TW202407100A - 用於處置ｓｎｃａ相關疾病的ｓｎｃａ－靶向ｓｉｒｎａ組成物 - Google Patents

用於處置ｓｎｃａ相關疾病的ｓｎｃａ－靶向ｓｉｒｎａ組成物 Download PDF

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Abstract

本揭露係關於靶向SNCA基因(特定而言，於CNS組織中)的雙股核糖核酸(dsRNAi)劑及組成物，以及抑制SNCA基因之表現的方法及使用此類dsRNAi劑及組成物治療患有SNCA相關神經退化性疾病或病症之受試者的方法，該等疾病或病症例如巴金森氏症(PD)、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)及其他突觸核蛋白病變。

Description

用於處置SNCA相關疾病的SNCA-靶向SIRNA組成物
相關申請案之交叉引用
基於35 U.S.C.§ 119(e)，本申請係關於並且主張於2022年4月2日遞交之題為「SNCA-Targeting siRNA Compositions for Treating SNCA-Associated Disease」之美國臨時專利申請第63/326,813號及於2022年4月1日遞交之題為「SNCA-Targeting siRNA Compositions for Treating SNCA-Associated Disease」之美國臨時專利申請第63/326,770號之優先權。前述專利申請案之整體內容係藉由該引用併入本文。
本揭露通常係關於SNCA-靶向RNAi劑及方法。
序列表
本申請含有序列表，其業經以可延伸標示語言(XML)格式提交電子版，且係藉由引用以其整體併入本文。該XML複本於2023年3月29日創建，名為ALN-461 WO.xml，大小為3242KB。
SNCA基因編碼突觸前神經元蛋白質α-突觸核蛋白(本文中亦稱為alpha-突觸核蛋白或突觸核蛋白-α)，其業經在遺傳學上及神經病理學上與巴金森氏症(PD)關聯(Stefanis,L.Cold Spring Harb Perspect Med.2：a009399)。α-突觸核蛋白被認為以多種方式有助於PD發病機制，但通常咸信，α-突觸核蛋白之異常的可溶性寡聚物構形，稱為基原纖維，係毒性物質，其等透過對各種細胞內標靶(包括突觸功能)的效應來媒介細胞恆定的破壞及神經元死亡。此外，咸信，經分泌之α-突觸核蛋白對於鄰近細胞發揮有害效應，因此可能有助於疾病傳播。儘管α-突觸核蛋白以何種程度牽涉到PD之全部病例中尚不明確，但當該蛋白失調時，由該蛋白所賦予的毒性功能呈現潛在有價值之治療策略，不僅用於PD而且用於稱為突觸核蛋白病變的其他神經退化性病況，該等病況全部由於α-突觸核蛋白蓄積而展現共有神經病理學印記，稱為路易氏體(LB)及路易氏神經突(LN)。除PD之外，此等已建檔或疑似的SNCA相關突觸核蛋白病包括而不限於，多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
PD、LBD及MSA為具有SNCA腦病理學的神經退化性病症之三種最盛行之實例。PD為最常見的運動病症，並且以僵直、運動減退、震顫及姿勢不穩為特徵。咸信，PD在全世界範圍內影響大約400至600萬人。LBD代 表了全部失智症的5%-15%。除了健忘及經常波動的其他失智症候之外，LBD患者典型係苦於反復跌倒及幻覺。MSA為一種快速進展之孤兒病症，其在幾年內導致受影響之受試者的嚴重運動障礙。據報導，MSA之盛行率在每100,000人3.4-4.9例之間。
除了在α-突觸核蛋白病變中觀察到的神經病理學變化之外，在受影響的腦區中，α-突觸核蛋白之量級通常亦增加(Klucken et al.,2006)。
α-突觸核蛋白單體、四聚物及纖維狀集聚物為具有腦鐵蓄積之神經退化中的路易氏體(LB)樣神經元內包涵物、神經膠質細胞包涵物及軸突球體之主要組分。主要由α-突觸核蛋白組成的路易氏相關病理學(LRP)係存在於大多數阿茲海默症屍體剖檢中，並且患者中的較高量級之α-突觸核蛋白業經與認知能力下降關聯(Twohig et al.(2019)Molecular Neurodegeneration)。SNCA基因中的體染色體顯性突變，包括A53T、A30P、E46K及H50Q等(Zarranz et al.(2004)Ann.Neurol.55,164-173，Choi et al.(2004)FEBS Lett.576,363-368，及Tsigelny et al.(2015)ACS Chem.Neurosci.6,403-416)、A53T(Polymeropoulos et al.(1997)Science)、以及三倍體及複製體，業經鑑定為在患有相關神經退化性疾病之家庭中運行。前述者指示，不僅SNCA中之致病性突變影響疾病結果，而且α-突觸核蛋白之增加亦影響疾病結果。
SNCA突變於疾病發作中之作用尚未充分理解；惟，證據表明，當正常α-突觸核蛋白超出一定量級(Stefanis et al.(2012)Cold Spring Harb Perspect Med.)且/或與細胞脂質及囊泡異常交互作用(reviewed in Kiechler et al.(2020)Front.Cell Dev.Biol)時，該蛋白之固有功能會產生毒性。顯然與此一致的是，與基因轉殖過表現者不同，SNCA缺失小鼠顯示無明顯的神經病理學或行 為學表型(Abeliovich et al.(2000)Neuron)。亦表明，SNCA之轉錄後調整透過結合至該基因之3'端的內源性microRNA發生(Junn et al.(2009)PNAS 106：13052-13057；Doxakis(2010),JBC)。再者，對SNCA中家族性點突變的研究表明受抑制的表現，尤其是在具有延長之疾病發作的情況下(Markopoulou et al.(1999)Ann Neurol.46(3)：374-81及Kobayashi et al.(2003)Brain 126(Pt 1)：32-42)。類似地，Voutsinas等人(2010)Hum Mutat.31(6)：685-91)發現，即便野生型SNCA信使RNA(mRNA)之過表現亦為疾病發作之原因。此等資料表明，總SNCA量級之抑制將會降低α-突觸核蛋白誘導之毒性。
對於突觸核蛋白病變，包括PD、多系統萎縮及路易氏體失智症，沒有疾病修飾治療，並且治療選項有限，例如，僅緩和性。舉例而言，當下，僅症狀治療可用於PD患者(藉由取代腦中活性多巴胺之損失)及AD患者(亦即，膽鹼酯酶抑制劑)。用於α-突觸核蛋白病的現有治療策略無一針對潛在疾病製程。
因此，注意到數種神經退化性病症(突觸核蛋白病變)中SNCA的上揭參與，對於藥劑特定而言針對中樞神經系統(CNS)的藥劑仍存在需求，鑑於α-突觸核蛋白於CNS組織中的所揭示之功能性，該功能性使用細胞自身之RNAi機制來選擇性地且有效地緘默化SNCA基因(例如，消除或降低毒性α-突觸核蛋白物質之效應)，該機制具有高生物活性及活體內安定性兩者，並且該功能性可有效地抑制標靶SNCA基因之表現。
本揭露提供RNAi劑組成物，其影響突觸核蛋白α(SNCA)基因之RNA轉錄本的RNA誘導之緘默化複合體(RISC)介導之裂解。SNCA基因可 係處於細胞內，例如受試者諸如人類體內之細胞內。於某些態樣中，該RNAi劑旨在且針對CNA之細胞及/或組織中的SNCA之減弱。本揭露亦提供使用本揭露之RNAi劑組成物的方法，用於抑制SNCA基因之表現或用於治療將會受益於抑制或降低SNCA基因之表現的受試者，例如，罹患或易患SNCA相關神經退化性疾病或病症的受試者，該疾病或病症為，例如，PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症及亨汀頓症。
據此，一方面，本揭露提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制SNCA之表現，其中該dsRNA劑包括具有5'-終端及3'-終端之有義股以及具有5'-終端及3'-終端之反義股，其中該有義股及反義股形成雙股區域，其中：有義股包括表3的SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：164或SEQ ID NO：142至149、151至156、158至163或165至184之核苷酸序列，具有0或1個誤配；該dsRNA劑之有義股包括接附於自該有義股之5'-末端計數之位置6或16處的親脂性部分；反義股包括表3的SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：207或SEQ ID NO：185至192、194至199、201至206或208至227之核苷酸序列，具有0或1個誤配；該dsRNA劑不包括GalNAc修飾；並且該dsRNA劑包括定位在自該dsRNA劑之有義股及反義股各者之相應3'-末端及5'-末端倒數第二個及最後一個核苷酸間鍵聯處的八個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
據此，一方面，本揭露提供一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制SNCA之表現，其中該dsRNA劑包括具有5'-終端及3'-終端之有義股以及具有5'-終端及3'-終端之反義股，其中該有義股及反義股形成雙股區域，其中：該有義股包括表3之核苷酸序列(SEQ ID NO：142至184)，具有0或1個誤配；該dsRNA劑之有義股包括接附於自該有義股之5'-末端計數之位置6或16處的親脂性部分；該反義股包括表3之核苷酸序列(SEQ ID NO：185至227)，具有0或1個誤配；該dsRNA劑不包括GalNAc修飾；並且該dsRNA劑包括六個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，其中該六個硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯定位在該反義股之5'末端及3'末端之倒數第二個及最後一個核苷酸間鍵聯處以及該有義股之5'末端之倒數第二個及最後一個核苷酸間鍵聯處。
於某些態樣中，該親脂性部分為脂肪族、脂環族或多脂環族化合物。
於某些態樣中，該親脂性部分為脂質、膽固醇、視網酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)絡膽酸、二甲氧基三苯甲基或啡
Figure 112112698-A0202-12-0006-31
。
於一個態樣中，該親脂性部分含有飽和或不飽和C4-C30烴鏈及由下列所組成的視需要含有之官能基：羥基、胺、羧酸、磺酸根、磷酸根、硫醇、疊氮化物或炔。
於一些態樣中，該親脂性部分含有飽和或不飽和C6-C18烴鏈。視需要，該親脂性部分含有飽和或不飽和C16烴鏈。
於一態樣中，該親脂性部分為
Figure 112112698-A0202-12-0007-1
，其中B為核苷酸鹼基或核苷酸鹼基類似物。視需要，B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
於某些態樣中，該親脂性部分係經由連接子或載劑接附。視需要，該親脂性部分係經由載劑接附，該載劑替換該有義股之位置6或16處(自該有義股之5'-終端核苷酸作為位置1計數)的核苷酸。於一想團態樣中，該載劑為環狀基團(例如，吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌
Figure 112112698-A0202-12-0007-32
基、[1,3]二氧雜環戊基、
Figure 112112698-A0202-12-0007-33
唑啶基、異
Figure 112112698-A0202-12-0007-34
唑啶基、
Figure 112112698-A0202-12-0007-35
啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
Figure 112112698-A0202-12-0007-36
啉基、嗒
Figure 112112698-A0202-12-0007-37
基、四氫呋喃基或十氫萘基)或為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之非環狀部分。
於一些態樣中，該親脂性部分係經由連接子接合至該dsRNA劑，該連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸根、胺、醯胺、馬來亞醯胺-硫醚、二硫醚、磷酸二酯、磺醯胺鏈結、點擊反應之產物或胺基甲酸根。
於一個態樣中，該親脂性部分係經由生物可裂解連接子接合之該dsRNA劑，該連接子為DNA、RNA、二硫醚、醯胺、半乳胺糖的經官能化之單醣或寡醣、葡萄糖胺、半乳糖及/或甘露糖或其組合。
於某些態樣中，該有義股或該反義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
於一個態樣中，該有義股之全部核苷酸皆為經修飾之核苷酸。
於另一態樣中，該反義股之全部核苷酸皆為經修飾之核苷酸。
於一額外態樣中，該有義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸係經修飾之核苷酸。
於某些態樣中，該dsRNA劑具有一個或多個經修飾之核苷酸，其中該一個或多個經修飾之核苷酸中之至少一者為去氧核苷酸、3'-末端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、2'-C-烷基修飾之核苷酸、2'-羥基修飾之核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2'-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物之核苷酸、包含乙烯基磷酸酯之核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)之核苷酸、包含胸苷-二醇核苷(GNA)S-異構物之核苷酸、包含2-羥基甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯之核苷酸、包含2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯之核苷酸、或連接至膽固醇基衍生物及十二烷酸雙癸基醯胺基團之末端核苷酸。
於另一態樣中，該dsRNA劑包括至少一個經修飾之核苷酸，該經修飾之核苷酸為2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-C16(2'-O-十六烷基)修飾之核苷酸或包括乙烯基磷酸酯之核苷酸。視需要，該dsRNA劑包括下列修飾中各者之至少一者：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-C16(2'-O-十六烷基)修飾之核苷酸及包括乙烯基磷酸酯之核苷酸。
於某些態樣中，該等dsRNA劑復包括在反義股之5'端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。視需要，該磷酸酯模擬物為5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
於一些態樣中，該dsRNA劑包括如表2中所示的經修飾之核苷酸模式(其中2'-C16、2'-O-甲基、2'-去氧、GNA、硫代磷酸酯、乙烯基膦酸酯及2'-氟修飾之定位係如表2中所展示，而無論所展示之dsRNA劑的個別核苷酸鹼基序列如何)。
於一個態樣中，該dsRNA劑具有AD-1804698、AD-1804699、AD-1747575、AD-1747576、AD-1804700、AD-1747577、AD-1747578、AD-1747579、AD-1747580、AD-1747581、AD-1804701、AD-1747582、AD-1804702、AD-1804703、AD-1804704、AD-1747583、AD-1804705、AD-1804706、AD-1804707、AD-1804708、AD-1804709、AD-1747591、AD-1747585、AD-1804710、AD-1804711、AD-1747586、AD-1804712、AD-1747587、AD-1804713、AD-1804714、AD-1747588、AD-1804715、AD-1804716、AD-1804717、AD-1804718、AD-1804719、AD-1804720、AD-1804721、AD-1804722、AD-1804723、AD-1804724、AD-1804725或AD-1804726之有義股核苷酸序列。視需要，該dsRNA劑具有AD-1747580、AD-1747583或AD-1747585之有義股核苷酸序列。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股具有下列修飾模式中之一者：5'-nsnsnnn(Nhd)NfnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'、5'-nsnsnnnnnnNfNfNfnnnn(Nhd)nnnsnsn-3'或5'-nsnsnnn(Nhd)nnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'，其中n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，並且(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸。
於態樣中，該dsRNA劑之有義股具有下列修飾模式：5'-(L1)(inv)snnnnnnnnNfNfNfnnnnnnnnns(inv)(L2)-3'，其中各(inv)為反向核苷酸(例如，反向無鹼基核苷酸，諸如反向無鹼基核糖核苷酸)，以及，(L1)及(L2)中之一者為包含親脂性基團之配體(例如，包含C16烷基或C16烯基)，並且(L1)及(L2)中之另一者不存在或為氫。
於一些態樣中，該dsRNA劑之反義股具有下列修飾模式中之一者：5'-VPnsdNsnndNndNnnnndNnNfnnnnnnnsnsn-3'、5'-VPnsNfsnndNn(Ngn)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'或5'-VPnsNfsnndNn(N2p)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，dN為2'-去氧-核苷酸，Nf為2'-氟-核苷酸，並且(Ngn)為二醇核酸S-異構物，並且N2p為2'-磷酸酯核苷酸。
於態樣中，該dsRNA劑之反義股具有下列修飾模式中之一者：5'-ZnsdNsnndNndNnnnndNnNfnnnnnsnsn-3'、5'-ZnsNfsnndNn(Ngn)nnnnnnNfnNfnnnsnsn-3'、5'-ZnsNfsnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnsNfsn-3'、5'-ZnsNfsnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnsnsn-3'、5'-ZnsNfsnNfnNfnnnnnNfnNfnNfnNfnsNfsn-3'、5'-ZnsNfsnsNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfsn-3'、5'-ZnsNfsnsNfnNfnnnnnNfnNfnNfnNfnNfsn-3'或5'-ZnsNfsnsNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnNfnnsn-3'，其中Z為5'-磷酸酯模擬物，諸如5'-環丙基膦酸酯(5'-CP)。(如本文中所用，5'-CP之結構為
Figure 112112698-A0202-12-0010-2
。)
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnn(Nhd)NfnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsdNsnndNndNnnnndNnNfnnnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，並且(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnn(Nhd)NfnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsNfsnndNn(Ngn)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，並且(Ngn)為二醇核酸S-異構物。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnn(Nhd)NfnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsNfsnndNn(N2p)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，(Ngn)為二醇核酸S-異構物，並且N2p為2'-磷酸酯核苷酸。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnnnnnNfNfNfnnnn(Nhd)nnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsdNsnndNndNnnnndNnNfnnnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，並且(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnnnnnNfNfNfnnnn(Nhd)nnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsNfsnndNn(Ngn)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，並且(Ngn)為二醇核酸S-異構物。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnnnnnNfNfNfnnnn(Nhd)nnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsNfsnndNn(N2p)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，(Ngn)為二醇核酸S-異構物，並且N2p為2'-磷酸酯核苷酸。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnn(Nhd)nnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsdNsnndNndNnnnndNnNfnnnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，並且(Ngn)為二醇核酸S-異構物。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnn(Nhd)nnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsNfsnndNn(Ngn)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，並且(Ngn)為二醇核酸S-異構物。
於某些態樣中，該dsRNA劑之有義股包含下列修飾模式：5'-nsnsnnn(Nhd)nnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'；並且反義股包含下列修飾模式：5'-VPnsNfsnndNn(N2p)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基-核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟-核苷酸，dN為2'-去氧-核苷酸，(Nhd)為2'-O-十六烷基-核苷酸，(Ngn)為二醇核酸S-異構物，並且N2p為2'-磷酸酯核苷酸。
本揭露之另一方面提供一種dsRNA劑，其用於抑制SNCA之表現，其中
Figure 112112698-A0202-12-0013-40
dsRNA劑包括具有5'-終端及3'-終端之有義股以及具有5'-終端及3'-終端之反義股，其中該有義股及反義股形成雙股區域，其中：該有義股包括表2之核苷酸序列及修飾(SEQ ID NO：13至55)，具有0或1個誤配；並且反義股包括表2之核苷酸序列及修飾(SEQ ID NO：56至98)，具有0或1個誤配。
於一個態樣中，該dsRNA劑具有下列有義股核苷酸序列中之一者：5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugusgsa-3'(SEQ ID NO：35)、5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuusgsa-3'(SEQ ID NO：28)、5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguugsgsa-3'(SEQ ID NO：21)、5'-gsusaca(Ahd)GfuGfCfUfcaguuccasasa-3'(SEQ ID NO：34)、5'-cscsauc(Ahd)gcAfGfUfgauugaagsusa-3'(SEQ ID NO：43)、5'-uscsccag(Uhd)uUfCfUfugagaucusgsa-3'(SEQ ID NO：261)或5'-uscsaug(Ahd)aaGfGfAfcuuucaaasgsa-3'(SEQ ID NO：19)，其中a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷 -3'-磷酸酯，(Ahd)為2'-O-十六烷基腺苷-3'-磷酸酯，(Uhd)為2'-O-十六烷基尿苷-3'-磷酸酯，並且(Chd)為2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸酯。
於另一態樣中，該dsRNA劑具有下列反義股核苷酸序列中之一者：5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3'(SEQ ID NO：78)、5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3'(SEQ ID NO：71)、5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3'(SEQ ID NO：64)、5'-VPusUfsugdGa(Agn)cugagcAfcUfuguacsasg-3'(SEQ ID NO：77)、5'-VPusdAscudTcdAaucadCuGfcugauggsasa-3'(SEQ ID NO：86)、5'-VPusdCsagdAudCucaadGaAfacugggasgsc-3'(SEQ ID NO：262)或5'-VPusdCsuudTgdAaagudCcUfuucaugasasu-3'(SEQ ID NO：62)，其中VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dG為2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，並且(Agn)為腺苷-二醇核酸(GNA)S-異構物。
於又一態樣中，該dsRNA劑具有下列核苷酸序列之雙鏈體對中之一者：(i)有義股：5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugusgsa-3'(SEQ ID NO：35)及反義股：5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3'(SEQ ID NO：78)；(ii)有義股：5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuusgsa-3'(SEQ ID NO：28)及反義股：5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3'(SEQ ID NO：71)；(iii)有義股：5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguugsgsa-3'(SEQ ID NO：21)及反義股：5'- VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3'(SEQ ID NO：64)；(iv)有義股：5'-gsusaca(Ahd)GfuGfCfUfcaguuccasasa-3'(SEQ ID NO：34)及反義股：5'-VPusUfsugdGa(Agn)cugagcAfcUfuguacsasg-3'(SEQ ID NO：77)；(v)有義股：5'-cscsauc(Ahd)gcAfGfUfgauugaagsusa-3'(SEQ ID NO：43)及反義股：5'-VPusdAscudTcdAaucadCuGfcugauggsasa-3'(SEQ ID NO：86)；(vi)有義股：5'-uscsccag(Uhd)uUfCfUfugagaucusgsa-3'(SEQ ID NO：261)及反義股：5'-VPusdCsagdAudCucaadGaAfacugggasgsc-3'(SEQ ID NO：262)；或(vii)有義股：5'-uscsaug(Ahd)aaGfGfAfcuuucaaasgsa-3'(SEQ ID NO：19)及反義股：5'-VPusdCsuudTgdAaagudCcUfuucaugasasu-3'(SEQ ID NO：62)，其中VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dG為2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，(Agn)為腺苷-二醇核酸(GNA)S-異構物，(Ahd)為2'-O-十六烷基腺苷-3'-磷酸酯，(Uhd)為2'-O-十六烷基尿苷-3'-磷酸酯，並且(Chd)為2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸酯。
本揭露之額外方面提供一種dsRNA劑，其用於抑制SNCA之表現，該dsRNA劑具有有義股序列5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugusgsa-3'(SEQ ID NO：35)及反義股序列5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3'(SEQ ID NO：78)，其中VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯， s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，並且(Chd)為2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸酯。
本揭露之另一方面提供一種dsRNA劑，其用於抑制SNCA之表現，該dsRNA劑具有有義股序列5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuusgsa-3'(SEQ ID NO：28)及反義股序列5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3'(SEQ ID NO：71)，其中VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dG為2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯，並且(Uhd)為2'-O-十六烷基尿苷-3'-磷酸酯。
本揭露之又一方面提供一種dsRNA劑，其用於抑制SNCA之表現，該dsRNA劑具有有義股序列5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguugsgsa-3'(SEQ ID NO：21)及反義股序列5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3'(SEQ ID NO：64)，其中VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，並且(Ahd)為2'-O-十六烷基腺苷-3'-磷酸酯。
於另一態樣中，該RNAi劑為其醫藥上可接受之鹽。本文之RNAi劑中之各者的「醫藥上可接受之鹽」包括但不限於，鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽及其混合物。本領域熟練人士將知悉，可將該RNAi劑提供為多陽離子鹽，其具有一個陽離子每視需要經修飾之磷酸二酯類主鏈及/或任何其他酸性修飾(例如，5'-終端磷酸酯基團)的游離酸基團。舉例而言，「n」核苷酸之長度的寡核苷酸含有n-1個視需要經修飾之磷酸二酯，使得21 nt之長度的寡核苷酸可提供為具有至多20個陽離子(例如，20個鈉陽離子)的鹽。類似地，具有21 nt之長度的有義股及23 nt之長度的反義股的RNAi劑可提供為具有至多42個陽離子(例如，42個鈉離子)的鹽。在前述實例中，若該RNAi劑亦包括5'-終端磷酸酯或5'-終端乙烯基膦酸酯基團，則該RNAi劑可提供為具有至多44個陽離子(例如，44個鈉陽離子)的鹽。
本揭露之另一方面提供一種細胞，其含有本文所揭露之dsRNA劑。
本揭露之另一方面提供一種醫藥組成物，其用於抑制α-突觸核蛋白之表現，該醫藥組成物包括本文所揭露之dsRNA劑。
於某些態樣中，該dsRNA劑及/或該醫藥組成物係於非緩衝溶液中投予。視需要，該非緩衝溶液為鹽水或水。
於一些態樣中，該dsRNA劑係與緩衝溶液一起投予。視需要，該緩衝溶液包括醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其組合。於某些態樣中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
本揭露之又一方面提供一種醫藥組成物，其包括本文所揭露之dsRNA劑及脂質製劑。
於一個態樣中，該脂質製劑包括或為脂質奈米顆粒(LNP)。
本揭露之另一方面提供一種抑制細胞中α-突觸核蛋白(SNCA)基因之表現及/或預防細胞或受試者內α-突觸核蛋白集聚物之形成的方法，該方法涉及：(a)使該細胞或受試者與本文所揭露之dRNA劑或醫藥組成物接觸；以及(b)將步驟(a)中產生之細胞或受試者維持足以獲得SNCA基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而抑制該細胞內SNCA基因之表現及/或預防該細胞或受試者內α-突觸核蛋白集聚物之形成。
於一個態樣中，該細胞處於受試者體內。視需要，該受試者為人類。或者，該受試者為恆河獼猴、食蟹獼猴、小鼠或大鼠。
於某些態樣中，該人類受試者罹患SNCA相關之疾病。視需要，該SNCA相關疾病為突觸核蛋白病變。視需要，該突觸核蛋白病變為PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及/或Creutzfeldt-Jakob二氏病。
於一些態樣中，與對照細胞或對照受試者相比，該細胞或該受試者中之SNCA表現被該dsRNA劑抑制至少約50%、至少約40%、至少約30%、至少約20%、或至少約10%。
本揭露之另一方面提供一種治療被診斷為患有SNCA相關神經退化性疾病之受試者的方法，該方法涉及向該受試者投予治療有效量的本文所揭露之dsRNA劑或醫藥組成物，視需要，其中該受試者係用治療有效量的本文所揭露之dsRNA劑或醫藥組成物，從而治療該受試者。
於某些態樣中，治療包括該SNCA相關神經退化性疾病之至少一種徵象或症候的緩解。
於一些態樣中，治療包括預防該疾病之進展。
於一些態樣中，該SNCA相關神經退化性疾病之特徵為下列症候中之一者或多者：震顫、動作遲緩(運動徐緩)、肌肉僵硬、姿勢及平衡受損、自發運動之損失、語音變化、字跡變化、幻視、幻聽、嗅幻覺、觸幻覺、身體機能(自主神經系統)調節不佳諸如暈眩、跌倒及腸問題、認知問題諸如混淆、注意力不佳、視空間問題及記憶力損失、睡眠困難諸如快速眼動(REM)睡眠行為障礙(其中夢在睡眠時以身體表現出來)、注意力波動(包括嗜睡發作、長時間凝視空處、白天長時間小睡或言語紊亂、抑鬱及冷漠)、起立性低血壓(當人站起時發生血壓之突然下降，導致人感覺暈眩及頭暈，並且需要坐、蹲或躺下以便防止昏迷)、動作笨拙或不協調、膀胱控制問題、手或肢之攣縮(關節周圍的肌肉或肌腱之慢性縮短，其阻止關節自由動作)、Pisa症候群(其中身體似乎向一側傾斜的異常姿勢)、頸項前屈(其中頸部向前彎曲且頭部向下)、以及不由自主且不可控制的歎息或喘息。
於某些態樣中，該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量向受試者投予。
於一些態樣中，該dsRNA劑或醫藥組成物係經鞘內向該受試者投予。
於一個態樣中，該方法復涉及向該受試者投予適用於治療或預防SNCA相關神經退化性疾病或病症的額外之劑或療法。
於某些態樣中，該SNCA相關神經退化性疾病為巴金森氏症(PD)。
於一個態樣中，該SNCA相關神經退化性疾病為路易氏體失智症(LBD)或多系統萎縮(MSA)。
於一些態樣中，SNCA表現經抑制約30%。
於另一態樣中，該方法復涉及向該受試者投予額外之治療劑。
於某些態樣中，該方法降低腦或脊髓組織中的SNCA之表現。視需要，該腦或脊髓組織為大腦皮質、小腦、基底神經節、海馬迴、杏仁核、丘腦、腦幹、頸部脊髓、腰部脊髓及/或胸部脊髓。
本揭露之另一方面提供一種抑制受試者中SNCA之表現的方法，該方法涉及向該受試者投予治療有效量的本文所揭露之dsRNA劑或醫藥組成物，從而抑制該受試者中的SNCA之表現。
本揭露之另一方面提供一種用於治療或預防受試者之SNCA相關疾病的方法，該方法涉及向該受試者投予治療有效量的本文所揭露之dsRNA劑或醫藥組成物，從而治療或預防該受試者的SNCA相關疾病。
於某些態樣中，該投予步驟產生該受試者之一個或多個組織中的SNCA mRNA或α-突觸核蛋白之至少60%減弱。視需要，該受試者之該一個或多個組織包括CSF、前額葉皮質、中腦、胸椎、海馬迴、髓質腦橋、紋狀體尾狀核及/或小腦。
本揭露之又一方面提供一種用於進行本文所揭露之方法的套組，該套組包括本文所揭露之dsRNA劑及其使用說明。視需要，該套組亦包括用於投予該dsRNA劑至受試者之機構。
定義
為了更容易地理解本揭露，首先定義某些術語。此外，應注意，無論何時，當應用參數之數值或數值範圍，該等數值及處於該等所引用之數值中間的範圍亦作為本揭露之一部分。
本文中使用之冠詞「一」指代該冠詞之語法賓語的一者或超過一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一元件」意指一個元件或超過一個元件如複數個元件。
本文中使用之術語「包括」意指「包括但不限於」，且與後者可互換地使用。
除非語境中明確排除，否則本文中使用之術語「或」意指「及/或」，且與後者可互換地使用。
本文中使用之術語「約」意指處於該領域中之公差範圍內。例如，「約」可理解為與均值偏離2標準偏差。於某些態樣中，約意指±10%。於某些態樣中，約意指±5%。當約存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「約」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
在一個數字或一系列數字之前的術語「至少」係理解為包括與該術語「至少」相鄰之數字以及全部後續數字或邏輯上可以包括的整數，如自上下文清晰可見者。舉例而言，核酸分子中的核苷酸數目必須為整數。舉例而言，「21個核苷酸核酸分子的至少18個核苷酸」意指18、19、20或21個核苷酸具有所 指示之特性。當「至少」存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「至少」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。
如本文所用，「不超過」或「少於」係理解為與該片語相鄰之值及邏輯上更低之值或整數，如自上下文清晰可見者，到零為止。舉例而言，具有「不超過2個核苷酸」突出的雙鏈體具有2、1或0個核苷酸突出。當「不超過存在於一系列數字或範圍之前時，係理解為「不超過」可修飾該一系列數字或範圍中之各者。如本文所用，範圍包括上限及下限兩者。
如本文所用，偵檢方法可包括對其存在之量低於該方法偵檢量級者之分析物的測定。
在所指示之標靶位點與有義股或反義股之核苷酸序列之間存在衝突的情況下，以所指示的序列為準。
在化學結構與化學名稱之間存在矛盾的情況下，以化學結構為準。
術語「SNCA」、「α-突觸核蛋白」、「突觸核蛋白α」或「alpha-突觸核蛋白」指代與稱為「突觸核蛋白病變」的神經退化性疾病相關聯之基因，以及由該基因編碼的蛋白質。人類SNCA基因區域覆蓋大約114kb。SNCA轉錄本含有13個外顯子，且15種mRNA同功型業經鑑定或以其他方式產生。SNCA的核苷酸及胺基酸序列可見於，舉例而言，GenBank登錄號NM_007308.3(人類(Homo sapiens)SNCA，SEQ ID NO：1，反向互補序列SEQ ID NO：2)；GenBank登錄號：XM_005555421(食蟹獼猴(Macaca fascicularis)SNCA，SEQ ID NO：3，反向互補序列SEQ ID NO：4)；GenBank登錄號：NM_009221(小鼠(Mus musculus)SNCA，SEQ ID NO：5，反向互補序列SEQ ID NO：6)；GenBank登錄號 NM_019169.2(大鼠(Rattus norvegicus)SNCA,SEQ ID NO：7，反向互補序列SEQ ID NO：8)及GenBank登錄號：XM_535656.7(家犬(Canis lupus familiaris)SNCA，SEQ ID NO：228，反向互補序列SEQ ID NO：229)。
如本文所用，術語「SNCA」亦指代SNCA基因之變型，包括所提供的天然存在之序列變異體，舉例而言，同功型1轉錄本NM_000345.4(SEQ ID NO：232)，其編碼多肽NP_000336.1；同功型2轉錄本NM_001146054.2(SEQ ID NO：230)，其編碼多肽NP_001139526.1；同功型3轉錄本NM_001146055.2(SEQ ID NO：231)，其編碼多肽NP_001139527.1；上文述及的同功型4轉錄本NM_007308.3(SEQ ID NO：1)，其編碼多肽NP_009292.1；同功型5轉錄本NM_001375285.1(SEQ ID NO：233)，其編碼多肽NP_001362214.1；同功型6轉錄本NM_001375286.1(SEQ ID NO：234)，其編碼多肽NP_001362215.1；同功型7轉錄本NM_001375287.1(SEQ ID NO：235)，其編碼多肽NP_001362216.1；同功型8轉錄本NM_001375288.1(SEQ ID NO：236)，其編碼多肽NP_001362217.1；同功型9轉錄本NM_001375290.1(SEQ ID NO：237)，其編碼多肽NP_001362219.1；以及預計之通恭喜X1轉錄本XM_011532203.1(SEQ ID NO：238)，其編碼多肽XP_011530505.1；預計之同功型X2轉錄本XM_011532204.3(SEQ ID NO：239)，其編碼多肽XP_011530506.1；預計之同功型X3轉錄本XM_011532205.2(SEQ ID NO：240)，其編碼多肽XP_011530507.1；預計之同功型X4轉錄本XM_011532206.1(SEQ ID NO：241)，其編碼多肽XP_011530508.1；預計之同功型X5轉錄本XM_011532207.1(SEQ ID NO：242)，其編碼多肽XP_011530509.1；及預計之同功型X8轉錄本XM_017008563.1(SEQ ID NO：243)，其編碼多肽XP_016864052.1(與前述登錄號中之各者關聯之獨特序列係藉 由引用以其在本申請遞交日時可獲得之形式併入本文)。SNCA序列之其他實例可見於可公共獲得之資料庫，舉例而言，GenBank、OMIM、UniProt、NCBI dbSNP(參見，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6622)及Macaca基因體項目網址(macaque.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)。關於SNCA之額外資訊可見於，舉例而言，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term=PDE3B。截至本申請案遞交之日，前述GenBank登錄號及基因資料庫編號中之各者的整體內容係藉由引用併入本文。
α-突觸核蛋白之三種蛋白質同功型業經揭示於UniProt中。最長的α-突觸核蛋白同功型為大約14kDa蛋白質(同功型1 UniProt，140個胺基酸之P37840)。UniProt中之其他α-突觸核蛋白同功型包括：同功型2-4，112個胺基酸之P37840-2；及同功型2-5，126個胺基酸之P37840-3。該140個胺基酸之α-突觸核蛋白係由映射至染色體基因座4q21.3-q22的5個外顯子對編碼。該α-突觸核蛋白具有由不完全KXKEGV(SEQ ID NO：244)模體構成的N末端區域、極疏水NAC域及高酸性C端域。在生理條件下，咸信，SNCA為一種內在無序之單體或經螺旋摺疊之四聚物。α-突觸核蛋白佔腦細胞之胞質液的1%，並且主要於新皮質、海馬迴、黑質、視丘及小腦中表現。α-突觸核蛋白亦以較低量於心臟、骨骼肌、胰臟、淋巴及血液細胞中表現。儘管尚未充分理解SNCA之功能，但有證據表明，其在維持突觸前末端中之突觸囊泡的適當供給中發揮重要作用。藉由調整對p53表現及促凋亡基因之反向活化兩者的抑制，α-突觸蛋白參與多巴胺釋放及轉運的調整、微管相關蛋白tau的原纖維化及非多巴胺能神經元中神經保護表型的調整，導致減少的凋亡蛋白酶-3活化。α-突觸核蛋白藉以誘 導神經退化性疾病諸如巴金森氏症、路易氏體失智症及多系統萎縮的主要機制似乎為該α-突觸核蛋白之量級升高，導致α-突觸核蛋白原纖維集聚物。
如本文中所用，「標靶序列」指代於SNCA基因之轉錄過程中形成之mRNA分子之核苷酸序列的連續部分，包括作為初級轉錄產物之RNA加工產物的mRNA。於一態樣中，該序列之標靶部分將至少長至足以用作RNAi引導之裂解的受質，該裂解位於在SNCA基因之轉錄過程中形成之mRNA分子的核苷酸序列的部分處或鄰近該處。於一個態樣中，標靶序列在SNCA基因之蛋白質編碼區域內。於另一態樣中，標靶序列在SNA基因之3'-UTR內。
標靶序列可係約9至36個核苷酸之長度，例如，約15至30個核苷酸之長度。例如，標靶序列可係約15至30個核苷酸之長度，如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度。於一些態樣中，標靶序列為約19至約30個核苷酸之長度。於其他態樣中，標靶序列為約19至約25個核苷酸之長度。於再其他態樣中，標靶序列為約19至約23個核苷酸之長度。於一些態樣中，標靶序列為約21至約23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
如本文中所使用，術語「包含序列之股」指代包含核苷酸之鏈的寡核苷酸，其中該核苷酸係藉由使用標準核苷酸命名法指代之序列而揭示。
在經修飾或未經修飾之核苷酸的語境中，「G」、「C」、「A」、「T」及「U」各自通常分別表示含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作為鹼基之核苷酸。惟，應理解，術語「核糖核苷酸」或「核苷酸」亦可指代經修飾之核苷酸，如下文進一步揭示者，或替代置換部分(參見，例如，表1)。熟練之人士熟知，鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶可經由其他部分置換而實質上不改變包含承載此置換部分之核苷酸之寡核苷酸的鹼基配對特性。例如而不限於，包含肌苷作為其鹼基之核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或鳥嘌呤之核苷酸進行鹼基配對。因此，於本揭露提出至dsRNA之核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤之核苷酸可置換為含有例如肌苷之核苷酸。於另一實例中，寡核苷酸中任意位置之腺嘌呤及胞嘧啶可分別置換為鳥嘌呤及尿嘧啶，以與標靶mRNA形成G-U Wobble鹼基配對。含有此類置換部分之序列適用於本揭露提出之組成物及方法。
如本文中可互換使用，術語「iRNA」、「RNAi劑」、「iRNA劑」、「RNA干擾劑」指代含有如本文中定義之術語的RNA，且其經由RNA誘導型緘默化複合物(RISC)路徑媒介RNA轉錄本的靶向裂解。RNA干擾(RNAi)為引導mRNA之序列特異性降解的過程。RNAi調整例如抑制細胞例如受試者諸如哺乳動物受試者體內之細胞中SNCA基因的表現。
於一態樣中，本揭露之RNAi劑係包括單股RNA，其係與靶標RNA序列例如SNCA靶標mRNA相互作用，以引導該靶標RNA之裂解。不欲受縛於理論，咸信被引入細胞內之長雙股RNA係藉由被稱為切丁酶(Dicer)之第 III型核酸內切酶而破碎為包含有義股及反義股的雙股短干擾RNA(siRNA)(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將此等dsRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3'突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，此等siRNA被併入RNA誘導型緘默化複合物(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙鏈體解捲曲，使得互補序列反義股能夠引導標靶辨識(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，一方面，本揭露係關於單股RNA(ssRNA)(siRNA雙鏈體之反義股)，其係於細胞內生成且促進RISC複合物之形成以有效緘默化標靶基因亦即SNCA基因。據此，本文中，術語「siRNA」亦用以指代如上揭之RNAi。
於另一態樣中，該RNAi劑可係單股RNA，其經引入細胞或有機體內以抑制標靶mRNA。單股RNAi劑結合至RISC核酸內切酶Argonaute 2，其隨後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常為15至30個核苷酸且經化學修飾。單股RNA之設計及測試描述於美國專利第8,101,348號中及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中，其各自之整體內容藉由引用而併入本文。本文中揭示之任一反義核苷酸序列可用作本文中揭示之單股siRNA或用作藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中揭示之方法化學修飾者。
於另一態樣中，用於本揭露之組成物及方法中之「RNAi劑」為雙股RNA，且於本文中係指代為「雙股RNAi劑」、「雙股RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA分子」或「dsRNA」。術語「dsRNA」指代核糖核酸分子之複合體，其具有包含兩個反平行且實質上互補之核酸股的雙鏈體結構，該兩個核酸股指代 為具有相對於靶標RNA亦即SNCA基因之「有義」取向及「反義」取向。於本揭露之一些態樣中，雙股RNA(dsRNA)透過轉錄後基因緘默化機制來觸發標靶RNA例如mRNA之降解，本文中，該機制指代為RNA干擾或RNAi。
通常，dsRNA分子可包括核糖核苷酸，但如本文中所詳述，各股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸及/或經修飾之核苷酸。此外，如本說明書中所用，「RNAi劑」可包括具有化學修飾之核糖核苷酸；RNAi劑可包括位於多個核苷酸處之實質性修飾。
如本文中所用，術語「經修飾之核苷酸」指代獨立具有經修飾之糖部分、經修飾之核苷酸間鍵聯、或經修飾之核酸鹼基的核苷酸。因此，術語「經修飾之核苷酸」涵蓋例如官能基或原子至核苷酸間鍵聯、糖部分或核鹼基之置換、加成或移除。適用於本揭露之劑中的修飾包括本文中所揭露或該領域中已知之全部類型的修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任意此類修飾，如在siRNA類型分子中所用者，係為「RNAi劑」所涵蓋。
於本揭露之某些態樣中，若存在，則在RNAi劑內包括去氧-核苷酸(其可認知為天然存在的核苷酸形式)可視為構建經修飾之核苷酸。
該雙鏈體區域可係允許所欲之靶標RNA通過RISC途徑而特異性降解的任意長度，且可係約9至36個鹼基對之長度範圍，如約15至30個鹼基對之長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36個鹼基對之長度，諸如約15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、 18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本發明之一部分。
形成該雙鏈體結構之兩股可係一個較大RNA分子之不同部分，或它們可係獨立之RNA分子。若該兩股為一個較大分子之部分，且因此藉由界於一股之3'末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5'末端之間的未中斷核苷酸鏈而連結，則該連結RNA鏈指代為「髮夾環圈」。髮夾環圈可包含至少一個未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可包含至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少23或更多個未配對之核苷酸或不引導至dsRNA之標靶位點的核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可係10個或更少核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可係8個或更少未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可係4至10個未配對之核苷酸。於一些態樣中，該髮夾環圈可係4至8個核苷酸。
於某些態樣中，雙股寡聚化合物之兩股可連接在一起。該兩股可在兩個末端或僅在一個末端彼此連接。在一個末端連接意為第一股之5'末端連接至第二股之3'末端，或第一股之3'末端連接至第二股之5'末端。當兩個在兩個末端彼此連接時，第一股之5'末端連接至第二股之3'末端，且第一股之3'末端連接至第二股之5'末端。兩股可藉由包括但不限於(N)n之寡核苷酸連接子連接在一起，其中N獨立地為經修飾或未經修飾之核苷酸，且n為3至23。於一些態 樣中，n為3至10，例如，3、4、5、6、7、8、9或10。於一些態樣中，該寡核苷酸連接子係選自由下列所組成之群組：GNRA、(G)4、(U)4及(dT)4，其中N為經修飾或未經修飾之核苷酸，且R為經修飾或未經修飾之嘌呤核苷酸。連接子中之一些核苷酸可牽涉到與該連接子中其他核苷酸的鹼基對相互作用中。兩股亦可藉由非核苷連接子例如本文所揭示之連接子連接在一起。具有本領域熟練技藝者應知悉，本文所揭示之任何寡核苷酸化學修飾或變異可用於寡核苷酸連接子中。
髮夾及啞鈴型寡聚化合物將具有等於或至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25個核苷酸對的雙鏈體區域。該雙鏈體區域可以等於或小於200、100或50之長度。於一些態樣中，雙鏈體區域之範圍為15至30、17至23、19至23、及19至21個核苷酸對之長度。
髮夾寡聚化合物可具有單股突出或端未配對區域，於一些態樣中在3'，而在一些態樣中在髮夾之反義側。於一些態樣中，突出為1至4個，更通常2至3個核苷酸之長度。可誘導RNA干擾之髮夾寡聚化合物在本文中亦稱為「shRNA」。
若dsRNA之兩個實質上互補之股係由獨立之RNA分子構成，則那些分子不必但可以共價連結。若該兩股藉由除界於一股之3'末端與形成該雙鏈體結構之相對另一股之5'末端之間的未中斷核苷酸鏈以外之手段共價連結，則該連結結構指代為「連接子」。該等RNA股可具有相同或相異數目之核苷酸。鹼基對之最大數目為該dsRNA之最短鏈中之核苷酸數減去該雙鏈體中存在之任意突出。RNAi除了包含該雙鏈體結構外，亦可包含一個或多個核苷酸突出。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑係dsRNA，其每一股為24至30個核苷酸之長度，其與靶標RNA序列例如SNCA靶標mRNA序列相互作用以引導該靶標RNA之裂解。不欲受縛於理論，經引入細胞內之長雙股RNA係藉由稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶而破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將dsRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3'突出部(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，該siRNA被併入RNA誘導型緘默化複合物(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙鏈體解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶辨識(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。於一個態樣中，本揭露之RNAi劑為24至30個核苷酸之dsRNA劑，其與SNCA RNA序列交互作用以引導該標靶RNA之裂解。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑為dsRNA劑，其各股獨立地包含19至23個核苷酸，其與SNCA RNA序列交互作用以引導該標靶RNA之裂解。不欲受縛於理論，經引入細胞內之長雙股RNA係藉由稱為切丁酶(Dicer)之第III型核酸內切酶而破碎為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。切丁酶，核酸酶III樣酶，將dsRNA加工為19至23個鹼基對之短干擾RNA，該短干擾RNA之特徵為具有兩個鹼基之3'突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。隨後，該siRNA被併入RNA誘導型緘默化複合物(RISC)內，於該處，一種或多種解旋酶令該siRNA雙鏈體解捲曲，使得補體反義股能夠引導標靶辨識(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。當結合至適宜之標靶mRNA時，該RISC 內之一種或多種核酸內切酶裂解該標靶以誘導緘默化(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。於一個態樣中，本揭露之RNAi劑為19至23個核苷酸之dsRNA劑，其與SNCA RNA序列交互作用以引導該標靶RNA之裂解。
如本文中所用，術語「核苷酸突出」指代從RNAi劑例如dsRNA之雙鏈體結構凸出之至少一個未配對之核苷酸。舉例而言，當dsRNA之一股的3'末端延伸超過另一股之5'末端，或與之相反，則存在核苷酸突出。dsRNA可包含具有至少一個核苷酸之突出；替代性地該突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多個。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於有義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5'末端、3'末端或兩端。
於dsRNA之一個態樣中，至少一股包含至少1個核苷酸的3'突出。於另一態樣中，至少一股包含至少2個，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的3'突出。於其他態樣中，RNAi劑之至少一股包含至少1個核苷酸的5'突出。於某些態樣中，至少一股包含至少2個，例如，2、5、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸的3'突出。於又其他態樣中，RNAi劑之至少一股的3'末端及5'末端兩者皆包含至少1個核苷酸的突出。
於一個態樣中，dsRNA之反義股具有位於3'末端、5'末端、兩個末端或任意末端的1至10個核苷酸，例如，0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10個，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸之。於一個態樣中，dsRNA之有義股具有位於3'末端、5'末端、兩個末端或任意末端的1至 10個核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個核苷酸之。於另一態樣中，該中之一個或多個核苷酸係替換為核苷硫代磷酸酯。
於某些態樣中，位於有義股或反義股或兩者之該突出可包括長於10個核苷酸之延伸長度，如，1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸或10至15個核苷酸之長度。於某些態樣中，延伸之突出位於該雙鏈體之有義股。於某些態樣中，延伸之突出係存在於該雙鏈體之有義股的3'末端。於某些態樣中，延伸之突出係存在於該雙鏈體之有義股的5'末端。於某些態樣中，延伸之突出位於該雙鏈體之反義股。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙鏈體之反義股的3'末端。於某些態樣中，延伸之突出存在於該雙鏈體之反義股的5'末端。於某些態樣中，該突出中之一個或多個核苷酸係替換為核苷硫代磷酸酯。於某些態樣中，該突出包括自互補部分，使得該能夠形成在生理條件下安定的髮夾結構。
如本文中所用，關於dsRNA之術語「鈍」或「鈍端」意指，在dsRNA之給定端係無為配對之核苷酸或核苷酸類似物，亦即，無核苷酸突出。dsRNA之一端或兩端可係鈍者。若dsRNA之兩端皆係鈍者，該dsRNA稱為鈍端者。明了起見，「鈍端之」dsRNA為兩端皆係鈍者之dsRNA，亦即，於分子之任一端皆無核苷酸突出。最常見之此類分子將在其整個長度上為雙股。
於一些態樣中，dsRNA包含3'突出。於一些態樣中，dsRNA包含具1個核苷酸之3'突出。於一些態樣中，dsRNA包含具2個核苷酸之3'突出。於一些態樣中，dsRNA包含5'突出。於一些態樣中，dsRNA包含具1個核苷酸之5'突出。於一些態樣中，dsRNA包含具2個核苷酸之5'突出。
於一些態樣中，dsRNA具有一個具有突出之末端及一個具有鈍端之末端。突出可係有義股3'突出、有義股5'突出、反義股3'突出或反義股5'突出。於一些態樣中，突出為具1個核苷酸之5'突出。於一些態樣中，突出為具2個核苷酸之5'突出。於一些態樣中，dsRNA具有兩個鈍端。於一些態樣中，dsRNA在兩端具有突出。在各端之突出可獨立地為有義股3'突出、有義股5'突出、反義股3'突出或反義股5'突出。於一些態樣中，突出為具1個核苷酸之5'突出。於一些態樣中，突出為具2個核苷酸之5'突出。一個或多個突出核苷酸可係經修飾之核苷酸、反向核苷酸、無鹼基核苷酸或反向無鹼基核苷酸。反向核苷酸可經由3'-3'磷酸二酯鍵聯連接。
於一些態樣中，該有義股為23個核苷酸之長度，且該反義股為21個核苷酸之長度。於一些態樣中，該有義股為23個核苷酸之長度，且該反義股為21個核苷酸之長度，其中該有義股之3'及5'終端核苷酸位置係反向無鹼基殘基。有義股3'及5'終端反向無鹼基殘基可係突出。
於一些態樣中，該有義股為21個核苷酸之長度，且該反義股為23個核苷酸之長度，其中該反義股含有具2個核鹼基之3'突出。
術語「反義股」或「引導股」指代RNAi劑例如dsRNA之股，其包括與標靶序列例如SNCA mRNA實質上互補之區域。
如本文中所用，術語「互補之區域」係指代反義股之與本文中定義之序列，例如標靶序列，例如，SNCA核苷酸序列實質上互補的區域。若該互補之區域與標靶序列不完全互補，則誤配可存在於該分子之中間區域或終端區域。通常，最能被容忍之誤配係存在於終端區域內，例如，該RNAi劑之5'終端或3'終端之5、4、3或2個核苷酸內。
於一些態樣中，本揭露之雙股RNA劑包括位於反義股之核苷酸誤配。
於一些態樣中，本揭露之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與標靶mRNA之誤配，例如，該反義股包括4、3、2、1或0個與標靶mRNA之誤配。於一些態樣中，本揭露之雙股RNA劑之反義股包括不超過4個與有義股之誤配，例如，該反義股包括4、3、2、1或0個與有義股之誤配。於一些態樣中，本揭露之雙股RNA劑包括位於有義股之核苷酸誤配。於一些態樣中，本發明之雙股RNA劑之有義股包括不超過4個與反義股之誤配，例如，該有義股包括4、3、2、1或0個與反義股之誤配。於一些態樣中，該核苷酸誤配位於，舉例而言，從iRNA之3'末端計數之5、4、3個核苷酸內。於另一態樣中，該核苷酸誤配位於，舉例而言，iRNA劑之3'終端核苷酸內。於一些態樣中，該(等)誤配不在種子區域內。
因此，本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與標靶序列之誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過3個誤配(亦即，3、2、1或0個誤配)。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過2個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過1個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個誤配。於某些態樣中，如果該RNAi劑之反義股含有與標靶序列之誤配，則誤配可視需要被限定在從互補區域之5'末端或3'末端計數之最末5個核苷酸內。舉例而言，於此類態樣中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與SNCA基因之區域互補的股通常不含位於中心13個核苷酸處之任意誤配。本文中揭示之方法或該領域中已知之方法可用以確定，含有與標靶序列之誤配的RNAi劑在抑制SNCA基因之表現中是否有效。慮及具有誤配之 RNAi劑在抑制SNCA基因之表現中的功效很重要，尤其若SNCA基因中之特定互補區域係已知具有該種群內之多形性序列變異。
如本文中所用，術語「有義股」指代RNA劑之股，其包括與如本文中定義之術語之反義股之區域實質上互補的區域。
如本文中所用，「實質上全部核苷酸係經修飾」為大部分但不是全部皆經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或1個未經修飾之核苷酸。
如本文中所用，術語「裂解區域」指代位於緊鄰裂解位點處之區域。裂解位點為該標靶之裂解出現處之位點。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的三個鹼基。於一些態樣中，裂解區域包含位於裂解位點任一端且緊鄰該裂解位點的兩個鹼基。於一些態樣中，裂解位點特異性地出現於反義股之藉由核苷酸10及11鍵結之位點，且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文中所用且除非明確排除，否則當術語「互補」用來揭示關於第二核苷酸序列之第一核苷酸序列時，指代包含該第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含該第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸雜交且形成雙鏈體結構的能力，如具熟練技術之人士所理解者。舉例而言，此等條件可係嚴苛條件，其中嚴苛條件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃、12至16小時，之後洗滌(參見，例如，《分子克隆：實驗室手冊》(「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press))。可施加其他條件，諸如生理學相關條件如可在生物體內部遭遇者。具熟練技術之人士將能夠根據所雜交之核苷酸的最終應用而確定最適用於兩個序列之互補性測試的條件集。
如本文中所述之RNAi劑，例如，dsRNA內之互補序列，包括包含第一核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列之寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列之整體長度上的鹼基配對。此類序列可指代為彼此「完全互補」。惟，本文中，若第一序列係指代為與第二序列“實質上互補”，則當雜交形成多達30個鹼基對之雙鏈體時，兩個序列可係完全互補，或它們可形成一個或多個但通常不超過5、4、3或2個誤配鹼基對，同時保留在最適於其最終應用之條件下雜交的能力，如對經由RISC途徑之基因表現的抑制。惟，若兩個寡核苷酸係經計為當雜交時形成一個或多個單股，則此類應視為關於確定互補性之誤配。舉例而言，包含一個長度為21個核苷酸之寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸之寡核苷酸的dsRNA，其中該較長之核苷酸係包含一個與該較短之核苷酸完全互補的21個核苷酸之序列，對於本文所揭示之目的，仍可指代為「完全互補」。
如本文中所用，「互補」序列亦可包括非Watson-Crick鹼基對或從非天然核苷酸及經修飾之核苷酸形成的鹼基對，或完全由其形成，只要滿足其雜交能力之上述需求得以滿足即可。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於，G：U Wobble鹼基配對或Hoogstein鹼基配對。
本文中，術語「互補」、「完全互補」及「實質上互補」可關於dsRNA之有義股與反義股間或RNAi劑之反義股與標靶序列之間的鹼基配對而使用，如可從其用途之語境中理解者。
如本文中所用，與信使RNA(mRNA)之「至少一部分實質上互補」之多核苷酸指代與目標mRNA(例如，編碼SNCA之mRNA)之接續部分實質上 互補之多核苷酸。舉例而言，如果該序列係與編碼SNCA之mRNA之非中斷部分實質上互補，則該多核苷酸係與SNCA mRNA之至少一部分互補。
據此，於一些態樣中，本文中揭露之反義股多核苷酸與標靶SNCA序列完全互補。
於某些態樣中，本文中揭露之反義股多核苷酸與標靶SNCA序列實質上互補且包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：1、3、5、7或228(對於SNCAA)、或者SEQ ID NO：1、3、5、7或228之片段之核苷酸序列的等效區域至少約80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於其他態樣中，本文所揭露之反義股多核苷酸與標靶SNCA序列實質上互補且包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與表2或3中之任一有義股核苷酸序列或表2或3中之任一有義股核苷酸序列之片段至少約80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補。
於一個態樣中，本揭露之RNAi劑包括有義股，該有義股與反義多核苷酸實質上互補，該反義多核苷酸繼而與標靶SNCA序列互補，並且其中該有義股多核苷酸包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與SEQ ID NO：2、4、6、8或229之核苷酸序列或SEQ ID NO：2、4、6、8或229中任一者之片段之核苷酸序列的等效區域至少約80%互補，諸如約85%、約86%、 約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%互補。
於一些態樣中，本揭露之iRNA包括有義股，該有義股與反義多核苷酸序列實質上互補，該反義多核苷酸繼而與標靶SNCA序列互補，並且其中該有義股多核苷酸包含接續核苷酸序列，該接續核苷酸序列在其整個長度上與表2或3中之任一反義股核苷酸序列或表2或3中之任一反義股核苷酸序列之片段至少約80%互補，諸如約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、或100%互補。
於一些態樣中，雙股iRNA劑之雙股區域為等於或至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個核苷酸對之長度。
於一些態樣中，雙股iRNA劑之反義股為等於或至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸之長度。
於一些態樣中，雙股iRNA劑之有義股為等於或至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸之長度。
於一個態樣中，雙股iRNA劑之有義及反義股各自為15至30個核苷酸之長度。
於一個態樣中，雙股iRNA劑之有義及反義股各自為19至25個核苷酸之長度。
於一個態樣中，雙股iRNA劑之有義及反義股各自為21至23個核苷酸之長度。
於一個態樣中，雙股iRNA劑之有義及反義股各自分別為21至23個核苷酸之長度。
於一個態樣中，雙股iRNA劑之有義及反義股各自分別為23至21個核苷酸之長度。
於一個態樣中，該iRNA劑之有義股為21個核苷酸之長度，且反義股為23個核苷酸之長度，其中該等股形成21個接續鹼基對之雙股區域，具有在3'末端的2個核苷酸長之單股突出。
於一個態樣中，該iRNA劑之有義股為23個核苷酸之長度，且反義股為21個核苷酸之長度，其中該等股形成21個接續鹼基對之雙股區域，具有在3'及5'末端的1個核苷酸長之單股。
於一些態樣中，各股之主要部分之核苷酸為核糖核苷酸，但如本文中所詳述，各股或兩股亦可包括一個或多個非核糖核苷酸，例如，去氧核糖核苷酸及/或經修飾之核苷酸。此外，「iRNA」可包括具有化學修飾的核糖核苷酸。此類修飾可包括本文所揭露或本領域中已知的全部類型之修飾。對於本說明書及申請專利範圍之目的，任何此類修飾，如在iRNA分子中所用者，係為「iRNA」所涵蓋。
在本揭露之一個方面，用於本揭露之方法及組成物中之劑為單股反義核酸分子，其經由反義抑制機制來抑制標靶mRNA。該單股反義RNA分子與標靶mRNA內之序列互補。該單股反義寡核苷酸可藉由與mRNA配備並物理阻塞轉譯機至而以化學計量方式抑制轉譯，參見Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。該單股反義rRNA分子可係約15至約30個核苷酸之長度，且具有與標靶序列互補的序列。舉例而言，該單股反義RNA分子可包含來自本文所揭示之任一反義序列的至少約14、15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸。
於一個態樣中，對SNCA基因之至少部分之阻抑係藉由SNCA mRNA量之減少而評估，該SNCA mRNA係從第一細胞或細胞之群組中分離或檢測，於該細胞或細胞之群組中，SNCA被轉錄，且該細胞或細胞之群組業經治療，使得與實質上與該第一細胞或細胞之群組相同但尚未經如是治療之第二細胞或細胞之群組(對照細胞)相比，SNCA基因之表現得以抑制。抑制之程度可藉由下述術語表現：
Figure 112112698-A0202-12-0041-3
如本文中所用，片語「令細胞與RNAi即接觸」包括藉由任意可能之手段接觸細胞。令細胞與RNAi劑接觸包括在活體外令細胞與RNAi劑接觸或在活體內令細胞與iRNA接觸。該接觸可直接或間接進行。因此，舉例而言，RNAi劑可藉由單獨實施該方法而令其與細胞物理接觸，或替代性地，可將RNAi劑置於將允許或造成其後續與該細胞接觸之境地。
舉例而言，可藉由使用RNAi劑溫育細胞而令該細胞在活體外接觸該RNAi劑。舉例而言，可藉由將RNAi劑注射至細胞所處之組織內或鄰近該組織處，或藉由視需要經鞘內、玻璃體內或其他注射將RNAi劑注射至另一區域例如中樞神經系統(CNS)或注射至血流或皮下空間內而使得該劑將會後續到達待接觸之細胞所處之組織，從而令該細胞在活體內與該RNAi劑接觸。舉例而 言，該RNAi劑可含有或偶合至配體例如下文所揭示且進一步詳述於例如藉由引用併入本文之PCT/US2019/031170中的一個或多個親脂性部分，該部分將該RNAi劑引導或以其他方式安定在所關注之位點例如CNS。於一些態樣中，該RNAi劑可含有或偶合至一個或多個親脂性部分，視需要在GalNAc衍生物不存在下。活體外接觸方法與活體內接觸方法之組合亦係可能者。舉例而言，細胞可在活體外與RNAi劑接觸，並隨後移植入受試者體內。
於一個態樣中，令細胞與RNAi劑接觸包括，藉由促進或影響至該細胞內之攝取或吸收而「將RNAi劑引入或輸送至細胞內」。RNAi劑之吸收或攝取可透過無輔助之擴散或活性細胞進程而進行，或藉由輔助劑或裝置而進行。將RNAi劑引入細胞內可係活體外及/或活體內進程。舉例而言，對於活體內引入，可將RNAi劑注射至組織部位或全身性投予。活體外引入細胞內係包括該領域中已知之方法，諸如電穿孔及脂質轉染。其他途徑揭示於下文中及/或為該領域中已知者。
術語「親脂」或「親脂性部分」廣泛地指代具有對於脂質之親和性的任意化合物或化學部分。一種表徵親脂性部分之親脂性的途徑為藉由辛醇-水分配係數logKow，其中Kow為兩相系統在平衡時辛醇相中之化學品濃度與水相中該化學品之濃度的比率。辛醇-水分配係數為物質的實驗室量測之特性。惟，其亦藉由使用有貢獻於化學品之結構組分的係數來預測，該等係數係使用第一原理或經驗方法計算(參見，舉例而言，Tetko et al.,J.Chem.Inf.Comput.Sci.41：1407-21(2001)，其藉由引用以其整體併入本文)。其提供物質傾向於優先進入非水性或油性環境而非水中的熱力學量測(亦即，其親水/親脂平衡)。原則上，當化學物質之logKow超越0時，其具有親脂特徵。典型地，親脂性部分具有超越 1、超越1.5、超越2、超越3、超越4、超越5、或超越10的logKow。例如，6-胺基己醇之logKow，例如，係預測為大約0.7。使用相同方法，膽固醇基N-(己-6-醇)胺甲酸酯logKow係預測為10.7。
分子之親脂性可關於其攜帶的官能基而變。例如，添加羥基或胺基至親脂性部分之末端可增加或降低該親脂性部分的分配係數(例如，logKow)值。
或者，接合至一個或多個親脂性部分的雙股RNAi劑之疏水性可藉由其蛋白質結合特徵來量測。例如，於某些態樣中，雙股RNAi劑之血漿蛋白結合檢定中的未結合分率可經測定為與該雙股RNAi劑之相對疏水性正相關，該相對疏水性則可與該雙股RNAi劑之緘默化活性正相關。
於一個態樣中，所測定的該血漿蛋白結合檢定為使用人類血清白蛋白蛋白質之電泳移動性位移檢定(EMSA)。該結合檢定之示例性方案於例如PCT/US2019/031170中詳細例示性說明。藉由該結合檢定中未結合的siRNA之分率量測的雙股RNAi劑之疏水性超越0.15、超越0.2、超越0.25、超越0.3、超越0.35、超越0.4、超越0.45、或超越0.5，用於增強的siRNA之活體內輸送。
據此，將親脂性部分接合至雙股RNAi劑之內部位置提供最優疏水性，以用於增強的siRNA之活體內輸送。
術語「脂質奈米顆粒」或「LNP」指代媒介物，其包含脂質層，該脂質層封裝藥學活性分子諸如核酸分子例如RNAi劑或RNAi劑自其轉錄之質體。LNP揭示於，舉例而言，美國專利第6,858,225號、第6,815,432號、第8,158,601號及第8,058,069號，該等專利之整體內容藉由引用而併入本文。
如本文所用，「受試者」為動物，諸如哺乳動物，包括靈長動物(諸如人類、非人類靈長動物，例如，猴及黑猩猩)或非靈長動物(諸如大鼠或小鼠)。於一較佳態樣中，受試者係人，諸如正在進行對將會受益於SNCA表現減少之疾病、病症或病症之治療或評估的人；處於將會受益於SNCA表現減少之疾病、病症或病症之風險下的人；罹患將會受益於SNCA表現減少之疾病、病症或病症的人；或正在正在進行對將會受益於SNCA表現減少之疾病、病症或病症之治療的人，如本文中所述。
如本文所用，術語「治療」或「處理」指代於患有神經退化性疾病之受試者中的有益或所欲之結果，包括但不限於與SNCA基因表現或SNCA蛋白質產生(例如，SNCA相關神經退化性疾病)之一種或多種徵象或症候的緩解或減輕，該疾病例如突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病；於增加的神經元失能或死亡區域中的減少的SNCA之表現或活性。「治療」亦可意指相對於在治療缺失情況下預期之存活期而延長存活期。
在受試者中SNCA或疾病標記或症候之含量/量級的情境中，術語「下降」指代此含量/量級之統計學顯著之減少。該減少可係，舉例而言，至少10%、15%、20%、25%、30%、%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%或更多。於某些態樣中，降幅為至少20%。於某些態樣中，該減少為疾病標記，例如，蛋白質或基因表現量級減少至少50%。於受試者體內之SNCA量級的情境中，「下降」視需要係低至如同不具此病變之個體至正常範圍內所接受的量級。於某些態樣中，「下降」係罹患疾病之受試者之標記或症候量級與個體正常範圍內之接受量級之間的差異減少，例如，在患有巴金森氏症之個體與未患有巴金森氏症或具有處於正常範圍內之症候的個體之間觀察到的運動速度(運動徐緩)及調價姿勢及平衡的能力之差異。
如本文所用，「預防」或「阻止」當參照疾病或病症使用時，將會受益於SNCA基因之表現或SNCA蛋白之產生降低，例如，在由於例如遺傳因素或年齡而易患SNCA相關病症之受試者中，其中該受試者尚未符合SNCA相關病症之診斷標準。如本文所用，預防可理解為向尚未符合SNCA相關病症之診斷標準的受試者投予藥劑，以延緩或降低該受試者將發展出SNCA相關病症的可能性。由於該劑為藥學劑，其係理解為投予典型將會處於健康照護專業人士的指導下，該專業人士能夠將尚未符合SNCA相關病症之診斷標準的受試者鑑定為易發展出SNCA相關病症。
術語「突觸核蛋白病變」指代以α-突觸核蛋白之原纖維集聚物為特徵的一組神經退化性病症，該集聚物傾向於在神經元及神經膠質細胞之選擇性群體中蓄積。因此，突觸核蛋白病變為一類SNCA相關神經退化性疾病及病症，其等包括巴金森氏症(PD)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)及多系統萎縮(MSA)等神經退化性疾病。臨床上，突觸核蛋白病變係以運動、認知、行為及自主功能之慢性及進行性能力下降為特徵，取決於病灶於大腦中之分佈。因為臨床重疊，差異性診斷有時非常困難。巴金森氏症候群為PD之 主要症候，但其可能難以與LBD及MSA之巴金森氏症候群區分開來。自主神經功能障礙為在PAF中的孤立發現，可能存在於PD及LBD中，但在MSA中往往更為突出且出現得更早。LBD可係與PD相同之疾病，但具有廣泛的皮質病理學狀態，導致失智症、認知波動及特徵性幻視。
發展出突觸核蛋白病變例如PD、LBD等的可能性降低，舉例而言，當具有關於PD或LBD(或其他突觸核蛋白病變)的風險因素的個體或未能發展出PD或LBD(或其他突觸核蛋白病變)或發展出PD或LBD(或其他突觸核蛋白病變)但嚴重程度低於具有相同風險因素而未接受本文所揭示之治療的群體時。無法發展為SNCA相關病症例如PD或LBD(或其他突觸核蛋白病變)或將發展為PD或LBD(或其他突觸核蛋白病變)的時間延遲數月或數年係視為有效預防。預防可能需要投予超過一劑之該iRNA劑。提供合適之方法以鑑定受試者處於發展為任何上述SNCA相關疾病之風險下，本文所提供的iRNA劑可用為在預防以神經元細胞擴大的胞內體為特徵的SNCA相關疾病之方法中使用的藥劑。關於各種SNCA相關疾病之風險因素係於本文中檢討。
如本文所用，術語「巴金森氏症」或「PD」指代一種影響運動的進行性神經系統病症。PD之主要病理學特徵為大腦基底神經節中之細胞死亡(到生命終結時，影響中腦黑質緻密帶中至多70%的多巴胺分泌神經元)及路易氏體(SNCA編碼的α-突觸核蛋白之蓄積)在剩餘神經元中之多數中的存在。症候逐漸開始，有時伴有一隻手的幾乎不明顯的震顫或者僵硬或動作遲緩。其他早期症候包括缺少面部表情，在行走時缺少手臂運動，以及言語不清。巴金森氏症之症候隨時間推移而惡化。PD之平均發作年齡為60歲，並且晚期發作與更高的症候嚴重性相關聯。臨床特徵包括但不限於，更嚴重之震顫、動作遲緩(運動徐緩)、肌 肉僵直、姿勢及平衡受損、自主運動的損失、言語變化及最終的失智症、幻覺及囿於輪椅。
如本文所用，「路易氏體失智症(LBD)」指代一種類型的進行性失智症，其由於α-突觸核蛋白在患病大腦神經元中之蓄積(稱為路易氏體及路易氏神經突)而導致思維、推理及獨立功能的能力下降。α-突觸核蛋白之集聚物導致受影響之神經元的次優運轉及最終死亡。症候包括視覺、聽覺、嗅覺或觸覺幻覺；巴金森氏症之徵象(巴金森氏症樣徵象)；對身體機能(自主神經系統)之不佳調整，諸如眩暈、跌倒及腸道問題；認知問題諸如精神錯亂、注意力不佳、視覺-空間問題及記憶力損失；睡眠困哪諸如快速眼動(REM)睡眠行為障礙(其中夢在睡眠時以身體表現出來)；注意力波動，包括嗜睡發作、長時間凝視空處、白天長時間小睡或言語紊亂、抑鬱及冷漠。
如本文所用，術語「多系統萎縮(MSA)」指代一種罕見的退化性神經病症，其影響受試者的非自願(自主神經)功能，包括血壓、呼吸、膀胱功能及運動控制。MSA先前稱為Shy-Drager症候群、橄欖體橋腦小腦萎縮或紋狀黑質退化，共享許多巴金森氏症樣症候，諸如動作遲緩、肌肉僵直及平衡不佳。MSA治療包括用藥及改變生活習慣以幫助管理症候，但無法治愈。MSA造成大腦之部分(小腦、基底神經節及腦幹)的劣化及收縮(萎縮)，其調整內部身體機能、消化及運動控制。MSA受試者的受損腦組織顯示含有異常量之α-突觸核蛋白的神經細胞(神經元)。MSA受試者典型在MSA症候首次出現後生存約7至10年。惟，帶MSA存活率差異很大。偶爾，MSA受試者可帶病存活15年或更久。死亡往往是由於呼吸問題。MSA逐步進展並最終導致死亡。影響身體的很多部分。MSA症候典型在成人期發展出，往往在五十幾歲或六十幾歲。MSA係分類為兩 種類型：巴金森氏症型及小腦型。類型係取決於在診斷室觀察到的症候。巴金森氏型MSA為最常見類型之MSA，其徵象及症候類似於巴金森氏症之彼等，諸如肌肉僵直、手臂及腿難以彎曲、動作遲緩(運動徐緩)、震顫(與經典巴金森氏症相比，在MSA中罕見)以及姿勢及平衡問題。小腦型MSA徵象及症候包括肌肉協調問題(共濟失調)，亦可能包括運動及協調受損，諸如步態不穩及失去平衡、口齒不清、言語遲緩或音量低(口吃)、視覺障礙諸如視線模糊或復視覺以及眼睛難以聚焦、難以吞嚥(吞嚥困難)或咀嚼，以及通常徵象及症候。此外，多系統萎縮之主要徵象為姿勢性(起立性)低血壓，其係一種型式之低血壓，當受試者從坐姿或臥姿站立時使得受試者感覺眩暈或頭暈，或甚至昏迷。MSA受試者亦可發展出危險的在躺下時之高血壓量級(仰臥位高血壓)。與MSA相關之其他困難包括非自願(自主神經)身體機能，諸如尿道及腸道障礙、便秘、膀胱或腸道控制的損失(失禁)、出汗異常、汗液、淚液及唾液分泌降低、由於出汗減少所致的熱不耐受、體溫控制受損(往往造成手腳冰冷)、睡眠障礙、由於將夢境「付諸行動」而導致的煩躁不安之睡眠、夜間呼吸異常、性功能障礙、無法達成或維持勃起(陽痿)、性慾喪失、心血管問題、由於血液淤積導致的手腳顏色變化、手腳冰冷、精神問題及難以控制情緒，諸如不適當的笑或哭。MSA的可能併發症包括睡眠期間呼吸異常；由於平衡不佳或昏迷所致的跌倒造成之損傷；進行性不動性，其可能導致繼發性問題諸如皮膚破裂、在日常活動中失去自我照護能力、導致言語及呼吸苦難的聲帶麻痺、及增加的吞嚥困難。
於一個態樣中，SNCA相關疾病或病症(突觸核蛋白病變)為下列疾病中之一者：巴金森氏症、路易氏體失智症、多系統萎縮(MSA)及單純性自主神經衰竭(PAF)。
如本文中所用，「治療有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑向患有SNCA相關疾病之受試者投予時，其量足以有效治療該疾病(例如，藉由削弱、緩解或維持現有疾病或疾病之一種或多種症候)。「治療有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病及其嚴重程度及待治療之受試者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個別特徵而變。
如本文中所用，「預防有效量」旨在包括RNAi劑之下述之量，當將該RNAi劑向患有SNCA相關疾病之受試者投予時，其量足以預防或緩解該疾病或該疾病之一種或多種症候。緩解該疾病包括減緩該疾病之進程或減輕後來發展之疾病的嚴重程度。「預防有效量」可依據RNAi劑、該劑如何投予、疾病風險程度及待治療之患者的病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前治療或並行治療之類型(若存在)、以及其他個別特徵而變。
「治療有效量」或「預防有效量」亦包括以可用於任意治療之合理效益/風險比率產生一些所欲之局部或全身效果之RNAi劑的量。本揭露之方法中採用之RNAi劑可以足以產生可用於此治療之合理效益/風險比率的量給投予。
本文中，片語「醫藥上可接受」用以指代彼等化合物、材料、組成物或劑型，其係處於適用於與人類受試者及動物受試者之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症之所謂醫療判斷之範疇內，與合理效益/風險比率相稱。
如本文中所用，片語「醫藥上可接受之載劑」意指醫藥上可接受之材料、組成物或媒介物，諸如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(如， 潤滑劑、雲母、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、或硬脂酸)、或溶劑封裝材料，其參與將受試化合物從一個器官或身體部分攜帶或運送至另一器官或身體部分。就與配製物之其他成分相容且不損害被治療之受試者而言，每一載劑必須為「可接受」。可用作藥學上可接受之載劑之材料的一些實例係包括：(1)糖類，如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉類，如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及醋酸纖維素；(4)黃蓍膠粉末；(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及雲母；(8)賦形劑，如可可脂及栓蠟；(9)油類，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄欖油及大豆油；(10)二醇類，如丙二醇；(11)多元醇類，如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯類，如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等張鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩衝溶液；(21)聚酯類、聚碳酸酯類或聚酐類；(22)增積劑，如多肽及胺基酸類；(23)血清組分，如血清白蛋白、HDL及LDL；以及(22)醫藥配製物中採用之其他非毒性相容物質。
如本文中所用，術語「樣品」包括從受試者分離之相似體液、細胞或組織的集合，以及受試者體內存在之體液、細胞或組織。生物體液之示例包括血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣品可包括來自組織、器官或局部區域之樣品。舉例而言，樣品可源自特定之器官、器官之部分、或彼等器官內之體液或細胞。於某些態樣中，樣品可源自腦部(例如，全腦或腦之某些區段，例如，紋狀體，或腦中某些類型之細胞諸如，例如，神經元及神經膠質細胞(星狀膠質細胞、寡樹突細胞、小神經膠質細胞))。於其他態樣中，「源自受試者之樣品」指代從該受試者抽取之血液或血漿或源自其之血 漿或血清。於進一步之態樣中，「源自受試者之樣品」指代源自該受試者之腦組織(或其亞組分)或腎組織(或其亞組分)。
應理解，舉例而言，儘管表2中之序列係揭示為經修飾或經接合之序列，但於某些態樣中，本揭露之RNAi劑的RNA，例如，本揭露之dsRNA，可包含表2或3中詳述之任一序列，其係經不同於表中所揭示者之修飾或接合。親脂性配體可包括在本申請中所提供的位置中之任一處，除非在指出之具體位置/定位的情況下。
圖1A及圖1B 顯示所選擇之SNCA-靶向RNAi劑對於人類BE(2)-C神經母細胞瘤細胞、COS-7非洲綠猴纖維母細胞樣細胞中之雙重螢光素酶報告系統以及人類SNCA-AAV過表現小鼠中之SNCA量級的效應。 圖1A 顯示SNCA-靶向RNAi劑AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634、AD-464779、AD-464314、AD-464313、AD-464590、AD-464585、AD-464229、AD-464586及AD-464592(荷有三觸角GalNAc修飾之「親本」siRNA，相對於本揭露的CNS定向siRNA)於BE(2)-C細胞中以及使用COS-7細胞中之雙重螢光素酶報告系統獲得的SNCA mRNA減弱，分別針對各siRNA。 圖1B 顯示所指示之雙鏈體於人類SNCA-AAV過表現小鼠中的活體內肝臟SNCA減弱結果。為了鑑定該等RNAi化合物於小鼠中之RNA活體內功效，首先藉由AAV轉導全長人類SNCA。於AAV投予後7天，輸送下列所選擇之雙鏈體：靶向人類SNCA之3' UTR的雙鏈體AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634、AD-464779；以及靶向 SNCA之編碼序列的雙鏈體AD-464314、AD-464313、AD-464590、AD-464585、AD-464229、AD-464586及AD-464592。資料係歸一化至經PBS處理之樣品。
圖2 顯示在對總計360種雙鏈體進行的組合熱點及結構活性關係(SAR)評定中，前四十種最強效之SNCA-靶向siRNA(肝臟靶向雙鏈體)的SNCA減弱結果。該四十種所指示之siRNA顯示在0.1nM雙鏈體濃度下的最高SNCA減弱結果並且展現清晰的線性劑量-反應。
圖3 顯示示例性AD-1549290雙鏈體之示意圖，其具備有義股序列5'-uscscca(Ghd)uuUfCfUfugagaucugaL96-3'(SEQ ID NO：245)及反義股序列5'-VPusdCsagdAudCucaadGaAfacugggasgsc-3'(SEQ ID NO：246)。
圖4 顯示活體內AAV滴定研究之結果，其中AAV係用於將人類SNCA投予小鼠肝臟，隨後評定輸送及表現之程度。於左圖中，當採用AAV投予人類SNCA時，用於評估小鼠肝臟中之人類SNCA表現的PCR媒介之人類SNCA檢測的閾值以劑量-反應方式顯示下降。於右圖中，當以3mg/kg(mpk)或10mpk量級向huSNCA-表現小鼠投予時，先前表徵之SNCA-靶向siRNA AD-464634(靶向SNCA 3' UTR序列)及AD-464314(靶向SNCA編碼序列)表明對在小鼠肝臟中SNCA表現的強勁活體內抑制。
圖5A及圖5B 顯示在活體內AAV研究中評估的全部17種SNCA-靶向siRNA於小鼠肝臟中之活體內SNCA減弱結果，以及雙鏈體序列修飾模式之示意圖。 圖5A 顯示在經由AAV投予人類SNCA的小鼠中觀察到的活體內人類SNCA減弱結果。將17中所指示的新評估之SCNA-靶向siRNA與先前鑑定的SNCA-靶向雙鏈體AD-464634.2並且與PBS對照比較。 圖5B 顯示潛在之肝臟靶向雙鏈體AD-1549333(有義股：5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugugaL96-3' SEQ ID NO：247；反義股：5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3' SEQ ID NO：248)、AD-1746465(有義股：5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuugaL96-3' SEQ ID NO：249；反義股：5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3' SEQ ID NO：250)、AD-1571188(有義股：5'-gsusaca(Ahd)GfuGfCfUfcaguuccaaaL96-3' SEQ ID NO：251；反義股：5'-VPusUfsugdGa(Agn)cugagcAfcUfuguacsasg-3' SEQ ID NO：252)、AD-1549401(有義股：5'-cscsauc(Ahd)gcAfGfUfgauugaaguaL96-3' SEQ ID NO：253；反義股：5'-VPusdAscudTcdAaucadCuGfcugauggsasa-3' SEQ ID NO：254)、AD-1549054(有義股：5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguuggaL96-3' SEQ ID NO：255；反義股：5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3' SEQ ID NO：256)、AD-1746466(有義股：5'-uscsccag(Uhd)uUfCfUfugagaucugaL96-3' SEQ ID NO：257；反義股：5'-VPusdCsagdAudCucaadGaAfacugggasgsc-3' SEQ ID NO：258)及AD-1548886(有義股：5'-uscsaug(Ahd)aaGfGfAfcuuucaaagaL96-3' SEQ ID NO：259；反義股：5'-VPusdCsuudTgdAaagudCcUfuucaugasasu-3' SEQ ID NO：260)之序列及修飾模式的示意圖，該等雙鏈體係經選擇以潛在地作為siRNA用於非人類靈長動物(NHP)研究。
圖6A至圖6C 顯示跨如上鑑定之七種SNCA-靶向siRNA的鼠活體內減弱、活體外減弱及位置資訊之比較，其獲得三種先導候選親本siRNA用於NHP研究，亦顯示了結構。 圖6A 顯示跨如上鑑定之七種SNCA-靶向siRNA AD-1549333、AD-1746465、AD-1571188、AD-1549401、AD-1549054、AD-1746466及AD-1548886的鼠活體內減弱及活體外減弱之比較。 圖6B 顯示候選先導親本siRNAAD-1549333、AD-1746465、AD-1571188、AD-1549401、AD-1549054、AD-1746466及AD-1548886中之各種的標靶SNCA mRNA位置。 圖6C 顯示，自上 而下，所選擇的候選親本雙鏈體AD-1549333(有義股：SEQ ID NO：247；反義股：SEQ ID NO：248)、AD-1746465(有義股：SEQ ID NO：249；反義股：SEQ ID NO：250)及AD-1549054(有義股：SEQ ID NO：255；反義股：SEQ ID NO：256)之序列及修飾模式。此等親本雙鏈體係相應地經調適以創建先導SNCA-靶向雙鏈體AD-1747585、AD-1747583及AD-1747580，具有如表2中所示的序列及修飾模式，用於NHP研究中之CNS投予。
圖7 呈現示意圖，其顯示三種經選擇用於NHP研究的雙鏈體：AD-1747585(具有有義股SEQ ID NO：35及反義股SEQ ID NO：78)、AD-1747583(具有有義股SEQ ID NO：28及反義股SEQ ID NO：71)以及AD-1747580(具有有義股SEQ ID NO：21及反義股SEQ ID NO：64)。
圖8A及圖8B 顯示在非人類靈長動物(NHP)中進行測試的三種候選先導雙鏈體的初始選擇及藥物動力學分佈。 圖8A 顯示經選擇以進行NHP動物研究的三種候選先導雙鏈體之初始活體內功效及ED50值。 圖8B 顯示，經由鞘內注射單一60mg劑量之siRNA而給藥至非人類靈長動物(NHP)的三種候選先導SNCA-靶向雙鏈體，在注射後的最初24小時，顯示跨所給藥動物的類似的藥物動力學。
圖9A及圖9B 顯示在經由鞘內注射投予的三種候選SNCA-靶向雙鏈體之NHP動物研究中獲得的藥物動力學(PK)及藥效學(PD)資料。 圖9A 顯示，在注射後第29天(「D29」)，所測試的三種SNCA-靶向雙鏈體中之各者展現前額葉及中腦兩者的NHP組織中的SNCA mRNA之高效力降低(左圖，PD結果)。貫穿所測試的NHP前額葉皮質及中腦組織，觀察到組織PK(所測試的雙鏈體之組織濃度)與組織SNCA mRNA PD之間的強相關性(右圖，PK/PD結果)，其 中所測試的三種雙鏈體中之各者顯示類似的效力(基於mRNA減弱結果，在第29天，在三種先導物之間沒有觀察到統計學顯著的差異)。名義上，在第29天，於NHP中觀察到下列IC50排名：AD-1747583(0.532μg/g)<AD-1747580(1.050μg/g)<AD-1747585(1.300μg/g)。 圖9B 顯示，在注射後第29天(「D29」)，接受鞘內給藥SNCA-靶向雙鏈體的NHP之大腦及脊髓中的α-突觸核蛋白量級降低，並且在所測試的三種候選先導劑之間觀察到微小差異。
圖10 顯示第29天NHP資料之總結。
圖11 顯示，在鞘內投予SNCA-靶向雙鏈體或對照分子後第84天(「D84」)，跨所測試的全部3種候選先導雙鏈體，於前額葉皮質及中腦組織兩者中皆觀察到顯著量級的SNCA mRNA減弱(左圖)。於上揭在投予後第29天觀察到的結果一致，第84天樣品展現組織PK與mRNA PD之間的良好相關性，具有與針對所檢查的三種候選先導雙鏈體中之各者觀察到的類似的效力(右圖)。值得注意的是，投予AD-1747585的組僅有一隻動物符合給藥準則，這導致投予AD-1747585的組之剩餘者經再次給藥。
圖12A至圖12E 顯示，在投予後第84天，不同大腦區域中的SNCA mRNA量級及α-突觸核蛋白量級兩者皆降低，其中在所測試的三種候選先導物(AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585雙鏈體)之間觀察到微小差異，並且亦顯示SNCA mRNA/α-突觸核蛋白相關性及再次給藥資料。 圖12A 顯示，在經由鞘內路徑投予60mg之雙鏈體劑後第84天，NHP中之SNCA mRNA降低。 圖12B 顯示，在第84天，大腦及脊髓(跨全部所檢查的區域)中的α-突觸核蛋白量級亦降低，再次在三種候選先導雙鏈體之間觀察到微小差異。 圖12C 顯示，在投予後第84天，跨所檢查的不同大腦區域，α-突觸核蛋白量級展現與 SNCA mRNA量級的高相關性。 圖12D 顯示，在某些經鑑定為在熟識投予時錯誤給藥的NHP中，再次給藥並且在超過第84天檢查大腦及脊髓組織表明，跨各種大腦區域，SNCA NHP組織蛋白藥效學(PD)展現強勁的減弱，詳而言於經再次給藥AD-1747580的NHP中。 圖12E 顯示，跨延長之時程，腦脊液(CSF)中的α-突觸核蛋白量級，該時程包括對某些初始錯誤給藥的NHP再次給藥並且在超過第84天之時間點監測之。於此類經再次給藥的NHP動物中，對於用雙鏈體AD-1747585(再次)給藥的動物，CSF α-突觸核蛋白量級展現至多75%降低，而對於用雙鏈體AD-1747580及AD-1747583(再次)給藥的動物，CSF α-突觸核蛋白量級展現至多50%降低。
圖13 顯示，在投予雙鏈體後第84天，對於用雙鏈體AD-1747580及AD-1747583給藥的動物，觀察到的NHP CSF中α-突觸核蛋白之量級為至多90%降低(PD效應)。同時，雙鏈體AD-1747585顯示約75% CSF α-突觸核蛋白減弱，而值得注意的是，雙鏈體AD-1747585亦展現可變的CSF α-突觸核蛋白減弱，這可能是由於血液污染，因為SNCA在血細胞中高度表現。
圖14A至圖14D 顯示，在第29天(作為「早期」時間點)，在相同組織中觀察到的減弱之SNCA mRNA量級與減弱之α-突觸核蛋白量級之間的分歧，並且顯示，此類分歧在第94天時間點消退，指示此類效應可歸因於α-突觸核蛋白於所檢查的組織中之長半衰期。 圖14A 顯示，於投予雙鏈體後第29天，對於所測試的全部三種先導雙鏈體，經治療之NHP的皮質及中腦僅展現α-突觸核蛋白(雙鏈體之PD效應)的最適度之(<60%)減弱(左圖)。皮質及中腦中的α-突觸核蛋白之此類適度降低可指示α-突觸核蛋白於此類組織中的延長之半衰期。對於全部三種所測試的雙鏈體，觀察到組織蛋白PK/PD係散佈者(中圖)；惟，組 織α-突觸核蛋白量級係與組織SNCA mRNA量級高度相關(右圖)。 圖14B 顯示，在投予後第29天，CSF中之α-突觸核蛋白減弱與皮質(左圖)及紋狀體(中圖)α-突觸核蛋白減弱相關。相比之下，在投予後第29天，中腦組織α-突觸核蛋白減弱不與CSF α-突觸核蛋白減弱相關(右圖)。 圖14C 顯示，儘管在投予(此處，SNCA-靶向雙鏈體AD-1747580)後第29天，前額葉皮質及中腦組織中之SNCA mRNA量級降低，但α-突觸核蛋白量級僅適度降低，其指示α-突觸核蛋白之長期蛋白質半衰期似乎解釋該分歧。 圖14D 顯示，在投予後第84天，對於全部3種先導雙鏈體，經治療之NHP動物的皮質及中腦組織中之α-突觸核蛋白量級顯示強勁的減弱(PD效應，左圖)。在第84天於皮質及中腦NHP組織中觀察到的強勁的α-突觸核蛋白減弱證實了α-突觸核蛋白之長蛋白質半衰期。對於全部三種雙鏈體，組織蛋白PK/PD曲線顯示類似的概況(中圖；AD-1747585組係標註為僅有一隻動物符合給藥準則，而該組之剩餘者經再次給藥)。α-突觸核蛋白量級係與皮質及中腦組織兩者中之mRNA量級高度相關(右圖)。
圖15 顯示，亦觀察到，在投予雙鏈體後第84天，NHP動物中的CSF中之α-突觸核蛋白減弱與前額葉皮質及中腦α-突觸核蛋白減弱相關。
圖16 顯示，在投予雙鏈體後第84天，跨所測試的NHP動物之各種大腦區域的siRNA組織曝露。除少數例外，siRNA劑之組織滲透良好，即使經最大曝露於siRNA雙鏈體之組織(例如，前額葉皮質)也不一定顯示所觀察到的最大量級之SNCA mRNA及/或α-突觸核蛋白減弱。
圖17 顯示，在投予後第2天或第84天，與僅用媒介物平行給藥的對照NHP動物相比，向NHP動物投予的三種候選先導雙鏈體無一展現對體重的任何顯著效應。
圖18 顯示當檢測給藥候選先導雙鏈體的NHP動物組組中的CSF中之神經絲輕鏈(NfL)時獲得的結果，與僅投予人工CSF(aCSF)的對照NHP動物相比。儘管對於全部三種雙鏈體皆在給藥後觀察到NfL之短暫加標，此類NfL加標在很大程度上並未持續超過投予後第29天，這指示該等三種SNCA-靶向候選先導雙鏈體似乎不具有可表明雙鏈體毒性的NfL概況。
圖19A至圖19D 顯示所檢查的三種候選先導雙鏈體中之各者的RNA-Seq資料。 圖19A 顯示AD-1747580雙鏈體(有義股：SEQ ID NO：21；反義股SEQ ID NO：64)之示意圖，其中RNA-Seq資料指示，與適當之對照相比，在AD-1747580雙鏈體之存在下，在投予AD-1747580雙鏈體並且經歷RNA-Seq分析的細胞中達成SNCA之93%減弱，同時，跨基因體沒有其他基因座顯示超過50%減弱(或強勁且顯著的升高)。 圖19B 顯示候選先導雙鏈體AD-1747580的效力匹配之RNA-Seq譜，其中亦顯示親本雙鏈體AD-1549054之RNA-Seq結果。在左圖中，展示了GalNAc修飾之AD-1549054親本雙鏈體(有義股：5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguuggaL96-3' SEQ ID NO：255；反義股：5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3' SEQ ID NO：256)的示意圖，其下方為該雙鏈體之RNA-Seq資料，該資料表明在經處理之細胞(投予10nM劑量之AD-1549054親本雙鏈體)中的大約74% SNCA減弱。中圖及右圖為AD-1747580雙鏈體(有義股：SEQ ID NO：21；反義股：SEQ ID NO：64)之示意圖，其下方為該雙鏈體的在相應之1nM(中圖，顯示大約78% SNCA減弱)及10nM(右圖，顯示大約93% SNCA減弱)劑量下的RNA-Seq結果。 圖19C 顯示候選先導雙鏈體AD-1747583的效力匹配之RNA-Seq譜，其中亦顯示親本雙鏈體AD-1549283之RNA-Seq結果。在左圖中，展示了GalNAc修飾之AD-1549283親本雙鏈體(有 義股：5'-uscsuuu(Ghd)cuCfCfCfaguuucuugaL96-3' SEQ ID NO：268；反義股：5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3' SEQ ID NO：269)的示意圖，其下方為該雙鏈體之RNA-Seq資料，該資料表明在經處理之細胞(投予10nM劑量之AD-1549283親本雙鏈體)中的大約79% SNCA減弱。中圖及右圖為AD-1747583雙鏈體(有義股：SEQ ID NO：28；反義股：SEQ ID NO：71)之示意圖，其下方為該雙鏈體的在相應之1nM(中圖，顯示大約67% SNCA減弱)及10nM(右圖，顯示大約92% SNCA減弱)劑量下的RNA-Seq結果。值得注意的是，三個脫靶基因座係經鑑定為受到用AD-1747583雙鏈體給藥的顯著影響(>50%降低)：HMGB2。PYGB、NREP及LCLAT1。 圖19D 顯示候選先導雙鏈體AD-1747585的效力匹配之RNA-Seq譜，其中亦顯示親本雙鏈體AD-1549333之RNA-Seq結果。在左圖中，展示了GalNAc修飾之AD-1549333親本雙鏈體(有義股：5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugugaL96-3' SEQ ID NO：247；反義股：5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3' SEQ ID NO：248)的示意圖，其下方為該雙鏈體之RNA-Seq資料，該資料表明在經處理之細胞(投予10nM劑量之AD-1549333親本雙鏈體)中的大約81% SNCA減弱。中圖及右圖為AD-1747586雙鏈體(有義股：SEQ ID NO：35；反義股：SEQ ID NO：78)之示意圖，其下方為該雙鏈體的在相應之0.1nM(左中圖，顯示大約68% SNCA減弱)、1nM(右中圖，顯示大約93% SNCA減弱)及10nM(右圖，顯示大約96% SNCA減弱)劑量下的RNA-Seq結果。值得注意的是，一個脫靶基因座係經鑑定為受到用AD-1747585雙鏈體給藥的顯著影響(>50%降低)：HMGB2。
圖20 顯示表格，其總結向NHP動物投予的全部三種候選先導SNCA-靶向雙鏈體之減弱及RNA-Seq資料。
貫穿圖示，術語「2-C16」指代2'-O-十六烷基修飾。本發明進一步藉由下列具體實施方式予以示例性說明。
本揭露係提供RNAi組成物，其係影響SNCA基因之RNA轉錄本的RNA誘導之緘默化複合體(RISC)介導之裂解。SNCA基因可係處於細胞內，例如受試者諸如人類體內之細胞內。本揭露亦提供使用本揭露之RNAi組成物的方法，用於抑制SNCA基因之表現或用於治療患有將會受益於抑制或降低SNCA基因之表現的病症之受試者，該病症為例如SNCA相關疾病，例如，突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
本發明之RNAi劑包括RNA股(反義股)，該股具有約30個核苷酸或更短之長度的區域，如15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、 20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度，該區域與SNCA基因之mRNA轉錄本的至少一部分實質上互補。於某些態樣中，本揭露之RNAi劑包括RNA股(反義股)，該股具有長度為約21至23個核苷酸之區域，該區域與SNCA基因之mRNA轉錄本的至少一部分實質上互補。
於某些態樣中，本揭露之RNAi劑包括RNA股(反義股)，該股可包括更長之長度，舉例而言，至多66個核苷酸，例如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸之長度，具有至少19個接續核苷酸之區域，該區域與SNCA基因之mRNA轉錄本的至少一部分實質上互補。此等具有長度較長之反義股的RNAi劑視需要包括長度為20至60個核苷酸之第二RNA股(有義股)，其中該有義股係與該反義股形成18至30個接續核苷酸之雙鏈體。
此等RNAi劑之使用使得哺乳動物之SNCA基因之mRNA的靶向降解成為可能。因此，該等方法及包括此等RNAi劑之組成物可用於治療將會受益於SNCA蛋白質之量級或活性之降低的受試者，諸如患有SNCA相關神經退化性疾病之受試者，該疾病例如突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲 海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
α-突觸核蛋白的神經元內蓄積業經揭示為導致路易氏體(圓形嗜酸性球透明10-20pm大包涵物)之形成或路易氏神經突(延長的線狀營養不良軸突及樹突)之形成。不欲受縛於理論，於PD腦中，路易氏體及路易氏神經突之沉積係廣泛存在，但對於此類沉積而言最脆弱之區域據信為黑質。病理學係廣泛存在，因為PD具有運動(基於黑質)及非運動(腦之其他部位，例如，皮質等)症候。黑質細胞對執行運動及姿勢功能而言至關重要，解釋了PD運動症候之屬性，而對其他細胞類型的影響解釋了PD非運動症候諸如失智症、情緒變化及抑鬱症。於LBD腦中，路易氏體及路易氏神經突之廣泛沉積係見於中腦及皮質區域兩者中。
α-突觸核蛋白為主要見於神經元內的蛋白質。於神經元內，α-突觸核蛋白主要位於突觸前，並且因此業經推測其在突觸活動之調整中發揮重要作用。業經鑑定了α-突觸核蛋白之三種主要同功型，其中最長且最常見形成包含140個胺基酸。
氧化應激業經牽涉到大量以誤摺疊之α-突觸核蛋白之病理學蓄積為特徵的神經退化性病症中。各種反應性氧物質可誘導脂質諸如細胞膜或脂蛋白之過氧，並且亦導致由多不飽和脂肪酸生成高反應性醛(Yoritaka et al.,1996)。
阿茲海默症(AD)之腦病理學指示，亦即，澱粉樣蛋白斑塊及神經纖維纏結，係見於大約50%的具有LBD之案例中。尚不清楚平行病理學之存在 是否意味著兩種不同疾病，或僅代表各相應病症之變種。有時，具有共病理學之案例係揭示為具有AD之路易氏體變種(Hansen et al.,1990)。
研究亦涉及SNCA於AD及唐氏症候群中之作用，因為α-突觸核蛋白業經表明在此等病症中蓄積於邊緣區域中(Crews et al.,2009)。
罕見的顯性遺傳形式之PD及LBD可由SNCA基因之點突變或複製造成。業經揭示，致病性突變A30P及A53T(Kruger et al.,1998)(Polymeropoulos et al.,1998)以及基因之複製(Chartier-Harlin et al.,2004)造成家族性PD，而業經報導，另一種其他α-突觸核蛋白突變E46K(Zarranz et al.,2004)以及α-突觸核蛋白基因之三倍體(Singleton et al.,2003)造成PD或LBD。
僅部分地理解了α-突觸核蛋白突變之致病性後果。惟，活體外資料業經顯示，A30P及A53T突變增加集聚之速率(Conway et al.,2000)。大量不同組成的α-突觸核蛋白物質(單體、二聚物、寡聚物，包括基原纖維)係牽涉到該集聚製程中，其等全部可具有不同的毒性特性。哪些分子物質於大腦內發揮毒性效應尚不明確。惟，研究業經指示，α-突觸核蛋白之寡聚物形式特別具有神經毒性。關於寡聚物之作用的額外證據業經藉由以下觀察結果給出：造成遺傳性巴金森氏症的某些α-突觸核蛋白突變(A30P及A53T)導致寡聚率增加。
α-突觸核蛋白集聚的級聯如何開始尚未完全已知。可能的是，單體性α-突觸核蛋白的改變之構形啟動二聚物及三聚物之形成，該二聚物及三聚物基序形成更高之可溶性寡聚物，包括基原纖維，然後此等中等程度尺寸之物質沉積為路易氏體中之不可溶性原纖維。亦可想象，α-突觸核蛋白寡聚物一旦形成即可結合新單體及/或α-突觸核蛋白之較小多聚物，並因此加速原纖維形成 製程。此類播種效應亦可在細胞外空間中可能地發生，因為一些證據表明，α-突觸核蛋白病理可能在患病大腦中在神經元之間傳播。
下述之詳細說明書揭露如何製作及使用含有用以抑制SNCA基因表現之RNAi劑的組成物，以及治療罹患將會從抑制或減少該等基因之表現中受益之疾病及病變之受試者的方法。
I.本揭露之RNAi劑
本文揭示抑制SNCA基因之表現的RNAi劑。於一個態樣中，RNAi劑包括雙股核糖核酸(dsRNA)分子，其用於抑制細胞諸如受試者體內之細胞中的SNCA基因之表現，該受試者為例如哺乳動物諸如諸如患有SNCA相關神經退化性疾病之人類，該疾病例如突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。該dsRNA包括具有互補區域之反義股，該互補區域與在SNCA基因表現中所形成之mRNA的至少一部分互補。於態樣中，該互補區域係約15至30個核苷酸或更短之長度。當與表現SNCA基因之細胞接觸時，該RNAi劑將SNCA基因(例如，人類基因、靈長動物基因、非靈長動物基因)之表現抑制至少50%，如藉由例如PCR或基於分支鏈DNA(bDNA)之方法所檢定，或藉由基於蛋白質之方法 所檢定，諸如藉由使用例如西方印漬術之免疫螢光分子或流式細胞分析術所檢定。
dsRNA包括兩個RNA股，在該dsRNA將被使用之條件下，該兩股互補並雜交以形成雙鏈體結構。dsRNA之一股(該反義股)包括互補區域，該互補區域與標靶序列實質上互補且通常完全互補。靶標序列可係源自在SNCA基因表現過程中形成之mRNA序列。另一股(該有義股)包括一區域，該區域與該反義股互補，使得當在適宜條件下組合時，兩股雜交並形成雙鏈體結構。如本文中他處所述，dsRNA之互補序列亦可作為單個核酸分子之自互補區域而保護，與作為獨立之寡核苷酸相反。
通常，該雙鏈體結構為15至30個鹼基對之長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對之長度。於某些較佳態樣中，該雙鏈體結構為18至25個鹼基對之長度，例如，18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24、 或24至25個鹼基對之長度，舉例而言，19至21個鹼基對之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
同樣，與標靶序列互補之區域為15至30個核苷酸之長度，例如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸之長度，舉例而言，19至23個核苷酸之長度或21至23個核苷酸之長度。上文引述之範圍及長度之間的範圍及長度亦視為本揭露之一部分。
於一些態樣中，該dsRNA為15至23個核苷酸之長度、或24至30個核苷酸之長度(視需要，25至30個核苷酸之長度)。通常，該dsRNA可係足夠長，以用作切丁酶之受質。舉例而言，該領域中係習知，長度超過約21至23個核苷酸之dsRNA可用作切丁酶之受質。具有該領域通常知識者亦將知悉，作為裂解標靶之RNA區域最通常為較大RNA分子之一部分，一般為mRNA分子。若相關，則mRNA標靶之「一部分」為mRNA標靶之接續序列，其長度足以令其作為RNAi引導之裂解(亦即，透過RISC途徑裂解)的受質。
本領域熟練人士亦知悉，該雙鏈體區域為dsRNA之主要功能性部分，例如，約15至36個鹼基對，例如，15至36、15至35、15至34、15至33、15至32、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15 至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24,20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個鹼基對，例如，19至21個鹼基對的雙鏈體區域。因此，於一個態樣中，就其被加工為例如15至30個鹼基對之以用於裂解之所欲RNA為靶向之官能性雙鏈體的程度而言，具有超過30個鹼基對之RNA分子或RNA分子之複合物為dsRNA。因此，具有通常知識之技術人員將知悉，於一個態樣中，miRNA為dsRNA。於另一態樣中，dsRNA不是天然出現之miRNA。於另一態樣中，可用於靶向SNCA表現之RNAi劑並非藉由較大dsRNA之裂解而在標靶細胞內生成。
本文中所述之dsRNA可復包括一個或多個具有例如1、2、3或4個核苷酸之單股核苷酸突出。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物或由其組成，其中該核苷酸/核苷類似物包括去氧核苷酸/核苷。該(等)突出可位於有義股、反義股或其任意組合。此外，突出之核苷酸可存在於dsRNA之反義股或有義股之5'末端、3'末端或兩端。於某些態樣中，較長、延伸之突出係可能者。
dsRNA可藉由如下文進一步檢討之該領域中已知之標準方法合成，例如，藉由使用自動DNA合成儀，例如可自Biosearch、SNCAlied Biosystems,Inc.商購者。
本揭露之iRNA化合物可使用兩步之過程製備。首先，單獨製備雙股RNA分子之個別股。隨後，將該等組分股黏著。該siRNA化合物之個別股可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。有機合成提供下述優點：包含非天然或經修飾之核苷酸的寡核苷酸股可輕易製備之。本揭露之單股寡核苷酸可使用溶液相有機合成、固相有機合成或兩者製備。
siRNA可藉由多種方法例如以整體產生。示例性方法包括：有機合成及RNA裂解，例如，活體外裂解。
siRNA可藉由獨立地合成單股RNA分子或雙股RNA分子之各相應股，之後可將該等組分股黏著。
大的生物反應器，例如，來自Pharmacia Biotec AB(Uppsala Sweden)之OligoPilot II，可用來為給定siRNA產生大量的特定RNA股。OligoPilotII反應器可使用僅1.5莫耳過量之磷亞醯胺核苷酸來有效地偶合核苷酸。為了作成RNA股，使用核糖核苷酸亞醯胺化物。使用單體加成之標準循環來為該siRNA合成21至23個核苷酸。典型地，獨立地產生兩個互補股，然後黏著之，例如，在從固體支撐物釋放且去保護之後。
有機合成可用來產生離散之siRNA物質。該等物質與SNCA基因之互補性可精確地指定。舉例而言，該等位置可與包括多型性(例如，單核苷酸多型性)之區域互補。再者，多型性之定位可精確地指定。於一些態樣中，該多型性係定位在內部區域中，例如，從一個或兩個端部起至少4、5、7或9個核苷酸。
於一個態樣中，所生成之RNA經小心地純化以去除端部。iRNA經活體外切割為siRNA，舉例而言，使用切丁酶或相當的基於RNAse III之活 性。舉例而言，該dsiRNA可在來自果蠅(Drosophila)之提取物中或使用經純化之組分(例如，經純化之RNAse或RISC(RNA誘導型緘默化複合物))進行活體外孵育。參見，例如，Ketting et al.Genes Dev 2001 Oct 15；15(20)：2654-9及Hammond Science 2001 Aug 10；293(5532)：1146-50。
dsiRNA裂解通常產生複數種siRNA物質，各自為源dsiRNA分子之特定21或23 nt片段。舉例而言，可存在包括與源dsiRNA分子之重疊區域及相鄰區域互補之序列的siRNA。
無論合成方法如何，該siRNA製劑可製備為適用於配製的溶液(例如，水溶液或有機溶液)。舉例而言，該siRNA可經沉澱並再溶解於純雙蒸餾水中，並凍乾。經乾燥之siRNA隨後可再懸浮於適用於預期配製製程之溶液中。
一方面，本揭露之dsRNA包括至少兩個核苷酸序列：有義序列及反義序列。The sense strand sequence for SNCA之有義股序列可選自由表2或3中提供之序列的群組，並且該有義股的相對應反義股之核苷酸序列可選自表2或3中之序列的群組。於此方面，該兩個序列之一者係與該兩個序列之另一者互補，且該等序列之一者係與在SNCA基因之表現中生成之mRNA序列實質上互補。如是，於此方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中對於SNCA，一個寡核苷酸係揭示為表2或3中之有義股(隨從股)，並且第二個寡核苷酸係揭示為表2或3中的有義股之相對應反義股(引導股)。
於一個態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在獨立寡核苷酸。於另一態樣中，該dsRNA之實質上互補序列包含在單個寡核苷酸。
應理解，舉例而言，儘管本文所提供之序列係揭示為經修飾或經接合之序列，但本揭露之RNAi劑的RNA，例如，本揭露之dsRNA，可包含表 2或3中詳述之任一序列，其係經不同於表中所揭示者之修飾或接合。一個或多個親脂性配體可包括在本申請所提供之RNAi劑的任何位置。
熟練之人士應知悉，具有約20至23個鹼基對如21個鹼基對之雙鏈體結構的dsRNA業經被稱為在誘導RNA干擾中尤其有效(Elbashir et al.,(2001)EMBO J.,20：6877-6888)。惟，其他人已發現，更短或更長之RNA雙鏈體結構亦可係有效者(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。於上文揭示之態樣中，憑藉本文中提供之寡核苷酸序列之天性，本文所揭示之dsRNA可包括至少一個長度為最少21個核苷酸之股。可合理地預期，僅在一端或兩端減去幾個核苷酸之較短雙鏈體可能具備與上述dsRNA類似之效果。因此，具有源自本文所提供之一個序列之至少15、16、17、18、19、20或更多個接續核苷酸之序列且其抑制SNCA基因表現之能力與包含全序列之dsRNA相異不超過約10%、15%、20%、25%或30%的dsRNA，係預期處於本發明之範疇內，該抑制係使用活體外檢定用Be(2)-C細胞及10nM濃度之RNA劑及本文實施例中所提供之PCR檢定測得。
一種用於SNCA抑制的基準檢定涉及使人類Be(2)-C細胞與本文所揭露的dsRNA劑接觸，其中與適宜之對照(例如，不與靶向SNCA之dsRNA接觸的細胞)相比，若觀察到SNCA轉錄本或蛋白質的至少5%降低、至少10%降低、至少15%降低、至少20%降低、至少25%降低、至少30%降低、至少35%降低、至少40%降低、至少45%降低、至少50%降低、至少55%降低、至少60%降低、至少65%降低、至少70%降低、至少75%降低、至少80%降低、至少85%降低、至少90%降低、至少95%降低、至少97%降低、至少98%降低、至少99%降低或更大幅度之降低，則鑑定為足夠或有效之SNCA抑制。視需要，本揭露 之dsRNA劑係以10nM濃度投予，且PCR檢定係如本文實施例中所提供者執行(例如，下文實施例2)。
此外，本文所揭示之RNA鑑定SNCA轉錄本中易進行RISC媒介之裂解的位點。如是，本揭露復提出靶向此位點之RNAi劑。如本文中所用，如果RNAi劑促進該特定位點內任意處之轉錄本的裂解，則稱該RNAi劑為以RNA轉錄本之特定位點內為靶向。此RNAi劑通常將包括來自本文所提供之一個序列的至少約15個接續核苷酸，視需要為至少19個核苷酸，該接續核苷酸係與取自SNCA基因中所選擇序列之接續區域的另一核苷酸序列偶合。
本文中所揭示之RNAi劑可含有一個或多個與靶標序列之誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過3個誤配(亦即，3、2、1或0個誤配)。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過2個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有不超過1個誤配。於一個態樣中，本文中所揭示之RNAi劑含有0個誤配。於某些態樣中，如果該RNAi劑之反義股含有與標靶序列之誤配，則誤配可視需要被限定在從互補區域之5'末端或3'末端計數之最末5個核苷酸內。舉例而言，於此類態樣中，對於23個核苷酸之RNAi劑，與SNCA基因之區域互補的股通常不含位於中心13個核苷酸處之任意誤配。本文中揭示之方法或該領域中已知之方法可用以確定，含有與標靶序列之誤配的RNAi劑在抑制SNCA基因之表現中是否有效。慮及具有誤配之RNAi劑在抑制SNCA基因之表現中的功效很重要，尤其若SNCA基因中之特定互補區域係已知具有該種群內之多形性序列變異。
II.本揭露的經修飾之RNAi劑
於較佳態樣中，本發明之RNAi，例如，dsRNA之RNA係經化學修飾以增強安定性或其他有益特徵。於本揭露之某些態樣中，本揭露之RNAi劑的實質上全部核苷酸係經修飾。於本揭露之其他態樣中，本揭露之RNAi劑的全部核苷酸係經修飾。其中「實質上全部核苷酸係經修飾」的本揭露之RNAi劑係大部分但非全部經修飾，且可包括不超過5、4、3、2或未經修飾之核苷酸。於本揭露之又其他態樣中，本揭露之RNAi劑可包括不超過5、4、3、2或1個經修飾之核苷酸。
本揭露提出之核酸可藉由該領域中良好構建之方法合成及/或修飾，諸如彼等於《現代核酸化學技術》(「Current protocols in nucleic acid chemistry」,Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA)中揭示者，該文獻藉由引用併入本文。修飾包括，舉例而言，末端修飾，例如，5'末端修飾(磷醯化、接合、反向鍵聯)或3'末端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鍵聯等)；鹼基修飾，例如，置換為安定化鹼基、去安定化鹼基、或與配偶體之拓展物進行鹼基配對之鹼基，移除鹼基(無鹼基之核苷酸)，或經接合之鹼基；糖修飾(例如，在2'-位置或4'-位置)或糖之置換；或主鏈修飾，包括磷酸二酯類鍵聯之修飾或置換。可用於本文所述態樣中之RNAi劑之具體實例包括，但不限於，含有經修飾之主鏈或不含天然核苷酸間鍵聯之RNA。具有經修飾之主鏈的RNA除此之外亦包括彼等在主鏈中不具有磷原子者。對於本說明書之目的，且如該領域中有時參照者，在其核苷酸間主鏈中不具有磷原子的經修飾之RNA亦可視為寡核苷酸。於一些態樣中，經修飾之RNAi劑將在其核苷酸間主鏈中具有磷原子。
經修飾之RNA主鏈包括，舉例而言，具有正常3'-5'鍵聯之硫代磷酸酯類、手性硫代磷酸酯類、二硫代磷酸酯類、磷酸三酯類、胺基烷基磷酸三酯類、包括3'-伸烷基磷酸酯類及手性磷酸酯類之甲基及其他烷基磷酸酯類、膦酸酯類、包括3'-胺基磷醯胺化物及胺基烷基磷醯胺化物之磷醯胺化物、硫羰基磷醯胺化物類、硫羰基烷基磷酸酯類、硫羰基烷基磷酸三酯類、以及硼磷酸酯類；此等之2'-5'連接類似物；以及彼等具有反向極性者，其中相鄰的核苷單元對將3'-5'連接至5'-3'或將2'-5'連接至5'-2'。亦可包括多種鹽類例如鈉鹽、混合鹽類及游離酸形式。
教示上述含磷鍵聯之製備的代表性美國專利係包括但不限於，美國專利第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,195號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第5,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第5,536,821號、第5,541,316號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799號、第5,587,361號、第5,625,050號、第6,028,188號、第6,124,445號、第6,160,109號、第6,169,170號、第6,172,209號、第6,239,265號、第6,277,603號、第6,326,199號、第6,346,614號、第6,444,423號、第6,531,590號、第6,534,639號、第6,608,035號、第6,683,167號、第6,858,715號、第6,867,294號、第6,878,805號、第7,015,315號、第7,041,816號、第7,273,933號、第7,321,029號、及美國再公告專利第39464號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
其內部不包括磷原子之經修飾之RNA主鏈具有藉由短鏈烷基或環烷基類核苷酸間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基類核苷酸間鍵聯、或一個或 多個短鏈雜原子或雜環類核苷酸間鍵聯形成的主鏈。此等包括彼等具有N-嗎啉基鍵聯(部分地由核苷至糖部分形成)；矽氧烷主鏈；硫醚、亞碸及碸主鏈；甲醯基及硫代甲醯基主鏈；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基主鏈；含有烯之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；以及其他具有混合之N、O、S及CH2組分部分者。
教示上述寡核苷酸之製備的代表性美國專利係包括但不限於，美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,64,562號、第5,264,564號、第5,405,938號、第5,434,257號、第5,466,677號、第5,470,967號、第5,489,677號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號、及第5,677,439號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
於其他態樣中，適宜之RNA模擬物係預期用於RNAi劑中，其中該核苷酸單元之糖及核苷酸間鍵聯兩者亦即主鏈係置換為新穎基團。鹼基單元維持與適宜之核酸標靶化合物雜交。一種此類寡聚化合物，業經顯示具有優異雜交特性之RNA模擬物，係指代為勝肽核酸(PNA)。於PNA化合物中，RNA之糖主鏈係置換為含有醯胺之主鏈，尤其是胺基乙基甘油主鏈。核鹼基得以保留且直接或間接地鍵結至主鏈之醯胺部分的氮雜氮原子。教示PNA化合物之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第5,539,082號、第5,714,331號、及第5,719,262號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。適用於本揭露之RNAi劑中之額外之PNA化合物係揭示於，舉例而言，Nielsen等人，Science,1991,254,1497-1500中。
本揭露提出之一些態樣包括具有硫代磷酸酯主鏈之RNA以及具有雜原子管之寡核苷酸，尤其是上文引用之美國專利第5,489,677號的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI主鏈]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中，天然磷酸二酯主鏈表示為--O--P--O--CH2--]，以及上文引用之美國專利第5,602,240號的醯胺主鏈。於一些態樣中，本文提出之RNA具有上文引用之美國專利第5,034,506號的
Figure 112112698-A0202-12-0075-41
啉基主鍵聯構。
經修飾之RNA亦可含有一個或多個經取代之糖部分。本文提出之RNAi劑例如dsRNA可包括位於2'位置之下述之一者：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中該烷基、烯基及炔基可係經取代或未經取代之C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例性合適修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)．nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3,O(CH2)nONH2、及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m為1至約10。於其他態樣中，dsRNA包括位於2'位置之下述之一者：C1至C10低級烷基、經取代之低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代之矽烷基、RNA裂解基團、保護基團、嵌入劑、用於改善RNAi劑之藥物動力學特性之基團、或用於改善RNAi劑之藥效動力學特性之基團、以及其他具有類似特性之取代基。於一些態樣中，該修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，亦即，烷氧基-烷氧基基團。另一示例性修飾為2'-二甲基胺基氧乙氧基，亦即，O(CH2)2ON(CH3)2基 團，亦稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述；以及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(該領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，亦即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。其他示例性修飾包括：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-去氧核苷酸(於此三組中，皆為R異構物與S異構物兩者)；2'-烷氧基烷基；以及2'-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-O-十六烷基及2'-氟(2'-F)。類似之修飾亦可在RNAi劑之RNA上之其他位置作成，尤其是3'端核苷酸之糖的3'位置或2'-5'鍵聯之dsRNA中以及5'端核苷酸之5'位置。RNAi劑亦可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模擬物諸如環丁基部分。教示此類經修飾之糖結構之製備的代表性美國專利包括但不限於，美國專利第4,981,957號、第5,118,800號、第5,319,080號、第5,359,044號、第5,393,878號、第5,446,137號、第5,466,786號、第5,514,785號、第5,519,134號、第5,567,811號、第5,576,427號、第5,591,722號、第5,597,909號、第5,610,300號、第5,627,053號、第5,639,873號、第5,646,265號、第5,658,873號、第5,670,633號、及第5,700,920號，此等中之某些為本申請所共有。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
本揭露之RNAi劑亦可包括核酸鹼基(該領域中一般簡稱為「鹼基」)修飾或取代。如本文中所用，「未經修飾」或「天然」核酸鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。經修飾之核酸鹼基包括其他合成及天然核酸鹼基，諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-胺基腺嘌呤；腺嘌呤及鳥嘌呤之6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鳥嘌呤之2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、 2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-鹵尿嘧啶、5-鹵胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵、8-胺基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基及其他8-取代之腺嘌呤及鳥嘌呤；5-鹵尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代之尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤；7-去氮鳥嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鳥嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸鹼基包括彼等揭露於美國專利第3,687,808號中者；彼等揭露於《生物化學、生物技術及醫藥中之經修飾之核苷酸》(Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008)中者；彼等揭露於《聚合物科學及工程之簡明百科》(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990)中者；此等由Englisch等人，(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30：613揭露者；以及彼等由《dsRNA研究及應用》第15章第289至302頁(Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and SNCAlications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993)揭露者。此等核鹼基中之某些特別可用於增加本揭露提出之寡聚化合物的結合親和性。此等包括5-取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶及5-丙基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示將核酸雙鏈體安定性增加0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and SNCAlications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)且為示例性鹼基取代，當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾合用時尤甚。
教示某些上述經修飾之核酸鹼基以及其他經修飾之核酸鹼基的代表性美國專利係包括但不限於，上述之美國專利第3,687,808號、第4,845,205號、第5,130,30號、第5,134,066號、第5,175,273號、第5,367,066號、第5,432,272號、第5,457,187號、第5,459,255號、第5,484,908號、第5,502,177號、第5,525,711號、第5,552,540號、第5,587,469號、第5,594,121號、第5,596,091號、第5,614,617號、第5,681,941號、第5,750,692號、第6,015,886號、第6,147,200號、第6,166,197號、第6,222,025號、第6,235,887號、第6,380,368號、第6,528,640號、第6,639,062號、第6,617,438號、第7,045,610號、第7,427,672號、及第7,495,088號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾，以包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸為具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2'碳與4'碳之外接橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3'-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中已顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.等人，(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾以包括一個或多個雙環糖部分。「雙環糖」為藉由兩個原子之橋接而修飾之呋喃糖基環。「雙環核苷」(「BNA」)為核苷，其具有包含連結該糖環之兩個碳原子之橋的糖部分，從而形成雙環系統。於某些態樣中，該橋連結糖環之4'碳與2'碳。因此，於一些態樣中，本揭露之劑可包括一個或多個鎖定之核酸(LNA)。鎖定之核酸為具有經修飾之核糖部分的核苷酸，其中該核糖部分包含連結2'碳與4'碳之外接橋。換言之，LNA為包含雙 環糖部分之核苷酸，其中該雙環糖部分係包含4'-CH2-O-2'橋。這一結構有效地將該核糖「鎖定」為3'-環內結構之構形。將鎖定之核酸加至siRNA中已顯示增加血清中siRNA安定性，且降低脫靶效應(Elmen,J.等人，(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.等人，(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.等人，(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。用於本揭露之多核苷酸之雙環核苷的實例包括而不限於，包含位於4'核糖基環原子與2'核糖基環原子間之橋的核苷。於某些態樣中，本揭露之反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4'至2'橋之雙環核苷。此類4'至2'橋接雙環核苷包括但不限於，4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(亦稱為「經約束之乙基」或「cEt」)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第8,278,283號)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第8,278,425號)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見例如，美國專利公開第2004/0171570號)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R為H、C1-C12烷基或保護基團(參見例如，美國專利第7,427,672號)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見例如，Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(=CH2)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第8,278,426號)。前述者各自之整體內容藉由引用併入本文。
教示鎖定之核酸核苷酸之製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於下列者：美國專利第6,268,490號、第6,525,191號、第6,670,461號、第6,770,748號、第6,794,499號、第6,998,484號、第7,053,207號、第7,034,133號、第7,084,125號、第7,399,845號、第7,427,672號、第7,569,686 號、第7,741,457號、第8,022,193號、第8,030,467號、第8,278,425號、第8,278,426號、第8,278,283號、第2008/0039618號、及第2009/0012281號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
前述雙環核苷之任意者可製備為具有一種或多種立體化學糖組態，包括，舉例而言，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見，WO 99/14226)。
本揭露之RNAi劑亦可經修飾以包括一個或多個經約束之乙基核苷酸。如本文中所用，「約束之乙基核苷酸」或「cEt」為包含雙環糖部分之鎖定之核酸，其中該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-0-2'橋。於一個態樣中，受約束之乙基核苷酸為S構形，本文中指代為「S-cEt」。
本揭露之RNAi劑亦可包括一個或多個「構形上受限之核苷酸」(「CRN」)。CRN為具有連結核糖之C2'碳與C4'碳或核糖之C3'碳與C5'碳之連接子的核苷酸類似物。CRN將該核糖鎖定為安定之構形，且增加其與mRNA之雜交親和性。該連接子足夠長，以將氧置於對於安定性及親和性為最優之位置，從而令核糖不易起皺。
教示上述CRN之製備的代表性專利公開包括但不限於，US 2013/0190383號及WO 2013/036868號，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
於一些態樣中，本揭露之RNAi劑包含一個或多個作為UNA(未鎖定之核酸)核苷酸之單體。UNA為未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一個示例中，UNA亦涵蓋其C1'-C4'鍵(亦即，位於C1'碳與C4'碳間之碳-氧-碳共價鍵)業經移除之單體。於另一實例中，糖之C2'-C3'鍵(亦即，C2'碳與C3'碳之間的碳-碳共價鍵)已移除(參見，Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)及Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，藉由引用併入本文)。
教示UNA之製備的代表性美國專利公開係包括但不限於，US8,314,227號及美國專利公開第2013/0096289號、第2013/0011922號、及第2011/0313020號，其各自之整體內容係藉由引用而併入本文。
對RNA分子之末端的潛在安定化修飾可包括N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2'-O-去氧胸腺嘧啶(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3'-磷酸酯、反向2'-去氧-繼續說之核糖核苷酸諸如反向dT(idT)、反向dA(idA)、及反向無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)等。該修飾之揭露可見於WO 2011/005861中。
於一個實例中，寡核苷酸之3'或5'末端係連接至反向2'-去氧-修飾之核糖核苷酸諸如反向dT(idT)、反向dA(idA)、或反向無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)。於一個特定實例中，反向2'-去氧-修飾之核糖核苷酸係連接至寡核苷酸之3'末端，諸如本文所揭示之有義股的3'末端，其中該連接係經由3'-3'磷酸二酯類鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結。
於另一實例中，有義股之3'末端係經由3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結連接至反向無鹼基核糖核苷酸(iAb)。於另一實例中，有義股之3'末端係經由3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結連接至反向dA(idA)。
於一個特定實例中，反向2'-去氧-修飾之核糖核苷酸係連接至寡核苷酸之3'末端，諸如本文所揭示之有義股的3'末端，其中該連接係經由3'-3'磷酸二酯類鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結。
於另一實例中，有義股之3'端核苷酸為反向dA(idA)且經由3'-3'-鏈結(例如，3'-3'-硫代磷酸酯類鏈結)連接至在先核苷酸。
本揭露之RNAi劑之其他修飾包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物，例如位於RNAi劑之反義股的5'端磷酸酯或磷酸酯模擬物。適宜之磷酸酯模擬物係揭露於，舉例而言，US 2012/0157511中，其整體內容藉由引用併入本文。
A.包含本揭露之模體的經修飾之RNAi劑
於本揭露之某些方面，本揭露之雙股RNAi劑係包括具有如例如WO 2013/075035中所揭露之化學修飾的劑，該申請之整體內容藉由引用併入本文。如本文中及WO2013/075035中所示，藉由將一個或多個位於三個接續核苷酸的三個相同修飾之模體引入RNAi劑之有義股或反義股，特定而言在或鄰近裂解位點處，可獲得傑出之結果。於一些態樣中，RNAi劑之有義股及反義股可以其他方式經完全修飾。此等模體之引入打斷有義或反義股之修飾模式(若存在)。該RNAi劑可視需要與GalNAc衍生物配體例如C16配體接合，例如在有義股。該RNAi劑可視需要用(S)-二醇核酸(GNA)修飾進行修飾，例如在反義股之一個或多個殘基上。所得RNAi劑呈現傑出之基因緘默化活性。
據此，本揭露提供能在體內抑制靶標基因(亦即，SNCA基因)之表現的雙股RNAi劑。該RNAi劑包含有義股及反義股。該RNAi劑之各股可係15至30個核苷酸之長度。舉例而言，各股可係16至30個核苷酸之長度、17至30個核苷酸之長度、25至30個核苷酸之長度、27至30個核苷酸之長度、17至23個核苷酸之長度、17至21個核苷酸之長度、17至19個核苷酸之長度、19至25個核苷酸之長度、19至23個核苷酸之長度、19至21個核苷酸之長度、21至25 個核苷酸之長度、或21至23個核苷酸之長度。於某些態樣中，各股為19至23個核苷酸之長度。
該有義股及反義股典型係形成雙鏈體雙股RNA(「dsRNA」)，本文中亦指代為「RNAi劑」。RNAi劑之雙鏈體區域可係15至30個核苷酸對之長度。舉例而言，該雙鏈體區域可係16至30個核苷酸對之長度、17至30個核苷酸對之長度、27至30個核苷酸對之長度、17至23個核苷酸對之長度、17至21個核苷酸對之長度、17至19個核苷酸對之長度、19至25個核苷酸對之長度、19至23個核苷酸對之長度、19至21個核苷酸對之長度、21至25個核苷酸對之長度、或21至23個核苷酸對之長度。於另一實例中，該雙鏈體區域係選自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸之長度。於較佳態樣中，該雙鏈體區域為19至21個核苷酸對之長度。
於一個態樣中，該RNAi劑可含有位於一股或兩股之3'末端、5'末端或兩端的一個或多個區域或封端基團。該可係1至6個核苷酸之長度，例如，2至6個核苷酸之長度、1至5個核苷酸之長度、2至5個核苷酸之長度、1至4個核苷酸之長度、2至4個核苷酸之長度、1至3個核苷酸之長度、2至3個核苷酸之長度、或1至2個核苷酸之長度。於較佳態樣中，該核苷酸區域為2個核苷酸之長度。該等可係一股比另一股長之結果，或係相同長度之兩股交錯之結果。該可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。該第一股與第二股亦可藉由例如額外之鹼基接合以形成髮夾，或藉由其他非鹼基連接子接合。
於一個態樣中，該RNAi劑之區域中之核苷酸可各自獨立為經修飾或未經修飾之核苷酸，包括但不限於，2'-糖修飾，諸如2'-F、2'-O-甲基胸苷(T)及其任意組合。
舉例而言，TT可係任一股任一端之序列。該可形成與標靶mRNA之誤配，或其可與待作為標靶之基因序列互補或可係另一序列。
位於該RNAi劑之有義股、反義股或兩個之5'或3'可經磷酸化。於一些態樣中，該區域含有兩個核苷酸且在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中該兩個核苷酸可係相同或相異。於一個態樣中，該係存在於有義股、反義股或兩股之3'末端。於一個態樣中，這一3'存在於反義股。於一個態樣中，這一3'存在於有義股。
該RNAi劑可僅含有單個，該可強化該RNAi劑之干擾活性而不影響其整體安定性。舉例而言，該單股可位於有義股之3'末端，或者位於反義股之3'末端。該RNAi劑亦可具有鈍端，位於反義股之5'末端(或有義股之3'末端)，反之亦然。通常，該RNAi之反義股係具有位於3'末端之核苷酸，且5'端係鈍端。儘管不欲受縛於理論，但位於反義股5'末端之不對稱鈍端以及反義股之3'末端有助於將導引股加載至RISC製程中。
於一個態樣中，該RNAi劑係19個核苷酸長度之雙鈍端者，其中有義股係含有至少一個位於從5'末端計數第7、8、9位置之三個接續核苷酸之三個2'-F修飾的模體。反義股係含有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於另一態樣中，該RNAi劑係20個核苷酸長度之雙鈍端者，其中有義股含有至少一個位於從5'末端計數第8、9、10位置之三個接續核苷酸之三 個2'-F修飾的模體。反義股係含有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於又一態樣中，該RNAi劑係21個核苷酸長度之雙鈍端者，其中有義股係含有至少一個位於從5'末端計數第9、10、11位置之三個接續核苷酸之三個2'-F修飾的模體。反義股係含有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
一個態樣中，該RNAi劑係包含21個核苷酸之有義股及23個核苷酸之反義股，其中該有義股係含有至少一個位於從5'末端計數第9、10、11位置之三個接續核苷酸之三個2'-F修飾的模體；該反義股係含有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體，其中該RNAi劑之一端係鈍端而另一端係包含具有2個核苷酸之。較佳地，該具有2個核苷酸之位於反義股之3'末端。當該2個核苷酸之位於反義股之3'末端時，在末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鍵聯，其中該三個核苷酸中之兩者為該核苷酸，且第三個核苷酸與緊鄰該核苷酸之下一個核苷酸配對。於一個態樣中，該RNAi劑在有義股之5'末端及反義股之5'末端兩處額外具有位於末端三個核苷酸之間的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯。於一個態樣中，該RNAi劑之有義股及反義股之每一個核苷酸，包括作為該等模體之一部分的核苷酸，皆係經修飾之核苷酸。於一個態樣中，每一殘基係獨立經2'-O-甲基或3'-氟以例如交替模體方式修飾。視需要，該RNAi劑復包含配體(例如，親脂性配體，視需要C16配體)。
於一個態樣中，該RNAi劑係包含有義股及反義股，其中該有義股係25至30個核苷酸殘基之長度，其中第一股之從5'端核苷酸(位置1)開始計 數之位置1至23係包含至少8個核糖核苷酸；該反義股係36至66個核苷酸殘基之長度，且從3'端核苷酸開始計數，係在與有義股之位置1至23配對以形成雙鏈體之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中至少反義股之3'端核苷酸係未與有義股配對，且至多6個接續之3'端核苷酸係未與有義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3'單股；其中反義股之5'端係包含10至30個為與有義股配對之接續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5'；其中，當將該有義股與反義股對準以進行最大互補時，至少該有義股之5'端核苷酸及3'端核苷酸係與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在該有義股與反義股之間形成實質上雙鏈體之區域；以及，反義股係在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與靶標RNA充分互補，以在當將該雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低靶標基因之表現；以及，其中該有義股係含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個2'-F修飾的模體，其中該等模體之至少一者係出現在裂解位點或鄰近該裂解位點處。反義股含有至少一個位於裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾的模體。
於一個態樣中，該RNAi劑包含有義股及反義股，其中該RNAi劑包含具有至少25個且至多29個核苷酸之長度的第一股，以及具有至多30個核苷酸之長度且具有至少一個位於從5'末端計數第11、12、13位置之三個接續核苷酸之三個2'-O-甲基修飾之模體的第二股；其中該第一股之3'末端及該第二股之5'末端係形成鈍端，且該第二股係於其3'末端比該第一股長1至4個核苷酸，其中該雙鏈體區域之長度係至少25個核苷酸，且該第二股係在沿著該第二股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將該RNAi劑引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現，以及，其中該RNAi劑之切丁酶裂解優先 得到包含該第二股之3'末端的siRNA，從而降低該哺乳動物體內之標靶基因的表現。視需要，該RNAi劑復包含配體。
於一個態樣中，該RNAi劑之有義股含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中該等模體之一者係出現在有義股之裂解位點處。
於一個態樣中，該RNAi劑之反義股亦可含有至少一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，其中該等模體之一者係出現在反義股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。
對於具有17至23個核苷酸之長度之雙鏈體區域的RNAi劑，該反義股之裂解位點典型係位於從5'末端計數之位置10、11、12附近。因此，該等三個一致修飾之模體可出現在反義股之位置9、10、11，位置10、11、12，位置11、12、13，位置12、13、14，或位置13、14、15，從該反義股之5'末端的第一個核苷酸開始計數，或在該雙鏈體區域內從該反義股之5'末端的第一個配對核苷酸開始計數。該反義股之裂解位點亦可根據該RNAi之雙鏈體區域從5'末端計數的長度而改變。
該RNAi劑之有義股可含有至少一個位於該股之裂解位點處之三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體；且該反義股可具有至少一個位於該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處之三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體。當有義股及反義股形成dsRNA雙鏈體時，該有義股及該反義股可經對準，使得位於該有義股之一個三核苷酸模體與位於該反義股之一個三核苷酸模體具有至少一個核苷酸重疊，亦即，該有義股模體之三個核苷酸之至少一者與該反義股模體之 三個核苷酸之至少一者鹼基配對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或全部三個核苷酸可重疊。
於一個態樣中，RNAi劑之有義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體。第一模體可出現在或鄰近該股之裂解位點處，且其他模體可係側翼修飾。本文中，術語「側翼修飾」指代出現在該股之另一部位的與在或鄰近同一股之裂解位點處之模體分隔開來的模體。側翼修飾或與第一模體相鄰或藉由至少一個或多個核苷酸與第一模體分隔開來。當該等模體彼此緊鄰時，則該等模體之化學性彼此不同；而當該等模體藉由一個或多個核苷酸分隔開來時，該等化學性可係相同或相異。可存在兩個或多個側翼修飾。例如，當存在兩個側翼修飾時，每一側翼修飾可出現在或鄰近裂解位點處之第一模體的一段，或出現在該前導模體之任一側。
與有義股相似，該RNAi劑之反義股可含有超過一個位於三個接續核苷酸之三個一致修飾的模體，且該等模體之至少一者出現在該股之裂解位點或鄰近該裂解位點處。該反義股亦可含有一個或多個側翼修飾，該側翼修飾之排列類似於可能存在於該有義股之側翼修飾。
於一個態樣中，該RNAi劑之有義股或反義股之側翼修飾典型係不包括位於該股之3'末端、5'末端或兩端之最開始的一個或兩個末端核苷酸。
於另一態樣中，該RNAi劑之有義股或反義股之側翼修飾典型係不包括位於該雙鏈體區域內該股之3'末端、5'末端或兩端之最開始的一個或兩個配對核苷酸。
當該RNAi劑之有義股及反義股各自含有至少一個側翼修飾時，該側翼修飾可落入該雙鏈體區域之相同末端上，且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
當該RNAi劑之有義股及反義股各自含有至少兩個側翼修飾時，該有義股與該反義股可經對準而使得來自一股之兩個修飾之各者落入該雙鏈體區域之一端上且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；來自一股之兩個修飾之各者落入該雙鏈體區域之另一端上且具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊；一股之兩個修飾分別落入該前導模體之兩端上且在該雙鏈體區域內具有一個、兩個或三個核苷酸之重疊。
於一個態樣中，該RNAi劑包含與標靶之誤配、雙鏈體中之誤配、或其組合。該誤配可出現在區域內或雙鏈體區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之締合或解離之自由能，自由能係基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C(I=肌苷)優於G：C。誤配，例如，非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)，優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於一個態樣中，該RNAi劑係包含，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者係選自下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及誤配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙鏈體之5'末端的解離。
於一個態樣中，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數之第1個位置的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT所組成之群組。或者，位於該 雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者為AU鹼基對。例如，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數之第一個鹼基對為AU鹼基對。
於另一態樣中，位於該有義股之3'末端的核苷酸為去氧胸腺嘧啶(dT)。於另一態樣中，位於該反義股之3'末端的核苷酸為去氧胸腺嘧啶(dT)。於一個態樣中，在該有義股或反義股之3'末端上存在去氧胸腺嘧啶核苷酸之短序列，舉例而言，兩個dT核苷酸。
於一個態樣中，該有義股序列可藉由式(I)表示：
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i及j各自獨立地為0或1；
p及q各自獨立地為0至6；
各Na獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np與nq獨立地表示核苷酸；
其中，Nb及Y不具有相同之修飾；以及
XXX、YYY及ZZZ各自獨立地表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。視需要，YYY全部為2'-F修飾之核苷酸。
於一個態樣中，Na'或Nb'包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，該YYY模體出現於該有義股之裂解位。舉例而言，當該RNAi劑具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，該YYY模體 出現於該有義股之裂解位或其左近(例如，可出現於位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13)，從5'末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5'末端之雙鏈體區域內第1個配對核苷酸開始計數。
於一個態樣中，i為1且j為0，或i為0且j為1，或i及j兩者皆為1。該有義股可因此藉由下列式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當該有義股由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
各Na可獨立第表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該有義股由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該有義股由式(Id)表示時，Nb各自獨立表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。視需要，Nb為0、1、2、3、4、5或6。各Na可獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z各自可係彼此相同或相異。
於其他態樣中，i為0且j為0，且該有義股可藉由下式表示：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當該有義股由式(Ia)表示時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
於一個態樣中，該RNAi之反有義股序列可由式(II)表示：
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
其中：
k及l各自獨立地為0或1；
p'及q'各自獨立地為0至6；
各Na'獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb'獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列；
各np'與nq'獨立地表示核苷酸；
其中Nb'及Y'不具有相同之修飾；
以及
X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'係各自獨立表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一個態樣中，Na'或Nb'包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，該Y'Y'Y'模體出現在或鄰近反義股之裂解位點處。例如，當該RNAi劑係具有長度為17至23個核苷酸之雙鏈體區域時，該Y'Y'Y'模體係出現於該反義股之位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15，從5'末端之第1個核苷酸開始計數；或視需要，從5'末端之雙鏈體區域內第一個配對核苷酸開始計數。視需要，該Y'Y'Y'模體出現於位置11、12、13。
於一個態樣中，Y'Y'Y'模體係全部為2'-OMe修飾之核苷酸。
於一個態樣中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l兩者皆為1。
該反義股可因此由下列式表示：
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb)；
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc)；或
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3' (IId)。
當該反義股由式(IIb)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該反義股經表示為式(IIc)時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該反義股經表示為式(IId)時，Nb'各自獨立表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na'獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。視需要，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
於其他態樣中，k為0且l為0，且該反義股可由下式表示：
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia)。
當該反義股經表示為式(Ia)時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'各自可係彼此相同或相異。
該有義股及反義股之每一核苷酸係獨立地經LNA、HNA、CeNA、2'-己氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟修飾。例如，該有義股及反義股之每一核苷酸係獨立地經2'-O-甲基或2'-氟修飾。特別地，X、Y、Z、X'、Y'及Z'可各自表示2'-O-甲基修飾或2'-F修飾。
於一個態樣中，當雙鏈體區域係21 nt時，該RNAi劑之有義股可含有出現在該股之9、10及11位置之YYY組元，從5'末端之第一個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5'末端之第一個配對核苷酸開始計數；以及，Y係表示2'-F修飾。該有義股可額外含有XXX模體或ZZZ模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，XXX與ZZZ各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
於一個態樣中，反義股可含有出現在該股之11、12及13位置之Y'Y'Y'模體，從5'末端之第1個核苷酸開始計數，或視需要，在雙鏈體區域內從5'末端之第1個配對核苷酸開始計數；以及，Y'表示2'-O-甲基修飾。該反義股可額外含有X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體作為位於雙鏈體區域之相反末端的側翼修飾；以及，X'X'X'與Z'Z'Z'各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一者表示之有義股係分別與由式(IIa)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一者表示之反義股形成雙鏈體。
據此，用於本發明之方法中的RNAi劑可包含有義股及反義股，各股具有14至30個核苷酸，該RNAi雙鏈體由式(III)表示：
有義：5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5'(III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p'、q及q'各自獨立地為0至6；
各Na及Na '獨立地表示包含0至25個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列，各序列包含至少兩個經不同修飾之核苷酸；
各Nb及Nb'獨立地表示包含0至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
其中
各np、nq及nq'可存在或不存在，且各自獨立地表示核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立第表示一個位於三個接續核苷酸之三個相同修飾的模體。
於一個態樣中，i為0且j為0；或i為1且j為0；或i為0且j為1；或i及j兩者皆為0；或i及j兩者皆為1。於另一態樣中，k為0且l為0；或k為1且l為0；或k為0且l為1；或k及l兩者皆為0；或k及l兩者皆為1。
形成RNAi雙鏈體之有義股與反義股之示例性組合包括下述各式：
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' 3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na 'nq ' 5'(IIIa)
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5'(IIIb)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' 3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5'(IIIc)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na-nq ' 5'(IIId)
當該RNAi劑由式(IIIa)表示時，各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2-10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該RNAi劑由式(IIIb)表示時，各Nb獨立地表示包含1至10、1至7、1至5或1-4個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該RNAi劑經表示為式(IIIc)時，各Nb、Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。
當該RNAi劑經表示為式(IIId)時，各Nb、Nb'獨立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。各Na、Na '獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個經修飾之核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb及Nb '中之各者獨立地包含交替模式之修飾。
於一個態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。於其他態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，且np'>0，以及，至少一個np'係經由硫代磷酸酯鍵聯連接至相鄰核苷酸。於另一態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鍵聯連接至相鄰核苷酸，以及，該有義股係透過二價或三價分支鏈之連接子(下文揭示)接合至一個或多個C16(或相關)部分。於另一態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結連接至相鄰核苷酸，該有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，該有義股係視需要透過連接子接合至一個多個親脂性例如C16(或相關)部分。
於一個態樣中，當該RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾為2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾，np'>0，且至少一個np'係經由硫代磷酸酯鏈結連接至相鄰核苷酸，該有義股包含至少一個硫代磷酸酯鏈結，以及，該有義股係透過連接子接合至一個多個親脂性例如C16(或相關)部分。
於一個態樣中，該RNAi劑為含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體係藉由鍵聯基連結。該連接子可係可裂解者或不可裂解者。視需要，該多聚物復包含配體。該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因或兩個相異基因；或該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個態樣中，該RNAi劑為含有3、4、5、6或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之雙鏈體的多聚物，其中該等雙鏈體係藉由鍵聯基連結。該連接子可係可裂解者或不可裂解者。視需要，該多聚物復包含配體。 該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因或兩個相異基因；或該等雙鏈體中之各者可靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
於一個態樣中，兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示之RNAi劑係在5'末端及一個或兩個3'末端彼此鍵聯，且視需要接合至配體。該等劑中之各者可靶向相同基因或兩個相異基因；或該等劑中之各者可靶向相同基因之兩個相異標靶位點。
多個出版物揭示可用於本揭露之方法中的多聚RNAi劑。此類出版物包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887、WO2011/031520及US 7858769，其各自之整體內容藉由引用併入本文。
於某些態樣中，本揭露之組成物及方法包括如本文所揭示之RNAi劑的5'-磷酸酯模擬物諸如乙烯基膦酸酯(VP)修飾。於示例性態樣中，本揭露的經乙烯基膦酸酯具有以下結構：
Figure 112112698-A0202-12-0098-4
本揭露之乙烯基膦酸酯可接附至本揭露之dsRNA的反義股或有義股。於某些較佳態樣中，本揭露之乙烯基膦酸酯係接附至dsRNA之反義股，視需要，在該dsRNA之反義股的5'末端接附。
於示例性態樣中，本揭露的經5'乙烯基膦酸酯修飾之核苷酸具有結構：
Figure 112112698-A0202-12-0099-5
其中X為O或S；
R為氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如，甲氧基或正十六烷氧基)；
R5'為=C(H)-P(O)(OH)2，且C5'碳與R5'之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)；以及
B為核鹼基或經修飾之核鹼基，視需要，其中B為腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
於一個態樣中，R5'為=C(H)-P(O)(OH)2，且該C5'碳與R5'之間的雙鍵為E取向。於另一態樣中，R為甲氧基，且R5'為=C(H)-P(O)(OH)2，且該C5'碳與R5'之間的雙鍵為E取向。於另一態樣中，X為S，R為甲氧基，且R5'為=C(H)-P(O)(OH)2，且該C5'碳與R5'之間的雙鍵為E取向。
乙烯基磷酸酯修飾亦預期用於本揭露之組成物及方法。示例性乙烯基磷酸酯結構為：
Figure 112112698-A0202-12-0099-6
其他示例性乙烯基磷酸酯結構包括在先結構，其中R5為=C(H)-OP(O)(OH)2，且C5'碳與R5'之間的雙鍵為E或Z取向(例如，E取向)。
於一些態樣中，5-磷酸酯模擬物係選自
Figure 112112698-A0202-12-0100-7
、
Figure 112112698-A0202-12-0100-8
或
Figure 112112698-A0202-12-0100-9
或其鹽(例如，鈉鹽)，其中斷裂之鍵為與5'-末端核苷酸之4'-碳的共價鍵。於一些態樣中，5'-末端核苷酸可係
Figure 112112698-A0202-12-0100-11
、
Figure 112112698-A0202-12-0100-12
、
Figure 112112698-A0202-12-0100-13
、
Figure 112112698-A0202-12-0100-14
或
Figure 112112698-A0202-12-0100-15
或其鹽(例如，鈉鹽)，其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基(例如，尿嘧啶或5-甲基尿嘧啶)。
B.熱去安定化修飾
於某些態樣中，dsRNA分子可藉由將熱去安定化修飾併入反義股之種子區域中而針對RNA進行優化(亦即，在反義股之5'末端之位置2至9處)以降低或抑制脫靶緘默化。已經發現，具有包含位於從反義股5'末端計數最先9個核苷酸內之雙鏈體之至少一個熱去安定化修飾之反義股的dsRNA，具有降低之脫靶基因緘默化活性。據此，於一些態樣中，反義股包含位於該反義股之5'區域之前9個核苷酸位置內的至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)雙鏈體熱去安定化修飾。於一些態樣中，一個或多個雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置2至9中，或視需要，位置4至8中。於又一些態樣中，雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置6、7或8處。於再又一些態樣中，雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置7處。術語「熱去安定化修飾」包括將會導致dsRNA具低於不具此類修飾之 dsRNA之總體熔融溫度(Tm)的有Tm(視需要，低一度、兩度、三度或四度)的修飾。於一些態樣中，雙鏈體熱去安定化修飾位於自該反義股之5'末端計數的位置2、3、4、5或9處。
熱去安定化修飾可包括但不限於無鹼基修飾；與相對股相對核苷酸之誤配；以及糖修飾諸如2'-去氧修飾或非環狀核苷酸例如未鎖定之核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)，及2'-5'-連接之核糖核苷酸(「3'-RNA」)。
示例性無鹼基修飾包括但不限於下列：
Figure 112112698-A0202-12-0101-16
其中R=H、Me、Et或OMe；R'=H、Me、Et或OMe；R”=H、Me、Et或OMe
Figure 112112698-A0202-12-0101-17
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基。
示例性糖修飾包括但不限於下列：
Figure 112112698-A0202-12-0102-18
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基。
於一些態樣中，該雙鏈體之熱去安定化修飾係選自由下列所組成之群組：
Figure 112112698-A0202-12-0102-19
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，且各結構上之星號表示R、S或外消旋。
於一些態樣中，該雙鏈體之熱去安定化修飾係選自由下列所組成之群組：
Figure 112112698-A0202-12-0103-20
其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，且星號表示R、S或外消旋(例如S)。
術語「非環狀核苷酸」指代任意具有非環狀核糖的核苷酸，舉例而言，其中核糖碳之間的任意鍵(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4')係不存在或核糖碳或氧中之至少一者(例如，C1'、C2'、C3'、C4'或O4')獨立地或組合地從該核苷酸中缺失。於一些態樣中，非環狀核苷酸為
Figure 112112698-A0202-12-0103-21
、
Figure 112112698-A0202-12-0103-22
、
Figure 112112698-A0202-12-0103-23
、
Figure 112112698-A0202-12-0103-24
或
Figure 112112698-A0202-12-0103-25
，其中B為經修飾或未經修飾之核鹼基，R1及R2獨立地為H、鹵素、OR3或烷基；且R3為H、烷基、環烷基、芳基、雜芳基或糖。術語「UNA」指代未鎖定之非環狀核酸，其中該糖之任意鍵業經移除，形成未鎖定之「糖」殘基。於一個實例中，UNA亦涵蓋其C1'-C4'鍵(亦即，位於C1'碳與C4'碳間之碳-氧-碳共價鍵)已移除之單體。於另一實例中，糖之C2'-C3'鍵(亦即，C2'碳與C3'碳之間的碳-碳共價鍵)經移除(參見，Mikhailov et.al.,Tetrahedron Letters,26(17)：2059(1985)及Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,10：1039(2009)，藉由引用以其整體併入本文)。非環狀衍生物提供更大 的主鏈撓性而不影響Watson-Crick配對。非環狀核苷酸可經由2'-5'或3'-5'鍵聯連接。
術語「GNA」指代二醇核酸，其為類似於DNA或RNA的聚合物但在其「主鏈」組成上有所差異，其主鏈由藉由磷酸二酯鍵連接的重複甘油單元構成：
Figure 112112698-A0202-12-0104-26
該雙鏈體之熱去安定化修飾可係該熱去安定化核苷酸與dsRNA雙鏈體內之相對股相對核苷酸之間的誤配(亦即，非互補鹼基對)。示例性誤配鹼基對包括G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、U：T、或其組合。本領域中已知的其他誤配鹼基配對亦依從本揭露。誤配可出現在作為天然存在之核苷酸或經修飾之核苷酸的核苷酸之間，亦即，誤配堿基配對可出現在來自獨立於核苷酸之糖上修飾的各自核苷酸的核鹼基之間。於某些態樣中，該dsRNA分子含有誤配配對的至少一個核鹼基，其為2'-去氧核鹼基，例如，有義股之2'-去氧核鹼基。
於一些態樣中，反義股之種子區域中雙鏈體之熱去安定化修飾包括具有受損的與標靶mRNA之互補鹼基之W-C H-鍵結的核苷酸，諸如：
Figure 112112698-A0202-12-0105-27
無鹼基核苷酸、非環狀核苷酸修飾(包括UNA及GNA)、及誤配修飾的更多實例業經揭示於WO 2011/133876中，其藉由引用以其整體併入本文。
熱去安定化修飾亦可包括通用鹼基，其具有降低或消除的與相對鹼基形成氫鍵的能力；以及磷酸酯修飾。
於一些態樣中，雙鏈體之熱去安定化修飾包括具有非規範鹼基的核苷酸，諸如但不限於，核鹼基修飾，其具有受損的或完全消除的與相對股之鹼基形成氫鍵的能力。業經針對dsRNA雙鏈體之中心區域的去安定化而評估此等核鹼基修飾，如WO 2010/0011895中所揭示，其藉由引用以其整體併入本文。示例性核鹼基修飾為：
Figure 112112698-A0202-12-0105-28
於一些態樣中，反義股之種子區域中雙鏈體的熱去安定化修飾包括與標靶mRNA上之鹼基互補的一個或多個α-核苷酸，諸如：
Figure 112112698-A0202-12-0106-29
其中R為H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
已知與天然磷酸二酯鍵聯相比減少dsRNA雙鏈體之熱安定性的示例性磷酸酯修飾為：
Figure 112112698-A0202-12-0106-30
用於R基團之烷基可係C1-C6烷基。用於R基團之特定烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基及己基。
如熟練技術人士將知悉者，核鹼基之功能性角色為定義本揭露之RNAi劑的特異性，核鹼基修飾可以如本文所揭示之各種方式進行，以例如將去安定化修飾引入本揭露之RNAi劑中二用於例如相對於脫靶效應增強上靶效應，就此而言，可用且通常存在於本揭露之RNAi劑的修飾更傾向於非核鹼基修飾，例如，對多核糖核苷酸之糖基團或磷酸酯主鏈之修飾。此類修飾更詳細地址揭示於本揭露之其他章節中並且明確地考慮用於本揭露之RNAi劑，其具備天然核鹼基或如上文或本文他處所揭示的經修飾之核鹼基。
該dsRNA除了包含具有熱去安定化修飾之反義股之外，亦可包含一個或多個安定化修飾。舉例而言，該dsRNA可包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)安定化修飾。不受 限制地，該等安定化修飾全部可存在於一股。於一些態樣中，有義及反義股兩者包含至少兩個安定化修飾。安定化修飾可出現在有義股或反義股之任意核苷酸。例如，該安定化修飾可出現在有義股或反義股之每一個核苷酸；各安定化修飾可以交替模式出現在有義股或反義股；或有義股或反義股包含交替模式之兩種安定化修飾。有義股之交替模式之安定化修飾可與反義股相同或相異，其有義股之交替模式之安定化修飾可具有相對於反義股之交替模式之安定化修飾的位移。
於一些態樣中，反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)安定化修飾。沒有限制，反義股之安定化修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，反義股包含在從5'末端起位置2、6、8、9、14及16的安定化修飾。於一些其他態樣中，反義股包含在從5'末端起位置2、6、14及16的安定化修飾。於又一些其他態樣中，反義股包含在從5'末端起位置2、14及16的安定化修飾。
於一些態樣中，反義股包含與去安定化修飾相鄰的至少一個安定化修飾。舉例而言，安定化修飾可係在去安定化修飾之5'末端或3'末端，亦即，在從去安定化修飾之位置起-1或+1之位置的核苷酸。於一些態樣中，反義股包含在去安定化修飾之5'末端及3'末端中之各者，亦即，在從去安定化修飾之位置起-1及+1之位置的安定化修飾。
於一些態樣中，反義股包含在去安定化修飾之3'末端，亦即，在從去安定化修飾之位置起+1及+2之位置的至少兩個安定化修飾。
於一些態樣中，有義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)安定化修飾。沒有限制，有義股之安定化修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，有義股包含在從5'末端起位置 7、10及1的安定化修飾。於一些其他態樣中，有義股包含在從5'末端起位置7、9、10及11處的安定化修飾。於一些態樣中，有義股包含在與從反義股之5'末端計數之位置11、12及15相對或互補之位置的安定化修飾。於一些其他態樣中，有義股包含在與從反義股之5'末端計數之位置11、12、13及15相對或互補之位置的安定化修飾。於一些態樣中，有義股包含具有兩個、三個或四個安定化修飾之模塊。
於一些態樣中，有義股不包含在與反義股雙鏈體之熱去安定化修飾相對或互補之位置的安定化修飾。
示例性熱去安定化修飾包括但不限於，2'-氟修飾。其他熱去安定化修飾包括但不限於LNA。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA包含至少四個(例如，四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)2'-氟核苷酸。不受限制地，該等2'-氟修飾全部可存在於一股。於一些態樣中，有義及反義股兩者包含至少兩個2'-氟修飾。2'-氟修飾可出現在有義股或反義股之任意核苷酸。例如，該2'-氟修飾可出現在有義股或反義股之每一個核苷酸；各2'-氟修飾可以交替模式出現在有義股或反義股；或有義股或反義股包含交替模式之兩種2'-氟修飾。有義股之交替模式之2'-氟修飾可與反義股相同或相異，其有義股之交替模式之2'-氟修飾可具有相對於反義股之交替模式之2'-氟修飾的位移。
於一些態樣中，反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)2'-氟核苷酸。沒有限制，反義股之2'-氟修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，反義股包含在從5'末端起位置2、6、8、9、14及16的2'-氟核苷酸。於一些其他態樣中，反義股包含在從5'末 端起位置2、6、14及1的2'-氟核苷酸。於又一些其他態樣中，反義股包含在從5'末端起位置2、14及16的2'-氟核苷酸。
於一些態樣中，反義股包含與去安定化修飾相鄰的至少一個2'-氟核苷酸。舉例而言，該2'-氟核苷酸可係在去安定化修飾之5'末端或3'末端，亦即，在從去安定化修飾之位置起-1或+1之位置的核苷酸。於一些態樣中，反義股包含在去安定化修飾之5'末端及3'末端之各者，亦即，在從去安定化修飾之位置起-1及+1之位置的2'-氟核苷酸。
於一些態樣中，反義股包含在去安定化修飾之3'末端，亦即，在從去安定化修飾之位置起+1及+2之位置的至少兩個2'-氟核苷酸。
於一些態樣中，有義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多)2'-氟核苷酸。沒有限制，有義股之2'-氟修飾可存在於任意位置。於一些態樣中，反義股包含在從5'末端起位置7、10及11的2'-氟核苷酸。於一些其他態樣中，有義股包含在從5'末端起位置2、9、10及11的7'-氟核苷酸。於一些態樣中，有義股包含在與從反義股之5'末端計數之位置11、12及15相對或互補之位置的2'-氟核苷酸。於一些其他態樣中，有義股包含在與從反義股之5'末端計數之位置11、12、13及15相對或互補之位置的2'-氟核苷酸。於一些態樣中，有義股包含具有兩個、三個或四個2'-氟核苷酸之模塊。
於一些態樣中，有義股不包含在與反義股雙鏈體之熱去安定化修飾相對或互補之位置的2'-氟核苷酸。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含21個核苷酸(nt)之有義股及23個核苷酸(nt)之反義股，其中反義股含有至少一個熱去安定化核苷酸，其 中該至少一個熱去安定化核苷酸出現在反義股之種子區域中(亦即，在反義股之5'末端的位置2至9)，其中該dsRNA之一個末端為鈍端，而另一末端包含2 nt突出，並且其中該dsRNA視需要復具有下列特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(iii)有義股係與配體接合；(iv)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)有義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；及(vii)dsRNA包含在反義股之5'末端的鈍端。視需要，該2nt突出係位於反義股之3'末端。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA包含有義股及反義股，其中該有義股係25至30個核苷酸殘基之長度，其中有義股之從5'端核苷酸(位置1)開始計數之位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；該反義股係36至66個核苷酸殘基之長度，且從3'端核苷酸開始計數，在與有義股之位置1至23配對以形成雙鏈體之位置中包含至少8個核糖核苷酸；其中至少反義股之3'端核苷酸係未與有義股配對，且至多6個接續之3'端核苷酸係未與有義股配對，從而形成具有1至6個核苷酸之3'單股突出；其中反義股之5'端係包含10至30個為與有義股配對之接續核苷酸，從而形成具有10至30個核苷酸之單股5'突出；其中，當將該有義股與反義股對準以進行最大互補時，至少該有義股之5'端核苷酸及3'端核苷酸係與反義股之核苷酸進行鹼基配對，從而在該有義股與反義股之間形成實質上雙鏈體之區域；以及，反義股係在沿著反義股長度之至少19個核苷酸與標靶RNA充分互補，以在當將該雙股核酸引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因之表現；以及，其中該反義股含有至少一個熱去安定化核苷酸，其中至少一個熱去安 定化核苷酸係在反義股之種子區域中(亦即，在反義股之5'末端的位置2至9處)。舉例而言，熱去安定化核苷酸出現在與有義股之5'末端之位置14至17相對或互補的位置之間，並且其中該dsRNA視需要復具有下列特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(iii)有義股係與配體接合；(iv)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)有義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；及(vii)dsRNA包含長度為12至30個核苷酸對的雙鏈體區域。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含有義股及反義股，其中該dsRNA分子包含長度為至少25且至多29個核苷酸之有義股及長度為至多30個核苷酸之反義股，且該有義股包含在從5'末端起位置11的易進行酶降解的經修飾之核苷酸，其中該有義股之3'末端及該反義股之5'末端形成鈍端且該反義股在其3'末端比有義股長1至4個核苷酸，其中雙鏈體區域為至少25個核苷酸之長度，且該反義股沿著該反義股長度之至少19 nt與標靶mRNA足夠互補以在該dsRNA分子被引入哺乳動物細胞內時降低標靶基因表現，並且其中該dsRNA之切丁酶裂解優先導致包含該反義股之3'末端的siRNA，從而降低該哺乳動物體內標靶基因之表現，其中該反義股含有至少一個熱去安定化核苷酸，其中該至少一個熱去安定化核苷酸係在反義股之種子區域中(亦即，在反義股之5'末端的位置2至9)，並且其中該dsRNA視需要復具有下列特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(iii)有義股係與配體接合；(iv)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)有義股 包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；及(vii)dsRNA具有長度為12至29個核苷酸對的雙鏈體區域。
於一些態樣中，該dsRNA分子之有義股及反義股之每一個核苷酸可經修飾。各苷酸可藉由相同或相異之修飾而經修飾，該等修飾可包括非鍵聯性磷酸酯氧之一者或兩者或鍵聯性磷酸酯氧之一者或多者的一個或多個變更；核糖之構建的變更，例如，核糖之2'-羥基之變更；以「去磷」連接子進行之磷酸酯部分的整體置換；天然出現之鹼基的修飾或置換；以及核糖-磷酸酯主鏈的置換或修飾。
由於核酸為子單元之聚合物，該等修飾之多數出現在核酸內重複之位置，例如，鹼基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分之非鍵聯性O的修飾。於一些情形中，該修飾將出現在該核酸之所有受試位置，但在多數情形中並非如此。舉例而言，修飾可僅出現在3'或5'終端位置，可僅出現在末端區域，例如，出現在末端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內。修飾可出現在雙股區域內、單股區域內、或兩者內。修飾可僅出現在RNA之雙股區域內，或僅出現在RNA之單股區域內。例如，位於非鍵聯性O位置之硫代磷酸酯修飾可僅出現在一終端或兩終端；可僅出現在終端區域，例如出現在終端核苷酸之位置或出現在一股之最末2、3、4、5或10個核苷酸內；或可出現在雙股區域及單股區域內，尤其是在末端。一個或多個5'末端可經磷酸化。
下述者係可能者，例如，增強安定性，在突出中包括特定鹼基，或在單股突出例如5'突出或3'突出或兩者中包括經修飾之核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能所欲者係在突出中包括嘌呤核苷酸。於一些態樣中，3'或5'突出中之全部或一些鹼基可經修飾，例如，具有本文所述之修飾。修飾可包括，例如， 使用在核糖之2'位置具有該領域中已知之修飾者，例如使用去氧核糖核苷酸，使用2'-去氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修飾者替代核鹼基之核糖，以及使用磷酸酯基團中之修飾例如硫代磷酸酯修飾。突出無需與標靶序列同源。
於一些態樣中，該有義股及反義股之每一殘基獨立地經LNA、HNA、CeNA、2'-己氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧或2'-氟修飾。該股可含有超過一個修飾。於一些態樣中，該有義股及反義股之每一殘基獨立地經2'-O-甲基或2'-氟修飾。應理解，此等修飾係除了存在於反義股之雙鏈體之至少一個熱去安定化修飾以外的。
至少兩個相異之修飾典型地存在於該有義股及反義股。彼等兩個修飾可係2'-去氧、2'-O-甲基或2'-氟修飾、非環狀核苷酸等。於一些態樣中，該有義股及反義股給子包含選自2'-O-甲基或2'-去氧的兩個經不同修飾的核苷酸。於一些態樣中，有義股及反義股之各殘基獨立地經2'-O-甲基核苷酸、2'-去氧核苷酸、2′-去氧-2'-氟核苷酸、2'-O-N-甲基乙醯胺基(2'-O-NMA)核苷酸、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)核苷酸、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)核苷酸或2'-ara-F核苷酸修飾。再一次，應理解，此等修飾係除了存在於反義股之雙鏈體之至少一個熱去安定化修飾以外的。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含交替模式的修飾，特別是在B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'、B4'區域中。如本文中所用，術語「交替模體」或「交替模式」指代具有一個或多個修飾之模體，各修飾出現在一股之交替核苷酸。交替核苷酸可指代每兩個核苷酸一個或每三個核苷酸一個或類似模式。例如，如果A、B及C各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體可係「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、 「AAABAAABAAAB…」、「AAABBBAAABBB…」或「ABCABCABCABC…」等。
交替模體中含有之修飾的類型可係相同或相異。例如，如果A、B、C、D各自表示一種類型之對核苷酸之修飾，則交替模體亦即每兩個核苷酸之修飾可係相同，但有義股或反義股可各自選自交替模體諸如「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」或「CDCDCD…」等中修飾之若干可能性。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含，該有義股之交替模體的修飾模式相對於該反義股之交替模體的修飾模式位移。該位移可使得有義股之核苷酸的修飾基團係與反義股之核苷酸的不同修飾基團相對應，反之亦然。例如，當有義股與反義股在dsRNA雙鏈體中鹼基配對時，在該雙鏈體區域內，該有義股之交替模體可始於該股之5'-3'之「ABABAB」，且該反義股之交替模體可始於該股之3'-5'之「BABABA」。作為另一實例，在該雙鏈體區域內，有義股之交替模體可始於該股之5'-3'之「AABBAABB」，且該反義股之交替模體可始於該股之3'-5'之「BBAABBAA」，因此該有義股與反義股之間存在修飾模式之完全或部分位移。
於一個特定實例中，有義股之交替模體為從該股之5'-3'的「ABABAB」，其中各A為未經修飾之核糖核苷酸且各B為2'-O-甲基修飾之核苷酸。
於一個特定實例中，有義股之交替模體為從該股之5'-3'的「ABABAB」，其中各A為2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸且各B為2'-O-甲基修飾之核苷酸。
於另一特定實例中，反義股之交替模體為從該股之3'-5'的「BABABA」，其中各A為2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸且各B為2'-O-甲基修飾之核苷酸。
於一個特定實例中，有義股之交替模體為從該股之5'-3'的「ABABAB」且反義股之交替模體為從該股之3'-5'的「BABABA」，其中各A為未經修飾之核糖核苷酸且各B為2'-O-甲基修飾之核苷酸。
於一個特定實例中，有義股之交替模體為從該股之5'-3'的「ABABAB」且反義股之交替模體為從該股之3'-5'的「BABABA」，其中各A為2'-去氧-2'-氟修飾之核苷酸且各B為2'-O-甲基修飾之核苷酸。
本揭露之dsRNA分子可復包含至少一個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯。該硫代磷酸酯或甲基膦酯類核苷酸間鍵聯修飾可出現在有義股或反義股或兩者之位於該股任意位置之任意核苷酸。例如，該核苷酸間鍵聯修飾可出現在有義股或反義股之每一個核苷酸；各核苷酸間鍵聯修飾可以交替模式出現在有義股或反義股；或有義股或反義股包含交替模式之兩種或更多種核苷酸間鍵聯修飾。有義股之交替模式之核苷酸間鍵聯修飾可與反義股相同或相異，其有義股之交替模式之核苷酸間鍵聯修飾可具有相對於反義股之交替模式之核苷酸間鍵聯修飾的位移。
於一些態樣中，該dsRNA分子包含位於突出區域內之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾。例如，該突出區域包含兩個核苷酸且在該兩個核苷酸間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯。核苷酸間鍵聯修飾亦可作成以將該突出核苷酸與雙鏈體區域內之末端配對核苷酸鍵聯。例如，至少2、3、4或全部突出核苷酸可透過硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯而 鍵聯，且視需要，可存在將突出核苷酸與作為該突出核苷酸之下一個成對核苷酸鍵聯的額外之硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯。例如，在末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代硫酸酯類核苷酸間鍵聯，其中該三個核苷酸中之兩者係突出核苷酸，且第三個核苷酸係緊鄰該突出核苷酸之下一個配對核苷酸。視需要地，此等終端三個核苷酸係位於反義股之3'末端。
於一些態樣中，該dsRNA分子之有義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的1至10個模塊的兩個至十個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該有義股係與反義股配對，該反義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的兩個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的三個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷 酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的四個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的六個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義 股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5、6、7或8個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的七個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3、4、5或6個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的八個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，該dsRNA分子之反義股包含藉由1、2、3或4個磷酸酯類核苷酸間鍵聯分隔的兩個模塊的九個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸類鍵聯，其中該等硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯中之一者係位於寡核苷酸序列中的任意位置，且該反義股係與有義股配對，該有義股包含硫代磷酸酯類、甲基膦酸酯類及膦酸酯類核苷酸間鍵聯的任意組合或包含硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類或磷酸酯類鍵聯。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義或反義股之終端位置1至10內的一個或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修 飾。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可透過位於有義或反義股之一個末端或兩個末端的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯來連接。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義或反義股之各者之雙鏈體之內部區域的位置1至10內的一個或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可透過在有義股從5'末端計數之雙鏈體區域位置8至16的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯來連接；該dsRNA分子可視需要復包含在1至10個末端位置內的一個或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的一個至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的一個至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個至五個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類或甲基磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2處的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類或甲基膦酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含位於反義股之5'末端的第1個與第2個核苷酸之間及第2個與第3個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含位於反義股之3'末端的 第1個與第2個核苷酸之間及第2個與第3個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含位於反義股之5'末端及3'末端兩者的第1個與第2個核苷酸之間及第2個與第3個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含位於反義股之3'末端的第1個與第2個核苷酸之間及第2個與第5個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含位於有義股之5'末端的第1個與第2個核苷酸之間及第2個與第3個核苷酸之間以及位於反義股之5'末端及3'末端兩者處的第1個與第2個核苷酸之間及第2個與第3個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含位於反義股之5'端的第1個與第2個核苷酸之間、位於第2個與第3個核苷酸之間以及位於第3個與第4個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾，位於反義股之3'端的第1個與第2個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾，以及位於有義股之5'端及3'端的第1個與第2個核苷酸之間的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯修飾。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位 置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1至5內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1及2處的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置20及21的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置20及21的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1及的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21及22處的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21及22的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置1及的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置22及23處的兩個硫代磷酸酯 類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)，以及在反義股之位置1的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子復包含在有義股之位置的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置21的一個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端)，以及在反義股之位置1及2的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾及在位置23及23處的兩個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯修飾(從5'末端計數)。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含主鏈手性中心模式。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少5個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少6個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少7個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少8個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少9個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少10個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少11個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少12個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少13個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少14個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少15個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少16個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少17 個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少18個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少19個Sp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過8個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過7個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過6個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過5個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過4個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過3個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過2個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過1個Rp組態之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過8個非手性之核苷酸間鍵聯(作為非限制性實例，磷酸二酯)。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過7個非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過6個非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過5個非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過4個非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過3個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過2個非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含不超過1個非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少10個Sp組態之核苷酸間鍵聯及不超過8個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少11個Sp組態之核 苷酸間鍵聯及不超過7個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少12個Sp組態之核苷酸間鍵聯及不超過6個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少13個Sp組態之核苷酸間鍵聯及不超過6個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少14個Sp組態之核苷酸間鍵聯及不超過5個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，主鏈手性中心之共有模式包含至少15個Sp組態之核苷酸間鍵聯及不超過4個並非手性之核苷酸間鍵聯。於一些態樣中，Sp組態之核苷酸間鍵聯係視需要為接續的或非接續的。於一些態樣中，Rp組態之核苷酸間鍵聯係視需要為接續的或非接續的。於一些態樣中，非手性之核苷酸間鍵聯係視需要為接續的或非接續的。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含作為立體化學模塊的模塊。於一些態樣中，模塊為Rp模塊，其中該模塊中之各核苷酸間鍵聯為Rp。於一些態樣中，5'-模塊為Rp模塊。於一些態樣中，3'-模塊為Rp模塊。於一些態樣中，模塊為Sp模塊，其中該模塊中之各核苷酸間鍵聯為Sp。於一些態樣中，5'-模塊為Sp模塊。於一些態樣中，3'-模塊為Sp模塊。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含Rp模塊及Sp模塊兩者。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含一個或多個Rp模塊但沒有Sp模塊。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含一個或多個Sp模塊但沒有Rp模塊。於一些態樣中，所提供之寡核苷酸包含一個或多個PO模塊，其中各核苷酸間鍵聯為天然磷酸酯鍵聯。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含為Sp模塊的5'模塊，其中各糖部分包含2'-F修飾。於一些態樣中，5'-模塊為Sp模塊，其中核苷酸間鍵聯中之各者為經修飾之核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-氟修飾。於一些態樣中，5'- 模塊為Sp模塊，其中核苷酸間鍵聯中之各者為硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-氟修飾。於一些態樣中，5'模塊包含4個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，5'模塊包含5個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，5'模塊包含6個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，5'模塊包含7個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3'模塊為Sp模塊，其中各糖部分包含2'-F修飾。於一些態樣中，3'-模塊為Sp模塊，其中核苷酸間鍵聯中之各者為經修飾之核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-氟修飾。於一些態樣中，3'-模塊為Sp模塊，其中核苷酸間鍵聯中之各者為硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯且各糖部分包含2'-氟修飾。於一些態樣中，3'模塊包含4個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3'模塊包含5個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3'模塊包含6個或更多個核苷酸單元。於一些態樣中，3'模塊包含7個或更多個核苷酸單元。
於一些態樣中，本揭露之化合物包含在區域中的一種那類型的核苷，或寡核苷酸之後為特定類型的核苷酸鍵聯，例如，天然磷酸酯類鍵聯、經修飾之核苷酸間鍵聯、Rp手性核苷酸間鍵聯、Sp手性核苷酸間鍵聯等。於一些態樣中，A之後為Sp。於一些態樣中，A之後為Rp。於一些態樣中，A之後為天然磷酸酯類鍵聯(PO)。於一些態樣中，U之後為Sp。於一些態樣中，U之後為Rp。於一些態樣中，U之後為天然磷酸酯類鍵聯(PO)。於一些態樣中，C之後為Sp。於一些態樣中，C之後為Rp。於一些態樣中，C之後為天然磷酸酯類鍵聯(PO)。於一些態樣中，G之後為Sp。於一些態樣中，G之後為Rp。於一些態樣中，G之後為天然磷酸酯類鍵聯(PO)。於一些態樣中，C及U之後為Sp。於一些態樣中，C及U之後為Rp。於一些態樣中，C及U之後為天然磷酸酯類鍵聯(PO)。於一些態樣中，A及G之後為Sp。於一些態樣中，A及G之後為Rp。
於一些態樣中，反義股包含在核苷酸位置21與22之間及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯，其中該反義股含有位於反義股之種子區域(例如，反義股之5'末端的位置2至9)中的至少一個熱去安定化修飾，並且其中該dsRNA視需要復具有以下特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義股包含3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(iii)有義股係與配體接合；(iv)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)有義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA包含12至40個核苷酸對之長度的雙鏈體區域；及(viii)dsRNA具有在反義股之5'末端的鈍端。
於一些態樣中，反義股包含在核苷酸位置1與2之間、在核苷酸位置2與3之間、在核苷酸位置21與22之間及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯，其中該反義股含有位於反義股之種子區域(例如，反義股之5'末端的位置2至9)中的至少一個熱去安定化修飾，並且其中該dsRNA視需要復具有以下特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)有義股係與配體及/或親脂性部分接合；(iii)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(iv)有義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(v)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vi)dsRNA包含12至40個核苷酸對之長度的雙鏈體區域；(vii)dsRNA包含12至40個核苷酸對之長度的雙鏈體區域；及(viii)dsRNA具有在反義股之5'末端的鈍端。
於一些態樣中，有義股包含在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯，其中該反義股含有位於反義股之種子區域(例如，反義股之5'末端的位置2至9)中的至少一個熱去安定化修飾，並且其中該dsRNA視需要復具有以下特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(iii)有義股係與配體及/或親脂性部分接合；(iv)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)有義股包含3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA包含12至40個核苷酸對之長度的雙鏈體區域；及(viii)dsRNA具有在反義股之5'末端的鈍端。
於一些態樣中，有義股包含在核苷酸位置1與2之間及在核苷酸位置2與3之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯，反義股包含在核苷酸位置1與2之間、在核苷酸位置2與3之間、在核苷酸位置21與22之間及在核苷酸位置22與23之間的硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯，其中該反義股含有位於反義股之種子區域(例如，反義股之5'末端的位置2至9)中的至少一個熱去安定化修飾，並且其中該dsRNA視需要復具有以下特徵中之至少一者(例如，一者、兩者、三者、四者、五者、六者或全部七者)：(i)反義股包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)有義股係與配體及/或親脂性部分接合；(iii)有義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(iv)有義股包含3、4或5個硫代磷酸酯類核苷酸間鍵聯；(v)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vi)dsRNA包含12至40個核苷酸對之長度的雙鏈體區域；及(vii)dsRNA具有在反義股之5'末端的鈍端。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含與標靶之誤配、雙鏈體中之誤配、或其組合。該誤配可出現在區域內或雙鏈體區域內。基於鹼基對促進解離或熔融之傾向性(例如，基於特定配對之締合或解離之自由能，自由能係基於個體配對檢查配對的最簡單之途徑，但亦可使用次近鄰分析及類似分析)，可將鹼基對排名。就促進解離而言：A：U優於G：C；G：U優於G：C；且I：C優於G：C(I為肌苷)。誤配，例如，非規範配對或除規範配對之外者(如本文中他處所揭示)，優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；且包括萬用鹼基之配對優於規範配對。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子包含，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數最前列之第1、2、3、4或5個鹼基對的至少一者可獨立地選自由下列所組成之群組：A：U、G：U、I：C、以及誤配例如非規範配對或除規範配對之外者或包括萬用鹼基之配對，以促進反義股於該雙鏈體之5'末端的解離。
於一些態樣中，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數之第1個位置的核苷酸係選自由A、dA、dU、U及dT所組成之群組。或者，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數最前列之第1、2或3個鹼基對的至少一者為AU鹼基對。例如，位於該雙鏈體區域內之反義股從5'末端計數之第一個鹼基對為AU鹼基對。
已發現，將4'-修飾或5'-修飾之核苷酸引入單股或雙股寡核苷酸之任意位置的二核苷酸之磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)鍵聯的3'-末端可發揮對於該核苷酸間鍵聯之立體效應，並因此保護或安定其不受核酸酶影響。
於一些態樣中，5'-修飾之核苷係經引入單股或雙股siRNA之任意位置的二核苷酸之3'-末端。例如，可將5'-烷基化之核苷引入單股或雙股siRNA之任意位置的二核苷酸之3'-末端。核糖之5'位置的烷基可係外消旋或手性純R或S異構物。示例性5'-烷基化之核苷為5'-甲基核苷。5'-甲基可係外消旋或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，4'-修飾之核苷係經引入單股或雙股siRNA之任意位置的二核苷酸之3'-末端。例如，可將4'-烷基化之核苷引入單股或雙股siRNA之任意位置的二核苷酸之3'-末端。核糖之4'位置的烷基可係外消旋或手性純R或S異構物。示例性4'-烷基化之核苷為4'-甲基核苷。4'-甲基可係外消旋或手性純R或S異構物。或者，可將4'-O-烷基化之核苷引入單股或雙股siRNA之任意位置的二核苷酸之3'-末端。核糖之4'-O-烷基可係外消旋或手性純R或S異構物。示例性4'-O-烷基化之核苷為4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可係外消旋或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將5'-烷基化之核苷引入dsRNA之有義或反義股任意位置，且此類修飾維持或改善dsRNA之效力。5'-烷基可係外消旋或手性純R或S異構物。示例性5'-烷基化之核苷為5'-甲基核苷。5'-甲基可係外消旋或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將4'-烷基化之核苷引入dsRNA之有義或反義股任意位置，且此類修飾維持或改善dsRNA之效力。4'-烷基可係外消旋或手性純R或S異構物。示例性4'-烷基化之核苷為4'-甲基核苷。4'-甲基可係外消旋或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，將4'-O-烷基化之核苷引入dsRNA之有義或反義股任意位置，且此類修飾維持或改善dsRNA之效力。5'-烷基可係外消旋或手性純R或S異構物。示例性4'-O-烷基化之核苷為4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可係外消旋或手性純R或S異構物。
於一些態樣中，本揭露之dsRNA分子可包含2'-5'鍵聯(具有2'-H、2'-OH及2'-OMe且具有P=O或P=S)。舉例而言，2'-5'鍵聯修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制有義股與反義股之結合，或可用在有義股之5'末端以避免有義股藉由RISC活化。
於另一態樣中，本揭露之dsRNA分子可包含L糖(例如，L-核糖，具有2'-H、2'-OH及2'-OMe之L-阿拉伯糖)。舉例而言，此等L糖修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制有義股與反義股之結合，或可用在有義股之5'末端以避免有義股藉由RISC活化。
多個出版物揭示多聚siRNA，其等可全部與本揭露之dsRNA合用。此類出版物包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，其等以其等之整體併入本文。
配位子及/或親脂性部分可經由載劑附接至多核苷酸。示例性載劑包括(i)至少一個「主鏈接附點」，視需要兩個「主鏈接附點」，以及(ii)至少一個「繫結接附點」。如本文中所用，「主鏈接附點」指代官能基例如羥基，或通常係鍵，其可用於且適用於將該載劑併入核糖核酸之主鏈例如磷酸酯或經修飾之磷酸酯例如含硫之主鏈中。於一些態樣中，「繫帶接附點」(TAP)指代環狀載劑之構建環原子，例如，碳原子或雜原子(與提供主鏈接附點之原子截然不同)， 其連結所選擇之部分。該部分可係例如親脂性烷基基團，視需要C16親脂性部分。視需要，所選擇之部分係藉由中介繫帶連結至該環狀載劑。因此，該環狀載劑可包括官能基例如胺基，或通常係提供適用於將另一化學實體例如配體及/或親脂性部分併入或繫帶至構建環的鍵。
該等RNAi劑可經由載劑接合至配體及/或親脂性部分，其中該載劑可係環狀基團或非環狀基團。視需要，環狀基團係選自吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊烷([1,3]dioxolane)、
Figure 112112698-A0202-12-0133-113
唑啶基、異
Figure 112112698-A0202-12-0133-114
唑啶基、
Figure 112112698-A0202-12-0133-115
啉基、噻唑啶基、異噻唑啶、喹
Figure 112112698-A0202-12-0133-116
啉基、嗒
Figure 112112698-A0202-12-0133-117
基、四氫呋喃基及十氫萘。視需要，環狀基團係選自絲胺醇骨架及二乙醇胺骨架。
於某些態樣中，用於本揭露之方法中的RNAi劑為選自表2或3中任一者中列述之劑所組成之群組的劑。此等劑可復包含配體，諸如一個或多個親脂性部分。
III.接合至配體之iRNA
本揭露之iRNA之RNA的另一修飾包括將一個或多個增強該iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取例如到細胞中的配體、部分或接合物化學連接至該iRNA。此類部分包括但不限於脂質部分如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86：6553-6556)、膽酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)；巰基膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538)；脂族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991, 10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969-973)；或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基-氧膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
於某些態樣中，配體改變其所併入之iRNA劑的分佈、靶向或壽命。於一些態樣中，配體提供比缺失此配體之物質增強的對於所選標靶例如分子、細胞或細胞類型、隔室例如細胞或器官之隔室、組織、器官或身體區域之親和性。典型之配體將不會參與雙鏈體核酸中之雙鏈體配對。
配體可包括天然出現之物質，諸如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，聚葡萄糖、聚散葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精或玻尿酸)；或脂質。配體亦可係重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之示例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳酸交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺之實例包括：聚伸乙二胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、精三胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模擬性聚胺、 樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺之四級鹽、或α-螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、醣蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體，其結合至特定之細胞類型諸如腎細胞。靶向基團可係促甲狀腺素、促黑素、凝集素、醣蛋白、界面活性劑蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、多價果糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、運鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸鹽、聚天冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模擬物。於某些態樣中，該配體為多價半乳糖，例如，N-乙醯基半乳胺糖。
配體之其他示例包括染料；嵌入劑(例如，吖啶類)；交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)；卟啉類(TPPC4、特沙扶林(texaphyrin)、SSNCAhyrin)；多環芳烴(例如，啡
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、二氫啡
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)；人工核酸內切酶(例如，EDTA)；親脂性分子(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十六烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基、或啡
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)；以及肽接合物(例如，觸角足突變肽、Tat肽)、烷基化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射標記至標記物、酵素、半抗原(如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配體可係蛋白質例如醣蛋白、或肽例如具有對於共配體之特異親和性的分子、或抗體例如結合至特定細胞類型諸如癌細胞、內皮細胞或骨細胞之抗體。配體亦可包括激素及激素受體。其等亦可包括非肽類物質，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔助因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基半乳胺糖、N-乙醯基葡萄胺糖、多價甘露糖、或多價果糖。配體可係，舉例而言，脂質多醣、p38 MAP激酶之活化劑、或NF-κB之活化劑。
配體可係物質例如藥物，其可藉由舉例而言擾亂細胞之細胞主鏈例如藉由擾亂細胞之微管、微絲或中間體絲而增加細胞對iRNA劑之攝取。該藥物可係，舉例而言，泰素(taxon)、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、杰普肯立德(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆環肽(phalloidin)、海洋苔蘚素(swinholide)A、吲達諾欣(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
於一些態樣中，接附至本文中所揭示之iRNA的配體係用作藥物動力學調節劑(PK調節劑)。PK調節劑包括親脂質類、膽汁酸、類固醇、磷脂質類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節劑包括但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂質、神經脂質、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、微生物E、生物素等。包含大量硫代硫酸酯類鏈結之寡核苷酸亦已知結合至血清蛋白，因此在主鏈中包含多個硫代磷酸酯類鏈結之短寡核苷酸如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基之寡核苷酸亦可作為配體(例如，作為PK調節配體)而遵循本揭露。此外，於本文所揭示之態樣中，結合血清組分(例如，血清蛋白)之適配體亦適用於作為PK調節性配體而使用。
本揭露之接合有配體之iRNA可藉由使用承載側鏈反應性官能度之寡核苷酸諸如衍生自將連接分子接附在寡核苷酸(揭示於下)上者而合成。該反應性寡核苷酸可直接與可商購之配體、合成為承載多種保護基團之任一者的配體、或具有附接於其上之鏈結部分的配體反應。
於本揭露之接合物中使用之寡核苷酸可透過習知之固相合成技術便利且常規性地合成。用於此合成之設備可由多個供應商販售，包括，舉例而言，SNCAlied Biosystems®(Foster City,Calif.)。可額外地或作為替代性地採用該領域中已知之用於此合成之任意其他手段。使用類似技術來製備其他寡核苷酸諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物亦係已知者。
於本揭露之接合有配體之寡核苷酸及承載序列特異性鏈結之核苷的配體分子中，該寡核苷酸及寡核苷可在適宜之DNA合成器使用標準核苷酸或核苷前驅物、或已經承載鏈結部分之核苷酸或核苷接合前驅物、已經承載配體分子之配體-核苷酸或核苷接合前驅物、或承載配體之非核苷酸構建模塊而組裝。
當使用已經承載連接部分之核苷酸接合前驅物時，典型係完成序列特異性連接之核苷的合成，隨後將該配體分子與該連接部分反應以形成接合有配體之寡核苷酸。於一些態樣中，本揭露之寡核苷酸或經連接之核苷係藉由自動合成器使用衍生自配體-核苷接合物之除標準亞磷醯胺之外的亞磷醯胺及可商購且常規用於寡核苷酸合成中之非標準亞磷醯胺來合成。
A.脂質接合物
於某些態樣中，配體或接合物為脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子可典型地結合血清蛋白諸如人類血清白蛋白(HSA)。HSA結合配體允許該接合物分佈於標靶組織，例如非腎臟之身體標靶組織。例如，標靶組織可係 CNS之組織，例如，腦組織。可結合HSA之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配體可(a)增加對於接合物降解之抗性，(b)增加對標靶細胞或細胞膜之靶向或輸送，及/或(c)可用以調節與血清蛋白例如HSA之結合。
基於脂質之配體可用以調節例如控制(例如，抑制)該接合物與標靶組織之結合。舉例而言，與HSA之結合更強的脂質或基於脂質之配體更不可能靶向腎臟，並因此更不可能被從身體清除。與HSA之結合強度較低的脂質或基於脂質之配體可用來令該接合物靶向腎臟。
於某些態樣中，該基於脂質之配體結合HSA。舉例而言，該配體可以足夠親和力結合HSA，使得該接合物至非腎臟組織至分佈增強。惟，親和力之強度典型不足以造成該HSA-配體之結合不可逆。
於某些態樣中，該基於脂質之配體與HSA之結合弱或根本不結合，使得該接合物至腎臟之分佈增強。靶向腎細胞的其他部分亦可用於替換該基於脂質之配體或與該基於脂質之配體同時使用。
於另一方面，該配體為被標靶細胞例如增殖細胞攝取之部分例如維生素。此等係尤其可用於治療以例如惡性或非惡性細胞例如癌細胞的非預期之細胞增殖為特徵的病變。示例性維生素包括維生素A、維生素E及維生素K。其他示例性維生素包括B族維生素，例如葉酸、維生素B12、核黃素、生物素、吡哆醛、或其他被癌細胞攝取之維生素或營養物質。亦包括HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
於另一方面，該配體為細胞滲透劑，諸如螺旋細胞滲透劑。於某些態樣中，該劑為兩性劑。示例性劑為肽，諸如tat或觸角足突變肽。如果該劑為肽，其可經修飾，包括肽基模擬物、嵌入體、非肽或假肽類鏈結、以及D-胺基酸之使用。該螺旋劑典型為α-螺旋劑，且可具有親脂相及疏脂相。
該配體可係肽或肽模擬物。肽模擬物(本文中亦指代為寡肽模擬物)為能折疊為所定義之類似於天然肽之三維結構的分子。肽及肽模擬物與iRNA劑之接附可影響iRNA之藥物動力學分佈，諸如藉由增強細胞辨識及吸收而影響。該肽或肽模擬物部分可係5至50個胺基酸之長度，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸之長度。
肽或肽模擬物可係，舉例而言，細胞滲透肽、陽離子肽、兩性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe構成)。該肽部分可係樹枝狀肽、受約束之肽或交聯之肽。於另一替代者中，該肽部分可包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性之含有MTS的疏水性肽為具有下述胺基酸序列的RFGF：AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：9)。含有疏水性MTS之RFGF類似物(例如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10))亦可係靶向部分。該肽部分可係「輸送」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸、及蛋白質在內之極性大分子跨越細胞膜。舉例而言，已經發現來自HIV Tat蛋白之序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：11)及果蠅觸角足突變肽蛋白之序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：12)能夠發揮作為輸送肽的功能。肽或肽模擬物可由DNA之隨機序列編碼，例如從噬菌體呈現庫或一珠一物(OBOC)組合庫鑑定之肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。典型地，經由合併之單體單元繫帶至dsRNA劑之肽或肽模擬 物為細胞靶向肽，諸如精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分之長度範圍可係約5個胺基酸至約40個胺基酸。該等肽部分可具有結構性修飾，例如以增加安定性或引導構形特性。可使用下文所述之任意結構性修飾。
用於本揭露之組成物及方法的RGD肽可係線性或環狀，且可經修飾，例如經糖基化或甲基化，以促進對特定組織之靶向。含有RGD之肽及肽模擬物可包括D-胺基酸，以及合成RGD模擬物。除了RGD之外，亦可使用其他以整合素配體為標靶之部分。這一配體之較佳接合物係以PECAM-1或VEGF為標靶。
RGD肽部分可用來靶向特定細胞類型，例如，腫瘤細胞，諸如內皮腫瘤細胞或乳癌腫瘤細胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD肽可促進dsRNA劑巴愛香值多種其他組織之腫瘤，包括肺、腎、脾或肝(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。典型地，RGD肽將促進iRNA劑靶向至腎。RGD肽可係線性或環狀，且可經修飾，例如醣基化或甲基化以促進靶向至特定組織。舉例而言，醣化RGD肽可將iRNA劑輸送至表現α Vß3之腫瘤細胞(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。
「細胞滲透肽」能夠滲透細胞例如微生物細胞諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可係，舉例而言，α-螺旋線性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵之肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或bactenecin)、或僅含有一個或兩個支配性胺基酸之肽(例如，PR-39或indolicidin)。細胞滲透肽亦可包括線性定位訊號(NLS)。舉例而言，細胞滲透肽可係雙向兩親性肽如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41之融合肽結構域及SV40的T抗原之NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.連接子
於一些態樣中，本文中揭示之接合物或配體可使用多種連接子接附至iRNA寡核苷酸，該連接子可係可裂解者或不可裂解者。
術語「連接子」或「連接基團」意指將化合物之兩個部分連結在一起，例如將化合物之兩個部分共價附接的有機部分。連接子典型係包含直接鍵結或原子如氧或硫，單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子之鏈，例如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其一個或多個亞甲基可由O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環基中繼或終止；其中R8係氫、醯基、脂族或經取代之脂族。於某些態樣中，該連接子之長度為約1至24個原子、2至24個原子、3至24個原子、4至24個原子、5至24個原子、6至24個原子、6至18個原子、7至18個原子、8至18個原 子、7至17個原子、8至17個原子、6至16個原子、7至16個原子、或8至16個原子之間。
可裂解之連接基團在細胞外係足夠安定，但當進入標靶細胞時裂解以釋放被該連接子保持在一起之兩個部分。於較佳之態樣中，該可裂解之連接基團在標靶細胞內或在第一參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現細胞內之條件)下之裂解比在受試者血液內或在第二參考條件(其可係例如經選擇以模擬或呈現見於血液或血清中之條件)下之裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少約100倍。
可裂解之連接基團係對於裂解劑例如pH、氧化還原電位或可降解分子之存在為敏感者。通常，與在血清或血液中相比，裂解劑在細胞內更為普遍或以更高含量或活性被發現。此類降解劑之示例包括：氧化還原劑，其係選擇用於特定之受質或其不具有受質特異性，包括例如細胞內存在之可降解氧化還原可藉由還原可裂解之連接基團的氧化酶、還原酶或還原劑如硫醇；酯酶；內切酶，或可創建酸性環境之劑如導致pH為5或更低之彼等；可藉由作為通用酸、肽酶(其可係受質特異性者)及磷酸酶作動而水解或降解酸可裂解之連接基團的酶。
可裂解之連接基團諸如二硫鍵可能對於pH敏感。人血清之pH為7.4，而細胞內平均pH略低，為7.1至7.3之範圍。胞內體具有酸性更強之pH，為5.5至6.0之範圍；而溶酶體甚至具有酸性更強之pH，約為5.0。一些連接子將具有可裂解之連接基團，該連接基團在較佳之pH裂解，從而在細胞內將陽離子脂質從該配體釋放出來或將該陽離子脂質釋放如所欲之細胞腔室內。
連接子可包括可藉由特定酶裂解之可裂解之連接基團。併入連接子內的可裂解之連接基團之類型可取決於待作為標靶之細胞。
通常，可藉由測試降解劑(或條件)裂解備選連接基團之能力而評估該備選之可裂解連接基團的適用性。亦所欲者係亦測試該備選可裂解連接基團在血液、腦脊液(CSF)中或當與其他非標靶組織接觸時之抵抗裂解的能力。因此，可測定第一條件與第二條件間之裂解相對敏感性，其中該第一條件係選擇為標靶細胞內之裂解標誌物，且該第二條件係選擇為其他組織或生物流體例如血液或血清中之裂解標誌物。該等評價可在無細胞之系統內、細胞內、細胞培養物內、器官或組織培養物內、或在整個動物體內進行。可能有用者係，在無細胞或培養條件下作成初始評價，并藉由在整體動物體內之進一步評價而證實之。於較佳之態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之活體外條件下)之裂解比在CSF、血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之活體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。
i.氧化還原可裂解之連接基團
於某些態樣中，可裂解之連接基團為氧化還原可裂解之連接基團，其在還原或氧化時被裂解。可經還原裂解之連接基團的示例係二硫連接基團(-S-S-)。為了確定備選可裂解連接子團是否為適宜之「可還原裂解之連接基團」或例如是否適用於與特定iRNA部分及特定靶向劑合用，可查看本文中揭示之方法。舉例而言，可藉由以二硫蘇糖醇(DTT)或使用該領域中已知試劑之還原劑溫育來評估備選者，該溫育模擬在細胞如標靶細胞內將會觀察到之裂解速率。該等被選中亦可在經選擇以模擬血液或血清條件之條件下評價。於一個態樣中，備選化合物在血 液中被裂解至多約10%。於其他態樣中，可用之備選化合物在細胞內(或在選擇以模擬細胞內條件之活體外條件下)之降解比在血液或血清中(或在選擇以模擬細胞外條件之活體外條件下)快至少約2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或約100倍。備選化合物之裂解速率可使用標準酶動力學分析在經選擇以模擬細胞內介質之條件下測定，並將其與在經選擇以模擬細胞外介質之條件下所測者比較。
ii.基於磷酸酯之可裂解連接基團
於某些態樣中，可裂解之連接子包含基於磷酸酯之可裂解連接基團。基於磷酸酯之可裂解連接基團係藉由降解或水解該磷酸酯基團之劑而裂解。在細胞內裂解磷酸酯基團之劑的示例係酶如細胞內之磷酸酶。磷酸酯系連接基團之示例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳之態樣係-O-P(O)(OH)-O-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
iii.酸可裂解之連接基團
於某些態樣中，可裂解之連接子包含酸可裂解之連接基團。酸可裂解之鏈結基團係在酸性條件下被裂解之鏈結基團。於較佳之態樣中，酸可裂解之鏈結基團係在pH為約6.5或更低(例如，約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)之酸性環境中被裂解，或由劑諸如可用作通用酸之酶裂解。於細胞內，特異性低pH胞器諸如胞內體及溶酶體，可提供用於酸可裂解之鏈接基團的裂解環境。酸可裂解之鏈結基團之示例包括但不限於腙類、酯類、及胺基酸之酯類。酸可裂解之連接基團 可具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。較佳之態樣為，接附至酯之氧(烷氧基)的碳為芳基、經取代之烷基、或四級烷基諸如二甲基戊基或第三丁基。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
iv.基於酯之可裂解連接基團
於某些態樣中，可裂解之連接子包含基於酯之可裂解連接基團。基於酯之可裂解連接基團由酶諸如酯酶或醯胺酶在細胞內裂解。基於酯之可裂解鏈接基團的實例係包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基之酯類。酯可裂解之連接基團可具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
v.基於肽之可裂解連接基團
於又一態樣中，可裂解之鏈結基為包含基於勝肽之可裂解鏈結基團。基於肽之可裂解連接基團係由酶諸如肽酶或蛋白酶在細胞內裂解。基於肽之可裂解基團為在胺基酸間形成以獲得寡肽(例如，二肽、三肽等)及多肽之肽鍵。基於肽之可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。該醯胺基團可在任意伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵為在胺基酸間形成以獲得肽及蛋白質之特定類型的醯胺鍵。基於肽之裂解基團通常限定為在胺基酸之間形成而獲得肽及蛋白質的肽鍵(亦即，醯胺鍵)，且不包括該完整醯胺官能基。肽系可裂解鏈接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB為兩個相鄰胺基酸之R基團。此等備選者可使用與上述之彼等類似之方法評價。
於本揭露之語境中，「嵌合」iRNA化合物或「嵌合體」為iRNA化合物，視需要為dsRNA劑，其含有兩個或更多個化學上不同之區域，各區域由至少一個單體單元構成，亦即，在dsRNA化合物之情形中，該單體單元為核苷酸。此等iRNA典型地含有至少一個區域，其中該RNA經修飾以賦予該iRNA 以增加之對核酸酶降解之抗性、增加之細胞攝取、或增加之與標靶核酸之親和性。該iRNA之額外區域可用作能裂解RNA：DNA雜交體或RNA：RNA雜交體之酶的受質。舉例而言，RNase H為細胞之核酸內切酶，其裂解RNA：DNA雙鏈體之RNA股。因此，RNase H之活化導致RNA標靶之裂解，從而極大地提升對基因表現之iRNA抑制的效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，使用較短之iRNA往往可獲得與使用雜交至相同標靶區域之硫代磷酸酯去氧dsRNA相當的結果。RNA標靶之裂解可藉由凝膠電泳常規偵檢之，且若需要，可將凝膠電泳與該領域中已知之相關核酸雜交技術合用。
於某些情況下，iRNA之RNA可藉由非配體基團修飾。大量非配體分子業經接合至iRNA以提升iRNA之活性、細胞分佈或細胞攝取，且實施此類接合之過程可在科技文獻中獲得。此類非脂質部分業經包括脂質部分，諸如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)；膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)；巰基膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)；脂族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)；磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸三乙銨(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)；聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)；或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995, 36：3651)、棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己基胺基-羰基-氧膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教示此類RNA接合物之製備的代表性美國專利業經列述於上文中。典型之接合策略包括在該序列之一個或多個位置承載胺基連接子之RNA的合成。該胺基隨後與使用適宜之偶合劑或活化劑接合之分子反應。該接合反應可使用仍鍵結至固體支撐物之RNA實施，或在RNA於溶液相中裂解後實施。藉由HPLC進行的RNA接合物之純化典型地提供純接合物。
IV.SNCA減弱之活體內測試
多種α-突觸核蛋白PD模型係可獲得(Gómez-Benito et al.Front Pharmacol.11：356)。大量PD之囓齒動物模型依賴於腦內或全身性投予α-突觸核蛋白預成形纖絲(PFF)或源自展現α-突觸核蛋白病理學之PD患者或基因轉殖小鼠之路易實體及α-突觸核蛋白的腦提取物。業經作成與SNCA RNAi劑之評定更相關的PD之基因模型。過表現SNCA基因的重組腺相關病毒載體(rAAV)業經用於模型PD：使用rAAV過表現野生型α-突觸核蛋白或PD-相關突變體(A53T或A30P α-突觸核蛋白)業經揭示為導致中腦黑質緻密帶(SNc)中的多巴胺能神經元之進行性損失、紋狀體中多巴胺末端之損失Koprich et al.Mol Neurodegener.5：43；Koprich et al.PLoS One.6：e17698；Oliveras-Salvá et al.Mol Neurodegener.8：44；Bourdenx et al.Acta Neuropathol Commun.3：46；Caudal et al.Exp Neurol.273：243-52；Lu et al.Biochem Biophys Res Commun.464：988-993；Ip et al.Biochem Biophys Res Commun.464：988-993)及紋狀體多巴胺含量之降低(Koprich et al.PLoS One.6：e17698；Ip et al.)。惟，用rAAV模型達成的神經退化程度在不同研究中可變。 業經測試了數種血清型、促進劑、α-突觸核蛋白物質、劑量及注射後之時程，並且全部此等因素皆影響所達成的巴金森氏症侯群表型。
亦業經生成表現E46K α-突觸核蛋白的數種基因轉殖小鼠品系(Emmer et al.J Biol Chem.286：35104-18；Nuber et al.Neuron.100：75-90.e5)，同時業經使用病毒載體於小鼠中過表現E46K人類α-突觸核蛋白。於rAAV-α-突觸核蛋白模型中，α-突觸核蛋白包涵物在黑質紋狀體系統中之存在係伴隨有黑質多巴胺能神經元之顯著損失及紋狀體中酪胺酸水解酶免疫反應性之損失。野生型或A53T人類α-突觸核蛋白之過表現誘導隨時間推移的SN中多巴胺能神經元之損失(Oliveras-Salvá et al.Mol Neurodegener.8：44)。
一些研究業經顯示，rAAV-α-突觸核蛋白表現造成運動改變之發展，諸如增加的阿朴嗎啡或安非他明誘導之轉動、步進測試中之缺陷或滾筒測試中增加的前爪不對稱性(Kirik et al.J Neurosci.22：2780-91；Decressac et al.Brain.134(Pt 8)：2302-11；Koprich et al.PLoS One.6：e17698；Decressac et al.Neurobiol Dis.45：939-53；Gaugler et al.Acta Neuropathol.123：653-69；Gombash et al.PLoS One.8：e81426；Oliveras-Salvá et al.Mol Neurodegener.8：44；Bourdenx et al.Acta Neuropathol Commun.3：46；Caudal et al.Exp Neurol.273：243-52；Ip et al.Biochem Biophys Res Commun.464：988-993)。此等運動缺陷在注射數週後於具有多巴胺能神經元之顯著損失的動物中出現。
此類模型業經用於開發及評估旨在降低α-突觸核蛋白之集聚及預防由α-突觸核蛋白誘導之神經退化的潛在療法(Decressac et al.Proc Natl Acad Sci U S A.110：E1817-26；Xilouri et al.Autophagy.9：2166-8；Rocha et al.Neurobiol Dis.82：495-503)，並且可復用於證明本文所提供之RNAi劑的活體內功效。在一 些包含致病性突變的情況下，此類模型可含有例如人類或大鼠SNCA的構成性或誘導型表現，例如，過表現。本文所使用的過表現模型之實例包括AAV誘導的全長人類(Homo sapiens)SNCA轉錄本s00240906_m1及3' UTR之表現，以及AAV誘導的全長溝鼠(Rattus norvegicus)SNCA轉錄本NM_019169.2及3' UTR之表現。
V.本揭露之RNAi劑的輸送
本發明之RNAi至細胞例如受試者諸如人類受試者(例如，有此需要之受試者，諸如患有SNCA相關病症，例如，PD、多系統萎縮、路易氏體失智症(LBD)等之受試者)體內之細胞的輸送可藉由大量不同路徑達成。舉例而言，可藉由將細胞與本揭露之RNAi劑在活體外或活體內接觸而實施輸送。活體內輸送亦可藉由將包含RNAi劑例如dsRNA之組成物向受試者投予而直接實施。或者，活體內輸送可藉由投予編碼並引導該RNAi劑之表現的一種或多種載體而間接實施。此等替代物係於下文中進一步檢討。
通常，輸送核酸分子之任意方法(活體外或活體內)可適用於與本揭露明之RNAi劑合用(參見，例如，Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144及WO94/02595，其係藉由引用而以其整體併入本文)。對於活體內輸送，針對輸送RNAi劑而慮及之因素包括，舉例而言，所輸送之劑的生物學安定性、非特異性效應之預防、及所輸送之劑在標靶組織內之蓄積。RNAi劑之非特異性效果可藉由局部投予而最小化，舉例而言，藉由直接注射或移植如組織內或外用投予該製劑。局部投予至治療位點使該劑之局部濃度最大化，限制該劑與可能受該劑傷害或可降解該劑之全身組織接觸，且允許以較低之劑量投予該RNAi劑。若干研究業經顯示，當局部投予RNAi劑時，成功敲除基因產物。 舉例而言，藉由玻璃體內注射於食蟹獼猴體內(Tolentino,MJ.et al.,(2004)Retina 24：132-138)及藉由視網膜下注射於小鼠體內(Reich,SJ.et al.(2003)Mol.Vis.9：210-216)進行之VEGF dsRNA的眼內輸送，兩者皆顯示防止老年性黃斑點退化實驗模型中的新血管生成。此外，在小鼠體內進行dsRNA之直接腫瘤內注射降低腫瘤體積(Pille,J.et al.(2005)Mol.Ther.11：267-274)並且可延長荷瘤小鼠之存活(Kim,WJ.et al.,(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.et al.,(2007)Mol.Ther.15：515-523)。藉由直接注射而局部輸送至CNS(Dorn,G.et al.,(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.et al.(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.et a.l(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al.(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al.(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)及藉由鼻內投予而輸送至肺(Howard,KA.et al.,(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.et al.,(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.et al.,(2005)Nat.Med.11：50-55)亦業經成功地顯示了RNA干擾。對於全身性地及/或鞘內地投予RNAi劑用於治療疾病，該RNA可經修飾或者使用藥物輸送系統輸送；兩種方法皆作動以防止該dsRNA被內核酸酶及外核酸在活體內快速降解。對RNA或醫藥載劑之修飾亦可允許該RNAi劑靶向至標靶組織並避免非所欲之脫靶效應(例如，不與受縛於理論，業經鑑定，如本文所揭示之GNA的使用使dsRNA之種子區域趨穩定，導致此類dsRNA的上靶有效性偏好相對於脫靶效應增強，因為此類脫靶效應藉由此類種子區域去安定化得以顯著弱化)。RNAi劑可藉由化學接合至親脂性基團諸如膽固醇而修飾，以增強細胞攝取且防止降解。舉例而言，將經接合至親脂性膽固醇部分之對抗ApoB的RNAi劑全身性注射至小鼠體內，導致肝臟及空腸兩處之apoB mRNA的敲除 (Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。業經顯示，將RNAi劑接合至適配體會抑制前列腺癌模型小鼠體內之腫瘤生長並媒介腫瘤衰退(McNamara,JO.et al.,(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。於替代性態樣中，該RNAi劑可使用藥物輸送系統諸如奈米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體、或陽離子輸送系統進行輸送。荷正電之陽離子輸送系統促進分子RNAi劑(荷負電)之結合，亦增強在荷負電之細胞膜處的交互作用，以允許該細胞對RNAi劑之有效攝取。陽離子脂質、樹枝狀聚合物或聚合物可鍵結至RNAi劑，或經引入以形成封裝RNAi劑之媒介物或微胞(參見例如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。媒介物或微胞之形成進一步防止當全身性投予時該RNAi劑之降解。製作及投予陽離子-RNAi劑錯合物之方法完全處於該領域熟練人士之能力範圍內(參見，例如，Sorensen,DR,et al(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN,et al(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al(2007)J.Hypertens.25：197-205，其皆藉由引用而以其整體併入本文)。可用於RNAi劑之全身性輸送的藥物輸送系統之一些非限制性實例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003)，同上；Verma,UN,et al(2003)，同上)、Oligofectamine「固體核酸脂質顆粒」(Zimmermann,TS,et al(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY,et al(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A,et al(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚伸乙基亞胺(Bonnet ME,et al(2008)Pharm.Res.Aug 16線上提前發行；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)、及聚醯胺基胺(Tomalia,DA,et al(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.,et al(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。於一些態樣中，RNAi 劑與環糊精形成用於全身性投予之錯合物。投予方法及RNAi劑與環糊精之醫藥組成物可見於美國專利第7,427,605號，其係藉由引用而以其整體併入本文。
本揭露之某些方面係關於降低細胞中SNCA標靶基因之表現的方法，包括令該細胞與本揭露之雙股RNAi劑接觸。於一個態樣中，該細胞為CNS細胞。
本揭露之另一方面係關於降低受試者之SNCA標靶基因之表現的方法，其包含向受試者投予本揭露之雙股RNAi劑。
本揭露之另一方面係關於治療患有SNCA相關病症之受試者的方法，其包含向受試者投予治療有效量的本揭露之雙股RNAi劑，從而治療該受試者。可藉由本揭露之方法治療的示例性CNS病症包括突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
於一個態樣中，該雙股RNAi劑係經鞘內投予。藉由雙股RNAi劑之鞘內投予該方法可降低SNCA標靶基因在腦(例如，紋狀體)或脊髓組織例如皮質、小腦、頸椎、腰椎及胸椎中的表現。
為了便於闡述，本章節主要關於經修飾之siRNA化合物討論配製物、組成物及方法。惟，可以理解，此等配製物、組成物及方法可使用其他siRNA 化合物，例如，未經修飾之siRNA化合物實踐，且此實踐係在本揭露內。包括RNAi劑之組成物可藉由多種路徑輸送至受試者。示例性路徑包括：鞘內、靜脈內、外用、直腸內、肛門內、陰道內、鼻內、肺部及眼內。
本揭露之RNAi劑可經併入適用於投予的醫藥組成物中。此類組成物典型包括一種或多種RNAi劑及醫藥上可接受之載劑。如本文所用，片語「醫藥上可接受之載劑」旨在包括與醫藥投予相容之任意及全部溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌及、等張及吸收延遲劑等。此類介質及劑用於醫藥活性物質的用途係本領域中習知者。除非任意常規介質或劑與活性化合物不相容，否則預期其在組成物中的使用。補充性活性化合物亦可併入組成物中。
本揭露之醫藥組成物可經由大量路徑投予，取決於局部治療或全身治療是否為所欲者，且取決於待治療之面積。投予可係外用(包括眼用、陰道內、直腸內、鼻內、透皮)、口服或腸胃外。腸胃外投予包括靜脈滴注，皮下、腹腔內或肌肉內注射，或鞘內或心室內投予。
可選擇投予之路徑及位點以增強靶向性。例如，為了靶向腦及其他CNS細胞，鞘內注射將係合乎邏輯之選擇。
用於外用投予之配製物可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末劑。傳統醫藥載劑、水性基質、粉末基質、油狀基質、增稠劑等可係必要者或所欲者。經塗覆之保險套、手套等亦可係有用者。
用於口服投予之組成物包括粉末劑或顆粒劑、於水中之懸浮液或容易、糖漿劑、酏劑或非水性介質、錠劑、膠囊劑、口含錠或喉錠。在錠劑之情況下，可使用之載劑包括乳糖、檸檬酸鈉及磷酸之鹽。各種崩解劑諸如澱粉及潤 滑劑諸如硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉及滑石係常用於錠劑中。對於膠囊形式之口服投予，可用之稀釋劑為乳糖及高分子量聚乙二醇。當需要水性懸浮液用於口服用途時，核酸組成物可與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，可添加某些甜味劑或風味劑。
用於鞘內或心室內投予之組成物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適之添加劑。
用於腸胃外投予之配製物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適之添加劑。鞘內注射可藉由鞘內導管促進，舉例而言，接附至儲器。對於鞘內使用，溶質之總濃度可經控制以使得該製劑等張。
於一個態樣中，該siRNA化合物，例如，雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物、組成物之投予係腸胃外，例如，鞘內、靜脈內(例如，作為單次快速注射或作為可擴散輸注)、皮內、腹腔內、肌肉內、心室內、顱內、皮下、跨黏膜、口頰、舌下、內視鏡、直腸內、口服、陰道內、外用、肺部、鼻內、尿道內或眼內。投予可由受試者或由另一人例如健康照護提供者提供。用藥可以經量測之劑量或在以計量劑量輸送之分配器中提供。所選之輸送模式在下文中更詳細地討論。
鞘內投予
於某些態樣中，該雙股RNAi劑係藉由鞘內腔注射(亦即，注射至浸泡腦及脊髓組織之脊髓液中)輸送。RNAi劑經鞘內腔注射至脊髓液中可作為單次快速注射進行，或經由可植入皮膚下的微型泵進行，該微型泵提供siRNA至脊髓液內的規則且恆定的輸送。脊髓液從其所產生之處的脈絡叢圍繞脊髓及背根神經節向下循環，且後續上行經過小腦且越過皮質以抵達蛛網膜顆粒，在該處，脊髓 液可以離開CNS，依據所注射之化合物的尺寸、安定性及溶解度，經鞘內輸送之分子可命中整個CNS之標靶。
於一些態樣中，鞘內投予係經由泵進行。泵可係經外科手術植入之滲透泵。於一個態樣中，滲透泵經植入到椎管之視網膜下腔以促進鞘內腔投予。
於一些態樣中，鞘內腔投予係經由藥用鞘內輸送系統，該系統包括容納一定體積之醫藥劑的儲器及經組態為輸送該儲器中容納之該醫藥劑之一部分的泵。關於該鞘內輸送系統的更多細節可見於WO 2015/116658中，其藉由引用以其整體併入。
經鞘內注射之RNAi劑的量可因標靶基因而異，且必須應用的適宜之量可針對各標靶基因個別地確定。典型地，該量在10μg至2mg之範圍，視需要為50μg至1500μg，更視需要為100μg至1000μg。
編碼本揭露之RNAi劑的載體
靶向SNCA基因之RNAi劑可以從插入NA或RNA載體內的轉錄單元表現(參見例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；WO 00/22113；WO 00/22114及US 6,054,299)。表現係視需要持續(數月或更久)，取決於所述使用之特定構建體及標靶組織或細胞類型。此等轉殖基因可作為線性構建體、環狀質體或病毒載體而引入，其可係整合載體或非整合載體。該轉殖基因亦可構造為允許其作為粒線體外質體而被繼承(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
RNAi劑之個別股或多股可從表現載體之啟動子轉錄。若兩個分離之股係待表現以生成例如dsRNA，則可將兩個分隔之表現載體共同引入(例如，藉由轉染或感染)標靶細胞內。或者，dsRNA之每一個別股可藉由位於相同 表現質體之兩種啟動子轉錄。於一個態樣中，dsRNA經表現為反向重複多核苷酸，其係藉由連接子奪核苷酸序列接合，使得該dsRNA具有莖環結構。
RNAi劑表現載體通常為DNA質體或病毒載體。與真核細胞相容之表現載體，視需要係彼等與脊椎動物細胞相容者，可用來生產用於表現本文所述RNAi劑之重組構造。RNAi劑表現載體之輸送可係至CNS諸如藉由鞘內投予；全身性者，諸如藉由靜脈內或肌肉內投予；藉由投予至從該患者外植之標靶細胞，之後重新引入患者體內；或藉由任意其他容許引入所欲之標靶細胞內的手段。
可與本文所述方法及組成物合用之病毒載體系統包括但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒(AAV)載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)Sv40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，諸如天花例如牛痘病毒載體，或禽痘例如金絲雀痘或雞痘病毒載體；以及(j)幫手依賴性或裸腺病毒載體。複製缺陷病毒亦可係優勢者。不同之載體將變為或不變為併入該細胞之基因體內。若必要，該等構造體可包括用於轉染之病毒序列。或者，該構造體可併入能進行附加型複製(episomal replication)之載體例如EPV載體及EBV載體內。用於RNAi劑之重組表現之構建體通常將會需要調節元件，例如啟動子、增強子等，以確保該RNAi劑在標靶細胞內之表現。對於載體及構建體所慮及之其他方面係該領域中已知者。
VI.本發明之醫藥組成物
本揭露亦包括醫藥組成物及配製物，其包括含本揭露之RNAi劑。於一個態樣中，本文提供醫藥組成物，其含有如本文所揭示之RNAi劑及醫藥上可接受之 載劑。含有該RNAi劑之醫藥組成物可用於治療與SNCA之表現活性相關之疾病或病症，例如SNCA相關神經退化性疾病，諸如突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
此等醫藥組成物係基於輸送模式而配製。一個實例為配製為用於直接輸送至CNS的組成物，例如，藉由鞘內路徑之注射，視需要藉由輸注至腦(例如，紋狀體)，諸如藉由連續泵輸注。
於一些態樣中，本揭露之醫藥組成物係無熱原或非熱原的。
本揭露之醫藥組成物可以足以抑制SNCA基因表現之劑量投予。通常，本揭露之RNAi劑的適當劑量將在約0.001至約200.0毫克每公斤接受者體重每天的範圍內，通常在約1至50mg每公斤體重每天的範圍內。
重複劑量方案可包括規則地投予治療量之RNAi劑，諸如每月一次到每六個月一次。於某些態樣中，該RNAi劑係約每個季度一次(亦即，約每三個月一次)到約每年兩次。
於初始之治療方案(例如，加載劑量)，該治療之實施頻次可降低。
於其他態樣中，醫藥組成物之單次劑量可係長效，使得後續劑量係以不超過1、2、3、4或更多個月之間期投予。於本揭露之一些態樣中，本揭 露之醫藥組成物的單次劑量係約每個月投予一次。於本揭露之其他態樣中，本揭露之醫藥組成物的單次劑量係約每個季度投予一次到每年投予兩次。
熟練技術人員應知悉，某些因素可影響有效治療受試者所需之劑量及時機，該等因素包括但不限於疾病或病症之嚴重性、先前之治療、受試者之一般健康情況或年齡、以及存在之其他疾病。此外，使用治療有效量之組成物治療受試者可包括單一治療或一系列治療。
小鼠遺傳性之進展產生了用於研究SNCA相關疾病的小鼠模型，該疾病將會受益於SNCA表現之降低。此類模型可用於RNAi劑之活體內測試，以及用於確定治療有效劑量。合適之小鼠模型係本領域中已知者，其包括例如本文他處所揭示之小鼠模型。
本揭露之醫藥組成物可經由大量路徑投予，取決於局部治療或全身治療是否為所欲者，且取決於待治療之面積。於某些態樣中，投予可係鞘內。惟，於某些態樣中，投予可係外用(例如，藉由透皮貼劑)；肺部投予，例如藉由粉末或氣溶膠之吸入或吹入，包括藉由噴霧器；氣管內投予、鼻內、表皮及透皮投予；口服或腸胃外投予。腸道外投予係包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；真皮下投予，例如經由植入裝置；或顱內投予，例如藉由腦實質內投予、鞘內投予或腦室內投予。
該等RNAi劑可以靶向特定組織諸如CNS(例如，腦之神經元組織、膠質組織或血管組織)的模式輸送。
用於外用投予之醫藥組成物及配製物可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳霜劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末劑。常規醫藥載劑、水性基質、粉末基質、油狀基質、增稠劑等可係必要者或所欲者。經塗覆之保險 套、手套等亦可係有用者。合適之外用配製物包括下述之彼等，其中本揭露所提出之RNAi劑係與外用輸送劑諸如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑混合。合適之脂質及脂質體包括中性(例如，二油醯基磷脂DOPE乙醇胺、二肉豆蔻醯基卵磷脂DMPC、二硬脂醯基卵磷脂)、陰性(例如，二肉豆蔻醯基磷脂甘油DMPG)及陽離子性(例如，二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂乙醇胺DOTMA)。本揭露提出之RNAi劑可封裝在脂質體內，或可與脂質體尤其是陽離子脂質體形成錯合物。或者，RNAi劑可與脂質體尤其是陽離子脂質體錯合。合適之脂肪酸及酯類包括但不限於花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸異丙酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽。外用配製物詳述於US 6,747,014中，其係藉由引用而併入本文。
A.包含RNAi劑配製物之膜分子組件
用於本揭露之組成物及方法中之RNAi劑可配製為用於在膜分子組件例如脂質體或微胞中輸送。如本文所用，術語「脂質體」指代由兩親性脂質構成之囊泡，該脂質以至少一個雙層排列，例如，一個雙層或複數個雙層。脂質體包括單層及多層泡囊，其具有從親脂性材料形成之膜及水性內腔。水性部分含有該RNAi劑組成物。該親脂性材料將該水性內腔與水性外部分離，而該水性外部並不包括該RNAi劑組成物，但在一些實例中，可包括該iRNA組成物。脂質體係有用於將活性成分轉移並輸送至作動位點。因為脂質體膜在結構上類似於生物膜，當將脂質體施加至組織時，脂質體雙層與細胞膜之雙層融合。隨著脂質體與 細胞之融匯進展，包括該RNAi劑之內部水性成分經輸送至細胞內，在該處，RNAi劑可特異性地結合至標靶RNA並且可媒介RNAi。在一些情況下，脂質體亦經特異性地靶向例如以將該RNAi劑引導至特定細胞類型。
含有RNAi劑之脂質體可藉由多種方法製備之。於一個示例中，將脂質體之脂質成分溶解在洗滌劑中，使得以該脂質成分形成微胞。舉例而言，該脂質成分可係兩親性陽離子脂質或脂質接合物。該洗滌劑可具有高臨界微胞濃度且可係非離子性。示例性之洗滌劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡萄糖苷、脫氧膽酸鹽、及月桂醯肌胺酸。隨後將該RNAi劑製劑加入包括該脂質成分之微胞中。該脂質之陽離子性基團與RNAi劑交互作用，並縮合在該RNAi劑周圍以形成脂質體。縮合之後，例如藉由滲析移除該洗滌劑，以得到RNAi劑之脂質體性製劑。
若必要，可在縮合反應過程中，例如藉由受控添加而加入有助於縮合之載劑化合物。舉例而言，該載劑化合物可係除核酸之外的聚合物(如，精胺或精三胺)。亦可調節pH以輔助縮合。
生產安定之聚核苷酸輸送媒介物之方法，其係將聚核苷酸/陽離子脂質錯合物作為該輸送媒介物之結構性成分而併入，進一步揭示於例如WO 96/37194中，其整體內容係藉由引用而併入本文。脂質體配製物亦可包括下列中所揭示之示例性方法的一個或多個方面：Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417；美國專利第4,897,355號；美國專利第5,171,678號；Bangham et al.,(1965)M.Mol.Biol.23：238；Olson et al.,(1979)Biochim.Biophys.Acta 557：9；Szoka et al.,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194；Mayhew et al.,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775：169；Kim et al.,(1983)Biochim.Biophys.Acta 728：339； 及Fukunaga et al.,(1984)Endocrinol.115：757。常用之製備其尺寸適合用作輸送媒介物之脂質聚集體的技術包括超音波處理及凍融加押出(參見例如，Mayer et al.,(1986)Biochim.Biophys.Acta 858：161)。當一致性地小(50至200nm)且相對均勻之聚集體係所欲者時，可使用微流體化(Mayhew et al.,(1984)Biochim.Biophys.Acta775：169)。此等方法可容易地適用於將RNAi劑製劑封裝入脂質體中。
脂質體係落入兩個大類中。陽離子脂質體為荷正電之脂質體，其與荷負電之核酸分子交互作用以形成安定之錯合物。荷正電之核酸/脂質體錯合物結合至荷負電之細胞表面，且在胞內體中被內化。由於胞內體中之酸性pH，該脂質體被破裂，將其內容物釋放到細胞質中(Wang et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147：980-985)。
pH敏感或荷負電之脂質體入陷核酸而非其等之錯合物。由於核酸及脂質兩者皆荷相似之電荷，係出現排斥而非形成錯合物。儘管如此，一些核酸仍經入陷至此等脂質體之水性內腔中。pH敏感之脂質體業經用來將編碼胸苷激酶基因之核酸輸送至培養物中之細胞單層。外源基因之表現係於標靶細胞中偵檢出(Zhou et al.(1992)Journal of Controlled Release,19：269-274)。
一種主要類型之脂質體性組成物包括除天然衍生之卵磷脂外之磷脂質。舉例而言，中性脂質體組成物可由二肉豆蔻醯基卵磷脂(DMPC)或二棕櫚醯基卵磷脂(DPPC)形成。陰離子性脂質體組成物通常係由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油形成，而陰離子性促融合脂質體係主要由二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質體性組成物係由卵磷脂(PC)如，舉例而言，大豆PC及蛋PC形成。另一類型係由磷脂質或卵磷脂或膽固醇之混合物形成。
活體外及活體內將脂質體引入細胞內的其他方法之實例包括美國專利第5,283,185號；美國專利第5,171,678號；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,(1994)J.Biol.Chem.269：2550；Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307；Nabel,(1992)Human Gene Ther.3：649；Gershon,(1993)Biochem.32：7143；及Strauss,(1992)EMBO J.11：417。
亦業經檢查非離子性脂質體系統，尤其是包含非離子性界面活性劑及膽固醇之系統，以確定其等在將藥物輸送至皮膚中之用途。包含NovasomeTM I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及NovasomeTM II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體配製物係用來將環孢素-A輸送至小鼠皮膚之真皮內。結果表明，此類非離子性脂質體系統係有效促進環孢素-A沈積在皮膚之不同層內(Hu et al.,(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6)：466)。
脂質體亦包括「立體安定化之」脂質體，如本文中使用，該術語指代包含一種或多種空間化脂質的脂質體，當該空間化脂質被併入脂質體中時，其導致循環壽命比缺失此類空間化脂質之脂質體提升。立體穩定化之脂質體的示例係下述之彼等：其中，脂質體之形成媒介物之脂質部分中的一部分(A)係包含一種或多種糖脂質，如單唾液酸神經節苷脂GM1，或(B)係使用一種或多種親水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分予以衍生。儘管不欲受縛於任意特定理論，於該領域中咸信，至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂、或PEG衍生之脂質的立體安定化之脂質體，此等立體安定化之脂質體的提升之循環半衰期係源於網狀內皮系統(RES)之細胞對其之攝取降低(Allen et al.,(1987)FEBS Letters,223：42；Wu et al.,(1993)Cancer Research,53：3765)。
各種包含一種或多種磷脂質之脂質體係該領域中已知者。Papahadjopoulos et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507：64)報導單唾液酸神經節苷脂GM1、硫酸半乳糖腦苷脂及磷脂醯肌醇改善脂質體之血液半衰期的能力。此等發現係藉由Gabizon et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85,：6949)闡述。美國專利第4,837,028號及WO 88/04924，兩者皆授予Allen et al.，係揭露包含(1)鞘磷脂及(2)神經節苷脂GM1或硫酸半乳糖腦苷脂之脂質體。美國專利第5,543,152號(Webb et al.)係揭露包含鞘磷脂之脂質體。包含1,2-sn-二肉豆蔻醯基卵磷脂之脂質體係揭露於WO 97/13499(Lim et al)中。
於一個態樣中，使用陽離子性脂質體。陽離子脂質體具備能融合至細胞膜之優點。儘管非陽離子脂質體不能有效地與漿膜融合，但其可在體內被巨噬細胞攝取，且可用以將RNAi劑輸送至巨噬細胞。
脂質體之進一步之優點係包括：從天然磷脂質獲得之脂質體係生物相容且生物可降解者；脂質體可合併多種水及脂溶性藥物；脂質體可保護封裝在其內部腔室中之RNAi劑不被代謝及降解(Rosoff,「Pharmaceutical Dosage Forms」,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,volume 1,p.245)。在脂質體配製物之製備中的重要考量為脂質表面電荷、泡囊尺寸、及脂質體之水性體積。
荷正電之合成陽離子脂質，氯化N-[1-(2,3-二油醯基氧)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)，可用以形成小脂質體，該小脂質體自發與核酸反應以形成脂質-核酸錯合物，該錯合物能與組織培養細胞之細胞膜的荷負電之脂質融合，從而完成iRNA劑之輸送(參見例如，Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417及美國專利第4,897,355號，關於DOTMA及其與DNA合用之描述)。
一種DOTMA類似物，1,2-雙(油醯基氧基)-3-(三甲基銨)丙烷(DOTAP)，可與磷脂質合用以形成錯合有DNA之泡囊。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)係用於將高度陰離子性核酸輸送至活體組織培養細胞內的有效之劑，該細胞包含荷正電之DOTMA脂質體，而該脂質體自發與荷負電之聚核苷酸相互作用以形成錯合物。當使用荷足夠正電之脂質體時，所得錯合物上之靜電荷亦為正。以此途徑製備之荷正電之錯合物自發地接附至荷負電之細胞表面，與漿膜融合，且有效地將官能性核酸輸送至例如組織培養細胞內。另一可商購之陽離子脂質，1,2-雙(油醯基氧基)-3,3-(三甲基銨)丙烷(「DOTAP」)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)與DOTMA之不同之處在於其油醯基部分係藉由酯而非醚鏈結者。
其他經報導之陽離子脂質化合物包括彼等業經接合至多種部分者，包括，舉例而言，業經接合至兩種類型之脂質之一的羧基精胺，且包括化合物諸如5-羧基精胺基甘胺酸十八油醯基醯胺(「DOGS」)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)及二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺基-醯胺(「DPPES」)(參見例如，美國專利第5,171,678號)。
另一陽離子脂質接合物包括具膽固醇之脂質衍生物(「DC-Chol」)，其業經與DOPE組合而配製在脂質體內(參見，Gao,X.and Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280)。業經報導，藉由將聚離胺酸接合至DOPE而作成的脂質聚離胺酸在血清存在下的轉染中有效(Zhou,X.et al.,(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065：8)。對於某些細胞系，據說此等含有經接合之陽離子脂質的脂質體顯現較低之毒性且提供比含DOTMA之組成物更有效之轉染。其他可商購之陽離子脂質產品包括DMRIE及DMRIE-HP(Vical,La Jolla, California)及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。其他適用於輸送寡核苷酸之陽離子脂質揭示於WO 98/39359及WO 96/37194中。
脂質體配製物尤其適用於外用投予，脂質體呈現比其他配製物優越之若干優點。此類優點包括，相對於對所投予之藥物的高度全身性吸收，副作用減低；所投予之藥物在所欲之標靶處的蓄積增加；以及，將RNAi劑投予至皮膚內的能力。於一些實作中，脂質體係用於將RNAi劑輸送至表皮細胞，且亦用以增強RNAi至真皮組織內例如皮膚內之滲透。舉例而言，該脂質體可外用施加。已有文獻報導配製為脂質體之藥物的外用輸送(參見例如，Weiner et al.,(1992)Journal of Drug Targeting,vol.2,405-410以及du Plessis et al.,(1992)Antiviral Research,18：259-265；Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniques 6：682-690；Itani,T.et al.,(1987)Gene 56：267-276；Nicolau,C.et al.(1987)Meth.Enzymol.149：157-176；Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101：512-527；Wang,C.Y.and Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855)。
亦業經檢查非離子性脂質體系統，尤其是包含非離子性界面活性劑及膽固醇之系統，以確定其等在將藥物輸送至皮膚中之用途。包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及Novasome II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)之非離子性脂質體配製物係用來將藥物輸送至小鼠皮膚之真皮內。此類具有RNAi劑之配製物可用於治療皮膚病變。
包括RNAi劑之脂質體可作成可高度變形者。該變形性令脂質體能夠滲透穿過小於該脂質體之平均半徑的孔。例如，傳遞體(高度可變形之脂質聚集體，其對於藥物輸送媒介物而言為有吸引力的候選物)為一種可變形之脂質 體。傳遞體可揭示為脂質液滴，其可變形性如此之高以至於它們能輕易地滲透穿過小於該液滴之孔。傳遞體可適應其所使用之環境，例如，它們係自優化(調適至孔如皮膚內之孔的形狀)、自修復，且可頻繁到達其標靶而不片段化，且一般係自載荷。傳遞體可藉由將表面邊緣活化劑，一般為界面活性劑，加入標準脂質體性組成物而作成。傳遞體業經用以將血清白蛋白輸送至皮膚。業經顯示，傳遞體媒介之血清白蛋白的輸送係與將含有血清白蛋白之溶液進行皮下注射同樣有效。包括RNAi劑之傳遞體可藉由例如注射而在皮下輸送，以將RNAi劑輸送至皮膚之角質細胞。為了橫跨哺乳動物之總皮層，脂質泡囊必需在適宜之透皮梯度的影響下穿透一系列微孔，每一微孔具有小於50nm之直徑。此外，由於脂質之特性，此等傳遞體可經自優化(調適至孔如皮膚內之孔的形狀)、自修復，且可頻繁到達其標靶而不片段化，且一般為自載荷。
其他依從本揭露之配製物係揭示於美國專利臨時申請序列號61/018,616(2008年1月2日遞交)、61/018,611(2008年1月2日遞交)、61/039,748(2008年3月26日遞交)、61/047,087(2008年4月22日遞交)及61/051,528(2008年5月8日遞交)。2007年10月3日遞交的PCT申請號PCT/US2007/080331亦揭示依從本揭露之配製物。
界面活性劑可廣泛用於配製物諸如本文所揭示之彼等，特定而言乳液(包括微乳液)及脂質體中。對包括天然及合成者在內之多種不同類型的界面活性劑之特性進行分類及排序的最常見途徑，係藉由使用親水/親脂平衡(HLB)。親水性基團(亦稱為「頭部」)之天性係提供將配製物中所用之不同界面活性劑歸類的最有用手段(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果界面活性劑分子未經離子化，則其分類為非離子性界面活性劑。非離子性界面活性劑可廣泛應用於醫藥及化妝產品中，且可在寬範圍之pH下使用。通常，其等之HLB值為2至約18之範圍，取決於其等之結構。非離子性界面活性劑包括非離子性酯類如乙二醇酯類、丙二醇酯類、甘油酯類、聚甘油酯類、失水山梨醇酯類、蔗糖酯類、及經乙氧基化之酯類。非離子性烷醇醯胺類及醚類諸如脂肪醇乙氧基化物、經丙氧基化之醇類、及經乙氧基化/丙氧基化之嵌段聚合物亦包括於這一類中。聚氧乙烯界面活性劑為非離子性界面活性劑類別中最常見之成員。
如果當將界面活性劑分子溶解或分散於水中時其攜帶負電荷，則該界面活性劑係分類為陰離子性。陰離子性界面活性劑包括羧酸酯類如皂類、醯基乳酸酯類、胺基酸之醯基醯胺類、硫酸之酯類如硫酸烷基酯及經乙氧基化之硫酸烷基酯、磺酸鹽類如烷基苯磺酸鹽類、醯基羥乙基磺酸鹽類、醯基酒石酸鹽類及磺基琥珀酸鹽類、及磷酸鹽類。陰離子性界面活性劑類別之最重要之成員為烷基硫酸鹽類及皂類。
如果當將界面活性劑分子溶解或分散於水中時其攜帶正電荷，則該界面活性劑係分類為陽離子性。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽類及經乙氧基化之胺類。四級銨鹽類為本類別中最常用之成員。
如果界面活性劑具有攜帶正電荷或負電荷之能力，則該界面活性劑係分類為兩性。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺類、N-烷基甜菜鹼類及磷脂類。
界面活性在藥物產品、配製物及乳液中之使用業經得以回顧(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用於本揭露之方法中的RNAi劑亦可提供為微胞配製物。本文中，「微胞」係定義為特定類型之分子組件，其中，兩性分子排列為球狀結構，使得該等分子之疏水性部分全部朝向內側，留下親水性部分與周圍之水相接觸。如果環境為疏水性，則存在逆向排列。
適用於透過跨真皮膜輸送之混合微胞配製物可藉由將siRNA組成物之水性溶液、鹼金屬之C8至C22烷基硫酸鹽、及形成微胞之化合物混合而製備。例示性之形成微胞之化合物包括卵磷脂；玻尿酸；玻尿酸、乙醇酸、乳酸的藥學可接受之鹽類；洋甘菊提取物；黃瓜提取物；亞麻油酸；次亞麻油酸；單油酸甘油酯；單油酸酯類；單月桂酸酯類；玻璃苣油；月見草油；薄荷油；三羥基側氧基膽烷基甘油及其藥學可接受之鹽類；甘油；聚甘油；離胺酸；聚離胺酸；三油酸甘油酯；聚氧乙烯醚類及其類似物；聚多卡醇烷基醚類及其類似物；鵝脫氧膽酸鹽類；脫氧膽酸鹽類；及其混合物。形成微胞之化合物可在加入鹼金屬之烷基硫酸鹽的同時或之後加入。為了提供較小尺寸之微胞，可使用除劇烈混合外之實質上任意種類的混合形成混合微胞。
於一種方法中，係製備含有該siRNA組成物及至少一種鹼金屬之烷基硫酸鹽的第一微胞組成物。隨後將該第一微胞組成物與至少三種形成微胞之化合物混合以形成混合微胞組成物。於另一方法中，係藉由將siRNA組成物、鹼金屬之烷基硫酸鹽、及至少一種形成微胞之化合物混合，之後在劇烈混合下加入剩餘的形成微胞之化合物而製備。
可將苯酚或間甲酚加至該混合微胞組成物中，以安定化配製物並防止細菌生長。或者，可將苯酚或間甲酚與形成微胞之成分一起加入。在形成該混合微胞組成物之後，亦可加入等張劑如甘油。
對於將微胞配製物作為噴霧劑輸送，可將該配製物置於氣溶膠分散器內，且該分散器係填充有推進劑。該推進劑處於壓力之下，在該分散器中為液體形式。調節各成分之比率，使得水性相與推進劑相稱為異體，亦即，僅存在一相。如果存在兩相，則在例如透過計量閥分散該等成分之一部分之前搖動該分散器。所分散劑量之藥劑係由該計量閥推進為細小噴霧。
推進劑可包括含氫之氯氟碳化合物、含氫之氟碳化合物、甲醚及乙醚。於某些態樣中，可使用HFA 134a(1,1,1,2-四氟乙烷)。
主要成分之具體濃度可藉由相對簡單之實驗確定。對於透過口腔進行之吸收，一般所欲者係增加劑量，例如，增加為透過注射投予或透過胃腸道投予之劑量的至少兩倍或三倍。
脂質顆粒
RNAi劑，例如，本揭露之dsRNA劑可完全封裝在脂質配製物如LNP中，或封裝在其他核酸-脂質顆粒內。
如本文中所使用，術語「LNP」指代安定之核酸-脂質顆粒。LNP典型地含有陽離子脂質、非陽離子脂質、及預防該顆粒聚集之脂質(例如，PEG-脂質接合物)。LNP係極其有用於全身性應用，蓋因其等在靜脈內(i.v.)注射後顯現延長之循環壽命且在遠端位點(例如，物理上與投予位點分隔之位點)蓄積。LNP包括「pSPLP」，其包括經封裝之縮合劑-核酸錯合物，如PWO00/03683中所詳述。LNP配製之顆粒典型係具有約50nm至約150nm、更典型約60nm至 約130nm、更典型約70nm至約110nm、最典型約70nm至約90nm之平均直徑，且係實質上無毒。此外，當核酸-脂質顆粒中存在核酸時，該核酸係在水性溶液中對抗核酸酶之降解。核酸-脂質顆粒及其等之製備方法係揭露於例如美國專利第5,976,567號、第5,981,501號、第6,534,484號、第6,586,410號、第6,815,432號；美國專利公開第2010/0324120號及WO 96/40964中。
於一個態樣中，脂質與藥物之比率(質量/質量比率)(例如，脂質與dsRNA之比率)將在約1：1至約50：1、約1：1至約25：1、約3：1至約15：1,from about 4：1至約10：1、約5：1至約9：1、或約6：1至約9：1之範圍內。上文引述之範圍之間的範圍亦視為本揭露之一部分。
用於RNAi劑之輸送的某些特定LNP配製物業經揭示於本領域中，包括例如，如例如WO 2008/042973中所揭示之「LNP01」配製物，該專利係藉由引用併入本文。
其他示例性脂質-dsRNA配製物係鑑定於以下圖表中。
Figure 112112698-A0202-12-0170-127
Figure 112112698-A0202-12-0171-128
Figure 112112698-A0202-12-0172-129
Figure 112112698-A0202-12-0173-130
DSPC：二硬脂醯基卵磷脂
DPPC：二棕櫚醯基卵磷脂
PEG-DMG：PEG-二肉桂醯基甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(PEG，平均分子量為2000)
PEG-DSG：PEG-二桂皮基甘油(C18-PEG，或PEG-C14)(PEG，平均分子量為2000)
PEG-cDMA：PEG-胺基甲醯基-1,2-二肉癸醯基氧基丙胺(PEG，平均分子量為2000)
包含SNALP(1,2-二亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))之配製物係揭示於WO 2009/127060中，其係藉由引用併入本文。
包含XTC之配製物係揭示於WO 2010/088537中，其整體內容藉由引用併入本文。
包含MC3之配製物係揭示於例如美國專利公開第2010/0324120中，其整體內容藉由引用併入本文。
包含ALNY-100之配製物係揭示於WO 2010/054406中，其整體內容藉由引用併入本文。
包含C12-200之配製物係揭示於WO 2010/129709中，其整體內容藉由引用併入本文。
用於口服投予之組成物及配製物包括粉末劑或顆粒劑、微粒劑、奈米顆粒劑、水中或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊劑、軟膠囊劑、袋劑、錠劑、或小錠劑。增稠劑、芳香劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑可係所欲者。於一些態樣中，口服配製物係下述之彼等，其中本揭露提出之dsRNA係與一種或多種滲透增強劑界面活性劑及螯合劑協同投予。適宜之界面活性劑包括脂肪酸類或其酯類或鹽類、膽汁酸類或其鹽類。適宜之膽汁酸類/膽汁酸鹽類包括鵝脫氧膽酸(CDCA)及烏索脫氧鵝脫氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、脫氧膽酸、糖膽酸、甘膽酸、甘胺脫氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺脫氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉及甘胺二氫褐黴酸鈉。適宜之脂肪酸類包括花生四烯酸、十一碳酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、蘇子油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、或其單甘油酯、二甘油酯或藥學可接受之鹽(例如，鈉鹽)。於一些態樣中，係使用滲透增強劑之組合，舉例而言，脂肪酸類/脂肪酸鹽類與膽汁酸/膽汁酸鹽類之組合。一種示例性之組合 為月桂酸之鈉鹽、癸酸及UDCA。其他滲透增強劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本揭露提出之dsRNA可作為包括噴霧乾燥顆粒在內之顆粒劑形式或錯合形成微粒或奈米顆粒而經口輸送。dsRNA錯合劑包括聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧雜環丁烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；陽離子化之明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙烯醇(PEG)及澱粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生之聚亞胺、支鏈澱粉、纖維素及澱粉。適宜之錯合劑包括幾丁聚醣、N-三甲基幾丁聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺酸、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(如，對-胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-丙烯酸甲酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-聚葡萄糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸鹽、及聚乙二醇(PEG)。用於dsRNA之口服配製物及其製備係詳細揭示於美國專利6,887,906、U.S.2003/0027780及美國專利第6,747,014號中，其各自藉由引用併入本文。
用於腸胃外、腦實質內(至腦內)、鞘膜內、心室內或肝內投予之組成物及配製物可包括無菌水溶液，其亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜之添加劑，例如但不限於，滲透增強劑、載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
本揭露之醫藥組成物包括但不限於，溶液、乳液、及含脂質體之配製物。此等組成物可從多種組分生成，該等組分包括但不限於，預成形之液體、 自乳化之固體及自乳化之半固體。特佳者為當治療SNCA相關疾病或病症時靶向腦部之配製物。
可便利地以單位劑型存在的本揭露之醫藥配製物，可根據醫藥工業中習知之傳統技術製備之。此類技術包括將活性成分與醫藥載劑或賦形劑帶至聯合之步驟。通常，該等配製物係藉由將或活性成分與液體載劑或精細分切之固體載劑或兩者均勻且緊密地帶至聯合而製備，隨後，若必要，令產物成形。
本揭露之組成物可配製為多種可能劑型之任一者，例如但不限於，錠劑、膠囊劑、軟膠囊劑、液體糖漿劑、軟膠劑、栓劑、及灌腸劑。本揭露之組成物亦可配製為處於水性、非水性或混合介質中的懸浮液。水性懸浮液可復含有增加該懸浮液黏度之物質，包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有安定劑。
其他製劑
i.乳波
本揭露之組成物可製備且配製為乳液。乳液係一種液體以直徑通常超過0.1μm之液滴形式分散於另一種液體中之典型非均質系統(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335； Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常為包含彼此緊密混合及分散之兩個不互混液體相之雙相系統。通常，乳液可係油包水(w/o)類或水包油(o/w)類。當水性相經精細切分為小液滴並分散於整塊油性相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油性相經精細切分為小液滴並分散於整塊水性相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。乳液除了含有分散相及可作為水性相、油性相存在於溶液中或本身作為單獨一相的活性藥物之外，亦可含有額外之組分。如需要，醫藥賦形劑如乳化劑、安定劑、染料及抗氧化劑亦可存在於乳液中。醫藥乳液亦可係由超過兩相構成之多乳液，舉例而言，油包水包油(o/w/o)乳液及水包油包水(w/o/w)乳液。此類複雜配製物經常提供簡單雙相乳液所不具有之某些優點。其中o/w乳液之個體油滴將小水滴容納在內之多乳液構建w/o/w乳液。同樣，油滴被容納在油性連續相中經安定化之水球內的系統提供o/w/o乳液。
乳液之特徵在於熱力學安定性小或沒有。一般情況下，乳液之分散相或不連續相良好地分散在外部相或連續相中，且透過乳化劑手段或形成黏度之手段維持其形式。乳液之任一相可係半固體或固體，如在乳液型軟膏基質及乳霜劑之情形中者。其他安定化乳液之手段需要使用可併入乳液之任一相中的乳化劑。廣義上，乳化劑可歸為四類：合成界面活性劑、天然界面活性劑、吸收基質、及精細分散之固體(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑，亦稱為表面活性劑，業經廣泛用於乳液配製物中且業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑典型為兩性的且包含親水性部分及疏水性部分。界面活性劑之親水性與疏水性之比率業經定義為親水/親脂平衡(HLB)，且為在配製物之製備中歸類及選擇界面活性劑之有價值的工具。基於其親水性基團之天性，界面活性劑可歸為不同之類別：非離子性、陰離子性、陽離子性及兩性(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液配製物中使用之天然乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂質、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基質具備親水特性，使得它們可吸收水以形成w/o乳液，而仍保持其半固體一致性，吸收基質為例如無水羊毛脂及親水石油脂。精細切分之固體亦業經用作良好之乳化劑，尤其是與界面活性劑合用或用於黏性製劑中。此等包括極性無機固體，諸如重金屬氫氧化物、非溶脹黏土諸如皂土、鎂鋁海泡石、水輝石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁及膠體矽酸鎂鋁、顏料及非極性固體如碳或甘油三硬脂酸酯。
大量非乳化材料亦包括於乳液配製物中，且對乳液之特性有所貢獻。此等包括脂肪、油類、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
親水性膠體或水膠體包括天然膠及合成化合物，諸如多醣(舉例而言，阿拉伯膠、瓊脂、藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠、刺梧桐膠及黃芪膠)、纖維素衍生物(舉例而言，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)、及合成聚合物(舉例而言，卡波姆、纖維素醚、及羧基乙烯基聚合物)。此等在水中分散或溶脹以形成膠體溶液，其藉由形成環繞分散相液滴之強界面膜且藉由增加外部相之黏度而安定化乳液。
由於乳液一般含有可輕易地支持微生物生長的大量成分如碳水化合物、蛋白質、固醇及磷脂質，此等配製物一般係併入防腐劑。乳液配製物包括的常用之防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、氯化苄烷基羥銨、對羥基苯甲酸之酯、及硼酸。抗氧化劑亦常常加入乳液配製物中以防止該配製物的變質。所使用之抗氧化劑可係自由基捕捉劑如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基化之羥基茴香醚、丁基化之羥基甲苯、或還原劑如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉、及抗氧化劑增效劑如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂。
乳液配製物經由護膚路徑、口服路徑及腸胃外路徑之應用及其製造方法業經在文獻中回顧(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。用於口服輸送之乳液配製物因為其容易配製以及在吸收及生物利用性觀點之效能而業經廣泛使用(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。礦物油基質輕瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑係屬於業經作為o/w乳液而常常口服投予的材料。
ii.微乳液
於本揭露之一個態樣中，RNAi劑及核酸之組成物經配製為微乳液。微乳液可定義為水、油及兩性之系統，其係單一光學各向同性且熱力學安定之溶液(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。典型地，微乳液為藉由下述製備之系統，首先，將油分散於界面活性劑水溶液中，隨後添加足量之第四成分，通常為中等鏈長之醇，以形成透明之系統。因此，微乳液亦業經揭示為兩種不互混液體的熱力學安定、各向同性之澄清分散液，該兩種液體係藉由表面活性分子之界面膜予以安定化(Leung and Shah，Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液通常係經由將三至五種組分組合而製備，該等組分係包括油、水、界面活性劑、助界面活性劑及電解質。微乳液是否為油包水(w/o)類型或水包油(o/w)類型係取決於所使用之油及界面活性劑之特性，亦取決於界面活性劑分子之極性頭部及烴類尾部至結構及幾何封裝(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
使用相圖之現象學途徑業經廣泛研究，且業經令該領域熟練人士獲得如何配製微乳液之全面知識(參見，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。與傳統乳液相比，微乳液具備將配製物中水不溶性藥物溶解為自發形成之熱力學安定之液滴的優點。
於微乳劑之製備中使用的界面活性劑係包括但不限於，離子性界面活性劑、非離子性界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，單獨使用或與助界面活性劑合用。助界面活性劑，一般為短鏈醇如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，係用來藉由 因為在界面活性劑分子間生成之空洞空間而滲透入界面活性劑膜並隨後創建失序膜，從而增加界面流動性。惟，微乳劑可不使用助界面活性劑而製備，且不含醇之自乳化微乳液系統係該領域中已知者。水性相典型可係但不限於，水、藥物之水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、及乙二醇之衍生物。油性相可包括但不限於，材料諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、重鏈(C8-C12)單、二及三甘油酯、聚氧乙基化之甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化之甘油酯、飽和聚二醇化之C8-C10甘油酯、植物油及矽油。
自藥物溶解性之觀點及增強之藥物吸收來看，微乳液係尤其感興趣者。業經提出，基於脂質之微乳液(o/w及w/o兩者)係增強藥物之口服生物利用性，該藥物係包括勝肽(參見，例如，美國專利第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供下列優點：改善之藥物溶解性、保護藥物不被酶水解、由於引入界面活性劑導致之膜流動性及可透過性之改變造成的可能提升之藥物吸收、容易製備、比固體劑型更易口服投予、改善之臨床潛能、以及降低之毒性(參見，例如，美國專利第6,191,105號、第7,063,860號、第7,070,802號、第7,157,099號；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當在環境溫度下將微乳液之組分帶至一起時，一般可自發形成微乳液。這在配製熱安定藥物、肽或RNAi劑時尤其具有優勢。亦業經發現，微乳液在化妝品及醫藥兩種應用中活性組分之透皮輸送中有效。預期本揭露之微乳液組成物及配製物將促進胃腸道對RNAi劑及核酸之全身性吸收，以及改善對RNAi劑及核酸之局部細胞攝取。
本揭露之微乳液亦可含有額外之組分及添加劑如失水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol、以及滲透增強劑，以改善配製物之特性並增強對本揭露之RNAi劑及核酸之吸收。本揭露之微乳液中使用之滲透增強劑可歸類為屬於下述五大類之一：界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。此等類型各自業經於上文檢討。
iii.微粒
本揭露之RNAi劑可併入顆粒例如微粒中。微粒可藉由噴霧乾燥生產，但亦可藉由其他方法生產，該等其他方法包括凍乾、蒸發、流動床乾燥、真空乾燥、或此等技術之組合。
iv.滲透增強劑
於一個態樣中，本揭露採用多種滲透增強劑以實現核酸尤其是RNAi劑至動物皮膚之有效輸送。大多數藥物以經離子化及未經離子化兩種形式存在於溶液中。惟，一般僅脂溶性或親脂性藥物輕易地跨越細胞膜。業經發現，如果待跨越之細胞膜經滲透增強劑處理，則即便是非親脂性藥物仍能夠跨越該細胞膜。滲透增強劑除了有助於非親脂性藥物跨越細胞膜之擴散之外，亦增強親水性藥物之滲透能力。
滲透增強劑可分類為屬於下述五大類之一：亦即，界面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑、及非螯合非界面活性劑(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述各類別之滲透增強劑更詳細揭示於下。
界面活性劑(或「表面活性劑」)為化學實體，當其溶解在水性溶液中時，係降低該溶液之表面張力或該水性溶液與另一液體間之界面張力，結果為RNAi劑透過黏膜之吸收得以增強。此等滲透增強劑除了膽酸鹽及脂肪酸外亦包括，舉例而言，月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；以及全氟化學乳液如FC-43。Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
作為滲透增強劑而作動之多種脂肪酸及其衍生物係包括，舉例而言，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油單油酸酯(1-單油醯基-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生油酸、甘油-1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如，甲酯、異丙酯及第三丁酯)、及其單甘油酯及二甘油酯(亦即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見，例如，Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁之生理學角色係包括促進對脂質及脂溶性微生物之分散及吸收(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。多種天然膽汁鹽及其合成衍生物係作為滲透增強劑而作動。因此，術語「膽汁鹽」包括膽汁之任意天然組分以及它們的任意合成衍生物。適宜之膽汁鹽包括，舉例而言，膽酸(或其醫藥上可接受之鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸鈉)、脫氧膽酸(脫氧膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、糖膽酸(糖膽酸鈉)、糖脫氧膽酸(糖脫氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺脫氧膽酸(牛磺脫氧膽酸鈉)、鵝脫氧膽酸(鵝脫氧膽酸鈉)、烏索脫氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴素鈉(STDHF)、糖基二氫褐黴素鈉及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(參見，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92頁；Swinyard，第39章，In：Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
與本揭露關聯使用之螯合劑可定義為，藉由與金屬離子形成錯合物而將該金屬離子從溶液中移除的化合物，結果為透過黏膜進行之RNAi劑吸收得以增強。關於他們作為滲透增強劑於本揭露中之用途，螯合劑具有亦作為DNase抑制劑而作動之附加優點，蓋因大多數特徵化DNA核酸酶係需要用於淬火之二價金屬離子並因此被螯合劑所抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。適宜之螯合劑包括但不限於，伸乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、枸櫞酸、柳酸鹽(如，柳酸鈉、5-甲氧基柳酸鹽及高香草酸鈉)、膠原之N-醯基衍生物、laureth- 9及β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺類)(參見，例如，Katdare,A.et al.,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文中所用，非螯合非界面活性劑滲透增強劑化合物可定義為，證明其作為螯合劑或作為界面活性劑之活性不顯著但仍然提升透過消化道黏膜進行之RNAi劑吸收的化合物(參見，例如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。這一類滲透增強劑包括，舉例而言，不飽和環狀脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92)；以及非類固醇抗炎劑諸如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛(indomethacin)及丁二苯吡唑二酮(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
於細胞量級增強RNAi劑攝入之劑亦可加入本揭露之醫藥組成物及其他組成物中。舉例而言，陽離子脂質諸如lipofectin(Junichi等人，美國專利第5,705,188號)、陽離子性甘油衍生物、及聚陽離子性分子諸如聚離胺酸(WO 97/30731)，亦已知提升dsRNA之細胞攝入。
其他劑可用以增強所投予之核酸的滲透，包括二醇類諸如乙二醇及丙二醇、吡咯類諸如2-吡咯、氮酮類、及萜類諸如檸檬烯及薄荷酮。
vi.賦形劑
與載劑化合物相比，「醫藥載劑」或「賦形劑」為醫藥上可接受之溶劑、懸浮劑或其他用於將一種或多種核酸輸送至動物之醫藥惰性媒介物。該賦形劑可 係液體或固體，且當與核酸及給定醫藥組成物之其他組分合併時，係基於所考慮之計劃投予模式而選擇，以提供所欲之體積、一致性等。典型之醫藥載劑包括但不限於，結合劑(例如，預膠凝之玉米澱粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填料(例如，乳糖及其他糖類、未經纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、雲母、氧化矽、膠體二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、醋酸鈉等)；崩解劑(例如，澱粉、澱粉乙醇酸鈉等)；以及潤濕劑(例如，月桂基硫酸鈉等)。
不與核酸進行有害反應的適用於非腸胃外投予之醫藥上可接受的有機或無機賦形劑亦可用以配製本揭露之組成物。適宜之醫藥上可接受的載劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、雲母、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
用於核酸之外用投予的配製物可包括無菌及非無菌水性溶液、在常用溶劑諸如醇類中之非水性溶液、或核酸在液體或固體油基質中之溶液。該等溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適宜之添加劑。可使用不與核酸進行有害反應的適用於非腸胃外投予之醫藥上可接受的有機或無機賦形劑。
適宜之醫藥上可接受的賦形劑包括但不限於，水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、雲母、矽酸、黏性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯基吡咯烷酮等。
vii.其他組分
本揭露之組成物可額外地含有常見於醫藥組成物中之其他輔助組分，用量為其等在該領域中常用的量級。因此，舉例而言，該等組成物可含有額外、可相 容、醫藥活性之材料如，舉例而言，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或可含有可用於物理上配製多種類型之本揭露之組成物的材料諸如染料、芳香劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及安定劑。惟，當加入此類材料時，此類材料應不過度干擾本揭露之組成物之組分的生物活性。該配製物可經無菌化，且若需要，與不與該製劑之核酸進行有害反應的佐劑例如潤滑劑、防腐劑、安定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽類、緩衝劑、著色劑、香味劑及/或芳香物質等混合。
水性懸浮液可含有增加該懸浮液黏度之物質，包括，舉例而言，羧甲基纖維素鈉、山梨醇或聚葡萄糖。懸浮液亦可含有安定劑。
於一些態樣中，本揭露提出之醫藥組成物包括(a)一種或多種RNAi劑及(b)一種或多種劑，其係藉由非RNAi機制而發揮功能且係有用於治療SNCA相關神經退化性病症。此類基之實例包括但不限於多巴胺促效劑及促進劑等，包括碳度巴-左旋多巴、左旋多巴、恩他卡朋(entacopone)、托卡朋(tolcapone)、阿片哌酮(opicapone)、普拉克索(pramipexole)、羅平尼咯(ropinirole)、阿朴嗎啡、羅替戈汀(rotigotine)、司立吉林(selegiline)、雷沙吉蘭(rasagiline)、沙芬醯胺(safinamide)、金剛烷胺、伊曲茶鹼(istradefylline)、苯海索(trihexyphenidyl)、苯脫品(benztropine)、利伐斯的明(rivastigmine)、多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)及美金剛。
此類化合物之毒性及治療效力可藉由標準醫藥過程在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD50(將群體之50%致死之劑量)及ED50(對群體之50%治療有效之劑量)。毒性與治療效力間之劑量比率為治療係數，且其可表現為LD50/ED50之比率。顯現高治療係數之化合物係較佳者。
從細胞培養檢定及動物研究中獲得之資料可用於配製在人體內使用之劑量範圍。本揭露提出之組成物的劑量通常處於包括ED50在內之具低毒性或無毒性之循環濃度範圍。劑量可依據所採用之劑型及所使用之投予路徑而在此範圍內變動。對於在本揭露提出之方法中使用的任意化合物，最初可從細胞培養物檢定中構建治療有效之劑量。劑量可配製為，用於動物模型以達成該化合物或(當適宜時)標靶序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(例如，達成多肽之降低之濃度)，該範圍包括如在細胞培養物中測定之IC50(亦即，達成對症候之半最大抑制時該測試化合物之濃度)。此資訊可用來更準確地確定可用於人體之劑量。舉例而言，可藉由高效液相色層分析術測量血漿中之量級。
除了如上文討論之投予之外，本揭露提出之RNAi劑亦可與其他已知之在治療由核苷酸重複序列表現媒介之病理進程中有效的劑合用。在任意情況下，主治醫生皆可基於該領域中已知或本文所述之標準效力測量方法觀察的結果來確定RNAi劑投予的量及時機。
VII.套組
在某些方面，本公開提供套組，其等包括含有siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物(例如，前驅物，例如可經處理為siRNA化合物的較大siRNA化合物，或編碼siRNA化合物例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物之DNA，或其前驅物)之醫藥配製物的合適容器。於某些態樣中，醫藥配製物之個別組分可提供在一個容器中。或者，將醫藥配製物之組分獨立地提供在兩個或更多個容器中可能係所欲者，例如，一個容器用於siRNA化合物製劑，且至少另一者用於載劑化合物。該套組可封裝為多種不同組態諸如單個盒子中的一個或多個容器。不溶組分可例如根據與套組一起提供的說明進行組合。該等組分可根 據本文所揭示之方法進行組合，例如，以製備並投予醫藥組成物。套組亦包括輸送裝置。
VIII.抑制SNCA表現之方法
本揭露亦提供抑制SNCA基因在細胞內之表現的方法。該等方法包括使細胞與其量有效抑制SNCA在細胞內之表現的RNAi劑，例如，雙股RNAi劑接觸，從而抑制SNCA在細胞內的表現。於本揭露之某些態樣中，SNCA係優先在CNS(例如，腦)細胞中得以抑制。
細胞與RNAi劑例如雙股RNAi劑的接觸可在活體外或活體內進行。使細胞在活體內與RNAi劑接觸包括使受試者例如人類受試者體內的細胞或細胞群組與RNAi劑接觸。接觸細胞的活體外方法與活體內方法之組合亦係可能者。
接觸細胞可係直接或間接的，如上文檢討。此外，接觸細胞可經由靶向配體實現，該配體包括本文所接受或本領域中已知的任意配體。
如本文中所用，術語「抑制」與「降低」、「緘默化」、「下調」、「阻抑」及其他類似術語可互換使用，且包括任意量級之抑制。於一些態樣中，抑制量級，例如，本揭露之RNAi劑之抑制量級，可在細胞培養條件下評估，例如，其中細胞培養物中之細胞係經由LipofectamineTM媒介之轉染在鄰近細胞處以10nM或更低、或1nM或更低之濃度轉染。給定RNAi劑之減弱可經由將細胞培養物中之處理前量級與細胞培養物中之處理後量級比較而測定，視需要亦針對用混雜或其他形式之對照RNAi劑平行處理的細胞進行比較。細胞培養物中例如視需要50%或更多的減弱可因此經鑑定為「抑制」或「降低」、「下調」或「阻抑」業經出現的標誌。明確地預期，對所靶向之mRNA或所編碼之蛋白質 含量(及因此由本揭露之RNAi劑引起的「抑制」程度等)的評估亦可在活體內系統中針對本揭露之RNAi劑在如本領域中揭示之經適宜控制之條件下評估。
如本文中所用，片語「抑制SNCA基因之表現」或「抑制SNCA之表現」包括抑制任意SNCA基因(例如，小鼠SNCA基因、大鼠SNCA基因、猴SNCA基因、或人類SNCA基因)以及編碼SNCA蛋白質之SNCA基因之變體或突變體的表現。因此，在經基因操縱之細胞、細胞群組或生物體之語境下，SNCA基因可係野生型SNCA基因、突變型SNCA基因、或基因轉殖SNCA基因。
「抑制SNCA基因之表現」包括對SNCA之任意量級之抑制，例如對SNCA基因之表現的至少部分的阻抑，諸如至少20%之抑制。於某些態樣中，抑制係至少30%、至少40%、視需要至少50%、至少約60%、至少70%、至少約80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%；或抑制到低於檢定方法之檢出量級。
SNCA基因之表現可基於任何與SNCA基因表現相關之變量的量級來評定，該變量例如SNCA mRNA量級或SNCA蛋白量級，或舉例而言，神經發炎之量級，例如，與神經細胞死亡相關的腦區域中之小神經膠質細胞及星狀神經膠質細胞活動以及SNCA沉積，及/或胞泌體(神經元的或其他的)內的SNCA mRNA/蛋白質之量級。
抑制可藉由此等變量之一者或多者之絕對量級或與對照量級相比之相對量級的下降而評估。該對照量級可係該領域中使用之任意類型之對照量級，例如給藥前之基線量級，或從未治療或經對照物(例如，僅含緩衝劑之對照物或非活性劑之對照物)治療之類似之受試者、細胞或樣品測得之量級。
於本揭露之方法的一些態樣中，SNCA基因之表現被抑制至少20%、30%、40%，視需要至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%，或被抑制到低於該檢定之檢出量級。於某些態樣中，該等方法包括對SNCA之表現的臨床相關抑制，例如，如藉由在用藥劑治療受試者以降低SNCA之表現後的臨床相關結果所表明。
對於SNCA基因之表現的抑制可體現為由第一細胞或細胞群組(此類細胞可能存在於，舉例而言，源自受試者之樣品中)所表現的mRNA之量降低，SNCA基因係於該細胞中轉錄，且該細胞已經過治療(例如，藉由使該細胞或細胞群組與本揭露之RNAi劑接觸，或藉由向其體內存在該等細胞之受試者投予本揭露之RNAi劑)，使得相較於第二細胞或細胞群組，SNCA基因係經抑制，該第二細胞或細胞群組實質上與第一細胞或細胞群組相同但未經如此治療(未用RNAi劑治療或未用靶向所關注之基因的RNAi劑治療的對照細胞)。抑制之程度可藉由下述術語表現：
Figure 112112698-A0202-12-0192-131
於其他態樣中，對於SNCA基因之表現的抑制可在與SNCA基因表現功能性地關聯之參數(例如，SNCA蛋白表現)降低方面評估。SNCA基因緘默化可以在任意表現SNCA之細胞內且藉由本領域中已知的任意檢定確定，該細胞與表現構建體或為內源性或為異源性。
對於SNCA蛋白之表現的抑制可體現為由細胞或細胞群組所表現之SNCA蛋白含量(例如，源自受試者之樣品中表現的蛋白質量級)降低。如上所 述，為了評估mRNA阻抑，經治療之細胞或細胞群組中之蛋白質表現量級的抑制可類似地表現為相對於對照細胞或細胞群組內蛋白質含量的百分比。
可用於評估對於SNCA基因之表現的抑制的對照細胞或細胞群組包括尚未與本揭露之RNAi劑接觸的細胞或細胞群組。舉例而言，對照細胞或細胞群組可在用RNAi劑治療受試者(例如，人類或動物受試者)之前源自該受試者。
由細胞或細胞群組表現的SNCA mRNA含量可使用本領域中已知用於評估mRNA表現的任何方法測定。於一個態樣中，樣品中SNCA表現量級係藉由偵檢經轉錄之多核苷酸或其部分(例如，SNCA基因之mRNA)來測定。RNA可使用RNA提取技術從細胞提取，該等技術包括，舉例而言，使用酸苯酚/異硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland)。使用核糖核酸雜交的典型檢定格式包括核連綴轉錄檢定(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNase保護檢定、北方印漬術、原位雜交及微陣列分析。循環SNCA mRNA可使用WO2012/177906中揭示之方法偵檢，該專利之整體內容藉由引用併入本文。
於一些態樣中，SNCA之表現量級係使用核酸探針測定。如本文中所用，術語「探針」指代能夠選擇性地結合至特定SNCA核酸或蛋白質或其片段的任意分子。探針可由本領域熟練人士合成，或源自適宜之生物製劑。探針可特異性地設計為經標記。可用作探針之分子的示例包括但不限於，RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
單離mRNA可用於雜交或擴增檢定中，該等檢定包括但不限於，南方或北方分析、聚合酶連鎖反應(PCR)分析及探針檢定。一種用於測定mRNA含量的方法涉及使單離mRNA與可雜交至SNCA mRNA的分子(探針)接觸。於 一個態樣中，mRNA係經固定在固體表面並與探針接觸，舉例而言，藉由使單離mRNA在瓊脂糖凝膠電泳並將該mRNA從凝膠轉移到膜諸如硝基纖維素來進行。於替代性態樣中，探針係經固定在固體表面，且使mRNA與探針接觸，舉例而言，在Affymetrix®基因晶片陣列中。熟練技術人員可輕易調整已知mRNA偵檢方法以用於測定SNCA mRNA之含量。
用於測定樣品中SNCA之表現量級的替代性方法涉及舉例而言樣品中之mRNA的核酸擴增或逆轉錄酶過程(以製備cDNA)，例如，藉由RT-PCR(實驗態樣詳述於Mullis,1987，美國專利第4,683,202號中)、連接酶連鎖反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)、自持續序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β複製酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環複製(olling circle replication)(Lizardi et al.，美國專利第5,854,033號)或任何其他核酸擴增方法，然後使用本領域熟練人士習知之技術對經擴增之分子進行偵檢。此等偵檢方案尤其有用於偵檢核酸分子，如果此類分子係以非常低的數量存在。在本揭露之特定方面，SNCA表現之量級係藉由定量螢光RT-PCR(亦即，TaqManTM系統)，藉由Dual-Glo®螢光素酶檢定或藉由其他本領域公認之用於量測SNCA表現量級或mRNA含量的方法測定。
SNCA mRNA之表現量級可使用膜印漬(諸如在雜交分子中使用者，諸如北方、南方、斑點等)或微孔、樣品管、凝膠、珠或纖維(或包含經結合之核酸的任何固體支撐物)監測。參見美國專利第5,770,722號、第5,874,219號、第5,744,305號、第5,677,195號及第5,445,934號，其等藉由引用併入本文。SNCA表現量級的測定亦可包含使用溶液中的核酸探針。
於一些態樣中，mRNA表現之量級係使用支鏈DNA(bDNA)檢定或實時PCR(qPCR)評估。該PCR方法之使用係揭示並例示於本文呈現之實施例中。此類方法亦可用於偵檢SNCA核酸。
SNCA蛋白表現之量級可使用本領域中已知用於量測蛋白質含量的任意方法測定。此類方法包括，舉例而言，電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析、流體或凝膠沉澱素反應、吸收光譜、比色檢定、分光光度檢定、流式細胞分析技術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、西方印漬、放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISAs)、免疫螢光檢定、電化學發光檢定等。此類檢定亦可用於偵檢指示SNCA蛋白之存在及複製的蛋白質。
於一些態樣中，本揭露之方法在治療SNCA相關疾病中的效力係藉由SNCA mRNA含量之減少來評估(例如，藉由評估CSF樣品的SNCA量級，藉由腦生檢或其他方式)。
於本揭露之方法的一些態樣中，該RNAi劑係向受試者投予，使得該RNAi劑經輸送至該受試者體內之特定位點。SNCA之表現的抑制可使用源自來自受試者體內特定位點(例如，CNS細胞)之樣品中SNCA mRNA或SNCA蛋白之量級或量級變化的測量值來評估。於某些態樣中，該等方法包括對SNCA之表現的臨床相關抑制，例如，如藉由在用藥劑治療受試者以降低SNCA之表現後的臨床相關結果所表明。
如本文中所用，術語偵檢或測定分析物之含量係理解為意指實施步驟以確定物質例如蛋白質、RNA是否存在。如本文所用，偵檢或測定包括對低於所使用之方法之檢出量級的分析物含量的偵檢或測定。
IX.治療或預防SNCA相關神經退化性疾病之方法
本揭露亦提供使用本揭露之RNAi劑或含有本揭露RNAi劑之組成物以降低及/或抑制細胞中SNCA表現之量級。該等方法包括向使該細胞與本揭露之dsRNA接觸並且將該細胞維持足以獲得SNCA基因之mRNA轉錄本之降解的時間，從而抑制該細胞內SNCA基因之表現。基因表現之減低可藉由該領域中已知之任意方法評估。舉例而言，SNCA表現之減低可藉由使用對於具有該領域通常技術之人士為常規之方法如北方印漬法、qRT-PCR來測定SNCA之mRNA表現量級而測定；或藉由使用對於具有該領域通常技術之人士為常規之方法如西方印漬法、免疫學技術及質譜法來測定SNCA之蛋白質量級而測定。
於本揭露之方法中，細胞可在活體內或活體外接觸，亦即，細胞可處於受試者體內。
適用於使用本揭露之方法治療的細胞可係表現SNCA基因之任何細胞。適用於本揭露之方法的細胞可係哺乳動物細胞，例如，靈長動物細胞(諸如人類細胞或非人類靈長動物細胞，例如，猴細胞或黑猩猩細胞)、非靈長動物細胞(諸如大鼠細胞或小鼠細胞)。於一個態樣中，該細胞係人類細胞，例如，人類CNS細胞。
於某些態樣中，該細胞中之SNCA表現被抑制至少30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或約100%，亦即，被抑制到低於檢出量級。於較佳之態樣中，SNCA表現經抑制至少50%。
本揭露之活體內方法可包括對受試者投予含有RNAi劑之組成物，其中該RNAi劑包括與待治療之哺乳動物之SNCA基因之RNA轉錄本之至 少一部分互補的核苷酸序列。當待治療之生物體係哺乳動物例如人類時，該組成物可藉由該領域中已知之任意手段投予，該等手段包括但不限於，CNS定向及/或顱內(例如，腦室內、腦實質內及鞘內)、口服、腹腔內或其他腸胃外路徑，包括靜脈內、肌肉內、玻璃體內、皮下、透皮、氣管(氣溶膠)、鼻內、直腸內及外用(包括頰腔及舌下)投予。於某些態樣中，該組成物係藉由鞘內輸注或注射投予。
於一些態樣中，該投予係經由積存注射進行。積存注射可在延長之時間段內以一致之途徑釋放RNAi劑。因此，積存注射可減低獲得所欲效果如所欲之SNCA抑制或治療性或預防性效果所需之給藥頻次。積存注射亦可提供更為一致之血清濃度。積存注射可包括鞘內注射、皮下注射或肌肉注射。
於一些態樣中，該投予係經由泵進行。該泵可係外部泵或經外科手術植入之泵。於另一態樣中，該泵為經皮下植入之滲透泵。於其他態樣中，該泵為輸液泵。輸液泵可用於顱內、靜脈內、皮下、動脈內或硬膜內輸液。於較佳態樣中，該輸注泵為經外科手術植入之將RNAi劑輸送至CNS的泵。
可基於局部治療或全身性治療是否係所欲者並基於待治療之面積而選擇投予模式。可選擇投予之路徑及位點以增強靶向性。
一方面，本揭露亦提供抑制SNCA基因在哺乳動物中之表現的方法。該等方法包括向該哺乳動物投予包含靶向該哺乳動物體內細胞中之SNCA基因之dsRNA的組成物並且將哺乳動物維持足以獲得SNCA基因之mRNA轉錄本之降解的時間，從而抑制該細胞內SNCA基因之表現。基因表現之降低可藉由該領域中已知之任意方法及藉由本文中揭示之方法例如qRT-PCR評估。蛋白質生產之降低可藉由該領域中已知之任意方法及藉由本文中揭示之方法例如 ELISA評估。於一個態樣中，CNS生檢樣品或腦脊液(CSF)樣品充當組織殘留用於監測SNCA基因或蛋白質表現(或其指標)的降低。
本揭露復提供在有此需要之受試者中進行治療的方法。本揭露之治療方法包括向受試者，例如將會受益於SNCA表現降低的受試者，投予本揭露之iRNA劑，其形式為治療有效量的靶向SNCA基因之RNAi劑或包含靶向SNCA基因之RNAi劑的醫藥組成物。
此外，本揭露提供預防、治療或抑制SNCA相關神經退化性疾病或病症之進展的方法，該疾病諸如突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
該等方法包括向受試者投予治療有效量的本文所提供之任意RNAi劑(例如，dsRNA劑)或醫藥組成物，從而預防、治療或抑制受試者的SNCA相關神經退化性疾病之進展。
本揭露之RNAi劑可作為「游離RNAi劑」投予。游離RNAi劑係在醫藥組成物不存在下投予。裸RNAi劑可處於合適之緩衝溶液中。該緩衝溶液可包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。 於一個態樣中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有RNAi劑之緩衝溶液之pH及滲透壓可經調節，使得其適用於向受試者投予。
或者，本揭露之RNAi劑可作為醫藥組成物投予，例如作為dsRNA脂質體配製物投予。
將會受益於SNCA基因表現之降低或抑制的受試者為彼等患有SNCA相關神經退化性疾病者。
本揭露復提供使用RNAi劑或其醫藥組成物例如用於治療將會受益於SNCA表現降低或抑制之受試者，例如，患有SNCA相關神經退化性病症之受試者的方法及用途，其係與其他藥品或其他治療方法合用，例如，與已知之藥品或已知之治療方法諸如舉例而言彼等當下用於治療此等病症者合用。舉例而言，於某些態樣中，靶向SNCA之RNAi劑係與例如本文他處所揭示或本領域中其他已知之有用於治療SNCA相關神經退化性病症的劑合用。舉例而言，適用於治療將會受益於SNCA表現降低之受試者，例如，患有SNCA相關神經退化性病症之受試者的其他劑及治療可包括當前用於治療SNCA相關疾病之症候的藥劑。該RNAi劑及額外治療劑可同時投予及/或在同一組合中投予，例如鞘內腔投予，或該額外治療劑可作為獨立組成物之一部分或在獨立之時間或藉由該領域中已知或本文中揭示之另一方法投予。
示例性額外治療劑及治療包括多巴胺調節劑等，例如，碳度巴-左旋多巴、左旋多巴、恩他卡朋(entacopone)、托卡朋(tolcapone)、阿片哌酮(opicapone)、普拉克索(pramipexole)、羅平尼咯(ropinirole)、阿朴嗎啡、羅替戈汀(rotigotine)、司立吉林(selegiline)、雷沙吉蘭(rasagiline)、沙芬醯胺(safinamide)、金剛烷胺、伊曲茶鹼(istradefylline)、苯海索(trihexyphenidyl)、苯脫品(benztropine)、 利伐斯的明(rivastigmine)、多奈哌齊(donepezil)、加蘭他敏(galantamine)及美金剛，以及物理、職業及言語療法，包括心肺、耐力、柔韌性及步態與平衡訓練之訓練程序，以及涉及將電極植入腦之靶向區域的深層腦刺激(DBS)。
於一個態樣中，該方法包括投予本文提出之組成物使得標靶SNCA基因之表現減少持續至少一個月。於某些態樣中，表現係減少至少2個月、3個月或6個月。
視需要，可用於本文提出之方法及組成物的RNAi劑特異性地靶向標靶SNCA基因之RNA(原生或經處理的)。使用RNAi劑抑制此等基因之表現的組成物及方法可如本文中所揭示者製備及實施。
根據本揭露之方法投予dsRNA可導致患有SNCA相關神經退化性病症之患者體內此等疾病或病變之嚴重性、跡象、症候或標記之降低。該語境中，「降低」意為此量級/含量之統計學顯著或臨床顯著的減少。該降低可係，舉例而言，至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或約100%。
疾病之治療或預防的效力可藉由下述評估，舉例而言，量測疾病進展、疾病緩解、症候嚴重性、疼痛之減低、生命品質、持續治療效果所需之藥物劑量、疾病標記或任意適用於給定之待治療疾病或預防之靶向的其他可量測之參數。藉由量測此類參數之任一者或參數之任意組合而監測治療或預防之效率，係完全處於熟悉該領域之人士的能力範圍內。舉例而言，治療SNCA相關神經退化性病症之功效可舉例而言藉由週期性監測受試者之認知、學習或記憶來評估。將後來之讀數與最初之讀數比較，係對醫師提供治療是否有效之指示。藉由量測此類參數之任一者或參數之任意組合而監測治療或預防之效率，係完 全處於熟悉該領域之人士的能力範圍內。與靶向SNCA之RNAi劑或其醫藥組成物之投予相關聯，「有效對抗」SNCA相關神經退化性病症指示，以臨床上適宜之模式投予在至少統計學顯著分數之患者中導致有益效果，例如症候之改善、治愈、疾病之減低、生命延長、生命品質之改善、或其他通常被熟悉治療SNCA相關神經退化性病症及相關肇因之醫生認為積極的效果。
當疾病狀態之一個或多個參數存在統計學顯著之改善時，或預期會惡化或發展出症候者沒有惡化或發展出症候時，係證明治療性或預防性效果。作為實例，可量測之疾病參數之至少10%且視需要為至少20%、30%、40%、50%或更高的有利改變，可係有效治療之指示。給定RNAi劑藥物或該藥物之配製物的效力亦可使用該領域中已知之用於給定疾病之實驗動物模型來判斷。當使用試驗動物模型時，當觀察到標記或症候的顯著降低時，證明治療之效力。
或者，該效力可藉由疾病嚴重程度降低來量測，如藉由診斷領域熟練人士基於臨床上接受的疾病嚴重程度分級量表所確定。使用適宜量表量測的任何導致例如疾病嚴重程度下降的積極變化，表示使用本文所揭示之RNAi劑或RNAi劑配製物的充分治療。
可向受試者投予治療量之dsRNA，諸如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
該RNAi劑可定期地經由玻璃體內注射或藉由歷經一段時間靜脈輸液而經鞘內投予。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之投予頻次可降低。投予該RNAi劑可將例如患者之細胞、組織、血液、CSF樣品或其他腔室中的SNCA量級降低至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70,% 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或至少約99%或更多。於較佳之態樣 中，投予該RNAi劑可將例如該患者之細胞、組織、血液、CSF樣品或其它腔室中的SNCA量級降低至少50%。
於投予全劑量之RNAi劑之前，可對患者投予較小之劑量諸如5%輸液反應，並監測副作用如過敏反應。於另一實例中，可監測患者之非所欲之免疫刺激效應如增加之細胞因子(例如，TNF-α或INF-α)量級。
一次或多次注射可用來將所欲之劑量，例如，每月劑量的RNAi劑輸送至受試者。該注射可在一段時間內重複實施。該投予可定期重複實施。於某些態樣中，於初始之治療方案後，該治療之投予頻次可降低。重複劑量方案可包括規則地投予治療量之RNAi劑，諸如每月一次或延伸至每個季度一次、每年兩次、每年一次。於某些態樣中，RNAi劑係約每個月投予一次到約每個季度投予一次(亦即，約每三個月投予一次)。
除非另做定義，否則本文中使用之所有科技術語具有與具有本發明所屬領域通常知識之人士所一般理解者相同之意。儘管在本發明提出之RNAi劑及方法之實踐或測試中可使用與本文中揭示之方法及材料類似或等效者，但適宜之方法及材料係揭示於下。本文中述及之所有出版物、專利申請案及其他參考文獻係藉由引用以其整體併入本文。若有矛盾之處，則以包括定義在內之本說明書為準。此外，材料、方法及實施例係僅做例示性說明之用而非意圖限制。
非正式序列表亦與本文一起提交並形成如所提交的說明書之一部分。
實施例
實施例1：材料及方法
生物資訊學
一組以人類突觸核蛋白α基因(SNCA；人類NCBI refseq ID NM_007308.3；NCBI GeneID：6622；SEQ ID NO：1)以及來自食蟹獼猴之毒性物種SNCA(XM_005555422.2；SEQ ID NO：3)異種同源物為標靶的siRNA係使用自定義R及Python腳本設計。全部siRNA經設計為具有與人類SNCA轉錄本之完美匹配，且子集係與食蟹獼猴異種同源物完美匹配或接近完美匹配。人類SNCA NM_007308 REFSEQ mRNA，版本3(SEQ ID NO：1)，係具有3312個鹼基之長度。用於一組siRNA設計之基本原理及方法係如下。使用衍生自對來自以多樣化之脊椎動物基因為靶向之數千個截然不同之siRNA設計之mRNA減弱之直接量測的隨機森林模型，確定從位置10至末端之每一個潛在23mer siRNA的預設效力。對於該siRNA之每一股，係在窮舉搜索中使用自定義Python腳本來量測該siRNA與人類轉錄組中全部潛在對準間之誤配的數目及位置。對此處定義為反義寡核苷酸之位置2至9的種子區域內的誤配、以及此處定義為反義寡核苷酸之位置10至12的裂解位點內的誤配，係給出超權重。對於種子誤配、裂解位點、及其它上至反義股位置19之位置，誤配之相對權重係2.8、1.2、1。忽略位於第一位置之誤配。藉由將每一加權誤配之值相加而計算每一股之特異性得分。對於其反義股在人類i食蟹獼猴中之得分>=2且預設效率為>=50%減弱的siRNA，係給出優先性。
活體外篩選-Dual-Glo®螢光素酶檢定
使Cos-7細胞(ATCC，Manassas,VA)在37℃於5% CO2氣氛中在補充有10% FBS的DMEM(ATCC)中生長至接近融合，之後藉由胰蛋白酶解作用從板中釋放。以10nM及0.1nM進行多劑量實驗。用含有3'未轉譯區域(UTR)之質體進行siRNA及psiCHECK2-SNCAs(人類NM_007308及小鼠NM_009221)質體轉染。轉染藉由下述進行：添加每孔5μL的siRNA雙鏈體及5μL(5ng)的psiCHECK2質體以及每孔4.9μL的Opti-MEM加0.1μL的LipofectamineTM 2000(Invitrogen，Carlsbad CA.cat# 13778-150)，然後於室溫溫育15分鐘。然後，將混合物添加至細胞中，該細胞係重新懸浮在35μL之新鮮完全培養基中。經轉染之細胞於37℃在5% CO2氣氛下溫育。
siRNA及psiCHECK2質體經轉染48小時後，量測螢火蟲螢光素酶(轉染對照)及海腎(Renilla)螢光素酶(融合至SNCA標靶序列)。首先，自細胞中去除培養基。然後，藉由向各孔添加20μL Dual-Glo®螢光素酶試劑與20μL DMEM之混合物來量測螢火蟲螢光素酶活性。將混合物在室溫下溫育30分鐘，然後在Spectramax(Molecular Devices)上量測螢光(500nm)以偵測螢火蟲螢光素酶訊號。藉由向各孔添加20μL之室溫Dual-Glo® Stop & Glo®緩衝液與0.1μL Dual-Glo® Stop & Glo®受質之混合物來量測海腎螢光素酶活性，並將平盤溫育10至15分鐘，然後再次量測螢光以確定海腎螢光素酶訊號。Dual-Glo® Stop & Glo®混合物淬滅螢火蟲螢光素酶訊號而令海腎螢光素酶反應持續發出螢光。藉由將各孔內的海腎(SNCA)訊號歸一化之螢火蟲(對照)訊號來確定siRNA活性。然後，相對於用相同載體轉染但未經siRNA處理或經非靶向siRNA處理的細胞，評估siRNA活性之振幅。全部轉染係使用n=4進行。
活體外篩選-細胞培養及轉染
藉由下述者轉染細胞：於384孔板中，將4.9μL之Opti-MEM加上0.1μL之RNAiMAX每孔(Invitrogen,Carlsbad CA.cat# 13778-150)加至5μL之siRNA雙鏈體每孔中，且每一siRNA雙鏈體係存在4組複本，以及在室溫溫育15分鐘。隨後，將含有~5x103個細胞的40μL之培養基添加至siRNA混合物中。在RNA純化之前，將細胞溫育24小時。實驗係以10nM、1nM及0.1nM以及用PBS對照進行。轉染實驗係於具有EMEM(ATCC目錄號30-2003)之人類肝細胞瘤Hep3B細胞(ATCC HB-8064)、具有EMEM培養基之小鼠神經母細胞瘤Neuro-2A細胞(ATCC CCL-131)以及人類神經母細胞瘤BE(2)-C細胞、HeLa細胞及B16-F10細胞中進行。BE(2)-C細胞(ATCC CRL-2268)係於EMEM：F12培養基(Gibco目錄號11765054)中生長。HeLa細胞B及16-F10細胞係根據標準方案生長。
活體外篩選-使用ABI高通量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA，Cat #4368813)進行cDNA合成
將12μL之含有1.2μL 10X緩衝液、0.48μL 25X dNTPs、1.2μL 10x隨機引子、0.6μL逆轉錄酶、0.6μL Rnase抑制劑及6.6μL H2O每反應之預混液加至上述結合單離之RNA的微珠中。將板密封、混合、並在電磁培養箱中於室溫溫育10分鐘，之後於37℃溫育2h。分支DNA檢定亦使用前述方案進行。
活體外篩選-實時PCR
在384孔板(Roche目錄號04887301001)中之各孔中，將2μL之cDNA添加至含有0.5μL之人類或小鼠GAPDH TaqMan探針(ThermoFisher cat 4352934E或4351309)及0.5μL之適宜SNCA探針(例如，Thermo Fisher Taqman人類： Hs00268077，小鼠：Mm00485946)的預混液及5μL Lightcycler 480探針預混液(Roche Cat# 04887301001)。實時PCR係於LightCycler480實時PCR系統(Roche)中進行。每一雙鏈體以N=4測試，且資料係歸一化至使用非靶向對照siRNA轉染之細胞。為了計算相對倍數改變，係使用△△Ct方法分析資料並將該資料歸一化為使用以非靶向對照siRNA轉染之細胞實施的檢定。
實施例2：鑑定潛在候選siRNA以適用於CNS定向用途
先前進行了活性SNCA-靶向siRNA(雙鏈體)的活體外及活體內篩選，並且鑑定了SNCA基因(mRNA標靶)中的大量減弱「熱點」。356中雙鏈體初始經歷跨各種細胞類型(包括人類BE(2)-C神經母細胞瘤細胞、人類HeLa上皮細胞、B16-F10小鼠上皮細胞)以及在COS-7非洲綠猴纖維母細胞樣細胞中的雙重螢光素酶報告系統中的活體外篩選。示例性3'UTR SNCA-靶向RNAi劑AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634、AD-464779及編碼序列(CD)SNCA-靶向RNAi劑AD-464314、AD-464313、AD-464590、AD-464585、AD-464229、AD-464586及AD-464592係分別在BE(2)-C細胞及COS-7細胞雙重螢光素酶報告系統中以10nM濃度評定(圖1A)，其中全部此類雙鏈體皆顯示之至少一種活體外系統中的顯著減弱(例如，>50% SNCA mRNA降低)。觀察到針對SNCA減弱的主要有效雙鏈體在3'UTR區域中出現。隨後，針對肝臟SNCA減弱，於過表現人類SNCA-AAV之小鼠中檢定12種所指示之雙鏈體(3'UTR-靶向siRNA：AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634、AD-464779；編碼序列-靶向siRNA：AD-464314、AD-464313、AD-464590、AD-464585、AD-464229、AD-464586及AD-464592)。對於所測試的各種siRNA，包括全部3'UTR-靶向雙鏈體(AD-464778、AD-464782、AD-464694、AD-464634及AD-464779)，並且特定而言對 於編碼序列-靶向AD-464314及AD-464229雙鏈體，觀察到了肝臟SNCA量級的強勁活體內減弱(圖1B)。觀察到活體外細胞株篩選與活體內肝臟AAV小鼠肝臟資料良好相關。
前40種最有效的SNCA-靶向siRNA係從活體外熱點與結構關係(SAR)評定中鑑定，該等評定係針對所測試的各肝臟定向(GalNAc修飾的)雙鏈體跨0.1nM、1nM及10nM之濃度範圍進行，並且亦對SNCA-靶向雙鏈體進行RNAseq測定，以鑑定選定數目之SNCA-靶向siRNA，從而進行進一步之活體內評定及適應於CNS-靶向siRNA(包括本揭露之siRNA)。詳而言，當選擇彼等在0.1nM下展現自高之減弱量級者及展示明確之線性劑量反應者時，SNCA-靶向siRNA AD-1548851.1、AD-1548854.1、AD-1548869.1、AD-1548870.1、AD-1548884.1、AD-1548886.1、AD-1549052.1、AD-1549054.1、AD-1549245.1、AD-1549266.1、AD-1549267.1、AD-1549269.1、AD-1549272.1、AD-1549283.1、AD-1549284.1、AD-1549285.1、AD-1549290.1、AD-1549333.1、AD-1549334.1、AD-1549351.1、AD-1549354.1、AD-1549357.1、AD-1549359.1、AD-1549397.1、AD-1549401.1、AD-1549403.1、AD-1549406.1、AD-1549407.1、AD-1549439.1、AD-1549518.1、AD-1549525.1、AD-1549628.1、AD-1549641.1、AD-1571164.1、AD-1571187.1、AD-1571188.1、AD-1571191.1、AD-1571193.1、AD-1571194.1及AD-1571262.1為經鑑定為具有最高效力的四十種雙鏈體(圖2)。
僅兩種所測試的雙鏈體(AD-1549525.1及AD-1549628.1)展現顯著之脫靶效應，亦即，超越log2倍數變化之脫靶基因變化。
基於上揭結果，選擇17種雙鏈體用於活體內用途的進一步評估(包括經由AAV向模型小鼠投予)。五種所選擇之雙鏈體(AD-1549052.1、 AD1549054.1、AD-1548886.1、AD-1548884.1及AD-1549245.1)靶向SNCA中之編碼序列(CD)，而剩餘12種所選擇之雙鏈體(AD-1549359.1、AD-1549333.1、AD-1549407.1、AD-1548854.1、AD-1549283.1、AD-1549267.1、AD-1548869.1、AD-1571164.1、AD-1549354.1、AD-1571188.1、AD-1549401.1及AD-1549290.1)靶向SNCA中之UTR序列。所選擇的雙鏈體為UTR-靶向雙鏈體AD-1549290.1(圖3)。表4提供用於任何個別雙鏈體的SNCA mRNA內之靶向位置(進一步注意：SNCA mRNA內之CD跨越核苷酸位置226至648，其中SNCA外顯子1跨越SNCA mRNA核苷酸殘基1至200，SNCA外顯子2跨越SNCA mRNA核苷酸殘基201至346，SNCA外顯子3跨越SNCA mRNA核苷酸殘基347至388，SNCA外顯子4跨越SNCA mRNA核苷酸殘基389至531，SNCA外顯子5跨越SNCA mRNA核苷酸殘基532至615，並且SNCA外顯子6跨越SNCA mRNA核苷酸殘基616至3177)。
實施例3：候選SNCA-靶向RNAi劑之活體內評估鑑定出三種適應於CNS定向用途的候選先導化合物
初始17種經選擇之雙鏈體係於活體內研究中評估，其中人類SNCA係經由腺相關病毒(AAV)投予且於小鼠中表現數天，然後投予SNCA-靶向siRNA。減弱係於siRNA投予後7至14天評定(對於siRNA減弱，10天係鑑定為最優)。首次驗證了藉由AAV在小鼠肝臟中的人類SNCA表現(圖4，左圖，其中循環閾值係用於檢測在第7、14及21天於小鼠肝臟中的以劑量反應方式的AAV媒介之SNCA表現)。先前所揭之SNCA-靶向雙鏈體AD-464634(3' UTR-靶向)及AD-464314(編碼序列-靶向)係各自經鑑定為以所評定的3mpk及10mpk兩個量，在7天及17天兩個時間點皆展現強勁之SNCA減弱(圖4，右圖)。隨後對17種所 選擇之雙鏈體針對hSNCA AAV轉染之小鼠的肝臟組織中的活體內SNCA減弱進行測試，並且大多數所測試之雙鏈體顯露強勁之活體內hSNCA減弱(圖5A)。特定而言，雙鏈體AD-1549052.3(CD-靶向)、AD-1549359.3(UTR-靶向)、AD-1549054.3(CD-靶向)、AD-1549333.3(UTR-靶向)、AD-1746467.2(UTR-靶向，具有有義股寡核苷酸A-3227795 5'-gscsagugauUfGfAfagua(Uhd)cuguaL96-3'(SEQ ID NO：263)、反義股寡核苷酸A-2861991 5'-VPusdAscadGadTacuudCaAfucacugcsusg-3'(SEQ ID NO：264)、對應的未經修飾之有義股寡核苷酸5'-GCAGUGAUUGAAGUAUCUGUA-3'(SEQ ID NO：265)及對應的未經修飾之反義股寡核苷酸序列5'-UACAGATACUUCAAUCACUGCUG-3'(SEQ ID NO：266)，其中CNS定向之雙鏈體具有有義股寡核苷酸5'-gscsagugauUfGfAfagua(Uhd)cugsusa-3'(SEQ ID NO：267)及反義股寡核苷酸SEQ ID NO：264)、AD-1746465.2(UTR-靶向)、AD-1571188.3(UTR-靶向)、AD-1549401.3(UTR-靶向)、AD-1548886.3(CD-靶向)及AD-1746466.2(UTR-靶向)，各自於hSNCAAAV轉染之小鼠的肝臟組織中展現強勁之hSNCA減弱。此等siRNA中之七者，AD-1549054.3、AD-1549333.3、AD-1746465.2、AD-1571188.3、AD-1549401.3、AD-1548886.3及AD-1746466.2，係經選擇用於進一步評估。於肝臟測試之形式中，此等雙鏈體中之各者荷有GalNAc及C16修飾兩者(圖5B)；惟，預期去除GalNAc部分以使此等雙鏈體適應CNS靶向。
活體內SNCA減弱、活體外SNCA減弱及RNAseq結果之其他回顧導致選擇一組較佳之三種SNCA-靶向siRNA，亦即，AD-1549333(3' UTR-靶向)、AD-1746465(3' UTR-靶向)及AD-1549054(CD-靶向)，用於進一步活體內評估，包括非人類靈長動物(NHP)研究(圖6A)。該選擇包括一種編碼序列靶向反- SNCA siRNA及兩種UTR-靶向siRNA(圖6B)，其各自展現於3mg/kg投予時的高活體內減弱活性並且包括位於反義股之位置6或位置16的C16修飾(一種先前研究業經去風險之化學法；圖6C)。此等三種雙鏈體，AD-1549333、AD-1746465及AD-1549054，藉由從有義股去除3'末端三觸角GalNAc且包含定位在有義股之3'末端倒數第一個及倒數第二個核苷酸間鍵聯處的兩個附加硫代磷酸酯修飾，係各自經調適用於CNS定向輸送，如表2中所示，以分別導致先導雙鏈體AD-1747585(具有親本雙鏈體AD-1549333)、AD-1747583(具有親本雙鏈體AD-1746465)及AD-1747580(具有親本雙鏈體AD-1549054)(圖7)。
實施例4：於非人類靈長動物(NHP)中的候選先導化合物功效及安全性之評估
於囓齒動物活體內AAV篩選中經鑑定為前三種先導候選CNS定序SNCA-靶向siRNA，亦即AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585，係經選自用於評估於非人類靈長動物(NHP)中之藥物動力學(PK)及藥效學(PD)特性以及評定任何脫靶效應及毒性評估(參照圖8A關於所選擇之雙鏈體的初始囓齒動物活體內減弱資料；所選擇之雙鏈體AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585係各自標註為可與食蟹獼猴(Macaca fascicularis)突觸核蛋白α(SNCA)、轉錄本變異體X2、mRNA(XM_005555422.3)交叉反應，靶向下列位置：AD-1747580靶向XM_005555422.3中之核苷酸257至279；AD-1747583靶向XM_005555422.3中之核苷酸506至528；並且AD-1747585靶向XM_005555422.3中之核苷酸556至578)。對於該等三種SNCA-靶向siRNA之PK/PD研究，研究設計係分配為於平行動物組上進行的29天及84天時程。對於29天研究(設計為提供關於效力之資訊並且可用於進一步雙鏈體選擇及/或在較早時間點之潛在實驗修改)，向三隻 對照動物給藥人工腦脊液(aCSF)，同時向第二組動物(n=5)投予單一60mg劑量之第一先導候選siRNA(AD-1747580)，向第三組動物(n=5)投予單一60mg劑量之第二先導候選siRNA(AD-1747583)，並且向第四組動物(n=5)投予單一60mg劑量之第三先導候選siRNA(AD-1747585)。類似地，對於在第84天(經設計為評估持續時間)終止的平行研究，另一組(第5組)三隻對照動物係用人工腦脊液(aCSF)給藥，同時向第六組動物(n=5)投予單一60mg劑量之第一先導候選siRNA(AD-1747580)，向第七組動物(n=5)投予單一60mg劑量之第二先導候選siRNA(AD-1747583)，向第八組動物(n=5)投予單一60mg劑量之第三先導候選siRNA(AD-1747585)。
從各組之NHP收集系列腦脊液(CSF)及血漿樣品用於生物標記分析(包括胞泌體評估)。收集組織用於PK/PD研究，以評估下列之各者中的mRNA及蛋白質量級：CNS組織=皮質、中腦、紋狀體、海馬迴、小腦、腦橋及脊髓；腎臟；肝臟；及心臟。
於第29天實驗NHP動物組的注射時間時的初始觀察結果中，其中每隻NHP動物經由鞘內注射用單一60mg劑量之siRNA給藥，所檢查的全部三種候選先導SNCA-靶向雙鏈體在給藥後的最早24小時時間段內皆顯示跨所給藥之動物的類似之藥物動力學(圖8B)，與已經發生的可再現之給藥相一致並且反映了平台安定性。
當於注射後第29天檢查SNCA減弱時，對於所檢查的三種候選先導SNCA-靶向雙鏈體中之各者，觀察到了於前額葉皮質中SNCA mRNA量級之大於80%減弱以及於中腦中SNCA mRNA量級之大於60%減弱的藥效學(PD)效應(圖9A，左圖)。對於全部三種所測試之雙鏈體，所觀察到的對NHP中SNCA mRNA量級之PD效應與雙鏈體於所檢查的組織中的藥物動力學(PK)分佈相關，如藉由雙鏈體組織濃度之量測所評定。分別針對AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585雙鏈體，計算1.050μg/g、0.532μg/g及1.300μg/g的雙鏈體組織濃度(PK)「劑量-組織SNCA mRNA(PD)反應曲線」IC50值(圖9A，右圖)。儘管此等三種雙鏈體之間的IC50值之計算差異並非統計學顯著，但關於標靶SNCA mRNA減弱的雙鏈體之IC50值排名明確為AD-1747583<AD-1747580<AD-1747585。於投予候選先導雙鏈體AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585的NHP之腦及脊髓組織中，α-突觸核蛋白量級亦顯著降低(圖9B，左圖)。於第29天，於脊髓(胸部)及CSF中觀察到α-突觸核蛋白減弱(顯示於下文之圖13中)，與鞘內給藥途徑一致。於腦組織中，在紋狀體中觀察到較大的α-突觸核蛋白減弱，而關於全部三種候選先導雙鏈體的組織蛋白PK/PD圖(圖9B，右圖)皆比關於SNCA mRNA減弱的相對應之圖(圖9A，右圖)更為分散。前述資料(包括圖10總結)指示，所測試的全部三種雙鏈體(AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585)展現類似的α-突觸核蛋白減弱效力，與小鼠AAV活體內篩選資料及關於NHP投予之mRNA PK/PD曲線兩者一致。
然後，各自投予三種候選先導化合物中之一者的NHP之組於注射後第84天予以評定。在第84天，對於所測試的全部三種雙鏈體(AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585)，於前額葉皮質及中腦兩者中觀察到高效力SNCA mRNA減弱。詳而言，在第84天，跨全部三種雙鏈體，於前額葉皮質中觀察到80%-90%或更多的SNCA mRNA之減弱(圖11，左圖)。於先前在投予後第29天觀察到的結果一致，第84天樣品展現組織PK與mRNAPD之間的良好相關性，具有與針對所檢查的三種候選先導雙鏈體中之各者觀察到的類似的效力(圖11， 右圖)。對於雙鏈體AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585，分別量測到0.985μg/g、0.239μg/g及1.40μg/g的計算IC50值。明顯地，投予AD-1747585的組僅有一隻動物符合給藥準則，這導致該投予AD-1747585的組之剩餘者再次給藥(該組中總計六隻動物經再次給藥，其中僅三隻再次給藥的動物經觀察為業經良好給藥)。
在第84進行的對給藥的NHP的不同腦區之近期檢查表明，在投予後第84天，不同腦區中的SNCA mRNA(圖12A)及α-突觸核蛋白(圖12B)兩者皆顯著降低，並且在所測試的三種候選先導物(AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585雙鏈體)之間觀察到微小差異。在經由鞘內途徑投予60mg之雙鏈體後的第84天，NHP中之SNCA mRNA降低，並且在所測試的三種雙鏈體之間於各種腦區(前額葉、中腦、海馬迴、髓質腦橋、紋狀體尾狀核及小腦)中及脊髓(胸椎)中觀察到類似的效力(圖12A)。在第84天的最大量級之mRNA減弱係於前額葉皮質及海馬迴中觀察到，與在當前平台上經由鞘內途徑投予所分佈的雙鏈體一致。詳而言，於紋狀體及中腦中觀察到SNCA mRNA的>60%減弱，其中一些經良好給藥的動物顯示於此等較深腦區中的至多90%減弱(圖12A)。在第84天，腦及脊髓中的α-突觸核蛋白量級亦降低(其中下列區域全部顯示α-突觸核蛋白量級的顯著降低：前額葉皮質、中腦、胸椎、海馬迴、髓質腦橋、紋狀體尾狀核及小腦；圖12B)，再次在此等三種候選先導雙鏈體之間觀察到微小差異。明顯地，於脊髓(胸部)、前額葉皮質、海馬迴及中腦中觀察到類似、強勁的α-突觸核蛋白降低(圖12B)。對於全部三種分子，亦於髓質腦橋及紋狀體尾狀核中觀察到α-突觸核蛋白之至多75%降低。此等資料表明，全部3種先導物具備類似的效力以及類似的持久性。在第84天，跨不同腦區，α-突觸核蛋白量級展現與SNCA mRNA量級的高相關性(圖12C)，其中對於除髓質腦橋之外的全部腦/脊髓區域，R2值超出0.9，並且展現各腦區中之相關性，達成高量級之統計學顯著。某些NHP經鑑定為在最初投予雙鏈體時錯誤給藥，特此那個溶液，一些業經接受AD-1747585雙鏈體之動物。此類動物經再次給藥並且監測超過第84天(圖12D，上圖及下圖，其中下圖省略與存到錯誤給藥事件相關的資料)。詳而言，在超過第84天檢查的經再次給藥之NHP顯示皮質及中腦組織中的強勁α-突觸核蛋白減弱，而最大幅度的α-突觸核蛋白減弱係於紋狀體(尾狀核)中觀察到，其中於經再次給藥之動物中檢測到超過90%降低的減弱量級(圖12D)。事實上，甚至在兩個給藥時間皆不符合成功給藥策略(當在投予後24小時量測腦脊液(CSF)之量級)的NHP動物在初始雙鏈體投予時亦於紋狀體尾狀核中展現超過90%的減弱量級。明顯地，對於全部三種雙鏈體，組織蛋白質藥效學在所檢查的各種CNS區域中展現類似的概況。當跨延伸的時間進程(其包括再次給藥及在超過第84天時間點檢測)檢查經再次給藥的NHP動物的腦脊液(CSF)中之α-突觸核蛋白量級時，對於用雙鏈體AD-1747585給藥的動物，CSF α-突觸核蛋白量級展現至多75%降低，而對於用AD-1747580及AD-1747583再次給藥的動物，CSF α-突觸核蛋白量級展現至多50%降低(圖12E)。
亦在投予雙鏈體後第84天評定經適當給藥的NHP動物的CSF中之α-突觸核蛋白量級。對於用雙鏈體AD-1747580及AD-1747583給藥的動物，觀察到NHP CSF中的α-突觸核蛋白之量級的至多90%降低(PD效應)(圖13)。用雙鏈體AD-1747585給藥的NHP動物顯示CSF中的約75% α-突觸核蛋白減弱。經雙鏈體AD-1747585再次給藥的動物亦明顯展現可變的CSF α-突觸核蛋 白減弱，可能是由於血液污染，因為SNCA係於血細胞中高度表現。血細胞計數資料可經評定以驗證血液污染是否事實上發生。
於投予雙鏈體後第29天，對於所測試的全部三種先導雙鏈體，經治療之NHP的皮質及中腦僅展現α-突觸核蛋白的最適度之(<60%)減弱(圖14A，左圖)。皮質及中腦中的α-突觸核蛋白之此類適度降低可指示α-突觸核蛋白於此類組織中的延長之半衰期。對於全部三種所測試的雙鏈體，觀察到組織蛋白PK/PD係散佈者(圖14A，中圖)；惟，組織α-突觸核蛋白量級係與組織SNCA mRNA量級高度相關(圖14A，右圖)。當亦檢查CSF中之量級時，在投予後第29天，CSF中之α-突觸核蛋白減弱與皮質(圖14B，左圖)及紋狀體(圖14B，中圖)α-突觸核蛋白減弱相關。事實上，皮質與CSF α-突觸核蛋白減弱量級之相關性係觀察到類似於先前用翻譯寡核苷酸向SNCA於NHP中所見者。相比之下，在投予後第29天，中腦組織α-突觸核蛋白減弱不與CSF α-突觸核蛋白減弱相關(圖14B，右圖)。儘管在投予(此處，SNCA-靶向雙鏈體AD-1747580)後第29天，前額葉皮質及中腦組織中之SNCA mRNA量級降低，但α-突觸核蛋白量級僅適度降低，其指示α-突觸核蛋白之長期蛋白質半衰期似乎解釋該分歧(圖14C)。事實上，第1型過氧化物歧化酶(SOD1)業經評定為在組織中為約28天，並且很明顯α-突觸核蛋白之類似半衰期可用於皮質及中腦組織中。當獲得投予後第84天資料時，進一步證明α-突觸核蛋白半衰期效應可能在投予後第29天造成SNCA mRNA與α-突觸核蛋白減弱結果之間的差異。於此類第84天資料中，對於全部三種先導雙鏈體，經治療之NHP動物的皮質及中腦組織中之α-突觸核蛋白量級展現強勁的減弱(PD效應，圖14D，左圖)。在第84天於皮質及中腦NHP組織中觀察到的強勁的α-突觸核蛋白減弱證實了α-突觸核蛋白之長蛋 白質半衰期。對於全部三種雙鏈體，組織α-突觸核蛋白PK/PD曲線顯示類似的概況(圖14D，中圖；AD-1747585組係標註為僅有一隻動物符合給藥準則，而該組之剩餘者經再次給藥)。在第84天，α-突觸核蛋白量級係與皮質及中腦組織兩者中之mRNA量級高度相關(圖14D，右圖)，與彼等上述在投予後第29天觀察者相反。
在投予雙鏈體後第84天，前額葉皮質及中腦組織α-突觸核蛋白減弱量級亦與α-突觸核蛋白CSF蛋白減弱良好相關(圖15)。皮質與CSF α-突觸核蛋白減弱量級之相關性(R之平方=0.7246，P值=0.0004)甚至優於先前關於反義寡核苷酸靶向SNCA於NHP中所揭示者(R之平方=0.6，P值=0.0089)(Cole et al.JCI Insight(2021),6(5),e135633.doi：10.1172/jci.insight.135633).
亦在投予雙鏈體後第84天，跨腦區檢查siRNA組織曝露。在大多數用此類雙鏈體給藥的動物中，全部三種候選雙鏈體皆顯示良好分佈於所檢查的全部標靶組織內(圖16)。有趣的是，高曝露於siRNA雙鏈體之組織(例如，小腦)不必顯示最高量級的SNCA mRNA及/或α-突觸核蛋白減弱。
為了評定並且最終嘗試減輕給藥候選先導雙鏈體至NHP動物的任何潛在之有害影響，因應於動物之雙鏈體給藥的經給藥動物之體重及CSF中之神經絲輕鏈(NfL)量級係作為此類動物之健康及所測試的雙鏈體對此類動物之潛在毒性的初始指示物，同時亦使用RNA-seq在經給藥的NHP動物中進行對任何顯著脫靶基因影響的基因體評估。與僅用媒液平行給藥的對照NHP動物相比，在投予後第29天或第84天，對於投予至NHP動物的三種候選先導雙鏈體，沒有觀察到對體重的影響(圖17)。對於給藥雙鏈體的NHP動物之CSF中的NfL檢測，儘管對於全部三種雙鏈體皆在給藥後觀察到NfL之短暫加標，此類NfL加 標在很大程度上並未持續超過投予後第29天，這指示該等三種SNCA-靶向候選先導雙鏈體似乎不具有可表明雙鏈體毒性的NfL概況(圖18)。亦獲得RNA-Seq資料並且針對用三種候選先導雙鏈體給藥的細胞進行評估，以鑑定由用各此類雙鏈體給藥所造成的脫靶效應。檢查了三種候選先導雙鏈體中之各者的RNA-Seq資料。對於AD-1747580雙鏈體以及對於親本雙鏈體AD-1549054，SNCA減弱係均勻地強勁並且沒有顯著之脫靶效應(以>50%失調的脫靶基因)以效力匹配之RNA-Seq概況鑑定(圖19A及19B)。與針對AD-1747580雙鏈體獲得的明確RNA-Seq結果相反，針對AD-1747583雙鏈體獲得的RNA-Seq結果表明強勁的SNCA mRNA減弱，其伴隨著經鑑定為以>50%失調的三種基因PYGB、NREP及LCLAT1(圖19C)。對於雙鏈體AD-1747585，強勁的SNCA mRNA減弱伴隨著鑑定為以>50%失調的一種基因HMGB2(圖19D)。從親本雙鏈體去除GalNAc經鑑定為與上靶及脫靶兩者之效力相關。
因此，AD-1747580雙鏈體係經由RNA-Seq鑑定為具備所測試的三種候選先導雙鏈體中之最有利選擇性概況(AD-1747580展現93% SNCA減弱而未檢出脫靶基因失調；AD-1747585展現96% SNCA減弱，具有單一失調的脫靶基因；並且AD-1747583展現92% SNCA減弱，但具有三種失調的脫靶基因)(圖20)。
實施例5：用於巴金森氏症療法之SNCA-靶向雙鏈體
向受試者投予SNCA-靶向雙鏈體以減弱SNCA作為巴金森氏症(PD)療法，特定而言，於具有GBAPD突變(GBA編碼溶酶體酶葡萄糖腦苷脂酶(GCase))或患有散發性PD之受試者中。進行評估以評定將SNCA-靶向雙鏈體投予至受試者 構建針對以腦中之α-突觸核蛋白為特徵之神經退化性疾病的疾病修飾療法的程度(諸如具有GBAPD突變或散發性PD之受試者中的PD)。
非正式序列表及本文所列述之某些「mRNA標靶」的「mRNA」序列可標註為引述胸腺嘧啶(T)殘基而非尿嘧啶(U)殘基。如對於本領域通常技藝者為顯而易見的，此類引述「T」殘基而非「U」殘基的序列可係源自作為「mRNA」序列而列述的NCBI登錄記錄，其係直接對應於mRNA序列的DNA序列(並非RNA序列)。直接對應於mRNA的此類DNA序列技術地構建作為所指示之mRNA的cDNA之補體(互補DNA)的DNA序列。因此，儘管mRNA標靶序列事實上確實包括尿嘧啶(U)而非胸腺嘧啶(T)，但源自NCBI記錄的「mRNA」序列包括胸腺嘧啶(T)殘基而非尿嘧啶(U)殘基。
表1.核苷酸序列呈現中使用之核苷酸單體的縮寫。應理解，當此等單體存在於寡核苷酸中，其係藉由5'-3'-磷酸二酯鍵而相互連接；且應理解，當核苷酸含有2'-氟修飾時，則該氟替換母體核苷酸中該位置之羥基(亦即，其係2'-去氧-2'-氟核苷酸)。亦應理解，當見於3'末端位置時，該等縮寫對應於省略3'-磷酸酯之核苷酸(亦即，其等為3'-OH)。
Figure 112112698-A0202-12-0218-132
Figure 112112698-A0202-12-0219-133
Figure 112112698-A0202-12-0220-134
Figure 112112698-A0202-12-0221-135
Figure 112112698-A0202-12-0222-136
Figure 112112698-A0202-12-0223-137
Figure 112112698-A0202-12-0224-138
Figure 112112698-A0202-12-0225-139
Figure 112112698-A0202-12-0226-140
Figure 112112698-A0202-12-0227-141
Figure 112112698-A0202-12-0228-142
Figure 112112698-A0202-12-0229-143
Figure 112112698-A0202-12-0230-144
Figure 112112698-A0202-12-0231-145
Figure 112112698-A0202-12-0232-146
Figure 112112698-A0202-12-0232-147
Figure 112112698-A0202-12-0233-148
Figure 112112698-A0202-12-0234-149
Figure 112112698-A0202-12-0234-150
Figure 112112698-A0202-12-0235-151
Figure 112112698-A0202-12-0236-152
非正式序列表
SEQ ID NO：1
基因座：NM_007308 3312 bp mRNA線性PRI 31-AUG-2020，定義：智人(Homo sapiens)突觸核蛋白α(SNCA)，轉錄本變異體4，mRNA。版本：NM_007308.3
Figure 112112698-A0202-12-0237-153
Figure 112112698-A0202-12-0238-154
SEQ ID NO：2
SEQ ID NO：1之反向互補序列
Figure 112112698-A0202-12-0238-155
Figure 112112698-A0202-12-0239-156
SEQ ID NO：3
基因座：XM_005555421 2955 bp mRNA線性PRI 25-JAN-2016
定義 預測：食蟹獼猴(Macaca fascicularis)突觸核蛋白α(SNCA)，轉錄本變異體X7，mRNA。
版本：XM_005555421.2
Figure 112112698-A0202-12-0239-157
Figure 112112698-A0202-12-0240-158
SEQ ID NO：4
SEQ ID NO：3之反向互補序列
Figure 112112698-A0202-12-0240-159
Figure 112112698-A0202-12-0241-160
SEQ ID NO：5
基因座：NM_009221 1208 bp mRNA線性ROD 06-SEP-2020
定義：小鼠(Mus musculus)突觸核蛋白α(Snca)，轉錄本變異體2，mRNA。版本：NM_009221.2
Figure 112112698-A0202-12-0241-161
Figure 112112698-A0202-12-0242-162
SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：5之反向互補序列
Figure 112112698-A0202-12-0242-163
SEQ ID NO：7
基因座：NM_019169 1176 bp mRNA線性ROD 23-AUG-2020
定義：大鼠(Rattus norvegicus)突觸核蛋白α(Snca)，mRNA。
版本：NM_019169.2
Figure 112112698-A0202-12-0242-164
Figure 112112698-A0202-12-0243-165
SEQ ID NO：8
SEQ ID NO：7之反向互補序列
Figure 112112698-A0202-12-0243-166
SEQ ID NO：228
基因座：XM_535656 1493 bp mRNA線性MAM 06-JAN-2021
定義 預測：家犬(Canis lupus familiaris)突觸核蛋白α(SNCA)，轉錄本變異體X12，mRNA。
登錄：XM_535656
版本：XM_535656.7
Figure 112112698-A0202-12-0244-167
SEQ ID NO：229
SEQ ID NO：228之反向互補序列
Figure 112112698-A0202-12-0244-168
Figure 112112698-A0202-12-0245-169
等效物
彼等熟悉本領域者將知悉或能夠使用不超過常規實驗查明等效於本文所揭之具體態樣及方法的多種等效物。此類等效物旨在為以下申請專利範圍之範疇所涵蓋。
TW202407100A_112112698_SEQL.xml

Claims (69)

  1. 一種用於抑制SNCA之表現的雙鏈核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA劑包含具有5'-終端及3'-終端之有義股以及具有5'-終端及3'-終端之反義股，其中，該有義股與該反義股形成雙股區域，其中：
    該有義股包含選自由下列所組成之群組的核苷酸序列：表3之SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：164及SEQ ID NO：142至149、151至156、158至163及165至184，具有0或1個誤配；
    該dsRNA劑之該有義股包含接附於自該有義股之5'-終端計數之位置6或16的親脂性部分；
    該反義股包含選自由下列所組成之群組的核苷酸序列：表3之SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：207及SEQ ID NO：185至192、194至199、201至206及208至227，具有0或1個誤配；
    該dsRNA劑不包含GalNAc修飾；以及
    該dsRNA劑包含八個位於自該dsRNA劑之該有義股及反義股各者之相應3'-終端及5'-終端計數的倒數第二個及倒數第一個核苷酸間鍵聯處的硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。
  2. 如請求項1所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分為脂族、脂環族或多脂環族化合物。
  3. 如請求項1或請求項2所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分為脂質、膽固醇、視網酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、 十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)絡膽酸、二甲氧基三苯甲基或啡
    Figure 112112698-A0202-13-0002-112
    。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分含有飽和或不飽和C4-C30烴鏈及選自由下列所組成之群組的視需要含有之官能基：羥基、胺、羧酸、磺酸根、磷酸根、硫醇、疊氮化物及炔。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分含有飽和或不飽和C6-C18烴鏈。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分含有飽和或不飽和C16烴鏈。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分為
    Figure 112112698-A0202-13-0002-170
    其中，B為核苷酸鹼基或核苷酸鹼基類似物，視需要，其中B係選自由下列所組成之群組：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係經由連接子或載劑接附。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係經由載劑接合，該載劑替換該有義股之位置6或16之核苷酸。
  10. 如請求項9所述之dsRNA劑，其中，該載劑為選自由下列所組成之群組的環狀基團：吡咯啶基、吡唑啉基、吡唑啶基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌
    Figure 112112698-A0202-13-0003-121
    基、[1,3]二氧雜環戊基、
    Figure 112112698-A0202-13-0003-122
    唑啶基、異
    Figure 112112698-A0202-13-0003-123
    唑啶基、
    Figure 112112698-A0202-13-0003-124
    啉基、噻唑啶基、異噻唑啶基、喹
    Figure 112112698-A0202-13-0003-125
    啉基、嗒
    Figure 112112698-A0202-13-0003-126
    基、四氫呋喃基及十氫萘基；或為基於絲胺醇主鏈或二乙醇胺主鏈之非環狀部分。
  11. 如請求項1至8中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係經由連接子接合至該dsRNA劑，該連接子含有醚、硫醚、脲、碳酸根、胺、醯胺、馬來亞醯胺-硫醚、二硫醚、磷酸二酯、磺醯胺鏈結、點擊反應之產物或胺基甲酸根。
  12. 如請求項1至8及11中任一項所述之dsRNA劑，其中，該親脂性部分係經由選自由下列所組成之群組的生物可裂解連接子接合至該dsRNA劑：DNA、RNA、二硫醚、醯胺、半乳胺糖的經官能化之單醣或寡醣、葡萄糖胺、半乳糖、甘露糖及其組合。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股之實質上全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之dsRNA劑，其中該，有義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之dsRNA劑，其中，該反義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之dsRNA劑，其中，該有義股之全部核苷酸及該反義股之全部核苷酸為經修飾之核苷酸。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之dsRNA劑，具有一個或多個經修飾繪製核苷酸，以及其中，該一個或多個經修飾之核苷酸中之至少一者係選自由下列所組成之群組：去氧核苷酸、3'-末端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-去氧修飾之核苷酸、鎖定之核苷酸、未鎖定之核苷酸、構形限定之核苷酸、約束之乙基核苷酸、無鹼基之核苷酸、2'-胺基修飾之核苷酸、2'-O-烯丙基修飾之核苷酸、2'-C-烷基修飾之核苷酸、2'-羥基修飾之核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾之核苷酸、2'-O-烷基修飾之核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基之核苷酸、四氫呋喃修飾之核苷酸、1,5-失水己糖醇修飾之核苷酸、環己烯基修飾之核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團之核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基團之核苷酸、包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物之核苷酸、包含乙烯基磷酸酯之核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)之核苷酸、包含胸苷-二醇核苷(GNA)S-異構物之核苷酸、包含2-羥基甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯之核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯之核苷酸、包含2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯之核苷酸、及連接至膽固醇基衍生物及十二烷酸雙癸基醯胺基團之終端核苷酸。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑包含選自由以下所組成之群組的至少一個經修飾之核苷酸：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-C16(2'-O-十六烷基)修飾之核苷酸及包含乙烯基磷酸酯之核苷酸，視需要，其中該dsRNA劑包含下列修飾中之各者中的至少一者：2'-O-甲基修飾之核苷酸、2'-氟修飾之核苷酸、2'-C16(2'-O-十六烷基)修飾之核苷酸及包含乙烯基磷酸酯之核苷酸。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之dsRNA劑，復包含在該反義股之5'末端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。
  21. 如請求項20所述之dsRNA劑，其中，該磷酸酯模擬物為5'-乙烯基-膦酸酯(VP)。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之dsRNA劑，其包含如表2中所示的經修飾之核苷酸模式(其中2'-C16、2'-O-甲基、2'-去氧、GNA、硫代磷酸酯、乙烯基膦酸酯及2'-氟修飾之定位係如表2中所展示，而無論所展示之dsRNA劑的個別核苷酸鹼基序列如何)。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之dsRNA劑，其具有選自由下列所組成之群組的單個雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列：AD-1804698、AD-1804699、AD-1747575、AD-1747576、AD-1804700、AD-1747577、AD-1747578、AD-1747579、AD-1747580、AD-1747581、AD-1804701、AD-1747582、AD-1804702、AD-1804703、AD-1804704、AD-1747583、AD-1804705、AD-1804706、AD-1804707、AD-1804708、AD-1804709、AD-1747591、AD-1747585、AD-1804710、AD-1804711、AD-1747586、AD-1804712、AD-1747587、AD-1804713、AD-1804714、AD-1747588、AD-1804715、AD-1804716、AD-1804717、AD-1804718、AD-1804719、AD-1804720、AD-1804721、AD-1804722、AD-1804723、AD-1804724、AD-1804725及AD-1804726，視需要具有選自由AD-1747580、AD-1747583及AD-1747585所組成之群組的單個雙鏈體之有義股核苷酸序列及反義股核苷酸序列。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之dsRNA劑，其中，該sRNA劑之有義股具有選自由下列所組成之群組的修飾模式：5'- nsnsnnn(Nhd)NfnNfNfNfnnnnnnnnsnsn-3'及5'-nsnsnnnnnnNfNfNfnnnn(Nhd)nnnsnsn-3'，其中，n為2'-O-甲基核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Nf為2'-氟核苷酸，以及(Nhd)為2'-O-十六烷基核苷酸。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之dsRNA劑，其中，該dsRNA劑之反義股具有選自由下列所組成之群組的修飾模式：5'-VPnsdNsnndNndNnnnnndNnNfnnnnnnnsnsn-3'及5'-VPnsNfsnndNn(Ngn)nnnnnnNfnNfnnnnnsnsn-3'，其中，VP為乙烯基膦酸酯，n為2'-O-甲基核苷酸，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，dN為2'-去氧核苷酸，Nf為2'-氟核苷酸，以及(Ngn)為二醇核酸S-異構物。
  26. 一種用於抑制SNCA之表現的雙鏈核酸(dsRNA)劑，其中，該dsRNA劑包含具有5'-終端及3'-終端之有義股以及具有5'-終端及3'-末終端之反義股，其中該有義股與該反義股形成雙股區域，其中：
    該有義股包含表2之核苷酸序列及修飾(SEQ ID NO：13至55)，具有0或1個誤配；以及
    該反義股包含表2之核苷酸序列及修飾(SEQ ID NO：56至98)，具有0或1個誤配。
  27. 如請求項1至26中任一項所述之dsRNA劑，其具有選自由下列所組成之群組的有義股核苷酸序列：5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugusgsa-3'(SEQ ID NO：35)、5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuusgsa-3'(SEQ ID NO：28)、5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguugsgsa-3'(SEQ ID NO：21)、5'-gsusaca(Ahd)GfuGfCfUfcaguuccasasa-3'(SEQ ID NO：34)、5'- cscsauc(Ahd)gcAfGfUfgauugaagsusa-3'(SEQ ID NO：43)、5'-uscsccag(Uhd)uUfCfUfugagaucusgsa-3'(SEQ ID NO：261)及5'-uscsaug(Ahd)aaGfGfAfcuuucaaasgsa-3'(SEQ ID NO：19)，其中，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，(Ahd)為2'-O-十六烷基腺苷-3'-磷酸酯，(Uhd)為2'-O-十六烷基尿苷-3'-磷酸酯，以及(Chd)為2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸酯。
  28. 如請求項1至27中任一項所述之dsRNA劑，其具有選自由下列所組成之群組的反義股核苷酸序列：5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3'(SEQ ID NO：78)、5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3'(SEQ ID NO：71)、5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3'(SEQ ID NO：64)、5'-VPusUfsugdGa(Agn)cugagcAfcUfuguacsasg-3'(SEQ ID NO：77)、5'-VPusdAscudTcdAaucadCuGfcugauggsasa-3'(SEQ ID NO：86)、5'-VPusdCsagdAudCucaadGaAfacugggasgsc-3'(SEQ ID NO：262)及5'-VPusdCsuudTgdAaagudCcUfuucaugasasu-3'(SEQ ID NO：62)，其中，VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'- 去氧胞苷-3'-磷酸酯，dG為2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，以及(Agn)為腺苷-二醇核酸(GNA)S-異構物。
  29. 如請求項1至28中任一項所述之dsRNA劑，其具有選自由下列所組成之群組的雙鏈體核苷酸序列：(i)有義股：5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugusgsa-3'(SEQ ID NO：35)及反義股：5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3'(SEQ ID NO：78)；(ii)有義股：5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuusgsa-3'(SEQ ID NO：28)及反義股：5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3'(SEQ ID NO：71)；(iii)有義股：5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguugsgsa-3'(SEQ ID NO：21)及反義股：5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3'(SEQ ID NO：64)；(iv)有義股：5'-gsusaca(Ahd)GfuGfCfUfcaguuccasasa-3'(SEQ ID NO：34)及反義股：5'-VPusUfsugdGa(Agn)cugagcAfcUfuguacsasg-3'(SEQ ID NO：77)；(v)有義股：5'-cscsauc(Ahd)gcAfGfUfgauugaagsusa-3'(SEQ ID NO：43)及反義股：5'-VPusdAscudTcdAaucadCuGfcugauggsasa-3'(SEQ ID NO：86)；(vi)有義股：5'-uscsccag(Uhd)uUfCfUfugagaucusgsa-3'(SEQ ID NO：261)及反義股：5'-VPusdCsagdAudCucaadGaAfacugggasgsc-3'(SEQ ID NO：262)；以及(vii)有義股：5'-uscsaug(Ahd)aaGfGfAfcuuucaaasgsa-3'(SEQ ID NO：19)及反義股：5'-VPusdCsuudTgdAaagudCcUfuucaugasasu-3'(SEQ ID NO：62)，其中，VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'- 去氧胞苷-3'-磷酸酯，dG為2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，(Agn)為腺苷-二醇核酸(GNA)S-異構物，(Ahd)為2'-O-十六烷基腺苷-3'-磷酸酯，(Uhd)為2'-O-十六烷基尿苷-3'-磷酸酯，以及(Chd)為2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸酯。
  30. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制SNCA之表現，具有有義股序列5'-asasgug(Chd)ucAfGfUfuccaaugusgsa-3'(SEQ ID NO：35)及反義股序列5'-VPusdCsacdAudTggaadCuGfagcacuusgsu-3'(SEQ ID NO：78)，其中VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Uf為2'-氟尿苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，以及(Chd)為2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸酯。
  31. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制SNCA之表現，具有有義股序列5'-uscsuuugcuCfCfCfaguu(Uhd)cuusgsa-3'(SEQ ID NO：28)及反義股序列5'-VPusdCsaadGadAacugdGgAfgcaaagasusa-3'(SEQ ID NO：71)，其中，VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dG為2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯，以及(Uhd)為2'-O-十六烷基尿苷-3'-磷酸酯。
  32. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其用於抑制SNCA之表現，具有有義股序列5'-gsasgca(Ahd)guGfAfCfaaauguugsgsa-3'(SEQ ID NO：21)及反義 股序列5'-VPusdCscadAcdAuuugdTcAfcuugcucsusu-3'(SEQ ID NO：64)，其中，VP為乙烯基膦酸酯，a為2'-O-甲基腺苷-3'-磷酸酯，u為2'-O-甲基尿苷-3'-磷酸酯，g為2'-O-甲基鳥苷-3'-磷酸酯，c為2'-O-甲基胞苷-3'-磷酸酯，s為硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯，Af為2'-氟腺苷-3'-磷酸酯，Gf為2'-氟鳥苷-3'-磷酸酯，Cf為2'-氟胞苷-3'-磷酸酯，dA為2'-去氧腺苷-3'-磷酸酯，dC為2'-去氧胞苷-3'-磷酸酯，dT為2'-去氧胸苷-3'-磷酸酯，以及(Ahd)為2'-O-十六烷基腺苷-3'-磷酸酯。
  33. 一種細胞，其含有如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑。
  34. 一種用於抑制α-突觸核蛋白之表現的醫藥組成物，其含有如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑。
  35. 如請求項34所述之醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係於非緩衝溶液中投予。
  36. 如請求項35所述之醫藥組成物，其中，該非緩衝溶液為鹽水或水。
  37. 如請求項34所述之醫藥組成物，其中，該dsRNA劑係與緩衝溶液一起投予。
  38. 如請求項37所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液包含醋酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶榖蛋白、碳酸鹽、或磷酸鹽、或其任意組合。
  39. 如請求項37所述之醫藥組成物，其中，該緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
  40. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑及脂質配製物。
  41. 如請求項40所述之醫藥組成物，其中，該脂質配製物包含LNP。
  42. 一種抑制細胞中α-突觸核蛋白(SNCA)基因之表現及/或預防細胞或受試者內α-突觸核蛋白集聚體之形成的方法，該方法包含：
    (a)使該細胞或受試者與如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑或如請求項34至41中任一項所述之醫藥組成物接觸；以及
    (b)將步驟(a)中產生之細胞或受試者維持足以獲得SNCA基因之mRNA轉錄本降解的時間，從而抑制該細胞內SNCA基因之表現及/或預防該細胞或受試者內α-突觸核蛋白集聚體之形成。
  43. 如請求項42所述之方法，其中，該細胞係處於受試者體內。
  44. 如請求項43所述之方法，其中，該受試者為人類。
  45. 如請求項43所述之方法，其中，該受試者係選自由恆河獼猴、食蟹獼猴、小鼠及大鼠所組成之群組。
  46. 如請求項44所述之方法，其中，該人類受試者苦於SNCA相關疾病。
  47. 如請求項46所述之方法，其中，該SNCA相關疾病為突觸核蛋白病變，視需要選自由下列所組成之群組的疾病：PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症(tangle predominant dementia)、嗜銀顆粒疾病(Argyrophilic grain disease)、神經節神經膠質細胞瘤(ganglioglioma)、神經節細胞瘤(gangliocytoma)、腦膜血管瘤病(meningioangiomatosis)、亞急性硬化性泛腦炎、 鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
  48. 如請求項42至47中任一項所述之方法，其中，與對照細胞或對照受試者相比，該細胞或該受試者中之SNCA表現被該dsRNA劑抑制至少約50%、至少約40%、至少約30%、至少約20%或至少約10%。
  49. 一種治療經診斷為患有SNCA相關神經退化性疾病之受試者的方法，該方法包含向該受試者投予治療有效量的如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑或如請求項34至42中任一項所述之醫藥組成物，視需要，其中，該受試者係以治療有效量的如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑或如請求項34至42中任一項所述之醫藥組成物.再次給藥，從而治療該受試者。
  50. 如請求項49所述之方法，其中，該受試者為人類。
  51. 如請求項49或請求項50所述之方法，其中，治療包含該SNCA相關神經退化性疾病之至少一種徵象或症候的緩解。
  52. 如請求項49至51中任一項所述之方法，其中，治療包含預防該疾病之進展。
  53. 如請求項49至52中任一項所述之方法，其中，該SNCA相關神經退化性疾病之特徵為選自由下列所組成之群組的一個或多個症候：震顫、動作遲緩(運動徐緩)、肌肉僵硬、姿勢及平衡受損、自發運動之損失、語音變化、字跡變化、幻視、幻聽、嗅幻覺、觸幻覺、身體機能(自主神經系統)調節不佳諸如暈眩、跌倒及腸問題、認知問題諸如混淆、注意力不佳、視空間問題及記憶力損失、睡眠困難諸如快速眼動(REM)睡眠行為障礙(其中夢在睡眠時以身體表現 出來)、包括嗜睡發作、長時間凝視空處、白天長時間小睡或言語紊亂、抑鬱及冷漠之注意力波動、起立性低血壓(當人站起時發生血壓之突然下降，導致人感覺暈眩及頭暈，以及需要坐、蹲或躺下以便防止昏迷)、動作笨拙或不協調、膀胱控制問題、手或肢之攣縮(關節周圍的肌肉或肌腱之慢性縮短，其阻止關節自由動作)、Pisa症候群(其中身體似乎向一側傾斜的異常姿勢)、頸項前屈(其中頸部向前彎曲且頭部向下)以及不由自主且不可控制的歎息或喘息。
  54. 如請求項49至53中任一項所述之方法，其中，該SNCA相關神經退化性疾病係選自由下列所組成之群組：突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
  55. 如請求項49至54中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係以約0.01mg/kg至約50mg/kg之劑量向該受試者投予。
  56. 如請求項49至55中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係經鞘內向該受試者投予。
  57. 如請求項49至56中任一項所述之方法，復包含向該受試者投予適用於治療或預防SNCA相關神經退化性疾病或病症的附加劑或療法。
  58. 如請求項49至57中任一項所述之方法，其中，該SNCA相關神經退化性疾病為巴金森氏症(PD)。
  59. 如請求項49至58中任一項所述之方法，其中，該SNCA相關神經退化性疾病係選自由下列所組成之群組：路易氏體失智症(LBD)及多系統萎縮(MSA)。
  60. 如請求項49至59中任一項之方法，其中，該SNCA表現被抑制至少約30%。
  61. 如請求項49至60中任一項所述之方法，復包含對該受試者投予額外的治療劑。
  62. 如請求項49至61中任一項所述之方法，其中，該dsRNA劑係經鞘內向該受試者投予。
  63. 如請求項62所述之方法，其中，該方法降低腦或脊髓組織中的SNCA之表現。
  64. 如請求項63所述之方法，其中，該腦或脊髓組織係選自由下列所組成之群組：大腦皮質、小腦、基底神經節、海馬迴、杏仁核、丘腦、腦幹、頸部脊髓、腰部脊髓及胸部脊髓。
  65. 一種抑制受試者的SNCA之表現的方法，該方法包含：
    向該受試者投予治療有效量的如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑或如請求項34至41中任一項所述之醫藥組成物，從而抑制該受試者的SNCA之表現。
  66. 一種用於治療或預防受試者之SNCA相關疾病之方法，該方法包含：
    向該受試者投予治療有效量的如請求項1至32中任一項所述之dsRNA劑或如請求項34至41中任一項所述之醫藥組成物，從而治療或預防該受試者之SNCA相關疾病。
  67. 如請求項66所述之方法，其中，該SNCA相關疾病係選自由下列所組成之群組：突觸核蛋白病變，諸如PD、多系統萎縮(MSA)、路易氏體失智症(LBD)、單純性自主神經衰竭(PAF)、Pick氏病、進行性核上神經麻痺症、拳擊手型失智症、與染色體17相關之巴金森氏症候群、Lytico-Bodig氏病、纏結優勢型失智症、嗜銀顆粒疾病、神經節神經膠質細胞瘤、神經節細胞瘤、腦膜血管瘤病、亞急性硬化性泛腦炎、鉛毒腦病、結節性硬化症、Hallervorden-Spatz二氏病、脂褐質症、皮質基底節退化、額顳葉失智症、額顳葉退化、阿茲海默症、亨汀頓症、唐氏症候群、精神病、思覺失調症及Creutzfeldt-Jakob二氏病。
  68. 如請求項66所述之方法，其中，該投予步驟於該受試者之一個或多個組織中產生SNCA mRNA或α-突觸核蛋白之至少60%減弱，視需要其中該受試者之該一個或多個組織係選自由下列所組成之群組：CSF、前額葉皮質、中腦、胸椎、海馬迴、髓質腦橋、紋狀體尾狀核及小腦。
  69. 一種用於進行如請求項42至67中任一項所述之方法的套組，其包含
    a)該dsRNA劑，
    b)使用說明，以及
    c)視需要，用於投予該dsRNA劑至受試者之手段工具。
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