TW202237150A - 用於抑制ｈａｏ１（羥基酸氧化酶１（乙醇酸氧化酶））基因表現的方法及組成物 - Google Patents

用於抑制ｈａｏ１（羥基酸氧化酶１（乙醇酸氧化酶））基因表現的方法及組成物 Download PDF

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Abstract

本發明係關於使用RNAi劑抑制HAO1之表現的方法，以及治療患有原發性高草酸鹽尿症例如PH1之受試者的方法。

Description

用於抑制HAO1(羥基酸氧化酶1(乙醇酸氧化酶))基因表現的方法及組成物
相關申請
本案主張2020年12月1日遞交之美國臨時申請第63/120,150號及2021年4月30日遞交之美國臨時申請第63/182,608號之優先權權益。前述申請之整體內容藉由引用併入本文。
序列表
本案含有序列表，其業經以ASCII格式與本案一起提交電子版，且藉由引用以其整體併入本文。所述ASCII拷貝於2021年11月11日創建，名為121301_19920_SL.txt，大小為8,128位元組。
草酸根(C2O42-)係草酸(C2H2O4)之成鹽離子，其廣泛分佈在植物及動物兩者中。它是人類飲食的組成部分，並且廣泛存在於植物及植物源性食物中。草酸根亦可經由主要在肝臟中發生的代謝途徑內源性地合成。乙醛酸鹽係草酸鹽之中間前驅物，且藉由乙醇酸氧化酶(GO)(亦稱 並且在本文中指代為羥基酸氧化酶(HAO1))進行之乙醇酸鹽之氧化反應或藉由羥基脯胺酸(膠原之一種組分)之分解代謝產生。藉由酶丙胺酸/乙醛酸胺基轉移酶(AGT)進行的乙醛酸鹽與丙胺酸之胺基轉移作用導致丙酮酸鹽及甘胺酸之形成。過量乙醛酸鹽將藉由乙醇酸氧化酶或乳酸脫氫酶轉化為草酸鹽。
原發性高草酸鹽尿症(PH)係一組遺傳性肝臟疾患，以草酸鹽(代謝之一種最終產物)之尿排泄增加為特徵。存在3個類型之PH：第1型(PH1)、第2型(PH2)及第3型(PH3)。PH1係最常見及最嚴重之類型，佔全部病例之70%至80%。PH1係極罕見的遺傳性疾病，在該疾病中，由肝臟產生過量之草酸鹽。在美國及歐洲，每百萬人中大約4個人患有PH1，估計有1,300至2,100例確診病例。在一些地區，諸如中東及北美，PH1之遺傳流行性更高。
第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)係體染色體隱性之乙醇酸代謝疾患，以肝臟產生過量草酸鹽及後繼之高草酸鹽尿症為特徵。肝乙醇酸鹽解毒作用由於丙胺酸-乙醛酸胺基轉移酶(AGXT)基因中之突變而受損。AGT將中間代謝物乙醛酸鹽轉化為甘胺酸之功能的喪失造成乙醛酸鹽之蓄積及乙醛酸鹽還原為乙醇酸鹽，乙醇酸鹽藉由酶乙醇酸氧化酶(GO)(亦稱羥基酸氧化酶(HAO1))氧化為草酸鹽並最終被運輸至腎臟進行排泄。其鈣鹽形式之草酸鹽幾乎完全由腎臟排泄。由於其不溶性，草酸鈣可以輕易地在尿路中結晶。在PH1中，過量之尿草酸鹽使得草酸鈣晶體在腎臟及尿路中形成並沉積，導致復發性腎結石及腎鈣沉積症，可導致疼痛、感染、進行性腎病及腎衰竭，伴有生活品質之下降(Cochat(2013)N Engl J Med. 369(7)：649-58)。腎損傷由來自草酸鹽之腎小管毒性、腎鈣沉積及結石所致之腎梗阻的組合造成。
隨著腎功能下降，草酸鹽之消除進一步減少，使得草酸鈣蓄積在骨骼、血管、皮膚、視網膜、心臟及神經系統中，導致嚴重的終末器官損傷(Cochat，同上)。當所評估之腎小球濾過率(eGFR)業經下降至低於30至45mL/min/1.73m2時，出現該毀滅性之狀況，亦即全身性草酸鹽沉積症。若不予治療，則疾病不可阻擋地惡化，並且不可避免地死於終末期腎病(ESRD)及/或草酸鹽沉積之併發症(Cochat supra；Harambat(2010)Kidney Int.77(5)：443-9；van der Hoeven(2012)Nephrol Dial Transplant.18(2)：273-9)。
直到最近魯馬斯蘭(lumasiran)獲批之前，尚無獲批用於治療PH之療法，且照護標準對於患者及其家庭而言負擔沉重。疾病管理係基於支持性措施，包括攝入大量液體及結晶抑制劑以增加尿草酸鹽溶解度，以及彼等尚未患有ESRD者之疾病併發症諸如尿路結石及感染的治療。吡哆醇可在少數(~5%)患者中正常化肝草酸鹽(及後繼之尿草酸鹽)的產生。由於患有PH之患者的內源性草酸鹽產生遠遠超出飲食攝入，飲食調理在治療中起的作用極小。惡化至或表現為患有ESRD之患者需要強化透析替代療法。透析不視為針對PH1之有效療法，而是充當趨向於肝-腎移植之臨床過程中的一個步驟或充當根本不治療之替代措施。透析通常不足以有效地解除蓄積之草酸鹽，且儘管進行此負擔沉重之治療，伴有終末器官損傷之全身性草酸鹽沉積症仍可能發展。針對PH1之透析方案典型比常規透析更為頻繁，容易增加併發症之風險。組合肝-腎移植提供潛在之治愈性療法，但 受限於有限之可用性、過程中相關之併發症、資源匱乏背景下之倫理考量及健康照護資源之頻繁使用。
據此，該領域中存在對於治療原發性高草酸鹽尿症之有效方法的需求。
本發明提供抑制HAO1表現之方法。本發明亦提供治療患有HAO1相關疾患如原發性高草酸鹽尿症(PH)(例如PH1)之受試者的方法，以及減少患有HAO1相關疾患如原發性高草酸鹽尿症(PH)(例如PH1)之受試者的血漿草酸鹽、減少髓性腎鈣沉積、及減少全身性草酸鹽沉積。該等方法包括以包括負載期及維持期之給藥方案投予雙股RNAi劑，例如靶向HAO1之雙股iRNA劑，以及包含此類雙股RNAi劑之組成物。
據此，於一個態樣中，本發明提供一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續 核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而抑制患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該方法包括
向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20kg之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義 股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，從而抑制患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約6mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該方法包括
向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’- UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，從而抑制患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
在抑制受試者之HAO1表現可以減少該受試者之血漿草酸鹽水平；減少該受試者之髓性腎鈣沉積；減少該受試者之全身性草酸鹽沉積，例如腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及/或眼草酸鹽沉積，例如，心草酸鹽沉積；及/或減輕該受試者之血液疾患，例如，貧血。
於一個態樣中，本發明提供一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或 其鹽，約每個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20kg之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’- GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而治療患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約6mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義 股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而治療患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
治療受試者可以減少該受試者之血漿草酸鹽水平；減少該受試者之髓性腎鈣沉積；減少該受試者之全身性草酸鹽沉積，例如腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及/或眼草酸鹽沉積，例如，心草酸鹽沉積；及/或減輕該受試者之血液疾患，例如，貧血。
於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者中血漿草酸鹽之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量 的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20kg之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形 成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約6mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列 5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
在投予該雙股RNAi劑之後，血漿草酸鹽水平可減少約35%或更多；及/或在投予該雙股RNAi劑之後，血漿草酸鹽水平減少至正常範圍內。
於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量 的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20kg之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股 RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約6mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列 5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
髓性腎鈣沉積之減少可發生於一個腎或兩個腎中。
於一個具體實施例中，髓性腎鈣沉積之減少係藉由腎臟超音波測定。
於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg 之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20kg之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙 股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始維持期，且該維持期包含每三個月向受試者投予約6mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含來 自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
該全身性草酸鹽沉積為腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及/或眼草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，在投予該雙股RNAi之後，左心室射出分率(LVEF)增加至少約5%。
於一個具體實施例中，在投予該雙股RNAi之後，全心室縱向應變(GLS)下降至少約2%。
於一個具體實施例中，在投予該雙股RNAi之後，早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)增加至少約2%。
於一個具體實施例中，全身性草酸鹽沉積之減少係藉由心臟超音波檢查測定。
於一個具體實施例中，該RNAi劑或其鹽係於藥物組成物中投予。
於一個具體實施例中，該雙股RNAi劑係鹽形式。
本發明之方法可復包括向受試者投予額外治療劑。
於一個具體實施例中，該原發性高草酸鹽尿症係第I型原發性高草酸鹽尿症(PH1)。
於一個具體實施例中，在投予該雙股RNAi之前，該受試者患有終末期腎病(ESRD)。
於另一具體實施例中，在投予該雙股RNAi之前，該受試者不患有終末期腎病(ESRD)。
於一個具體實施例中，該受試者正在進行透析，例如，血液透析。
於另一具體實施例中，該受試者未進行透析，例如，血液透析。
於一個具體實施例中，該雙股RNAi劑係經皮下投予至受試者。
於一個具體實施例中，該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少17個接續核苷酸。
於另一具體實施例中中，該反義股包含5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之核苷酸序列。
於一個具體實施例中，該正義股包含核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’，且該反義股包含核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’。
於一個具體實施例中，該雙股RNAi劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
於一個具體實施例中，該正義股之核苷酸中之不超過五個及該反義股之核苷酸中之不超過五個係未經修飾之核苷酸。
於另一具體實施例中，該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸皆包含修飾。
於一個具體實施例中，該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由下列所組成之群組：去氧核苷酸、3’端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、鎖核苷酸、解鎖核苷酸(unlocked nucleic acid)、構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide)、拘束之乙基核苷酸(constrained ethyl nucleotide)、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、包含磷酸乙烯酯之核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)之核苷酸、包含胸苷二醇核酸(GNA)S異構物之核苷酸、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2’-去氧胸苷-3’磷酸酯之核苷酸、包含2’-去氧鳥苷-3’磷酸酯之核苷酸、2’-O-十六烷基核苷酸、包含2’-磷酸酯之核苷酸、胞苷-2'-磷酸酯核苷酸、鳥苷-2'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-胞苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-腺苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-鳥苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-尿苷-3'-磷酸酯核苷酸、5’-乙烯基磷酸酯(VP)、2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧胞 苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧尿苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧尿苷核苷酸、以及鏈接至膽固醇基衍生物及十二烷酸雙癸基醯胺基團之末端核苷酸；及其組合。
於一個具體實施例中，至少一股包含具有至少1個核苷酸之3’懸垂，或至少一股包含具有至少2個核苷酸之3’懸垂。
該正義股及該反義股可各自獨立地為15至30個核苷酸之長度；各自獨立地為19至30個核苷酸之長度；各自獨立地為19至25個核苷酸之長度；各自獨立地為19至23個核苷酸之長度；或各自獨立地為21至23個核苷酸之長度。
該雙股區域能係17至23個核苷酸對之長度；17至25個核苷酸對之長度；23至27個核苷酸對之長度；19至21個核苷酸對之長度；或21至23個核苷酸對之長度。
於一個具體實施例中，該雙股RNAi劑復包含至少一個硫代磷酸酯或甲基硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一個具體實施例中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之3’端。
於另一具體實施例中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之5’端。
於一個具體實施例中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之5’端及3’端兩處。
於一個具體實施例中，該雙股RNAi劑包含6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一個具體實施例中，該雙股RNAi劑復包含附接於該正義股之3’端的配體。
於一個具體實施例中，該配體為透過二價或三價分支鏈之鏈結子附接的一個或多個GalNAc衍生物。
於一個具體實施例中，該配體為
Figure 110144852-A0202-12-0023-147
於一個具體實施例中，該dsRNA劑結合至如下述式中所示之配體
Figure 110144852-A0202-12-0023-148
，其中X為O或S。
於一個具體實施例中，該正義股之基本上全部核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成之群組的修飾，其中該正義股包含兩個位於5'端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中該反義股之基本上全部核苷酸包含選自由2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾所組成之群組的修飾，其中該 反義股包含兩個位於5'端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結及兩個位於3'端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，並且其中該正義股在3'端結合至透過二價或三價分支鏈之連接子附接至一個或多個GalNAc衍生物。
於一個具體實施例中，該正義股與核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’相異不超過3個鹼基，且該反義股與核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’相異不超過3個鹼基，其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個具體實施例中，該正義股與核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’相異不超過2個鹼基，且該反義股與核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’相異不超過2個鹼基，其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個具體實施例中，該正義股與核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’相異不超過1個鹼基，且該反義股與核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’相異不超過1個鹼基，其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個具體實施例中，正義股包含核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’，並且反義股包含核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’，其中，a、g、c及u分別為2'- O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別係2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個具體實施例中，正義股由核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’組成，並且反義股由核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’組成，其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別係2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
於一個具體實施例中，正義股包含核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’，並且反義股包含核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’，其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別係2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結，並且其中GalNAc配體結合至如下圖所述之正義股之3’末端：
Figure 110144852-A0202-12-0025-149
，其中X為O。
於一個具體實施例中，正義股由核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’組成，並且反義股由核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’組成，其中，a、g、c及u分別 為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別係2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結，並且其中GalNAc配體結合至如下圖所述之正義股之3’末端：
Figure 110144852-A0202-12-0026-150
，其中X為O。
第1圖顯示智人HAO1 mRNA(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列。
第2圖顯示智人HAO1 mRNA(SEQ ID NO：2)之核苷酸序列的反向補體。
第3圖係圖表，其顯示在原代食蟹獼猴肝細胞中，ALN-65585對HAO1 mRNA的劑量依賴性抑制。
第4圖係兩張圖表，其顯示在使用ALN-GO1進行單劑治療後，小鼠中之HAO1 mRNA及血清乙醇酸鹽水平。
第5圖係圖表，其顯示在使用ALN-GO1進行單劑治療後，小鼠中之HAO1 mRNA緘默化的持續時間。
第6圖係圖表，其顯示在使用ALN-GO1進行單劑治療後，大鼠中之HAO1 mRNA及血清乙醇酸鹽水平。
第7圖係兩張圖表，其顯示在單劑之ALN-GO1後，第I型原發性高草酸鹽尿症之小鼠模型中的尿草酸鹽及乙醇酸鹽水平。
第8A圖係圖表，其顯示在單劑之ALN-GO1後，第I型原發性高草酸鹽尿症之大鼠模型中的HAO1 mRNA水平。
第8B圖係圖表，其顯示在單劑之ALN-GO1後，第I型原發性高草酸鹽尿症之大鼠模型中的尿草酸鹽水平。
第9圖係兩張圖表，其顯示在重複給藥ALN-GO1後，第I型原發性高草酸鹽尿症之大鼠模型中的HAO1 mRNA及尿草酸鹽水平。
第10圖係兩張圖表，其顯示在重複給藥後，非人類靈長動物中的HAO1 mRNA及血清乙醇酸鹽水平。
第11圖係圖表，其顯示使用HAO1 siRNA ALN-GO1治療之健康人類受試者的血漿乙醇酸鹽水平。
第12圖係圖表，其顯示使用HAO1 siRNA ALN-GO1治療之健康人類受試者的到血漿乙醇酸鹽恢復之時間。
第13圖係圖表，其顯示在投予ALN-GO1後，隊列1中之24小時尿草酸鹽水平。
第14圖係圖表，其顯示在投予ALN-GO1後29天，隊列2中之24小時尿草酸鹽水平。
第15圖係圖表，其顯示在投予ALN-GO1後，患者之尿草酸鹽水平的減少。
第16圖係圖表，其顯示診斷後之存活年數與ESRD之對比。
第17圖係圖表，其使用PK-PD模型且顯示血漿乙醇酸鹽水平之劑量依賴性增加。
第18圖係圖表，其使用PK-PD模型且揭示PH1患者中之草酸鹽應答。實線=中位數；陰影區域=第5至第95百分位；箭頭=劑量投予；符號=觀察結果。負時間值代表主動ALN-GO1劑量方案啟動之前的時間。假設基線尿草酸鹽中位數為1.7(mmol/24h/1.73m2)，執行模擬。
第19圖係圖表，其使用PK-PD模型且預測在PH1患者中劑量與穩定狀態GO酶抑制之間的關係。實線=中位數；陰影區域=第5至第95百分位。模型評估之乙醇酸鹽氧化率及草酸鹽降解率的抑制係假設與GO酶抑制相同。
第20圖係圖表，其使用PK-PD模型且預測在PH1患者中劑量與穩定狀態尿草酸鹽減少之間的關係。淺虛線=1.5x草酸鹽ULN：0.7mmol/24h/1.73m2；深虛線=尿草酸鹽之ULN：0.46mmol/24h/1.73m2；實線=中位數；陰影區域=第5至第95百分位。
第21A圖係圖表，其顯示在隨機、雙盲、安慰劑對照研究之魯馬斯蘭(lumasirin)及安慰劑組中，i)在徵得同意之前12個月、ii)在6個月雙盲期之後、及iii)在6個月延伸期之後，年齡
Figure 110144852-A0202-12-0028-6
6歲之PH1患者中的腎結石事件發生率。誤差槓代表95%信賴區間。
第21B圖係圖表，其顯示在隨機、雙盲、安慰劑對照研究之魯馬斯蘭組中，i)在徵得同意之前12個月、ii)在6個月雙盲期(第1天至第6個月)之後、iii)在6個月延伸期(第6個月至第12個月)之後、iv)在 延伸期中第12個月至第18個月、及v)在延伸期中第18個月至第24個月，年齡
Figure 110144852-A0202-12-0029-7
6歲之PH1患者中的腎結石事件發生率。誤差槓代表95%信賴區間。
第22圖係圖表，其顯示在隨機、雙盲、安慰劑對照研究之魯馬斯蘭(lumasirin)及安慰劑組中，i)安慰劑組中在6個月之安慰劑治療之後、ii)魯馬斯蘭組中在6個月之魯馬斯蘭治療之後、及iii)魯馬斯蘭組中在12個月之魯馬斯蘭治療之後，年齡
Figure 110144852-A0202-12-0029-8
6歲之PH1患者中的腎鈣沉積相對於基線的變化。
第23A圖係圖表，其顯示i)在徵得同意之前12個月、及ii)在用魯馬斯蘭治療6個月之後，年齡<6歲之PH1患者中的腎結石事件發生率。誤差槓代表95%信賴區間。對於年齡<6個月之患者，未計算在徵得同意之前的腎結石事件年發生率。
第23B圖係圖表，其顯示i)在徵得同意之前12個月、及ii)在用魯馬斯蘭治療6個月之後以及在用魯馬斯蘭治療6個月至12個月之間，年齡<6歲之PH1患者中的腎結石事件發生率。誤差槓代表95%信賴區間。對於年齡<6個月之患者，未計算在徵得同意之前的腎結石事件年發生率。
第24圖係圖表，其顯示在用魯馬斯蘭治療6個月之後，年齡<6歲之PH1患者中的腎鈣沉積相對於基線的變化。
本發明提供抑制HAO1表現之方法。本發明亦提供治療患有HAO1相關疾患如原發性高草酸鹽尿症(PH)(例如PH1)之受試者的方法，以及減少患有HAO1相關疾患如原發性高草酸鹽尿症(PH)(例如PH1)之受試者的血漿草酸鹽、減少髓性腎鈣沉積、及減少全身性草酸鹽沉積。該等方法包括以包括負載期及維持期之給藥方案投予雙股RNAi劑，例如靶向HAO1之雙股iRNA劑，以及包含此類雙股RNAi劑之組成物。
本發明人令人驚奇地發現以基於重量的給藥方案來治療患有原發性高草酸鹽尿症例如PH1之受試者，該方案強烈地、持續性地且有效地抑制HAO1表現，減少血漿草酸鹽，減少髓性腎鈣沉積，減少全身性草酸鹽沉積，並且達成足夠之RISC裝載。本發明人亦令人驚奇地發現，無論受試者之腎功能完整或受損與否，本發明的基於重量之給藥方案皆有效。
I.定義
為了更容易地理解本發明，首先定義某些術語。此外，應注意，每當述及參數之數值或數值範圍時，皆意欲包含所述數值間之數值及範圍作為本發明內的一部份。
本文中使用之冠詞「一」指代文中語法之賓語的一或多於一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一元件」意指一個元件或多於一個元件(如複數個元件)。
本文中使用之術語「包括」意指「包括但不限於」，且與後者可互換地使用。
除非上下文另明確指示，否則本文中使用之術語「或」意指「及/或」，且與後者可互換地使用。
本文中使用之術語「約」意指處於該技藝中之公差範圍內。例如，「約」可理解為與均值偏離2個標準差。於某些具體實施例中，「約」意指+10%。於某些具體實施例中，「約」意指+5%。當「約」存在於一系列數字或範圍之前時，應理解為「約」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
處於數字或一系列數字之前的術語「至少」、「不低於」或「或更多」係理解為包括該術語「至少」旁之數字，以及自上下文明確表示之後續的全部數字或邏輯上可包括之整數。例如，核酸分子中之核苷酸的數目必須為整數。例如，「21個核苷酸之核酸分子的至少19個核苷酸」意指19、20或21個核苷酸具有所指示之特性。當「至少」存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「至少」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
如本文所用，短語「不多於」或「或更低」係理解為與短語旁之數值以及符合上下文邏輯之邏輯上更低之數值或整數到零為止。例如，具有「不多於2個核苷酸」之懸垂的雙螺旋具有2、1或0個核苷酸之懸垂。當「不多於」存在於一系列數字或範圍之前時，應理解為「不多於」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。如本文中所用，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，偵檢方法可包括分析物呈現之量低於該方法之偵檢水平的測定。
在所指示之標靶位點與正義或反義股之核苷酸序列之間存在矛盾的情況下，以所指示之序列為準。
在序列與其在轉錄本或其他序列所指示之位點之間存在矛盾的情況下，以本說明書中敘述之核苷酸序列為準。
如本文所用，術語「原發性高草酸鹽尿症」指代一組相對罕見的乙醇酸鹽代謝之體染色體隱性遺傳疾患，其特徵為內源性草酸鹽水平之顯著增加。原發性高草酸鹽尿症存在三個類型，其可以為第1型(PH1)、第2型(PH2)及第3型。全部三種類型之特徵皆為失去了去除乙醛酸鹽之能力。
PH1佔病例之大多數(70-80%)，源自過氧化物酶體肝臟酶AGT之不存在或缺乏，該酶之活性取決於磷酸吡哆醛。由於AGT催化乙醛酸鹽至甘胺酸之胺基轉移作用，其在PH1中之缺乏使得乙醛酸鹽被還原為乙醇酸鹽或被乙醇酸氧化酶(GO，亦稱為羥基酸氧化酶(HAO1))氧化為草酸鹽。
PH2源自細胞質肝臟酶乙醛酸還原酶/羥基丙酮酸還原酶(GRHPR)之缺乏。嚴重之高草酸鹽尿症為PH1及PH2之臨床特點，所報告之尿草酸鹽水平為，PH1在每24小時88至352mg(每24小時1至4mmol)範圍內，而PH2在每24小時88至176mg(每24小時1至2mmol)範圍內。
在第三種形式之高草酸鹽尿症PH3中，患者呈現正常之AGT及GRJPR酶活性。不欲受縛於具體理論，咸信，PH3係歸咎於DHDPSL中之突變。假設DHDPSL編碼4-羥基-2-側氧基戊二酸醛醇酶，該酶催化羥基脯胺酸之代謝中的最後一步。
如本文所用，「HAO1」指代編碼酶羥基酸氧化酶1之基因。其他基因名稱包括GO、GOX、GOX1及HAOX1。該蛋白質亦稱為乙醇酸氧化酶及(S)-2-羥基-酸氧化酶。人類HAO1 mRNA至之GenBank登錄號為NM_017545.2；食蟹獼猴(Macaca fascicularis)HAO1 mRNA為XM_005568381.1；小鼠(Mus musculus)HAO1 mRNA為NM_010403.2；大鼠(Rattus norvegicus)HAO1 mRNA為XM_006235096.1。
關於HAO1之進一步資訊提供於例如https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54363之NCBI基因資料庫中。
自遞交本案之日起，前述GenBank登錄號及Gene資料庫號之各者的整體內容藉由引用併入本文。
如本文中所用，術語「HAO1」亦指代HAO1基因的天然出現之DNA序列變異，諸如HAO1基因中之單核苷酸多型性(SNP)。示例性SNP可見於可於www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP獲得之NCBI dbSNP短基因變異資料庫。
如本文中所用，「標靶序列」指代於HAO1基因之轉錄過程中形成之mRNA分子之核苷酸序列的接續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指代包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸藉由使用標準核苷酸命名法指代之序列而揭示。
「G」、「C」、「A」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。「T」及「dT」在本文中可互 換使用且指代其中核鹼基為胸腺嘧啶的去氧核糖核苷酸，例如，去氧核糖胸腺嘧啶、2’-去氧胸苷或胸苷。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」或「去氧核糖核苷酸」亦可指代經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代物替換部分。熟練之人士熟知，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可經由其他部分替換而基本上不改變包含承載此替換部分之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對特性。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本發明之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可替換為含有例如肌苷之核苷酸。包含此類替換部分之序列適係本發明之具體實施例。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」及「RNA干擾劑」指代含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導型緘默化複合體物(RISC)途徑而媒介RNA轉錄本的靶向裂解。iRNA透過作為RNA干擾(RNAi)之進程而引導mRNA之序列特異性降解。iRNA調整例如抑制細胞如受試者如哺乳動物受試者體內之細胞中HAO1的表現。
於一個具體實施例中，本發明之RNAi劑包括單股RNA，其與標靶RNA序列例如如HAO1標靶mRNA交互作用，以引導該標靶RNA之裂解。不欲受縛於理論，咸信被引入細胞內之長雙股RNA藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶之作用破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將daRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3’懸垂(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，該siRNA 被併入RNA誘導型緘默化複合體(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙螺旋解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，於一方面，本發明係關於單股RNA(siRNA)，其於細胞內生成且促進RISC複合體之形成，以有效緘默化標靶基因亦即HAO1基因。據此，本文中，術語「siRNA」亦用以指代上揭之RNAi。
於另一具體實施例中，該RNAi劑可係單股siRNA，其係引入細胞或生物體內以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常係15-30個核苷酸且經化學修飾。單股siRNA之設計及測試揭示於美國專利第8,101,348號及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各自之整體內容藉由引用併入本文。本文中揭示之任意反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150；：883-894中揭示之方法化學修飾者。
於又一具體實施例中，本發明提供靶向HAO1之單股反義寡核苷酸分子。「單股反義寡核苷酸分子」與標靶mRNA(亦即，HAO1)內之序列互補。單股反義寡核苷酸分子可藉由與mRNA進行鹼基配對並物理性地阻礙轉譯機制以抑制轉譯(以化學計量測定)，參見，Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。或者，單股反義寡核苷酸分子藉由雜交至標靶並透過RNaseH裂解該標靶而抑制該標靶mRNA。單股反義寡核苷酸分子可係約10至約30個核苷酸之長度，並且具有與標靶序列互補 之序列。舉例而言，單股反義寡核苷酸分子可包含本文所述之任一具有至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸之反義核苷酸序列，或結合本文所述之標靶位點中任一者。單股反義寡核苷酸分子可包括經修飾之RNA、DNA或其組合。
於另一具體實施例中，用於本發明之組成物、用途及方法中之「iRNA」為雙股RNA，且在本文中指代為「雙股RNAi劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA分子」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指代核糖核酸分子之複合體，其具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙螺旋結構，該兩個核酸股指代為具有相對於靶標RNA(即HAO1基因)之「正義」取向及「反義」取向。於本發明之一些具體實施例中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因緘默化機制而觸發標靶RNA如mRNA之降解，本文中，該機制指代為RNA干擾或RNAi。
通常，dsRNA分子之每一股之主要部分之核苷酸係核糖核苷酸，但如本文中所詳述，一股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，如去氧核糖核苷酸及/或經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「RNAi劑」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；RNAi劑可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。此類修飾可包括本文中揭露或本領域中已知之全部類型之修飾。用於siRNA類型分子中的任何此類修飾皆借本說明書及專利申請範圍之「RNAi劑」以涵蓋。
形成該雙螺旋結構之兩股可係一個較大RNA分子之不同部分，或它們可係單獨之RNA分子。當該兩股係一個較大分子之部分，且因此藉由界於一股之3’末端與形成該雙螺旋結構之相對另一股之5’末端之間 的未中斷核苷酸鏈而連結，則該連結RNA鏈指代為「髮夾環圈」。當兩股藉由除界於一股之3’末端與形成雙螺旋結構之相對另一股之5’末端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指代為「鏈結子」。RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目係dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去雙螺旋中存在之任意懸垂。RNAi劑除包含雙螺旋結構外，亦可包含一個或多個核苷酸懸垂。
於一個具體實施例中，本發明之RNAi劑為24至30個核苷酸之dsRNA，其與標靶RNA序列(例如HAO1標靶mRNA序列)相互作用以引導標靶RNA之裂解。不欲受縛於理論，被引入細胞內之長雙股RNA藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶之作用破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將daRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3’懸垂(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，該siRNA被併人RNA誘導型緘默化複合體(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙螺旋解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。
如本文所用，「核苷酸懸垂」指代或當RNAi劑之一股的3’端延伸超過另一股之5’端時，自該RNAi劑之雙螺旋結構突出的一股或多個未配對之核苷酸，反之亦然。「鈍」或「鈍端」意指於雙股RNAi劑之末端沒有未配對之核苷酸，亦即，沒有核苷酸懸垂。「鈍端之」RNAi劑為 dsRNA於其整個長度上為雙股，亦即，於分子之每一端皆沒有核苷酸突出端。本發明之RNAi劑包括於一端具有核苷酸懸垂的RNAi劑(即，具有一個懸垂及一個鈍端之劑)或於兩端皆具有核苷酸懸垂的RNAi劑。
術語「反義股」指代雙股RNAi劑之股，其包括與標靶序列(例如，人類HAO1 mRNA)實質上互補之區域。如本文所用，術語「與編碼HAO1之mRNA之一部分互補之區域」指代反義股上之區域，該區域與HAO1 mRNA序列之一部分實質上互補。當互補區域並非與標靶序列完全互補，則最能接受錯配出現在末端區域，且若存在錯配時，係通常位於一或多個末端區域內錯配，例如，在5’及/或3’端之6、5、4、3或2個核苷酸內。
如本文中所用，術語「正義股」指代dsRNA之股，其包括與反義股之區域實質上互補之區域。
如本文中所用，術語「裂解區域」指代位於緊鄰裂解位點處之區域。裂解位點係標靶上之裂解出現處之位點。於一些具體實施例中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。於一些具體實施例中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。於一些具體實施例中，裂解位點特異性地出現於反義股之藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文中所用且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指代包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙螺旋結構的能力，如具熟練技術之人士所理解者。 舉例而言，此等條件可係嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌。可施加其他條件，諸如生理學相關條件如可在生物體內部遭遇者。例如，互補序列足以使得核酸之相關功能基序進行，例如，RNAi。具熟練技術之人士將能夠根據所雜交之核苷酸的最終應用而確定最適用於兩個序列之互補性測試的條件集。
當第一核苷酸序列之核苷酸與第二核苷酸序列之核苷酸在該第一及第二核苷酸序列之全長上的鹼基皆配對時，該等序列可以相對於彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列指代為與第二序列「實質上互補」，則當雜交時，兩個序列可完全互補，或它們可形成一個或多個但通常不超過4、3或2個錯配鹼基對，同時保留在最適於其最終應用之條件下雜交的能力。惟，當兩個寡核苷酸設計為雜交時形成一個或多個單股懸垂，則此類懸垂不應被視為互補上的錯配。舉例而言，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之核苷酸包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指代為「完全互補」。
如本文中所用，「互補」序列亦可包括非Watson-Crick鹼基對及/或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於，G：U Wobble鹼基配對或Hoogstein鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「基本互補」可用於dsRNA之正義股與反義股之間或dsRNA之反義股與標靶序列之間的鹼基配對，其將從所用之處的上下文理解。
如本文中所用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」之多核苷酸指代與感興趣之mRNA(例如，編碼HAO1之mRNA)之接續部分實質上互補之多核苷酸，該接續部分包括5’UTR、開讀框(ORF)或3’UTR。舉例而言，如果該序列與編碼HAO1之mRNA之非中斷部分實質上互補，則該多核苷酸與HAO1 mRNA之至少一部分互補。
如本文中所用，短語「令細胞與雙股RNAi劑接觸」包括藉由任意可能之手段接觸細胞。令細胞與雙股RNAi劑接觸包括在活體外令細胞與RNAi劑接觸或在活體內令細胞與RNAi劑接觸。接觸可直接或間接進行。因此，舉例而言，RNAi劑可藉由單獨施行該方法而令其與細胞物理接觸，或者，可將RNAi劑置於將允許或造成其後續與該細胞接觸之境地。
舉例而言，可藉由將細胞與RNAi劑一同培養而令該細胞在活體外接觸該RNAi劑。舉例而言，可藉由將RNAi劑注射至細胞所處之組織內或鄰近該組織處，或藉由將RNAi劑注射至另一區域(血流或皮下空間)內而使得該劑將後續到達待接觸之細胞所處之組織，從而令該細胞在活體內與該RNAi劑接觸。舉例而言，該RNAi劑可含有配體(例如GalNAc3配體)及/或與配體偶聯，該配體引導該RNAi劑至感興趣之部位(例如肝臟)。活體外接觸方法與活體內接觸方法之組合亦可行。關於本發明之方法，細胞可在活體外與RNAi劑接觸，并隨後移植入受試者體內。
如本文所用，「受試者」包括人類及非人動物，較佳為脊椎動物，且更佳為哺乳動物。受試者可以包括基因轉殖生物體。最佳地，受試者為人類，諸如罹患或易發展出HAO1相關疾患之人類。
如本文所用，「患者」或「受試者」旨在包括人類或非人動物，較佳為哺乳動物，例如，人類或猴。最佳地，受試者或患者為人類。於一個具體實施例中，「患者」或「受試者」為人類兒童受試者或人類兒童患者。於另一具體實施例中，「患者」或「受試者」為人類成年受試者或人類成年患者。
如本文所用，「兒童受試者」或「兒童患者」為介於約0歲年齡至約6歲年齡之間的受試者及/或具有約20kg或更低之體重的受試者。例如，此類受試者可以為0至1、0至2、0至3、0至4、0至5、1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6或5至6歲並且可以具有約20kg或更低、10kg或更低、5kg或更低、10至20kg、15至20kg或5至15kg之體重。
如本文所用，「HAO1相關疾患」旨在包括藉由抑制HAO1之表現可得以治療或預防或其症狀可得以減少的任何疾患。實例包括但不限於原發性高草酸鹽尿症(PH)，例如，第1型(PH1)、第2型(PH2)及第3型(PH3)。於一個具體實施例中，pPH為PH1。
如本文中所用，「治療有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑投予患者以用於治療HAO1相關疾病(如PH1)時，其量足以對該疾病之治療造成功效(例如，藉由削弱、緩解或維持現有疾病或 疾病之一種或多種症狀)。「治療有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病及其嚴重性及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、由HAO1表現媒介之病理過程之階段、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
如本文中所用，「預防有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑投予尚未經歷或表現HAO1相關疾病(例如，PH1)之症狀但可能易患該疾病的受試者時，其量足以預防或改善該疾病或該疾病之一種或多種症狀。緩解該疾病包括減緩該疾病之進程或減輕後來發展之疾病的嚴重性。「預防有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病風險程度及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個體特徵而變。
如本文所用，術語「治療」(treating或treatment)指代有益或所欲之結果，包括但不限於，一種或多種相關於非所欲之HAO1表現之症狀(例如，高草酸鹽尿症、腎鈣沉積症及/或全身性草酸鹽沉積症)的緩解或減輕。「治療」亦可意指相對於在治療缺失情況下預期之存活期而延長存活期。
如本文所用，當術語「預防」或「防止」用於相關可能受益於HAO1基因之表現減少的疾病、疾患或其病症時，該術語指代降低受試者將發展出與此疾病、疾患或病症相關之症狀(例如與原發性高草酸鹽尿症相關之症狀，例如高草酸鹽尿症、腎鈣沉積症、腎結石及/或全身性草酸鹽沉積症)的可能性。發展出高草酸鹽尿症、腎鈣沉積症、腎結石及/或全身性草酸鹽沉積症的可能性降低，例如，當具有高草酸鹽尿症、腎鈣沉積症、腎 結石及/或全身性草酸鹽沉積症之一種或多種風險因素的個體未能發展出高草酸鹽尿症、腎鈣沉積症、腎結石及/或全身性草酸鹽沉積症或者發展出其嚴重程度低於具有相同風險因素且未接受本文所揭示之治療的群體的高草酸鹽尿症、腎鈣沉積症、腎結石及/或全身性草酸鹽沉積症時。沒有發展出疾病、病症或病況，或減小與此疾病、病症或病況相關之症狀的發展(例如，將該疾病或病症之臨床可接受規格上減小至少約10%)，或顯現症狀之延遲(例如，延遲幾天、幾週、幾個月或幾年)，係視為有效之預防。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括以可用於任意治療之合理效益/風險比率產生一些所欲之局部或系統性效果之RNAi劑的量。本發明方法中採用之RNAi劑可以足以產生可用於此治療之合理效益/風險比率的量投予。
如本文中所用，術語「樣本」包括從受試者單離之相似體液、細胞或組織的集合，以及受試者體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。舉例而言，樣本可源自特定之器官、器官之部分、或彼等器官內之體液或細胞。於某些具體實施例中，樣本可源自肝臟(例如，全肝或肝臟之某些區段或肝臟中某些類型之細胞，例如，肝細胞)。於一些具體實施例中，「源自受試者之樣本」指代從該受試者抽取之血液或血漿。於又一些具體實施例中，「源自受試者之樣本」指代源自受試者之肝組織(或其亞組分)。
II.本發明之方法
本發明提供用於抑制患有原發性高草酸鹽尿症(PH)，例如第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該等方法包括對受試者投予如本文所述之靶向HAO1之RNAi劑，例如雙股RNAi劑。
本發明之方法亦包括給藥方案，其包括密集間隔投予之「負載期」，之後接續以「維持期」，在維持期內，RNAi劑以較長之間隔時間投予。此類給藥方案基於在治療開始時之受試者體重而變。此類給藥方案不基於受試者之腎臟功能而變。
據此，於一個態樣中，本發明提供一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症(PH)(例如，PH1)之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，從而抑制患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一 個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有介於約10kg至約20公斤(kg)之間之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而抑制患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫 克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而抑制患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之加量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
此等計劃之任一者可視需要進行一次或多次重複。重複之次數可取決於所欲效果(例如，HAO1基因之抑制)之達成，及/或治療性或預防性效果(例如，降低草酸鹽水平或減輕PH1之症狀)之達成。
該雙股RNAi劑或其鹽可於藥物組成物中投予。
如本文中所用，術語「抑制」與「減少」、「緘默化」、「下調」及其他類似術語可互換使用，且包括任意水平之抑制。
如本文中所用，短語「抑制HAO1之表現」旨在指代抑制任意HAO1基因(例如，小鼠HAO1基因、大鼠HAO1基因、猴HAO1基因、或人HAO1基因)以及編碼HAO1基因之變體或突變體的表現。因此，於經基因操縱之細胞、細胞群組或生物體之上下文中，HAO1基因可係野生型HAO1基因、突變HAO1基因或基因轉殖HAO1基因。
「抑制HAO1基因之表現」包括對HAO1基因之任意水平之抑制，例如，對HAO1基因之表現的至少部分的阻抑。HAO1基因之表現可基於與HAO1基因表現相關之任意變量之水平例如HAO1 mRNA水平、HAO1蛋白質水平或水平之改變而評估。這一水平可於個體細胞或細胞群組中評估之，該細胞或細胞群組包括，例如，源自受試者之樣本。
抑制可藉由與HAO1表現相關之一個或多個變數之絕對或相對水平與對照水平相比的下降而評估。對照水平可係該領域中使用之任意類型之對照水平，如投藥前之基線水平，或自未治療或經對照物(例如，僅含緩衝劑之對照物或非活性劑之對照物)治療之類似受試者、細胞或樣本測得之水平。
於本發明之方法之一些具體實施例中，HAO1基因之表現經抑制至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%。
HAO1基因表現之抑制可藉由第一細胞或細胞群組(此類細胞可存在於，例如，來源於受試者之樣本中)所表現之mRNA量相對於基本上與第一細胞或細胞群組相同但未經如是處理之第二細胞或細胞群組(對照細胞)減少而體現，於該細胞或細胞群組中，HAO1基因經轉錄並且業經處理(例如，藉由令該一個或多個細胞與本發明之RNAi劑接觸，或藉由 將本發明之RNAi劑投予其體內存在或曾經存在該細胞之受試者)，使得HAO1基因之表現得以抑制。於一些具體實施例中，該抑制係藉由使用下式將經處理之細胞中的mRNA水平表示為相對於對照細胞中之mRNA水平的百分比而評估：
Figure 110144852-A0202-12-0048-151
或者，HAO1基因表現之抑制可以就功能上與HAO1基因表現例如HAO1蛋白質表現、GO酶活性、尿草酸鹽水平、血漿草酸鹽水平、血漿乙醇酸鹽水平、髓性腎鈣沉積症、全身性草酸鹽沉積症(例如，腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及眼草酸鹽沉積)，例如，心草酸鹽沉積、及/或血液疾患(例如，貧血)關聯之參數的降低而言進行評估。
例如，於一些具體實施例中，HAO1表現之抑制係藉由血漿草酸鹽水平，例如，使用LC-MS/MS(液相層析術串聯質譜)量測。於一些具體實施例中，在投予之後，受試者之血漿草酸鹽水平降低約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，或血漿草酸鹽水平降低至正常範圍內(<1.6μmol/L)。
於一些具體實施例中，HAO1表現之抑制係藉由測定髓性腎鈣沉積之程度而評估。於一個具體實施例中，在投予之後，髓性腎鈣沉積減少。如本文所用，關於髓性腎鈣沉積之術語「減少」包括髓性腎鈣沉積例如相對於基線值(例如，治療之前)的降低或減少。關於髓性腎鈣沉積之 「減少」亦包括髓性腎鈣沉積例如相對於基線值(例如，治療之前)無變化。於一些具體實施例中，髓性腎鈣沉積之程度係低於基線(改善)，例如，在一個腎臟中或在兩個腎臟中，及/或相對於基線保持不變(無變化)，例如，在一個腎臟中或在兩個腎臟中。熟練專業人員可輕易地藉由腎臟超音評估髓性腎鈣沉積。例如，如實施例中所揭示，超音量測髓性腎鈣沉積之級別(範圍：0至3)，其中級別愈高，指示髓性腎鈣沉積愈嚴重。每個腎臟之髓性腎鈣沉積級別之變化歸類為3組：(1)無變化，(2)惡化，或(3)改善。
於一些具體實施例中，HAO1表現之抑制係藉由測定全身性草酸鹽沉積、腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及/或眼草酸鹽沉積之程度，例如，相對於基線(例如，投予之前的水平)之變化來評估。
於一些具體實施例中，心草酸鹽沉積係藉由心臟超音檢查(回波)測定，並且測定心功能參數，例如，左心室射出分率(LVEF)、全心室縱向應變(GLS)及/或早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)。於一些具體實施例中，在投予之後，左心室射出分率(LVEF)增加至少約5%，例如，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%或更多；及/或全心室縱向應變(GLS)降低至少約2%，例如，2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多；及/或早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)增加至少約2%，例如，2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多。
於一些具體實施例中，皮膚草酸鹽沉積係使用Bates-Jensen創傷評估工具評估。於一些具體實施例中，使用Bates-Jensen創傷評估工 具在創傷狀態演變(Wound Status Continuum)上評估之總分(1至60；60為創傷惡化，13為創傷再生，且1為組織健康)降低至約55、50、45、40、35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1。
於一些具體實施例中，眼草酸鹽沉積係使用總黃斑體積及視覺敏銳度測量來評估。於一些具體實施例中，在投予之後，總黃斑體積及視覺敏銳度增加。熟練專業人員可藉由OCT(光學同調斷層掃描)、CFP(彩色眼底攝影)及/或FAF(眼底自體螢光)輕易地評估總黃斑體積及視覺敏銳度。
於一些具體實施例中，骨骼草酸鹽沉積係藉由X射線及/或核成像骨掃描由熟練專業人員評估。於一些具體實施例中，在投予之後，骨骼草酸鹽沉積減少。
於一些具體實施例中，HAO1表現之抑制係藉由測定血液疾患之變化來評估。例如，於一些具體實施例中，患有PH全身性草酸鹽沉積症之受試者可能具有草酸鹽晶體之骨髓浸潤，並且於一些具體實施例中，具有腎衰竭以及其所導致之貧血。因此，使用本發明之方法減少全身性草酸鹽沉積將減少骨髓中之草酸鹽並改善造血作用，從而減輕受試者之貧血。於一些具體實施例中，白血球計數及血小板計數亦得到改善。
於一些具體實施例中，在投予之後，紅血球計數增加(且貧血降低)。
於本發明之方法的一些具體實施例中，HAO1表現之降低持續較長之時間，例如，至少一週、兩週、三週、或四週或更久。例如，在某 些情況下，藉由投予本文所揭示之iRNA劑，HAO1基因之表現被抑制至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%。
於一些具體實施例中，藉由投予該iRNA劑，HAO1基因被抑制至少約60%、70%或80%。於一些具體實施例中，藉由投予該雙股寡核苷酸，HAO1基因被抑制至少約85%、90%或95%。於另一具體實施例中，在投予之後，HAO1基因保持受抑制7天、10天、20天、30天或更久。
HAO1基因緘默化可於持續性表現HAO1或藉由基因體工程化改造而表現HAO1之任意細胞內測定，並且藉由該技藝中已知之任意檢定法測定。肝臟為HAO1表現之主要位點。表現之其他顯著位點包括腎臟及子宮。
HAO1蛋白表現之抑制可藉由細胞或細胞群組所表現之HAO1蛋白水平(例如，於源自受試者之樣本中表現的蛋白質水平)之減少而體現。如前述對於mRNA抑制之評估方式，經處理之細胞或細胞群組中蛋白質表現水平之抑制可類似地表現為相對於對照細胞或細胞群組中蛋白質水平的百分比。
可用來評估HAO1基因表現之抑制的對照細胞或細胞群組包括尚未與本發明之RNAi劑接觸之細胞或細胞群組。舉例而言，對照細胞或細胞群組可源自使用RNAi劑治療受試者之前的個體受試者(例如，人類或動物受試者)。
細胞或細胞群體所表現之HAO1 mRNA水平可使用該領域中已知用於評估mRNA表現之任意方法測定。於一個具體實施例中，樣本中之HAO1表現水平可藉由偵檢經轉錄之聚核苷酸或其蛋白質(例如HAO1基因)之mRNA而測定。可使用RNA萃取技術，包括例如使用酸酚/異硫氰酸胍萃取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasy RNA製備套組(Qiagen)或PAXgene(PreAnalytix，瑞士)，從細胞中萃取RNA。採用核糖核酸雜交之典型檢定型式包括核連綴檢定、RT-PCR、RNase保護檢定(Melton et al.,Nuc.Acids Res.12：7035)、北方墨點法、原位雜交及微陣列分析。
於一個具體實施例中，使用核酸探針測定HAO1之表現水平。如本文所用，術語「探針」指代能夠選擇性地結合至特異性HAO1的任意分子。探針可由該領域熟練人士合成，或來源於適宜之生物學製程。探針可特異性地設計為具標記的。可用作探針之分子的實例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
單離之mRNA可用於雜交或擴增檢定中，該檢定包括但不限於，南方或北方墨點分析、聚合酶連鎖反應(PCR)分析及探針陣列。一種用於測定mRNA水平之方法包括令單離之mRNA與可雜交至HAO1 mRNA之核酸分子(探針)接觸。於一個具體實施例中，例如，藉由令單離之mRNA於瓊脂糖凝膠上電泳並將該mRNA從該凝膠轉移至膜諸如硝基纖維素膜上，從而將mRNA固定於固體表面上並令其與探針接觸。於一替代之具體實施例中，例如，於Affymetrix基因晶片陣列中，將探針固定於固體表面上並令mRNA與該探針接觸。熟練人士可輕易地調整已知之mRNA偵檢方法以用於測定HAO1 mRNA之水平。
用於測定樣本中HAO1表現水平之方法包括例如樣本中之mRNA的核酸擴增及/或逆轉錄(以製備cDNA)之製程，該製程係例如藉由RT-PCR(Mullis於1987年於美國專利4,683,202中詳述之實驗性具體實施例)、連接酶連鎖反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自我持續之序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環式複製(Lizardi等人，美國專利第5,854,033號)或任意其他核酸擴增方法進行，之後使用該領域彼等熟練人士習知之技術偵檢所擴增之分子。如果核酸分子以非常低之數量存在，則此等偵檢方法尤其有用於偵檢此類分子。於本發明之特定態樣中，HAO1表現之水平係藉由定量螢光RT-PCR(亦即，TaqManTM系統)測定。
可使用膜墨點(諸如雜交分析中所用者，諸如北方墨點、南方墨點、點狀墨點等)或微孔盤、樣本管、凝膠、磁珠或纖維(或包含經結合之核酸的任意固體支撐物)監測HAO1 mRNA之表現水平。參見，美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號及第5,445,934號，該等專利藉由引用併入本文。HAO1表現水平之測定亦可包含使用處於溶液中之核酸探針。
於一些具體實施例中，使用分枝DNA(bDNA)檢定或即時PCR(qPCR)評估mRNA表現之水平。此等方法之用途揭示且例示於本文之實施例中。
HAO1蛋白表現之水平可使用該領域中已知用於量測蛋白質水平之任意方法測定。此類方法包括，例如，電泳、毛細管電泳、高效液相層析術(HPLC)、薄層層析術(TLC)、超擴散層析術、流體或凝膠沈澱素反應、吸收光譜、比色檢定、分光光度檢定、流式細胞術、免疫擴散(單向或雙向)、免疫電泳、西方墨點法、放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定等。
如本文中所用，術語「樣本」指代從受試者單離之相似體液、細胞或組織的集合，以及受試者體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之實例包括血液、血清及漿膜液、血漿、淋巴液、尿液、腦脊液、唾液、眼液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域之樣本。舉例而言，樣本可源自特定之器官、器官之部分、或彼等器官內之體液或細胞。於某些具體實施例中，樣本可源自肝臟(例如，全肝或肝臟之某些區段或肝臟中某些類型之細胞，例如，肝細胞)。於一些具體實施例中，「源自受試者之樣本」指代從該受試者抽取之血液或血漿。於其他具體實施例中，「源自受試者之樣本」指代源自該受試者之肝組織。
於本發明之方法的一些具體實施例中，將RNAi劑投予受試者，使得RNAi劑被遞送至該受試者體內之具體位點。HAO1表現之抑制可使用來源於來自該受試者特定位點之體液或組織的樣本中HAO1 mRNA或HAO1蛋白質之水平或水平改變的量測值進行評估。於一些具體實施例中，該位點係肝臟。該位點亦可為來自前述位點中任一者之細胞的亞組或子群。該位點亦可包括表現特定類型之受體的細胞。
本發明亦提供治療或預防可藉由HAO1基因表現來調控之疾病及病症，諸如原發性高草酸鹽尿症(PH)例如PH1之方法。
據此，本發明提供用於治療患有原發性高草酸鹽尿症(PH)，例如第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之受試者之方法。該等方法包括對受試者投予如本文所揭示之靶向HAO1之RNAi劑，例如雙股RNAi劑。該等方法可包括向受試者投予治療或預防有效量的雙股RNAi劑。
本發明之治療方法亦包括給藥方案，其包括密集間隔投予之「負載期」，之後接續以「維持期」，在維持期內，RNAi劑以較長之間隔時間投予。此類給藥方案基於在治療開始時之受試者體重而變。此類給藥方案不基於受試者之腎臟功能而變。
據此，於一個態樣中，本發明提供一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之方法。該等方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，從而治療患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一 個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而治療患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個態樣中，本發明提供一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi 劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而治療患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
此等計劃之任一者可視需要進行一次或多次重複。重複之次數可取決於所欲效果(例如，HAO1基因之抑制)之達成，及/或治療性或預防性效果(例如，降低草酸鹽水平或減輕PH1之症狀)之達成。
該雙股RNAi劑或其鹽可於藥物組成物中投予。
於一個具體實施例中，將靶向HAO1之dsRNA投予至患有原發性高草酸鹽尿症之受試者，使得HAO1水平例如該受試者之細胞、組織、血液、尿液或其他組織或體液內的GAO1水平減少至少約10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、62%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%、或至少約99%或更多，並且隨後將額外治療劑(如下所述)投予至該受試者。
用於治療原發性高草酸鹽尿症之額外治療劑可以為，例如，維生素B6(吡哆醇)及/或檸檬酸鉀。
根據本發明之方法及用途投予dsRNA劑可導致患有原發性高草酸鹽尿症之患者體內此等疾病或病變之嚴重性、徵象、症狀、及/或標記之減輕/減少。這一上下文中，「減輕/減少」意為此水平之統計學上顯著的下降。該減少可係，舉例而言，至少約2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或約100%。
疾病之治療或預防的效力可藉由下述評估，舉例而言，量測疾病進展、疾病緩解、症狀嚴重性、疼痛之減輕、生活品質、維持治療效果所需之藥物劑量、疾病標記或任何適用於給定之待治療疾病或預防之靶向的其他可量測之參數。藉由量測此類參數之任一者或參數之任意組合而監控治療或預防之效率，完全處於熟悉該領域之人士的能力範圍內。舉例而言，可例如藉由週期性監測被治療之受試者體內之草酸鹽水平而評估對原發性高草酸鹽尿症之治療效力。將後來之量測結果與最初之量測結果比較，向醫師提供治療是否有效之指示。藉由量測此參數或參數之任意組合而監控治療或預防之效率，完全處於熟悉該領域之人士的能力範圍內。對於靶向HAO1之dsRNA劑或其藥物組成物之投予，「有效對抗」原發性高草酸鹽尿症係指以臨床上適宜之方式投予在至少統計學上顯著的患者數中導致有益效果，例如症狀之改善、疾病之治愈、疾病之減輕、生命延長、 生活品質之改善、或其他通常被熟悉治療原發性高草酸鹽尿症及相關肇因之醫生認為積極的效果。
治療性或預防性效果係顯見於當疾病狀態之一個或多個參數存在統計學上顯著之改善時，或預期會惡化或發展出症狀者沒有惡化或發展出症狀時。作為實例，可量測之疾病參數中至少10%，且較佳至少20%、30%、40%、50%或更多的有利變化可係有效治療之指示。
任意導致例如使用適宜量表量測之疾病嚴重程度變小的正向變化，代表使用本文所揭示之dsRNA劑或dsRNA製劑進行了足夠之治療。
舉例而言，於一些具體實施例中，治療之功效係藉由測定血漿乙醇酸鹽水平及/或尿草酸鹽排泄及/或GO酶活性及/或血漿草酸鹽水平，例如，相對於基線(例如，治療之前的水平)之變化來評估。
於一些具體實施例中，治療之功效係藉由測定血漿草酸鹽水平，例如，使用LC-MS/MS(液相層析術串聯質譜)評估。於一些具體實施例中，在投予之後，受試者之血漿草酸鹽水平降低約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多，或血漿草酸鹽水平降低至正常範圍內(<1.6μmol/L)。
於一些具體實施例中，治療之功效係藉由測定髓性腎鈣沉積之程度而評估。於一個具體實施例中，在投予之後，髓性腎鈣沉積減少。如本文所用，關於髓性腎鈣沉積之術語「減少」包括髓性腎鈣沉積例如相對於基線值(例如，治療之前)的降低或減少。關於髓性腎鈣沉積之「減少」亦包括髓性腎鈣沉積例如相對於基線值(例如，治療之前)無變化。於一些具體實施例中，髓性腎鈣沉積之程度係低於基線(改善)，例如，在一個腎臟中 或在兩個腎臟中，及/或相對於基線保持不變(無變化)，例如，在一個腎臟中或在兩個腎臟中。熟練專業人員可輕易地藉由腎臟超音評估髓性腎鈣沉積。例如，如實施例中所揭示，超音量測髓性腎鈣沉積之級別(範圍：0至3)，其中級別愈高，指示髓性腎鈣沉積愈嚴重。每個腎臟之髓性腎鈣沉積級別之變化歸類為3組：(1)無變化，(2)惡化，或(3)改善。
於一些具體實施例中，治療之功效係藉由測定全身性草酸鹽沉積、腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及/或眼草酸鹽沉積之程度，例如，相對於基線(例如，投予之前的水平)之變化來評估。
於一些具體實施例中，心草酸鹽沉積係藉由心臟超音檢查(回波)測定，並且測定心功能參數，例如，左心室射出分率(LVEF)、全心室縱向應變(GLS)及/或早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)。於一些具體實施例中，在投予之後，左心室射出分率(LVEF)增加至少約5%，例如，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、或50%或更多；及/或全心室縱向應變(GLS)降低至少約2%，例如，2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多；及/或早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)增加至少約2%，例如，2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多。
於一些具體實施例中，皮膚草酸鹽沉積係使用Bates-Jensen創傷評估工具評估。於一些具體實施例中，使用Bates-Jensen創傷評估工具在創傷狀態連續統(Wound Status Continuum)上評估之總分(1至60；60為創傷惡化，13為創傷再生，且1為組織健康)降低至約55、50、45、40、 35、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1。
於一些具體實施例中，眼草酸鹽沉積係使用總黃斑體積及視覺敏銳度測量來評估。於一些具體實施例中，在投予之後，總黃斑體積及視覺敏銳度增加。熟練專業人員可藉由OCT(光學同調斷層掃描)、CFP(彩色眼底攝影)及/或FAF(眼底自體螢光)輕易地評估總黃斑體積及視覺敏銳度。
於一些具體實施例中，骨骼草酸鹽沉積係藉由X射線及/或核成像骨掃描由熟練專業人員評估。於一些具體實施例中，在投予之後，骨骼草酸鹽沉積減少。
於一些具體實施例中，治療之功效係藉由測定血液疾患，例如，相對於基線(例如，投予之前的水平)之變化來評估。於一些具體實施例中，在投予之後，紅血球計數增加(且貧血降低)。
本發明復提供用於減少患有原發性高草酸鹽尿症(PH)，例如第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之人類受試者的血漿草酸鹽之方法；用於減少患有原發性高草酸鹽尿症(PH)，例如第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之人類受試者的髓性腎鈣沉積之方法；以及用於減少患有原發性高草酸鹽尿症(PH)，例如第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之人類受試者的全身性草酸鹽沉積之方法。該等方法包括對受試者投予如本文所揭示之靶向HAO1之RNAi劑，例如雙股RNAi劑。
於一些具體實施例中，本發明之方法亦包括給藥方案，其包括密集間隔投予之「負載期」，之後「維持期」，在維持期內，RNAi劑以 較長之間隔時間投予。此類給藥方案基於在治療開始時之受試者體重而變。此類給藥方案不基於受試者之腎臟功能而變。
據此，於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤 (mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一 個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
血漿草酸鹽水平可在投予雙股RNAi劑之後例如相對於基線(例如，投予之前的水平)降低約35%，例如，35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%或更多，及/或在投予雙股RNAi劑之後降低至正常範圍內。
此等計劃之任一者可視需要進行一次或多次重複。重複之次數可取決於所欲效果之達成。
該雙股RNAi劑或其鹽可於藥物組成物中投予。
於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一 個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg) 至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
髓性腎鈣沉積可得以減少，例如，髓性腎鈣沉積之程度係低於基線，例如，在一個腎臟中或在兩個腎臟中，及/或相對於基線保持不變，例如，在一個腎臟中或在兩個腎臟中。熟練專業人員可輕易地藉由腎臟超音評估髓性腎鈣沉積。
此等計劃之任一者可視需要進行一次或多次重複。重複之次數可取決於所欲效果之達成。
該雙股RNAi劑或其鹽可於藥物組成物中投予。
於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積之方法。該方法包括向受試者投予抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有低於約10公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤 (mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
於另一態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有約10kg至約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約4mg/kg至約8mg/kg，例如，約4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或約8mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約6mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
於一個態樣中，本發明提供一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積之方法。該方法包括向受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現之雙股RNAi劑或其鹽，其中該受試者具有大於約20公斤(kg)之體重，其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期之給藥方案投予，其中該負載期包含向受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向受試者投予約1mg/kg至約5mg/kg，例如，約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或約5mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次，從而減少患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該負載期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。於一個具體實施例中，該維持期包含向受試者投予約3mg/kg之劑量的雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
該全身性草酸鹽沉積為腎草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積及/或眼草酸鹽沉積。
於一個具體實施例中，該全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積。於一個具體實施例中，該全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積，且在投予雙股RNAi之後，左心室射出分率(LVEF)增加至少約5%，例如，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。
於一個具體實施例中，該全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積，且在投予雙股RNAi之後，全心室縱向應變(GLS)降低至少約2%，例如，2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%或更多。
於一個具體實施例中，該全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積，且在投予雙股RNAi之後，其二尖瓣流人速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)增加至少約2%，例如，2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。
此等計劃之任一者可視需要進行一次或多次重複。重複之次數可取決於所欲效果之達成。
該雙股RNAi劑或其鹽可於藥物組成物中投予。
於另一態樣中，本發明之特徵為一種向終端使用者，例如，照護者或受試者，說明如何投予本文所揭示之iRNA劑之方法。該方法包括，視需要，向終端使用者提供一個或多個劑量之iRNA劑，並且向終端使用者說明按本文所揭示之方案投予該iRNA劑，從而向該終端使用者說明。
本發明之活體內方法及用途可包括投予受試者含有dsRNA劑之組成物，其中該dsRNA劑包括與待治療之哺乳動物之HAO1基因之RNA轉錄本之至少一部分互補的核苷酸序列。當待治療之生物體為哺乳動 物諸如人類時，該組成物可藉由該領域中已知之任意手段投予，包括但不限於，皮下、靜脈內、口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，腦室內、腦實質內及鞘內)、肌肉內、透皮、氣管(氣溶膠)、鼻內、直腸內及外用(包括頰腔及舌下)投予。於某些具體實施例中，該組成物係藉由皮下或靜脈內輸液或注射而投予。於一個具體實施例中，該組成物係藉由皮下投予而投予。
於一些具體實施例中，該投予係經由貯庫注射進行。貯庫注射可在延長之時間段內以一致之途徑釋放dsRNA劑。因此，貯庫注射可減少為獲得所欲效果(如所欲之HAO1抑制或治療性或預防性效果)所需之給藥頻率。貯庫注射亦可提供更為一致之血清濃度。貯庫注射可包括皮下注射或肌肉注射。於較佳之具體實施例中，貯庫注射係皮下注射。
於一些具體實施例中，該投予係經由泵進行。該泵可以為外部泵或經外科手術植入之泵。於某些具體實施例中，該泵為經皮下植入之滲透泵。於其他具體實施例中，該泵為輸液泵。輸液泵可用於靜脈內、皮下、動脈內或硬膜內輸液。於較佳之具體實施例中，該輸液泵為皮下輸液泵。於其他具體實施例中，該泵為經外科手術植入之將dsRNA劑遞送至肝臟的泵。
其他投予模式包括硬膜上投予、腦內投予、腦室內投予、鼻內投予、動脈內輸注、心內輸注、骨內輸注、鞘內腔注射、玻璃體內注射及肺內投予。可基於局部治療或系統性治療是否係所欲者並基於待治療之面積而選擇投予模式。可選擇投予之途徑及位點以增強靶向性。
通常，該iRNA劑並不活化免疫系統，例如，它並不增加細胞激素水平，諸如TNF-α或IFN-α水平。舉例而言，當藉由檢定法諸如活體外PBMC檢定法諸如本文所揭示者量測時，TNF-α或IFN-α水平之增幅小於用對照dsRNA諸如不靶向HAO1之dsRNA處理之對照細胞的30%、20%或10%。
需要HAO1 RNAi劑之患者可藉由取得家族病史進行鑑定。健康照護提供者，諸如醫生、護士或家庭成員，可在開具處方或投予HAO1 dsRNA之前取得家族病史。亦可在將HAO1 RNAi劑投予患者之前，對該患者施行DNA測試以鑑定AGT1基因中之突變。PH1之診斷可藉由本領域熟練人士習知之任何測試予以證實。
由於對HAO1表現之抑制效果，根據本發明之組成物或自其製備之醫藥組成物可增強生活品質。
本發明之dsRNA劑可以「裸」形式或作為「自由dsRNA劑」投予。裸dsRNA劑係於藥物組成物不存在下投予。裸dsRNA劑可處於合適之緩衝溶液中。緩衝溶液可包含醋酸鹽、枸櫞酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。於一個具體實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有dsRNA劑之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其適用於投予至受試者。
或者，本發明之dsRNA劑可作為醫藥組成物投予，例如作為dsRNA劑脂質體製劑投予。
將會受益於HAO1基因表現之減少及/或抑制之受試者為彼等患有如本文所揭示之原發性高草酸鹽尿症者。
將會受益於HAO1基因表現之減少及/或抑制之受試者的治療包括治療性及預防性治療(例如，該受試者攜帶AGTX基因中之突變且患有PH1)。
適合之受試者可患有或不患有終末期腎病(ESRD)。適合之受試者可正在進行或未進行透析，例如，血液透析。
本發明復提供dsRNA劑或其醫藥組成物用於治療原發性高草酸鹽尿症之方法及用途(包括dsRNA劑或其包含dsRNA劑之醫藥組成物用於治療原發性高草酸鹽尿症之方法及用途)，與其他治療劑及/或其他治療方法組合，例如，與已知藥物及/或已知治療方法諸如彼等當先用於治療此等疾患者組合。舉例而言，於某些具體實施例中，靶向HAO1之dsRNA劑係與例如本文中他處所揭示之可用於治療原發性高草酸鹽尿症之劑組合。
舉例而言，適用於治療將會受益於HAO1表現減少之受試者(例如，患有原發性高草酸鹽尿症之受試者)的額外之治療劑及治療方法包括維生素B6(吡哆醇)及/或檸檬酸鉀或前述任意者之組合。
該dsRNA劑(及/或用於治療原發性高草酸鹽尿症之劑)及額外之治療劑及/或治療可同時投予及/或在同一組合中投予，例如腸胃外投予，或該額外之治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間及/或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
III.用於本發明之方法中的iRNA劑遞送
用於本發明之方法中的iRNA劑至細胞例如受試者諸如人類受試者(例如，有此需要之受試者，諸如患有原發性高草酸鹽尿症之受試者) 體內之細胞的遞送可藉由大量不同路徑達成。舉例而言，可藉由將細胞與本發明之iRNA在活體外或活體內接觸而施行遞送。活體內遞送亦可藉由將包含iRNA如dsRNA之組成物投予至受試者而直接施行。或者，活體內遞送可藉由投予編碼並引導該iRNA之表現的一種或多種載體而間接施行。此等選擇於下文中進一步檢討。
通常，遞送核酸分子之任意方法(活體外或活體內)可適用於與本發明之iRNA合用(參見，例如，Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其藉由引用而以其整體併入本文)。對於活體內遞送，為了遞送iRNA分子而慮及之因素包括，舉例而言，所遞送至分子的生物學穩定性、非特異性效應之預防、及所遞送之分子在標靶組織內之蓄積。iRNA之非特異性效應可藉由局部投予而最小化，舉例而言，藉由直接注射或移植入組織內或外用投予該製劑。局部投予至治療位點將該劑之局部濃度最大化，限制該劑與可能受該劑傷害或可降解該劑之全身組織接觸，且允許以較低之劑量投予iRNA分子。若干研究已顯示，當局部投予iRNA時，成功敲落(knockdown)基因產物。舉例而言，藉由玻璃體內注射對食蟹猴進行VEGF dsRNA之眼內遞送(Tolentino,MJ.,et al(2004)Retina 24：132-138)以及藉由視網膜下注射對小鼠進行該眼內遞送(Reich,SJ.,et al(2003)Mol.Vis.9：210-216)，兩者皆顯示防止老年性黃斑點退化實驗模型中的新血管生成。此外，在小鼠體內進行dsRNA之直接腫瘤內注射減小腫瘤體積(Pille,J.,et al(2005)Mol.Ther.11：267-274)且可延長荷瘤小鼠之存活期(Kim,WJ.,et al(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.,et al(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾亦已顯示出藉由 直接注射成功地局部遞送至中樞神經系統(CNS)(Dorn,G.,et al.(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.,et al(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.,et al(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)以及藉由鼻內投予而成功遞送至肺部(Howard,KA.,et al(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.,et al(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.,et al(2005)Nat.Med.11：50-55)。對於全身投予iRNA用於治療疾病，該RNA可經修飾或者使用藥物遞送系統遞送；兩種方法皆作動以防止該dsRNA被核酸內切酶及核酸外切酶在活體內快速降解。對RNA或藥學載劑之修飾亦可允許該iRNA組成物以靶標組織為靶向且避免非所欲之脫靶效應。iRNA分子可藉由化學複合酯親脂性基團如膽固醇而修飾，以提升細胞攝取且防止降解。舉例而言，將結合至親脂性膽固醇部分之對抗ApoB的iRNA經全身注射至小鼠體內，導致肝臟及空腸兩處之apoB mRNA的敲落(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。業經顯示，將iRNA結合至適體抑制前列腺癌模型小鼠體內之腫瘤生長並媒介腫瘤衰退(McNamara,JO.et al.,(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。於作為另一種選擇之具體實施例中，該iRNA可使用藥物遞送系統如奈米顆粒、樹型聚合物、聚合物、脂質體、或陽離子遞送系統進行遞送。荷正電之陽離子遞送系統係促進iRNA分子(荷負電)之結合，亦提升在荷負電之細胞膜處的相互作用，以允許該細胞對iRNA之有效攝取。陽離子脂質、樹型聚合物或聚合物可或結合至iRNA或被誘 導以形成包合iRNA之囊泡或微胞(參見，例如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。媒介物或微胞之形成進一步防止當全身投予時該iRNA之降解。製作及投予陽離子-iRNA錯合物之方法完全處於該領域熟練人士之能力範圍內(參見，例如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al.(2007)J.Hypertens.25：197-205，其皆藉由引用而整體併入本文)。可用於iRNA之系統性遞送的藥物遞送系統之一些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003)，同上；Verma,UN.et al.,(2003)，同上)、Oligofectamine、「固體核酸脂質顆粒」(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16電子優先發佈；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺基胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些具體實施例中，iRNA與環糊精形成用於全身性投予之錯合物。投予方法及iRNA與環糊精之醫藥組成物可見於美國專利第7,427,605號，其藉由引用而以其整體併入本文。
A.用於本發明之經載體編碼之iRNA
靶向HAO1基因之iRNA可從插入DNA或RNA載體之轉錄單元表現(參見，例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；Skillern, A.,et al.，國際PCT公佈第WO 00/22113號；Conrad，國際PCT公佈第WO 00/22114號；以及Conrad，美國專利第6,054,299號)。表現可係瞬時者(幾小時至幾週之量級)或持續者(幾週至幾個月或更久)，取決於所使用之具體構造及標靶組織或細胞類型。此等基因轉殖可作為線性構造、環狀質體、或病毒載體而引入，其可係整合載體或非整合載體。基因轉殖亦可構造為允許其被作為粒線體外質體而被繼承(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
iRNA之單股或多股可從表現載體上之啟動子轉錄。當兩個單獨之股待表現以生成例如dsRNA，則可將兩個單獨之表現載體共同引入(例如，藉由轉染或感染)靶標細胞內。或者，dsRNA之每一單股可藉由位於相同表現質體上之兩種啟動子轉錄。於一個具體實施例中，dsRNA表現為反向重複聚核苷酸，其藉由鏈結子聚核苷酸序列接合，使得該dsRNA具有莖環結構(stem and loop structure)。
iRNA表現載體通常為DNA質體或病毒載體。與真核細胞相容之表現載體，較佳為彼等與脊椎動物細胞相容者，可用來生產用於表現本文所述iRNA之重組構造。真核細胞表現載體為該領域中習知者，且可從大量商業來源獲得。典型地，此類載體提供為含有用於插入所欲之核酸鏈段的便利限定位點。iRNA表現載體之屬性可係全身性者，如藉由靜脈內或肌肉內投予；藉由投予至從該患者外植之靶標細胞，之後重新引入患者體內；或藉由任何其他容許引入所欲之靶標細胞內的手段。
iRNA表現質體可作為與陽離子脂質載劑之錯合物(例如，Oligofectamine)或非陽離子脂質系載劑(例如，Transit-TKOTM)而經轉染至 標靶細胞內。本發明亦設想，於一週或更久之時間內進行針對靶向標靶RNA不同區域之iRNA介導之敲落的多脂質轉染。載體至宿主細胞內之成功引入可使用各種已知方法監測之。例如，暫態轉染(transient trasfection)可使用報導子諸如螢光標誌物諸如綠色螢光蛋白(GFP)發出信號。離體外(ex vivo)細胞之穩定轉染可使用標誌物確保之，該標誌物向經轉染之細胞提供對於特定環境因素(例如，抗生素及藥物)之抗性，諸如潮黴素B抗性。
可與本文所述方法及組成物合用之病毒載體系統包括但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)Sv40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳突病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體(如正痘病毒)，例如牛痘病毒載體或禽痘(如金絲雀痘或雞痘)病毒載體；以及(j)輔助病毒依賴性病毒或無腸病毒載體。複製缺陷型病毒(replication-defective virus)亦能為優選。不同之載體將併入或不併入該細胞之基因組內。若必要，該等構造可包括病毒序列以用於轉染。或者，該構造可併入能進行附加型複製(episomal replication)之載體如EPV載體及EBV載體內。用於iRNA之重組表現之構造通常將會需要調節元素，如啟動子、增強子等，以確保該iRNA在標靶細胞內之表現。對於載體及構造所慮及之其他方面進一步揭示於下。
可用於遞送iRNA之載體將包括足以在所欲標靶細胞或組織內表現iRNA之調控元件(啟動子、增強子等)。可選擇調控元件以提供組成性或經調控/可誘導之表現。
iRNA之表現可例如使用可誘導之調控序列精確調控之，該調控序列對於某些生理調控因子例如循環葡萄糖水平或激素敏感(Docherty et al.,1994,FASEB J.8：20-24)。此類適用於控制細胞或哺乳動物體內之dsRNA表現的可誘導之表現系統包括，例如，藉由蛻皮激素、雌激素、黃體素、四環素、二聚化之化學誘導劑以及異丙基-β-D1-硫代半乳糖苷(IPTG)之調控。本領域技術人員將能夠基於iRNA基因轉殖之預期用途而選擇適宜之調控/啟動子序列。
可使用含有編碼iRNA之核酸序列的病毒載體。例如，可使用逆轉錄病毒載體(參見，Miller et al.,Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。此等逆轉錄病毒載體含有正確封裝病毒基因組並整合至宿主細胞DNA中所必需之成分。編碼iRNA之核酸序列經選殖至一個或多個載體中，其促進將核酸遞送至患者體內。關於逆轉錄病毒載體之更多細節可見於，例如，Boesen et al.,Biotherapy 6：291-302(1994)中，其揭示逆轉錄病毒遞送mdr1基因至造血幹細胞以作成更耐化療之幹細胞的用途。其他例證逆轉錄病毒載體於基因療法中之用途的參考文獻係：Clowes et al.,J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem et al.,Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg,Human Gene Therapy 4：129-141(1993)；以及Grossman and Wilson,Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)。預期使用之慢病毒載體包括，例如，美國專利第6,143,520號、第5,665,557號及第5,981,276號中揭示之HIV系載體，該等專利藉由引用併入本文。
亦考慮使用腺病毒於遞送本發明之iRNA。腺病毒係特別誘人之載體，例如，用於遞送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，它們於該處造成輕度疾病。腺病毒系遞送系統之其他標靶係肝臟、中樞神經系統、內皮細胞及肌肉。腺病毒具有能夠感染非分裂細胞之優點。Kozarsky and Wilson,Current Opinion in Genetics and Development 3：499-503(1993)提出基於腺病毒之基因療法的綜述。Bout et al.,Human Gene Therapy 5：3-10(1994)演示了腺病毒載體轉移基因至恆河猴呼吸道上皮的用途。腺病毒於基因療法中之用途的其他實例可見於Rosenfeld et al.,Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.,Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.,J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；PCT公佈WO94/12649；以及Wang,et al.,Gene Therapy 2：775-783(1995)。適用於表現本發明提出之iRNA的AV載體、構建重組AV載體之方法、以及遞送載體至標靶細胞內之方法揭示於Xia H et al.(2002),Nat.Biotech.20：1006-1010中。
腺相關病毒(AAV)載體亦可用來遞送本發明之iRNA(Walsh et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)；美國專利第5,436,146號)。於一個具體實施例中，iRNA可表現為來自重組AAV載體的兩個獨立、互補之單股RNA分子，該載體具有例如U6或H1 RNA啟動子或者具有巨細胞病毒(CMV)啟動子。適用於表現本發明提出之dsRNA的AAV、構建重組AV載體之方法、以及遞送載體至標靶細胞內之方法揭示於以下文獻中：Samulski R et al.(1987),J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J et al.(1996),J.Virol,70：520-532；Samulski R et al.(1989),J.Virol. 63：3822-3826；美國專利第5,252,479號；美國專利第5,139,941號；國際專利申請第WO 94/13788號；以及國際專利申請第WO 93/24641號，此等文獻之整體揭露藉由引用併入本文。
其他適用於遞送本發明之iRNA的病毒載體係痘病毒諸如牛痘病毒，例如，減毒牛痘病毒諸如改良阿卡拉病毒(Modified Virus Ankara(MVA))或NYVAC(一種禽類痘病毒諸如雞痘病毒或金絲雀痘病毒)。
病毒載體之向性可藉由以來自其他病毒之套膜(envelope)蛋白或其他表面抗原將載體假分型(pseudotyping)或藉由按需要取代不同之病毒殼蛋白而修飾。例如，可使用來自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、伊波拉病毒、莫科拉(Mokola)病毒等之表面蛋白將慢病毒載體假分型。可藉由工程化載體以表現不同殼蛋白血清型而將AAV病毒作成靶向不同細胞；參見，例如，Rabinowitz J E et al.(2002),J Virol 76：791-801，其整體揭露藉由引用併入本文。
載體之藥物製劑可包括處於可接受之稀釋劑中之該載體，或可包括將基因遞送媒介物包埋於其中的緩慢釋放基質。另選地，在可以從重組細胞完整地產生完全基因遞送載體例如逆轉錄病毒載體的情況下，藥物製劑可包括產生該基因遞送系統的一個或多個細胞。
IV.用於本發明之方法中的雙股iRNA劑
適用於本發明之方法中的雙股RNAi劑包括具有互補區域之反義股，該互補區域與在HAO1基因表現中所形成之mRNA的至少一部分互補。該互補區域係約19至30個核苷酸之長度(例如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19個核苷酸之長度)。當與表現HAO1 基因之細胞接觸時，該iRNA將該基因(例如，人類、靈長類、非靈長類或大鼠HAO1基因)之表現抑制至少約50%，如藉由例如PCR或基於分枝DNA(bDNA)之方法所檢定，或藉由基於蛋白質之方法諸如藉由使用例如西方墨點法之免疫螢光分子或流式細胞術所檢定。於較佳之具體實施例中，表現之抑制係藉由qPCR方法測定，siRNA係例如10nM濃度，於其中提供之適宜生物體細胞系中進行。於較佳之具體實施例中，體內表現之抑制係藉由敲落表現人類基因之內齒動物(例如，表現人類標靶基因之小鼠或經AAV轉染之小鼠)體內之人類基因而測定，例如，當在RNA表現之最低點投予3mg/kg之單一劑量時。肝臟中之RNA表現係使用PCR方法測定。
dsRNA包括兩個RNA股，在該dsRNA將被使用之條件下，該兩股互補並雜交以形成雙螺旋結構。dsRNA之一股(反義股)包括互補區域，該互補區域與標靶序列實質上互補且通常完全互補。標靶序列可源自在HAO1基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(正義股)包括一區域，該區域與該反義股互補，使得當在適宜條件下組合時，兩股雜交並形成雙螺旋結構。如本文中他處所述，相對於位在各自獨立之複數寡核苷酸上，dsRNA之互補序列亦可包含單一個核酸分子上自我互補的區域。
於一些具體實施例中，該dsRNA劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，其中該正義股包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中任一者之核苷酸序列相異不超過1、2或3個核苷酸之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含與SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中任一者之核苷酸序列相異不超過1、2或3個核苷酸之至少15個接續核苷酸。
通常，該雙螺旋區域係19至30個鹼基對之長度。同樣，與標靶序列互補之區域係19至30個核苷酸之長度。
於一些具體實施例中，該dsRNA係約19至約23個核苷酸之長度，或約25至約30個核苷酸之長度。通常，該dsRNA足夠長，以用作切丁酶之受質。舉例而言，該領域中習知，長度超過約21至23個核苷酸之dsRNA可用作切丁酶之受質。具有該領域通常知識者亦應認知，作為裂解標靶之RNA區域最通常係較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。當有關時，mRNA標靶之「一部分」係mRNA標靶之接續序列，其長度足以令其作為RNAi所引導之裂解(亦即，透過RISC途徑裂解)的受質。
熟識該領域者亦應認知，雙螺旋區域係dsRNA之主要功能性部分，例如，約19至約30個鹼基對，例如，約19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對之雙螺旋區域。因此，於一個具體實施例中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之所欲RNA為靶向之官能性雙螺旋的程度而言，具有超過30個鹼基對之RNA分子或RNA分子之複合體係dsRNA。因此，具有通常知識之技術人員將認知，於一個具體實施例中，miRNA為dsRNA。於另一具體實施例中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一 具體實施例中，可用於以HAO1基因之表現為靶向之iRNA劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在靶標細胞內生成。
本文中所述之dsRNA可復包括一個或多個具有例如1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3或4個核苷酸之單股核苷酸懸垂。相對於其鈍端之對應物，具有至少一個核苷酸懸垂之dsRNA能具有傑出之抑制特性。核苷酸懸垂可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。懸垂可位於正義股上、反義股上或其任意組合上。此外，懸垂之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或正義股之5’末端、3’末端或兩端。
懸垂可係一股比另一股長之結果，或係相同長度之兩股交錯之結果。懸垂可形成與標靶mRNA之錯配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。第一股與第二股亦可藉由例如額外之鹼基結合以形成髮夾，或藉由其他非鹼基鏈結子接合。
於一個具體實施例中，該RNAi劑之懸垂區域中之核苷酸可各自獨立地為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於，2’-糖修飾，例如，2-F、2’-O-甲基胸苷(T)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2`-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2`-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任意組合。舉例而言，TT可係任一股上任一端之懸垂序列。懸垂可形成與標靶mRNA之錯配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。
位於該RNAi劑之正義股、反義股或兩個之5’懸垂或3’懸垂可經磷酸化。於一些具體實施例中，該懸垂區域含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中該兩個核苷酸可係相同或相異的。於 一個具體實施例中，該懸垂存在於正義股、反義股或兩股之3’末端。於一個具體實施例中，這一3’懸垂存在於反義股中。於一個具體實施例中，這一3’懸垂存在於正義股中。
該RNAi劑可僅含有單個懸垂，該懸垂可強化該RNAi劑之干擾活性而不影響其整體穩定性。舉例而言，該單股懸垂可位於正義股之3’末端，或者位於反義股之3’末端。該RNAi劑亦可具有鈍端，位於反義股之5’末端(或正義股之3’末端)，反之亦然。通常，該RNAi之反義股具有位於3’末端之核苷酸懸垂，且5’端係鈍端。儘管不欲受縛於理論，但位於反義股5’末端之不對稱鈍端以及反義股之3’末端懸垂有助於將導引股裝載至RISC製程中。
於一些具體實施例中，用於本發明之方法中的雙股RNAi劑未經修飾。於其他具體實施例中，用於本發明之方法中的雙股RNAi劑經修飾，例如，包含能夠抑制標靶基因(亦即，HAO1基因)在活體內之表現的化學修飾。
如下文中更詳細揭示者，於本發明之某些方面，本發明之iRNA的基本上全部核苷酸經修飾。於本發明之其他具體實施例中，本發明之iRNA之全部核苷酸皆係經修飾者。本發明之其「基本上全部核苷酸經修飾」的iRNA大多數並非全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
本發明提出之核酸中之任一者，例如，RNAi，可藉由該領域中良好構建之方法合成及/或修飾，該方法為例如彼等於《現代核酸化學技術》(「Current protocols in nucleic acid chemistry」,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中揭示者，該文獻藉由引用而併入本文。修飾包括，舉例而言，末端修飾，例如，5’末端修飾(磷醯化、接合、反向鏈結)或3’末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，置換為穩定化鹼基、去穩定化鹼基、或與同伴之拓展物進行鹼基配對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或複合鹼基；糖修飾(例如，在2’-位置或4’-位置)或糖之置換；及/或骨幹修飾，包括磷酸二酯類鏈結之修飾或置換。可用於本文所述具體實施例中之iRNA化合物之具體實例係包括，但不限於，含有經修飾之骨幹或不含天然核苷酸間鏈結之RNA。具有經修飾之骨幹的RNA除此之外亦包括彼等在骨幹中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，且如該領域中有時參照者，在其核苷酸間骨幹中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。於一些具體實施例中，經修飾之RNA將在其核苷酸間骨幹中具有磷原子。
經修飾之RNA骨幹包括，舉例而言，具有正常3’-5’鏈結之硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3’-伸烷基磷酸酯類及手性磷酸酯類之甲基及其他烷基磷酸酯類、膦酸酯類、包括3’-胺基磷醯胺化物及胺基烷基磷醯胺化物之磷醯胺化物、硫羰基磷醯胺化物類、硫羰基烷基磷酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及硼磷酸酯類；此等之2’-5’鏈結類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰至核苷單元對係將3’-5’鏈接至5’-3’或將2’-5’鏈接至5’-2’。亦可包括多種鹽類、混合鹽類及游離酸形式。
教示上述含磷鏈結之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243 號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第7,273,933號、第7,321,029號、及美國再公告專利第39464號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾之RNA骨幹具有藉由短鏈烷基或環烷基類核苷酸間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷酸間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷酸間鏈結形成的骨幹。此等包括彼等具有嗎啉基鏈結(部分地由核苷至糖部分形成)；矽氧烷骨幹；硫醚、亞碸及碸骨幹；甲醯基及硫代甲醯基骨幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨幹；含有伸烷基之骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨幹；磺酸酯及磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；以及其他具有混合之N、O、S及CH2組分部分者。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134 號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號、及第5,677,439號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
於其他具體實施例中，適宜之RNA模擬物係考慮用於iRNA中，其中該核苷酸單元之糖以及核苷酸間鏈結(即骨幹)經置換為新穎基團。鹼基單元係保留與適宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物，指代為肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖骨幹替換為含有醯胺之骨幹，尤其是胺基乙基甘油骨幹。核酸鹼基得以保留，且直接或間接地鍵結至骨幹之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。適用於本發明之iRNA中之額外之PNA化合物揭示於，舉例而言，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本發明提出之一些具體實施例包括具有硫代磷酸酯骨幹之RNA以及具有雜原子管之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨幹]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯骨幹表示為--O--P--O--CH2--]，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺骨幹。 於一些具體實施例中，本文提出之RNA具有上文引用之美國專利第5,034,506號的嗎啉基骨幹結構。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分。本文提出之iRNA如dsRNA可包括位於2’位置之下述之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。例示性之適宜修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m係從1至約10。於其他具體實施例中，dsRNA包括位於2’位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善iRNA之藥物動力學特性之基團、或用於改善iRNA之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些具體實施例中，該修飾包括2’-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基基團。另一例示性修飾為2'-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，亦稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(該領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。類似之修飾亦可在iRNA之RNA上之其他位置作成，尤其是3’端核苷酸上之糖的3’位置或2'-5’鏈結之dsRNA中以及5’端核苷酸之5’位置。iRNA亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模擬物如環丁基部分。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號、及第5,700,920號，此等中之某些為本案所共有。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
iRNA亦可包括核酸鹼基(該領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，諸如去氧-胸腺嘧啶(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤； 5-鹵尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於《生物化學、生物技術及醫藥中之經修飾之核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008)中者；彼等揭露於《聚合物科學及工程之簡明百科》(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990)中者；此等由Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及應用》第15章第289至302頁(Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993)揭露者。此等核酸鹼基中之某些尤其可用於增加本發明提出之寡聚化合物的結合親和性。此等包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及O-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代業經顯示將核酸雙螺旋穩定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且係示例性之鹼基取代，尤其是當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾合用時尤甚。
教示某些上述經修飾之核酸鹼基以及其他經修飾之核酸鹼基的代表性美國專利包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066 號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
iRNA之RNA亦可經修飾，以包括一個或多個鎖核酸(LNA)。鎖核酸係具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2’碳與4’碳之外接橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3’-環內結構之構形。將鎖核酸加至siRNA中業經顯示增加血清中siRNA穩定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
教示鎖核酸核苷酸之製備的代表性美國專利包括但不限於下列者：美國專利第6,268,490號、第6,670,461號、第6,794,499號、第6,998,484號、第7,053,207號、第7,084,125號、及第7,399,845號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
對RNA分子之末端的潛在穩定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2'-0-去氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷- 3"-磷酸酯、反向鹼基dT(idT)等。這一修飾之揭露可見於PCT申請第WO 2011/005861號中。
A.本發明之包含模體的經修飾之iRNA
於本發明之某些態樣中，本發明之雙股RNAi劑包括具有如例如2011年11月18日遞交至美國臨時專利申請第61/561,710號中、或者2012年11月16日遞交之PCT/US2012/065691並公佈為WO2013075035 A1中所揭露之化學修飾的劑，該等申請各自之整體內容藉由引用併入本文。
如本文及臨時申請第61/561,710號中所示，藉由將一個或多個位於三個接續核苷酸上之三個相同修飾的模體(motif)引入RNAi劑之正義股及/或反義股中，尤其在裂解位點處或鄰近裂解位點處，可獲得傑出之結果。於一些具體實施例中，RNAi劑之正義股及反義股可以其他方式完全修飾。此等模體之引入中斷正義股及/或反義股之修飾模式(若存在)。RNAi劑可視需要與GalNAc衍生物配體例如於正義股上結合。所得RNAi劑呈現傑出之基因緘默化活性。
更詳而言，業經令人驚奇地發現，當雙股RNAi劑之正義股及反義股經修飾以在RNAi劑之至少一股的裂解位點處或鄰近裂解位點處具有一個或多個位於三個接續核苷酸上之三個相同修飾的模體時，RNAi劑之基因緘默化活性得以顯著增強。
於一個具體實施例中，該RNAi劑為19個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5’末端計數第7、8、9位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’末 端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於另一具體實施例中，該RNAi劑為20個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5’末端計數第8、9、10位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於又一具體實施例中，該RNAi劑為21個核苷酸長度之雙鈍端者，其中正義股含有至少一個位於從5’末端計數第9、10、11位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-F修飾的模體。反義股含有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-O-甲基修飾的模體。
於一個具體實施例中，該RNAi劑包含21個核苷酸之正義股及23個核苷酸之反義股，其中，該正義股含有至少一個位於從5’末端計數第9、10、11位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-F修飾的模體；該反義股含有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-O-甲基修飾的模體，其中，該RNAi劑之一端為鈍端而另一端包含具有2個核苷酸之懸垂。較佳地，具有2個核苷酸之懸垂位於反義股之3’末端。當具有2個核苷酸之懸垂位於反義股之3’末端時，在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中，該三個核苷酸中之兩者為懸垂核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該懸垂核苷酸之下一個核苷酸配對。於一個具體實施例中，RNAi劑在正義股之5’末端及反義 股之5’末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。於一個具體實施例中，該RNAi劑之正義股及反義股中之每一個核苷酸，包括作為該等模體之一部分的核苷酸，皆為經修飾之核苷酸。於一個具體實施例中，每一殘基獨立經2’-O-甲基或3’-氟以例如交替模體方式修飾。視需要，該RNAi劑復包含配體(較佳為GalNAc3)。
於一個具體實施例中，RNAi劑包含正義股及反義股，其中，該RNAi劑包含具有至少25個且至多29個核苷酸之長度的第一股，以及具有至多30個核苷酸之長度且具有至少一個位於從5’末端計數第11、12、13位置處之三個接續核苷酸上之三個2’-O-甲基修飾之模體的第二股；其中，該第一股之3’末端及該第二股之5’末端形成鈍端，且該第二股於其3’末端比該第一股長1至4個核苷酸，其中，該雙螺旋區域之長度為至少25個核苷酸，且該第二股在沿著該第二股長度之至少19個核苷酸上與標靶RNA充分互補，以在當將該RNAi劑引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現，以及，其中，該RNAi劑之切丁酶裂解優先得到包含該第二股之3’末端的siRNA，從而降低該哺乳動物體內之標靶基因的表現。視需要，RNAi劑復包含配體。
於一個具體實施例中，該RNAi劑之正義股含有至少一個位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體，其中，該等模體之一者出現在正義股之裂解位點處。
於一個具體實施例中，RNAi劑之反義股亦可含有至少一個位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體，其中，該等模體之一者出現在反義股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。
對於具有17至23個核苷酸之長度之雙螺旋區域的RNAi劑，該反義股之裂解位點典型位於從5’末端計數之位置10、11、12附近。因此，該等三個一致修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11，位置10、11、12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，從該反義股之5’末端的第一個核苷酸開始計數，或在該雙螺旋區域內從該反義股之5’末端的第一個配對核苷酸開始計數。反義股之裂解位點亦可根據該RNAi之雙螺旋區域從5’末端計數的長度而改變。
RNAi劑之正義股可含有至少一個位於該股之裂解位點處之三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體；且反義股可具有至少一個位於該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體。當正義股及反義股形成dsRNA雙螺旋時，正義股及反義股可經比對，使得位於正義股上之一個三核苷酸模體與位於反義股上之一個三核苷酸模體具有至少一個核苷酸重疊，亦即，正義股中模體之三個核苷酸之至少一者與反義股中模體之三個核苷酸之至少一者鹼基配對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
於一個具體實施例中，RNAi劑之正義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體。第一模體可出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處，且其他模體可係側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」指代出現在該股之另一部位的與位於相同股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之模體分隔開來的模體。側翼修飾或與第一模體相鄰或藉由至少一個或多個核苷酸與第一模體分隔開來。當模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性彼此截然不同；而當模體藉由一個或多個核苷酸分隔開來時， 則該等化學性可相同或相異。可存在兩個或多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，每一側翼修飾可出現在位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之第一模體的一段，或出現在該前導模體之任一側。
與正義股相似，該RNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體，且該等模體之至少一者係出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。這一反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該側翼修飾之排列類似於可能存在於該正義股上之側翼修飾。
於一個具體實施例中，RNAi劑之正義股或反義股上之側翼修飾典型不包括位於該股之3’末端、5’末端或兩端之最開始的一個或兩個末端核苷酸。
於另一具體實施例中，RNAi劑之正義股或反義股上之側翼修飾典型不包括位於該雙螺旋區域內該股之3’末端、5’末端或兩端之最開始的一個或兩個配對核苷酸。
當RNAi劑之正義股及反義股各自含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落入該雙螺旋區域之相同末端上，且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
當該RNAi劑之正義股及反義股各自含有至少兩個側翼修飾時，該正義股與該反義股可經比對而使得來自一股之兩個修飾之個者落入該雙螺旋區域之一端上且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；來自一股之兩個修飾之各者落入該雙螺旋區域之另一端上且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；一股之兩個修飾分別落入該前導模體之兩端上且在該雙螺旋區域內具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
於一個具體實施例中，該RNAi劑之正義股及反義股中之每一個核苷酸，包括作為該等模體之一部分的核苷酸，可係經修飾。每一核苷酸可藉由相同或相異之修飾而經修飾，該等修飾可包括非鏈結性磷酸酯氧之一者或兩者及/或鏈結性磷酸酯氧之一者或多者的一個或多個變更；核糖之構建的變更，如核糖上2-羥基之變更；以“去磷”鏈結子進行之磷酸酯部分的整體置換；天然出現之鹼基的修飾或置換；以及核糖-磷酸酯骨幹的置換或修飾。
由於核酸係子單元之聚合物，多數修飾出現在核酸內重複之位置，如，鹼基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鏈結性O的修飾。於一些情形中，該修飾將出現在該核酸之所有受試位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3’或5’端位置，可僅出現在末端區域，例如，出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內。修飾可出現在雙股區域內、單股區域內、或兩者內。修飾可僅出現在RNA之雙股區域內，或僅出現在RNA之單股區域內。例如，位於非鏈結性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一端或兩端；可僅出現在末端區域，例如出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內；或可出現在雙股區域及單股區域內，尤其是在末端。一個或多個5’末端可經磷酸化。
下述係可能者，例如，提升穩定性，在懸垂中包括特定之鹼基，或在單股懸垂如5’懸垂或3’懸垂或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在懸垂中包括嘌呤核苷酸。於一些具體實施例中，3’或5’懸垂中之全部或一些鹼基可經修飾，例如，具有本文所述 之修飾。修飾可包括，例如，使用在核糖之2’位置具有該領域中已知之修飾者，如使用去氧核糖核苷酸，使用2’-去氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修飾者替代核酸鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾如硫代磷酸酯修飾。懸垂無需與標靶序列同源。
於一個具體實施例中，該正義股及反義股之每一殘基獨立地經LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-去氧、2’-羥基或2’-氟修飾。該股可含有超過一個修飾。於一個具體實施例中，正義股及反義股之每一殘基獨立地經2’-O-甲基或2’-氟修飾。
至少兩個相異之修飾典型存在於正義股及反義股上。彼等兩個修飾可以為2’-O-甲基或2’-氟修飾等。
於一個具體實施例中，Na及/或Nb包含交替模式之修飾。如本文中所用，術語「交替模體」指代具有一個或多個修飾之模體，每一修飾出現在一股之交替核苷酸上。交替核苷酸可指代每兩個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可係「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」或「ABCABCABCABC…」等。
交替模體中含有之修飾的類型可係相同或相異的。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體亦即每兩個核苷酸上之修飾可係相同，但正義股或反義股可各自選自交替模體如 「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」或「CDCDCD…」等中修飾之若干可能性。
於一個具體實施例中，本發明之RNAi劑包含，該正義股上之交替模體的修飾模式相對於該反義股上之交替模體的修飾模式位移。該位移可使得正義股上之核苷酸的修飾基團與反義股之核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當正義股與反義股在dsRNA雙螺旋中鹼基配對時，在該雙螺旋區域內，該正義股中之交替模體可始於該股之5’-3’之“ABABAB”，且該反義股中之交替模體可始於該股之5’-3’之“BABABA”。作為另一實例，在雙螺旋區域內，正義股中之交替模體可始於該股之5’-3’之「AABBAABB」，且反義股中之交替模體可始於該股之5’-3’之「BBAABBAA」，因此正義股與反義股之間存在修飾模式之完全或部分位移。
於一個具體實施例中，該RNAi劑包含位於正義股上之2'-O-甲基修飾與2'-F修飾起始之交替模體之模式，該模式具有相對於位於反義股上之2'-O-甲基修飾與2'-F修飾起始之交替模體之模式的位移，亦即，正義股鹼基對上之2'-O-甲基修飾之核苷酸與反義股上之2'-F修飾之核苷酸進行鹼基配對，反之亦然。正義股之位置1可始於該2'-F修飾，且反義股之位置1可始於該2'-O-甲基修飾。
將一個或多個位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體引入該正義股及/或反義股中，中斷該正義股及/或反義股中存在之初始修飾模式。藉由將一個或多個位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體 引入該正義股及/或反義股中而中斷該正義股及/或反義股的修飾模式，係出乎意料地提升了對於靶標基因之基因緘默化活性。
於一個具體實施例中，當將位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體引入任一股中時，位於該模體之下一個核苷酸上的修飾為與該模體之修飾不同的修飾。例如，含有該模體之序列部位為「…NaYYYNb…」，其中，「Y」表示位於三個接續核苷酸上之三個一致修飾的模體，且「Na」及「Nb」表示位於模體「YYY」之下一個核苷酸上的不同於Y修飾之修飾，且其中Na與Nb可以為相同或相異之修飾。或者，當存在側翼修飾時，Na及/或Nb可存在或不存在。
該RNAi劑可復包含至少一個硫代磷酸酯或甲基硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。該硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸間鏈結修飾可出現在正義股或反義股或兩股之位於該股任意位置之任意核苷酸上。例如，該核苷酸間鏈結修飾可出現在正義股及/或反義股之每一個核苷酸上；每一核苷酸間鏈結修飾可以交替模式出現在正義股及/或反義股上；或正義股或反義股可含有交替模式之兩種核苷酸間鏈結修飾。正義股上之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可與反義股相同或相異，其正義股上之交替模式之核苷酸間鏈結修飾可具有相對於反義股上之交替模式之核苷酸間鏈結修飾的位移。
於一個具體實施例中，該RNAi包含位於懸垂區域內之硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸間鏈結修飾。例如，懸垂區域可含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸間鏈結。核苷酸間鏈結修飾亦可作成以將懸垂核苷酸與雙螺旋區域內之末端配對核苷酸鏈結。例如，至少2、3、4或全部懸垂核苷酸可透過硫代磷酸酯或甲基膦 酸酯核苷酸間鏈結而鏈結，且視需要，可存在將懸垂核苷酸與作為該懸垂核苷酸之下一個成對核苷酸鏈結的額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。例如，在末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者為懸垂核苷酸，且第三個核苷酸為緊鄰該懸垂核苷酸之配對核苷酸。此等末端核苷酸可位於反義股之3’末端、正義股之3’末端、反義股之5’末端、及/或正義股之5’末端。
於一個具體實施例中，2個核苷酸之懸垂位於反義股之3’末端，且在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯核苷酸間鏈結，其中該三個核苷酸中之兩者為該懸垂核苷酸，且第三個核苷酸為緊鄰該懸垂核苷酸之配對核苷酸。視需要地，該RNAi劑可在正義股之5’末端及反義股之5’末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於一個具體實施例中，RNAi劑包含與標靶之錯配、雙螺旋中之錯配、或其組合。錯配可出現在懸垂區域內或雙螺旋區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之關聯或解離之自由能，自由能為基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I為肌苷)。錯配如非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括通用鹼基之配對優於規範配對。
於一個具體實施例中，RNAi劑包含，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’末端計數最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者 係選自下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及錯配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括通用鹼基之配對，以促進反義股於該雙螺旋之5’末端的解離。
於一個具體實施例中，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’末端計數之第1個位置處的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT所組成之群組。或者，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’末端計數最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者為AU鹼基對。例如，位於該雙螺旋區域內之反義股中從5’末端計數之第一個鹼基對為AU鹼基對。
於一個具體實施例中，正義股序列可由式(I)表示：
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i及j各自獨立地為0或1；
p及q各自獨立地為0-6；
Na各自獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
Nb各自獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
np與nq各自獨立地表示懸垂核苷酸；
其中，Nb及Y不具有相同之修飾；以及
XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸上之三個相同修飾的模體。較佳地，YYY全部為2’-F修飾之核苷酸。
於一個具體實施例中，Na及/或Nb包含交替模式之修飾。
於一個具體實施例中，YYY模體出現於該正義股之裂解位點。例如，當該RNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙螺旋區域時，該YYY模體可出現於該正義股之裂解位或其鄰近處(例如，可出現於位置6、7、8處；7、8、9處；9、10、11處；10、11、12處；或11、12、13處)，從5’末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5’末端之雙螺旋區域內第一個配對核苷酸開始計數。
於一個具體實施例中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i及j兩者皆為1。正義股可因此藉由下列式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當該正義股由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na可各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該正義股由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na可各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該正義股由式(Id)表示時，Nb各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較 佳地，Nb為0、1、2、3、4、5或6。Na可各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z各自可彼此相同或相異。
於其他具體實施例中，i為0且j為0，且正義股可藉由下式表示：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當正義股由式(Ia)表示時，Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
於一個具體實施例中，RNAi之反正義股序列可由式(II)表示：
5' nq’-Na'-(Z’Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
其中：
k及l各自獨立地為0或1；
p’及q’各自獨立地為0至6；
Na’各自獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
Nb’各自獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
np’與nq’各自獨立地表示懸垂核苷酸；
其中，Nb’及Y’不具有相同之修飾；
以及
X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸上之三個相同修飾的模體。
於一個具體實施例中，Na’及/或Nb’包含交替模式之修飾。
於一個具體實施例中，Y’Y’Y’模體出現於反義股之裂解位點處。例如，當該RNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙螺旋區域時，該Y’Y’Y’模體出現於該反義股之位置9、10、11處；10、11、12處；11、12、13處；12、13、14處：或13、14、15處，從5’末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5’末端之雙螺旋區域內第一個配對核苷酸開始計數。較佳地，Y’Y’Y’模體出現於位置11、12、13處。
於一個具體實施例中，Y’Y’Y’模體全部為2’-OMe修飾之核苷酸。
於一個具體實施例中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l兩者皆為1。
反義股可因此藉由下列式表示：
5' nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np’3' (IIb)；
5' nq’-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np’3' (IIc)；或
5' nq’-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np’3' (IId)。
當該反義股由式(IIb)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na’各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該反義股表示為式(IIc)時，Nb’表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na’各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該反義股表示為式(IId)時，Nb’各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na’各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。較佳地，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
於其他具體實施例中，k為0且l為0，且反義股可藉由下式表示：
5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3' (Ia)。
當反義股表示為式(Ia)時，Na’各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’及Z’各自可彼此相同或相異。
正義股及反義股之每一核苷酸獨立地經LNA、HNA、CeNA、2’-己氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羥基或2’-氟修飾。例如，正義股及反義股之每一核苷酸獨立地經2’-O-甲基或2’-氟修飾。特別地，X、Y、Z、X’、Y’及Z’可各自表示2’-O-甲基修飾或2’-F修飾。
於一個具體實施例中，當雙螺旋區域為21個核苷酸(nt)時，該RNAi劑之正義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY模體，從5’末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙螺旋區域內從5’末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y表示2’-F修飾。正義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙螺旋區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
於一個具體實施例中，反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y'Y'Y'模體，從5’末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙螺旋區域內從5’末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y'表示2’-O-甲基修飾。反義股可額外含有X’X’X’模體或Z’Z’Z’模體作為位於雙螺旋區域之相反末端的側翼修飾；以及，X’X’X’與Z’Z’Z’各自獨立地表示2’-OMe修飾或2’-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之正義股分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙螺旋。
據此，用於本發明之方法中的RNAi劑可包含正義股及反義股，每一股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙螺旋由式(III)表示：
正義：5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq3'
反義：3'np ’-Na ’-(X’X'X')k-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-(Z'Z'Z')l-Na ’-nq ’5'
(III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p'、q及q'各自獨立地為0至6；
Na及Na’各自獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，每一序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
Nb與Nb'各自獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
np’、np、nq’及nq各自可存在或不存在，且各自獨立地表示懸垂核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’及Z’Z’Z’各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸上之三個相同修飾的模體。
於一個具體實施例中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i及j兩者皆為0；或i及j兩者皆為1。於另一具體實施例中，k為0且l為0；或k為1且l為0；或k為0且l為1；或k及l兩者皆為0；或k及l兩者皆為1.
形成RNAi雙螺旋之正義股與反義股之例示性組合包括下述各式：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3’
3' np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Na ’nq ’ 5'
(IIIa)
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na ’nq ’ 5'
(IIIb)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Na ’-nq ’ 5'
(IIIc)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3' np ’-Na ’-X'X'X'-Nb ’-Y'Y'Y'-Nb ’-Z'Z'Z'-Na-nq ’ 5'
(IIId)
當RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑由式(IIIb)表示時，Nb各自獨立地表示包含1至10、1至7、1至5或1至4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑表示為式(IIIc)時，Nb、Nb’各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na各自獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當RNAi劑表示為式(IIIc)時，Nb、Nb’各自獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na及Na’各自獨立地表示包含2-20、2-15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb及Nb’各自獨立地包含交替模式之修飾。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)中之X、Y及Z各自可彼此相同或相異。
當該RNAi劑由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示時，Y核苷酸之至少一者可與Y'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。或者，Y核苷酸之至少兩者與相應之Y'核苷酸進行鹼基配對；或Y核苷酸之全部三者與相應之Y'核苷酸進行鹼基配對。
當該RNAi劑由式(IIIb)或(IIId)表示時，Z核苷酸之至少一者可與Z'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。或者，Z核苷酸之至少兩者與相應之Z'核苷酸進行鹼基配對；或Z核苷酸之全部三者與相應之Z'核苷酸進行鹼基配對。
當該RNAi劑由式(IIIc)或(IIId)表示時，X核苷酸之至少一者可與X'核苷酸之至少一者進行鹼基配對。或者，X核苷酸之至少兩者與相應之X'核苷酸進行鹼基配對；或X核苷酸之全部三者與相應之X'核苷酸進行鹼基配對。
於一個具體實施例中，Y核苷酸上之修飾不同於Y’核苷酸上之修飾，Z核苷酸上之修飾不同於Z’核苷酸上之修飾，及/或X核苷酸上之修飾不同於X’核苷酸上之修飾。
於一個具體實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'氟修飾。於另一具體實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，且np’>0，以及，至少一個np’經由硫代磷酸酯鏈結而鏈接至相鄰核苷酸。於又一具體實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'經由硫代磷酸酯鏈結而鏈接至相鄰核苷酸，以及，正義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子(下文揭示)結合至一個多個GalNAc衍生物。於另一具體實施例中，當RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np '>0，且至少一個np '經由硫代磷酸酯鏈結而鏈接至相鄰核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，正義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子結合至一個多個GalNAc衍生物。
於一個具體實施例中，當RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np '>0，且至少一個np '經由硫代磷酸酯鏈結而鏈接至相鄰核苷酸，正義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，正義股透過二價或三價分支鏈之鏈結子結合至一個多個GalNAc衍生物。
於一個具體實施例中，RNAi劑含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙螺旋的多聚物，其中該等雙螺旋藉由鏈結子連結。鏈結子可為可裂解者或不可裂解者。視需要，多聚物復包含配體。雙螺旋可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或雙螺旋可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個具體實施例中，RNAi劑含有3、4、5、6或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙螺旋的多聚物，其中該等雙螺旋藉由鏈結子連結。鏈結子可為可裂解者或不可裂解者。視需要，多聚物復包含配體。雙螺旋可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或雙螺旋可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個具體實施例中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之RNAi劑在5’末端及一個或兩個3’末端彼此鏈結，且視需要結合至配體。該等劑可各自靶向相同基因或兩個相異基因；或該等劑可各自靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
多個出版物揭示可用於本發明之方法中的多聚RNAi劑。此類出版物包括WO2007/091269、美國專利第7858769號、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。
含有一個或多個碳水化合物部分至RNAi劑之複合的RNAi劑可優化該RNAi劑之一種或多種特性。於多種情形中，碳水化合物部分將附接至該RNAi劑之經修飾之子單元。例如，dsRNA劑之一個或多個核糖核苷酸子單元的核糖可替換為另一部分，如其上附接有碳水化合物配體之非碳水化合物(較佳係環狀)載劑。本文中，其子單元之核糖業經如是替換的核糖核苷酸子單元指代為核糖替換修飾子單元(RRMS)。環狀載劑可係碳環系統，亦即，所有環原子皆係碳原子；或係雜環系統，亦即，一個或多個環原子可係雜環如氮、氧、硫。環狀載劑可係單環系統，或可含有兩個或多個環如稠環。環狀載劑可係完全飽和之環系統，或其可含有一個或多個雙鍵。
配體可經由載劑附接至多核苷酸。載劑包括(i)至少一個「骨幹附接點」，較佳兩個「骨幹附接點」，以及(ii)至少一個「繫帶附接點」。如本文中所用，「骨幹附接點」指代官能基如羥基，或通常為鍵，其可用於且適用於將載劑併入核糖核酸之骨幹如磷酸酯或經修飾之磷酸酯如含硫之骨幹中。於一些具體實施例中，「繫帶附接點」(TAP)指代環狀載劑之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供骨幹附接點之原子不同)，其連結所選擇之部分。該部分可係例如碳水化合物，如單醣、二醣、三醣、四醣、寡醣及多醣。視需要，所選擇之部分藉由中介繫帶連結至所選擇之載劑。因此，環狀載劑一般將包括官能基例如胺基，或通常提供適用於將另一化學實體如配體併入或繫帶至構建環的鍵。
RNAi劑可經由載劑結合至配體，其中載劑可係環狀基團或非環狀基團；較佳地，環狀基團係選自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪 唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊環基、唑啶基、異唑啶基、嗎啉基、噻唑啉基、異噻唑啉基、喹啉基、嗒酮基、四氫呋喃基、十氫萘基；較佳地，該非環狀基團係選自絲胺醇骨幹或二乙醇胺骨幹。
於某些具體之具體實施例中，用於本發明之方法中的RNAi劑係選自由表1a、1b、2a、2b、2c、10至13及15中任一者中所列之劑所組成之群組。於一個具體實施例中，當該劑為表1中列述之劑時，該劑可缺少末端dT。
本發明復包括雙股RNAi劑，該等雙股RNAi劑包含表1或2中任一者中列述之序列中的任一者，其包含反義股上之5’磷酸酯或磷酸酯模擬物(參見，例如，PCT公佈第WO 2011005860號)。再者，本發明包括雙股RNAi劑，該等RNAi劑包含表1a、1b、2a、2b、2c、10至13及15中任一者中列述之序列中的任一者，其包括在正義股之5’末端處替代2’-OMe基團之2’-氟基團。
B.額外之模體
於某些態樣中，本文所揭示之雙股RNAi劑包含正義股及反義股，其中所述正義股及反義股包含少於十一個、十個、九個、八個、七個、六個或五個2’-去氧氟。
於某些態樣中，本文所揭示之雙股RNAi劑包含正義股及反義股，其中所述正義股及反義股包含少於十個、九個、八個、七個、六個、五個或四個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於某些態樣中，本文所揭示之雙股RNAi劑包含正義股及反義股，其中所述正義股及反義股包含少於十個2’-去氧氟及少於六個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於某些態樣中，本文所揭示之雙股RNAi劑包含正義股及反義股，其中所述正義股及反義股包含少於八個2’-去氧氟及少於六個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
於某些態樣中，本文所揭示之雙股RNAi劑包含正義股及反義股，其中所述正義股及反義股包含少於九個2’-去氧氟及少於六個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
適用於本發明之方法中之雙股RNAi劑亦提供於美國專利第10,478,500號中，其整體內容藉由引用併入本文。
V.配體
本發明之雙股RNAi劑可視需要結合至一個或多個配體。配體可於3’末端、5’末端或兩端附接至正義股、反義股或兩股。例如，配體可結合至正義股。於一些具體實施例中，配體結合至正義股之3’末端。於一個具體實施例中，該配體為GalNAc配體。於一些具體特定具體實施例中，該配體為GalNAc3。配體經由中介繫帶或直接或間接地偶聯，較佳共價偶聯。
於一些具體實施例中，配體改變其所併入之分子的分佈、靶向或壽命。於一些具體實施例中，配體提供較之於不存在此配體者增強的對於所選標靶例如分子、細胞或細胞類型、腔室、受體例如細胞或器官之 腔室、組織、器官或身體區域之親和性。提供增強的對於所選標靶之親和性的配體亦稱為靶向配體。
一些配體可具有胞內體溶解(endosomolytic)特性。胞內體溶解配體促進胞內體之裂解及/或本發明之組成物或其組分自胞內體至該細胞之細胞質的轉運。胞內體溶解配體可以為聚陰離子肽或肽模擬物，其顯示pH依賴性膜活性及促融合性。於一個具體實施例中，胞內體溶解配體假定在胞內體pH下呈其活性構形。「活性」構形為下述構形，在該構形下，胞內體溶解配體促進胞內體之裂解及/或本發明之組成物或其組分自胞內體至該細胞之細胞質的轉運。示例性胞內體溶解配體包括GALA肽(Subbaraoet al.,Biochemistry,1987,26：2964-2972)、EALA肽(Vogel et al.,J.Am.Chem.Soc.,1996,118：1581-1586)、及其等之衍生物(Turk et al.,Biochem.Biophys.Acta,2002,1559：56-68)。於一個具體實施例中，胞內體溶解組分可含有化學基團(例如，胺基酸)，該化學基團將因應於pH之變化而經歷電荷或質子化之變化。胞內體溶解組分可以為線性或分支鏈。
配體可改善轉運、雜交及特異性特性，並且亦可改善所得天然或經修飾之寡核糖核苷酸、或包含本文所揭示之單體之任意組合及/或天然或經修飾之核糖核苷酸的聚合物分子之核酸醇抗性。
通常，配體可包括治療性修飾劑，例如，以增強攝取；診斷性化合物或受體基團，例如，以監測分佈；交聯劑；以及核酸酶抗性賦予部分。通常之實例包括脂質、類固醇、維生素、糖、蛋白質、肽、聚胺基肽模擬物。
配體可包括天然出現之物質，例如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖、聚三葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精或玻尿酸)；或脂質。配體亦可係重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸(例如，適體)。聚胺基酸之實例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之實例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬性聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、或α螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其與特定之細胞類型諸如腎細胞結合。靶向基團可係促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模擬物或適體。
配體之其他實例包括染料；嵌入劑(例如，吖啶類)；交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)；卟啉類(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)； 多環芳烴(例如，啡嗪(phenazine)、二氫啡嗪(dihydrophenazine))；人工核酸內切酶或螯合劑(例如，EDTA)；親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)；以及肽結合物(例如，觸角足突變肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、統基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記之標記物、酵素、半抗原(例如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑結合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可係蛋白質例如醣蛋白、或肽例如具有對於共配體之特異親和性的分子、或抗體諸如與特定細胞類型諸如癌細胞、內皮細胞或骨細胞結合之抗體。配體亦可包括激素及激素受體。它們亦可包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖或適體。配體可係，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κB之活化劑。
配體可係例如藥物之物質，其可藉由例如擾亂細胞之細胞骨幹例如藉由擾亂細胞之微管、微絲及/或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物可係，舉例而言，泰素(taxon)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、促進微絲聚合劑(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆 環肽(phalloidin)、紅海海綿抗菌素(swinholide A)、吲達諾欣(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
舉例而言，配體可藉由活化發炎反應而增加寡核苷酸至細胞內的攝取。將會具有此效果之示例性配體包括腫瘤壞死因子α(TNFα)、介白素-1β、或γ-干擾素。
於一個態樣中，配體為脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子較佳與血清蛋白例如人血清白蛋白(HSA)結合。HSA結合配體允許該結合物分佈於標靶組織，例如非腎臟之身體標靶組織。舉例而言，標靶組織可係肝臟，包括肝臟之實質細胞。可與HSA結合之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配體可(a)增加對於結合物解之抗性，(b)增加對靶標細胞或細胞膜之靶向或輸送，及/或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配體可用以調控，例如，控制該結合物與標靶組織之結合。舉例而言，與HSA之結合強度較高之脂質或基於脂質之配體將較不可能靶向腎臟，並因此較不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配體可用來令結合物靶向腎臟。
於一個具體實施例中，該基於脂質之配體與HSA結合。較佳地，其以足夠之親和性與HSA結合，使得該結合物將較佳地分佈至非腎臟組織內。於一個具體實施例中，該親和性使得HSA-配體結合可逆。於另一具體實施例中，該基於脂質之配體與HSA之結合係弱結合或根本不結合，使得該結合物將較佳分佈至腎臟內。以腎細胞為靶標之其他部分亦可用於替換該基於脂質之配體或與該基於脂質之配體同時使用。
於另一態樣中，該配體係被標靶細胞(例如增殖細胞)攝取之部分(例如維生素)。此等尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞(如癌細胞)的非預期之細胞增殖為特徵的疾患。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，例如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被癌細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括HAS[無中文名]、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)。
於另一態樣中，配體為細胞滲透劑，較佳為螺旋細胞滲透劑。較佳地，該劑係兩親性。示例性劑為肽，例如tat或觸角足突變肽。如果該劑為肽，其可經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非肽或假肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。該螺旋劑較佳為α-螺旋劑，其較佳具有親脂相及疏脂相。
該配體可係肽或肽模擬物。肽模擬物(本文中亦指代為寡肽模擬物)為能折疊為所定義之類似於天然肽之三維結構的分子。肽或肽模擬物部分可係5-50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。肽或肽模擬物可係，舉例而言，細胞滲透肽、陽離子肽、兩親性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。肽部分可係樹枝狀肽、拘束胜肽(constrained peptide)或交聯之肽。於另一選擇中，肽部分可包括疏水性膜易位序列(membrane translocation sequence,MTS)。示例性之含有MTS的疏水性肽為具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：9)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10))亦可係靶向部分。肽部分可係「遞送性」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸、及 蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，業經發現，來自HIV Tat蛋白質之序列(GRKKRRQRRRPPQ)(SEQ ID NO：11)及來自果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO：12)能起到遞送肽之功能。肽或肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，例如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。較佳地，經由合併之單體單元繫帶至iRNA劑之肽或肽模擬物為細胞靶向肽諸如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分之長度範圍可係約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部分可具有結構性修飾，例如以增加穩定性或引導構形特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。RGD肽部分可用來靶向腫瘤細胞，諸如內皮瘤細胞或乳癌腫瘤細胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD肽可促成iRNA劑靶向各種其他組織(包括肺、腎、脾或肝)之腫瘤(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。較佳地，RGD肽將促成iRNA劑靶向腎臟。RGD肽可係線性或環狀，並且可經修飾例如糖基化或甲基化以促成靶向特定組織。舉例而言，經糖基化之RGD肽可將iRNA劑遞送至表現αVß3之腫瘤細胞(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。可以使用靶向在增殖細胞中富集之標記物的肽。舉例而言，含有RGD之肽及肽模擬物可靶向癌細胞，特別是展現整合素之細胞。因此，可使用RGD肽、含有RGD之環狀肽、包括D-胺基酸之RGD肽以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用其他以整合素配體為標靶之部分。通常，此類配體可以用來控制增殖細胞及血管生成。該類型之配體的一些結合物靶向PECAM-1、VEGF或其他癌症基因，例如，本文所揭示之癌症基因。
「細胞滲透肽」能滲透細胞例如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可係，舉例而言，α-螺旋線性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或bactenecin)、或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之肽(例如，PR-39或indolicidin)。細胞滲透肽亦可包括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透胜肽可係雙向兩親性胜肽如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41之融合胜肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
於一個具體實施例中，靶向肽可係兩親性α-螺旋肽。示例性兩親性α-螺旋肽包括但不限於，天蠶素(cecropin)、蜘蛛毒素(lycotoxin)、細胞膜毒素(paradaxin)、buforin、CPF(caerulein precursor fragment)、鈴蟾抗菌肽(bombinin)樣肽(BLP)、抗菌肽(cathelicidin)、角朊毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鰻腸道抗微生物肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽(magainine)、東北林蛙抗菌肽(brevinin)-2、蛙皮素抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒素(melittin)、美洲擬鰈抗菌肽(pleurocidin)、H2A肽、非洲爪蟾(Xenopus)肽、esculentinis-1、及caerin。較佳將慮及多種因素以維持螺旋穩定性之完整性。舉例而言，將利用最大數量之螺旋穩定化殘基(例如，leu、ala或lys)，並且將利用最小數量之螺旋去穩定化殘基(例如，脯胺酸或環狀單體單元).封端殘基將被慮及(舉例而言，Gly為示例性N-封端殘基)及/或C-末端醯胺化可用來提供額外H鍵以將螺旋穩定化。於具有相反之電荷、藉由i±3或i±4位置分隔之殘基之間形成鹽橋可提供穩定 性。舉例而言，陽離子殘基諸如離胺酸、精胺酸、高精胺酸、鳥胺酸或組胺酸可與陰離子殘基麩胺酸鹽或天冬胺酸鹽形成鹽橋。
肽及肽模擬物配體包括彼等具有天然出現或經修飾之肽者，例如，D-肽或L-肽；α、β或γ肽；N-甲基肽；氮雜肽；具有一個或多個醯胺，亦即肽鏈結來替換一個或多個脲、硫脲或磺醯基脲鏈結的肽；或環狀肽。
靶向配體可係能夠靶向特異性受體之任意配體。實例為：葉酸、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(諸如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)或適體。簇係兩個或更多個糖單元之組合。靶向配體亦包括整合素受體配體、趨化因子受體配體、運鐵蛋白、生物素、血清素受體配體、PSMA、內皮素、GCPII、體抑素、LDL及HDL配體。配體亦可基於核酸，例如，適體。適體可未經修飾或具有本文所揭露之修飾之任意組合。
胞內體釋放及包括咪唑類、聚咪唑類或寡咪唑類、PEI類、肽類、促融合肽類、聚羧酸酯類、聚陽離子類、經掩蔽之寡或聚陽離子類或陰離子類、縮醛類、聚縮醛類、縮酮類/聚縮酮類、原酸酯類、具有經掩蔽或未掩蔽之陽離子或陰離子電荷的聚合物、具有經掩蔽或未掩蔽之陽離子或陰離子電荷的樹型聚合物。
PK調節子表示藥物動力學調節子。PK調節子包括親脂質物、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、胜肽、蛋白結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節子包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經鞘脂質、萘普生、布洛芬、維生素E、 生物素等。包含大量硫代硫酸酯鏈結之寡核苷酸亦已知與血清蛋白結合，因此在骨幹中包含多個硫代磷酸酯鏈結之短寡核苷酸如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配體(例如，作為PK調節配體)而遵循本發明。
此外，與血清組分(例如，血清蛋白)結合之適體亦作為PK調節配體而適用於本發明。
其他適用於本發明之配體結合物揭示於2004年8月10日遞交之美國專利申請USSN：10/916,185、2004年9月21日遞交之USSN：10/946,873、2007年8月3日遞交之USSN：10/833,934、2005年4月27日遞交之USSN：1/115,989及2007年11月21日遞交之USSN：11/944,227中，該等申請藉由引用以其整體出於全部目的併入本文。
當存在兩個或更多個配體時，該等配體可全部具有相同特性，全部具有不同特性，或者一些配體具有相同特性而其他配體具有不同特性。舉例而言，配體可具有靶向特性，具有胞內體溶解活性，或具有PK調節特性。於一些具體實施例中，全部配體皆具有不同特性。
配體可在各種位置，舉例而言，3’末端、5’末端及/或中間位置處偶聯至寡核苷酸。於一些具體實施例中，配體經由中間繫帶，例如，本文所揭示之載劑附接至寡核苷酸。當將單體併入生長中之股內時，配體或經繫帶之配體可存在於該單體上。於一些具體實施例中，配體可經由在「前驅物」單體業經併入生長中之股內後偶聯至該「前驅物」單體而併入。舉例而言，具有例如胺基末端繫帶(亦即，不具有經締合之配體)之單體，例如，TAP-(CH2)nNH2，可併入生長中之寡核苷酸股內。於後續操作中，亦 即，在將前驅物單體併入股內後，可藉由將具有親電基團(例如，五氟苯基酯或醛基團)之配體之親電基團與該前驅物單體繫帶之親核基團偶聯而將該配體後續附接之該前驅物單體。
於另一實例中，可併入具有適用於參與Click化學反應之化學基團的單體，例如，疊氮化物或炔末端繫帶/鏈結子。於後續操作中，亦即，在將前驅物併入股內後，可藉由將互補化學基團例如炔及疊氮化物偶聯在一起而將具有該炔或疊氮化物之配體附接至前驅物單體。
於一些具體實施例中，配體可結合至核酸分子之核鹼基、糖部分或核苷間鏈結。結合至嘌呤核鹼基或其衍生物可發生在任何位置處，包括環內及環外原子處。於一些具體實施例中，嘌呤核鹼基之2、6、7或8位附接至結合物部分。結合至嘧啶核鹼基或其衍生物亦可發生在任何位置處。於一些具體實施例中，嘧啶核鹼基之2、5及6位經結合物部分取代。結合至核苷之糖部分可發生在任何碳原子處。可附接至結合物部分之糖部分之實例碳原子包括2’、3'及5’碳原子。1’位亦可附接至結合物部分，諸如在無鹼基殘基中。核苷酸間鏈結亦可帶有結合物部分。對於含磷之鏈結(例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、胺基磷酸酯等)，該結合物部分可直接附接至磷原子或附接至與磷原子鍵合之O、N或S原子。對於含胺或醯胺至核苷間鏈結(例如，PNA)，該結合物部分可附接至胺或醯胺之氮原子或附接至相鄰碳原子。
於一些具體實施例中，靶向HAO1基因之siRNA結合至碳水化合物，例如，單醣(諸如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、多醣。於一些具體實施例中，siRNA結合至N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)配體。其在皮下 投予之後增強至幹細胞之有效遞送。將碳水化合物例如N-乙醯基半乳胺糖結合至例如siRNA之方法係本領域熟練人士所習知者。實例可見於US8,106,022及WO2014/025805中。
於一些具體實施例中，靶向HAO1基因之siRNA經由鏈結子結合至配體，例如，結合至GalNac。舉例而言，配體可係透過二價或三價分支鏈之鏈結子附接的一個或多個GalNAc(N-乙醯基半乳胺糖)衍生物。
於一個具體實施例中，本發明之dsRNA結合至二價及三級分支鏈之鏈結子，包括式(IV)至(VII)中任一者所示之結構：
Figure 110144852-A0202-12-0125-6
Figure 110144852-A0202-12-0125-7
Figure 110144852-A0202-12-0125-8
或
Figure 110144852-A0202-12-0126-9
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時獨立地表示0至20，並且其中該重複單元可相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C於每次出現時獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時獨立地為不存在、伸烷基、經取代之伸烷基(其中，一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或封端)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 110144852-A0202-12-0126-10
、
Figure 110144852-A0202-12-0126-11
、
Figure 110144852-A0202-12-0126-12
、
Figure 110144852-A0202-12-0126-13
、
Figure 110144852-A0202-12-0126-14
或雜環基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配體，亦即，於每次出現時各自獨立地為單醣(諸如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣、或多醣；且
Ra為H或胺基酸側鏈。
三價結合GalNAc衍生物尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制標靶基因之表現，諸如式(VII)之彼等：
Figure 110144852-A0202-12-0127-15
其中L5A、L5B及L5C表示單醣，諸如GalNAc衍生物。
合適之結合GalNAc衍生物之二價及三價分支鏈之鏈結子的實例包括但不限於，下列化合物：
Figure 110144852-A0202-12-0127-16
Figure 110144852-A0202-12-0128-17
Figure 110144852-A0202-12-0128-18
Figure 110144852-A0202-12-0128-19
Figure 110144852-A0202-12-0128-20
Figure 110144852-A0202-12-0129-21
Figure 110144852-A0202-12-0129-22
Figure 110144852-A0202-12-0129-23
Figure 110144852-A0202-12-0129-24
Figure 110144852-A0202-12-0129-25
於一些具體實施例中，該配體係選自下列中之一者：
Figure 110144852-A0202-12-0130-26
Figure 110144852-A0202-12-0130-27
Figure 110144852-A0202-12-0130-28
Figure 110144852-A0202-12-0131-29
Figure 110144852-A0202-12-0131-30
，及
Figure 110144852-A0202-12-0131-31
VI.本發明之醫藥組成物
本發明亦包括用於本發明之方法中的包括本發明之iRNA的藥物組成物及製劑。於一具體實施例中，本文提供含有如本文所揭示之iRNA以及藥學可接受之載劑的藥物組成物。含有iRNA之醫藥組成物可用於治療原發性高草酸鹽尿症。此等醫藥組成物係基於遞送模式而配製。
包含本發明之RNAi劑的藥物組成物可係，舉例而言，具有或不具有緩衝性之溶液，或含有藥學上可接受之載劑的組成物。此類組成 物包括，舉例而言，水性或晶體性組成物、脂質體製劑、微胞製劑、乳液、及基因治療載體。
於本發明之方法中，RNAi劑可於溶液中投予。自由之RNAi劑可於非緩衝溶液例如鹽水或水中投予。另選地，自由之siRNA亦可於合適之緩衝溶液中投予。緩衝溶液可包含醋酸鹽、枸櫞酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。於一個具體實施例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有RNAi劑之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其適用於投予受試者。
於一些具體實施例中，緩衝溶液復包含控制溶液滲透性之劑，使得滲透性保持為所欲之值，例如，人類血漿之生理學值。可加至緩衝溶液中以控制滲透性之溶質包括但不限於，蛋白質、胜肽、胺基酸、非代謝性聚合物、維生素、離子、糖、代謝物、有機酸、脂質或鹽。於一些具體實施例中，控制溶液滲透性之劑係鹽。於某些具體實施例中，控制溶液滲透性之劑係氯化鈉或氯化鉀。
於一個具體實施例中，本發明之醫藥組成物包含如本文所揭示的靶向HAO1之雙股RNAi劑，例如魯馬斯蘭，例如約94.5mg之魯馬斯蘭；注射用水，例如0.5mL；以及將pH調節至約7.0之氫氧化鈉及/或磷酸。此類醫藥組成物可係無菌及/或不含防腐劑，用於皮下投予，並且具有透明及/或無色至黃色之外觀。
於一些具體實施例中，本發明之醫藥組成物係無熱原者或非熱原性者。
本發明之醫藥組成物可以足以抑制HAO1基因表現之劑量投予。
本發明之藥物組成物可經由大量途徑投予，取決於局部治療或全身治療是否為所欲者，且取決於待治療之面積。投予可係外用(例如，藉由透皮貼劑)；肺部投予，例如藉由粉末或氣溶膠之吸入或吹入，包括藉由噴霧器；氣管內投予、鼻內投予、表皮投予及透皮投予；口服或腸道外投予。腸胃外投予包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；真皮下投予，例如經由植入裝置；或顱內投予，例如藉由腦實質內投予、鞘內投予或腦室內投予。
iRNA可以靶向特定組織諸如肝臟之方式遞送。
本發明之藥物組成物包括但不限於，溶液、乳液、及含脂質體之製劑。此等組成物可自多種組分生成，該等組分包括但不限於，預成形之液體、自乳化之固體及自乳化之半固體。
可根據醫藥工業中習知之傳統技術，製備本發明之可便利地以單位劑型存在的醫藥製劑。此類技術包括將活性成分與醫藥載劑或賦形劑帶至聯合之步驟。通常，該等製劑係藉由將活性成分與液體載劑或精細分切之固體載劑或兩者均勻且緊密地帶至聯合而製備，隨後，若必要，令產物成形。
本發明之組成物可配製為多種可能劑型之任一者，諸如但不限於，片劑、膠囊劑、軟膠囊劑、液體糖漿劑、軟膠劑、栓劑、及灌腸劑。本發明之組成物亦可配製為處於水性、非水性或混合介質中的懸浮液。水 性懸浮液可復含有增加該懸浮液黏度之物質，該物質包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
本發明之組成物可經配製用於口服投予、腸道外投予、實質內投予(至腦內)、鞘內腔投予、心室內或肝內投予、及/或外用投予。
用於口服投予之組成物及製劑包括粉末劑或顆粒劑、微粒劑、奈米顆粒劑、水中或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊劑、軟膠囊劑、袋劑、片劑、或小片劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可係所欲者。於一些具體實施例中，口服製劑係下述之彼等，其中本文提出之dsRNA係於一種或多種滲透增強劑界面活性劑及螯合劑協同投予。適宜之界面活性劑包括脂肪酸類及/或其酯類或鹽類、膽汁酸類及/或其鹽類。合適之膽汁酸類/膽汁酸鹽類包括鵝去氧膽酸(CDCA)及烏索去氧鵝去氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、糖膽酸、甘膽酸、甘胺去氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉及甘胺二氫褐黴酸鈉。合適之脂肪酸類包括花生四烯酸、十一碳酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽(例如，鈉鹽)。於一些具體實施例中，使用滲透增強劑之組合，舉例而言，脂肪酸類/脂肪酸鹽類與膽汁酸/膽汁酸鹽類之組合。一種示例性之組合係月桂酸之鈉鹽、癸酸及UDCA。其他滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發明提出之dsRNA可作為包括噴霧乾燥顆粒在內之顆粒劑形式或錯合形成微粒或奈米顆粒而經口輸送。 dsRNA錯合劑包括聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧雜環丁烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；陽離子化之明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙烯醇(PEG)及澱粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生之聚亞胺、支鏈澱粉、纖維素及澱粉。合適之錯合劑包括幾丁聚醣、N-三甲基幾丁聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺酸、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如，對-胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-丙烯酸甲酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-聚葡萄糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸鹽、及聚乙二醇(PEG)。dsRNA之口服製劑及其製備詳細揭示於美國專利第6,887,906號、美國專利公佈第20030027780號及美國專利第6,747,014號中，其各自藉由引用併入本文。
用於腸胃外、腦實質內(至腦內)、鞘內腔、心室內或肝內投予之組成物及製劑可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜之添加劑，例如但不限於，滲透增強劑、載劑化合物及其他藥學可接受之載劑或賦形劑。
用於外用投予之醫藥組成物及製劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末劑。傳統醫藥載劑、水性基質、粉末基質、油狀基質、增稠劑等可係必要者或所欲者。經塗覆之保險套、手套等亦可係有用者。適宜之外用製劑係包括下述之彼等，其中本文所提出之iRNA係與外用輸送劑如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪 酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑混合。適宜之脂質及脂質體包括中性(例如，二油醯基磷脂DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基卵磷脂DMPC、二硬脂醯基卵磷脂)、陰性(例如，二肉豆蔻醯基磷脂甘油DMPG)及陽離子性(例如，二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂乙醇胺DOTMA)。本發明提出之iRNA可封裝在脂質體內，或可與脂質體尤其是陽離子脂質體形成錯合物。或者，iRNA可與脂質尤其是陽離子脂質錯合。適宜之脂肪酸及酯類包括但不限於花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸異丙酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽)。外用製劑詳述於美國專利第6,747,014號中，其藉由引用併入本文。
A.包含膜分子組件之iRNA製劑
用於本發明之組成物及方法中之iRNA可配製為用於在膜分子組件例如脂質體或微胞中輸送。如本文中所用，術語「脂質體」指代由排列為至少一個雙層例如一個雙層或複數個雙側之兩親性脂質構成的囊泡。脂質體包括單層或多層囊泡，其具有從親脂性材料形成之膜及水性內腔。水性部分含有iRNA組成物。該親脂性材料將該水性內腔與水性外部分離，而該水性外部並不包括該iRNA組成物，但在一些實例中，可包括該iRNA組成物。脂質體係有用於將活性成分轉移並遞送至作動位點。因為脂質體膜在結構上類似於生物膜，當將脂質體投予組織時，脂質體雙層與細胞膜之雙層融合。隨著脂質體與細胞之融匯的進行，包括iRNA之內 部水性內容物被遞送至細胞內，在該處，iRNA可特異性地結合標靶RNA並可媒介RNAi。於一些情況下，脂質體亦特異性地靶向例如以將iRNA引導至特定細胞類型。
含有RNAi劑之脂質體可藉由多種方法製備之。於一個實例中，將脂質體之脂質成分溶解在洗滌劑中，使得以該脂質成分形成微胞。舉例而言，該脂質成分可係兩親性陽離子脂質或脂質複合物。該洗滌劑可具有高臨界微胞濃度且可係非離子性。示例性之洗滌劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡萄糖苷、去氧膽酸鹽、及月桂醯肌胺酸。隨後將RNAi劑製劑加入包括該脂質成分之微胞中。該脂質上之陽離子性基團與RNAi劑相互作用，並縮合在RNAi劑周圍以形成脂質體。縮合之後，例如藉由滲析移除該洗滌劑，以得到RNAi劑之脂質體性製劑。
若必要，可在縮合反應過程中，例如藉由受控添加而加入有助於縮合之載劑化合物。舉例而言，該載劑化合物可係除核酸之外的聚合物(例如，精胺或精三胺)。亦可調節pH以輔助縮合。
生產穩定之聚核苷酸輸送媒介物之方法，該方法將聚核苷酸/陽離子脂質錯合物作為遞送媒介物之結構性成分而併入，進一步揭示於例如WO 96/37194中，其整體內容藉由引用而併入本文。脂質體製劑亦可包括下列中揭示之示例性方法的一個或多個態樣：Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987；美國專利第4,897,355號；美國專利第5,171,678號；Bangham,et al.M.Mol.Biol.23：238,1965；Olson,et al.Biochim.Biophys.Acta 557：9,1979；Szoka,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194,1978；Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984；Kim,et al.Biochim.Biophys.Acta 728：339,1983；以及Fukunaga,et al.Endocrinol.115：757,1984。常用之製備其尺寸適合用作遞送媒介物之脂質聚集體的技術包括超音波處理及凍融加押出(參見，例如，Mayer,et al.Biochim.Biophys.Acta 858：161,1986)。當一致性地小(50至200nm)且相對均勻之聚集體係所欲者時，可使用微流體化(Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984)。此等方法可容易地適用於將RNAi劑製劑封裝入脂質體中。
脂質體落入兩個大類中。陽離子脂質體係荷正電之脂質體，其與荷負電之核酸分子相互作用以形成穩定之錯合物。荷正電之核酸/脂質體錯合物係結合至荷負電之細胞表面，且在胞內體中被內化。由於胞內體中之酸性pH，該脂質體被破裂，將其內容物釋放到細胞質中(Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1987,147,980-985)。
pH敏感或荷負電之脂質體係包埋入核酸而非與核酸錯合。由於核酸及脂質兩者係荷相似，相斥而非錯合物形成係產生。儘管如此，一些核酸仍被包埋入此等脂質體之水性內腔中。pH敏感之脂質體業經用來將編碼胸苷激酶基因之核酸遞送至培養物中之細胞單層。外源基因之表現係於靶標細胞中偵檢出(Zhou et al.,Journal of Controlled Release,1992,19,269-274)。
一種主要類型之脂質體性組成物包括除天然衍生之卵磷脂外之磷脂質。舉例而言，中性脂質體組成物可由二肉豆蔻醯基卵磷脂(DMPC)或二棕櫚醯基卵磷脂(DPPC)形成。陰離子性脂質體組成物通常由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油形成，而陰離子性促融合脂質體主要由二油醯基磷脂醯乙 醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質體性組成物由卵磷脂(PC)諸如，舉例而言，大豆PC及蛋PC形成。另一類型係由磷脂質及/或卵磷脂及/或膽固醇之混合物形成。
在活體外及活體內將脂質體引入細胞內之其他方法的實例係包括美國專利第5,283,185號；美國專利第5,171,678號；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,J.Biol.Chem.269：2550,1994；Nabel,Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307,1993；Nabel,Human Gene Ther.3：649,1992；Gershon,Biochem.32：7143,1993；以及Strauss EMBO J.11：417,1992。
亦業經檢查非離子性脂質體系統，尤其是包含非離子性界面活性劑及膽固醇之系統，以測定它們在將藥物遞送至皮膚中之用途。包含NovasomeTM I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTM II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體製劑係用來將環孢素-A輸送至小鼠皮膚之真皮內。結果表明，此類非離子性脂質體系統係有效促進環孢素-A沈積在皮膚之不同層內(Hu et al.S.T.P.Pharma.Sci.,1994,4(6)466)。
脂質體亦包括「立體穩定化之」脂質體，如本文中使用，該術語指代包含一種或多種空間化脂質的脂質體，當該空間化脂質被併入脂質體中時，其導致循環壽命比缺失此類空間化脂質之脂質體提升。立體穩定化之脂質體的實例係下述之彼等：其中，脂質體之形成媒介物之脂質部分中的一部分(A)係包含一種或多種糖脂質，如單唾液酸神經節苷脂GMI，或(B)係使用一種或多種親水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分予以衍生。儘 管不欲受縛於任何特定理論，於該領域中據信，至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂、或PEG衍生之脂質的立體穩定化之脂質體，此等立體穩定化之脂質體的提升之循環半衰期係源於網狀內皮系統(RES)之細胞對其之攝取減少(Allen et al.,FEBS Letters,1987,223,42；Wu et al.,Cancer Research,1993,53,3765)。
多種包含一種或多種磷脂質之脂質體係該領域中已知者。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y. Acad.Sci.,1987,507,64)報導單唾液酸神經節苷脂GM1、硫酸半乳糖腦苷脂及磷脂醯肌醇改善脂質體之血液半衰期的能力。此等發現係由Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85,6949)闡述。美國專利第4,837,028號及WO 88/04924，兩者皆授予Allen等人，揭露包含(1)鞘磷脂及(2)神經節苷脂GM1或硫酸半乳糖腦苷脂之脂質體。美國專利第5,543,152號(Webb等人)揭露包含鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯基卵磷脂之脂質體係揭露於WO 97/13499(Lim等人)中。
於一個具體實施例中，使用陽離子性脂質體。陽離子脂質體具備能融合至細胞膜之優點。儘管非陽離子脂質體不能有效地與漿膜融合，但其可在活體內被巨噬細胞攝取，且可用以將RNAi劑遞送至巨噬細胞。
脂質體之其他優勢包括：從天然磷脂質獲得之脂質體係生物相容且生物可降解者；脂質體可合併多種水及脂溶性藥物；脂質體可保護封裝在其內部腔室中之RNAi劑不被代謝及降解(Rosoff,in "Pharmaceutical Dosage Forms",Lieberman,Rieger and Banker(Eds.), 1988,volume 1,p.245)。在脂質體製劑之製備中的重要考量係脂質表面電荷、囊泡尺寸、及脂質體之水性體積。
荷正電之合成陽離子脂質，氯化N-[1-(2,3-二油醯基氧)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)，可用以形成小脂質體，該小脂質體自發與核酸反應以形成脂質-核酸錯合物，該錯合物能與組織培養細胞之細胞膜的荷負電之脂質融合，從而完成RNAi劑之遞送(參見，例如，Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987以及美國專利第4,897,355號關於DOTMA及其與DNA合用之描述)。
一種DOTMA類似物，1,2-雙(油醯基氧)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，可與磷脂質合用以形成錯合有DNA之囊泡。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)係用於將高度陰離子性核酸遞送至活體組織培養細胞內的有效之劑，該細胞包含荷正電之DOTMA脂質體，而該脂質體自發與荷負電之聚核苷酸相互作用以形成錯合物。當使用荷足夠正電之脂質體時，所得錯合物上之靜電荷亦為正。以此途徑製備之荷正電之錯合物自發地附接至荷負電之細胞表面，與漿膜融合，且有效地將官能性核酸遞送至例如組織培養細胞內。另一可商購之陽離子脂質，1,2-雙(油醯基氧)-3,3-(三甲基氨)丙烷(「DOTAP」)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)與DOTMA之不同之處在於其油醯基部分係藉由酯而非醚鏈結者。
其他報導之陽離子脂質化合物包括彼等業經複合至多種部分者，包括，舉例而言，業經複合至兩種類型之脂質之一的羧基精胺，且包括化合物如5-羧基精胺基甘胺酸十八油醯基醯胺(「DOGS」) (TransfectamTM,Promega，麥迪遜，Wisconsin)及二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺基-醯胺(「DPPES」)(參見，例如，美國專利第5,171,678號)。
另一陽離子脂質結合物包括具膽固醇之脂質衍生物(「DC-Chol」)，其業經與DOPE組合而配製在脂質體內(參見，Gao,X.and Huang,L.,Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280,1991)。脂質聚離胺酸，由複合聚離胺酸至DOPE而作成者，業經被報導其係在血清之存在下的轉染中有效(Zhou,X.et al.,Biochim.Biophys.Acta 1065：8,1991)。對於某些細胞系，據稱此等含有經結合之陽離子脂質的脂質體顯現較低之毒性且提供比含DOTMA之組成物更有效之轉染。其他可商購之陽離子脂質產物包括DMRIE及DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。其他適用於遞送寡核苷酸之陽離子脂質揭示於WO 98/39359及WO 96/37194中。
脂質體製劑尤其適用於外用投予，脂質體呈現比其他製劑優越之若干優點。此類優點包括，相對於對所投予之藥物的高度系統性吸收，副作用減少；所投予之藥物在所欲之標靶處的蓄積增加；以及，將RNAi劑投予皮膚內的能力。於一些實作中，脂質體用於將RNAi劑遞送至表皮細胞，且亦用以提升RNAi劑至真皮組織內如皮膚內之滲透。舉例而言，該脂質體可外用施加。業經有文獻報導典型之配製為脂質體的藥物至皮膚之遞送(參見，例如，Weiner et al.,Journal of Drug Targeting,1992,vol.2,405-410及du Plessis et al.,Antiviral Research,18,1992,259-265；Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,Biotechniques 6：682-690,1988；Itani,T.et al.Gene 56：267-276.1987；Nicolau,C.et al.Meth.Enz.149： 157-176,1987；Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.Meth.Enz.101：512-527,1983；Wang,C.Y.and Huang,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855,1987)。
亦業經檢查非離子性脂質體系統，尤其是包含非離子性界面活性劑及膽固醇之系統，以測定它們在將藥物遞送至皮膚中之用途。包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及Novasome II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體製劑用來將藥物遞送至小鼠皮膚之真皮內。此類具有RNAi劑之製劑可用於治療皮膚病症。
包括iRNA之脂質體可作成可高度變形者。該變形性令脂質體能夠滲透穿過小於該脂質體之平均半徑的孔。舉例而言，傳遞體係一種類型之可變形脂質體。傳遞體可藉由將表面邊緣活化劑，一般為界面活性劑，加入標準脂質體性組成物而作成。包括RNAi劑之傳遞體可藉由例如注射而在皮下遞送，以將RNAi劑遞送至皮膚之角質細胞。為了橫跨哺乳動物之總皮層，脂質囊泡必需在合適之透皮梯度的影響下穿透一系列微孔，每一微孔具有小於50nm之直徑。此外，由於脂質之特性，此等傳遞體可係自優化(調適至孔如皮膚內之孔的形狀)、自修復，且可頻繁到達其標靶而不片段化，且一般為自載荷。
適用於本發明之其他製劑揭示於下列美國臨時專利申請案中：2008年1月2日遞交之第61/018,616號、2008年1月2日遞交之第61/018,611號、2008年3月26日遞交之第61/039,748號、2008年4月22日遞交之第61/047,087號及2008年5月8日遞交之第61/051,528號。 2007年10月3日遞交之PCT申請案第PCT/US2007/080331號亦揭示適用於本發明之製劑。
傳遞體(Transferosome)係又一類型之脂質體，且係可高度變形之脂質聚集體，對於藥物輸送媒介物而言，其係有吸引力之備選。傳遞體可揭示為脂質液滴，其可變形性如此之高以至於它們能輕易地滲透穿過小於該液滴之孔。傳遞體可適應其所使用之環境，例如，它們係自優化(調適至孔如皮膚內之孔的形狀)、自修復，且可頻繁到達其標靶而不片段化，且一般係自載荷。為了製作傳遞體，可將表面邊緣活化劑，一般為界面活性劑，加入標準脂質體性組成物。傳遞體業經用以將血清白蛋白遞送至皮膚。業經顯示，傳遞體媒介之血清白蛋白的遞送與將含有血清白蛋白之溶液進行皮下注射同樣有效。
界面活性劑可廣泛用於製劑如乳液(包括微乳液)及脂質體中。對包括天然及合成者在內之多種不同類型的界面活性劑之特性進行分類及排序的最常見途徑，係藉由使用親水/親脂平衡(HLB)進行。親水性基團(亦稱為「頭部」)之天性係提供將製劑中所用之不同界面活性劑歸類的最有用手段(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果界面活性劑分子未經離子化，則其分類為非離子性界面活性劑。非離子性界面活性劑可廣泛應用於醫藥及化妝產品中，且可在廣範圍之pH下使用。通常，它們的HLB值係2至約18之範圍，取決於它們的結構。非離子性界面活性劑包括非離子性酯類如乙二醇酯類、丙二醇酯類、甘油酯類、聚甘油酯類、失水山梨醇酯類、蔗糖酯類、及經乙氧基 化之酯類。非離子性烷醇醯胺類及醚類如脂肪醇乙氧基化物、經丙氧基化之醇類、及經乙氧基化/丙氧基化之嵌段聚合物亦包括於這一類中。聚氧乙烯界面活性劑係非離子性界面活性劑類別中最常見之成員。
如果當將界面活性劑分子溶解或分散於水中時其攜帶負電荷，則該界面活性劑係分類為陰離子性。陰離子性界面活性劑包括羧酸酯類如皂類、醯基乳酸酯類、胺基酸之醯基醯胺類、硫酸之酯類如硫酸烷基酯及經乙氧基化之硫酸烷基酯、磺酸鹽類如烷基苯磺酸鹽類、醯基羥乙基磺酸鹽類、醯基酒石酸鹽類及磺基琥珀酸鹽類、及磷酸鹽類。陰離子性界面活性劑類別之最重要之成員係烷基硫酸鹽類及皂類。
如果當將界面活性劑分子溶解或分散於水中時其攜帶正電荷，則該界面活性劑係分類為陽離子性。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽類及經乙氧基化之胺類。四級銨鹽類係本類別中最常用之成員。
如果界面活性劑具有攜帶正電荷或負電荷之能力，則該界面活性劑係分類為兩性。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺類、N-烷基甜菜鹼類及磷脂類。
界面活性劑在藥物產品、製劑及乳液中之使用業經綜述(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用於本發明之方法中的iRNA亦可提供為微胞製劑。本文中，「微胞」定義為特定類型之分子組件，其中，兩性分子排列為球狀結構，使得該等分子之疏水性部分全部朝向內側，留下親水性部分與周圍之水相接觸。如果環境係疏水性，則存在逆向排列。
適用於透過跨真皮膜遞送之混合微胞製劑可藉由將siRNA組成物之水性溶液、鹼金屬之C8至C22烷基硫酸鹽、及形成微胞之化合物混合而製備。示例性之形成微胞之化合物包括卵磷脂；玻尿酸；玻尿酸、乙醇酸、乳酸的藥學可接受之鹽類；洋甘菊提取物；黃瓜提取物；亞麻油酸；次亞麻油酸；單油酸甘油酯；單油酸酯類；單月桂酸酯類；玻璃苣油；月見草油；薄荷油；三羥基側氧基膽烷基甘油及其藥學可接受之鹽類；甘油；聚甘油；離胺酸；聚離胺酸；三油酸甘油酯；聚氧乙烯醚類及其類似物；聚多卡醇烷基醚類及其類似物；鵝去氧膽酸鹽類；去氧膽酸鹽類；及其混合物。形成微胞之化合物可在加入鹼金屬之烷基硫酸鹽的同時或之後加入。為了提供較小尺寸之微胞，可使用除劇烈混合外之基本上任何種類的混合形成混合微胞。
於一種方法中，製備含有siRNA組成物及至少一種鹼金屬之烷基硫酸鹽的第一微胞組成物。隨後將該第一微胞組成物與至少三種形成微胞之化合物混合以形成混合微胞組成物。於另一方法中，藉由將siRNA組成物、鹼金屬之烷基硫酸鹽、及至少一種形成微胞之化合物混合，之後在劇烈混合下加入剩餘的形成微胞之化合物而製備。
可將苯酚及/或間甲酚加至該混合微胞組成物中，以穩定化製劑並防止細菌生長。或者，可將苯酚及/或間甲酚與形成微胞之成分一起加入。在形成該混合微胞組成物之後，亦可加入等張劑如甘油。
對於將微胞製劑作為噴霧劑遞送，可將該製劑置於氣溶膠分散器內，且該分散器填充有推進劑。該推進劑處於壓力之下，在該分散器中為液體形式。調節各成分之比率，使得水性相與推進劑相成為一體，亦 即，僅存在一相。如果存在兩相，則在例如透過計量閥分散該等成分之一部分之前搖動該分散器。所分散劑量之藥劑係由該計量閥推進為細小噴霧。
推進劑可包括含氫之氯氟碳化合物、含氫之氟碳化合物、甲醚及乙醚。於某些具體實施例中，可使用HFA 134a(1,1,1,2-四氟乙烷)。
主要成分之具體濃度可藉由相對簡單之實驗測定。對於透過口腔進行之吸收，一般所欲者係增加劑量，例如，增加為透過注射投予或透過胃腸道投予之劑量的至少兩倍或三倍。
B.脂質顆粒
本發明之iRNA，例如dsRNA，可完全封裝在脂質製劑如LNP中，或封裝在其他核酸-脂質顆粒內。
如本文中所使用，術語「LNP」指代穩定之核酸-脂質顆粒。LNP含有陽離子脂質、非陽離子脂質、及預防該顆粒聚集之脂質(例如，PEG-脂質結合物)。LNP極其有用於系統性應用，蓋因它們在靜脈內(i.v.)注射後顯現延長之循環壽命且在遠端位點(例如，物理上與投予位點分隔之位點)蓄積。LNP包括「pSPLP」，其包括經封裝之縮合劑-核酸錯合物，如PCT公佈第WO 00/03683號中所詳述。本發明之顆粒典型具有約50nm至約150nm、更典型約60nm至約130nm、更典型約70nm至約110nm、最典型約70nm至約90nm之平均直徑，且實質上無毒。此外，當本發明之核酸-脂質顆粒中存在核酸時，該核酸在水性溶液中對抗核酸酶之降解。核酸-脂質顆粒及它們的製備方法揭露於例如美國專利第5,976,567號、第5,981,501號、第6,534,484號、第6,586,410號、第6,815,432號及美國專利公佈第2010/0324120號以及PCT公佈WO 96/40964中。
於一個具體實施例中，脂質與藥物之比率(質量/質量比率)(例如，脂質與dsRNA之比率)將在約1：1至約50：1、約1：1至約25：1、約3：1至約15：1,from about 4：1至約10：1、約5：1至約9：1、或約6：1至約9：1之範圍內。上文引述之範圍之間的範圍亦視為本發明之一部分。
該陽離子脂質可係，舉例而言，N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(DDAB)、N-(I-(2,3-二油醯基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油基氧)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧)丙胺(DODMA)、1,2-二次亞麻基氧-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻基氧-N,N-三甲基胺基丙烷(DLenDMA)、1,2-二次亞麻基胺基甲醯基氧-3-三甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二次亞麻基氧-3-(二甲基胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二次亞麻基氧-3-嗎啉基丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞麻油醯基-3-三甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二次亞麻基thio-3-三甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞麻油醯基-2-亞麻油基氧-3-三甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二次亞麻基氧-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞麻油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二次亞麻基樣-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二次亞麻基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二次亞麻基側氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二次亞麻油基氧-N,N-三甲基胺基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]二氧戊環(DLin-K-DMA)或其類似物、 (3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-胺(ALN100)、4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)十二碳-2-醇(Tech G1)、或其混合物。該陽離子脂質可佔據存在於該顆粒內之總脂質的約20mol%至約50mol%或約40mol%。
於另一具體實施例中，化合物2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]二氧戊環可用以製備脂質-siRNA奈米顆粒。2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]二氧戊環之合成揭示於國際申請第PCT/US2009/061897號且公佈為WO/2010/048536中，其藉由引用併入本文。
於一個具體實施例中，該脂質-siRNA顆粒包括40%之2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]二氧戊環：10% DSPC：40%膽固醇：10% PEG-C-DOMG(莫耳百分比)，且具有63.0±20nm之粒徑及0.027之siRNA/脂質比率。
該可離子化/非陽離子性脂質可係陰離子性脂質或中性脂質，係包括但不限於，二硬脂醯基卵磷脂(DSPC)、二油醯基卵磷脂(DOPC)、二棕櫚醯基卵磷脂(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基-磷脂醯及乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基卵磷脂(POPC)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、4-(N-馬來醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸二油醯基-磷脂醯乙醇胺酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1- 硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、膽固醇、或其混合物。如果包括膽固醇，則該非陽離子脂質可佔據存在於該顆粒內之總脂質的約5mol%至約90mol%、約10mol%或約58mol%。
抑制顆粒聚集之經複合之脂質可係，舉例而言，聚乙二醇(PEG)-脂質，包括而不限於，PEG-二醯基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂質、PEG-腦醯胺(Cer)、或其混合物。該PEG-DAA複合物可係，舉例而言，PEG-二月桂基氧丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻基氧丙基(C14)、PEG-二棕櫚基氧丙基(C16)、或PEG-二硬脂基氧丙基(C18)。預防顆粒聚集之經復合之脂質可佔據存在於該顆粒內之總脂質的約0mol%至約20mol%或約2mol%。
於一些具體實施例中，該核酸-脂質顆粒復包括佔據存在於該顆粒內之總脂質的約10mol%至約60mol%或約48mol%的膽固醇。
於一個具體實施例中，類脂質ND98˙4HCl(MW 1487)(參見，2008年3月26日遞交之美國專利申請第12/056,230號，其係藉由引用併入本文)、膽固醇(Sigma-Aldrich)、及PEG-腦醯胺C16(Avanti Polar Lipids)可用以製備脂質-dsRNA奈米顆粒(例如，LNP01顆粒)。各自在乙醇中之原液可如下述者製備：ND98，133mg/ml；膽固醇，25mg/ml；PEG-腦醯胺C16，100mg/ml。隨後，將ND98、膽固醇及PEG-腦醯胺C16原液以例如42：48：10之莫耳比率合併。合併之脂質溶液可與水性dsRNA(例如，在pH 5之醋酸鈉水溶液中)混合，使得最終之乙醇濃度為約35%至45%，且最終之醋酸鈉濃度為約100至300mM。脂質-dsRNA奈米顆粒典型係在混合時自發形成。依據所欲之粒徑分佈，所得奈米顆粒混合物可透 過聚碳酸酯膜(例如，100nm截留)使用例如熱筒押出機如Lipex押出機(Northern Lipids,Inc)押出。於一些情形中，該押出步驟可省略。可藉由例如滲析或切向流過濾實施乙醇之移除及同步之緩衝劑交換。緩衝劑可交換為，舉例而言，約pH 7例如約pH 6.9、約pH 7.0、約pH 7.1、約pH 7.2、約pH 7.3、或約pH 7.4之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。LNP01製劑揭示於例如國際申請公佈第WO 2008/042973號中，其藉由引用併入本文。
其他示例性脂質-dsRNA製劑揭示於表A中。
Figure 110144852-A0202-12-0151-32
Figure 110144852-A0202-12-0152-35
Figure 110144852-A0202-12-0153-36
表A中之縮寫包括下列：DSPC：二硬脂醯基卵磷脂；DPPC：二棕櫚醯基卵磷脂；PEG-DMG：PEG-二肉桂醯基甘油(C14-PEG，或PEG- C14)(PEG，平均分子量為2000)；PEG-DSG：PEG-二桂皮基甘油(C18-PEG，或PEG-C14)(PEG，平均分子量為2000)；PEG-cDMA：PEG-胺基甲醯基-1,2-二肉癸醯基樣丙胺(PEG，平均分子量為2000)。
包含DLinDMA，亦即(1,2-二亞麻油基樣-N,N-二甲基胺基丙烷)之製劑揭示於2009年4月15日遞交之國際公佈第WO2009/127060號中，其藉由引用併入本文。
包含XTC之製劑揭示於例如2009年1月29日遞交之美國臨時專利申請第61/148,366號、2009年3月2日遞交之美國臨時專利申請第61/156,851號、2009年6月10日遞交之美國臨時專利申請、2009年7月24日遞交之美國臨時專利申請第61/228,373號、2009年9月3日遞交之美國臨時專利申請第61/239,686號、及2010年1月29日遞交之國際申請第PCT/US2010/022614號中，其藉由引用併入本文。
包含MC3之製劑，揭示於例如2010年6月10日遞交之美國專利申請第2010/0324120號中，其整體內容藉由引用併入本文。
包含ALN-100之製劑揭示於例如2009年11月10日遞交之國際專利申請第PCT/US09/63933號中，其藉由引用併入本文。
包含C12-200之製劑揭示於例如2009年5月5日遞交之美國臨時專利申請第61/175,770號及2010年5月5日遞交之國際申請第PCT/US10/33777號中，其藉由引用併入本文。
C.其他製劑
i.乳液
本發明之組成物可製備且配製為乳液。乳液係一種液體以直徑通常超過0.1μm之液滴形式分散於另一種液體中之典型非均質系統(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常包含彼此緊密混合及分散之兩個不互混液體相之雙相系統。通常，乳液可係油包水(w/o)類或水包油(o/w)類。當水性相經精細切分為小液滴並分散於整塊油性相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油性相經精細切分為小液滴並分散於整塊水性相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為水性相、油性相存在於溶液中或本身作為單獨一相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。如需要，醫藥賦形劑如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。醫藥乳液亦可係由超過兩相構成之多乳液，舉例而言，油包水包油(o/w/o)乳液及水包油包水(w/o/w)乳液。此類復配製劑往往提供簡單雙相乳液所不具有之某些優點。其中o/w乳液之個體油滴將小水滴容納在內 之多乳液係構建w/o/w乳液。同樣，油滴被容納於穩定存在於油性連續相中之水球內的系統，係提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學穩定性小或沒有。一般情況下，乳液之分散相或不連續相良好地分散在外部相或連續相中，且透過乳化劑手段或形成黏度之手段維持其形式。乳液之任一相可係半固體或固體，如在乳液型軟膏基質及乳霜劑之情形中者。其他穩定化乳液之手段需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。廣義上，乳化劑可歸為四類：合成界面活性劑、天然界面活性劑、吸收基質、及精細分散之固體(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，業經廣泛用於乳液製劑中且業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型係兩性者且包含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親 水性與疏水性之比率業經定義為親水/親脂平衡(HLB)，且係在製劑之製備中歸類及選擇界面活性劑之有價值的工具。基於其親水性基團之天性，界面活性劑可歸為不同之類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液製劑中使用之天然乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂質、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基質具備親水特性，使得它們可吸收水以形成w/o乳液，而仍保持其半固體一致性，吸收基質係例如無水羊毛脂及親水石油脂。精細切分之固體亦業經用作良好之乳化劑，尤其是與界面活性劑合用或用於黏性製劑中。此等包括極性無機固體，如重金屬氫氧化物、非溶脹黏土如皂土、鎂鋁海泡石、水輝石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁及膠體矽酸鎂鋁、顏料及非極性固體如碳或甘油三硬脂酸酯。
大量非乳化材料亦包括於乳液製劑中，且對乳液之特性有所貢獻。此等包括脂肪、油類、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第335頁；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，第199頁)。
親水性膠體或水膠體包括天然膠及合成化合物，如多醣(舉例而言，阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠(guar gum)、刺梧桐膠及黃芪膠)、纖維素衍生物(舉例而言，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)、及合成聚合物(舉例而言，卡波姆(carbomers)、纖維素醚、及羧基乙烯基聚合物)。此等在水中分散或溶脹以形成膠體溶液，其藉由形成環繞分散相液滴之強界面膜且藉由增加外部相之黏度而穩定化乳液。
由於乳液一般含有可輕易地支持微生物生長的大量成分如碳水化合物、蛋白質、固醇及磷脂質，此等製劑一般係併入防腐劑。乳液製劑包括的常用之防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、氯化苄烷基羥銨、對羥基苯甲酸之酯、及硼酸。抗氧化劑亦常常加入乳液製劑中以防止該製劑的變質。所使用之抗氧化劑可係自由基捕捉劑如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化之羥基茴香醚、丁基化之羥基甲苯、或還原劑如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉、及抗氧化劑增效劑如枸櫞酸、酒石酸及卵磷脂。
乳液製劑經由護膚途徑、口服途徑及腸胃外途徑之應用及其製造方法業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。用於口服輸送之乳液製劑因為其容易配製以及在吸收及生物利用性觀點之效能而業經廣泛使用(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。礦物油基質輕瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑屬於業經作為o/w乳液而常常口服投予的材料。
ii.微乳液
於本發明之一個態樣中，iRNA及核酸之組成物經配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩性之系統，其係單一光學各向同性且熱力學穩定之溶液(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液係藉由下述製備之系統，首先，將油分散於界面活性劑水溶液中，隨和加入足量之第四成分，通常係中等鏈長之醇，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混液體的熱力學穩定、各向同性之澄清分散液，該兩種液體藉由表面活性分子之界面膜予以穩定化(Leung and Shah，在：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York，第185-215頁)。微乳 液通常經由將三至五種組分組合而製備，該等組分包括油、水、界面活性劑、助界面活性劑及電解質。微乳液是否為油包水(w/o)類型或水包油(o/w)類型係取決於所使用之油及界面活性劑之特性，亦取決於界面活性劑分子之極性頭部及烴類尾部至結構及幾何封裝(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
使用相圖至現象學途徑業經廣泛研究，且業經令該領域熟練人士獲得如何配製微乳液之全面知識(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。與傳統乳液相比，微乳液具備將製劑中水不溶性藥物溶解為自發形成之熱力學穩定之液滴的優點。
於微乳劑之製備中使用的界面活性劑包括但不限於，離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，單獨使用或與助界面活性劑合用。助界面活性劑，一般係短鏈 醇如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，用來藉由因為在界面活性劑分子間生成之空洞空間而滲透入界面活性劑膜並隨後創建失序膜，從而增加界面流動性。惟，微乳劑可不使用助界面活性劑而製備，且不含醇之自乳化微乳液系統係該領域中已知者。水性相典型可係但不限於，水、藥物之水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、及乙二醇之衍生物。油性相可包括但不限於，材料諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、重鏈(C8-C12)單、二及三甘油酯、聚氧乙基化之甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化之甘油酯、飽和聚二醇化之C8-C10甘油酯、植物油及矽油。
自藥物溶解性之觀點及增強之藥物吸收來看，微乳液係尤其感興趣者。業經提出，基於脂質之微乳液(o/w及w/o兩者)係增強藥物之口服生物利用性，該藥物係包括胜肽(參見，例如，美國專利第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供下列優點：改善之藥物溶解性、保護藥物不被酶水解、由於引入界面活性劑導致之膜流動性及可透過性之改變造成的可能提升之藥物吸收、容易製備、比固體劑型更易口服投予、改善之臨床潛能、以及降低之毒性(參見，例如，美國專利第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當在環境溫度下將微乳液之組分帶至一起時，一般可自發形成微乳液。這在配製熱穩定藥物、胜肽或iRNA時尤其具有優勢。亦業經發現，微乳液在化妝品及醫藥兩種應用中活性組 分之透皮遞送中有效。預期本發明之微乳液組成物及製劑將促進胃腸道對iRNA及核酸之全身性吸收，以及改善對iRNA及核酸之局部細胞攝取。
本發明之微乳液亦可含有額外之組分及添加劑如失水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol、以及滲透增強劑，以改善製劑之特性並增強對本發明之iRNA及核酸之吸收。本發明之微乳液中使用之滲透增強劑可歸類為屬於下述五大類之一：界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。此等類型各自業經於上文討論。
iii.微粒
本發明之RNAi劑可併入顆粒例如微粒中。微粒可藉由噴霧乾燥生產，但亦可藉由其他方法生產，該等其他方法包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透增強劑
於一個具體實施例中，本發明採用多種滲透增強劑以實現核酸尤其是iRNA至動物皮膚之有效輸送。大多數藥物以經離子化及未經離子化兩種形式存在於溶液中。惟，一般僅脂溶性或親脂性藥物輕易地跨越細胞膜。業經發現，如果待被跨越之細胞膜經滲透增強劑處理，則即便是非親脂性藥物仍能夠跨越該細胞膜。滲透增強劑除了有助於非親脂性藥物跨越細胞膜之擴散之外，亦提升親水性藥物之滲透能力。
滲透增強劑可分類為屬於下述五大類之一：亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述各類別之滲透增強劑更詳細揭示於下。
界面活性劑(或「表面活性劑」)為化學實體，當其溶解在水性溶液中時，降低該溶液之表面張力或該水性溶液與另一液體間之界面張力，導致透過黏膜之iRNA的吸收得以提升。此等滲透增強劑除了膽酸鹽及脂肪酸外亦包括，舉例而言，月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；以及全氟化學乳液諸如FC-43(Takahashi et al.,J. Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
作為滲透增強劑而作動之多種脂肪酸及其衍生物係包括，舉例而言，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯(1-單油醯基-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生油酸、甘油-1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如，甲酯、異丙酯及第三丁酯)、及其單甘油酯及二甘油酯(亦即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見，例如，Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁之生理學角色包括促進對脂質及脂溶性微生物之分散及吸收(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。多種天然膽汁鹽及其合成衍生物作為滲透增強劑而作動。因此，術語「膽汁鹽」包括膽汁之任意天然組分以及它們的任意合成衍生物。適宜之膽汁鹽包括，舉例而言，膽酸(或其藥學可接受之鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、糖膽酸(糖膽酸鈉)、糖去氧膽酸(糖去氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、烏索去氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴素鈉(STDHF)、糖基二氫褐黴素鈉及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Swinyard,Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，第39章，Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990，第782-783頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
與本發明關聯使用之螯合劑可定義為，藉由與金屬離子形成錯合物而將該金屬離子從溶液中移除的化合物，結果為透過黏膜進行之 iRNA吸收得以提升。關於他們作為滲透增強劑於本發明中之用途，螯合劑具有亦作為DNase抑制劑而作動之附加優點，蓋因大多數特徵化DNA核酸酶係需要用於催化之二價金屬離子並因此被螯合劑所抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。適宜之螯合劑包括但不限於，伸乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、枸構酸、柳酸鹽(例如，柳酸鈉、5-甲氧基柳酸鹽及高香草酸鈉)、膠原之N-醯基衍生物、laureth-9及β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺類)(參見，例如，Katdare,A.et al.,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文中所用，非螯合非界面活性劑滲透增強劑化合物可定義為，證明其作為螯合劑或作為界面活性劑之活性不顯著但仍然提升透過消化道黏膜進行之iRNA吸收的化合物(參見，例如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。這一類滲透增強劑包括，舉例而言，不飽和環狀脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92)；以及非類固醇抗炎劑如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛(indomethacin)及丁二苯吡唑二酮(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
於細胞水平提升iRNA攝入之劑亦可加入本發明之醫藥組成物及其他組成物中。舉例而言，陽離子脂質如lipofectin(Junichi等人，美國專利第5,705,188號)、陽離子性甘油衍生物、及聚陽離子性分子如聚離胺酸(Lollo等人，PCT申請WO 97/30731)，亦已知提升dsRNA之細胞攝入。可商購之轉染試劑的實例包括，舉例而言LipofectamineTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、293fectinTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、CellfectinTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、DMRIE-CTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、FreeStyleTM MAX(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、LipofectamineTM 2000 CD(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、LipofectamineTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、RNAiMAX(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、OligofectamineTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、OptifectTM(Invitrogen；卡爾斯巴德，加利福尼亞州)、X-tremeGENE Q2轉染試劑(Roche；格倫扎赫大街，瑞士)、DOTAP脂質體轉染試劑(格倫扎赫大街，瑞士)、DOSPER脂質體轉染試劑(格倫扎赫大街，瑞士)、或Fugene(格倫扎赫大街，瑞士)、Transfectam®試劑(Promega；麥迪遜，威斯康辛州)、TransFastTM轉染試劑(Promega；麥迪遜，威斯康辛州)、TfxTM-20試劑(Promega；麥迪遜，威斯康辛州)、TfxTM-50試劑(Promega；麥迪遜，威斯康辛州)、DreamFectTM(OZ Biosciences；馬賽，法國)、EcoTransfect(OZ Biosciences；馬賽，法國)、TransPassa D1轉染試劑(New England Biolabs；伊普斯維奇、麻薩諸塞州，USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invitrogen；聖地 牙哥，加利福尼亞州，USA),PerFectin轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、NeuroPORTER轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、GenePORTER轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、GenePORTER 2轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、Cytofectin轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、BaculoPORTER轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、TroganPORTERTM轉染試劑(Genlantis；聖地牙哥，加利福尼亞州，USA)、RiboFect(Bioline；湯頓、麻薩諸塞州、USA)、PlasFect(Bioline；湯頓，麻薩諸塞州，USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；山景城，加利福尼亞州，USA)、SureFECTOR(B-Bridge International；山景城，加利福尼亞州,USA)、或HiFectTM(B-Bridge International、山景城，加利福尼亞州，USA)等。
其他劑可用以增強所投予之核酸的滲透，包括二醇類如乙二醇及丙二醇、吡咯類如2-吡咯、氮酮類、及萜類如檸檬烯及薄荷酮。
v.載劑
本發明之某些組成物亦將載劑化合物併入製劑中。如本文中所用，「載劑化合物」或「載劑」可指代核酸或其類似物，其係惰性(亦即，本身不具備生物活性)但被活體內製程作為核酸識別，該製程係藉由例如降解生物學活性之核酸或促進將其從循環移除而降低具有生物學活性之核酸的生物利用性。核酸與載體化合物之共同投予(典型上採用過量之後者)，可導致從肝臟、腎臟或其他循環系統外之器官回收之核酸的量實質性減少，可能是由於載劑化合物與核酸間競爭共同的受體。舉例而言，當將部分硫 代磷酸酯dsRNA與聚肌苷酸、硫酸聚葡萄糖、聚胞苷酸或4-乙醯胺基-4'-異硫氰酸基-二苯乙烯-2,2'-二磺酸共同投予時，從肝組織中回收之部分硫代磷酸酯dsRNA可能減少(Miyao et al.,DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura et al.,DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183。
vi.賦形劑
與載劑化合物相比，「藥物載劑」或「賦形劑」係藥學可接受之溶劑、懸浮劑或其他用於將一種或多種核酸遞送至動物之藥學惰性媒介物。該賦形劑可係液體或固體，且當與核酸及給定醫藥組成物之其他組分合併時，係基於所考慮之計劃投予模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。典型之醫藥載劑包括但不限於，結合劑(例如，預膠凝之玉米澱粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填料(例如，乳糖及其他糖類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石、氧化矽、膠體二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如，澱粉、澱粉乙醇酸鈉等)；以及潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉等)。
不與核酸進行有害反應的適用於非腸胃外投予之藥學可接受的有機或無機賦形劑亦可用以配製本發明之組成物。適宜之藥學可接受的載劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
用於核酸之外用投予的製劑可包括無菌及非無菌水性溶液、在常用溶劑如醇類中之非水性溶液、或核酸在液體或固體油基質中之溶液。該等溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜之添加劑。可使用不與核酸進行有害反應的適用於非腸胃外投予之藥學可接受的有機或無機賦形劑。
適宜之藥學可接受的賦形劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
vii.其他組分
本發明之組成物可額外地含有常見於醫藥組成物中之其他輔助組分，用量為它們在該領域中常用的水平。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外、可相容、藥學活性之材料如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有可用於物理上配製多種類型之本發明之組成物的材料如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及安定劑。惟，當加入此類材料時，此類材料應不過度干擾本發明之組成物之組分的生物活性。該製劑可經無菌化，且(若需要)與不與該製劑之核酸進行有害反應的佐劑如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、調味劑或芳香物質等混合。
水性懸浮液可含有增加該懸浮液黏度之物質，該物質包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
於一些具體實施例中，本發明提出之醫藥組成物包括(a)一種或多種iRNA化合物及(b)一種或多種劑，其係藉由非RNAi機制而發揮功能且係有用於治療例如PH1。
此類化合物之毒性及治療功效可藉由標準藥學過程在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(將群體之50%致死之劑量)及ED50(對群體之50%治療有效之劑量)。毒性與治療功效間之劑量比率係治療係數，且其可表現為LD50/ED50之比率。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
從細胞培養檢定及動物研究中獲得之資料可用於配製在人體內使用之劑量範圍。本發明提出之組成物的劑量通常處於包括ED50在內之具低毒性或無毒性之循環濃度範圍。劑量可依據所採用之劑型及所使用之投予途徑而在此範圍內變動。對於在本發明提出之方法中使用的任意化合物，最初可從細胞培養物檢定中構建治療有效之劑量。劑量可在動物模型中配製為達成該化合物或(當適宜時)標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如，達成多肽之降低之濃度)，該範圍包括如在細胞培養物中測定之IC50(亦即，達成對症狀之半最大抑制時該測試化合物之濃度)。此資訊可用來更準確地確定可用於人體之劑量。舉例而言，可藉由高效液相色層分析術量測血漿中之水平。
除了如上文檢討之投予之外，本發明提出之iRNA亦可與其他已知在治療由鐵過載媒介且可藉由抑制HAO1表現而治療之病理進程中有效的劑合用。在任何情況下，主治醫生皆可基於該領域中已知或本文所述之標準功效測量方法觀察至結果而確定iRNA投予之量及時機。
VII.套組
本發明亦提供用於施行本發明之任意方法之套組。此類套組包括一種或多種dsRNA劑及使用說明，例如，用於投予預防或治療有效量之雙股RNAi劑的使用說明書。雙股RNAi劑可處於小瓶內或預填充之注射器內。套組可視需要復包含用於投予雙股RNAi劑之裝置(例如，注射設備，諸如預填充之注射器)或用於量測對HAO1之抑制的裝置(例如，用於量測對HAO1 mRNA、HAO1蛋白質及/或HAO1活性之抑制的裝置)。此類用於量測對HAO1之抑制的裝置可包含用於從受試者獲得樣本如血漿樣本的裝置。本發明之套組可視需要復包含用於測定治療有效量或預防有效量的裝置。
除非另做定義，否則本文中使用之所有科技術語具有與具有本發明所屬領域通常知識之人士所一般理解者相同之意。儘管在本發明提出之iRNA及方法之實踐或測試中可使用與本文中揭示之方法及材料類似或等效者，但適宜之方法及材料係揭示於下。本文中述及之所有出版物、專利申請案及其它參考文獻藉由引用而以其整體併入本文。若有矛盾之處，則以包括定義在內之本說明書為準。此外，材料、方法及實施例僅做例示性說明之用而非意圖限制。
本發明藉由下述實施例進一步示例性說明，該等實施例不應視為限制性。本說明書通篇所引用之全部參考文獻、專利及公佈專利申請之整體內容以及非正式序列表及圖示藉由引用而併入本文。
實施例
材料及方法
下列材料及方法用於實施例中。如本文所用，「HAO」、「HAO1」、「GO1」及「GO」可互換使用。
siRNA合成
單股RNA係使用8909合成儀(Applied Biosystems,Applera Deutschland GmbH，達姆斯塔特，德國)及受控之多孔玻璃(CPG，500Å，Proligo Biochemie GmbH，漢堡，德國)作為固體支持物以1微莫耳之規模藉由固相合成生產。RNA及含有2’-O-甲基之RNA係分別採用相對應之磷醯亞胺及2'-O-甲基磷醯亞胺(Proligo Biochemie GmbH，漢堡，德國)藉由固相合成生成。此等構建塊係使用標準核苷磷醯亞胺化學諸如Current protocols in nucleic acid chemistry,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA中所揭示者併入寡核苷酸鏈之序列內的選定位點處。硫代磷酸酯連結係藉由將碘氧化劑溶液替換為Beaucage試劑(Chruachem Ltd，格拉斯哥，UK)在乙腈中之溶液(1%)而引入。其他輔助試劑係獲自Mallinckrodt Baker(格里斯海姆，德國)。
根據已建立之程序，藉由陰離子交換HPLC進行粗製寡核苷酸之去保護及純化。藉由相應之RNA溶液在260nm之波長的UV吸收，使用分光光度計(DU 640B,Beckman Coulter GmbH，下施萊斯海姆，德國)測定產率及濃度。
雙股RNA藉由下述生成：將互補股之等莫耳溶液在貼合緩衝液(20mM磷酸鈉，pH 6.8；100mM氯化鈉)中混合，於水浴中在85至90℃加熱3分鐘，並歷經3至4小時之時間段冷卻至室溫。經貼合之RNA溶液在-20℃儲存備用。
在一些情況下，雙螺旋(dsRNA)經合成超過一次。不同批次以不同之擴展名標記之。舉例而言，AD-62933.1及AD-62933.2為相同雙螺旋之不同批次。
細胞培養及轉染
使用原代食蟹獼猴肝細胞(PCH)及原代小鼠肝細胞(PMH)。藉由下述轉染PCH(Celsis # M003055，批號CBT)或PMH(經新鮮單離)：在96孔盤之每個孔中，將每孔14.8μl的Opti-MEM加0.2μl的Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen，卡爾斯巴德加利福尼亞州.目錄號13778-150)添加至每孔5μl的siRNA雙螺旋中，並且於室溫孵育15分鐘。然後，將含有~2x104PCH或PMH的80μl的InVitroGRO CP大鼠培養基(InVitro Technologies)添加至siRNA混合物中。將細胞孵育24小鼠，之後進行RNA純化。以10或20nM以及0.1或0.2nM之最終雙螺旋濃度施行單劑量實驗，並且在10nM至36fM之最終雙螺旋濃度的劑量範圍(8次6倍稀釋)內進行劑量反應實驗。
總RNA單離
使用DYNABEADS mRNA單離套組單鏈總RNA(InvitrogenTM，料件編號：610-12)。收穫細胞並在150μl之裂解/結合緩衝液中裂解，然後使用Eppendorf Thermomixer在850rpm混合5分鐘(混合速度在整個製程中相同)。將10微升之磁珠與80μl裂解/結合緩衝液混合物添加至圓底盤中並混合物1分鐘。使用磁性台架捕獲磁珠，並去除上清液而不干擾該等磁珠。去除上清液之後，將經裂解之細胞添加至剩餘磁珠中並混合物5分鐘。去除上清液之後，將磁珠用150μl洗滌緩衝液A洗 滌2次並混合1分鐘。再次捕獲磁珠並去除上清液。然後將磁珠用150μl洗滌緩衝液B洗滌，捕獲，並去除上清液。之後，將磁珠用150μl溶析緩衝液B洗滌，捕獲，並去除上清液。將磁珠乾燥2分鐘。乾燥之後，在70℃添加50μl之溶析緩衝液並混合5分鐘。將磁珠捕獲在磁鐵上，持續5分鐘。去除40μl之上清液並添加至另一96孔盤中。
cDNA合成
使用ABI高能cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亞州，目錄號#4368813)施行cDNA之合成。
將每反應2μl 10X緩衝液、0.8μl 25X dNTP、2μl隨機引子、1μl逆轉錄酶、1μl RNase抑制劑及3.2μl之H2O的預混液添加至10μl總RNA中。使用Bio-Rad C-1000或S-1000熱循環儀(赫拉克勒斯，加利福尼亞州)透過下列步驟生成cDNA：25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5sec，4℃保持。
即時PCR
在384孔50盤(Roche目錄號04887301001)之每一孔中，將2μl之cDNA添加至含有0.5μl至小鼠GAPDH(目錄號4352339E，Life Technologies)或定制之食蟹獼猴GAPDH TaqMan探針(F-GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO：7)、R-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO：8)、探針-CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO：9))、0.5μl人或小鼠HAO1(HS00213909_M1-，其可與食蟹獼猴HOA1反應；Mm 00439249_m1用於小鼠檢定；life technologies)及5μl Lightcycler 480探針預混液 (Roche Cat # 04887301001)的預混液中。即時PCR係使用△△Ct(RQ)檢定於LightCycler480即時PCR系統(Roche)中進行。每種雙螺旋在兩個獨立轉染中測試，且每一轉染係以一式兩份檢定，除非在匯總表中明確排除。
為了計算相對倍數改變，使用△△Ct方法實時分析資料並將該資料歸一化至使用以10nM AD-1955轉染或模擬轉染之細胞施行的檢定。使用以XLFit進行之4參數擬合模型計算IC50，並歸一化至以AD-1955轉染或天然細胞。
AD-1955之正義及反義序列為：正義：5’-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3’(SEQ ID NO：10)；以及反義：5’-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3’(SEQ ID NO：11)。
Figure 110144852-A0202-12-0176-37
Figure 110144852-A0202-12-0177-38
Figure 110144852-A0202-12-0178-39
Figure 110144852-A0202-12-0179-40
實施例1：ALN-65585
AD-65585係靶向人HAO1基因之核苷酸1341-1363的雙股siRNA。「ALN-GO1」指代經修飾之AD-65585的GalNAc版本，亦指代為魯馬斯蘭(Lumasiran)。核苷酸單體之縮寫如表B中所示。
各股之序列如下：
Figure 110144852-A0202-12-0179-41
實施例2：使用ALN-65585進行藥理學研究
肝細胞中之HAO1抑制。
使用具有經連續稀釋之AD-65585(ALN-65585，「ALN-GO1」)的RNAimax(Invitrogen)或10nM之非靶向mRNA螢光素酶對照(AD1955)轉染原代獼猴肝細胞。HAO1 mRNA之相對水平係藉由歸一化至藉由實時RT-PCR定量之GAPDH mRNA水平而測定。資料經繪圖以計算10pM之IC50值。結果顯示於第3圖中。
AD-65585之活體外轉染表明了在原代獼猴肝細胞中大約10pM的ED50。
小鼠中之單劑量藥理學
ALN-GO1藥理學係於小鼠中藉由將肝臟HAO1 mRNA及血漿乙醇酸鹽水平定量而評估(第4圖)。單個SC劑量之ALN-GO1導致HAO1 mRNA的劑量依賴性抑制，其中10mg/kg之劑量導致ED90緘默化。用於小鼠中GO1緘默化之ED
Figure 110144852-A0202-12-0180-98
劑量經評估為0.3mg/kg。血清乙醇酸鹽水平以劑量回應性模式增加，其中最高水平比基線水平高大約4倍。結果顯示於第4圖中，其示出在C57BL/6小鼠中，在單個皮下劑量之ALN-65585之後10天的肝臟HAO1 mRNA及血清乙醇酸鹽。柱表示3或4隻動物之均值，且誤差槓描繪標準偏差。
小鼠中之單劑量持續時間
在單個SC劑量之後，GO1緘默化係可持續且可逆(第5圖)。在小鼠中，3mg/kg之單個SC劑量之ALN-GO1導致
Figure 110144852-A0202-12-0180-99
70% mRNA緘默化，持續大約6週，此後，mRNA水平通過12週的給藥後時間段恢復至基 線水平。結果顯示於第5圖中：在C57BL/6小鼠中，在單個皮下劑量之ALN-65585之後，在多個時間點的肝臟HAO1 mRNA水平。每個資料點表示3隻動物之均值，且誤差槓描繪標準偏差。
大鼠中之單劑量藥理學
ALN-GO1藥理學亦於大鼠中藉由將肝臟HAO1 mRNA水平定量而評估(第6圖)。向雄性Sprague Dawley大鼠單次SC投予之ALN-GO1導致HAO1 mRNA的劑量依賴性抑制，其中
Figure 110144852-A0202-12-0181-100
3mg/kg之劑量導致ED90緘默化。結果顯示於第6圖中：在Sprague Dawley大鼠中，在單個皮下劑量之LALN-65585之後10天的肝臟HAO1 mRNA水平。柱表示3隻動物之均值，且誤差槓描繪標準偏差。用於大鼠中GO1緘默化之ED50劑量經評估為0.3mg/kg。
AGXT KO小鼠中之單劑量藥理學
ALN-GO1對草酸鹽水平之影響係於PH1之AGXT KO小鼠模型中評估。結果顯示於第7圖中：在單個皮下劑量之ALN-65585之後，Agxt KO小鼠的24小時尿草酸鹽(上圖)及乙醇酸鹽(下圖)排泄。不同字母意指在每個特定週時3個劑量組(每個劑量n=3)之間的顯著差異。在PBS對照動物(n=1)中，隨時間推移之尿排泄沒有顯著變化。
在單個劑量之ALN-GO1之後，尿草酸鹽水平顯示劑量依賴性減少，其中在3mg/kg劑量下的草酸鹽減少最多為大約50%，持續
Figure 110144852-A0202-12-0181-101
3週，此後恢復至給藥前水平。在單個劑量之ALN-GO1之後，尿乙醇酸鹽水平顯示劑量依賴性增加，其中在3mg/kg劑量下的草酸鹽增加最多為大約5倍，持續
Figure 110144852-A0202-12-0181-102
4週。
PH1誘導型大鼠Rat模型中之單劑量藥理學
ALN-GO1係於第二PH1嚙齒動物模型中評估，其中在大鼠中使用siRNA抑制肝臟AGXT並使用乙二醇刺激草酸鹽水平(第8A圖及第8B圖)。將肝臟HAO1 mRNA及24小時尿草酸鹽定量以測定最大草酸鹽減少所需的HAO1下降程度。結果顯示於第8A圖及第8B圖中：在單個皮下劑量之ALN-65585並每週給藥AF-011-AGXT siRNA(2個1mg/kg之劑量)之後14天，PH1之大鼠誘導模型中的肝臟HAO1 mRNA水平。將24小時尿草酸鹽歸一化至尿肌酸酐。柱表示3隻動物之均值，且誤差槓描繪標準偏差。mRNA與草酸鹽下降相關圖表示來自多個實驗之個體動物。
單個劑量之ALN-GO1在該模型中表明劑量回應性mRNA及尿草酸鹽下降，其中在最高劑量之ALN-GO1時觀察到大約85%的最大mRNA減少及大約90%的最大尿草酸鹽減少(第8A圖及第8B圖)。在該PH1之誘導大鼠模型中，mRNA減少與尿草酸鹽減少導致了1：1相關。
PH1誘導型大鼠Rat模型中之多劑量藥理學
藉由將肝臟HAO1 mRNA及24小鼠尿草酸鹽定量，在研究中在具有經抑制之AGXT活性及乙二醇之正常大鼠(PH1之誘導模型)中評估ALN-GO1之效價。結果顯示於第9圖中：在重複皮下給藥ALN-65585並重複IV給藥AF-011-AGXT siRNA(4個1mg/kg之劑量)之後28天，PH1之大鼠誘導模型中的肝臟HAO1 mRNA水平。將24小時尿草酸鹽歸一化至尿肌酸酐。柱表示2或3隻動物之均值，且誤差槓描繪標準偏差。
用ALN-GO1治療在全部治療組中皆導致持續之尿草酸鹽減少，持續大約3週。在重複給藥ALN-GO1(及四個劑量之AF-011-AGXT)之後第28天，全部組皆顯示>95%mRNA減少及>85%尿草酸鹽下降。
NHP中之多劑量藥理學
ALN-GO1藥理學係藉由將肝臟活檢體中之HAO1 mRNA水平及血清乙醇酸鹽水平定量於食蟹獼猴(非人靈長動物(NHP))中評估。下表顯示NHP藥理學研究概述，其詳述劑量水平及給藥方案。
Figure 110144852-A0202-12-0183-42
結果顯示於第10圖中。截至第85天之全部組的NHP血清乙醇酸鹽水平，資料表示每組3隻動物之組平均，線條表示標準偏差。在第29天之肝臟活檢體HAO1 mRNA，線條表示組平均，符號表示個體動物mRNA水平相對於在第29天的PBS對照。
在第一個月之給藥後(第29天)，在全部組中皆觀察到劑量回應性mRNA緘默化，其中在以每個月4mg/kg或每週2mg/kg給藥之第6 組及第7組中觀察到高達99% mRNA緘默化。在以每個月4mg/kg給藥之第6組中，大約70μM的最大升高血清乙醇酸鹽水平維持了至少3週。
實施例3：人類受試者中之ALN-GO1 1/2期研究
單次遞增劑量(SAD)研究係於32位健康成年人類志願受試者中使用經皮下投予之AD-65585(ALN-65585，「ALN-GO1」)或安慰劑施行。給藥計劃如下：
0.3mg/kg X 1 SC，N=8
1.0mg/kg X 1 SC，N=8
3.0mg/kg X 1 SC，N=8
6.0mg/kg X 1 SC，N=8
評估了安全性、藥物動力學及藥效學。沒有發生嚴重的不良事件或由於不良事件的中斷。沒有觀察到肝功能、腎功能或血液參數的其他臨床顯著變化。
使用本文所揭示之方法及/或本領域技術人員習知之方法測定血清乙醇酸鹽水平。結果顯示於第11圖及第12圖中。血清乙醇酸鹽水平以劑量依賴性模式增加，在較高劑量時，明顯的活性最早出現在給藥後第29天且一直持續到第85天。導致可察覺之乙醇酸鹽增加的最低劑量為1mg/kg。
該等結果表明一種增加受試者之血漿乙醇酸鹽水平之方法，該方法包含向受試者投予有效量的ALN-GO1 siRNA，藉此增加該受試者之血漿乙醇酸鹽水平。有效量可以為1.0、3.0或6.0mg/kg。ALN-GO1 siRNA可以經皮下投予。
實施例4：PH1患者中之ALN-GO1 1/2期研究
多次遞增劑量(MAD)研究係於隨機化3：1、單盲、安慰劑對照研究中，使用經皮下投予之魯馬斯蘭例如AD-65585(ALN-65585，「ALN-GO1」)或安慰劑針對PH1患者施行。
給藥計劃如下：
1.0mg/kg，q28d x 3 SC，N=4
3.0mg/kg，q28d x 3 SC，N=4
3.0mg/kg，q84d x 2 SC，N=4
PH1患者之年齡範圍為6至64歲；具有>45ml/min/1.73m2的eGFR(估計腎小球濾過率)；且具有
Figure 110144852-A0202-12-0185-103
0.70mmol/24h/1.73m2的尿草酸鹽排泄隊列1及2各自具有下列人口統計資訊：
Figure 110144852-A0202-12-0185-43
評估了安全性。沒有發生嚴重的不良事件或由於不良事件的中斷。
隊列1係使用下列給藥計劃投予ALN-GO1：1mg/kg q28d×3個劑量。使用本文所揭示之方法及/或本領域技術人員習知之方法測定尿草酸鹽排泄水平。結果顯示於第13圖中。投予ALN-GO1將尿草酸鹽排泄減少了超過50%。
隊列2係使用下列給藥計劃投予ALN-GO1：3mg/kg q28d×3個劑量。使用本文所揭示之方法及/或本領域技術人員習知之方法測定尿草酸鹽排泄水平。結果顯示於第14圖中。在第一劑量之ALN-GO1或安慰劑之後，在第29天的平均尿草酸鹽排泄平均降低>50%。由於患者在進行中之研究中保持不知情，安慰劑包括在總結中。
對於全部患者，投予ALN-GO1使得尿草酸鹽下降至低於1.1mmol/1.73m2/24小時，其中基線排泄為
Figure 110144852-A0202-12-0186-104
1.6mmol/1.73m2/24小時。已經證明，在診斷時未患有ESRD之PH患者中，在彼等具有最高水平之尿草酸鹽排泄者中，腎存活估計值下降(Zhao et al.CJASN 2016；11：119-126)。
研究表明，PH1患者對於多個劑量之AD-65585(ALN-65585，「ALN-GO1」)耐受良好，無藥物相關之SAE或源自研究之中斷。該藥物治療方案在所治療之全部患者中達成尿草酸鹽水平之實質性減少，強調了透過RNAi媒介之乙醇酸氧化酶抑制之受質減少療法的潛力。
初始結果B部分：PH1患者中之ALN-GO1 1/2期研究
B部分為魯馬斯蘭在PH1患者中的隨機化(藥物：安慰劑為3：1)、單盲、安慰劑對照評估。隊列1及隊列2分別以1mg/kg或3mg/kg 接受三個每月劑量之魯馬斯蘭(ALN-65585，「ALN-GO1」)，隊列3以3mg/kg接受兩個每季度劑量。在最開始兩個隊列各自之延伸期中，另外八例患者接受魯馬斯蘭之開放性試驗(open-label)，總計納入20例患者。隨機分配至安慰劑組之患者在投予安慰劑之後，亦接受後續皮下投予之魯馬斯蘭。患者之平均年齡為14.9歲(範圍：6至43)，且平均估計腎小球濾過率(eGFR)為77mL/min/1.73m2(分為：42至131)。
納入準則如下：PH1；年齡6至64歲；eGFR>45ml/min/1.73m2；尿草酸鹽排泄
Figure 110144852-A0202-12-0187-105
0.70mmol/24h/1.73m2。患者人口統計資訊如下：
Figure 110144852-A0202-12-0187-44
結果：魯馬斯蘭在納入隊列1至3(N=12)之患者中表現了65%的尿草酸鹽之平均最大減少，其中全部此等患者皆經歷尿草酸鹽下降至低於0.7mmol/24hrs/1.73m2，亦即與終末期腎病的較慢惡化速率相關之閾值(資料未顯示)。在第85天，具有可用資料之接受魯馬斯蘭的患者(N=9)維持63%的平均尿草酸鹽減少(範圍：49%至73%)。
如第15圖及第16圖中所示，在基線排泄
Figure 110144852-A0202-12-0188-106
1.6mmol/24hr/1.73m2之全部患者中，魯馬斯蘭使得UOx(尿草酸鹽)下降至低於1.1mmol/24hr/1.73m2。藉由在診斷時尿草酸鹽(UOx)排泄(mmol/24hr/1.73m2)之百分位來檢查腎存活。在診斷時未患有ESRD之PH患者中，在彼等具有最高水平之尿草酸鹽排泄者中，腎存活估計值下降。
亦使用下述納入準則。較年輕之患者的處置包括出生至<6歲；如果為12個月或更大，則eGFR>45mL/min/1.73m2；如果為<12個月，則無腎功能損傷。對患有晚期腎病之患者的處置包括全年齡，且如果為12個月或更大，則eGFR
Figure 110144852-A0202-12-0188-107
45mL/min/1.73m2；如果存在<12個月的全身性草酸鹽沉積之OR臨床證據，則腎功能受損。
魯馬斯蘭(ALN-GO1)為經皮下投予之研究性RNAi治療劑，其減少患有第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之患者的草酸鹽之肝產生。PH1患者對於多個劑量之魯馬斯蘭耐受良好，無藥物相關之嚴重不良事件(serious adverse event,SAE)或源自研究之中斷。接受魯馬斯蘭之患者經歷尿草酸鹽的實質性及持續之減少，證實RNAi媒介之乙醇酸氧化酶抑制為穩健療法以減輕該毀滅性疾病中的草酸鹽之病理性過度產生。尿草酸鹽之強效且持久之減少支持每個季度一次的皮下給藥方案。GO抑制減少肝草酸鹽產生水平並使其正常化，停滯PH1疾病惡化。
AD-65585(魯馬斯蘭)之先前I/II期臨床試驗的總結
如上述實施例中所揭示，來自AD-65585(魯馬斯蘭)之I/II期臨床試驗的資料表明，在給藥魯馬斯蘭之患者中，AD-65585之皮下投予導致64%的24小時內尿草酸鹽之平均最大減少(隊列1至3)並且達成尿草酸 鹽之正常至接近正常水平(<0.7mmol/24h/1.73m2)(範圍：0.29至0.67mmol/24h/1.73m2)。尿草酸鹽之該抑制經由重複給藥得以維持，指示魯馬斯蘭之藥物動力學效果的持續性。此外，在多次遞增劑量組(B部分；n=10)中，初步資料顯示在最後一個劑量之後28天，血漿草酸鹽相對於基線平均減少59%。血漿草酸鹽之平均最大減少為75%(範圍：57%至94%)，且50%之患者達成了正常範圍(<1.6μmol/L)內之血漿草酸鹽水平。
實施例5：ALN-GO1(一種針對原發性高草酸鹽尿症1(PH1)之研究性RNAi治療劑)之藥效學-藥物動力學(PK-PD)模型
該研究之目標為預測人體中之ALN-GO1肝臟及RISC濃度-時間曲線，以及將關於在健康志願者中之血漿乙醇酸鹽升高及PH1患者中之尿草酸鹽減少的ALN-GO1劑量反應定量。
健康志願者中及藉由(上文揭示之)I期研究結果提供之乙醇酸鹽反應曲線藉由PK-PD模型充分揭示，如第17圖中所示。在健康志願者中觀察到血漿草酸鹽水平的劑量依賴性增加。在6mg/kg劑量下，預計乙醇酸鹽相對於基線增加約6.5倍，相對應的預測之GO抑制為約85%。
藉由(上文揭示之)I期研究結果提供的PH1患者之草酸鹽反應曲線藉由PK-PD模型充分揭示，如第18圖中所示。經ALN-GO1治療之全部患者皆顯示尿草酸鹽水平之減少。在三個1mg/kg之每個月劑量之後，預測峰值尿草酸鹽下降出現在最後一個劑量之後2個月時，之後緩慢恢復至基線。在三個1mg/kg之每個月劑量之ALN-GO1之後，模型預測的尿草酸鹽之中值最大下降為56%。
使用PK-PD模型在PH1患者中預測的劑量與穩定狀態GO酶抑制之間的關係。如第19圖中所示，
Figure 110144852-A0202-12-0190-108
2mg/kg之每個月劑量及
Figure 110144852-A0202-12-0190-109
5mg/kg之每個季度劑量係預期獲得GO酶之>90%抑制。
使用PK-PD模型在PH1患者中預測的劑量與尿草酸鹽減少之間的關係。如第20圖中所示，
Figure 110144852-A0202-12-0190-110
2mg/kg之每個月劑量及
Figure 110144852-A0202-12-0190-111
5mg/kg之每個季度劑量係預期獲得PH1患者之尿草酸鹽的接近最大抑制。假設基線尿草酸鹽中位數為2.0(mmol/24h/1.73m2)，執行模擬。
PK-PD模型充分揭示了觀察到的健康志願者中之血漿乙醇酸鹽增肌及PH1患者中之尿草酸鹽降低的時間進程及個體間差異性。2mg/kg之每個月劑量或5mg/kg之每個季度劑量的ALN-GO1可導致GO酶之>90%抑制並因此導致接近最大之尿草酸鹽減少。
實施例6：AD-65585之III期臨床試驗及髓性腎鈣沉積之改善
執行III期、隨機、雙盲、安慰劑對照研究，以評估經皮下投予之AD-65585(魯馬斯蘭)在患有經證實之第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之成人及兒童中的功效、安全性、藥物動力學及藥效學(pharmacodynamics)。
AD-65585之序列揭示於上文實施例1中。
患者群體如下：
˙成人及
Figure 110144852-A0202-12-0190-112
6歲之兒童
˙尿草酸鹽排泄
Figure 110144852-A0202-12-0190-113
0.7mmol/24hr/1.73m2
˙經證實之AGXT(丙胺酸乙醛酸胺基轉移酶)突變
˙eGFR
Figure 110144852-A0202-12-0190-114
30mL/min/1.73m2
將患者群體(N=39)隨機化為2：1，受試者：安慰劑。
魯馬斯蘭組每個月一次經皮下接受3.0mg/kg之負載劑量的魯馬斯蘭，持續3個月，然後在最後一個負載劑量之後一個月開始，每3個月一次經皮下接受3.0mg/kg之維持劑量的魯馬斯蘭。安慰劑組每個月一次經皮下接受3.0mg/kg之負載劑量的安慰劑，持續3個月，然後在最後一個負載劑量之後一個月開始，每3個月一次經皮下接受3.0mg/kg之維持劑量的魯馬斯蘭。雙盲治療期持續6個月。全部患者皆堅持完成54個月之延伸期，總計60個月。
主要結果指標為從基線至第6個月的尿草酸鹽排泄之百分比變化。次要結果指標包括(1)從基線到研究結束(第60個月)(時間框架：最多60個月)的尿草酸鹽排泄之百分比變化；(2)相對於基線(時間框架：最多60個月)的尿草酸鹽排泄之絕對值變化；(3)發現尿草酸鹽：肌酐比率
Figure 110144852-A0202-12-0191-115
接近正常化閾值
Figure 110144852-A0202-12-0191-116
1.5×uln)(時間框架：最多60個月)之時間點的百分比；(4)尿草酸鹽排泄
Figure 110144852-A0202-12-0191-117
正常上限(uln)及
Figure 110144852-A0202-12-0191-118
1.5 x uln(時間框架：最多60個月)之參與者的百分比；(5)從基線到研究結束(第60個月)(時間框架：最多60個月)的血漿草酸鹽之百分比變化；(6)從基線到研究結束(第60個月)(時間框架：最多60個月)的血漿草酸鹽之絕對值變化；(7)AD-65585之最大觀察血漿濃度(cmax)(時間框架：最多24個月)；(8)AD-65585的到最大觀察血漿濃度之時間(tmax)(時間框架：最多24個月)；(9)AD-65585之消除半衰期(t1/2β)(時間框架：最多24個月)；(10)AD-65585之濃度-時間曲線下面積(auc)(時間框架：最多24個月)；(11)AD-65585之表觀清除率(cl/f)(時間框架：最多24個月)；(12)AD-65585之擬分佈體積(v/f)(時間框架： 最多24個月)；(13)所評估之腎小球濾過率(egfr)相對於基線的變化(時間框架：最多60個月)；及(14)不良事件(ae)之頻率(時間框架：最多60個月)。
結果
24小時尿草酸鹽之減少持續至第12個月
最初經隨機分配至魯馬斯蘭之患者(魯馬斯蘭/魯馬斯蘭)具有持續至第12個月的持續之24小時UOx減少(相對於基線之平均減少幅度為64.1%)。最初經隨機分配至安慰劑的與魯馬斯蘭交叉之患者(安慰劑/魯馬斯蘭)顯示相似的時間進程及24小時UOx減少幅度(在6個月之治療後，平均減少幅度為57.3%)。此外，24小時尿草酸鹽之絕對減少持續至第12個月。
達成持續至第12個月之24小時尿草酸鹽接近正常化或正常化之患者的比例
魯馬斯蘭/魯馬斯蘭患者之24小時UOx接近正常化或正常化(
Figure 110144852-A0202-12-0192-119
1.5×ULN)持續至第12個月，且77%的安慰劑/魯馬斯蘭交叉患者在6個月之治療後達成24小時UOx接近正常化或正常化(
Figure 110144852-A0202-12-0192-120
1.5×ULN)。
血漿草酸鹽之減少持續至第12個月
最初經隨機分配至魯馬斯蘭之患者(魯馬斯蘭/魯馬斯蘭)維持其血漿草酸鹽減少持續至第12個月(子啊第12個月，平均百分比減少幅度為35.0%)。最初經隨機分配至安慰劑的與魯馬斯蘭交叉之患者(安慰劑/魯馬斯蘭)顯示相似的時間進程血漿草酸鹽減少幅度。在6個月之治療後，其等之血漿草酸鹽平均百分比減少幅度為48.9%。
此外，使用魯馬斯蘭治療，eGFR保持穩定，持續至第12個月。血漿乙醇酸鹽最初增加然後進入平台期，與肝GO活性之減少相一致。
治療後，腎結石事件發生率下降
腎結石事件定義為由患者報告且包括下列至少一者之事件：a)因腎結石訪視健康照護提供者，b)針對腎絞痛用藥，c)尿路結石(stone passage)，及/或d)腎結石所致的肉眼可見之血尿。腎結石事件發生率計算為腎結石事件之總數除以總人-年數。
在魯馬斯蘭/魯馬斯蘭組中，在最初經隨機分配至魯馬斯蘭之患者中，相對於徵得同意之前的12個月，腎結石事件發生率在魯馬斯蘭治療期間的前6個月內降低。該減少在另外6個月之治療後得以維持，使得使用魯馬斯蘭治療時的腎結石事件發生率降低持續至第12個月。
在最初經隨機分配至安慰劑之患者中，相對於徵得同意之前的12個月，腎結石事件發生率在6個月之安慰劑治療期間保持不變。在此等患者自安慰劑自安慰劑轉為魯馬斯蘭後，在6個月之魯馬斯蘭治療之後，腎結石事件發生率降低。
eGFR及腎結石事件(藉由事件數每100人每天報告)亦透過雙盲期及延伸期(總計12個月)評估。在投予魯馬斯蘭之患者中，eGFR保持穩定。在魯馬斯蘭組中，如第21A圖中所示，在徵得同意之前的12個月所報告之腎結石事件發生率為3.19。在雙盲期及延伸期的前6個月內觀察到的事件發生率分別為1.09及0.85。在安慰劑組中，在徵得同意之前的12個月所報告之腎結石事件發生率為0.54，而在雙盲期內觀察到之事件發 生率為0.66。在延伸期中之魯馬斯蘭治療的前6個月內，在先前接受安慰劑之患者中觀察到0.17的事件發生率。
在擴展研究的下六個月(研究的第12個月至第18個月)內，魯馬斯蘭組之腎結石事件發生率為0.56且安慰劑組之腎結石事件發生率為0.0；而在研究的第18個月至第24個月內，魯馬斯蘭組之腎結石事件發生率為0.63且安慰劑組之腎結石事件發生率為0.48。
第21B圖係圖表，其總結在研究之魯馬斯蘭組中魯馬斯蘭投予對於腎結石事件發生率之影響，按治療期分類，直至第24個月。
用魯馬斯蘭治療之患者的髓性腎鈣沉積改善
髓性腎鈣沉積係藉由在基線及第6個月、第12個月及第24個月藉由腎臟超音檢查評估，由放射科醫師在對時間點及治療組不知情下集中讀取。於每個腎中之腎鈣沉積程度係基於經標準化之4點量表分級。在進行穩定管理方案之老年PH1患者中，髓性腎鈣沉積應不會自發改善。在試驗開始時，29例患者在基線時具有腎鈣沉積，12例在安慰劑組中(92.3%)且17例在魯馬斯蘭組中(70.8%)。
對於腎鈣沉積，在49例在基線及第6個月進行腎臟超音檢查之患者中，魯馬斯蘭組之36例中的4例顯示腎鈣沉積改善，魯馬斯蘭組之36例中的1例顯示腎鈣沉積惡化，且安慰劑組之13例中的1例顯示腎鈣沉積惡化，如第22圖中所示。其他經魯馬斯蘭(n=36)或安慰劑(n=13)治療之患者無一在6個月後表現出腎鈣沉積變化。
在魯馬斯蘭組的24例在基線及第12個月進行腎臟超音檢查之患者中，24例中的11例顯示腎鈣沉積改善，且24例中的3例顯示腎鈣沉積惡化，如第22圖中所示。
在研究之第24個月，在魯馬斯蘭組的13例在基線及第24個月進行腎臟超音檢查之患者中，3例顯示腎鈣沉積改善或減少，9例顯示腎鈣沉積無變化，且1例顯示腎鈣沉積惡化或增加。
高含量之草酸鹽有毒，蓋因草酸鹽不能為人體所分解並蓄積於腎臟中。草酸根可與腎臟中之鈣結合，且高草酸鹽尿症可造成尿CaOx超飽和，導致CaOx晶體於腎組織中之形成及沉積。此等CaOx晶體可能有貢獻於瀰漫性腎石灰化(腎鈣沉積症)及結石(腎結石)。此外，當先天性腎防禦機制被阻遏時，由此等CaOx晶體導致之損傷及進行性發炎，連同繼發性併發症諸如腎小管阻塞，可能導致腎功能降低並在一些嚴重情況下導致終末期腎衰竭。此外，CaOx之全身性沉積(全身性草酸鹽沉積)可能在腎外組織內發生，如果不予治療可能導致死亡。
實施例7：AD-65585(ILLUMINATE-B)之III期臨床試驗
執行III期、單臂、開放試驗研究，以評估經皮下投予之AD-65585(魯馬斯蘭)在患有經證實之第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之成人及兒童中的功效、安全性、藥物動力學及藥效學。
AD-65585之序列揭示於上文實施例1中。
患者群體如下：
‧嬰兒及
Figure 110144852-A0202-12-0195-121
6歲之兒童
‧升高之尿草酸鹽：肌酸酐比率
‧經證實之AGXT(丙胺酸乙醛酸胺基轉移酶)突變
‧如果為
Figure 110144852-A0202-12-0196-122
12個月大，則eGFR>45mL/min/1.73m2；如果為<12個月大，則血清肌酸酐正常患者群體(N=18)。
<10kg之患者每個月一次接受6.0mg/kg之負載劑量，持續3個月，然後每個月一次接受3.0mg/kg之維持劑量；
Figure 110144852-A0202-12-0196-123
10至<20kg之患者每個月一次接受6.0mg/kg之負載劑量，持續3個月，然後每3個月一次接受6.0mg/kg之維持劑量；
Figure 110144852-A0202-12-0196-124
20kg之患者每個月一次接受3.0mg/kg之負載劑量，持續3個月，然後每3個月一次接受3.0mg/kg之維持劑量。維持劑量在最後一個負載劑量投予後1個月開始。治療期持續6個月。全部患者皆堅持完成54個月之延伸期，總計60個月。
主要結果指標為從基線至第6個月的抽樣尿草酸鹽：肌酸酐比率之百分比變化。次要結果指標包括(1)從基線到研究結束(第60個月)(時間框架：最多60個月)的尿草酸鹽排泄之百分比變化；(2)相對於基線(時間框架：最多60個月)的尿草酸鹽排泄之絕對值變化；(3)發現尿草酸鹽：肌酐比率
Figure 110144852-A0202-12-0196-125
接近正常化閾值
Figure 110144852-A0202-12-0196-126
1.5×uln)(時間框架：最多60個月)之時間點的百分比；(4)尿草酸鹽排泄
Figure 110144852-A0202-12-0196-127
正常上限(uln)及
Figure 110144852-A0202-12-0196-128
1.5 x uln(時間框架：最多60個月)之參與者的百分比；(5)從基線到研究結束(第60個月)(時間框架：最多60個月)的血漿草酸鹽之百分比變化；(6)從基線到研究結束(第60個月)(時間框架：最多60個月)的血漿草酸鹽之絕對值變化；(7)AD-65585之最大觀察血漿濃度(cmax)(時間框架：最多24個月)；(8)AD-65585的到最大觀察血漿濃度之時間(tmax)(時間框架：最多24個月)；(9)AD-65585之消除半衰期(t1/2β)(時間框架：最多24個月)；(10)AD- 65585之濃度-時間曲線下面積(auc)(時間框架：最多24個月)；(11)AD-65585之表觀清除率(cl/f)(時間框架：最多24個月)；(12)AD-65585之擬分佈體積(v/f)(時間框架：最多24個月)；(13)所評估之腎小球濾過率(egfr)相對於基線的變化(時間框架：最多60個月)；及(14)不良事件(ae)之頻率(時間框架：最多60個月)。
在該III期、單臂、開放試驗研究中，以上揭基於重量之給藥方案投予魯馬斯蘭之患者的腎結石事件發生率係計算為腎結石事件之總數除以相應時間段內總人-年數。事件發生率之95% CI係使用Poisson分佈之廣義線性模型獲得，除非該發生率為0，在這種情況下，95% CI之上限係使用精確Poisson方法計算。
腎結石事件定義為包括下列至少一者之事件：因腎結石訪視健康照護提供者；針對腎絞痛用藥；及/或腎結石所致的尿路結石(stone passage)及肉眼可見之血尿。
人-年數之總數定義為：對於篩選期，獲得知情同意之日起至第一個魯馬斯蘭劑量的持續時間。對於主要分析期，從第一個魯馬斯蘭劑量直至在第6個月時之劑量投予或對於提前終止治療之患者直至第6個月訪視之日的持續時間。對於延伸分析期，該持續時間以6個月之魯馬斯蘭治療為一段，從第6個月之魯馬斯蘭劑量開始直至最後暴露之日。對於整個研究期間，該持續時間為從第一個魯馬斯蘭劑量直至最後暴露之日。最後暴露之日為投予最後一個劑量之日+84天、分析截止日或研究結束日(最早者)。
為了評估該III期、單臂、開放試驗魯馬斯蘭研究中的上揭基於重量之給藥方案對於髓性腎鈣沉積之效應，使用腎臟超音檢查來量測髓性腎鈣沉積之級別(範圍：0至3)，其中級別愈高，指示疾病嚴重度愈大。每個腎臟之髓性腎鈣沉積級別之變化歸類為3組：無變化；惡化；或改善。在第一個劑量之魯馬斯蘭之前，基線為最後一次評估。無變化為與基線相同之級別；改善為低於基線之級別；惡化為高於基線之級別。總結了從基線至基線後每次訪視的腎鈣沉積級別之變化。亦總結了按從基線至每次基線後訪視之腎鈣沉積級別變化(亦即，腎鈣沉積藉以改善或惡化之級別數字)之患者分佈。在每次基線後訪視時，將測定處於下列4類總體變化(亦即，歸於兩個腎臟)中之患者的數量及相關百分比：無變化；改善；惡化；及中間態(一個腎臟改善，一個腎臟惡化)。經歷腎移植之患者在腎移植之時間點自研究中刪除。
在用魯馬斯蘭治療6個月之後，eGFR保持穩定且不存在腎結石事件發生率之變化。從徵得同意之前的12個月直至魯馬斯蘭治療的前6個月，腎結石事件之低發生率不變。在徵得同意之前12個月，所報告之每人每年的腎結石事件發生率為0.24。在6個月治療期內觀察到的每人每年腎結石事件發生率為0.24，如第23A圖中所示。
此外，在治療期之第6個月至第12個月觀察到的每人每年腎結石發生率為0.12。
第23B圖總結了按治療期的每人每年腎結石事件發生率。
44%的投予魯馬斯蘭之患者在6個月之治療後顯示改善之腎鈣沉積。
在經魯馬斯蘭治療的在基線具有腎鈣沉積且可在基線及第6個月對其進行腎臟超音檢查之患者中，在6個月之魯馬斯蘭治療其內，14例患者中的8例顯示腎鈣沉積改善(5例顯示腎鈣沉積單側改善，且3例顯示腎鈣沉積雙側改善)，6例患者顯示腎鈣沉積無變化，及0例患者顯示腎鈣沉積惡化，如第24圖中所示。
在4例經魯馬斯蘭治療的在基線不具有腎鈣沉積且可可在基線及第6個月對其進行腎臟超音檢查之患者中，無一在6個月後表現出腎鈣沉積之變化。
在研究之第12個月，在基線時具有腎鈣沉積之受試者中，11例受試者顯示腎鈣沉積減少，包括3例單側減少及8例雙側減少。三例患者顯示腎鈣沉積無變化，且沒有患者表現出腎鈣沉積之惡化。在研究之第12個月，在基線不具有腎鈣沉積之受試者無一顯示腎鈣沉積之任何變化、惡化或減少。
實施例8：AD-65585(ILLUMINATE-C)之III期臨床試驗
執行III期、單臂、開放試驗研究，以評估經皮下投予之AD-65585(魯馬斯蘭)在患有第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)之受試者，特別是具有PH1之診斷記錄(藉由遺傳分析證實)的患有藉由eGFR
Figure 110144852-A0202-12-0199-129
45ml/min/1.73m2(或者在年齡<12個月之患者中，血清肌酸酐隨著年齡增長而升高)證明之晚期腎病的受試者中的功效、安全性、藥物動力學及藥效學。
該研究包括具有藉由遺傳分析證實之PH1診斷記錄的嬰兒到成人的全年齡段，在年齡
Figure 110144852-A0202-12-0199-130
12個月之患者中，篩選時的eGFR
Figure 110144852-A0202-12-0199-131
45 mL/min/1.73m2(在年齡<12個月之患者中，具有被認定為隨年齡增長而升高的血清肌酸酐)，如果正在接受吡哆醇療法者在知情同意前的至少90天執行穩定方案並且保持接受該方案直至第6個月訪視，則在篩選時的血漿草酸鹽
Figure 110144852-A0202-12-0200-132
20μmol/L，並且有意願且能夠依從全部研究要求且按照當地及國家要求提供知情同意(並獲得批准，若適用)。正在接受透析之患者僅正在接受血液透析療法並且必須已經持續至少4週接受穩定方案；正在接受血液透析/腹膜透析組合療法或單獨之腹膜透析的患者排除在該研究外。
採用如下之基於體重的給藥方案：
Figure 110144852-A0202-12-0200-45
用魯馬斯蘭治療之持續時間為最多60個月，且最後一個劑量在第57個月訪視時投予。對於每一例患者評估經歷之研究總時間為最多64個月，包括最多4個月之篩選。
AD-65585的未經修飾及經修飾之正義及反義股核苷酸序列提供於上文之實施例1中。
該研究包括2個隊列，隊列A及隊列B。隊列A包括尚不需要透析之患者。隊列B包括正在進行透析治療之患者。透析方式僅限於正在接受血液透析之患者。經歷腎損傷隨時間推移而惡化且開始需要透析療法的隊列A患者轉至隊列B。
針對隊列A之主要結果指標為，從基線至第6個月，血漿草酸鹽之百分比變化。
針對隊列B之主要結果指標為，從基線至第6個月，透析前血漿草酸鹽之百分比變化。
隊列A及隊列B兩者在從基線至第6個月之主要分析期內的次要結果指標包括：透析療程之間的血漿草酸鹽AUC之百分比變化；血漿草酸鹽之絕對變化；尿草酸鹽之變化；對於在徵得同意時年齡為
Figure 110144852-A0202-12-0201-133
2至<18歲之患者，藉由PedsQL總分評估的生活品質(QoL)之變化，以及對於在徵得同意時年齡為
Figure 110144852-A0202-12-0201-134
18隨之患者，藉由KDQOL腎病負擔及腎病對日常生活之影響分量表、以及SF-12軀體健康調查及心理健康調查評估的QoL之變化；以及魯馬斯蘭之血漿PK參數之變化。
隊列A及隊列B兩者從第6個月至研究結束(最多60個月)的次要長期結果治療包括：透析療程之間的血漿草酸鹽AUC之百分比變化；血漿草酸鹽之百分比及絕對值變化；藉由腎臟超音檢查評估之腎鈣沉積變化；透析頻率及模式之變化；腎結石事件頻率之變化；尿草酸鹽之變化；藉由eGFR評估之腎功能變化；在下列系統中之全身性草酸鹽沉積指標之變化：心、皮膚、骨骼及眼；以及，對於在徵得同意時年齡為
Figure 110144852-A0202-12-0201-135
2至<18歲之患者，藉由PedsQL總分評估的生活品質(QoL)之變化，以及對於在徵 得同意時年齡為
Figure 110144852-A0202-12-0202-136
18隨之患者，藉由KDQOL腎病負擔及腎病對日常生活之影響分量表、以及SF-12軀體健康調查及心理健康調查評估的QoL之變化。
對於隊列A及隊列B兩者之探索性結果指標包括：在徵得同意時年齡<6歲之患者的生長參數；在徵得同意時年齡<6歲之患者的發育里程碑之變化；對於在徵得同意時年齡
Figure 110144852-A0202-12-0202-137
2至18歲之患者的藉由EQ-5D-Y及PedsQL(通用模塊及ESRD模塊之個體分量表，及ESRD模塊總分)評估的QoL之變化，以及在徵得同意時年齡
Figure 110144852-A0202-12-0202-138
18歲之患者的藉由EQ-5D-5L評估者；在徵得同意時年齡
Figure 110144852-A0202-12-0202-139
18歲之患者的藉由KDQOL症狀及腎病問題分量表評估的QoL之變化；患者及照護者資源使用(例如，工作/學校出勤率、訪視醫生/醫院)之變化；藉由患者體驗調查問卷及照護者體驗調查問卷評估的患者及照護者體驗之變化；ADA之頻率；尿及血漿乙醇酸鹽之變化。
實施例9：在用魯馬斯蘭治療之後，患有原發性高草酸鹽尿症之患者的全身性草酸鹽沉積降低
藉由針對隊列A及隊列B兩者中之受試者藉由心臟超音波檢查(echo)測定各種心功能參數，包括左心室射出分率(LVEF)、全心室縱向應變(GLS)、及早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)之變化，評估實施例8中揭示之III期、單臂、開放試驗研究中的基於重量之魯馬斯蘭給藥方案對於心全身性草酸鹽沉積的效應。
LVEF為每次心跳時泵送出左心室之血液的百分比。正常的LVEF為約55%至約70%。
左心室全心室縱向應變(GLS)量測心肌縱向長度在收縮期間相較於舒張期間之靜止長度的最大縮短值。在射出分率(EF)之損失變得明顯之前，減少之GLS可以反映收縮功能異常。GLS之正常值為-15.9%至-22.1%。
早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)為左心室(LV)填充壓力的指標。正常的E/e’比率大於8。
在研究啟動之前，在基線(在第一個劑量之魯馬斯蘭之前收集的最後一個非遺漏值)，隊列A及隊列B(n=21)之受試者於心臟超音波的平均左心室射出分率為60.2(±7.8)。在治療之後，在研究之第6個月，隊列A及隊列B(n=20)之受試者於心臟超音波的平均左心室伸出分率為63.4(±7.5)，相對於基線之平均變化為3.5(±6.1)，相對於基線之重要改善(增加)為
Figure 110144852-A0202-12-0203-140
5%。
在研究啟動之前，在基線(在第一個劑量之魯馬斯蘭之前收集的最後一個非遺漏值)，隊列A及隊列B(n=21)之受試者的全心室縱向應變為-19.3(±6.0)。在治療之後，在研究之第6個月，隊列A及隊列B(n=20)之受試者的全心室縱向應變為-21.0(±6.1)，相對於基線之平均變化為-1.9(±4.8)，相對於基線之改善(降低)為
Figure 110144852-A0202-12-0203-141
2%。
在研究啟動之前，在基線(在第一個劑量之魯馬斯蘭之前收集的最後一個非遺漏值)，隊列A及隊列B(n=18)之受試者的早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度為6.77(±2.28)。在治療之後，在研究之第6個月，隊列A及隊列B(n=17)之受試者的早期二尖瓣流入速度：二尖瓣 環早期舒張速度為7.34(±3.92)，相對於基線之平均變化為0.72(±3.88)，相對於基線之改善(增加)為
Figure 110144852-A0202-12-0204-142
2%。
此等資料表明，基於重量之魯馬斯蘭給藥方案在患有原發性高草酸鹽尿症之患者中減少心全身性草酸鹽沉積並改善心功能。
實施例10：魯馬斯蘭用於腎功能受損的患有原發性高草酸鹽尿症之患者：來自3期ILLUMINATE-C試驗之6個月分析的資料
背景
第1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)為一種罕見之遺傳性疾患，以導致進行性腎病之肝草酸鹽過度產生為特徵。隨著腎功能下降，草酸鹽清除受損並且血漿草酸鹽(POx)增加，導致全身性草酸鹽沉積。在3b至5期慢性腎病(CKD)中，升高之POx直接與草酸鹽沉積之病理生理學相關聯，且POx之減少為相關臨床試驗終點。魯馬斯蘭係一種經設計以減少肝草酸鹽產生之RNA干擾治療劑，其適用於全部年齡組之PH1治療。來自ILLUMINATE-C試驗(EudraCT：2019-0013346-17)之資料表明，在持續6個月接受魯馬斯蘭的腎功能受損之PH1患者中的POx之實質性減少及可接受之安全性，該等患者包括正在接受血液透析(HD)之患者。在隊列A(無HD)及隊列B(正在接受HD)中，魯馬斯蘭分別導致33.33%(95%CI：-15.16，81.82)及42.43%(95%CI：34.15，50.71)最小平方(LS)的從基線至第6個月(主要終點)之POx平均減少。此處，呈現了來自ILLUMINATE-C之6個月主要分析期的其他結果。
方法
ILLUMINATE-C為正在進行的3期、單臂研究，使用兩個隊列，亦即，隊列A(N=6；在研究開始時無HD)及隊列B(N=15；正在接受HD)。在6個月之初步研究期之後是最多54個月的延伸期(EP)。關鍵納入準則包括經遺傳證實之PH1、eGFR
Figure 110144852-A0202-12-0205-143
45mL/min/1.73m2及POx
Figure 110144852-A0202-12-0205-144
20μmol/L。患者接受魯馬斯蘭的基於重量之皮下給藥。結果包括使用心臟超音波圖對心全身性草酸鹽沉積之評估，藉由腎臟超音檢查對髓性腎鈣沉積之評估，度腎結石事件之評估，以及對PH1之繁重症狀之評估。
結果
全部21例患者(43%女性；76%白種人；中位年齡8[範圍，0至59]歲)皆完成6個月之主要分析期。對於隊列A患者，中位血漿草酸鹽水平為57.94μmol/L，且基線時針對體表面積(BSA)校正之中位24小時尿草酸鹽排泄為2.01mmol/24hr/1.73m2。對於隊列B患者，中位血漿草酸鹽水平為103.65μmol/L。
兩個隊列中之患者在早至第1個月即具有血漿草酸鹽減少。對於隊列A，血漿草酸鹽水平從基線至第6個月(平均從第3個月至第6個月)之變化為-33.3%(95%)的最小平方(LS)均值差異。
在基線時左心室射出分率異常(LVEF；異常定義為LVEF<55%)之患者中，隊列A中之1/1例患者及隊列B中之2/4例患者在第6個月顯示
Figure 110144852-A0202-12-0205-145
5%改善。在基線時全心室縱向應變異常(GLS；對於預測結果，比LVEF更敏感的LV收縮性之指標；異常定義為GLS<15%)之患者中，隊列A中之1/1例患者及隊列B中之3/3例患者在第6個月顯示
Figure 110144852-A0202-12-0205-146
2%改善。在隊列A中，5/6例患者在基線時具有腎鈣沉積；在第6個月時，2例 保持穩定，無一惡化，且3例得以改善。在隊列A中，1例患者在基線時不具有腎鈣沉積症，但在第6個月具有雙側惡化。在隊列B中，2/11例患者在基線時具有腎鈣沉積；兩者皆得以改善(1例單側改善，1例雙側改善)。在隊列A中，每人每年的腎結石事件發生率在徵得同意之前的12個月內為3.20(95% CI：1.96，5.22)，而在魯馬斯蘭治療期間的前6個月內為1.48(95% CI：0.55，3.92)。隊列B中之患者係預期具有腎結石事件。對於兩個隊列之患者，在基線時最為繁重之症狀(包括疲勞、惡心/食慾下降、骨痛及活動能力降低)在第6個月時皆得以改善或保持穩定；該等症狀無一惡化。
結論
魯馬斯蘭治療在患有PH1及晚期腎病之全年齡患者中導致POx的實質性減少。關於全身性草酸鹽沉積之心臟測量的觀察結果，連同腎結石事件及腎鈣沉積結果，與來自全身性儲存之草酸鹽調用一致。此等長期結果之資料將繼續收集並在EP中進一步評估之。此等結果連同來自ILLUMINATE-A及ILLUMINATE-B之先前報告，證明了魯馬斯蘭在PH1疾病嚴重性中跨全面的有效性。
<110> 美商艾拉倫製藥股份有限公司(ALNYLAM PHARMACEUTICALS,INC.)
<120> 用於抑制HAO1(羥基酸氧化酶1(乙醇酸氧化酶)基因表現的方法及組成物(METHODS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITION OF HAO1(HYDROXYACID OXIDASE 1(GLYCOLATE OXIDASE))GENE EXPRESSION)
<130> 121301-19920
<140>
<141>
<150> 63/182,608
<151> 2021-04-30
<150> 63/120,150
<151> 2020-12-01
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1746
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
Figure 110144852-A0202-12-0207-46
Figure 110144852-A0202-12-0208-47
<210> 2
<211> 1746
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
Figure 110144852-A0202-12-0208-48
Figure 110144852-A0202-12-0209-49
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：RFGF肽
<400> 3
Figure 110144852-A0202-12-0209-50
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的描述：RFGF模擬肽
<400> 4
Figure 110144852-A0202-12-0210-51
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類免疫缺陷病毒
<400> 5
Figure 110144852-A0202-12-0210-52
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Drosophila sp.
<400> 6
Figure 110144852-A0202-12-0210-53
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探針
<400> 7
Figure 110144852-A0202-12-0210-54
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探針
<400> 8
Figure 110144852-A0202-12-0211-57
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成探針
<400> 9
Figure 110144852-A0202-12-0211-58
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 10
Figure 110144852-A0202-12-0211-59
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 11
Figure 110144852-A0202-12-0211-60
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 12
Figure 110144852-A0202-12-0211-61
<210> 13
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 13
Figure 110144852-A0202-12-0212-62
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 14
Figure 110144852-A0202-12-0212-63
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 15
Figure 110144852-A0202-12-0212-64

Claims (130)

  1. 一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重低於約10公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而抑制該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  5. 一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現的方法，該方法包含
    向該受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重為約10kg至約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約4mg/kg之約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而抑制該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
  6. 如請求項5所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  7. 如請求項5或6所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  8. 如請求項5至7中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  9. 一種抑制患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的羥基酸氧化酶(HAO1)之表現的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重高於約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而抑制該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的HAO1之表現。
  10. 如請求項9所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  11. 如請求項9或10所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  12. 如請求項9至11中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之方法，其中抑制該受試者之HAO1表現減少該受試者之血漿草酸鹽水平。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之方法，其中抑制該受試者之HAO1表現減少該受試者之髓質腎鈣沉積。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之方法，其中抑制該受試者之HAO1表現減少該受試者之全身性草酸鹽沉積。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該全身性草酸鹽沉積係選自由下列所組成之群組：腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及眼草酸鹽沉積。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該受試者全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之方法，其中抑制該受試者之HAO1表現減輕該受試者之血液疾患。
  19. 如請求項18所述之方法，其中該血液疾患為貧血。
  20. 一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重低於約10公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義 股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而治療該患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  22. 如請求項20或21所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  23. 如請求項20至22中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  24. 一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重為約10kg至約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並 且該維持期包含向該受試者投予約4mg/kg之約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而治療該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
  25. 如請求項24所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  26. 如請求項24或25所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  27. 如請求項24至26中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  28. 一種治療患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重高於約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而治療該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者。
  29. 如請求項28所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  30. 如請求項28或29所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  31. 如請求項28至30中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月， 開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  32. 如請求項20至31中任一項所述之方法，其中治療該受試者減少該受試者之血漿草酸鹽水平。
  33. 如請求項20至32中任一項所述之方法，其中治療該受試者減少該受試者之髓質腎鈣沉積。
  34. 如請求項20至33中任一項所述之方法，其中治療該受試者減少該受試者之全身性草酸鹽沉積。
  35. 如請求項34所述之方法，其中該全身性草酸鹽沉積係選自由下列所組成之群組：腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及眼草酸鹽沉積。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該受試者全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積。
  37. 如請求項20至36中任一項所述之方法，其中治療該受試者減輕該受試者之血液疾患。
  38. 如請求項37所述之方法，其中該血液疾患為貧血。
  39. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重低於約10公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的血漿草酸鹽。
  40. 如請求項39所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  41. 如請求項39或40所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  42. 如請求項39至41中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  43. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重為約10kg至約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約4mg/kg之約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
  44. 如請求項43所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  45. 如請求項43或44所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  46. 如請求項43至45中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月 投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  47. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之血漿草酸鹽的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重高於約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的血漿草酸鹽。
  48. 如請求項47所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  49. 如請求項47或48所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  50. 如請求項47至49中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  51. 如請求項39至50中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之後，該血漿草酸鹽水平降低約35%或更多。
  52. 如請求項39至51中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之後，該血漿草酸鹽水平降低至正常範圍內。
  53. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重低於約10公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的髓性腎鈣沉積。
  54. 如請求項53所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  55. 如請求項53或54所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  56. 如請求項53至54中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  57. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積的方法，該方法包含
    向該受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重為約10kg至約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約4mg/kg之約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
  58. 如請求項57所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  59. 如請求項57或58所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  60. 如請求項57至59中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月， 開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  61. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之髓性腎鈣沉積的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重高於約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的髓性腎鈣沉積。
  62. 如請求項61所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  63. 如請求項61或62所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  64. 如請求項61至63中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  65. 如請求項53至64中任一項所述之方法，其中在一個腎臟中減少髓性腎鈣沉積。
  66. 如請求項53至64中任一項所述之方法，其中在兩個腎臟中減少髓性腎鈣沉積。
  67. 如請求項44至66中任一項所述之方法，其中該髓性腎鈣沉積之減少係藉由腎臟超音測定。
  68. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積的方法，該方法包含
    向該受試者投予抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重低於約10公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並 且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者的全身性草酸鹽沉積。
  69. 如請求項68所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  70. 如請求項68或69所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  71. 如請求項68至70中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次。
  72. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積的方法，該方法包含
    向該受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重為約10kg至約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約4毫克每公斤(mg/kg)至約8mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約4mg/kg之約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
  73. 如請求項72所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  74. 如請求項72或73所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  75. 如請求項72至74中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約6mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約6mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  76. 一種減少患有原發性高草酸鹽尿症之人類受試者之全身性草酸鹽沉積的方法，該方法包含
    向該受試者投予治療有效量的抑制HAO1之表現的雙股RNAi劑或其鹽，
    其中該受試者之體重高於約20公斤(kg)，
    其中該雙股RNAi劑或其鹽係以包含負載期及附隨之維持期的給藥方案投予，
    其中該負載期包含向該受試者投予約1毫克每公斤(mg/kg)至約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每個月投予一次，持續約三個月，並且該維持期包含向該受試者投予約1mg/kg之約5mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑，約每三個月投予一次，
    其中該雙股RNAi劑包含形成雙股區域之一正義股及一反義股，
    其中該正義股包含來自核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’之至少15個接續核苷酸，且該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少15個接續核苷酸，
    從而減少該患有原發性高草酸鹽尿症之受試者的全身性草酸鹽沉積。
  77. 如請求項76所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月。
  78. 如請求項76或77所述之方法，其中該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  79. 如請求項76至77中任一項所述之方法，其中該負載期包含向該受試者投予約3mg/kg之劑量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每個月投予一次，持續約三個月；並且在該負載期之最後一個劑量之後一個月，開始該維持期，且該維持期包含向該受試者投予約3mg/kg之加量的該雙股RNAi劑或其鹽，約每三個月投予一次。
  80. 如請求項68至79中任一項所述之方法，其中該全身性草酸鹽沉積係選自由下列所組成之群組：腎草酸鹽沉積、心草酸鹽沉積、血管草酸鹽沉積、骨骼草酸鹽沉積、皮膚草酸鹽沉積及眼草酸鹽沉積。
  81. 如請求項80所述之方法，其中該受試者全身性草酸鹽沉積為心草酸鹽沉積。
  82. 如請求項68至81中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之後，左心室射出分率(LVEF)增加至少約5%。
  83. 如請求項68至82中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之後，全心室縱向應變(GLS)降低至少約2%。
  84. 如請求項68至83中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之後，早期二尖瓣流入速度：二尖瓣環早期舒張速度(E/e’)增加至少約2%。
  85. 如請求項68至84中任一項所述之方法，其中該全身性草酸鹽沉積之減少係藉由心臟超音波檢查測定。
  86. 如請求項1至85中任一項所述之方法，其中該RNAi劑或其鹽係於醫藥組成物中投予。
  87. 如請求項1至86中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑為鹽形式。
  88. 如請求項1至87中任一項所述之方法，復包含對該受試者投予額外之治療劑。
  89. 如請求項1至88中任一項所述之方法，其中該原發性高草酸鹽尿症為第I型原發性高草酸鹽尿症(PH1)。
  90. 如請求項1至89中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之前，該受試者患有終末期腎病(ESRD)。
  91. 如請求項1至89中任一項所述之方法，其中在投予該雙股RNAi之前，該受試者不患有終末期腎病(ESRD)。
  92. 如請求項1至91中任一項所述之方法，其中該受試者正在進行透析。
  93. 如請求項1至91中任一項所述之方法，其中該受試者未進行透析。
  94. 如請求項1至93中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑係經皮下向該受試者投予。
  95. 如請求項1至94中任一項所述之方法，其中該反義股包含來自核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之至少17個接續核苷酸。
  96. 如請求項95所述之方法，其中該反義股包含5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’之核苷酸序列。
  97. 如請求項1至96中任一項所述之方法，其中該正義股包含核苷酸序列5’-GACUUUCAUCCUGGAAAUAUA-3’，且該反義股包含核苷酸序列5’-UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCA-3’。
  98. 如請求項1至97中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑包含至少一個經修飾之核苷酸。
  99. 如請求項1至98中任一項所述之方法，其中該正義股之核苷酸中之不超過五個及該反義股之核苷酸中之不超過五個係未經修飾之核苷酸。
  100. 如請求項1至99中任一項所述之方法，其中該正義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸包含修飾。
  101. 如請求項98至100中任一項所述之方法，其中該經修飾之核苷酸之至少一者係選自由下列所組成之群組：去氧核苷酸、3’端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、鎖核苷酸、解鎖核苷酸(unlocked nucleic acid)、構形受限核苷酸(conformationally restricted nucleotide)、拘束(constrained)之乙 基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2’-胺基修飾之核苷酸、2’-O-烯丙基修飾之核苷酸、2’-C-烷基修飾之核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2’-O-烷基修飾之核苷酸、嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己基修飾之核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5’-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模擬物之核苷酸、包含磷酸乙烯酯之核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)之核苷酸、包含胸苷二醇核酸(GNA)S異構物之核苷酸、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2’-去氧胸苷-3’磷酸酯之核苷酸、包含2’-去氧鳥苷-3’磷酸酯之核苷酸、2’-O-十六烷基核苷酸、包含2’-磷酸酯之核苷酸、胞苷-2'-磷酸酯核苷酸、鳥苷-2'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-胞苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-腺苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-鳥苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-O-十六烷基-尿苷-3'-磷酸酯核苷酸、5’-乙烯基磷酸酯(VP)、2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧尿苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯核苷酸、2'-去氧尿苷核苷酸、以及鏈接至膽固醇基衍生物及十二酸雙癸基醯胺基團之末端核苷酸；及其組合。
  102. 如請求項1至101中任一項所述之方法，其中至少一股包含具有至少1個核苷酸之3’懸垂，或至少一股具有至少2個核苷酸之3’懸垂。
  103. 如請求項1至102中任一項所述之方法，其中該正義股及該反義股各自獨立地為15至30個核苷酸之長度。
  104. 如請求項1至102中任一項所述之方法，其中該正義股及該反義股獨立地為19至30個核苷酸之長度。
  105. 如請求項1至102中任一項所述之方法，其中該正義股及該反義股各自獨立地為19至25個核苷酸之長度。
  106. 如請求項1至102中任一項所述之方法，其中該正義股及該反義股各自獨立地為19至23個核苷酸之長度。
  107. 如請求項1至102中任一項所述之方法，其中該正義股及該反義股各自獨立地為21至23個核苷酸之長度。
  108. 如請求項1至107中任一項所述之方法，其中該雙股區域為17至23個核苷酸對之長度。
  109. 如請求項1至107中任一項所述之方法，其中該雙股區域為17至25個核苷酸對之長度。
  110. 如請求項1至107中任一項所述之方法，其中該雙股區域為23至27個核苷酸對之長度。
  111. 如請求項1至107中任一項所述之方法，其中該雙股區域為19至21個核苷酸對之長度。
  112. 如請求項1至107中任一項所述之方法，其中該雙股區域為21至23個核苷酸對之長度。
  113. 如請求項1至112中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑復包含至少一個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。
  114. 如請求項113所述之方法，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之3’端。
  115. 如請求項113所述之方法，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之5’端。
  116. 如請求項113所述之方法，其中該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結位於一股之5’端及3’端兩處。
  117. 如請求項116所述之方法，其中該雙股RNAi劑包含6至8個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
  118. 如請求項1至117中任一項所述之方法，其中該雙股RNAi劑復包含附接於該正義股之3’末端的配體。
  119. 如請求項1至118中任一項所述之方法，其中該配體為透過二價或三價分支鏈之連接子附接的一個或多個GalNAc衍生物。
  120. 如請求項1至119中任一項所述之方法，其中該配體為
    Figure 110144852-A0202-13-0026-153
  121. 如請求項120所述之方法，其中該雙股RNAi劑結合至如下述式中所示之配體
    Figure 110144852-A0202-13-0027-66
    ，其中X為O或S。
  122. 如請求項1至121中任一項所述之方法，
    其中，該正義股之基本上全部核苷酸包含選自由2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所組成之群組的修飾，
    其中，該正義股包含兩個位於5’端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，
    其中，該反義股之基本上全部核苷酸包含選自由2’-O-甲基修飾及2’-氟修飾所組成之群組的修飾，
    其中，該反義股包含兩個位於5’端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結以及兩個位於3’端之硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，並且
    其中，該正義股在3’端結合至透過分支鏈之二價或三價連接子附接的一個或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
  123. 如請求項97至122中任一項所述之方法，其中該正義股與核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’相異不超過3個鹼基，且該反義股與核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’相異不超過3個鹼基，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  124. 如請求項97至122中任一項所述之方法，其中該正義股與核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’相異不超過2個鹼基，且該反義股與核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’相異不超過2個鹼基，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  125. 如請求項97至122中任一項所述之方法，其中該正義股與核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’相異不超過1個鹼基，且該反義股與核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’相異不超過1個鹼基，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  126. 如請求項97至122中任一項所述之方法，其中該正義股包含核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’，且該反義股包含核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  127. 如請求項126所述之方法，其中該正義股由核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’組成，且該反義股由核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’組成，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結。
  128. 如請求項97至122中任一項所述之方法，其中該正義股包含核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’，且該反義股包含核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結，並且
    其中GalNAc配體結合至如下圖所述之正義股之3’末端：
    Figure 110144852-A0202-13-0029-67
    ，其中X為O。
  129. 如請求項97至122中任一項所述之方法，其中該正義股由核苷酸序列5’-gsascuuuCfaUfCfCfuggaaauaua-3’組成，且該反義股由核苷酸序列5’-usAfsuauUfuCfCfaggaUfgAfaagucscsa-3’組成，
    其中，a、g、c及u分別為2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；Af、Gf、Cf及Uf分別為2'-氟A、G、C及U；並且s為硫代磷酸酯鏈結，並且
    其中GalNAc配體結合至如下圖所述之正義股之3’末端：
    Figure 110144852-A0202-13-0030-68
    ，其中X為O。
  130. 如請求項1至129中任一項所述之方法，其中該維持期在該負載期之最後一個劑量之後一個月開始。
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