TW202132567A - 亨汀頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法 - Google Patents

亨汀頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法 Download PDF

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詹姆斯 Ｄ 麥克尼奇
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馬克Ｋ 史奇蓋爾
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Abstract

本揭露係關於靶向亨汀頓蛋白(HTT)基因例如HTT基因之外顯子1的雙股核糖核酸(dsRNAi)劑及組成物，以及使用此類dsRNAi劑及組成物來抑制HTT基因之表現的方法及治療患有HTT相關疾病或疾患例如亨汀頓氏病之受試者的方法。

Description

亨汀頓蛋白(HTT)iRNA劑組成物及其使用方法
[相關申請]
本申請主張2019年11月1日遞交之美國臨時申請第62/929,174號之優先權權益，該臨時申請之整體內容藉由引用併入本文。
[序列表]
本申請含有序列表，其業經以ASCII格式提交電子版，且藉由引用以其整體併入本文。所述ASCII拷貝於2020年10月26日創建，名為121301_10320_SL.txt，大小為1,468,832位元組。
亨汀頓氏病係以運動失調、認知能力喪失及精神表現為特徵之進行性神經退行性疾病(Martin and Gusella(1986)N.Engl.J.Med.315：1267-1276)。它以常染色體顯性方式遺傳，在大多數歐洲血統之人群中，每10,000個人中大約1個受到其影響(Harper,P.S.等人，《亨汀頓氏病》，W.B.Saunders,Philadelphia,1991)。亨汀頓氏病之特點係獨特之舞蹈病性行動障礙，其典型在四十至五十歲時發病，起病細微而隱匿，並在10至 20年內逐漸惡化，直至死亡。偶爾，亨汀頓氏病於青少年中表現為典型具有更嚴重症候之表現，包括僵硬及更快之病程。亨汀頓氏病之青少年發病與該疾病等位基因之父系傳遞優勢有關。亨汀頓氏病之神經病理學亦展示獨特之模式，神經元之選擇性喪失在腦部之尾狀及殼核區域最嚴重。
業經顯示，亨汀頓氏病係由被稱為IT15或亨汀頓蛋白(HTT)之基因的外顯子1中麩醯胺酸重複序列之擴張造成。儘管這一基因被廣泛表現並且為正常發育所需，但亨汀頓氏病之病理學僅限於腦部，其原因尚未理解。於患有HD(一種常染色體隱性遺傳病)之患者中，多麩醯胺酸重複序列之擴張導致野生型之轉錄本、具有經擴張之多麩醯胺酸重複序列的全長度之突變轉錄本、以及具有經擴張之多麩醯胺酸重複序列的截短之突變轉錄本。已經顯示，儘管亨汀頓蛋白基因產物於患者及對照者中以類似之量級表現，但多麩醯胺酸重複序列之擴張以及全長度突變轉錄本及截短突變轉錄本之存在誘導毒性。
目前尚無對亨汀頓氏病的有效治療。舞蹈病性行動及焦躁行為可藉由抗精神病藥物(例如，氯丙嗪)或利舍平得到一般僅部分地遏制，直到出現嗜睡、低血壓或巴金森症候群等副作用為止。此外，儘管於RNAi及亨汀頓氏病治療領域中的顯著進展，但對於可使用細胞自身之RNAi機制來選擇性地且有效地靜默HD基因的藥劑仍存在需求，該藥劑具有高生物學活性及體內安定性並且可有效地抑制標靶亨汀頓蛋白基因之表現。
本揭露係提供RNAi劑組成物，其係影響亨汀頓蛋白(HTT)基因之RNA轉錄本的RNA誘導靜默複合體(RISC)介導之裂解。HTT基因可係處於細胞內，例如受試者諸如人體內之細胞內。本揭露亦提供使用本揭露之RNAi劑組成物抑制HTT基因之表現或治療將從抑制或降低HTT基因表現中受益之受試者例如正苦於或被證實苦於HTT相關疾病之受試者的方法。
一方面，本發明提供用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)之表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA劑包含形成雙股區域之一正義股及反義股，其中，該正義股包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列相異不超過3、2、1或0個核苷酸之至少15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，並且該反義股包含與SEQ ID NO：6之核苷酸序列相異不超過3、2、1或0個核苷酸之至少15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸，以及，其中，一個或多個親脂性部分接合之至少一股之一個或多個內部位置。
於一些態樣中，該正義股之核苷酸序列係包含表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32和33之任一者中的任一正義股核苷酸序列。
於一些態樣中，該正義股包含與SEQ ID NO：1之下列核苷酸之任一核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少15個接續核苷酸：618-640、1215-1237、1248-1270、1403-1425、4051-4073、4393-4415、4398-4420、4403-4425、4441-4463、4518-4540、4548-4570、5105-5127、5215-5237、5217-5239、5221-5243、5222-5244、5366-5388、5372- 5394、5450-5472、5509-5531、5883-5905、6009-6031、6010-6032、6011-6033、6012-6034、6013-6035、6014-6036、6015-6037、6347-6369、6512-6534、7523-7545、7525-7547、7526-7548、9127-9149、9531-9553、或9538-9560。
於一些態樣中，該反義股包含與選自由下列所成群組之雙螺旋的任一反義股核苷酸序列相異不超過0、1、2或3個核苷酸之至少15個接續核苷酸：AD-953769.1、AD-953778.1、AD-953784.1、AD-953786.1、AD-953849.1、AD-953854.1、AD-953855.1、AD-953857.1、AD-953862.1、AD-953866.1、AD-953867.1、AD-953880.1、AD-953883.1、AD-953884.1、AD-953885.1、AD-953886.1、AD-953887.1、AD-953888.1、AD-953889.1、AD-953891.1、AD-953896.1、AD-953898.1、AD-953899.1、AD-953900.1、AD-953901.1、AD-953902.1、AD-953903.1、AD-953904.1、AD-953907.1、AD-953911.1、AD-953921.1、AD-953923.1、AD-953924.1、AD-953932.1、AD-953933.1、AD-953937.1。
於一些態樣中，親脂性部分經由鏈結子或載子接合。
在另一方面，本發明提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)，其係用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)在細胞內之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中，該反義股包含與編碼HTT之mRNA互補的區域，並且其中該互補區域包含與表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27-30、32和33中任一者中之任一反義核苷酸序列相異不超過3、2、1或0個核苷酸的至少15個例如15、16、17、18、19、20或21個接續核苷酸。
該正義股、該反義股、或該正義股及該反義股兩者可接合至一個或多個親脂性部分。於一些態樣中，該親脂性部分接合至該dsRNA劑之雙股區域中之一個或多個內部位置，例如，一個或多個親脂性部分可接合至該反義股之一個或多個內部位置。於一些態樣中，該一個或多個親脂性部分經由鏈結子或載子接合至至少一股之一個或多個內部位置。
於一些態樣中，藉由logKow量測，該親脂性部分之親脂性係超過0。
於一些態樣中，藉由該dsRNA劑之血漿蛋白質結合檢定中之未結合區分量測，該dsRNA劑之疏水性係超過0.2。於一些態樣中，該血漿蛋白質結合檢定係使用人血清白蛋白蛋白質之電泳遷移位移檢定。
於一些態樣中，該內部位置包括自該正義股或該反義股之每一端之末端兩個位置以外的所有位置。於其他態樣中，該內部位置包括自該正義股或該反義股之每一端之末端三個位置以外的所有位置。
於一些態樣中，該等內部位置不包括正義股之裂解位點區域，諸如該等內部位置包括自正義股之5’端計數之位置9至12之外的全部位置，或者該等內部位置包括自正義股之3’端計數之位置11至13之外的全部位置。
於一些態樣中，該等內部位置不包括反義股之裂解位點區域。於其他態樣中，該內部位置包括自該反義股之5’-端起計數之位置12至14以外的所有位置。於一些態樣中，該內部位置包括自該正義股從3’-端起計數之位置11至13以及該反義股從5’-端起計數之位置12至14以外的所有位置。
於一些態樣中，該一個或多個親脂性部分接合至一個或多個選自由下列所成群組的內部位置：該正義股之位置4至8及13至18，以及該反義股之位置6至10及15至18，每一股皆自5’端起計數。
於一些態樣中，該一個或多個親脂性部分接合至一個或多個選自由下列所成群組的內部位置：該正義股之位置5、6、7、15及17，以及該反義股之位置15及17，每一股皆自5’端起計數。
於一些態樣中，該雙股區域中之該等位置不包括該正義股之裂解位點區域。
於一些態樣中，該正義股係21個核苷酸之長度，該反義股係23個核苷酸之長度，以及，該親脂性部分接合至該正義股之位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或該反義股之位置16。
於其他態樣中，該正義股係21個核苷酸之長度，該反義股係23個核苷酸之長度，以及，該親脂性部分接合至該正義股之位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或該反義股之位置16。
於一些態樣中，親脂性部分係脂族、脂環族或多脂環族化合物。
於一些態樣中，該親脂性部分係選自由下列所成群組：脂質、膽固醇、視網酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基團、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡
Figure 109137670-A0202-12-0006-84
。
於一些態樣中，該親脂性部分含有飽和或不飽和之C4-C30烴鏈，以及視需要之選自由羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮化物及炔所成群組的官能基。
於一些態樣中，該親脂性部分含有飽和或不飽和之C6-C18烴鏈。
於一些態樣中，該親脂性部分含有飽和或不飽和之C16烴鏈。於一些態樣中，該飽和或不飽和之C16烴鏈接合至自該股之5’-端起計數之位置6。
於一些態樣中，該親脂性部分經由載子接合，該載子替換該內部位置或該雙股區域中之一個或多個核苷酸。於一些態樣中，該載子係選自由下列所成群組的環狀基團：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌
Figure 109137670-A0202-12-0007-85
基、[1,3]二氧雜環戊烷基、
Figure 109137670-A0202-12-0007-86
唑啶基、異
Figure 109137670-A0202-12-0007-87
唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
Figure 109137670-A0202-12-0007-88
啉基、嗒
Figure 109137670-A0202-12-0007-89
酮基、四氫呋喃基及十氫萘基；或係基於絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹之非環狀部分。
於一些態樣中，該親脂性部分經由鏈結子接合至該dsRNA劑，該鏈結子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鏈結、click反應之產物或胺基甲酸酯。
於一些態樣中，親脂性部分接合至核酸鹼基、糖部分或核苷間鏈結。
於一些態樣中，該dsRNA劑係包含至少一個經修飾之核苷酸。於一些態樣中，不超過五個該正義股之核苷酸及不超過五個該反義股 之核苷酸係未經修飾之核苷酸。於其他態樣中，該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸係包含修飾。
於一些態樣中，該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由下列所成群組：脫氧核苷酸、3’-末端脫氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-脫氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己基修飾之核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、包含磷酸乙烯酯之核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)之核苷酸、包含胸苷二醇核酸(GNA)S異構物之核苷酸、包含2-經甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2’-脫氧胸苷-3’磷酸酯之核苷酸、包含2’-脫氧烏苷-3’磷酸酯之核苷酸、鏈結至膽固醇基衍生物之末端核苷酸、及十二酸雙癸基醯胺基團；及其組合。
於其他態樣中，該經修飾之核苷酸係選自由下列所成群組：2’-脫氧-2’-氟修飾之核苷酸、2’-脫氧修飾之核苷酸、3’-末端脫氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)、鎖定之核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基修飾之核苷酸、胺基磷酸酯、以及包含非天然鹼基之核苷酸。
於一些態樣中，該經修飾之核苷酸中的至少一者係選自由下列所成群組：脫氧核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、2’-氟修飾之核苷酸、2’-脫氧修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)以及乙烯基-膦酸酯之核苷酸；及其組合。
於一些態樣中，該等核苷酸之修飾之至少一者係熱去安定化核苷酸修飾。於一些態樣中，該熱去安定化核苷酸修飾係選自由下列所成群組：無鹼基之修飾；與雙螺旋中對向核苷酸之誤配；以及去安定化糖修飾、2’-脫氧修飾、非環狀核苷酸、未鎖定之核酸(UNA)、以及甘油核酸(GNA)。
於一些態樣中，該經修飾之核苷酸包含3’-末端脫氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)之短序列。
於一些態樣中，核苷酸之修飾係2’-O-甲基、GNA及2’-氟修飾。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含至少一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一些態樣中，該dsRNA劑復包含6至8個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一個態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之3’-末端。視需要地，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。於相關態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5’-末端。視需要地，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。於另一態樣中，該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結係位於一股之5’-末端及3’-末端兩處。視需要地，該股係反義股。於另一態樣中，該股係正義股。
於一些態樣中，每一股係不超過30個核苷酸之長度。
於一些態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸之3’突出；或具有至少2個核苷酸之3’突出。
雙股區域可係15至30個核苷酸對之長度；17至23個核苷酸對之長度；17至25個核苷酸對之長度；23至27個核苷酸對之長度；19至21個核苷酸對之長度；或21至23個核苷酸對之長度。
每一股可係19至30個核苷酸；19至23個核苷酸；或21至23個核苷酸。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含靶向肝組織之靶向配位子。於一些態樣中，該靶向配位子係GalNAc接合物。
於某些態樣中，該雙股RNAi劑復包括靶向介導至CNS之遞送之受體的靶向配位子，例如，親水性配位子。
於某些態樣中，該靶向配位子係C16配位子。於一個態樣中，該配位子係
Figure 109137670-A0202-12-0010-357
其中，B係核苷酸鹼基或核苷酸鹼基類似物，視需要地，其中B係腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
於一些態樣中，該親脂性部分或靶向配位子經由生物可裂解之鏈結子接合，該鏈結子係選自由下列所成群組：DAN，RNA，二硫化物， 醯胺，半乳胺糖、葡萄胺糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化之單醣或寡醣，及其組合。
於一些態樣中，該正義股之3’端係經由端帽保護，該端帽係具有胺之環狀基團，該環狀基團係選自由下列所成群組：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌
Figure 109137670-A0202-12-0011-90
基、[1,3]二氧雜環戊烷基、
Figure 109137670-A0202-12-0011-91
唑啶基、異
Figure 109137670-A0202-12-0011-92
唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
Figure 109137670-A0202-12-0011-93
啉基、嗒
Figure 109137670-A0202-12-0011-94
酮基、四氫呋喃基及十氫萘基。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子；末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子；以及末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態或Sp組態之鏈結磷原子。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一及第二個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子；末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子；以及末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態或Sp組態之鏈結磷原子。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一、第二及第三個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子；末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子；以及末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態或Sp組態之鏈結磷原子。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一及第二個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子；末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第三個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子；末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子；以及末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態或Sp組態之鏈結磷原子。
於一些態樣中，該dsRNA劑復包含末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一及第二個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子；末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一及第二個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子；以及末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態或Sp組態之鏈結磷原子。
於一些態樣中，該dsRNA劑係包含位於該反義股之5’端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。於一些態樣中，該磷酸酯模擬物係5’-膦酸乙烯基酯(VP)。
於一些態樣中，位於該雙鏈之反義股之5'-端第1位置處的鹼基對係AU鹼基對。
於一些態樣中，該正義股係具有總計21個核苷酸，且該反義股係具有總計23個核苷酸。
本揭露之另一方面提供用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)基因之表現的雙股RNAi劑，其中，該靶向HTT之雙股RNAi劑包括形成雙股區域之正義股及反義股；其中，該正義股包括與SEQ ID NO：1至5中任一 者相異不超過3個核苷酸(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個例如15、16、17、18、19或20個接續核苷酸，並且該反義股包括與SEQ ID NO：6至10中任一者相異不超過3個核苷酸(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個例如15、16、17、18、19或20個接續核苷酸；其中，以尿嘧啶取代SEQ ID NO：1至10中提供之序列中之任意胸腺嘧啶(當比較比對之序列時)不視作造成與SEQ ID NO：1至10中提供之任一核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的差異；其中，該正義股之實質上全部核苷酸包括修飾，修飾係2’-O-甲基修飾、GNA或2’-氟修飾，其中，該正義股包括位於5’-末端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；其中，該反義股之實質上全部核苷酸包括選自由2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所成群組的修飾，其中，該反義股包括位於5’-末端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結及位於3’-末端之兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；以及，其中，該正義股接合之一個或多個親脂性(例如，C16)配位子。
本揭露之另一方面提供用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)基因之表現的雙股RNAi劑，其中，該靶向HTT之雙股RNAi劑包括形成雙股區域之正義股及反義股；其中，該正義股包括與SEQ ID NO：1至5中任一者相異不超過3個核苷酸(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個例如15、16、17、18、19或20個接續核苷酸，並且該反義股包括與SEQ ID NO：6至10中任一者相異不超過3個核苷酸(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個接續核苷酸；其中，以尿嘧啶取代SEQ ID NO：1至10中提供之序列中之任意胸腺嘧啶(當比較比對之序列時)不視作造成與SEQ ID NO：1至10中提供之任一核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的差 異；其中，該正義股包括至少一個3’-末端之去氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)；並且，其中，該反義股包括至少一個3’-末端之去氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)。
本揭露之另一方面提供用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)基因表現之雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該RNAi劑具備正義股及反義股，並且其中該反義股包括互補區域，該互補區域包括與表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33之反義股核酸鹼基序列之任一者相異不超過3個核苷酸(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個接續核苷酸，例如，(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個核苷酸、(亦即，相異3、2、1或0個核苷酸)之至少19個核苷酸。於一態樣中，RNAi劑包括下列修飾中之一者或多者：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、包含二醇核酸(GNA)、硫代磷酸酯(PS)和膦酸乙烯基酯(VP)。視需要地，RNAi劑包括下列每種修飾之至少一者：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、包含二醇核酸(GNA)、硫代磷酸酯及膦酸乙烯基酯(VP)。
於另一態樣中，RNAi劑包括四個或更多個PS修飾，係需要六個至十個PS修飾，視需要八個PS修飾。
於再一態樣中，RNAi劑之正義股及反義股之各者具備5’-末端及3’-末端，並且RNAi劑包括位於來自RNAi劑之正義股及反義股之各者之各別3’-末端及5’-末端的次終端及終端核苷酸鏈結之各者的八個PS修飾。
於另一態樣中，RNAi劑之正義股及反義股之各者包括5’-末端及3’-末端，並且RNAi劑包括僅一個包括GNA之核苷酸。視需要地，該包括GNA之核苷酸位於反義股之自該反義股之5’-末端計數的第七個核酸鹼基殘基。
於再一態樣中，RNAi劑之正義股及反義股之各者包括5’-末端及3’-末端，並且RNAi劑包括一個至四個2’-C-烷基修飾之核苷酸。視需要地，2’-C-烷基修飾之核苷酸係2’-C16-修飾之核苷酸。視需要地，RNAi劑包括單一2’-C-烷基例如C16修飾之核苷酸。視需要地，單一2’-C-烷基例如C16修飾之核苷酸位於正義股之自該正義股5’-末端計數之第六個核酸鹼基位置。
於另一態樣中，RNAi劑之正義股及反義股之各者包括5’-末端及3’-末端，並且RNAi劑包括兩個或更多個2’-氟修飾之核苷酸。視需要地，RNAi劑之正義股及反義股之各者包括兩個或更多個2’-氟修飾之核苷酸。視需要地，2’-氟修飾之核苷酸位於正義股之自該正義股5’-末端計數之核酸鹼基位置7、9、10及11，以及位於反義股之自該反義股5’-末端計數之核酸鹼基位置2、14及16。
於再一態樣中，RNAi劑之正義股及反義股之各者包括5’-末端及3’-末端，並且RNAi劑包括一個或多個VP修飾。視需要地，RNAi劑包括位於反義股5’-末端之單一VP修飾。
於另一態樣中，RNAi劑之正義股及反義股之各者包括5’-末端及3’-末端，並且RNAi劑包括兩個或更多個2’-O-甲基修飾之核苷酸。視需要地，RNAi劑包括位於所有未經2'-氟、2’-C-烷基或二醇核酸(GNA) 修飾之核酸鹼基位置的2'-O-甲基修飾之核苷酸。視需要地，兩個或多個2’-氟修飾之核苷酸位於正義股之自該正義股5’-末端計數之核酸鹼基位置1、2、3、4、5、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20及21，以及位於反義股之自該反義股5’-末端計數之核酸鹼基位置1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21、22及23。
於一個態樣中，該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸係經修飾之核苷酸。
於另一態樣中，每一股具有19至30個核苷酸。
於某些態樣中，RNAi劑之反義股包括位於5’區域之最先9個核苷酸位置內的雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾或其前驅物。視需要地，雙螺旋之熱去安定化修飾係下列之一者或多者
Figure 109137670-A0202-12-0016-358
其中B係核酸鹼基。
本發明復提供含有用於抑制編碼HTT之基因表現的本發明之任意dsRNA劑及醫藥組成物的細胞，其包含本發明之任意daRNA劑。
於一態樣中，雙股RNAi劑係處於非緩衝溶液中。視需要地，非緩衝溶液係鹽水或水。於另一態樣中，雙股RNAi劑係處於緩衝溶液中。 視需要地，緩衝溶液包括醋酸鹽、枸櫞酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。於另一態樣中，緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。本揭露之另一方面提供一種醫藥組成物，其包括本揭露之雙股RNAi劑及脂質製劑。於一態樣中，脂質製劑包括脂質奈米顆粒(LNP)。
本揭露之再一方面提供抑制細胞中HTT基因表現的方法，該方法包括(a)令細胞與本揭露之雙股RNAi劑或本揭露之醫藥組成物接觸；以及(b)將步驟(a)中產生之細胞維持足以獲得HTT基因之mRNA轉錄本退化的時間，從而抑制該細胞中HTT基因之表現。
於一個態樣中，細包處於受試者內。視需要地，受試者係人。
於某些態樣中，受試者係恆河猴、食蟹猴、小鼠或大鼠。於某些態樣中，HTT表現被RNAi劑抑制至少約50%。
於某些態樣中，該人受試者業經被診斷為患有HTT相關疾病，例如，亨汀頓氏病。
本揭露之另一方面提供治療被診斷為患有HTT相關疾病例如亨汀頓氏病之受試者的方法，該方法包括向該受試者給藥治療有效量之本揭露之雙股RNAi劑或本揭露之醫藥組成物，從而治療該受試者。
於一態樣中，治療包括減輕該疾病之至少一種症狀或症候。於另一態樣中，治療包括預防疾病之進展。
於一些態樣中，dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量給藥至該受試者。
於一些態樣中，daRNA劑係經鞘內腔給藥至該受試者。於一態樣中，該方法減低腦(例如，紋狀體)或脊椎組織內之HTT基因的表現。視需要地，腦或脊椎組織係紋狀體、皮質、小腦、頸椎、腰椎或胸椎。
於一些態樣中，該方法復包括量測從該受試者獲得之樣本中HTT的量級。
本揭露之另一方面提供抑制受試者體內亨汀頓蛋白(HTT)之表現的方法，該方法包括向該受試者給藥治療有效量之本揭露之雙股RNAi劑或本揭露之醫藥組成物，從而抑制該受試者體內HTT之表現。
於一些態樣中，該方法復包括將適用於治療或預防HTT相關疾患的另外之劑給藥至該受試者。
圖1係圖示於表現野生型人HTT(經由AAV)之一部分的小鼠肝臟中，野生型人HTT mRNA之量級。於AAV投藥後第14天，此等小鼠係經皮下給藥單次劑量為3mg/kg之靶向人HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋。所顯示之人HTT量級係標準化至siRNA投藥後14天之經AAV治療之對照組。
圖2係圖示於表現野生型人HTT(經由AAV)之一部分的小鼠肝臟中，野生型人HTT mRNA之量級。於AAV投藥後第14天，此等小鼠係經皮下給藥單次劑量為3mg/kg之靶向人HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋。所顯示之人HTT量級係標準化至siRNA投藥後14天之經AAV治療之對照組。
圖3A係圖示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg之靶向人HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠的肝臟中，全長度突變人HTT mRNA之量級。所顯示之人HTT係標準化至PBS處置量級。
圖3B係西方印漬圖，其顯示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg之靶向人HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠的肝臟中，突變人HTT蛋白質及野生型小鼠HTT蛋白質之量級。
圖3C係柱狀圖，其顯示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg之靶向人HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠的肝臟中，突變人HTT蛋白質之量級。所顯示之突變人HTT量級係標準化至PBS處置量級。
圖4A係圖示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg的所指示之靶向HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠的肝臟中，全長度突變HTT mRNA量級。所顯示之全長度突變人HTT量級係標準化至PBS處置量級。
圖4B係柱狀圖，其顯示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg之靶向HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠的肝臟中，突變HTT蛋白質量級的定量。所顯示之突變人HTT量級係標準化至PBS處置量級。
圖5係圖示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg之靶向HTT轉錄本之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小 鼠的肝臟中，全長度突變人HTT mRNA量級。所顯示之人HTT量級係標準化至PBS處置量級。
圖6係圖示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠中，全長度突變人HTT mRNA之量級，以及肝臟中相對應之全長度突變人HTT蛋白質量級。所顯示之突變人mRNA量級及蛋白質HTT量級係標準化至PBS處置量級。
圖7係圖示於投藥後第7天，經皮下給藥單次劑量為10mg/kg的指示dsRNA雙螺旋之YAC128小鼠中，突變全長度人HTT mRNA量級。所顯示之突變人HTT量級係標準化至PBS處置量級。
圖8A及8B係圖示以10nM或50nM之靶向多種外顯子或特異性靶向人HTT之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋轉染之人纖維母細胞中，全長度人HTT mRNA量級。纖維母細胞獲自Coriell、成年健康對照患者(「對照組」，GM02153)、成年發病之HD患者(「成年組」，GM04478)及青少年發病之HD患者(「青少年組」，GM09197)。所顯示之HTT量級係標準化至經模仿轉染之對照組。
圖9A及9B係圖示以10nM或50nM之靶向多種外顯子或特異性靶向人HTT之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋轉染之人纖維母細胞中，全長度人HTT mRNA量級。纖維母細胞獲自Coriell、成年健康對照患者(「對照組」，GM02153)、成年發病之HD患者(「成年組」，GM04478)及青少年發病之HD患者(「青少年組」，GM09197)。所顯示之HTT量級係標準化至經模仿轉染之對照組。
圖10A至10D係圖示以10nM或50nM之靶向多種外顯子或特異性靶向人HTT之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋轉染之人纖維母細胞中，全長度人HTT mRNA量級。纖維母細胞獲自Coriell、成年健康對照患者(「對照組」，GM02153)、成年發病之HD患者(「成年組」，GM04478)及青少年發病之HD患者(「青少年組」，GM09197)。所顯示之HTT量級係標準化至經模仿轉染之對照組。
圖11A至11D係示以10nM或50nM之靶向多種外顯子或特異性靶向人HTT之外顯子1的指示dsRNA雙螺旋轉染之人纖維母細胞中，全長度HTT mRNA mRNA量級。纖維母細胞獲自Coriell、成年健康對照患者(「對照組」，GM02153)、成年發病之HD患者(「成年組」，GM04478)及青少年發病之HD患者(「青少年組」，GM09197)。所顯示之HTT量級係標準化至經模仿轉染之對照組。
圖12係圖示於表現人野生型HTT(「AAV」)之一部分並於投藥後指示日經皮下給藥所單次劑量的靶向全長度HTT轉錄本之指示dsRNA雙螺旋的YAC 128小鼠或野生型小鼠之肝臟中，全長度突變人HTT mRNA量級。所顯示之HTT係標準化至PBS處置量級。
圖13A至13D係圖示於經由AAV表現人野生型HTT之一部分的小鼠肝臟中，全長度人HTT mRNA量級。於投藥後第14天，此等小鼠係經皮下給藥單次劑量為3mg/kg之靶向全長度HTT轉錄本的指示dsRNA雙螺旋。於siRNA投藥後14天，相對於經AAV治療之對照量級，顯示HTT量級。
本揭露係提供RNAi組成物，其係影響亨汀頓蛋白(HTT)基因之RNA轉錄本的RNA誘導靜默複合體(RISC)介導之裂解。HTT基因可係於細胞內，例如受試者諸如人體內之細胞內。此等iRNA之使用使得哺乳動物體內相對應基因(HTT基因)之mRNA的靶向退化稱為可能。
本發明之iRNA業經設計為靶向HTT基因，包括在其他哺乳動物物種之HTT同源物中保守的基因部份。本發明之iRNA亦業經設計為靶向HTT基因之特定部分，外顯子1，例如，從而靶向全長度野生型轉錄本、全長度突變轉錄本以及截短之突變轉錄本。不試圖受限於理論，咸信，前述特性與此等iRNA中之特異標靶位點例如外顯子1或特異修飾之組合或亞組合賦予本發明之iRNA以改善之功效、安定性、效力、耐久性及安全性。
據此，本揭露亦提供使用本揭露之RNAi組成物抑制HTT基因之表現或治療患有將從抑制或降低HTT基因表現中受益之疾患的受試者的方法，該疾患為例如HTT相關疾病，例如，亨汀頓氏病(HD)。
本揭露之RNAi劑包括RNA股(反義股)，該股係具有約30個核苷酸或更短之長度的區域，如15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至 28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸之長度，該區域實質上互補於HTT基因之mRNA轉錄本的至少一部分。於某些態樣中，本揭露之RNAi劑包括具有約21至23個核苷酸之長度之區域的RNA股(反義股)，該區域實質上互補於HTT基因之mRNA轉錄本的至少一部分。
於某些態樣中，本揭露之RNAi劑包括RNA股(反義股)，該股可包括較長長度，例如最多66個核苷酸，例如36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸之長度，具有實質上互補於HTT基因之mRNA轉錄本之至少一部分互補的至少19個接續核苷酸之區域。此類具有較長長度之反義股的RNAi劑較佳包括一長度為20至60個核苷酸之第二RNA股(正義股)，其中該正義股與該反義股係形成18至30個接續核苷酸之雙螺旋。
此等RNAi劑之使用使得對哺乳動物體內之HTT基因之mRNA之靶向退化成為可能。因此，包括此等RNAi劑之方法及組成物可用於治療將受益於HTT蛋白質的量級或活性減低的受試者，諸如患有HTT相關疾病諸如亨汀頓氏病(HD)的受試者。
下述之詳細說明書係揭露如何製作及使用含有用以抑制HTT基因表現之RNAi劑的組成物，以及治療罹患將從抑制或減少該等基因之表現而受益之疾病及疾患之受試者的方法。
I.定義
為了更容易地理解本揭露，首先定義某些術語。此外，應注意，無論何時，當應用參數之數值或數值範圍，該等數值及處於該等所引用之數值中間的範圍亦作為本揭露之一部分。
本文中使用之冠詞「一」指稱該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一元件」意指一個元件或超過一個元件如複數個元件。
本文中使用之術語「包括」意指且與用語「包括但不限於」可互換地使用。除非語境中明確排除，否則本文中使用之術語「或」意指且與用語「及/或」可互換地使用。
本文中使用之術語「約」意指處於該技藝中之典型公差範圍內。例如，「約」可理解為與均值偏離2標準偏差。於某些態樣中，「約」意指±10%。於某些態樣中，「約」意指±5%。當「約」存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「約」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
處於數字或一系列數字之前的術語「至少」理解為包括與該術語「至少」相鄰之數字，以及後面之全部數字或邏輯上可包括之整數，如從語境中明顯可知者。例如，核酸分子中之核苷酸的數目必需為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子的至少18個核苷酸」意指18、19、20或21個核苷酸具有指示特性。當「至少」存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「至少」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
如本文所用，「不超過」或「少於」理解為與短語相鄰之數值以及邏輯上更低之數值或整數，如從語境中邏輯上推知者，到零為止。例如，具有「不超過2個核苷酸」之突出的雙螺旋具有2、1或0個核苷酸 之突出。當「不超過」存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「不超過」可修飾該一系列數字或範圍中之每一個。
如本文所用，偵檢方法可包括確定所存在之分析質的量低於該方法之偵檢量級。
在所指示之標靶位點與正義或反義股之核苷酸序列之間存在矛盾的情況下，以所指示之序列為準。
在化學結構與化學名稱之間存在矛盾的情況下，以化學結構為準。
術語「HTT」或「亨汀頓蛋白」，亦稱為「亨汀頓蛋白質」、「亨汀頓氏病蛋白質」、「IT15」、「HD」、「HD蛋白」或「LOMARS」，指稱編碼蛋白質HTT之習知基因，該蛋白質被廣泛表現且為正常發育所需，並且該疾病基因與亨汀頓氏病關聯，亨汀頓氏病係一種神經退行性疾患，以亨汀頓蛋白基因中之擴張的不安定三核苷酸(CAG)重複序列所致之紋狀體神經元缺失為特徵，該重複序列於蛋白產物中轉譯為聚麩醯胺重複序列。
示例性核苷酸及HTT之胺基酸序列可見於，例如，GenBank登錄號NM_002111.8(智人HTT,SEQ ID NO：1，反向互補序列，SEQ ID NO：6)；GenBank登錄號NM_010414.3(小鼠HTT，SEQ ID NO：2；反向互補序列，SEQ ID NO：7)；GenBank登錄號NM_024357.3(大鼠HTT，SEQ ID NO：3，反向互補序列，SEQ ID NO：8)；GenBank登錄號XM_015449989.1(食蟹猴HTT，SEQ ID NO：4，反向互補序列，SEQ ID NO：9)；以及GenBank登錄號XM_028848247.1(恆河獼猴HTT，SEQ ID NO：5，反向互補序列，SEQ ID NO：10)。
HTT序列之其他示例可見於可公開獲得之資料庫，例如，GenBank、OMIM及UniProt。
HTT之其他訊息可見於，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3064。
自遞交本申請案之日起，前述GenBank登錄號及Gene資料庫號之每一者的整體內容藉由引用併入本文。
如本文所用，術語HTT亦指稱HTT基因之變異，包括SNP資料庫中提供之變體。HTT中之大量序列變異業經鑑定並可見於，例如，NCBI dbSNP及UniProt(參見，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？LinkName=gene_snp&from_uid=3064)，自本申請案遞交之日起，其整體內容藉由引用併入本文。
如本文中所用，「標靶序列」指稱於HTT基因之轉錄過程中形成之mRNA分子之核苷酸序列的接續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。於一態樣中，該序列之標靶部分將至少長至足以用作RNAi引導之裂解的受質，該裂解位於在HTT基因之轉錄過程中形成之mRNA分子的核苷酸序列的部分處或鄰近該處。
標靶序列為約15至30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可約15至30個核苷酸之長度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、 18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度。於某些態樣中，標靶序列係19至23個核苷酸之長度，視需要21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指稱包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸藉由使用標準核苷酸命名法指稱之序列而揭示。
於經修飾或未修飾之核苷酸的語境中，「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指稱經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代置換部分(參見，例如，表1)。熟練之人士熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶可經由其他部分置換而基本上不改變包含承載此置換部分之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對特性。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本揭露提出的dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可置換為含有例如肌苷之核苷酸。於另一示例中，寡核苷酸中任意位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別置換為鳥嘌呤及尿嘧啶，以與標靶mRNA形成 G-U Wobble鹼基配對。含有此類置換部分之序列適用於本揭露提出之組成物及方法。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」指稱含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導之靜默複合體(RISC)途徑而介導RNA轉錄本的靶向裂解。RNA干擾(RNAi)係引導mRNA之序列特異性降解的製程。RNAi調整例如抑制細胞如受試者如哺乳動物受試者體內之細胞中HTT的表現。
於一態樣中，本揭露之RNAi劑包括單股RNAi，其與標靶RNA序列如HTT標靶mRNA相互作用，以引導該標靶RNA之裂解。不欲受縛於理論，咸信被引入細胞內之長雙股RNA藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶而破碎為包含正義股及反義股之雙股端干擾RNA(siRNA)(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將此等daRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵係具有兩個鹼基之3’突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，此等siRNA被併入RNA誘導之靜默複合體(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙螺旋解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導靜默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，於一方面，本揭露係關於單股RNA(ssRNA)(siRNA雙螺旋之反義股)，其係於細胞內生成且促進RISC複合體之形成以有效靜默標靶基因如HTT基因。據此，本文中，術語「siRNA」亦用以指稱上揭之RNAi。
於另一態樣中，該RNAi劑可係單股RNA，其係引入細胞或有機體內以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常係15至30個核苷酸且經化學修飾。單股RNA之設計及測試揭示於美國專利第8,101,348號及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。本文中揭示之任意反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中揭示之方法化學修飾者。
於另一態樣中，用於本揭露之組成物及方法中之「RNAi劑」係雙股RNA，且於本文中指稱為「雙股RNAi劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA分子」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指稱核糖核酸分子之複合體，其具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙螺旋結構，該兩個核酸股指稱為具有相對於標靶RNA亦即HTT基因之「正義」取向及「反義」取向。於本揭露之一些態樣中，雙股RNA(dsRNA)經由轉錄後基因靜默機制而觸發標靶RNA如mRNA之降解，本文中，該機制指稱為RNA干擾或RNAi。
通常，dsRNA分子可包括核糖核苷酸，但如本文中所詳述，一股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，如脫氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「RNAi劑」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；RNAi劑可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。如本文中所用，術語「經修飾之核苷酸」指稱獨立具有經修飾之糖部分、經修飾之核苷酸間鏈結、或經修飾之核酸鹼基的核苷酸。因此，術語「經修飾之核 苷酸」涵蓋例如官能基或原子至核苷酸間鏈結、糖部分或核酸鹼基之置換、加成或移除。適用於本揭露之劑中的修飾包括本文中所揭露或該領域中已知之全部類型的修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在siRNA類型分子中所用者，為「RNAi劑」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，將去氧核苷酸(若存在)包合於RNAi劑中可被視為構建經修飾之核苷酸。
該雙螺旋區域可係允許所欲之標靶RNA經由RISC途徑而特異性降解的任意長度，且可係約15至36個鹼基對之長度範圍，例如，約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個鹼基對之長度，諸如約15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。於某些態樣中，雙螺旋區域係19至21個鹼基對之長度，例如，21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
形成該雙螺旋結構之兩股可係一個較大RNA分子之不同部分，或它們可係獨立之RNA分子。若該兩股係一個較大分子之部分，且因 此藉由界於一股之3’末端與形成該雙螺旋結構之相對另一股之5’末端之間的未中斷核苷酸鏈而連結，則該連結RNA鏈指稱為「髮夾環圈」。髮夾環圈可包含至少一個未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少23或更多個未配對之核苷酸或未被引導至dsRNA標靶位點之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係10個或更少核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係8個或更少未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係4至10個未配對之核苷酸。於一些態樣中，髮夾環圈可係4至8個核苷酸。
若dsRNA之兩個實質上互補之股由獨立之RNA分子構成，則那些分子不必但可以共價連結。於某些態樣中，若該兩股係藉由除界於一股之3’端與形成該雙螺旋結構之相對另一股之5’端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指稱為「鏈結子」(但應注意，本文中他處定義之某些其他結構亦可指稱為「鏈結子」)。該等RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目係該dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去該雙螺旋中存在之任意突出。RNAi除了包含該雙螺旋結構外，亦可包含一個或多個核苷酸突出。於RNAi劑之一個態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸的3’突出。於另一態樣中，至少一股包含具有至少2個核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之3’突出。於其他態樣中，RNAi劑之至少一股包含具有至少1個核苷酸之5’突出。於某些態樣中，至少一股包含具有至少2個核苷酸，例如2、5、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸之3’突出。於 又其他態樣中，RNAi劑之一股的3’及5’端包含具有至少1個核苷酸之突出。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑係dsRNA，其每一股獨立地包含19至23個核苷酸，其係與標靶RNA序列如HTT標靶mRNA序列相互作用以引導標靶RNA之裂解。
如本文中所用，術語「核苷酸突出」指稱從RNAi劑例如dsRNA之雙螺旋結構凸出之至少一個未配對之核苷酸。舉例而言，當dsRNA之一股的3’端延伸超過另一股之5’端，或與之相反，則存在核苷酸突出。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸之突出；或者該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括脫氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或正義股之5’端、3’端或兩端。
於一個態樣中，dsRNA之反義股具有突出在3’端或5’端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於一個態樣中，dsRNA之正義股具有突出在3’端或5’端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，該dsRNA之反義股具有突出在3’端或5’端之1至10個核苷酸，例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於一個態樣 中，dsRNA之正義股具有突出在3’端或5’端之1至10個核苷酸，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸。於另一態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，位於正義股或反義股之突出可包括長於10個核苷酸之延伸長度，如，1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸或10至15個核苷酸之長度。於某些態樣中，延伸之突出位於該雙螺旋之正義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙螺旋之正義股的3’端。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙螺旋之正義股的5’末端。於某些態樣中，延伸之突出位於該雙螺旋之反義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙螺旋之反義股的3’端。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙螺旋之反義股的5’端。於某些態樣中，突出中之一個或多個核苷酸被替換為核苷硫代磷酸酯。於某些態樣中，突出包括自身互補之部分，使得該突出能夠形成在生理學條件下安定之髮夾結構。
於某些態樣中，至少一股之至少一端延伸超出雙螺旋靶向區域，包括其中該等股中之一者包括熱力學安定化四環圈結構的結構(參見，例如，美國專利第8,513,207號及第8,927,705號以及WO2010033225，其各自之整體內容藉由引用併入本文)。此類結構可包括單股延伸(於分子之一側或兩側)以及雙股延伸。
於某些態樣中，正義股之3’端及反義股之5’端藉由包含核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或兩者之多核苷酸序列接合，視需要地，其中該多核苷酸序列包含四環圈序列。於某些態樣中，正義股係25至35個核苷酸之長度。
四環圈可含有核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、經修飾之核苷酸及其組合。典型地，四環圈具有4至5個核苷酸。於一些態樣中，環圈包含作為GAAA詳述之序列。於一些態樣中，環圈(GAAA)之核苷酸中的至少一者包含核苷酸修飾。於一些態樣中，經修飾之核苷酸包含2'-修飾。於一些態樣中，2'-修飾係選自由2'-胺基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-胺基二乙氧基甲醇、2'-adem及2'-去氧-2'氟- -d-阿拉伯糖核酸所成群組的修飾。於一些態樣中，環圈之全部核苷酸皆經修飾。於一些態樣中，GAAA序列中之G包含2’-OH。於一些態樣中，GAAA序列中之每個核苷酸皆包含2’-O-甲基修飾。於一些態樣中，GAAA序列中之每個A包含2’-OH，並且GAAA序列中之G包含2’-O-甲基修飾。於較佳之態樣中，於一些態樣中，GAAA序列中之每個A包含2'-O-甲氧基乙基(MOE)修飾，並且GAAA序列中之G包含2'-O-甲基修飾；或GAAA序列中之每個A包含2'-adem修飾，並且GAAA序列中之G包含2'-O-甲基修飾。參見，例如，PCT公開案第2020/206350號，其整體內容藉由引用而併入本文。
示例性之經2’-adem修飾之核苷酸如下所示：
Figure 109137670-A0202-12-0035-359
如本文中所用，關於dsRNA之術語「鈍」或「鈍端」意指，在dsRNA之給定端無未配對之核苷酸或核苷酸類似物，亦即，無核苷酸突出。dsRNA之一端或兩端可係鈍者。若dsRNA之兩端皆係鈍者，該dsRNA稱為鈍端者。明了起見，「鈍端之」dsRNA係兩端皆係鈍者之dsRNA，亦即，於分子之任一端皆無核苷酸突出。最常見之此類分子將於其整個長度係雙股。
術語「反義股」或「導引股」指稱RNAi劑例如dsRNA之股，其包括與標靶序列如HTT mRNA實質上互補之區域。
如本文中所用，術語「互補之區域」指稱反義股之與本文中定義之序列如標靶序列如HTT核苷酸序列實質上互補的區域。若該互補之區域與該標靶序列不完全互補，誤配可存在於該分子之中間區域或末端區域。通常，最能被容忍之誤配存在於末端區域內，例如，RNAi劑之5’末端或3’末端之5、4、3或2個核苷酸內。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於反義股中之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與標靶mRNA之誤配，例如，反義股包括4、3、 2、1或0個與標靶mRNA之誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與正義股之誤配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與正義股之誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑包括位於正義股中之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之正義股包括不超過4個與反義股之誤配，例如，正義股包括4、3、2、1或0個與反義股之誤配。於一些態樣中，核苷酸誤配位於例如自iRNA之3’端計數之5、4、3個核苷酸內。於另一態樣中，核苷酸誤配係例如位於iRNA劑之3’-末端核苷酸中。於一些態樣中，誤配不處於種子區域中。
因此，本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與標靶序列之誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過3個誤配(亦即，3、2、1或0個誤配)。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過2個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過1個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個誤配。於某些態樣中，如果RNAi劑之反義股含有與標靶序列之誤配，則該誤配較佳可被限定在從互補區域之5’端或3’端計數之最後5個核苷酸內。例如，於此類態樣中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與HTT基因互補區域之股通常不含位於中心13個核苷酸處之任意誤配。本文中揭示之方法或該領域中已知之方法可用以確定，含有與標靶序列之誤配的RNAi劑在抑制HTT基因之表現中是否有效。慮及具有誤配之RNAi劑在抑制HTT基因之表現中的效力係重要者，尤其若HTT基因中之特定互補區域係已知具有該種群內之多態性序列變更。
如本文中所用，術語「正義股」指稱RNAi劑之股，其包括與如本文中定義之術語之反義股之區域實質上互補的區域。
如本文中所用，術語「裂解區域」指稱位於緊鄰裂解位點處之區域。裂解位點係該標靶之裂解出現處之位點。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。於一些態樣中，裂解位點特異性地出現於反義股之藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文中所用且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指稱包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙螺旋結構的能力，如具熟練技術之人士所理解者。
如本文中所述之RNAi劑例如dsRNA內之互補序列，包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列之整體長度上的鹼基配對。此類序列可指稱為彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列指稱為與第二序列「實質上互補”，則當雜交形成多達30個鹼基對之雙螺旋時，兩個序列可完全互補，或它們可形成一個或多個但通常不超過5、4、3或2個誤配鹼基對，同時保留在最適於其最終應用之條件下雜交的能力，如對經由RISC途徑之基因表現的抑制。惟，若兩個寡核苷酸設計為當雜交時形成一個或多個單股突出，則此類突出不應視為關於確定互補性之誤配。舉例而言，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸 之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之核苷酸包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指稱為「完全互補」。
如本文中所用，「互補之」序列亦可包括非Watson-Crick鹼基對及/或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要對其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於，G：U Wobble鹼基配對或Hoogstein鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之正義股與反義股之間或RNAi劑之反義股與標靶序列之間的鹼基配對而使用，如可從其用途之語境中理解者。
如本文中所用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」之多核苷酸指稱與感興趣之mRNA(例如，編碼HTT13之mRNA)之接續部分實質上互補之多核苷酸。舉例而言，如果該序列與編碼HTT之mRNA之非中斷部分基本互補，則該多核苷酸與HTT mRNA之至少一部分互補。
據此，於一些態樣中，本文中揭露之反義多核苷酸與標靶HTT序列完全互補。於其他態樣中，本發明之反義多核苷酸與標靶互補組分HTT序列實質上互補，且包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度與SEQ ID NO：1至5中任一者或SEQ ID NO：1至5中任一者之片段的等效核苷酸序列區域為至少80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約85%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
於其他態樣中，本文揭露之反義多核苷酸與標靶HTT序列實質上上互補，並且包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整個長度與表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32和33中任一者中之任一正義股核苷酸序列或表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32和33之任一者中任一正義股核苷酸序列的片段為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑包括正義股，該正義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸反而與標靶HTT序列相同，其中該正義股多核苷酸係包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整個長度與SEQ ID NO：6至10或SEQ ID NO：6至10中任一者片段之等效核苷酸序列區域為至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一些態樣中，本發明之iRNA包括正義股，該正義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸反而與標靶HTT序列互補，其中該正義股多核苷酸係包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列係在其整個長度與表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32和33中任一者中之任一反義股核苷酸序列或表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32和33之任一者中任一反義股核苷酸序列的片段為至少約80%互補，諸如約85%、 約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約95%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一個態樣中，對HTT基因之至少部分之阻抑係藉由HTT mRNA量之減少而評估，該HTT mRNA係從第一細胞或細胞之群組中單離或偵檢，於該細胞或細胞之群組中，HTT基因被轉錄，且該細胞或細胞之群組業經治療，使得與基本上與該第一細胞或細胞之群組相同但尚未經如是治療之第二細胞或細胞之群組(對照細胞)相比，HTT基因之表現得以抑制。抑制之程度可藉由下述術語表現：
Figure 109137670-A0202-12-0040-360
如本文中所用，短語「令細胞與RNAi劑接觸」包括藉由任意可能之手段接觸細胞。令細胞與RNAi劑接觸包括在體外令細胞與RNAi劑接觸或在體內令細胞與RNAi劑接觸。該接觸可直接或間接進行。因此，舉例而言，RNAi劑可藉由單獨執行該方法而令其與細胞物理接觸，或作為另一種選擇，可將RNAi劑置於將允許或造成其後續與該細胞接觸之境地。
舉例而言，可藉由使細胞與RNAi劑溫育而令該細胞在體外接觸該RNAi劑。舉例而言，可藉由將RNAi劑注射至細胞所處之組織內或鄰近該組織處，或藉由將RNAi劑注射至另一區域例如中樞神經系統(CNS)，視需要經由鞘內腔注射、玻璃體腔內注射或其他注射，或注射至血流或皮下空間內，使得該劑將後續到達待接觸之細胞所處之組織，從而令該細胞在體內與該RNAi劑接觸。例如，RNAi劑可含有配位子或與其偶 聯，該配位子係例如下文揭示之一個或多個親脂性部分並進一步詳述於例如PCT/US2019/031170中，該專利藉由引用併入本文，該配位子引導或以其他方式安定化位於感興趣之位點例如CNS處之RNAi劑。體外接觸方法與體內接觸方法之組合亦係可能者。舉例而言，細胞可在體外與RNAi劑接觸，並隨後移植入受試者體內。
於一個態樣中，令細胞與RNAi劑接觸包括，藉由促進或影響至該細胞內之攝取或吸收而「將RNAi劑引入或遞送至細胞內」。RNAi劑之吸收或攝取可經由無輔助之擴散或活性細胞進程而進行，或藉由輔助劑或裝置而進行。將RNAi劑引入細胞內可係體外或體內進程。舉例而言，對於體內進行之引入，可將RNAi劑注射至組織部位或系統性給藥。在體外進行之引入細胞內包括該領域中已知之方法，如電穿孔及脂質轉染。其他途徑揭示於下文中或係該領域中已知者。
術語「親脂體」或「親脂性部分」廣泛地指稱具有對於脂質之親和性的任何化合物或化學部分。一種表徵親脂性部分之親脂性的方法係藉由辛醇-水分配係數logKow進行，其中Kow係兩相系統處於平衡狀態時，辛醇相中之化學品濃度與其在水相中之濃度的比率。辛醇-水分配係數係物質之實驗室量測之特性。惟，其亦可使用歸因於化學品之結構組分的係數進行預測，該等係數係使用第一原理或經驗方法計算(參見，例如，Tetko et al.,J.Chem.Inf.Comput.Sci.41：1407-21(2001)，其藉由引用以其整體併入本文)。其提供物質傾向於非水性或油性介質而非水(亦即，其親水/親脂平衡)的熱力學量測。原則上，當化學物質之logKow超過0時，其符合親脂性之特徵。典型地，親脂性部分具備超過1，超過1.5，超過2， 長3，超過4，超過5或超過10之logKow。例如，6-胺基己醇之logKow係例如預測為大約0.7。使用同一方法，膽固醇基N-(己-6-醇)胺基甲酸酯之logKow係預測為10.7。
分子之親脂性可隨其攜帶之官能基而改變。例如，將羥基或胺基團加至親脂性部分之末端，可增加或降低該親脂性部分之分配係數(例如，logKow)值。
另選地，與一個或多個親脂性部分接合至雙股RNAi劑的疏水性可藉由其蛋白質結合特徵而量測。例如，於某些態樣中，雙股RNAi劑之血漿蛋白結合檢定中之未結合部分可確定為與該雙股RNAi劑之相對疏水性正相關，而相對疏水性可與該雙股RNAi劑之靜默活性正相關。
於一個態樣中，血漿蛋白結合檢定係使用人血清白蛋白蛋白質之電泳遷移位移檢定而測定。這一結合檢定之示例性方案係於例如PCT/US2019/031170中詳細例證。藉由該結合檢定中之未結合siRNA部分量測的雙股RNAi劑之疏水性超過0.15，超過0.2，超過0.25，超過0.3，超過0.35，超過0.4，超過0.45戶超過0.5，以增強siRNA之體內遞送。
據此，將親脂性部分接合至雙股RNAi劑之內部位置，提供優化之疏水性，以增強siRNA之體內遞送。
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」係媒介，其包含脂質層，該脂質層封裝藥學活性分子如核酸分子例如RNAi劑或RNAi劑自其轉錄之質體。LNP揭示於，舉例而言，美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號，該等專利之整體內容藉由引用而併入本文。
如本文所用，「受試者」係動物諸如哺乳動物，包括靈長動物(諸如人，非人靈長動物例如猴及黑猩猩)或非領漲動物(諸如大鼠或小鼠)。於一較佳之態樣中，受試者係人，如正在進行對將受益於HTT表現減少之疾病、疾患或病症之治療或評估的人；處於將受益於HTT表現減少之疾病、疾患或病症之風險下的人；罹患將受益於HTT表現減少之疾病、疾患或病症的人；或正在正在進行對將受益於HTT表現減少之疾病、疾患或病症之治療的人，如本文中所述。於一些態樣中，受試者係女人。於一些態樣中，受試者係男人。於一個態樣中，受試者係成年受試者。於一個態樣中，受試者係小兒受試者。於另一態樣中，受試者係青少年受試者，亦即，年齡小於20歲之受試者。
如本文所用，術語「治療」(treating或treatment)指稱有益或所希望之結果，包括但不限於，一種或多種與HTT基因表現或HTT蛋白產生相關者例如HTT相關疾病諸如亨汀頓氏病之跡象或症候的緩解或減輕。「治療」亦可意指相對於在治療缺失情況下預期之生存期而延長生存期。
在受試者之HTT或疾病標記物或症候量級之情境中，術語「降低」指稱此量級之統計學顯著之下降。該下降可係，舉例而言，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。於某些態樣中，下降係至少20%。於某些態樣中，下降係疾病標記物例如蛋白質或基因表現量級之至少50%。於受試者體內之HTT量級的情境中，「降低」較佳係低至如同不具此疾患之個體之正常範圍內所接受的量級。於某些態樣中，「降低」係 苦於疾病之受試者的標記物或症候量級與處於個體正常範圍內所接受量級之間之差異的下降，例如，肥胖個體之體重與正常範圍內所接受體重之間的下降量級。
如本文所用，當關於將受益於HTT基因表現或HTT蛋白產生之減低的疾病、疾患或其病症而使用「預防」或「阻止」時，該術語指稱減低受試者將發展出與此疾病、疾患或病症相關之症候例如HTT相關疾病之症候的可能性。沒有發展出疾病、疾患或症狀，或減小與此疾病、疾患或症狀相關之症候的發展(例如，將該疾病或疾患之臨床可接受規格上減小至少約10%)，或顯現症候之延遲(例如，延遲幾天、幾個禮拜、幾個月或幾年)，係視為有效之預防。
如本文所用，術語「HTT相關疾病」或「HTT相關疾患」理解為將受益於HTT表現及/或活性之減低的任意疾病或疾患。示例性之HTT相關疾病包括亨汀頓氏病。
「亨汀頓氏病」，亦稱為HD、亨汀頓氏舞蹈症、大舞蹈症、慢性進行性舞蹈症及遺傳性舞蹈症，係常染色體顯性遺傳疾患，以舞蹈病狀之舉動及進行性智力衰退為特徵，往往於中年(35至50歲發病)。該疾病對男性及女性的影響均等。尾核萎縮，小細胞群體退化，並且神經傳遞質γ-胺基丁酸(GABA)及物質P下降。這一退化導致特徵性之「方箱腦室」(boxcar ventricle)，CT掃描可見。
HD之症候及跡象隱匿性地發展。HD之最顯見症候係所謂舞蹈症之不正常身體舉動以及協調性之缺乏，但其亦影響多種心智能力及 性格之一些方面。此等物理症候常常在四十幾歲時變得明顯，但可於任意年齡發生。如果發病年齡低於20歲，則稱之為青少年HD。
癡呆或精神紊亂，從冷漠及易怒到全面發展之雙極性障礙或類思覺失調症，可先於運動障礙出現或在運動障礙進程中發展。失樂症或避群行為可能係最早之行為表現。運動表現包括四肢之顫抖舉動、步態輕快、運動保持困難(不能持續運動作動，諸如舌頭伸出)、面部扭曲、共濟失調及緊張不足。
HD係亨汀頓蛋白(HTT)中之三核苷酸重複序列擴張所致，且係重症聚麩醯胺擴張(或PolyQ擴張)疾病之一。這產生突變亨汀頓蛋白(mHtt)之擴張形式，其造成選定之腦部區域內的細胞死亡。
如本文中所用，「治療有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑給藥至患有HTT相關疾病之受試者時，其量足以有效治療該疾病(例如，藉由削弱、緩解或維持現有疾病或疾病之一種或多種症狀)。「治療有效量」可依據RNAi劑、該劑如何給藥、疾病及其嚴重性及待治療之受試者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
如本文中所用，「預防有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑給藥至患有HTT相關疾患之受試者時，其量足以預防或緩解該疾病或該疾病之一種或多種症狀。緩解該疾病包括減緩該疾病之進程或減輕後來發展之疾病的嚴重性。「預防有效量」可依據RNAi劑、該劑如何給藥、疾病風險程度及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族 病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括以可用於任意治療之合理效益/風險比率產生一些所欲之局部或系統性效果之RNAi劑的量。本揭露之方法中採用之RNAi劑可以足以產生可用於此治療之合理效益/風險比率的量給藥。
本文中，短語「藥學上可接受」用以指稱彼等化合物、材料、組成物或劑型，其處於適用於與人類受試者及動物受試者之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症之所謂醫療判斷之範疇內，與合理效益/風險比率相稱。
如本文中所用，短語「藥學上可接受之載子」意指藥學上可接受之材料、組成物或媒介，如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(如，潤滑劑、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、或硬脂酸)、或溶劑封裝材料，其牽涉入將受試化合物從一個器官或身體部分攜帶或運送至另一器官或身體部分。就與製劑至其他成分相容且不損害被治療之受試者而言，每一載劑必須係「可接受」者。可用作藥學上可接受之載劑之材料的一些示例包括：(1)糖類，如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉類，如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；(4)黃蓍膠粉末；(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及滑石；(8)賦形劑，如可可脂及栓蠟；(9)油類，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油及大豆油；(10)二醇類，如丙二醇；(11)多元醇類，如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12) 酯類，如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等張鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩衝溶液；(21)聚酯類、聚碳酸酯類或聚酐類；(22)增積劑，如多肽及胺基酸類；(23)血清組分，如血清白蛋白、HDL及LDL；以及(22)藥學製劑中採用之其他非毒性相容物質。
如本文中所用，術語「樣本」包括從受試者單離之相似體液、細胞或組織的集合，以及受試者體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之示例包括血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。舉例而言，樣本可源自特定之器官、器官之部分、或彼等器官內之體液或細胞。於某些態樣中，樣本可源自腦(例如，全腦或腦之某些節段，例如，紋狀體，或腦內之某些類型之細胞，諸如神經元或膠質細胞(星狀細胞、寡樹突細胞、微膠質細胞))。於一些態樣中，「源自受試者之樣本」指稱從該受試者抽取之血液或自其衍生之血漿或血清。於進一步之態樣中，「源自受試者之樣本」指稱源自受試者之腦組織(或其亞組分)或視網膜組織(或其亞組分)。
II.本揭露之RNAi劑
本文中係揭示抑制HTT基因之表現的RNAi劑。於一態樣中，RNAi劑包括用於抑制細胞中HTT基因表現之雙股核糖核酸(dsRNA)分子，該細胞係諸如處於受試者例如哺乳動物諸如患有HTT相關疾病例如亨汀頓氏病之人的體內。dsRNA包括具有互補區域之反義股，該互補區域與在HTT基因表現中所形成之mRNA的至少一部分互補。互補區域係約15至30個核苷酸或更短之長度。當與表現HTT基因之細胞接觸時，RNAi 劑將該HTT基因(例如，人基因、靈長動物基因、非靈長動物基因)之表現抑制至少50%，如藉由例如PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法所分析，或藉由基於蛋白質之方法所分析，例如藉由使用例如西方印跡法之免疫螢光分子或流式細胞術所分析。於一態樣中，減弱之量級係使用雙螢光素酶檢定方法於Cos7細胞中檢定。
dsRNA包括兩個RNA股，在該dsRNA將被使用之條件下，該兩股互補並雜交以形成雙螺旋結構。dsRNA之一股(反義股)包括互補區域，該互補區域與標靶系列實質上互補且通常完全互補。標靶序列可源自在HTT基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(正義股)包括一區域，該區域與該反義股互補，使得當在適宜條件下組合時，兩股雜交並形成雙螺旋結構。如本文中他處所述，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自互補區域而保護，與作為獨立之寡核苷酸相反。
通常，該雙螺旋結構係15至30個鹼基對之長度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。於某些較佳態樣中，雙螺旋結構係18至25個鹼基對之長度，例如，18至25、18至 24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25個鹼基對之長度，例如，19至21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
同樣地，與標靶序列互補之區域係15至30個核苷酸之長度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度，例如，19至23個核苷酸之長度或21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
於一些態樣中，該雙螺旋區域係19至30個鹼基對之長度。同樣，與標靶序列互補之區域係19至30個核苷酸之長度。
於一些態樣中，dsRNA係15至23個核苷酸之長度，19至23個核苷酸之長度，或25至30個核苷酸之長度。通常，該dsRNA係足夠長，以用作切丁酶之受質。舉例而言，該領域中係習知，長度超過約21 至23個核苷酸之dsRNA可用作切丁酶之受質。具有該領域通常知識者亦應認知，作為裂解標靶之RNA區域最通常係較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。若相關，則mRNA標靶之「一部分」係mRNA標靶之接續序列，其長度足以令其作為RNAi引導之裂解(亦即，經由RISC途徑裂解)的受質。
該領域之熟練人士亦應認知，雙螺旋區域係daRNA之主要官能部分，例如，雙螺旋區域係約15至36個鹼基對，例如，15至36、15至35、15至34、15至33、15至32、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對，例如，19至21個鹼基對。因此，於一態樣中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之所欲RNA為靶向之官能性雙螺旋的程度而言，具有超過30個鹼基對之RNA分子或RNA分子之複合體係dsRNA。因此，具有通常知識之技術人員將認知，於一個態樣中，miRNA係dsRNA。於另一態樣中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一態樣中，可用於靶向HTT表現之RNAi劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在標靶細胞內生成。
本文中所述之dsRNA可復包括一個或多個具有例如1、2、3或4個核苷酸之單股核苷酸突出。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括脫氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於正義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或正義股之5’端、3’端或兩端。
daRNA可藉由該技藝中已知之標準方法合成。本發明之雙股RNAi化合物可使用兩步之過程製備。首先，雙股RNA分子之個體股係單獨製備。隨後，將該等組分股低溫黏合。該siRNA化合物之個體股可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。有機合成提供下述優點：包含非天然或經修飾之核苷酸的寡核苷酸股可輕易製備之。同樣，本發明之單股寡核苷酸可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。
一方面，本揭露之dsRNA包括至少兩個核苷酸序列：正義序列及反義序列。HTT之正義股序列選自由表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33之任一者中提供之序列所成群組，而正義股之反義股之相對應核苷酸序列選自表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33中任一者之序列所成群組。於此方面，該兩個序列之一者與該兩個序列之另一者互補，且該等序列之一者係與在HTT基因之表現中生成之mRNA序列實質上互補。如是，於此方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸揭示為表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33中任一者之正義股(隨從股)，而第二個寡 核苷酸揭示為表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33中任一者之正義股的對應反義股(導引股)。
於一個態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在獨立之寡核苷酸。於另一態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在單個寡核苷酸。
應理解，儘管表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33中之序列揭示為經修飾或接合之序列，但本揭露之RNAi劑之RNA例如本揭露之dsRNA可包含表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33中任一者中詳述之任一序列，其係未經修飾、未經接合、或經不同於表中所述者修飾或接合。例如，儘管表3、9、12、15、17、27、29及32中所示之劑的正義股接合至GalNAc配位子，但此等劑可接合至引導至CNS之遞送的部分，例如，C16配位子，如本文所揭示。親脂性配位子可包括於本申請案中提供之任意位置處。
熟練之人士應知悉，具有約20至23個鹼基對如21個鹼基對之雙螺旋結構的dsRNA業經被稱為在誘導RNA干擾中尤其有效(Elbashir et al.,(2001)EMBO J.,20：6877-6888)。惟，其他人業經發現，更短或更長之RNA雙螺旋結構亦可係有效者(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。於上文揭示之態樣中，憑藉本文中提供之寡核苷酸序列之天性，本文所揭示之dsRNA可包括至少一個長度為最少21個核苷酸之股。可合理地預期，僅在一端或兩端減去幾個核苷酸之較短雙螺旋可能具備與上述dsRNA類似之效果。 因此，具有源自本文所提供之一個序列之至少15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸之序列，且使用以Cos7及10nM濃度之RNA劑進行之體外檢定以及如本文實施例中提供之PCR檢定所測的其抑制HTT基因表現之能力與包含全序列dsRNA相異不超過約5%、10%、15%、20%、25%或30%的dsRNA，係預期處於本揭露之範疇內。
此外，本文所揭示之RNA鑑定HTT轉錄本中易受RISC介導之裂解影響的位點。如是，本揭露復提出位於此位點內之RNAi劑。如本文中所用，如果RNAi劑促進該特定位點內任意處之轉錄本的裂解，則稱該RNAi劑為以RNA轉錄本之特定位點內為靶向。此RNAi劑通常將包括來自本文所提供之一個序列的至少約15個接續核苷酸，較佳至少19個核苷酸，該接續核苷酸與取自HTT基因中所選擇序列之接續區域的另一核苷酸序列偶聯。
III.本揭露的經修飾之RNAi劑
於一態樣中，本揭露之RNAi劑之RNA如dsRNA係未修飾者，且不包含例如該領域中已知及本文所述之化學修飾或接合。於較佳態樣中，本揭露之RNAi劑之RNA如dsRNA經化學修飾以增強安定性或其他有益特徵。於本揭露之某些態樣中，本揭露之RNAi劑之實質上全部核苷酸係經修飾。於本揭露之其他態樣中，本揭露之RNAi劑之全部核苷酸係經修飾。本揭露之其「實質上全部核苷酸係經修飾者」的RNAi劑大多數並非全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。於本揭露之又其他態樣中，本揭露之RNAi劑可包括不超過5、4、3、2或1個經修飾之核苷酸。
本揭露提出之核酸可藉由該領域中良好構建至方法合成或修飾，該方法係例如彼等於《現代核酸化學技術》(「Current protocols in nucleic acid chemistry」,Beaucage,S.L.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中揭示者，該文獻藉由引用而併入本文。修飾包括，舉例而言，末端修飾，例如，5’端修飾(磷醯化、接合、反向鏈結)或3’端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，置換為安定化鹼基、去安定化鹼基、或與同伴之拓展物進行鹼基配對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或接合鹼基；糖修飾(例如，在2’-位置或4’-位置)或糖之置換；或骨幹修飾，包括磷酸二酯類鏈結之修飾或置換。可用於本文所述態樣中之RNAi劑之具體示例包括，但不限於，含有經修飾之骨幹或不含天然核苷酸間鏈結之RNA。具有經修飾之骨幹的RNA除此之外亦包括彼等在骨幹中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，且如該領域中有時參照者，在其核苷酸間骨幹中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。於一些態樣中，經修飾之RNAi劑將在其核苷酸間骨幹中具有磷原子。
經修飾之RNA骨幹包括，舉例而言，具有正常3’-5’鏈結之硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3’-伸烷基磷酸酯類及手性磷酸酯類之甲基及其他烷基磷酸酯類、膦酸酯類、包括3’-胺基磷醯胺化物及胺基烷基磷醯胺化物之磷醯胺化物、硫羰基磷醯胺化物類、硫羰基烷基磷酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及硼磷酸酯類；此等之2’-5’鏈結類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰之核苷單元對係將3’-5’鏈結至5’-3’或將2’-5’鏈結至 5’-2’。亦可包括多種鹽類、混合鹽類及游離酸形式。於本發明之一些態樣中，本發明之dsRNA劑可係游離酸形式。於本發明之其他態樣中，本發明之dsRNA劑可係鹽形式。於一個態樣中，本發明之dsRNA劑可係鈉鹽形式。於某些態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。其中實質上全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結皆具有鈉抗衡離子之劑，包括不超過5、4、3、2或1個沒有鈉抗衡離子之磷酸二酯及/或硫代磷酸酯類鏈結。於一些態樣中，當本發明之dsRNA劑係鈉鹽形式時，鈉離子可作為該劑中存在之全部磷酸二酯及/或硫代磷酸酯基團之抗衡離子而存在於該劑中。
教示上述含磷鏈結之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第 7,273,933號、第7,321,029號、及美國再公告專利第39464號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾之RNA骨幹具有藉由短鏈烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環類核苷酸間鏈結形成的骨幹。此等包括彼等具有N-嗎啉基鏈結(部分地由核苷至糖部分形成)；矽氧烷骨幹；硫醚、亞碸及碸骨幹；甲醯基及硫代甲醯基骨幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨幹；含有伸烷基之骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨幹；磺酸酯及磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；以及其他具有混合之N、O、S及CH2組分部分者。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號、及第5,677,439號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
於其他態樣中，適宜之RNA模擬物預期用於RNAi劑中，其中該核苷酸單元之糖及核苷酸間鏈結兩者亦即骨幹係置換為新穎基團。鹼基單元維持與適宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物，指稱為胜肽核酸(PNA)。於PNA 化合物中，RNA之糖骨幹係置換為含有醯胺之骨幹，尤其是胺基乙基甘油骨幹。核酸鹼基得以保留，且直接或間接地鍵結至骨幹之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。適用於本揭露之RNAi劑中之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本揭露提出之一些態樣包括具有硫代磷酸酯骨幹之RNA以及具有雜原子骨幹之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨幹]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯骨幹表示為--O--P--O--CH2--1，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺骨幹。於一些態樣中，本文提出之RNA具有上文引用之美國專利第US 5,034,506號的N-嗎啉基骨幹結構。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分。本文提出之RNAi劑例如dsRNA可包括位於2’位置之下述之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例性之合適修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m係1至約10。於其他態樣中，dsRNA包括位於2’位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷 基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善RNAi劑之藥物動力學特性之基團、或用於改善RNAi劑之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些態樣中，該修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基。另一示例性修飾係2'-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(該領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。其他示例性修飾包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-脫氧核苷酸(於此三組中，皆係R異構物與S異構物兩者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。類似之修飾亦可在RNAi劑之RNA之其他位置作成，尤其是3’末端核苷酸之糖的3’位置或2’-5’鏈結之dsRNA中以及5’末端核苷酸之5’位置。iRNA亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模擬物如環丁基部分。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第 5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號、及第5,700,920號，此等中之某些為本申請所共有。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
本揭露之RNAi劑亦可包括核酸鹼基(該領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於《生物化學、生物技術及醫藥中之經修飾之核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008)中者；彼等揭露於《聚合物科學及工程之簡明百科》(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990)中者；此等由Englisch et al.,(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30：613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及應用》第15章第289至302頁(Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993)揭露者。此等核酸鹼基中之某些尤其可用於增加本揭露提出之寡聚化合物的結合親和性。此等包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代業經顯示將核酸雙螺旋安定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且係示例性之鹼基取代，尤其是當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾合用時尤甚。
教示某些上述經修飾之核酸鹼基以及其他經修飾之核酸鹼基的代表性美國專利包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾，以包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4’碳之外接橋。這一結構有效地將該核糖“鎖定”為3’-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾，以包括一個或多個雙環糖部分。「雙環糖」係藉由兩個原子之橋接而修飾之呋喃糖基環。「雙環核苷」(「BNA」)係核苷，其具有包含連結該糖環之兩個碳原子之橋的糖部分，從而形成雙環系統。於某些態樣中，該橋連結糖環之4'碳與2'碳。因此，於一些態樣中，本揭露之劑可包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4’碳之外接橋。換言之，LNA係包含雙環糖部分之核苷酸，其中該雙環糖部分包含4'-CH2-O-2’橋。這一結構有效地將該核糖“鎖定”為3’-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本揭露之多核苷酸之雙環核苷的示例包括而不限於，包含位於4'核糖基環原子與2'核糖基環原子間之橋的核苷。於某些態樣中，本揭露之反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4’至2’橋之雙環核苷。此類4’至2’橋接 至雙環核苷的示例包括但不限於，4’-(CH2)-O-2’(LNA)；4’-(CH2)-S-2’；4’-(CH2)2-O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)-O-2’(亦指稱為「受約束之乙基」或「cEt」)及4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第7,399,845號)；4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,283號)；4’-CH2-N(OCH3)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,425號)；4’-CH2-O-N(CH3)-2’(參見，例如，美國專利申請第2004/0171570號)；4’-CH2-N(R)-O-2’，其中R係H、C1-C12烷基、或保護基團(參見，例如，美國專利第7,427,672號)；4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(參見，例如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4’-CH2-C(=CH2)-2’(及其類似物；參見，例如，美國專利第8,278,426號)。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
教示鎖定之核酸核苷酸之製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於下列者：美國專利第6,268,490號、第6,525,191號、第6,670,461號、第6,770,748號、第6,794,499號、第6,998,484號、第7,053,207號、第7,034,133號、第7,084,125號、第7,399,845號、第7,427,672號、第7,569,686號、第7,741,457號、第8,022,193號、第8,030,467號、第8,278,425號、第8,278,426號、第8,278,283號、第2008/0039618號、及第2009/0012281號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
前述雙環核苷之任意者可製備為具有一種或多種立體化學糖組態，包括，舉例而言，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見，WO 99/14226)。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾，以包括一個或多個約束之乙基核苷酸。如本文中所用，「約束之乙基核苷酸」或「cEt」包含雙環糖部分之鎖定之核酸，其中該雙環糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’橋。於一個態樣中，約束之乙基核苷酸係S構形，本文中指稱為「S-cEt」。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾，以包括一個或多個「構形上受限之核苷酸」(「CRN」)。CRN係具有連結核糖之C2’碳與C4’碳或核糖之C3碳與C5'碳之鏈結子的核苷酸類似物。CRN將該核糖鎖定為適宜之構形，且增加其至mRNA之雜交親和性。該鏈接基係足夠長，以將氧置於對於安定性及親和性為最優之位置，從而令核糖不易起皺。
教示上述CRN之製備的代表性專利公開包括但不限於，US 2013/0190383及WO 2013/036868，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
於一些態樣中，本揭露之RNAi劑包含一個或多個作為UNA(未鎖定之核酸)核苷酸之單體。UNA係未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一示例中，UNA亦涵蓋其C1’-C4’鍵(亦即，位於C1’碳與C4’碳間之碳-氧-碳共價鍵)業經移除之單體。於另一示例中，糖之C2’-C3’鍵(亦即，界於C2’碳與C3’碳之間的碳-碳共價鍵)業經移除(參見，Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，藉由引用併入本文)。
教示UNA之製備的代表性美國專利公開包括但不限於，US 8,314,227及美國專利公開第2013/0096289號、第2013/0011922號、及第2011/03130200號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
對RNA分子之末端的潛在安定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2’-O-脫氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)等。這一修飾之揭露可見於WO 2011/005861中。
本揭露之RNAi劑之其他修飾包括5’磷酸酯或5’磷酸酯模擬物，例如位於RNAi劑之反義股的5’末端磷酸酯或磷酸酯模擬物。合適之磷酸酯模擬物揭露於，舉例而言，美國專利公開第2012/0157511號中，其整體內容藉由引用而併入本文。
A.本揭露之包含模體的經修飾之RNAi劑
於本揭露之某些方面，本揭露之雙股RNAi劑包括具有如例如WO 2013/075035中所揭露之化學修飾的劑，該申請之整體內容藉由引用而併入本文。如本文及WO 2013/075035中所示，藉由將一個或多個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體引入RNAi劑之正義股或反義股中，尤其在裂解位點處或鄰近裂解位點處，可獲得傑出之結果。於一些態樣中，RNAi劑之正義股及反義股可以其他方式完全修飾。此等模體之引入中斷正義股或反義股之修飾模式(若存在)。RNAi劑可視需要與親脂性配位子例如C16配位子例如於正義股接合。RNAi劑可視需要經(S)-二醇核酸(GNA)修飾例如於反義股之一個或多個殘基修飾。所得RNAi劑呈遞傑出之基因靜默活性。
據此，本揭露提供能在體內抑制標靶基因(亦即，HTT基因)之表現的雙股RNAi劑。RNAi劑包含正義股及反義股。RNAi劑之各股可15至30個核苷酸之長度。舉例而言，各股可係16至30個核苷酸之長度、17至30個核苷酸之長度、25至30個核苷酸之長度、27至30個核苷酸之長度、17至23個核苷酸之長度、17至21個核苷酸之長度、17至19個核苷酸之長度、19至25個核苷酸之長度、19至23個核苷酸之長度、19至21個核苷酸之長度、21至25個核苷酸之長度、或21至23個核苷酸之長度。於某些態樣中，各股係19至23個核苷酸之長度。
該正義股及反義股典型係形成雙螺旋雙股RNA(“dsRNA”)，本文中亦指稱為“RNAi劑”。RNAi劑之雙螺旋區域可係15至30個核苷酸對之長度。舉例而言，該雙螺旋區域可係16至30個核苷酸對之長度、17至30個核苷酸對之長度、27至30個核苷酸對之長度、17至23個核苷酸對之長度、17至21個核苷酸對之長度、17至19個核苷酸對之長度、19至25個核苷酸對之長度、19至23個核苷酸對之長度、19至21個核苷酸對之長度、21至25個核苷酸對之長度、或21至23個核苷酸對之長度。於另一示例中，該雙螺旋區域係選自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸之長度。於較佳之態樣中，該雙螺旋區域係19至21個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該RNAi劑可含有位於一股或兩股之3’端、5’端或兩端的一個或多個突出區域或封端基團。該突出可係1至6個核苷酸之長度，例如，2至6個核苷酸之長度、1至5個核苷酸之長度、2至5個核苷酸之長度、1至4個核苷酸之長度、2至4個核苷酸之長度、1至3 個核苷酸之長度、2至3個核苷酸之長度、或1至2個核苷酸之長度。於較佳之態樣中，該核苷酸突出區域係2個核苷酸之長度。該等突出可係一股比另一股長之結果，或係相同長度之兩股交錯之結果。該突出可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。該第一股與第二股亦可藉由例如額外之鹼基接合以形成髮夾，或藉由其他非鹼基鏈結子接合。
於一個態樣中，該RNAi劑之突出區域中之核苷酸可各自獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於，2’-糖修飾，諸如，2-F、2’-O-甲基胸苷(T)及其任意組合。
舉例而言，TT可係用於任一股之任一端之突出序列。該突出可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。
位於該RNAi劑之正義股、反義股或二者之5’突出或3’突出可經磷酸化。於一些態樣中，該突出區域含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中該兩個核苷酸可係相同或相異。於一個態樣中，該突出存在於正義股、反義股或兩股之3’端。於一個態樣中，此3’突出存在於反義股。於一個態樣中，此3’突出存在於正義股。
該RNAi劑可僅含有單一突出，該突出可強化該RNAi劑之干擾活性而不影響其整體安定性。舉例而言，該單股突出可位於正義股之3’末端，或者位於反義股之3’末端。該RNAi劑亦可具有鈍端，位於反義股之5’端(或正義股之3’端)，反之亦然。通常，該RNAi之反義股具有位於3’端之核苷酸突出，且5’端係鈍端。儘管不欲受縛於理論，但位於反義 股5’端之不對稱鈍端以及反義股之3’端突出有助於將導引股加載至RISC製程中。
於一個態樣中，該RNAi劑係19個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5’端計數第7、8、9位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於另一態樣中，該RNAi劑係20個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5’端計數第8、9、10位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於又一態樣中，該RNAi劑係21個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5’端計數第9、10、11位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於一個態樣中，該RNAi劑包含21個核苷酸之正義股及23個核苷酸之反義股，其中該正義股含有至少一個位於從5’端計數第9、10、11位置處之三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體；該反義股含有至少一個位於從5’端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體，其中該RNAi劑之一端係鈍端而另一端包含具有2個核苷酸之突出。較佳地，該具有2個核苷酸之突出位於反義股之3’端。當該具有2個核苷酸之突出位於反義股之3’端時，在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者係該突 出核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該突出核苷酸之下一個核苷酸配對。於一個態樣中，該RNAi劑在正義股之5’端及反義股之5’端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。於一個態樣中，該RNAi劑之正義股及反義股中之各個核苷酸，包括作為該等模體之一部分的核苷酸，皆係經修飾之核苷酸。於一個態樣中，各殘基獨立經2’-O-甲基或3’-氟以例如交替模體方式修飾。視需要地，RNAi劑復包含配位子(例如，親脂性配位子，視需要C16配位子)。
於一個態樣中，RNAi劑包含正義股及反義股，其中該正義股係25至30個核苷酸殘基之長度，其中第一股之從5’末端核苷酸(位置1)開始計數之位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；該反義股係36至66個核苷酸殘基之長度，且從3’末端核苷酸開始計數，在與正義股之位置1至23配對以形成雙螺旋之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中至少反義股之3’末端核苷酸未與正義股配對，且至多6個接續之3’末端核苷酸未與正義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3’單股突出；其中反義股之5’末端包含10至30個為與正義股配對之接續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5’突出；其中，當將該正義股與反義股對準以進行最大互補時，至少該正義股之5’末端核苷酸及3’末端核苷酸與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在該正義股與反義股之間形成實質上雙螺旋之區域；以及，反義股在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將該雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現；以及，其中該正義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個2’-F修飾的模體，其中該等模體之至少一者出現在裂解位點或鄰近該裂解位點處。反義股含 有至少一個位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於一個態樣中，RNAi劑包含正義股及反義股，其中該RNAi劑包含具有至少25個且至多29個核苷酸之長度的第一股，以及具有至多30個核苷酸之長度且具有至少一個位於從5’端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸之三個2’-O-甲基修飾之模體的第二股；其中該第一股之3’端及該第二股之5’端形成鈍端，且該第二股於其3’端比該第一股長1至4個核苷酸，其中該雙螺旋區域之長度係至少25個核苷酸，且該第二股在沿著該第二股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將該RNAi劑引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現，以及，其中該RNAi劑之切丁酶裂解優先得到包含該第二股之3’端的siRNA，從而降低該哺乳動物體內之標靶基因的表現。視需要地，RNAi劑復包含配位子。
於一個態樣中，該RNAi劑之正義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中該等模體之一者出現在正義股之裂解位點處。
於一個態樣中，RNAi劑之反義股亦可含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中該等模體之一者出現在反義股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。
對於具有17至23個核苷酸之長度之雙螺旋區域的RNAi劑，該反義股之裂解位點典型位於從5’端計數之位置10、11、12附近。因此，該等三個相同修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11，位置10、11、12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，從該 反義股之5’端的第一個核苷酸開始計數，或在該雙螺旋區域內從該反義股之5’端的第一個配對核苷酸開始計數。反義股之裂解位點亦可根據該RNAi之雙螺旋區域從5’端計數的長度而改變。
RNAi劑之正義股可含有至少一個位於該股之裂解位點處之三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體；且反義股可具有至少一個位於該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。當正義股及反義股形成dsRNA雙螺旋時，該正義股及該反義股可經對準，使得位於該正義股之一個三核苷酸模體與位於該反義股之一個三核苷酸模體具有至少一個核苷酸重疊，亦即，該正義股中模體之三個核苷酸之至少一者與該反義股中模體之三個核苷酸之至少一者鹼基配對。另選地，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
於一個態樣中，RNAi劑之正義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。第一模體可出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處，且其他模體可係側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」指稱出現在該股之另一部位的與位於相同股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之模體分隔開來的模體。側翼修飾或與第一模體相鄰或藉由至少一個或多個核苷酸與第一模體分隔開來。當該等模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性彼此截然不同；而當該等模體藉由一個或多個核苷酸分隔開來時，則該等化學性可相同或相異。可存在兩個或多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，每一側翼修飾可出現在位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之第一模體的一段，或出現在該前導模體之任一側。
與正義股相似，RNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體，且該等模體之至少一者出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。這一反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該側翼修飾之排列類似於可能存在於該正義股之側翼修飾。
於一個態樣中，RNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於該股之3’端、5’端或兩端之最開始的一個或兩個末端核苷酸。
於另一態樣中，RNAi劑之正義股或反義股之側翼修飾典型不包括位於該雙螺旋區域內該股之3’端、5’端或兩端之最開始的一個或兩個配對核苷酸。
當RNAi劑之正義股及反義股各自含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落入該雙螺旋區域之相同端，且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
當RNAi劑之正義股及反義股各自含有至少兩個側翼修飾時，該正義股與該反義股可經對準而使得來自一股之兩個修飾之各者落入該雙螺旋區域之一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；來自一股之兩個修飾之各者落入該雙螺旋區域之另一端且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；一股之兩個修飾分別落入該前導模體之兩端且在該雙螺旋區域內具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
於一個態樣中，RNAi劑包含與標靶之誤配、雙螺旋中之誤配、或其組合。誤配可出現在突出區域內或雙螺旋區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之關聯或解離之自由能，自由能係基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類 似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I係肌苷)。誤配例如非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於一個態樣中，RNAi劑包含，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’端計數最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者係選自下列所成群組：A：U、G：U、I：C、以及誤配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙螺旋之5’端的解離。
於一個態樣中，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’端計數之第1個位置處的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT所成群組。另選地，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’端計數最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者係AU鹼基對。例如，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’端計數之第一個鹼基對係AU鹼基對。
於另一態樣中，位於該正義股之3’端的核苷酸係脫氧胸腺嘧啶(dT)。於另一態樣中，位於該反義股之3’端的核苷酸係脫氧胸腺嘧啶(dT)。於一個態樣中，在正義股或反義股之3’端上存在脫氧胸腺嘧啶核苷酸之短序列，例如，兩個dT核苷酸。
於一個態樣中，正義股序列可藉由式(I)表示：
5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ (I)
其中：
i及j各自獨立為0或1；
p及q各自獨立為0至6；
各Na獨立表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb獨立表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np與nq獨立表示突出核苷酸；
其中，Nb及Y不具有相同之修飾；以及
XXX、YYY及ZZZ各自獨立表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。較佳地，YYY全部為2’-F修飾之核苷酸。
於一個態樣中，Na或Nb包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，YYY模體出現於該正義股之裂解位點。例如，當RNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙螺旋區域時，YYY模體出現於該正義股之裂解位點或其左近(例如，可出現於位置6、7、8；7、8、9；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)，從5’端之第1個核苷酸開始計數；或視需要地，從5’端之雙螺旋區域內第一個配對核苷酸開始計數。
於一個態樣中，i係1且j係0，或i係0且j係1，或i及j兩者均係1。正義股可因此藉由下列式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’ (Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’ (Id)。
當正義股係藉由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
各Na可獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當正義股係藉由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當正義股係藉由式(Id)表示時，各Nb獨立表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb係0、1、2、3、4、5或6。各Na獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
各X、Y及Z可係彼此相同或相異。
於其他態樣中，i係0且j係0，且該正義股可藉由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia)。
當正義股係藉由式(Ia)表示時，各Na獨立表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
於一個態樣中，RNAi之反正義股序列可藉由式(II)表示：
5’nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-Na’-np’3’ (II)
其中：
k及l各自獨立為0或1；
p’及q’自獨立為0至6；
各Na’獨立表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb’獨立表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np’與nq’獨立表示突出核苷酸；
其中，Nb’及Y’不具有相同之修飾；
以及
X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自獨立表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一態樣中，Na’或Nb’包含交替模式之修飾。
Y’Y’Y’模體出現於或鄰近於反義股之裂解位點。例如，當RNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙螺旋區域時，Y’Y’Y’模體出現於該反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，從5’端之第1個核苷酸開始計數；或視需要地，從5’端之雙螺旋區域內第一個配對核苷酸開始計數。較佳地，Y’Y’Y’模體出現於位置11、12、13。
於一態樣中，Y’Y’Y’模體全部為2’-OMe修飾之核苷酸。
於一態樣中，k係1且l係0，或k係0且l係1，或k及l兩者均係1。
反義股可因此藉由下列式表示：
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’3’ (IIb)；
5’nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’3’ (IIc)；或
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’3’ (IId)。
當反義股係藉由式(IIb)表示時，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核 苷酸序列。各Na’獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IIc)時，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股表示為式(IId)時，各Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na’獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb係0、1、2、3、4、5或6。
於其他態樣中，k係0且1係0，且反義股可藉由下式表示：5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’ (Ia)。
當反義股表示為式(Ia)時，各Na’獨立表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’及Z’各自可係彼此相同或相異。
正義股及反義股之各核苷酸獨立經LNA、HNA、CeNA、2’-己氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基或2’-氟修飾。例如，正義股及反義股之各核苷酸獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。特別地，各X、Y、Z、X’、Y’及Z’可表示2’-O-甲基修飾或2’-F修飾。
於一態樣中，當雙螺旋區域係21 nt時，RNAi劑之正義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY模體，從5’端之第一個核苷酸開始計數，或視需要地，在雙螺旋區域內從5’端之第一個配對核苷酸開 始計數；以及，Y表示2’-F修飾。正義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙螺旋區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ各自獨立表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
於一態樣中，反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y’Y’Y’模體，從5’端之第一個核苷酸開始計數，或視需要地，在雙螺旋區域內從5’端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y’表示2’-O-甲基修飾。反義股可額外含有X’X’X’模體或Z’Z’Z’模體作為位於雙螺旋區域之相反末端的側翼修飾；以及，X’X’X’與Z’Z’Z’各自獨立表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之正義股分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙螺旋。
據此，用於本揭露之方法中的RNAi劑可包含正義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙螺旋由式(III)表示：
正義：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
反義：3’np’-Na’-(X’X’X’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(Z’Z’Z’)l-Na’-nq’5’ (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立為0或1；
p、p’、q及q’各自獨立為0至6；
各Na與Na’獨立表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb與Nb’獨立表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
各np’、np、nq’及nq各自可存在或不存在，且獨立表示突出核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自獨立表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一態樣中，i係0且j係0；或i係1且j係0；或i係0且j係1；或i及j兩者均係0；或i及j兩者均係1.於另一態樣中，k係0且l係0；或k係1且l係0；或k係0且l係1；或k及l兩者均係0；或k及l兩者均係1。
形成RNAi雙螺旋之正義股與反義股的示例性組合包括下述各式：
5’np-Na-YYY-Na-nq 3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’5’
(IIIa)
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’np’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na’-nq’5’
(IIIb)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’
3’np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-nq’5’
(IIIc)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’np’-Na’-X’X’X’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-Z’Z’Z’-Na-nq’5’
(IIId)
當RNAi劑係藉由式(IIIa)表示時，各Na獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑係藉由式(IIIb)表示時，各Nb獨立表示包含1至10、1至7、1至5或1至4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑表示為式(IIId)時，各Nb、Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑表示為式(IIId)時，各Nb、Nb’獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na’獨立表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na’、Nb及Nb’獨立包含交替模式之修飾。
於一態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2'-O-甲基修飾或2'修飾。於另一態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2-O-甲基修飾或2氟修飾，且np’>0，以及，至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸。於又一態樣中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2-O-甲基修飾或2氟修飾，np’>0，且至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，以及，正義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子(下文揭示)接合至一個多個GalNAc衍生物。於另一態樣中，當RNAi 劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2-O-甲基修飾或2氟修飾，np’>0，且至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，該正義股接合至一個多個親脂性例如C16(或相關)部分，視需要經由二價或三價分支鏈之鏈結子接合。
於一態樣中，當RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾係2-O-甲基修飾或2氟修飾，np’>0，且至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈結至相鄰核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，該正義股經由二價或三價分支鏈之鏈結子接合至一個多個親脂性例如C16(或相關)部分。
於一態樣中，RNAi劑含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙螺旋的多聚物，其中該等雙螺旋藉由鏈結子連結。鏈結子可係可裂解者或不可裂解者。視需要地，該多聚物復包含配位子。該等雙螺旋可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或該等雙螺旋可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一態樣中，RNAi劑含有3、4、5、6或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙螺旋的多聚物，其中該等雙螺旋藉由鏈結子連結。鏈結子可係可裂解者或不可裂解者。視需要地，該多聚物復包含配位子。該等雙螺旋可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或該等雙螺旋可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一態樣中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之RNAi劑在5’末端及一個或兩個3’末端彼此鏈結，且視需要接合至配 位子。該等劑可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或該等劑可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
多個出版物揭示可用於本揭露之方法中的多聚RNAi劑。此類出版物包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887、WO2011/031520及US 7858769，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
於某些態樣中，本揭露之組成物及方法包括本文所揭示之RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。於示例性態樣中，本揭露之膦酸乙烯酯具有下述結構：
Figure 109137670-A0202-12-0081-361
本揭露之膦酸乙烯酯可附接至本揭露之dsRNA之反義股或正義股。於某些較佳態樣中，本揭露之膦酸乙烯酯附接至dsRNA之反義股，視需要附接在dsRNA之反義股的5’端。
膦酸乙烯酯修飾亦預期用於本揭露之組成物及方法中。示例性膦酸乙烯酯結構係：
Figure 109137670-A0202-12-0081-362
i.熱去安定化修飾
於某些態樣中，藉由將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域(亦即，反義股之5’端的位置2至9)以減低或抑制脫靶基因靜默，從而優化dsRNA分子以用於RNA干擾。業經發現，具有包含位於從反義股5’端計數最先9個核苷酸內之雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾之反義股的dsRNA，具有減低之脫靶基因靜默活性。據此，於一些態樣中，反義股包含位於從反義股5’區域之最先9個核苷酸內之雙螺旋的至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)熱去安定化修飾。於一些態樣中，雙螺旋之一個或多個熱去安定化修飾係位於從反義股5’端之位置2至9處，或較佳位置4至8處。於又一些態樣中，雙螺旋之熱去安定化修飾係位於從反義股5’端之位置6、7或8處。於再一些態樣中，雙螺旋之熱去安定化修飾係位於從反義股5’端之位置7處。術語「熱去安定化修飾」包括將導致dsRNA具有較低總體熔融溫度(Tm)(較佳地，Tm比不具有此類修飾之dsRNA之Tm低一度、兩度、三度或四度)的修飾。於一些態樣中，雙螺旋之熱去安定化修飾係位於從反義股5’端之位置2、3、4、5或9處。
熱去安定化修飾可包括但不限於，無鹼基之修飾；與相反股中相反核苷酸之誤配；以及糖修飾諸如2’-脫氧修飾或非環狀核苷酸，例如未鎖定之核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)。
示例性之無鹼基之修飾包括但不限於下列：
Figure 109137670-A0202-12-0083-363
其中，R=H、Me、Et或OMe；R’=H、Me、Et或OMe；R”=H、Me、Et或OMe
Figure 109137670-A0202-12-0083-364
其中，B係經修飾或未修飾之核酸鹼基。
示例性之糖修飾包括但不限於下列：
Figure 109137670-A0202-12-0083-365
Figure 109137670-A0202-12-0084-366
其中，B係經修飾或未修飾之核酸鹼基。
於一些態樣中，雙螺旋之熱去安定化修飾係選自由下列所成群組：
Figure 109137670-A0202-12-0084-367
其中，B係經修飾或未修飾之核酸鹼基，並且每個結構之星號表示R、S或外消旋。
術語「非環狀核苷酸」指稱具有非環狀核糖之任意核苷酸，例如，其中核糖碳之間的任意鍵(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’或C1’-O4’)係不存在或核糖碳或氧之至少一者(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)獨立地或組合地不存在於該核苷酸中。於一些態樣中，非環狀 核苷酸係
Figure 109137670-A0202-12-0085-368
、
Figure 109137670-A0202-12-0085-369
、
Figure 109137670-A0202-12-0085-370
、
Figure 109137670-A0202-12-0085-371
或
Figure 109137670-A0202-12-0085-372
，其中，B係經修飾或未修飾之核酸鹼基，R1與R2獨立為H、鹵素、OR3或烷基；並且R3係H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖。術語「UNA」指稱未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一示例中，UNA亦涵蓋其C1’-C4’鍵(亦即，位於C1’碳與C4’碳間之碳-氧-碳共價鍵)被移除之單體。於另一示例中，糖之C2'-C3'鍵(亦即，界於C2’碳與C3’碳之間的碳-碳共價鍵)被移除(參見，Mikhailov et.al.,Tetrahedron Letters,26(17)：2059(1985)；以及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,10：1039(2009)，藉由引用以其整體併入本文)。非環狀衍生物提供更大之骨幹可撓性而不影響Watson-Crick配對。非環狀核苷酸可經由2’-5’或3’-5’鏈結而鏈結。
術語「GNA」指稱二醇核酸，其係類似於DNA或RNA但其「骨幹」組成(由藉由磷酸二酯鍵鏈結之重複甘油單元構成)與DNA或RNA有所區別之聚合物：
Figure 109137670-A0202-12-0086-373
雙螺旋之熱去安定化修飾可係熱去安定化核苷酸與dsRNA雙螺旋內相反股之相反核苷酸之間的誤配(亦即，非互補性鹼基對)。示例性誤配鹼基對包括G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、U：T、或其組合。該領域中已知之其他誤配鹼基配對亦適用於本發明。誤配可出現於天然出現之核苷酸之間或經修飾之核苷酸之間，亦即，誤配鹼基配對可出現於來自核苷酸之核糖之獨立修飾之相應核苷酸的核酸鹼基之間。於某些態樣中，dsRNA分子含有至少一個誤配對中之核酸鹼基，其係2’-脫氧核酸鹼基；例如，該2’-脫氧核酸鹼基位於正義股中。
於一些態樣中，反義股之種子區域內的雙螺旋之熱去安定化修飾包括其與標靶mRNA之互補鹼基的W-C H鍵鍵結受損的核苷酸，諸如：
Figure 109137670-A0202-12-0087-374
無鹼基之核苷酸、非環狀核苷酸修飾(包括UNA及GNA)及誤配修飾的更多示例業經詳細揭示於WO 2011/133876中，該專利藉由引用而以其整體併入本文。
熱去安定化修飾亦可包括通用鹼基及磷酸酯修飾，該通用鹼基與相反鹼基形成氫鍵之能力被減低或廢除。
於一些態樣中，雙螺旋之熱去安定化修飾包括具有非規範鹼基之核苷酸，諸如但不限於，其與相反股中之鹼基形成氫鍵的能力受損或被完全廢除的核苷酸修飾。此等核酸鹼基修飾業經評估其對於daRNA雙螺旋之中心區域的去安定化，如WO 2010/0011895中所揭示，該專利藉由引用而以其整體併入本文。示例性核酸鹼基修飾係：
Figure 109137670-A0202-12-0088-375
於一些態樣中，反義股之種子區域內的雙螺旋之熱去安定化修飾包括與標靶mRNA之互補的一個或多個α-核苷酸，諸如：
Figure 109137670-A0202-12-0088-376
其中R係H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
已知相對於天然磷酸二酯鏈結降低dsRNA雙螺旋之熱安定性的示例性磷酸酯修飾係：
Figure 109137670-A0202-12-0088-377
R基團之烷基可係C1-C6烷基。用於R基團之具體烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基及己基。
熟練技術人士應認知，鑒於核酸鹼基之功能角色係定義本揭露之RNAi劑之特異性，而核酸鹼基修飾可以如本文所揭示之各種方式執行例如以將去安定化修飾引入本揭露之RNAi劑中而例如用於相對於脫靶 效應而增強上靶效應的目的，可用並且通常於本揭露之RNAi劑的修飾之範圍傾向於比非核酸鹼基修飾例如對多核糖核苷酸之糖基團或磷酸酯骨幹之修飾大得多。此類修飾更詳細地揭示於本揭露之其他章節中，並且明確為本揭露之RNAi劑所考量，或具備天然核酸鹼基或具備上揭或本文中他處所揭示之修飾核酸鹼基。
除了包含熱去安定化修飾之反義股之外，dsRNA亦可包含一個或多個安定化修飾。舉例而言，daRNA可包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)安定化修飾。無限制地，安定化修飾全部可存在於一股。於一些態樣中，正義股及反義股兩者皆包含至少兩個安定化修飾。安定化修飾可出現於正義股或反義股之任意核苷酸。例如，安定化修飾可出現在正義股及/或反義股之每一個核苷酸；每一安定化修飾可以交替模式出現在正義股或反義股；或正義股或反義股包含交替模式之兩種安定化修飾。正義股之交替模式之安定化修飾可與反義股相同或相異，其正義股之交替模式之安定化修飾可具有相對於反義股之交替模式之安定化修飾的位移。
於一些態樣中，反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)安定化修飾。無限制地，反義股之安定化修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，反義股包含位於自5’端之位置2、6、8、9、14及16的安定化修飾。於一些其他態樣中，反義股包含位於自5’端之位置2、6、14及16處的安定化修飾。於再一些其他態樣中，反義股包含位於自5’端之位置2、14及16的安定化修飾。
於一些態樣中，反義股包含與去安定化修飾相鄰之至少一個安定化修飾。舉例而言，安定化修飾可位於去安定化修飾之5’端或3’端之核苷酸，亦即，位於自該去安定化修飾位置之-1或+1位置。於一些態樣中，反義股包含安定化修飾，該安定化修飾位於去安定化修飾之5’端及3’端中之每一處，亦即，位於自該去安定化修飾位置之-1及+1位置。
於一些態樣中，反義股包含至少兩個安定化修飾，該安定化修飾位於去安定化修飾之3’端，亦即，位於自該去安定化修飾位置之+1及+2位置。
於一些態樣中，正義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)安定化修飾。無限制地，正義股之安定化修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，正義股包含位於自5’端之位置7、10及11的安定化修飾。於一些其他態樣中，正義股包含位於自5’端之位置7、9、10及11的安定化修飾。於一些態樣中，正義股包含安定化修飾，該安定化修飾位於與反義股之自該反義股5’端之位置11、12及15相反或互補的位置。於一些其他態樣中，正義股包含安定化修飾，該安定化修飾位於與反義股之自該反義股5’端之位置11、12、13及15相反或互補的位置。於一些態樣中，正義股包含兩個、三個或四個安定化修飾之嵌段。
於一些態樣中，正義股不包含位於與反義股之該雙螺旋之熱去安定化修飾相反或互補之位置的安定化修飾。
示例性之熱安定化修飾包括但不限於，2’-氟修飾。其他熱安定化修飾包括但不限於，LNA。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA包含至少四個(例如，四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)2’-氟核苷酸。無限制地，2’-氟核苷酸全部可存在於一股。於一些態樣中，正義股及反義股兩者皆包含至少兩個2’-氟核苷酸。2’-氟修飾可出現於正義股或反義股之任意核苷酸。例如，2’-氟修飾可出現在正義股及/或反義股之每一個核苷酸；每一2’-氟修飾可以交替模式出現在正義股或反義股；或正義股或反義股包含交替模式之兩種2’-氟修飾。正義股之交替模式之2’-氟修飾可與反義股相同或相異，其正義股之交替模式之2’-氟修飾可具有相對於反義股之交替模式之2’-氟修飾的位移。
於一些態樣中，反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)2’-氟核苷酸。無限制地，反義股中之2’-氟修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，反義股包含位於自5’端之位置2、6、8、9、14及16的2’-氟核苷酸。於一些其他態樣中，反義股包含位於自5’端之位置2、6、14及16的2’-氟核苷酸。於再一些其他態樣中，反義股包含位於自5’端之位置2、14及16的2’-氟核苷酸。
於一些態樣中，反義股包含與去安定化修飾相鄰之至少一個2’-氟核苷酸。舉例而言，2’-氟核苷酸可位於去安定化修飾之5’端或3’端之核苷酸，亦即，位於自該去安定化修飾位置之-1或+1位置處。於一些態樣中，反義股包含2’-氟核苷酸於去安定化修飾之5’端及3’端之各者中，亦即，位於自該去安定化修飾位置之-1及+1位置。
於一些態樣中，反義股包含至少兩個2’-氟核苷酸，該2’-氟核苷酸位於去安定化修飾之3’端，亦即，位於自該去安定化修飾位置之+1及+2位置處。
於一些態樣中，正義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)2’-氟核苷酸。無限制地，正義股中之2’-氟修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，正義股包含位於自5’端之位置7、10及11的2’-氟核苷酸。於一些其他態樣中，正義股包含位於自5’端之位置7、9、10及11的2’-氟核苷酸。於一些態樣中，正義股包含2’-氟核苷酸，該2’-氟核苷酸位於與反義股之自該反義股5’端之位置11、12及15相反或互補的位置。於一些其他態樣中，正義股包含2’-氟核苷酸，該2’-氟核苷酸位於與反義股之自該反義股5’端之位置11、12、13及15相反或互補的位置。於一些態樣中，正義股包含兩個、三個或四個2’-氟核苷酸之嵌段。
於一些態樣中，正義股不包含位於與反義股之該雙螺旋之熱去安定化修飾相反或互補之位置的2’-氟核苷酸。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含21個核苷酸之正義股及23個核苷酸之反義股，其中該反義股含有至少一個熱去安定化核苷酸，其中該至少一個熱去安定化核苷酸出現於反義股之種子區域(亦即，位於反義股5’端之位置2至9處)，其中dsRNA之一端係鈍端，而另一端包含2 nt之突出，亦即，其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2’-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代 磷酸酯類核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配位子接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；以及(vii)dsRNA包含位於反義股5’端之鈍端。較佳地，該2 nt之突出位於反義股之3’端。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含正義股及反義股，其中：該正義股係25至30個核苷酸殘基之長度，其中該股從5’末端核苷酸(位置1)開始之位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；該反義股係36至66個核苷酸殘基之長度，且從3’末端核苷酸開始，在與正義股之位置1至23配對以形成雙螺旋之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中至少反義股之3’端核苷酸未與正義股配對，且至多6個接續之3’端核苷酸未與正義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3’單股突出；其中反義股之5’末端包含10至30個為與正義股配對之接續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5’突出；其中，當將該正義股與反義股對準以進行最大互補時，至少該正義股之5’末端核苷酸及3’末端核苷酸與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在該正義股與反義股之間形成實質上雙螺旋之區域；以及，反義股在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將該雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現；以及，其中該反義股含有至少一個熱去安定化核苷酸，其中至少一個熱去安定化核苷酸位於反義股之種子區域內(亦即，位於反義股5’端之位置2至9)。舉例而言，熱去安定化核苷酸出現於與正義股之5’端之位置14至17相反或互補的位置之間，並且其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、 4、5或6個2’-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配位子接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；以及(vii)dsRNA包含長度為12至30個核苷酸對之雙螺旋區域。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含正義股及反義股，其中該dsRNA分子包含長度為至少25個核苷酸並且最多為29個核苷酸之正義股以及長度至多為30個核苷酸之反義股，且正義股包含位於自5’端起位置11的對於酶降解敏感之修飾核苷酸，其中該正義股之3’端及該反義股之5’端形成鈍端，並且該反義股於其3’端比正義股長1至4個核苷酸，其中雙螺旋區域之長度為至少25個核苷酸，並且當將該dsRNA分子引入哺乳動物細胞內時，該反義股沿著該反義股之至少19 nt與標靶mRNA充分互補以減低標靶基因表現，並且其中該dsRNA之切丁酶裂解優先導致包含該反義股之該3’端的siRNA，從而減低哺乳動物體內標靶基因之表現，其中該反義股含有至少一個熱去安定化核苷酸，其中該至少一個熱去安定化核苷酸位於反義股之種子區域中(亦即，位於反義股5’端之位置2至9)，並且其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2’-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配位子接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(vi) dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；以及(vii)dsRNA具有長度為12至29個核苷酸對之雙螺旋區域。
於一些態樣中，dsRNA分子之正義股及反義股中的每個核苷酸可經修飾。各核苷酸可藉由相同或相異之修飾而經修飾，該等修飾可包括非鏈結性磷酸酯氧之一者或兩者或鏈結性磷酸酯氧之一者或多者的一個或多個變更；核糖之構建的變更，如核糖2’-羥基之變更；以「去磷」鏈結子進行之磷酸酯部分的整體置換；天然出現之鹼基的修飾或置換；以及核糖-磷酸酯骨幹的置換或修飾。
由於核酸係子單元之聚合物，該等修飾之多數出現在核酸內重複之位置，如，鹼基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鏈結性O的修飾。於一些情形中，該修飾將出現在該核酸之所有受試者位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3’或5’末端位置，可僅出現在末端區域，例如，出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最後2、3、4、5或10個核苷酸內。修飾可出現在雙股區域內、單股區域內、或兩者內。修飾可僅出現在RNA之雙股區域內，或僅出現在RNA之單股區域內。例如，位於非鏈結性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一端或兩端；可僅出現在末端區域，例如出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最後2、3、4、5或10個核苷酸內；或可出現在雙股區域及單股區域內，尤其是在末端。一個或多個5’端可經磷酸化。
下述係可能者，例如，提升安定性，在突出中包括特定之鹼基，或在單股突出如5’突出或3’突出或兩者包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在突出中包括嘌呤核苷酸。於一些態樣中， 3’或5’突出中之全部或一些鹼基可經修飾，如具有本文所述之修飾。修飾可包括，例如，使用在核糖之2’位置具有該領域中已知之修飾者，如使用脫氧核糖核苷酸，使用2’-脫氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾者替代核酸鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾如硫代磷酸酯修飾。突出無需與標靶序列同源。
於一些態樣中，該正義股及反義股之各殘基獨立經LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脫氧或2’-氟修飾。該股可含有超過一個修飾。於一些態樣中，該正義股及反義股之各殘基獨立經2’-O-甲基或2’-氟修飾。應理解，此等修飾係額外於存在於反義股之雙螺旋的至少一個熱去安定化修飾者。
至少兩個相異之修飾典型存在於該正義股及反義股。彼等兩個修飾可係2’-脫氧、2’-O-甲基或2’-氟修飾、非環狀核苷酸等。於一些態樣中，正義股及反義股各自包含選自2’-O-甲基或2’-去氧之兩個不同的修飾核苷酸。於一些態樣中，正義股及反義股之各殘基獨立地經2’-O-甲基核苷酸、2’-脫氧核苷酸、2’-脫氧-2’-氟核苷酸、2’-O-N-甲基乙醯胺基(2’-O-NMA)核苷酸、2’-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)核苷酸、2’-O-胺基丙基(2’-O-AP)核苷酸或2’-ara-F核苷酸予以修飾。再次應理解，此等修飾係額外於存在於反義股中雙螺旋的至少一個熱去安定化修飾者。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含交替模式之修飾，尤其於B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、B4’區域中。如本文中所用，術語「交替模體」指稱具有一個或多個修飾之模體，每一修飾出現在一股之交替核苷酸。交替核苷酸可指稱每兩個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類 似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可係「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」或「ABCABCABCABC…」等。
交替模體中含有之修飾的類型可係相同或相異。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體亦即每兩個核苷酸之修飾可係相同，但正義股或反義股可各自選自交替模體如「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」或「CDCDCD…」等中修飾之若干可能性。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含，正義股之交替模體的修飾模式相對於該反義股之交替模體的修飾模式位移。該位移可使得正義股之核苷酸的修飾基團與反義股之核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當正義股與反義股在dsRNA雙螺旋中鹼基配對時，在該雙螺旋區域內，正義股之交替模體可始於該股之5’-3’之「ABABAB」，且反義股之交替模體可始於該股之3’-3’之「BABABA」。作為另一實例，在雙螺旋區域內，正義股之交替模體可始於該股之5’-3’之「AABBAABB」，且反義股之交替模體可始於該股之3’-3’之「BBAABBAA」，因此正義股與反義股之間存在修飾模式之完全或部分位移。
本揭露之dsRNA分子可復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾可出現在正義股或反義股或兩者之位於該股任意位置之任意核苷酸。例如，核苷酸間鏈結修飾可出現在正義股及/或反義股之每一個核苷酸；每 一核苷酸間鏈結修飾可以交替模式出現在正義股或反義股；或正義股或反義股包含交替模式之兩種核苷酸間鏈結修飾。正義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可與反義股相同或相異，其正義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可具有相對於反義股之交替模式之核苷酸間鏈結修飾的位移。
於一些態樣中，dsRNA分子包含位於突出區域之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。例如，突出區域包含兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾亦可作成以將該突出核苷酸與雙螺旋區域內之末端配對核苷酸鏈結。例如，至少2、3、4或全部突出核苷酸可經由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結而鏈結，且視需要地，可存在將突出核苷酸與作為該突出核苷酸之下一個成對核苷酸鏈結的額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。例如，在末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸係緊鄰該突出核苷酸之下一個配對核苷酸。較佳地，此等末端三個核苷酸可位於反義股之3’端。
於一些態樣中，dsRNA分子之正義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之兩個或十個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的1至10個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該正義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的反義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的反義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之兩個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之三個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之四個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之六個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7或8個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之七個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5或6個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之八個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類 核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3或4個磷酸酯類核苷酸間鏈結分隔之九個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸鏈結的二個嵌段，其中該硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結之一被置於該寡核苷酸序列之任意位置，並且該反義股與包含硫代硫酸酯類、甲基膦酸酯類及磷酸酯類核苷酸間鏈結之任意組合的正義股或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鏈結的正義股配對。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股或反義股之末端位置1至10內的一個或多個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。舉例而言，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可經由硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結而鏈結於正義股或反義股之一端或兩端。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含位於正義股或反義股各自之雙螺旋內部區域1至10內的一個或多個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結。舉例而言，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可經由硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結而鏈結於自正義股之5’末端計數之雙螺旋區域的位置8至16；dsRNA分子可視需要復包含末端位置1至10內的一個或多個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的一至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的一至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義 股(自5’末端計數)之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置20及21的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21處的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置20及21的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位位置21及22的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21及22的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置22及23的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含正義股(自5’-端計數)之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置21的一個 硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾，以及反義股(自5’端計數)之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾及位置23及23的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結修飾。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含骨幹手性中心之模式。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少5個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少6個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少7個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少8個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少9個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少10個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少11個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少12個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少13個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少14個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少15個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少16個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少17個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少18個Sp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少19個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過8個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態 樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過7個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過6個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過5個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過4個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過3個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過2個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過1個Rp組態之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過8個非手性(作為非限制性示例，磷酸二酯)之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過7個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過6個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過5個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過4個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過3個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過2個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含不超過1個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少10個Sp組態之核苷酸間鏈結，以及不超過8個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少11個Sp組態之核苷酸間鏈結，以及不超過7個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少12個Sp組態之核苷酸間鏈結，以及不超過6個非手性 之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少13個Sp組態之核苷酸間鏈結，以及不超過6個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少14個Sp組態之核苷酸間鏈結，以及不超過5個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，骨幹手性中心之共有模式包含至少15個Sp組態之核苷酸間鏈結，以及不超過4個非手性之核苷酸間鏈結。於一些態樣中，Sp組態之核苷酸間鏈結視需要係接續者或非接續者。於一些態樣中，Rp組態之核苷酸間鏈結視需要係接續者或非接續者。於一些態樣中，非手性之核苷酸間鏈結視需要係接續者或非接續者。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含嵌段，該嵌段係立體化學嵌段。於一些態樣中，嵌段係Rp嵌段，其中該嵌段之各核苷酸間鏈結係Rp。於一些態樣中，5’-嵌段係Rp嵌段。於一些態樣中，3’-嵌段係Rp嵌段。於一些態樣中，嵌段係Sp嵌段，其中該嵌段之各核苷酸間鏈結係Sp。於一些態樣中，5’-嵌段係Sp嵌段。於一些態樣中，3’-嵌段係Sp嵌段。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含Rp嵌段及Sp嵌段二者。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含一個或多個Rp嵌段但不包含Sp嵌段。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含一個或多個Sp嵌段但不包含Rp嵌段。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含一個或多個PO嵌段，其中各核苷酸間鏈結係天然磷酸酯鏈結。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含5’-嵌段，該嵌段係Sp嵌段，其中各糖部分包含2’-F修飾。於一些態樣中，5’-嵌段係Sp嵌段，其中各核苷酸間鏈結係經修飾之核苷酸間鏈結，並且各糖部分包含2’-F修 飾。於一些態樣中，5’-嵌段係Sp嵌段，其中各核苷酸間鏈結係經硫代磷酸酯類鏈結，並且各糖部分包含2’-F修飾。於一些態樣中，5’-嵌段包含4個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，5’-嵌段包含5個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，5’-嵌段包含6個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，5’-嵌段包含7個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3’-嵌段係Sp嵌段，其中各糖部分包含2’-F修飾。於一些態樣中，3’-嵌段係Sp嵌段，其中各核苷酸間鏈結係經修飾之核苷酸間鏈結，並且各糖部分包含2’-F修飾。於一些態樣中，3’-嵌段係Sp嵌段，其中各核苷酸間鏈結係經硫代磷酸酯類鏈結，並且各糖部分包含2’-F修飾。於一些態樣中，3’-嵌段包含4個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3’-嵌段包含5個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3’-嵌段包含6個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3’-嵌段包含7個或更多個核苷酸單元。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含位於一區域中之一種類型的核苷酸或寡核苷酸，其後為特定類型之核苷酸間鏈結，例如，天然磷酸酯鏈結、經修飾之核苷酸間鏈結、Rp手性核苷酸間鏈結、Sp手性核苷酸間鏈結等。於一些態樣中，A之後係Sp。於一些態樣中，A之後係Rp。於一些態樣中，A之後係天然磷酸酯鏈結(PO)。於一些態樣中，U之後係Sp。於一些態樣中，U之後係Rp。於一些態樣中，U之後係天然磷酸酯鏈結(PO)。於一些態樣中，C之後係Sp。於一些態樣中，C之後係Rp。於一些態樣中，C之後係天然磷酸酯鏈結(PO)。於一些態樣中，G之後係Sp。於一些態樣中，G之後係Rp。於一些態樣中，G之後係天然磷酸酯鏈結(PO)。於一些態樣中，C及U之後係Sp。於一些態樣中，C及U之後係Rp。於 一些態樣中，C及U之後係天然磷酸酯鏈結(PO)。於一些態樣中，A及G之後係Sp。於一些態樣中，A及G之後係Rp。
於一些態樣中，反義股包含核苷酸位置21與22之間以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，其中反義股含有定位在反義股之種子區域內(亦即，位於反義股之5’端的位置2至9處)的雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾，並且其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2’-氟修飾；(ii)反義股包含3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配位子接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；(vii)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對之雙螺旋區域；以及(viii)dsRNA具有反義股5’端之鈍端。
於一些態樣中，反義股包含核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，其中反義股含有定位在反義股之種子區域內(亦即，位於反義股之5’端的位置2至9處)的雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾，並且其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2’-氟修飾；(ii)正義股與配位子接合；(iii)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(iv)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(v)dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；(vi)dsRNA包含長 度為12至40個核苷酸對之雙螺旋區域；(vii)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對之雙螺旋區域；以及(viii)dsRNA具有反義股5’端之鈍端。
於一些態樣中，正義股包含核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，其中反義股含有定位在反義股之種子區域內(亦即，位於反義股之5’端的位置2至9處)的雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾，並且其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2’-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配位子接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(v)正義股包含3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；(vii)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對之雙螺旋區域；以及(viii)dsRNA具有反義股5’端之鈍端。
於一些態樣中，正義股包含核苷酸位置1與2之間以及核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，反義股包含核苷酸位置1與2之間、核苷酸位置2與3之間、核苷酸位置21與22之間以及核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結，其中反義股含有定位在反義股之種子區域內(亦即，位於反義股之5’端的位置2至9處)的雙螺旋之至少一個熱去安定化修飾，並且其中dsRNA視需要復具有下述特徵之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2’-氟修飾；(ii)正義股與配位子接合；(iii)正義股包含2、3、4或5個2’-氟修飾；(iv)正義股包含3、4或5個硫代 磷酸酯類核苷酸間鏈結；(v)dsRNA包含至少四個2’-氟修飾；(vi)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對之雙螺旋區域；以及；(vii)dsRNA具有反義股5’端之鈍端。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含與標靶之誤配、雙螺旋內之誤配、或其組合。誤配可出現在突出區域內或雙螺旋區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之關聯或解離之自由能，自由能係基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I係肌苷)。誤配例如非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’端最前之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者可獨立選自下列所成群組：A：U、G：U、I：C、以及誤配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙螺旋之5’端的解離。
於一些態樣中，雙螺旋區域內從反義股之5’端之第1個位置處的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT所成群組。另選地，雙螺旋區域內從反義股之5’末端之最前之第1、2或3個鹼基對的至少一者係AU鹼基對。例如，該雙螺旋區域內從反義股之5’端之第一個鹼基對係AU鹼基對。
已發現，將4’-修飾或5’-修飾之核苷酸引入單股或雙股寡核苷酸任意位置處之二核苷酸的磷酸二酯類(PO)、硫代磷酸酯類(PS)或二硫代磷酸酯類(PS2)鏈結的3’-端，可對該核苷酸間鏈結發揮立體效應，並因此保護或安定化該鏈結以對抗核酸酶。
於一些態樣中，將5’-修飾之核苷引入單股或雙股siRNA任意位置處之二核苷酸的3’端。例如，可將5’-烷基化之核苷引入單股或雙股siRNA任意位置處之二核苷酸的3末端。核糖之5’位置處的烷基基團可係外消旋物或手性純R或S異構物。示例性5’-烷基化之核苷係5’-甲基核苷。5’-甲基可係外消旋物或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將4’-修飾之核苷引入單股或雙股siRNA任意位置處之二核苷酸的3’端。例如，可將4’-烷基化之核苷引入單股或雙股siRNA任意位置處之二核苷酸的3’端。位於核糖之4’位置處的烷基基團可係外消旋物或手性純R或S異構物。示例性4’-烷基化之核苷係4’-甲基核苷。4’-甲基可係外消旋物或手性純R或S異構物。另選地，可將4’-O-烷基化之核苷引入單股或雙股siRNA任意位置處之二核苷酸的3’端。核糖之4’-O烷基可係外消旋物或手性純R或S異構物。示例性4’-O-烷基化之核苷係4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可係外消旋物或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將5’-烷基化之核苷引入dsRNA之正義股或反義股的任意位置處，並且此類修飾維持或改進dsRNA之效力。5’-烷基可係外消旋物或手性純R或S異構物。示例性5’-烷基化之核苷係5’-甲基核苷。5’-甲基可係外消旋物或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將4’-烷基化之核苷引入dsRNA之正義股或反義股的任意位置處，並且此類修飾維持或改進dsRNA之效力。4’-烷基可係外消旋物或手性純R或S異構物。示例性4’-烷基化之核苷係4’-甲基核苷。4’-甲基可係外消旋物或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將4’-O-烷基化之核苷引入dsRNA之正義股或反義股的任意位置處，並且此類修飾維持或改進dsRNA之效力。5’-烷基可係外消旋物或手性純R或S異構物。示例性4’-O-烷基化之核苷係4’-O-甲基核苷。4’-O-甲基可係外消旋物或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子可包含2’-5’鏈結(與2’-H、2’-OH及2’-OMe鏈結以及與P=O或P=S鏈結)。舉例而言，2’-5’鏈結修飾可用來促進核酸酶抗性或用來抑制正義股與反義股之結合，或可用於正義股之5’末端以避免正義股被RISC激活。
於另一態樣中，本揭露之dsRNA分子可包含L-糖(例如，L-核糖、L-阿拉伯糖，其具有2’-H、2’-OH及2’-OMe)。舉例而言，此等L-糖可用來促進核酸酶抗性或用來抑制正義股與反義股之結合，或可用於正義股之5’末端以避免正義股被RISC激活。
多個出版物揭示可用於本揭露之dsRNA中的多倍體siRNA。此類出版物係包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自藉由引用而以其整體併入本文。
如下文中更詳細揭示，含有一個或多個碳水化合物部分至RNAi劑之接合的RNAi劑可優化該RNAi劑之一種或多種特性。於多種 情形中，碳水化合物部分將附接至該RNAi劑之經修飾之子單元。例如，dsRNA劑之一個或多個核糖核苷酸子單元的核糖可替換為另一部分，如其上附接有碳水化合物配位子之非碳水化合物(較佳係環狀)載劑。本文中，其子單元之核糖業經如是替換的核糖核苷酸子單元指稱為核糖置換修飾子單元(RRMS)。環狀載子可係碳環系統，亦即，所有環原子皆係碳原子；或係雜環系統，亦即，一個或多個環原子可係雜環如氮、氧、硫。環狀載子可係單環系統，或可含有兩個或多個環如稠環。環狀載子可係完全飽和之環系統，或其可含有一個或多個雙鍵。
配位子可經由載子附接至多核苷酸。載子包括(i)至少一個「骨幹附接點」，較佳兩個「骨幹附接點」，以及(ii)至少一個「繫帶附接點」。如本文中所用，「骨幹附接點」指稱官能基如羥基，或通常係鍵，其可用於且適用於將該載劑併入核糖核酸之骨幹如磷酸酯或經修飾之磷酸酯如含硫之骨幹中。於一些態樣中，「繫帶附接點」(TAP)指稱環狀載子之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供骨幹附接點之原子截然不同)，其連結所選擇之部分。該部分可係例如碳水化合物，如單糖、二醣、三醣、四醣、寡醣及多醣。視需要地，所選擇之部分係藉由中介繫帶連結至該患者載劑。因此，環狀載子一般將包括官能基例如胺基，或通常提供適用於將另一化學實體如配位子併入或繫帶至構建環的鍵。
RNAi劑可經由載劑接合至配位子，其中載劑可係環狀基團或非環狀基團；較佳地，環狀基團係選自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌
Figure 109137670-A0202-12-0115-95
基、[1,3]二氧雜環戊烷基、
Figure 109137670-A0202-12-0115-96
唑烷基、異
Figure 109137670-A0202-12-0115-97
唑烷基、嗎啉基、噻唑啉基、異噻唑啉基、喹
Figure 109137670-A0202-12-0115-98
啉基、嗒
Figure 109137670-A0202-12-0115-99
酮基、四 氫呋喃基及十氫萘基；較佳地，該非環狀基團係選自絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹。
於某些具體態樣中，用於本揭露之方法中的RNAi劑係選自由表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32及33中任一者中所列之劑所組成的組。此等劑可復包含配位子。
IV.接合至配位子之iRNA
本發明之iRNA之RNA的另一修飾牽涉將一個或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取之配位子、部分或接合物化學鏈結至該iRNA。此等部分包括但不限於脂質部分如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)、膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚例如綠柱石基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚醯基部分(Mishra et al., Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
於某些態樣中，配位子改變其所併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。於一些態樣中，配位子提供比缺失此配位子者增強的對於所選標靶如分子、細胞或細胞類型、腔室如細胞或器官之腔室、組織、器官或身體區域之親和性。典型之配位子將不參與雙螺旋核酸中之雙螺旋配對。
配位子可包括天然出現之物質，例如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖、聚三葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精或玻尿酸)；或脂質。配位子亦可係重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之示例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之示例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、胜肽模擬性聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、或α-螺旋胜肽。
配位子亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其結合至特定之細胞類型如腎細胞。靶向基團可係促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑 蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、生物素、或RGD胜肽或RGD胜肽模擬物。於某些態樣中，配位子係多價半乳糖，例如，N-乙醯基-半乳胺糖。
配位子之其他示例包括染料；嵌入劑(例如，吖啶類)；交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)；卟啉類(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)；多環芳烴(例如，啡
Figure 109137670-A0202-12-0118-100
、二氫啡
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)；人工核酸內切酶(例如，EDTA)；親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或啡
Figure 109137670-A0202-12-0118-102
)；以及胜肽複合物(例如，觸角足突變肽、Tat胜肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記至標記物、酵素、半抗原(如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑複合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配位子可係蛋白質如醣蛋白、或胜肽如具有對於共配位子之特異親和性的分子、或抗體如結合至特定細胞類型諸如癌細胞、內皮細胞或骨細胞之抗體。配位子亦可包括激素及激素受體。它們亦可包括非胜肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、或多 價果糖。配位子可係，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κ B之活化劑。
配位子可係例如藥物之物質，其可藉由例如擾亂細胞之細胞骨幹如藉由擾亂細胞之微管、微絲或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物可係，舉例而言，紫杉(taxon)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、杰普肯諾得(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆環肽(phalloidin)、司文何諾得(swinholide)A、吲達諾欣(indanocine)、或美瑟文(myoservin)。
於一些態樣中，附接至本文中所述之iRNA的配位子用作藥物動力學調節子(PK調節子)。PK調節子包括親脂質物、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、胜肽、蛋白結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節子包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經鞘脂質、萘普生、布洛芬、維生素E、生物素等。包含大量硫代硫酸酯類鏈結之寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白，因此在骨幹中包含多個硫代磷酸酯類鏈結之短寡核苷酸如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配位子(如，作為PK調節配位子)而適用於本發明。此外，於本文所揭示之態樣中，結合血清組分(例如，血清蛋白)之適配體亦適用於作為PK調節性配位子而使用。
本發明之接合有配位子之iRNA可藉由使用承載側鏈反應性官能度之寡核苷酸如衍生自將鏈結分子附接在寡核苷酸(揭示於下)而合成。這一反應性寡核苷酸可直接與可商購之配位子、合成為承載多種保護基團之任一者的配位子、或具有附接於其上之鏈結部分的配位子反應。
於本發明之接合物中使用之寡核苷酸可經由習知之固相合成技術便利且常規性地合成。用於此合成之設備可由多個供應商販售，包括，舉例而言，Applied Biosystems®(Foster City,Calif.)。可額外地或作為另一種選擇地採用該領域中已知之用於此合成之任何其他手段。使用類似技術來製備其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物亦係已知者。
於本發明之接合有配位子之寡核苷酸及承載序列特異性鏈結之核苷的配位子分子中，該寡核苷酸及寡核苷可在合適DNA合成器使用標準核苷酸或核苷前驅物、或已經承載鏈結部分之核苷酸或核苷接合前驅物、已經承載配位子分子之配位子-核苷酸或核苷接合前驅物、或承載配位子之非核苷酸構建模塊而組裝。
當使用已經承載鏈結部分之核苷酸接合前驅物時，典型係完成序列特異性鏈結之核苷的合成，隨後將該配位子分子與該鏈結部分反應以形成接合有配位子之寡核苷酸。於一些態樣中，本發明之寡核苷酸或經鏈結之核苷係藉由自動合成器使用除可商購且常規用於寡核苷酸合成中之標準亞磷醯胺及非標準亞磷醯胺以外之衍生自配位子-核苷接合物之亞磷醯胺來合成。
A.脂質接合物
於某些態樣中，配位子或接合物係脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子典型可結合血清蛋白諸如人血清白蛋白(HSA)。HSA結合配位子允許接合物分佈於標靶組織，如非腎臟之身體標靶組織。舉例而言，標靶組織可係肝臟，包括肝臟之實質細胞。可結合HSA之其他分子亦可用作配位子。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質 或基於脂質之配位子可(a)增加對於接合物降解之抗性，(b)增加對標靶細胞或細胞膜之靶向或遞送，或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配位子可用以調節例如控制(例如，抑制)接合物結合至標靶組織。舉例而言，與HSA之結合更強的脂質或基於脂質之配位子將更不可能靶向腎臟，並因此更不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配位子可用來令接合物靶向腎臟。
於某些態樣中，基於脂質之配位子結合HSA。例如，配位子可以足夠之親和性結合HSA，使得接合物至非腎臟組織之分佈得以增強。惟，親和性之強度典型係不足以導致該HSA-配位子之結合稱為不可逆者。
於某些態樣中，基於脂質之配位子與HSA之結合弱或根本不結合，使得接合物至腎臟之分佈得以增強。靶向腎細胞之其他部分亦可用於替換該基於脂質之配位子或與該基於脂質之配位子同時使用。
於另一方面，配位子係被標靶細胞例如增殖細胞攝取之部分例如維生素。此等係尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞如癌細胞的非預期之細胞增殖為特徵的疾患。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被癌細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括者係HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
於另一方面，該配位子係細胞滲透劑，諸如螺旋細胞滲透劑。於某些態樣中，該劑係雙性劑。示例性劑係胜肽，例如tat或觸角足突變肽。如果該劑係胜肽，其可經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非胜肽或 假胜肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。螺旋劑典型係α-螺旋劑，並且可具有親脂相及疏脂相。
該配位子可係胜肽或胜肽模擬物。胜肽模擬物(本文中亦指稱為寡肽模擬物)係能折疊為所定義之類似於天然胜肽之三維結構的分子。胜肽及胜肽模擬物至iRNA劑之附接可影響iRNA之藥物動力學分佈，例如藉由提升細胞識別及吸收而影響。胜肽或胜肽模擬物部分可係5至50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。
胜肽或胜肽模擬物可係，舉例而言，細胞滲透胜肽、陽離子胜肽、兩親性胜肽、或疏水性胜肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。胜肽部分可係樹枝狀胜肽、受約束之胜肽或交聯之胜肽。於另一選擇中，胜肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性之含有MTS的疏水性胜肽係具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：11)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：12))亦可係靶向部分。胜肽部分可係「遞送性」胜肽，其可攜帶包括胜肽、寡核苷酸、及蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，業經發現，來自HIV Tat蛋白質之序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：13))及來自果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：14))能發揮遞送性胜肽之功能。胜肽或胜肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，例如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之胜肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。典型地，經由合併之單體單元繫帶至dsRNA劑之胜肽或胜肽模擬物係細 胞靶向胜肽諸如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)胜肽或RGD模擬物。胜肽部分之長度範圍可係約5個胺基酸至約40個胺基酸。等胜肽部分可具有結構性修飾，例如以增加安定性或引導構形特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。
用於本發明之組成物及方法的RGD胜肽可係線性或環狀，且可經修飾如經糖基化或甲基化以促進對特定組織之靶向。含有RGD之胜肽及胜肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用其他以整合素配位子為標靶之部分。這一配位子之較佳接合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD胜肽部分可用來靶向具體細胞類型，例如腫瘤細胞，諸如內皮瘤細胞或乳癌腫瘤細胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD胜肽可促成dsRNA劑靶向各種其他組織(包括肺、腎、脾或肝)之腫瘤(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。典型地，RGD胜肽將促成iRNA劑靶向腎臟。RGD胜肽可係線性或環狀，並且可經修飾例如糖基化或甲基化以促成靶向特定組織。舉例而言，經糖基化之RGD胜肽可將iRNA劑遞送至表現α Vß3之腫瘤細胞(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。
「細胞滲透胜肽」能滲透細胞如微生物細胞如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞如人細胞。微生物細胞滲透胜肽可係，舉例而言，α-螺旋線性胜肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵之胜肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或貝坦內辛(bactenecin))、或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之胜肽(例如，PR-39或吲哚西定(indolicidin))。細胞滲透胜肽亦可包 括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透胜肽可係雙向兩親性胜肽如MPG，其衍生自HIV-1 gp41之融合胜肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
於本發明之組成物及方法的一些態樣中，iRNA復包含碳水化合物。接合有碳水化合物之iRNA對於核酸之體內遞送具有優勢，且組成物適用於體內治療性用途，如本文中所揭示。如本文中所用，「碳水化合物」指稱碳水化合物自身，其由一個或多個具有至少6個碳原子之單糖單元(其可係線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成；或係具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個具有至少6個碳原子之單糖單元(其可係線性、分支鏈或環狀)與鍵結至每一碳原子之氧、氮或硫原子所組成。代表性碳水化合物包括糖類(單糖、二醣、三醣及含有約4、5、6、7、8、或9個單醣單元之寡醣)，以及多醣如澱粉、糖原、纖維素及多醣膠。具體之單糖包括C5糖類及上述(例如，C5、C6、C7或C8)糖類；二醣及三醣，其包括具有兩個或三個單糖單元(例如，C5、C6、C7或C8)之糖類。
於某些態樣中，碳水化合物接合物包含單糖。
於某些態樣中，單糖係N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。GalNAc接合物，其包含一種或多種N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物，係揭示於例如US 8,106,022中，該專利之整體內容藉由引用而併入本文。於一些態樣中，GalNAc接合物用作配位子，其令iRNA靶向具體細胞。於 一些態樣中，GalNAc接合物令iRNA靶向肝臟細胞，例如，藉由用作肝臟細胞(例如，肝細胞)之去唾液酸糖蛋白受體配位子。
於一些態樣中，碳水化合物接合物包含一個或多個GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可經由鏈結子例如二價或三價分支鏈結子附接。於一些態樣中，GalNAc接合物接合至正義股之3’端。於一些態樣中，GalNAc接合物經由鏈結子例如本文所揭示之鏈結子接合至iRNA劑(例如，接合至正義股之3’端)。於一些態樣中，GalNAc接合物係接合至正義股之5’端。於一些態樣中，GalNAc接合物經由鏈結子例如本文所揭示之鏈結子接合至iRNA劑(例如，接合至正義股之5’端)。
於本發明之某些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於本發明之又一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於本發明之其他態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由四價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。
於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含一個附接至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。於某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其經由複數個單價鏈結子而各自獨立附接至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3’端與另一股之5’端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環 圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙螺旋之一股中的延伸突出形成。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3’端與另一股之5’端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環圈亦可藉由雙螺旋之一股中的延伸突出形成。
於一些態樣中，GalNAc接合物係
Figure 109137670-A0202-12-0126-378
於一些態樣中，RNAi劑經由下式所示之鏈結子附接至碳水化合物接合物，其中，X係O或S
Figure 109137670-A0202-12-0126-379
於一些態樣中，RNAi劑附接至如表1中定義且如下所示之L96：
Figure 109137670-A0202-12-0127-380
於某些態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係選自下列所成群組：
Figure 109137670-A0202-12-0127-381
Figure 109137670-A0202-12-0127-382
Figure 109137670-A0202-12-0127-383
Figure 109137670-A0202-12-0128-385
Figure 109137670-A0202-12-0128-386
Figure 109137670-A0202-12-0128-387
Figure 109137670-A0202-12-0128-388
Figure 109137670-A0202-12-0128-384
Figure 109137670-A0202-12-0129-390
Figure 109137670-A0202-12-0129-391
Figure 109137670-A0202-12-0129-392
Figure 109137670-A0202-12-0129-389
Figure 109137670-A0202-12-0130-394
Figure 109137670-A0202-12-0130-395
Figure 109137670-A0202-12-0130-396
Figure 109137670-A0202-12-0130-397
Figure 109137670-A0202-12-0130-398
Figure 109137670-A0202-12-0130-399
Figure 109137670-A0202-12-0130-393
Figure 109137670-A0202-12-0131-401
Figure 109137670-A0202-12-0131-402
Figure 109137670-A0202-12-0131-400
Figure 109137670-A0202-12-0131-403
，其中Y係O或S，且n係3至6(式XXIV)；
Figure 109137670-A0202-12-0131-404
，其中Y係O或S，且n係3至6(式XXV)；
Figure 109137670-A0202-12-0132-405
Figure 109137670-A0202-12-0132-406
，其中X係O或S(式XXVII)；
Figure 109137670-A0202-12-0132-407
Figure 109137670-A0202-12-0132-408
；式XXIX；
Figure 109137670-A0202-12-0133-409
Figure 109137670-A0202-12-0133-412
；式XXXI；
Figure 109137670-A0202-12-0133-410
Figure 109137670-A0202-12-0133-411
；式XXXIII；
Figure 109137670-A0202-12-0134-413
於某些態樣中，用於本發明之組成物及方法中之碳水化合物接合物係單糖。於某些態樣中，該單糖係N-乙醯基半乳胺糖，諸如
Figure 109137670-A0202-12-0134-414
用於本文所述之態樣中的另一代表性碳水化合物接合物包括但不限於，
Figure 109137670-A0202-12-0134-415
 (式XXXVI)，
當X或Y之一者係寡核苷酸時，另一者係氫。
於一些態樣中，合適之配位子係WO2017/0340661中揭露之配位子，該專利之整體內容係藉由引用而併入本文。於一態樣中，配位子包含以下結構：
Figure 109137670-A0202-12-0135-416
於某些態樣中，本揭露之RNAi劑可包括GalNAc配位子，即便此類GalNAc配位子當下被預測為對於本揭露之較佳鞘內/CNA遞送途徑的價值有限。
於本發明之某些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。於本發明之又一些態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價鏈結子附接至本發明之iRNA劑。
於一態樣中，本發明之雙股RNAi劑包含一個或多個附接至該iRNA劑之GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可經由鏈結子附接至正義股或反義股之任意核苷酸。GalNAc可附接至正義股之5’端、正義股 之3’端、反義股之5’端、或反義股之3’端。於一態樣中，GalNAc經由三價鏈結子附接至正義股之3’端。
於其他態樣中，本發明之雙股RNAi劑含複數(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其經由複數個鏈結子例如單價鏈結子而各自獨立附接至該雙股RNAi劑之複數個核苷酸。
於一些態樣中，舉例而言，當本發明之iRNA劑之兩股皆係一個更大分子之一部分且藉由位於一股之3’端與另一股之5’端之間的不間斷核苷酸鏈連結而形成包含複數個未配對核苷酸的髮夾環圈時，該髮夾環圈內之每一個未配對核苷酸可獨立包含經由單價鏈結子附接之GalNAc或GalNAc衍生物。
於一些態樣中，碳水化合物接合物復包含如上文所述的一個或多個另外配位子，例如但不限於，PK調節子或細胞滲透胜肽。
適用於本發明之額外之碳水化合物複合物(及鏈結子)包括彼等於WO 2014/179620及WO 2014/179627中所揭示者，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
D.鏈結子
於一些態樣中，本文中揭示之接合物或配位子可使用多種鏈結子附接至iRNA寡核苷酸，該鏈接基可係可裂解者或不可裂解者。
術語「鏈結子」或「鏈結基團」意指將化合物之兩個部分連結在一起如將化合物之兩個部分共價附接的有機部分。鏈結子典型包含直接鍵結或原子如氧或硫，單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子之鏈，諸如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取 代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其一個或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環基中繼或終止；其中R8係氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於某些態樣中，鏈結子係約1至24個原子、2至24個原子、3至24個原子、4至24個原子、5至24個原子、6至24個原子、6至18個原子、7至18個原子、8至18個原子、7至17個原子、8至17個原子、6至16個原子、7至16個原子、或8至16個原子。
可裂解之鏈結基團在細胞外足夠安定，但當進入標靶細胞時裂解以釋放被該鏈結子保持在一起之兩個部分。於較佳之態樣中，可裂解之鏈結基團在標靶細胞內或在第一參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現細胞內之條件)下之裂解比在受試者血液內或在第二參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現見於血液或血清中之條件)下之裂解快至少約10 倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少約100倍。
可裂解之鏈接基團係對於裂解劑例如pH、氧化還原電位或可降解分子之存在為敏感者。通常，與在血清或血液中相比，裂解劑在細胞內更為普遍或以更高量級或活性被發現。此類降解劑之示例包括：氧化還原劑，其被選擇用於特定之受質或其不具有受質特異性，包括例如細胞內存在之可降解氧化還原可藉由還原可裂解之鏈結基團的氧化酶、還原酶或還原劑如硫醇；酯酶；內切酶，或可創建酸性環境之劑如導致pH為5或更低之彼等；可藉由作為通用酸、肽酶(其可係受質特異性者)及磷酸酶作動而水解或降解酸可裂解之鏈結基團的酶。
可裂解之鏈結基團如二硫鍵可能對於pH敏感。人血清之pH為7.4，而細胞內平均pH略低，為7.1至7.3之範圍。胞內體具有酸性更強之pH，為5.5至6.0之範圍；而溶酶體甚至具有酸性更強之pH，約為5.0。一些鏈結子將具有可裂解之鏈結基團，該鏈結基團在較佳之pH裂解，從而在細胞內將陽離子脂質從該配位子釋放出來或將該陽離子脂質釋放如所欲之細胞腔室內。
鏈結子可包括可藉由特定酶裂解之可裂解之鏈結基團。併入鏈結子的可裂解之鏈結基團的類型可取決於待作為標靶之細胞。舉例而言，肝臟靶向配位子可經由包括酯基之鏈結子而鏈結至鏈結子。肝細胞富含酯酶，因此鏈結子在肝細胞中將比在不富含酯酶之細胞類型內更有效地被裂解。其他富含酯酶之細胞類型包括肺、腎皮質及睪丸之細胞。
當靶向細胞類型係富含肽酶者如肝細胞及滑膜細胞時，可使用含有肽鍵之鏈結子。
通常，可藉由測試降解劑(或條件)裂解備選鏈結基團之能力而評估該備選之可裂解鏈結基團的適用性。亦所欲者係亦測試該備選可裂解鏈結基團在血液中或當與其他非標靶組織接觸時之抵抗裂解的能力。因此，可測定第一條件與第二條件間之裂解相對敏感性，其中該第一條件係選擇為標靶細胞內之裂解標誌物，且該第二條件係選擇為其他組織或生物流體例如血液或血清中之裂解標誌物。該等評估可在無細胞之系統內、細胞內、細胞培養物內、器官或組織培養物內、或在整個動物體內進行。可能有用者係，在無細胞或培養條件下作成初始評估，並藉由在整體動物體內之進一步評估而證實之。於較佳之態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件下)之裂解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。
i.氧化還原可裂解之鏈結基團
於某些態樣中，可裂解之鏈結基團係氧化還原可裂解之鏈結基團，其當還原或氧化時被裂解。可經還原裂解之鏈結基團的實例係二硫鏈結基團(-S-S-)。為了確定備選可裂解鏈結基團是否係合適之「可還原裂解之鏈結基團」或例如是否適用於與特定iRNA部分及特定靶向劑合用，可查看本文中揭示之方法。舉例而言，可藉由以二硫蘇糖醇(DTT)或使用該領域中已知試劑之其他還原劑溫育來評估備選者，該溫育模擬在細胞例如標靶細胞內將會觀察到之裂解速率。該等備選物亦可在經選擇以模擬血液 或血清條件之條件下評估之。於一個態樣中，備選化合物在血液中被裂解至多約10%。於其他態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之體外條件下)之降解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。備選化合物之裂解速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件下測定，並將其與在經選擇以模擬細胞外介質之條件下所測者比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解鏈結基團
於某些態樣中，可裂解之鏈結子包含基於磷酸酯之可裂解鏈結基團。基於磷酸酯之可裂解鏈結基團藉由降解或水解該磷酸酯基團之劑而裂解。在細胞內裂解磷酸酯基團之劑的示例係酶如細胞內之磷酸酶。磷酸酯系鏈結基團之示例係-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳之態樣係-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。較佳之態樣係-O-P(O)(OH)-O-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iii.酸可裂解之鏈結基團
於某些態樣中，可裂解之鏈結子包含酸可裂解之鏈結基團。酸可裂解之鏈結基團係在酸性條件下被裂解之鏈結基團。於較佳之態樣中，酸可裂解之鏈結基團係在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)之酸性環境中被裂解，或被劑諸如可用作通用酸之酶裂解。於細胞內，特異的低pH胞器如胞內體及溶酶體，可提供用於酸可裂解之鏈結基團的裂解環境。酸可裂解之鏈結基團之示例包括但不限於腙類、酯類、及胺基酸之酯類。酸可裂解之鏈結基團可具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。當附接至酯之氧(烷氧基)的碳係芳基時，較佳之態樣係經取代之烷基、或四級烷基如二甲基戊基或第三丁基。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
iv.基於酯之可裂解鏈結基團
於某些態樣中，可裂解之鏈結子包含基於酯之可裂解鏈結基團。基於酯之可裂解鏈結基團由酶諸如酯酶或醯胺酶在細胞內裂解。基於酯之可裂解鏈結基團的示例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯類。酯可裂解之鏈結基團可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
v.基於胜肽之可裂解鏈結基團
於又一態樣中，可裂解之鏈結子包含基於胜肽之可裂解鏈結基團。基於胜肽之可裂解鏈結基團由酶諸如肽酶及蛋白酶在細胞內裂解。基於胜肽之可裂解基團在胺基酸間形成以獲得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽之肽鍵。基於胜肽之可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。醯胺基團可在任意伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵在胺基酸間形成以獲 得胜肽及蛋白質之特異類型的醯胺鍵。基於胜肽之裂解基團通常限定為在胺基酸間形成而獲得胜肽及蛋白質的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括該完整醯胺官能基。基於胜肽之可裂解鏈結基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA與RB係兩個相鄰胺基酸之R基團。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評估。
於一些態樣中，本發明之iRNA透過鏈結子接合至碳水化合物。本發明之組成物及方法之具有鏈結子之iRNA碳水化合物接合體的非限制性示例包括，但不限於，
Figure 109137670-A0202-12-0142-417
Figure 109137670-A0202-12-0142-418
Figure 109137670-A0202-12-0142-419
Figure 109137670-A0202-12-0143-421
Figure 109137670-A0202-12-0143-422
Figure 109137670-A0202-12-0143-423
Figure 109137670-A0202-12-0143-420
Figure 109137670-A0202-12-0144-424
(式XLIV)，其中，X或Y之一者係寡核苷酸，且另一者係氫。
於本發明之組成物及方法之某些態樣中，配位子係一種或多種經由二價或三價分支鏈之鏈結子附接的GalNAc(N-乙醯基半乳胺糖)衍生物。
於某些態樣中，本發明之dsRNA接合至選自式(XLV)至(XLVI)中任一者所示結構組成之群組的二價或三價分支鏈之鏈結子：
Figure 109137670-A0202-12-0144-425
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時獨立表示0至20，其中該重複單元可係相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T5A、T5B、T5C於每次出現時獨立為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時獨立為不存在或係伸烷基、經取代之伸烷基(其中，一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或終止)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 109137670-A0202-12-0145-426
、
Figure 109137670-A0202-12-0145-427
、
Figure 109137670-A0202-12-0145-428
、
Figure 109137670-A0202-12-0145-429
，
Figure 109137670-A0202-12-0145-430
或雜環基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配位子，亦即，於每次出現時各自獨立為單糖(如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣、或多醣；且Ra係H或胺基酸側鏈。三價接合GalNAc衍生物尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制標靶基因之表現，例如式(XLIX)之彼等：
式XLIX
Figure 109137670-A0202-12-0145-431
其中L5A、L5B及L5C表示單醣，諸如GalNAc衍生物。
合適之接合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈之鏈結子的示例包括但不限於，上文作為式II、VII、XI、X、及XIII而引用之結構。
教示RNA接合物之製備之代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,828,979號、第4,948,882號、第5,218,105號、第5,525,465號、第5,541,313號、第5,545,730號、第5,552,538號、第5,578,717號、第5,580,731號、第5,591,584號、第5,109,124號、第5,118,802號、第5,138,045號、第5,414,077號、第5,486,603號、第5,512,439號、第5,578,718號、第5,608,046號、第4,587,044號、第4,605,735號、第4,667,025號、第4,762,779號、第4,789,737號、第4,824,941號、第4,835,263號、第4,876,335號、第4,904,582號、第4,958,013號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,082,830號、第5,112,963號、第5,214,136號、第5,245,022號、第5,254,469號、第5,258,506號、第5,262,536號、第5,272,250號、第5,292,873號、第5,317,098號、第5,371,241號、第5,391,723號、第5,416,203號、第5,451,463號、第5,510,475號、第5,512,667號、第5,514,785號、第5,565,552號、第5,567,810號、第5,574,142號、第5,585,481號、第5,587,371號、第5,595,726號、第5,597,696號、第5,599,923號、第5,599,928號、第5,688,941號、第6,294,664號、第6,320,017號、第6,576,752號、第6,783,931號、第6,900,297號、第7,037,646號、第8,106,022，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
給定化合物之所有位置經均勻修飾係不必要者，且事實上，超過一種前述修飾可併入單個化合物中或甚至併入iRNA之單個核苷處。本發明亦包括作為嵌合化合物之iRNA化合物。
於本發明之語境中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」係iRNA化合物，較佳係dsRNA劑，其含有兩個或更多個化學上截然不同之區域，各自由至少一個單體單元構成，亦即，在dsRNA化合物之情形中，該單體單元係核苷酸。此等iRNA典型含有至少一個區域，其中該RNA經修飾以賦予該iRNA以增加之對核酸酶降解之抗性、增加之細胞攝取、或增加之與標標靶核酸之親和性。iRNA之附加區域可用作能裂解RNA：DNA雜交體或RNA：RNA雜交體之酶的受質。舉例而言，RNase H係細胞之核酸內切酶，其裂解RNA：DNA雙螺旋之RNA股。因此，RNase H之激活導致RNA標靶之裂解，從而極大地提升對基因表現之iRNA抑制的效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，使用較短之iRNA往往可獲得與使用雜交至相同標靶區域之硫代磷酸酯脫氧dsRNA相當的結果。RNA標靶之裂解可藉由凝膠電泳常規偵檢之，且若需要，可將凝膠電泳與該領域中已知之相關核酸雜交技術合用。
於某些例子中，iRNA之RNA可藉由非配位子基團予以修飾。大量非配位子分子業經接合至iRNA以提升iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取，且執行此類接合之過程可在科技文獻中獲得。此類非配位子部分業經包括脂質部分，如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994, 4：1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)、磷脂質例如二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-磷酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚醯基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基胺-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此類RNA接合物之製備的代表性美國專利列述於上文中。典型之接合策略牽涉在該序列之一個或多個位置承載胺基鏈結子之RNA的合成。胺基隨後與使用合適之偶聯劑或活化劑接合之分子反應。接合反應可使用仍鍵結至固體支撐物之RNA執行，或在RNA於溶液相中裂解後執行。藉由HPLC進行之RNA接合物之純化典型提供純接合物。
V.本揭露之RNAi劑的遞送
本揭露之RNAi劑至細胞例如受試者例如人類受試者(例如，有此需要之受試者，諸如具有HTT相關疾患例如亨汀頓氏病之受試者)體內之細胞的遞送可藉由大量不同路徑達成。舉例而言，可藉由將細胞與本 揭露之RNAi劑在體外或體內接觸而執行遞送。體內遞送亦可藉由將包含RNAi基例如dsRNA之組成物給藥至受試者而直接執行。或者，體內遞送可藉由將編碼並引導該RNAi劑之表現的一種或多種載體給藥而間接執行。此等選擇於下文中進一步檢討。
通常，遞送核酸分子之任意方法(體外或體內)可適用於與本揭露之RNAi劑合用(參見，例如，Akhtar S.and Julian RL.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其藉由引用而以其整體併入本文)。對於體內遞送，為了遞送RNAi劑而慮及之因素包括，舉例而言，所遞送之劑的生物學安定性、非特異性效果之預防、及所遞送之劑於標靶組織內之蓄積。RNAi劑之非特異性效果可藉由局部給藥而最小化，舉例而言，藉由直接注射或移植入組識內或外用給藥該製劑。局部給藥至治療位點將該劑之局部濃度最大化，限制該劑與可能受該劑傷害或可降解該劑之系統性組織接觸，且允許以較低之劑量給藥RNAi劑。若干研究業經顯示，當局部給藥RNAi劑時，得到基因成功減弱之產物。舉例而言，藉由玻璃體內注射對食蟹猴進行VEGF dsRNA之眼內遞送(Tolentino,MJ.et al.,(2004)Retina 24：132-138)以及藉由視網膜下注射對小鼠進行該眼內遞送(Reich,SJ.et al.(2003)Mol.Vis.9：210-216)，兩者皆顯示防止老年性黃斑部退化實驗模型中的新血管生成。此外，在小鼠體內進行dsRNA之直接腫瘤內注射減小腫瘤體積(Pille,J.et al.(2005)Mol.Ther.11：267-274)且可延長荷瘤小鼠之生存期(Kim,WJ.et al.,(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.et al.,(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾亦業經顯示藉由直接注射進行之局部遞送的成功(Dorn,G.et al.,(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.et al.(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.et a.l(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al.(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al.(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)以及藉由鼻內給藥而成功遞送至肺部(Howard,KA.et al.,(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.et al.,(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.et al.,(2005)Nat.Med.11：50-55)。對於系統性給藥RNAi劑用於治療疾病，該RNA可經修飾或者使用藥物遞送系統遞送；兩種方法皆作動以防止dsRNA被內核酸酶及外核酸在體內快速降解。RNA之修飾或藥物載劑亦可容許RNAi劑靶向組織並避免非所欲之脫靶效應(例如，不欲受縛於理論，如本文所揭示之GNA的用途業經被鑑定為去安定化dsRNA之種子區域，導致此類dsRNA相對於脫靶效應對上靶有效性之偏好增強，因為此類脫靶效應被該種子區域去安定化作用顯著弱化)。RNAi劑可藉由化學接合至親脂性基團諸如膽固醇而修飾，以增強細胞攝取並且防止降解。舉例而言，將被接合至親脂性膽固醇部分之對抗ApoB的RNAi劑系統性注射至小鼠體內，導致肝臟及空腸兩處之apoB mRNA的減弱(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。業經顯示，將RNAi劑接合至適配體抑制前列腺癌模型小鼠體內之腫瘤生長並介導腫瘤衰退(McNamara,JO.et al.,(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。於作為另一種選擇之態樣中，RNAi劑可使用藥物遞送系統如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體、或陽離子遞送系統進行遞送。荷正電之陽離子遞送系統促成分子RNAi劑(荷負電)之結合，亦增強在荷負 電之細胞膜處的相互作用，以允許該細胞對RNAi劑之有效攝取。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可或結合至RNAi劑或被誘導以形成包合RNAi劑之泡囊或微胞(參見，例如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。泡囊或微胞之形成進一步防止當系統性給藥時RNAi劑之降解。製作及給藥陽離子-RNAi劑錯合物之方法完全處於該領域熟練人士之能力範圍內(參見，例如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al.(2007)J.Hypertens.25：197-205，其皆藉由引用而整體併入本文)。可用於RNAi劑之系統性遞送的藥物遞送系統之一些非限制性示例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003)，同上；Verma,UN.et al.,(2003)，同上)、Oligofectamine、「固體核酸脂質顆粒」(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16電子優先發佈；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)胜肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺基胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些態樣中，RNAi劑與環糊精形成用於系統性給藥之錯合物。給藥之方法及RNAi劑與環糊精之醫藥組成物可見於美國專利第7,427,605號，其藉由引用而以其整體併入本文。
本揭露之某些方面係關於細胞中減低HTT標靶基因之表現的方法，包括令該細胞與本揭露之雙股RNAi劑接觸。於一態樣中，細胞係肝外細胞，視需要係CNS細胞。
本揭露之另一方面係關於受試者體內減低HTT標靶基因之表現的方法，包括向該受試者給藥本揭露之雙股RNAi劑。
本揭露的另一方面係關於治療患有CNS疾患的受試者，包括向該受試者給藥治療有效量的本揭露之雙股HTT靶向RNAi劑，從而治療受試者。可藉由本揭露之方法治療的示例性CNS疾患包括亨汀頓氏病。
於一態樣中，雙股RNAi劑係經鞘內給藥。藉由雙股RNAi劑之鞘內給藥，該方法減低腦(例如，紋狀體)或脊柱組織例如皮質、小腦、頸椎、腰椎及胸椎中之HTT標靶基因表現。
為了便於闡述，本章節中之製劑、組成物及方法主要關於經修飾之siRNA化合物而檢討。惟，可以理解，此等製劑、組成物及方法可使用其他siRNA化合物例如未修飾之siRNA化合物實踐，並且此實踐處於本揭露範圍內。咸信，藉由多種途徑將包括RNAi劑之組成物遞送至受試者。示例性途徑包括：鞘內、靜脈內、外用、直腸內、經肛門、陰道內、鼻內、肺部內及眼內。
本揭露之RNAi劑可併入適用於給藥之醫藥組成物中。此類組成物典型包括一種或多種RNAi劑及藥學可接受之載劑。如本文所用，短語「藥學可接受之載劑」旨在包括與藥物給藥相容之任意及全部溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑等。此類用於藥學活性物質之介質及劑的使用係該領域中習知者。除非任意傳統介質 或劑與活性化合物不相容，否則預期其在組成物中之使用。補充活性化合物亦可併入組成物中。
本揭露之醫藥組成物可經由大量路徑給藥，取決於局部治療或系統性治療是否為所欲者，且取決於待治療之面積。給藥可係外用(包括眼部給藥、陰道給藥、直腸給藥、鼻腔內給藥、透皮給藥)、口服或腸胃外給藥。腸胃外給藥包括靜脈點滴、皮下注射、腹膜內注射或肌肉內注射，或者鞘內給藥或腦室內給藥。
可選擇給藥之途徑及位點以增強靶向性。舉例而言，為了靶向肌肉細胞，肌肉內注射至感興趣之肌肉中將係合乎邏輯之選擇。藉由給藥噴霧劑形式之RNAi劑，可靶向肺細胞。藉由以RNAi劑塗覆球囊導管以及機械地引入RNA，可靶向血管內皮細胞。
用於外用給藥之製劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末劑。傳統醫藥載劑、水性基質、粉末基質、油狀基質、增稠劑等可係必要者或所欲者。經塗覆之保險套、手套等亦可係有用者。
用於口服給藥之組成物包括粉末劑或顆粒劑、水中之懸浮劑或溶液劑、糖漿劑、酏劑或非水性介質、片劑、膠囊劑、錠劑或口含錠劑。於片劑之情況下，可使用之載劑包括乳糖、檸檬酸鈉及磷酸之鹽。各種崩解劑諸如澱粉及潤滑劑諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉及滑石常用於片劑中。對於膠囊形式之口服給藥，可用之稀釋劑係乳糖及高分子量聚乙二醇。當需要使用水性懸浮劑進行口服使用時，可將核酸組成物與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，可添加某些甜味劑或矯味劑。
用於鞘內或腦室內給藥之組成物可包括無菌水溶液，該無菌水溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適之添加劑。
用於腸胃外給藥之製劑可包括無菌水溶液，該無菌水溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適之添加劑。腦室內注射可藉由例如附接至儲器之腦室內導管得以促成。對於靜脈內用途，可控制溶質之總濃度以使得製備物等張。
於一態樣中，siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物、組成物的給藥係腸胃外給藥例如靜脈內給藥(例如，作為推注或作為擴散性輸注)、皮內給藥、腹膜內給藥、肌肉內給藥、鞘內給藥、腦室內給藥、顱內給藥、皮下給藥、跨黏膜給藥、口含給藥、舌下給藥、內窺鏡給藥、直腸給藥、口服給藥、陰道給藥、外用給藥、肺部給藥、鼻腔內給藥、尿道給藥或眼部給藥。給藥可由實施者提供或由另一個人例如醫療從業人員提供。藥品可以可量測之劑量提供或提供在遞送定量劑量之分配器中。下文更詳細地檢討所選擇之遞送模式。
A.鞘內給藥
於一態樣中，藉由鞘內注射(亦即，注射至腦及脊髓組織浸沒於其中的脊髓液中)遞送雙股RNAi劑。將RNAi劑鞘內注射至脊髓液中，可作為推注或經由迷你幫浦執行，該迷你幫浦可植入皮膚下，提供規則且恆定的siRNA至脊髓液中之遞送。脊髓液自脈絡叢(其在該處產生)環繞脊髓及背根神經節下行，然後上行經過小腦及皮質到達蛛膜粒，在該處可離開CNS，從而完成循環，依據所注射化合物之尺寸、安定性及溶解度，經鞘內遞送至分子可擊中整個CNS範圍內之標靶。
於一些態樣中，鞘內給藥係經由幫浦進行。幫浦可係經外科手術植入之滲透幫浦。於一態樣中，將滲透幫浦植入脊髓管之蛛膜下腔內以促成鞘內給藥。
於一些態樣中，鞘內給藥係經由藥用之鞘內遞送系統進行，該系統包括含有一定體積藥劑之儲器，以及配置為遞送該儲器中所含藥劑之一部分的幫浦。關於這一鞘內遞送系統之更多細節可見於WO 2015/116658中，該專利藉由引用以其整體併入本文。
對於不同之標靶基因，經鞘內注射之RNAi劑的量可變，並且必須施加之適宜量可能必須關於每種標靶基因單獨確定。典型地，這一量係10μg至2mg，較佳50μg至1500μg，更佳100μg至1000μg之範圍。
B.編碼本揭露之RNAi劑的載體
靶向HTT之RNAi劑可從插入DNA或RNA載體之轉錄單元表現(參見，例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；WO 00/22113、WO 00/22114及US 6,054,299)。表現較佳係持續(數月或更久)，取決於所使用之特定構造及標靶組織或細胞類型。此等基因轉殖可作為線性構造、環狀質體、或病毒載體而引入，其可係整合載體或非整合載體。基因轉殖亦可構造為允許其被作為粒線體外質體而被繼承(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
RNAi劑之個體股或多股可從表現載體之啟動子轉錄。若兩個分離之股待表現以生成例如dsRNA，則可將兩個分隔之表現載體共同引入(例如，藉由轉染或感染共同引入)靶標細胞內。或者，dsRNA之每一個 體股可藉由位於相同表現質體之兩種啟動子轉錄。於一個態樣中，dsRNA係表現為反向重複聚核苷酸，其藉由鏈結子聚核苷酸序列接合，使得該dsRNA具有莖環結構。
RNAi劑表現載體通常係DNA質體或病毒載體。與真核細胞相容之表現載體，較佳係彼等與脊椎動物細胞相容者，可用來生產用於表現本文所揭示之RNAi劑的重組構造。RNAi劑表現載體之屬性可係全身性者，如藉由靜脈內或肌肉內給藥；藉由給藥至從該患者外植之靶標細胞，之後重新引入患者體內；或藉由任何其他容許引入所欲之靶標細胞內的手段。
可與本文所述方法及組成物合用之病毒載體系統包括但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，如天花如牛痘病毒載體，或禽痘如金絲雀痘或雞痘病毒載體；以及(j)幫手依賴性或裸腺病毒載體。複製缺陷病毒亦可係優勢者。不同之載體將變為或不變為併入該細胞之基因組內。若必要，該等構造可包括用於轉染之病毒序列。或者，該構造可併入能進行附加型複製(episomal replication)之載體如EPV載體及EBV載體內。用於RNAi劑之重組表現之構造通常將需要調整性元件例如啟動子、增強子等，以確保該RNAi劑在標靶細胞內之表現。對於載體及構造所慮及之其他方面係該領域中已知者。
VI.本發明之醫藥組成物
本揭露亦包括，包括本揭露之RNAi劑的醫藥組成物及製劑。於一態樣中，本文提供含有如本文所揭示之RNAi劑以及藥學可接受之載劑的醫藥組成物。含有RNAi劑之醫藥組成物可用於治療與HTT之表現或活性相關之疾病或疾患例如亨汀頓氏病。
於一些態樣中，本發明之醫藥組成物係無菌者。於另一態樣中，本發明之醫藥組成物係無熱原者或非熱原性者。
此等醫藥組成物係基於遞送模式而配製。一個示例係將組成物配製為用於經由腸胃外遞送之系統性給藥，例如，藉由靜脈內(IV)遞送、肌肉內(IM)遞送或用於皮下(subQ)遞送。另一示例係配製為用於直接遞送至CNS中的組成物，例如藉由鞘內或玻璃體內注射途徑，視需要藉由輸注入腦(例如，紋狀體)內，諸如藉由連續幫浦輸注。
本揭露之醫藥組成物可以足以抑制HTT基因表現之劑量給藥。通常，本揭露之RNAi劑的適當劑量將係約0.001至約200.0毫克每公斤接受者體重每天的範圍內，通常係約1至50每公斤體重每天的範圍內。
重複劑量方案可包括規則地給藥治療量之RNAi劑，如每個月一次至每六個月一次。於某些態樣中，RNAi劑係約每季給藥一次(亦即，約每三個月給藥一次)至約每年給藥兩次。
於初始之治療方案(例如，加載劑量)後，治療之實施頻次可降低。
於其他態樣中，單一加量之醫藥組成物可係長期持續者，使得後續劑量係以不超過1、2、3或4個月或更久之間隔給藥。於本揭露之 一些態樣中，單一劑量之本揭露之醫藥組成物係每個月給藥一次。於本揭露之其他態樣中，單一劑量之本揭露之醫藥組成物係每季給藥一次至每年給藥兩次。
熟練技術人員應知悉，某些因素可影響有效治療受試者所需之劑量及時機，該等因素包括但不限於疾病或病變之嚴重性、先前之治療、受試者之一般健康情況/或年齡、以及存在之其他疾病。此外，使用治療有效量之組成物治療受試者可包括單一治療或一系列治療。
在小鼠基因學中之進展業經生成大量用於研究多種將從HTT表現之降低中受益的人類疾病諸如HD之小鼠模型。此類模型可用於RNAi劑之體內測試，以及用於確定治療有效劑量。合適之嚙齒動物係該領域中已知者，並且包括例如彼等揭示於例如Cepeda,et al.(ASN Neuro(2010)2(2)：e00033)中及Pouladi,et al.(Nat Reviews(2013)14：708)中者。
本揭露之醫藥組成物可經由大量路徑給藥，取決於局部治療或系統性治療是否為所欲者，且取決於待治療之面積。給藥可係外用(例如，藉由透皮貼劑)；肺部給藥，例如藉由粉末或氣溶膠之吸入或吹入，包括藉由噴霧器；氣管內給藥、鼻內給藥、表皮給藥及透皮給藥；口服或腸道外給藥。腸胃外給藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；真皮下給藥，例如經由植入裝置；或顱內給藥，例如藉由腦實質內給藥、鞘內給藥或腦室內給藥。
可以靶向具體組織諸如CNS(例如，腦之神經元、神經膠質或血管組織)的模式遞送RNAi劑。
用於外用給藥之醫藥組成物及製劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末劑。傳統醫藥載劑、水性基質、粉末基質、油狀基質、增稠劑等可係必要者或所欲者。經塗覆之保險套、手套等亦可係有用者。適宜之外用製劑包括下述之彼等，其中本揭露所提出之RNAi劑與外用遞送劑如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑混合。適宜之脂質及脂質體包括中性(例如，二油醯基磷脂DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基卵磷脂DMPC、二硬脂醯基卵磷脂)、陰性(例如，二肉豆蔻醯基磷脂甘油DMPG)及陽離子性(例如，二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂乙醇胺DOTMA)。本揭露提出之RNAi劑可封裝在脂質體內，或可與脂質體尤其是陽離子脂質體形成複合物。另選地，RNAi劑可與脂質尤其是陽離子脂質複合。適宜之脂肪酸及酯類包括但不限於花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸異丙酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽。外用製劑詳細揭示於US 6,747,014中，其藉由引用而併入本文。
A.包含膜分子組件之RNAi劑製劑
用於本公開之組成物及方法中之RNAi劑可配製為用於在膜分子組件如脂質體或微胞中遞送。如本文中所用，術語「脂質體」指稱由排列為至少一個雙層例如一個雙層或複數個雙側之兩親性脂質構成的泡囊。脂質體包括單層或多層泡囊，其具有從親脂性材料形成之膜及水性內 腔。水性部分含有RNAi劑組成物。親脂性材料將水性內腔與水性外部分離，而該水性外部並不包括RNAi劑組成物，但在一些示例中，可包括RNAi劑組成物。脂質體係有用於將活性成分轉移並遞送至作動位點。因為脂質體膜在結構上類似於生物膜，當將脂質體施用至組織時，脂質體雙層與細胞膜之雙層融合。隨著脂質體與細胞之融匯的進行，包括RNAi劑之內部水性內容物被遞送至細胞內，在該處，RNAi劑可特異性地結合標靶RNA並可介導RNAi。於一些情況下，脂質體亦特異性地靶向例如以將RNAi劑引導至特定細胞類型。
含有RNAi劑之脂質體可藉由多種方法製備之。於一個實例中，將脂質體之脂質成分溶解在洗滌劑中，使得以該脂質成分形成微胞。舉例而言，該脂質成分可係兩親性陽離子脂質或脂質接合物。該洗滌劑可具有高臨界微胞濃度且可係非離子性。示例性之洗滌劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡萄糖苷、脫氧膽酸鹽、及月桂醯肌胺酸。隨後將RNAi劑製劑加入包括該脂質成分之微胞中。該脂質上之陽離子性基團與RNAi劑相互作用，並縮合在RNAi劑周圍以形成脂質體。縮合之後，例如藉由滲析移除該洗滌劑，以得到RNAi劑之脂質體性製劑。
若必要，可在縮合反應過程中，例如藉由受控添加而加入有助於縮合之載子化合物。舉例而言，該載子化合物可係除核酸之外的聚合物(如，精胺或精三胺)。亦可調節pH以輔助縮合。
生產安定之聚核苷酸輸送媒介物之方法，該方法將多核苷酸/陽離子脂質複合物作為遞送媒介物之結構性成分而併入，進一步揭示於例如WO 96/37194中，其整體內容藉由引用而併入本文。脂質體製劑亦可包 括下列中揭示之示例性方法的一個或多個方面：Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417；美國專利第4,897,355號；美國專利第5,171,678號；Bangham et al.,(1965)M.Mol.Biol.23：238；Olson et al.,(1979)Biochim.Biophys.Acta 557：9；Szoka et al.,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194；Mayhew et al.,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169；Kim et al.,(1983)Biochim.Biophys.Acta 728：339；以及Fukunaga et al.,(1984)Endocrinol.115：757。常用之製備其尺寸適合用作遞送媒介物之脂質聚集體的技術包括超音波處理及凍融加押出(參見，例如，Mayer et al.,(1986)Biochim.Biophys.Acta 858：161)。當一致性地小(50至200nm)且相對均勻之聚集體係所欲者時，可使用微流體化(Mayhew et al.,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169)。此等方法可容易地適用於將RNAi劑製劑封裝入脂質體中。
脂質體落入兩個大類中。陽離子脂質體係荷正電之脂質體，其與荷負電之核酸分子相互作用以形成安定之複合物。荷正電之核酸/脂質體複合物係結合至荷負電之細胞表面，且在胞內體中被內化。由於胞內體中之酸性pH，該脂質體被破裂，將其內容物釋放到細胞質中(Wang et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147：980-985)。
pH敏感或荷負電之脂質體係入陷核酸而非與核酸之複合物。由於核酸及脂質兩者皆荷相似之電荷，係出現排斥而非形成複合物。儘管如此，一些核酸仍被入陷至此等脂質體之水性內腔中。pH敏感之脂質體業經用來將編碼胸苷激酶基因之核酸遞送至培養物中之細胞單層。外源 基因之表現係於標靶細胞中偵檢出(Zhou et al.(1992)Journal of Controlled Release,19：269-274)。
一種主要類型之脂質體性組成物係包括除天然衍生之卵磷脂外之磷脂質。舉例而言，中性脂質體組成物可由二肉豆蔻醯基卵磷脂(DMPC)或二棕櫚醯基卵磷脂(DPPC)。陰離子性脂質體組成物通常係由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油形成，而陰離子性促融合脂質體係主要由二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質體性組成物係由卵磷脂(PC)如，舉例而言，大豆PC及蛋PC形成。另一類型係由磷脂質或卵磷脂或膽固醇之混合物形成。
在體外及體內將脂質體引入細胞內之其他方法的示例包括美國專利第5,283,185號；美國專利第5,171,678號；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,(1994)J.Biol.Chem.269：2550；Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307；Nabel,(1992)Human Gene Ther.3：649；Gershon,(1993)Biochem.32：7143；以及Strauss,(1992)EMBO J.11：417。
亦業經檢查非離子性脂質體系統，尤其是包含非離子性界面活性劑及膽固醇之系統，以確定它們在將藥物遞送至皮膚中之用途。包含NovasomeTM I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTM II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體製劑用來將環孢素-A遞送至小鼠皮膚之真皮內。結果表明，此類非離子性脂質體系統有效促進環孢素-A沈積在皮膚之不同層內(Hu et al.,(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6)：466)。
脂質體亦包括「立體安定化之」脂質體，如本文中使用，該術語指稱包含一種或多種空間化脂質的脂質體，當該空間化脂質被併入脂質體中時，其導致循環壽命比缺失此類空間化脂質之脂質體提升。立體安定化之脂質體的示例係下述之彼等：其中，脂質體之形成泡囊之脂質部分中的一部分(A)包含一種或多種糖脂質，如單唾液酸神經節苷脂GM1，或(B)使用一種或多種親水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分予以衍生。儘管不欲受縛於任何特定理論，於該領域中咸信，至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂、或PEG衍生之脂質的立體安定化之脂質體，此等立體安定化之脂質體的提升之循環半衰期係源於網狀內皮系統(RES)之細胞對其之攝取減低(Allen et al.,(1987)FEBS Letters,223：42；Wu et al.,(1993)Cancer Research,53：3765)。
多種包含一種或多種磷脂質之脂質體係該領域中已知者。Papahadjopoulos et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507：64)報導單唾液酸神經節苷脂GM1、硫酸半乳糖腦苷脂及磷脂醯肌醇改善脂質體之血液半衰期的能力。此等發現係藉由下列闡述：Gabizon et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85,：6949)。美國專利第4,837,028號及WO 88/04924，兩者皆授予Allen等人，係揭露包含(1)鞘磷脂及(2)神經節苷脂GM1或硫酸半乳糖腦苷脂之脂質體。美國專利第5,543,152號(Webb等人)係揭露包含鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯基卵磷脂之脂質體係揭露於WO 97/13499(Lim等人)中。
於一態樣中，係使用陽離子性脂質體。陽離子脂質體具備能融合至細胞膜之優點。儘管非陽離子脂質體不能有效地與漿膜融合，但其可在體內被巨噬細胞攝取，且可用以將RNAi劑遞送至巨噬細胞。
脂質體之進一步之優點包括：從天然磷脂質獲得之脂質體係生物相容且生物可降解者；脂質體可合併多種水及脂溶性藥物；脂質體可保護封裝在其內部腔室中之RNAi劑不被代謝及降解(Rosoff,in "Pharmaceutical Dosage Forms",Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,volume 1,p.245)。在脂質體製劑之製備中的重要考量係脂質表面電荷、泡囊尺寸、及脂質體之水性體積。
荷正電之合成陽離子脂質，氯化N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)，可用以形成小脂質體，該小脂質體自發與核酸反應以形成脂質-核酸錯合物，該錯合物能與組織培養細胞之細胞膜的荷負電之脂質融合，從而完成RNAi劑之遞送(參見，例如，Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417以及美國專利第4,897,355號關於DOTMA及其與DNA合用之描述)。
一種DOTMA類似物，1,2-雙(油醯基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，可與磷脂質合用以形成複合有DNA之泡囊。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)係用於將高度陰離子性核酸遞送至活體組織培養細胞內的有效之劑，該細胞包含荷正電之DOTMA脂質體，而該脂質體自發與荷負電之聚核苷酸相互作用以形成複合物。當使用荷足夠正電之脂質體時，所得複合物之淨電荷亦為正。以此途徑製備之荷正電之複合物自發地附接至荷負電之細胞表面，與漿膜融合， 且有效地將官能性核酸遞送至例如組織培養細胞內。另一可商購之陽離子脂質，1,2-雙(油醯基氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(「DOTAP」)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)與DOTMA之不同之處在於其油醯基部分係藉由酯而非醚鏈結者。
其他經報導之陽離子脂質化合物包括彼等業經接合至多種部分者，包括，舉例而言，業經接合至兩種類型之脂質之一的羧基精胺，且包括化合物如5-羧基精胺基甘胺酸十八油醯基醯胺(「DOGS」)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)及二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺基-醯胺(「DPPES」)(參見，例如，美國專利第5,171,678號)。
另一陽離子脂質接合物包括具膽固醇之脂質衍生物(「DC-Chol」)，其業經與DOPE組合而配製在脂質體內(參見，Gao,X.and Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280)。脂質聚離胺酸，由接合聚離胺酸至DOPE而作成者，業經被報導其係在血型之存在下的轉染中有效(Zhou,X.et al.,(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065：8)。對於某些細胞系，據說此等含有經接合之陽離子脂質的脂質體顯現較低之毒性且提供比含DOTMA之組成物更有效之轉染。其他可商購之陽離子脂質產物包括DMRIE及DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。其他適用於遞送寡核苷酸之陽離子脂質揭示於WO 98/39359及WO 96/37194中。
脂質體製劑尤其適用於外用給藥，脂質體呈現比其他製劑優越之若干優點。此類優點包括，相對於對所給藥之藥物的高度系統性吸收， 副作用減低；所給藥之藥物在所欲之標靶處的蓄積增加；以及，將RNAi劑給藥至皮膚內的能力。於一些實作中，脂質體用於將RNAi劑遞送至表皮細胞，且亦用以提升RNAi劑至真皮組織內如皮膚內之滲透。舉例而言，該脂質體可外用施加。業經有文獻報導典型之配製為脂質體的藥物至皮膚之遞送(參見，例如，Weiner et al.,(1992)Journal of Drug Targeting,vol.2,405-410；du Plessis et al.,(1992)Antiviral Research,18：259-265；Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniques 6：682-690；Itani,T.et al.,(1987)Gene 56：267-276；Nicolau,C.et al.(1987)Meth.Enzymol.149：157-176；Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101：512-527；以及Wang,C.Y.and Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855)。
亦業經檢查非離子性脂質體系統，尤其是包含非離子性界面活性劑及膽固醇之系統，以確定它們在將藥物遞送至皮膚中之用途。包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及Novasome II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體製劑用來將藥物遞送至小鼠皮膚之真皮內。此類具有RNAi劑之製劑可用於治療皮膚疾患。
包括RNAi劑之脂質體可作成可高度變形者。該變形性令脂質體能夠滲透穿過小於該脂質體之平均半徑的孔。舉例而言，傳遞體係一種類型之可變形脂質體。傳遞體可藉由將表面邊緣活化劑，一般為界面活性劑，加入標準脂質體性組成物而作成。包括RNAi劑之傳遞體可藉由例如注射而在皮下遞送，以將RNAi劑遞送至皮膚之角質細胞。為了橫跨哺 乳動物之總皮層，脂質泡囊必需在合適之透皮梯度的影響下穿透一系列微孔，每一微孔具有小於50nm之直徑。此外，由於脂質之特性，此等傳遞體可係自優化(調適至孔如皮膚內之孔的形狀)、自修復，且可頻繁到達其標靶而不片段化，且一般為自載荷。
適用於本揭露之其他製劑揭示於下列美國臨時專利申請案中：2008年1月2日遞交之第61/018,616號、2008年1月2日遞交之第61/018,611號、2008年3月26日遞交之第61/039,748號、2008年4月22日遞交之第61/047,087號及2008年5月8日遞交之第61/051,528號。2007年10月3日遞交之PCT申請案第PCT/US2007/080331號亦揭示適用於本揭露之製劑。
傳遞體係又一類型之脂質體，其係可高度變形之脂質聚集體，對於藥物遞送媒介物而言，其係有吸引力之備選。傳遞體可揭示為脂質液滴，其可變形性如此之高以至於它們能輕易地滲透穿過小於該液滴之孔。傳遞體可適應其所使用之環境，例如，它們係自優化(調適至孔如皮膚內之孔的形狀)、自修復，且可頻繁到達其標靶而不片段化，且一般係自載荷。為了製作傳遞體，可將表面邊緣活化劑，一般為界面活性劑，加入標準脂質體性組成物。傳遞體業經用以將血清白蛋白遞送至皮膚。業經顯示，傳遞體介導之血清白蛋白的遞送與將含有血清白蛋白之溶液進行皮下注射同樣有效。
界面活性劑可廣泛用於製劑諸如本文揭示之彼等，尤其是乳液(包括微乳液)及脂質體中。對包括天然及合成者在內之多種不同類型的界面活性劑之特性進行分類及排序的最常見途徑，係藉由使用親水/親脂平 衡(HLB)進行。親水性基團(亦稱為「頭部」)之天性係提供將製劑中所用之不同界面活性劑歸類的最有用手段(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果界面活性劑分子未經離子化，則其分類為非離子性界面活性劑。非離子性界面活性劑可廣泛應用於醫藥及化粧產品中，且可在寬範圍之pH下使用。通常，它們的HLB值係2至約18之範圍，取決於它們的結構。非離子性界面活性劑包括非離子性酯類如乙二醇酯類、丙二醇酯類、甘油酯類、聚甘油酯類、失水山梨醇酯類、蔗糖酯類、及經乙氧基化之酯類。非離子性烷醇醯胺類及醚類如脂肪醇乙氧基化物、經丙氧基化之醇類、及經乙氧基化/丙氧基化之嵌段聚合物亦包括於這一類中。聚氧乙烯界面活性劑係非離子性界面活性劑類別中最常見之成員。
如果當將界面活性劑分子溶解或分散於水中時其攜帶負電荷，則該界面活性劑係分類為陰離子性。陰離子性界面活性劑包括羧酸酯類如皂類、醯基乳酸酯類、胺基酸之醯基醯胺類、硫酸之酯類如硫酸烷基酯及經乙氧基化之硫酸烷基酯、磺酸鹽類如烷基苯磺酸鹽類、醯基羥乙基磺酸鹽類、醯基酒石酸鹽類及磺基琥珀酸鹽類、及磷酸鹽類。陰離子性界面活性劑類別之最重要之成員係烷基硫酸鹽類及皂類。
如果當將界面活性劑分子溶解或分散於水中時其攜帶正電荷，則該界面活性劑係分類為陽離子性。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽類及經乙氧基化之胺類。四級銨鹽類係本類別中最常用之成員。
如果界面活性劑具有攜帶正電荷或負電荷之能力，則該界面活性劑係分類為兩性。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺類、N-烷基甜菜鹼類及磷脂類。
界面活性劑在藥物產品、製劑及乳液中之使用業經得以回顧(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用於本揭露之方法中的RNAi劑亦可提供為微胞製劑。本文中，「微胞」定義為特定類型之分子組件，其中，兩性分子排列為球狀結構，使得該等分子之疏水性部分全部朝向內側，留下親水性部分與周圍之水相接觸。如果環境係疏水性，則存在逆向排列。
適用於透過跨真皮膜遞送之混合微胞製劑可藉由將siRNA組成物之水性溶液、鹼金屬之C8至C22烷基硫酸鹽、及形成微胞之化合物混合而製備。示例性之形成微胞之化合物包括卵磷脂；玻尿酸；玻尿酸、乙醇酸、乳酸的藥學可接受之鹽類；洋甘菊提取物；黃瓜提取物；亞麻油酸；次亞麻油酸；單油酸甘油酯；單油酸酯類；單月桂酸酯類；玻璃苣油；月見草油；薄荷油；三羥基側氧基膽烷基甘油及其藥學可接受之鹽類；甘油；聚甘油；離胺酸；聚離胺酸；三油酸甘油酯；聚氧乙烯醚類及其類似物；聚多卡醇烷基醚類及其類似物；鵝脫氧膽酸鹽類；脫氧膽酸鹽類；及其混合物。形成微胞之化合物可在加入鹼金屬之烷基硫酸鹽的同時或之後加入。為了提供較小尺寸之微胞，可使用除劇烈混合外之基本上任何種類的混合形成混合微胞。
於一種方法中，製備含有siRNA組成物及至少一種鹼金屬之烷基硫酸鹽的第一微胞組成物。隨後將該第一微胞組成物與至少三種形成微胞之化合物混合以形成混合微胞組成物。於另一方法中，藉由將siRNA組成物、鹼金屬之烷基硫酸鹽、及至少一種形成微胞之化合物混合，之後在劇烈混合下加入剩餘的形成微胞之化合物而製備。
可將苯酚或間甲酚加至該混合微胞組成物中，以安定化製劑並防止細菌生長。或者，可將苯酚或間甲酚與形成微胞之成分一起加入。在形成該混合微胞組成物之後，亦可加入等張劑如甘油。
對於將微胞製劑作為噴霧劑遞送，可將該製劑置於氣溶膠分散器內，且該分散器填充有推進劑。該推進劑處於壓力之下，在該分散器中為液體形式。調節各成分之比率，使得水性相與推進劑相成為一體，亦即，僅存在一相。如果存在兩相，則在例如透過計量閥分散該等成分之一部分之前搖動該分散器。所分散劑量之藥劑係由該計量閥推進為細小噴霧。
推進劑可包括含氫之氯氟碳化合物、含氫之氟碳化合物、甲醚及乙醚。於某些態樣中，可使用HFA 134a(1,1,1,2-四氟乙烷)。
主要成分之具體濃度可藉由相對簡單之實驗確定。對於透過口腔進行之吸收，一般所欲者係增加劑量，例如，增加為透過注射給藥或透過胃腸道給藥之劑量的至少兩倍或三倍。
B.脂質顆粒
本揭露之RNAi劑例如dsRNA可完全封裝在脂質製劑如LNP中，或封裝在其他核酸-脂質顆粒內。
如本文中所使用，術語「LNP」指稱安定之核酸-脂質顆粒。LNP典型含有陽離子脂質、非陽離子之、及預防該顆粒聚集之脂質(例如，PEG-脂質接合物)。LNP極其有用於系統性應用，蓋因它們在靜脈內(i.v.)注射後顯現延長之循環壽命且在遠端位點(例如，物理上與給藥位點分隔之位點)蓄積。LNP包括「pSPLP」，其包括經封裝之縮合劑-核酸錯合物，如PCT公佈第WO 00/03683號中所詳述。本揭露之顆粒典型具有約50nm至約150nm、更典型約60nm至約130nm、更典型約70nm至約110nm、最典型約70nm至約90nm之平均直徑，且基本上無毒。此外，當本揭露之核酸-脂質顆粒中存在核酸時，該核酸在水性溶液中對抗核酸酶之降解。核酸-脂質顆粒及它們的製備方法揭露於例如美國專利第5,976,567號、第5,981,501號、第6,534,484號、第6,586,410號、第6,815,432號及美國專利公佈第2010/0324120號以及WO 96/40964中。
於一態樣中，脂質與藥物之比率(質量/質量比率)(例如，脂質與dsRNA之比率)將在約1：1至約50：1、約1：1至約25：1、約3：1至約15：1、在約4：1至約10：1、約5：1至約9：1、或約6：1至約9：1之範圍。上文引述之範圍之間的範圍亦視為本揭露之一部分。
某些用於遞送RNAi之特定LNP製劑業經揭示於該領域中，包括，例如，揭示於例如WO 2008/042973中之「LNP01」製劑，該專利藉由引用併入本文。
其他示例性脂質-dsRNA製劑鑑定於下表中。
Figure 109137670-A0202-12-0172-432
Figure 109137670-A0202-12-0173-437
Figure 109137670-A0202-12-0174-434
DSPC：二硬脂醯基卵磷脂
DPPC：二棕櫚醯基卵磷脂
PEG-DMG：PEG-二肉桂醯基甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(PEG，平均分子量為2000)
PEG-DSG：PEG-二桂皮基甘油(C18-PEG，或PEG-C14)(PEG，平均分子量為2000)
PEG-cDMA：PEG-胺基甲醯基-1,2-二肉癸醯基氧基丙胺(PEG，平均分子量為2000)
包含SNALP(1,2-二亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))之製劑，揭示WO 2009/127060中，其藉由引用而併入本文。
包含XTC之製劑，揭示於WO 2010/088537中，其整體內容藉由引用而併入本文。
包含MC3之製劑，揭示於例如美國專利公開案第2010/0324120號中，其整體內容藉由引用而併入本文。
包含ALNY-100之製劑，揭示於WO 2010/054406中，其整體內容藉由引用而併入本文。
包含C12-200之製劑，揭示於WO 2010/129709中，其整體內容藉由引用而併入本文。
用於口服給藥之組成物及製劑包括粉末劑或顆粒劑、微粒劑、奈米顆粒劑、水中或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊劑、軟膠囊劑、袋劑、片劑、或小片劑。增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可係所欲者。於一些態樣中，口服製劑係下述之彼等，其中本揭露提出之dsRNA與一種或多種滲透增強劑界面活性劑及螯合劑協同給藥。合適之界面活性劑包括脂肪酸類或其酯類或鹽類、膽汁酸類或其鹽類。合適之膽汁酸類/膽汁酸鹽類包括鵝脫氧膽酸(CDCA)及烏索脫氧鵝脫氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、脫氧膽酸、糖膽酸、甘膽酸、甘胺脫氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺脫氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉及甘胺二氫褐黴酸鈉。合適之脂肪酸類包括花生四烯酸、十一碳酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽(例如，鈉鹽)。於一些態樣中，使用滲透增強劑之組合，舉例而言，脂肪酸類/脂肪酸鹽類與膽汁酸/膽汁酸鹽類之組合。一種例示性之組合係月桂酸之鈉鹽、癸酸及UDCA。其他滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本揭露提出之dsRNA可作為包括噴霧乾燥顆粒在內之顆粒劑形式或錯合形成微粒或奈米顆粒而經口遞送。dsRNA錯合劑包括聚 胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧雜環丁烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；陽離子化之明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙烯醇(PEG)及澱粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生之聚亞胺、聚三葡萄糖、纖維素及澱粉。合適之複合劑包括幾丁聚醣、N-三甲基幾丁聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺酸、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如，對-胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-丙烯酸甲酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯醯腔、DEAE-白蛋白及DEAE-聚葡萄糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸鹽、及聚乙二醇(PEG)。dsRNA之口服製劑及其製備詳細揭示於美國專利第6,887,906號、U.S.2003/0027780及美國專利第6,747,014號中，其各自藉由引用併入本文。
用於腸胃外、腦實質內(至腦內)、鞘膜內、心室內或肝內給藥之組成物及製劑可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其它適宜之添加劑，例如但不限於，滲透增強劑、載劑化合物及其它藥學可接受之載劑或賦形劑。
本揭露之醫藥組成物包括但不限於，溶液、乳液、及含脂質體之製劑。此等組成物可從多種組分生成，該等組分包括但不限於，預成形之液體、自乳化之固體及自乳化之半固體。特佳者係當治療APP相關疾病或疾患時靶向腦之製劑。
可便利地以單位劑型存在的本揭露之醫藥製劑，可根據醫藥工業中習知之傳統技術製備之。此類技術包括將活性成分與醫藥載劑或賦形劑帶至聯合之步驟。通常，該等製劑係藉由將活性成分與液體載劑或精細分切之固體載劑或兩者均勻且緊密地帶至聯合而製備，隨後，若必要，令產物成形。
本揭露之組成物可配製為多種可能劑型之任一者，例如但不限於，片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、液體糖漿劑、軟膠劑、栓劑、及灌腸劑。本揭露之組成物亦可配製為處於水性、非水性或混合介質中的懸浮液。水性懸浮液可復含有增加懸浮液黏度之物質，該物質包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有安定劑。
C.其他製劑
i.乳液
本揭露之組成物可製備且配製為乳液。乳液係一種液體以直徑通常超過0.1μm之液滴形式分散於另一種液體中之典型非均質系統(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常係包含彼此緊密混合及分散之兩個不互混液體相之雙相系統。通常，乳液可係油包水(w/o)類或水包油(o/w)類。當水性相經精細切分為小液滴並分散於整塊油性相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油性相經精細切分為小液滴並分散於整塊水性相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為水性相、油性相存在於溶液中或本身作為單獨一相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。如需要，醫藥賦形劑如乳化劑、安定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。醫藥乳液亦可係由超過兩相構成之多乳液，舉例而言，油包水包油(o/w/o)乳液及水包油包水(w/o/w)乳液。此類復配製劑往往提供簡單雙相乳液所不具有之某些優點。其中o/w乳液之個體油滴將小水滴容納在內之多乳液係構建w/o/w乳液。同樣地，油滴被容納於安定存在於油性連續相中之水球內的系統，提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學安定性小或沒有。一般情況下，乳液之分散相或不連續相良好地分散在外部相或連續相中，且經由乳化劑手段或形成黏度之手段維持其形式。乳液之任一相可係半固體或固體，如在乳液型軟膏基質及乳霜劑之情形中者。其他安定化乳液之手段需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。廣義上，乳化劑可歸為四類：合成界面活性劑、天然界面活性劑、吸收基質、及精細分散之固體(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，業經廣泛用於乳液製劑中且業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型係兩性者且包含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親水性與疏水性之比率業經定義為親水/親脂平衡(HLB)，且係在製劑之製備中歸類及選擇界面活性劑之有價值的工具。基於其親水性基團之天性，界面活性劑可歸為不同之類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液製劑中使用之天然乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂質、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基質具備親水特性，使得它們可吸收水以形成w/o 乳液，而仍保持其半固體一致性，吸收基質係例如無水羊毛脂及親水石油脂。精細切分之固體亦業經用作良好之乳化劑，尤其是與界面活性劑合用或用於黏性製劑中。此等包括極性無機固體，如重金屬氫氧化物、非溶脹黏土如皂土、鎂鋁海泡石、水輝石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁及膠體矽酸鎂鋁、顏料及非極性固體如碳或甘油三硬脂酸酯。
大量非乳化材料亦包括於乳液製劑中，且對乳液之特性有所貢獻。此等包括脂肪、油類、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
親水性膠體或水膠體包括天然膠及合成化合物，如多醣(舉例而言，阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠、刺梧桐膠及黃芪膠)、纖維素衍生物(舉例而言，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)、及合成聚合物(舉例而言，卡波姆、纖維素醚、及羧基乙烯基聚合物)。此等在水中分散或溶脹以形成膠體溶液，其藉由形成環繞分散相液滴之強界面膜且藉由增加外部相之黏度而安定化乳液。
由於乳液一般含有可輕易地支持微生物生長的大量成分如碳水化合物、蛋白質、固醇及磷脂質，此等製劑一般係併入防腐劑。乳液製劑包括的常用之防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、氯化苄烷基羥銨、對羥基苯甲酸之酯、及硼酸。抗氧化劑亦常常 加入乳液製劑中以防止該製劑的變質。所使用之抗氧化劑可係自由基捕捉劑如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化之羥基茴香醚、丁基化之羥基甲苯、或還原劑如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉、及抗氧化劑增效劑如枸櫞酸、酒石酸及卵磷脂。
乳液製劑經由護膚途徑、口服途徑及腸胃外途徑之應用及其製造方法業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。用於口服遞送之乳液製劑因為其容易配製以及在吸收及生物利用性觀點之效能而業經廣泛使用(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。礦物油基質輕瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑屬於業經作為o/w乳液而常常口服給藥的材料。
ii.微乳液
於本揭露之一個態樣中，RNAi劑及核酸之組成物係配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩性之系統，其係單一光學各向同性且熱力學安定之溶液(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液係藉由下述製備之系統，首先，將油分散於界面活性劑水溶液中，隨後加入足量之第四成分，通常係中等鏈長之醇，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混液體的熱力學安定、各向同性之澄清分散液，該兩種液體藉由表面活性分子之界面膜予以安定化(Leung and Shah，Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液通常經由將三至五種組分組合而製備，該等組分包括油、水、界面活性劑、助界面活性劑及電解質。微乳液是否為油包水(w/o)類型或水包油(o/w)類型取決於所使用之油及界面活性劑之特性，亦取決於界面活性劑分子之極性頭部及烴類尾部至結構及幾何封裝(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
使用相圖之現象學途徑業經廣泛研究，且業經令該領域熟練人士獲得如何配製微乳液之全面知識(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。與傳統乳液相比，微乳液具備將製劑中水不溶性藥物溶解為自發形成之熱力學安定之液滴的優點。
於微乳劑之製備中使用的界面活性劑包括但不限於，離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，單獨使用或與助界面活性劑合用。助界面活性劑，一般係短鏈醇如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，用來藉由因為在界面活性劑分子間生成之空洞空間而滲透入界面活性劑膜並隨後創建失序膜，從而增加界面流動性。惟，微乳劑可不使用助界面活性劑而製備，且不含醇之自乳化微乳液系統係該領域中已知者。水性相典型可係但不限於，水、藥物之水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、及乙二醇之衍生物。油性相可包括但不限於，材料諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、重鏈(C8-C12)單、二及三甘油酯、聚氧乙基化之甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化之甘油酯、飽和聚二醇化之C8-C10甘油酯、植物油及矽油。
自藥物溶解性之觀點及增強之藥物吸收來看，微乳液係尤其感興趣者。業經提出，基於脂質之微乳液(o/w及w/o兩者)增強藥物之口服生物利用性，該藥物包括胜肽(參見，例如，美國專利第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供下列優點：改善之藥物溶解性、保護藥物不被酶水解、由於引入界面活性劑導致之膜流動性及可透過性之改變造成的可能提升之藥物吸收、容易製備、比固體劑型更易口服給藥、改善之臨床潛能、以及降低之毒性(參見，例如，美國專利第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當在環境溫度下將微乳液之組分帶至一起時，一般可自發形成微乳液。這在配製熱安定藥物、胜肽或RNAi劑時尤其具有優勢。亦業經發現，微乳液在化妝品及醫藥兩種應用中活性組分之透皮遞送中有效。預期本揭露之微乳液組成物及製劑將促進胃腸道對RNAi劑及核酸之系統性吸收，以及改善對RNAi劑及核酸之局部細胞攝取。
本揭露之微乳液亦可含有額外之組分及添加劑如失水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol、以及滲透增強劑，以改善製劑之特性並增強對本發明之RNAi劑及核酸之吸收。本揭露之微乳液中使用之滲透增強劑可歸類為屬於下述五大類之一：界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合 劑、及非螯合非界面活性劑(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。此等類型各自業經於上文檢討。
iii.微粒
本揭露之RNAi劑可併入顆粒例如微粒中。微粒可藉由噴霧乾燥生產，但亦可藉由其他方法生產，該等其他方法包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透增強劑
於一態樣中，本揭露採用多種滲透增強劑以實現核酸尤其是RNAi劑至動物皮膚之有效遞送。大多數藥物以經離子化及未經離子化兩種形式存在於溶液中。惟，一般僅脂溶性或親脂性藥物輕易地跨越細胞膜。業經發現，如果待被跨越之細胞膜經滲透增強劑處理，則即便是非親脂性藥物仍能夠跨越該細胞膜。滲透增強劑除了有助於非親脂性藥物跨越細胞膜之擴散之外，亦提升親水性藥物之滲透能力。
滲透增強劑可分類為屬於下述五大類之一：亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述各類別之滲透增強劑更詳細揭示於下。
界面活性劑(或「表面活性劑」)係化學實體，當其溶解在水性溶液中時，降低該溶液之表面張力或該水性溶液與另一液體間之界面張力，結果為RNAi劑經由黏膜至吸收得以提升。此等滲透增強劑除了膽酸鹽及脂肪酸外亦包括，舉例而言，月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚及 聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；以及全氟化學乳液如FC-43。(Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
作為滲透增強劑而作動之多種脂肪酸及其衍生物包括，舉例而言，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯(1-單油醯基-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生油酸、甘油-1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如，甲酯、異丙酯及第三丁酯)、及其單甘油酯及二甘油酯(亦即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見，例如，Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁之生理學角色包括促進對脂質及脂溶性微生物之分散及吸收(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。多種天然膽汁鹽及其合成衍生物作為滲透增強劑而作動。因此，術語「膽 汁鹽」包括膽汁之任意天然組分以及它們的任意合成衍生物。適宜之膽汁鹽包括，舉例而言，膽酸(或其藥學可接受之鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、糖膽酸(糖膽酸鈉)、糖脫氧膽酸(糖脫氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺脫氧膽酸(牛磺脫氧膽酸鈉)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、烏索脫氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴素鈉(STDHF)、糖基二氫褐黴素鈉及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Swinyard,Chapter 39 In：Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
與本揭露關聯使用之螯合劑可定義為，藉由與金屬離子形成錯合物而將該金屬離子從溶液中移除的化合物，結果為經由黏膜進行之RNAi劑吸收得以提升。關於它們作為滲透增強劑於本揭露中之用途，螯合劑具有亦作為DNase抑制劑而作動之附加優點，蓋因大多數特徵化DNA核酸酶需要用於催化之二價金屬離子並因此被螯合劑所抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。適宜之螯合劑包括但不限於，伸乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、枸櫞酸、柳酸鹽(例如，柳酸鈉、5-甲氧基柳酸鹽及高香草酸鈉)、膠原之N-醯基衍生物、laureth-9及beta-二酮之N-胺基醯 基衍生物(烯胺類)(參見，例如，Katdare,A.et al.,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文中所用，非螯合非界面活性劑滲透增強劑化合物可定義為，證明其作為螯合劑或作為界面活性劑之活性不顯著但仍然增強經由消化道黏膜進行之RNAi劑吸收的化合物(參見，例如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。這一類滲透增強劑包括，舉例而言，不飽和環狀脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92)；以及非類固醇抗炎劑如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛(indomethacin)及丁二苯吡唑二酮(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
於細胞層級增強RNAi劑攝入之劑亦可加入本揭露之醫藥組成物及其他組成物中。舉例而言，陽離子脂質如lipofectin(Junichi等人，美國專利第5,705,188號)、陽離子性甘油衍生物、及聚陽離子性分子如聚離胺酸(Lollo等人，PCT申請WO 97/30731)，亦已知增強dsRNA之細胞攝入。
其他劑可用以增強所給藥之核酸的滲透，包括二醇類如乙二醇及丙二醇、吡咯類如2-吡咯、氮酮類、及萜類如檸檬烯及薄荷酮。
vi.賦形劑
與載劑化合物相比，「藥物載劑」或「賦形劑」係藥學可接受之溶劑、懸浮劑或其他用於將一種或多種核酸遞送至動物之藥學惰性媒介物。賦形劑可係液體或固體，且當與核酸及給定醫藥組成物之其他組分合併時，基於所考慮之計劃給藥模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。典型之藥物載劑包括但不限於，結合劑(例如，預膠凝化之玉米澱粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填料(例如，乳糖及其他糖類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、氧化矽、膠體二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如，澱粉、澱粉乙醇酸鈉等)；以及潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉等)。
不與核酸進行有害反應的適用於非腸胃外給藥之藥學可接受的有機或無機賦形劑亦可用以配製本揭露之組成物。適宜之藥學可接受的載劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
用於核酸之外用給藥的製劑可包括無菌及非無菌水性溶液、在常用溶劑如醇類中之非水性溶液、或核酸在液體或固體油基質中之溶液。該等溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜之添加劑。可使用不與核酸進行有害反應的適用於非腸胃外給藥之藥學可接受的有機或無機賦形劑。
適宜之藥學可接受的賦形劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
vii.其他組分
本揭露之組成物可額外地含有常見於醫藥組成物中之其他輔助組分，用量為它們在該領域中常用的量級。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外、可相容、藥學活性之材料諸如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有可用於物理上配製多種類型之本揭露之組成物的材料諸如染料、矯味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及安定劑。惟，當加入此類材料時，此類材料應不過度干擾本揭露之組成物之組分的生物活性。該製劑可經無菌化，且(若需要)與不與該製劑之核酸進行有害反應的佐劑如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、矯味劑或芳香物質等混合。
水性懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，該物質包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。懸浮液亦可含有安定劑。
於一些態樣中，本揭露提出之醫藥組成物包括(a)一種或多種RNAi劑化合物及(b)一種或多種劑，其藉由非RNAi機制而發揮功能且有用於治療HTT相關之疾患。此類劑之示例包括但不限於，單胺抑制劑、蛇根鹼、抗痙攣劑、抗精神病藥及抗抑鬱藥。
此類化合物之毒性及治療功效可藉由標準藥學過程在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(族群之50%致死之劑量)及ED50(族群之50%治療有效之劑量)。毒性與治療功效間之劑量比率係治療 係數，且其可表現為LD50/ED50之比率。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
從細胞培養檢定及動物研究中獲得之資料可用於配製在人體內使用之劑量範圍。本揭露提出之組成物的劑量通常處於包括ED50在內之具低毒性或無毒性之循環濃度範圍。劑量可依據所採用之劑型及所使用之給藥途徑而在此範圍內變動。對於在本揭露提出之方法中使用的任意化合物，最初可從細胞培養物檢定中構建治療有效之劑量。劑量可在動物模型中配製為達成該化合物或(當適宜時)標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如，達成多肽之降低之濃度)，該範圍包括如在細胞培養物中測定之IC50(亦即，達成對症候之半最大抑制時該測試化合物之濃度)。此訊息可用來更準確地確定可用於人體之劑量。舉例而言，可藉由高效液相色層分析術量測血漿中之量級。
除了如上文檢討之給藥之外，本揭露提出之RNAi劑亦可與其他已知之在治療由核苷酸重複序列表現介導之病理進程中有效的劑合用。在任何情況下，主治醫生皆可基於該領域中已知或本文所述之標準功效測量方法觀察之結果而確定RNAi劑給藥的量及時機。
VII.套組
於某些方面，本揭露提供包括合適容器之套組，該容器含有siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前驅物，例如，可加工為ssiRNA化合物之較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物之DNA，例如，雙股siRNA化合物、或ssiRNA化合物或其前驅物)。
此類套組包括一種或多種dsRNA劑及使用說明，例如，用於給藥預防或治療有效量之dsRNA劑的使用說明書。dsRNA劑可處於小瓶內或預填充之注射器內。套組可視需要復包含用於給藥dsRNA劑之機構(例如，注射裝置，諸如預填充之注射器)或用於量測對C3之抑制的機構(例如，用於量測對HTT mRNA、HTT蛋白質及/或HTT活性之抑制的機構)。此類用於量測對HTT之抑制的機構可包含用於從受試者獲得樣本例如SCF及/或血漿樣本的機構。本發明之套組可視需要復包含用於確定治療有效量或預防有效量的機構。
於某些態樣中，藥物製劑之個體組分可提供於一個容器例如小瓶或預填充之注射器內。另選地，可能所欲者係將藥物製劑之組分單獨提供於兩個或更多個容器中，例如，一個用於siRNA化合物製備的容器以及至少另一個用於載劑化合物的容器。套組可包裝成多種不同組態，諸如一個盒子中之一個或多個容器。不同組分可組合，例如，根據套組提供之使用說明書組合。組分可根據本文所揭示之方法組合，例如以製備並給藥一種醫藥組成物。套組亦可包括遞送裝置。
VIII.抑制HTT表現之方法
本揭露亦提供抑制HTT基因在細胞內之表現的方法。該方法包括令細胞與其量足以抑制該細胞內HTT之表現的RNAi劑例如雙股RNAi劑接觸，從而抑制該細胞內HTT之表現。於本揭露之某些態樣中，HTT優先於CNA(例如，腦)細胞內被抑制。
細胞與RNAi劑例如雙股RNAi劑之接觸可於體外或體內進行。令細胞與RNAi劑於體內接觸包括令受試者例如人類受試者體內之 細胞或細胞群組與RNAi劑接觸。體外接觸細胞之方法與體內接觸細胞之方法的組合亦係可能者。
與細胞接觸可係直接或間接者，如上文檢討。此外，與細胞之接觸可經由靶向配位子施行，該配位子包括本文所揭示或該領域中已知之任意配位子。於一些態樣中，靶向配位子係碳水化合物部分，例如GalNAc配位子，或將RNAi劑引導至感興趣之位點的任意其他配位子。
如本文中所用，術語「抑制」與「減輕」、「靜默」、「下調」、「阻抑」及其他類似術語可互換使用，且包括任意量級之抑制。於某些態樣中，本揭露之RNAi劑的抑制量級可於細胞培養條件下評估，其中經由細胞附近濃度為10nM或更低、1nM或更低等等的LipofectamineTM介導之轉染將細胞培養物中之細胞轉染。給定RNAi劑之減弱可經由將細胞培養物中之處理前量級與細胞培養物中之處理後量級比較而確定，視需要亦與使用加擾或其他形式之對照RNAi劑平行處理之細胞比較。細胞培養物中例如較佳50%或更多之減弱，可因此被鑑定為「抑制」、「減輕」、「下調」或「阻抑」業經出現之標誌。明確預期，在如該領域所揭示者的適宜控制之條件下，亦可於體內系統中評估本揭露之RNAi劑所靶向之mRNA或所編碼之蛋白質量級(並因此評估由本揭露之RNAi劑造成之「抑制」等的程度)。
如本文中所用，短語「抑制HTT基因之表現」或「抑制HTT之表現」包括抑制任意HTT基因(例如，小鼠HTT基因、大鼠HTT基因、猴HTT基因、或人HTT基因)以及編碼HTT蛋白質的HTT基因之變體或 突變體的表現。因此，於經基因操縱之細胞、細胞群組或生物體之語境中，HTT基因可係野生型HTT基因、突變HTT基因或基因轉殖HTT基因。
「抑制HTT基因之表現」包括對HTT基因之任意量級之抑制，例如，對HTT基因之表現的至少部分的阻抑，諸如至少約20%之抑制。於某些態樣中，抑制程度係至少30%、至少40%，較佳地至少50%、至少about 60%、至少70%、至少about 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%；或至低於檢定方法之偵檢量級。
HTT基因之表現可基於與HTT基因表現相關之任意變量之量級例如HTT mRNA量級或HTT蛋白質量級或例如C9orf72擴張蛋白質之量級而評估。
抑制可藉由此等變量之一者或多者之絕對水平或與對照量級相比之相對水平的下降而評估。該對照量級可係該領域中使用之任意類型之對照量級，如投藥前之基線量級，或從未治療或經對照物(例如，僅含緩衝劑之對照物或非活性劑之對照物)治療之類似之受試者、細胞或樣本測得之量級。
於本揭露之方法的一些態樣中，HTT基因之表現被抑制至少20%、30%、40%，較佳至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%，或被抑制到低於該檢定之偵檢量級。於某些態樣中，該方法包括對HTT表現之臨床相關抑制，例如，藉由在使用劑治療受試者以減低HTT表現之後的臨床相關結局證明者。
HTT基因表現之抑制可藉由第一細胞或細胞群組(此類細胞可存在於來如來源於受試者之樣本中)所表現之mRNA量相對於基本上與第一細胞或細胞群組相同但未經如是處理之第二細胞或細胞群組(未經RNAi劑處理或未經靶向感興趣基因之RNAi劑處理的對照細胞)減低而體現，於該細胞或細胞群組中，HTT基因被轉錄並且業經處理(例如，藉由令該一個或多個細胞與本揭露之RNAi劑接觸，或藉由將本揭露之RNAi劑給藥至其體內存在或曾經存在該細胞之受試者)，使得HTT基因被抑制。抑制之程度可藉由下述術語表現：
Figure 109137670-A0202-12-0195-84
於其他態樣中，HTT基因表現之抑制可從功能上與HTT基因表現例如HTT蛋白質表現關聯之參數的減低而進行評估。HTT基因靜默可於與表現構造物同源或異源的表現HTT之任意細胞內測定，並且藉由該技藝中已知之任意檢定測定。
HTT蛋白質表現之抑制可藉由細胞或細胞群組所表現之HTT蛋白質量級(例如，於源自受試者之樣本中表現的蛋白質量級)之減低而體現。如上所述，對於mRNA阻抑之評估，經處理之細胞或細胞群組中蛋白質表現量級之抑制可類似地表現為相對於對照細胞或細胞群組中蛋白質量級的百分比。
可用來評估HTT基因表現之抑制的對照細胞或細胞群組包括尚未與本揭露之RNAi劑接觸之細胞或細胞群組。舉例而言，對照細胞 或細胞群組可源自使用RNAi劑治療受試者之前的個體受試者(例如，人類或動物受試者)。
細胞或細胞群體所表現之HTT mRNA量級可使用該領域中已知用於評估mRNA表現之任意方法測定。於一態樣中，樣本中之HTT表現量級可藉由偵檢經轉錄之多核苷酸或其蛋白質例如HTT基因之mRNA而測定。可使用RNA抽取技術，包括例如使用酸酚/異硫氰酸胍抽取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgene(PreAnalytix，Switzerland)，從細胞中抽取RNA。採用核糖核酸雜交之典型檢定型式包括核連綴檢定、RT-PCR、RNase保護檢定、北方印漬術、原位雜交及微陣列分析。循環HTT mRNA可使用WO2012/177906中揭示之方法偵檢，該專利之整體內容藉由引用併入本文。
於一些態樣中，使用核酸探針確定HTT之表現量級。如本文所用，術語「探針」指稱能夠選擇性地結合至特異性HTT核酸或蛋白質或其片段的任意分子。探針可由該領域熟練人士合成，或來源於適宜之生物學製劑。探針可特異性地涉及為被標記。可用作探針之分子的示例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增檢定中，該檢定包括但不限於，南方或北方印漬分析、聚合酶連鎖反應(PCR)分析及探針陣列。一種用於測定mRNA量級之方法包括令單離之mRNA與可雜交至HTT mRNA之核酸分子(探針)接觸。於一態樣中，例如，藉由令單離之mRNA於瓊脂糖凝膠電泳並將mRNA從該凝膠轉移至膜諸如硝基纖維素膜，從而將mRNA固定於固體表面並令其與探針接觸。於備選之態樣中，例如，於 Affymetrix®基因晶片陣列中，將探針固定於固體表面並令mRNA與該探針接觸。熟練人士可輕易地調整已知之mRNA偵檢方法以用於測定HTT mRNA之量級。
用於測定樣本中HTT表現量級之方法包括例如樣本中之mRNA的核酸擴增或逆轉錄(以製備cDNA)之製程，該製程係例如藉由RT-PCR(Mullis於1987年於美國專利4,683,202中詳述之實驗性態樣)、連接酶連鎖反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我持續之序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi et al.,US Patent No.5,854,033)或任意其他核酸擴增方法進行，之後使用該領域彼等熟練人士習知之技術偵檢所擴增之分子。如果核酸分子以非常低之數量存在，則此等偵檢方法尤其有用於偵檢此類分子。於本揭露之具體方面，藉由定量螢光RT-PCR(亦即，TaqManTM系統)、藉由Dual-Glo®螢光素酶檢定、或藉由其他該領域認可之用於量測HTT表現或mRNA量級之方法測定HTT表現量級。
可使用膜印漬(諸如雜交分析中所用者，諸如北方印漬、南方印漬、點等)或微孔、樣本管、凝膠、珠或纖維(或包含經結合之核酸的任意固體支撐物)監控HTT mRNA之表現量級。參見，美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號及第5,445,934號，該等專利藉由引用併入本文。HTT表現量級之測定亦可包含包含處於溶液中之核酸探針。
於一些態樣中，使用分支DNA(bDNA)檢定或實時PCR(qPCR)評估mRNA表現之量級。這一PCR方法之用途揭示且例示於本文之實施例中。此類方法亦可用於偵檢HTT核酸。
HTT蛋白質表現之量級可使用該領域中已知用於量測蛋白質量級之任意方法測定。此類方法包括，例如，電泳、毛細管電泳、高效液相層析術(HPLC)、薄層層析術(TLC)、超擴散層析術、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜、比色檢定、分光光度檢定、流式細胞術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、西方印漬術、放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定等。此類檢定可用於偵檢HTT蛋白質之存在或複製的蛋白質標誌物。
於一些態樣中，本揭露之方法於治療HTT相關疾病中之功效藉由HTT mRNA量級之降低(例如，藉由評估CSF樣本及/或血漿樣本之HTT量級，藉由腦部生物活檢，或其他方式)而評估。
於本揭露之方法的一些態樣中，將RNAi劑給藥至受試者，使得RNAi劑被遞送至該受試者體內之具體位點。HTT表現之抑制可使用來源於該受試者之具體位點的樣本例如CNS細胞中HTT mRNA或HTT蛋白質之量級或量級改變的量測值進行評估。於某些態樣中，該方法包括對HTT表現之臨床相關抑制，例如，藉由在使用劑治療受試者以減低HTT表現之後的臨床相關結局證明者，舉例而言，尾狀萎縮之安定化或抑制(例如，藉由容積MRI(vMRI)評估者)、來自受試者之CSF樣本中神經元絲輕鏈(Nfl)量級的安定化或減低、突變HTT mRNA或經裂解之HTT蛋白質的減低(例如，全長度突變HTT mRNA或蛋白質以及經裂解之突變HTT mRNA或蛋白質中的一者或兩者)、以及統一亨汀頓氏病評定量表(Unified Huntington’s Disease Rating Scale(UHDRS))得分。
如本文中所用，術語偵檢或確定分析質之量級係理解為意指執行該等步驟以確定材料例如蛋白質、RNA是否存在。如本文中所用，偵檢或確定方法包括偵檢或確定低於所使用方法之偵檢量級的分析質量級。
IX.治療或預防HTT相關疾病之方法
本揭露亦提供使用本揭露之RNAi劑或含有本揭露之RNAi劑的組成物來減低或抑制細胞內HTT表現的方法。該方法包括令細胞與本揭露之dsRNA接觸，並將細胞維持足以獲得HTT基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而抑制該HTT基因在細胞中的表現。基因表現之減低可藉由該領域中已知之任意方法評估。舉例而言，HTT表現之減低可藉由使用對於具有該領域通常技術之人士為常規之方法如北方印漬術、qRT-PCR來測定HTT之mRNA表現量級而測定；或藉由使用對於具有該領域通常技術之人士為常規之方法如西方印漬術、免疫學技術來測定HTT之蛋白質量級而測定。
於本揭露之方法中，細胞可在體內或體外接觸，亦即，細胞可處於受試者體內。
適用於使用本揭露之方法治療的細胞可係表現HTT基因之任意細胞。適用於在本揭露之方法中使用之細胞可係哺乳動物細胞，例如靈長動物細胞(諸如人類細胞或非人靈長動物細胞，例如猴細胞或黑猩猩細胞)、非靈長動物細胞(諸如大鼠細胞或小鼠細胞)。於一個態樣中，該細胞係人類細胞，如人類CNS細胞。
細胞中之HTT表現被抑制至少約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，亦即，抑制到低於偵檢量級。於較佳之態樣中，HTT表現被抑制至少50%。
本揭露之體內方法可包括對受試者給藥含有RNAi劑之組成物，其中該RNAi劑包括與待治療之哺乳動物之HTT基因之RNA轉錄本之至少一部分互補的核苷酸序列。當待治療之有機體係哺乳動物例如人時，該組成物可藉由該領域中已知之任意手段給藥，該手段包括但不限於，口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，腦室內、腦實質內及鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、透皮、氣管(氣溶膠)、鼻內、直腸內及外用(包括口含及舌下)給藥。於某些態樣中，該組成物係藉由靜脈內輸液或注射而給藥。於某些態樣中，該組成物係藉由皮下注射而給藥。於某些態樣中，該組成物係藉由鞘內注射而給藥。
於一些態樣中，該給藥係經由積存注射進行。積存注射可在延長之時間段內以一致之途徑釋放RNAi劑。因此，積存注射可減低獲得所欲效果如所欲之HTT抑制或治療性或預防性效果所需之給藥頻次。積存注射亦可提供更為一致之血清濃度。積存注射可包括皮下注射或肌肉注射。於較佳之態樣中，積存注射係皮下注射。
於一些態樣中，該給藥係經由幫浦進行。該幫浦可係外部幫浦或經外科手術植入之幫浦。於另一態樣中，該幫浦係經皮下植入之滲透幫浦。於其它態樣中，該幫浦係輸液幫浦。輸液幫浦可用於顱內、靜脈內、皮下、動脈內或硬膜內輸液。於較佳之態樣中，該輸液幫浦係皮下輸液幫 浦。於其他態樣中，該幫浦係經外科手術植入之將RNAi劑遞送至CNS的幫浦。
可基於局部治療或系統性治療是否係所欲者並基於待治療之面積而選擇給藥模式。可選擇給藥之途徑及位點以增強靶向性。
一方面，本揭露亦提供抑制HTT基因在哺乳動物體內之表現的方法。該方法包括向哺乳動物給藥包含靶向哺乳動物細胞內HTT基因之dsRNA的組成物，並將該哺乳動物維持足以獲得HTT基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而抑制該HTT基因在細胞中的表現。基因表現之減低可藉由該領域中已知之任意方法及藉由本文中揭示之方法例如qRT-PCR評估。蛋白質生產之減低可藉由該領域中已知之任意方法及藉由本文中揭示之方法例如ELISA評估。於一個太陽中，CNS生物活檢樣本或腦脊液(CSF)樣本作為組織材料用於監控HTT基因或蛋白質表現(或其替代者)之減低。
本揭露復提供治療有此需要之受試者的方法。本揭露之治療方法包括將本揭露之RNAi劑給藥至受試者例如將受益於抑制HTT表現的受試者，給藥量為靶向HTT基因之RNAi劑或包含靶向HTT基因之RNAi劑之醫藥組成物的治療有效量。
此外，本揭露提供預防、治療或抑制受試者之HTT相關疾病或疾患(例如，亨汀頓氏病)之進展諸如HTT相關疾病或疾患之進展的方法。該方法包括向受試者給藥治療有效量之本文提供之任意RNAi劑例如dsRNA劑或醫藥組成物，從而預防、治療或抑制該受試者之HTT相關疾病或疾患的進展。
本揭露之RNAi劑可作為「游離RNAi劑」給藥。游離RNAi劑係於醫藥組成物之不存在下給藥。裸RNAi劑可處於合適之緩衝溶液中。緩衝溶液可包含醋酸鹽、枸櫞酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。於一個態樣中，緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有RNAi劑之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其適用於給藥至受試者。
或者，本揭露之RNAi劑可作為醫藥組成物給藥，例如作為dsRNA脂質體製劑給藥。
將受益於HTT基因表現之減低或抑制的受試者係彼等患有HTT相關疾病例如亨汀頓氏病者。
本揭露復提供使用RNAi劑及其醫藥組成物的方法，例如，用於治療將受益於HTT表現之減低或抑制的受試者，如患有HTT相關疾患之受試者，該方法與其他藥品或其他治療方法合用，例如，與已知之藥品或已知之治療方法如彼等當下用於治療此等疾患者合用。例如，於某些態樣中，靶向HTT之RNAi劑與例如如本文中他處所揭示或如該領域中以其他方式已知的可用於治療HTT相關病變之劑合用。例如，適用於治療將受益於HTT表現減低之受試者例如患有HTT相關病變之受試者的附加劑可包括當目前於治療HTT症候之劑。RNAi劑及附加治療劑可同時給藥及/或在同一組合中給藥，例如鞘內給藥，或附加治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法給藥。
示例性之附加治療劑包括，例如，單胺抑制劑例如四苯喹嗪(tetrabenazine(Xenazine))、氘代四苯喹嗪(deutetrabenazine(Austedo))及 蛇根鹼；抗痙攣劑例如丙戊酸(丙戊酸鈉(Depakote)、帝拔癲、Depacon)及可那氮平(Klonopin)；抗精神病藥例如利培酮(Risperdal)及氟派醇(Haldol)；以及抗抑鬱藥例如帕羅西汀(Paxil)。
於一態樣中，該方法包括給藥本文中提出之組成物，使得標靶HTT基因之表現降低，該降低持續至少一個月。於較佳之態樣中，表現降低持續至少2個月、3個月或6個月。
較佳地，可用於本文中提出之方法及組成物之RNAi劑特異性地靶向標靶HTT基因的RNA(初代或經處理者)。使用RNAi劑抑制此等基因之表現的組成物及方法可如本文中所揭示者製備及實施。
根據本揭露之方法給藥dsRNA可導致患有HTT相關病變之患者體內此等疾病或病變之嚴重性、跡象、症候或標誌物之減低。這一語境中，「減低」意指此量級之統計學顯著或臨床顯著的下降。減低可係，舉例而言，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或約100%。
疾病之治療或預防的效力可藉由下述評估，舉例而言，量測疾病進展、疾病緩解、症候嚴重性、疼痛之減低、生命品質、持續治療效果所需之藥物劑量、疾病標記物或任何適用於給定之待治療疾病或預防之靶向的其他可量測之參數。藉由量測此類參數之任一者或參數之任意組合而監控治療或預防之效率，完全處於熟悉該領域之人士的能力範圍內。例如，HTT相關病變之治療功效可例如藉由對受試者之週期性監控而評估。將後來之讀數與最初之讀數比較，對醫師提供治療是否有效之指示。藉由量測此類參數之任一者或參數之任意組合而監控治療或預防之效率，完全 處於熟悉該領域之人士的能力範圍內。與靶向HTT之RNAi劑或其醫藥組成物之給藥相關聯，「有效對抗」HTT相關病變指示，以臨床上適宜之模式給藥在至少統計學顯著分數之患者中導致有益效果，例如症候之改善、治愈、疾病之減低、生命延長、生命品質之改善、或其他通常被熟悉治療脂質代謝病變及相關肇因之醫生認為積極的效果。
當疾病狀態之一個或多個參數存在統計學顯著之改善時，或預期會惡化或發展出症候者沒有惡化或發展出症候時，證明治療性或預防性效果。作為實例，可量測之疾病參數之至少10%且較佳至少20%、30%、40%、50%或更高的有利改變，可係有效治療之指示。給定RNAi劑藥物或該藥物之製劑的效力亦可使用該領域中已知之用於給定疾病之實驗動物模型來判斷。當使用試驗動物模型時，當觀察到標誌物或症候之統計學顯著的減低時，則證明治療之功效。
另選地，可藉由診斷領域之熟練人士基於臨床上接受之疾病嚴重程度分級量表確定之疾病嚴重程度的減低，量測該功效。任意導致例如使用適宜量表量測之疾病嚴重程度變小的正向改變，代表使用本文所揭示之RNAi劑或RNAi製劑之足夠治療。
受試者可經給藥治療量之dsRNA，諸如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
RNAi劑可經鞘內給藥，經靜脈內注射給藥，或藉由在一段時間內定期靜脈輸注而給藥。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。RNAi劑之給藥可將例如細胞、組織、血液、CSF樣本或患者之其他腔室內的HTT量級減低至少20%、30%、40%、50%、 55%、60%、65%、70,%75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或至少約99%或更多。於較佳之態樣中，RNAi劑之給藥可減低HTT量級，例如，於該患者之細胞、組織、血液、CSF樣本或其他腔室內，HTT量級減低至少50%。
於給藥全劑量之RNAi劑之前，可對患者給藥較小之劑量諸如5%輸液反應，並監控副作用諸如過敏反應。於另一示例中，可監控患者之非所欲之免疫刺激效應如增加之細胞因子(例如，TNF-α或INF-α)量級。
另選地，RNAi劑可經皮下給藥，亦即，藉由皮下注射給藥。一次或多次注射可用來將所欲之例如月劑量的RNAi劑遞送至受試者。該注射可在一段時間內重複實施。該給藥可定期重複實施。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之實施頻次可降低。重複劑量方案可包括規則地給藥治療量之RNAi劑，諸如每個月一次或延長至每季一次、每年兩次、每年一次。於某些態樣中，RNAi劑係大約每個月給藥一次至大約每季給藥一次(亦即，大約每三個月給藥一次)。
除非另做定義，否則本文中使用之所有科技術語具有與具有本發明所屬領域通常知識之人士所一般理解者相同之意。儘管在本發明提出之RNAi劑及方法之實踐或測試中可使用與本文中揭示之方法及材料類似或等效者，但適宜之方法及材料揭示於下。本文中述及之所有出版物、專利申請案及其它參考文獻藉由引用而以其整體併入本文。若有矛盾之處，則以包括定義在內之本說明書為準。此外，材料、方法及實施例僅做例示性說明之用而非意圖限制。
[實施例]
實施例1. RNAi劑涉及、合成、選擇及體外評估
本實施例揭示HTT RNAi劑之設計、合成、選擇及體外評估之方法。
試劑之來源
若本文中未具體給出試劑之來源，則測量試劑可從任何分子生物學用試劑供應商以用於分子生物學應用之品質/純度標準獲得。
生物資訊學
使用訂製之R及Python腳本設計靶向人類亨汀頓蛋白轉錄本(HTT；人NCBI refseqID NM_002111.8；NCBI GeneID：3064)或鼠HTT轉錄本(HTT；鼠NCBI refseqID NM_010414.3；NCBI GeneID：15194)之siRNA。人NM_002111 REFSEQ mRNA，版本8，長度為13,498個鹼基。鼠NM_010414 REFSEQ mRNA，版本3，長度為13,237個鹼基。
此外，使用訂製之R及Python腳本設計靶向人類亨汀頓蛋白轉錄本(HTT；人NCBI refseqID NM_002111.8；NCBI GeneID：3064)之外顯子1的siRNA。
未修飾之HTT正義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表2、5、8、11、14、18、21、25、28、30及33中。經修飾之HTT正義股及反義股核苷酸序列的詳細列述顯示於表3、6、9、12、15、17、20、24、27、29及32中。
應理解，本申請通篇中，不具小數之雙螺旋名稱等同於具有小數之雙螺旋名稱，其僅引用雙螺旋之批號。例如，AD-564727等同於AD-564727.1。
細胞培養及轉染
藉由下述者轉染細胞：於384孔板中，將4.9μl之Opti-MEM加上0.1μl之RNAiMAX每孔(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)加至5μl之siRNA雙螺旋每孔中，且各siRNA雙螺旋存在4組重複，以及在室溫溫育15分鐘。隨後，將含有~5x103個細胞之40μl的培養基加至siRNA混合物中。在RNA純化之前，將細胞溫育24小時。實驗以50nM、10nM、1nM及0.1nM執行。於人類神經母細胞瘤BE(2)C細胞(ATCC CRL-2268)中使用EMEM：F12培養基(Gibco目錄號11765054)執行轉染實驗。
細胞培養及384孔轉染
使在轉染之前短於1小時內新鮮單離之初代石蟹獼猴肝細胞(PCH)於初代肝細胞培養基中生長。使HepB細胞於適宜之培養基中生長。藉由下述者轉染細胞：於每個孔中，將每孔14.8麱1之Opti-MEM加上0.2μl至Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，Carlsbad CA目錄# 13778-150)加入5μl之各siRNA雙螺旋中。然後將混合物於室溫溫育15分鐘。隨後，將含有~2x104個細胞之80μl的無抗生素培養基加至siRNA混合物中。在RNA純化之前，將細胞溫育24小時。以50nM、10nM、1nM及0.1nM之最終雙螺旋濃度，於HepB中執行單劑量實驗。以50 nM、10nM、1nM及0.1nM之最終雙螺旋濃度，於PCH中執行單劑量實驗。
使用DYNABEADS mRNA單離套組進行之總RNA單離
使用自動方法在BioTek-EL406平台上使用DYNABEADs(Invitrogen,cat#61012)單離RNA。簡而言，將70μL之裂解液/結合緩衝液及10μL之含有3μL磁性微珠的裂解緩衝液加至具有細胞之板中。將板於電磁培養箱中於室溫溫育10分鐘，隨後捕獲磁性微珠並移除上清液。隨後，將微珠結合之RNA以150μL洗滌緩衝液A洗滌2次，以洗滌緩衝液B洗滌一次。將微珠以150μL沖提緩衝液洗滌，再次捕獲並移除上清液。
使用高效cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)之cDNA合成
將10μL之含有11 10X緩衝液、0.4μL 25X dNTPs、1μL 10x隨機引子、0.5μL逆轉錄酶、0.5μL Rnase抑制劑及6.6μL H2O每反應之預混液加至上述單離之RNA中。將板密封、混合、並在電磁培養箱中於室溫溫育10分鐘，之後於37℃溫育2小時。
實時PCR
於384孔板(Roche cat # 04887301001)之每孔中，將2μL之cDNA加至含有0.5μL之人或鼠GAPDH TaqMan探針(ThermoFisher cat 4352934E或4351309)及0.5μL之適宜HTT探針(可例如自Thermo Fisher商購)的預混液及5μL Lightcycler 480探針預混液(Roche Cat # 04887301001)中。實時PCR係於LightCycler480實時PCR系統(Roche) 中進行。每一雙螺旋係測試N=4，且將資料標準化至使用非靶向對照siRNA轉染之細胞。為了計算相對倍數改變，使用△△Ct方法分析資料並將該資料標準化至使用以非靶向對照siRNA轉染之細胞實施的檢定。
於BE(2)C細胞中進行之表2及表3所列dsRNA劑的篩查結果提供於表4中。
於BE(2)C細胞中進行之表5及表6所列dsRNA劑的篩查結果提供於表7中。
於BE(2)C細胞中進行之表8及表9所列dsRNA劑的篩查結果提供於表10中。
於BE(2)C細胞中進行之表11及表12所列dsRNA劑的篩查結果提供於表13中。
於BE(2)C細胞中進行之表14及表15所列dsRNA劑的篩查結果提供於表16中。
於BE(2)C細胞中進行之表17及表18所列dsRNA劑的篩查結果提供於表19中。
於HepB細胞中進行之表20及表21所列dsRNA劑的篩查結果提供於表22中。
於初代石蟹獼猴肝細胞(PCH)細胞中進行之表20及表21所列dsRNA劑的篩查結果提供於表23中。
於BE(2)C細胞中進行之表24及表25所列dsRNA劑的篩查結果提供於表26中。
於BE(2)C細胞中進行之表27及表28所列dsRNA劑的篩查結果提供於表34中。
於BE(2)C細胞中進行之表29及表30所列dsRNA劑的篩查結果提供於表31中。
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實施例2：使用靶向HTT外顯子1之RNAi劑之HTT體內篩查-AAV
對感興趣之靶向HTT外顯子1的從上述體外研究鑑定之雙螺旋進行體內評估。
具體而言，於投藥前之第-14天，藉由眶後給藥2x 1010編碼野生型人HTT之腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒，轉導野生型小鼠(C57BL/6)。示例性AAV載體係提供於下表中。
Figure 109137670-A0202-12-0365-313
本實驗中，係向小鼠給藥編碼野生型HTT之一部分的AAV8(AAV1)。
於第0天，對三個小鼠之群組皮下給藥3mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第14天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取組織mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。將人HTT mRNA量級與管家基因GAPDH比較。隨後將該值標準化至AAV對照群組之平均值。資料係表達為相對於基線值之百分比，並呈現為均值±標準偏差。顯示於圖1及2中之結果表明，所測試之示例性雙螺旋劑於體內有效地減低了人HTT信使RNA之量級。
實施例3：使用靶向HTT外顯子1之RNAi劑進行HTT體內篩查
於本領域認可之亨汀頓氏症(HD)小鼠模型，亦即HD之YAC128小鼠模型中，評估靶向人HTT之外顯子1的感興趣之雙螺旋。YAC128小鼠荷有含完整人HD基因之酵母人工染色體(YAC)，於其基因組中含有128個CAG重複序列。YAC128小鼠發展出運動異常及年齡依賴性腦萎縮，包括與紋狀體神經元缺失相關之皮質及紋狀體萎縮。YAC128小鼠表現出優異之初始高活動性，之後表現出運動缺陷之發作，並最終表現出運動機能減退(請參見，例如，Slow,et al.(2003)Human Molecular Genetics 12(13)：1555；Van Raamsdonk,et al.(2005),2 Human Molecular Genetics 14(24)：3823；及Carroll,et al.(2011)Neurobiology of Disease 43：257-265)。
於第0天，對YAC128小鼠(7至13週齡，27.7±3.4公克，n=36)皮下給藥10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第7天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
此等劑對於全長度野生型人HTT mRNA之效果係顯示於圖3A中。此等資料表明，所測試之示例性雙螺旋劑於體內有效地減低了人HTT信使RNA之量級。
使用西方印漬術分析來測定人突變HTT蛋白質量級。
簡而言，將肝於RIPA中與蛋白酶抑制劑一起均質化。使用Pierce BCA套組，遵循製造商之使用說明書，將總蛋白質定量。藉由在4x LDS緩衝液中煮沸將80μg之總細胞裂解液變性，令其於3-8% tris醋酸鹽梯度凝膠中進行SDS-PAGE，並轉移至PVDF膜。於室溫，以Odyssey阻斷緩衝液將印漬阻斷1小時，並與特異性抗體於4℃雜交過夜。使用下列抗體：HTT(Millipore，目錄號#MAB2166)、Calnexin(Millipore-Sigma，目錄號# C4731)、螢光接合之二級抗體(Licor，山羊抗兔，目錄號#926-32211；以及驢抗小鼠，目錄號#926-680721：5000)。使用Biorad Chemidoc MP成像系統完成對蛋白質條帶之偵檢。將每一HTT條帶之密度標準化至荷載鈣連伴護蛋白(Calnexin)之對照物，並使用經標準化之強度將經siRNA處理之樣本中的HTT減弱相對於經媒介物(1X PBS)處理之對照物定量。
此等劑對於突變人HTT蛋白質量級之效果係顯示於圖3B至3C中。此等資料表明，所測試之示例性雙螺旋劑於體內有效地減低了全長度野生型人HTT信使RNA(圖3A)以及突變人HTT蛋白質之量級。
於另一實驗設定中，於第0天，對YAC128小鼠(7至13週齡，27.7±3.4公克，n=36)皮下給藥10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第7天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速 凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。如上文所揭示，分析全長度突變HTT mRNA量級及全長度突變HTT蛋白質量級。顯示於圖4A至4B中之結果表明，所測試之示例性雙螺旋劑於體內有效地減低了突變人HTT蛋白質之量級。
亦於不同年齡及體重之小鼠體內，評估靶向人HTT之外顯子1的另外感興趣之雙螺旋的抑制人全長度野生型HTT表現之能力。詳而言，於第0天，對小鼠(10至16週齡，28.2±3.7公克，n=84)皮下給藥10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第7天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
如本文所揭示，量測全長度野生型人HTT mRNA量級，結果係顯示於圖5中並且表明，所測試之示例性雙螺旋劑於體內有效地減低了全長度野生型人HTT mRNA之量級。
實施例4：結構性活性關係分析
選擇靶向人HTT之外顯子1的感興趣之雙螺旋，進行進一步之結構性活性關係(SAR)分析並評估其在體內抑制突變HTT表現之能力。
詳而言，於第0天，對小鼠(6至16週齡，28.2±4公克，n=84)皮下給藥10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第7天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
圖6顯示此等劑對於全長度突變人HTT mRNA量級及全長度突變人蛋白質量級之效果。資料表明，該等劑於體內抑制人HTT之突變外顯子1及全長度突變人HTT mRNA及全長度人蛋白的表現。
亦於YAC128小鼠(6週齡，n=4每組)中評估其他感興趣之雙螺旋。於第0天，對小鼠皮下給藥10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第7天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
圖7顯示此等劑對於全長度突變人HTT mRNA量級之效果。
實施例5：人HD患者纖維母細胞中之體外篩查
亦於人纖維母細胞中評估感興趣之雙螺旋對於全長度野生型人HTT及全長度突變HTT之表現的效果。纖維母細胞獲自Coriell、成年健康對照患者(「對照組」，GM02153)、成年發病之HD患者(「成年組」，GM04478)及青少年發病之HD患者(「青少年組」，GM09197)。纖維母細胞係經10nM或50nM之靶向HTT基因之外顯子1或全長度HTT基因的雙螺旋轉染。
結果係顯示於圖8A至圖8B、圖9A至圖9B、圖10A至圖10D及圖11A至圖11D中並且表明，該等靶向HTT基因之外顯子1或全長度HTT基因之劑於體內患者樣本中抑制全長度突變人HTT mRNA之表現。
實施例6：使用靶向全長度人HTT之RNAi劑進行HTT體內篩查
如本文所揭示，使用YAC128小鼠模型及AAV途徑兩者，於體內評估自上述體外研究中鑑定之靶向全長度人HTT的感興趣之雙螺旋。
如上文實施例2中所揭示，於投藥前之-14天，藉由眶後給藥2 x 1010編碼人HTT之一部分的腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒(包括AAV1、AAV2、AAV3或AAV4)，將野生型小鼠(C57BL/6，7至13週齡，27.7±3.4公克，n=36)轉染。
於第0天，對經轉染之小鼠及YAC128小鼠皮下給藥3mg/kg或10mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第7天或第14天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
如圖12中所示，使用兩種實驗模型，該等劑於體內抑制全長度人HTT或全長度突變人HTT mRNA之表現。
亦評估其他靶向全長度人HTT之感興趣之雙螺旋的於體內抑制野生型人HTT之能力。
於投藥前之-14天，藉由靜脈內給藥2 x 1010病毒顆粒AAV1、AAV2、AAV3或AAV4(參見實施例2中之上表)，將野生型小鼠(C57BL/6，7至13週齡，27.7±3.4公克，n=36)轉染。
於第0天，對經轉染之小鼠皮下給藥3mg/kg之單次劑量的感興趣之劑或PBS對照物。於投藥後之第14天，犧牲動物，收集肝樣本並於液氮中速凍。提取肝mRNA並藉由RT-QPCR方法分析。
如圖13A至圖13D中所示，該等劑於體內抑制全長度野生型人HTT mRNA之表現，並且確定大量靶向全長度人HTT轉錄本之雙螺旋係具有大於90%之功效。

Claims (88)

  1. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，係用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)之表現，其中，該dsRNA劑係包含形成雙股區域之正義股及反義股，
    其中，該正義股係包含與SEQ ID NO：1之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸之至少15個接續核苷酸，且該反義股係包含與SEQ ID NO：6之核苷酸序列相異不超過3個核苷酸之至少15個接續核苷酸，以及
    其中，一個或多個親脂性部分係接合至位於該正義股或該反義股之至少一者的一個或多個內部位置。
  2. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中，該正義股之核苷酸序列係包含表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27至30、32或33之任一者中的任一正義股核苷酸序列。
  3. 如請求項1或2所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係經由鏈結子或載子接合。
  4. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)，其係用於抑制亨汀頓蛋白(HTT)在細胞內之表現，其中，該dsRNA包含形成雙股區域之正義股及反義股，其中，該反義股包含與編碼HTT之mRNA互補的區域，並且其中該互補區域包含與表2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、24、25、27-30、32或33中任一者中之任一反義核苷酸序列相異不超過3個核苷酸的至少15個接續核苷酸。
  5. 如請求項4之dsRNA劑，其中，該正義股、該反義股、或該正義股及該反義股二者接合至一個或多個親脂性部分。
  6. 如請求項5所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分接合至該dsRNA劑之該雙股區域的一個或多個內部位置。
  7. 如請求項5或6所述之dsRNA劑，其中，該一個或多個親脂性部分接合至該反義股之一個或多個內部位置。
  8. 如請求項5或6所述之dsRNA劑，其中，該一個或多個親脂性部分經由鏈結子或載子接合至至少一股之一個或多個內部位置。
  9. 如請求項1至3及5至8中任一項所述之dsRNA劑，其中，藉由logKow量測，該親脂性部分之親脂性係超過0。
  10. 如請求項1至3及5至9中任一項所述之dsRNA劑，其中，藉由該dsRNA劑之血漿蛋白結合檢定中之未結合級分量測，該dsRNA劑之疏水性係超過0.2。
  11. 如請求項10所述之dsRNA劑，其中，該血漿蛋白結合檢定係使用人血清白蛋白蛋白質之電泳遷移位移檢定。
  12. 如請求項1至3及7至11中任一項所述之dsRNA劑，其中，該內部位置包括自該正義股或該反義股之各端之末端兩個位置以外的所有位置。
  13. 如請求項12所述之dsRNA劑，其中，該內部位置包括自該正義股或該反義股之各端之末端三個位置以外的所有位置。
  14. 如請求項1至3及5至13中任一項所述之dsRNA劑，其中，該內部位置不包括該正義股之裂解位點區域。
  15. 如請求項14所述之dsRNA劑，其中，該內部位置包括自該正義股之5’-端起計數之位置9至12以外的所有位置。
  16. 如請求項14所述之dsRNA劑，其中，該內部位置包括自該正義股之3’-端起計數之位置11至13以外的所有位置。
  17. 如請求項1至3及5至13中任一項所述之dsRNA劑，其中，該內部位置不包括該反義股之裂解位點區域。
  18. 如請求項17所述之dsRNA劑，其中，該內部位置包括自該反義股之5’-端起計數之位置12至14以外的所有位置。
  19. 如請求項1至3及5至18中任一項所述之dsRNA劑，其中，該內部位置包括自該正義股從3’-端起計數之位置11至13以及該反義股從5’-端起計數之位置12至14以外的所有位置。
  20. 如請求項1至3及5至19中任一項所述之dsRNA劑，其中，該一個或多個親脂性部分接合至一個或多個選自由下列所成群組的內部位置：該正義股之位置4至8及13至18，以及該反義股之位置6至10及15至18，各股自5’-端起計數。
  21. 如請求項20所述之dsRNA劑，其中，該一個或多個親脂性部分接合至一個或多個選自由下列所成群組的內部位置：該正義股之位置5、6、7、15及17，以及該反義股之位置15及17，各股自5’-端起計數。
  22. 如請求項6所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域中之該等位置不包括該正義股之裂解位點區域。
  23. 如請求項1至3及5至22中任一項所述之dsRNA劑，其中，該正義股係21個核苷酸之長度，該反義股係23個核苷酸之長度， 以及，該親脂性部分接合至該正義股之位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或該反義股之位置16。
  24. 如請求項5至22中任一項所述之dsRNA劑，其中，該正義股係21個核苷酸之長度，該反義股係23個核苷酸之長度，以及，該親脂性部分接合至該正義股之位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或該反義股之位置16。
  25. 如請求項1至3及5至24中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係脂族、脂環族或多脂環族化合物。
  26. 如請求項25所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係選自由下列所成群組：脂質、膽固醇、視網酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基團、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡
    Figure 109137670-A0202-13-0004-346
    。
  27. 如請求項26所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分含有飽和或不飽和之C4-C30烴鏈，以及視需要之選自由羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮化物及炔所成群組的官能基。
  28. 如請求項27所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分含有飽和或不飽和之C6-C18烴鏈。
  29. 如請求項28所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分含有飽和或不飽和之C16烴鏈。
  30. 如請求項29所述之dsRNA劑，其中，該飽和或不飽和之C16烴鏈結合至自該股之5’-端起計數之位置6。
  31. 如請求項1至3及5至30中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分經由載子接合，該載子替換該內部位置或該雙股區域中之一個或多個核苷酸。
  32. 如請求項31所述之dsRNA劑，其中，該載子係選自由下列所成群組的環狀基團：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌
    Figure 109137670-A0202-13-0005-347
    基、[1,3]二氧雜環戊烷基、
    Figure 109137670-A0202-13-0005-348
    唑啶基、異
    Figure 109137670-A0202-13-0005-349
    唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
    Figure 109137670-A0202-13-0005-350
    啉基、嗒
    Figure 109137670-A0202-13-0005-351
    酮基、四氫呋喃基及十氫萘基；或係基於絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹之非環狀部分。
  33. 如請求項1至3及5至32中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分經由鏈結子接合至該dsRNA劑，該鏈結子含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鏈結、click反應之產物或胺基甲酸酯。
  34. 如請求項1至3及5至33中任一項所述之雙股iRNA劑，其中，該親脂性部分接合至核酸鹼基、糖部分或核苷間鏈結。
  35. 如請求項1至34中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
  36. 如請求項35所述之dsRNA劑，其中，不超過五個該正義股之核苷酸及不超過五個該反義股之核苷酸係未經修飾之核苷酸。
  37. 如請求項35所述之dsRNA劑，其中，該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸係經修飾之核苷酸。
  38. 如請求項35至37中任一項所述之dsRNA劑，其中，該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由下列所成群組：脫氧核苷酸、3’-端脫 氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-脫氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-羥基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己基修飾之核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、包含磷酸乙烯酯之核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)之核苷酸、包含胸苷二醇核酸(GNA)S異構物之核苷酸、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2’-脫氧胸苷-3’磷酸酯之核苷酸、鏈結至膽固醇基衍生物之末端核苷酸、十二酸雙癸基醯胺基團；胞苷-2’-磷酸酯、鳥苷-2’-磷酸酯、尿苷-2’-磷酸酯、腺苷-2’-磷酸酯、2’-O-十六烷基-腺苷-3’-磷酸酯、2’-O-十六烷基-胞苷-3’-磷酸酯、2’-O-十六烷基-鳥苷-3’-磷酸酯以及2’-O-十六烷基-尿苷-3’-磷酸酯，及其組合。
  39. 如請求項38所述之dsRNA劑，其中，該經修飾之核苷酸係選自由下列所成群組：2’-脫氧-2’-氟修飾之核苷酸、2’-脫氧修飾之核苷酸、3’-末端脫氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)、鎖定之核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、磷醯胺化物、以及包含非天然鹼基之核苷酸。
  40. 如請求項38所述之dsRNA，其中，該經修飾之核苷酸中的至少一者係選自由下列所成群組：脫氧核苷酸、2’-O-甲基修飾之核苷酸、 2’-氟修飾之核苷酸、2’-脫氧修飾之核苷酸、二醇修飾之核苷酸(GNA)以及乙烯基-膦酸酯修飾之核苷酸；及其組合。
  41. 如請求項38所述之dsRNA，其中，該等核苷酸之修飾之至少一者係熱去安定化核苷酸修飾。
  42. 如請求項41之dsRNA，其中，該熱去安定化核苷酸修飾係選自由下列所成群組：無鹼基之修飾；與雙螺旋中相反核苷酸之誤配；以及去安定化糖修飾、2’-脫氧修飾、非環狀核苷酸、未鎖定之核酸(UNA)、以及甘油核酸(GNA)。
  43. 如請求項38所述之dsRNA，其中，該經修飾之核苷酸包含3’-末端脫氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)之短序列。
  44. 如請求項38所述之dsRNA劑，其中，該核苷酸之修飾係2’-O-甲基修飾、GNA及2’-氟修飾。
  45. 如請求項1至44中任一項所述之dsRNA劑，其復包含至少一個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
  46. 如請求項45所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含6至8個硫代磷酸酯類核苷酸間鏈結。
  47. 如請求項1至45中任一項所述之dsRNA劑，其中，各股係不超過30個核苷酸之長度。
  48. 如請求項1至47中任一項所述之dsRNA劑，其中，至少一股包含至少1個核苷酸的3’突出。
  49. 如請求項1至47中任一項所述之dsRNA劑，其中，至少一股包含至少2個核苷酸的3’突出。
  50. 如請求項1至49中任一項所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係15至30個核苷酸對之長度。
  51. 如請求項50所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係17至23個核苷酸對之長度。
  52. 如請求項50所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係17至25個核苷酸對之長度。
  53. 如請求項50所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係23至27個核苷酸對之長度。
  54. 如請求項50所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係19至21個核苷酸對之長度。
  55. 如請求項50所述之dsRNA劑，其中，該雙股區域係21至23個核苷酸對之長度。
  56. 如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑，其中，每一股具有19至30個核苷酸。
  57. 如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑，其中，每一股具有19至23個核苷酸。
  58. 如請求項1至55中任一項所述之dsRNA劑，其中，每一股具有21至23個核苷酸。
  59. 如請求項1至58中任一項所述之dsRNA劑，其復包含靶向肝臟組織之靶向配位子。
  60. 如請求項59所述之dsRNA劑，其中，該靶向配位子係GalNAc接合物。
  61. 如請求項1至3及5至60所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分或靶向配位子經由生物可裂解之鏈結子接合，該鏈結子係選自由下列所成群組：DAN，RNA，二硫化物，醯胺，半乳胺糖、葡萄胺糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化之單醣或寡醣，及其組合。
  62. 如請求項1至3及5至61中任一項所述之dsRNA劑，其中，該正義股之3’端係經由端帽保護，該端帽係具有胺之環狀基團，該環狀基團係選自由下列所成群組：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌
    Figure 109137670-A0202-13-0009-352
    基、[1,3]二氧雜環戊烷基、
    Figure 109137670-A0202-13-0009-353
    唑啶基、異
    Figure 109137670-A0202-13-0009-354
    唑啶基、嗎啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
    Figure 109137670-A0202-13-0009-355
    啉基、嗒
    Figure 109137670-A0202-13-0009-356
    酮基、四氫呋喃基及十氫萘基。
  63. 如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑，其復包含
    末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子，
    末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子，以及
    末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態或Sp組態之鏈結磷原子。
  64. 如請求項1至62中任一項所述之dsRNA劑，其復包含
    末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一個及第二個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子，
    末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子，以及
    末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp或Sp組態之鏈結磷原子。
  65. 如請求項1至62項中任一項所述之dsRNA劑，其復包含
    末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一個、第二個及第三個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子，
    末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子，以及
    末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp或Sp組態之鏈結磷原子。
  66. 如請求項1至62項中任一項所述之dsRNA劑，其復包含
    末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一個及第二個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子，
    末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第三個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子，
    末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子，以及
    末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp或Sp組態之鏈結磷原子。
  67. 如請求項1至62項中任一項所述之dsRNA劑，其復包含
    末端掌性修飾，其出現於該反義股3’端之第一個及第二個核苷酸間鏈結處，具有Sp組態之鏈結磷原子，
    末端掌性修飾，其出現於該反義股5’端之第一個及第二個核苷酸間鏈結處，具有Rp組態之鏈結磷原子，以及
    末端掌性修飾，其出現於該正義股5’端之第一個核苷酸間鏈結處，具有Rp或Sp組態之鏈結磷原子。
  68. 如請求項1至67項中任一項所述之dsRNA劑，其氟包含位於該反義股5’端之磷酸酯或磷酸酯模擬物。
  69. 如請求項68項所述之dsRNA劑，其中，該磷酸酯模擬物係5’-膦酸乙烯基酯(VP)。
  70. 如請求項1至69項中任一項所述之dsRNA劑，其中，該雙鏈之反義股5'-端第1位置處的鹼基對係AU鹼基對。
  71. 如請求項1至70項中任一項所述之dsRNA劑，其中，該正義股具有總計21個核苷酸，且該反義股具有總計23個核苷酸。
  72. 一種細胞，係含有如請求項1至71項中任一項所述之dsRNA劑。
  73. 一種用於抑制編碼HTT之基因表現的醫藥組成物，係包含如請求項1至71項中任一項所述之dsRNA劑。
  74. 一種醫藥組成物，係包含如請求項1至71項中任一項所述之dsRNA劑，以及脂質製劑。
  75. 一種抑制亨汀頓蛋白(HTT)在細胞中之表現的方法，該方法包括：
    (a)令該細胞與如請求項1至71項中任一項所述之dsRNA劑或如請求項73或74項所述之醫藥組成物接觸；以及
    (b)將步驟(a)中產生之細胞維持足以獲得HTT基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而抑制該HTT基因在細胞中的表現。
  76. 如請求項75項所述之方法，其中，該細胞係位於受試者體內。
  77. 如請求項76項所述之方法，其中，該受試者係人。
  78. 如請求項75至77項中任一項所述之方法，其中，HTT之表現被抑制至少50%。
  79. 如請求項77項所述之方法，其中該受試者業經被診斷為患有HTT相關疾病。
  80. 如請求項79項所述之方法，其中該核苷酸重複序列擴張疾病係亨汀頓氏病。
  81. 一種治療被診斷為患有HTT相關疾病之受試者的方法，該方法包括對該受試者給藥治療有效量之如請求項1至71項中任一項所述之dsRNA劑或如請求項73或74項所述之醫藥組成物，從而治療該受試者。
  82. 如請求項81項所述之方法，其中，治療包括減輕該疾病之至少一種症狀或症候。
  83. 如請求項81項所述之方法，其中，治療包括阻止該疾病之進展。
  84. 如請求項81項所述之方法，其中該HTT相關疾病係亨汀頓氏病。
  85. 如請求項81至84項中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量給藥至該受試者。
  86. 如請求項81至85項中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係經鞘內給藥至該受試者。
  87. 如請求項81至86項中任一項所述之方法，復包括量測從該受試者獲得之樣本中HTT的量級。
  88. 如請求項81至87項中任一項所述之方法，復包括將適用於治療或預防HTT相關疾患的另外之劑給藥至該受試者。
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