神経筋疾患の治療又は防止において使用されることを目的とする。このような疾患は、例えばＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰と関係している進行性神経筋疾患である。
【００３１】
かくして、本発明の薬学的組成物は特に、コリン作用性伝達の欠陥に関係する進行性神経筋疾患の治療または防止に好適である。
【００３２】
特に、薬学的組成物は、筋肉変形、筋肉再神経支配またはＮＭＪ異常を含み、例えば、重症筋無力症、イートン・ランバート症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、多発性硬化症、失調、脳梗塞後硬化症、外傷後筋肉損傷、術後麻痺、過剰再神経支配、ＡＣｈＥ阻害薬への暴露後に関係する進行性神経筋疾患治療用である。
【００３３】
本発明の薬学的組成物は、身体的運動のスタミナ向上または筋肉疲労を軽減するためにも有用である。
【００３４】
さらに、本発明は、化合物のＢＢＢ通過を助長するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと、さらに任意に、付加的な薬学的活性物質及び／又は薬学的に条件を満たした補助的なキャリア又は希釈剤からなる薬学的組成物に関するものである。付加的な薬学的活性物質とは、ＢＢＢを通過して伝達される化合物である。例えば、中枢神経系用の造影剤、乱用した薬物による影響をブロックする薬剤、抗生物質、化学療法薬、遺伝子治療に使用されるベクターである。この化合物は、明らかにＢＢＢ維持に関係があるＡＣｈＥ−Ｅの生成を抑制することにより本質的に機能する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
明細書及び図面において本発明を詳しく説明する。
明確にする為に、以下の略語をここで使用する。
ＡＣｈＥ：アセチルコリンエステラーゼ
ＡＣｈＥ−Ｒ：アセチルコリンエステラーゼ、”リードスルー”変異体又はイソ型。そのｍＲＮＡは偽イントロンＩ４を含む。
ＡＣｈＥ−Ｓ：アセチルコリンエステラーゼ、シナプス変異体又はイソ型。
ＡＳ−ＯＮ：アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＢＢＢ：血液脳関門
ＣＭＡＰ：複合筋活動電位
ＣＮＳ：中枢神経系
ＥＡＭＧラット：実験的に自己免疫筋無力症にされたラット
ＥＮ１０１：ＡＳ３とも呼ばれる。ヒト、ラット、又はマウス（それぞれｈＥＮ１０１、ｒＥＮ１０１、またはｍＥＮ１０１）ＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＥＮ１０２：ＡＳ１とも呼ばれる。ＥＮ１０１とは違う領域で、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＭＧ：重症筋無力症。神経筋接合疾患。
ｉ．ｖ．：静脈注射
ｏ．ｇ．：強制経口投与（ｏｒａｌ ｇａｖａｇｅ）
ｐ．ｏ．：経口投与
【００３６】
アンチセンスヌクレオチド：ＡＣｈＥ ｍＲＮＡの配列とは逆の相補的配列からなるヌクレオチド。このヌクレオチドは、好適にはオリゴデオキシヌクレオチドだが、リボヌクレオチドやヌクレオチド類似体、またはその混合体も本発明によって考慮される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのヌクレアーゼ抵抗性を高めるため、その細胞膜透過性を向上させるため、又はその両方を目的として変化させても良い。アンチセンスオリゴヌクレオチドは線形でも２次構造でもよい。また、リボザイム活性のような酵素活性から構成されてもよい。
【００３７】
進行性神経筋疾患：過剰ＡＣｈＥ ｍＲＮＡまたはプロテイン生成に関係した疾患又は状態。ＮＭＪの形態学の変化や神経筋伝達の欠陥が特徴である。神経筋疾患は、筋肉破壊、筋肉再神経支配またはＮＭＪ異常を伴う。さらに好適には、進行性神経筋疾患は重症筋無力症、筋ジストロフィー症、多発硬化性、筋萎縮性側索硬化症、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、又は失調である。
【００３８】
本発明は、実質上ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される新しい種類のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに関するものであり、ここではｈＥＮ１０１と表されている。
【００３９】
ＡＣｈＥ配列に相補的な配列の一部に加え、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、酵素のヌクレオチド的活性を有するＲＮＡ配列を含ませたり、そのような配列に結合させても良い。好適なヌクレオチド配列は、特にｍＲＮＡ転写と相互に作用するリボザイム配列でる。それらはアンチセンスオリゴヌクレオチドによって挟まれたＲＮａｓｅ活性サイトを含むリボ核酸配列である（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３，ｐ．５８５、Ｓｅｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，ｐ．１２２２）。好適なリポザイムはハンマーヘッド型リポザイムである（Ｃｏｎａｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，２４００−２４０７；ａｎｄ Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２１３４−４４）。他の好適なリポザイムは、例えばタバコ輪点ウィルスサテライトＲＮＡから得られるようなヘアピン型リボザイム構造である（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｕｉｚ（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，３３−４３）。
【００４０】
本発明のまったく新しいアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ヌクレオチド７９５−５’からヌクレオチド３’−８１４までのヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡ配列の逆相補体に対応する（図１）。本発明者たちの以前の研究により、ＡＣｈＥ生成の抑制及び記憶欠乏症の治療において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが有効であることを証明している。また、その研究においてＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの数が開示されている。その研究ではさらに、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの望ましい性質とその変異体、例えばヌクレアーゼ抵抗性を有する変異体やオリゴヌクレオチドの細胞膜輸送を高めるための変異体なども開示している。以前の研究、つまりＷＯ９８／２６０２６は参考として本明細書全体に組み込まれている。他の刊行物において、本発明者たちは、様々な神経変性病の治療におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの役目を開示している（Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ．９，３３３−３４０（１９９９）。
【００４１】
本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、好適にはヌクレアーゼ抵抗性である。ヌクレアーゼ抵抗性を与えるようなオリゴヌクレオチドの変異体が数多くある。ＷＯ９８／２６０６２において、例えば、ホスホジエステルインターヌクレオチド結合をホスホロチオエート結合に変更し、２’−Ｏ−メチルグループによって１つ以上のヌクレオチドを変化させ、又は生理学上の条件下でループ構造を形成し得るヌクレオチド配列をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の３’末端に加えることにより、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性に作られる。ループを形成する構造は、配列５’ＣＧＣＧＡＡＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に加えてヌクレアーゼ抵抗性を作る。
【００４２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが影響を与える細胞は、神経軸索と終板構造を含む筋肉細胞及びＮＭＪの細胞である。
【００４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＡＣｈＥ−Ｒの量とＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルが中枢神経系内で、投与後２４時間以内に少なくとも約３０％、好適には少なくとも約４０％、さらに好適には少なくとも約５０％、また、連続投与により約８０％減少することが期待される。この減少は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と免疫標識によって示され、その効果は電気生理学及び踏み車テストで確認された。これは、以前に報告された他の細胞及び組織におけるＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡのＡＳ−ＯＮ破壊を圧倒的に上回るものである。
【００４４】
さらに、本発明の他の実施例おいて、オリゴヌクレオチド候補での治療をＦＩＳＨで評価する。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは同業者にとって良く知られてた技法で、例えば、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．（Ｅｄ．）ＩＳＢＮ：０１９９６３３２７４；Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ，Ｗｉｓｄｅｎ Ｗ．，Ｍｏｒｒｉｓ Ｂ．Ｊ．（Ｅｄｓ．），ＩＳＢＮ：０１２７５９９２０７，ＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ １８６），Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｃ．Ｓ．，Ｊｏｈｎ Ｏ’Ｌｅａｒｙ Ｊ．，（Ｅｄｓ）ＩＳＭＮ：０１９９６３６３２Ｘにおいて記載されている。放射活性を持たせていない標識プローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに関する詳細なプロトコルはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＧｍｂＨ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で入手可能である。
【００４５】
標識ＡＣｈＥ−Ｒ ｃＲＮＡ配列は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブとして使用可能である。ＡＣＨＥ ｃＲＮＡプローブは、好適にＩ４偽イントロン配列からなる。
【００４６】
本発明の実施例において、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣを利用して決定され、その技法は、例えば上述した刊行物、及びＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３ｒｄ ｅｄ．，ｂｙ Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）において記載されている。
【００４７】
ホスホロチオエートで変化させたオリゴヌクレオチドは、一般的に副作用がないとされている。Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ホスホジエステル−ホスホロチオエート混合バックボーンを使用すると、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの望まないｉｎ ｖｉｖｏ副作用は軽減されると記載している。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエートとして有効であり、さらに部分的に２’−Ｏ−メチル保護のオリゴヌクレオチドとして有効であると発見した。ＷＯ９８／２６０６２において、約２０のインターヌクレオチド結合のうち３つのホスホロチオエート結合を含んでいるＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを、約１−１０μＭの濃度で使用する場合は安全だと記載している。しかしながら、長期投与においては、分化したときに中毒性グループを解放しないオリゴヌクレオチドのほうが好適である。このオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル保護のオリゴヌクレオチドを含むが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含まない。ホスホロチオエート保護より２’−Ｏ−メチル保護の利点は、少ない量のオリゴヌクレオチドでＡＣｈＥを抑制出来ることである。この違いは、２’−Ｏ−メチル保護のオリゴヌクレオチドを使用したとき得られる２本鎖の安定性に関係していると思われる（Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．＆Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，６９９１−７，（１９９８）。２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのよりすごい有効性として、オリゴヌクレオチド鎖が細胞膜へ進入することを促進する。２’−Ｏ−メチル保護の更なる利点は、ヌクレアーゼ仲介の悪化に対する、より優れた予防であり、結果としてこのように保護されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を持続することとなる。
【００４８】
本発明によると、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの投与量は、投与する動物の体重１ｇあたり約０．００１から５０μｇのオリゴヌクレオチドである。好適には、約０．０１から約５．０μｇ。さらに好適には、約０．０５から約０．５μｇである。従って、適正な投与量は、ラットとサル両方の動物の体重１ｋｇにつき５０−５００μｇである。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ過剰生成をもたらす疾患の治療に使用される。
【００５０】
疾患は、ＮＭＪにおいて機能的そして形態学的変化に伴って生じる疾患である。
【００５１】
進行性神経筋疾患は、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰発現に伴う。
【００５２】
さらに好適には、疾患は例えば、多発性硬化症、ＰＴＳＤ、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、失調、筋肉破壊、筋肉再神経支配、又は過剰筋肉神経支配だが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
過剰筋肉神経支配は、心的外傷後又は切断後の過剰神経支配だが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ある側面として、本発明は進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防、身体的運動におけるスタミナ向上及び／又は慢性筋肉疲労の軽減のための薬学的組成物に関するものであり、活性成分としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義される合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドｈＥＮ１０１からなる。また任意的に付加的な治療薬及び／又は薬学的に条件を満たしたキャリア、賦形剤、及び／又は希釈剤を含む。好適に、上記の薬学的組成物は、重症筋無力症の治療及び／又は予防に使用される。
【００５５】
本発明の薬学的組成物で治療及び／又は予防される進行性神経筋疾患はＡＣｈＥまたはプロテインの過剰と関係している。通常、過剰ＡＣｈＥはＡｃｈＥ−Ｒ変異体又はイソ型である。
【００５６】
さらに、本発明の薬学的組成物で治療及び／又は予防される上記進行性神経疾患は、コリン作用性伝達の欠陥と関係している。上記疾患は、筋肉破壊、筋肉再神経支配、又は神経筋接合部（ＮＭＪ）異常を伴う。
【００５７】
本発明の薬学的組成物は、重症筋無力症（ＭＧ）、イートン・ランバート疾患、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索側硬化症（ＡＬＳ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳梗塞後硬化症、外傷後筋肉障害、過剰神経支配、原因不明の術後麻痺、ＡＣｈＥ阻害薬に対する暴露後のような疾患の治療及び／又は予防に使用される。
【００５８】
１つの実施例として、治療は、本発明の薬学的組成物を約０．００１から５０μｇ／ｇの活性成分量で毎日患者に投与する。好適には、約０．０１から５．０μｇ／ｇの活性成分量。さらに好適には、約０．０５から０．５０μｇ／ｇの投与量、もっとも好適なのは、約０．１５から０．５０μｇ／ｇの投与量である。
【００５９】
更なる側面として、本発明は、化合物のＢＢＢ通過を助長するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義されるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる薬学的組成物に関する。さらに任意に、付加的な薬学的活性物質及び／又は薬学的に条件を満たした補足的なキャリア又は希釈剤を含む。その付加的な薬学的活性物質はＢＢＢを通って運ばれる化合物である。本発明の薬学的組成物は、活性物質をＣＮＳへ投与しなくてはならない、中枢神経系に関連した疾患の治療、例えば脳腫瘍のような疾患の治療に使用される。従来の化学療法薬剤はＢＢＢを通過しないため、有効性でない（ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．４３３，１１４−１２３（２００１））。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＢＢに浸透するため、脳腫瘍は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの注射又は経口投与で治療可能であり、ＣＮＳへの進入を必要とする方法の必要性をなくす又は減らす。アンチセンスオリゴヌクレオチドは腫瘍限定である（Ｒａｔａｊｃｚａｋ Ｍ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１１８２３−１１８２７（１９９２））；そのため、ＢＢＢ通過するものを発見しなければならず、またそれは限定的で効果的でなければならない。かくして、本発明の組成物に含まれる付加的な薬学的物質は例えば制ガン及び転移性薬物である。
【００６０】
通常ＢＢＢが化合物の進入を妨ぐ中枢神経系に作用する状態の診断又は治療には、数多くの化合物が必要である。これらの状態は、いかなる疾患や病状を含む。例えば、遺伝的疾患同様、感染症、神経化学疾患、脳腫瘍、神経こうしゅ、脱髄、他の神経障害、脳症、昏睡、虚血、低酸素症、てんかん、痴呆、認知疾患、神経精神病学疾患（例えば、憂鬱、不安、精神分裂病など）であるが、これらに限られるものではない。かくして、ＢＢＢを通過する上記化合物又は付加的な薬学的活性物質は、例えば、中枢神経系用の造影剤（色素）、抗生物質や化学療法薬のような薬物、遺伝子療法ベクター、又は乱用された薬物の影響をブロックする薬剤などがある。これらの化合物は一般的に、患者の年齢、性別、体重、及び他の医学的に重要な事柄を含む医療的状態を考慮して投与される。投与の方法及び薬学的に効果的な量は従来例で知られているように、以上のような考慮により決定される。組成物の輸送においては、記載されるように様々な方法で化合物を投与することが出来る（以下参照）。
【００６１】
ＢＢＢを通過する化合物は、本発明の組成物と同時に投与するか、又は生物学的に組成物の活性が有効である期間中に投与する。つまり、本発明の組成物は、投与量に応じた有効時間中にＢＢＢの破壊を促進、つまり、ＢＢＢをオープンにする。そしてこのオープン状態の間に化合物を投与する。
【００６２】
効果的にする為、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本発明の薬学的組成物と組合させると、細胞膜を通過する。一般的に、特に特定受容体と結合した可飽和摂取機構により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞膜を通過する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖分子であるので、ある程度疎水性であり、細胞膜を通過して受動拡散する。細胞膜を通過する性質を向上する為にアンチセンスオリゴヌクレオチドを変化させる。例えば、オリゴヌクレオチド分子を任意にまた部分的に不飽和脂肪酸炭化水素鎖からなるグループ、及びカルボン酸グループ、エステルグループ、アルコールグループのような１つ以上の極性又は帯電グループに結合させる。又は、オリゴヌクレオチドをペプチド構造に結合させる。好適には細胞膜に影響を及ぼすペプチドである。このように変化したオリゴヌクレオチドはよりたやすく細胞膜に浸透する。これは重要なことであり、それらの活性をとても高める。パルミチル結合のオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２，１７７−８４（１９９８））によって開示されている。ゲラニオール結合のオリゴヌクレオチドは、Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５，２６１−７３（１９９８））によって開示されている。ペプチド、例えば細胞膜に影響を及ぼすペプチド結合のオリゴヌクレオチド及びそれらの生成はＳｏｕｋｃｈａｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９，４６６−７５（１９９８））によって開示されている。ある細胞をターゲットとし、その細胞のオリゴヌクレオチド摂取を高めるアンチセンス分子又は他の薬物の改良は、Ｗａｎｇ，Ｊ．（ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ ５３，３９−４８（１９９８））に開示されている。
【００６３】
本発明のいかなる組成物も注射、局所投与、又は経口摂取により使用される。注射による本発明の薬学的組成物は、皮下注射、腹膜内注射、筋内注射が好適である。以下の例に示すように、経口投与もとても効果的であると証明されている。
【００６４】
経口投与に適した本発明の組成物は、活性成分が必要なだけ入ったカプセル、小袋、タブレットのような個別単位として、パウダーや顆粒として、水性又は水性でない液体の溶液又は懸濁液として、又は水内オイル状液体エマルジョン又はオイル内水状液体エマルジョンとして与えられる。活性成分はまた、ボーラス、舐剤、又はペーストとして与えられる。タブレットは圧縮又は型にはめて作り、１つ以上の補助的成分を入れてもよい。圧縮型タブレットは、パウダーや顆粒等でなる活性成分を適当な機械で圧縮して作る。任意に結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ハイドロキシプロピルメチル、セルロース）、潤滑油、不活性希釈剤、防腐剤、錠剤分解物質（例えばナトリウム、でんぷん、グリコース酸塩、交差結合ポビドン、交差結合ナトリウム、カルボキシメチルセルロース）、海面活性剤又は分散剤と混合してもよい。また、型で作ったタブレットは、不活性液希釈剤で湿らせたパウダー状の化合物を適当な機械で型どって作る。タブレットを、任意にコーティングしたり分割したりしても良く、また、例えば、ハイドロキシプロプルメチルセルロースをある割合で使用して、タブレット中の活性成分が所望の融解性を持つように作ることも出来る。タブレットは、任意にお腹よりも腸で解けるように腸溶性コーティングを施すことも出来る。
【００６５】
本発明の薬学的組成物は、一般的に緩衝剤、その浸透圧を調節する薬剤からなり、また任意に薬学的合成剤にフレーバー、色、潤滑をつけるために周知のキャリア、賦形材、及び／又は添加剤を混ぜてもよい。好適な緩衝材は、浸透圧を調整したリン酸緩衝生理食塩液である。
【００６６】
キャリアは、でんぷんやその誘導体、セルロースや例えば微結晶性セルロースのようなその誘導体、キサンタンガムなどを含む。潤滑は水添のキャスターオイルなどを含む。
【００６７】
好適には、薬学的製剤にキャリアを含まないことである。好適には、その製剤を静脈注射などの注射で投与する。
【００６８】
薬学的組成物の配合は、良く知られており、多数の出版物やテキストで開示されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，特にｐｐ．１５２１−１７１２参照。
【００６９】
添加剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞膜を通過して摂取させるようにする。そのような薬剤は一般的に２本鎖ＤＮＡ分子の細胞摂取を高める。例えば、ある脂質分子はこの目的で開発されている。例えば、商業的に入手可能なトランスフェクション試薬ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍがある。アンチセンスオリゴヌクレオチド摂取を高めるこれらの試薬の比較については、Ｑｕａｔｔｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，２５、（１９９５））及びＣａｐａｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７，８１８（１９９３）を参照。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、リポゾーム内に封入される。例えば、上記のトランスフェクション試薬を使用したリポゾームの生成及び使用法は良く知られている。リポゾームを得る他の方法は、センダイ・ウィルス又は他のウィルスを使用する。リポゾーム技術を利用した、細胞内へのオリゴヌクレオチド浸透を開示する刊行物の例として、例えばＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１５６２１−７（１９９８））、Ｋｉｔａ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０，５５３−８（１９９９））、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５，１４５５−６１（１９９８））、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．９，２５３−６２（１９９８））、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２８，１４０２−１０（１９９８））、Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６６，８１４−９（１９９８）、及び同ジャーナルｐ．８１９−２０の討論）、Ｂｏｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５，１３６４−９（１９９８））、Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３３，１６９−７３（１９９８）、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８３，５５２−９（１９９８）、Ｋａｎａｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．５，２３５−４６（１９９８））及びこれらの中の参考文献がある。リポゾーム仲介のオリゴヌクレオチド摂取におけるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎの使用は、Ｓｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．３９，２３７−４４（１９９８））に開示されている。融合誘導陽イオン脂質で再構成されたインフルエンザウィルスエンベロープ（陽イオンビロゾーム）の使用法は、Ｗａｅｌｔｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｃｅｒ，７７，７２８−３３（１９９８））に開示されている。
【００７０】
上記の陽イオン又は非イオン脂質薬剤は、ただ細胞のオリゴヌクレオチド摂取を高めるだけでなく、細胞に摂取されたオリゴヌクレオチドの安定性も向上させる。
【００７１】
本発明はまた、進行性神経筋疾患やＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰生成に伴う他の疾患の治療や予防の方法に関する。この方法とは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドや、本発明又はその好適な実施例の薬学的組成物を治療が必要な患者に投与することである。
【００７２】
最後に、本発明は、ＣＮＳの疾患や病気を治療する治療薬を患者に投与する方法に関するものである。この方法は、上記患者に本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドや上記治療薬を投与することからなる。この治療薬は、本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同時に投与するか、その後に投与する。本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるＢＢＢの破裂は、治療薬がＢＢＢを通過してＣＮＳへ届くようにし、これは必要なことである。
【００７３】
本発明は、ここに記載した特定な例、処理方法、物質に限定されるものではなく、変形することが出来る。また、本発明の範囲は添付の請求の範囲やその同等物に限定されるものであるので、ここに記載されている専門用語は特定の実施例を説明するために使用したものであり、限定されるものではない。
【００７４】
本明細書やクレイムを通じて、”〜なる”という表現は、言及した整数値や整数値のステップやグループを含めるという意味であり、他の整数値や整数値のステップやグループを含まないというわけではない。
【００７５】
下記の例は、発明者によって本発明の特徴の実施における代表的技術である。これらの技術は、本発明を実行するための例示であり、同業者は本発明の特徴を用いずに様々な改良を行うことが出来る。
【実施例】
【００７６】
実験手順
動物：
ラット：ＥＡＭＧを、Ｊａｃｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した雌ルイスラット（１２０−１５０ｇ）に導入し、ＮＩＨ指針に従ってＨｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで飼育した。対照ＦＶＢ／Ｎマウスは、（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８ ｉｄ ｉｂｉｄ．）で記載されているように泳がせてストレスを与えた。ＡＣｈＥ−Ｒ過剰発現の遺伝子移植ＦＶＢ／Ｎマウスは、（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，８６４７−８６５２）で詳述されている。
【００７７】
サル：目的種の雌と雄、１５ヶ月目のカニクイザルを使用した。
オリゴヌクレオチド：ＨＰＬＣ精製されたＧＬＰ品質のオリゴヌクレオチド（キャピラリー電気泳動法での９０％より大きい精製）をＨｙｂｒｉｄｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＳＡ）から購入した。乾燥オリゴヌクレオチドを、殺菌して２重に蒸留した水に浮遊させ（２４ｍｇ／ｍｌ）、２０度で保存した。ホスホジエステル結合だが３’末端に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドが作られたオリゴヌクレオチドを用意した。この研究で使用される主な配列は以下である。
【００７８】
ｈＥＮ１０１ ５’−ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ−３’
（ヒトＡＳ３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
２’−Ｏ−メチル化ｈＥＮ１０１（*はメチル化ヌクレオチド）
５’−ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡ*Ｃ*Ｃ*−３’
ｍＥＮ１０１ ５’−ＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＡＣＣ−３’
（マウスＡＳ３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（Ｇｒｉｆｍａｎ，Ｍ．，ａｎｄ ｓｏｒｅｑ，Ｈ．（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ７，３５１−９）
ｒＥＮ１０１ ５’−ＣＴＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＣ−３’
（ラットＡＳ３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ＷＯ９８／２６０６２）
ｒＥＮ１０２ ５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ＷＯ９８／２６０６２）
ｒ−ｉｎｖＥＮ１０２ ５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００２） ｉｄ ｉｂｉｄ）
【００７９】
ｈＥＮ１０１の安定性：ｈＥＮ１０１は、３回の凍結解凍に続きＥＤＴＡを有するヒトの血漿に室温で２時間保存後、又は２０度で１ヶ月の保存後は安定である（本来の濃度の９０％）ことがわかった。室温でリチウムへパリン処理された血液にさらすと、ほぼ３０分程度でｈＥＮ１０１は減少した。
【００８０】
抗体：Ｃ末端ＡＣｈＥ−Ｒに対するラビットポリクロナ−ル抗体を用意して（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００） ｉｂｉｄ）に記載されているように精製した。ヤギポリクロナ−ル抗ＡＣｈＲ（Ｃ−２０，Ｓ．Ｃ．−１４４８）抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのものである。
【００８１】
ＥＡＭＧの導入：上述したように（Ｂｏｎｅｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ２３，１２０４−８）、トルペドーアセチルコリン受容体（Ｔ−ＡＣｈＲ）を神経毒−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂上でアフィニティ・クロマトグラフィによりＴ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ電気板から精製した。１ｍｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）を追加したフロイント完全アドジュバントの中で乳状した４０μｇの精製Ｔ−ＡＣｈＲでラットに免疫を与えた。動物の後ろ足に皮下注射し、３０日後に同量の追加免疫注射をした。２回目の注射後にＥＡＭＧが発達しなかった動物に３回目の注射をした。最初の１ヶ月間は１週間ごと、そして追加免疫を与えた後は毎日動物の体重を量り、筋肉の衰弱性を観察した。ラットの臨床症状は、（０）明確な衰弱なし（踏み車走行時間，２３±３分）；軽度（１）１週間で３％より大きい体重減少で１０分より長い踏み車走行；中度（２）弱い握力又は疲れた泣き声に伴う中度衰弱。５−１０％の体重減少で３−５分の踏み車走行；中度―重度（３）中度から重度の衰弱。安静時は猫背の姿勢。頭がうなだれ、前肢指が曲がり、震えながら移動。１０％の体重減少で１−２分の踏み車走行；重度（４）重度の衰弱。泣かず握力もない。１分未満の踏み車走行で１０％より大きい体重減少；（５）死亡。
【００８２】
抗ＡＣｈＲ抗体判定：Ｔ−ＡＣｈＲとラット（Ｒ）ＡＣｈＲに結合した１２５Ｉ−αブンガロトキシン（ＢｇＴ）を使用して、直接放射免疫測定によって血清を分析した（Ｂｏｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）。すべてのＥＡＭＧラットにおいて標準誤差（ＳＥ）±血清平均は、抗Ｔ−ＡＣｈＲ抗体に対して８２．１±１６．０ｎＭ、抗Ｒ−ＡＣｈＲに対して１９．９±１．８ｎＭであり、高い抗Ｔ−ＡＣｈＲ又は抗Ｒ−ＡＣｈＲ力価を見せた。ヒト血清の抗ＡＣｈＲ抗体のレベルを（Ｄｒａｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｂ．（１９９４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３３０、１７９７−８１０）で開示しているように試験した。
【００８３】
ｎＡＣｈＲの数量化：上記したように、飽和した硫酸アンモニウムによって促進された１２５Ｉ−α−ＢｇＴ結合を使用して、腓腹筋及び脛骨筋のＡＣｈＲ濃度を決定した（Ｂｏｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）。
【００８４】
免疫細胞学：筋肉切片をキシレンで脱パラフィン化し、異なった濃度（１００％、９０％、７０％）のエタノール溶液及びＰＢＳで再水和させた。５００ｍｌの０．０１Ｍクエン酸塩緩衝ｐＨ６．０の中で、レンジ加熱（強さを押さえて１０分後８５０Ｗで急速沸騰）を施して抗原復元を行った。スライドを室温まで冷やし、２回蒸留した水でリンスした。未特定結合を、０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０の入ったＰＢＳの中で４％の正常ドンキー血清によってブロックした。ビオチン化１次抗体を同じ緩衝液で薄め（ラビット抗ＡＣｈＥ−Ｒ（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）及びヤギ抗ｎＡＣｈＲに対しそれぞれ１：１００及び１：３０）、スライドを４度で１晩培養した後、室温で１時間培養した。切片を、同様のブロッキング緩衝液で薄めたアルカリ性ホスファターゼ共役の２次抗体でリンスして、室温で１時間培養した後、さらに４度で１晩培養した。アルカリ性ホスファターゼ基質Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出を行った。スライドは同時に停止液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＢＳ内１ｍＭのレバミゾール，ｐＨ７．２）に移し、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ）で覆って取り出した。
【００８５】
脊髄切片に関し、１次マウス抗ＳＣ３５抗体を上記の１次抗体と同じ緩衝液で薄め（１：１００）、スライドを４度で１晩培養した後、室温で１時間培養した。切片は、同じブロッキング緩衝液で薄めたペルオキシターゼ共益のヤギ抗マウス２次抗体でリンスし、室温で１時間培養後、さらに４度で１晩培養した。ＤＡＢ基質（Ｓｉｇｍａ）で検出を行った。スライドをＩｍｍｕｎｏｍｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で覆って取り出した。
【００８６】
筋電図検査：ラットを２．５ｍｇ／Ｋｇのペントバルビタールのｉ．ｐ．注射で麻痺させ、固定し、１組の３Ｈｚの集中針電極を使用して坐骨神経の反復刺激を行った。最大強度での反復神経刺激後、腓腹筋に差し込まれた集中針電極により基準複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を記録した。動物ごとに、反復刺激を２セット行い、５回目対１回目の筋活動電位の振幅における減少（％）を計測した。１０％以上の減少は、神経筋伝達の機能障害と考えられる。
【００８７】
薬物投与：抗ＡＣｈＲ抗体検査用の静脈注射や血液サンプリングは麻酔状態における頸静脈を介して行われる。経口投与に関し、球端を持つ湾曲した強制経口投与用の特別な針が使用された（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ ＩＬ）。Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入したＭｅｓｔｉｎｏｎ（登録商標）を毎日１ｍｇ／ｋｇ投与した。
【００８８】
踏み車の訓練：ＥＡＭＧラットの神経筋能力を臨床的に計測するため、踏み車分析を行った。動物を２５ｍ／ｍｉｎ（中間の早さ）の電動踏み車に乗せ、疲労するまで走らせた（Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｔｈｅｒｍ Ｂｉｏｌ ２１，１７１−１８１）。アンチセンス又はＭｅｓｔｉｎｏｎ（登録商標）投与の前後に、ラットが走れる時間を記録した。
【００８９】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：組織を４％のパラフォルムアルデヒドに入れ、７μｍのパラフィン包埋切片に切った。脊髄切片を脱パラフィン化し、シリアルエタノール希釈剤を使用して再水和させ、プロテイナ−ゼＫ（１０μｇ／ｍｌ、室温）を浸透させた。それぞれヒトＡＣＨＥ偽イントロン４又はエクソン６が相補されている、５’ビオチン化された完全な２’−オキシメチル化ＡＣｈＥ−Ｒ又はＡＣｈＥ−Ｓ特有の５０−ｍｅｒ ｃＲＮＡプローブにスライドをさらした（Ｇｒｉｓａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｉｄ ｉｂｉｄ．）。３７５ｍＭのクロリドＮａ及び３７．５ｍＭのクエン酸塩Ｎａ、ｐＨ４．５内で１０μｇ／ｍｌプローブ、５０μ／ｍｌイーストｔＲＮＡ、５０μｇ／ｍｌへパリン、及び５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション混合液を用い、５２度で１晩かけてハイブリダイゼーションを行った。サル切片用に、プローブはヒトＡＣｈＥ−Ｒ配列に応じて作られた；ラット切片用には、マウス配列に応じて作られた。スライドを洗浄して混成していないプローブを取り除き、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０及び２ｍＭのレバミゾールを含む１％のスキムミルク、未特定染色を抑制するアルカリ性ホスファターゼ阻害薬でブロックし、ステプタビジン・アルカリホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で培養した。検出用に、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用した。ＤＡＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で核を見えるようにした。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ４．０（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアを利用して、顕微鏡の映像で分析した。
【００９０】
血清分析：ＥＡＭＧラット及びＭＧ患者から得た血液サンプルを、ＡＣｈＥの触媒活性測定（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）同様、（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ）で開示されているような不変性ゲル電気泳動法にさらした。血清サンプル中のブチリルコリンエステラーゼ活性をブロックするために、ｉｓｏ−ＯＭＰＡ（テトライソプロピルピロホスホルアミド，５ｘ１０−５μＭ）を使用した。ポリアクリルアミドゲルの活性染色用に、５・１０−６Ｍのｉｓｏ−ＯＭＰＡを使用した。
【００９１】
実験例１ ＥＡＭＧラットの血液中及び筋肉内のＡＣｈＥ−Ｒ蓄積
発明者たちによって示されたように、ＡＣｈＥ−Ｒ変異体は、４量体シナプス酵素よりも早く不変性ポリアクリルアミドゲル上を移動（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ）し、ＭＧ患者の血清中に存在する（ＷＯ０１／３６６２７）。同様に、ＥＡＭＧラットは健康ラットに比べ、血清ＡＣｈＥ−Ｒが異常に多いことが免疫ブロット分析で確認された（図７）。
【００９２】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現同様、代替的ＡＣｈＥ変異体の発現を対照及びＥＡＭＧラットで実験した。ｎＡＣｈＲに対する抗体を利用した定量的免疫学的分析によって明らかになったように、ＥＡＭＧラットの筋切片においてｎＡＣｈＲの減少が見られた（図８Ｂ、１及び２）。免疫染色により、対照と比べ、筋ｎＡＣｈＲは、１０匹の軽度動物（症状１−２、実験手順参照）で通常値から４８％±７％、１０匹の重度ラット（症状４）において７５±５％の減少が見られ、この動物モデルの筋無力症が証明された（図８Ｂ，１及び２）。ＡＣｈＥ−Ｒを選択的に検出する（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）多クローン抗血清を利用した免疫組織化学の染色により、対照ラットのすべてではないが、いくつかの筋肉繊維において陽性であることがわかった。同様のパターンが、不活性逆指向オリゴヌクレオチドｒ−ｉｎｖＥＮ１０２での治療下で見られた（図８Ｂ、３）。ＥＡＭＧラット（図８Ｂ，４）において、ＡＣｈＥ−Ｒの染色は、シナプス変異体のシナプス後クラスター分散（Ｒｏｓｓｉ，Ｓ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｔｕｎｄｏ，Ｒ．Ｌ．（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６８、１９１５２−９）とは対照的に、イソ型の性質である分散細胞質局在性共に、一様に分散したＡＣｈＥ−Ｒを示した。ＥＡＭＧ及び健康、未治療及びｒ−ｉｎｖＥＮ１０２治療のラットにおいて、同様な筋肉ＡＣｈＥ−Ｓの発現レベル及び細胞分散が見られた。
【００９３】
変異体選択プローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、治療をしていない健康ラット、及びｒ−ｉｎｖＥＮ１０２治療したＥＡＭＧラットのシナプス後筋肉においてＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡが存在しているとわかった（図８Ｂ、５及び６）。反対に、健康なラットにおいては、より薄くて拡散したＡＣｈ−Ｓ ｍＲＮＡ転写標識がみられ、一方、ＥＡＭＧラットの三頭筋においてより顕著なＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ標識がみられ、ｒ−ｉｎｖＥＮ１０２治療に影響されていなかった（図８Ｂ、７及び８）。密集したクラスター細胞核の中でリッチ領域の蓄積は、以前に行ったシナプス後領域についての観察と一致している（Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｒｏｔｕｎｄｏ（１９９３） ｉｄ ｉｂｉｄ）。これらのデータは、ＥＡＭＧラットの筋肉内におけるＡＣｈＥ−Ｒの選択的過剰発現を示し、ＭＧ病態生理学上でのこの酵素変異体の役割についての見解を強めた。
【００９４】
実験例２ ｒＥＮ１０１に反応した筋肉内のＡＣｈＥ−Ｒ及びＡＣｈＥＲ ｍＲＮＡレベル
ＡＣｈＥ−Ｒの溶性及び分泌性は、シナプス後細胞膜に到着する前に受容体活性を制限して、アセチルコリンを低下させると思われていた。この仮説をテストするため、ＡＣｈＥ−Ｒ生成を選択的に抑制することができるｒＥＮ１０１アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した（Ｇａｌｙａｍ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１，５１−５７）。健康ラット及び筋肉内でｎＡＣｈＲレベルが低下しているＥＡＭＧラットに２５０μｇ／ＫｇのｒＥＮ１０１を１回ｉ．ｖ．投与した後、ＡＣｈＥ−Ｒ抑制を調べた。免疫組織化学染色により、健康なラットにおいてもＥＡＭＧラットにおいても、ＡＣｈＥ−ＳではなくＡＣｈＥ−Ｒが明らかに筋肉から減少しているとわかった（図８Ｃ，３，４，データは示されていない）。治療していない動物とｒ−ｉｎｖＥＮ１０２を投与した動物と同様に、受容体標識パターンは、健康的なラットで高いままであり、ＥＡＭＧ動物は低いままだった（図８Ｂ、１及び２と図８Ｃ、１及び２を比較）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、核のシナプス後クラスターサイトに限られるＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ標識が、ｒＥＮ１０１により僅かに影響を受けることを示し、神経筋伝達はこの治療で影響を受けないことを示した（図８Ｃ，５及び６）。反対にｒＥＮ１０１は、健康なラット及び筋無力症ラット両方ともからＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ標識をほとんど検出の限界まで減少させた（図８Ｃ，７及び８）。
【００９５】
実験例３ ＥＡＭＧラットにおいて正常ＣＭＡＰを復元するＡＣｈＥ−Ｒ抑制
免疫ブロット法のデンシトメトリーによる数量化は、ＥＡＭＧにおける血清ＡＣｈＥ−Ｒの増加、及び２５０μｇ／Ｋｇのｒ−ｉｎｖＥＮ１０２ではなくｒＥＮ１０１の１回ｉ．ｖ．投与の有効性を２４時間後の血清レベルの減少により証明した（図９Ａ）。この抑制の生理学上効果を評価する為、腓腹筋からの複合筋活動電位（ＣＭＡＰｓ）を記録した。ＥＡＭＧラットにおいて、３Ｈｚの反復刺激の間に、健康なラットには決して見られないＣＭＡＰの減少があった。基準値の減少、第５回目及び１回目の誘発電位におけるパーセンテージの相違は、健康なラットの間で４．０±０．９％であるのに比べ、１０％から３６％（平均±ＳＥＭ＝１３．０±２．５％、図９Ｂ、差し込み図）であった。ＭＧ患者の一般的な治療は、受容体を活性させる閾値までＡＣｈレベルを上げるアンチコリンエステラーゼの投与である。したがって、ネオスチグミン臭化物（Ｐｒｏｓｔｉｇｍｉｎｅ（登録商標），７５μｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．投与した。これは、治療していない動物の第１回目誘発電位８７．６％からこのレベル（第１回目の誘発電位）の１２０％以上（つまり１０７．４％）まで、ＥＡＭＧラットのＣＭＡＰ減少をすばやくしかも効果的に調整した。コリンエステラーゼのブロック効果は、投与後１５分で効き始め、２時間続いた後、ＣＭＡＰ値が基準値に戻った（図９Ｂ）。
【００９６】
すべてのＡＣｈＥ変異体を防止するアンチコリンエステラーゼとは異なり、ｒＥＮ１０１は選択的に筋肉ＡＣｈＥ−Ｒ生成を抑制することが示された（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）。それゆえ、ｒＥＮ１０１治療したＥＡＭＧラットのＣＭＡＰの安定回復は、筋無力症表現型の特徴である神経筋低下の原因においてＡＣｈＥ−Ｒの役割を証明する。この考えをテストするために、ｒＥＮ１０１を１０−５００μｇ／Ｋｇ（２から２０ｎｍｏｌ／ラット）の範囲でｉ．ｖ．投与した。ｒＥＮ１０１は、健康ラットのＣＭＡＰに影響を及ぼさなかったが、１時間以内に安定なＣＭＡＰ率を回復した。（図９Ｂ、差し込み図，９Ｃ，表１）。ＣＭＡＰの正常化は、向上した運動性、真っ直ぐな姿勢、強くなった腕力、移動時の振せん減少を伴う。
【００９７】
【表１】
【００９８】
ＣＭＡＰ調整の程度と期間は投与量による。例えば、５００μｇ／Ｋｇは７２時間以上、基準値の１２５％までＣＭＡＰを調整し、一方、５０μｇ／Ｋｇはたった２４時間しか効果がない。ｒＥＮ１０２、つまりｒＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ特有な配列をターゲットとしている３’保護ＡＳ−ＯＮ（ＡＳ１とも示されている）（Ｇｒｉｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｏｒｅｑ（１９９７）ｉｄ ｉｂｉｄ）は、ＥＡＭＧラットのＣＭＡＰ減少を同様に調整し、この効果の貢献要素としてＡＣｈＥ−Ｒの関連性を確認した。同程度量のｒ−ｉｎｖＥＮ１０２は、筋肉機能を向上せず、ＡＳ−ＯＮ治療結果の特異性を証明した（表１）。投与反応曲線は、投与後５時間まで、ｒＥＮ１０１が１０μｇ／Ｋｇ未満のＩＣ５０で可飽和反応を引き起こしたと明らかにした。この効果は、長い持続性及び濃度に依存する効果と重なることを表し、研究の範囲において不飽和を証明した（図９Ｄ）。この現象は、ｒＥＮ１０１による安定ＣＭＡＰ回復下において、変質筋肉及び／又は神経筋接合部の特性を反映するであろう。
【００９９】
実験例４ ＥＡＭＧラットのスタミナを向上させるための、ＡＣｈＥ−Ｒ蓄積を防止するアンチセンス
健康ラットを２５ｍ／ｍｉｎの踏み車に置き、疲れていると明らかにわかるまで２３．０±３．０分間走らせた。２５０μｇ／ＫｇのｒＥＮ１０１投与５時間後から少なくとも２４時間、ＥＡＭＧラットの踏み車走行は向上した。病状２、３、４の動物はそれぞれ２４７±３５、１７９±２１、及び３２±６秒だったが、４８８±５８、５００±１９３、及び２１２±５９秒と走行時間が長くなった（各グループから６−９匹の動物の平均値）。反対に、健康ラットはｒＥＮ投与で明らかな変化は見られなかった（図１０）。
【０１００】
他は、２’−オキシメチル保護ＡＳ−ＯＮ薬剤の経口投与の有効性を示した（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．（１９９７）Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９，１０７−１１９）。それゆえ、発明者たちは、ＥＡＭＧモデルでこの方法をテストした。発明者自身の発見に基づき、５０μｇ／ＫｇのｒＥＮ１０１の投与を選択し、ＥＡＭＧラットに１日１回強制経口投与した。その後１、５、２４時間後にＣＭＡＰを測定した。この投与量は、２５μｇ／Ｋｇのｉ．ｖ．投与と同じ効果であった（表１、図９、図１３）。ｒＥＮ１０２の経口投与もＣＭＡＰ減少を反転させたが、その効果はｒＥＮ１０１と比較していくらか遅かった。ピリドスチグミン（１０００μｇ／ｋｇ）の経口投与は数時間までＣＭＡＰを回復させたが、ｒ−ｉｎｖＥＮ１０２に明らかな効果はなかった（表１）。
【０１０１】
実験例５ ＥＡＭＧラットへのヒトＥＮ１０１の経口投与
ヒトＥＮ１０１（ｈＥＮ１０１）（１回の投与量０．２５μｇ／ｇ）を病状が中度であるＥＡＭＧ（スコア２．５−３．５）のラットに経口投与した。結果は表１に要約してある。治療後の時間及び踏み車の走行時間に注目した。筋肉衰弱度を評価するたびに動物を検査した。ラットの臨床状態は、（０）衰弱なし（踏み車走行２３±３秒）；軽度（１）１週間で３％より大きい体重減少で１０分より長い踏み車走行；中度（２）弱い握力又は疲れた泣き声を伴うの中度衰弱。５−１０％の体重減少で３−５分の踏み車走行；中度−重度（３）中度から重度の衰弱。安静時は猫背の姿勢。頭がうなだれ、前肢指が曲がり、震えながら移動。１０％の体重減少で１−２分の踏み車走行；重度（４）重度の衰弱。泣かず握力もない。１分未満の踏み車走行で１０％より大きい体重減少；（５）死亡。各行は個々のラットを表す。治療後すべてのラットにおいて臨床的スコア（括弧内）が時間経過と共に下がり、ほとんどの動物において５時間後及び２４時間後の走行時間が著しく長くなり、テストした動物うち２匹は４８時間後においても長くなった。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
これらの結果はラットＥＮ１０１（踏み車の例を参照、上部）のように、本発明のヒトＥＮ１０１アンチオリゴデオキシヌクレオチドが、ＥＡＭＧを導入したラットの筋肉スタミナを向上させたことを示した。
【０１０４】
実験例６ ラット動物モデルにおけるｈＥＮ１０１及びｒＥＮ１０１の比較分析
ｈＥＮ１０１の毒性度同様、電位有効性を、産まれてから４週間目のＣｒｌ：ＣＤラットで研究した。１２匹の動物（雌６匹、雄６匹）に、０．０（生理食塩水のみ）、０．５０又は２．５０μｇ／ｇ／日のｈＥＮ１０１を経口投与（ｏ．ｇ．）、０．５０μｇ／ｇ／日のｒＥＮ１０１をｏ．ｇ．投与、又は０．５０μｇ／ｇ／日のｒＥＮ１０１又はｈＥＮ１０１をｉ．ｖ．投与した。投与していない対照グループもある。７日間動物の全体毒性信号を検査した：死亡率、体重、食料消費、眼科学、血液学（末梢血）、血液化学。７日後に死亡させ、解剖して肉眼でわかる病変や組織の重さを検査した。壊死又は細胞死を明らかにするために、脳（小脳、大脳、中脳、骨髄）、心臓（耳、腹の領域）、腎臓（皮質、骨髄、乳頭領域）、肝臓（すべての主な葉）、肺（気管支を含む２つの主な葉）、リンパ節（下顎及び腸間膜）、脊髄（頸部、腰部、胸のレベルにおける横断面及び縦断面）、盲腸、結腸、十二指腸、回腸、空腸、食道、直腸、脾臓、腹（角化、腺、洞）の特定部分をヘマトキシリン・エオジンによって染色した。
【０１０５】
下顎リンパ節を検査し、ＥＮ１０１がＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡに及ぼす影響を調べた。生理食塩水を投与した対照ラットと比べ、ｒＥＮ１０１（経口またはｉ．ｖ．）またはｈＥＮ１０１（ｉ．ｖ．）は、これらのリンパ節内でＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルの低下において一貫性はなかった（データは示さず）。反対に、ｒＥＮ１０１（経口投与又はｉ．ｖ．）又はｈＥＮ１０１（ｉ．ｖ．）の投与は、下顎リンパ節内でＡＣｈＥのＡＣｈＥ−Ｓシナプス変異体の発現に影響しなかった（データは示さず）。かくして、シナプス変異体の発現に影響を及ぼさず、つまり、コリン作用性伝達に不利に影響を及ぼさずにＡＣｈＥ−Ｒ変異体を抑制するために本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用することが出来る。
【０１０６】
実験例７ ＥＡＭＧ病態生理学の過程を変化させるＡＣｈＥ−Ｒ抑制
例５に示したように、アンチコリンエステラーゼとは違い、ｒＥＮ１０１はＣＭＡＰを長期間安定させた。これにより、発明者たちは、コリン作用性不安定がＥＡＭＧの性質である生理学上の悪化の原因となるかをさらに検査出来るようになった。最初、１日１回、５日間、ｒＥＮ１０１をラットに投与し、毎回投与前にＣＭＡＰを検査した。正常のＣＭＡＰを回復するようなｒＥＮ１０１の有効性及びＣＭＡＰ値に関する動物内変動を減少する効力は、ピリドスチグミンのレベルと同様だった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。しかしながら、ピリドスチグミンは反応がより早く（表１）、ｒＥＮ１０１はより長い持続性を示した。ｒＥＮ１０１の連日経口投与及びｉ．ｖ．投与は、治療の過程に渡り、ＣＭＡＰを安定させた（図１１Ｂ）。反対に、ピリドスチグミンの効果は数時間以内になくなり、筋肉状態が明確に変動した（表１、図１１）。ピリドスチグミンを毎日投与した６匹の動物のうち、５匹は５日間の実験中に死亡した。反対に、ｒＥＮ１０１を１日１回ｏ．ｇ．投与した８匹の動物のうち、６匹は５日間生き残った。この明白な相違は、反復麻酔及びＣＭＡＰ測定に対するＥＡＭＧラットの影響を反映したものだろう。これらの付加的ストレスを防いでＥＡＭＧ病態生理学上のアンチセンス治療の効果を評価するために、発明者たちは、中度の動物を１日１回の経口投与で１ヶ月間治療した。その間、測定は最小限なものとした。ｒＥＮ１０１を毎日経口投与したＥＡＭＧラットは、ピリドスチグミンや生理食塩水を投与した動物と比較し、生存度、臨床状態、踏み車走行において著しい向上が見られた（図１２；４週間生存に対しＰ＜０．０４１、Ｆｉｓｈｅｒ精密テスト、ＡＳ−ＯＮ対他の治療）。一方方向反復測定ＡＮＯＶＡは、他のすべての測定に対してＰ＜０．０５だった（４週間後のＡＳ対他の治療）。臨床症状におけるｒＥＮ１０１の効果もまた、体重変化によって裏付けられた。生理食塩水を投与したグループ及びＭｅｓｔｉｎｏｎ投与したグループは、それぞれ１３．５及び１１ｇ減少し、ｒＥＮ１０１投与した動物は、投与期間の間に平均１３ｇ増加した。かくして、なにも投与していない動物及びピリドスチグミンを投与した動物が悪化した状態と同じ状況の下、ｒＥＮ１０１の連日投与は中度から重症のラットのＥＡＭＧにおいて長期的変化をもたらした。
【０１０７】
発明者たちは、遺伝子発現のレベルで慢性神経筋不安定の結果を評価するための研究材料としてＭＧとＥＡＭＧを利用し、ＭＧ及びＥＡＭＧにおいてＡＣｈＥ−Ｒ変異体が全身的に向上することを確認した。さらに、ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制が、反復神経刺激に対するＮＭＪ反応を正常化させ、筋肉力を向上させ、食べられないほど衰弱していた動物の健康を回復さることも示した。これらの観察は、ＡＣｈＥ−ＲがＭＧ病態生理学における直接的原因になるという発明者の考案を支持し、ＮＭＪの不安定なコリン作用性機能に対する長期間のｍＲＮＡ治療の原理の評価を求めるものである。
【０１０８】
実験例８ カニクイザルへのｈＥＮ１０１経口投与
この目的のための飼育した６匹（雌３匹、雄３匹）の１５ヶ月目（青年）のカニクイザルで実験を行った。このサルを雄雌対の３つのグループ（１、２、３）に別けた。０．１５及び０．５０μｇ／ｇ／日でｈＥＮ１０１を７日間、グループ１、２にそれぞれｏ．ｇ．投与した。また、グループ３には、０．５０μｇ／ｇ／日でｈＥＮ１０１を７日間ｉ．ｖ．投与した。
【０１０９】
１２時間以上かけ、第２回目の投与日に得た血漿サンプルで各投与量のトキシコキネティック特徴を調査した。この調査において、以下の要素によって動物の全体毒性サインを７日の治療の間チェックする：死亡率、体重、食物消費、心電図記録、血圧、血液学（末梢血）、血液化学。７日目にサルを死亡させ、解剖して目でわかる病変や組織重量を調べた。壊死又は細胞死を明らかにするために、脳（小脳、大脳、中脳、骨髄）、盲腸、結腸、十二指腸、心臓（耳、腹の領域）、回腸、空腸、腎臓（皮質、骨髄、乳頭領域）、肝臓（すべての主な葉）、肺（気管支を含む２つの主な葉）、リンパ節（下顎及び腸間膜）、食道、直腸、座骨神経、骨格筋（腿）、脊髄（頸部レベルにおける横断面及び縦断面）、脾臓、腹（胴体、洞）の特定部分をヘマトキシリン・エオジンによって染色した。
【０１１０】
これらの臨床的調査において、いかなる治療方法によっても毒性影響が見られなかった。死亡解剖で、各グループ２匹の動物のうちどちらかにおいて、治療に関係していると思われるお腹胴体のわずかな治療衰退及び静脈注射の場所の血管周囲の組織炎症以外、治療に関係した効果は見られなかった。
【０１１１】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでパラフィン包埋７μｍ膵臓部を検査し、ＡＣｈＥ−Ｒ及びＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡのレベルを測定した。３つの投与方法（０．１５μｇ／ｇ／日及び０．５０μｇ／ｇ／日の経口及び０．５０μｇ／ｇ／日のｉ．ｖ．）において、ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ（図１４）において明らかな減少は見られなかった。しかしながら、０．１５（経口）から０．５０（経口又はｉ．ｖ．）までｈＥＮ１０１の連日投与量を増加させると、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡに明らかな減少がみられ、ｉ．ｖ．投与のほうがより効果的であった。
【０１１２】
サル脊髄からのＡＣｈＥ−Ｒが陽性である部分を分析し、細胞体直径とＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞率の関係を見出した（図１５）。細胞を胴体直径に応じて３つに別け、各部分からのＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞率を評価した。ＥＮ１０１（１５０μｇ／ｋｇ／日）の低濃度治療は、野生サルと比較して、小さなＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞（直径７０μｍ未満）を増加させた。これは、ＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルを上げると知られている注射ストレス反応によるものであろう（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）。高濃度（５００μｇ／ｋｇ／日）のＥＮ１０１のｉ．ｖ．又はｐ．ｏ．投与は、低濃度（ｐ＜０．０５、生徒の検査）と比較してＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞を減少させた。この減少は、直径が４０−７０μｍの細胞体の神経より、小さなサイズ（２３−４０μｍ）の神経においてより顕著なものであり、大きなサイズ（直径＞７０μｍ）の神経において減少は見られなかった（図１５）。標識された小さいサイズ（直径２３―４０μｍ）の神経及び中間サイズ（４０−７０μｍ）の神経に関し、低から高濃度ｈＥＮ１０１への経口投与、さらにｉ．ｖ．投与において細胞率の減少が目立った。大きな細胞（＞７０μｍ）に関しては、ｈＥＮ１０１の認められる効果は見られなかった。我々は、ＡＣｈＥ−Ｒ発現のアンチセンス抑制の有効性を決定する細胞の大きさの機能的相互関係を発見しなければならない。これは、ＥＮ１０１が、介在ニューロンが運動ニューロンへ入るときにストレスで起こる障害を防ぎ、かくして例えば術後麻痺を防止することを示唆する。
【０１１３】
実験例９ サル血漿のＡＣｈＥ活性のｈＥＮ１０１抑制
ｈＥＮ１０１の２日目の投与１２時間後にサル血漿を取りだし保管した。ｉｓｏ−ＯＭＰＡの存在又は不在下において（選択的ブリチルコリンエステラーゼ、ＢＣｈＥ、阻害薬）、血漿コリンエステラーゼ活性をアセチルコリンの加水分解速度を測定する分光測光法で測定した（アセチルコリンの加水分解を測定するＥｌｌｍａｎ分析で測定した）（Ｅｌｌｍａｎ、Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９６１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，８８−９５）。血清ＢＣｈＥにより、全体の活性は大体変わらなかった（図１６Ａ）。１×１０−５Ｍのｉｓｏ−ＯＭＰＡの存在下で測定したとき、ＡＣｈＥ活性は投与後５時間以内に増加した。１５０μｇ／Ｋｇのもとで観察したこの増加は、５００μｇ／ｋｇのｈＥＮ１０１の高投与によって効果的に抑制され弱力化した。また、この投与としては、ｉ．ｖ．投与がより効果的であった（図１６Ｂ）。
【０１１４】
実験例１０ ラット脊髄神経におけるｒＥＮ１０１の発現ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡへの影響
サル脊髄神経へのｈＥＮ１０１の影響とは反対に、マウスプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる評価において、ｒＥＮ１０１はラット脊髄のＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを抑制しない（図１７）。陽性の細胞数にも染色強度にも明らかな変化はなかった。この結果の説明としては、少なくとも選択した実験状態において、ＣＮＳを孤立させる血液脳関門が、ラットよりサルのほうがより浸透させるからである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｄｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ５５０４０；Ｓｏｒｅｑ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（２４），９６８８−９６９２（１９９０））、及びコーディング配列７９５−５’から３’−８１４（影）のヌクレオチドをターゲットとした、ヒトＥＮ１０１（ｈＥＮ １０１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。
【図２Ａ】ヒトＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の様々な薬学的及び化学的性質を示す。オリゴヌクレオチドの内部構造、及びその構造を分解する為に必要なエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の予測を示す。
【図２Ｂ】ヒトＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の様々な薬学的及び化学的性質を示す。塩基組成物、及び相補的ｍＲＮＡを使用したそのハイブリッドの融解温度の予測を示す。
【図３】マウスＡＣｈＥ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ５６５１８；Ｒａｃｈｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｅｕｒｏｎ ５（３），３１７−３２７）、及びコーディング配列６３９−５’から３’−６５８（影）のヌクレオチドをターゲットとしたマウスＥＮ１０１（ｍＥＮ１０１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。
【図４Ａ】マウスＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の様々な物理的及び化学的性質を示す。オリゴヌクレオチドの内部構造、及びその構造を分解するために必要とされるエネルギー（ｋａｌ／ｍｏｌ）の予測を示す。
【図４Ｂ】マウスＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の様々な物理的及び化学的性質を示す塩基組成物、及び相補ｍＲＮＡを使用したそのハイブリッドの融解温度の予想を示す。
【図５】ラットＡＣｈＥ ｍＲＮＡ（一部、２０６６のヌクレオチド）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｓ５０８７９；Ｌｅｇａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６０（１），３３７−３４６）、及びコード配列５１−５’から３’−７０（影）のヌクレオチドをターゲットとしたラットＥＮ１０２（ｒＥＮ１０２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５），及びコード配列６３９−５’から３’−６５８（影）のヌクレオチドをターゲットとしたラットＥＮ１０１（ｒＥＮ１０１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。
【図６Ａ】ラットＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の様々な物理的及び化学的性質を示す。オリゴヌクレオチドの内部構造及び、その構造を分解するために必要なエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の予測を示す。
【図６Ｂ】ラットＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の様々な物理的及び化学的性質を示す。塩基組成物、及び相補的ｍＲＮＡを使用したそのハイブリッドの溶解温度の予測を示す。
【図７】ＥＡＭＧラットの免疫反応性ＡＣｈＥ−Ｒを示す。ラットの血清を変性でないポリアクリルアミドゲル内で分離させ、そのゲルを検査して免疫反応性ＡＣｈＥ−Ｒを調べた。ＥＡＭＧラットは、対照ラットと比べ、すばやく移動するｒＲ変異体が相当高いレベルで見られた。
【図８】ＥＡＭＧラットの筋肉における過剰ＡＣｈＥ−Ｒ発現を示す。図８Ａ：筋肉内において発現したＡＣｈＥ ｍＲＮＡ転写を示す。末梢エンハンサーにおいて機能的なグリココルチコイド反応性エレメント（ＧＲＥ）を持つストレスに反応する哺乳類ＡＣＨＥ遺伝子、及び筋肉内に発現するその２つのｍＲＮＡ転写を示す。因みに、エクソン６はシナプス性転写ＡＣｈＥ−Ｓに特有なものであり、偽イントロン４’は、ストレスで誘発されたＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡにおいてのみ表現されるものである。抗体は、ＡＣｈＥ−Ｒプロテインを検出するために供給される、偽イントロン４’で誘発されたＣ末端ペプチドをターゲットとし、ｃＲＮＡプローブはエクソン６をターゲットとし、偽イントロン４’は、その２つの転写を標識する（星印）。図８Ｂ：ＥＡＭＧ筋肉における激減ｎＡＣｈＲ及び過剰ＡＣｈＥ−Ｒを示す。何も治療していないラットと同様、不活性で逆（ｒ−ｉｎｖ ＥＮ１０２）オリゴヌクレオチドで治療された正常ラット及びＥＡＭＧラットからの三頭筋のパラフィン包埋部分の免疫組織化学染色を示している。染色は、ｎＡＣｈＲ（１，２）及びＡＣｈＥ−Ｒ（３，４）に対するポリクローナルラビット抗体を用いた。免疫陽性部分は赤色に染まっている。因みに、ＥＭＡＧにおいて、ＡＣｈＥ−Ｒプロテインは著しく高められ、ｎＡＣｈＲは劇的に減少した。ＡＣｈＥ−Ｒ又は−Ｓ ｍＲＮＡに特有なプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞核を示すためのＤＡＰＩ（白）を用いて、ＲＮＡを赤く染色した。対照動物ではなく、ＥＡＭＧにおけるＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの原子核内の蓄積が目立っている（５，６）。ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡは、対照及びＥＡＭＧラット両方の原子核内部分において強調している（７，８）。図８Ｃ：ＥＮ１０１治療を示す。逆配列（図８Ｂ参照）で治療したラットと比較し、ＥＡＭＧラットにおいて、ＥＮ１０１はＡＣｈＥ−Ｒ（１，２）及びＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ（５，６）のレベルを減少させたが、ｎＡＣｈＲ（３，４）及びＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ（７，８）に影響はなかった。
【図９】ＡＣｈＥ−Ｒの抑制下における、標準ＥＡＭＧ筋肉の電気生理現象を示す。図９Ａ：図７Ｂの場合と同様に、ｒＥＮ１０１又はｒ−ｉｎｖＥＮ１０２で治療した健康ラット及び重病のＥＡＭＧラットの血清中において免疫反応性ＡＣｈＥ−Ｒを検査した。密集度は棒グラフで示されている。図９Ｂ：動物（各グループにおいて少なくとも６匹のラット）にＡＣｈＥ阻害薬ネオスチグミン（７５μｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ注射し、基準に対するＣＭＡＰ率を測定した。治療前のＥＡＭＧラットの平均ＣＭＡＰ率は最初の脱分極の８７±２．５％であり、ｒＥＮ１０１治療した動物の平均ＣＭＡＰ率は、１０７．４±３．８％（差し込み図）だった。図９Ｃ：動物（各グループで少なくとも６匹のラット）を様々な量のｒＥＮ１０１で治療した。治療（１０−５００μｇ／ｋｇの投与量）は、７２時間後までＣＭＡＰ減少を復活させた。因みに、投与量の増加は、より長い持続性を見せた。図９Ｄ：投与量反応。ＥＮ１０１濃度に対するＣＭＡＰ反応を示す。１時間目及び５時間目においてはっきりとした２つの効果が見られる。大幅な増加は低ＥＮ１０１濃度（ＩＣ５０＜１０μｇ／ｋｇ）に依存するもので、より長く持続するというとても低い親和性効果に重ね合わされる。
【図１０】ラットＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で改善した筋無力症ラットのスタミナを示す。様々な重症度の自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）ラットと健康的なルイスラットを疲れるまで電気的に回る踏み車（２５ｍ／ｍｉｎ、差し込み図）で走らせた。２５０μｇ／ｋｇのｒＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与前と２４時間経過した後にラットが走れる平均時間（秒±ＳＥＭ）を示す。因みに、ＥＡＭＧラットの走行時間は病気の重症度に応じて減少し、ｒＥＮ１０１の治療後は向上した。
【図１１】ｒＥＮ１０１を経口投与したＥＡＭＧラットの低下しているＣＭＡＰ反応の安定的逆転を示す。１日１回、４日間、ラットにｒＥＮ１０１を静脈注射（２５μｇ／ｋｇ）又は強制経口投与（５０μ／ｋｇ）、又はピリドスチグミン（１０００μ／ｋｇ）を強制経口投与した。１回目の投与後１時間と５時間後、及びその後は投与前（２４時間ごと）にＣＭＡＰ率を計算した。図１１Ａ：１回投与。経口投与したピリドスチグミン（ｎ＝４）とｒＥＮ１０１（ｎ＝８）は、低下していたＣＭＡＰ反応を１時間以内に緩和した。ピリドスチグミンの投与２４時間後には、ラットの筋肉内においてＣＭＡＰ率が基準値に低下した。反対にｒＥＮ１０１を投与したラットに低下は見られなかった。図１１Ｂ：連日投与。グラフは、ｒＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与（２５μｇ／ｋｇ，ｎ＝４）と比較した、経口投与（５０μｇ／ｋｇ，ｎ＝８）による筋肉機能の向上を示す。因みに、ｒＥＮ１０１の連日投与は、ＣＭＡＰ低下を安定的に長期間緩和した。２４時間ごとのピリドスチグミン連日投与は、２回目の投与前に基準値へと低下し、ＥＮ１０１よりも明らかにＣＭＡＰ改善が短かった。
【図１２】長期間のｒＥＮ１０１治療によるＥＡＭＧ変化を示す。図１２Ａ：生存。同様な症状、同じ数の動物にも関わらず、毎日１回ｒＥＮ１０１（５０μｇ／ｋｇ，毎日，ｐ．ｏ．）を投与した動物は、ピリドスチグミン（１０００μｇ／ｋｇ）を投与した動物より生存率が高かった。図１２Ｂ：臨床状況。投与したグループから生存している動物の臨床状況（実験手順で定義する）の平均値を示す。ｒＥＮ１０１で治療した動物の症状は向上したのに比べ、生理食塩水及びピリドスチグミンで治療した動物は症状は悪化した。図１２Ｃ：スタミナ。ｒＥＮ１０１及びピリドスチグミンを投与した動物の平均走行時間を示す。投与前、ＥＡＭＧラットは重症な動物だった（臨床症状４）。
【図１３】ＥＮ１０１活性のモデルを示す。神経筋接合部において、運動ニューロン末端（上部）からシナプス間隙へと放たれたアセチルコリン（ＡＣｈ）は、筋肉のシナプス後細胞膜へと向かう。そこでｎＡＣｈＲと相互に作用し、内部イオン電流を起こして筋肉活動電位を誘発する。ＡＣｈは、次にシナプス結合ＡＣｈＥ−Ｓによって加水分解される。シナプス後筋肉核（楕円）は、第１のＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ転写に加え、代替的３’末端を有する通常にはないＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを作り出す。この転写は、水溶性分泌ＡＣｈＥ−Ｒモノマーに変える。ｎＡＣｈＲに対する筋無力自己免疫抗体は、ＡＣｈの不足状態を擬態しながら活動電位の開始を防ぐ。コリン作用的不安定性は、筋肉疲労を導くＡＣｈＥを破壊するＡＣｈＥ−Ｒ蓄積を引き起こす。化学的なアンチコリンエステラーゼ（円）は、選択せずにＡＣｈＥ−Ｓ及びＡＣｈＥ−Ｒ両方をブロックし、一時的にＡＣｈレベルを高め、さらにＡＣｈＥ−Ｒを活発に過剰生成する。反対にアンチセンス薬剤ＥＮ１０１は選択的にＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを破壊し、ＡＣｈＥ−Ｓ及び正常の神経筋伝達を維持しながらＡＣｈＥ−Ｒ合成を防止する。
【図１４】ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡではなく、ニューロンのＡＣｈ−Ｒ ｍＲＮＡのｈＥＮ１０１抑制を示す。ＡＣｈＥ−Ｒ又はＡＣｈＥ−Ｓ ｃＲＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに続き、ｈＥＮ１０１を投与したサルの脊髄の代表的部分を示す。ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡは減少したが、ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡは変化しなかった。ｈＥＮ１０１の量を増加したｏ．ｇ．投与は、より効果的にＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを抑制した。ｉ．ｖ．での投与量増加は、ｏ．ｇ．よりも効果的であることが示されている。
【図１５】ニューロンのＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルのｈＥＮ１０１抑制は細胞型特有である。ヘマトキシリン・エオジンで染色されたサルの脊髄ニューロンを直径＜４０、４０−７０、及び＞７０μｍの細胞に分けた。各ｈＥＮ１０１投与した１ｍｍ２の５つの領域において、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡとみなされた細胞の割合（％）を各大きさのグループごとに記録した。因みに、比較的小さい介在ニューロンにおいてｈＥＮ１０１の有効性が明らかに高く、最大の運動ニューロンにおいて有効性が一番低かった。
【図１６】加水分解したアセチルチオコリンのレベルを示す。１５０又は５００μｇ／ｋｇのｈＥＮ１０１を連続２日間ｉ．ｖ．投与、又は５００μｇ／ｋｇのｈＥＮ１０１を経口投与したカニクイザルの血漿におけるアセチルコリンエステラーゼ活性を示す。図１６Ａ：全体活性。図１６Ｂ：５×１０５Ｍのｉｓｏ−ＯＭＰＡ（ＡＣｈＥ）下での活性。注射で誘発された酵素活性の増加、及びＡＳ−ＯＮ減少に注目。
【図１７】ラットの脊髄ニューロンにおける、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡに対するｒＥＮ１０１の効果を示す。ｒＥＮ１０１（５００μｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．，毎日）を７日間投与したラットの脊髄部でＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ陽性細胞が確認された。
【０００１】
本発明は、特に進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防のため、ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）ｍＲＮＡの一般的なコーディング領域を対象とした合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及びその薬学的又は医学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
引例を含め、本明細書に引用されているすべての出版物は、言及することによりここに組み込まれている。
【０００３】
神経筋接合部（ＮＭＪ）は、とても特徴的で形態学的に異なったコリン作動性シナプスである（Ｈａｌｌ ａｎｄ Ｓａｎｅｓ（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２ Ｓｕｐｐｌ．， ９９−１２１）。ＮＭＪ活性の慢性障害は、筋肉構造及び機能の進行低下という神経筋疾患を引き起こす。ＮＭＪの活性低下から筋肉消耗までの分子及び細胞のメカニズムはまだ解明されていない。
【０００４】
疾患の１つとして重症筋無力症（ＭＧ）があり、これは、機能的なシナプス後筋肉ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の数を大幅に減少させる自己抗体が仲介する神経筋伝達の異常によって起こる（Ｄｒａｃｈｍａｎ Ｄ．Ｇ．（１９９４）Ｎ．Ｅｎｇｌ.Ｊ．Ｍｅｄ．３３０，１７９７−１８１０；Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１２，５４５−５５１）。ＭＧは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の抑制剤により筋力が一時的に改善することが特徴である（Ｐｅｎｎ Ａ．Ｓ． ａｎｄ Ｒｏｗｌａｎｄ Ｌ．Ｐ．（１９９５） Ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ Ｇｒａｖｉｓ Ｉｎ：Ｍｅｒｉｔｔ‘ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ｓｅｃｔｉｏｎ ＸＶII，７５４−７６１）。電気診断で見られる特徴的な異常性として、３又は５Ｈｚでの反復神経刺激により複合筋活動電位（ＣＡＭＰ）の振幅が進行的に、また急激に減衰してしまうことである。現在のところ、一般的なＭＧ治療は、ピリドスチグミン（Ｍｅｓｔｉｎｏｎ（登録商標））のような末梢ＡＣｈＥ阻害薬を１日数回、長期にって投与する等の免疫抑制療法である。ＡＣｈＥ阻害薬はＭＧ患者の筋肉を効果的に回復させるが、その効果は長く続かず、他の効果的な治療の開発が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アンチセンス技術は、従来のアンチコリンエステラーゼ療法に代わる、魅力的で遺伝子に基づくものである。アンチセンス技術は、長さが１５−２５残基で、対象のｍＲＮＡの配列を補う配列を持つ短いオリゴヌクレオチドをデザインするワトソン−クリック型対合の規則を生かしている（Ａｇｒａｗａｌ Ｓ．ａｎｄ Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ Ｅ．Ｒ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，６，７２−８１）。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯＮ）とそのターゲットとのハリブリダイゼーションにより形成される二重鎖ＲＮＡの伸縮性は、ＲＮＡｓｅＨを活性化させ（Ｃｒｏｏｋｅ Ｓ．Ｔ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，３−４５）、二本鎖ｍＲＮＡ特有の低下を促進させる。アンチセンス療法学は、プロテインよりもむしろＲＮＡを対象としているため、ナノモル程度の効率的な濃度で特に特定的な薬物をデザインする（Ｇａｌｙａｍ Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｅｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１１，５１−５７）。マウスＡＣｈｅ ｍＲＮＡを対象とした、ホスホロチオエート化され、３’末端が保護された２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト及びげっ歯類の培養細胞（Ｋｏｅｎｉｇｓｂｅｒｇｅｒ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６９，１３８９−１３９７；ＷＯ ９８／２６０６２；Ｇｒｉｓａｒｕ Ｄ．ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７，９３−１０５）、及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて脳（Ｓｈｏｈａｍｉ Ｅ．ｅｔ．ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８，２７８−２３６；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、ｉｎ ｐｒｅｓｓ）、筋肉（Ｌｅｖ−ＬｅｈｍａｎＥ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，９３−１０５）及び骨髄（Ｇｒｉｓａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｉｂｉｄ．）のＡＣｈＥ発現をブロックすることに効果的であることが示された。
【０００６】
発明者は、非可逆的コリンエステラーゼ阻害薬ジイソプロピル・フルオロ・ホスホネート（ＤＦＰ）での治療が、脳（Ｋａｕｆｅｒ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９３，３７３−３７７）及び腸（Ｓｈａｐｉｒａ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．９，１２７３−１２８２）において、ＡＣｈＥ、ＡＣｈＥ−Ｒの珍しい非シナプス的で代替的なスプライシング変異体を過剰発現させることを観察した。ＤＦＰで治療した動物の筋肉においてもまたＡＣｈＥ−Ｒが過剰発現し、神経突起の分岐増加、消耗性繊維の乱れ及びＮＭＪ障害を引き起こす。マウスＡＣｈＥ ｍＲＮＡをターゲットとした部分的に保護された２’−Ｏ−メチルアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥのフィードバックアップレギュレーションを抑制し、ＤＦＰが誘発したＮＭＪの障害を改善した（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｂｉｄ．）。これらの観察により、コリン作用性ストレスは筋肉においてＡＣｈＥ−Ｒを高発現させ、アンチセンスオリゴヌクレオチドはそのＡＣｈＥ−Ｒを抑制して、有害な結果を防止することが出来ると証明された。
【０００７】
上述したように、電気診断で見られる独特な異常性として、３又は５Ｈｚの反復神経刺激により複合筋活動電位（ＣＡＭＰ）の振幅が進行性に、また急激に減衰してしまうことである。この筋無力性の疲労び原因は、シナプス後部に局在するＡＣｈＲ分子の数が減少することである。抗ＡＣｈＲ抗体の抑制は、８５−９０％の患者において行われている（Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．（１９９９）ｉｄ ｉｂｉｄ）。
【０００８】
先天的ではない、他の原因によるＭＧ患者（Ｔｒｉｇｇｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １５，２６７−７２）は、塩化エドロホニウムのようなＡＣｈＥ阻害薬に対して一時的な臨床反応をみせる。入手可能な抗ＡＣｈＥ薬剤は、治療において真っ先に使用されるものであるが、ほとんどの患者にはさらなるなにかが必要である。例えば、血漿交換、胸腺摘出術、免疫抑制などの思い切った治療である。不運にも、現在使用されているすべてのＭＧ薬物の投薬計画は、長期的で、有害な結果を伴う。例えば、神経筋伝達の障害、ＭＧ症状の悪化と誘発である。安全な抗感染薬、心臓脈管薬、抗コリン作用薬、抗痙攣薬、抗リウマチ剤などの一般的な薬物の使用もまた、ＭＧ患者の症状を悪化させるという報告がある（Ｗｉｔｔｂｒｏｄｔ（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５７，３９９−４０８）。
【０００９】
カルバミン酸塩アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害薬（例えば、ピリドスチグミン）の長期全身投与は、ＭＧと関係している神経筋の機能低下を一時的に緩和するが、発明者たちは、ピリドスチグミンがＡＣｈＥ過剰蓄積を導くフィードバック反応を引き起こすことを発見した（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２，１３８２−１３８５；Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ；Ｍｅｓｃｈｏｒｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５，５０８−１２）。この発見は、そのような阻害薬の長期使用が、患者の神経筋システムのコリン作用性バランスを変化させ、そのためにこれらの薬物の投与量を増やさなければならなくなること、；ＭＧ患者に適用される投与計画がとても変更されやすいこと、；また、アセチルコリン加水分解を抑制する他の方法の開発を求めることを示唆するものである。
【００１０】
エクソン１‐４及び６を有して”シナプス”（Ｓ）イソ型をコーディングするＥ６ ｍＲＮＡ、エクソン１−６を有して”赤血球”（Ｅ）イソ型をコーディングするＥ５ ｍＲＮＡ、そしてエクソン１−６と偽イントロンＩ４を有して、３’未スプライシング転写より生成された”リードスルー”ＡＣｈＥ−ＲをコーディングするＩ４ ｍＲＮＡを生じる３’選択的スプライシングをＡＣｈＥ−コーディングＲＮＡに行う。
【００１１】
筋肉ではなく、脊髄運動ニューロン内でヒトＡＣｈＥ−Ｓが過剰発現している遺伝子移植マウスは、ＮＭＪ超構造の変化に関係する進行性神経支配障害をもつ（Ａｎｄｒｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，８１７３−８１７８）。しかしながら、筋肉内におけるある程度の過剰発現ＡＣｈＥが、この深刻な筋病理学を仲介するのに十分であるかどうかは明らかになっていなかった。発明者たちはげっ歯動物において、外傷性ストレス及びコリンエステラーゼ阻害薬の両方が、コリン性作動薬及び抑制因子の両方に対する神経過敏症を伴う（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）ｉｄ ｉｂｉｄ）、カルシウム依存の深刻なＡＣｈＥ−Ｅの過剰発現を引き起こすことをあらかじめ発見していた（Ｋａｕｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ．）。
【００１２】
慢性的なＡＣｈＥ過剰は、遺伝子移植マウス及び両生類胚において進行性神経支配を低下させることがわかった（Ｂｅｎ Ａｚｉｚ−Ａｌｏｙａ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，２４７１−２４７５；Ｓｅｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６２，１６７０−１６８１；Ｓｅｉｄｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｏｉｌ．１５，２９９３−３００２；Ａｎｄｒｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４，８１７３−８１７８；Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，１２４０−１２４９）。また、筋無力症患者は、年平均２．５％の発生率（Ｂｅｒｒｏｕｓｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２５，１２２８−３５）で、抗ＡＣｈＥ中毒を暗示させるような呼吸不全を伴う深刻なクリーゼを患う。
【００１３】
本発明の発明者たちは、ＡＣｈＥの共通コーディング領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＣｈＥ生成を抑制するために有用であることをあらかじめ発見していた（ＷＯ ９８／２６０６２）。この出願はまた、脳にヒトＡＣｈＥが過剰発現した遺伝子移植マウスを観察し、ヒトＡＣｈＥに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが記憶欠乏症の治療に有用であることを記載している。この観察結果（ＷＯ ９８／２６０６２の表４−５参照）によると、同様の効果をもち、さらに従来のＡＣｈＥ阻害薬タクリンより大幅に作用時間が長い（ＷＯ ９８／２６０６２の図９Ｂ参照）。
【００１４】
以上からみて、ＭＧおよび神経筋伝達欠陥を含む他の症状に対し、さらなる治療方法の改善が望まれる。ＡＣｈＥ阻害薬を使用した従来の治療は、阻害薬がＡＣｈＥを誘発し神経筋も傷つけ、また精神状態の変化（ストレス）で効果が変わるために、良くない副作用がでる。
【００１５】
ＷＯ０１／３６６２７において、ＮＭＪ内の形態的で機能的変化は、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡの特定イソ型、つまり、成熟したｍＲＮＡの偽イントロンを含有する”リードスルー”イソ型の過剰発現と関係していると記載している。このＰＣＴ出願では、ＡＣｈＥの一般コーディング領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、特にＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを破壊することが出来ること、神経筋疾患の治療において、ＡＣｈＥアンチセンス薬剤が従来のＡＣｈＥ酵素阻害薬よりも優れていることも示している。これらのアンチセンス薬剤の優性は、従来の酵素阻害薬がＩ４ ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ過剰発現を活発に引き起こすという事実によるものである。ＷＯ０１／３６６２７によると、これはＮＭＪにおいて有害な変化をもたらす。この治療結果は、ＷＯ０１／３６６２７のアンチセンス薬剤を使用することによって完全に防止することが出来る。
【００１６】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）のホメオスタシス環境を維持する。血液を脳に供給する毛細血管は密着結合し、毛細血管内皮細胞の膜を通過する分子のほとんどをブロックする。脂溶性物質は細胞膜を通過するが、水溶性物質は一般的にＢＢＢを通過しない。仲介輸送機構は、水溶性グルコース及び必須アミノ酸がＢＢＢを通過するようにする。活性支援機構は、カリウムのような過剰になる分子を脳から取り除く（参考として、Ｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ−Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｂａｒｒｉｅｒｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３２，ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈｅｄ．，Ｅｄｓ Ｓｉｅｇｅｌ，Ａｌｂｅｒｓ Ａｇｒａｎｏｆｆ，Ｍｏｌｉｎｏｆｆ，ｐｐ．６８１−７０１；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｅｔｚ（１９８６）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，ｐｐ．７４−８３）。
【００１７】
ＢＢＢは薬物がＣＮＳに到着するのを遅らせる。そのため、例えばオヤマリザーバーを利用した、鞘内輸送によるＣＮＳ内の直接輸送等、必要な薬物を輸送する方法が計画されている。Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，４５５，０４４は、拡散システムを利用したＣＮＳへの輸送について記載している（他のＣＮＳへの輸送機構については、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，５５８，８５２、Ｂｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，ｉｂｉｄ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｂｅｔｚ，ｉｂｉｄ）。Ｔａｖｉｔａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｔａｖｉｔａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ Ｍｅｄ４（４）：４６７−７１）は、２’−メチルオリゴヌクレオチドの脳内への浸透を観察した。他のシステムにおいては、ＢＢＢの構造と機能を考慮し、例えば、脂溶性薬物をデザインするか又はＢＢＢに浸透可能なペプチドと結合することにより特別に薬物をデザインし、薬物を輸送する。
【００１８】
ストレスがＢＢＢへの浸透性に影響を及ぼすことがわかっている（Ｓｈａｒｍａ Ｈ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．９１，１８９−１９６；Ｂｅｎ−Ｎａｔｈａｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｌｉｆｅ．Ｓｃｉ．４８９，１４９３−１５００）。さらに、哺乳類動物は急性ストレスにより神経興奮性が増加し、放出されたアセチルコリンが短時間で一時的に増加した（Ｉｍｐｅｒａｔｏ Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５３８，１１１−１１７）。本発明の発明者たちは、ＡＣｈＥ−Ｒイソ型及びＡＣｈＥのＩ４ペプチドがストレスを擬態する薬剤として作用し、ＢＢＢを破ることをあらかじめ発見している。これらの発見は、ここに参照として組み込まれているＰＣＴ出願ＷＯ９８／２２１３２の基礎になっている。ＷＯ９８／２２１３２は、ＡＣｈＥ−Ｒスプライス変異体及び／又はペプチドＩ４からなる化合物のＢＢＢ通過を促進する組成物に関するものである。
【００１９】
部分的に人間の治療に役立つかもしれないヒトＡＣｈＥ領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究において、発明者たちは、本発明の目的でもある、ヌクレオチド配列：５’−ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ−３’（ここではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と指定する）を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発見した。これはＡＣｈＥ−Ｒイソ型の生成を選択的に抑制するのに有用なだけでなく、異種間の特異性を持ち、つまり様々な症状のげっ歯類動物モデルに使用可能であり、さらに明らかにＢＢＢに浸透するため、単独で又は他の治療薬と合わせて中枢神経疾患の治療に有用である。特にＢＢＢは大きな極性分子に対して不浸透性であると考えられていたため、本発明の新たなアンチセンスがＢＢＢに浸透するという発見は意外なものであった。
【００２０】
オリゴヌクレオチドを脳に輸送するシステムの欠乏により、神経系疾患の治療に適用されるアンチセンスの技術は最近まで限界があると考えられていた。それにもかかわらず、この難題を回避するためにいくつもの実験が行われた（Ｓｅｉｄｍａｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ，９，３３３−３４０参照）。ＢＢＢとして知られている生体力学的バリアは、血中の化学薬物が脳の間質腔に進入するのを制限する。ホスホジエステルバックボーンの強力な陰イオン性は、ＢＢＢを通過時にオリゴヌクレオチドを特に弱めてしまう。ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物生態学において、全身投与により１％未満のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドが脳に到達しても、そこで６０分程度しかとどまっているいないことが証明されている。この問題に対する解決法は、オリゴヌクレオチドを頭蓋内に注入するという、ＢＢＢへの直接投与である。ラット及びマウスに対して公開された定位座標を用い、１回注射、埋め込み型カニューレによる反復投与、又はＡｌｚｅｔ（Ａｌｚａ，Ｐａｌｏ，Ａｌｔｏ，ＣＡ）のような浸透性ミニポンプを利用した継続注入により、オリゴヌクレオチドを輸送することが出来る。オリゴヌクレオチドはＣＳＦ内に輸送されるか、又は関係ある脳の領域に直接輸送される。一般的に、オリゴヌクレオチドは実質内投与後において比較的局在すると考えられている。ｃＡＭＰ反応性エレメント（ＣＲＥＢ）を目的とした２４μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチドをラットの小脳扁桃へ１回投与すると、注射箇所の周りに０．７２±０．０４μｌ拡散し、条件性味覚嫌悪（ＣＴＡ）に局部的影響を及ぼすことが報告された。同じオリゴヌクレオチドを小脳扁桃上２ｍｍの大脳基底核へ注入してもＣＴＡに影響はない。同様に、ストレスに関わる転写因子ｃ−ｆｏｓに対するアンチセンスヌクレオチドを前頭葉に注入後（１回の投与；１０μｇ）、神経伝達物質の酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するオリゴヌクレオチドを視床下部腹内側部に輸送後（１回の投与；１μｇ）、及びｃＡＭＰ反応転写因子ＣＲＥＢをコーディングするｍＲＮＡをターゲットとしたオリゴヌクレオチドを青斑核へ５日間連続注入した後（１日２０μｇ）における、行動への影響が具体的に報告された。さらに、直接的で高流量な実質内ミクロ注入により、脳内のオリゴヌクレオチドを広げる（４８時間後、注入場所から４４３μｌまで）ことが可能と報告された。この場合、オリゴヌクレオチドの平均的な組織濃度は、生理的に有効だと考えられている３−１５μＭと計算された。神経細胞への取り込みに関し、ラットのストリアトゥムの神経細胞は、グリアに比べて優先的にオリゴヌクレオチドを取り込む。研究で報告された注入場所周辺のオリゴヌクレオチドの一般的な残留にもかかわらず、投射経路に沿って離れた場所へ移動したことが観察された。しかしながら、効果的な治療のためには、オリゴヌクレオチドを静脈注射、又はさらに好適には、経口投与で中枢神経内で安定させ自由に浸透させるようにすることである。本発明は、ヒトＡＣｈＥの共通コーディング領域に対する、新たな、そして好適にはヌクレアーゼ保護のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを目的としている。このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、選択的にＡＣｈＥ−Ｒの生成を抑制して、筋肉機能の臨床改善を短時間で、しかも持続させる。また、異種間特異性を有し、ＢＢＢに浸透し、中枢神経細胞内のＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを破壊する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、進行性神経筋疾患の治療及び／又は防止用の薬学的又は医学的組成物に関するものである。この組成物は、活性成分として、ヌクレオチド配列：５’ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなり、ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するものである。
【００２２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを優先的に破壊し、異種間特異性を有し、げっ歯類動物や霊長類動物において毒性を起こさないことが証明され、そしてｉ．ｖ．及びｐ．ｏ．投与により霊長類動物（サル）のＢＢＢに浸透することが出来る。
【００２３】
実施例において、ヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を有する合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性である。ヌクレア−ゼ抵抗性は、部分的に不飽和脂肪族炭化水素系溶剤鎖、及びカルボン酸グループ、エステルグループ、及びアルコールグループを含む１つ以上の極性又は電荷グループからなるように本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを変化させることで達成される。
【００２４】
特に、本発明のヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデキシヌクレオチドは、最後３つの３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つが２’−Ｏ−メチル化、好適には最後の３’末端ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル化されている。又は、本発明のヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、最後の３’末端ヌクレオチドの少なくとも１つがフッ素化であることである。又は、本発明のヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、最後の３’末端ヌクレオチド塩基のうち少なくとも１つの結合がホスホロチエート結合であり、好適には最後４つの３’末端ヌクレオチド塩基がホスホロチエート結合であることである。又、さらに、ヌクレアーゼ抵抗性は、３’末端にヌクレオチドループを形成する配列、例えばヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＡＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である９−ヌクレオチドループを有する本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによって達成される。
【００２５】
本発明の合成ヌクレアーゼ抵抗性アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、哺乳類のＡＣｈＥ生成を選択的に調節することが出来る。特に、介在ニューロンのヒトＡＣｈＥを含め、中枢神経系に在している神経細胞の霊長類ＡＣｈＥ生成を選択的に調節する。
【００２６】
更なる側面として本発明は、本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、さらに任意的に、薬学的に条件を満たした補助的キャリア又は希釈剤からなる薬学的組成物に関するものである。
【００２７】
実施例において、本発明の薬学的組成物は、最後の３’末端ヌクレオチドのうち少なくとも１つ、好適にはすべてが２’−Ｏ−メチル化されている、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の薬学的組成物は、スタミナの向上及び／又は慢性的筋肉疲労の減少のため、進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防において有用である。
【００２９】
本発明の薬学的組成物においては、毎日１回、約０．００１μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇ、好適には、約０．０１μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇ、さらに好適には、約０．１５μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇの活性成分の投与に使用される。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、特にＡＣｈＥ ｍＲＮＡ又はプロテインの過剰と関係している進行性神経筋疾患の治療又は防止において使用されることを目的とする。このような疾患は、例えばＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰と関係している進行性神経筋疾患である。
【００３１】
かくして、本発明の薬学的組成物は特に、コリン作用性伝達の欠陥に関係する進行性神経筋疾患の治療または防止に好適である。
【００３２】
特に、薬学的組成物は、筋肉変形、筋肉再神経支配またはＮＭＪ異常を含み、例えば、重症筋無力症、イートン・ランバート症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、多発性硬化症、失調、脳梗塞後硬化症、外傷後筋肉損傷、術後麻痺、過剰再神経支配、ＡＣｈＥ阻害薬への暴露後に関係する進行性神経筋疾患治療用である。
【００３３】
本発明の薬学的組成物は、身体的運動のスタミナ向上または筋肉疲労を軽減するためにも有用である。
【００３４】
さらに、本発明は、化合物のＢＢＢ通過を助長するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと、さらに任意に、付加的な薬学的活性物質及び／又は薬学的に条件を満たした補助的なキャリア又は希釈剤からなる薬学的組成物に関するものである。付加的な薬学的活性物質とは、ＢＢＢを通過して伝達される化合物である。例えば、中枢神経系用の造影剤、乱用した薬物による影響をブロックする薬剤、抗生物質、化学療法薬、遺伝子治療に使用されるベクターである。この化合物は、明らかにＢＢＢ維持に関係があるＡＣｈＥ−Ｅの生成を抑制することにより本質的に機能する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
明細書及び図面において本発明を詳しく説明する。
明確にする為に、以下の略語をここで使用する。
ＡＣｈＥ：アセチルコリンエステラーゼ
ＡＣｈＥ−Ｒ：アセチルコリンエステラーゼ、”リードスルー”変異体又はイソ型。そのｍＲＮＡは偽イントロンＩ４を含む。
ＡＣｈＥ−Ｓ：アセチルコリンエステラーゼ、シナプス変異体又はイソ型。
ＡＳ−ＯＮ：アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＢＢＢ：血液脳関門
ＣＭＡＰ：複合筋活動電位
ＣＮＳ：中枢神経系
ＥＡＭＧラット：実験的に自己免疫筋無力症にされたラット
ＥＮ１０１：ＡＳ３とも呼ばれる。ヒト、ラット、又はマウス（それぞれｈＥＮ１０１、ｒＥＮ１０１、またはｍＥＮ１０１）ＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＥＮ１０２：ＡＳ１とも呼ばれる。ＥＮ１０１とは違う領域で、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
ＭＧ：重症筋無力症。神経筋接合疾患。
ｉ．ｖ．：静脈注射
ｏ．ｇ．：強制経口投与（ｏｒａｌ ｇａｖａｇｅ）
ｐ．ｏ．：経口投与
【００３６】
アンチセンスヌクレオチド：ＡＣｈＥ ｍＲＮＡの配列とは逆の相補的配列からなるヌクレオチド。このヌクレオチドは、好適にはオリゴデオキシヌクレオチドだが、リボヌクレオチドやヌクレオチド類似体、またはその混合体も本発明によって考慮される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのヌクレアーゼ抵抗性を高めるため、その細胞膜透過性を向上させるため、又はその両方を目的として変化させても良い。アンチセンスオリゴヌクレオチドは線形でも２次構造でもよい。また、リボザイム活性のような酵素活性から構成されてもよい。
【００３７】
進行性神経筋疾患：過剰ＡＣｈＥ ｍＲＮＡまたはプロテイン生成に関係した疾患又は状態。ＮＭＪの形態学の変化や神経筋伝達の欠陥が特徴である。神経筋疾患は、筋肉破壊、筋肉再神経支配またはＮＭＪ異常を伴う。さらに好適には、進行性神経筋疾患は重症筋無力症、筋ジストロフィー症、多発硬化性、筋萎縮性側索硬化症、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、又は失調である。
【００３８】
本発明は、実質上ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示される新しい種類のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドに関するものであり、ここではｈＥＮ１０１と表されている。
【００３９】
ＡＣｈＥ配列に相補的な配列の一部に加え、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、酵素のヌクレオチド的活性を有するＲＮＡ配列を含ませたり、そのような配列に結合させても良い。好適なヌクレオチド配列は、特にｍＲＮＡ転写と相互に作用するリボザイム配列でる。それらはアンチセンスオリゴヌクレオチドによって挟まれたＲＮａｓｅ活性サイトを含むリボ核酸配列である（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３，ｐ．５８５、Ｓｅｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７，ｐ．１２２２）。好適なリポザイムはハンマーヘッド型リポザイムである（Ｃｏｎａｔｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７，２４００−２４０７；ａｎｄ Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４０，２１３４−４４）。他の好適なリポザイムは、例えばタバコ輪点ウィルスサテライトＲＮＡから得られるようなヘアピン型リボザイム構造である（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｕｉｚ（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，９，３３−４３）。
【００４０】
本発明のまったく新しいアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、ヌクレオチド７９５−５’からヌクレオチド３’−８１４までのヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡ配列の逆相補体に対応する（図１）。本発明者たちの以前の研究により、ＡＣｈＥ生成の抑制及び記憶欠乏症の治療において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが有効であることを証明している。また、その研究においてＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの数が開示されている。その研究ではさらに、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの望ましい性質とその変異体、例えばヌクレアーゼ抵抗性を有する変異体やオリゴヌクレオチドの細胞膜輸送を高めるための変異体なども開示している。以前の研究、つまりＷＯ９８／２６０２６は参考として本明細書全体に組み込まれている。他の刊行物において、本発明者たちは、様々な神経変性病の治療におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの役目を開示している（Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌ．９，３３３−３４０（１９９９）。
【００４１】
本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、好適にはヌクレアーゼ抵抗性である。ヌクレアーゼ抵抗性を与えるようなオリゴヌクレオチドの変異体が数多くある。ＷＯ９８／２６０６２において、例えば、ホスホジエステルインターヌクレオチド結合をホスホロチオエート結合に変更し、２’−Ｏ−メチルグループによって１つ以上のヌクレオチドを変化させ、又は生理学上の条件下でループ構造を形成し得るヌクレオチド配列をアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の３’末端に加えることにより、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ抵抗性に作られる。ループを形成する構造は、配列５’ＣＧＣＧＡＡＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に加えてヌクレアーゼ抵抗性を作る。
【００４２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが影響を与える細胞は、神経軸索と終板構造を含む筋肉細胞及びＮＭＪの細胞である。
【００４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することにより、ＡＣｈＥ−Ｒの量とＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルが中枢神経系内で、投与後２４時間以内に少なくとも約３０％、好適には少なくとも約４０％、さらに好適には少なくとも約５０％、また、連続投与により約８０％減少することが期待される。この減少は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）と免疫標識によって示され、その効果は電気生理学及び踏み車テストで確認された。これは、以前に報告された他の細胞及び組織におけるＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡのＡＳ−ＯＮ破壊を圧倒的に上回るものである。
【００４４】
さらに、本発明の他の実施例おいて、オリゴヌクレオチド候補での治療をＦＩＳＨで評価する。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは同業者にとって良く知られてた技法で、例えば、Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．（Ｅｄ．）ＩＳＢＮ：０１９９６３３２７４；Ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｒａｉｎ，Ｗｉｓｄｅｎ Ｗ．，Ｍｏｒｒｉｓ Ｂ．Ｊ．（Ｅｄｓ．），ＩＳＢＮ：０１２７５９９２０７，ＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ １８６），Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ Ｃ．Ｓ．，Ｊｏｈｎ Ｏ’Ｌｅａｒｙ Ｊ．，（Ｅｄｓ）ＩＳＭＮ：０１９９６３６３２Ｘにおいて記載されている。放射活性を持たせていない標識プローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに関する詳細なプロトコルはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ ＧｍｂＨ（Ｂａｌｇａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で入手可能である。
【００４５】
標識ＡＣｈＥ−Ｒ ｃＲＮＡ配列は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用のプローブとして使用可能である。ＡＣＨＥ ｃＲＮＡプローブは、好適にＩ４偽イントロン配列からなる。
【００４６】
本発明の実施例において、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡは、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣを利用して決定され、その技法は、例えば上述した刊行物、及びＰＣＲ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３ｒｄ ｅｄ．，ｂｙ Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）において記載されている。
【００４７】
ホスホロチオエートで変化させたオリゴヌクレオチドは、一般的に副作用がないとされている。Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．は、ホスホジエステル−ホスホロチオエート混合バックボーンを使用すると、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの望まないｉｎ ｖｉｖｏ副作用は軽減されると記載している。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、部分的にホスホロチオエートとして有効であり、さらに部分的に２’−Ｏ−メチル保護のオリゴヌクレオチドとして有効であると発見した。ＷＯ９８／２６０６２において、約２０のインターヌクレオチド結合のうち３つのホスホロチオエート結合を含んでいるＡＣｈＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを、約１−１０μＭの濃度で使用する場合は安全だと記載している。しかしながら、長期投与においては、分化したときに中毒性グループを解放しないオリゴヌクレオチドのほうが好適である。このオリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル保護のオリゴヌクレオチドを含むが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含まない。ホスホロチオエート保護より２’−Ｏ−メチル保護の利点は、少ない量のオリゴヌクレオチドでＡＣｈＥを抑制出来ることである。この違いは、２’−Ｏ−メチル保護のオリゴヌクレオチドを使用したとき得られる２本鎖の安定性に関係していると思われる（Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．＆Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７，６９９１−７，（１９９８）。２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのよりすごい有効性として、オリゴヌクレオチド鎖が細胞膜へ進入することを促進する。２’−Ｏ−メチル保護の更なる利点は、ヌクレアーゼ仲介の悪化に対する、より優れた予防であり、結果としてこのように保護されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を持続することとなる。
【００４８】
本発明によると、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの投与量は、投与する動物の体重１ｇあたり約０．００１から５０μｇのオリゴヌクレオチドである。好適には、約０．０１から約５．０μｇ。さらに好適には、約０．０５から約０．５μｇである。従って、適正な投与量は、ラットとサル両方の動物の体重１ｋｇにつき５０−５００μｇである。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ過剰生成をもたらす疾患の治療に使用される。
【００５０】
疾患は、ＮＭＪにおいて機能的そして形態学的変化に伴って生じる疾患である。
【００５１】
進行性神経筋疾患は、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰発現に伴う。
【００５２】
さらに好適には、疾患は例えば、多発性硬化症、ＰＴＳＤ、重症筋無力症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、失調、筋肉破壊、筋肉再神経支配、又は過剰筋肉神経支配だが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
過剰筋肉神経支配は、心的外傷後又は切断後の過剰神経支配だが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ある側面として、本発明は進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防、身体的運動におけるスタミナ向上及び／又は慢性筋肉疲労の軽減のための薬学的組成物に関するものであり、活性成分としてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義される合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドｈＥＮ１０１からなる。また任意的に付加的な治療薬及び／又は薬学的に条件を満たしたキャリア、賦形剤、及び／又は希釈剤を含む。好適に、上記の薬学的組成物は、重症筋無力症の治療及び／又は予防に使用される。
【００５５】
本発明の薬学的組成物で治療及び／又は予防される進行性神経筋疾患はＡＣｈＥまたはプロテインの過剰と関係している。通常、過剰ＡＣｈＥはＡｃｈＥ−Ｒ変異体又はイソ型である。
【００５６】
さらに、本発明の薬学的組成物で治療及び／又は予防される上記進行性神経疾患は、コリン作用性伝達の欠陥と関係している。上記疾患は、筋肉破壊、筋肉再神経支配、又は神経筋接合部（ＮＭＪ）異常を伴う。
【００５７】
本発明の薬学的組成物は、重症筋無力症（ＭＧ）、イートン・ランバート疾患、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索側硬化症（ＡＬＳ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳梗塞後硬化症、外傷後筋肉障害、過剰神経支配、原因不明の術後麻痺、ＡＣｈＥ阻害薬に対する暴露後のような疾患の治療及び／又は予防に使用される。
【００５８】
１つの実施例として、治療は、本発明の薬学的組成物を約０．００１から５０μｇ／ｇの活性成分量で毎日患者に投与する。好適には、約０．０１から５．０μｇ／ｇの活性成分量。さらに好適には、約０．０５から０．５０μｇ／ｇの投与量、もっとも好適なのは、約０．１５から０．５０μｇ／ｇの投与量である。
【００５９】
更なる側面として、本発明は、化合物のＢＢＢ通過を助長するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義されるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドからなる薬学的組成物に関する。さらに任意に、付加的な薬学的活性物質及び／又は薬学的に条件を満たした補足的なキャリア又は希釈剤を含む。その付加的な薬学的活性物質はＢＢＢを通って運ばれる化合物である。本発明の薬学的組成物は、活性物質をＣＮＳへ投与しなくてはならない、中枢神経系に関連した疾患の治療、例えば脳腫瘍のような疾患の治療に使用される。従来の化学療法薬剤はＢＢＢを通過しないため、有効性でない（ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．４３３，１１４−１２３（２００１））。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＢＢに浸透するため、脳腫瘍は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの注射又は経口投与で治療可能であり、ＣＮＳへの進入を必要とする方法の必要性をなくす又は減らす。アンチセンスオリゴヌクレオチドは腫瘍限定である（Ｒａｔａｊｃｚａｋ Ｍ．Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，１１８２３−１１８２７（１９９２））；そのため、ＢＢＢ通過するものを発見しなければならず、またそれは限定的で効果的でなければならない。かくして、本発明の組成物に含まれる付加的な薬学的物質は例えば制ガン及び転移性薬物である。
【００６０】
通常ＢＢＢが化合物の進入を妨ぐ中枢神経系に作用する状態の診断又は治療には、数多くの化合物が必要である。これらの状態は、いかなる疾患や病状を含む。例えば、遺伝的疾患同様、感染症、神経化学疾患、脳腫瘍、神経こうしゅ、脱髄、他の神経障害、脳症、昏睡、虚血、低酸素症、てんかん、痴呆、認知疾患、神経精神病学疾患（例えば、憂鬱、不安、精神分裂病など）であるが、これらに限られるものではない。かくして、ＢＢＢを通過する上記化合物又は付加的な薬学的活性物質は、例えば、中枢神経系用の造影剤（色素）、抗生物質や化学療法薬のような薬物、遺伝子療法ベクター、又は乱用された薬物の影響をブロックする薬剤などがある。これらの化合物は一般的に、患者の年齢、性別、体重、及び他の医学的に重要な事柄を含む医療的状態を考慮して投与される。投与の方法及び薬学的に効果的な量は従来例で知られているように、以上のような考慮により決定される。組成物の輸送においては、記載されるように様々な方法で化合物を投与することが出来る（以下参照）。
【００６１】
ＢＢＢを通過する化合物は、本発明の組成物と同時に投与するか、又は生物学的に組成物の活性が有効である期間中に投与する。つまり、本発明の組成物は、投与量に応じた有効時間中にＢＢＢの破壊を促進、つまり、ＢＢＢをオープンにする。そしてこのオープン状態の間に化合物を投与する。
【００６２】
効果的にする為、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、本発明の薬学的組成物と組合させると、細胞膜を通過する。一般的に、特に特定受容体と結合した可飽和摂取機構により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞膜を通過する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖分子であるので、ある程度疎水性であり、細胞膜を通過して受動拡散する。細胞膜を通過する性質を向上する為にアンチセンスオリゴヌクレオチドを変化させる。例えば、オリゴヌクレオチド分子を任意にまた部分的に不飽和脂肪酸炭化水素鎖からなるグループ、及びカルボン酸グループ、エステルグループ、アルコールグループのような１つ以上の極性又は帯電グループに結合させる。又は、オリゴヌクレオチドをペプチド構造に結合させる。好適には細胞膜に影響を及ぼすペプチドである。このように変化したオリゴヌクレオチドはよりたやすく細胞膜に浸透する。これは重要なことであり、それらの活性をとても高める。パルミチル結合のオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｒｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６２，１７７−８４（１９９８））によって開示されている。ゲラニオール結合のオリゴヌクレオチドは、Ｓｈｏｊｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ ５，２６１−７３（１９９８））によって開示されている。ペプチド、例えば細胞膜に影響を及ぼすペプチド結合のオリゴヌクレオチド及びそれらの生成はＳｏｕｋｃｈａｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．９，４６６−７５（１９９８））によって開示されている。ある細胞をターゲットとし、その細胞のオリゴヌクレオチド摂取を高めるアンチセンス分子又は他の薬物の改良は、Ｗａｎｇ，Ｊ．（ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ ５３，３９−４８（１９９８））に開示されている。
【００６３】
本発明のいかなる組成物も注射、局所投与、又は経口摂取により使用される。注射による本発明の薬学的組成物は、皮下注射、腹膜内注射、筋内注射が好適である。以下の例に示すように、経口投与もとても効果的であると証明されている。
【００６４】
経口投与に適した本発明の組成物は、活性成分が必要なだけ入ったカプセル、小袋、タブレットのような個別単位として、パウダーや顆粒として、水性又は水性でない液体の溶液又は懸濁液として、又は水内オイル状液体エマルジョン又はオイル内水状液体エマルジョンとして与えられる。活性成分はまた、ボーラス、舐剤、又はペーストとして与えられる。タブレットは圧縮又は型にはめて作り、１つ以上の補助的成分を入れてもよい。圧縮型タブレットは、パウダーや顆粒等でなる活性成分を適当な機械で圧縮して作る。任意に結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ハイドロキシプロピルメチル、セルロース）、潤滑油、不活性希釈剤、防腐剤、錠剤分解物質（例えばナトリウム、でんぷん、グリコース酸塩、交差結合ポビドン、交差結合ナトリウム、カルボキシメチルセルロース）、海面活性剤又は分散剤と混合してもよい。また、型で作ったタブレットは、不活性液希釈剤で湿らせたパウダー状の化合物を適当な機械で型どって作る。タブレットを、任意にコーティングしたり分割したりしても良く、また、例えば、ハイドロキシプロプルメチルセルロースをある割合で使用して、タブレット中の活性成分が所望の融解性を持つように作ることも出来る。タブレットは、任意にお腹よりも腸で解けるように腸溶性コーティングを施すことも出来る。
【００６５】
本発明の薬学的組成物は、一般的に緩衝剤、その浸透圧を調節する薬剤からなり、また任意に薬学的合成剤にフレーバー、色、潤滑をつけるために周知のキャリア、賦形材、及び／又は添加剤を混ぜてもよい。好適な緩衝材は、浸透圧を調整したリン酸緩衝生理食塩液である。
【００６６】
キャリアは、でんぷんやその誘導体、セルロースや例えば微結晶性セルロースのようなその誘導体、キサンタンガムなどを含む。潤滑は水添のキャスターオイルなどを含む。
【００６７】
好適には、薬学的製剤にキャリアを含まないことである。好適には、その製剤を静脈注射などの注射で投与する。
【００６８】
薬学的組成物の配合は、良く知られており、多数の出版物やテキストで開示されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，特にｐｐ．１５２１−１７１２参照。
【００６９】
添加剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞膜を通過して摂取させるようにする。そのような薬剤は一般的に２本鎖ＤＮＡ分子の細胞摂取を高める。例えば、ある脂質分子はこの目的で開発されている。例えば、商業的に入手可能なトランスフェクション試薬ＤＯＴＡＰ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａ、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍがある。アンチセンスオリゴヌクレオチド摂取を高めるこれらの試薬の比較については、Ｑｕａｔｔｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，２５、（１９９５））及びＣａｐａｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７，８１８（１９９３）を参照。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、リポゾーム内に封入される。例えば、上記のトランスフェクション試薬を使用したリポゾームの生成及び使用法は良く知られている。リポゾームを得る他の方法は、センダイ・ウィルス又は他のウィルスを使用する。リポゾーム技術を利用した、細胞内へのオリゴヌクレオチド浸透を開示する刊行物の例として、例えばＭｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１５６２１−７（１９９８））、Ｋｉｔａ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ８０，５５３−８（１９９９））、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５，１４５５−６１（１９９８））、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．９，２５３−６２（１９９８））、Ｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２８，１４０２−１０（１９９８））、Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６６，８１４−９（１９９８）、及び同ジャーナルｐ．８１９−２０の討論）、Ｂｏｃｈｏｔ ｅｔ ａｌ．（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５，１３６４−９（１９９８））、Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３３，１６９−７３（１９９８）、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．８３，５５２−９（１９９８）、Ｋａｎａｍａｒｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．５，２３５−４６（１９９８））及びこれらの中の参考文献がある。リポゾーム仲介のオリゴヌクレオチド摂取におけるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎの使用は、Ｓｕｇａｗａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．３９，２３７−４４（１９９８））に開示されている。融合誘導陽イオン脂質で再構成されたインフルエンザウィルスエンベロープ（陽イオンビロゾーム）の使用法は、Ｗａｅｌｔｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｃｅｒ，７７，７２８−３３（１９９８））に開示されている。
【００７０】
上記の陽イオン又は非イオン脂質薬剤は、ただ細胞のオリゴヌクレオチド摂取を高めるだけでなく、細胞に摂取されたオリゴヌクレオチドの安定性も向上させる。
【００７１】
本発明はまた、進行性神経筋疾患やＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰生成に伴う他の疾患の治療や予防の方法に関する。この方法とは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドや、本発明又はその好適な実施例の薬学的組成物を治療が必要な患者に投与することである。
【００７２】
最後に、本発明は、ＣＮＳの疾患や病気を治療する治療薬を患者に投与する方法に関するものである。この方法は、上記患者に本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドや上記治療薬を投与することからなる。この治療薬は、本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同時に投与するか、その後に投与する。本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによるＢＢＢの破裂は、治療薬がＢＢＢを通過してＣＮＳへ届くようにし、これは必要なことである。
【００７３】
本発明は、ここに記載した特定な例、処理方法、物質に限定されるものではなく、変形することが出来る。また、本発明の範囲は添付の請求の範囲やその同等物に限定されるものであるので、ここに記載されている専門用語は特定の実施例を説明するために使用したものであり、限定されるものではない。
【００７４】
本明細書やクレイムを通じて、”〜なる”という表現は、言及した整数値や整数値のステップやグループを含めるという意味であり、他の整数値や整数値のステップやグループを含まないというわけではない。
【００７５】
下記の例は、発明者によって本発明の特徴の実施における代表的技術である。これらの技術は、本発明を実行するための例示であり、同業者は本発明の特徴を用いずに様々な改良を行うことが出来る。
【実施例】
【００７６】
実験手順
動物：
ラット：ＥＡＭＧを、Ｊａｃｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した雌ルイスラット（１２０−１５０ｇ）に導入し、ＮＩＨ指針に従ってＨｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆａｃｕｌｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで飼育した。対照ＦＶＢ／Ｎマウスは、（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８ ｉｄ ｉｂｉｄ．）で記載されているように泳がせてストレスを与えた。ＡＣｈＥ−Ｒ過剰発現の遺伝子移植ＦＶＢ／Ｎマウスは、（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７，８６４７−８６５２）で詳述されている。
【００７７】
サル：目的種の雌と雄、１５ヶ月目のカニクイザルを使用した。
オリゴヌクレオチド：ＨＰＬＣ精製されたＧＬＰ品質のオリゴヌクレオチド（キャピラリー電気泳動法での９０％より大きい精製）をＨｙｂｒｉｄｏｎ、Ｉｎｃ．（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＳＡ）から購入した。乾燥オリゴヌクレオチドを、殺菌して２重に蒸留した水に浮遊させ（２４ｍｇ／ｍｌ）、２０度で保存した。ホスホジエステル結合だが３’末端に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドが作られたオリゴヌクレオチドを用意した。この研究で使用される主な配列は以下である。
【００７８】
ｈＥＮ１０１ ５’−ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＣ−３’
（ヒトＡＳ３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
２’−Ｏ−メチル化ｈＥＮ１０１（*はメチル化ヌクレオチド）
５’−ＣＴＧＣＣＡＣＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡ*Ｃ*Ｃ*−３’
ｍＥＮ１０１ ５’−ＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＡＣＣ−３’
（マウスＡＳ３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）（Ｇｒｉｆｍａｎ，Ｍ．，ａｎｄ ｓｏｒｅｑ，Ｈ．（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ７，３５１−９）
ｒＥＮ１０１ ５’−ＣＴＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＣ−３’
（ラットＡＳ３，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）（ＷＯ９８／２６０６２）
ｒＥＮ１０２ ５’−ＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（ＷＯ９８／２６０６２）
ｒ−ｉｎｖＥＮ１０２ ５’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧ−３’
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００２） ｉｄ ｉｂｉｄ）
【００７９】
ｈＥＮ１０１の安定性：ｈＥＮ１０１は、３回の凍結解凍に続きＥＤＴＡを有するヒトの血漿に室温で２時間保存後、又は２０度で１ヶ月の保存後は安定である（本来の濃度の９０％）ことがわかった。室温でリチウムへパリン処理された血液にさらすと、ほぼ３０分程度でｈＥＮ１０１は減少した。
【００８０】
抗体：Ｃ末端ＡＣｈＥ−Ｒに対するラビットポリクロナ−ル抗体を用意して（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００） ｉｂｉｄ）に記載されているように精製した。ヤギポリクロナ−ル抗ＡＣｈＲ（Ｃ−２０，Ｓ．Ｃ．−１４４８）抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのものである。
【００８１】
ＥＡＭＧの導入：上述したように（Ｂｏｎｅｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｕｓｃｌｅ＆Ｎｅｒｖｅ２３，１２０４−８）、トルペドーアセチルコリン受容体（Ｔ−ＡＣｈＲ）を神経毒−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂上でアフィニティ・クロマトグラフィによりＴ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ電気板から精製した。１ｍｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ ＭＩ）を追加したフロイント完全アドジュバントの中で乳状した４０μｇの精製Ｔ−ＡＣｈＲでラットに免疫を与えた。動物の後ろ足に皮下注射し、３０日後に同量の追加免疫注射をした。２回目の注射後にＥＡＭＧが発達しなかった動物に３回目の注射をした。最初の１ヶ月間は１週間ごと、そして追加免疫を与えた後は毎日動物の体重を量り、筋肉の衰弱性を観察した。ラットの臨床症状は、（０）明確な衰弱なし（踏み車走行時間，２３±３分）；軽度（１）１週間で３％より大きい体重減少で１０分より長い踏み車走行；中度（２）弱い握力又は疲れた泣き声に伴う中度衰弱。５−１０％の体重減少で３−５分の踏み車走行；中度―重度（３）中度から重度の衰弱。安静時は猫背の姿勢。頭がうなだれ、前肢指が曲がり、震えながら移動。１０％の体重減少で１−２分の踏み車走行；重度（４）重度の衰弱。泣かず握力もない。１分未満の踏み車走行で１０％より大きい体重減少；（５）死亡。
【００８２】
抗ＡＣｈＲ抗体判定：Ｔ−ＡＣｈＲとラット（Ｒ）ＡＣｈＲに結合した１２５Ｉ−αブンガロトキシン（ＢｇＴ）を使用して、直接放射免疫測定によって血清を分析した（Ｂｏｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）。すべてのＥＡＭＧラットにおいて標準誤差（ＳＥ）±血清平均は、抗Ｔ−ＡＣｈＲ抗体に対して８２．１±１６．０ｎＭ、抗Ｒ−ＡＣｈＲに対して１９．９±１．８ｎＭであり、高い抗Ｔ−ＡＣｈＲ又は抗Ｒ−ＡＣｈＲ力価を見せた。ヒト血清の抗ＡＣｈＲ抗体のレベルを（Ｄｒａｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｂ．（１９９４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ３３０、１７９７−８１０）で開示しているように試験した。
【００８３】
ｎＡＣｈＲの数量化：上記したように、飽和した硫酸アンモニウムによって促進された１２５Ｉ−α−ＢｇＴ結合を使用して、腓腹筋及び脛骨筋のＡＣｈＲ濃度を決定した（Ｂｏｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）。
【００８４】
免疫細胞学：筋肉切片をキシレンで脱パラフィン化し、異なった濃度（１００％、９０％、７０％）のエタノール溶液及びＰＢＳで再水和させた。５００ｍｌの０．０１Ｍクエン酸塩緩衝ｐＨ６．０の中で、レンジ加熱（強さを押さえて１０分後８５０Ｗで急速沸騰）を施して抗原復元を行った。スライドを室温まで冷やし、２回蒸留した水でリンスした。未特定結合を、０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０の入ったＰＢＳの中で４％の正常ドンキー血清によってブロックした。ビオチン化１次抗体を同じ緩衝液で薄め（ラビット抗ＡＣｈＥ−Ｒ（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）及びヤギ抗ｎＡＣｈＲに対しそれぞれ１：１００及び１：３０）、スライドを４度で１晩培養した後、室温で１時間培養した。切片を、同様のブロッキング緩衝液で薄めたアルカリ性ホスファターゼ共役の２次抗体でリンスして、室温で１時間培養した後、さらに４度で１晩培養した。アルカリ性ホスファターゼ基質Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｏｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で検出を行った。スライドは同時に停止液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＢＳ内１ｍＭのレバミゾール，ｐＨ７．２）に移し、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ）で覆って取り出した。
【００８５】
脊髄切片に関し、１次マウス抗ＳＣ３５抗体を上記の１次抗体と同じ緩衝液で薄め（１：１００）、スライドを４度で１晩培養した後、室温で１時間培養した。切片は、同じブロッキング緩衝液で薄めたペルオキシターゼ共益のヤギ抗マウス２次抗体でリンスし、室温で１時間培養後、さらに４度で１晩培養した。ＤＡＢ基質（Ｓｉｇｍａ）で検出を行った。スライドをＩｍｍｕｎｏｍｏｕｎｔ（Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）で覆って取り出した。
【００８６】
筋電図検査：ラットを２．５ｍｇ／Ｋｇのペントバルビタールのｉ．ｐ．注射で麻痺させ、固定し、１組の３Ｈｚの集中針電極を使用して坐骨神経の反復刺激を行った。最大強度での反復神経刺激後、腓腹筋に差し込まれた集中針電極により基準複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を記録した。動物ごとに、反復刺激を２セット行い、５回目対１回目の筋活動電位の振幅における減少（％）を計測した。１０％以上の減少は、神経筋伝達の機能障害と考えられる。
【００８７】
薬物投与：抗ＡＣｈＲ抗体検査用の静脈注射や血液サンプリングは麻酔状態における頸静脈を介して行われる。経口投与に関し、球端を持つ湾曲した強制経口投与用の特別な針が使用された（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ ＩＬ）。Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ−Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入したＭｅｓｔｉｎｏｎ（登録商標）を毎日１ｍｇ／ｋｇ投与した。
【００８８】
踏み車の訓練：ＥＡＭＧラットの神経筋能力を臨床的に計測するため、踏み車分析を行った。動物を２５ｍ／ｍｉｎ（中間の早さ）の電動踏み車に乗せ、疲労するまで走らせた（Ｍｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｔｈｅｒｍ Ｂｉｏｌ ２１，１７１−１８１）。アンチセンス又はＭｅｓｔｉｎｏｎ（登録商標）投与の前後に、ラットが走れる時間を記録した。
【００８９】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：組織を４％のパラフォルムアルデヒドに入れ、７μｍのパラフィン包埋切片に切った。脊髄切片を脱パラフィン化し、シリアルエタノール希釈剤を使用して再水和させ、プロテイナ−ゼＫ（１０μｇ／ｍｌ、室温）を浸透させた。それぞれヒトＡＣＨＥ偽イントロン４又はエクソン６が相補されている、５’ビオチン化された完全な２’−オキシメチル化ＡＣｈＥ−Ｒ又はＡＣｈＥ−Ｓ特有の５０−ｍｅｒ ｃＲＮＡプローブにスライドをさらした（Ｇｒｉｓａｒｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）ｉｄ ｉｂｉｄ．）。３７５ｍＭのクロリドＮａ及び３７．５ｍＭのクエン酸塩Ｎａ、ｐＨ４．５内で１０μｇ／ｍｌプローブ、５０μ／ｍｌイーストｔＲＮＡ、５０μｇ／ｍｌへパリン、及び５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション混合液を用い、５２度で１晩かけてハイブリダイゼーションを行った。サル切片用に、プローブはヒトＡＣｈＥ−Ｒ配列に応じて作られた；ラット切片用には、マウス配列に応じて作られた。スライドを洗浄して混成していないプローブを取り除き、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０及び２ｍＭのレバミゾールを含む１％のスキムミルク、未特定染色を抑制するアルカリ性ホスファターゼ阻害薬でブロックし、ステプタビジン・アルカリホスファターゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で培養した。検出用に、Ｆａｓｔ Ｒｅｄ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用した。ＤＡＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で核を見えるようにした。Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ４．０（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアを利用して、顕微鏡の映像で分析した。
【００９０】
血清分析：ＥＡＭＧラット及びＭＧ患者から得た血液サンプルを、ＡＣｈＥの触媒活性測定（Ｓｈａｐｉｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）同様、（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ）で開示されているような不変性ゲル電気泳動法にさらした。血清サンプル中のブチリルコリンエステラーゼ活性をブロックするために、ｉｓｏ−ＯＭＰＡ（テトライソプロピルピロホスホルアミド，５ｘ１０−５μＭ）を使用した。ポリアクリルアミドゲルの活性染色用に、５・１０−６Ｍのｉｓｏ−ＯＭＰＡを使用した。
【００９１】
実験例１ ＥＡＭＧラットの血液中及び筋肉内のＡＣｈＥ−Ｒ蓄積
発明者たちによって示されたように、ＡＣｈＥ−Ｒ変異体は、４量体シナプス酵素よりも早く不変性ポリアクリルアミドゲル上を移動（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ｉｄ ｉｂｉｄ）し、ＭＧ患者の血清中に存在する（ＷＯ０１／３６６２７）。同様に、ＥＡＭＧラットは健康ラットに比べ、血清ＡＣｈＥ−Ｒが異常に多いことが免疫ブロット分析で確認された（図７）。
【００９２】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の発現同様、代替的ＡＣｈＥ変異体の発現を対照及びＥＡＭＧラットで実験した。ｎＡＣｈＲに対する抗体を利用した定量的免疫学的分析によって明らかになったように、ＥＡＭＧラットの筋切片においてｎＡＣｈＲの減少が見られた（図８Ｂ、１及び２）。免疫染色により、対照と比べ、筋ｎＡＣｈＲは、１０匹の軽度動物（症状１−２、実験手順参照）で通常値から４８％±７％、１０匹の重度ラット（症状４）において７５±５％の減少が見られ、この動物モデルの筋無力症が証明された（図８Ｂ，１及び２）。ＡＣｈＥ−Ｒを選択的に検出する（Ｓｔｅｒｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）多クローン抗血清を利用した免疫組織化学の染色により、対照ラットのすべてではないが、いくつかの筋肉繊維において陽性であることがわかった。同様のパターンが、不活性逆指向オリゴヌクレオチドｒ−ｉｎｖＥＮ１０２での治療下で見られた（図８Ｂ、３）。ＥＡＭＧラット（図８Ｂ，４）において、ＡＣｈＥ−Ｒの染色は、シナプス変異体のシナプス後クラスター分散（Ｒｏｓｓｉ，Ｓ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｔｕｎｄｏ，Ｒ．Ｌ．（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ２６８、１９１５２−９）とは対照的に、イソ型の性質である分散細胞質局在性共に、一様に分散したＡＣｈＥ−Ｒを示した。ＥＡＭＧ及び健康、未治療及びｒ−ｉｎｖＥＮ１０２治療のラットにおいて、同様な筋肉ＡＣｈＥ−Ｓの発現レベル及び細胞分散が見られた。
【００９３】
変異体選択プローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、治療をしていない健康ラット、及びｒ−ｉｎｖＥＮ１０２治療したＥＡＭＧラットのシナプス後筋肉においてＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡが存在しているとわかった（図８Ｂ、５及び６）。反対に、健康なラットにおいては、より薄くて拡散したＡＣｈ−Ｓ ｍＲＮＡ転写標識がみられ、一方、ＥＡＭＧラットの三頭筋においてより顕著なＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ標識がみられ、ｒ−ｉｎｖＥＮ１０２治療に影響されていなかった（図８Ｂ、７及び８）。密集したクラスター細胞核の中でリッチ領域の蓄積は、以前に行ったシナプス後領域についての観察と一致している（Ｒｏｓｓｉ ａｎｄ Ｒｏｔｕｎｄｏ（１９９３） ｉｄ ｉｂｉｄ）。これらのデータは、ＥＡＭＧラットの筋肉内におけるＡＣｈＥ−Ｒの選択的過剰発現を示し、ＭＧ病態生理学上でのこの酵素変異体の役割についての見解を強めた。
【００９４】
実験例２ ｒＥＮ１０１に反応した筋肉内のＡＣｈＥ−Ｒ及びＡＣｈＥＲ ｍＲＮＡレベル
ＡＣｈＥ−Ｒの溶性及び分泌性は、シナプス後細胞膜に到着する前に受容体活性を制限して、アセチルコリンを低下させると思われていた。この仮説をテストするため、ＡＣｈＥ−Ｒ生成を選択的に抑制することができるｒＥＮ１０１アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した（Ｇａｌｙａｍ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ １１，５１−５７）。健康ラット及び筋肉内でｎＡＣｈＲレベルが低下しているＥＡＭＧラットに２５０μｇ／ＫｇのｒＥＮ１０１を１回ｉ．ｖ．投与した後、ＡＣｈＥ−Ｒ抑制を調べた。免疫組織化学染色により、健康なラットにおいてもＥＡＭＧラットにおいても、ＡＣｈＥ−ＳではなくＡＣｈＥ−Ｒが明らかに筋肉から減少しているとわかった（図８Ｃ，３，４，データは示されていない）。治療していない動物とｒ−ｉｎｖＥＮ１０２を投与した動物と同様に、受容体標識パターンは、健康的なラットで高いままであり、ＥＡＭＧ動物は低いままだった（図８Ｂ、１及び２と図８Ｃ、１及び２を比較）。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、核のシナプス後クラスターサイトに限られるＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ標識が、ｒＥＮ１０１により僅かに影響を受けることを示し、神経筋伝達はこの治療で影響を受けないことを示した（図８Ｃ，５及び６）。反対にｒＥＮ１０１は、健康なラット及び筋無力症ラット両方ともからＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ標識をほとんど検出の限界まで減少させた（図８Ｃ，７及び８）。
【００９５】
実験例３ ＥＡＭＧラットにおいて正常ＣＭＡＰを復元するＡＣｈＥ−Ｒ抑制
免疫ブロット法のデンシトメトリーによる数量化は、ＥＡＭＧにおける血清ＡＣｈＥ−Ｒの増加、及び２５０μｇ／Ｋｇのｒ−ｉｎｖＥＮ１０２ではなくｒＥＮ１０１の１回ｉ．ｖ．投与の有効性を２４時間後の血清レベルの減少により証明した（図９Ａ）。この抑制の生理学上効果を評価する為、腓腹筋からの複合筋活動電位（ＣＭＡＰｓ）を記録した。ＥＡＭＧラットにおいて、３Ｈｚの反復刺激の間に、健康なラットには決して見られないＣＭＡＰの減少があった。基準値の減少、第５回目及び１回目の誘発電位におけるパーセンテージの相違は、健康なラットの間で４．０±０．９％であるのに比べ、１０％から３６％（平均±ＳＥＭ＝１３．０±２．５％、図９Ｂ、差し込み図）であった。ＭＧ患者の一般的な治療は、受容体を活性させる閾値までＡＣｈレベルを上げるアンチコリンエステラーゼの投与である。したがって、ネオスチグミン臭化物（Ｐｒｏｓｔｉｇｍｉｎｅ（登録商標），７５μｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ．投与した。これは、治療していない動物の第１回目誘発電位８７．６％からこのレベル（第１回目の誘発電位）の１２０％以上（つまり１０７．４％）まで、ＥＡＭＧラットのＣＭＡＰ減少をすばやくしかも効果的に調整した。コリンエステラーゼのブロック効果は、投与後１５分で効き始め、２時間続いた後、ＣＭＡＰ値が基準値に戻った（図９Ｂ）。
【００９６】
すべてのＡＣｈＥ変異体を防止するアンチコリンエステラーゼとは異なり、ｒＥＮ１０１は選択的に筋肉ＡＣｈＥ−Ｒ生成を抑制することが示された（Ｌｅｖ−Ｌｅｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）ｉｄ ｉｂｉｄ）。それゆえ、ｒＥＮ１０１治療したＥＡＭＧラットのＣＭＡＰの安定回復は、筋無力症表現型の特徴である神経筋低下の原因においてＡＣｈＥ−Ｒの役割を証明する。この考えをテストするために、ｒＥＮ１０１を１０−５００μｇ／Ｋｇ（２から２０ｎｍｏｌ／ラット）の範囲でｉ．ｖ．投与した。ｒＥＮ１０１は、健康ラットのＣＭＡＰに影響を及ぼさなかったが、１時間以内に安定なＣＭＡＰ率を回復した。（図９Ｂ、差し込み図，９Ｃ，表１）。ＣＭＡＰの正常化は、向上した運動性、真っ直ぐな姿勢、強くなった腕力、移動時の振せん減少を伴う。
【００９７】
【表１】
ＣＭＡＰ調整の程度と期間は投与量による。例えば、５００μｇ／Ｋｇは７２時間以上、基準値の１２５％までＣＭＡＰを調整し、一方、５０μｇ／Ｋｇはたった２４時間しか効果がない。ｒＥＮ１０２、つまりｒＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ特有な配列をターゲットとしている３’保護ＡＳ−ＯＮ（ＡＳ１とも示されている）（Ｇｒｉｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｏｒｅｑ（１９９７）ｉｄ ｉｂｉｄ）は、ＥＡＭＧラットのＣＭＡＰ減少を同様に調整し、この効果の貢献要素としてＡＣｈＥ−Ｒの関連性を確認した。同程度量のｒ−ｉｎｖＥＮ１０２は、筋肉機能を向上せず、ＡＳ−ＯＮ治療結果の特異性を証明した（表１）。投与反応曲線は、投与後５時間まで、ｒＥＮ１０１が１０μｇ／Ｋｇ未満のＩＣ５０で可飽和反応を引き起こしたと明らかにした。この効果は、長い持続性及び濃度に依存する効果と重なることを表し、研究の範囲において不飽和を証明した（図９Ｄ）。この現象は、ｒＥＮ１０１による安定ＣＭＡＰ回復下において、変質筋肉及び／又は神経筋接合部の特性を反映するであろう。
【００９９】
実験例４ ＥＡＭＧラットのスタミナを向上させるための、ＡＣｈＥ−Ｒ蓄積を防止するアンチセンス
健康ラットを２５ｍ／ｍｉｎの踏み車に置き、疲れていると明らかにわかるまで２３．０±３．０分間走らせた。２５０μｇ／ＫｇのｒＥＮ１０１投与５時間後から少なくとも２４時間、ＥＡＭＧラットの踏み車走行は向上した。病状２、３、４の動物はそれぞれ２４７±３５、１７９±２１、及び３２±６秒だったが、４８８±５８、５００±１９３、及び２１２±５９秒と走行時間が長くなった（各グループから６−９匹の動物の平均値）。反対に、健康ラットはｒＥＮ投与で明らかな変化は見られなかった（図１０）。
【０１００】
他は、２’−オキシメチル保護ＡＳ−ＯＮ薬剤の経口投与の有効性を示した（Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．（１９９７）Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９，１０７−１１９）。それゆえ、発明者たちは、ＥＡＭＧモデルでこの方法をテストした。発明者自身の発見に基づき、５０μｇ／ＫｇのｒＥＮ１０１の投与を選択し、ＥＡＭＧラットに１日１回強制経口投与した。その後１、５、２４時間後にＣＭＡＰを測定した。この投与量は、２５μｇ／Ｋｇのｉ．ｖ．投与と同じ効果であった（表１、図９、図１３）。ｒＥＮ１０２の経口投与もＣＭＡＰ減少を反転させたが、その効果はｒＥＮ１０１と比較していくらか遅かった。ピリドスチグミン（１０００μｇ／ｋｇ）の経口投与は数時間までＣＭＡＰを回復させたが、ｒ−ｉｎｖＥＮ１０２に明らかな効果はなかった（表１）。
【０１０１】
実験例５ ＥＡＭＧラットへのヒトＥＮ１０１の経口投与
ヒトＥＮ１０１（ｈＥＮ１０１）（１回の投与量０．２５μｇ／ｇ）を病状が中度であるＥＡＭＧ（スコア２．５−３．５）のラットに経口投与した。結果は表１に要約してある。治療後の時間及び踏み車の走行時間に注目した。筋肉衰弱度を評価するたびに動物を検査した。ラットの臨床状態は、（０）衰弱なし（踏み車走行２３±３秒）；軽度（１）１週間で３％より大きい体重減少で１０分より長い踏み車走行；中度（２）弱い握力又は疲れた泣き声を伴うの中度衰弱。５−１０％の体重減少で３−５分の踏み車走行；中度−重度（３）中度から重度の衰弱。安静時は猫背の姿勢。頭がうなだれ、前肢指が曲がり、震えながら移動。１０％の体重減少で１−２分の踏み車走行；重度（４）重度の衰弱。泣かず握力もない。１分未満の踏み車走行で１０％より大きい体重減少；（５）死亡。各行は個々のラットを表す。治療後すべてのラットにおいて臨床的スコア（括弧内）が時間経過と共に下がり、ほとんどの動物において５時間後及び２４時間後の走行時間が著しく長くなり、テストした動物うち２匹は４８時間後においても長くなった。
【０１０２】
【表２】
これらの結果はラットＥＮ１０１（踏み車の例を参照、上部）のように、本発明のヒトＥＮ１０１アンチオリゴデオキシヌクレオチドが、ＥＡＭＧを導入したラットの筋肉スタミナを向上させたことを示した。
【０１０４】
実験例６ ラット動物モデルにおけるｈＥＮ１０１及びｒＥＮ１０１の比較分析
ｈＥＮ１０１の毒性度同様、電位有効性を、産まれてから４週間目のＣｒｌ：ＣＤラットで研究した。１２匹の動物（雌６匹、雄６匹）に、０．０（生理食塩水のみ）、０．５０又は２．５０μｇ／ｇ／日のｈＥＮ１０１を経口投与（ｏ．ｇ．）、０．５０μｇ／ｇ／日のｒＥＮ１０１をｏ．ｇ．投与、又は０．５０μｇ／ｇ／日のｒＥＮ１０１又はｈＥＮ１０１をｉ．ｖ．投与した。投与していない対照グループもある。７日間動物の全体毒性信号を検査した：死亡率、体重、食料消費、眼科学、血液学（末梢血）、血液化学。７日後に死亡させ、解剖して肉眼でわかる病変や組織の重さを検査した。壊死又は細胞死を明らかにするために、脳（小脳、大脳、中脳、骨髄）、心臓（耳、腹の領域）、腎臓（皮質、骨髄、乳頭領域）、肝臓（すべての主な葉）、肺（気管支を含む２つの主な葉）、リンパ節（下顎及び腸間膜）、脊髄（頸部、腰部、胸のレベルにおける横断面及び縦断面）、盲腸、結腸、十二指腸、回腸、空腸、食道、直腸、脾臓、腹（角化、腺、洞）の特定部分をヘマトキシリン・エオジンによって染色した。
【０１０５】
下顎リンパ節を検査し、ＥＮ１０１がＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡに及ぼす影響を調べた。生理食塩水を投与した対照ラットと比べ、ｒＥＮ１０１（経口またはｉ．ｖ．）またはｈＥＮ１０１（ｉ．ｖ．）は、これらのリンパ節内でＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルの低下において一貫性はなかった（データは示さず）。反対に、ｒＥＮ１０１（経口投与又はｉ．ｖ．）又はｈＥＮ１０１（ｉ．ｖ．）の投与は、下顎リンパ節内でＡＣｈＥのＡＣｈＥ−Ｓシナプス変異体の発現に影響しなかった（データは示さず）。かくして、シナプス変異体の発現に影響を及ぼさず、つまり、コリン作用性伝達に不利に影響を及ぼさずにＡＣｈＥ−Ｒ変異体を抑制するために本発明のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用することが出来る。
【０１０６】
実験例７ ＥＡＭＧ病態生理学の過程を変化させるＡＣｈＥ−Ｒ抑制
例５に示したように、アンチコリンエステラーゼとは違い、ｒＥＮ１０１はＣＭＡＰを長期間安定させた。これにより、発明者たちは、コリン作用性不安定がＥＡＭＧの性質である生理学上の悪化の原因となるかをさらに検査出来るようになった。最初、１日１回、５日間、ｒＥＮ１０１をラットに投与し、毎回投与前にＣＭＡＰを検査した。正常のＣＭＡＰを回復するようなｒＥＮ１０１の有効性及びＣＭＡＰ値に関する動物内変動を減少する効力は、ピリドスチグミンのレベルと同様だった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。しかしながら、ピリドスチグミンは反応がより早く（表１）、ｒＥＮ１０１はより長い持続性を示した。ｒＥＮ１０１の連日経口投与及びｉ．ｖ．投与は、治療の過程に渡り、ＣＭＡＰを安定させた（図１１Ｂ）。反対に、ピリドスチグミンの効果は数時間以内になくなり、筋肉状態が明確に変動した（表１、図１１）。ピリドスチグミンを毎日投与した６匹の動物のうち、５匹は５日間の実験中に死亡した。反対に、ｒＥＮ１０１を１日１回ｏ．ｇ．投与した８匹の動物のうち、６匹は５日間生き残った。この明白な相違は、反復麻酔及びＣＭＡＰ測定に対するＥＡＭＧラットの影響を反映したものだろう。これらの付加的ストレスを防いでＥＡＭＧ病態生理学上のアンチセンス治療の効果を評価するために、発明者たちは、中度の動物を１日１回の経口投与で１ヶ月間治療した。その間、測定は最小限なものとした。ｒＥＮ１０１を毎日経口投与したＥＡＭＧラットは、ピリドスチグミンや生理食塩水を投与した動物と比較し、生存度、臨床状態、踏み車走行において著しい向上が見られた（図１２；４週間生存に対しＰ＜０．０４１、Ｆｉｓｈｅｒ精密テスト、ＡＳ−ＯＮ対他の治療）。一方方向反復測定ＡＮＯＶＡは、他のすべての測定に対してＰ＜０．０５だった（４週間後のＡＳ対他の治療）。臨床症状におけるｒＥＮ１０１の効果もまた、体重変化によって裏付けられた。生理食塩水を投与したグループ及びＭｅｓｔｉｎｏｎ投与したグループは、それぞれ１３．５及び１１ｇ減少し、ｒＥＮ１０１投与した動物は、投与期間の間に平均１３ｇ増加した。かくして、なにも投与していない動物及びピリドスチグミンを投与した動物が悪化した状態と同じ状況の下、ｒＥＮ１０１の連日投与は中度から重症のラットのＥＡＭＧにおいて長期的変化をもたらした。
【０１０７】
発明者たちは、遺伝子発現のレベルで慢性神経筋不安定の結果を評価するための研究材料としてＭＧとＥＡＭＧを利用し、ＭＧ及びＥＡＭＧにおいてＡＣｈＥ−Ｒ変異体が全身的に向上することを確認した。さらに、ＡＣｈＥ−Ｒのアンチセンス抑制が、反復神経刺激に対するＮＭＪ反応を正常化させ、筋肉力を向上させ、食べられないほど衰弱していた動物の健康を回復さることも示した。これらの観察は、ＡＣｈＥ−ＲがＭＧ病態生理学における直接的原因になるという発明者の考案を支持し、ＮＭＪの不安定なコリン作用性機能に対する長期間のｍＲＮＡ治療の原理の評価を求めるものである。
【０１０８】
実験例８ カニクイザルへのｈＥＮ１０１経口投与
この目的のための飼育した６匹（雌３匹、雄３匹）の１５ヶ月目（青年）のカニクイザルで実験を行った。このサルを雄雌対の３つのグループ（１、２、３）に別けた。０．１５及び０．５０μｇ／ｇ／日でｈＥＮ１０１を７日間、グループ１、２にそれぞれｏ．ｇ．投与した。また、グループ３には、０．５０μｇ／ｇ／日でｈＥＮ１０１を７日間ｉ．ｖ．投与した。
【０１０９】
１２時間以上かけ、第２回目の投与日に得た血漿サンプルで各投与量のトキシコキネティック特徴を調査した。この調査において、以下の要素によって動物の全体毒性サインを７日の治療の間チェックする：死亡率、体重、食物消費、心電図記録、血圧、血液学（末梢血）、血液化学。７日目にサルを死亡させ、解剖して目でわかる病変や組織重量を調べた。壊死又は細胞死を明らかにするために、脳（小脳、大脳、中脳、骨髄）、盲腸、結腸、十二指腸、心臓（耳、腹の領域）、回腸、空腸、腎臓（皮質、骨髄、乳頭領域）、肝臓（すべての主な葉）、肺（気管支を含む２つの主な葉）、リンパ節（下顎及び腸間膜）、食道、直腸、座骨神経、骨格筋（腿）、脊髄（頸部レベルにおける横断面及び縦断面）、脾臓、腹（胴体、洞）の特定部分をヘマトキシリン・エオジンによって染色した。
【０１１０】
これらの臨床的調査において、いかなる治療方法によっても毒性影響が見られなかった。死亡解剖で、各グループ２匹の動物のうちどちらかにおいて、治療に関係していると思われるお腹胴体のわずかな治療衰退及び静脈注射の場所の血管周囲の組織炎症以外、治療に関係した効果は見られなかった。
【０１１１】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションでパラフィン包埋７μｍ膵臓部を検査し、ＡＣｈＥ−Ｒ及びＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡのレベルを測定した。３つの投与方法（０．１５μｇ／ｇ／日及び０．５０μｇ／ｇ／日の経口及び０．５０μｇ／ｇ／日のｉ．ｖ．）において、ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ（図１４）において明らかな減少は見られなかった。しかしながら、０．１５（経口）から０．５０（経口又はｉ．ｖ．）までｈＥＮ１０１の連日投与量を増加させると、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡに明らかな減少がみられ、ｉ．ｖ．投与のほうがより効果的であった。
【０１１２】
サル脊髄からのＡＣｈＥ−Ｒが陽性である部分を分析し、細胞体直径とＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞率の関係を見出した（図１５）。細胞を胴体直径に応じて３つに別け、各部分からのＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞率を評価した。ＥＮ１０１（１５０μｇ／ｋｇ／日）の低濃度治療は、野生サルと比較して、小さなＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞（直径７０μｍ未満）を増加させた。これは、ＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルを上げると知られている注射ストレス反応によるものであろう（Ｋａｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９８）。高濃度（５００μｇ／ｋｇ／日）のＥＮ１０１のｉ．ｖ．又はｐ．ｏ．投与は、低濃度（ｐ＜０．０５、生徒の検査）と比較してＡＣｈＥ−Ｒ陽性細胞を減少させた。この減少は、直径が４０−７０μｍの細胞体の神経より、小さなサイズ（２３−４０μｍ）の神経においてより顕著なものであり、大きなサイズ（直径＞７０μｍ）の神経において減少は見られなかった（図１５）。標識された小さいサイズ（直径２３―４０μｍ）の神経及び中間サイズ（４０−７０μｍ）の神経に関し、低から高濃度ｈＥＮ１０１への経口投与、さらにｉ．ｖ．投与において細胞率の減少が目立った。大きな細胞（＞７０μｍ）に関しては、ｈＥＮ１０１の認められる効果は見られなかった。我々は、ＡＣｈＥ−Ｒ発現のアンチセンス抑制の有効性を決定する細胞の大きさの機能的相互関係を発見しなければならない。これは、ＥＮ１０１が、介在ニューロンが運動ニューロンへ入るときにストレスで起こる障害を防ぎ、かくして例えば術後麻痺を防止することを示唆する。
【０１１３】
実験例９ サル血漿のＡＣｈＥ活性のｈＥＮ１０１抑制
ｈＥＮ１０１の２日目の投与１２時間後にサル血漿を取りだし保管した。ｉｓｏ−ＯＭＰＡの存在又は不在下において（選択的ブリチルコリンエステラーゼ、ＢＣｈＥ、阻害薬）、血漿コリンエステラーゼ活性をアセチルコリンの加水分解速度を測定する分光測光法で測定した（アセチルコリンの加水分解を測定するＥｌｌｍａｎ分析で測定した）（Ｅｌｌｍａｎ、Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９６１），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７，８８−９５）。血清ＢＣｈＥにより、全体の活性は大体変わらなかった（図１６Ａ）。１×１０−５Ｍのｉｓｏ−ＯＭＰＡの存在下で測定したとき、ＡＣｈＥ活性は投与後５時間以内に増加した。１５０μｇ／Ｋｇのもとで観察したこの増加は、５００μｇ／ｋｇのｈＥＮ１０１の高投与によって効果的に抑制され弱力化した。また、この投与としては、ｉ．ｖ．投与がより効果的であった（図１６Ｂ）。
【０１１４】
実験例１０ ラット脊髄神経におけるｒＥＮ１０１の発現ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡへの影響
サル脊髄神経へのｈＥＮ１０１の影響とは反対に、マウスプローブを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる評価において、ｒＥＮ１０１はラット脊髄のＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを抑制しない（図１７）。陽性の細胞数にも染色強度にも明らかな変化はなかった。この結果の説明としては、少なくとも選択した実験状態において、ＣＮＳを孤立させる血液脳関門が、ラットよりサルのほうがより浸透させるからである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｄｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ５５０４０；Ｓｏｒｅｑ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（２４），９６８８−９６９２（１９９０））、及びコーディング配列７９５−５’から３’−８１４（影）のヌクレオチドをターゲットとした、ヒトＥＮ１０１（ｈＥＮ １０１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を示す。
【図２Ａ】ヒトＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の様々な薬学的及び化学的性質を示す。オリゴヌクレオチドの内部構造、及びその構造を分解する為に必要なエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の予測を示す。
【図２Ｂ】ヒトＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の様々な薬学的及び化学的性質を示す。塩基組成物、及び相補的ｍＲＮＡを使用したそのハイブリッドの融解温度の予測を示す。
【図３】マウスＡＣｈＥ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ５６５１８；Ｒａｃｈｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｅｕｒｏｎ ５（３），３１７−３２７）、及びコーディング配列６３９−５’から３’−６５８（影）のヌクレオチドをターゲットとしたマウスＥＮ１０１（ｍＥＮ１０１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を示す。
【図４Ａ】マウスＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の様々な物理的及び化学的性質を示す。オリゴヌクレオチドの内部構造、及びその構造を分解するために必要とされるエネルギー（ｋａｌ／ｍｏｌ）の予測を示す。
【図４Ｂ】マウスＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）の様々な物理的及び化学的性質を示す塩基組成物、及び相補ｍＲＮＡを使用したそのハイブリッドの融解温度の予想を示す。
【図５】ラットＡＣｈＥ ｍＲＮＡ（一部、２０６６のヌクレオチド）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｓ５０８７９；Ｌｅｇａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６０（１），３３７−３４６）、及びコード配列５１−５’から３’−７０（影）のヌクレオチドをターゲットとしたラットＥＮ１０２（ｒＥＮ１０２，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５），及びコード配列６３９−５’から３’−６５８（影）のヌクレオチドをターゲットとしたラットＥＮ１０１（ｒＥＮ１０１，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を示す。
【図６Ａ】ラットＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の様々な物理的及び化学的性質を示す。オリゴヌクレオチドの内部構造及び、その構造を分解するために必要なエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の予測を示す。
【図６Ｂ】ラットＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の様々な物理的及び化学的性質を示す。塩基組成物、及び相補的ｍＲＮＡを使用したそのハイブリッドの溶解温度の予測を示す。
【図７】ＥＡＭＧラットの免疫反応性ＡＣｈＥ−Ｒを示す。ラットの血清を変性でないポリアクリルアミドゲル内で分離させ、そのゲルを検査して免疫反応性ＡＣｈＥ−Ｒを調べた。ＥＡＭＧラットは、対照ラットと比べ、すばやく移動するｒＲ変異体が相当高いレベルで見られた。
【図８】ＥＡＭＧラットの筋肉における過剰ＡＣｈＥ−Ｒ発現を示す。図８Ａ：筋肉内において発現したＡＣｈＥ ｍＲＮＡ転写を示す。末梢エンハンサーにおいて機能的なグリココルチコイド反応性エレメント（ＧＲＥ）を持つストレスに反応する哺乳類ＡＣＨＥ遺伝子、及び筋肉内に発現するその２つのｍＲＮＡ転写を示す。因みに、エクソン６はシナプス性転写ＡＣｈＥ−Ｓに特有なものであり、偽イントロン４’は、ストレスで誘発されたＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡにおいてのみ表現されるものである。抗体は、ＡＣｈＥ−Ｒプロテインを検出するために供給される、偽イントロン４’で誘発されたＣ末端ペプチドをターゲットとし、ｃＲＮＡプローブはエクソン６をターゲットとし、偽イントロン４’は、その２つの転写を標識する（星印）。図８Ｂ：ＥＡＭＧ筋肉における激減ｎＡＣｈＲ及び過剰ＡＣｈＥ−Ｒを示す。何も治療していないラットと同様、不活性で逆（ｒ−ｉｎｖ ＥＮ１０２）オリゴヌクレオチドで治療された正常ラット及びＥＡＭＧラットからの三頭筋のパラフィン包埋部分の免疫組織化学染色を示している。染色は、ｎＡＣｈＲ（１，２）及びＡＣｈＥ−Ｒ（３，４）に対するポリクローナルラビット抗体を用いた。免疫陽性部分は赤色に染まっている。因みに、ＥＭＡＧにおいて、ＡＣｈＥ−Ｒプロテインは著しく高められ、ｎＡＣｈＲは劇的に減少した。ＡＣｈＥ−Ｒ又は−Ｓ ｍＲＮＡに特有なプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞核を示すためのＤＡＰＩ（白）を用いて、ＲＮＡを赤く染色した。対照動物ではなく、ＥＡＭＧにおけるＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの原子核内の蓄積が目立っている（５，６）。ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡは、対照及びＥＡＭＧラット両方の原子核内部分において強調している（７，８）。図８Ｃ：ＥＮ１０１治療を示す。逆配列（図８Ｂ参照）で治療したラットと比較し、ＥＡＭＧラットにおいて、ＥＮ１０１はＡＣｈＥ−Ｒ（１，２）及びＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ（５，６）のレベルを減少させたが、ｎＡＣｈＲ（３，４）及びＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ（７，８）に影響はなかった。
【図９】ＡＣｈＥ−Ｒの抑制下における、標準ＥＡＭＧ筋肉の電気生理現象を示す。図９Ａ：図７Ｂの場合と同様に、ｒＥＮ１０１又はｒ−ｉｎｖＥＮ１０２で治療した健康ラット及び重病のＥＡＭＧラットの血清中において免疫反応性ＡＣｈＥ−Ｒを検査した。密集度は棒グラフで示されている。図９Ｂ：動物（各グループにおいて少なくとも６匹のラット）にＡＣｈＥ阻害薬ネオスチグミン（７５μｇ／ｋｇ）をｉ．ｐ注射し、基準に対するＣＭＡＰ率を測定した。治療前のＥＡＭＧラットの平均ＣＭＡＰ率は最初の脱分極の８７±２．５％であり、ｒＥＮ１０１治療した動物の平均ＣＭＡＰ率は、１０７．４±３．８％（差し込み図）だった。図９Ｃ：動物（各グループで少なくとも６匹のラット）を様々な量のｒＥＮ１０１で治療した。治療（１０−５００μｇ／ｋｇの投与量）は、７２時間後までＣＭＡＰ減少を復活させた。因みに、投与量の増加は、より長い持続性を見せた。図９Ｄ：投与量反応。ＥＮ１０１濃度に対するＣＭＡＰ反応を示す。１時間目及び５時間目においてはっきりとした２つの効果が見られる。大幅な増加は低ＥＮ１０１濃度（ＩＣ５０＜１０μｇ／ｋｇ）に依存するもので、より長く持続するというとても低い親和性効果に重ね合わされる。
【図１０】ラットＥＮ１０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）で改善した筋無力症ラットのスタミナを示す。様々な重症度の自己免疫重症筋無力症（ＥＡＭＧ）ラットと健康的なルイスラットを疲れるまで電気的に回る踏み車（２５ｍ／ｍｉｎ、差し込み図）で走らせた。２５０μｇ／ｋｇのｒＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与前と２４時間経過した後にラットが走れる平均時間（秒±ＳＥＭ）を示す。因みに、ＥＡＭＧラットの走行時間は病気の重症度に応じて減少し、ｒＥＮ１０１の治療後は向上した。
【図１１】ｒＥＮ１０１を経口投与したＥＡＭＧラットの低下しているＣＭＡＰ反応の安定的逆転を示す。１日１回、４日間、ラットにｒＥＮ１０１を静脈注射（２５μｇ／ｋｇ）又は強制経口投与（５０μ／ｋｇ）、又はピリドスチグミン（１０００μ／ｋｇ）を強制経口投与した。１回目の投与後１時間と５時間後、及びその後は投与前（２４時間ごと）にＣＭＡＰ率を計算した。図１１Ａ：１回投与。経口投与したピリドスチグミン（ｎ＝４）とｒＥＮ１０１（ｎ＝８）は、低下していたＣＭＡＰ反応を１時間以内に緩和した。ピリドスチグミンの投与２４時間後には、ラットの筋肉内においてＣＭＡＰ率が基準値に低下した。反対にｒＥＮ１０１を投与したラットに低下は見られなかった。図１１Ｂ：連日投与。グラフは、ｒＥＮ１０１のｉ．ｖ．投与（２５μｇ／ｋｇ，ｎ＝４）と比較した、経口投与（５０μｇ／ｋｇ，ｎ＝８）による筋肉機能の向上を示す。因みに、ｒＥＮ１０１の連日投与は、ＣＭＡＰ低下を安定的に長期間緩和した。２４時間ごとのピリドスチグミン連日投与は、２回目の投与前に基準値へと低下し、ＥＮ１０１よりも明らかにＣＭＡＰ改善が短かった。
【図１２】長期間のｒＥＮ１０１治療によるＥＡＭＧ変化を示す。図１２Ａ：生存。同様な症状、同じ数の動物にも関わらず、毎日１回ｒＥＮ１０１（５０μｇ／ｋｇ，毎日，ｐ．ｏ．）を投与した動物は、ピリドスチグミン（１０００μｇ／ｋｇ）を投与した動物より生存率が高かった。図１２Ｂ：臨床状況。投与したグループから生存している動物の臨床状況（実験手順で定義する）の平均値を示す。ｒＥＮ１０１で治療した動物の症状は向上したのに比べ、生理食塩水及びピリドスチグミンで治療した動物は症状は悪化した。図１２Ｃ：スタミナ。ｒＥＮ１０１及びピリドスチグミンを投与した動物の平均走行時間を示す。投与前、ＥＡＭＧラットは重症な動物だった（臨床症状４）。
【図１３】ＥＮ１０１活性のモデルを示す。神経筋接合部において、運動ニューロン末端（上部）からシナプス間隙へと放たれたアセチルコリン（ＡＣｈ）は、筋肉のシナプス後細胞膜へと向かう。そこでｎＡＣｈＲと相互に作用し、内部イオン電流を起こして筋肉活動電位を誘発する。ＡＣｈは、次にシナプス結合ＡＣｈＥ−Ｓによって加水分解される。シナプス後筋肉核（楕円）は、第１のＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ転写に加え、代替的３’末端を有する通常にはないＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを作り出す。この転写は、水溶性分泌ＡＣｈＥ−Ｒモノマーに変える。ｎＡＣｈＲに対する筋無力自己免疫抗体は、ＡＣｈの不足状態を擬態しながら活動電位の開始を防ぐ。コリン作用的不安定性は、筋肉疲労を導くＡＣｈＥを破壊するＡＣｈＥ−Ｒ蓄積を引き起こす。化学的なアンチコリンエステラーゼ（円）は、選択せずにＡＣｈＥ−Ｓ及びＡＣｈＥ−Ｒ両方をブロックし、一時的にＡＣｈレベルを高め、さらにＡＣｈＥ−Ｒを活発に過剰生成する。反対にアンチセンス薬剤ＥＮ１０１は選択的にＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを破壊し、ＡＣｈＥ−Ｓ及び正常の神経筋伝達を維持しながらＡＣｈＥ−Ｒ合成を防止する。
【図１４】ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡではなく、ニューロンのＡＣｈ−Ｒ ｍＲＮＡのｈＥＮ１０１抑制を示す。ＡＣｈＥ−Ｒ又はＡＣｈＥ−Ｓ ｃＲＮＡプローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに続き、ｈＥＮ１０１を投与したサルの脊髄の代表的部分を示す。ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡは減少したが、ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡは変化しなかった。ｈＥＮ１０１の量を増加したｏ．ｇ．投与は、より効果的にＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡを抑制した。ｉ．ｖ．での投与量増加は、ｏ．ｇ．よりも効果的であることが示されている。
【図１５】ニューロンのＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡレベルのｈＥＮ１０１抑制は細胞型特有である。ヘマトキシリン・エオジンで染色されたサルの脊髄ニューロンを直径＜４０、４０−７０、及び＞７０μｍの細胞に分けた。各ｈＥＮ１０１投与した１ｍｍ２の５つの領域において、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡとみなされた細胞の割合（％）を各大きさのグループごとに記録した。因みに、比較的小さい介在ニューロンにおいてｈＥＮ１０１の有効性が明らかに高く、最大の運動ニューロンにおいて有効性が一番低かった。
【図１６】加水分解したアセチルチオコリンのレベルを示す。１５０又は５００μｇ／ｋｇのｈＥＮ１０１を連続２日間ｉ．ｖ．投与、又は５００μｇ／ｋｇのｈＥＮ１０１を経口投与したカニクイザルの血漿におけるアセチルコリンエステラーゼ活性を示す。図１６Ａ：全体活性。図１６Ｂ：５×１０５Ｍのｉｓｏ−ＯＭＰＡ（ＡＣｈＥ）下での活性。注射で誘発された酵素活性の増加、及びＡＳ−ＯＮ減少に注目。
【図１７】ラットの脊髄ニューロンにおける、ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡに対するｒＥＮ１０１の効果を示す。ｒＥＮ１０１（５００μｇ／ｋｇ，ｉ．ｖ．，毎日）を７日間投与したラットの脊髄部でＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡ陽性細胞が確認された。
Claims (13)
- 進行性神経筋疾患の治療及び／又は予防、スタミナの向上、及び／又は慢性筋肉疲労の減少において使用される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義されるアンチセンスオリゴヌクレオチドｈＥＮ１０１からなる
ことを特徴とする薬学的組成物。 - 筋無力症の治療及び／又は予防に使用する
ことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。 - 約０．００１μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇの活性成分量を患者に毎日投与する
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の薬学的組成物。 - 約０．０１μｇ／ｇから約５．０μｇ／ｇの活性成分の投与により治療及び／又は予防する
ことを特徴とする請求項３に記載の薬学的組成物。 - 約０．１５μｇ／ｇから約０．５μｇ／ｇの活性成分の投与により治療及び／又は予防する
ことを特徴とする請求項４に記載の薬学的組成物。 - ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ又はプロテインの過剰に関係した進行性神経筋疾患の治療又は予防用に使用される
ことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。 - ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの過剰に関係した進行性神経筋疾患の治療又は予防用に使用される
ことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。 - コリン作用性伝達の障害に関係した進行性神経筋疾患の治療又は予防用に使用される
ことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。 - 筋肉変形、筋肉再神経支配、又は神経筋接合部（ＮＭＪ）異常に関係した進行性神経筋疾患の治療又は予防用に使用される
ことを特徴とする請求項８に記載の薬学的組成物。 - 重症筋無力症、イートン・ランバート症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索側硬化症、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、多発性硬化症、失調、脳梗塞後硬化症、過剰再神経支配、原因不明の術後麻痺、及びＡＣｈＥ阻害薬暴露後に関係した進行性神経筋疾患の治療又は予防用に使用される
ことを特徴とする請求項１から９のいずれかに記載の薬学的組成物。 - 身体的運動のスタミナ向上又は筋肉疲労の軽減のために使用される
ことを特徴とする請求項１から１０のいずれかに記載の薬学的組成物。 - 化合物のＢＢＢ通過を助長するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で定義されるアンチオリゴデオキシヌクレオチドと、さらに、ＢＢＢを通過して運ばれる付加的な薬学的活性物質、及び／又は薬学的に条件を満たした補助的なキャリア又は希釈剤からなる
ことを特徴とする薬学的組成物。 - 上記付加的な薬学的活性物質は、中枢神経造影に使用される造影剤、乱用された薬物の影響をブロックする薬物、抗生物質、化学療法薬、及び遺伝子療法において使用されるベクターから選択される
ことを特徴とする請求項１２に記載の薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL143379A IL143379A (en) | 2001-05-24 | 2001-05-24 | Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses |
| PCT/IL2002/000411 WO2003002739A1 (en) | 2001-05-24 | 2002-05-23 | Antisense oligonucleotide against human acetylcholinesterase (ache) and uses thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004536103A true JP2004536103A (ja) | 2004-12-02 |
| JP2004536103A5 JP2004536103A5 (ja) | 2006-01-05 |
| JP4316373B2 JP4316373B2 (ja) | 2009-08-19 |
Family
ID=11075445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003509100A Expired - Fee Related JP4316373B2 (ja) | 2001-05-24 | 2002-05-23 | ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｈｅ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7074915B2 (ja) |
| EP (1) | EP1390493B1 (ja) |
| JP (1) | JP4316373B2 (ja) |
| AU (1) | AU2002256873B2 (ja) |
| CA (1) | CA2458806C (ja) |
| ES (1) | ES2397302T3 (ja) |
| IL (1) | IL143379A (ja) |
| NZ (1) | NZ529549A (ja) |
| WO (1) | WO2003002739A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009533421A (ja) * | 2006-04-10 | 2009-09-17 | エステル ネウロスシエンセス リミテド | 炎症性疾患を治療するためのアセチルコリンエステラーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド |
| JP2011523935A (ja) * | 2008-02-19 | 2011-08-25 | マイオセプト インコーポレイテッド | シナプス後部を標的とした化学的除神経剤およびそれらの使用方法 |
| JP2021505568A (ja) * | 2017-12-04 | 2021-02-18 | ビアル−ポルテラ エ コンパニア，ソシエダッド アノニマ | ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ阻害剤 |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL143379A (en) * | 2001-05-24 | 2013-11-28 | Yissum Res Dev Co | Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses |
| CA2524255C (en) | 2003-03-21 | 2014-02-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
| US7766902B2 (en) | 2003-08-13 | 2010-08-03 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microfluidic device for drug delivery |
| IL158600A (en) | 2003-10-26 | 2015-07-30 | Hermona Soreq | Dioxysoligonucleotide Antisense Against Acetylcholinesterase as an Anti-Inflammatory Agent |
| GB2441581B (en) * | 2005-06-24 | 2011-01-19 | Roderic M K Dale | Compositions and methods for the treatment of muscle wasting |
| EP1976567B1 (en) | 2005-12-28 | 2020-05-13 | The Scripps Research Institute | Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets |
| GB0605337D0 (en) | 2006-03-17 | 2006-04-26 | Genomica Sau | Treatment of CNS conditions |
| WO2007123391A1 (en) | 2006-04-20 | 2007-11-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene. |
| EP1857548A1 (en) | 2006-05-19 | 2007-11-21 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and method for inducing exon-skipping |
| US20100184833A1 (en) | 2006-08-11 | 2010-07-22 | Prosenta Technologies B.V. | Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders |
| AU2008317566B2 (en) | 2007-10-26 | 2014-05-01 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| USRE48468E1 (en) | 2007-10-26 | 2021-03-16 | Biomarin Technologies B.V. | Means and methods for counteracting muscle disorders |
| EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
| US8795259B2 (en) | 2008-08-01 | 2014-08-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Drug delivery platform incorporating hydrogel pumping mechanism with guided fluid flow |
| US8986250B2 (en) | 2008-08-01 | 2015-03-24 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Drug delivery platform utilizing hydrogel pumping mechanism |
| WO2010018583A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Toll-like receptor 9 agonists for the treatment of anxiety-related disorders and inflammatory disorders |
| MY188457A (en) | 2008-10-03 | 2021-12-10 | Opko Curna Llc | Treatment of apolipoprotein-a1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-a1 |
| KR101866152B1 (ko) | 2008-12-04 | 2018-06-08 | 큐알엔에이, 인크. | 종양 억제 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 종양 억제 유전자 관련된 질환의 치료 |
| MX2011005912A (es) | 2008-12-04 | 2011-06-17 | Opko Curna Llc | Tratamiento de enfermedades relacionadas con factor de crecimiento endotelial vascular por inhibicion de transcrito antisentido natural para factor de crecimiento endotelial vascular. |
| KR101829469B1 (ko) | 2008-12-04 | 2018-03-30 | 큐알엔에이, 인크. | Ｅｐｏ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 에리트로포에틴(ｅｐｏ) 관련된 질환의 치료 |
| CA2752237C (en) | 2009-02-12 | 2020-03-24 | Opko Curna, Llc | Treatment of brain derived neurotrophic factor (bdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bdnf |
| US9464287B2 (en) | 2009-03-16 | 2016-10-11 | Curna, Inc. | Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2 |
| WO2010107740A2 (en) | 2009-03-17 | 2010-09-23 | Curna, Inc. | Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1 |
| ES2593836T3 (es) | 2009-04-24 | 2016-12-13 | Biomarin Technologies B.V. | Oligonucleótido que comprende una inosina para tratar la DMD |
| NZ720946A (en) | 2009-04-29 | 2017-09-29 | Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd | Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same |
| MX2011011538A (es) | 2009-04-29 | 2012-06-13 | Amarin Pharma Inc | Composicion farmaceutica estable y metodos de uso de la misma. |
| KR101722541B1 (ko) | 2009-05-06 | 2017-04-04 | 큐알엔에이, 인크. | Ｔｔｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료 |
| US9155754B2 (en) | 2009-05-06 | 2015-10-13 | Curna, Inc. | Treatment of ABCA1 gene related diseases by inhibition of a natural antisense transcript to ABCA1 |
| JP5931720B2 (ja) | 2009-05-08 | 2016-06-08 | クルナ・インコーポレーテッド | Ｄｍｄファミリーに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるジストロフィンファミリー関連疾患の治療 |
| DK2432881T3 (en) | 2009-05-18 | 2018-02-26 | Curna Inc | TREATMENT OF REPROGRAMMING FACTOR-RELATED DISEASES BY INHIBITING NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTS TO A REPROGRAMMING FACTOR |
| EP2432882B1 (en) | 2009-05-22 | 2019-12-25 | CuRNA, Inc. | TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3 |
| WO2010138806A2 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | Curna, Inc. | Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene |
| US20120171170A1 (en) | 2009-06-16 | 2012-07-05 | Opko Curna, Llc | Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene |
| CN102612560B (zh) | 2009-06-16 | 2017-10-17 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对对氧磷酶1(pon1)的天然反义转录物来治疗pon1相关的疾病 |
| JP6073133B2 (ja) | 2009-06-24 | 2017-02-01 | クルナ・インコーポレーテッド | 腫瘍壊死因子受容体２（ｔｎｆｒ２）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｔｎｆｒ２関連疾患の治療 |
| WO2010151674A2 (en) | 2009-06-26 | 2010-12-29 | Curna, Inc. | Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene |
| WO2011011700A2 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Curna, Inc. | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
| ES2585360T3 (es) | 2009-08-05 | 2016-10-05 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen de la insulina (INS) por inhibición de la transcripción antisentido natural en un gen de la insulina (INS) |
| ES2599986T3 (es) | 2009-08-11 | 2017-02-06 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con adiponectina (ADIPOQ) mediante la inhibición de un transcrito antisentido natural de una adiponectina (ADIPOQ) |
| WO2011022606A2 (en) | 2009-08-21 | 2011-02-24 | Curna, Inc. | Treatment of 'c terminus of hsp70-interacting protein' (chip) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to chip |
| KR101892760B1 (ko) | 2009-08-25 | 2018-08-28 | 큐알엔에이, 인크. | ＩＱＧＡＰ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ＧＴＰａｓｅ 활성화 단백질을 함유하는 ＩＱ 모티프(ＩＱＧＡＰ)와 관련된 질환의 치료 |
| WO2011038210A2 (en) | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Curna, Inc. | Treatment of filaggrin (flg) related diseases by modulation of flg expression and activity |
| RU2639550C2 (ru) | 2009-12-16 | 2017-12-21 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1 |
| WO2011079261A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Curna, Inc. | Treatment of hepatocyte growth factor (hgf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to hgf |
| WO2011079263A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Curna, Inc. | Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2 |
| ES2657452T3 (es) | 2009-12-29 | 2018-03-05 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor respiratorio nuclear 1 (NRF1) mediante inhibición de transcrito antisentido natural a NRF1 |
| WO2011090741A2 (en) | 2009-12-29 | 2011-07-28 | Opko Curna, Llc | TREATMENT OF TUMOR PROTEIN 63 (p63) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO p63 |
| DK2519632T3 (en) | 2009-12-31 | 2018-07-23 | Curna Inc | TREATMENT OF INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2- (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPTION TO IRS2 AND TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) |
| WO2011082409A2 (en) | 2010-01-04 | 2011-07-07 | Curna, Inc. | Treatment of interferon regulatory factor 8 (irf8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to irf8 |
| KR101853509B1 (ko) | 2010-01-06 | 2018-04-30 | 큐알엔에이, 인크. | 췌장 발달 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 췌장 발달 유전자와 관련된 질환의 치료 |
| US8328757B2 (en) | 2010-01-08 | 2012-12-11 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Bladder arrangement for microneedle-based drug delivery device |
| ES2664866T3 (es) | 2010-01-11 | 2018-04-23 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la globulina fijadora de hormonas sexuales (shbg) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a shbg |
| WO2011091390A2 (en) | 2010-01-25 | 2011-07-28 | Opko Curna, Llc | Treatment of rnase h1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to rnase h1 |
| US8962586B2 (en) | 2010-02-22 | 2015-02-24 | Curna, Inc. | Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1 |
| TWI600759B (zh) | 2010-04-02 | 2017-10-01 | 可娜公司 | 藉由抑制群落刺激因子３（ｃｓｆ３）之天然反義轉錄物以治療ｃｓｆ３相關疾病 |
| JP5978203B2 (ja) | 2010-04-09 | 2016-08-24 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | Ｆｇｆ２１に対する天然アンチセンス転写物の阻害による線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ２１）線維芽細胞増殖因子ｆｇｆ２１）関連疾患の治療 |
| RU2018110642A (ru) | 2010-05-03 | 2019-02-27 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt) |
| TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病 |
| NO2576784T3 (ja) | 2010-05-26 | 2018-04-14 | ||
| EP3299464B1 (en) | 2010-05-26 | 2019-10-02 | CuRNA, Inc. | Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1 |
| JP6023705B2 (ja) | 2010-06-23 | 2016-11-09 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | ナトリウムチャネル、電位依存性、αサブユニット（ＳＣＮＡ）に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるＳＣＮＡ関連疾患の治療 |
| CN103068982B (zh) | 2010-07-14 | 2017-06-09 | 库尔纳公司 | 通过抑制盘状大同系物(dlg)的天然反义转录物而治疗dlg相关疾病 |
| EP2625274B1 (en) | 2010-10-06 | 2017-07-19 | CuRNA, Inc. | Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4 |
| JP6049623B2 (ja) | 2010-10-22 | 2016-12-21 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | α‐Ｌ‐イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）への天然アンチセンス転写物の阻害によるＩＤＵＡ関連疾患の治療 |
| US10000752B2 (en) | 2010-11-18 | 2018-06-19 | Curna, Inc. | Antagonat compositions and methods of use |
| JP6071893B2 (ja) | 2010-11-23 | 2017-02-01 | カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド | Ｎａｎｏｇへの天然アンチセンス転写物の阻害によるｎａｎｏｇ関連疾患の治療 |
| ES2653247T3 (es) | 2011-06-09 | 2018-02-06 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la frataxina (FXN) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen FXN |
| EA029151B1 (ru) | 2011-09-06 | 2018-02-28 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦАМИ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ (SCNxA), С ПОМОЩЬЮ МАЛЫХ МОЛЕКУЛ |
| AU2013212758A1 (en) | 2012-01-27 | 2014-08-14 | Biomarin Technologies B.V. | RNA modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy |
| TR201815503T4 (tr) | 2012-03-15 | 2018-11-21 | Curna Inc | Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (bknf) ile ilişkili hastalıkların doğal antisens transkriptinin bknf'ye inhibisyonu ile muamelesi. |
| WO2013168162A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Clustered single nucleotide polymorphisms in the human acetylcholinesterase gene and uses thereof in diagnosis and therapy |
| US9814733B2 (en) | 2012-12-31 | 2017-11-14 | A,arin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions comprising EPA and obeticholic acid and methods of use thereof |
| US9283201B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-03-15 | Amarin Pharmaceuticals Ireland Limited | Compositions and methods for treating or preventing obesity in a subject in need thereof |
| US20200054611A1 (en) | 2017-01-09 | 2020-02-20 | Gt Biopharma, Inc. | Use and composition for treating myasthenia gravis and other myasthenic syndromes |
| US20200000756A1 (en) * | 2017-01-24 | 2020-01-02 | Gt Biopharma, Inc. | Neostigmine combination and compositions |
| US20200283834A1 (en) * | 2017-10-06 | 2020-09-10 | The Regents Of The University Of California | Rapid in situ detection of dna and rna |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL101600A (en) * | 1992-04-15 | 2000-02-29 | Yissum Res Dev Co | Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them |
| US6110742A (en) * | 1992-04-15 | 2000-08-29 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Synthetic antisense oligodeoxynucleotides targeted to AChE |
| WO1994021294A1 (en) | 1993-03-19 | 1994-09-29 | Bigner Darell D | Method of treating tumors with antibodies |
| US5455044A (en) | 1993-05-14 | 1995-10-03 | Depotech Corporation | Method for treating neurological disorders |
| WO1998026062A2 (en) * | 1996-12-12 | 1998-06-18 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Synthetic antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them |
| IL132972A0 (en) * | 1999-11-16 | 2001-03-19 | Yissum Res Dev Co | Pharmaceutical compositions comprising acetylcholinesterase antisense deoxynucleotides for the treatment of muscular and neuromuscular disorders |
| IL143379A (en) | 2001-05-24 | 2013-11-28 | Yissum Res Dev Co | Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses |
-
2001
- 2001-05-24 IL IL143379A patent/IL143379A/en not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-05-23 CA CA2458806A patent/CA2458806C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-23 NZ NZ529549A patent/NZ529549A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-05-23 JP JP2003509100A patent/JP4316373B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-05-23 EP EP02726406A patent/EP1390493B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-23 WO PCT/IL2002/000411 patent/WO2003002739A1/en active IP Right Grant
- 2002-05-23 AU AU2002256873A patent/AU2002256873B2/en not_active Ceased
- 2002-05-23 ES ES02726406T patent/ES2397302T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-03-27 US US10/402,016 patent/US7074915B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-02-01 US US11/346,145 patent/US7456154B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-10-07 US US12/287,274 patent/US20090281165A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009533421A (ja) * | 2006-04-10 | 2009-09-17 | エステル ネウロスシエンセス リミテド | 炎症性疾患を治療するためのアセチルコリンエステラーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド |
| JP2011523935A (ja) * | 2008-02-19 | 2011-08-25 | マイオセプト インコーポレイテッド | シナプス後部を標的とした化学的除神経剤およびそれらの使用方法 |
| JP2021505568A (ja) * | 2017-12-04 | 2021-02-18 | ビアル−ポルテラ エ コンパニア，ソシエダッド アノニマ | ドーパミン−β−ヒドロキシラーゼ阻害剤 |
| JP7167155B2 (ja) | 2017-12-04 | 2022-11-08 | ビアル－ポルテラ エ コンパニア，ソシエダッド アノニマ | ドーパミン－β－ヒドロキシラーゼ阻害剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL143379A (en) | 2013-11-28 |
| EP1390493A1 (en) | 2004-02-25 |
| CA2458806A1 (en) | 2003-01-09 |
| CA2458806C (en) | 2012-10-09 |
| NZ529549A (en) | 2008-07-31 |
| WO2003002739A1 (en) | 2003-01-09 |
| ES2397302T3 (es) | 2013-03-06 |
| EP1390493B1 (en) | 2012-11-07 |
| US7456154B2 (en) | 2008-11-25 |
| JP4316373B2 (ja) | 2009-08-19 |
| AU2002256873B2 (en) | 2007-07-05 |
| US20030216344A1 (en) | 2003-11-20 |
| US7074915B2 (en) | 2006-07-11 |
| US20090281165A1 (en) | 2009-11-12 |
| US20060178333A1 (en) | 2006-08-10 |
| IL143379A0 (en) | 2002-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4316373B2 (ja) | ヒトのアセチルコリンエステラーゼ（ａｃｈｅ）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその使用 | |
| AU2002256873A1 (en) | Antisense oligonucleotide against human acetylcholinesterase (AChE) and uses thereof | |
| JP6885620B2 (ja) | 筋障害を相殺するための手段と方法 | |
| CN103038345B (zh) | 转甲状腺素蛋白表达的调节 | |
| USRE48468E1 (en) | Means and methods for counteracting muscle disorders | |
| TW202140509A (zh) | 人類染色體９開讀框７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法 | |
| CN116234585A (zh) | 微管相关蛋白TAU(MAPT)iRNA剂组合物及其使用方法 | |
| TW202132567A (zh) | 亨汀頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法 | |
| Zhang et al. | Uptake and distribution of fluorescein-labeled D 2 dopamine receptor antisense oligodeoxynucleotide in mouse brain | |
| JP4427639B2 (ja) | 合成アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド類およびそれらを含む医薬組成物 | |
| TW202328453A (zh) | 治療或預防以擴大的胞內體為特徵之疾病的ＡＰＰ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 | |
| TW202229551A (zh) | 用於治療或預防ＳＮＣＡ相關的神經退化性疾病的ＳＮＣＡ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 | |
| US20240240187A1 (en) | Sirna targeting tmprss6 for the treatment of myeloproliferative disorders | |
| CN118215735A (zh) | 用于治疗或预防以扩大的核内体为特征的疾病的APP iRNA组合物及其使用方法 | |
| TW202407100A (zh) | 用於處置ｓｎｃａ相關疾病的ｓｎｃａ－靶向ｓｉｒｎａ組成物 | |
| CN118265786A (zh) | 微管相关蛋白Tau（MAPT）iRNA药剂组合物和其使用方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050519 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050519 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080925 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20081201 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20081208 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090123 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090224 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090312 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090325 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090423 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090520 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120529 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130529 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |