JP2022515193A - アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ＲＮＡｉ薬剤組成物およびその使用方法 - Google Patents

アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ＲＮＡｉ薬剤組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＡＰＰ遺伝子を標的化する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡｉ）薬剤および組成物ならびにかかるｄｓＲＮＡｉ薬剤および組成物を用いてＡＰＰ遺伝子の発現を阻害する方法およびＡＰＰ関連疾患または障害、例えば脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）および早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤまたはｅＦＡＤ）を有する対象を処置する方法に関する。【選択図】図１Ａ

Description

本開示は、一般的にＡＰＰ標的化ＲＮＡｉ薬剤および方法に関する。
配列表
本出願は配列表を含み、配列表はＡＳＣＩＩ形式で電子形式により提出されており、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記のＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年１２月１８日に作成されたものであり、名称は５３４３３＿５００ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは６３２ｋＢである。
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子は、神経細胞およびグリアにおいて発現される内在性膜タンパク質をコードしている。ＡＰＰの主要機能は不明であるが、ＡＰＰのセクレターゼ切断型形態、特にＡＰＰのＡβ切断形態、例えば、アミロイドベータプラークにおいて支配的タンパク質として一般的に見出されるＡβ（１－４２）（別名Ａβ４２）およびＡβ（１－４０）（別名Ａβ４０）は、罹患個体におけるアルツハイマー病（ＡＤ）の発症および進行と関連していることが長きにわたって報告されている。実際、対象におけるミロイド（ｍｙｌｏｉｄ）ベータプラークの同定はＡＤの病理学的診断に必要である。ＡＰＰのＡβ切断形態は特に、２つのＡＤ関係／関連疾患：脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）および早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤまたはｅＦＡＤ）の発症に決定的役割および原因となる役割すら果たしていることが報告されている。
ＡＰＰを選択的に効率的に阻害し、それによりＡＰＰのＡβ切断形態の生成および／またはレベルをブロックすること、または弱めることができる薬剤によるＡＰＰの発現および／または活性の阻害は、さまざまなＡＰＰ関連の疾患および障害、とりわけ例えばＡＤ、ＣＡＡおよびＥＯＦＡＤを予防または処置に有用であろう。
ＡＰＰ関連の疾患および障害に対して現在使用されている処置選択肢は限られており、かつ大体は有効でない。遺伝性ＣＡＡに対して現存する治療法はなく、孤発性形態のＡＤおよびＥＯＦＡＤを処置するための試みは、これまで不奏効であることが証明されており、例えば、孤発性ＡＤの処置のためのＢＡＣＥ１（β－セクレターゼ）阻害薬の治験はすべて、今までのところ失敗に終わっている（Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７８：１６９１－１７０３；Ｈｕｎｇ ａｎｄ Ｆｕ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：４７）。一方、いくつかのＡβ指向型免疫療法が種々のフェーズの開発段階であるが、いくつかのヒトγ－セクレターゼ阻害薬のプログラムは毒性のため中止されている（Ｓｅｌｋｏｅ ａｎｄ Ｈａｒｄｙ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：５９５－６０８）。これまで、ＡＰＰ関連の疾患または障害に対する承認済の薬理学的処置薬は、予防または治癒ではなく症状の処置に対するものであり、かかる処置薬は、特に、罹患個体においてＡＰＰ関連の疾患または障害が進行するにつれて効力は限定的となる。したがって、ＡＰＰ関連の疾患および障害に罹患している対象のための治療薬が必要であり、例えば遺伝性ＣＡＡおよびＥＯＦＡＤに罹患している対象のための治療薬が特に必要である。
Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７８：１６９１－１７０３ Ｈｕｎｇ ａｎｄ Ｆｕ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：４７ Ｓｅｌｋｏｅ ａｎｄ Ｈａｒｄｙ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：５９５－６０８
本開示により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすＲＮＡｉ組成物を提供する。ＡＰＰ遺伝子は細胞内、例えば、対象、例えばヒト内部の細胞内に存在し得る。また、本開示により、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するため、および／またはＡＰＰ遺伝子の発現の阻害もしくは低減による恩恵を受けるであろう対象、例えばＡＰＰ関連疾患、例えば脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）もしくはアルツハイマー病（ＡＤ）、例えば早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）に罹患している対象あるいは罹患する傾向がある対象を処置するために本開示のＲＮＡｉ組成物を使用する方法を提供する。
したがって、一態様において、本開示により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、該ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０のうちのいずれか１つに列記されたアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤を提供する。一部の特定の実施形態において、アラインメント（比較）された配列間のチミンがウラシルおよび／またはウラシルがチミンの違いは、アラインメント（比較）された該配列間で異なるヌクレオチドとしてカウントしない。
本開示の別の態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該ｄｓＲＮＡ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０に提示されたセンス鎖配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み；該アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０に提示されたアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖とアンチセンス鎖のうちの少なくとも一方は、１または複数の内部ヌクレオチド位置に任意選択でリンカーまたは担体を介してコンジュゲートされた１または複数の親油性部分を含む。
本開示のさらなる一態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該ｄｓＲＮＡ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該センス鎖が、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、ここで、配列番号：１～１４のいずれかのチミンのウラシルでの置き換え（アラインメントした配列を比較した場合）は、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つとの３個以下のヌクレオチドの該相違に寄与する違いとしてカウントせず；該アンチセンス鎖が、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、ここで、配列番号：１５～２８のいずれかのチミンのウラシルでの置き換え（アラインメントした配列を比較した場合）は、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つとの３個以下のヌクレオチドの該相違に寄与する違いとしてカウントせず、該センス鎖と該アンチセンス鎖のうちの少なくとも一方は、１または複数の内部ヌクレオチド位置に任意選択でリンカーまたは担体を介してコンジュゲートされた１または複数の親油性部分を含む二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖は、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２８１６、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８５５、ＡＤ－３９２８４０、ＡＤ－３９２８３５、ＡＤ－３９２７２９、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２８７６、ＡＤ－３９２８６３、ＡＤ－３９２９１７、ＡＤ－３９２７８３、ＡＤ－３９２７６５、ＡＤ－３９２７９１、ＡＤ－３９２８００、ＡＤ－３９２７１１、ＡＤ－３９２８０１、ＡＤ－３９２８２６、ＡＤ－３９２８１８、ＡＤ－３９２７９２、ＡＤ－３９２８０２、ＡＤ－３９２７６６、ＡＤ－３９２７６７、ＡＤ－３９２８３４、ＡＤ－３９２９７４、ＡＤ－３９２７８４、ＡＤ－３９２７４４、ＡＤ－３９２７５２、ＡＤ－３９２７３７、ＡＤ－３９２９１８、ＡＤ－３９２９１９、ＡＤ－３９２８０３、ＡＤ－３９２８０４、ＡＤ－３９２８２７、ＡＤ－３９２８２８、ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２７１５、ＡＤ－３９２８３６、ＡＤ－３９２９６６、ＡＤ－３９２８３２、ＡＤ－３９２９７２、ＡＤ－３９２９６１、ＡＤ－３９２９６７、ＡＤ－３９２８９４、ＡＤ－３９２８６４、ＡＤ－３９２８６５、ＡＤ－３９２９２２、ＡＤ－３９２８３３、ＡＤ－３９２９６８、ＡＤ－３９２９６２、ＡＤ－３９２９６３、ＡＤ－３９２９６９、ＡＤ－３９２９７３、ＡＤ－３９２９２３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２８７７、ＡＤ－３９２７０７、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２７１７、ＡＤ－３９２７００、ＡＤ－３９２８７８、ＡＤ－３９２７１８、ＡＤ－３９２９２９、ＡＤ－３９２８１９、ＡＤ－３９２７４５、ＡＤ－３９２７７０、ＡＤ－３９２８０６、ＡＤ－３９２７７１、ＡＤ－３９２８２０、ＡＤ－３９２８２１、ＡＤ－３９２７８６、ＡＤ－３９２７７２、ＡＤ－３９２６９９、ＡＤ－３９２８６８、ＡＤ－３９２７１９、ＡＤ－３９２８８０、ＡＤ－３９２９３０、ＡＤ－３９２９３２、ＡＤ－３９２８６９、ＡＤ－３９２８７０、ＡＤ－３９２８９６、ＡＤ－３９２７２０、ＡＤ－３９２７４６、ＡＤ－３９２７７３、ＡＤ－３９２８０７、ＡＤ－３９２７３０、ＡＤ－３９２７２１、ＡＤ－３９２９３３、ＡＤ－３９２８８１、ＡＤ－３９２８９７、ＡＤ－３９２８９８、ＡＤ－３９２８９９、ＡＤ－３９２９３５、ＡＤ－３９２８８２、ＡＤ－３９２７３８、ＡＤ－３９２７３９、ＡＤ－３９２９３６、ＡＤ－３９２９００、ＡＤ－３９２９０１、ＡＤ－３９２９３７、ＡＤ－３９２８８３、ＡＤ－３９２９７５、ＡＤ－３９２９３８、ＡＤ－３９２９０２、ＡＤ－３９２９４１、ＡＤ－３９２９４２、ＡＤ－３９２９４３、ＡＤ－３９２９４４、ＡＤ－３９２９０３、ＡＤ－３９２７７５、ＡＤ－３９２７５８、ＡＤ－３９２９４５、ＡＤ－３９２８８４、ＡＤ－３９２９４７、ＡＤ－３９２７４８、ＡＤ－３９２７５９、ＡＤ－３９２８３７、ＡＤ－３９２９７０、ＡＤ－３９２９７６、ＡＤ－３９２９６５、ＡＤ－３９２８３１、ＡＤ－３９２９０４、ＡＤ－３９２８８５、ＡＤ－３９２８８６、ＡＤ－３９２７７６、ＡＤ－３９２８８７、ＡＤ－３９２７２２、ＡＤ－３９２７６０、ＡＤ－３９２７３１、ＡＤ－３９２７０９、ＡＤ－３９２７２３、ＡＤ－３９２９４８、ＡＤ－３９２７２４、ＡＤ－３９２９４９、ＡＤ－３９２７２５、ＡＤ－３９２９５０、ＡＤ－３９２７３２、ＡＤ－３９２７２６、ＡＤ－３９２８６２、ＡＤ－３９２９５１、ＡＤ－３９２８７１、ＡＤ－３９２８７２、ＡＤ－３９７１８３、ＡＤ－３９７１７５、ＡＤ－３９７１７７、ＡＤ－３９７１７６、ＡＤ－３９７２６０、ＡＤ－３９７２６６、ＡＤ－３９７２６７、ＡＤ－３９７１７８、ＡＤ－３９７１８０、ＡＤ－３９７１８４、ＡＤ－３９７１７９、ＡＤ－３９７２２４、ＡＤ－３９７２２５、ＡＤ－３９７２０３、ＡＤ－３９７１８５、ＡＤ－３９７１９５、ＡＤ－３９７２０４、ＡＤ－３９７１９１、ＡＤ－３９７２５１、ＡＤ－３９７２４０、ＡＤ－３９７２０５、ＡＤ－３９７２５４、ＡＤ－３９７２５９、ＡＤ－３９７２４７、ＡＤ－３９７２３３、ＡＤ－３９７１８１、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１９７、ＡＤ－３９７２２６、ＡＤ－３９７２１２、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ－３９７２２７、ＡＤ－３９７２１７、ＡＤ－３９７２１３、ＡＤ－３９７２２９、ＡＤ－３９７２６４、ＡＤ－３９７２６５、ＡＤ－３９７２０９、ＡＤ－３９７１９２、ＡＤ－３９７２１０、ＡＤ－３９７２１９、ＡＤ－３９７２１４、ＡＤ－３９７２２０、ＡＤ－３９７２３０、ＡＤ－３９７２３１、ＡＤ－３９７１９３、ＡＤ－３９７１９０、ＡＤ－３９７２００、ＡＤ－３９７２４８、ＡＤ－３９７２０７、ＡＤ－３９７２１１、ＡＤ－３９７２４３、ＡＤ－３９７２４６、ＡＤ－３９７２２３、ＡＤ－３９７２０２、ＡＤ－３９７２５６、ＡＤ－３９７２５７、ＡＤ－３９７２５８、ＡＤ－３９７２５０、ＡＤ－３９７２４４、ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３、ＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５またはＡＤ－９６１５８６の二重鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む。
別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖は、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２８１６、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８５５、ＡＤ－３９２８４０、ＡＤ－３９２８３５、ＡＤ－３９２７２９、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２８７６、ＡＤ－３９２８６３、ＡＤ－３９２９１７、ＡＤ－３９２７８３、ＡＤ－３９２７６５、ＡＤ－３９２７９１、ＡＤ－３９２８００、ＡＤ－３９２７１１、ＡＤ－３９２８０１、ＡＤ－３９２８２６、ＡＤ－３９２８１８、ＡＤ－３９２７９２、ＡＤ－３９２８０２、ＡＤ－３９２７６６、ＡＤ－３９２７６７、ＡＤ－３９２８３４、ＡＤ－３９２９７４、ＡＤ－３９２７８４、ＡＤ－３９２７４４、ＡＤ－３９２７５２、ＡＤ－３９２７３７、ＡＤ－３９２９１８、ＡＤ－３９２９１９、ＡＤ－３９２８０３、ＡＤ－３９２８０４、ＡＤ－３９２８２７、ＡＤ－３９２８２８、ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２７１５、ＡＤ－３９２８３６、ＡＤ－３９２９６６、ＡＤ－３９２８３２、ＡＤ－３９２９７２、ＡＤ－３９２９６１、ＡＤ－３９２９６７、ＡＤ－３９２８９４、ＡＤ－３９２８６４、ＡＤ－３９２８６５、ＡＤ－３９２９２２、ＡＤ－３９２８３３、ＡＤ－３９２９６８、ＡＤ－３９２９６２、ＡＤ－３９２９６３、ＡＤ－３９２９６９、ＡＤ－３９２９７３、ＡＤ－３９２９２３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２８７７、ＡＤ－３９２７０７、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２７１７、ＡＤ－３９２７００、ＡＤ－３９２８７８、ＡＤ－３９２７１８、ＡＤ－３９２９２９、ＡＤ－３９２８１９、ＡＤ－３９２７４５、ＡＤ－３９２７７０、ＡＤ－３９２８０６、ＡＤ－３９２７７１、ＡＤ－３９２８２０、ＡＤ－３９２８２１、ＡＤ－３９２７８６、ＡＤ－３９２７７２、ＡＤ－３９２６９９、ＡＤ－３９２８６８、ＡＤ－３９２７１９、ＡＤ－３９２８８０、ＡＤ－３９２９３０、ＡＤ－３９２９３２、ＡＤ－３９２８６９、ＡＤ－３９２８７０、ＡＤ－３９２８９６、ＡＤ－３９２７２０、ＡＤ－３９２７４６、ＡＤ－３９２７７３、ＡＤ－３９２８０７、ＡＤ－３９２７３０、ＡＤ－３９２７２１、ＡＤ－３９２９３３、ＡＤ－３９２８８１、ＡＤ－３９２８９７、ＡＤ－３９２８９８、ＡＤ－３９２８９９、ＡＤ－３９２９３５、ＡＤ－３９２８８２、ＡＤ－３９２７３８、ＡＤ－３９２７３９、ＡＤ－３９２９３６、ＡＤ－３９２９００、ＡＤ－３９２９０１、ＡＤ－３９２９３７、ＡＤ－３９２８８３、ＡＤ－３９２９７５、ＡＤ－３９２９３８、ＡＤ－３９２９０２、ＡＤ－３９２９４１、ＡＤ－３９２９４２、ＡＤ－３９２９４３、ＡＤ－３９２９４４、ＡＤ－３９２９０３、ＡＤ－３９２７７５、ＡＤ－３９２７５８、ＡＤ－３９２９４５、ＡＤ－３９２８８４、ＡＤ－３９２９４７、ＡＤ－３９２７４８、ＡＤ－３９２７５９、ＡＤ－３９２８３７、ＡＤ－３９２９７０、ＡＤ－３９２９７６、ＡＤ－３９２９６５、ＡＤ－３９２８３１、ＡＤ－３９２９０４、ＡＤ－３９２８８５、ＡＤ－３９２８８６、ＡＤ－３９２７７６、ＡＤ－３９２８８７、ＡＤ－３９２７２２、ＡＤ－３９２７６０、ＡＤ－３９２７３１、ＡＤ－３９２７０９、ＡＤ－３９２７２３、ＡＤ－３９２９４８、ＡＤ－３９２７２４、ＡＤ－３９２９４９、ＡＤ－３９２７２５、ＡＤ－３９２９５０、ＡＤ－３９２７３２、ＡＤ－３９２７２６、ＡＤ－３９２８６２、ＡＤ－３９２９５１、ＡＤ－３９２８７１、ＡＤ－３９２８７２、ＡＤ－３９７１８３、ＡＤ－３９７１７５、ＡＤ－３９７１７７、ＡＤ－３９７１７６、ＡＤ－３９７２６０、ＡＤ－３９７２６６、ＡＤ－３９７２６７、ＡＤ－３９７１７８、ＡＤ－３９７１８０、ＡＤ－３９７１８４、ＡＤ－３９７１７９、ＡＤ－３９７２２４、ＡＤ－３９７２２５、ＡＤ－３９７２０３、ＡＤ－３９７１８５、ＡＤ－３９７１９５、ＡＤ－３９７２０４、ＡＤ－３９７１９１、ＡＤ－３９７２５１、ＡＤ－３９７２４０、ＡＤ－３９７２０５、ＡＤ－３９７２５４、ＡＤ－３９７２５９、ＡＤ－３９７２４７、ＡＤ－３９７２３３、ＡＤ－３９７１８１、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１９７、ＡＤ－３９７２２６、ＡＤ－３９７２１２、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ－３９７２２７、ＡＤ－３９７２１７、ＡＤ－３９７２１３、ＡＤ－３９７２２９、ＡＤ－３９７２６４、ＡＤ－３９７２６５、ＡＤ－３９７２０９、ＡＤ－３９７１９２、ＡＤ－３９７２１０、ＡＤ－３９７２１９、ＡＤ－３９７２１４、ＡＤ－３９７２２０、ＡＤ－３９７２３０、ＡＤ－３９７２３１、ＡＤ－３９７１９３、ＡＤ－３９７１９０、ＡＤ－３９７２００、ＡＤ－３９７２４８、ＡＤ－３９７２０７、ＡＤ－３９７２１１、ＡＤ－３９７２４３、ＡＤ－３９７２４６、ＡＤ－３９７２２３、ＡＤ－３９７２０２、ＡＤ－３９７２５６、ＡＤ－３９７２５７、ＡＤ－３９７２５８、ＡＤ－３９７２５０、ＡＤ－３９７２４４、ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３、ＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５またはＡＤ－９６１５８６の二重鎖のアンチセンスヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む。
任意選択で、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の特定の実施形態では、ｌｏｇＫｏｗによって測定される親油性部分の親油性が０より大きい。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合分率によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の疎水性が０．２より大きい。関連する一実施形態では、血漿タンパク質結合アッセイがヒト血清アルブミンタンパク質を用いる電気泳動移動度シフトアッセイである。
一部の特定の実施形態では、センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。任意選択で、センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。
一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。任意選択で、センス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１個はデオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、コンホメーション制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロクスリー（ｈｙｄｒｏｘｌｙ）－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基含有ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェート部もしくは５’ホスフェート模倣部を含むヌクレオチド、ビニルホスフェート部を含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェート部を含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェート部を含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェート部を含むヌクレオチド、あるいはコレステリル誘導体および／またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドである。
関連する一実施形態では、修飾ヌクレオチドが２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および／または非天然塩基含有ヌクレオチドである。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドは３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
別の実施形態において、該ヌクレオチドの該修飾部は２’－Ｏ－メチル、２’フルオロおよびＧＮＡ修飾部である。
さらなる一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。任意選択で、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は６～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
一部の特定の実施形態では、相補性の領域が少なくとも１７個のヌクレオチドの長さである。任意選択で、相補性の領域は１９～２３個のヌクレオチドの長さである。任意選択で、相補性の領域は１９個のヌクレオチドの長さである。
一実施形態において、各鎖は３０個以下のヌクレオチドの長さである。
別の実施形態において、少なくとも一方の鎖は、少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。任意選択で、少なくとも一方の鎖は、少なくとも２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一部の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が、センス鎖の３’端、５’端または３’端と５’端に一価のリンカーまたは分岐した二価のリンカーまたは三価のリンカーによりコンジュゲートされたＣ１６リガンドをさらに含む。
一実施形態において、リガンドは
Figure 2022515193000002
 であり、
式中、Ｂはヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基アナログであり、任意選択でＢはアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
別の実施形態において、相補性の領域は、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０のうちのいずれか１つのアンチセンス配列のうちのいずれか１つを含む。
さらなる一実施形態において、相補性の領域は表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０のうちのいずれか１つのアンチセンス配列のうちのいずれか１つのものである。
一部の実施形態では、内部ヌクレオチド位置が、該鎖の各端から２つの末端位置以外のすべての位置を含む。
関連する一実施形態では、該内部位置が、該鎖の各端から３つの末端位置以外のすべての位置を含む。任意選択で、該内部位置はセンス鎖の切断部位領域を除く。
一実施形態において、該内部位置はセンス鎖の５’端から数えて９～１２個の位置を除く。
別の実施形態において、該内部位置はセンス鎖の３’端から数えて１１～１３個の位置を除く。任意選択で、該内部位置はアンチセンス鎖の切断部位領域を除く。
一実施形態において、該内部位置はアンチセンス鎖の５’端から数えて１２～１４個の位置を除く。
別の実施形態において、該内部位置はセンス鎖の３’端から数えて１１～１３個の位置およびアンチセンス鎖の５’端から数えて１２～１４個の位置を除く。
さらなる一実施形態において、１または複数の親油性部分は、以下の内部位置：各鎖の５’端から数えてセンス鎖の４位～８位および１３位～１８位ならびにアンチセンス鎖の６位～１０位および１５位～１８位のうちの１または複数にコンジュゲートされる。任意選択で、該１または複数の親油性部分は、以下の内部位置：各鎖の５’端から数えてセンス鎖の５位、６位、７位、１５位および１７位ならびにアンチセンス鎖の１５位および１７位のうちの１または複数にコンジュゲートされる。
一部の特定の実施形態では、親油性部分が脂肪族、脂環式または多環脂肪族の化合物である。任意選択で、親油性部分は脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシアノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンである。
一部の実施形態では、親油性部分が、飽和または不飽和のＣ４～Ｃ３０炭化水素鎖ならびにヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジドおよび／またはアルキンである選択される任意選択の官能基を含む。
一部の特定の実施形態では、親油性部分が飽和または不飽和のＣ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含む。任意選択で、親油性部分は飽和または不飽和のＣ１６炭化水素鎖を含む。関連する一実施形態では、親油性部分が、該内部位置（１つまたは複数）内の１または複数のヌクレオチドと置き換えられる担体を介してコンジュゲートされる。一部の特定の実施形態では、担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニルもしくはデカリニルである環式基；またはセリノール骨格もしくはジエタノールアミン骨格を主体とする非環式部分である環式基である。
一部の実施形態では、親油性部分が二本鎖ＲＮＡｉ薬剤に、エーテル、チオエーテル、ウレア、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物またはカルバメートを含有しているリンカーを介してコンジュゲートされる。
一実施形態において、親油性部分は核酸塩基、糖部分またはヌクレオシド間結合部にコンジュゲートされる。
別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖の５’端にホスフェート部またはホスフェート模倣部をさらに含む。任意選択で、ホスフェート模倣部は５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
一部の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が、ＣＮＳ組織への送達を媒介する受容体を標的化する標的化リガンドをさらに含む。一実施形態において、標的化リガンドはＣ１６リガンドである。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が脳組織を標的化する標的化リガンドをさらに含む。
一実施形態において、親油性部分または標的化リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの機能性単糖もしくは機能性オリゴ糖および／またはその組合せである生体内切断性リンカーを介してコンジュゲートされる。
関連する一実施形態では、センス鎖の３’端がアミンを有する環式基であるエンドキャップによって保護されており、環式基はピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニルまたはデカリニルである。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチドおよび／またはビニルホスフェートを含むヌクレオチドである少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤は、以下の修飾部：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を構成するヌクレオチドおよびビニルホスフェート部を含むヌクレオチドの各々を少なくとも１つを含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、図１Ａ、図１Ｂ、表２Ａ、表５Ａまたは表９に示すようなパターンの修飾ヌクレオチドを含む（ここで、２’－Ｃ１６、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ、ホスホロチオエートおよび２’－フルオロ修飾部の場所は、表示されたＲＮＡｉ薬剤の個々のヌクレオチド塩基配列に関係なく、図１Ａ、図１Ｂ、表２Ａ、表５Ａまたは表９に表示したとおりである）。
本開示の別の態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、該鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'- nq' 5' (III)
で表され、
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し；
Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
該センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる
二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
一実施形態では、ｉが０であり；ｊが０であり；ｉが１であり；ｊが１であり；ｉとｊがともに０であるか；またはｉとｊがともに１である。
別の実施形態では、ｋが０であり；ｌが０であり；ｋが１であり；ｌが１であり；ｋとｌがともに０であるか；またはｋとｌがともに１である。
一部の特定の実施形態では、ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、ＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’に相補的である。
別の実施形態において、ＹＹＹモチーフはセンス鎖の切断部位または該切断部位付近に存在する。
さらなる一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフはアンチセンス鎖の５’端から１１位、１２位および１３位に存在する。任意選択で、Ｙ’は２’－Ｏ－メチルである。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩａ）：
センス： 5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa)
で表されるものである。
別の実施形態において、式（ＩＩＩ）は式（ＩＩＩｂ）：
センス： 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIIb)
で表されるものであり、
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
さらなる一実施形態において、式（ＩＩＩ）は式（ＩＩＩｃ）：
センス： 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIc)
で表されるものであり、
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
一部の特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｄ）：
センス： 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-X’X’X’-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIId)
で表されるものであり、
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
別の実施形態において、二本鎖領域は１５～３０ヌクレオチド対の長さである。任意選択で、二本鎖領域は１７～２３ヌクレオチド対の長さである。
一部の特定の実施形態では、二本鎖領域が１７～２５ヌクレオチド対の長さである。任意選択で、二本鎖領域は２３～２７ヌクレオチド対の長さである。
一部の実施形態では、二本鎖領域が１９～２１ヌクレオチド対の長さである。任意選択で、二本鎖領域は２１～２３ヌクレオチド対の長さである。
一部の特定の実施形態では、各鎖が１５～３０個のヌクレオチドを有する。任意選択で、各鎖は１９～３０個のヌクレオチドを有する。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤の該ヌクレオチドの該修飾部はＬＮＡ、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシおよび／または２’－ヒドロキシルおよびその組合せである。任意選択で、ヌクレオチドの該修飾部としては、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロおよび／またはＧＮＡならびにその組合せが挙げられる。関連する一実施形態では、該ヌクレオチドの該修飾部が２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、二価または三価の分岐したリンカーにより結合されている１または複数のＣ１６部分であるリガンドあるいは該部分を含むリガンドを含む。
一部の特定の実施形態では、リガンドはセンス鎖の３’端に結合される。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。関連する一実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の３’末端に存在する。任意選択で、該鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態において、該鎖はセンス鎖である。関連する一実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の５’末端に存在する。任意選択で、該鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態において、該鎖はセンス鎖である。
別の実施形態において、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の５’末端と３’末端の両方に存在する。任意選択で、該鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態において、該鎖はセンス鎖である。
さらなる一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤二重鎖のアンチセンス鎖の５’端の１位の塩基対がＡ：Ｕ塩基対である。
一部の特定の実施形態では、Ｙヌクレオチドが２’－フルオロ修飾部を含む。
一部の実施形態では、Ｙ’ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾部を含む。
一部の特定の実施形態では、ｐ’＞０である。任意選択で、ｐ’＝２である。
一部の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’個のオーバーハングヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに相補的である。
一部の特定の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’個のオーバーハングヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに非相補的である。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖が合計２１個のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が合計２３個のヌクレオチドを有する。
別の実施形態において、少なくとも１個のｎｐ’が、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。任意選択で、すべてのｎｐ’が、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている。
一部の特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６および／または９に列記されたもののうちの１つである。
一部の実施形態では、センス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾部を含む。
本開示の別の態様により、細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、該鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
で表され、
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、該修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
該センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる
二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
本開示のさらなる一態様により、細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、該鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
で表され、
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、該修飾部は２’－Ｏ－メチル、グリコール核酸（ＧＮＡ）または２’－フルオロ修飾部であり；
Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
該センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる
二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
本開示の別の態様により、細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、該鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は
式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
で表され、
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、該修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
該センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、任意選択で該リガンドは１または複数のＣ１６リガンドである
二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
本開示のさらなる一態様により、細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、該鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
で表され、
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、該修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
該センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
該センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、任意選択で該リガンドは１または複数のＣ１６リガンドである
二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
本開示の別の態様により、細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、該鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は
式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na -YYY-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa)
で表され、
式中：
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、該修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
該センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；
該センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、任意選択で該リガンドは１または複数のＣ１６リガンドである
二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
本開示のさらなる一態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は、二本鎖領域を形成しているセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、前記センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾部、ＧＮＡおよび／または２’－フルオロ修飾部である修飾部を含み、該センス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾部および２’－フルオロ修飾部からなる群より選択される修飾部を含み、該アンチセンス鎖は、５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該センス鎖は１または複数のＣ１６リガンドにコンジュゲートされる二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
本開示の別の態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ薬剤であって、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は、二本鎖領域を形成しているセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、該アンチセンス鎖は、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、該センス鎖は少なくとも１個の３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）を含み、該アンチセンス鎖は少なくとも１個の３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）を含む二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。
一実施形態では、センス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである。
別の実施形態では、各鎖が１９～３０個のヌクレオチドを有する。
一部の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖が５’領域またはその前駆体の最初の９つのヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部を含む。任意選択で、二重鎖の熱不安定化性修飾部は
Figure 2022515193000003
 のうちの１または複数であり、
式中、Ｂは核酸塩基である。
本開示の別の態様により、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を含む細胞を提供する。
本開示のさらなる一態様により、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を含む、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は非緩衝溶液中に含めて投与される。任意選択で、非緩衝溶液は生理食塩水または水である。
別の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はバッファー溶液とともに投与される。任意選択で、バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩またはリン酸塩またはその任意の組合せを含む。別の実施形態において、バッファー溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
本開示の別の態様により、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤および脂質製剤を含む医薬組成物を提供する。
一実施形態において、脂質製剤はＬＮＰを含む。
本開示のさらなる一態様により、細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害する方法であって：（ａ）該細胞を本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または本開示の医薬組成物と接触させること；および（ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに充分な時間維持し、それにより該細胞内におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害することを伴う方法を提供する。
一実施形態において、細胞は対象内部に存在する。任意選択で、対象はヒトである。
一部の特定の実施形態では、対象がアカゲザル、シノモルゴース（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）ザル、マウスまたはラットである。
一実施形態において、ヒト対象はＡＰＰ関連障害に罹患している対象である。任意選択で、ＡＰＰ関連疾患は脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）である。
別の実施形態において、ＡＰＰ関連障害は早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）である。さらなる一実施形態において、ＡＰＰ関連障害はアルツハイマー病（ＡＤ）である。
一部の特定の実施形態では、ＡＰＰ発現がＲＮＡｉ薬剤によって少なくとも約３０％阻害される。
本開示の別の態様により、ＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう障害を有する対象の処置方法であって、該対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または本開示の医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより該対象を処置することを伴う方法を提供する。
一部の特定の実施形態では、該方法が、さらなる治療用薬剤を該対象に投与することをさらに伴う。
一部の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が対象に髄腔内投与される。
一部の特定の実施形態では、対象への二本鎖ＲＮＡｉの投与によりＡβ蓄積の減少が引き起こされる。任意選択で、対象への二本鎖ＲＮＡｉの投与によりＡβ（１－４０）および／またはＡβ（１－４２）の蓄積の減少が引き起こされる。
関連する実施形態において、対象へのｄｓＲＮＡの投与により該対象においてアミロイドプラークの形成および／または蓄積の減少が引き起こされる。
一実施形態において、該方法により脳または脊椎の組織内での標的遺伝子の発現が低減される。任意選択で、脳または脊椎の組織は皮質、小脳、線条体、頸椎、腰椎および／または胸椎である。
本開示の別の態様により、対象におけるＡＰＰの発現を阻害する方法であって：該対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または本開示の医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより該対象におけるＡＰＰの発現を阻害することを伴う方法を提供する。
本開示のさらなる一態様により、対象のＡＰＰ関連疾患または障害を処置または予防するための方法であって、該対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または本開示の医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより該対象のＡＰＰ関連疾患または障害を処置または予防することを伴う方法を提供する。
一部の特定の実施形態では、ＡＰＰ関連疾患または障害が脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）および／またはアルツハイマー病（ＡＤ）である。任意選択で、ＡＤは早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）である。
本開示の別の態様により：ａ）本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤、およびｂ）使用説明書、およびｃ）任意選択で、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を対象に投与するための手段を含む、本開示の方法を行なうためのキットを提供する。
本開示のさらなる一態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、該ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を有し、該アンチセンス鎖は、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２８１６、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８５５、ＡＤ－３９２８４０、ＡＤ－３９２８３５、ＡＤ－３９２７２９、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２８７６、ＡＤ－３９２８６３、ＡＤ－３９２９１７、ＡＤ－３９２７８３、ＡＤ－３９２７６５、ＡＤ－３９２７９１、ＡＤ－３９２８００、ＡＤ－３９２７１１、ＡＤ－３９２８０１、ＡＤ－３９２８２６、ＡＤ－３９２８１８、ＡＤ－３９２７９２、ＡＤ－３９２８０２、ＡＤ－３９２７６６、ＡＤ－３９２７６７、ＡＤ－３９２８３４、ＡＤ－３９２９７４、ＡＤ－３９２７８４、ＡＤ－３９２７４４、ＡＤ－３９２７５２、ＡＤ－３９２７３７、ＡＤ－３９２９１８、ＡＤ－３９２９１９、ＡＤ－３９２８０３、ＡＤ－３９２８０４、ＡＤ－３９２８２７、ＡＤ－３９２８２８、ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２７１５、ＡＤ－３９２８３６、ＡＤ－３９２９６６、ＡＤ－３９２８３２、ＡＤ－３９２９７２、ＡＤ－３９２９６１、ＡＤ－３９２９６７、ＡＤ－３９２８９４、ＡＤ－３９２８６４、ＡＤ－３９２８６５、ＡＤ－３９２９２２、ＡＤ－３９２８３３、ＡＤ－３９２９６８、ＡＤ－３９２９６２、ＡＤ－３９２９６３、ＡＤ－３９２９６９、ＡＤ－３９２９７３、ＡＤ－３９２９２３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２８７７、ＡＤ－３９２７０７、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２７１７、ＡＤ－３９２７００、ＡＤ－３９２８７８、ＡＤ－３９２７１８、ＡＤ－３９２９２９、ＡＤ－３９２８１９、ＡＤ－３９２７４５、ＡＤ－３９２７７０、ＡＤ－３９２８０６、ＡＤ－３９２７７１、ＡＤ－３９２８２０、ＡＤ－３９２８２１、ＡＤ－３９２７８６、ＡＤ－３９２７７２、ＡＤ－３９２６９９、ＡＤ－３９２８６８、ＡＤ－３９２７１９、ＡＤ－３９２８８０、ＡＤ－３９２９３０、ＡＤ－３９２９３２、ＡＤ－３９２８６９、ＡＤ－３９２８７０、ＡＤ－３９２８９６、ＡＤ－３９２７２０、ＡＤ－３９２７４６、ＡＤ－３９２７７３、ＡＤ－３９２８０７、ＡＤ－３９２７３０、ＡＤ－３９２７２１、ＡＤ－３９２９３３、ＡＤ－３９２８８１、ＡＤ－３９２８９７、ＡＤ－３９２８９８、ＡＤ－３９２８９９、ＡＤ－３９２９３５、ＡＤ－３９２８８２、ＡＤ－３９２７３８、ＡＤ－３９２７３９、ＡＤ－３９２９３６、ＡＤ－３９２９００、ＡＤ－３９２９０１、ＡＤ－３９２９３７、ＡＤ－３９２８８３、ＡＤ－３９２９７５、ＡＤ－３９２９３８、ＡＤ－３９２９０２、ＡＤ－３９２９４１、ＡＤ－３９２９４２、ＡＤ－３９２９４３、ＡＤ－３９２９４４、ＡＤ－３９２９０３、ＡＤ－３９２７７５、ＡＤ－３９２７５８、ＡＤ－３９２９４５、ＡＤ－３９２８８４、ＡＤ－３９２９４７、ＡＤ－３９２７４８、ＡＤ－３９２７５９、ＡＤ－３９２８３７、ＡＤ－３９２９７０、ＡＤ－３９２９７６、ＡＤ－３９２９６５、ＡＤ－３９２８３１、ＡＤ－３９２９０４、ＡＤ－３９２８８５、ＡＤ－３９２８８６、ＡＤ－３９２７７６、ＡＤ－３９２８８７、ＡＤ－３９２７２２、ＡＤ－３９２７６０、ＡＤ－３９２７３１、ＡＤ－３９２７０９、ＡＤ－３９２７２３、ＡＤ－３９２９４８、ＡＤ－３９２７２４、ＡＤ－３９２９４９、ＡＤ－３９２７２５、ＡＤ－３９２９５０、ＡＤ－３９２７３２、ＡＤ－３９２７２６、ＡＤ－３９２８６２、ＡＤ－３９２９５１、ＡＤ－３９２８７１、ＡＤ－３９２８７２、ＡＤ－３９７１８３、ＡＤ－３９７１７５、ＡＤ－３９７１７７、ＡＤ－３９７１７６、ＡＤ－３９７２６０、ＡＤ－３９７２６６、ＡＤ－３９７２６７、ＡＤ－３９７１７８、ＡＤ－３９７１８０、ＡＤ－３９７１８４、ＡＤ－３９７１７９、ＡＤ－３９７２２４、ＡＤ－３９７２２５、ＡＤ－３９７２０３、ＡＤ－３９７１８５、ＡＤ－３９７１９５、ＡＤ－３９７２０４、ＡＤ－３９７１９１、ＡＤ－３９７２５１、ＡＤ－３９７２４０、ＡＤ－３９７２０５、ＡＤ－３９７２５４、ＡＤ－３９７２５９、ＡＤ－３９７２４７、ＡＤ－３９７２３３、ＡＤ－３９７１８１、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１９７、ＡＤ－３９７２２６、ＡＤ－３９７２１２、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ－３９７２２７、ＡＤ－３９７２１７、ＡＤ－３９７２１３、ＡＤ－３９７２２９、ＡＤ－３９７２６４、ＡＤ－３９７２６５、ＡＤ－３９７２０９、ＡＤ－３９７１９２、ＡＤ－３９７２１０、ＡＤ－３９７２１９、ＡＤ－３９７２１４、ＡＤ－３９７２２０、ＡＤ－３９７２３０、ＡＤ－３９７２３１、ＡＤ－３９７１９３、ＡＤ－３９７１９０、ＡＤ－３９７２００、ＡＤ－３９７２４８、ＡＤ－３９７２０７、ＡＤ－３９７２１１、ＡＤ－３９７２４３、ＡＤ－３９７２４６、ＡＤ－３９７２２３、ＡＤ－３９７２０２、ＡＤ－３９７２５６、ＡＤ－３９７２５７、ＡＤ－３９７２５８、ＡＤ－３９７２５０、ＡＤ－３９７２４４ ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３、ＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５またはＡＤ－９６１５８６のアンチセンス鎖核酸塩基配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む相補性の領域を含む二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤を提供する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、以下の修飾部：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を構成するヌクレオチド、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびビニルホスホネート（ＶＰ）のうちの１または複数を含む。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤は、以下の修飾部：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を構成するヌクレオチド、ホスホロチオエートおよびビニルホスホネート（ＶＰ）の各々を少なくとも１つを含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、４以上のＰＳ修飾部、任意選択で６～１０のＰＳ修飾部、任意選択で８つのＰＳ修飾部を含む。
さらなる一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は５’末端と３’末端を有し、該ＲＮＡｉ薬剤は、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々のそれぞれの３’末端および５’末端の最後から２番目と最後のヌクレオチド間結合の各々に位置する８つのＰＳ修飾部を含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は５’末端と３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤は、ＧＮＡを含むヌクレオチドを１個だけ含む。任意選択で、ＧＮＡを含むヌクレオチドはアンチセンス鎖に、アンチセンス鎖の５’末端から７番目の核酸塩基の残基に位置する。
さらなる一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は５’末端と３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤は１～４つの２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドは２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドである。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤は単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、該単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドはセンス鎖に、センス鎖の５’末端から６番目の核酸塩基の位置または５’端の末端核酸塩基の位置に位置する。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は５’末端と３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤は２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドはセンス鎖にセンス鎖の５’末端から７位、９位、１０位および１１位の核酸塩基に、ならびにアンチセンス鎖にアンチセンス鎖の５’末端から２位、１４位および１６位の核酸塩基に位置する。
さらなる一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は５’末端と３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤は１または複数のＶＰ修飾を含む。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖の５’末端に単一のＶＰ修飾を含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は５’末端と３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤は２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを、２’－フルオロ、２’－Ｃ－アルキルまたはグリコール核酸（ＧＮＡ）で修飾されていないすべての核酸塩基の場所に含む。任意選択で、該２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、センス鎖にセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、８位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位および２１位に、ならびにアンチセンス鎖にアンチセンス鎖の５’末端から１位、３位、４位、５位、６位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位および２３位に位置する。
本開示の別の態様により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、該ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該アンチセンス鎖は、ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の１８９１～１９１９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２２８２～２３０６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２４６４～２４９４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２４７５～２６３８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２６２１～２６８９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２６８２～２７２５位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７０５～２７４６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７２６～２７７１位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７５４～２７８８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７８２～２８１３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８０１～２８２６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８４７～２８９０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８７１～２８９６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８８２～２９６０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２９４２～２９７１位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２９５１～３０５７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３１７２～３２２３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３２０９～３２３５位；ＮＭ＿００４８４の３２５６～３２８９位；ＮＭ＿００４８４の３３０２～３３３８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３３１８～３３５３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３３３４～３３６１位、ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２５１～２８４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の３６２～４０４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の４７１～５１０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の５３２～５８７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の６０１～６４９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の６３３～６６２位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１３５１～１３８８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１６０９～１６４９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１６７５～１６９８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１７５２～１７８７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２１６５～２２１７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２２８０～２３４４位；またはＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２４０３～２４３１位の標的ＡＰＰ配列に、ＡＰＰノックダウンをもたらすのに充分に相補的である少なくとも１５個隣接している核酸塩基の長さの領域を含み、かつ該ＡＰＰ標的配列に、ＡＰＰノックダウンをもたらすのに充分に相補的な該少なくとも１５個隣接している核酸塩基において３個以下のヌクレオチドが相違する二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤を提供する。
本開示の別の態様により、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を構成するヌクレオチド、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびビニルホスホネート（ＶＰ）からなる群より選択される１または複数の修飾を含む二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供し、任意選択で、前記ＲＮＡｉ薬剤は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を構成するヌクレオチド、ホスホロチオエートおよびビニルホスホネート（ＶＰ）からなる群より選択される各修飾を少なくとも１つ含む。
本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤が、４以上のＰＳ修飾部、任意選択で６～１０のＰＳ修飾部、任意選択で８つのＰＳ修飾部を含むことを提供する。
本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤が、該ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々のそれぞれの３’末端および５’末端の最後から２番目と最後のヌクレオチド間結合に位置する８つのＰＳ修飾部を含むことを提供する。
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本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤が、ＧＮＡを構成するヌクレオチドを１個だけ含み、任意選択でＧＮＡを構成する該ヌクレオチドはアンチセンス鎖に、アンチセンス鎖の５’末端から７番目の核酸塩基の残基に位置することを提供する。
本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤が１～４つの２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で該２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドが２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドであり、任意選択で該ＲＮＡｉ薬剤は単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で該単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドはセンス鎖に、センス鎖の５’末端から６番目の核酸塩基の位置または５’端の末端核酸塩基の位置に位置することを提供する。
本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤が、２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で、該ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で該２’－フルオロ修飾ヌクレオチドはセンス鎖にセンス鎖の５’末端から７位、９位、１０位および１１位の核酸塩基に、ならびにアンチセンス鎖にアンチセンス鎖の５’末端から２位、１４位および１６位の核酸塩基に位置することを提供する。
本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤が１または複数のＶＰ修飾部を含み、任意選択で該ＲＮＡｉ薬剤は単一のＶＰ修飾をアンチセンス鎖の５’末端に含むことを提供する。
本開示の別の態様により、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、該ＲＮＡｉ薬剤が２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で該ＲＮＡｉ薬剤は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを、２’－フルオロ、２’－Ｃ－アルキルまたはグリコール核酸（ＧＮＡ）で修飾されていないすべての核酸塩基の場所に含み、任意選択で該２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、センス鎖にセンス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、８位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位および２１位に、ならびにアンチセンス鎖にアンチセンス鎖の５’末端から１位、３位、４位、５位、６位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位および２３位に位置することを提供する。
一例として示しているが本開示を記載の具体的な実施形態のみに限定することを意図するものでない以下の詳細説明は、添付の図面と併せると最良に理解され得よう。
図１Ａおよび図１Ｂは、インビボｈｓＡＰＰノックダウン活性について試験した修飾ＲＮＡｉ薬剤の模式図を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、図１Ａおよび図１Ｂに示した修飾ＲＮＡｉ薬剤で観察されたインビボｈｓＡＰＰノックダウン活性の結果を示す。 図３Ａは、遺伝性脳アミロイド血管症（ｈＣＡＡ）の標的化において効力のあるヒトＡＰＰ（ｈＡＰＰ）のｓｉＲＮＡを同定するためのストラテジーを示すスキームである。 図３Ｂは、Ｂｅ（２）Ｃ細胞での１０ｎＭの濃度のｈＡＰＰ ｓｉＲＮＡのインビトロエンドジェナススクリーニングにおける残存ｍＲＮＡパーセントのプロットである。 図４Ａは、ＢＥ（２）Ｃ 神経細胞でのＡＰＰ ｓｉＲＮＡトランスフェクションのタイミングを示すスキームである。ＡＰＰ ｓｉＲＮＡは１０、１および０．１ｎＭでトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間および４８時間目に評価した。 図４Ｂは、トランスフェクション後４８時間目のＢＥ（２）Ｃ細胞におけるＡＰＰ二重鎖ｓｉＲＮＡの適用濃度に対する残存ｍＲＮＡパーセントを示すグラフである。 図４Ｃは、トランスフェクション後４８時間目のＢＥ（２）Ｃ細胞の上清み中の可溶性ＡＰＰアルファ種（上）およびベータ種（下）の２つのグラフである。 図５Ａは、ＡＰＰ ｓｉＲＮＡの非ヒト霊長類（ＮＨＰ）スクリーニング試験デザインを示すスキームである。５種類の化合物を評価し、各実験で５匹の動物を使用した。７２ｍｇの対象化合物の単回髄腔内（ＩＴ）注射を発症時に行なった。 図５Ｂは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７２のＩＴ投与後のＢＥ（２）Ｃ（下）での可溶性ＡＰＰアルファ種（上）およびベータ種（下）の２つのグラフである。 図５Ｃは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７２のＩＴ投与後２９日目の組織ｍＲＮＡノックダウンの結果を示すグラフである。 図５Ｄは、ＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７２化合物の構造（上）およびカニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７２のＩＴ投与後２９日目のＡＤ－４５４９７２化合物の組織内送達レベルを示す表（下）を示すスキームである。 図６は、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７２のＩＴ投与後２～３ヶ月目に収集されたＣＳＦ中の可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）およびＣＳＦ中のアミロイドベータ種（下）の結果を示す２つのグラフである。 図７Ａは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４２のＩＴ投与後８、１５および２９日目に収集され、可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）ならびにアミロイドベータ３８、４０および４２（下）について解析されたＣＳＦの結果を示す２つのグラフである。 図７Ｂは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４２のＩＴ投与後２９日目のＡＤ－４５４８４２化合物の組織内送達レベルを示す表である。 図８Ａは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４３のＩＴ投与後８、１５および２９日目に収集され、可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）ならびにアミロイドベータ３８、４０および４２（下）について解析されたＣＳＦの結果を示す２つのグラフである。 図８Ｂは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４３のＩＴ投与後２９日目の組織ｍＲＮＡノックダウンの結果を示すグラフである。 図８Ｃは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４３のＩＴ投与後２９日目のＡＤ－４５４８４３化合物の組織内送達レベルを示す表である。 図９Ａは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４３のＩＴ投与後２～３ヶ月目に収集されたＣＳＦ中の可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）およびＣＳＦ中のアミロイドベータ種（下）の結果を示す２つのグラフである。 図９Ｂは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４３のＩＴ投与後８５日目の組織ｍＲＮＡノックダウンの結果を示すグラフである。 図１０Ａは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４４のＩＴ投与後８、１５および２９日目に収集され、可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）ならびにアミロイドベータ３８、４０および４２（下）について解析されたＣＳＦの結果を示す２つのグラフである。 図１０Ｂは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４４のＩＴ投与後２９日目の組織ｍＲＮＡノックダウンの結果を示すグラフである。 図１０Ｃは、ＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４４化合物の構造（上）およびカニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４４のＩＴ投与後２９日目のＡＤ－４５４８４４化合物の組織内送達レベルを示す表（下）を示すスキームである。 図１１Ａは、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ｓｉＲＮＡのＩＴ投与後２９日目の高レベルの化合物の組織内送達を示す表である。 図１１Ｂは、カニクイザルにおける高レベル（図１１Ａ）のＡＰＰ標的化送達化合物のＩＴ投与後２９日目の組織ｍＲＮＡノックダウンの結果を示すグラフである。 図１１Ｃは、カニクイザルにおける７２ｍｇの高レベルのＡＰＰ標的化送達化合物（図１１Ａ）のＩＴ投与後８、１５および２９日目に収集され、可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）ならびにアミロイドベータ３８、４０および４２（下）について解析されたＣＳＦの結果を示す２つのグラフである。 図１２Ａは、５つのｍｉＲＮＡ二重鎖試験の平均を示す２つのプロットである。上パネルは、カニクイザルにおける７２ｍｇのｓｉＲＮＡのＩＴ投与後２９日目の５種類の化合物の結果の箱ひげ図である。下パネルは、カニクイザルにおけるＩＴ投与後２９日目の各組織内に残存するｍＲＮＡの量（対照と比較）の箱ひげ図である。 図１２Ｂは、ＣＳＦを、カニクイザルにおける７２ｍｇのＡＰＰ標的化ｓｉＲＮＡ化合物のＩＴ投与後８、１５および２９日目に収集し、可溶性ＡＰＰアルファおよびベータ（上）ならびにアミロイドベータ３８、４０および４２（下）について解析した反復ｍｉＲＮＡ二重鎖試験を示す２種類のプロットである。 図１３Ａは、カニクイザルにおけるＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７２のＩＴ投与後２９日目の線条体組織内の残存ＡＰＰ ｍＲＮＡパーセントを示すグラフである。 図１３Ｂは、カニクイザルにおけるＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４９７３のＩＴ投与後２９日目の線条体組織内の残存ＡＰＰ ｍＲＮＡパーセントを示すグラフである。 図１３Ｃは、カニクイザルにおけるＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４２のＩＴ投与後２９日目の線条体組織内の残存ＡＰＰ ｍＲＮＡパーセントを示すグラフである。 図１３Ｄは、カニクイザルにおけるＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４３のＩＴ投与後２９日目の線条体組織内の残存ＡＰＰ ｍＲＮＡパーセントを示すグラフである。 図１３Ｅは、カニクイザルにおけるＡＰＰ標的化ＡＤ－４５４８４４のＩＴ投与後２９日目の線条体組織内の残存ＡＰＰ ｍＲＮＡパーセントを示すグラフである。 図１４Ａおよび図１４Ｂは、マウスにおいてインビボｈｓＡＰＰノックダウン活性についてスクリーニングした、ＡＵリッチシードを有する修飾ＲＮＡｉ薬剤の模式図である。 図１５は、ＡＵリッチシードで処置したＡＡＶ８．ＨｓＡＰＰ－ＣＤＳ３ＴＲＮＣマウスの肝臓におけるｈｓＡＰＰノックダウン％を示すグラフである。ＰＢＳ、未処置およびＡＤ－３９２９２７（ＲＬＤ５９２）対照をグラフに含めている。 図１６Ａ～１６Ｄは、ＡＡＶマウスにおいてインビボｈｓＡＰＰノックダウン活性についてスクリーニングした修飾リードＲＮＡｉ薬剤の模式図である。 図１７Ａおよび図１７Ｂは、リードオリゴヌクレオチドで処置したＡＡＶ８．ＨｓＡＰＰ－ＣＤＳ３ＴＲＮＣマウスの肝臓におけるｈｓＡＰＰノックダウン％を示すグラフである。ＰＢＳおよび未処置、対照をグラフに含めている。 図１８Ａ～１８Ｄは、ＡＡＶマウスにおいてインビボｈｓＡＰＰノックダウン活性についてスクリーニングし、それぞれＡＤ－８８６８６４親（図１８Ａ）、ＡＤ－８８６８９９親（図１８Ｂ）、ＡＤ－８８６９１９親（図１８Ｃ）およびＡＤ－８８６８２３親（図１８Ｄ）に基づいてファミリーとしてグループ分けした修飾リードＲＮＡｉ薬剤の模式図である。 図１９は、ＡＤ－４５４８４４の４ヶ月間の試験のＡＰＰノックダウン非ヒト霊長類（ＮＨＰ）スクリーニングの試験デザインを示すスキームであり、この試験において、カニクイザルに対して６０ｍｇの対象化合物の単回髄腔内（ＩＴ）注射を発症時に行なった。 図２０Ａ～２０Ｇ ６は、親ＡＤ－４５４８５５およびＡＤ－４５４８５５の構造活性相関試験で得た５種類のさらなるｓｉＲＮＡコンジュゲートを含むＣ１６ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのインビボスクリーニングのデータを示す。グラフは、６０ｍｇの各化合物の髄腔内投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示す。図２０Ａは、２例の非ヒト霊長類対象でのＡＤ－４５４８４４の投与後４ヶ月目の可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのグラフである。図２０Ｂは、ＡＤ－４５４８４４の投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示すグラフである。図２０Ｃは、５’末端Ｃ１６ ｓｉＲＮＡコンジュゲートＡＤ－９９４３７９の投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示すグラフである。図２０Ｄは、ＡＤ－９６１５８３の投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示すグラフである。図２０Ｅは、ＡＤ－９６１５８４の投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示すグラフである。図２０Ｆは、ＡＤ－９６１５８５の投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示すグラフである。図２０Ｇは、ＡＤ－９６１５８６の投与後８、１５および１９日目のＣＳＦから収集した可溶性ＡＰＰアルファおよびベータのパーセントを示すグラフである。 図２１Ａおよび２１Ｂは、非ヒト霊長類においてインビボＡＰＰノックダウン活性についてスクリーニングしたＣ１６修飾リードＲＮＡｉ薬剤の模式図である。図２１Ａは、親の内部Ｃ１６ ＲＮＡｉ薬剤ＡＤ－４５４８４４および５’末端Ｃ１６ ｓｉＲＮＡ薬剤ＡＤ－９９４３７９の模式図である。図２１Ｂは、ＲＮＡｉ薬剤ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５およびＡＤ－９６１５８６の模式図である。
本開示により、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらすＲＮＡｉ組成物を提供する。ＡＰＰ遺伝子は細胞内、例えば、対象、例えばヒト内部の細胞内に存在し得る。また、本開示により、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するため、および／またはＡＰＰ遺伝子の発現の阻害もしくは低減による恩恵を受けるであろう障害、例えばＡＰＰ関連の疾患、例えば脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）もしくはアルツハイマー病（ＡＤ）、例えば早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）を有する対象を処置するために本開示のＲＮＡｉ組成物を使用する方法を提供する。
本開示のＲＮＡｉ薬剤は、約３０個またはそれより少ないヌクレオチドの長さ、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２個のヌクレオチドの長さである領域であって、ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。
一部の特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である少なくとも１９個の連続したヌクレオチドの領域を有する、より長鎖のもの、例えば最大６６個までのヌクレオチド、例えば、３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３個のヌクレオチドの長さを含むものであり得るＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含む。より長鎖のアンチセンス鎖を有するこのようなＲＮＡｉ薬剤は好ましくは、２０～６０個のヌクレオチドの長さの第２のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み、ここで、センス鎖とアンチセンス鎖は１８～３０個連続したヌクレオチドの二重鎖を形成する。
このようなＲＮＡｉ薬剤の使用により、哺乳動物におけるＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解が可能になる。非常に少ない投薬量のＡＰＰ ＲＮＡｉ薬剤では、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が特異的に効率的に媒介され、ＡＰＰ遺伝子の発現の有意な阻害がもたらされ得る。細胞ベースのアッセイを使用し、本発明者らは、ＡＰＰを標的化するＲＮＡｉ薬剤がＲＮＡｉを媒介し、ＡＰＰ遺伝子の発現の有意な阻害をもたらし得ることを実証した。したがって、このようなＲＮＡｉ薬剤を含む方法および組成物は、ＡＰＰタンパク質のレベルおよび／または活性の低下の恩恵を受けるであろう対象、例えば、ＡＰＰ関連疾患、例えばＣＡＡまたはＡＤ、例えばＥＯＦＡＤなどを有する対象を処置するのに有用である。
以下の詳細な説明に、ＲＮＡｉ薬剤含有組成物をどのようにして作製し、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するために使用するか、ならびにこの遺伝子の発現の阻害および／または低減による恩恵を受けるであろう疾患および障害を有する対象を処置するための組成物および方法を開示する。
Ｉ．定義
本開示内容がより容易に理解され得るように、一部の特定の用語をまず定義する。また、パラメータの値または値の範囲が記載されている場合はいつでも、記載の値同士の間にある値および範囲もまた本開示の一部であることが意図されることに注意されたい。
冠詞“ａ”および“ａｎ”は本明細書において、その冠詞の文法上の目的語である対象物が１つまたは１より多く（すなわち、少なくとも１つ）であることを示すために用いる。一例として、“ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）”は、１つの要素（ｏｎｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）または１つより多くの要素（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、例えば複数の要素を意味する。
用語“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（～を含む）”は本明細書において、語句“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（限定されないが、～を含む）”を意味するために用いており、該語句と互換的に用いている。用語“ｏｒ（または／もしくは）”は、本文中にそうでないことを明示していない限り、用語“ａｎｄ／ｏｒ（および／または）”を意味するために用いており、該用語と互換的に用いている。
用語「約」は本明細書において、当該技術分野における典型的な許容範囲内を意味するために用いている。例えば、「約」は平均から約２標準偏差と理解され得る。一部の特定の実施形態では、約は±１０％を意味する。一部の特定の実施形態では、約は±５％を意味する。約が一連の数値または範囲の前にある場合、「約」は該一連の数値の各々または該範囲内の数値の各々を修飾し得ると理解されたい。
１つの数値または一連の数値の前にある用語「少なくとも」は、用語「少なくとも」の隣の数値、ならびに論理的に含まれ得るであろうことが文脈から明らかなそれ以降のすべての数値または整数を包含していると理解されたい。例えば、核酸分子内のヌクレオチドの数は整数でなければならない。例えば、「２１個のヌクレオチドの核酸分子内の少なくとも１８個のヌクレオチド」は、１８、１９、２０または２１個のヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。少なくともが一連の数値または範囲の前にある場合、「少なくとも」は該一連の数値の各々または該範囲内の数値の各々を修飾し得ると理解されたい。
本明細書で用いる場合、「以下」または「未満」は、該語句の隣の値および文脈から論理的なそれより小さい、ゼロまでの論理値または整数と理解されたい。例えば、「２個以下のヌクレオチド」のオーバーハングを有する二重鎖は２、１または０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。「以下」が一連の数値または範囲の前にある場合、「以下」は該一連の数値の各々または該範囲内の数値の各々を修飾し得ると理解されたい。
用語「ＡＰＰ」はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）であり、数ある名称の中でもアミロイドベータ前駆体タンパク質、アルツハイマーディセアセアミロイドタンパク質および脳血管アミロイドペプチドとしても知られており、特に指定のない限り、任意の脊椎動物供給源または哺乳動物供給源由来の、例えば限定されないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、齧歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サルおよびモルモット由来のアミノ酸配列を有するものである。該用語はまた、天然状態のＡＰＰの少なくとも１つのインビボ活性またはインビトロ活性を維持している、天然状態のＡＰＰの断片およびバリアント（例えば、中でも、Ａβペプチドのベータ－アミロイドペプチド（１－４０）、ベータ－アミロイドペプチド（１－３８）およびベータ－アミロイドペプチド（１－４２）形態など）、例えば、性質が神経毒性であるＡＰＰ断片の１または複数の活性を維持しているＡＰＰ断片のバリアントも示す（例えば、神経毒性の性質を維持しているＡβ４２ペプチドのバリアント形態は明白に想定される）。該用語には、ＡＰＰのプロセッシングされていない完全長の前駆体形態ならびにシグナルペプチドの翻訳後切断により生じる成熟形態が包含される。該用語には、さらなる切断によってＡＰＰから誘導されるペプチド、例えばＡβペプチドなども包含される。ヒトＡＰＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：２２８００８４０５（ＮＭ＿２０１４１４；配列番号：１）にみられ得る。また、ヒトＡＰＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：２２８００８４０３（ＮＭ＿０００４８４．３；配列番号：２）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：２２８００８４０４（ＮＭ＿２０１４１３．２；配列番号：３）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：３２４０２１７４６（ＮＭ＿００１１３６０１６．３；配列番号：４）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：２２８００８４０２（ＮＭ＿００１１３６１２９．２；配列番号：５）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：２２８００８４０１（ＮＭ＿００１１３６１３０．２；配列番号：６）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：３２４０２１７４７（ＮＭ＿００１１３６１３１．２；配列番号：７）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：３２４０２１７３７（ＮＭ＿００１２０４３０１．１；配列番号：８）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：３２４０２１７３５（ＮＭ＿００１２０４３０２．１；配列番号：９）；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：３２４０２１７３９（ＮＭ＿００１２０４３０３．１；配列番号：１０）；およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：１３７０４８１３８５（ＸＭ＿０２４４５２０７５．１；配列番号：１１）にもみられ得る。
カニクイザルＡＰＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：９８２２３７８６８（ＸＭ＿００５５４８８８３．２；配列番号：１２）にみられ得る。マウスＡＰＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：３１１８９３４００（ＮＭ＿００１１９８８２３；配列番号：１３）にみられ得る。ラットＡＰＰのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＩ：４０２６９２７２５（ＮＭ＿０１９２８８．２；配列番号：１４）にみられ得る。ＡＰＰ配列のさらなる例は、公衆に利用可能なデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＯＭＩＭを用いて容易に入手可能である。
用語「ＡＰＰ」はまた、本明細書で用いる場合、ＡＰＰ遺伝子の天然に存在するＤＮＡ配列異型形態、例えばＡＰＰ遺伝子における単一ヌクレオチド多型によって細胞内で発現される特定のポリペプチドを示す。ＡＰＰ遺伝子内の数多くのＳＮＰが同定されており、例えばＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ参照）にみられ得る。ＡＰＰ遺伝子内のＳＮＰの非限定的な例は、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰアクセッション番号ｒｓ１９３９２２９１６、ｒｓ１４５５６４９８８、ｒｓ１９３９２２９１６、ｒｓ２１４４８４、ｒｓ２８１８６５１６１、ｒｓ３６４０４８、ｒｓ４６６４３３、ｒｓ４６６４４８、ｒｓ５３２８７６８３２、ｒｓ６３７４９８１０、ｒｓ６３７４９９６４、ｒｓ６３７５００６４、ｒｓ６３７５００６６、ｒｓ６３７５０１５１、ｒｓ６３７５０２６４、ｒｓ６３７５０３６３、ｒｓ６３７５０３９９、ｒｓ６３７５０４４５、ｒｓ６３７５０５７９、ｒｓ６３７５０６４３、ｒｓ６３７５０６７１、ｒｓ６３７５０７３４、ｒｓ６３７５０８４７、ｒｓ６３７５０８５１、ｒｓ６３７５０８６８、ｒｓ６３７５０９２１、ｒｓ６３７５０９７３、ｒｓ６３７５１０３９、ｒｓ６３７５１１２２およびｒｓ６３７５１２６３にみられ得る。ＥＯＦＡＤの発症の一因となっているとこれまでに報告されている一部の特定の例示的な珍しいＡＰＰバリアントがＨｏｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７８：１２５０－５７）において同定された。また、シーケンシングされたｃＤＮＡ内にエキソン内（ｉｎｔｒａｅｘｏｎｉｃ）接合部を有する種々の「非古典的」ＡＰＰバリアントが最近、ＡＤ患者の脳内での体細胞遺伝子組換えの発生と関連していると同定されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３０５２０、これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。かかる「非古典的」ＡＰＰバリアントの例としては、ｃＡＰＰ－Ｒ３／１６（配列番号：１８６５）、ｃＡＰＰ－Ｒ３／１６－２（配列番号：１８６６）、ｃＡＰＰ－Ｒ２／１８（配列番号：１８６７）、ｃＡＰＰ－Ｒ６／１８（配列番号：１８６８）、ｃＡＰＰ－Ｒ３／１４（配列番号：１８６９）、ｃＡＰＰ－Ｒ３／１７（配列番号：１８７０）、ｃＡＰＰ－Ｒ１／１１（配列番号：１８７１）、ｃＡＰＰ－Ｒ１／１３（配列番号：１８７２）、ｃＡＰＰ－Ｒ１／１１－２（配列番号：１８７３）、ｃＡＰＰ－Ｒ１／１４（配列番号：１８７４）、ｃＡＰＰ－Ｒ２／１７（配列番号：１８７５）、ｃＡＰＰ－Ｒ２／１６（配列番号：１８７６）、ｃＡＰＰ－Ｒ６／１７（配列番号：１８７７）、ｃＡＰＰ－Ｒ２／１４（配列番号：１８７８）、ｃＡＰＰ－Ｒ１４／１７－ｄ８（配列番号：１８７９）およびｃＡＰＰ－Ｄ２／１８－３（配列番号：１８８０）が挙げられる。本開示のＲＮＡｉ薬剤が「非古典的」ＡＰＰバリアントを標的化するために使用され得ること、および／または任意選択でかかる「非古典的」ＡＰＰバリアントに特異的なＲＮＡｉ薬剤が設計され、任意選択で本開示の他のＲＮＡｉ薬剤、例えば天然状態の形態のＡＰＰを標的化するものと併用して使用され得ることは明白に想定される。かかる「非古典的」ＡＰＰバリアントは、注目すべきことに、アッセイされたＨＩＶ患者集団には非存在であると報告され、ＨＩＶ患者集団におけるＡＤの有病率は期待値レベルと比べて有意に低く、これは、ＨＩＶ患者を処置するために一般的に使用される逆転写酵素阻害薬および／または他の抗レトロウイルス療法薬もおそらく同様にＡＤに対して治療的／予防的役割を果たすことを示した。したがって、本開示のＲＮＡｉ薬剤は任意選択で、治療目的および／または予防目的のために逆転写酵素阻害薬および／または他の抗レトロウイルス療法薬と併用して使用され得ることが明白に想定される。
本明細書で用いる場合、「標的配列」は、ＡＰＰ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した一部分、例えば、一次転写産物のＲＮＡプロセッシングの産物であるｍＲＮＡを示す。一エンボドメント（ｅｍｂｏｄｍｅｎｔ）において、配列の標的部分は少なくとも、ＡＰＰ遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該一部分または該一部分付近でのＲＮＡｉ指向性切断のための基質として機能を果たすのに充分長い。
標的配列は、約９～３６個のヌクレオチドの長さ、例えば約１５～３０個のヌクレオチドの長さであり得る。例えば、標的配列は、約１５～３０個のヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２個のヌクレオチドの長さであり得る。上記に記載の範囲および長さの間にある範囲および長さもまた本開示の一部であることが想定される。
本明細書で用いる場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて示される配列によって記載されたヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを示す。
“Ｇ”、“Ｃ”、“Ａ”、“Ｔ”および“Ｕ”は各々、一般的に、それぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルを塩基として含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」はまた、以下にさらに詳述するような修飾ヌクレオチド、または代用置き換え部分も示し得ることは理解されよう（例えば、表１参照）。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルが、かかる置き換え部分を担持しているヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に改変することなく他の部分で置き換えられ得ることを充分に承知している。例えば、限定されないが、イノシンを塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含有しているヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニンまたはアデニンを含有しているヌクレオチドは、本開示において特記するｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列内において、例えばイノシンを含有しているヌクレオチドで置き換えられ得る。別の例では、オリゴヌクレオチド内の任意の箇所のアデニンおよびシトシンがグアニンおよびウラシルで置き換えられ、それぞれ、標的ｍＲＮＡとＧ－Ｕゆらぎ塩基対合を形成し得る。かかる置き換え部分を含んでいる配列は、本開示において特記する組成物および方法に好適である。
本明細書において互換的に用いている用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ薬剤」、「ｉＲＮＡ薬剤」、「ＲＮＡ干渉剤」は、用語を本明細書において定義しているＲＮＡを含有している薬剤であって、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路によるＲＮＡ転写物の標的化切断を媒介する薬剤を示す。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡの配列特異的分解が指令されるプロセスである。ＲＮＡｉにより細胞内、例えば、対象、例えば哺乳動物対象内部の細胞内におけるＡＰＰの発現が調節される、例えば阻害される。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、標的ＲＮＡ配列、例えばＡＰＰ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を指令する一本鎖ＲＮＡｉを含む。理論に拘束されることを望まないが、細胞内に導入された長鎖の二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒによって、このようなｄｓＲＮＡは、２個の塩基の特徴的な３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにプロセッシングされる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いで、このようなｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、該複合体では、１種類または複数種のヘリカーゼが該ｓｉＲＮＡの二重鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１種類または複数種のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様において、本開示は、細胞内に生成される一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖）であって、標的遺伝子、すなわちＡＰＰ遺伝子のサイレンシングをもたらすためのＲＩＳＣ複合体の形成を促進させる一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」はまた本明細書において、上記のようなＲＮＡｉを示すためにも用いる。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または生物体に導入される一本鎖ＲＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡｉ薬剤はＲＩＳＣのエンドヌクレアーゼであるＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合し、次いでこれが標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは一般的に１５～３０個のヌクレオチドであり、化学修飾される。一本鎖ＲＮＡの設計および試験は米国特許第８，１０１，３４８号およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載されており、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のアンチセンスヌクレオチド配列はいずれも、本明細書に記載のような一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用してもよく、Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載の方法により化学修飾されたものとして使用してもよい。
別の実施形態において、本開示の組成物および方法における使用のための「ＲＮＡｉ薬剤」は二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ薬剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ薬剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称する。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわちＡＰＰ遺伝子に対して「センス」方向と「アンチセンス」方向を有すると称される逆平行で実質的に相補的な２つの核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を示す。本開示の一部の実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称する転写後遺伝子サイレンシング機構によって標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡの分解を誘発する。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のいくつかのヌクレオチドはリボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載するように、各鎖または両方の鎖はまた、１または複数の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。また、本明細書で用いる場合、「ＲＮＡｉ薬剤」には化学修飾を有するリボヌクレオチドが包含され得；ＲＮＡｉ薬剤は、多種類のヌクレオチドに実質的な修飾部を含むものであってもよい。本明細書で用いる場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを示す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分または核酸塩基に対する例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本開示の薬剤における使用に適した修飾には本明細書に開示の、または当該技術分野で知られたあらゆる型の修飾が含まれる。本明細書および特許請求の範囲の解釈上、ｓｉＲＮＡ型分子において使用される際は、任意のかかる修飾体が「ＲＮＡｉ薬剤」に包含される。
本開示の一部の特定の実施形態において、デオキシ－ヌクレオチド（これは、ヌクレオチドの天然に存在する形態と認知されている）が含まれていることは、ＲＮＡｉ薬剤に存在している場合、修飾ヌクレオチドを構成しているとみなされ得る。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解が可能である任意の長さのものであり得、約９～３６の範囲の塩基対の長さ、例えば約１５～３０塩基対の長さ、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６塩基対の長さ、例えば約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の長さであり得る。上記に記載の範囲および長さの間にある範囲および長さもまた本開示の一部であることが想定される。
二重鎖構造を形成している２つの鎖は１つの大型ＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、別々のＲＮＡ分子であってもよい。該２つの鎖が１つの大型分子の一部であり、したがって、二重鎖構造を形成している一方の鎖の３’端とそれぞれの他方の鎖の５’端間の途切れていないヌクレオチド鎖によって連結されている場合、この連結ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは少なくとも１個の非対合ヌクレオチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ヘアピンループが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれより多くの非対合ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループが１０個またはそれより少ないヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループが８個またはそれより少ない非対合ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループが４～１０個の非対合ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループが４～８個のヌクレオチドであり得る。
ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な該２つの鎖が別々のＲＮＡ分子で構成されている場合、該分子は共有結合により連結され得るが、連結されなくてもよい。該２つの鎖が、二重鎖構造を形成している一方の鎖の３’端とそれぞれの他方の鎖の５’端間の途切れていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合により連結されている一部の特定の実施形態において、この連結構造部は「リンカー」と称される（が、本明細書の他の箇所で規定している一部の特定の他の構造部もまた「リンカー」と称される場合があり得ることに注意されたい）。該ＲＮＡ鎖は同じ数のヌクレオチドを有するものであっても異なる数のヌクレオチドを有するものであってもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡから二重鎖に存在している任意のオーバーハングを差し引いた最も短い鎖のヌクレオチドの数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは１または複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。ＲＮＡｉ薬剤の一実施形態において、少なくとも一方の鎖は少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態において、少なくとも一方の鎖は、少なくとも２個のヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。他の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤の少なくとも一方の鎖は、少なくとも１個のヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。一部の特定の実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２個のヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤の一方の鎖の３’端と５’端の両方が少なくとも１個のヌクレオチドのオーバーハングを含む。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、各鎖が１９～２３個のヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、標的ＲＮＡ配列、例えばＡＰＰ標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を指令するｄｓＲＮＡである。理論に拘束されることを望まないが、細胞内に導入された長鎖の二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。リボヌクレアーゼ－ＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒによってｄｓＲＮＡは、２個の塩基の特徴的な３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡにプロセッシングされる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いでｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、該複合体では、１種類または複数種のヘリカーゼが該ｓｉＲＮＡの二重鎖を巻き戻し、相補的アンチセンス鎖が標的認識をガイドすることを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合したら、ＲＩＳＣ内の１種類または複数種のエンドヌクレアーゼが標的を切断し、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書で用いる場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ＲＮＡｉ薬剤、例えばｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突き出た少なくとも１個の非対合ヌクレオチドを示す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’端が他方の鎖の５’端を超えて伸長しているか、またはその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは少なくとも１個のヌクレオチドのオーバーハングを含むものであってもよい；あるいはまた、オーバーハングは、少なくとも２個のヌクレオチド、少なくとも３個のヌクレオチド、少なくとも４個のヌクレオチド、少なくとも５個のヌクレオチドまたはそれより多くを含むものであってもよい。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログ、例えばデオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むものであってもよく、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログ、例えばデオキシヌクレオチド／ヌクレオシドからなるものであってもよい。オーバーハング（１つまたは複数）は、センス鎖、アンチセンス鎖またはその任意の組合せに存在し得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド（１個または複数）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’端、３’端または両端に存在し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、１～１０個のヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドのオーバーハングを３’端および／または５’端に有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、１～１０個のヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドのオーバーハングを３’端および／または５’端に有する。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１または複数がヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、１～１０個のヌクレオチドの、例えば０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドのオーバーハングを３’端および／または５’端に有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、１～１０個のヌクレオチドの、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドのオーバーハングを３’端および／または５’端に有する。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１または複数がヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
一部の特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖または両方のオーバーハングが、１０個より長いヌクレオチド、例えば１～３０個のヌクレオチド、２～３０個のヌクレオチド、１０～３０個のヌクレオチドまたは１０～１５個のヌクレオチドの長さである伸長した長さを含むものであり得る。一部の特定の実施形態では、伸長オーバーハングが二重鎖のセンス鎖にある。一部の特定の実施形態では、伸長オーバーハングが二重鎖のセンス鎖の３’端に存在する。一部の特定の実施形態では、伸長オーバーハングが二重鎖のセンス鎖の５’端に存在する。一部の特定の実施形態では、伸長オーバーハングが二重鎖のアンチセンス鎖にある。一部の特定の実施形態では、伸長オーバーハングが二重鎖のアンチセンス鎖の３’端に存在する。一部の特定の実施形態では、伸長オーバーハングが二重鎖のアンチセンス鎖の５’端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１または複数がヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。一部の特定の実施形態では、オーバーハングが自己相補部分を含み、該オーバーハングが、生理学的条件下で安定なヘアピン構造を形成できるようになっている。
用語「平滑な」または「平滑末端の」は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書で用いる場合、ｄｓＲＮＡの所与の終末端に非対合のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログがないこと、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方の端が平滑であっても両端が平滑であってもよい。ｄｓＲＮＡの両端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは平滑末端であるといえる。明確化のために言うと、「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、両端が平滑である、すなわち分子のいずれの端にもヌクレオチドオーバーハングがないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、かかる分子は全長にわたって二本鎖である。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、ＲＮＡｉ薬剤、例えばｄｓＲＮＡの、標的配列、例えばＡＰＰ ｍＲＮＡに実質的に相補的である領域を含む鎖を示す。
本明細書で用いる場合、用語「相補性の領域」は、アンチセンス鎖上の、ある配列、例えば本明細書において定義している標的配列、例えばＡＰＰヌクレオチド配列に実質的に相補的である領域を示す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的でない場合、ミスマッチが分子の内部領域または末端領域に存在し得る。一般的に、最も許容されるミスマッチは、ＲＮＡｉ薬剤の末端領域、例えば５’末端および／または３’末端の５、４、３または２個以内のヌクレオチドに存在するものである。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ薬剤の、用語を本明細書において定義しているアンチセンス鎖の一領域に実質的に相補的である領域を含む鎖を示す。
本明細書で用いる場合、用語「切断領域」は、切断部位のすぐ隣に位置する領域を示す。切断部位は、切断が起こる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域が切断部位のいずれかの端のすぐ隣の３個の塩基を含むものである。一部の実施形態では、切断領域が切断部位のいずれかの端のすぐ隣の２個の塩基を含むものである。一部の実施形態では、切断部位が具体的にはアンチセンス鎖の１０番目と１１番目のヌクレオチドが結合している部位に存在し、切断領域が１１番目、１２番目および１３番目のヌクレオチドを含む。
本明細書で用いる場合、特に記載のない限り、用語「相補的」は、第２のヌクレオチド配列との関連において第１のヌクレオチド配列を説明するために用いる場合、当業者には理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を示す。かかる条件は例えばストリンジェント条件であり得、この場合、ストリンジェント条件としては：４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間の後、洗浄することが挙げられ得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ参照）。他の条件、例えば、生物体内部で遭遇し得るような生理学的に関連性のある条件を適用してもよい。当業者は、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件セットを、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終適用に応じて決定することができよう。
ＲＮＡｉ薬剤内、例えば本明細書に記載のようなｄｓＲＮＡ内の相補的な配列は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。かかる配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的」と称され得る。しかしながら、本明細書において、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、該２つの配列は完全に相補的であってもよく、最大３０塩基対までの二重鎖のハイブリダイゼーションで１つまたは複数、しかし一般的には５つ以下、４つ、３つまたは２つのミスマッチ塩基対が形成されてもよいが、最終適用、例えばＲＩＳＣ経路による遺伝子発現の阻害に最も関連性のある条件下でハイブリダイズする能力は維持されている。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションすると１または複数の一本鎖オーバーハングが形成されるように設計する場合、かかるオーバーハングは相補性の測定に関してミスマッチとみなさないものとする。例えば、２１個のヌクレオチドの長さの１つのオリゴヌクレオチドと２３個のヌクレオチドの長さの別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１個のヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、記載の本明細書の解釈上、それでも「完全に相補的」と称され得る。
「相補的な」配列は、本明細書で用いる場合、非ワトソン－クリック塩基対および／または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドで形成された塩基対も含むものであってもよく、完全に非ワトソン－クリック塩基対および／または非天然ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドで形成された塩基対から形成されていてもよいが、ハイブリダイズする能力に関する上記の要件を満たしている場合に限る。かかる非ワトソン－クリック塩基対としては、限定されないが、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対合またはフーグスティーン型塩基対合が挙げられる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、使用されている状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間またはＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基のマッチングに関して使用され得る。
本明細書で用いる場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、対象ｍＲＮＡ（例えば、ＡＰＰコードｍＲＮＡ）の連続した一部分に実質的に相補的であるポリヌクレオチドを示す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＡＰＰコードｍＲＮＡの割り込みのない一部分に実質的に相補的である場合、ＡＰＰ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示のアンチセンス鎖のポリヌクレオチドは標的ＡＰＰ配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示のアンチセンス鎖のポリヌクレオチドは標的ＡＰＰ配列に実質的に相補的であり、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列の対応領域の全長において、または配列番号：１～１４の断片に少なくとも約８０％相補的である、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である連続したヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態において、本明細書に開示のアンチセンスポリヌクレオチドは標的ＡＰＰ配列に実質的に相補的であり、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂもしくは２６のうちのいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの全長において、または表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂもしくは２６のうちのいずれか１つのセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つの断片に少なくとも約８０％相補的である、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である連続したヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、アンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であるセンス鎖を含み、さらには該アンチセンスポリヌクレオチドが標的ＡＰＰ配列と同じであり、ここで、該センス鎖のポリヌクレオチドは、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列の対応領域の全長において、または配列番号：１５～２８のうちのいずれか１つの断片に少なくとも約８０％相補的である、例えば約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％相補的である連続したヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、ＡＰＰ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＡＰＰ遺伝子が転写され、ＡＰＰ遺伝子の発現が阻害されるような処理がなされている第１の細胞または細胞群から単離され得るか、または該第１の細胞または細胞群において検出され得るＡＰＰ ｍＲＮＡの量が、該第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのような処理がなされていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比べて低減されていることによって評価される。阻害の度合いは：
Figure 2022515193000004
 の形で示され得る。
ｄｓＲＮＡなどの「ＲＮＡｉ薬剤と細胞を接触させる」という語句は、本明細書で用いる場合、考えられ得る任意の手段による細胞の接触を含む。細胞をＲＮＡｉ薬剤と接触させることは、細胞をインビトロでＲＮＡｉ薬剤と接触させること、または細胞をインビボでＲＮＡｉ薬剤と接触させることを含む。接触は直接行なってもまたは間接的に行なってもよい。したがって、例えば、ＲＮＡｉ薬剤は、個人が該方法を行なうことによって細胞との物理的接触状態になり得るか、あるいはまた、ＲＮＡｉ薬剤は、後に細胞との接触状態になることが可能になるか、または後に細胞との接触状態が引き起こされる状況に置かれ得る。
インビトロでの細胞の接触は、例えば細胞をＲＮＡｉ薬剤とともにインキュベートすることにより行なわれ得る。インビボでの細胞の接触は、例えば、ＲＮＡｉ薬剤を、該細胞が位置する組織内または該組織付近に注射することにより、またはＲＮＡｉ薬剤を別の領域内、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）に任意選択で髄腔内、硝子体内もしくは他の注射によって、あるいは血流もしくは皮下腔に注射し、該薬剤が後に、接触させる細胞が位置する組織に達するようにすることにより行なわれ得る。例えば、ＲＮＡｉ薬剤は、ＲＮＡｉ薬剤を対象部位、例えばＣＮＳに指向する、および／またはＲＮＡｉ薬剤を対象部位、例えばＣＮＳで別の様式で安定化させるリガンド、例えば、後述しており、例えば米国特許出願第６２／６６８，０７２号、同第６２／７３８，７４７号および／または同第６２／７７３，０８２号にさらに詳述されているような親油性部分（１つまたは複数）を含有し得る、および／または該リガンドにカップリングされ得る。インビトロ接触法とインビボ接触法の併用も可能である。例えば、細胞はまた、インビトロでＲＮＡｉ薬剤と接触させられ、その後、対象に移植され得る。
一実施形態において、細胞をＲＮＡｉ薬剤と接触させることは、細胞内への取込みまたは吸収を助長すること、またはもたらすことよって「導入すること」または「ＲＮＡｉ薬剤を細胞内に送達すること」を含む。ＲＮＡｉ薬剤の吸収または取込みは、補助なしの拡散的もしくは能動的な細胞プロセスによって、または補助薬剤もしくは補助デバイスによって行なわれ得る。細胞内へのＲＮＡｉ薬剤の導入はインビトロおよび／またはインビボであり得る。例えば、インビボ導入のためには、ＲＮＡｉ薬剤は組織部位内に注射され得るか、または全身投与され得る。細胞内へのインビトロ導入としては、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどの当該技術分野で知られた方法が挙げられる。さらなるアプローチは本明細書において後述している、および／または当該技術分野で知られている。
用語「親油性」または「親油性部分」は幅広く、脂質に対する親和性を有する任意の化合物または化学部分を示す。親油性部分の親油性を特性評価するための様式の一例は、オクタノール－水分配係数ｌｏｇＫｏｗによるものであり、ここで、Ｋｏｗは、平衡状態の二相系における化学薬品のオクタノール相中の濃度のその水相中の濃度に対する比である。オクタノール－水分配係数は、物質の実験室測定特性である。しかしながら、これは、第一原理または経験的方法を用いて計算される、化学薬品の該構造成分に帰属する係数を使用することによっても予測され得る（例えば、Ｔｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．４１：１４０７－２１（２００１）参照、これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これは、物質が、水ではなく非水性または油性の環境を好む傾向（すなわち、その親水性／親油性バランス）の熱力学的尺度をもたらす。原則的に、化学物質は、そのｌｏｇＫｏｗが０より大きい場合、親油性の性質である。典型的には、親油性部分は、１より大きい、１．５より大きい、２より大きい、３より大きい、４より大きい、５より大きい、または１０より大きいｌｏｇＫｏｗを有する。例えば、６－アミノヘキサノールのｌｏｇＫｏｗは、例えばおよそ０．７であると予測される。同じ方法を用いて、コレステリルＮ－（ヘキサン－６－オール）カルバメートのｌｏｇＫｏｗは１０．７であると予測される。
分子の親油性は担持されている官能基に関連して変化し得る。例えば、ヒドロキシル基またはアミン基を親油性部分の端に付加すると、該親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫｏｗ）の値は増減し得る。
あるいはまた、１または複数の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定され得る。例えば、一部の特定の実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合分率は二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の相対的疎水性と正相関すると決定され得るかもしれず、次いで、これが、該二本鎖ＲＮＡｉ薬剤のサイレンシング活性と正相関し得るかもしれない。
一実施形態において、測定が実施される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を用いる電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的なプロトコルは、例えば米国特許出願第６２／６６８，０７２号、同第６２／７３８，７４７号および／または同第６２／７７３，０８２号に詳細に示されている。結合アッセイにおける非結合ｓｉＲＮＡ分率によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の疎水性は、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の促進のためには、０．１５より大きい、０．２より大きい、０．２５より大きい、０．３より大きい、０．３５より大きい、０．４より大きい、０．４５より大きい、または０．５より大きい。
したがって、親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の内部位置（１つまたは複数）にコンジュゲートさせると、ｓｉＲＮＡのインビボ送達の促進のために最適な疎水性がもたらされる。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、医薬活性分子、例えば核酸分子、例えばｒＮＡｉ薬剤またはＲＮＡｉ薬剤が転写されるプラスミドを封入している脂質層を含む小胞である。ＬＮＰは、例えば米国特許第６，８５８，２２５号、同第６，８１５，４３２号、同第８，１５８，６０１号および同第８，０５８，０６９号に記載されており、これらの全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いる場合、「対象」は動物、例えば哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えばサルおよびチンパンジー）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、リャマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマおよびクジラ）または鳥類（例えば、アヒルもしくはガチョウ）である。一実施形態において、対象はヒト、例えば、ＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう疾患、障害もしくは病状について処置もしくは評価されるヒト；ＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう疾患、障害もしくは病状のリスクがあるヒト；ＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう疾患、障害もしくは病状を有するヒト；および／または本明細書に記載のようなＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう疾患、障害もしくは病状について処置を受けているヒトである。
本明細書で用いる場合、用語「処置する」または「処置」は、ＡＰＰ遺伝子発現および／またはＡＰＰタンパク質産生と関連している１または複数の症状、例えば、ＡＰＰ関連の疾患または障害、とりわけ例えばＡＤ、ＣＡＡ（例えば、遺伝性ＣＡＡ）およびＥＯＦＡＤの有益な結果または所望の結果、例えば限定されないが、緩和または軽快を示す。また、「処置」は、処置なしで期待される生存期間と比べた生存期間の延長も意味し得る。
用語「低下する」は、対象におけるＡＰＰまたは疾患マーカーもしくは症状のレベルの状況において、かかるレベルの統計学的に有意な減少を示す。該減少は、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれより大きいものであり得る。一部の特定の実施形態では、該減少は少なくとも２０％である。対象におけるＡＰＰレベルの状況における「低下する」は好ましくは、かかる障害がない個体での正常範囲内と認められるレベルまで下がることである。
本明細書で用いる場合、「予防」または「予防する」は、ＡＰＰ遺伝子の発現および／またはＡＰＰタンパク質の産生の低減による恩恵を受けるであろう疾患、障害またはその病状に関して用いる場合、対象が、かかる疾患、障害または病状と関連している症状、例えば、ＡＰＰ遺伝子発現、例えば、種々の形態のＡβ（例えば、Ａβ３８、Ａβ４０および／またはＡβ４２など）の存在、アミロイドプラークおよび／または脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）あるいはアルツハイマー病（ＡＤ）、例えば早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）などの症状を発現する尤度の低減を示す。疾患、障害または病状が発現しないこと、あるいはかかる疾患、障害または病状と関連している症状の発現の低減（例えば、該疾患または障害について臨床的に許容されるスケールで少なくとも約１０％の）、あるいは遅延状態の症状遅延が示されること（例えば、数日、数週間、数ヶ月または数年）が有効な予防とみなされる。
本明細書で用いる場合、用語「ＡＰＰ関連疾患」は、ＡＰＰ遺伝子発現またはＡＰＰタンパク質産生によって引き起こされるか、あるいはＡＰＰ遺伝子発現またはＡＰＰタンパク質産生と関連している疾患または障害である。用語「ＡＰＰ関連疾患」には、ＡＰＰ遺伝子の発現、複製またはタンパク質活性の減少による恩恵を受けるであろう疾患、障害または病状が包含される。ＡＰＰ関連疾患の非限定的な例としては、例えば脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）、例えば早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）などが挙げられる。
「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、ＡＰＰ関連障害を有する対象に投与されたとき、該疾患の処置をもたらす（例えば、存在している疾患または疾患の１つもしくはそれより多くの症状を減退させる、軽快させる、または維持することによって）のに充分なＲＮＡｉ薬剤の量を包含していることを意図する。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ薬剤、該薬剤がどのようにして投与されるか、疾患およびその感受性ならびに処置対象の対象の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、以前の処置または併用処置（あれば）の型および他の個々の特性に応じてさまざまであり得る。
「予防有効量」は、本明細書で用いる場合、ＡＰＰ関連障害を有する対象に投与されたとき、該疾患または該疾患の１つもしくはそれより多くの症状を予防する、または軽快させるのに充分なＲＮＡｉ薬剤の量を包含していることを意図する。疾患の軽快としては、疾患過程の遅滞または遅発疾患の重症度の低減が挙げられる。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ薬剤、該薬剤がどのようにして投与されるか、疾患リスクの度合い、ならびに処置対象の患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構成、以前の処置または併用処置（あれば）の型および他の個々の特性に応じてさまざまであり得る。
また、「治療有効量」または「予防有効量」には、ある程度の所望の局所効果または全身性効果を任意の処置に適用可能な妥当な便益／リスク比でもたらすＲＮＡｉ薬剤の量も包含される。本開示の方法に使用されるＲＮＡｉ薬剤は、かかる処置に適用可能な妥当な便益／リスク比が得られるのに充分な量で投与され得る。
語句「薬学的に許容され得る」は、本明細書において、化合物、材料、組成物および／または投薬形態が、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な便益／リスク比に相応し、過度な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症を伴うことなくヒト対象および動物対象の組織との接触における使用に適していることを示すために用いている。
語句「薬学的に許容され得る担体」は、本明細書で用いる場合、ある器官もしくは身体部分から別の器官もしくは身体部分への主題の化合物の運搬または輸送に関与する薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル、例えば液状もしくは固形の増量剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、あるいは溶媒 封入材料を意味する。各担体は、製剤のその他の成分と適合性であり、処置される対象に有害でないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。薬学的に許容され得る担体としての機能を果たし得る材料の一例としては：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばマグネシウム状態、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤用ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）充填剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；ならびに（２２）医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質が挙げられる。
用語「試料」は、本明細書で用いる場合、対象から単離される一群の類似した体液、細胞または組織、ならびに対象内部に存在する体液、細胞または組織を包含している。生体液の例としては、血液、血清および漿液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ、尿、唾液などが挙げられる。組織試料としては、組織、器官または局所領域由来の試料が挙げられ得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の一部または該器官内の液もしくは細胞に由来するものであり得る。一部の特定の実施形態では、試料は、脳（例えば、脳全体または特定の脳セグメントまたは脳内の特定の型細胞、例えば神経細胞およびグリア細胞（星状細胞、希突起膠細胞、小グリア細胞）など）に由来するものであり得る。一部の実施形態では、「対象に由来する試料」は、対象から採取された血液または血漿を示す。さらなる実施形態では、「対象に由来する試料」は、対象に由来する脳組織（もしくはその分割構成要素）または網膜組織（もしくはその分割構成要素）を示す。
ＩＩ．本開示のＲＮＡｉ薬剤
本明細書において、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ薬剤を記載する。一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は細胞内、例えば、ＡＰＰ関連障害、例えば脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）、例えば早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）などを有する対象、例えば哺乳動物、例えばヒト内部の細胞内におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。該ｄｓＲＮＡは、ＡＰＰ遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は約３０個またはそれより少ないヌクレオチドの長さ（例えば約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９もしくは１８個のヌクレオチドまたはそれより少ない長さ）である。ＡＰＰ遺伝子を発現している細胞と接触すると、ＲＮＡｉ薬剤はＡＰＰ遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類または鳥類のＡＰＰ遺伝子）の発現を、例えばＰＣＲもしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法による解析で、または例えばウエスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー手法を使用するタンパク質ベースの方法、例えば免疫蛍光解析による解析で、少なくとも約１０％阻害する。
ｄｓＲＮＡは、相補的であり、該ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含む。標的配列は、ＡＰＰ遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの配列に由来するものであり得る。他方の鎖（センス鎖）はアンチセンス鎖に相補的である領域を含み、適当な条件下で合わせるとこの２つの鎖がハイブリダイズして二重鎖構造を形成するようになっている。また、本明細書の他の箇所に記載のように、および当該技術分野で知られているように、ｄｓＲＮＡの相補的な配列が、別々のオリゴヌクレオチドに存在しているのではなく、単一の核酸分子の自己相補領域として含まれていることもあり得る。
一般的に、二重鎖構造は１５～３０塩基対の長さ、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対の長さである。一部の特定の好ましい実施形態では、二重鎖構造が１８～２５塩基対の長さ、例えば１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～２５、２３～２４または２４～２５塩基対の長さである。上記に記載の範囲および長さの間にある範囲および長さもまた本開示の一部であることが想定される。
同様に、標的配列に対する相補性の領域は１５～３０個のヌクレオチドの長さ、例えば１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２個のヌクレオチドの長さである。上記に記載の範囲および長さの間にある範囲および長さもまた本開示の一部であることが想定される。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは約１５～約２３個のヌクレオチドの長さ、または約２５～約３０個のヌクレオチドの長さである。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素の基質としての機能を果たすのに充分に長い。例えば、約２１～２３個より長いヌクレオチドのｄｓＲＮＡはＤｉｃｅｒの基質としての機能を果たすことができるというのは当該技術分野でよく知られている。また、当業者には認識されるように、ＲＮＡの切断の標的対象領域はほとんどの場合、大型ＲＮＡ分子の、多くの場合ｍＲＮＡ分子の一部である。該当する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路による切断）の基質となることが可能であるのに充分な長さの、ｍＲＮＡ標的の連続した配列である。
また、当業者には該二重鎖領域がｄｓＲＮＡの主要な機能性部分であることが認識され、例えば二重鎖領域は約９～３６塩基対、例えば約１０～３６、１１～３６、１２～３６、１３～３６、１４～３６、１５～３６、９～３５、１０～３５、１１～３５、１２～３５、１３～３５、１４～３５、１５～３５、９～３４、１０～３４、１１～３４、１２～３４、１３～３４、１４～３４、１５～３４、９～３３、１０～３３、１１～３３、１２～３３、１３～３３、１４～３３、１５～３３、９～３２、１０～３２、１１～３２、１２～３２、１３～３２、１４～３２、１５～３２、９～３１、１０～３１、１１～３１、１２～３１、１３～３２、１４～３１、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３または２１～２２塩基対である。したがって、一実施形態では、切断のための所望のＲＮＡを標的化する例えば１５～３０塩基対の機能性二重鎖にプロセッシングされる限りにおいて、３０塩基対より多くの二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子複合体がｄｓＲＮＡである。したがって、当業者には、一実施形態ではｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることは認識されよう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは天然に存在するｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＡＰＰ発現を標的化するのに有用なＲＮＡｉ薬剤は、標的細胞内で大型ｄｓＲＮＡの切断によって生成するものではない。
本明細書に記載のようなｄｓＲＮＡは、例えば１、２、３または４個のヌクレオチドの１または複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも１個のヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、予期せずして、平滑端の対応物と比べて卓越した阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログ、例えばデオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むものであってもよく、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログ、例えばデオキシヌクレオチド／ヌクレオシドからなるものであってもよい。オーバーハング（１つまたは複数）は、センス鎖、アンチセンス鎖またはその任意の組合せに存在し得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチド（１個または複数）は、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’端、３’端または両端に存在し得る。
ｄｓＲＮＡは、以下にさらに論考するような当該技術分野で知られた標準的な方法によって、例えば、例えばＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているものなどの自動ＤＮＡ合成装置の使用によって合成され得る。
本開示のＲＮＡｉ薬剤は、二工程手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別々に調製される。次いで、この成分鎖がアニーリングされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は液相もしくは固相での有機合成または両方を用いて調製され得る。有機合成では、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点がもたらされる。本開示の一本鎖オリゴヌクレオチドは液相もしくは固相での有機合成または両方を用いて調製され得る。
一態様において、本開示のｄｓＲＮＡは、センス配列とアンチセンス配列の少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。センス鎖配列は、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のうちのいずれか１つに示す配列の群から選択され得、センス鎖の対応するヌクレオチド配列であるアンチセンス鎖は、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のうちのいずれか１つの配列の群から選択され得る。この態様において、該２つの配列の一方は該２つの配列の他方に相補的であり、一方の配列は、ＡＰＰ遺伝子の発現で生じるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。そのため、この態様において、ｄｓＲＮＡは２つのオリゴヌクレオチドを含み、このとき、一方のオリゴヌクレオチドは、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のうちのいずれか１つのセンス鎖（パッセンジャー鎖）として記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のうちのいずれか１つのセンス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として記載される。したがって、一例として、表３のセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列の以下のペアでの選択が本開示の二重鎖を形成すると明白に想定される：配列番号：８５５と８５６；配列番号：８５７と８５８；配列番号：８５９と８６０；配列番号：８６１と８６２；配列番号：８６３と８６４；配列番号：８６５と８６６；配列番号：８６７と８６８；配列番号：８６９と８７０；配列番号：８７１と８７２；配列番号：８７３と８７４；配列番号：８７５と８７６；配列番号：８７７と８７８；配列番号：８７９と８８０；配列番号：８８１と８８２；配列番号：８８３と８８４；配列番号：８８５と８８６；配列番号：８８７と８８８；配列番号：８８９と８９０；配列番号：８９１と８９２；配列番号：８９３と８９４；配列番号：８９５と８９６；配列番号：８９７と８９８；配列番号：８９９と９００；配列番号：９０１と９０２；配列番号：９０３と９０４；配列番号：９０５と９０６；配列番号：９０７と９０８；配列番号：９０９と９１０；配列番号：９１１と９１２；配列番号：９１３と９１４；配列番号：９１５と９１６；配列番号：９１７と９１８；配列番号：９１９と９２０；配列番号：９２１と９２２；配列番号：９２３と９２４；配列番号：９２５と９２６；配列番号：９２７と９２８；配列番号：９２９と９３０；配列番号：９３１と９３２；配列番号：９３３と９３４；配列番号：９３５と９３６；配列番号：９３７と９３８；配列番号：９３９と９４０；配列番号：９４１と９４２；配列番号：９４３と９４４；配列番号：９４５と９４６；配列番号：９４７と９４８；配列番号：９４９と９５０；配列番号：９５１と９５２；配列番号：９５３と９５４；配列番号：９５５と９５６；配列番号：９５７と９５８；配列番号：９５９と９６０；配列番号：９６１と９６２；配列番号：９６３と９６４；配列番号：９６５と９６６；配列番号：９６７と９６８；配列番号：９６９と９７０；配列番号：９７１と９７２；配列番号：９７３と９７４；配列番号：９７５と９７６；配列番号：９７７と９７８；配列番号：９７９と９８０；配列番号：９８１と９８２；配列番号：９８３と９８４；配列番号：９８５と９８６；配列番号：９８７と９８８；配列番号：９８９と９９０；配列番号：９９１と９９２；配列番号：９９３と９９４；配列番号：９９５と９９６；配列番号：９９７と９９８；配列番号：９９９と１０００；配列番号：１００１と１００２；配列番号：１００３と１００４；配列番号：１００５と１００６；配列番号：１００７と１００８；配列番号：１００９と１０１０；配列番号：１０１１と１０１２；配列番号：１０１３と１０１４；配列番号：１０１５と１０１６；配列番号：１０１７と１０１８；配列番号：１０１９と１０２０；配列番号：１０２１と１０２２；配列番号：１０２３と１０２４；配列番号：１０２５と１０２６；配列番号：１０２７と１０２８；配列番号：１０２９と１０３０；配列番号：１０３１と１０３２；配列番号：１０３３と１０３４；配列番号：１０３５と１０３６；配列番号：１０３７と１０３８；配列番号：１０３９と１０４０；配列番号：１０４１と１０４２；配列番号：１０４３と１０４４；配列番号：１０４５と１０４６；配列番号：１０４７と１０４８；配列番号：１０４９と１０５０；配列番号：１０５１と１０５２；配列番号：１０５３と１０５４；配列番号：１０５５と１０５６；配列番号：１０５７と１０５８；配列番号：１０５９と１０６０；配列番号：１０６１と１０６２；配列番号：１０６３と１０６４；配列番号：１０６５と１０６６；配列番号：１０６７と１０６８；配列番号：１０６９と１０７０；配列番号：１０７１と１０７２；配列番号：１０７３と１０７４；配列番号：１０７５と１０７６；配列番号：１０７７と１０７８；配列番号：１０７９と１０８０；配列番号：１０８１と１０８２；配列番号：１０８３と１０８４；配列番号：１０８５と１０８６；配列番号：１０８７と１０８８；配列番号：１０８９と１０９０；配列番号：１０９１と１０９２；配列番号：１０９３と１０９４；配列番号：１０９５と１０９６；配列番号：１０９７と１０９８；配列番号：１０９９と１１００；配列番号：１１０１と１１０２；配列番号：１１０３と１１０４；配列番号：１１０５と１１０６；配列番号：１１０７と１１０８；配列番号：１１０９と１１１０；配列番号：１１１１と１１１２；配列番号：１１１３と１１１４；配列番号：１１１５と１１１６；配列番号：１１１７と１１１８；配列番号：１１１９と１１２０；配列番号：１１２１と１１２２；配列番号：１１２３と１１２４；配列番号：１１２５と１１２６；配列番号：１１２７と１１２８；配列番号：１１２９と１１３０；配列番号：１１３１と１１３２；配列番号：１１３３と１１３４；配列番号：１１３５と１１３６；配列番号：１１３７と１１３８；配列番号：１１３９と１１４０；配列番号：１１４１と１１４２；配列番号：１１４３と１１４４；配列番号：１１４５と１１４６；配列番号：１１４７と１１４８；配列番号：１１４９と１１５０；配列番号：１１５１と１１５２；配列番号：１１５３と１１５４；配列番号：１１５５と１１５６；配列番号：１１５７と１１５８；配列番号：１１５９と１１６０；配列番号：１１６１と１１６２；配列番号：１１６３と１１６４；配列番号：１１６５と１１６６；配列番号：１１６７と１１６８；配列番号：１１６９と１１７０；配列番号：１１７１と１１７２；配列番号：１１７３と１１７４；配列番号：１１７５と１１７６；配列番号：１１７７と１１７８；配列番号：１１７９と１１８０；配列番号：１１８１と１１８２；配列番号：１１８３と１１８４；配列番号：１１８５と１１８６；配列番号：１１８７と１１８８；配列番号：１１８９と１１９０；配列番号：１１９１と１１９２；配列番号：１１９３と１１９４；配列番号：１１９５と１１９６；配列番号：１１９７と１１９８；配列番号：１１９９と１２００；配列番号：１２０１と１２０２；配列番号：１２０３と１２０４；配列番号：１２０５と１２０６；配列番号：１２０７と１２０８；配列番号：１２０９と１２１０；配列番号：１２１１と１２１２；配列番号：１２１３と１２１４；配列番号：１２１５と１２１６；配列番号：１２１７と１２１８；配列番号：１２１９と１２２０；配列番号：１２２１と１２２２；配列番号：１２２３と１２２４；配列番号：１２２５と１２２６；配列番号：１２２７と１２２８；配列番号：１２２９と１２３０；配列番号：１２３１と１２３２；配列番号：１２３３と１２３４；配列番号：１２３５と１２３６；配列番号：１２３７と１２３８；配列番号：１２３９と１２４０；配列番号：１２４１と１２４２；配列番号：１２４３と１２４４；配列番号：１２４５と１２４６；配列番号：１２４７と１２４８；配列番号：１２４９と１２５０；配列番号：１２５１と１２５２；配列番号：１２５３と１２５４；配列番号：１２５５と１２５６；配列番号：１２５７と１２５８；配列番号：１２５９と１２６０；配列番号：１２６１と１２６２；配列番号：１２６３と１２６４；配列番号：１２６５と１２６６；配列番号：１２６７と１２６８；配列番号：１２６９と１２７０；配列番号：１２７１と１２７２；配列番号：１２７３と１２７４；配列番号：１２７５と１２７６；配列番号：１２７７と１２７８；配列番号：１２７９と１２８０；配列番号：１２８１と１２８２；配列番号：１２８３と１２８４；配列番号：１２８５と１２８６；配列番号：１２８７と１２８８；配列番号：１２８９と１２９０；配列番号：１２９１と１２９２；配列番号：１２９３と１２９４；配列番号：１２９５と１２９６；配列番号：１２９７と１２９８；配列番号：１２９９と１３００；配列番号：１３０１と１３０２；配列番号：１３０３と１３０４；配列番号：１３０５と１３０６；配列番号：１３０７と１３０８；配列番号：１３０９と１３１０；配列番号：１３１１と１３１２；配列番号：１３１３と１３１４；配列番号：１３１５と１３１６；配列番号：１３１７と１３１８；配列番号：１３１９と１３２０；配列番号：１３２１と１３２２；配列番号：１３２３と１３２４；配列番号：１３２５と１３２６；配列番号：１３２７と１３２８；配列番号：１３２９と１３３０；配列番号：１３３１と１３３２；配列番号：１３３３と１３３４；配列番号：１３３５と１３３６；配列番号：１３３７と１３３８；配列番号：１３３９と１３４０；配列番号：１３４１と１３４２；配列番号：１３４３と１３４４；配列番号：１３４５と１３４６；配列番号：１３４７と１３４８；配列番号：１３４９と１３５０；配列番号：１３５１と１３５２；配列番号：１３５３と１３５４；配列番号：１３５５と１３５６；配列番号：１３５７と１３５８；配列番号：１３５９と１３６０；配列番号：１３６１と１３６２；配列番号：１３６３と１３６４；配列番号：１３６５と１３６６；配列番号：１３６７と１３６８；配列番号：１３６９と１３７０；配列番号：１３７１と１３７２；配列番号：１３７３と１３７４；配列番号：１３７５と１３７６；配列番号：１３７７と１３７８；配列番号：１３７９と１３８０；配列番号：１３８１と１３８２；配列番号：１３８３と１３８４；配列番号：１３８５と１３８６；配列番号：１３８７と１３８８；配列番号：１３８９と１３９０；配列番号：１３９１と１３９２；配列番号：１３９３と１３９４；配列番号：１３９５と１３９６；配列番号：１３９７と１３９８；配列番号：１３９９と１４００；および配列番号：１４０１と１４０２。同様に、本開示の表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のセンス鎖とアンチセンス鎖のペアでの組合せも明白に想定され、例えば、表２Ａから選択されるセンス鎖が表２Ｂから選択されるアンチセンス鎖と一体となる、またはその逆などが挙げられる。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は別々のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一のオリゴヌクレオチドに含まれる。
表２Ａ、２Ｂ、５Ａ、５Ｂ、９、１０、１２、１４、１６Ａ、１６Ｂおよび２６の配列は修飾型および／またはコンジュゲート型の配列として記載しているが、本開示のＲＮＡｉ薬剤のＲＮＡ、例えば、本開示のｄｓＲＮＡは、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のうちのいずれか１つに示された配列のうちのいずれか１つを、非修飾型、非コンジュゲート型および／または本明細書に記載のものとは異なる修飾型および／またはコンジュゲート型で含むものであってもよいことは理解されよう。
当業者は、約２０～２３塩基対、例えば２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡがＲＮＡ干渉の誘導に特に有効であると称賛されていることを充分に承知している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、より短鎖またはより長鎖のＲＮＡ二重鎖構造もまた有効であり得ることが他者によって見出されている（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上記の実施形態において、本明細書において提供するオリゴヌクレオチド配列の性質のおかげで、本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、最低２１個のヌクレオチドの長さの少なくとも一方の鎖を含むものであってもよい。一方の端または両端のヌクレオチドがわずか数個少ない短い二重鎖は上記のｄｓＲＮＡと比べて同様に有効であり得ることが当然期待され得る。したがって、本明細書において提供する配列のうちの１つに由来する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれより多く連続したヌクレオチドの配列を有し、そのＡＰＰ遺伝子の発現を阻害する能力と完全配列を含むｄｓＲＮＡの阻害との差が約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下または約３０％以下であるｄｓＲＮＡは本開示の範囲に含まれることが想定される。
また、本明細書に記載のＲＮＡにより、ＡＰＰ転写物内のＲＩＳＣ媒介性切断を受けやすい部位（１つまたは複数）が特定される。そのため、本開示においてさらに、この部位（１つまたは複数）内を標的化するＲＮＡｉ薬剤を特記する。本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ薬剤は、該ＲＮＡｉ薬剤がＲＮＡ転写物の特定の部位内のどこかで該転写物の切断を促進させる場合、該特定の部位内を標的化するといえる。かかるＲＮＡｉ薬剤は一般的に、本明細書において提供する配列のうちの１つに由来する少なくとも約１５個隣接しているヌクレオチドを、ＡＰＰ遺伝子内の選択された配列と隣接している領域から採用されたさらなるヌクレオチド配列とカップリングされた状態で含む。
本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤は、標的配列との１または複数のミスマッチを含み得る。一実施形態において、本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤は３つ以下のミスマッチを含む。一部の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチは任意選択で、相補性の領域の５’端または３’端のいずれかから最後の５個のヌクレオチド範囲にあると限定され得る。例えば、かかる実施形態において、２３個のヌクレオチドのＲＮＡｉ薬剤では、ＡＰＰ遺伝子の一領域に相補的である鎖は一般的に、中央部の１３個のヌクレオチド範囲にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載の方法または当該技術分野で知られた方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むＲＮＡｉ薬剤がＡＰＰ遺伝子の発現の阻害において有効かどうかを調べることができる。ミスマッチを有するＲＮＡｉ薬剤のＡＰＰ遺伝子の発現の阻害における効力の考慮は、特に、ＡＰＰ遺伝子内の具体的な相補性の領域が集団において多型による配列異型形態を有することがわかっている場合に重要である。
ＩＩＩ．本開示の修飾ＲＮＡｉ薬剤
一実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤のＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは非修飾であり、例えば当該技術分野で知られている本明細書に記載の化学修飾および／またはコンジュゲーションが含まれていない。別の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤のＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特性が向上するように化学修飾されている。本開示の一部の特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤の実質的にすべてのヌクレオチドが修飾されている。本開示の他の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤のすべてのヌクレオチドが修飾されている。「実質的にすべてのヌクレオチドが修飾されている」本開示のＲＮＡｉ薬剤は全体ではなく大部分が修飾されており、含まれている非修飾ヌクレオチドが５個以下、４、３、２または１個であり得る。本開示のさらに他の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤に含まれている修飾ヌクレオチドが５個以下、４、３、２または１個であり得る。
本開示において特記する核酸は、当該技術分野で充分に確立された方法、例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（これは、ここに引用により本明細書に組み込まれる）に記載のものによって合成および／または修飾され得る。修飾としては、例えば、端の修飾、例えば５’端の修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合）もしくは３’端の修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など）；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくはパートナーの拡張レパートリーと塩基対合する塩基での置き換え、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）あるいはコンジュゲート型塩基；糖修飾（例えば、２’位もしくは４’位における）あるいは糖の置き換え；および／または骨格修飾、例えばホスホジエステル結合修飾もしくは置き換えが挙げられる。本明細書に記載の実施形態に有用なＲＮＡｉ薬剤の具体例としては、限定されないが、修飾骨格を含むＲＮＡまたは天然のヌクレオシド間結合が含まれていないＲＮＡが挙げられる。修飾骨格を有するＲＮＡとしては、とりわけ、該骨格内にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の解釈上、および場合によっては当該技術分野で参照されるように、ヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡｉ薬剤はヌクレオシド間骨格にリン原子を有するものである。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミダート、例えば３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、その２’－５’連結アナログ、および隣接するヌクレオシド単位のペアの連結３’－５’が５’－３’または２’－５’が５’－２’である逆の極性を有するものが挙げられる。また、種々の塩、混合塩および遊離酸の形態も挙げられる。
上記のリン含有結合の調製が教示されている代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９５号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３１６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；同第５，６２５，０５０号；同第６，０２８，１８８号；同第６，１２４，４４５号；同第６，１６０，１０９号；同第６，１６９，１７０号；同第６，１７２，２０９号；同第６、２３９，２６５号；同第６，２７７，６０３号；同第６，３２６，１９９号；同第６，３４６，６１４号；同第６，４４４，４２３号；同第６，５３１，５９０号；同第６，５３４，６３９号；同第６，６０８，０３５号；同第６，６８３，１６７号；同第６，８５８，７１５号；同第６，８６７，２９４号；同第６，８７８，８０５号；同第７，０１５，３１５号；同第７，０４１，８１６号；同第７，２７３，９３３号；同第７，３２１，０２９号；および米国再発行特許第３９４６４号が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
リン原子が含まれていない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合型のヌクレオシド間結合、または１つもしくはそれより多くの短鎖ヘテロ原子含有もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。このようなものとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分で形成されている）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２混合成分部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製が教示されている代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態において、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が新規な基で置き換えられた、ＲＮＡｉ薬剤における使用に好適なＲＮＡ模倣物が想定される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。かかるオリゴマー型化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣物はペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖骨格がアミド含有骨格で、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられている。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の調製が教示されている代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。本開示のＲＮＡｉ薬剤における使用に適したさらなるＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。
本開示において特記する一部の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡならびにヘテロ原子骨格、特に、上記に挙げた米国特許第５，４８９，６７７号の－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［ここで、天然状態のホスホジエステル骨格は－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表される］、および上記に挙げた米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書において特記するＲＮＡは、上記に挙げた米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
また、修飾ＲＮＡは１または複数の置換糖部分を含むものであってもよい。本明細書において特記するＲＮＡｉ薬剤、例えばｄｓＲＮＡは２’位に、以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含むものであり得、ここで、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾部としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、ここで、ｎおよびｍは１～約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは２’位に、以下：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ＲＮＡｉ薬剤の薬物動態特性を改善するための基またはＲＮＡｉ薬剤の薬力学的特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。一部の実施形態では、該修飾部としては、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわちアルコキシ－アルコキシ基が挙げられる。別の例示的な修飾部は、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られ、本明細書において以下の実施例に記載のような２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２である。さらなる例示的な修飾部としては：５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド（これらの３つのファミリーのＲおよびＳの両方の異性体）；２’－アルコキシアルキル；ならびに２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾部としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－Ｏ－ヘキサデシルおよび２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。また、同様の修飾がＲＮＡｉ薬剤のＲＮＡの他の位置に、特に、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位または２’－５’連結ｄｓＲＮＡ内および５’末端ヌクレオチドの５’位に行われてもよい。また、ＲＮＡｉ薬剤は、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣物、例えばシクロブチル部分を有するものであってもよい。かかる修飾糖構造の調製が教示されている代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号；同第５，１１８，８００号；同第５，３１９，０８０号；同第５，３５９，０４４号；同第５，３９３，８７８号；同第５，４４６，１３７号；同第５，４６６，７８６号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５１９，１３４号；同第５，５６７，８１１号；同第５，５７６，４２７号；同第５，５９１，７２２号；同第５，５９７，９０９号；同第５，６１０，３００号；同第５，６２７，０５３号；同第５，６３９，８７３号；同第５，６４６，２６５号；同第５，６５８，８７３号；同第５，６７０，６３３号；および同第５，７００，９２０号が挙げられ、これらのうちのあるものは所有者が本出願と共通である。前述のものの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
また、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、核酸塩基（多くの場合、当該技術分野では単に「塩基」と称される）の修飾または置換を含むものであってもよい。本明細書で用いる場合、「非修飾型」または「天然」の核酸塩基にはプリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基、例えば５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルアナル（ａｎａｌ）他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダアザ（ｄａａｚａ）アデニンならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが挙げられる。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されているもの；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のうちの一部の特定のものは、本開示において特記するオリゴマー型化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。このようなものとしては、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンならびにＮ－２、Ｎ－６および０－６置換プリン、例えば２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンが挙げられる。５－メチルシトシン置換体は、核酸の二重鎖安定性を０．６～１．２℃高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、さらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と併せた場合は例示的な塩基置換体である。
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の一部の特定のものの調製が教示されている代表的な米国特許としては、限定されないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，６８１，９４１号；同第５，７５０，６９２号；同第６，０１５，８８６号；同第６，１４７，２００号；同第６，１６６，１９７号；同第６，２２２，０２５号；同第６，２３５，８８７号；同第６，３８０，３６８号；同第６，５２８，６４０号；同第６，６３９，０６２号；同第６，６１７，４３８号；同第７，０４５，６１０号；同第７，４２７，６７２号；および同第７，４９５，０８８号が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
また、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、１または複数のロック核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロック核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を連結している付加的架橋部を含んでいる修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造により、リボースが３’エンド型構造のコンホメーションに有効に「ロック」される。ロック核酸をｓｉＲＮＡに付加すると、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性が高まり、オフターゲット効果が低減されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
また、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、１または複数の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２個の原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（“ＢＮＡ”）は、糖環の２個の炭素原子を連結している架橋部を含み、それにより二環式の環系が形成されている糖部分を有するヌクレオシドである。一部の特定の実施形態では、架橋部が糖環の４’炭素と２’炭素を連結する。したがって、一部の実施形態において、本開示の薬剤は１または複数のロック核酸（ＬＮＡ）を含むものであり得る。ロック核酸は、リボース部分が２’炭素と４’炭素を連結している付加的架橋部を含んでいる修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すると、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋部を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造により、リボースが３’エンド型構造のコンホメーションに有効に「ロック」される。ロック核酸をｓｉＲＮＡに付加すると、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性が高まり、オフターゲット効果が低減されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本開示のポリヌクレオチドにおける使用のための二環式ヌクレオシドの例としては、限定されないが、４’と２’のリボシル環内原子間の架橋部を含むヌクレオシドが挙げられる。一部の特定の実施形態では、本開示のアンチセンスポリヌクレオチド薬剤は、４’と２’の架橋部を含む二環式ヌクレオシドを１または複数含む。かかる４’と２’が架橋された二環式ヌクレオシドの例としては、限定されないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または“ｃＥｔ”とも称される）ならびに４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第７，３９９，８４５号参照）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびそのアナログ；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびそのアナログ；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号参照）；４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許出願公開公報第２００４／０１７１５７０号参照）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’、ここで、ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは保護基である（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号参照）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４参照）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびそのアナログ；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号参照）が挙げられる。前述のものの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
ロック核酸ヌクレオチドの調製が教示されているさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開公報としては、限定されないが、以下のもの：米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，５２５，１９１号；同第６，６７０，４６１号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第６，９９８，４８４号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第７，０８４，１２５号；同第７，３９９，８４５号；同第７，４２７，６７２号；同第７，５６９，６８６号；同第７，７４１，４５７号；同第８，０２２，１９３号；同第８，０３０，４６７号；同第８，２７８，４２５号；同第８，２７８，４２６号；同第８，２７８，２８３号；ＵＳ２００８／００３９６１８；およびＵＳ ２００９／００１２２８１が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
１または複数の立体化学的糖構成を有する以下の任意の二環式ヌクレオシド、例えば、α－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースなどが調製され得る（ＷＯ９９／１４２２６参照）。
また、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、１または複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で用いる場合、「拘束エチルヌクレオチド」または“ｃＥｔ”は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－０－２’架橋部を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において“Ｓ－ｃＥｔ”と称するＳコンホメーションである。
また、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、１または複数の「コンホメーション制限ヌクレオチド」（“ＣＲＮ”）を含むものであってもよい。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素またはリボースのＣ３炭素とＣ５’炭素を連結しているリンカーを有するヌクレオチドアナログである。ＣＲＮはリボース環を安定なコンホメーションにロックし、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を高める。リンカーは、酸素を安定性および親和性のための最適な位置に配置し、リボース環のパッカリングが少なくなるのに充分な長さのものである。
上記のＣＲＮのうちの一部の特定のものの調製が教示されている代表的な刊行物としては、限定されないが、米国特許出願公開公報第２０１３／０１９０３８３号；およびＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１３／０３６８６８が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、ＵＮＡ（アンロック核酸）ヌクレオチドである１または複数の単量体を含む。ＵＮＡは、非環式のアンロック核酸であり、糖の結合のいずれかが除去されてアンロック「糖」残基が形成されている。一例では、ＵＮＡには、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素間の炭素－酸素－炭素共有結合）が除去されている単量体もまた包含される。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’間結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素間の炭素－炭素共有結合）が除去されている（引用により本明細書に組み込まれるＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９参照）。
ＵＮＡの調製が教示されている代表的な米国特許出願公開公報としては、限定されないが、米国特許第８，３１４，２２７号；ならびに米国特許出願公開公報第２０１３／００９６２８９号；同第２０１３／００１１９２２号；および同第２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ分子の端に対する潜在的安定化性修飾部としては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－０－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－ホスフェート、逆位塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられ得る。この修飾の開示はＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１１／００５８６１号にみられ得る。
本開示のＲＮＡｉ薬剤の他の修飾部としては、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣部、例えばＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖の５’末端のホスフェート部またはホスフェート模倣部が挙げられる。好適なホスフェート模倣部は、例えば米国特許出願公開公報第２０１２／０１５７５１１号に開示されており、その全内容は引用により本明細書に組み込まれる。
Ａ．本開示のモチーフを含む修飾ＲＮＡｉ薬剤
本開示の一部の特定の態様において、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は、例えば、２０１２年１１月１６日に出願されたＷＯ２０１３／０７５０３５（その全内容は引用により本明細書に組み込まれる）に開示されているような、化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書およびＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１３／０７５０３５号に示されているように、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１または複数のモチーフをＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖に、特に切断部位または切断部位付近に導入することにより、卓越した結果が得られ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は別の様式で完全に修飾され得る。このようなモチーフの導入により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターン（存在するならば）に割り込みが入る。ＲＮＡｉ薬剤は任意選択で、例えばセンス鎖においてＣ１６リガンドとコンジュゲートされ得る。ＲＮＡｉ薬剤は任意選択で、例えばアンチセンス鎖の１または複数の残基が（Ｓ）－グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾により修飾され得る。得られるＲＮＡｉ薬剤は卓越した遺伝子サイレンシング活性を示す。
より具体的には、驚くべきことに、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１または複数のモチーフをＲＮＡｉ薬剤の少なくとも一方の鎖の切断部位または切断部位付近に有するように完全に修飾した場合、ＲＮＡｉ薬剤の遺伝子サイレンシングアシテビティ（ａｃｉｔｉｖｉｔｙ）が卓越して向上したことが見い出された。
したがって、本開示により、標的遺伝子（すなわち、ＡＰＰ遺伝子）の発現をインビボで阻害するできる二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を提供する。ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ薬剤の各鎖は１２～３０個のヌクレオチドの長さの範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４～３０個のヌクレオチドの長さ、１７～３０個のヌクレオチドの長さ、２５～３０個のヌクレオチドの長さ、２７～３０個のヌクレオチドの長さ、１７～２３個のヌクレオチドの長さ、１７～２１個のヌクレオチドの長さ、１７～１９個のヌクレオチドの長さ、１９～２５個のヌクレオチドの長さ、１９～２３個のヌクレオチドの長さ、１９～２１個のヌクレオチドの長さ、２１～２５個のヌクレオチドの長さ、または２１～２３個のヌクレオチドの長さであり得る。
センス鎖とアンチセンス鎖は典型的には、本明細書において「ＲＮＡｉ薬剤」とも称する二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（“ｄｓＲＮＡ”）を形成する。ＲＮＡｉ薬剤の二重鎖領域は１２～３０ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二重鎖領域は、１４～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～３０ヌクレオチド対の長さ、２７～３０ヌクレオチド対の長さ、１７～２３ヌクレオチド対の長さ、１７～２１ヌクレオチド対の長さ、１７～１９ヌクレオチド対の長さ、１９～２５ヌクレオチド対の長さ、１９～２３ヌクレオチド対の長さ、１９～２１ヌクレオチド対の長さ、２１～２５ヌクレオチド対の長さ、または２１～２３ヌクレオチド対の長さであり得る。別の例では、二重鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６および２７個のヌクレオチドの長さから選択される。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、１または複数のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を一方または両方の鎖の３’端、５’端または両端に含むものであり得る。オーバーハングは、１～６個のヌクレオチドの長さ、例えば、２～６個のヌクレオチドの長さ、１～５個のヌクレオチドの長さ、２～５個のヌクレオチドの長さ、１～４個のヌクレオチドの長さ、２～４個のヌクレオチドの長さ、１～３個のヌクレオチドの長さ、２～３個のヌクレオチドの長さ、または１～２個のヌクレオチドの長さであり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長い結果、または同じ長さの２つの鎖がずれている結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、または標的化対象の遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。また、第１の鎖と第２の鎖が、例えば、ヘアピンを形成するためのさらなる塩基によって、または他の非塩基リンカーによって接合されていてもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のオーバーハング内のヌクレオチド領域は各々、独立して、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチド、例えば限定されないが、２’－糖修飾型、例えば２－Ｆ、２’－Ｏメチル、チミジン（Ｔ）および任意のその組合せであり得る。
例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの端のオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得るか、または標的化対象の遺伝子配列に相補的であり得るか、または別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の５’－オーバーハングまたは３’－オーバーハングがリン酸化されていてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域（１つまたは複数）が、２個のヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２個のヌクレオチドを含み、ここで、該２個のヌクレオチドは同じであっても異なっていてもよい。一実施形態において、オーバーハングはセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’端に存在している。一実施形態において、この３’－オーバーハングはアンチセンス鎖内に存在している。一実施形態において、この３’－オーバーハングはセンス鎖内に存在している。
ＲＮＡｉ薬剤は、ＲＮＡｉの干渉活性を全体的安定性に影響することなく強化し得るオーバーハングを１つだけ含むものであり得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’終末端に、あるいはまたアンチセンス鎖の３’終末端に位置し得る。また、ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’端（もしくはセンス鎖の３’端）またはその逆の場合に位置する平滑末端を有するものであってもよい。一般的に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖はヌクレオチドオーバーハングを３’端に有し、５’端は平滑である。理論に拘束されることを望まないが、アンチセンス鎖の５’端が平滑末端でアンチセンス鎖の３’端がオーバーハングという非相称性は、ガイド鎖がＲＩＳＣプロセスに負荷されるのに有利となる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は１９個のヌクレオチドの長さの両端平滑体であり、ここで、センス鎖は、５’端から７位、８位、９位に３つの２’－Ｆ修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’端から１１位、１２位、１３位に３つの２’－Ｏ－メチル修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、２０個のヌクレオチドの長さの両端平滑体であり、ここで、センス鎖は、５’端から８位、９位、１０位に３つの２’－Ｆ修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’端から１１位、１２位、１３位に３つの２’－Ｏ－メチル修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。
また別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、２１個のヌクレオチドの長さの両端平滑体であり、ここで、センス鎖は、５’端から９位、１０位、１１位に３つの２’－Ｆ修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’端から１１位、１２位、１３位に３つの２’－Ｏ－メチル修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は２１個のヌクレオチドのセンス鎖と２３個のヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、５’端から９位、１０位、１１位に３つの２’－Ｆ修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含み；アンチセンス鎖は、５’端から１１位、１２位、１３位に３つの２’－Ｏ－メチル修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ薬剤の一方の端は平滑であるが、他方の端は２個のヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、該２個のヌクレオチドのオーバーハングはアンチセンス鎖の３’端に存在する。該２個のヌクレオチドのオーバーハングがアンチセンス鎖の３’端に存在する場合、３個の末端ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し得、ここで、該３個のヌクレオチドのうちの２個はオーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドの隣の対合ヌクレオチドである。一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤はさらに、センス鎖の５’端とアンチセンス鎖の５’端の両方の３個の末端ヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。一実施形態において、該モチーフの一部であるヌクレオチドを含むＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドも修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、各残基は独立して２’－Ｏ－メチルまたは３’－フルオロで、例えば交互モチーフで修飾されている。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤はリガンド（任意選択でＣ１６リガンド）をさらに含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、センス鎖は２５～３０個のヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチドを始点（１位）として、第１の鎖の１位～２３位は少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は３６～６６個のヌクレオチド残基の長さであり、３’末端ヌクレオチドを始点として、センス鎖の１位～２３位と対合して二重鎖を形成している位置に少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；少なくともアンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と非対合であり、最大６個まで連続した３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と非対合であり、それにより１～６個のヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成しており；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と非対合であり、それにより１０～３０個のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成している１０～３０個連続したヌクレオチドを含み；少なくともセンス鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖が最大の相補性でアラインメントされる場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖間の実質的に二重鎖の領域を形成し；二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された場合、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の少なくとも１９個のリボヌクレオチドの長さにおいて標的ＲＮＡに、標的遺伝子発現が低減されるのに充分に相補的であり；センス鎖は、３つの２’－Ｆ修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含み、該モチーフのうち少なくとも１つは切断部位または切断部位付近に存在する。アンチセンス鎖は、３つの２’－Ｏ－メチル修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを切断部位または切断部位付近に含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、該ＲＮＡｉ薬剤は、少なくとも２５個で最大２９個のヌクレオチドである長さを有する第１の鎖と、最大３０個のヌクレオチドである長さを有し、５’端から１１位、１２位、１３位に３つの２’－Ｏ－メチル修飾をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを有する第２の鎖を含み；第１の鎖の３’端と第２の鎖の５’端は平滑末端を形成しており、第２の鎖は、その３’端において第１の鎖より１～４個のヌクレオチド分長く、二重鎖領域 少なくとも２５個のヌクレオチドの長さである領域、ＲＮＡｉ薬剤が哺乳動物細胞内に導入された場合、第２の鎖は、第２の鎖の少なくとも１９個のヌクレオチドの長さにおいて標的ｍＲＮＡに、標的遺伝子発現が低減されるのに充分に相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎａｔａｒｙ）であり、ＲＮＡｉ薬剤のダイサー切断により第２の鎖の３’端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減される。任意選択で、ＲＮＡｉ薬剤はリガンドをさらに含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖は、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含み、該モチーフのうち１つはセンス鎖内の切断部位に存在する。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖もまた、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを含み得、該モチーフのうち１つはアンチセンス鎖内の切断部位または該切断部位付近に存在する。
１７～２３個のヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有するＲＮＡｉ薬剤では、アンチセンス鎖の切断部位は典型的には５’端から１０位、１１位および１２位のあたりである。したがって、３つの同一の修飾部のモチーフは、アンチセンス鎖の５’端から１番目のヌクレオチドから数え始めて、または二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から１番目の対合ヌクレオチドから数え始めて、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得る。アンチセンス鎖内の切断部位は、ＲＮＡｉの二重鎖領域の５’端からの長さに応じて変化することもあり得る。
ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖は、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを該鎖の切断部位に含むものであり得；アンチセンス鎖は、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの少なくとも１つのモチーフを該鎖の切断部位または切断部位付近に有するものであり得る。センス鎖とアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合、センス鎖とアンチセンス鎖は、センス鎖の該３個のヌクレオチドの１つのモチーフとアンチセンス鎖の該３個のヌクレオチドの１つのモチーフが少なくとも１個のオーバーラップヌクレオチドを有するように、すなわち、センス鎖内の該モチーフの３個のヌクレオチドのうち少なくとも１個がアンチセンス鎖内の該モチーフの３個のヌクレオチドのうち少なくとも１個と塩基対を形成するようにアラインメントされ得る。あるいはまた、少なくとも２個のヌクレオチドがオーバーラップしてもよく、３個すべてのヌクレオチドがオーバーラップしてもよい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖は、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドのモチーフを１つより多く含むものであってもよい。第１のモチーフは、該鎖の切断部位または切断部位付近に存在し得、その他のモチーフはウィング（ｗｉｎｇ）修飾部であり得る。用語「ウィング修飾部」は本明細書において、同じ鎖の切断部位または切断部位付近のモチーフとは離れた該鎖の別の部分に存在するモチーフを示す。ウィング修飾部は、第１のモチーフに隣接しているか、または少なくとも１または複数のヌクレオチドによって離れているかのいずれかである。該モチーフ同士が互いのすぐ隣である場合は、該モチーフのケミストリーは互いに相違しており、該モチーフが１または複数のヌクレオチドによって離れている場合、ケミストリーは同じであっても異なっていてもよい。２以上のウィング修飾部が存在していてもよい。例えば、２つのウィング修飾部が存在する場合、各ウィング修飾部は、切断部位もしくは切断部位付近に存在する第１のモチーフの一方の端または該リードモチーフのいずれか一方側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ薬剤のアンチセンス鎖は、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドのモチーフを１つより多くを含むものであってもよく、該モチーフのうち少なくとも１つは該鎖の切断部位または切断部位付近に存在する。また、このアンチセンス鎖も、センス鎖に存在し得るウィング修飾部と同様の配置の１または複数のウィング修飾部を含むものであり得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾部は典型的には、該鎖の３’端、５’端または両端の最初の１個または２個の末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾部は典型的には、二重鎖領域内の該鎖の３’端、５’端または両端の最初の１つまたは２つの対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも１つのウィング修飾部を含む場合、ウィング修飾部は二重鎖領域の同じ端に位置していてもよく、１、２または３個のヌクレオチドのオーバーラップ部を有し得る。
ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも２つのウィング修飾部を含む場合、センス鎖とアンチセンス鎖は、一方の鎖の２つの修飾部が各々、二重鎖領域の一方の端に位置し、１、２または３個のヌクレオチドのオーバーラップ部を有する；一方の鎖の２つの修飾部が各々、二重鎖領域の他方の端に位置し、１、２または３個のヌクレオチドのオーバーラップ部を有する；一方の鎖の２つの修飾部がリードモチーフの両側に位置し、二重鎖領域内に１、２または３個のヌクレオチドのオーバーラップ部を有するようにアラインメントされ得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、標的とのミスマッチ（１つまたは複数）を、二重鎖内に、またはその組合せに含む。ミスマッチはオーバーハング領域に存在していても二重鎖領域に存在していてもよい。塩基対は、その解離または融解の促進傾向に基づいてランク付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づいて。最も簡単なアプローチはペアを個々のペアベースで調べることであるが、最近接（ｎｅｘｔ ｎｅｉｇｈｂｏｒ）解析または同様の解析もまた使用され得る）。解離の促進に関して：Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準型または標準型以外の対合（本明細書の他の箇所に記載のような）は標準型（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合は標準型対合より好ましい。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は：Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃおよびミスマッチペア、例えば非標準型または標準型以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択される、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から最初の１、２、３、４または５つの塩基対のうちの少なくとも１つを含み、二重鎖の５’端でのアンチセンス鎖の解離を促進させる。
一実施形態において、二重鎖領域内のアンチセンス鎖内の５’端から１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群より選択される。あるいはまた、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から最初の１、２または３つの塩基対のうちの少なくとも１つがＡＵ塩基対である。例えば、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から最初の塩基対がＡＵ塩基対である。
別の実施形態において、センス鎖の３’端のヌクレオチドはデオキシ－チミン（ｄＴ）である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’端のヌクレオチドがデオキシ－チミン（ｄＴ）である。一実施形態において、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’端にデオキシ－チミンヌクレオチドの短い配列、例えば２個のｄＴヌクレオチドが存在する。
一実施形態において、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
5’ np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’ (I)
で表され得、
式中：
ｉおよびｊは各々、独立して０または１であり；
ｐおよびｑは各々、独立して０～６であり；
各Ｎａは独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、ＮｂとＹは同じ修飾を有するものではなく；
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し．好ましくは、ＹＹＹはすべて２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態において、Ｎａおよび／またはＮｂは交互パターンの修飾部を含む。
一実施形態において、ＹＹＹモチーフはセンス鎖の切断部位または該切断部位付近に存在する。例えば、ＲＮＡｉ薬剤が１７～２３個のヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位または切断部位の近接部に存在し得る。（例えば：６位，７位，８位、７位，８位，９位、８位，９位，１０位、９位，１０位，１１位、１０位，１１位，１２位または１１位，１２位，１３位に存在し得る）－５’端から１番目のヌクレオチドから数え始め；または任意選択で二重鎖領域内の５’端から１番目の対合ヌクレオチドから数え始める。
一実施形態では、ｉが１であり、ｊが０であるか、またはｉが０であり、ｊが１であるか、またはｉとｊがともに１である。したがって、センス鎖は、以下の式：
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib);
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic);または
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id)
で表され得る。
センス鎖が式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｄ）として表される場合、各Ｎｂは独立して、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
各Ｘ、ＹおよびＺは同じであっても互いに異なっていてもよい。
他の実施形態では、ｉが０であり、ｊが０であり、センス鎖が、式：
5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia)
で表され得る。
センス鎖が式（Ｉａ）で表される場合、各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）：
5’ nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’ 3’ (II)
で表され得、
式中：
ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
ｐ’およびｑ’は各々、独立して０～６であり；
各Ｎａ’は独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ここで、Ｎｂ’とＹ’は同じ修飾を有するものではなく；
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表す。
一実施形態において、Ｎａ’および／またはＮｂ’は交互パターンの修飾部を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフはアンチセンス鎖の切断部位または該切断部位付近に存在する。例えば、ＲＮＡｉ薬剤が１７～２３個のヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の５’端から１番目のヌクレオチドから数え始めて；または任意選択で二重鎖領域内の５’端から１番目の対合ヌクレオチドから数え始めて９位，１０位，１１位、１０位，１１位，１２位；１１位，１２位，１３位；１２位，１３位，１４位；または１３位，１４位，１５位に存在し得る。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態において、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフはすべて２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋが１であり、ｌが０であるか、またはｋが０であり、ｌが１であるか、またはｋとｌがともに１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式：
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb)；
5’ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc)；または
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId)
で表され得る。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎｂ ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｃ）として表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（ＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態では、ｋが０であり、ｌが０であり、アンチセンス鎖が、式：
5’ np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’ 3’ (Ia)
で表され得る。
アンチセンス鎖が式（ＩＩａ）として表される場合、各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
各Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は同じであっても互いに異なっていてもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は特に２’－Ｏ－メチル修飾部または２’－フルオロ修飾部を表し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１個のｎｔである場合、該鎖の５’端から１番目のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択で二重鎖領域内の５’端から１番目の対合ヌクレオチドから数え始めて９位、１０位および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含むものであり得；Ｙは２’－Ｆ修飾部を表す。センス鎖は、ＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをウィング修飾部として二重鎖領域の対向する端にさらに含み得；ＸＸＸおよびＺＺＺは各々、独立して、２’－ＯＭｅ修飾部または２’－Ｆ修飾部を表す。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、該鎖の５’端から１番目のヌクレオチドから数え始めて、または任意選択で二重鎖領域内の５’端から１番目の対合ヌクレオチドから数え始めて１１位、１２位、１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含むものであり得；Ｙ’は２’－Ｏ－メチル修飾部を表す。アンチセンス鎖は、Ｘ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをウィング修飾部として二重鎖領域の対向する端にさらに含み得；Ｘ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、２’－ＯＭｅ修飾部または２’－Ｆ修飾部を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のうちのいずれか１つで表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のうちのいずれか１つで表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本開示の方法における使用のためのＲＮＡｉ薬剤は、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、各鎖が１４～３０個のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖が、式（ＩＩＩ）：
センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
で表されるものであり得、
式中：
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
各ＮａおよびＮａ ’は独立して、０～２５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ ’は独立して、０～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
ここで
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉが０であり、ｊが０であるか；またはｉが１であり、ｊが０であるか；またはｉが０であり、ｊが１であるか；またはｉとｊがともに０であるか；またはｉとｊがともに１である。別の実施形態では、ｋが０であり、ｌが０であるか；またはｋが１であり、ｌが０であり；ｋが０であり、ｌが１であるか；またはｋとｌがともに０であるか；またはｋとｌがともに１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖の例示的な組合せとしては、下記の式：
5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Na ’nq ’ 5’
(IIIa)
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na ’nq ’ 5’
(IIIb)
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Na ’-nq ’ 5’
(IIIc)
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na-nq ’ 5’
(IIId)
が挙げられる。
ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｂ）で表される場合、各Ｎｂは独立して、１～１０、１～７、１～５または１～４個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｃ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｄ）として表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は独立して、２～２０、２～１５または２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’、ＮｂおよびＮｂ ’は独立して交互パターンの修飾部を含む。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部である。別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結される。また別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、センス鎖は、二価または三価の分岐したリンカー（後述）により結合されている１または複数のＣ１６（または関連）部分にコンジュゲートされる。別の実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、任意選択で二価または三価の分岐したリンカーにより結合されている１または複数のＣ１６（または関連）部分にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、Ｎａ修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結され、センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖は、二価または三価の分岐したリンカーにより結合されている１または複数のＣ１６（または関連）部分にコンジュゲートされる。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される二重鎖を少なくとも２つ含み、該二重鎖がリンカーによって連結されている多量体である。リンカーは切断性であっても非切断性であってもよい。任意選択で、該多量体はリガンドをさらに含む。各二重鎖は同じ遺伝子もしくは異なる２つの遺伝子を標的化し得るか；または各二重鎖は異なる２つの標的部位の同じ遺伝子を標的化し得る。
一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される二重鎖を３、４、５、６つまたはそれより多く含み、該二重鎖がリンカーによって連結されている多量体である。リンカーは切断性であっても非切断性であってもよい。任意選択で、該多量体はリガンドをさらに含む。各二重鎖は同じ遺伝子もしくは異なる２つの遺伝子を標的化し得るか；または各二重鎖は異なる２つの標的部位の同じ遺伝子を標的化し得る。
一実施形態において、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される２つのＲＮＡｉ薬剤は互いに５’端および一方または両方の３’端で連結され、任意選択でリガンドにコンジュゲートされる。各薬剤は同じ遺伝子もしくは異なる２つの遺伝子を標的化し得るか；または各薬剤は異なる２つの標的部位の同じ遺伝子を標的化し得る。
種々の刊行物に、本開示の方法に使用され得る多量体型ＲＮＡｉ薬剤が記載されている。かかる刊行物としては、ＷＯ２００７／０９１２６９、米国特許第７８５８７６９号、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。一部の特定の実施形態において、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、たとえＧａｌＮＡｃリガンドが現在進行中のプロジェクトで本開示の好ましい髄腔内／ＣＮＳ送達経路（１つまたは複数）に対する価値が限定的であるとしても、かかるＧａｌＮＡｃリガンドを含むものであってもよい。
以下により詳細に記載するように、ＲＮＡｉ薬剤との１または複数の糖鎖部分のコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ薬剤はＲＮＡｉ薬剤の１または複数の特性を最適化し得る。多くの場合、糖鎖部分はＲＮＡｉ薬剤の修飾サブユニットに結合される。例えば、ｄｓＲＮＡの薬剤の１または複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、糖鎖リガンドが結合されている非糖鎖（好ましくは環状）担体で置き換えられ得る。サブユニットのリボース糖がそのように置き換えられているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書ではリボース置き換え修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称する。環状担体は、炭素環式の環系、すなわちすべての環内原子が炭素原子であるものであってもよく、複素環式の環系、すなわち、１または複数の環内原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、イオウであり得るものであってもよい。環状担体は単環式の環系であってもよく、２以上の環、例えば縮合環を含むものであってもよい。環状担体は完全飽和型の環系であってもよく、１または複数の二重結合を含むものであってもよい。
リガンドは該ポリヌクレオチドに担体を介して結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング結合点」を含む。「骨格結合点」は、本明細書で用いる場合、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般的には、骨格内への担体の組込みに利用可能であり、該組込みに適した結合、例えばホスフェートもしくは修飾ホスフェート、例えばリボ核酸の含硫骨格を示す。「テザリング結合点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態において、選択された部分を連結する、環状担体の構成環内原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点をもたらす原子とは相違する）を示す。該部分は、例えば糖鎖、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザリング部によって環状担体に連結される。したがって、環状担体は多くの場合、官能基、例えばアミノ基を含むものであるか、または一般的には、構成環への別の化学的実体、例えばリガンドの組込みまたはテザリングに適した結合をもたらすものである。
ＲＮＡｉ薬剤はリガンドに担体を介してコンジュゲートされ得、ここで、該担体は環式基または非環式基であり得；好ましくは、該環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびおよびデカリンから選択され；好ましくは、該非環式基はセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
一部の特定の具体的な実施形態では、本開示の方法における使用のためのＲＮＡｉ薬剤が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６のうちのいずれか１つに列記された薬剤の群から選択される薬剤である。このような薬剤はリガンドをさらに含んでいてもよい。
ＩＶ．ＡＰＰ関連疾患を処置するためのＡＰＰノックダウン
本開示の一部の特定の態様は、ＣＡＡおよびＡＤ、例えば遺伝性ＣＡＡおよびＥＯＦＡＤ、ならびに孤発性および／または遅発型ＡＤを含むＡＰＰ関連の疾患または障害のＲＮＡｉ薬剤媒介性ノックダウンに関する。
遺伝性ＣＡＡ（ｈＣＡＡ）は、治療はアミロイド仮説が比較的直接的であり、臨床試験可能である血管性プロテイノパチーである。これは破滅的で稀な疾患であり、既存の治療法がない。ｈＣＡＡの抗ＡＰＰ ｓｉＲＮＡ媒介性処置の臨床検証のために生化学的バイオマーカーとイメージングバイオマーカーの両方が存在する。
本開示のＲＮＡｉ薬剤を用いる処置が想定されるｈＣＡＡの具体的な型の１つは「Ｄｕｔｃｈ型」Ａβ ｈＣＡＡであり、これは、数百の推定患者集団が主にオランダと西オーストラリアに存在する。ＡＰＰ関連疾患の中でも、ｈＣＡＡは純粋に血管性であることが特有であり：ＣＡＡでは、アミロイド線維がＣＮＳの実質および軟膜の細動脈および毛細血管に沈着し、ＣＡＡに罹患している対象において脳虚血および微小出血のため認知機能の低下に至る。ＣＡＡは全ＡＤ対象の８０％より多くに存在しており（ＡＤ対象の２５％は中等度から重度のＣＡＡを有する）、ＣＡＡの発生率は対象の年齢とともに上昇し、７０歳を超える高齢者ではおよそ５０％の発生率である。
以下は遺伝性ＣＡＡの例示的な呈示である：
アミロイド－ベータ－孤発性ＣＡＡ、ＨＣＨＷＡ－Ｄｕｔｃｈ型およびＩｔａｌｉａｎ型ＥＯＦＡＤ、ＬＯＡＤ、２１トリソミー
ＡＢｒｉ－家族性イギリス型認知症
ＡＤａｎ－家族性デンマーク型認知症
シスタチンＣ－ＨＣＨＷＡ－アイスランド型（ＨＣＨＷＡ－アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血）
ゲルソリン－家族性アミロイドーシス－フィンランド型
プリオンタンパク質－プリオン疾患
トランスサイレチン－遺伝性全身性アミロイドーシス
上記のように、Ａβ－ｈＣＡＡ（別名ＡＰＰ－ｈＣＡＡ）は、脳内出血と関連している急速進行性の認知症性疾患である。ＣＡＡの既知の適応症としてはＡＰＰ－ｈＣＡＡと孤発性ＣＡＡの両方が挙げられる。考えられ得るさらなるＣＡＡの適応症としては：ＥＯＦＡＤと関連しているＣＡＡ（ＰＳＥＮ１；ＡＰＰ；ＰＳＥＮ２）；ダウン症と関連しているＣＡＡ；および遅発型アルツハイマー病と関連しているＣＡＡ（その有病率は一般的であり、上記のとおり）が挙げられる。
適応症としてのＡＰＰ－ｈＣＡＡについて、ＡＰＰ－ｈＣＡＡの有病率は不明である；しかしながら、純粋なＡＰＰ－ｈＣＡＡはＥＯＦＡＤより一般的でない（Ｄｕｔｃｈ型ｈＣＡＡ（ＡＰＰ Ｅ６９３Ｑ変異を伴う）は数百例の個体で報告されている）。典型的には、ＡＰＰ－ｈＣＡＡ症状の発生は３５～４５歳で起こり；ＡＰＰ－ｈＣＡＡは、典型的には２～５年以内に重篤なＣＶＡに進行し、ＣＶＡによる死亡のピーク年齢は５５歳となっている。
適応症としての孤発性ＣＡＡは比較的高い有病率を示し：これは、高齢者における脳葉内出血（ＩＣＨ）の一般的な原因である。これもまた急速進行性疾患であり、３１６人の患者のうち８６人（３６％）が平均５年の追跡期間において再発性ＩＣＨを発症した（Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。孤発性ＣＡＡにおける認知症の累積発生率は、一例の試験において、１年間で１４％および５年間で７３％であることが観察された（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ｃｅｒｅｂｒ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ）。また、孤発性ＣＡＡは、進行型ＣＡＡはＡＤ脳のおよそ２５％に存在することが認定されているためＡＤと広く重なる；しかしながら、実際には、ＡＤの病理学的基準を満たすＣＡＡ症例は５０％未満である。
本開示のＲＮＡｉ薬剤で処置した対象におけるＡＰＰノックダウンの効力を評価するため、可溶性形態のＡＰＰ、特にＡＰＰαおよびＡＰＰβなどがＡＰＰノックダウン効率の評価のための脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカーとしての機能を果たし得ることを明白に想定する。
ＣＡＡにおけるアミロイド－βの産生、消失および沈着：収束証拠により、Ａβの主要供給源は神経細胞性であることが示されている。これは、β－およびγ－セクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の逐次切断により、神経細胞の活性に比例して生じる。Ａβは脳から、主に４つの経路：（ａ）エンドペプチダーゼ（例えば、ネプリリシンおよびインスリン分解酵素（ＩＤＥ））によるタンパク質分解性分解；（ｂ）脳実質内の細胞（小膠細胞、星状細胞および程度は少ないが神経細胞）による受容体媒介性クリアランス；（ｃ）血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して血中への能動輸送；（ｄ）脳から間質液が排出される血管周囲経路に沿った消失によって消失する。特殊な担体（例えば、ＡｐｏＥ）および／または受容体輸送機構（例えば、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）およびＬＤＬＲ関連タンパク質（ＬＲＰ１））が、すべての主要な細胞性クリアランス経路に関与している。血管沈着は、Ａβ４０：Ａβ４２比を高め（一方、Ａβ４２の増加はオリゴマー化およびアミロイドプラークをもたらす）、血管周囲の通路を妨げる因子によって助長される。クリアランス機構は年齢とともに衰えるため、Ａβは漸増的に血管周囲の排出経路から脳の毛細血管および細動脈の基底膜内に閉じ込められ、ＣＡＡに至る。ＡｐｏＥ対立遺伝子は、Ａβの産生、消失および沈着のいろいろな分子プロセスおよび細胞プロセスに対して、ＣＡＡの発病リスクが高まるか、または低下するかのいずれかであるような様式で効果の差を有する（Ｃｈａｒｉｄｉｍｏｕ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１２；８３：１２４－１３７）。
ＡＰＰの逐次切断は２つの経路によって起こる。ＡＰＰタンパク質ファミリーは、生物活性を有する大きなＮ末端エクトドメインならびにアダプタータンパク質Ｘ１１およびＦｅ６５が結合する、非常に重要なチロシン－グルタミン酸－アスパラギン－プロリン－トレオニン－チロシン（ＹＥＮＰＴＹ；配列番号：１８６３）タンパク質選別ドメインを含む短鎖Ｃ末端を有することが知られている。得られるＡβペプチド切断産物は、エクトドメイン内から始まり、膜貫通領域内まで続く。第１の経路では、ＡＰＰは、ＡＰＰの非アミロイド生成性プロセッシングの実行においてα－セクレターゼによって、続いてγ－セクレターゼによって切断される。第２の経路では、ＡＰＰのアミロイド生成性プロセッシングがＢＡＣＥ１切断、続いてγ－セクレターゼを伴う。両方のプロセッシングにより、可溶性のエクトドメイン（ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβ）と同一の細胞内Ｃ末端断片が生じる（ＡＩＣＤ；配列番号：１８６４；Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ ａｎｄ Ｋｏｏ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：２９６１５－１９；Ｒｅｉｎｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，２４：３９９６－４００６；Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，３５：４１６－４２０；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｗｏｎｇ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４：１８５－２０４）。
ＣＡＡの組織病理学は、血管壁の形態構造変化（ヘマトキシリン－エオシン染色によって示される）およびＡβ沈着を含む。軟膜細動脈には、有意な構造改変および二重化が観察されている（Ｃｈａｒｉｄｉｍｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ８３：１２４－１３７）。軽度および中等度のＣＡＡでは、わずかな最小限の構造変化が検出されている；しかしながら、進行型ＣＡＡでは有意な構造改変が検出されており、その最も極端なものが二重化（中膜の外側部分の分離および層間剥離）である。また、軟膜細動脈における同様の一連の病理学的ＣＡＡ関連変化が、Ａβの免疫組織化学的検出を用いて観察されている。軽度のＣＡＡでは、アミロイドの斑様沈着が検査した血管の壁に観察されている。中等度のＣＡＡでは、血管壁全体に広がったより密なアミロイド沈着が示されており、一方、重度のＣＡＡでは、ダブルボールド（ｄｏｕｂｌｅ ｂａｌｌｅｄ）血管および内皮浸潤が示されている。皮質細動脈におけるＣＡＡの病理学的所見により、Ａβ沈着の進行が疾患重症度に比例することが明らかになっている。中等度のＣＡＡでは、脳実質周囲におけるＡβ沈着とともにＡβの全壁（ｐａｎ－ｍｕｒａｌ）沈着が示されており、一方、重度のＣＡＡでは、二重化血管が観察されているが、これは軟膜血管と比較すると、あまり一般的ではなかった（Ｃｈａｒｉｄｉｍｏｕ ｅｔ ａｌ．）。
また、ＣＡＡの病因も調べられている。脳実質によって産生されるアミロイドベータは、通常、血管周囲経路を経由してクリアランスされる。特定のＣＡＡ傾向ＡβバリアントのＡβ発現の過剰産生およびＡβ排出の遅延は、ＣＮＳ内の小動脈の中膜内へのアミロイド沈着に至ることが観察されている。可能性および不溶性のアミロイド線維は血管の平滑筋に対して毒性であると認定されており、かかる線維がこのような細胞と置き換わり、血管反応性を無効にする。内皮に対するさらなる損傷は、認知症に至る微小出血、微小梗塞および組織破壊をもたらすことが観察されている。さらなる進行が脳内出血を引き起こし、これは、多くの場合、致死性であることが観察されている。ＣＡＡは、最も高頻度で後頭葉に起こり、低頻度で海馬、小脳、基底核に起こり、通常、深部中心灰白質、皮質下白質および脳幹には起こらないことが観察されている（Ｃｈａｒｉｄｉｍｏｕ ｅｔ ａｌ．）。
ＣＡＡのヒト試験の実施のための多くの潜在的転帰マーカーが同定されている。症候性脳内出血に加えて、微小出血、白質高信号域（ＷＭＨ）およびアミロイドイメージングが疾患の重症度および進行と関連付けられている（Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ １３：４１９－２８）。
また、利用可能なアッセイを使用し、ヒトＣＳＦ試料中の可溶性ＡＰＰレベルを検出することができる。特に、ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβは可溶性形態のＡＰＰであり、ＰＤ（薬力学的）バイオマーカーとしての機能を果たすと認定されている。また、被検物質は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＳＦ試料においても検出されており、かかるアッセイにより、ＮＨＰでの効力試験が可能であり得る。また、Ａβ４０／４２／３８ペプチドおよび総ｔａｕ／Ｐ１８１ Ｔａｕの検出を本試験において記載し、実施した。
また、イメージングバイオマーカーも、脳血管機能がＣＡＡの病態を反映することが認定されているため、ＣＡＡ試験に利用可能である。イメージングは、具体的には、視覚刺激後の血中酸素レベル依存型（ＢＯＬＤ）シグナルを測定するために使用されている（Ｖａｎ Ｏｐｓｔａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ；１６（２）；２０１７；Ｐｅｃａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２０１３；８１（１９）；Ｓｗｉｔｚｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．，ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ；２０１６）。ＣＡＡ対象でのＢＯＬＤ ｆＭＲＩの実施において（運動タスクおよび視覚タスクに対する評価群の血中酸素レベル依存型機能的ＭＲＩ応答）、ＣＡＡを有する患者で機能的ＭＲＩにおける活性化の低下が観察されている。特に、視覚野におけるＢＯＬＤ ｆＭＲＩ活性は、高ＷＭＨ容積および高微小出血数と相関していることが観察されている（Ｐｅｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１３；８１（１９）；Ｓｗｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．ＮｅｕｒｏＩｍａｇｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ２０１６）。
また、ＣＡＡの動物モデルも報告されており、これにより、ＣＡＡの病態に対するＡＰＰノックダウンの効果の測定および形式変換可能なバイオマーカーの同定が可能である。特に、変異型ヒトＡＰＰを発現し、ＣＡＡの病態を示す複数種の齧歯類モデル、例えばＴｇ－ＳｗＤＩ／ＮＯＳ２－／－が開発されている。Ｔｇ－ＳｗＤＩ／ＮＯＳ２－／－マウスモデルでは、高値のＡβレベルが高齢マウスモデルで認定されている。また、血管周囲の過剰リン酸化タウタンパク質も、Ｔｇ－ＳｗＤＩ／ＮＯＳ２－／－マウスだけでなくヒトＣＡＡ－１型試料において毛細血管アミロイドと関連している（Ｈａｌｌ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｓｏｎ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ．２０１２；８８（１）：３－１２；Ａｔｔｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，３７，７５－９３）。また、ＡＤのＣＶＮマウスモデル（ＡＰＰＳＤＩ／ＮＯＳ２ ＫＯ）は、海馬、視床および皮質におけるアミロイドプラーク、組織炎症の増大ならびに行動欠陥を含む表現型を示した。トランスジェニックラットモデル（ｈＡＰＰ変異を有する）もまた開発されている。
したがって、ＡＰＰは、遺伝性脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の標的として同定されている。重度形態のＣＡＡを引き起こすことが報告されているＡＰＰの変異としては、Ａ６９２Ｇ（Ｆｌｅｍｉｓｈ）、Ｅ６９３Ｑ（Ｄｕｔｃｈ）、Ｅ６９３Ｋ（Ｉｔａｌｉａｎ）およびＤ６９４Ｎ（Ｉｏｗａ）が挙げられる。一方、早期発症型ＡＤを引き起こすことが報告されているＡＰＰの変異としては、Ｅ６６５Ｄ、Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ（Ｓｗｅｄｉｓｈ）、Ｔ７１４Ａ（Ｉｒａｎｉａｎ）、Ｔ７１４Ｉ（Ａｕｓｔｒｉａｎ）、Ｖ７１５Ｍ（Ｆｒｅｎｃｈ）、Ｖ７１５Ａ（Ｇｅｒｍａｎ）、Ｉ７１６Ｖ（Ｆｌｏｒｉｄａ）、Ｉ７１６Ｔ、Ｖ７１７Ｉ（Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｖ７１７Ｆ、Ｖ７１７ＧおよびＶ７１７Ｌが挙げられる。特に、ＡＰＰ Ｅ６９３Ｑ（Ｄｕｔｃｈ）変異は、わずかに実質の神経原線維変化を伴う重度のＣＡＡを引き起こし；Ｅ６９３Ｑは、アミロイドベータの凝集および毒性を増大させ、；Ｅ６９３Ｋ（Ｉｔａｌｉａｎ）は同様であるがＥ６９３Ｇ（Ａｒｃｔｉｃ）、Ｅ６９３ＡおよびＥ６９３デルタ変異は、ＣＡＡをほとんどまたは全く伴わないＥＯＦＡＤを引き起こし；ＡＰＰ Ｄ６９４Ｎ（Ｉｏｗａ）は典型的なＡＤの病態を伴う重度のＣＡＡを引き起こす。先の点変異に加えて、ＡＰＰの過剰発現をもたらすＡＰＰの重複もまた、Ａβ沈着を引き起こすことが認定されている。一方、ＡＰＰ－ｈＣＡＡを抑制または遅延する既知のＡＰＰ変異は報告されていない。ＡＰＰ変異型に加え、Ａβ ＣＡＡは、ＰＳＥＮ１（Ｌ２８２Ｖ）およびＰＳＥＮ２（Ｎ１４１Ｉ）変異でも観察されている。一方、ＡｐｏＥ ε２（ＡＤに非依存的）およびＡｐｏＥ ε４（ＡＤに依存的）もまたＣＡＡのリスクファクターであることが報告されている（Ｒｅｎｓｉｎｋ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，４３（２）２００３）。
本開示の一部の特定の態様は、ＡＰＰ－ｈＣＡＡを有する個体におけるノックダウンのためのＡＰＰの標的化に関する。ＣＡＡの疾患修飾治療薬は現在、存在しないため、かかる薬剤の必要性が存在している。一部の特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、ＣＮＳ全体において変異型ＡＰＰレベルとＷＴのＡＰＰレベルの両方のおよそ６０～８０％のノックダウンをもたらすはずである。
異型接合型ＡＰＰ変異を有するヒトは一般集団に０．３のｐＬＩスコアで存在する；しかしながら、ヒトＡＰＰノックアウトはこれまでに同定されていない。
ヒトＣＡＡを処置するための薬理学的試みとしては以下のものが挙げられる：
アミロイドベータ４０抗体であるポネズマブは、Ｐｆｉｚｅｒ社により、遅発型ＣＡＡを有する３６例の個体で試験された。６０日間の過程でポネズマブまたはプラセボの３回の輸注により、ＢＯＬＤ ｆＭＲＩによって測定される脳血管反応性の変化、ならびに脳浮腫、梗塞、Ａβ、認知機能の変化および他の副次的転帰について評価された。ポネズマブは薬物－プラセボ間の違いを示したが、主要エンドポイントを達成しなかった。
ＢＡＮ２４０１－．全身送達されるアミロイドベータ治療用抗体は安全であることが認定されたが局所脳浮腫を引き起こすことがあり得ることも認定された。ＬＯＡＤにおけるＢＡＮ２４０１の１８か月間の治験の最近のフェーズＩＩにおいて、ＳＡＥの発生率はプラセボで１７．６％であり、最高用量（１０ｍｇ／ｋｇ 隔週）で１５．５％であった。アミロイド関連画像異常－浮腫（ＡＲＩＡ－Ｅ）は、ＡＰＯＥ４キャリアにおける最高用量で１４．６％であった。
動物ＣＡＡモデルに対し、ポネズマブは、ＣＡＡのマウスモデルにおいてアミロイドベータ負荷量の低下および血管反応性に関して有効であることがみとめられた（Ｂａｌｅｓ，２０１８）。一方、全身性ＡＰＰノックアウトマウスは生存可能であることがさらにみとめられた。
また、以下の例示的なバイオマーカーおよび病理学的データにより、ＣＡＡの病因におけるアミロイドベータタンパク質の中心的な役割のさらなる検証が示されている：
遺伝性形態の「純粋な」ＣＡＡ（すなわち、実質内アミロイドプラークがない）では、実質性ＡＤにおけるＡβ４２とは反対に、アミロイドの沈着が主にＡβ４０であることを特徴とすることが観察されている；
ＣＡＡは、ＡＤでは高値レベルで観察されるのとは対照的にＣＳＦ中のＴ－ｔａｕレベルおよびＰ－ｔａｕレベルが正常であり、「タウオパチー」でないとの観察である；
ＰｉＢ ＰＥＴによって測定される脳アミロイド負荷量の増加に伴うＣＳＦ Ａβ４０レベルの低下という逆相関はＣＡＡに特有であることが認定されている；ならびに
インビトロおよびインビボでの実験データにより、遺伝性ＣＡＡ変異を含むＡβ４０はＷＴタンパク質においてミスフォールティングし、ミスフォールティングを誘導する傾向を有し、そのため両方がアミロイド線維内に存在する（トランスサイレチン（ＴＴＲ）と似ている）というＣＡＡにおけるプリオン仮説に対する支持の高まりが示されている。
以下の実施例に開示するように、本開示において、二重鎖を２ｍｇ／Ｋｇで単回用量にて投与した場合の、投与後２１日目の評価時の肝臓内ＡＰＰ ｍＲＮＡについて得られたスクリーニング結果に基づいた、いくつかのマウス／ラット交差反応性ＡＰＰ標的化二重鎖（例えばＡＤ－３９７１７７、ＡＤ３９７１９２、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ３９７１９０、ＡＤ－３９７２６５およびＡＤ－３９７２０３など）を示す。また、本開示において、カニクイザル初代肝細胞およびヒトＢＥ（２）Ｃ細胞の処理で得られたスクリーニング結果に基づいた、いくつかのヒト／カニクイザル交差反応性二重鎖（例えばＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２９１３、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２８４４、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２８２４、ＡＤ－３９２７０４およびＡＤ－３９２７９０など）も示す。
ＥＯＦＡＤのＲＮＡｉ薬剤媒介性ノックダウンもまた明白に想定される。ｈＣＡＡと同様、ＥＯＦＡＤも破滅的で稀な疾患であり、ｈＣＡＡの場合と同様、ＡＰＰの原因的役割は充分に確立されており、疾患の表現型分類は、例えば孤発性および／または遅発型ＡＤ（任意選択で、遅発型ＡＤのサブクラスとして、重度のＣＡＡを伴う遅発型ＡＤ）より高い精度で、より短期間で行なわれ得る。ＥＯＦＡＤは若年成人における進行性の認知症性神経変性疾患であり、発症年齢は６０歳前～６５歳、多くの場合、５５歳前である。
ＥＯＦＡＤの有病率は、リスクのある集団（すなわち、４０～５９歳の人）で１００，０００人あたり４１．２人であると推定されており、ＥＯＦＡＤに罹患している人の６１％がＥＯＦＡＤ陽性の家族歴を有する（これらのうち、１３％が３世代の個体で罹患した）。ＥＯＦＡＤは、全ＡＤの３％未満を構成する（Ｂｉｒｄ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０：２３１－２３９；Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｗａｎｇ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕ Ｓｃｉ，２０１１，３４：１８５－２０４；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ）。
ＡＰＰ標的（ＯＭＩＭ １０４３００）のヒト遺伝学的検証が行なわれ、ＥＯＦＡＤを引き起こす一部の特定のＡＰＰ変異、例えば、上記のようなＥ６６５Ｄ、Ｋ６７０Ｎ、Ｍ６７１Ｌ（Ｓｗｅｄｉｓｈ）、Ｔ７１４Ａ（Ｉｒａｎｉａｎ）、Ｔ７１４Ｉ（Ａｕｓｔｒｉａｎ）、Ｖ７１５Ｍ（Ｆｒｅｎｃｈ）、Ｖ７１５Ａ（Ｇｅｒｍａｎ）、Ｉ７１６Ｖ（Ｆｌｏｒｉｄａ）、Ｉ７１６Ｔ、Ｖ７１７Ｉ（Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｖ７１７Ｆ、Ｖ７１７ＧおよびＶ７１７Ｌが同定されている。また、ＥＯＦＡＤおよびＣＡＡを引き起こすアミロイドベータ前駆体タンパク質の優性変異も同定されている。
理論に拘束されることを望まないが、ＡＤの病因は、両方の側脳室のすぐ上部の灰白質の膨隆部である海馬から始まると考えられる。この組織の変性が、早期疾患に特徴的な記憶力の低下を引き起こすと考えられる。神経変性のタンパク質レベルでの機構は大きな議論の対象となっているが、ＥＯＦＡＤと関連しているＡＰＰの重複はＡＰＰの過剰発現で充分にＡＤが引き起こされ得ることが示されている（Ｈａａｓｓ ａｎｄ Ｓｅｌｋｏｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：１０１－１１２）。
ＥＯＦＡＤおよびＣＡＡとは対照的に、孤発性ＡＤの病原性機構はまだ理解されておらず、臨床的に定義される孤発性ＡＤ集団は、おそらく機序が不均一である。
本開示の一部の特定の態様は、ＥＯＦＡＤを有する個体におけるノックダウンのためのＡＰＰの標的化に関する。より一般的にはＡＤ、特にＥＯＦＡＤに対して症状指向型処置（効力が限定的な）しか存在しないため、かかる薬剤の必要性が存在している。一部の特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤は、ＣＮＳ全体において変異型ＡＰＰレベルとＷＴのＡＰＰレベルの両方のおよそ６０～８０％のノックダウンをもたらすはずである。ＣＮＳ細胞におけるＡＰＰレベルをノックダウンできるＡＰＰ標的療法のおそらく治療性の効力に言及しているヒト遺伝学によるさらなる観察結果の１つは、一般集団においてキャリアをＡＤおよび認知症から保護するＡ６７３Ｔ変異が同定されたことである（Ｊｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒ，４８８．ｄｏｉ：ｄｏｉ：１０．１０３８／性質１１２８３）。Ａ６７３Ｔ置換は、β－セクレターゼ切断部位に隣接しており、細胞アッセイにおいてアミロイドベータの４０％低減をもたらすと報告されている。したがって、ドミナントネガティブＡＰＰ点変異型は家族をＡＤから保護すると思われ、さらに、ＡＰＰのＲＮＡｉ薬剤媒介性ノックダウンが、少なくとも一部の特定の形態のＡＤ、例えばＥＯＦＡＤにおいて同様の保護効果および／または治療効果を奏し得るであろうことが強調された。
ＡＰＰ標的化ＲＮＡｉ薬剤開発の初期段階の補助において、ＡＰＰノックアウトマウスが実現可能であることが注目されており（ＯＭＩＭ １０４３００）、これにより、リード化合物の開発の際のモデル系としてのマウスの実現可能な使用が可能になることが期待される。マウスとは対照的に、異型接合型ＡＰＰ変異を有するヒトは一般集団に０．３のＥＸＡＣスコアで存在するが、ヒトＡＰＰノックアウトはこれまで同定されていない。ＡＰＰ標的化ＲＮＡｉ薬剤の開発に利用可能なバイオマーカーとしては、ＣＳＦ中のＡＰＰおよびＭＡＰＴペプチドが挙げられ、これらは、遺伝学的に均一な集団においてであっても迅速な評価および有用な効力を可能にするはずである（Ｍｏ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ＆ Ｄｅｍｅｎｔｉａ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，６：２０１－２０９）。
上記のように、孤発性形態のＡＤおよびＥＯＦＡＤを処置するための試みは、これまで不奏効であることが証明されており、例えば、孤発性ＡＤの処置のためのＢＡＣＥ１（β－セクレターゼ）阻害薬（ＢＡＣＥ１ｉ）の治験はすべて、今までのところ失敗に終わっている（Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７８：１６９１－１７０３；Ｈｕｎｇ ａｎｄ Ｆｕ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：４７）。かかるＢＡＣＥｉ試験では、遺伝学的に定義された集団において完了した試験はない（試験を開始しただけ）。注目すべきことに、つい最近のＢＡＣＥ１ｉ試験で、ベルベセスタットが、年齢およびおそらくＡＤの診断が示唆される臨床基準に基づいて選択された集団においてアミロイドベータレベルを６０％低下させることが示された（Ｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３７８：１６９１－１７０３；Ｈｕｎｇ ａｎｄ Ｆｕ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４：４７）。一方、Ａβ指向型免疫療法の中のかかる免疫療法の１つで、孤発性ＡＤの最近の治験において概念実証が示され、進行中のフェーズＩＩＩ治験の開始が支持された（Ｓｅｌｋｏｅ ａｎｄ Ｈａｒｄｙ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８：５９５－６０８）。ＡＰＰ切断におけるその役割を考慮し、γ－セクレターゼもまた、一部の特定のＡＤ指向型治験において標的化されている。しかしながら、今までのところ、遺伝学的に定義された集団において完了したγ－セクレターゼ阻害薬の治験はなく；いくつかのプログラムが毒性のため中断されている（Ｓｅｌｋｏｅ ａｎｄ Ｈａｒｄｙ）。
したがって、罹患個体のＡＰＰ関連の疾患または障害を処置または予防することができる薬剤の必要性が存在している。
あらゆるＡＰＰ関連の疾患または障害が最終的には本開示のＲＮＡｉ薬剤を用いて標的化され得ることは明白に想定され、具体的には、孤発性ＣＡＡならびに孤発性および／または遅発型ＡＤの標的化もまた、これらの具体的なＡＰＰ関連疾患が現在直面している診断上／表現型分類の課題を考慮したとしても、本開示のＲＮＡｉ薬剤について想定される（このような疾患の診断法もまた改善され続けることがさらに想定される）。
Ｖ．リガンドにコンジュゲートされたＲＮＡｉ薬剤
本開示のＲＮＡｉ薬剤のＲＮＡの別の修飾は、該ＲＮＡに、そのＲＮＡｉの活性、細胞内分布または細胞内取込みを向上させるリガンド、部分またはコンジュゲートの１または複数を化学的に連結させることを伴う。かかる部分としては、限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えばベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ，１０：１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４）、リン脂質例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７）が挙げられる。
一実施形態において、リガンドは、これが組み込まれるＲＮＡｉ薬剤の分布、標的化または寿命を改変するものである。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、かかるリガンドがない種と比べて、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞型、区画、例えば細胞区画もしくは器官区画、組織、器官または身体領域に対する親和性の向上をもたらす。好ましいリガンドは、二重鎖の核酸における二重鎖の対合には関与しない。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミンもしくはヒアルロン酸）；または脂質が挙げられ得る。また、リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸であってもよい。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリエド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリリック（ａｃｒｙｌｌｉｃ）酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては：ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第４級塩、またはアルファらせん状ペプチドが挙げられる。
また、リガンドとしては、標的化群、例えば細胞または組織を標的化する薬剤、例えば、特定の細胞型、例えば腎臓細胞に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体も挙げられ得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤、プロテインＡ、ムチン糖鎖、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチンまたはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣物であり得る。
リガンドの他の例としては、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、クロスリンカー（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収助長剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、特定の細胞型、例えばＣＮＳ細胞に結合する抗体であり得る。また、リガンドとしてはホルモンおよびホルモン受容体も挙げられ得る。また、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、糖質、ビタミン類、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン 多価マンノースまたは多価フコースも挙げられ得る。
リガンドは、細胞内へのＲＮＡｉ薬剤の取込みを、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば細胞の微小管、微小線維および／または中間径フィラメントを破壊することによって高め得る物質、例えば薬物であってもよい。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤に結合させたリガンドは薬物動態モジュレータ（ＰＫモジュレータ）としての機能を果たす。ＰＫモジュレータとしては、親油性、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミン類などが挙げられる。例示的なＰＫモジュレータとしては、限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもまた血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格内に複数のホスホロチオエート結合を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５個の塩基、１０個の塩基、１５個の塩基または２０個の塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンド（例えば、ＰＫモジュレートリガンド）として本開示に適している。また、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載の実施形態におけるＰＫモジュレートリガンドとしての使用に好適である。
本開示のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドは、反応性ペンダント官能部、例えばオリゴヌクレオチドへの連結分子の結合に由来するものを有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、さまざまな任意の保護基を有する合成されたリガンド、または自身に結合された連結部分を有するリガンドと直接反応し得る。
本開示のコンジュゲートにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、よく知られた固相合成手法によって簡便に常套的に作製され得る。かかる合成のための機器は、いくつかの供給元、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）などによって販売されている。かかる合成のための当該技術分野で知られた任意の他の手段を付加的または択一的に使用してもよい。また、他のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を調製するために同様の手法を使用することも知られている。
本開示のリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドおよびリガンド分子担持配列特異的連結型ヌクレオシドにおいて、該オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは好適なＤＮＡシンセサイザー上で、標準的なヌクレオチドもしくはヌクレオシドの前駆体、または連結部分を既に担持しているヌクレオチドもしくはヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、リガンド分子既に担持しているリガンド－ヌクレオチドもしくはヌクレオシド－コンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド担持構成ブロックを用いてアセンブリングされ得る。
連結部分を既に担持しているヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合、配列特異的連結型ヌクレオシドの合成は典型的には完了しており、次いで、リガンド分子を連結部分と反応させてリガンドコンジュゲート型オリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドまたは連結型ヌクレオシドは、自動化合成装置により、市販されており、オリゴヌクレオチド合成に常套的に使用される標準的ホスホロアミダイトおよび非標準的ホスホロアミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホロアミダイトを用いて合成される。
Ａ．親油性部分
一部の特定の実施形態において、親油性部分は、脂肪族、環式、例えば脂環式または多環式、例えば多環脂肪族の化合物、例えばステロイド（例えば、ステロール）あるいは線状または分岐した脂肪族炭化水素である。親油性部分は一般的に、環式であっても非環式であってもよい炭化水素鎖を含むものであり得る。炭化水素鎖は、種々の置換基および／または１または複数のヘテロ原子、例えば酸素もしくは窒素原子を含むものであり得る。かかる親油性の脂肪族部分としては、限定されないが、飽和または不飽和のＣ４～Ｃ３０炭化水素（例えば、Ｃ６～Ｃ１８炭化水素）、飽和または不飽和の脂肪酸、ワックス（例えば、脂肪酸の一価アルコールエステルおよび脂肪族ジアミド）、テルペン（例えば、Ｃ１０テルペン、Ｃ１５セスキテルペン、Ｃ２０ジテルペン、Ｃ３０トリテルペンおよびＣ４０テトラテルペン）ならびに他の多環脂肪族炭化水素が挙げられる。例えば、親油性部分は、Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖（例えば、Ｃ４～Ｃ３０アルキルまたはアルケニル）を含むものであり得る。一部の実施形態では、親油性部分が、飽和または不飽和のＣ６～Ｃ１８炭化水素鎖（例えば、線状のＣ６～Ｃ１８アルキルまたはアルケニル）を含むものである。一実施形態では、親油性部分が、飽和または不飽和のＣ１６炭化水素鎖（例えば、線状のＣ１６アルキルまたはアルケニル）を含むものである。
親油性部分はＲＮＡｉ薬剤に、当該技術分野で知られた任意の方法によって、例えば、親油性部分に既に存在しているか、またはＲＮＡｉ薬剤内に導入された官能基、例えばヒドロキシ基（例えば、－ＣＯ－ＣＨ２－ＯＨ）によって結合され得る。親油性部分に既に存在しているか、またはＲＮＡｉ薬剤内に導入された官能基としては、限定されないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジドおよびアルキンが挙げられる。
ＲＮＡｉ薬剤と親油性部分のコンジュゲーションは、例えば、ヒドロキシとアルキル基Ｒ－、アルカノイル基ＲＣＯ－または置換カルバモイル基ＲＮＨＣＯ－間のエーテル結合またはカルボン酸エステル結合またはカルバモイルエステル結合の形成によって行なわれ得る。アルキル基Ｒは、環式（例えば、シクロヘキシル）であっても非環式（例えば、直鎖または分岐鎖；および飽和または不飽和）であってもよい。アルキル基Ｒは、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシルまたはオクタデシル基などであり得る。
一部の実施形態では、親油性部分が二本鎖ＲＮＡｉ薬剤に、エーテル、チオエーテル、ウレア、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物（例えば、アジド－アルキンの環化付加によるトリアゾール）またはカルバメートを含有しているリンカーであるリンカーを介してコンジュゲートされる。
別の実施形態において、親油性部分はステロイド、例えばステロールである。ステロイドは、ペルヒドロ－１，２－シクロペンタノフェナントレン環系を含む多環式化合物である。ステロイドとしては、限定されないが、胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸およびデヒドロコール酸）、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロール、およびカチオン性ステロイド、例えばコルチゾンが挙げられる。「コレステロール誘導体」は、例えば置換基の置換、付加または除去によってコレステロールから誘導される化合物を示す。
別の実施形態において、親油性部分は芳香族部分である。これに関連して、用語「芳香族」は、広く単環芳香族炭化水素および多環芳香族炭化水素を示す。芳香族基としては、限定されないが、任意選択で置換されていてもよい１～３個の芳香族環を含むＣ６～Ｃ１４アリール部分；アルキル基に共有結合により連結されたアリール基を含む（いずれかが独立して任意選択で置換されていても非置換であってもよい）「アラルキル」または「アリールアルキル」基；および「ヘテロアリール」基が挙げられる。本明細書で用いる場合、用語「ヘテロアリール」は、５～１４個の環内原子、好ましくは５、６、９または１０個の環内原子を有し；環のアレイ内で共有される６、１０または１４個のπ電子を有し、炭素原子に加えて、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）およびイオウ（Ｓ）からなる群より選択される１～約３個のヘテロ原子を有する基を示す。
本明細書で用いる場合、「置換」アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリールまたは複素環式基は、１～約４個、好ましくは１～約３個、より好ましくは１個または２個の非水素置換基を有するものである。好適な置換基としては、限定されないが、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノおよびウレイド基が挙げられる。
一部の実施形態では、親油性部分はアラルキル基、例えば２－アリールプロパノイル部分である。アラルキル基の構造形体は、親油性部分が少なくとも１つのタンパク質にインビボで結合するように選択される。一部の特定の実施形態では、アラルキル基の構造形体が、親油性部分が血清タンパク質、血管タンパク質または細胞タンパク質に結合するように選択される。一部の特定の実施形態では、アラルキル基の構造形体が、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、α－２－マクログロブリンまたはα－１－糖タンパク質との結合を促進させるものである。
一部の特定の実施形態では、リガンドがナプロキセンまたはナプロキセンの構造的誘導体である。ナプロキセンの合成のための手順は米国特許第３，９０４，６８２号および米国特許第４，００９，１９７号にみられ得、これらは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。ナプロキセンは（Ｓ）－６－Ｍエトキシ－α－メチル－２－ナフタレン酢酸という化学名を有し、その構造は
Figure 2022515193000005
 である。
一部の特定の実施形態では、リガンドがイブプロフェンまたはイブプロフェンの構造的誘導体である。イブプロフェンの合成のための手順は米国特許第３，２２８，８３１号にみられ得、これらは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。イブプロフェンの構造は
Figure 2022515193000006
 である。
さらなる例示的なアラルキル基が米国特許第７，６２６，０１４号に例示されており、これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
別の実施形態において、好適な親油性部分としては、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシアノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、イブプロフェン、ナプロキセン、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンが挙げられる。
一部の特定の実施形態では、特に親油性部分が低い親油性または疎水性を有する場合、１つより多くの親油性部分が二本鎖ＲＮＡｉ薬剤内に組み込まれ得る。一実施形態において、２以上の親油性部分が、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の同じ鎖内に組み込まれる。一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の各鎖に１または複数の親油性部分が組み込まれる。一実施形態では、２以上の親油性部分が、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の同じ位置（すなわち、同じ核酸塩基、同じ糖部分または同じヌクレオシド間結合）内に組み込まれる。これは、例えば、該２以上の親油性部分を担体を介してコンジュゲートさせること、および／または該２以上の親油性部分を分岐したリンカーを介してコンジュゲートさせること、および／または該２以上の親油性部分を１または複数のリンカーを介してコンジュゲートさせること（ここで、該１又は複数のリンカーは該親油性部分を連続的に連結している）により行なわれ得る。
親油性部分はＲＮＡｉ薬剤に、ＲＮＡｉ薬剤のリボース糖との直接結合を介してコンジュゲートされ得る。あるいはまた、親油性部分は二本鎖ＲＮＡｉ薬剤に、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされ得る。
一部の特定の実施形態では、親油性部分はＲＮＡｉ薬剤に、１または複数のリンカー（テザリング部）を介してコンジュゲートされ得る。
一実施形態では、親油性部分が二本鎖ＲＮＡｉ薬剤に、エーテル、チオエーテル、ウレア、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物（例えば、アジド－アルキンの環化付加によるトリアゾール）またはカルバメートを含有しているリンカーを介してコンジュゲートされる。
本開示のＡＰＰ標的化ＲＮＡｉ薬剤の中枢神経系指向型送達を行なうのに有用な例示的なリンカー、テザリング部、担体、核酸修飾部、コンジュゲート、リガンドおよび他の部分は、例えば米国特許出願第６２／６６８，０７２号、同第６２／７３８，７４７号および／または同第６２／７７３，０８２号にさらに詳細に記載されており、これらの全内容はこの引用により本明細書に組み込まれる。
Ｂ．脂質コンジュゲート
一実施形態において、リガンドまたはコンジュゲートは脂質または脂質ベースの分子である。かかる脂質または脂質ベースの分子は好ましくは、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合するものである。ＨＳＡ結合リガンドにより、身体の標的組織、例えば非腎臓標的組織へのコンジュゲートの血管経由分布が可能になる。一部の特定の実施形態では、標的組織が、ＣＮＳ、例えば脳のグリア細胞であり得る。また、ＨＳＡに結合し得る他の分子をリガンドとして使用してもよい。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリンが使用され得る。脂質または脂質ベースのリガンドは（ａ）コンジュゲートの分解耐性を高め得る、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜への標的化もしくは輸送を高め得る、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調整するために使用され得る。
脂質ベースのリガンドは、標的組織に対する該コンジュゲートの結合を阻害するため、例えば制御するために使用され得る。例えば、ＨＳＡに対してより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、おそらく腎臓に標的化されにくくなり、したがっておそらく身体からクリアランスされにくくなる。ＨＳＡにあまり強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、該コンジュゲートを腎臓に標的化させるために使用され得る。
任意選択で、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合するものである。好ましくは、これはＨＳＡに、該コンジュゲートが非腎臓組織に好ましくは分布するのに充分な親和性で結合する。しかしながら、該親和性は、ＨＳＡ－リガンド間結合が反転できないほど強くないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しないものであり、そのため、該コンジュゲートは腎臓に好ましくは分布される。また、腎臓細胞に標的化される他の部分を、脂質ベースのリガンドの代わりに、または脂質ベースのリガンドに加えて使用してもよい。
別の態様では、リガンドが、標的細胞、例えば増殖している細胞に取り込まれる部分、例えばビタミン類である。このようなものは、例えば悪性または非悪性型、例えばがん細胞の不要な細胞増殖を特徴とする障害を処置するために特に有用である。例示的なビタミン類としてはビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。挙げられる他の例示的なビタミン類はビタミンＢ群、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサルまたは標的細胞、例えば脳細胞によって取り込まれる他のビタミン類もしくは栄養素である。また、ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
Ｃ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドが細胞透過剤、好ましくはらせん状細胞透過剤である。好ましくは、該薬剤は両親媒性である。例示的な薬剤はペプチド、例えばｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）である。該薬剤がペプチドである場合、これは、修飾型、例えばペプチジル模倣物、反転体（ｉｎｖｅｒｔｏｍｅｒ）、非ペプチドまたはプソイド－ペプチド結合、およびＤ－アミノ酸が使用されたものであり得る。該らせん状薬剤は好ましくはアルファ－らせん状薬剤であり、これは好ましくは親油相と疎油相を有する。
リガンドはペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（本明細書においてオリゴペプチド模倣物とも称する）は、天然ペプチドと同様の規定の３次元構造にフォールティングできる分子である。ＲＮＡｉ薬剤へのペプチドおよびペプチド模倣物の結合は、例えば細胞による認識および吸収を向上させることにより該ＲＮＡｉ薬剤の薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣物部分は、約５～５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐもしくはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分はデンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の択一例において、ペプチド部分は疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含むものであり得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号：２９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦアナログ（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号：３０）もまた標的化部分であり得る。ペプチド部分「送達」ペプチドであってもよく、これは、大きな極性分子、例えばペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を、細胞膜を通過して運ぶことができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号：３１）およびショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：３２）に由来する配列は送達ペプチドとして機能できることがわかっている。ペプチドまたはペプチド模倣物は、ランダム配列のＤＮＡにコードされているもの、例えばファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドであってもよい（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞標的化目的のために組み込まれた単量体単位を介してｄｓＲＮＡ薬剤にテザリングされたペプチドまたはペプチド模倣物の例はアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣物である。ペプチド部分は、約５個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性を高めるため、または配座特性を高めるために構造修飾を有するものであってもよい。後述する任意の構造の修飾部が利用され得る。
本開示の組成物および方法における使用のためのＲＧＤペプチドは線状であっても環状であってもよく、特定の組織（１つまたは複数）への標的化を助長するために修飾、例えばグリコシル化またはメチル化されていてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣物としてはＤ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣物が挙げられ得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用してもよい。このリガンドの好ましいコンジュゲートはＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的化するものである。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば微生物細胞、例えば細菌細胞もしくは真菌細胞または哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を透過できるものである。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－らせん状線状ペプチド（例えば、ＬＬ－３７もしくはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンもしくはバクテネシン）、または１個だけ、もしくは２個の支配的アミノ酸を含有しているペプチド（例えば、ＰＲ－３９もしくはインドリシジン）であり得る。また、細胞透過ペプチドは核移行シグナル（ＮＬＳ）を含むものであってもよい。例えば、細胞透過ペプチドは、双節型両親媒性ペプチド、例えば、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｄ．糖鎖コンジュゲートおよびリガンド
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤オリゴヌクレオチドが糖鎖をさらに含む。糖鎖コンジュゲート型ＲＮＡｉ薬剤は、本明細書に記載のような核酸ならびにインビボ治療的使用に適した組成物のインビボ送達に好都合である。本明細書で用いる場合、「糖鎖」は、少なくとも６個の炭素原子（これは線状であっても分枝状であっても環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素もしくはイオウ原子が結合している１つもしくはそれより多くの単糖単位で構成された糖鎖自体であるか；または各々が少なくとも６個の炭素原子（これは線状であっても分枝状であっても環状であってもよい）を有し、各炭素原子に酸素、窒素もしくはイオウ原子が結合している１つもしくはそれより多くの単糖単位で構成された糖鎖部分をその一部として有する化合物であるかのいずれかである化合物を示す。代表的な糖鎖としては、糖（単糖、二糖、三糖および約４個から、５、６、７、８または９個の単糖単位を含有しているオリゴ糖）、または多糖、例えばデンプン、グリコゲン、セルロースおよび多糖類ガムが挙げられる。具体的な単糖としては、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）の糖が挙げられ；二糖および三糖としては２つまたは３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を有する糖が挙げられる。
一実施形態において、本開示の組成物および方法における使用のための糖鎖コンジュゲートは単糖である。
一部の特定の実施形態では、本開示の組成物および方法はＣ１６リガンドを含む。例示的な実施形態において、本開示のＣ１６リガンドは、以下の構造（ここでは以下にウラシル塩基のものを例示しているが、Ｃ１６リガンドの結合は、任意の塩基（Ｃ、Ｇ、Ａなど）を提示する、および／または本明細書に提示した任意の他の修飾部を有するヌクレオチドの場合も想定される。ただし、２’リボ結合は保存されているものとする）を有し、そのように修飾された残基内のリボの２’位で結合される：
Figure 2022515193000007
上記に示したように、Ｃ１６リガンド修飾残基は、そのように修飾された例示的な残基（ここではウラシル）の２’－リボの位置に直鎖アルキルを提示する。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ薬剤の糖鎖コンジュゲートが、１または複数の上記のようなさらなるリガンド、例えば限定されないが、ＰＫモジュレータおよび／または細胞透過ペプチドをさらに含む。
本開示における使用に適したさらなる糖鎖コンジュゲート（およびリンカー）としては、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１４／１７９６２０号および同ＷＯ２０１４／１７９６２７号に記載のものが挙げられ、これらの各々の全内容は引用により本明細書に組み込まれる。
一部の特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾部を含む。例示的な実施形態において、本開示のビニルホスホネートは以下の構造を有する：
Figure 2022515193000008
 本開示のビニルホスホネートは本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに結合され得る。一部の特定の好ましい実施形態では、本開示のビニルホスホネートは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖、任意選択でｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’端に結合される。
ビニルホスフェート修飾部もまた本開示の組成物および方法に想定される。例示的なビニルホスフェート構造は：
Figure 2022515193000009
 である。
Ｅ．熱不安定化性修飾部
一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害するための熱不安定化性修飾部をアンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）組み込むことにより、ＲＮＡ干渉のために最適化され得る。アンチセンス鎖の５’端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの二重鎖の熱不安定化性修飾部を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡはオフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減させたことが見い出されている。したがって、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５またはそれより多く）の二重鎖の熱不安定化性修飾部をアンチセンス鎖の５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に含む。一部の実施形態では、１または複数の二重鎖の熱不安定化性修飾部は、アンチセンス鎖の５’端から２～９位または好ましくは４～８位に位置する。一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱不安定化性修飾部（１つまたは複数）がアンチセンス鎖の５’端から６位、７位または８位に位置する。さらに一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱不安定化性修飾部がアンチセンス鎖の５’端から７位に位置する。用語「熱不安定化性修飾部（１つまたは複数）」は、ｄｓＲＮＡが全般的に低融解温度（Ｔｍ）（好ましくは、かかる修飾部（１つまたは複数）を有していないｄｓＲＮＡのＴｍより１、２、３または４度低いＴｍを有することによる結果であろう修飾部（１つまたは複数）を包含している。一部の実施形態では、二重鎖の熱不安定化性修飾部がアンチセンス鎖の５’端から２位、３位、４位、５位または９位に位置する。
熱不安定化性修飾部としては、限定されないが、脱塩基修飾部；対向する鎖の対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾部、例えば２’－デオキシ修飾部または非環状ヌクレオチド、例えばアンロック核酸（ＵＮＡ）もしくはグリコール核酸（ＧＮＡ）が挙げられ得る。
例示される脱塩基修飾部としては、限定されないが、以下のもの：
Figure 2022515193000010
 式中、Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ”＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ
Figure 2022515193000011
 が挙げられ、
式中、Ｂは修飾型または非修飾型の核酸塩基である。
例示される糖修飾部としては、限定されないが、以下のもの：
Figure 2022515193000012
 が挙げられ、
式中、Ｂは修飾型または非修飾型の核酸塩基である。
一部の実施形態では、二重鎖の熱不安定化性修飾部が：
Figure 2022515193000013
 からなる群より選択され、
式中、Ｂは修飾型または非修飾型の核酸塩基であり、各構造におけるアスタリスクはＲ、Ｓまたはラセミ体のいずれかを表す。
用語「非環状ヌクレオチド」は、例えば、ヌクレオチドにリボース炭素（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’もしくはＣ１’－Ｏ４’）間のいずれかの結合が存在しない、および／またはリボースの炭素もしくは酸素（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’もしくはＯ４’）のうちの少なくとも１つが独立して、あるいは組合せで存在しない非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを示す。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは
Figure 2022515193000014
 であり、式中、Ｂは修飾型または非修飾型の核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３またはアルキルであり；Ｒ３はＨ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である）。用語「ＵＮＡ」は非環式のアンロック核酸を示し、この場合、糖のいずれかの結合が除去されてアンロック「糖」残基を形成している。一例では、ＵＮＡには、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素間の炭素－酸素－炭素共有結合）が除去されている単量体もまた包含される。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’間の結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素間の炭素－炭素共有結合）が除去されている（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）を参照されたく、これらは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非環状誘導体は、ワトソン－クリック対合に影響することなく、より大きな骨格柔軟性をもたらす。非環状ヌクレオチドは２’－５’結合または３’－５’結合を介して連結され得る。
用語「ＧＮＡ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡと同様のポリマーであるが、その「骨格」の組成が、ホスホジエステル結合によって連結された反復グリセロール単位で構成されているという点で異なる、グリコール核酸を示す：
Figure 2022515193000015
二重鎖の熱不安定化性修飾部は、ｄｓＲＮＡ二重鎖内の熱不安定化性ヌクレオチドと向かい側の鎖の対向するヌクレオチド間のミスマッチ（すなわち、非相補的な塩基対）であってもよい。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔまたはその組合せが挙げられる。また、当該技術分野で知られた他のミスマッチ塩基対合も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチド間で起こり得る、すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖の修飾に関係なく、それぞれのヌクレオチドの核酸塩基間で起こり得る。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、ミスマッチ対合内に２’－デオキシ核酸塩基である少なくとも１つの核酸塩基を含む；例えば、２’－デオキシ核酸塩基はセンス鎖に存在する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二重鎖の熱不安定化性修飾部は、標的ｍＲＮＡの相補的な塩基、例えば：
Figure 2022515193000016
 とのＷ－Ｃ Ｈ－結合形成が障害されたヌクレオチドを含む。
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾部（例えば、ＵＮＡおよびＧＮＡ）ならびにミスマッチ修飾部のさらなる例はＷＯ２０１１／１３３８７６に詳細に記載されており、これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
また、熱不安定化性修飾部は、対向する塩基との水素結合形成能が低いか、または無効であるユニバーサル塩基、ホスフェート修飾部を含むものであってもよい。
一部の実施形態では、二重鎖の熱不安定化性修飾部は、非標準型の塩基、例えば限定されないが、向かい側の鎖の塩基との水素結合形成能が障害された、または完全に無効にされた核酸塩基修飾部を有するヌクレオチドを含む。このような核酸塩基修飾部は、ＷＯ２０１０／００１１８９５（これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、ｄｓＲＮＡ二重鎖の中央領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基修飾部は：
Figure 2022515193000017
 である。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二重鎖の熱不安定化性修飾部は、標的ｍＲＮＡの塩基、例えば：
Figure 2022515193000018
 に相補的な１または複数のα－ヌクレオチドを含み、
式中、ＲはＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ－アルキルである。
天然のホスホジエステル結合と比べてｄｓＲＮＡ二重鎖の熱安定性を低下させることが知られている例示的なホスフェート修飾部は：
Figure 2022515193000019
 である。
Ｒ基のアルキルはＣ１～Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとしては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
当業者には、本開示のＲＮＡｉ薬剤の特異性を規定する核酸塩基の機能的役割に鑑みると認識されるように、核酸塩基の修飾は、例えばオフターゲット効果と比べてオンターゲット効果を向上させる目的で、例えば不安定化性修飾部を本開示のＲＮＡｉ薬剤に導入するために、本明細書に記載のような種々の様式で行なわれ得るが、本開示のＲＮＡｉ薬剤に利用可能であり一般的には本開示のＲＮＡｉ薬剤に存在させる修飾部の範囲は、非核酸塩基の修飾、例えばポリリボヌクレオチドの糖鎖基および／またはリン酸骨格に対する修飾の方がずっと広い傾向にある。かかる修飾部は、本開示の他のセクションにさらに詳細に記載されており、天然状態の核酸塩基あるいは上記および／または本明細書の他の箇所に記載のような修飾核酸塩基のいずれかを有する本開示のＲＮＡｉ薬剤に明白に想定される。
熱不安定化性修飾部を含むアンチセンス鎖に加えて、ｄｓＲＮＡはまた、１または複数の安定化性修飾部を含むものであってもよい。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０またはそれより多く）の安定化性修飾部を含むものであり得る。限定されないが、安定化性修飾部はすべて一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が少なくとも２つの安定化性修飾部を含む。安定化性修飾部はセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、安定化性修飾部は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のどのヌクレオチドに存在し得；各安定化性修飾部がセンス鎖またはアンチセンス鎖に交互パターンで存在し得るか；あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖が交互パターンの両方の安定化性修飾部を含む。センス鎖の安定化修飾部の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても異なっていてもよく、センス鎖の安定化修飾部の交互パターンがアンチセンス鎖の安定化修飾部の交互パターンに対してシフトしていてもよい。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０またはそれより多く）の安定化性修飾部を含む。限定されないが、アンチセンス鎖の安定化性修飾部は任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスが安定化性修飾部を５’端から２位、６位、８位、９位、１４位および１６位に含む。一部の他の実施形態において、アンチセンスが安定化性修飾部を５’端から２位、６位、１４位および１６位に含む。一部のさらに他の実施形態において、アンチセンスが安定化性修飾部を５’端から２位、１４位および１６位に含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、不安定化性修飾部と隣接する少なくとも１つの安定化性修飾部を含む。例えば、安定化性修飾部は、不安定化性修飾部の５’端または３’端、すなわち不安定化性修飾部の位置から－１位または＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖が安定化性修飾部を不安定化性修飾部の５’端と３’端の各々、すなわち不安定化性修飾部の位置から－１位と＋１位に含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が少なくとも２つの安定化性修飾部を不安定化性修飾部の３’端、すなわち不安定化性修飾部から＋１位と＋２位の位置に含む。
一部の実施形態では、センス鎖が少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０またはそれより多く）の安定化性修飾部を含む。限定されないが、センス鎖の安定化性修飾部は任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖が安定化性修飾部を５’端から７位、１０位および１１位に含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は安定化性修飾部を５’端から７位、９位、１０位および１１位に含む。一部の実施形態では、センス鎖が安定化性修飾部を、アンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の１１位、１２位および１５位の向かい側の位置または相補的な位置に含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は安定化性修飾部をアンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の１１位、１２位、１３位および１５位の向かい側の位置または相補的な位置に含む。一部の実施形態では、センス鎖が、２、３または４つの安定化性修飾部のブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の二重鎖の熱不安定化性修飾部の向かい側の位置または相補的な位置に安定化性修飾部を含むものでない。
例示的な熱安定化性修飾部としては、限定されないが２’－フルオロ修飾部が挙げられる。他の熱安定化性修飾部としては、限定されないがＬＮＡが挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡが少なくとも４個（例えば、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多く）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。限定されないが、２’－フルオロヌクレオチドはすべて一方の鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方が少なくとも２個の２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾部はセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、２’－フルオロ修飾部は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のどのヌクレオチドに存在し得；各２’－フルオロ修飾部がセンス鎖またはアンチセンス鎖に交互パターンで存在し得るか；あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖が交互パターンの両方の２’－フルオロ修飾部を含む。センス鎖の２’－フルオロ修飾部の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても異なっていてもよく、センス鎖の２’－フルオロ修飾部の交互パターンがアンチセンス鎖の２’－フルオロ修飾部の交互パターンに対してシフトしていてもよい。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多く）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。限定されないが、アンチセンス鎖の２’－フルオロ修飾部は任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスが２’－フルオロヌクレオチドを５’端から２位、６位、８位、９位、１４位および１６位に含む。一部の他の実施形態において、アンチセンスが２’－フルオロヌクレオチドを５’端から２位、６位、１４位および１６位に含む。一部のさらに他の実施形態において、アンチセンスが２’－フルオロヌクレオチドを５’端から２位、１４位および１６位に含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、不安定化性修飾部と隣接する少なくとも１つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化性修飾部の５’端または３’端、すなわち不安定化性修飾部の位置から－１位または＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、２’－フルオロヌクレオチドを不安定化性修飾部の５’端と３’端の各々、すなわち不安定化性修飾部の位置から－１位と＋１位に含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が少なくとも２個の２’－フルオロヌクレオチドを不安定化性修飾部の３’端、すなわち不安定化性修飾部から＋１位と＋２位の位置に含む。
一部の実施形態では、センス鎖が少なくとも２個（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多く）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。限定されないが、センス鎖の２’－フルオロ修飾部は任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスが２’－フルオロヌクレオチドを５’端から７位、１０位および１１位に含む。一部の他の実施形態では、センス鎖が２’－フルオロヌクレオチドを５’端から７位、９位、１０位および１１位に含む。一部の実施形態では、センス鎖が２’－フルオロヌクレオチドをアンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の１１位、１２位および１５位の向かい側の位置または相補的な位置に含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は２’－フルオロヌクレオチドをアンチセンス鎖の５’端から数えてアンチセンス鎖の１１位、１２位、１３位および１５位の向かい側の位置またはコンプリメンタリーな位置に含む。一部の実施形態では、センス鎖が２、３または４つの２’－フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の二重鎖の熱不安定化性修飾部の向かい側の位置またはコンプリメンタリーな位置に２’－フルオロヌクレオチドを含むものでない。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、２１個のヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖と２３個のヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、該アンチセンス鎖は少なくとも１個の熱不安定化性ヌクレオチドを含み、ここで、該少なくとも１個の熱不安定化性ヌクレオチドはアンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）存在し、ｄｓＲＮＡの一方の端は平滑であるが、他方の端は２ｎｔのオーバーハングである ２ｎｔのオーバーハングを含み、該ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）アンチセンスが１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｖ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖ）センス鎖が１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡがアンチセンス鎖の５’端に平滑末端を含む。好ましくは、２ｎｔのオーバーハングはアンチセンスの３’端に存在する。
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖を含む本開示のｄｓＲＮＡ分子、ここで：センス鎖は２５～３０個のヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチドを始点（１位）として、前記センス鎖の１位～２３位は少なくとも８個のリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は３６～６６個のヌクレオチド残基の長さであり、３’末端ヌクレオチドを始点として、センス鎖の１位～２３位と対合して二重鎖を形成している位置に少なくとも８個のリボヌクレオチド；少なくともアンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と非対合であり、最大６個まで連続した３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と非対合であり、それにより１～６個のヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成しており；アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と非対合であり、それにより１０～３０個のヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成している１０～３０個連続したヌクレオチドを含み；少なくともセンス鎖の５’末端ヌクレオチドと３’末端ヌクレオチドは、センス鎖とアンチセンス鎖が最大の相補性でアラインメントされる場合、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖間の実質的に二重鎖の領域を形成し；前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞内に導入された場合、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の少なくとも１９個のリボヌクレオチドの長さにおいて標的ＲＮＡに、標的遺伝子発現が低減されるのに充分に相補的であり；アンチセンス鎖は少なくとも１個の熱不安定化性ヌクレオチドを含み、該少なくとも１個の熱不安定化性ヌクレオチドはアンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）存在する。例えば、熱不安定化性ヌクレオチドはセンス鎖の５’端の１４位～１７位の向かい側の位置間またはコンプリメンタリーな位置間に存在し、該ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）アンチセンスが１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｖ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖ）センス鎖が１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡが１２～３０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子がセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５個で最大２９個のヌクレオチドである長さを有するセンス鎖と最大３０個のヌクレオチドである長さを有するアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを５’端から１１位に含み、前記センス鎖の３’端と前記アンチセンス鎖の５’端は平滑末端を形成しており、前記アンチセンス鎖は、その３’端においてセンス鎖より１～４個のヌクレオチド分長く、二重鎖少なくとも２５個のヌクレオチドの長さである領域、前記アンチセンス鎖は、前記ｄｓＲＮＡ分子が哺乳動物細胞内に導入された場合に標的遺伝子発現が低減されるように、前記アンチセンス鎖の少なくとも１９ｎｔの長さに沿って標的ｍＲＮＡに充分に相補的であり、前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、アンチセンス鎖は少なくとも１個の熱不安定化性ヌクレオチドを含み、ここで、該少なくとも１個の熱不安定化性ヌクレオチドはアンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）存在し、該ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）アンチセンスが１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｖ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖ）センス鎖が１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは１２～２９ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドも修飾されたものであり得る。各ヌクレオチドは、同じ修飾で修飾されていても異なる修飾で修飾されていてもよく、該修飾としては、リン酸基の非連結酸素の一方もしくは両方および／またはリン酸基の１つもしくはそれより多くの連結酸素の１または複数の改変；リボース糖の構成要素、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの改変；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大規模な置き換え；天然に存在する塩基の修飾または置き換え；ならびにリボース－リン酸骨格の置き換えもしくは修飾が挙げられ得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるため、修飾の多くは核酸内で繰り返されている位置に存在し、例えば、塩基またはリン酸部分またはリン酸部分の非連結Ｏの修飾である。一部の場合では、修飾部は、核酸内の対象位置のすべてに存在するが、多くの場合、そうではない。一例として、修飾部は、３’末端または５’末端の位置のみに存在し得る、鎖の末端領域内、例えば末端ヌクレオチドまたは最後の２、３、４、５もしくは１０個のヌクレオチドの位置のみに存在し得る。修飾部は、二本鎖領域に存在していても、一本鎖領域に存在していても、両方に存在していてもよい。修飾部は、ＲＮＡの二本鎖領域内のみに存在していてもＲＮＡの一本鎖領域内のみに存在していてもよい。例えば、非連結Ｏの位置のホスホロチオエート修飾部は、一方の端のみまたは両方の端に存在し得、鎖の末端領域内、例えば末端ヌクレオチドまたは最後の２、３、４、５もしくは１０個のヌクレオチドの位置のみに存在し得るか、あるいは二本鎖領域内および一本鎖領域内に、特に末端に存在し得る。５’端（１つまたは複数）がリン酸化され得る。
例えば、安定性を向上させること、特定の塩基をオーバーハング内に含めること、あるいは修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドサロゲートを一本鎖オーバーハング内に、例えば、５’オーバーハングもしくは３’オーバーハングまたは両方に含めることが考えられ得る。例えば、プリンヌクレオチドをオーバーハング内に含めることが望ましい場合があり得る。一部の実施形態では、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング内の塩基の全部または一部が例えば本明細書に記載の修飾部で修飾され得る。修飾としては、例えば、当該技術分野で知られた修飾でのリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボース糖の代わりにデオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチル修飾型の使用、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾部が挙げられ得る。オーバーハングは標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基が独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシまたは２’－フルオロで修飾される。該鎖は１つより多くの修飾部を含んでいてもよい。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基が独立して、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾される。このような修飾部は、アンチセンス鎖に存在する二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部に付加的であることは理解されよう。
異なる少なくとも２つの修飾部は典型的にはセンス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。該２つの修飾部は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部、非環状ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシから選択される、修飾部が異なる２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基が独立して、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２´－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチドまたは２’－ａｒａ－Ｆヌクレオチドで修飾される。この場合も、このような修飾部は、アンチセンス鎖に存在する二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部に付加的であることは理解されよう。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、交互パターンの修飾部を、特にＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域内に含む。用語「交互のモチーフ」または「交互にみられるパターン」は、本明細書で用いる場合、１または複数の修飾部を有し、各修飾部が一方の鎖の交互のヌクレオチドに存在するモチーフを示す。交互のヌクレオチドは、１個おき１個のヌクレオチドもしくは３個ごと１個のヌクレオチドまたは同様のパターンを示し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドに対する１つの型の修飾部を表す場合、交互のモチーフは、“ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…”、“ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…”、“ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…”、“ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…”、“ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…”または“ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…”などであり得る。
交互のモチーフに含まれる修飾部の型は同じであっても異なっていてもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチドに対する１つの型の修飾部を表す場合、交互パターン、すなわち１個おきのヌクレオチドの修飾部は同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、交互のモチーフにおける修飾部のいくつかの可能性、例えば“ＡＢＡＢＡＢ…”、“ＡＣＡＣＡＣ…”“ＢＤＢＤＢＤ…”または“ＣＤＣＤＣＤ…”などから選択され得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、アンチセンス鎖の交互のモチーフの修飾パターンに対してシフトしているセンス鎖の交互のモチーフの修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応する（およびその逆の場合）ようなものであり得る。例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖内でセンス鎖がアンチセンス鎖と対合している場合、二重鎖領域内のセンス鎖の交互のモチーフは該鎖の５’から３’に向かって“ＡＢＡＢＡＢ”で始まり得、アンチセンス鎖の交互のモチーフは該鎖の３’から５’に“ＢＡＢＡＢＡ”で始まり得る。別の一例として、二重鎖領域内のセンス鎖の交互のモチーフは該鎖の５’から３’に向かって“ＡＡＢＢＡＡＢＢ”で始まり得、アンチセンス鎖の交互のモチーフは該鎖の３’から５’に向かって“ＢＢＡＡＢＢＡＡ”で始まり得、センス鎖とアンチセンス鎖間に修飾パターンの完全シフトまたは部分シフトが存在するようになっている。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含んでいてもよい。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部は、センス鎖またはアンチセンス鎖または両方の該鎖の任意の位置の任意のヌクレオチドに存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾部は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のどのヌクレオチドにも存在し得；各ヌクレオチド間結合修飾部がセンス鎖またはアンチセンス鎖に交互パターンで存在し得るか；あるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖が交互パターンの両方のヌクレオチド間結合修飾部を含む。センス鎖のヌクレオチド間結合修飾部の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても異なっていてもよく、センス鎖のヌクレオチド間結合修飾部の交互パターンは、アンチセンス鎖のヌクレオチド間結合修飾部の交互パターンに対してシフトを有するものであってもよい。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子が、オーバーハング領域内にホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部を含む。例えば、オーバーハング領域は、２個のヌクレオチドを含み、該２個のヌクレオチド間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する。また、ヌクレオチド間結合修飾部を、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の対合ヌクレオチドと連結させるために作製してもよい。例えば、少なくとも２個、３時、４個またはすべてのオーバーハングヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合により連結され得、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドを該オーバーハングヌクレオチドのとなりの対合ヌクレオチドと連結させるさらなるホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が存在し得る。例えば、３個の末端ヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し得、ここで、該３個のヌクレオチドのうちの２個はオーバーハングヌクレオチドであり、３個目はオーバーハングヌクレオチドの隣の対合ヌクレオチドである。好ましくは、このような末端の３個のヌクレオチドはアンチセンス鎖の３’端に存在し得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた２～１０個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の１つ～１０のブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むアンチセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた３個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた４個ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた６個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５、６、７または８個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた７個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３、４、５または６個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖が、１、２、３または４個のホスフェートヌクレオチド間結合によって隔てられた９個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、該ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合のうちの１つは該オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、メチルホスホネートヌクレオチド間結合およびホスフェートヌクレオチド間結合の任意の組合せを含むセンス鎖またはホスホロチオエート結合もしくはメチルホスホネート結合もしくはホスフェート結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の１～１０個の末端位置内に１または複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の一方の端または両方の端で連結され得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の各々の二重鎖の１～１０個の内部領域内に１または複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドがホスホロチオエート メチルホスホネートヌクレオチド間結合により、センス鎖の５’端から数えて二重鎖領域の８位～１６位で連結され得；該ｄｓＲＮＡ分子は任意選択で、１～１０個の末端位置内に１または複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に１～５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１～５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１～５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１～５つをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つ、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つ、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位～５位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および１８位～２３位内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２０位と２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位に１つをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２０位と２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位と２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位と２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２２位と２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖の（５’端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、センス鎖の（５’端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部、ならびにアンチセンス鎖（５’端から数えて）１位と２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部および２３位と２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾部をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物が、あるパターンの骨格キラル中心を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも５個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも６個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも７個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも８個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも９個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１０個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１１個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１２個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１３個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１４個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１５個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１６個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１７個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１８個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＳｐ体の少なくとも１９個のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の８個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の７個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の６個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の５個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の４個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の３個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の２個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンがＲｐ体の１個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない８個以下のインターヌクレオチド結合（非限定的な一例として、ホスホジエステル）を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない７個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない６個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない５個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない４個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない３個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない２個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、キラルでない１個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、Ｓｐ体の少なくとも１０個のインターヌクレオチド結合およびキラルでない８個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、Ｓｐ体の少なくとも１１個のインターヌクレオチド結合およびキラルでない７個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、Ｓｐ体の少なくとも１２個のインターヌクレオチド結合およびキラルでない６個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、Ｓｐ体の少なくとも１３個のインターヌクレオチド結合およびキラルでない６個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、Ｓｐ体の少なくとも１４個のインターヌクレオチド結合およびキラルでない５個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、骨格キラル中心の共通パターンが、Ｓｐ体の少なくとも１５個のインターヌクレオチド結合およびキラルでない４個以下のインターヌクレオチド結合を含むものである。一部の実施形態では、Ｓｐ体のインターヌクレオチド結合が任意選択で連続しているか、または連続していない。一部の実施形態では、Ｒｐ体のインターヌクレオチド結合が任意選択で連続しているか、または連続していない。一部の実施形態では、キラルでないインターヌクレオチド結合が任意選択で連続しているか、または連続していない。
一部の実施形態では、本開示の化合物がブロックを含み、該ブロックが立体化学的配置ブロックである。一部の実施形態では、ブロックが、該ブロックの各インターヌクレオチド結合がＲｐであるＲｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックがＲｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックがＲｐブロックである。一部の実施形態では、ブロックが、該ブロックの各インターヌクレオチド結合がＳｐであるＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックがＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックがＳｐブロックである。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドがＲｐブロックとＳｐブロックの両方を含む。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドが１または複数のＲｐを含んでいるがＳｐブロックを含んでいない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドが１または複数のＳｐを含んでいるがＲｐブロックを含んでいない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドが、１または複数のＰＯブロックを含み、天然のホスフェート結合内の各インターヌクレオチド結合。
一部の実施形態では、本開示の化合物が５’－ブロックを含み、該５’－ブロックが、各糖部分が２’－Ｆ修飾部を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックが、インターヌクレオチド結合の各々が修飾インターヌクレオチド結合であり、各糖部分が２’－Ｆ修飾部を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックが、インターヌクレオチド結合の各々がホスホロチオエート結合であり、各糖部分が２’－Ｆ修飾部を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックが４以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックが５以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックが６以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックが７以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックが、各糖部分が２’－Ｆ修飾部を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックが、インターヌクレオチド結合の各々が修飾インターヌクレオチド結合であり、各糖部分が２’－Ｆ修飾部を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックが、インターヌクレオチド結合の各々がホスホロチオエート結合であり、各糖部分が２’－Ｆ修飾部を含むＳｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックが４以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックが５以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックが６以上ヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックが７以上ヌクレオシド単位を含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物が、ある領域内またはオリゴヌクレオチド内のある型のヌクレオシドの後に特定の型のインターヌクレオチド結合、例えば、天然のホスフェート結合、修飾型インターヌクレオチド結合、Ｒｐキラルインターヌクレオチド結合、Ｓｐキラルインターヌクレオチド結合などがあるものを含む。一部の実施形態では、Ａの後にＳｐがある。一部の実施形態では、Ａの後にＲｐがある。一部の実施形態では、Ａの後に天然のホスフェート結合（ＰＯ）がある。一部の実施形態では、Ｕの後にＳｐがある。一部の実施形態では、Ｕの後にＲｐがある。一部の実施形態では、Ｕの後に天然のホスフェート結合（ＰＯ）がある。一部の実施形態では、Ｃの後にＳｐがある。一部の実施形態では、Ｃの後にＲｐがある。一部の実施形態では、Ｃの後に天然のホスフェート結合（ＰＯ）がある。一部の実施形態では、Ｇの後にＳｐがある。一部の実施形態では、Ｇの後にＲｐがある。一部の実施形態では、Ｇの後に天然のホスフェート結合（ＰＯ）がある。一部の実施形態では、ＣとＵの後にＳｐがある。一部の実施形態では、ＣとＵの後にＲｐがある。一部の実施形態では、ＣとＵの後に天然のホスフェート結合（ＰＯ）がある。一部の実施形態では、ＡとＧの後にＳｐがある。一部の実施形態では、ＡとＧの後にＲｐがある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、２１番目と２２番目のヌクレオチド位置間および２２番目と２３番目のヌクレオチド位置間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部を含み、ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）アンチセンスが３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｖ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖ）センス鎖が１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡが１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡがアンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖が、１番目と２番目のヌクレオチド位置間、２番目と３番目のヌクレオチド位置間、２１番目と２２番目のヌクレオチド位置間および２２番目と２３番目のヌクレオチド位置間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部を含み、ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｉｉ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｖ）センス鎖が１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡが１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡがアンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態では、センス鎖が、１番目と２番目のヌクレオチド位置間および２番目と３番目のヌクレオチド位置間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部を含み、ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）アンチセンスが１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｖ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖ）センス鎖が３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡが１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡがアンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態では、センス鎖が、１番目と２番目のヌクレオチド位置間および２番目と３番目のヌクレオチド位置間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖が、１番目と２番目のヌクレオチド位置間、２番目と３番目のヌクレオチド位置間、２１番目と２２番目のヌクレオチド位置間および２２番目と２３番目のヌクレオチド位置間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、該アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に（すなわち、アンチセンス鎖の５’端の２～９位に）位置する二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部を含み、該ｄｓＲＮＡは任意選択でさらに、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたは７つすべて）を有する：（ｉ）アンチセンスが２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｉ）センス鎖がリガンドとコンジュゲートされている；（ｉｉｉ）センス鎖が２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｉｖ）センス鎖が３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡが少なくとも４つの２’－フルオロ修飾部を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡが１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡがアンチセンス鎖の５’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が標的とのミスマッチ（１つまたは複数）を二重鎖内、またはその組合せに含む。ミスマッチは、オーバーハング領域に存在していても二重鎖領域に存在していてもよい。塩基対は、その解離または融解の促進傾向に基づいて（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づいてランク付けされ得る。最も簡単なアプローチはペアを個々のペアベースで調べることであるが、最近接解析または同様の解析もまた使用され得る）。解離の促進に関して：Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準型または標準型以外の対合（本明細書の他の箇所に記載のような）は標準型（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合より好ましく；ユニバーサル塩基を含む対合は標準型対合より好ましい。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から最初の１、２、３、４または５つの塩基対のうちの少なくとも１つを含み、該塩基対は独立して：Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃおよびミスマッチペア、例えば非標準型対合もしくは標準型以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から選択され得、二重鎖の５’端でのアンチセンス鎖の解離を促進させる。
一部の実施形態では、二重鎖領域内のアンチセンス鎖内の５’端から１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群より選択される。あるいはまた、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から最初の１、２または３つの塩基対のうちの少なくとも１つがＡＵ塩基対である。例えば、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’端から最初の塩基対がＡＵ塩基対である。
４’修飾ヌクレオチドおよび／または５’修飾ヌクレオチドを、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドの任意の位置のジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）および／またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）結合の３’端に導入すると、ヌクレオチド間結合に対して立体効果が奏され、したがって該結合がヌクレアーゼに対して保護または安定化され得ることが認められた。
一部の実施形態では、５’修飾ヌクレオシドが一本鎖または二本鎖のｉＲＮＡの任意の位置のジヌクレオチドの３’端に導入される。例えば、５’－アルキル化ヌクレオシドが一本鎖または二本鎖のｉＲＮＡの任意の位置のジヌクレオチドの３’端に導入され得る。リボース糖の５’位のアルキル基はラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳの異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドは５’－メチルヌクレオシドである。５’－メチルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’修飾ヌクレオシドが一本鎖または二本鎖のｉＲＮＡの任意の位置のジヌクレオチドの３’端に導入される。例えば、４’－アルキル化ヌクレオシドが一本鎖または二本鎖のｉＲＮＡの任意の位置のジヌクレオチドの３’端に導入され得る。リボース糖の４’位のアルキル基はラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳの異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドは４’－メチルヌクレオシドである。４’－メチルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。あるいはまた、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドが一本鎖または二本鎖のｉＲＮＡの任意の位置のジヌクレオチドの３’端に導入され得る。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲもしくはＳの異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは４’－Ｏ－メチルヌクレオシドである。４’－Ｏ－メチルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、５’－アルキル化ヌクレオシドがｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、かかる修飾によりｄｓＲＮＡの有効能が維持または改善される。５’－アルキルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドは５’－メチルヌクレオシドである。５’－メチルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－アルキル化ヌクレオシドがｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、かかる修飾によりｄｓＲＮＡの有効能が維持または改善される。４’－アルキルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドは４’－メチルヌクレオシドである。４’－メチルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドがｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置に導入され、かかる修飾によりｄｓＲＮＡの有効能が維持または改善される。５’－アルキルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは４’－Ｏ－メチルヌクレオシドである。４’－Ｏ－メチルはラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体またはキラル的に純粋なＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が２’－５’結合を含み得る（２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有し、Ｐ＝ＯまたはＰ＝Ｓを有する）。例えば、２’－５’結合修飾部は、ヌクレアーゼ耐性を促すため、またはアンチセンス鎖に対するセンス鎖の結合を阻害するために使用され得るか、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’端に使用され得る。
別の実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子はＬ糖を含み得る（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ－アラビノース）。例えば、このようなＬ糖部修飾部は、ヌクレアーゼ耐性を促すため、またはアンチセンス鎖に対するセンス鎖の結合を阻害するために使用され得るか、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’端に使用され得る。
種々の刊行物に多量体型ｓｉＲＮＡが記載されており、これらはすべて、本開示のｄｓＲＮＡで使用され得る。かかる刊行物としては、ＷＯ２００７／０９１２６９、米国特許第７８５８７６９号、ＷＯ２０１０／１４１５１１、ＷＯ２００７／１１７６８６、ＷＯ２００９／０１４８８７およびＷＯ２０１１／０３１５２０が挙げられ、これらは本明細書にその全体が組み込まれる。
ｄｓＲＮＡ分子との１または複数の糖鎖部分のコンジュゲーションを含むｄｓＲＮＡ分子は、該ｄｓＲＮＡ分子の１または複数の特性を最適化し得る。多くの場合、糖鎖部分はｄｓＲＮＡ分子の修飾サブユニットに結合される。例えば、ｄｓＲＮＡ分子の１または複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば、糖鎖リガンドが結合されている非糖鎖（好ましくは環状）担体で置き換えられ得る。サブユニットのリボース糖がそのように置き換えられているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書ではリボース置き換え修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称する。環状担体は、炭素環式の環系、すなわちすべての環内原子が炭素原子であるものであってもよく、複素環式の環系、すなわち、１または複数の環内原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、イオウであり得るものであってもよい。環状担体は単環式の環系であってもよく、２以上の環、例えば縮合環を含むものであってもよい。環状担体は完全飽和型の環系であってもよく、１または複数の二重結合を含むものであってもよい。
リガンドは該ポリヌクレオチドに担体を介して結合され得る。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格結合点」、好ましくは２つの「骨格結合点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザリング結合点」を含む。「骨格結合点」は、本明細書で用いる場合、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般的には、骨格内への担体の組込みに利用可能であり、該組込みに適した結合、例えばホスフェートもしくは修飾ホスフェート、例えばリボ核酸の含硫骨格を示す。「テザリング結合点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態において、選択された部分を連結する、環状担体の構成環内原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点をもたらす原子とは相違する）を示す。該部分は、例えば糖鎖、例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在するテザリング部によって環状担体に連結される。したがって、環状担体は多くの場合、官能基、例えばアミノ基を含むものであるか、または一般的には、構成環への別の化学的実体、例えばリガンドの組込みまたはテザリングに適した結合をもたらすものである。
一実施形態において、本開示のｄｓＲＮＡ分子はリガンドに担体を介してコンジュゲートされ、ここで、該担体は環式基または非環式基であり得；好ましくは、該環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、該非環式基はセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
本開示の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）薬剤は任意選択で１または複数のリガンドにコンジュゲートされ得る。リガンドはセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖に３’端、５’端または両端で結合され得る。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’端にコンジュゲートされ得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子が５’リン酸化型であるか、あるいは５’プライム末端にホスホリルアナログを含む。５’－ホスフェート修飾部としては、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合性であるものが挙げられる。好適な修飾部としては：５’－モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－グアノシンキャップ（７－メチル化型または非メチル化型）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、ならびに任意の修飾または非修飾のヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）；５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）；５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）；任意のさらなる組合せの酸素／イオウ置き換え型モノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェート（例えば、５’－アルファ－チオトリホスフェート、５’－ガンマ－チオトリホスフェートなど）、５’－ホスホロアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’，（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）が挙げられる。一例では、該修飾部がｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖分子の代わりとなり得る。
Ｆ．リンカー
一部の実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートまたはリガンドはＲＮＡｉ薬剤オリゴヌクレオチドに、切断性または非切断性であり得る種々のリンカーを用いて結合され得る。
用語「リンカー」または「連結基」は、化合物の２つの部分を連結する、例えば化合物の２つの部分を共有結合によって結合させる有機部分を意味する。リンカーは典型的には、直接結合あるいは原子、例えば酸素もしくはイオウ、単位、例えばＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは原子鎖、例えば限定されないが、置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換もアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリールを含むものであり、その１または複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換のアリール、置換または非置換のヘテロアリール、置換または非置換の複素環式部で分断されていても終結していてもよく；ここで、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７または８～１６個の原子である。
切断性連結基は、細胞外では充分に安定であるが、標的細胞内に進入したら切断されて、リンカーが一体にして保持している２つの部分を解離させるものである。好ましい一実施形態では、切断性連結基は、標的細胞内または第１の参照条件下において（これは、例えば細胞内条件を模倣するか、あるいは細胞内条件を表すように選択され得る）、対象の血中または第２の参照条件下（これは、例えば、血液もしくは血清においてみられる条件を模倣するか、あるいは血液もしくは血清においてみられる条件を表すように選択され得る）より少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも約１００倍速く切断される。
切断性連結基は切断因子に対して、例えば、ｐＨ、レドックス電位または分解性分子の存在に対して感受性である。一般的に、切断因子は、細胞内部の方が血清中または血中より高いレベルまたは活性で、より多くみられる、あるいは見い出される。かかる分解性薬剤の例としては：特定の基質に対して選択されるか、あるいは基質特異性を有しないレドックス因子、例えば、細胞内に存在する酸化酵素または還元酵素もしくは還元によってレドックス切断性連結基を分解することができる還元因子、例えばメルカプタンなど；エステラーゼ；エンドソームまたは酸性環境をもたらし得る薬剤、例えば５以下のｐＨをもたらすもの；一般酸として作用することによって酸切断性連結基を加水分解して分解させ得る酵素、ペプチダーゼ（これは基質特異的であり得る）、およびホスファターゼが挙げられる。
切断性の連結基、例えばジスルフィド結合はｐＨに対して感受性であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均的な細胞内ｐＨは若干低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、５．０前後のさらにより酸性のｐＨを有する。一部のリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断性連結基を有し、それによりカチオン性脂質がリガンドから細胞内部に、または細胞の所望の区画内に放出される。
リンカーは、特定の酵素により切断性の切断性連結基を含むものであり得る。リンカーに組み込まれる切断性連結基の型は、標的化対象の細胞に依存し得る。
一般に、切断性連結基の候補の好適性は、分解性の因子（または条件）が候補連結基を切断する能力を試験することによって評価され得る。また、切断性連結基の候補を、血中での切断耐性能力または他の非標的組織と接触している場合の切断耐性能力について試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件間で切断に対する相対感受性を調べてもよく、この場合、第１の条件は標的細胞内での切断を示すように選択され、第２の条件は、他の組織内または生体液中、例えば血中もしくは血清中での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系、細胞、細胞培養物、器官もしくは組織培養物において、または全身動物個体において行なわれ得る。初期評価を無細胞または細胞培養物の条件において行なうこと、およびさらなる評価を全身動物個体において確認することは有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比べて少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く切断される。
ｉ．レドックス切断性連結基
一実施形態において、切断性連結基は、還元または酸化されると切断されるレドックス切断性連結基である。還元切断性連結基の一例はジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）である。切断性連結基の候補が好適な「還元切断性連結基」であるかどうか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的化剤との使用に適しているかどうかを調べるために、本明細書に記載の方法に目が向けられ得る。例えば、候補は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または当該技術分野で知られた試薬を用いる他の還元剤との、細胞内、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断速度を模倣するインキュベーションによって評価され得る。また、候補を、血液または血清の状態を模倣するように選択された条件下で評価してもよい。１つにおいて、候補化合物は、血液中では最大で約１０％切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）において、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比べて少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、標準的な酵素速度論アッセイを使用し、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で測定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．ホスフェートベースの切断性連結基 別の実施形態において、切断性リンカーはホスフェートベースの切断性連結基を含む。ホスフェートベースの切断性連結基は、リン酸基を分解または加水分解する因子によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する因子の一例は細胞内の酵素、例えばホスファターゼである。ホスフェートベースの連結基の例は－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ Ｒｋ）－Ｓ－である。好ましい実施形態は－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－である。好ましい一実施形態は－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これらの候補は、上記のものと同様の方法を用いて評価され得る。
ｉｉｉ．酸切断性連結基
別の実施形態において、切断性リンカーは酸切断性連結基を含むものである。酸切断性連結基は酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断性連結基は、約６．５もしくはそれより低い（例えば約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０もしくはそれより低い）ｐＨを有する酸性環境において、または薬剤、例えば一般酸として作用し得る酵素によって切断される。細胞内では、特定の低ｐＨ細胞小器官、例えばエンドソームおよびリソソームが酸切断性連結基に対する切断性環境をもたらす。酸切断性連結基の例としては、限定されないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断性基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏまたは－ＯＣ（Ｏ）を有するものであり得る。好ましい一実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合している炭素がアリール基、置換アルキル基、または第三級アルキル基、例えばジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである場合である。このような候補は、上記のものと同様の方法を用いて評価され得る。
ｉｖ．エステルベースの連結基 別の実施形態において、切断性リンカーはエステルベースの切断性連結基を含むものである。エステルベースの切断性連結基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断性連結基の例としては、限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンのエステル基が挙げられる。エステル切断性連結基は一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有するものである。このような候補は、上記のものと同様の方法を用いて評価され得る。
ｖ．ペプチドベースの切断基
また別の実施形態において、切断性リンカーはペプチドベースの切断性連結基を含むものである。ペプチドベースの切断性連結基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断性連結基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドがもたらされるようにアミノ酸間に形成されるペプチド結合である。ペプチドベースの切断性基はアミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を包含しない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキンレン間に形成され得るものである。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質がもたらされるようにアミノ酸間に形成される特殊な型のアミド結合である。ペプチドベースの切断基は一般的に、ペプチドおよびタンパク質がもたらされるようにアミノ酸間に形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含むものではない。ペプチドベースの切断性連結基は一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有するものであり、式中、ＲＡおよびＲＢは、隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。このような候補は、上記のものと同様の方法を用いて評価され得る。
ＲＮＡコンジュゲートの調製が教示されている代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号；同第６，２９４，６６４号；同第６，３２０，０１７号；同第６，５７６，７５２号；同第６，７８３，９３１号；同第６，９００，２９７号；同第７，０３７，６４６号；同第８，１０６，０２２号が挙げられ、これらの各々の全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物のすべての位置が均一に修飾されていることは必要でなく、実際、１つより多くの前述の修飾部が単一の化合物に組み込まれ得るか、あるいはＲＮＡｉ薬剤の単一のヌクレオシドに組み込まれることさえあり得る。本開示は、キメラ化合物であるＲＮＡｉ薬剤もまた包含している。
本開示との関連における「キメラ」ＲＮＡｉ薬剤または「キメラ体」は、２以上の化学的に相違する領域を含み、該領域の各々が少なくとも１つの単量体単位で、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドで構成されているＲＮＡｉ薬剤であり、好ましくはｄｓＲＮＡである。このようなＲＮＡｉ薬剤は典型的には、ＲＮＡｉ薬剤に対してヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取込みの増大および／または標的核酸に対する結合親和性の増大が付与されるようにそのＲＮＡが修飾された少なくとも１つの領域を含んでいる。ＲＮＡｉ薬剤のさらなる領域を、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質として使用してもよい。一例として、ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化によってＲＮＡ標的の切断がもたらされ、それにより遺伝子発現のＲＮＡｉ薬剤媒介性阻害の効率が大きく向上する。その結果、キメラｄｓＲＮＡを使用すると、多くの場合、より短鎖のＲＮＡｉ薬剤で、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比べて同等の結果が得られ得る。ＲＮＡ標的の切断はゲル電気泳動によって、および必要な場合は、当該技術分野で知られた核酸ハイブリダイゼーション手法を伴って常套的に検出され得る。
一部の特定の場合では、ＲＮＡｉ薬剤のＲＮＡが非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子がＲＮＡｉ薬剤に、ＲＮＡｉ薬剤の活性、細胞内分布または細胞内取込みを向上させるためにコンジュゲートされており、かかるコンジュゲーションを行なうための手順は科学文献において入手可能である。かかる非リガンド部分は、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が含まれているものである。かかるＲＮＡコンジュゲートの調製が教示されている代表的な米国特許は上記に列記している。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１または複数の位置にアミノリンカーを担持しているＲＮＡの合成を伴う。次いでアミノ基を、コンジュゲートさせる分子と、適切なカップリング試薬または活性化試薬を用いて反応させる。コンジュゲーション反応は、まだ固相支持体に結合しているＲＮＡを用いて、またはＲＮＡの切断後、溶液相中でのいずれかで行なわれ得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により典型的には純粋なコンジュゲートが得られる。
ＶＩ．本開示のＲＮＡｉ薬剤の送達
細胞への本開示のＲＮＡｉ薬剤の送達、例えば、対象、例えばヒト対象（例えば、該送達を必要とする対象、例えばＡＰＰ関連障害、例えばＣＡＡおよび／またはＡＤ、例えばＥＯＦＡＤを有する対象）内部の細胞への本開示のＲＮＡｉ薬剤の送達は、いくつかの異なる様式で行なわれ得る。例えば、送達は、細胞を本開示のＲＮＡｉ薬剤とインビトロまたはインビボのいずれかで接触させることにより行なわれ得る。また、インビボ送達は、ＲＮＡｉ薬剤、例えばｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接的に行なわれ得る。あるいはまた、インビボ送達は、ＲＮＡｉ薬剤をコードしており、その発現を指令する１または複数のベクターを投与することによって間接的に行なわれ得る。このような択一的な方法は以下にさらに論考している。
一般に、核酸分子（インビトロまたはインビボ）の任意の送達方法が本開示のＲＮＡｉ薬剤での使用に適合され得る。（例えば、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４およびＷＯ９４／０２５９５参照、これらは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。インビボ送達について、ＲＮＡｉ薬剤を送達するために考慮する要素としては、例えば、送達される薬剤の生体内安定性、非特異的効果の抑制および送達される薬剤の標的組織内における蓄積が挙げられる。ＲＮＡｉ薬剤の非特異的効果は、局所投与によって、例えば組織内への直接注射または埋込み、または該調製物を経表面投与することによって最小限になり得る。処置部位への局所投与により、薬剤の局所濃度が最大限になり、局所投与以外の場合では薬剤の被害を受ける可能性があるか、または薬剤を分解し得る全身の組織への該薬剤の曝露が限定的となり、投与するＲＮＡｉ薬剤の総用量を少なくすることが可能となる。いくつかの試験で、ＲＮＡｉ薬剤を局所投与した場合の遺伝子産物の成功裡のノックダウンが示されている。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）およびマウスにおける網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）はどちらも加齢性黄斑変性の実験モデルにおいて新血管形成を抑制すること示された。また、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射により腫瘍体積が縮小し（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍担持マウスの生存期間が長くなり得る（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。また、ＲＮＡ干渉も、直接注射によるＣＮＳへの局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａ．ｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）および鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）で成功裡であることが示されている。疾患の処置のためのＲＮＡｉ薬剤の全身投与のためには、ＲＮＡは修飾され得るか、あるいはまた薬物送達系を用いて送達され得る；どちらの方法も、インビボでエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速分解を抑制する作用がある。また、ＲＮＡまたは医薬用担体の修飾により、標的組織へのＲＮＡｉ薬剤の標的化が可能となり、望ましくないオフターゲット効果が回避される（例えば、理論に拘束されることを望まないが、本明細書に記載のようなＧＮＡの使用は、ｄｓＲＮＡのシード領域を不安定化させ、オフターゲット効果と比べてオンターゲット有効性に対するかかるｄｓＲＮＡの優先性の向上をもたらし、そのため、かかるシード領域の不安定化によってオフターゲット効果が有意に弱められることが確認されている）。ＲＮＡｉ薬剤は、細胞内取込みを向上させ、分解を抑制するために親油性基、例えばコレステロールとの化学的コンジュゲーションによって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたＡｐｏＢに対して指向されるＲＮＡｉ薬剤をマウスに全身注射し、肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。アプタマーとのＲＮＡｉ薬剤のコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害し、腫瘍の退縮を媒介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。択一的な一実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤が、薬物送達系、例えばナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソームまたはカチオン性送達系を用いて送達され得る。正荷電のカチオン性送達系は、ＲＮＡｉ薬剤分子（負荷電）の結合を助長し、また、負荷電の細胞膜での相互作用を向上させ、細胞によるＲＮＡｉ薬剤の効率的な取込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマーまたはポリマーはＲＮＡｉ薬剤に結合され得るか、あるいは小胞またはミセルを形成するように誘導され得るかのいずれかであり（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６参照）、該小胞またはミセルにはＲＮＡｉ薬剤が封じ込められる。小胞またはミセルの形成は、全身投与した場合のＲＮＡｉ薬剤の分解をさらに抑制する。カチオン性のＲＮＡｉ薬剤複合体の作製および投与のための方法は充分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５参照、これらは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡｉ薬剤の全身送達に有用な薬物送達系の非限定的な一例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），上掲；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３），上掲）、「固形核酸脂質粒子」のオリゴフェクタミン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日に出版前電子公開；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤を、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成させる。ＲＮＡｉ薬剤およびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は米国特許第７，４２７，６０５号にみられ得、これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示の一部の特定の態様は、細胞におけるＡＰＰ標的遺伝子の発現を低減させる方法であって、前記細胞を本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤と接触させることを含む方法に関する。一実施形態において、細胞は肝外細胞、任意選択でＣＮＳ細胞である。
本開示の別の態様は、対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を投与することを含む、対象におけるＡＰＰ標的遺伝子の発現を低減させる方法に関する。
本開示の別の態様は、ＣＮＳ障害を有する対象の処置方法であって、該対象に治療有効量の本開示の二本鎖ＡＰＰ標的化ＲＮＡｉ薬剤を投与し、それにより該対象を処置することを含む方法に関する。本開示の方法によって処置され得る例示的なＣＮＳ障害としては、アルツハイマー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症、ハンチントン、パーキンソン、脊髄小脳、プリオンおよびラフォラが挙げられる。
一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は髄腔内投与される。二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の髄腔内投与により、該方法によって脳または脊椎の組織、例えば皮質、小脳、線条体、頸椎、腰椎および胸椎におけるＡＰＰ標的遺伝子の発現を低減させることができる。
説明を簡単にするため、このセクションにおける製剤、組成物および方法は広く修飾型ｓｉＲＮＡ化合物に関して論考している。しかしながら、このような製剤、組成物および方法は他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば非修飾型ｓｉＲＮＡ化合物でも実施され得、かかる実施は本開示の範囲に含まれることは理解され得よう。ＲＮＡｉ薬剤を含む組成物は対象にさまざまな経路によって送達され得る。例示的な経路としては：髄腔内、静脈内、経表面、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、経肺、接眼が挙げられる。
本開示のＲＮＡｉ薬剤は、投与に適した医薬組成物内に組み込まれ得る。かかる組成物は典型的には、１種類または複数種の種のＲＮＡｉ薬剤および薬学的に許容され得る担体を含む。本明細書で用いる場合、文言「薬学的に許容され得る担体」は、医薬品の投与と適合性の任意のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含していることを意図する。医薬活性物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。任意の慣用的な媒体または薬剤は、活性化合物と非適合性でない限り、該組成物中におけるその使用が想定される。また、補助活性化合物を該組成物中に組み込んでもよい。
本開示の医薬組成物は、局所処置が所望されるか、または全身性処置が所望されるかに応じて、および処置対象の領域に応じていくつかの様式で投与され得る。投与は、経表面（例えば、経眼、経膣、経直腸、鼻腔内、経皮）、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射または髄腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。
投与の経路および部位は、標的化が向上するように選出され得る。例えば、筋肉細胞を標的化するためには、対象筋肉内への筋肉内注射が当然の選択であろう。肺細胞は、エーロゾル形態のＲＮＡｉ薬剤を投与することによって標的化され得よう。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをＲＮＡｉ薬剤でコーティングし、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的化することができよう。
経表面投与のための製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、スプレー剤、液状剤および粉末剤が挙げられ得る。慣用的な医薬用担体、水性、粉末状または油性の基剤、増粘剤などが必要であり得るか、または望ましい場合があり得る。コーティングされたコンドーム、グローブなどもまた有用であり得る。
経口投与のための組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水、シロップ、エリキシルもしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは液剤、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤またはトローチ剤が挙げられる。錠剤の場合、使用され得る担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウムおよびリン酸の塩が挙げられる。種々の崩壊剤、例えばデンプン、ならびに潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクが錠剤に一般的に使用される。カプセル形態での経口投与では、有用な希釈剤はラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁剤が経口使用に必要とされる場合、核酸組成物を乳化剤および懸濁化剤と合わせるのがよい。所望される場合は、ある種の甘味剤および／または着香剤が添加され得る。
髄腔内または脳室内投与のための組成物は滅菌水性液剤を含むものであり得、該水性液剤にはバッファー、希釈剤および他の好適な添加剤もまた含有させてもよい。
非経口投与のための製剤滅菌水性液剤を含むものであり得、該水性液剤にはバッファー、希釈剤および他の好適な添加剤もまた含有させてもよい。脳室内注射は、例えばレザーバに取り付けた脳室内カテーテルによって助長され得る。静脈内使用では、液剤の総濃度が、調製物が等張性となるように制御され得る。
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｉＲＮＡ化合物またはｓｓｉＲＮＡ化合物、組成物の投与は非経口、例えば静脈内（例えばボーラスとして、もしくは拡散性輸注として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔内、舌下、内視鏡的、経直腸、経口、経膣、経表面、経肺、鼻腔内、経尿道または接眼である。投与は対象によって、または別の人、例えば医療供給者によって行なわれ得る。投薬は用量を測って、または定量を送達するディスペンサーで行なわれ得る。選択される送達様式を以下により詳細に論考する。
髄腔内投与．一実施形態において、二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は、髄腔内注射（すなわち、脳および脊髄の組織が浸されている髄液内への注射）によって送達される。髄液中へのＲＮＡｉ薬剤の髄腔内注射はボーラス注射として、またはミニポンプによって行なわれ得、ミニポンプは皮下に埋め込まれ、髄液中へのｓｉＲＮＡの規則的で持続的な送達をもたらし得る。髄液が生成される脈絡叢から脊髄および後根神経節あたりまで下降し、その後、上行して小脳を通過し、皮質を超え、髄液がＣＮＳから退去し得るクモ膜顆粒への髄液の循環により、注射される化合物の大きさ、安定性および可溶性にもよるが、髄腔内送達される該分子はＣＮＳ全体において標的に到達し得よう。
一部の実施形態では、髄腔内投与がポンプによるものである。ポンプは外科的埋め込み型浸透圧ポンプであり得る。一実施形態において、浸透圧ポンプは脊柱管のクモ膜下腔内に埋め込まれ、髄腔内投与が助長される。
一部の実施形態では、髄腔内投与が、ある容量の医薬用薬剤を内包しているレザーバを含む医薬品用の髄腔内送達系によるものであり、ポンプは、レザーバ内に含まれている医薬用薬剤の一部を送達するように構成される。この髄腔内送達系に関するさらなる詳細は、２０１５年１月２８日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１３２５３において知得され得、これは、引用によりその全体が組み込まれる。
髄腔内注射されるＲＮＡｉ薬剤の量は標的遺伝子ごとに異なり得、適用されるべき適切な量は各標的遺伝子に対して個々に決定すべきであり得る。典型的には、この量は１０μｇ～２ｍｇ、好ましくは５０μｇ～１５００μｇ、より好ましくは１００μｇ～１０００μｇの範囲である。
Ａ．本開示のＲＮＡｉ薬剤をコードしているベクター
ＡＰＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター内に挿入した転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際出願公開公報ＷＯ００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄ，ＰＣＴ国際出願公開公報ＷＯ００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号参照）。発現は、使用される具体的な構築物および標的の組織または細胞型に応じて、一過的（数時間～数週間程度）であっても持続的（数週間～数ヶ月またはそれより長期）であってもよい。このような導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、または組み込みベクターであっても非組み込みベクターであってもよいウイルスベクターとして導入され得る。また、導入遺伝子を、染色体外プラスミドとして受け継がれることが可能となるように構築してもよい（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２９２）。
ＲＮＡｉ薬剤の個々の鎖または複数の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写され得る。２つの別々の鎖を発現させて例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、２つの別々の発現ベクターが標的細胞内に共導入され得る（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいはまた、ｄｓＲＮＡの個々の各鎖が、どちらも同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡを、該ｄｓＲＮＡがステム・ループ構造を有するようなリンカーポリヌクレオチド配列によって接合された逆向きの反復ポリヌクレオチドとして発現させる。
ＲＮＡｉ薬剤発現ベクターは一般的にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞と適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞と適合性のものが、本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤の発現用の組換え構築物の作製に使用され得る。真核生物細胞用発現ベクターは当該技術分野でよく知られており、いくつかの市販の供給元から入手可能である。典型的には、かかるベクターは、所望の核酸セグメントの挿入のための簡便な制限部位を含めて提供される。ＲＮＡｉ薬剤発現ベクターの送達は、例えば、静脈内もしくは筋肉内投与による、患者から取り出した標的細胞に投与した後、該患者に再導入することによる、または所望の標的細胞内への導入を可能にする任意の他の手段による全身性であり得る。
本明細書に記載の方法および組成物で利用可能なウイルスベクター系としては、限定されないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レトロウイルスベクター、例えば限定されないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えばオルソポックス、例えばワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えばカナリアポックスまたは鶏痘；および（ｊ）ヘルパー依存性アデノウイルスまたはガットレスアデノウイルスが挙げられる。また、複製欠陥ウイルスも好都合であり得る。ベクターは、細胞のゲノム内に組み込まれるまたは組み込まれない、様々なベクターがある。構築物には、所望される場合は、トランスフェクションのためのウイルス配列を含めてもよい。あるいはまた、構築物をエピソーム的複製が可能なベクター内に、例えばＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター内に組み込んでもよい。ＲＮＡｉ薬剤の組換え発現用の構築物は一般的に、標的細胞内でのＲＮＡｉ薬剤の発現を確実にするための調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクターおよび構築物について考慮するための他の側面は当該技術分野で知られている。
ＶＩＩ．本開示の医薬組成物
本開示はまた、本開示のＲＮＡｉ薬剤を含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態では、本明細書において、本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。ＲＮＡｉ薬剤を含む医薬組成物は、ＡＰＰ遺伝子の発現または活性と関連している疾患または障害、例えばＡＰＰ関連疾患、例えばＣＡＡまたはＡＤ、例えばＥＯＦＡＤを処置するのに有用である。
かかる医薬組成物は送達様式に基づいて製剤化される。一例は、例えば静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）による非経口送達による全身投与のため、または皮下（ｓｕｂＱ）送達のために製剤化される組成物である。別の一例は、例えば髄腔内または硝子体内経路の注射による、任意選択で例えば連続ポンプ輸注による脳内への輸注によるＣＮＳ内への直接送達のために製剤化される組成物である。
本開示の医薬組成物は、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するのに充分な投薬量で投与され得る。一般に、本開示のＲＮＡｉ薬剤の好適な用量は、１日あたりレシピエントの体重１キログラムあたり約０．００１～約２００．０ミリグラムの範囲、一般的には１日あたり体重１キログラムあたり約１～５０ｍｇの範囲である。典型的には、本開示のＲＮＡｉ薬剤の好適な用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
反復用量レジメンとしては、定期的な、例えば隔月または毎月から年間１回の治療量のＲＮＡｉ薬剤の投与が挙げられ得る。一部の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤が、月に約１回～四半期に約１回（すなわち、３ヶ月ごとに約１回）投与される。
初期レジメン後、処置薬は、より低頻度で投与され得る。
投薬単位を、長期間にわたる送達のために、例えば、長期間にわたるＲＮＡｉ薬剤の徐放をもたらす慣用的な徐放製剤を用いて複合化してもよい。徐放製剤は当該技術分野でよく知られており、特定の部位への薬剤の送達に特に有用であり、例えば本開示の薬剤で使用することができよう。この実施形態では、投薬単位は、対応する複数の例えば毎月用量を含む。
他の実施形態において、単回用量の医薬組成物は長期持続性であり得、そのため、後続用量は、１週間以内、２、３または４週間またはそれより長い週の間隔で投与される。本開示の一部の実施形態では、単回用量の本開示の医薬組成物が週１回投与される。本開示の他の実施形態では、単回用量の本開示の医薬組成物が隔月で投与される。
当業者には、一部の特定の要素、例えば限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の一般健康状態および／または年齢ならびに存在する他の疾患が、対象を有効に処置するために必要とされる投薬量および投与のタイミングに影響を及ぼし得ることが認識されよう。さらに、治療有効量の組成物での対象の処置には単回処置または一連の処置が包含され得る。本開示に包含される個々のＲＮＡｉ薬剤の有効な投薬量およびインビボ半減期の推定は慣用的な方法論を用いて、または本明細書の他の箇所に記載のような適切な動物モデルを用いたインビボ試験に基づいて行なわれ得る。
マウス遺伝学の進歩により、ＡＰＰの発現の低減による恩恵を受けるであろう種々のヒト疾患、例えばＡＰＰ関連障害の試験用のいくつかのマウスモデルが作成されている。かかるモデルは、ＲＮＡｉ薬剤のインビボ試験のため、ならびに治療有効用量を決定するために使用され得る。好適なマウスモデルは当該技術分野で知られており、例えば、本明細書の他の箇所に記載のＡＤおよび／またはＣＡＡモデルが挙げられる。
本開示の医薬組成物は、局所処置が所望されるか、または全身性処置が所望されるかに応じて、および処置対象の領域に応じていくつかの様式で投与され得る。投与は、経表面（例えば、経皮パッチによる）、例えばネブライザーなどによる粉末剤もしくはエーロゾル剤の吸入もしくは吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射もしくは輸注；例えば埋め込み型デバイスによる真皮下；または例えば実質内、髄腔内もしくは脳室内投与による頭蓋内が挙げられる。
ＲＮＡｉ薬剤は、特定の組織、例えばＣＮＳ（例えば、神経細胞組織、グリア細胞組織および／または脳の血管組織）を処置するための様式で送達され得る。
経表面投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、スプレー剤、液状剤および粉末剤が挙げられ得る。慣用的な医薬用担体、水性、粉末状または油性の基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合があり得る。コーティングされたコンドーム、グローブなどもまた有用であり得る。好適な経表面製剤としては、本開示において特記するＲＮＡｉ薬剤が、経表面送達用薬剤、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤と混合状態ものが挙げられる。好適な脂質およびリポソームとしては、中性のもの（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）負電荷のもの（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）ならびにカチオン性のもの（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本開示において特記するＲＮＡｉ薬剤をリポソーム内に封入してもよく、リポソーム、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成させてもよい。あるいはまた、ＲＮＡｉ薬剤を脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成させてもよい。好適な脂肪酸およびエステルとしては、限定されないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１－２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたはその薬学的に許容され得る塩が挙げられる。経表面製剤は米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、これは引用により本明細書に組み込まれる。
Ａ．膜性分子アセンブリを含むＲＮＡｉ薬剤の製剤
本開示の組成物および方法における使用のためのＲＮＡｉ薬剤は、膜性分子アセンブリ、例えばリポソームまたはミセルでの送達のために製剤化され得る。本明細書で用いる場合、用語「リポソーム」は、少なくとも１つの二重層、例えば１つの二重層または複数の二重層の状態で整列した両親媒性脂質で構成された小胞を示す。リポソームには、親油性物質で形成された膜と水性内部を有する単層小胞および多層小胞が包含される。該水性部分にはＲＮＡｉ薬剤組成物が含まれている。親油性物質は水性内部を、典型的にはＲＮＡｉ薬剤組成物は含まれていないが一部の例では含まれている場合もあり得る水性外部から隔離する。リポソームは、活性成分を作用部位に移動および送達するのに有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用すると、リポソームの二重層が細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の合体が進むにつれて、ＲＮＡｉ薬剤を含む内部の水性内容物が細胞内に送達され、その細胞でＲＮＡｉ薬剤が標的ＲＮＡに特異的に結合し得、ＲＮＡｉを媒介し得る。また、一部の場合では、リポソームが、例えばＲＮＡｉ薬剤を特定の細胞型に指向するように特異的に標的化される。
ＲＮＡｉ薬剤を含有しているリポソームは、さまざまな方法によって調製され得る。一例では、リポソームの脂質成分をデタージェントに溶解させ、該脂質成分とのミセルが形成されるようにする。例えば、脂質成分は、両親媒性のカチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。デタージェントは高い臨界ミセル濃度を有するものであり得、非イオン性であってもよい。例示的なデタージェントとしては、コレート、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコレートおよびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いでＲＮＡｉ薬剤調製物を、該脂質成分を含むミセルに添加する。該脂質上のカチオン性基がＲＮＡｉ薬剤と相互作用してＲＮＡｉ薬剤周囲に密集し、リポソームが形成される。密集後、デタージェントを例えば透析によって除去し、ＲＮＡｉ薬剤のリポソーム調製物を得る。
必要であれば、密集を補助する担体化合物を、例えば制御添加によって密集反応の際に添加してもよい。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であり得る。また、ｐＨを、密集に都合がよいように調整してもよい。
ポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体が送達媒体の構造成分として組み込まれている安定なポリヌクレオチド送達媒体を作製するための方法は、例えばＷＯ９６／３７１９４にさらに記載されており、その全内容は引用により本明細書に組み込まれる。また、リポソームの形成としても、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９；およびＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７に記載の例示的な方法の１または複数の態様が挙げられ得る。送達媒体としての使用に適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される手法としては、超音波処理および凍結－融解＋押出しが挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１参照。マイクロフルイダイゼーションは、常に小さく（５０～２００ｎｍ）比較的一様な凝集体が所望される場合に使用され得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９。このような方法は、リポソーム内へのＲＮＡｉ薬剤調製物のパッケージングに容易に適合される。
リポソームは２つの類型に大別される。カチオン性リポソームは、負荷電の核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正荷電リポソームである。正荷電の核酸／リポソーム複合体は負荷電の細胞表面に結合し、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨのため、リポソームは破裂し、内容物が細胞の細胞質内に放出される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９８０－９８５）。
ｐＨ感受性であるか、または負荷電リポソームは、核酸と複合体形成するのではなく核酸を閉じ込める。核酸も脂質のどちらも同様の電荷を有するため、複合体形成ではなく反発が起こる。それでもなお、一部の核酸はこのようなリポソームの水性内部に閉じ込められている。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードしている核酸を培養状態の単層細胞に送達するために使用されている。この外来性遺伝子の発現は標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９：２６９－２７４）。
主要な型の一例のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。天然のリポソーム組成物は、例えばジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は一般的にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、アニオン性融合性リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の型のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）例えばダイズＰＣおよび卵ＰＣなどから形成される。別の型は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
リポソームを細胞内にインビトロおよびインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；米国特許第５，１７１，６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Ｆｅｌｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９；Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３；およびＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
また、非イオン性リポソームの系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系も、皮膚への薬物の送達におけるその有用性を調べるために検討されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、シクロスポリン－Ａをマウスの皮膚の真皮内に送達するために使用された。結果により、かかる非イオン性リポソームの系は、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を助長するのに有効であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，４（６）：４６６）。
また、リポソームとしては「立体安定化型」リポソームも挙げられ、この用語は、本明細書で用いる場合、１種類または複数種の特殊な脂質を含むリポソームであって、該特殊な脂質は、リポソーム内に組み込まれると、かかる特殊な脂質がないリポソームと比べて向上した循環寿命をもたらすものであるリポソームを示す。立体安定化型リポソームの例は、リポソームの小胞形成性脂質部分の一部が（Ａ）１種類または複数種の糖脂質、例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１を含むか、あるいは（Ｂ）１種類または複数種の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されているものである。なんら特定の理論に拘束されることを望まないが、当該技術分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含有している立体安定化型リポソームについて、このような立体安定化型リポソームの向上した循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取込みの低減によるものであると考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３：４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３７６５）。
１種類または複数種の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８７），５０７：６４）により、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力が報告された。このような所見はＧａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．によって詳しく説明された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５，：６９４９）。どちらもＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．に対するものである米国特許第４，８３７，０２８号およびＷＯ８８／０４９２４には、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）には、スフィンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームはＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜と融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、同様には効率的に原形質膜と融合できないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、ＲＮＡｉ薬剤をマクロファージに送達するために使用され得る。
リポソームのさらなる利点としては：天然のリン脂質から得られるリポソームは生体適合性で生分解性である；リポソームには広範な水および脂質に可溶性の薬物を組み込むことができる；リポソームは、その内部区画内に封入されたＲＮＡｉ薬剤を代謝および分解から保護することができるということが挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は脂質表面の電荷、小胞サイズおよびリポソームの水性部分の容積である。
正荷電の合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、核酸と自発的に相互作用して脂質－核酸複合体を形成する小型のリポソームを形成するために使用され得、この脂質－核酸複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負荷電の脂質と融合でき、ＲＮＡｉ薬剤の送達をもたらす（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、ならびにＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用の説明については米国特許第４，８９７，３５５号参照）。
ＤＯＴＭＡアナログである１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、ＤＮＡ複合体形成性小胞を形成するためにリン脂質と併用して使用され得る。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性核酸を、負荷電のポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正荷電のＤＯＴＭＡリポソームを含む組織培養生細胞内に送達するための有効な薬剤である。充分な正荷電リポソームが使用される場合、得られる複合体の正味電荷もまた正である。このようにして調製される正荷電の複合体は負荷電の細胞表面に自発的に結合し、原形質膜と融合し、機能性核酸を例えば組織培養細胞内に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（“ＤＯＴＡＰ”）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、ＤＯＴＭＡとは、オレオイル部分がエーテル結合ではなくエステル結合によって連結されているという点で異なる。
報告されている他のカチオン性脂質化合物としては、さまざまな部分にコンジュゲートされているもの、例えば、２つの型のうちの一方の型の脂質にコンジュゲートされているカルボキシスペルミンなどが挙げられ、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（“ＤＯＧＳ”）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（“ＤＰＰＥＳ”）（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号参照）などの化合物が挙げられる。
別のカチオン性脂質コンジュゲートとしては、脂質をコレステロールで誘導体化し（“ＤＣ－Ｃｈｏｌ”）、これをＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化したものが挙げられる（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０参照）。ポリリシンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって作製されるリポポリリシンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８）。一部の特定の細胞株では、コンジュゲート型カチオン性脂質を含有しているこのようなリポソームは低毒性を示すといわれており、ＤＯＴＭＡ含有組成物より効率的なトランスフェクションをもたらす。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ならびにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質はＷＯ９８／３９３５９およびＷＯ９６／３７１９４に記載されている。
リポソーム製剤は経表面投与に特に適しており、リポソームは他の製剤と比べていくつかの利点を提示する。かかる利点としては、投与された薬物の高い全身性吸収に関連する副作用の低減、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増大、およびＲＮＡｉ薬剤を皮膚に投与できる可能性が挙げられる。実施の一例では、リポソームは、表皮細胞へのＲＮＡｉ薬剤の送達のため、また、真皮組織、例えば皮膚内へのＲＮＡｉ薬剤の浸透を向上させるためにも使用される。例えば、リポソームは経表面適用され得る。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への経表面送達は文献に示されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｖｏｌ．２，４０５－４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７－１７６；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２－５２７；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５参照）。
また、非イオン性リポソームの系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系も、皮膚への薬物の送達におけるその有用性を調べるために検討されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、薬物をマウスの皮膚の真皮内に送達するために使用された。ＲＮＡｉ薬剤を有するかかる製剤は皮膚科系障害を処置するのに有用である。
ＲＮＡｉ薬剤を含むリポソームは高度に変形可能となり得る。かかる変形可能性により、リポソームは、このリポソームの平均半径より小さい細孔を通り抜けて浸透することが可能となり得る。例えば、トランスファーソームは変形可能な型のリポソームの一例である。トランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）は、表面縁部活性化剤、通常、界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することにより作製され得る。ＲＮＡｉ薬剤を含むトランスファーソームは、例えば、ＲＮＡｉ薬剤を皮膚内のケラチノサイトに送達するために感染によって皮下送達され得る。インタクトな哺乳動物皮膚を横断するためには、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、各々が５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通り抜けなければならない。また、脂質の特性のため、このようなトランスフェロソームは、自己最適化性（例えば皮膚内の細孔の形状に適応性）、自己修復性であり得、断片化を伴わずに高頻度でその標的に到達することができ、多くの場合、自己負荷性であり得る。
本開示に適した他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国特許仮出願第６１／０１８，６１６号；２００８年１月２日に出願された同第６１／０１８，６１１号；２００８年３月２６日に出願された同第６１／０３９，７４８号；２００８年４月２２日に出願された同第６１／０４７，０８７号および２００８年５月８日に出願された同第６１／０５１，５２８に記載されている。また、２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号にも、本開示に適した製剤が記載されている。
トランスファーソームはまた別の型のリポソームであり、薬物送達媒体として魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるため自身よりも小さい細孔を容易に通り抜けて浸透できる脂質小滴と説明され得る。トランスファーソームは、自身が使用される環境に適応可能であり、例えば、自己最適化性（皮膚内の細孔の形状に適応性）、自己修復性であり、断片化を伴わずに高頻度でその標的に到達し、多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するためには、表面縁部活性化剤、通常、界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介性送達は、血清アルブミンを含有している液剤の皮下注射と同等に有効であることが示されている。
界面活性剤は、製剤、例えば本明細書に記載のものにおいて、パティキュラレイ（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌａｙ）乳剤（例えば、マイクロエマルジョン）およびリポソームにおいて幅広い適用がみられる。天然および合成の多くの異なる型の界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な様式は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用されるいろいろな界面活性剤をカテゴリー分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、これは非イオン性界面活性剤と分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品において幅広い適用がみられ、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、構造にもよるが２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもまた、この類型に包含される。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤類型の最もよく知られた構成員である。
界面活性剤分子が、水中に溶解または分散させた場合に負電荷を担持するならば、この界面活性剤はアニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、例えばセッケン、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えばアルキルスルフェートおよびエトキシル化アルキルスルフェート、スルホネート、例えばアルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネートならびにホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤類型の最も重要な構成員はアルキルスルフェートおよびセッケンである。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散させた場合に正電荷を担持するならば、この界面活性剤はカチオン性と分類される。カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第４級アンモニウム塩は、この類型の最も使用されている構成員である。
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを担持する能力を有するならば、この界面活性剤は両性と分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤および乳剤における界面活性剤の使用は概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
また、本開示の方法における使用のためのＲＮＡｉ薬剤はミセル製剤として提供されてもよい。「ミセル」は、本明細書において、両親媒性分子が、該分子のすべての疎水性部分が内側に向いており、親水性部分が周囲の水相と接触状態となっているような球体構造に配列している特定の型の分子アセンブリと定義する。環境が疎水性である場合は、逆の配列で存在する。
経皮的に膜を通り抜ける送達に適した混合型ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ８～Ｃ２２アルキルスルフェートおよびミセル形成性化合物を混合することにより調製され得る。例示的なミセル形成性化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミールエキス、キュウリエキス、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ボラージオイル、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリシン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびそのアナログ、ポリドカノールアルキルエーテルおよびそのアナログ、ケノデオキシコレート、デオキシコレート、ならびにその混合物が挙げられる。ミセル形成性化合物は、アルカリ金属アルキルスルフェートの添加と同時に添加してもよく、その後に添加してもよい。混合型ミセルは、実質的にどのような種類の成分混合を用いても形成されるが、より小サイズのミセルを得るために激しく混合する。
一例の方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と少なくともアルカリ金属アルキルスルフェートを含む第１のミセル組成物を調製する。次いで、この第１のミセル組成物を少なくとも３種類のミセル形成性化合物と混合し、混合型ミセル組成物を形成する。別の方法では、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキルスルフェートおよびミセル形成性化合物のうちの少なくとも１種類を混合することによりミセル組成物を調製した後、残りのミセル形成性化合物を、激しく混合しながら添加する。
フェノールおよび／またはｍ－クレゾールは混合型ミセル組成物に、製剤を安定化させ、細菌増殖を防御するために添加され得る。あるいはまた、フェノールおよび／またはｍ－クレゾールをミセル形成性成分とともに添加してもよい。また、混合型ミセル組成物の形成後に等張性薬剤、例えばグリセリンを添加してもよい。
ミセル製剤をスプレー剤として送達するためには、製剤はエーロゾルディスペンサー内に入れられ得、ディスペンサーには噴射剤が仕込まれる。加圧下にある噴射剤はディスペンサー内では液状形態である。その成分比は、水性相と噴射剤相１となる、すなわち１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、内容物の一部を例えば絞り弁から施薬する前にディスペンサーを振ることが必要である。施薬用量の医薬用薬剤が絞り弁から微細スプレーの状態で噴射される。
噴射剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテルおよびジエチルエーテルが挙げられ得る。一部の特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用され得る。
必須成分の具体的な濃度は、比較的直接的な実験法によって決定され得る。口腔からの吸収のためには、多くの場合、胃腸管経由の注射または投与による場合の投薬量の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが望ましい。
脂質粒子
本開示におけるＲＮＡｉ薬剤、例えばｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えばＬＮＰまたは他の核酸－脂質粒子内に完全に封入され得る。
本明細書で用いる場合、用語「ＬＮＰ」は安定な核酸－脂質粒子を示す。ＬＮＰには典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を抑制する脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）が含有される。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後、長い循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）にも蓄積されるため、全身性適用に極めて有用である。ＬＮＰには“ｐＳＰＬＰ”も包含され、これは、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ００／０３６８３号に示されているような封入された縮合剤－核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒性である。また、本開示の核酸－脂質粒子内に存在している核酸は、水溶液中でヌクレアーゼでの分解に耐性である。核酸－脂質粒子およびその調製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国特許出願公開公報第２０１０／０３２４１２０号およびＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
一実施形態において、薬物に対する脂質の比（質量／質量比）（例えば、ｄｓＲＮＡに対する脂質の比）は約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１または約６：１～約９：１の範囲である。上記に記載の範囲の間にある範囲もまた本開示の一部であることが想定される。
ＲＮＡｉ薬剤の送達のための一部の特定の具体的なＬＮＰ製剤は当該技術分野で報告されており、例えば国際出願公開公報ＷＯ２００８／０４２９７３号（これは引用により本明細書に組み込まれる）に記載のような例えば“ＬＮＰ０１”製剤が挙げられる。
さらなる例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を以下の表において特定する。
Figure 2022515193000020
Figure 2022515193000021
ＳＮＡＬＰ（ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））含有製剤は、２００９年４月１５日に出願された国際出願公開公報ＷＯ２００９／１２７０６０号に記載されており、これは引用により本明細書に組み込まれる。
ＸＴＣ含有製剤はＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１０／０８８５３７号に記載されており、その全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
ＭＣ３含有製剤は、例えば、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開公報第２０１０／０３２４１２０号に記載されており、その全内容は引用により本明細書に組み込まれる。
ＡＬＮＹ－１００含有製剤はＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１０／０５４４０６号に記載されており、その全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
Ｃ１２－２００含有製剤はＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１０／１２９７０９号に記載されており、その全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる。
経口投与のための組成物および製剤としては、散剤もしくは顆粒剤、ミクロ粒子状剤、ナノ粒子状剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が所望され得る。一部の実施形態では、経口製剤は、本開示において特記するｄｓＲＮＡが１種類または複数種の浸透向上剤 界面活性剤およびキレート剤とともに投与されるものである。好適な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはモノグリセリド、ジグリセリドまたはその薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、浸透向上剤の組合せ、例えば胆汁酸／塩との組合せでの脂肪酸／塩が使用される。例示的な組合せの一例はラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透向上剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示において特記するｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含むか、またはミクロ粒子もしくはナノ粒子を形成するように複合体形成された顆粒形態で経口送達され得る。ｄｓＲＮＡ複合体形成剤としては、ポリ－アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロースおよびデンプンが挙げられる。好適な複合体形成剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシナオ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミンおよびＤＥＡＥ－デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその調製は、米国特許６，８８７，９０６号、米国特許出願公開公報第２００３００２７７８０号および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、これらの各々は引用により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内）、髄腔内、脳室内または肝内投与のための組成物および製剤としては、バッファー、希釈剤および他の好適な添加剤、例えば限定されないが、浸透向上剤、担体化合物および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤もまた含有され得る滅菌水性液剤が挙げられ得る。
本開示の医薬組成物としては、限定されないが、液剤、乳剤およびリポソーム含有製剤が挙げられる。このような組成物は、限定されないが予備形成液状物、自己乳化性固形物および自己乳化性半固形物を含むさまざまな成分から作製され得る。特に好ましいのは、ＡＰＰ関連の疾患または障害を処置する場合に脳を標的化する製剤である。
単位投薬形態で簡便に提示され得る本開示の医薬製剤は、製薬業界でよく知られた慣用的な手法に従って調製され得る。かかる手法は、活性成分を医薬用担体（１種類もしくは複数種）または賦形剤（１種類もしくは複数種）と付随状態にする工程を含む。一般に、製剤は、活性成分を液状担体または微細化固形担体または両方と一様に密に付随状態にし、次いで、必要であれば製剤品に成形することにより調製される。
本開示の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液状シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤および注腸剤などの多くの考えられ得る任意の投薬形態に製剤化され得る。また、本開示の組成物は、水性、非水性または混合型の媒体中の懸濁剤として製剤化され得る。水性懸濁剤には、懸濁剤の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランなどがさらに含有され得る。また、懸濁剤には安定剤も含有され得る。
さらなる製剤
ｉ．乳剤
本開示の組成物は乳剤として調製および製剤化され得る。乳剤は典型的には、ある液状物が別の液状物中に、通常、０．１μｍを超える直径の小滴の形態で分散された不均一な系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１参照）。乳剤は多くの場合、互いに直接混合され、分散された２つの非混和性の液相を含む二相系である。一般に、乳剤は油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水相がバルク油相中で極めて小さな小滴に微細化されてバルク油相中に極めて小さな小滴として分散される場合、得られる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と称される。あるいはまた、油相がバルク水相中で極めて小さな小滴に微細化されてバルク水相中に極めて小さな小滴として分散される場合、得られる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）乳剤と称される。乳剤に、分散相および活性薬物に加えてさらなる成分を含有させてもよく、活性薬物は、水相中、油相中のいずれかの溶液として存在し得るか、あるいはそれ自体が別個の相として存在し得る。また、必要に応じて医薬用賦形剤、例えば乳化剤、安定剤、色素および酸化防止剤を乳剤中に存在させてもよい。また、医薬用乳剤は、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）乳剤の場合などの２つより多くの相で構成された多重乳剤であってもよい。かかる複合製剤は多くの場合、単純な二相乳剤ではもたらされないある特定の利点をもたらす。ｏ／ｗ乳剤の個々の油滴が小さな水滴を封入している多重乳剤はｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成している。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球体中に油滴が封入されている系はｏ／ｗ／ｏ乳剤を示す。
乳剤は、熱力学的安定性がほとんど、または全くないことを特徴とする。多くの場合、乳剤の分散相または不連続相は外相または連続相中に良好に分散されており、乳化剤または製剤の粘度という手段によってこの形態に維持される。乳剤の相のいずれかは、乳剤スタイルの軟膏基剤およびクリーム剤の場合のように半固形物または固形物であり得る。乳剤を安定化させる他の手段は、乳剤の相のいずれかに組み込まれ得る乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、４つのカテゴリー：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤および微細分散固形物に大別され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。
合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、乳剤の製剤において幅広い利用可能性がみられており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。界面活性剤は典型的には両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の比は親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、カテゴリー分類する際および製剤の調製における界面活性剤の選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて異なる類型：非イオン性、アニオン性、カチオン性および両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５参照）。
乳剤製剤に使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ワセリンなどの吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏ乳剤を形成するがまだ半固形の粘稠度を保持し得るような親水性の特性を有する。また、微細分散固形物も、特に、界面活性剤との組合せで、および粘性調製物において良好な乳化剤として使用されている。このようなものとしては、極性無機固形物、例えば重金属水酸化物、非膨潤性クレイ、例えばベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料および無極性固形物、例えば炭素またはトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。
また、多種多様な非乳化性物質も乳剤製剤中に含められ、乳剤の特性に寄与する。このようなものとしては、脂肪、油類、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存料および酸化防止剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然に存在するガムおよび合成ポリマー、例えば多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアガム、カラヤガムおよびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。このようなものは水中で分散または膨潤し、分散相の小滴周囲に強い界面膜を形成することによって、および外部相の粘度を高めることによって乳剤を安定化させるコロイド状溶液を形成する。
乳剤は多くの場合、微生物の増殖を容易に補助し得るいくつかの成分、例えば糖質、タンパク質、ステロールおよびホスファチドを含有しているため、このような製剤には多くの場合、保存料が組み込まれる。乳剤製剤中に含められる一般的に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第４級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が挙げられる。また、酸化防止剤も、製剤の劣化を抑制するために一般的に乳剤製剤に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えばトコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えばアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに酸化防止相乗剤、例えばクエン酸、酒石酸およびレシチンであり得る。
皮膚科学的、経口および非経口経路による乳剤製剤の適用ならびにその製造のための方法は文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。経口送達のための乳剤製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの観点からの効力ため、非常に広く使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。中でも、鉱物油ベースの緩下薬、油溶性ビタミン類および高脂肪栄養調製物は、ｏ／ｗ乳剤として一般的に経口投与されている物質である。
ｉｉ．マイクロエマルジョン
本開示の一実施形態において、ＲＮＡｉ薬剤および核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油および両親媒性物質の、光学的に等方性で熱力学的に安定な単一の液状溶液である系と定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５参照）。典型的にはマイクロエマルジョンは、まず、油を界面活性剤水溶液中に分散させ、次いで充分な量の第４の成分、一般的には中鎖長アルコールを添加して透明な系を形成することにより調製される系である。したがって、また、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面膜によって安定化されている２つの非混和性の液状物の熱力学的に安定で等方性的に透明な分散体であると説明されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルジョンは一般的に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤および電解質を含む３～５種類の成分の組合せによって調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）型のものになるか水中油型（ｏ／ｗ）型のものになるかは、使用される油および界面活性剤の特性ならびに界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素テイルの構造および幾何学的充填に依存している（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用する現象学的アプローチが広く試験されており、当業者に対し、どのようにしてマイクロエマルジョンを製剤化するかの包括的な知識をもたらしている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（第８版），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５参照）。慣用的な乳剤と比較すると、マイクロエマルジョンでは、水不溶性薬物が、自発的に形成される熱力学的に安定な小滴の製剤中で可溶化されるという利点が得られる。
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤としては、限定されないが、単独または補助界面活性剤との併用での、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキ（ｓｅｑｕｉ）オレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。補助界面活性剤、通常、短鎖アルコール、例えばエタノール、１－プロパノールおよび１－ブタノールは、界面活性剤の膜内に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に空隙が生じるため、該膜を障害することにより界面の流動性を高める機能を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは補助界面活性剤の使用なしで調製することができ、アルコールフリーの自己乳化性マイクロエマルジョン系が当該技術分野で知られている。水相は典型的には、限定されないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相としては、限定されないが、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジおよびトリ－グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油ならびにシリコーン油などの物質が挙げられ得る。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物の吸収の向上の観点から特に重要である。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、薬物、例えばペプチドの経口バイオアベイラビリティを向上させることが提案されている。（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５参照）。マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化の改善、酵素による加水分解からの薬物の保護、膜の流動性および透過性の界面活性剤誘導性の改変による薬物吸収の向上の可能性、調製の容易性、固形投薬形態と比べた経口投与の容易性、臨床的有効能の改善、ならびに毒性の低下という利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号；同第７，０６３，８６０号；同第７，０７０，８０２号；同第７，１５７，０９９号；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３参照）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、周囲温度でその成分を一緒にすると自発的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチドまたはＲＮＡｉ薬剤を製剤化する場合に特に好都合であり得る。また、マイクロエマルジョンは、化粧品適用および医薬品適用の両方においても活性成分の経皮送達に有効となっている。本開示のマイクロエマルジョン組成物および製剤により、胃腸管からのＲＮＡｉ薬剤および核酸の全身性吸収の増大が助長されること、ならびにＲＮＡｉ薬剤および核酸の局所細胞内取込みが改善されることが期待される。
また、本開示のマイクロエマルジョンに、製剤の特性を改善するため、および本開示のＲＮＡｉ薬剤および核酸の吸収を向上させるためのさらなる成分および添加剤、例えばソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌおよび浸透向上剤を含有させてもよい。本開示のマイクロエマルジョンに使用される浸透向上剤は、５つの広義のカテゴリー－－界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの類型の各々は上記に論考した。
ｉｉｉ．ミクロ粒子
本開示のＲＮＡｉ薬剤は粒子内、例えばミクロ粒子内に組み込まれ得る。ミクロ粒子は、噴霧乾燥によって作製され得るが、他の方法、例えば凍結乾燥、エバポレーション、流動床乾燥、真空乾燥またはこれらの手法の組合せによっても作製され得る。
ｉｖ．浸透向上剤
一実施形態において、本開示では、動物の皮膚への核酸、特にＲＮＡｉ薬剤の効率的な送達がもたらされるように種々の浸透向上剤が使用される。ほとんどの薬物は溶液中でイオン化形態と非イオン化形態の両方で存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性または親油性の薬物のみが容易に細胞膜を通過する。通過対象の膜を浸透向上剤で処理した場合、非親油性の薬物であっても細胞膜を通過できることが見い出されている。非親油性の薬物が細胞膜を通過して拡散するのを補助することに加えて、浸透向上剤もまた、親油性の薬物の透過性を向上させる。
浸透向上剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート化非界面活性剤のうちの１つに属すると分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２参照）。上記の類型の浸透向上剤の各々は、さらに詳細に後述する。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解させた場合、溶液の表面張力または該水溶液と別の液体間の界面張力を低下させ、その結果、ＲＮＡｉ薬剤が粘膜を通過して吸収されることを向上させる化学的実体である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、このような浸透向上剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ． Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２参照）；およびパーフルオロ化学的乳剤、例えばＦＣ－４３．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０、２５２）が挙げられる。
浸透向上剤としての機能を果たす種々の脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１－モノカプレート、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ－ブチル）、ならびにそのモノ－およびジ－グリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４参照）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂肪可溶性ビタミン類の分散および吸収の助長が挙げられる。（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５参照）。種々の天然の胆汁酸塩およびその合成誘導体が浸透向上剤としての機能を果たす。したがって、用語「胆汁酸塩」には、胆汁の天然に存在する任意の成分ならびにその任意の合成誘導体が包含される。好適な胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３参照）。
キレート剤は、本開示との関連で用いる場合、金属イオンと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果、ＲＮＡｉ薬剤が粘膜を通過して吸収されることを向上させる化合物であると定義され得る。本開示における浸透向上剤としての使用に関して、特性評価済みのほとんどのＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがってキレート剤によって阻害されるため、キレート剤はＤＮａｓｅ阻害薬としての機能も果たすという付加的な利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。好適なキレート剤としては、限定されないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ラウレス－９ならびにベータ－ジケトンのＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ 薬物送達，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１参照）。
本明細書で用いる場合、非キレート化非界面活性浸透向上性化合物は、キレート剤として、または界面活性剤として示す活性は取るに足らないが、それでもなおＲＮＡｉ薬剤が消化管の粘膜を通過して吸収されることを向上させる化合物であると定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３参照）。この類型の浸透向上剤としては、例えば、不飽和環状ウレア、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；ならびに非ステロイド系抗炎症剤、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
また、細胞レベルでのＲＮＡｉ薬剤の取込みを向上させる薬剤も本開示の医薬組成物および他の組成物に添加され得る。例えば、カチオン性脂質、例えばリポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリシン（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ９７／３０７３１）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取込みを向上させることが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、とりわけ、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
投与される核酸の浸透を向上させる他の薬剤、例えば、グリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば２－ピロール、アゾン、ならびにテルペン、例えばリモネンおよびメントンを利用してもよい。
ｖ．担体
また、本開示の一部の特定の組成物では製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で用いる場合、「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体は生物学的活性を有しない）が、例えば生物学的に活性な核酸を分解することにより、または循環系からのその除去を促進させることにより生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低減させるインビボプロセスによって核酸として認識される核酸またはそのアナログを示し得る。核酸と担体化合物の共投与（典型的には、後者の物質が過剰）により、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のため、肝臓、腎臓ならびに他の循環系外レザーバ内に回収される核酸の量の相当な削減がもたらされ得る。例えば、肝組織内への部分ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジル酸または４－アセトアミド－４’イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と共投与した場合、低減され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬用担体」または「賦形剤」は、１または複数の核酸を動物に送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁化剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液状であっても固形であってもよく、計画された投与様式を念頭において、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と合わせた場合、所望の嵩、粘稠度などがもたらされるように選択される。典型的な医薬用担体としては、限定されないが、結合剤（例えば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微晶質セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害な反応を行なわない非腸管外投与に適した薬学的に許容され得る有機または無機賦形剤もまた、本開示の組成物を製剤化するために使用され得る。好適な薬学的に許容され得る担体としては、限定されないが、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の経表面投与のための製剤としては、アルコールなどの一般的な溶媒中の滅菌された、および滅菌されていない水性液剤、非水性液剤、または液状もしくは固形の油性基剤中の核酸の液剤が挙げられ得る。また、液剤にはバッファー、希釈剤および他の好適な添加剤も含有され得る。核酸と有害な反応を行なわない非腸管外投与に適した薬学的に許容され得る有機または無機賦形剤が使用され得る。
好適な薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されないが、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の成分
本開示の組成物にさらに、医薬組成物に慣用的にみられる他の補助成分を、当該技術分野で確立された使用レベルで含有させてもよい。したがって、例えば該組成物は、適合性のさらなる医薬活性物質、例えば止痒剤、収斂剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などを含み得るか、あるいは、種々の投薬形態の本開示の組成物を物理的に製剤化するのに有用なさらなる物質、例えば色素、着香剤、保存料、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤を含み得る。しかしながら、かかる物質は、添加した場合、本開示の組成物の成分の生物学的活性を極度に妨害するものであるべきでない。製剤は滅菌され得、所望される場合は、製剤の核酸（１種類または複数種）と有害な相互作用を行なわない補助薬剤、例えば滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、バッファー、着色料、着香料および／または芳香族物質などと混合され得る。
水性懸濁剤には、懸濁剤の粘度を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランなどが含有され得る。また、懸濁剤には安定剤も含有され得る。
一部の実施形態では、本開示において特記する医薬組成物は（ａ）１種類または複数種のＲＮＡｉ薬剤および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、かつＡＰＰ関連障害の処置に有用な１種類または複数種の薬剤を含む。かかる薬剤の例としては、限定されないが、抗炎症剤、抗脂肪変性剤、抗ウイルス剤および／または抗線維形成剤、あるいは対象のＡＤ（例えば、ＥＯＦＡＤ）および／またはＣＡＡを処置するために含められる他の薬剤が挙げられる。
かかる化合物の毒性および治療効力は、標準的な製薬手順により細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療が有効な用量）を調べるために測定され得る。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０比と表示され得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物試験で得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量範囲を設定するのに使用され得る。開示において本明細書において特記する組成物の投薬量は一般的に、毒性がほとんど、または全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、この範囲内で、使用される投薬形態および利用される投与経路に応じて異なり得る。本開示において特記する方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。用量を動物モデルにおいて、細胞培養において決定したＩＣ５０（すなわち、症状の半数阻害が得られる試験化合物濃度）を含む、化合物または、適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲が得られる（例えば、該ポリペプチドの濃度の低減が得られる）ように設定してもよい。かかる情報は、ヒトにおける有用な用量をより精密に決定するために使用され得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本開示において特記するＲＮＡｉ薬剤は、上記に論考したようなそれ自体の投与に加えて、ＡＰＰ発現によって媒介される病理学的プロセスの処置に有効な他の既知の薬剤と併用して投与してもよい。任意の事象において、投与担当医は、ＲＮＡｉ薬剤の投与の量およびタイミングを、当該技術分野で知られた、または本明細書に記載の標準的な効力測定を用いて観察された結果に基づいて調整することができよう。
ＶＩＩＩ．キット
一部の特定の態様では、本開示により、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｉＲＮＡ化合物またはｓｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えばｓｓｉＲＮＡ化合物にプロセッシングされ得るより大型のｓｉＲＮＡ化合物、あるいはｓｉＲＮＡ化合物、例えば二本鎖ｉＲＮＡ化合物もしくはｓｓｉＲＮＡ化合物またはその前駆体をコードしているＤＮＡ）の医薬製剤が内包された適当な容器を含むキットを提供する。一部の特定の実施形態では、医薬製剤の個々の成分が１つの容器内に提供され得る。あるいはまた、医薬製剤の成分を２以上の容器内に別々に、例えば、１つの容器にｓｉＲＮＡ化合物の調製物および少なくとも１つの他の容器には担体化合物を提供することが望ましいもあり得る。キットは、単一のボックス内に１または複数の容器などの、いくつかの異なる構成でパッケージングされ得る。いろいろな成分は、例えばキットに備えられた説明書に従って合わされ得る。該成分は、本明細書に記載の方法に従って、例えば医薬組成物を調製し、投与するために合わされ得る。また、キットに送達デバイスを含めてもよい。
ＩＸ．ＡＰＰ発現を阻害するための方法
また、本開示により、細胞内におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。該方法は、細胞を、ＲＮＡｉ薬剤例えば二本鎖ＲＮＡｉ薬剤と、該細胞内におけるＡＰＰの発現が阻害されるのに有効な量で接触させ、それにより該細胞内におけるＡＰＰの発現を阻害することを含む。本開示の一部の特定の実施形態において、ＡＰＰはＣＮＳ（例えば、脳）細胞において優先的に阻害される。
ＲＮＡｉ薬剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ薬剤との細胞の接触はインビトロまたはインビボで行なわれ得る。インビボでのＲＮＡｉ薬剤との細胞の接触は、対象、例えばヒト対象の細胞または細胞群をＲＮＡｉ薬剤と接触させることを含む。細胞接触のインビトロ法とインビボ法の併用も可能である。
細胞の接触は、上記に論考したように直接であっても間接的であってもよい。さらに、細胞の接触は、標的化リガンド、例えば本明細書に記載の、または当該技術分野で知られた任意のリガンドによって行なわれ得る。一部の実施形態では、標的化リガンドが糖鎖部分、例えばＣ１６リガンド、またはＲＮＡｉ薬剤を対象部位に指向する任意の他のリガンドである。
用語「阻害する」とは、本明細書で用いる場合、「低減させる」、「サイレンシングする」、「下方調節する」、「抑制する」および他の同様の用語と互換的に用いており、任意の阻害レベルを包含する。一部の特定の実施形態では、例えば本開示のＲＮＡｉ薬剤に対する阻害レベルが、例えば、細胞培養物の細胞を細胞近接部において１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下などの濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）媒介性トランスフェクションによってトランスフェクトする細胞培養条件で評価され得る。所与のＲＮＡｉ薬剤のノックダウンは、細胞培養物での処置前レベル対細胞培養物での処置後レベルの比較によって、また、任意選択で、スクランブルまたは他の形態の対照ＲＮＡｉ薬剤によりパラレルで処理した細胞と比較することによって測定され得る。細胞培養物における、例えば少なくとも１０％またはそれより多く、少なくとも２０％またはそれより多くなどのノックダウンは、それにより、「阻害」および／または「低減」、「下方調節」または「抑制」などが起こったことを示すと認定され得る。また、標的化されたｍＲＮＡおよび／またはコードされたタンパク質のレベル（したがって、本開示のＲＮＡｉ薬剤によって引き起こされた「阻害」の程度など）の評価がインビボ系で本開示のＲＮＡｉ薬剤について、当該技術分野で報告されているような適正に制御された条件下で評価され得ることは明白に想定される。
語句「ＡＰＰの発現を阻害する」とは、本明細書で用いる場合、任意のＡＰＰ遺伝子（例えばマウスＡＰＰ遺伝子、ラットＡＰＰ遺伝子、サルＡＰＰ遺伝子またはヒトＡＰＰ遺伝子など）ならびにＡＰＰタンパク質をコードしているＡＰＰ遺伝子のバリアントまたは変異型の発現の阻害を包含している。したがって、ＡＰＰ遺伝子は、野生型ＡＰＰ遺伝子、変異型ＡＰＰ遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞群もしくは生物体の状況にではトランスジェニックＡＰＰ遺伝子であり得る。
「ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害する」には、ＡＰＰ遺伝子の任意の阻害レベル、例えばＡＰＰ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば少なくとも約２０％の阻害が包含される。一部の特定の実施形態では、阻害は少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である。
ＡＰＰ遺伝子の発現を、ＡＰＰ遺伝子発現と関連している任意の可変量のレベル、例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡレベルまたはＡＰＰタンパク質レベル（例えば、ＡＰＰ切断産物）に基づいて評価してもよい。また、ＡＰＰの発現を、本明細書に記載のようなＡＰＰ関連バイオマーカーのレベルに基づいて間接的に評価してもよい。
阻害は、対照レベルと比較したこれらの可変量の１または複数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、当該技術分野で利用されている任意の型の対照レベル、例えば投与前のベースラインレベル、または未処置もしくは対照（例えば、バッファーのみの対照もしくは不活性薬剤対照など）で処置された同様の対象、細胞もしくは試料で測定されたレベルであり得る。
一部の特定の実施形態では、サロゲートマーカーがＡＰＰの阻害を検出するために使用され得る。例えば、ＡＰＰ発現を低減させるための薬剤での許容され得る診断基準およびモニタリング基準によって示される、ＡＰＰ関連障害、例えばＣＮＳ障害、例えばＥＯＦＡＤ、ＣＡＡまたは他の障害の有効な予防または処置は、臨床的に関連性のあるＡＰＰの低減を示すと理解され得る。
本開示の方法の一部の実施形態では、ＡＰＰ遺伝子の発現が、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、またはアッセイの検出レベル未満まで阻害される。一部の特定の実施形態では、該方法は、例えば、ＡＰＰの発現を低減させるための薬剤での対象の処置後の臨床的に関連性のある転帰によって示される、臨床的に関連性のあるＡＰＰ発現阻害を含む。
ＡＰＰ遺伝子の発現の阻害は、ＡＰＰ遺伝子が転写され、ＡＰＰ遺伝子の発現が阻害されるような処理がなされた（例えば、細胞（１つまたは複数）を本開示のＲＮＡｉ薬剤と接触させることによって、あるいは本開示のＲＮＡｉ薬剤を、細胞が存在する、または存在した対象に投与することによって）第１の細胞または細胞群（かかる細胞は例えば対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるがそのような処理がなされていない第２の細胞または細胞群（ＲＮＡｉ薬剤で処理されていない、あるいは対象遺伝子に標的化されるＲＮＡｉ薬剤で処理されていない対照細胞（１つまたは複数））と比べて低減されていることによって顕在化され得る。阻害の度合いは：
Figure 2022515193000022
 の形で示され得る。
他の実施形態において、ＡＰＰ遺伝子の発現の阻害は、ＡＰＰ遺伝子発現と機能的に関連しているパラメータ、例えば、ＡＰＰタンパク質の発現、ＡＰＰ切断産物の形成および／またはレベルあるいはＡＰＰシグナル伝達経路の低減の形で評価され得る。ＡＰＰ遺伝子サイレンシングは、内因的または発現構築物から異種的のいずれかでＡＰＰを発現している任意の細胞において、当該技術分野で知られた任意のアッセイによって測定され得る。
ＡＰＰタンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＡＰＰタンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中に発現されているタンパク質のレベル）の低減によって顕在化され得る。上記に説明したように、ｍＲＮＡ抑制の評価について、処理された細胞または細胞群におけるタンパク質の発現レベルの阻害も同様に、対照の細胞または細胞群におけるタンパク質レベルに対するパーセンテージとして表示され得る。
ＡＰＰ遺伝子の発現の阻害を評価するために使用され得る対照の細胞または細胞群としては、本開示のＲＮＡｉ薬剤とまだ接触させていない細胞または細胞群が挙げられる。例えば、対照の細胞または細胞群は、ＲＮＡｉ薬剤で処置する前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来するものであり得る。
細胞または細胞群によって発現されるＡＰＰ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該技術分野で知られた任意の方法を用いて測定され得る。一実施形態において、試料中におけるＡＰＰの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部分、例えばＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより測定される。ＲＮＡは細胞から、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の使用を含むＲＮＡ抽出手法を用いて抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ラン・オン（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ－ｏｎ）アッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ解析が挙げられる。循環ＡＰＰ ｍＲＮＡは、ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１２／１７７９０６（その全内容はここに引用により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を用いて検出され得る。
一部の実施形態では、ＡＰＰの発現レベルは、核酸プローブを用いて測定される。用語「プローブ」は、本明細書で用いる場合、特異的ＡＰＰに選択的に結合できる任意の分子を示す。プローブは当業者によって合成されてもよく、適切な生物学的調製物に由来するものであってもよい。プローブを、標識されるように特異的に設計してもよい。プローブとして利用され得る分子の例としては、限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、限定されないがサザンまたはノザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）解析およびプローブアレイが挙げられるハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用され得る。ｍＲＮＡレベルの測定のための方法の一例は、単離されたｍＲＮＡを、ＡＰＰ ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させることを伴う。一実施形態では、ｍＲＮＡを固相表面上に固定化し、プローブと接触させる（例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動させ、ゲルのｍＲＮＡをニトロセルロースなどの膜に転写することにより）。択一的な一実施形態では、プローブ（１種類または複数種）を固相表面上に固定化し、ｍＲＮＡを該プローブ（１種類または複数種）と、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて接触させる。当業者は、既知のｍＲＮＡ検出方法を、ＡＰＰ ｍＲＮＡのレベルの測定における使用のための容易に適合させることができよう。
試料中におけるＡＰＰの発現レベルを測定するための択一的な方法は、例えば試料中のｍＲＮＡの、例えばＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に示された実験の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写による増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル型複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅および／または逆転写酵素（ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｃＤＮＡ）の後、当業者によく知られた手法を用いた増幅分子の検出というプロセスを伴う。このような検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在している場合のかかる分子の検出に特に有用である。本開示の特定の態様では、ＡＰＰの発現レベルは、定量的蛍光発生性（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイによって、あるいはＡＰＰ発現および／またはｍＲＮＡレベルの測定のための他の当該技術分野で認知されている方法によって測定される。
ＡＰＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ハイブリダイゼーション解析、例えばノザン、サザン、ドットなどにおいて使用される）、またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズもしくはファイバー（あるいは結合された核酸を備えた任意の固相支持体）を用いてモニタリングされ得る。米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号および同第５，４４５，９３４号を参照されたく、これらは引用により本明細書に組み込まれる。また、ＡＰＰ発現レベルの測定は、溶液中での核酸プローブの使用を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。このＰＣＲ法の使用は、本明細書に提示した実施例に記載し、例示している。また、かかる方法は、ＡＰＰ核酸、ＳＲＥＢＰ核酸またはＰＮＰＬＡ３核酸の検出のためにも使用され得る。
ＡＰＰタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野で知られた任意の方法を用いて測定され得る。かかる方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流動体またはゲル内プレシピチン（ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎ）反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光測色アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（単純または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。また、かかるアッセイは、ＡＰＰタンパク質、ＡＰＰ切断産物またはＡＰＰと関連している他のタンパク質、例えば、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２などの存在または複製を示すタンパク質の検出ためにも使用され得る。
一部の実施形態では、ＡＰＰ関連疾患の処置における本開示の方法の効力が、ＡＰＰ ｍＲＮＡレベルの低下（例えば、ＡβレベルについてのＣＳＦ試料の評価による、脳生検による、あるいは別の様式で）によって評価される。
本開示の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤が対象に、ＲＮＡｉ薬剤が該対象内部の特定部位に送達されるように投与される。ＡＰＰの発現の阻害は、対象内部の特定部位、例えばＣＮＳ細胞に由来する試料中のＡＰＰ ｍＲＮＡまたはＡＰＰタンパク質のレベルの測定値またはレベルの変化を用いて評価され得る。一部の特定の実施形態では、該方法は、例えば、ＡＰＰの発現を低減させるための薬剤での対象の処置後の臨床的に関連性のある転帰によって示される、臨床的に関連性のあるＡＰＰ発現阻害を含む。
本明細書で用いる場合、被検物質のレベル検出または測定するという用語は、物質、例えばタンパク質、ＲＮＡが存在するかどうかを調べるための工程を行なうことを意味すると理解されたい。本明細書で用いる場合、検出または測定の方法は、使用される方法で検出レベル未満である被検物質レベルの検出または測定を包含している。
Ｘ．ＡＰＰ関連疾患を処置または予防する方法
また、本開示により、本開示のＲＮＡｉ薬剤および／または本開示のＲＮＡｉ薬剤を含有している組成物を、細胞内におけるＡＰＰ発現を低減および／または阻害するために使用する方法を提供する。該方法は、細胞を本開示のｄｓＲＮＡと接触させること、および該細胞を、ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに充分な時間維持し、それにより該細胞内におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当該技術分野で知られた任意の方法によって評価され得る。例えば、ＡＰＰの発現の低減は、ＡＰＰのｍＲＮＡ発現レベルを当業者にとって常套的な方法、例えばノザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを用いて測定することにより；ＡＰＰのタンパク質レベルを当業者にとって常套的な方法、例えばウエスタンブロッティング、免疫学的手法を用いて測定することにより測定され得る。また、ＡＰＰの発現の低減は、ＡＰＰの可溶性の切断産物のレベルの低下、例えば、任意選択で対象のＣＳＦ試料中の可溶性ＡＰＰα、ＡＰＰβおよび／または可溶性のＡβペプチドのレベルの低下を測定することにより間接的に評価され得る。
本開示の方法において、細胞はインビトロで接触させてもよく、インビボで接触させてもよい、すなわち、細胞は対象内部に存在し得る。
本開示の方法を使用する処置に適した細胞は、ＡＰＰ遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。本開示の方法における使用に適した細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞（例えば、ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えばサル細胞もしくはチンパンジー細胞）、非霊長類細胞（例えば、ウシ細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、リャマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞またはバッファロー細胞）、鳥類細胞（例えば、アヒル細胞またはガチョウ細胞）あるいはクジラ細胞であり得る。一実施形態において、細胞はヒト細胞、例えばヒトＣＮＳ細胞である。
ＡＰＰ発現は細胞において、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または約１００％阻害される。好ましい実施形態では、ＡＰＰ発現が少なくとも２０％阻害される。
本開示のインビボ法は、対象にＲＮＡｉ薬剤含有組成物を投与することを含むものであり得、ここで、ＲＮＡｉ薬剤は、処置対象の哺乳動物のＡＰＰ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むものである。処置対象の生物体が哺乳動物、例えばヒトである場合、該組成物は、当該技術分野で知られた任意の手段、例えば限定されないが、経口、腹腔内、または非経口経路、例えば、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および髄腔内）、静脈内、筋肉内、硝子体内、皮下、経皮、気道（エーロゾル）、経鼻、経直腸ならびに経表面（例えば、口腔内および舌下）投与によって投与され得る。一部の特定の実施形態では、該組成物は静脈内への輸注または注射によって投与される。一部の特定の実施形態では、該組成物は皮下注射投与される。
一部の実施形態では、投与はデポー注射によるものである。デポー注射では、ＲＮＡｉ薬剤が一貫した様式で長期間にわたって放出され得る。したがって、デポー注射では、所望の効果、例えばＡＰＰの所望の阻害、または治療効果もしくは予防効果を得るために必要とされる投薬頻度が低減され得る。また、デポー注射では、より一貫した血清濃度がもたらされ得る。デポー注射としては皮下注射または筋肉内注射が挙げられ得る。好ましい実施形態では、デポー注射が皮下注射である。
一部の実施形態では、投与はポンプによるものである。ポンプは外用ポンプであっても外科的埋め込み型ポンプであってもよい。一部の特定の実施形態では、ポンプが皮下埋め込み型浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプが輸注ポンプである。輸注ポンプは、静脈内、皮下、動脈または硬膜外輸注のために使用され得る。好ましい実施形態では、輸注ポンプが皮下輸注ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉ薬剤をＣＮＳに送達する外科的埋め込み型ポンプである。
投与様式は、局所処置が所望されるか、または全身性処置が所望されるかに基づいて、および処置対象の領域に基づいて選出され得る。投与の経路および部位は、標的化が向上するように選出され得る。
一態様において、また、本開示により、哺乳動物におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、哺乳動物に、該哺乳動物の細胞内のＡＰＰ遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含む組成物を投与すること、および該哺乳動物を、ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに充分な時間維持し、それにより該細胞内におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当該技術分野で知られた任意の方法によって、および本明細書に記載の方法、例えばｑＲＴ－ＰＣＲによって評価され得る。タンパク質産生の低減は、当該技術分野で知られた任意の方法によって、および本明細書に記載の方法、例えばＥＬＩＳＡによって評価され得る。一実施形態では、ＣＮＳ生検試料または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料が、ＡＰＰ遺伝子および／またはタンパク質発現（またはしたがって、本明細書に記載のような、もしくは当該技術分野で知られた代用物）の低減のモニタリング用の組織材料としての機能を果たす。
本開示によりさらに、処置を必要とする対象の処置方法を提供する。本開示の処置方法は、本開示のＲＮＡｉ薬剤をＡＰＰ発現の低減および／または阻害による恩恵を受けるであろう対象、例えば対象に、ＡＰＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤またはＡＰＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤を含む医薬組成物の治療有効量で投与することを含む。
また、本開示により、対象のＡβ４０および／またはＡβ４２レベルを低下させる方法を提供する。該方法は、本開示のＲＮＡｉ薬剤をＡＰＰ発現の低減および／または阻害による恩恵を受けるであろう対象、例えば対象に、ＡＰＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤またはＡＰＰ遺伝子を標的化するＲＮＡｉ薬剤を含む医薬組成物の治療有効量で投与することを含む。
また、本開示により、対象におけるＡＰＰ関連疾患または障害（例えば、ＣＡＡおよび／またはＡＤ、任意選択でＥＯＦＡＤ）の進行、例えばＡＰＰ関連疾患もしくは障害を有する対象またはＡＰＰ関連疾患もしくは障害の発症リスクがある対象におけるＡＰＰ関連疾患または障害の神経変性、アミロイドプラーク形成増大および／または認知機能の低下への進行の予防、処置および／または阻害の方法を提供する。該方法は、対象に、本明細書において提供するｄｓＲＮＡのいずれかまたは医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより該対象のＡＰＰ関連疾患または障害の進行を予防、処置および／または阻害することを含む。
本開示のＲＮＡｉ薬剤を「遊離ＲＮＡｉ薬剤」として投与してもよい。遊離ＲＮＡｉ薬剤は医薬組成物なしで投与される。裸のＲＮＡｉ薬剤は適当なバッファー溶液中に存在させ得る。バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩もしくはリン酸塩またはその任意の組合せを含むものであり得る。一実施形態では、バッファー溶液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ薬剤を含有しているバッファー溶液のｐＨおよび容積オスモル濃度は、対象に対する投与に好適となるように調整され得る。
あるいはまた、本開示のＲＮＡｉ薬剤は医薬組成物として、例えばｄｓＲＮＡリポソーム製剤として投与され得る。
ＡＰＰ遺伝子発現の低減および／または阻害による恩恵を受けるであろう対象は、ＡＰＰ関連障害を有する対象である。用語「ＡＰＰ関連疾患」は、ＡＰＰの遺伝子発現、複製またはタンパク質活性の低減による恩恵を受けるであろう疾患、障害または病状を包含している。ＡＰＰ関連疾患の非限定的な例としては、例えば、ＣＡＡ（例えば、ｈＣＡＡおよび孤発性ＣＡＡ）ならびにＡＤ（例えば、ＥＯＦＡＤ、孤発性および／または遅発型ＡＤ、任意選択でＣＡＡを伴うもの）が挙げられる。
本開示によりさらに、例えば、ＡＰＰ発現の低減および／または阻害による恩恵を受けるであろう対象、例えば、ＡＰＰ関連障害を有する対象を処置するために、他の医薬品および／または他の治療方法との併用での、例えば、既知の医薬品および／または既知の治療方法、例えばこのような障害を処置するために現在使用されているものなどとの併用でのＲＮＡｉ薬剤またはその医薬組成物の使用のための方法を提供する。例えば、一部の特定の実施形態において、ＡＰＰを標的化するＲＮＡｉ薬剤は、例えば、本明細書の他の箇所に記載のような、あるいは当該技術分野で知られているようなＡＰＰ関連障害の処置に有用な薬剤と併用して投与される。例えば、ＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう対象、例えばＡＰＰ関連障害を有する対象を処置するのに適したさらなる薬剤としては、ＡＤの症状を処置するために現在使用されている薬剤が挙げられ得る。かかる薬剤の非限定的な例としては、コリンエステラーゼ阻害薬（例えば、ドネペジル、リバスチグメート（ｒｉｖａｓｔｉｇｍａｔｅ）およびガランタミン）、メマンチン、ＢＡＣＥ１ｉ、免疫療法ならびにセクレターゼ阻害薬が挙げられ得る。ＲＮＡｉ薬剤とさらなる治療用薬剤は同時に、および／または同じ合剤にて例えば髄腔内投与され得るか、あるいは該さらなる治療用薬剤は、別個の組成物の一部として、または別個の時点で、および／または当該技術分野で知られた、もしくは本明細書に記載の別の方法によって投与され得る。
一実施形態において、該方法は、本明細書において特記する組成物を、標的ＡＰＰ遺伝子の発現が、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２または約３６時間低減されるように投与することを含む。一実施形態において、標的ＡＰＰ遺伝子の発現は長期間、例えば少なくとも約２、３、４日間またはそれより多く、例えば約１週間、２週間、３週間もしくは４週間それより多く低減される。
好ましくは、本明細書において特記する方法および組成物に有用なＲＮＡｉ薬剤は、標的ＡＰＰ遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセッシング済）を特異的に標的化する。ＲＮＡｉ薬剤を用いてこのような遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書に記載のようにして調製および実施され得る。
本開示の方法によるｄｓＲＮＡの投与は、ＡＰＰ関連障害を有する患者において、かかる疾患または障害の重症度、徴候、症状および／またはマーカーの低減をもたらし得る。これとの関連において「低減」により、かかるレベルの統計学的に有意な減少を意図する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約１００％であり得る。
疾患の処置または予防の効力は、例えば疾患の進行、疾患の寛解、症状重症度、痛みの軽減、生活の質、処置効果を持続させるために必要とされる投薬物の用量、処置対象または予防の標的化対象の所与の疾患に適切な疾患マーカーまたは任意の他の測定可能なパラメータのレベルを測定することによって評価され得る。かかるパラメータのうちのいずれか１つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって処置または予防の効力をモニタリングすることは充分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＡＰＰ関連障害の処置の効力は、例えば、対象の認知力、ＣＳＦ Ａβレベルなどの定期的なモニタリングによって評価され得る。初期の読取り値と後の読取り値との比較は、担当医に処置が有効であるかどうかの指標を提供する。かかるパラメータのうちのいずれか１つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって処置または予防の効力をモニタリングすることは充分に当業者の能力の範囲内である。ＡＰＰを標的化するＲＮＡｉ薬剤またはその医薬組成物の投与との関連において、ＡＰＰ関連障害「に対して有効な」とは、臨床的に適切な様式での投与により、少なくとも統計学的に有意な割合の患者に対して有益な効果、例えば症状の改善、治癒、疾患の軽減、寿命の延長、生活の質の改善、またはＡＰＰ関連障害および関連する原因の処置を熟知している医師によって一般的にプラスであると認識される他の効果がもたらされることを示す。
処置または予防の効果は、疾患状態の１つもしくはそれより多くのパラメータにおいて統計学的に有意な改善がみられる場合、または通常であれば予期される症状の悪化もしくは発現がない場合に明白である。一例として、疾患の測定可能なパラメータにおいて少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれより多くの好都合な変化は有効な処置を示し得る。また、所与のＲＮＡｉ薬剤薬物または該薬物の製剤の効力は、その所与の疾患の当該技術分野で知られた実験動物モデルを用いて判断され得る。実験動物モデルを使用する場合、処置の効力は、マーカーまたは症状の統計学的に有意な低減が観察される場合、証拠となる。
あるいはまた、効力は、臨床的に認められた疾患重症度の分類評価段階（ほんの一例として認知症の知能試験）に基づいた診断の当業者による判定時の疾患の重症度の低減によって測定され得る。例えば適切な評価段階を用いて測定された疾患の重症度の低下をもたらす任意のプラスの変化は、本明細書に記載のようなＲＮＡｉ薬剤またはＲＮＡｉ薬剤の製剤を用いた充分な処置を表す。
対象には治療量、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。
ＲＮＡｉ薬剤は、髄腔内に、硝子体内注射によって、および／または静脈内輸注によって長期間にわたって定期的に投与され得る。一部の特定の実施形態では、初期レジメン後、処置薬は、より低頻度で投与され得る。ＲＮＡｉ薬剤の投与により、例えば患者の細胞、組織、血液、ＣＳＦ試料または他の区画におけるＡＰＰレベルは、少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは少なくとも約９９％またはそれより大きく低下し得る。好ましい一実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤の投与により、例えば患者の細胞、組織、血液、ＣＳＦ試料または他の区画におけるＡＰＰレベルが少なくとも２０％低下し得る。
ＲＮＡｉ薬剤のフルドーズ投与の前に、より小用量、例えば５％輸注反応量を患者に投与し、有害効果、例えばアレルギー反応についてモニタリングしてもよい。別の例では、患者は、不要な免疫賦活効果、例えばサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファまたはＩＮＦ－アルファ）レベルの上昇についてモニタリングされ得る。
あるいはまた、ＲＮＡｉ薬剤は皮下投与され得る、すなわち皮下注射によって投与され得る。所望の、例えば月１回用量のＲＮＡｉ薬剤を対象に送達するために、１回またはそれより多くの注射が使用されてもよい。注射を長期間にわたって反復してもよい。投与を定期的に反復してもよい。一部の特定の実施形態では、初期レジメン後、処置薬は、より低頻度で投与され得る。反復用量レジメンとしては、定期的な、例えば毎月あるいは年に１回もしくは２、３、４および／または５年毎に１回の範囲に及ぶ治療量のＲＮＡｉ薬剤の投与が挙げられ得る。一部の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ薬剤が、月に約１回～四半期に約１回（すなわち、３ヶ月ごとに約１回）投与される。
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料が、本発明において特記するＲＮＡｉ薬剤および方法の実施または試験において使用され得るが、好適な方法および材料を以下に説明する。本明細書に挙げた刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、引用によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書（定義を含む）に支配される。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
実施例１．ＲＮＡｉ薬剤の設計、合成、選択およびインビトロ評価
この実施例では、ＡＰＰ ＲＮＡｉ薬剤の設計、合成、選択およびインビトロ評価のための方法を記載する。
試薬の供給元
試薬の供給元を本明細書において具体的に示していない場合、かかる試薬は、分子生物学用の試薬の任意の業者から、分子生物学における適用のための品質／純度の標準規格で入手することができる。
バイオインフォマティクス
ヒトアミロイドベータ前駆体タンパク質遺伝子（ＡＰＰ；ヒトＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑ ＮＭ＿２０１４１４；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：３５１；配列番号：１）ならびにカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）：ＸＭ＿００５５４８８８３．２；配列番号：１２）由来の毒性種ＡＰＰオーソログを標的化する第１のセットのｓｉＲＮＡ薬剤を、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて設計した。ｓｉＲＮＡ設計物はすべて、ヒトＡＰＰ転写物との完全マッチを有し、サブセットはカニクイザルオーソログと完全マッチまたはほぼ完全マッチのいずれかを有する。ヒトＮＭ＿２０１４１４ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ，バージョン２は３４２３塩基の長さを有する。このセットのｓｉＲＮＡ設計物の理論的説明および方法は以下のとおりである：１０位から端までのあらゆる潜在的２３量体ｓｉＲＮＡの予測される効力を、多様なセットの脊椎動物遺伝子を標的化する数千種類の相違するｓｉＲＮＡ設計物によるｍＲＮＡノックダウンの直接測定により作成したランダムフォレストモデルを用いて調べた。ｓｉＲＮＡの各鎖について、カスタムＰｙｔｈｏｎスクリプトを力まかせ探索において使用し、ｓｉＲＮＡとヒトトランスクリプトームのすべての潜在的アラインメント対象間のミスマッチの数および位置を測定した。シード領域（ここでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２～９位と定義する）、同様にｓｉＲＮＡの切断部位（ここでは、アンチセンスオリゴヌクレオチド１０～１１位と定義する）におけるミスマッチに付加加重（ｅｘｔｒａ ｗｅｉｇｈｔ）を与えた。ミスマッチの相対加重は、シードミスマッチ、切断部位およびアンチセンス１９位までの他の位置について２．８、１．２、１であった。最初の位置のミスマッチは無視した。特異性スコアを各鎖について、各加重ミスマッチの値を合計することにより計算した。ヒトおよびサルにおけるアンチセンススコアが≧３であり、≧５０％ノックダウンの予測効力を有するｓｉＲＮＡ（１６１配列）またはアンチセンススコア≧２および≧６０％の予測ノックダウンを有するｓｉＲＮＡ（１１８配列）を優先採用した。
毒性種ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（マウス）アミロイドベータ前駆体タンパク質（Ａｐｐ，ヒトＡＰＰのオーソログ；マウスＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑ ＮＭ＿００１１９８８２３；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：１１８２０；配列番号：１３）ならびにドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ラット）Ａｐｐオーソログ：ＮＭ＿０１９２８８．２（配列番号：１４）を標的化する第２のセットのｓｉＲＮＡを、カスタムＲおよびＰｙｔｈｏｎスクリプトを用いて設計した。ｓｉＲＮＡ設計物はすべて、マウスＡｐｐ転写物との完全マッチを有しており、サブセットは、ラットオーソログと完全マッチまたはほぼ完全マッチのいずれかを有していた。マウスＮＭ＿００１１９８８２３ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡ，バージョン１は３３７７塩基の長さを有する。ヒト配列について上記のものと同じ選択プロセスを使用したが、以下の選択基準を適用した：マウスおよびラットにおけるアンチセンススコアが≧２．８であり、≧５０％ノックダウンの予測効力を有するｓｉＲＮＡ（８５配列）またはアンチセンススコア≧２および≧６１％の予測ノックダウンを有するｓｉＲＮＡ（８配列）を優先採用した。
ＡＰＰ配列の合成
ＡＰＰ一本鎖およびＡＰＰ二重鎖の合成
オリゴヌクレオチドはすべて、ＭｅｒＭａｄｅ １９２合成装置において１μモルスケールで、一般サポートまたは顧客サポートを用いて調製した。ホスホロアミダイトはすべて、１００％アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦ中１００ｍＭの濃度で、２－シアノエチルホスホロアミダイトに関する標準プロトコルを用いて使用したが、カップリング時間は４００秒間に延長した。新たに形成された結合の酸化は、ホスフェート結合の作出のためには９：１のアセトニトリル：水中５０ｍＭのＩ２の溶液およびホスホロチオエート結合のためには９：１のピリジン：アセトニトリル中１００ｍＭのＤＤＴＴを用いて行なった。トリチルオフ合成後、カラムを１５０μＬの４０％水性メチルアミンとともに４５分間インキュベートし、溶液を真空によって９６ウェルプレート内に排出した。インキュベーションおよび排出を一部の新鮮水性メチルアミンで繰り返した後、粗製オリゴヌクレオチド溶液が入ったプレートを密封し、室温でさらに６０分間振盪し、すべての保護基を完全に除去した。粗製オリゴヌクレオチドの沈殿を、各ウェルへの１．２ｍＬの９：１のアセトニトリル：ＥｔＯＨの添加後、－２０℃で一晩のインキュベーションによって行なった。次いでプレートを３０００ＲＰＭで４５分間、遠心分離し、上清みを各ウェルから除去し、ペレットを９５０μＬの２０ｍＭ水性ＮａＯＡｃ中に再懸濁させた。最後に、各粗製溶液をＧＥ Ｈｉ－Ｔｒａｐ脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）で水を用いて脱塩し、オリゴヌクレオチド最終生成物を溶出した。実体および純度はすべて、それぞれＥＳＩ－ＭＳおよびＩＥＸ ＨＰＬＣを用いて確認した。
ＡＰＰ一本鎖のアニーリングをＴｅｃａｎ液体ハンドリングロボットにおいて行なった。センス一本鎖とアンチセンス一本鎖を等モル比で９６ウェルプレート内で合わせ、１０×ＰＢＳを用いて緩衝し、１×ＰＢＳ中１０μＭの最終二重鎖濃度を得た。相補的な一本鎖を合わせた後、９６ウェルプレートをしっかり密封し、１００℃の炉内で４０分間加熱し、２～３時間かけてゆっくり室温にし、その後、適切な濃度で直接、インビトロスクリーニングアッセイに使用した。
修飾ＡＰＰのセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列の詳述なリストを表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂおよび２６に示し、非修飾ＡＰＰのセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列の詳述なリストを表３、６、１１、１３、１５および２６に示す。
マウス初代肝細胞、カニクイザル初代肝細胞、Ｂｅ（２）ＣおよびＮｅｕｒｏｎ２Ａのインビトロスクリーニング：
細胞培養およびトランスフェクション：
ヒトＢｅ（２）Ｃ（ＡＴＣＣ）、マウスＮｅｕｒｏ２Ａ（ＡＴＣＣ）、マウス初代肝細胞（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）およびカニクイザル初代肝細胞（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ）を、４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）を３８４ウェルプレート内の５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖／ウェル（各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４連）に添加し、室温で１５分間インキュベートすることによりトランスフェクトした。次いで、約５×１０３個の細胞を含む４０μｌの培地をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を２４時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行なった。反復用量実験を１０ｎＭおよび０．１ｎＭで行なった。
ＤＹＮＡＢＥＡＤ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，品番：６１０－１２）を用いた全ＲＮＡの単離：
ＲＮＡを、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームでの自動化プロトコルを使用し、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号６１０１２）を用いて単離した。簡単には、７０μｌの溶解／結合バッファーおよび３μｌの磁性ビーズを含む１０μｌの溶解バッファーを、細胞を有するプレートに添加した。プレートを電磁式振盪機において室温で１０分間インキュベートし、次いで磁性ビーズを捕捉し、上清みを除去した。次いでビーズ結合ＲＮＡを、１５０μｌの洗浄バッファーＡで２回および洗浄バッファーＢで１回洗浄した。次いでビーズを１５０μｌの溶出バッファーで洗浄し、再捕捉し、上清みを除去した。
ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡの合成：
反応あたり１μｌの１０×バッファー、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害薬および６．６μｌのＨ２Ｏを含む１０μｌのマスターミックスを、上記で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密封し、混合し、電磁式振盪機において室温で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）ならびに０．５μｌのＡＰＰヒトプローブ（Ｈｓ００１６９０９８＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。または、２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３５２３３９Ｅ）ならびに０．５μｌのＡＰＰマウスプローブ（Ｍｍ０１３４４１７２＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。または、２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのカニクイザルＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡ－３’、リバースプライマー：５’－ＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣ－３’、プローブ：５’ＨＥＸ－ＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣ－３’ＢＨＱ－１）および０．５μｌのＡＰＰカニクイザルプローブ（Ｍｆ０１５５２２９１＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で行なった。各二重鎖を少なくとも２回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。
相対変化倍数を計算するため、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を用いて解析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞で行なったアッセイに対して正規化した。アッセイの結果を表４および７に示す。
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表４．カニクイザル初代肝細胞およびＢｅ（２）Ｃ細胞株におけるＡＰＰ単回用量スクリーニング
データを、残存メッセージのＡＤ－１９５５非標的化対照に対するパーセントとして表示する。
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一部の特定の薬剤群は、特に有効なＡＰＰノックダウン標的化の領域に存在すると同定された。上記の結果に示されるように、ＡＰＰ転写物の一部の領域は、他の領域より本開示のＲＮＡｉ薬剤での標的化に対して比較的より感受性のようである。例えば、ＡＰＰ ＮＭ＿０００４８４配列内の２６３９～２６８９位を標的化する薬剤（すなわち、ＲＮＡｉ薬剤ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３およびＡＤ－３９２７１５）は、Ｂｅ（２）Ｃ細胞株において特にロバストなノックダウン結果を示し、ＡＰＰ転写物のこれらの位置を標的化する他の重複するＲＮＡｉ薬剤のものとおそらく同様の活性を有する「ホットスポット」の可能性が示唆された。したがって、ＮＭ＿０００４８４内の位置の以下のウィンドウ：ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の１８９１～１９１９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２２８２～２３０６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２４６４～２４９４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２４７５～２６３８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２６２１～２６８９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２６８２～２７２５位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７０５～２７４６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７２６～２７７１位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７５４～２７８８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７８２～２８１３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８０１～２８２６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８４７～２８９０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８７１～２８９６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８８２～２９６０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２９４２～２９７１位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２９５１～３０５７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３１７２～３２２３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３２０９～３２３５位；ＮＭ＿００４８４の３２５６～３２８９位；ＮＭ＿００４８４の３３０２～３３３８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３３１８～３３５３位；およびＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３３３４～３３６１位内に完全に存在する標的配列を有する任意のＲＮＡｉ薬剤は、おそらくロバストなＡＰＰ阻害効果を示すことが明白に想定される。
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上記の表４で記載したように、ＮＭ＿００１１９８８２３．１の位置の以下のウィンドウ：ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２５１～２８４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の３６２～４０４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の４７１～５１０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の５３２～５８７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の６０１～６４９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の６３３～６６２位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１３５１～１３８８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１６０９～１６４９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１６７５～１６９８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１７５２～１７８７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２１６５～２２１７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２２８０～２３４４位；およびＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２４０３～２４３１位内に完全に存在する標的配列を有するいずれののＲＮＡｉ薬剤も、おそらくロバストなＡＰＰ阻害効果を示すことが明白に想定される。
実施例２．ＲＮＡｉ薬剤のインビボ評価
選択されたＡＰＰ標的化ＲＮＡｉ薬剤を、インビボ効力について、それぞれ概念実証およびＡＡＶマウスにおけるヒトＡＰＰノックダウンのためのリード同定スクリーニングにおいて評価した。かかる試験で選択されたＲＮＡｉ薬剤には、上記の表２Ａに記載の配列を有し、上記の表３に示すような非修飾配列に該当し、図１Ａおよび図１Ｂにグラフィック表示したようなＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２９１３、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８４４、ＡＤ－３９２８２４、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２７９０、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２７１４およびＡＤ－３９２９２６を含め、本実施例で試験した各ＲＮＡｉ薬剤は、マウスに皮下投与する場合にかかるＲＮＡｉ薬剤の肝臓標的化を補助する目的でセンス鎖の３’残基に結合しているトリアンテナ型ＧａｌＮＡｃ部分をさらに存在させた（髄腔内投与では、コンジュゲート型ＧａｌＮＡｃ部分がない薬剤が明白に想定される）。
かかる試験において、ホモサピエンスＡＰＰ保有ＡＡＶベクターを６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに静脈内注射し、ＡＡＶ投与後１４日目、選択されたＲＮＡｉ薬剤または対照薬剤を３ｍｇ／ｋｇでマウス（ｎ＝３／群）に皮下注射し、ＲＮＡｉ薬剤または対照の皮下注射後１４日目にマウスを致死させ、肝臓をＡＰＰ ｍＲＮＡレベルについて評価した。試験したすべてのＲＮＡｉ薬剤で、ＰＢＳおよび未処置（ＡＡＶのみ）対照と比べて有意なレベルのインビボヒトＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンが肝臓において観察され、例えばＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２９１３、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８４４、ＡＤ－３９２８２４、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２７１４およびＡＤ－３９２９２６で特にロバストなレベルのノックダウンが観察された（図２Ａおよび図２Ｂ）。図２Ａおよび図２Ｂを作成するために使用した結果を以下の表８に表にする。
Figure 2022515193000076
実施例３：遺伝性脳アミロイド血管症（ｈＣＡＡ）に対して効力のあるヒトＡＰＰ ｓｉＲＮＡの同定
遺伝性脳アミロイド血管症（ｈＣＡＡ）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードしている遺伝子内の常染色体優性変異によって駆動される（Ｖａｎ Ｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１６ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。この疾患では、神経細胞誘導型ベータアミロイドが血管構造内に沈着し、有意な構造改変および独特な血管の二重化が引き起こされる。ｈＣＡＡは、実質内プラークまたはタウのもつれの存在は最小限である比較的純粋な血管障害のようである（Ｎａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。最終的に、アミロイドベータの沈着が増大して微小出血、認知症および卒中に至る。ｈＣＡＡは急速進行性の疾患であり、推定寿命は症状発生後７～１０年である（Ｃｈａｒｉｄｉｍｏｕ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２０１２；８３：１２４－１３７）。本明細書に記載したように、現在、利用可能な疾患修飾療法はない。本開示において、安定なｓｉＲＮＡ設計物を択一的なコンジュゲーションストラテジーと併用すると、単回髄腔内投与後、ＣＮＳにおいて効力のある長期持続性のサイレンシングがもたらされ、３ヶ月間まで９５％の標的ノックダウンが観察された。
Ｂｅ（２）Ｃ細胞でのスクリーニングおよびインビボ肝臓ベーススクリーニング
効力のあるｈＡＰＰ ｓｉＲＮＡを同定するため、ｓｉＲＮＡを、まずＢｅ（２）Ｃ細胞においてインビトロでスクリーニングした。図３Ａおよび図３Ｂに示すように、３００種類を超えるｓｉＲＮＡを、Ｂｅ（２）Ｃ細胞内に１０ｎＭ（図３Ｂ）および０．１ｎＭ（データ示さず）の濃度でトランスフェクトし、残存ｍＲＮＡのパーセントをｑＰＣＲによってアッセイした。次いで、ヒトＡＰＰをノックダウンできる化合物を同定するためにインビボ肝臓ベースＡＡＶ－ｈＡＰＰスクリーニングをマウスにおいて行なった。ｈＡＰＰ ＯＲＦまたはｈＡＰＰ ３’ＵＴＲのいずれかに対して設計したＧａｌＮＡｃ ＡＰＰ ｓｉＲＮＡを３ｍｇ／ｋｇで皮下投与した（それぞれ、図２Ａおよび２Ｂに示すとおり）。次いで、選択されたサブセットの化合物をＣＮＳコンジュゲートに変換し、非ヒト霊長類リード発見試験および髄腔内（ＩＴ）投与を用いた齧歯類疾患モデルの両方に使用した。上記のように、例えばＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２９１３、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８４４、ＡＤ－３９２８２４、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２７１４およびＡＤ－３９２９２６で特にロバストなレベルのノックダウンが観察された（図２Ａおよび図２Ｂ）。
Ｂｅ（２）Ｃ 神経細胞を１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭでトランスフェクトしたＡＰＰ ｓｉＲＮＡを、ＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンならびにトランスフェクション後２４時間目および４８時間目の両方での可溶性ＡＡＰ α／βレベルについて評価した（例えば、図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ参照）。濃度依存性ＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンが、両方の対象ｓｉＲＮＡ例で観察された（例えば、図４Ａ～４Ｃに示すｓｉＲＮＡ １およびｓｉＲＮＡ ２）。さらに、細胞内ＡＰＰの低減は、Ｂｅ（２）Ｃ 神経細胞における可溶性のＡＡＰ α／βの４８時間以内で９９％までものノックダウンに相当した。
実施例４：非ヒト霊長類の脊髄および脳全体へのＡＰＰ ｓｉＲＮＡの髄腔内（ＩＴ）投与による送達．
非ヒト霊長類試験
用量製剤および調製物
試験オリゴヌクレオチドおよびビヒクル情報
試験オリゴヌクレオチド：ＡＤ－４５４９７２
ＡＤ－４５４９７３
ＡＤ－４５４８４２
ＡＤ－４５４８４３
ＡＤ－４５４８４４
このプロトコルにおいて先に記載した現状の科学知識および適用可能なガイドラインは、この試験の目的を達成するための生体動物の使用のインビトロまたは別の様式での許容され得る代替例を示すものではない。ヒトならびに他の動物の健康およびウエルビーイングの改善に必要な知識を深めるには、多種多様な動物種を用いるインビボ実験が必要とされる。動物全般が、ヒトの身体を構成する種々の細胞、組織および器官間の動的相互作用を最良に反映するため、研究および試験において必須である。ビーグル犬は、種々の試験物品の毒性を評価するため、および膨大な過去データベースがあるものに使用される通常の非齧歯類モデルである。しかしながら、サルもまた、毒性を評価するために使用される動物モデルである。この試験における使用には、薬理学的に関連性のある種であるため具体的にはサルを選択した。試験オリゴヌクレオチド内のｓｉＲＮＡは、サルおよびヒトのアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ｍＲＮＡ標的配列に対して指向される。
試験デザイン
Figure 2022515193000077
前述の非ヒト霊長類試験に使用したオリゴヌクレオチドの配列および構造を以下の表９にさらに詳細に記載する。
Figure 2022515193000078
以下は、カニクイザルのＣＮＳ組織への７２ｍｇの薬物の髄腔内（ＩＴ）注射によるＣＳＦバイオマーカーおよび組織ｍＲＮＡのノックダウンの非限定的な例である。経皮的針穿刺による７２ｍｇの対象ＡＰＰ ｓｉＲＮＡの単回ＩＴ注射をカニクイザルの腰椎槽のＬ２／Ｌ３間またはＬ４／Ｌ５間に施行した（以下の方法および材料参照）。図５Ａに示すように、５種類の化合物を評価し、各実験で５匹の動物を使用した。収集した組織は脊髄（腰部、胸部および頸部）ならびに脳（前頭前皮質、側頭皮質、小脳、脳幹、海馬および線条体）であった。さらに、収集する体液には脳脊髄液（ＣＳＦ）と血漿の両方を含めた。薬物レベルおよびｍＲＮＡノックダウンを投与後２９日目に評価した。図５Ｂに示すように、ＡＰＰα／βならびにアミロイドベータ３８、４０および４２をＣＳＦ中の循環ターゲットエンゲージメントバイオマーカーとして使用し、投与後８、１５および２９日目に評価した。組織におけるノックダウンは、投与後７日目という早期のＣＳＦ中のターゲットエンゲージメントバイオマーカーのサイレンシングに相当した。図５Ｃに示すように、ＩＴ投薬により脊椎および脳全体への充分なｓｉＲＮＡ送達がもたらされ、組織レベルでのＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた。試験薬物レベルを質量分析によって評価し、図５Ｄに示す。要約すると、図５Ａ～５Ｄは、ＣＳＦバイオマーカーレベル、ｍＲＮＡノックダウンおよびＡＰＰ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－４５４９７２のＣＮＳ薬物送達間の相関を示す。したがって、注目すべきことに、ＣＳＦバイオマーカーレベルおよび組織ｍＲＮＡノックダウンは、ＣＮＳ内のｓｉＲＮＡコンジュゲート薬物レベルに応答して急速でロバストで持続的な低下を示すことが見い出された。図６は、ＣＳＦ中においてターゲットエンゲージメントバイオマーカーに対してＡＤ－４５４９７２投与後２～３ヶ月目も持続的な薬力学的効果が観察されることを示す。
図７ＡはＣＳＦ中のｓＡＰＰα／βに対するＡＤ－４５４８４２の結果を示し、一方、図７Ｂは、質量分析によって評価された、組織中のＡＤ－４５４８４２の試験された薬物レベルを示す。要約すると、図７Ａ～７Ｂは、ＣＳＦバイオマーカーレベルはＡＤ－４５４８４２のＣＮＳ内薬物レベルと相関し、高組織内薬物レベルで動物内のｓＡＰＰの有意な低減をもたらすことを示す。
図８Ａは、それぞれＣＳＦ中のｓＡＰＰα／βおよびアミロイドベータ種に対するＡＤ－４５４８４３の結果を示す。図８Ｂに示すように、ＩＴ投薬により、脊椎、海馬および皮質領域全体への充分なｓｉＲＮＡ送達がもたらされ、組織レベルでのＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた。試験薬物レベルを質量分析によって評価し、図８Ｃに示す。したがって、図８Ａ～８Ｃは、ＣＳＦバイオマーカーレベル、ｍＲＮＡノックダウンおよびＡＤ－４５４８４３のＣＮＳ薬物送達間の明らかな相関を示す。
図９Ａ～９Ｂは、ＡＤ－４５４８４３について、ＣＳＦ中においてターゲットエンゲージメントバイオマーカーに対して投与後２～３ヶ月目も持続的な薬力学的効果が観察されることを示す。カニクイザルにおいて投与後８５日目のＣＮＳ組織内で、ｍＲＮＡレベルで８０％までものノックダウンが観察された。
図１０Ａ～１０Ｃは、ＣＳＦバイオマーカーレベル、ｍＲＮＡノックダウンおよびＡＤ－４５４８４４のＣＮＳ薬物送達間の相関を示す。試験薬物レベルを質量分析によって評価し、図１０Ｃに示す。
図１１Ａ～１１Ｃは、ＡＰＰリードｓｉＲＮＡの最適な送達によりロバストな活性が示されることを示す。例えば、ｍＲＮＡノックダウンおよびターゲットエンゲージメントバイオマーカーのサイレンシングに対する高レベルの薬物の結果は、組織内高μｇ／ｇ薬物レベルがＣＮＳ組織内、例えば皮質および脊椎における７５～９０％ノックダウンと相関したことを示す。驚くべきことに、最適な送達により線条体での有意なノックダウンも示された。
図１２Ａは、５つの二重鎖の平均を示す；集合的に、ＩＴ投薬により、ＡＰＰ ｍＲＮＡが２９日目に組織レベルで６０～７５％ノックダウンされるような充分なｓｉＲＮＡ送達がもたらされた。さらに、図１２Ｂに示すように、可溶性ＡＰＰα／βならびにアミロイドベータ３８、４０および４２は、２９日目、ＣＳＦ中において７５％低減された。
投与後２９日目の非ヒト霊長類の線条体におけるＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウン
経皮的針穿刺による７２ｍｇの対象ＡＰＰ ｓｉＲＮＡの単回髄腔内（ＩＴ）注射をカニクイザルの腰椎槽のＬ２／Ｌ３間またはＬ４／Ｌ５間に施行した。本開示において、ｓｉＲＮＡコンジュゲート化合物の送達により線条体内でＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンがもたらされるという注目すべき発見がなされた。以下のｓｉＲＮＡ：ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３およびＡＤ－４５４８４４により、投与後２９日目の非ヒト霊長類の線条体においてＡＰＰ ｍＲＮＡがノックダウンされていることが観察された（図１３Ａ～１３Ｅに示すとおり）。
材料および方法
可溶性ＡＰＰアルファ／可溶性ＡＰＰベータ
ｓＡＰＰαおよびｓＡＰＰβのＣＳＦ中レベルは、サンドイッチイムノアッセイＭＳＤ（登録商標）９６ウェルＭＵＬＴＩ－ＳＰＯＴ ｓＡＰＰα／ｓＡＰＰβアッセイ（カタログ番号Ｋ１５１２０Ｅ；Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、ある程度の変形を伴ったが製造業者のプロトコルに従って利用して測定した。標準品、ブランクおよび非ヒト霊長類ＣＳＦ試料（８倍希釈）を、１％Ｂｌｏｃｋｅｒ－Ａ／ＴＢＳＴ（キットに付属）を用いて調製した。プレコートプレート（キットに付属）を、１５０μＬ／ウェルの３％Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ／ＴＢＳＴ溶液で室温にて１時間、振盪しながらブロックした。１×ＴＢＳＴで３回の洗浄後、調製した２５μＬ／ウェルの標準品、ブランクおよびＣＳＦ試料をプレートに二連で添加し、室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。その後プレートを洗浄した後、１％Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａ／ＴＢＳＴ中で調製した５０μＬ／ウェルの検出抗体（５０倍希釈）を添加し、室温で１時間、振盪しながらインキュベートした。プレート洗浄後、１×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔをプレートに添加し、室温で１０分間インキュベートした（振盪なしで）後、ＭＳＤ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ Ｉｍａｇｅｒでのイメージングおよび解析を行なった。
未加工データを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ，バージョン７．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解析した。５パラメータロジスティック曲線フィッティングを１／Ｙ２加重関数とともに使用して個々の検量線モデルを作成し、試料中の被検物質の濃度を計算した。
ベータ－アミロイドパネル（Ａβ４０、Ａβ３８、Ａβ４２）
ベータ－アミロイド（Ａβ４０、Ａβ３８、Ａβ４２）のＣＳＦ中レベルを、サンドイッチイムノアッセイマルチプレックスキットＭＳＤ（登録商標）９６ウェルＭＵＬＴＩ－ＳＰＯＴ ＡＢ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐａｎｅｌ １ Ｖ－Ｐｌｅｘ（カタログ番号Ｋ１５２００Ｅ，Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）を、ある程度の変形を伴ったが製造業者のプロトコルに従って利用して測定した。標準品、ブランクおよび非ヒト霊長類ＣＳＦ（８倍希釈）を、Ｄｉｌｕｅｎｔ ３５（キットに付属）を用いて調製した。検出抗体（５０×で供給）を、３０μＬのＡβ４０ Ｂｌｏｃｋｅｒと合わせたＤｉｌｕｅｎｔ １００（キットに付属）で１×の使用濃度に調製した。プレコートプレート（キットに付属）を、１５０μＬ／ウェルにてＤｉｌｕｅｎｔ ３５で室温にて１時間、振盪しながらブロックした。１×ＰＢＳＴで３回の洗浄後、調製した２５μｌ／ウェルの検出抗体溶液をプレートに添加した。調製した２５μＬ／ウェルの標準品、ブランクおよび試料を二連で添加した後、プレートを室温で２時間、振盪しながらインキュベートした。その後プレートを洗浄した後、１５０μＬ／ウェルの２×Ｒｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔを添加し、即座にＭＳＤ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ Ｉｍａｇｅｒでプレートをイメージングし、解析した。
未加工データを、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ，バージョン７．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析した。４－パラメータロジスティック曲線フィッティングを１／Ｙ２加重関数とともに使用して個々の検量線モデルを作成し、試料中の被検物質の濃度を計算した。
質量分析法
血漿、ＣＳＦおよびＣＮＳ組織試料中の薬物濃度を、適格ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を用いて定量した。簡単には、組織試料を溶解バッファー中でホモジナイズし、次いで、オリゴヌクレオチドを血漿、ＣＳＦまたは組織ライセートから、固相抽出によって抽出し、質量分析と対にしたイオンペア逆相液体クロマトグラフィーをネガティブイオン化モードで用いて解析した。投与された二重鎖の完全長のアンチセンス鎖の濃度を測定した。薬物濃度は、アンチセンスベースの二重鎖濃度として報告した。検量線の実用範囲は、血漿およびＣＳＦ試料では１０～５０００ｎｇ／ｍＬ、ＣＮＳ組織試料では１００～５００００ｎｇ／ｇである。ＬＬＯＱ未満であると計算された濃度は＜ＬＬＯＱと報告する。異なる分子量を有する二重鎖アナログは内部標準として使用した。
ｑＰＣＲ法によるｍＲＮＡノックダウン
全ＲＮＡをラットの脳および脊髄の組織試料から、（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１７００４）のｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを製造業者の説明書に従って用いて単離した。単離後、ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ ＶＩＬＯ（商標）逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。定量ＰＣＲ解析を、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ ０２４５１のＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＶｉｉＡ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号４４５３５３７）を使用し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３５２０４２）、予備検証済アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（Ｍｆ０１５５２２９１＿ｍ１）およびペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（ＰＰＩＢ）（Ｍｆ０２８０２９８５＿ｍ１）Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行なった。
ＡＰＰ ｍＲＮＡの相対減少を、サイクル閾値比較（Ｃｔ）法を用いて計算した。ｑＰＣＲ中、機器において、増幅曲線の対数期内にベースラインが設定され、Ｃｔ値はベースラインと増幅曲線の交点に基づいて割り当てられる。ＡＰＰ ｍＲＮＡの減少を未処置実験対照群に対して、以下の計算：
ΔＣｔＡｐｐ＝ＣｔＡｐｐ－ＣｔＰｐｉｂ
ΔΔＣｔＡｐｐ＝ΔＣｔＡｐｐ－ΔＣｔ未処置対照群の平均
相対ｍＲＮＡレベル＝２－ΔΔＣｔ
によるＣｔ値を用いて、それぞれの各群のパーセンテージとして正規化した。
実施例５：さらなるＲＮＡｉ薬剤の設計、合成ならびにＣｏｓ－７、Ｂｅ（２）－ＣおよびＮｅｕｒｏ－２ａ細胞株でのインビトロスクリーニング．
この実施例では、設計、合成、選択ならびにＣｏｓ－７（Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター）、Ｂｅ（２）－ＣおよびＮｅｕｒｏ－２ａ細胞でのさらなるＡＰＰ ＲＮＡｉ薬剤のインビトロスクリーニングのための方法を記載する。
試薬の供給元
試薬の供給元を本明細書において具体的に示していない場合、かかる試薬は、分子生物学用の試薬の任意の業者から、分子生物学における適用のための品質／純度の標準規格で入手することができる。
細胞培養およびトランスフェクション：
Ｃｏｓ－７細胞（ＡＴＣＣ）は、５μｌの１ｎｇ／μｌ（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中で希釈）のＣ９ｏｒｆ７２イントロン１ ｐｓｉＣＨＥＣＫ２ベクター（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１１６６８－０１９）を３８４ウェルプレート内の５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖／ウェル（各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４連）に添加し、室温で１５分間インキュベートすることによりトランスフェクトした。次いで、約５×１０３個の細胞を含有している３５μｌのダルベッコ改変イーグル培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ホタル（トランスフェクション対照）およびウミシイタケ（標的配列と融合）ルシフェラーゼの測定を行なった。３つの用量１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．１ｎＭで実験を行なった。
Ｂｅ（２）－Ｃ細胞（ＡＴＣＣ）は、４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）を３８４ウェルプレート内の５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖／ウェル（各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４連）に添加し、室温で１５分間インキュベートすることによりトランスフェクトした。次いで、約５×１０３個の細胞を含有している最小必須培地とＦ１２培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が１：１の４０μｌの混合物をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行なった。２つの用量１０ｎＭおよび０．１ｎＭで実験を行なった。
Ｎｅｕｒｏ－２ａ細胞（ＡＴＣＣ）は、４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ＋０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ／ウェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）を３８４ウェルプレート内の５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖／ウェル（各ｓｉＲＮＡ二重鎖について４連）に添加し、室温で１５分間インキュベートすることによりトランスフェクトした。次いで、約５×１０３個の細胞を含有している４０μｌの最小必須培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をｓｉＲＮＡ混合物に添加した。細胞を４８時間インキュベートした後、ＲＮＡ精製を行なった。２つの用量１０ｎＭおよび０．１ｎＭで実験を行なった。
ＤＹＮＡＢＥＡＤ ｍＲＮＡ単離キットを用いた全ＲＮＡの単離：
ＲＮＡを、ＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームでの自動化プロトコルを使用し、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号６１０１２）を用いて単離した。簡単には、７０μｌの溶解／結合バッファーおよび３μｌの磁性ビーズを含む１０μｌの溶解バッファーを、細胞を有するプレートに添加した。プレートを電磁式振盪機において室温で１０分間インキュベートし、次いで磁性ビーズを捕捉し、上清みを除去した。次いでビーズ結合ＲＮＡを、１５０μｌの洗浄バッファーＡで２回および洗浄バッファーＢで１回洗浄した。次いでビーズを１５０μｌの溶出バッファーで洗浄し、再捕捉し、上清みを除去した。
ＡＢＩハイキャパシティｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，カタログ番号４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡの合成：
反応あたり１μｌの１０×バッファー、０．４ｕｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのＲＮａｓｅ阻害薬および６．６μｌのＨ２Ｏを含む１０μｌのマスターミックスを、上記で単離したＲＮＡに添加した。プレートを密封し、混合し、電磁式振盪機において室温で１０分間、続いて３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡおよび５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）と０．５μｌのＣ９ｏｒｆ７２ヒトプローブ（Ｈｓ００３７６６１９＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ）または０．５μｌのマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３５２３３９Ｅ）と０．５μｌのＣ９ｏｒｆ７２マウスプローブ（Ｍｍ０１２１６８３７＿ｍ１，Ｔｈｅｒｍｏ）のいずれかに添加した。リアルタイムＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で行なった。各二重鎖を少なくとも２回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。相対変化倍数を計算するため、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を用いて解析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞で行なったアッセイに対して正規化した。
さらなるＡＰＰオリゴヌクレオチド配列：
表１０～表１６Ｂに、さらなる修飾ＡＰＰ配列および標的ＡＰＰ配列を列記する。
Figure 2022515193000079
Figure 2022515193000080
Figure 2022515193000081
Figure 2022515193000082
Figure 2022515193000083
Figure 2022515193000084
Figure 2022515193000085
Figure 2022515193000086
Figure 2022515193000087
Figure 2022515193000088
Figure 2022515193000089
Figure 2022515193000090
Figure 2022515193000091
Figure 2022515193000092
Figure 2022515193000093
Figure 2022515193000094
Figure 2022515193000095
Figure 2022515193000096
Figure 2022515193000097
Figure 2022515193000098
Figure 2022515193000099
表１７に、１０ｎＭ、１ｎＭまたは０．１ｎＭのいずれかで実施した、Ｂｅ（２）細胞での反復用量ＡＰＰスクリーニングの結果を要約する。データを、残存メッセージのＡＤ－１９５５非標的化対照に対するパーセントとして表示する。
Figure 2022515193000100
Figure 2022515193000101
Figure 2022515193000102
Figure 2022515193000103
Figure 2022515193000104
Figure 2022515193000105
Figure 2022515193000106
Figure 2022515193000107
Figure 2022515193000108
Figure 2022515193000109
Figure 2022515193000110
Figure 2022515193000111
Figure 2022515193000112
Figure 2022515193000113
実施例６．ＡＵリッチシードを有する配列のインビボＡＰＰスクリーニング
インビボスクリーニングをＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて行ない、ＡＵリッチシードを有するオリゴヌクレオチドを試験した。試験デザインの概要を表１９に示す。表２０Ａに示すように、以下のＡＵリッチシードを有するオリゴヌクレオチド：ＡＤ－５０６９３５．２、ＡＤ－５０７０６５．２、ＡＤ－５０７１５９．２、ＡＤ－５０７５３８．２、ＡＤ－５０７６２４．２、ＡＤ－５０７７２４．２、ＡＤ－５０７７２５．２、ＡＤ－５０７７８９．２、ＡＤ－５０７８７４．２、ＡＤ－５０７９２８．２およびＡＤ－５０７９４９．２を試験した。表２０Ａに、これらのＡＵリッチオリゴヌクレオチドの各々のセンス、アンチセンスおよび標的のオリゴヌクレオチド配列を列挙する。ＲＬＤ５９２のオリゴヌクレオチドＡＤ－３９２９２７．２（ＧＮＡ７ Ｃ１６ケミストリー）を陽性対照配列として使用した。ＡＵリッチオリゴヌクレオチドの構造を図１４Ａおよび１４Ｂに示す。さらに、各ＡＵリッチシードを有するオリゴヌクレオチドを、交差反応性について、ヒト（例えば、ＮＭ＿０００４８４配列によってアッセイ）、シノモルゴースザル（ＸＭ＿００５５４８８８３配列によってアッセイ）、マウス（ＮＭ＿００１１９８８２３配列によってアッセイ）、ラット（ＮＭ＿０１９２８８配列によってアッセイ）およびイヌ（ＮＭ＿００１２９３２７９配列によってアッセイ）において試験し、このデータを表２０Ｂに要約する。
Figure 2022515193000114
Figure 2022515193000115
Figure 2022515193000116
選択されたＡＵリッチ候補をインビボ効力について、ＡＡＶマウスにおけるヒトＡＰＰノックダウンのためのリード同定スクリーニングにおいて評価した。簡単には、ホモサピエンスＡＰＰ保有ＡＡＶベクター（例えば、ｈｓＡＰＰ－ＣＤＳ３ＴＲＮＣ）を６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに静脈内注射し、ＡＡＶ投与後１４日目、選択されたＲＮＡｉ薬剤または対照薬剤をマウス（ｎ＝３／群に３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下注射した。スクリーニンググループを表２１に要約する。
Figure 2022515193000117
Figure 2022515193000118
マウスを致死させ、その肝臓をＡＰＰ ｍＲＮＡレベルについて、ＲＮＡｉ薬剤または対照の皮下注射後１４日目にｑＰＣＲによって評価した。表２２および図１５に示すように、試験したほとんどのＡＵリッチＲＮＡｉ薬剤で、ＰＢＳおよび未処置（ＡＡＶのみ）対照と比べて有意なレベルのインビボヒトＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンが肝臓において観察され、ＡＤ－５０７５３８．２、ＡＤ－５０７７２４．２、ＡＤ－３９２９２７．２（ＲＬＤ５９２）、ＡＤ－５０７９２８．２、ＡＤ－５０６９３５．２およびＡＤ－５０７８７４．２で特にロバストなレベルのノックダウンが観察された。
Figure 2022515193000119
表２３は、ＤＬおよびＢｅ（２）Ｃ細胞株の両方における、３ｍｇ／ｋｇの上記のＡＵリッチＲＮＡｉ薬剤による肝臓におけるインビボヒトｈｓＡＰＰ ｍＲＮＡノックダウンの、１０ｎＭまたは０．１ｎＭのいずれかの同じＡＵリッチＲＮＡｉ薬剤でのインビトロＡＰＰノックダウンとの比較を示す。
Figure 2022515193000120
実施例７．構造活性相関試験のためのリード配列のインビボＡＰＰスクリーニング
インビボスクリーニングをＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて行ない、構造活性相関試験をリードオリゴヌクレオチドにおいて実施した。試験デザインの概要を表２５に示す。表２６に示すように、以下のリードオリゴヌクレオチド：ＡＤ－８８６８２３、ＡＤ－８８６８３９、ＡＤ－８８６８４５、ＡＤ－８８６８５３、ＡＤ－８８６８５８、ＡＤ－８８６８６４、ＡＤ－８８６８７３、ＡＤ－８８６８７７、ＡＤ－８８６８７９、ＡＤ－８８６８８３、ＡＤ－８８６８８４、ＡＤ－８８６８８９、ＡＤ－８８６８９９、ＡＤ－８８６９００、ＡＤ－８８６９０６、ＡＤ－８８６９０７、ＡＤ－８８６９０８、ＡＤ－８８６９０９、ＡＤ－８８６９１９、ＡＤ－８８６９２８、ＡＤ－８８６９３０およびＡＤ－８８６９３１を試験した。表２６に、各リードオリゴヌクレオチドのセンス配列およびアンチセンス配列、ならびに各リードオリゴヌクレオチドの関連標的配列を列記する。リードオリゴヌクレオチドの構造を図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃおよび図１６Ｄに示す。
Figure 2022515193000121
Figure 2022515193000122
Figure 2022515193000123
Figure 2022515193000124
Figure 2022515193000125
Figure 2022515193000126
表２９は、Ｂｅ（２）Ｃ細胞株における、１０ｎＭまたは０．１ｎＭのいずれかの上記の（例えば、表２６）リードＲＮＡｉ薬剤でのインビトロＡＰＰノックダウンを示す。
Figure 2022515193000127
実施例８．非ヒト霊長類におけるＣ－１６ ｓｉＲＮＡコンジュゲートによるＡＰＰのインビボノックダウン
ｓｉＲＮＡコンジュゲートＡＤ－４５４８４４の効力のため、構造活性相関試験をＡＤ－４５４８４４において行ない、その結果、可溶性ＡＰＰのカニクイザルインビボスクリーニングに基づいて新たに５種類のＣ１６化合物がリード化合物として同定された。Ｃ１６ ｓｉＲＮＡコンジュゲートのインビボノックダウン効果を、６０ｍｇのＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５またはＡＤ－９６１５８６を髄腔内投与により腰椎槽のＬ２／Ｌ３間またはＬ４／Ｌ５間に経皮的針穿刺によって受けたカニクイザルにおいて評価した（図２０Ａ～２０Ｇ）。投与後８日目、１５日目および２９日目に収集したＣＳＦ由来の可溶性ＡＰＰアルファおよびベータターゲットエンゲージメントバイオマーカーを評価した。ＩＴ投薬により、投与後１週間という早期でのターゲットエンゲージメントバイオマーカーのサイレンシングによって示されるように、脊椎および脳全体への充分なｓｉＲＮＡ送達がもたらされ、活性は２９日目まで持続した。注目すべきことに、５’端Ｃ１６コンジュゲート（ＡＤ－９９４３７９）のインビボノックダウン活性は内部Ｃ１６コンジュゲート（ＡＤ－４５４８４４）のものと同様であった。（アンチセンス配列は、試験した両分子において同一である）。
さらに、Ｃ１６ ｓｉＲＮＡコンジュゲートはサインフィカント（ｓｉｇｎｆｉｃａｎｔ）な長期持続性のノックダウン効果を示した。６０ｍｇのＡＤ－４５４８４４の単回用量後、可溶性ＡＰＰが４ヶ月間にわたって５０％より充分下に維持される持続的な薬力学的効果が観察された（図１９および２０Ａ）。
Figure 2022515193000128
Figure 2022515193000129
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）ならびに０．５μｌのＡＰＰヒトプローブ（Ｈｓ００１６９０９８＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。または、２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのマウスＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３５２３３９Ｅ）ならびに０．５μｌのＡＰＰマウスプローブ（Ｍｍ０１３４４１７２＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。または、２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）内のウェルあたり０．５μｌのカニクイザルＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡ－３’（配列番号：２９０３）、リバースプライマー：５’－ＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣ－３’（配列番号：２９０４）、プローブ：５’ＨＥＸ－ＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣ－３’ＢＨＱ－１（配列番号：２９０５））および０．５μｌのＡＰＰカニクイザルプローブ（Ｍｆ０１５５２２９１＿ｍ１）および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに添加した。リアルタイムＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で行なった。各二重鎖を少なくとも２回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞に対して正規化した。

Claims (168)

  1. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０のうちのいずれか１つに列記されたアンチセンス配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む相補性領域を有する、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  2. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０に提示されたセンス鎖配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み；および
    前記アンチセンス鎖が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０に提示されたアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  3. 前記センス鎖と前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも一方が、１または複数の内部ヌクレオチド位置に、任意選択でリンカーまたは担体を介して、コンジュゲートされた１または複数の親油性部分を含む、請求項１または請求項２に記載の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  4. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記ｄｓＲＮＡ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、ここで、配列番号：１～１４内のいずれかののチミンに対するウラシルでの置き換えは、前記の配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なることに寄与する違いとしてカウントされない；および
    前記アンチセンス鎖は、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、ここで、配列番号：１５～２８内のいずれかのチミンのウラシルでの置き換えは、前記の配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドのが異なることに寄与する違いとしてカウントされない、
    前記センス鎖と前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも一方が、１または複数の内部ヌクレオチド位置に、任意選択でリンカーまたは担体を介して、コンジュゲートされた１または複数の親油性部分を含む、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  5. 前記センス鎖が、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２８１６、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８５５、ＡＤ－３９２８４０、ＡＤ－３９２８３５、ＡＤ－３９２７２９、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２８７６、ＡＤ－３９２８６３、ＡＤ－３９２９１７、ＡＤ－３９２７８３、ＡＤ－３９２７６５、ＡＤ－３９２７９１、ＡＤ－３９２８００、ＡＤ－３９２７１１、ＡＤ－３９２８０１、ＡＤ－３９２８２６、ＡＤ－３９２８１８、ＡＤ－３９２７９２、ＡＤ－３９２８０２、ＡＤ－３９２７６６、ＡＤ－３９２７６７、ＡＤ－３９２８３４、ＡＤ－３９２９７４、ＡＤ－３９２７８４、ＡＤ－３９２７４４、ＡＤ－３９２７５２、ＡＤ－３９２７３７、ＡＤ－３９２９１８、ＡＤ－３９２９１９、ＡＤ－３９２８０３、ＡＤ－３９２８０４、ＡＤ－３９２８２７、ＡＤ－３９２８２８、ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２７１５、ＡＤ－３９２８３６、ＡＤ－３９２９６６、ＡＤ－３９２８３２、ＡＤ－３９２９７２、ＡＤ－３９２９６１、ＡＤ－３９２９６７、ＡＤ－３９２８９４、ＡＤ－３９２８６４、ＡＤ－３９２８６５、ＡＤ－３９２９２２、ＡＤ－３９２８３３、ＡＤ－３９２９６８、ＡＤ－３９２９６２、ＡＤ－３９２９６３、ＡＤ－３９２９６９、ＡＤ－３９２９７３、ＡＤ－３９２９２３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２８７７、ＡＤ－３９２７０７、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２７１７、ＡＤ－３９２７００、ＡＤ－３９２８７８、ＡＤ－３９２７１８、ＡＤ－３９２９２９、ＡＤ－３９２８１９、ＡＤ－３９２７４５、ＡＤ－３９２７７０、ＡＤ－３９２８０６、ＡＤ－３９２７７１、ＡＤ－３９２８２０、ＡＤ－３９２８２１、ＡＤ－３９２７８６、ＡＤ－３９２７７２、ＡＤ－３９２６９９、ＡＤ－３９２８６８、ＡＤ－３９２７１９、ＡＤ－３９２８８０、ＡＤ－３９２９３０、ＡＤ－３９２９３２、ＡＤ－３９２８６９、ＡＤ－３９２８７０、ＡＤ－３９２８９６、ＡＤ－３９２７２０、ＡＤ－３９２７４６、ＡＤ－３９２７７３、ＡＤ－３９２８０７、ＡＤ－３９２７３０、ＡＤ－３９２７２１、ＡＤ－３９２９３３、ＡＤ－３９２８８１、ＡＤ－３９２８９７、ＡＤ－３９２８９８、ＡＤ－３９２８９９、ＡＤ－３９２９３５、ＡＤ－３９２８８２、ＡＤ－３９２７３８、ＡＤ－３９２７３９、ＡＤ－３９２９３６、ＡＤ－３９２９００、ＡＤ－３９２９０１、ＡＤ－３９２９３７、ＡＤ－３９２８８３、ＡＤ－３９２９７５、ＡＤ－３９２９３８、ＡＤ－３９２９０２、ＡＤ－３９２９４１、ＡＤ－３９２９４２、ＡＤ－３９２９４３、ＡＤ－３９２９４４、ＡＤ－３９２９０３、ＡＤ－３９２７７５、ＡＤ－３９２７５８、ＡＤ－３９２９４５、ＡＤ－３９２８８４、ＡＤ－３９２９４７、ＡＤ－３９２７４８、ＡＤ－３９２７５９、ＡＤ－３９２８３７、ＡＤ－３９２９７０、ＡＤ－３９２９７６、ＡＤ－３９２９６５、ＡＤ－３９２８３１、ＡＤ－３９２９０４、ＡＤ－３９２８８５、ＡＤ－３９２８８６、ＡＤ－３９２７７６、ＡＤ－３９２８８７、ＡＤ－３９２７２２、ＡＤ－３９２７６０、ＡＤ－３９２７３１、ＡＤ－３９２７０９、ＡＤ－３９２７２３、ＡＤ－３９２９４８、ＡＤ－３９２７２４、ＡＤ－３９２９４９、ＡＤ－３９２７２５、ＡＤ－３９２９５０、ＡＤ－３９２７３２、ＡＤ－３９２７２６、ＡＤ－３９２８６２、ＡＤ－３９２９５１、ＡＤ－３９２８７１、ＡＤ－３９２８７２、ＡＤ－３９７１８３、ＡＤ－３９７１７５、ＡＤ－３９７１７７、ＡＤ－３９７１７６、ＡＤ－３９７２６０、ＡＤ－３９７２６６、ＡＤ－３９７２６７、ＡＤ－３９７１７８、ＡＤ－３９７１８０、ＡＤ－３９７１８４、ＡＤ－３９７１７９、ＡＤ－３９７２２４、ＡＤ－３９７２２５、ＡＤ－３９７２０３、ＡＤ－３９７１８５、ＡＤ－３９７１９５、ＡＤ－３９７２０４、ＡＤ－３９７１９１、ＡＤ－３９７２５１、ＡＤ－３９７２４０、ＡＤ－３９７２０５、ＡＤ－３９７２５４、ＡＤ－３９７２５９、ＡＤ－３９７２４７、ＡＤ－３９７２３３、ＡＤ－３９７１８１、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１９７、ＡＤ－３９７２２６、ＡＤ－３９７２１２、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ－３９７２２７、ＡＤ－３９７２１７、ＡＤ－３９７２１３、ＡＤ－３９７２２９、ＡＤ－３９７２６４、ＡＤ－３９７２６５、ＡＤ－３９７２０９、ＡＤ－３９７１９２、ＡＤ－３９７２１０、ＡＤ－３９７２１９、ＡＤ－３９７２１４、ＡＤ－３９７２２０、ＡＤ－３９７２３０、ＡＤ－３９７２３１、ＡＤ－３９７１９３、ＡＤ－３９７１９０、ＡＤ－３９７２００、ＡＤ－３９７２４８、ＡＤ－３９７２０７、ＡＤ－３９７２１１、ＡＤ－３９７２４３、ＡＤ－３９７２４６、ＡＤ－３９７２２３、ＡＤ－３９７２０２、ＡＤ－３９７２５６、ＡＤ－３９７２５７、ＡＤ－３９７２５８、ＡＤ－３９７２５０、ＡＤ－３９７２４４、ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３、ＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５およびＡＤ－９６１５８６からなる群より選択される二重鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  6. 前記アンチセンス鎖が、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２８１６、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８５５、ＡＤ－３９２８４０、ＡＤ－３９２８３５、ＡＤ－３９２７２９、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２８７６、ＡＤ－３９２８６３、ＡＤ－３９２９１７、ＡＤ－３９２７８３、ＡＤ－３９２７６５、ＡＤ－３９２７９１、ＡＤ－３９２８００、ＡＤ－３９２７１１、ＡＤ－３９２８０１、ＡＤ－３９２８２６、ＡＤ－３９２８１８、ＡＤ－３９２７９２、ＡＤ－３９２８０２、ＡＤ－３９２７６６、ＡＤ－３９２７６７、ＡＤ－３９２８３４、ＡＤ－３９２９７４、ＡＤ－３９２７８４、ＡＤ－３９２７４４、ＡＤ－３９２７５２、ＡＤ－３９２７３７、ＡＤ－３９２９１８、ＡＤ－３９２９１９、ＡＤ－３９２８０３、ＡＤ－３９２８０４、ＡＤ－３９２８２７、ＡＤ－３９２８２８、ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２７１５、ＡＤ－３９２８３６、ＡＤ－３９２９６６、ＡＤ－３９２８３２、ＡＤ－３９２９７２、ＡＤ－３９２９６１、ＡＤ－３９２９６７、ＡＤ－３９２８９４、ＡＤ－３９２８６４、ＡＤ－３９２８６５、ＡＤ－３９２９２２、ＡＤ－３９２８３３、ＡＤ－３９２９６８、ＡＤ－３９２９６２、ＡＤ－３９２９６３、ＡＤ－３９２９６９、ＡＤ－３９２９７３、ＡＤ－３９２９２３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２８７７、ＡＤ－３９２７０７、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２７１７、ＡＤ－３９２７００、ＡＤ－３９２８７８、ＡＤ－３９２７１８、ＡＤ－３９２９２９、ＡＤ－３９２８１９、ＡＤ－３９２７４５、ＡＤ－３９２７７０、ＡＤ－３９２８０６、ＡＤ－３９２７７１、ＡＤ－３９２８２０、ＡＤ－３９２８２１、ＡＤ－３９２７８６、ＡＤ－３９２７７２、ＡＤ－３９２６９９、ＡＤ－３９２８６８、ＡＤ－３９２７１９、ＡＤ－３９２８８０、ＡＤ－３９２９３０、ＡＤ－３９２９３２、ＡＤ－３９２８６９、ＡＤ－３９２８７０、ＡＤ－３９２８９６、ＡＤ－３９２７２０、ＡＤ－３９２７４６、ＡＤ－３９２７７３、ＡＤ－３９２８０７、ＡＤ－３９２７３０、ＡＤ－３９２７２１、ＡＤ－３９２９３３、ＡＤ－３９２８８１、ＡＤ－３９２８９７、ＡＤ－３９２８９８、ＡＤ－３９２８９９、ＡＤ－３９２９３５、ＡＤ－３９２８８２、ＡＤ－３９２７３８、ＡＤ－３９２７３９、ＡＤ－３９２９３６、ＡＤ－３９２９００、ＡＤ－３９２９０１、ＡＤ－３９２９３７、ＡＤ－３９２８８３、ＡＤ－３９２９７５、ＡＤ－３９２９３８、ＡＤ－３９２９０２、ＡＤ－３９２９４１、ＡＤ－３９２９４２、ＡＤ－３９２９４３、ＡＤ－３９２９４４、ＡＤ－３９２９０３、ＡＤ－３９２７７５、ＡＤ－３９２７５８、ＡＤ－３９２９４５、ＡＤ－３９２８８４、ＡＤ－３９２９４７、ＡＤ－３９２７４８、ＡＤ－３９２７５９、ＡＤ－３９２８３７、ＡＤ－３９２９７０、ＡＤ－３９２９７６、ＡＤ－３９２９６５、ＡＤ－３９２８３１、ＡＤ－３９２９０４、ＡＤ－３９２８８５、ＡＤ－３９２８８６、ＡＤ－３９２７７６、ＡＤ－３９２８８７、ＡＤ－３９２７２２、ＡＤ－３９２７６０、ＡＤ－３９２７３１、ＡＤ－３９２７０９、ＡＤ－３９２７２３、ＡＤ－３９２９４８、ＡＤ－３９２７２４、ＡＤ－３９２９４９、ＡＤ－３９２７２５、ＡＤ－３９２９５０、ＡＤ－３９２７３２、ＡＤ－３９２７２６、ＡＤ－３９２８６２、ＡＤ－３９２９５１、ＡＤ－３９２８７１、ＡＤ－３９２８７２、ＡＤ－３９７１８３、ＡＤ－３９７１７５、ＡＤ－３９７１７７、ＡＤ－３９７１７６、ＡＤ－３９７２６０、ＡＤ－３９７２６６、ＡＤ－３９７２６７、ＡＤ－３９７１７８、ＡＤ－３９７１８０、ＡＤ－３９７１８４、ＡＤ－３９７１７９、ＡＤ－３９７２２４、ＡＤ－３９７２２５、ＡＤ－３９７２０３、ＡＤ－３９７１８５、ＡＤ－３９７１９５、ＡＤ－３９７２０４、ＡＤ－３９７１９１、ＡＤ－３９７２５１、ＡＤ－３９７２４０、ＡＤ－３９７２０５、ＡＤ－３９７２５４、ＡＤ－３９７２５９、ＡＤ－３９７２４７、ＡＤ－３９７２３３、ＡＤ－３９７１８１、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１９７、ＡＤ－３９７２２６、ＡＤ－３９７２１２、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ－３９７２２７、ＡＤ－３９７２１７、ＡＤ－３９７２１３、ＡＤ－３９７２２９、ＡＤ－３９７２６４、ＡＤ－３９７２６５、ＡＤ－３９７２０９、ＡＤ－３９７１９２、ＡＤ－３９７２１０、ＡＤ－３９７２１９、ＡＤ－３９７２１４、ＡＤ－３９７２２０、ＡＤ－３９７２３０、ＡＤ－３９７２３１、ＡＤ－３９７１９３、ＡＤ－３９７１９０、ＡＤ－３９７２００、ＡＤ－３９７２４８、ＡＤ－３９７２０７、ＡＤ－３９７２１１、ＡＤ－３９７２４３、ＡＤ－３９７２４６、ＡＤ－３９７２２３、ＡＤ－３９７２０２、ＡＤ－３９７２５６、ＡＤ－３９７２５７、ＡＤ－３９７２５８、ＡＤ－３９７２５０、ＡＤ－３９７２４４、ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３、ＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５およびＡＤ－９６１５８６からなる群より選択される二重鎖のアンチセンスヌクレオチド配列と３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  7. 少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  8. ｌｏｇＫｏｗによって測定される前記親油性部分の親油性が０より大きい、請求項３～６のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  9. 二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合分率によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ薬剤の前記疎水性が０．２より大きい、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  10. 前記血漿タンパク質結合アッセイがヒト血清アルブミンタンパク質を用いる電気泳動移動度シフトアッセイである、請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  11. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  12. 前記アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  13. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  14. 前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  15. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれかに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  16. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１個が、デオキシ－ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、コンホメーション制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロクスリー－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基含有ヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェート部または５’ホスフェート模倣部を含むヌクレオチド、ビニルホスフェート部を含むヌクレオチド、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）を構成するヌクレオチド、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ－異性体を構成するヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェート部を含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェート部を含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェート部を含むヌクレオチドおよびコレステリル誘導体とドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項７および１１～１５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  17. 前記修飾ヌクレオチドが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダートおよび非天然塩基含有ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  18. 前記修飾ヌクレオチドが３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  19. 前記ヌクレオチドの前記修飾部が２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡおよび２’フルオロ修飾部である、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  20. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  21. ６～８つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  22. 前記相補性の領域が少なくとも１７個のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  23. 前記相補性の領域が１９～２３個のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  24. 前記相補性の領域が１９個のヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  25. 各鎖が３０個以下のヌクレオチドの長さである、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  26. 少なくとも一方の鎖が少なくとも１個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  27. 少なくとも一方の鎖が少なくとも２個のヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  28. 前記センス鎖の３’端、５’端または３’端と５’端に一価のリンカーまたは分岐した二価のリンカーまたは三価のリンカーによりコンジュゲートされたＣ１６リガンドをさらに含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  29. 前記リガンドが
    Figure 2022515193000130
     であり、
    ここで、Ｂはヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基アナログであり、任意選択でＢは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される、請求項２８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  30. 前記相補性の領域が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０のうちのいずれか１つのアンチセンス配列のうちのいずれか１つを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  31. 前記相補性の領域が、表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６、９、１０～１５、１６Ａ、１６Ｂ、２６および３０のうちのいずれか１つのアンチセンス配列のうちのいずれか１つからなる、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  32. 前記内部位置が、前記鎖の各端から２つの末端位置以外のすべての位置を含む、請求項３～６および８～１０のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  33. 前記内部位置が、前記鎖の各端から３つの末端位置以外のすべての位置を含む、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  34. 前記内部位置は前記センス鎖の切断部位領域を除く、請求項３２または３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  35. 前記内部位置は前記センス鎖の５’端から数えて９～１２個の位置を除く、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  36. 前記内部位置は前記センス鎖の３’端から数えて１１～１３個の位置を除く、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  37. 前記内部位置は前記アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、請求項３２または３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  38. 前記内部位置は前記アンチセンス鎖の５’端から数えて１２～１４個の位置を除く、請求項３７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  39. 前記内部位置は３’端から数えて前記センス鎖の１１～１３個の位置および５’端から数えて前記アンチセンス鎖の１２～１４個の位置を除く、請求項３２または３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  40. １または複数の親油性部分が、以下の内部位置：各鎖の５’端から数えて前記センス鎖の４位～８位および１３位～１８位ならびに前記アンチセンス鎖の６位～１０位および１５位～１８位のうちの１または複数にコンジュゲートされる、請求項３～６のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  41. 前記１または複数の親油性部分が、以下の内部位置：各鎖の５’端から数えて前記センス鎖の５位、６位、７位、１５位および１７位ならびに前記アンチセンス鎖の１５位および１７位のうちの１または複数にコンジュゲートされる、請求項４０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  42. 前記親油性部分が脂肪族、脂環式または多環脂肪族の化合物である、請求項３または４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  43. 前記親油性部分が脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシアノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジンである、請求項３または４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  44. 前記親油性部分が、飽和または不飽和のＣ４～Ｃ３０炭化水素鎖ならびにヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジドおよびアルキンからなる群より選択される任意選択の官能基を含む、請求項３または４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  45. 前記親油性部分が飽和または不飽和のＣ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含む、請求項４４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  46. 前記親油性部分が飽和または不飽和のＣ１６炭化水素鎖を含む、請求項４５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  47. 前記親油性部分が、前記内部位置（１つまたは複数）内の１または複数のヌクレオチドと置き換えられる担体を介してコンジュゲートされる、請求項３または４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  48. 前記担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニルおよびデカリニルからなる群より選択される環式基であるか；またはセリノール骨格もしくはジエタノールアミン骨格を主体とする非環式部分である、請求項４７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  49. 前記親油性部分が、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤に、エーテル、チオエーテル、ウレア、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド結合、クリック反応の生成物またはカルバメートを含有しているリンカーを介してコンジュゲートされる、請求項３～６および８～４８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  50. 前記親油性部分が核酸塩基、糖部分またはヌクレオシド間結合部にコンジュゲートされる、請求項３～６および８～４９のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  51. 前記アンチセンス鎖の５’端にホスフェート部またはホスフェート模倣部をさらに含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  52. 前記ホスフェート模倣部が５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項５１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  53. ＣＮＳ組織への送達を媒介する受容体を標的化する標的化リガンドをさらに含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  54. 前記標的化リガンドがＣ１６リガンドである、請求項５３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  55. 脳組織を標的化する標的化リガンドをさらに含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  56. 前記親油性部分または標的化リガンドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの機能性単糖または機能性オリゴ糖およびその組合せからなる群より選択される生体内切断性リンカーを介してコンジュゲートされる、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  57. 前記センス鎖の３’端がアミンを有する環式基であるエンドキャップによって保護されており、前記環式基が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニルおよびデカリニルからなる群より選択される、請求項３～６および８～５６のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  58. ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチドおよびビニルホスフェート部を含むヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で、以下の修飾部：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチドおよびビニルホスフェート部を含むヌクレオチドの各々を少なくとも１つを含む、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  59. 図１Ａ、図１Ｂ、表２Ａまたは表５Ａに示すようなパターンの修飾ヌクレオチドを含むものである（ここで、２’－Ｃ１６、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ、ホスホロチオエートおよび２’－フルオロ修飾部の位置は、表示されたＲＮＡｉ薬剤の個々のヌクレオチド塩基配列に関係なく図１Ａ、図１Ｂ、表２Ａまたは表５Ａに表示されたとおりである）、前記請求項のいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  60. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、前記鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
    センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    で表され、
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し；
    Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  61. ｉが０であり；ｊが０であり；ｉが１であり；ｊが１であり；ｉとｊがともに０であるか；またはｉとｊがともに１である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  62. ｋが０であり；ｌが０であり；ｋが１であり；ｌが１であり；ｋとｌがともに０であるか；またはｋとｌがともに１である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  63. ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、ＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’に相補的である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  64. 前記ＹＹＹモチーフが前記センス鎖の切断部位または前記センス鎖の切断部位付近に存在する、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  65. 前記Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが前記アンチセンス鎖の５’端から１１位、１２位および１３位に存在する、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  66. 前記Ｙ’が２’－Ｏ－メチルである、請求項６５に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  67. 式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩａ）：
    センス： 5' np-Na-YYY-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa)
    で表されるものである、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  68. 式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｂ）：
    センス： 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIIb)
    で表されるものであり、
    式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、
    請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  69. 式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｃ）：
    センス： 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIc)
    で表されるものであり、
    式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、
    、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  70. 式（ＩＩＩ）が式（ＩＩＩｄ）：
    センス： 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'-nq' 5' (IIId)
    で表されるものであり、
    式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～１０個の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、
    請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  71. 前記二本鎖領域が１５～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  72. 前記二本鎖領域が１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項７１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  73. 前記二本鎖領域が１７～２５ヌクレオチド対の長さである、請求項７１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  74. 前記二本鎖領域が２３～２７ヌクレオチド対の長さである、請求項７１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  75. 前記二本鎖領域が１９～２１ヌクレオチド対の長さである、請求項７１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  76. 前記二本鎖領域が２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  77. 各鎖が１５～３０個のヌクレオチドを有する、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  78. 各鎖が１９～３０個のヌクレオチドを有する、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  79. 前記ヌクレオチドの前記修飾部が、ＬＮＡ、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－ヒドロキシルおよびその組合せからなる群より選択され、好ましくはヌクレオチドの前記修飾部が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、ＧＮＡおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  80. 前記ヌクレオチドの前記修飾部が２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部である、請求項７９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  81. 前記リガンドが、二価または三価の分岐したリンカーにより結合されている１または複数のＣ１６部分である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  82. 前記リガンドが前記センス鎖の３’端、５’端または３’端と５’端に結合している、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  83. 前記薬剤が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  84. 前記ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の３’末端に存在する、請求項８３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  85. 前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項８４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  86. 前記鎖が前記センス鎖である、請求項８４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  87. 前記ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の５’末端に存在する、請求項８３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  88. 前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項８７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  89. 前記鎖が前記センス鎖である、請求項８７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  90. 前記ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の５’末端と３’末端の両方に存在する、請求項８３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  91. 前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項９０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  92. 二重鎖のアンチセンス鎖の５’端の１位の前記塩基対がＡＵ塩基対である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  93. 前記Ｙヌクレオチドが２’－フルオロ修飾部を含む、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  94. 前記Ｙ’ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾部を含む、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  95. ｐ’＞０である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  96. ｐ’＝２である、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  97. ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’個のオーバーハングヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに相補的である、請求項９６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  98. ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０であり、ｐ’個のオーバーハングヌクレオチドが標的ｍＲＮＡに非相補的である、請求項９６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  99. 前記センス鎖が合計２１個のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が合計２３個のヌクレオチドを有する、請求項９０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  100. 少なくとも１個のｎｐ’が、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  101. すべてのｎｐ’が、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されている、請求項１００に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  102. 表２Ａ、２Ｂ、３、５Ａ、５Ｂ、６および９のうちのいずれか１つに列記されたＲＮＡｉ薬剤の群から選択される、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  103. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾部を含む、請求項６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  104. 細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、前記鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
    センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    で表され、
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、前記修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
    Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；および
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  105. 細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、前記鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
    センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    で表され、
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、前記修飾部は２’－Ｏ－メチル、グリコール核酸（ＧＮＡ）または２’－フルオロ修飾部であり；
    Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；および
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされる、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  106. 細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、前記鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
    センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    で表され、
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、前記修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
    Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；および
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、任意選択で前記リガンドは１または複数のＣ１６リガンドである、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  107. 細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、前記鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
    センス： 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
    で表され、
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々、独立して０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～１０個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、前記修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
    Ｎｂの修飾部はＹの修飾部と異なっており、Ｎｂ’の修飾部はＹ’の修飾部と異なっており；
    前記センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；および
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、任意選択で前記リガンドは１または複数のＣ１６リガンドである、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  108. 細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤はアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、ＡＰＰをコードしているｍＲＮＡ部分に相補的な領域を含み、前記鎖の各々は約１４～約３０個のヌクレオチドの長さであり、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は式（ＩＩＩ）：
    センス： 5' np-Na -YYY-Na-nq 3'
    アンチセンス：3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5' (IIIa)
    で表され、
    式中：
    各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は各々、存在していても存在していなくてもよく、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑおよびｑ’は各々、独立して０～６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１個のｎｐ’は、隣り合うヌクレオチドにホスホロチオエート結合を介して連結されており；
    各ＮａおよびＮａ’は独立して、修飾型または非修飾型またはその組合せのいずれかである０～２５個のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、修飾部が異なる少なくとも２個のヌクレオチドを含み；
    ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々、独立して、３つの同一の修飾部をもつ３個の連続したヌクレオチドの１つのモチーフを表し、前記修飾部は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾部であり；
    前記センス鎖は少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；および
    前記センス鎖は少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、任意選択で前記リガンドは１または複数のＣ１６リガンドである、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  109. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、
    前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は、二本鎖領域を形成しているセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾部および２’－フルオロ修飾部からなる群より選択される修飾部を含み、
    前記センス鎖は５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    ｗｈｅｒｅｉｎ 前記アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾部および２’－フルオロ修飾部からなる群より選択される修飾部を含み、
    前記アンチセンス鎖は５’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、および
    前記センス鎖は１または複数のＣ１６リガンドにコンジュゲートされる、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  110. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、
    前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤は、二本鎖領域を形成しているセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖は、配列番号：１～１４のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号：１５～２８のヌクレオチド配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なる、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖は少なくとも１個の３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）を含み、および
    前記アンチセンス鎖は少なくとも１個の３’末端デオキシ－チミンヌクレオチド（ｄＴ）を含む、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  111. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドである、請求項１０９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  112. 各鎖が１９～３０個のヌクレオチドを有する、請求項１０９または１１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  113. ＲＮＡｉ薬剤の前記アンチセンス鎖が、５’領域またはその前駆体の最初の９つのヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも１つの熱不安定化性修飾部を含む、請求項１～１１２のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  114. 二重鎖の前記熱不安定化性修飾部が、
    Figure 2022515193000131
     からなる群より選択され、
    式中、Ｂは核酸塩基である、
    請求項１１４に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  115. 請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を含む細胞。
  116. 請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を含む、ＡＰＰ遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
  117. 前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が、非緩衝溶液中に含めて投与される、請求項１１６に記載の医薬組成物。
  118. 前記非緩衝溶液が生理食塩水または水である、請求項１１７に記載の医薬組成物。
  119. 前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤がバッファー溶液とともに投与される、請求項１１６に記載の医薬組成物。
  120. 前記バッファー溶液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩またはリン酸塩またはその任意の組合せを含む、請求項１１９に記載の医薬組成物。
  121. 前記バッファー溶液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項１１９に記載の医薬組成物。
  122. 請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤および脂質製剤を含む医薬組成物。
  123. 前記脂質製剤がＬＮＰを含む、請求項１２２に記載の医薬組成物。
  124. 細胞内におけるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害する方法であって：
    （ａ）前記細胞を、請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または請求項１１４～１２１のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物と接触させること；および
    （ｂ）工程（ａ）で得られた細胞を、ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解が得られるのに充分な時間維持し、それにより前記細胞内におけるＡＰＰ遺伝子の発現を阻害すること
    を含む方法。
  125. 前記細胞が対象内部に存在する、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記対象がヒトである、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記対象が、アカゲザル、シノモルゴースザル、マウスおよびラットからなる群より選択される、請求項１２５に記載の方法。
  128. 前記ヒト対象がＡＰＰ関連障害に罹患している対象である、請求項１２６に記載の方法。
  129. 前記ＡＰＰ関連疾患が脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）である、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記ＡＰＰ関連障害が早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）である、請求項１２８に記載の方法。
  131. 前記ＡＰＰ関連障害がアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１２８に記載の方法。
  132. 前記ＡＰＰ発現が少なくとも約３０％阻害される、請求項１２４～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. ＡＰＰ発現の低減による恩恵を受けるであろう障害を有する対象の処置方法であって、前記対象に、請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または請求項１１６～１２３のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより前記対象を処置することを含む方法。
  134. 前記対象がＡＰＰ関連障害に罹患している対象である、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記対象がヒトである、請求項１３３に記載の方法。
  136. 前記ＡＰＰ関連疾患が脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）である、請求項１３４に記載の方法。
  137. 前記ＡＰＰ関連疾患が早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）である、請求項１３４に記載の方法。
  138. 前記ＡＰＰ関連疾患がアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１３４に記載の方法。
  139. 前記ＡＰＰ発現が少なくとも約３０％阻害される、請求項１３３～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. さらなる治療用薬剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１３３～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. 前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１３３～１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. 前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤が前記対象に髄腔内投与される、請求項１３３～１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 対象への二本鎖ＲＮＡｉの前記投与によりＡβの蓄積の減少が引き起こされ、任意選択で対象への二本鎖ＲＮＡｉの前記投与によりＡβ（１－４０）および／またはＡβ（１－４２）の蓄積の減少が引き起こされる、請求項１３３～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 対象へのｄｓＲＮＡの前記投与により前記対象においてアミロイドプラークの形成および／または蓄積の減少が引き起こされる、請求項１３３～１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 前記方法により脳または脊椎の組織内での標的遺伝子の発現が低減される、請求項１３３に記載の方法。
  146. 前記脳または脊椎の組織が、皮質、小脳、線条体、頸椎、腰椎および胸椎からなる群より選択される、請求項１４５に記載の方法。
  147. 対象におけるＡＰＰの発現を阻害する方法であって：
    前記対象に請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または請求項１１６～１２３のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより前記対象におけるＡＰＰの発現を阻害することを含む方法。
  148. 対象のＡＰＰ関連疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
    前記対象に請求項１～１１４または１５１～１６８のうちのいずれか１つに記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤または請求項１１６～１２３のうちのいずれか１つに記載の医薬組成物を治療有効量で投与し、それにより前記対象のＡＰＰ関連疾患または障害を処置または予防することを含む方法。
  149. 前記ＡＰＰ関連疾患または障害が、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）からなる群より選択され、任意選択で前記ＡＤが早期発症型家族性アルツハイマー病（ＥＯＦＡＤ）である、請求項１４８に記載の方法。
  150. ａ）前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤、および
    ｂ）使用説明書、および
    ｃ）任意選択で、前記二本鎖ＲＮＡｉ薬剤を対象に投与するための手段
    を備えた、請求項１２４～１４９のうちのいずれか１つに記載の方法を行なうためのキット。
  151. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記アンチセンス鎖は、ＡＤ－３９２９１１、ＡＤ－３９２９１２、ＡＤ－３９２８１６、ＡＤ－３９２７０４、ＡＤ－３９２８４３、ＡＤ－３９２８５５、ＡＤ－３９２８４０、ＡＤ－３９２８３５、ＡＤ－３９２７２９、ＡＤ－３９２９１６、ＡＤ－３９２８７６、ＡＤ－３９２８６３、ＡＤ－３９２９１７、ＡＤ－３９２７８３、ＡＤ－３９２７６５、ＡＤ－３９２７９１、ＡＤ－３９２８００、ＡＤ－３９２７１１、ＡＤ－３９２８０１、ＡＤ－３９２８２６、ＡＤ－３９２８１８、ＡＤ－３９２７９２、ＡＤ－３９２８０２、ＡＤ－３９２７６６、ＡＤ－３９２７６７、ＡＤ－３９２８３４、ＡＤ－３９２９７４、ＡＤ－３９２７８４、ＡＤ－３９２７４４、ＡＤ－３９２７５２、ＡＤ－３９２７３７、ＡＤ－３９２９１８、ＡＤ－３９２９１９、ＡＤ－３９２８０３、ＡＤ－３９２８０４、ＡＤ－３９２８２７、ＡＤ－３９２８２８、ＡＤ－３９２７８５、ＡＤ－３９２８２９、ＡＤ－３９２９２０、ＡＤ－３９２９２１、ＡＤ－３９２７６８、ＡＤ－３９２８０５、ＡＤ－３９２７６９、ＡＤ－３９２７５３、ＡＤ－３９２７１４、ＡＤ－３９２７０３、ＡＤ－３９２７１５、ＡＤ－３９２８３６、ＡＤ－３９２９６６、ＡＤ－３９２８３２、ＡＤ－３９２９７２、ＡＤ－３９２９６１、ＡＤ－３９２９６７、ＡＤ－３９２８９４、ＡＤ－３９２８６４、ＡＤ－３９２８６５、ＡＤ－３９２９２２、ＡＤ－３９２８３３、ＡＤ－３９２９６８、ＡＤ－３９２９６２、ＡＤ－３９２９６３、ＡＤ－３９２９６９、ＡＤ－３９２９７３、ＡＤ－３９２９２３、ＡＤ－３９２８６６、ＡＤ－３９２８７７、ＡＤ－３９２７０７、ＡＤ－３９２９２６、ＡＤ－３９２９２７、ＡＤ－３９２７１７、ＡＤ－３９２７００、ＡＤ－３９２８７８、ＡＤ－３９２７１８、ＡＤ－３９２９２９、ＡＤ－３９２８１９、ＡＤ－３９２７４５、ＡＤ－３９２７７０、ＡＤ－３９２８０６、ＡＤ－３９２７７１、ＡＤ－３９２８２０、ＡＤ－３９２８２１、ＡＤ－３９２７８６、ＡＤ－３９２７７２、ＡＤ－３９２６９９、ＡＤ－３９２８６８、ＡＤ－３９２７１９、ＡＤ－３９２８８０、ＡＤ－３９２９３０、ＡＤ－３９２９３２、ＡＤ－３９２８６９、ＡＤ－３９２８７０、ＡＤ－３９２８９６、ＡＤ－３９２７２０、ＡＤ－３９２７４６、ＡＤ－３９２７７３、ＡＤ－３９２８０７、ＡＤ－３９２７３０、ＡＤ－３９２７２１、ＡＤ－３９２９３３、ＡＤ－３９２８８１、ＡＤ－３９２８９７、ＡＤ－３９２８９８、ＡＤ－３９２８９９、ＡＤ－３９２９３５、ＡＤ－３９２８８２、ＡＤ－３９２７３８、ＡＤ－３９２７３９、ＡＤ－３９２９３６、ＡＤ－３９２９００、ＡＤ－３９２９０１、ＡＤ－３９２９３７、ＡＤ－３９２８８３、ＡＤ－３９２９７５、ＡＤ－３９２９３８、ＡＤ－３９２９０２、ＡＤ－３９２９４１、ＡＤ－３９２９４２、ＡＤ－３９２９４３、ＡＤ－３９２９４４、ＡＤ－３９２９０３、ＡＤ－３９２７７５、ＡＤ－３９２７５８、ＡＤ－３９２９４５、ＡＤ－３９２８８４、ＡＤ－３９２９４７、ＡＤ－３９２７４８、ＡＤ－３９２７５９、ＡＤ－３９２８３７、ＡＤ－３９２９７０、ＡＤ－３９２９７６、ＡＤ－３９２９６５、ＡＤ－３９２８３１、ＡＤ－３９２９０４、ＡＤ－３９２８８５、ＡＤ－３９２８８６、ＡＤ－３９２７７６、ＡＤ－３９２８８７、ＡＤ－３９２７２２、ＡＤ－３９２７６０、ＡＤ－３９２７３１、ＡＤ－３９２７０９、ＡＤ－３９２７２３、ＡＤ－３９２９４８、ＡＤ－３９２７２４、ＡＤ－３９２９４９、ＡＤ－３９２７２５、ＡＤ－３９２９５０、ＡＤ－３９２７３２、ＡＤ－３９２７２６、ＡＤ－３９２８６２、ＡＤ－３９２９５１、ＡＤ－３９２８７１、ＡＤ－３９２８７２、ＡＤ－３９７１８３、ＡＤ－３９７１７５、ＡＤ－３９７１７７、ＡＤ－３９７１７６、ＡＤ－３９７２６０、ＡＤ－３９７２６６、ＡＤ－３９７２６７、ＡＤ－３９７１７８、ＡＤ－３９７１８０、ＡＤ－３９７１８４、ＡＤ－３９７１７９、ＡＤ－３９７２２４、ＡＤ－３９７２２５、ＡＤ－３９７２０３、ＡＤ－３９７１８５、ＡＤ－３９７１９５、ＡＤ－３９７２０４、ＡＤ－３９７１９１、ＡＤ－３９７２５１、ＡＤ－３９７２４０、ＡＤ－３９７２０５、ＡＤ－３９７２５４、ＡＤ－３９７２５９、ＡＤ－３９７２４７、ＡＤ－３９７２３３、ＡＤ－３９７１８１、ＡＤ－３９７１９６、ＡＤ－３９７１９７、ＡＤ－３９７２２６、ＡＤ－３９７２１２、ＡＤ－３９７１８２、ＡＤ－３９７２２７、ＡＤ－３９７２１７、ＡＤ－３９７２１３、ＡＤ－３９７２２９、ＡＤ－３９７２６４、ＡＤ－３９７２６５、ＡＤ－３９７２０９、ＡＤ－３９７１９２、ＡＤ－３９７２１０、ＡＤ－３９７２１９、ＡＤ－３９７２１４、ＡＤ－３９７２２０、ＡＤ－３９７２３０、ＡＤ－３９７２３１、ＡＤ－３９７１９３、ＡＤ－３９７１９０、ＡＤ－３９７２００、ＡＤ－３９７２４８、ＡＤ－３９７２０７、ＡＤ－３９７２１１、ＡＤ－３９７２４３、ＡＤ－３９７２４６、ＡＤ－３９７２２３、ＡＤ－３９７２０２、ＡＤ－３９７２５６、ＡＤ－３９７２５７、ＡＤ－３９７２５８、ＡＤ－３９７２５０ ＡＤ－３９７２４４、ＡＤ－４５４９７２、ＡＤ－４５４９７３、ＡＤ－４５４８４２、ＡＤ－４５４８４３、ＡＤ－４５４８４４、ＡＤ－９９４３７９、ＡＤ－９６１５８３、ＡＤ－９６１５８４、ＡＤ－９６１５８５およびＡＤ－９６１５８６からなる群より選択される二重鎖のアンチセンス鎖核酸塩基配列のうちのいずれか１つと３個以下のヌクレオチドが異なり、少なくとも１５個の隣接するヌクレオチドを含む相補性の領域を有する、
    二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  152. ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびビニルホスホネート（ＶＰ）からなる群より選択される１または複数の修飾部を含み、任意選択で、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、ホスホロチオエートおよびビニルホスホネート（ＶＰ）からなる群より選択される各修飾を少なくとも１つ含む、請求項１５１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  153. ４以上のＰＳ修飾部、任意選択で６～１０のＰＳ修飾部、任意選択で８つのＰＳ修飾部を含む、請求項１５１または請求項１５２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  154. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々のそれぞれの３’末端および５’末端の最後から２番目と最後のヌクレオチド間結合に位置する８つのＰＳ修飾部を含む、請求項１５３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  155. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が、ＧＮＡを構成するヌクレオチドを１個だけ含み、任意選択で、ＧＮＡを構成する前記ヌクレオチドが前記アンチセンス鎖に、前記アンチセンス鎖の５’末端から７番目の核酸塩基の残基に位置する、請求項１５１～１５４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  156. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が１～４つの２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で前記２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドは２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドであり、任意選択でＲＮＡｉ薬剤は単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で前記単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドは前記センス鎖に、前記センス鎖の５’末端から６番目の核酸塩基の位置または前記５’端の末端核酸塩基の位置に位置する、請求項１５１～１５５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  157. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、任意選択でＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々は２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で前記２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは前記センス鎖に前記センス鎖の５’末端から７位、９位、１０位および１１位の核酸塩基に、ならびに前記アンチセンス鎖に前記アンチセンス鎖の５’末端から２位、１４位および１６位の核酸塩基に位置する、請求項１５１～１５６のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  158. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が１または複数のＶＰ修飾部を含み、任意選択でＲＮＡｉ薬剤は単一のＶＰ修飾を前記アンチセンス鎖の５’末端に含む、請求項１５１～１５７のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  159. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、任意選択でＲＮＡｉ薬剤は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを、２’－フルオロ、２’－Ｃ－アルキルまたはグリコール核酸（ＧＮＡ）で修飾されていないすべての核酸塩基の場所に含み、任意選択で前記２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、前記センス鎖に前記センス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、８位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位および２１位に、ならびに前記アンチセンス鎖に前記アンチセンス鎖の５’末端から１位、３位、４位、５位、６位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位および２３位に位置する、請求項１５１～１５８のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  160. アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤であって、前記ＲＮＡｉ薬剤はセンス鎖とアンチセンス鎖を含み、
    前記アンチセンス鎖が、ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の１８９１～１９１９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２２８２～２３０６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２４６４～２４９４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２４７５～２６３８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２６２１～２６８９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２６８２～２７２５位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７０５～２７４６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７２６～２７７１位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７５４～２７８８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２７８２～２８１３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８０１～２８２６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８４７～２８９０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８７１～２８９６位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２８８２～２９６０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２９４２～２９７１位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の２９５１～３０５７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３１７２～３２２３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３２０９～３２３５位；ＮＭ＿００４８４の３２５６～３２８９位；ＮＭ＿００４８４の３３０２～３３３８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３３１８～３３５３位；ＡＰＰ ＮＭ＿００４８４の３３３４～３３６１位、ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２５１～２８４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の３６２～４０４位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の４７１～５１０位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の５３２～５８７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の６０１～６４９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の６３３～６６２位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１３５１～１３８８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１６０９～１６４９位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１６７５～１６９８位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の１７５２～１７８７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２１６５～２２１７位；ＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２２８０～２３４４位；およびＡＰＰ ＮＭ＿００１１９８８２３．１の２４０３～２４３１位からなる群より選択される標的ＡＰＰ配列に、ＡＰＰノックダウンをもたらすのに充分に相補的である少なくとも１５個隣接している核酸塩基の長さの領域を含み、かつ前記ＡＰＰ標的配列に、ＡＰＰノックダウンをもたらすのに充分に相補的な前記少なくとも１５個隣接している核酸塩基において３個以下のヌクレオチドが異なる、二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）薬剤。
  161. ２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、ホスホロチオエート（ＰＳ）およびビニルホスホネート（ＶＰ）からなる群より選択される１または複数の修飾部を含み、任意選択で、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、ホスホロチオエートおよびビニルホスホネート（ＶＰ）からなる群より選択される各修飾を少なくとも１つ含む、請求項１６０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  162. ４以上のＰＳ修飾部、任意選択で６～１０のＰＳ修飾部、任意選択で８つのＰＳ修飾部を含む、請求項１６０または請求項１６１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  163. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々のそれぞれの３’末端および５’末端の最後から２番目と最後のヌクレオチド間結合に位置する８つのＰＳ修飾部を含む、請求項１６２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  164. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が、ＧＮＡを構成するヌクレオチドを１個だけ含み、任意選択で前記ＧＮＡを構成するヌクレオチドは前記アンチセンス鎖に前記アンチセンス鎖の５’末端から７番目の核酸塩基の残基に位置する、請求項１６０～１６３のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  165. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が１～４つの２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で前記２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチドは２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドであり、任意選択でＲＮＡｉ薬剤は単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で前記単一の２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドは前記センス鎖に前記センス鎖の５’末端から６番目の核酸塩基の位置または前記５’端の末端核酸塩基の位置に位置する、請求項１６０～１６４のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  166. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が、２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、任意選択でＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々は２以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含み、任意選択で前記２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは前記センス鎖に前記センス鎖の５’末端から７位、９位、１０位および１１位の核酸塩基に、ならびに前記アンチセンス鎖に前記アンチセンス鎖の５’末端から２位、１４位および１６位の核酸塩基に位置する、請求項１６０～１６５のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  167. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が１または複数のＶＰ修飾部を含み、任意選択でＲＮＡｉ薬剤は単一のＶＰ修飾を前記アンチセンス鎖の５’末端に含む、請求項１６０～１６６のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
  168. ＲＮＡｉ薬剤の前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が５’末端および３’末端を含み、ＲＮＡｉ薬剤が２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、任意選択でＲＮＡｉ薬剤は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを、２’－フルオロ、２’－Ｃ－アルキルまたはグリコール核酸（ＧＮＡ）で修飾されていないすべての核酸塩基の位置に含み、任意選択で前記２以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは前記センス鎖に前記センス鎖の５’末端から１位、２位、３位、４位、５位、８位、１２位、１３位、１４位、１５位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位および２１位に、ならびに前記アンチセンス鎖に前記アンチセンス鎖の５’末端から１位、３位、４位、５位、６位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１３位、１５位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２２位および２３位に位置する、請求項１６０～１６７のいずれか一項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ薬剤。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107158445B (zh) 2012-05-29 2021-01-15 3M创新有限公司 包括聚合物泡沫和中间体的吸收制品
US11732260B2 (en) 2018-03-02 2023-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of amyloid-β precursor protein
KR20230043914A (ko) * 2020-07-28 2023-03-31 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 App 발현을 감소시키기 위한 화합물 및 방법
EP4284390A1 (en) * 2021-01-29 2023-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing amyloid precursor protein (app)
EP4399311A2 (en) * 2021-09-10 2024-07-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. App irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing diseases characterized by enlarged endosomes
TW202333750A (zh) * 2021-11-08 2023-09-01 美商黛瑟納製藥公司 ＲＮＡｉ寡核苷酸共軛體
WO2023173061A2 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 University Of Massachusetts Oligonucleotides for app modulation
WO2023207615A1 (zh) * 2022-04-26 2023-11-02 南京明德新药研发有限公司 一类含由天然核苷酸组成突出端的双链RNAi化合物
WO2023224979A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-23 University Of Massachusetts Optimized sirna scaffolds
WO2023230465A1 (en) * 2022-05-23 2023-11-30 Switch Therapeutics Inc. Antisense oligonucleotides

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003350A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-13 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF ALZHEIMER’S DISEASE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080032942A1 (en) * 2000-08-30 2008-02-07 Mcswiggen James RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
US20050209179A1 (en) * 2000-08-30 2005-09-22 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering nucleic acid (siNA)
EP2314690A1 (en) 2002-07-10 2011-04-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
US7851615B2 (en) * 2003-04-17 2010-12-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipophilic conjugated iRNA agents
GB0324854D0 (en) * 2003-10-24 2003-11-26 Expresson Biosystems Ltd App/ena antisense
WO2009113579A1 (ja) * 2008-03-11 2009-09-17 学校法人埼玉医科大学 癌の予防乃至治療に好適な二本鎖核酸分子、癌細胞増殖抑制剤、並びに医薬
US8778904B2 (en) * 2009-12-09 2014-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the CNS
US20130253168A1 (en) * 2010-08-31 2013-09-26 Steven L. Colletti Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
WO2013180038A1 (ja) * 2012-05-26 2013-12-05 株式会社ボナック デリバリー機能を有する遺伝子発現制御用の一本鎖核酸分子
RS56783B9 (sr) * 2012-12-05 2021-12-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Sastavi pcsk9 irnk i postupci njihovih primena
JP7289610B2 (ja) * 2014-08-20 2023-06-12 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 修飾二本鎖ｒｎａ剤
JOP20200115A1 (ar) * 2014-10-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات وطرق لتثبيط التعبير الجيني عن hao1 (حمض أوكسيداز هيدروكسيلي 1 (أوكسيداز جليكولات))
WO2017064308A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for use in treating alzheimer's disease
JP7353301B2 (ja) * 2018-05-07 2023-09-29 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド 肝臓外送達
WO2020160163A1 (en) * 2019-01-29 2020-08-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing app expression
US20220307024A1 (en) * 2019-06-17 2022-09-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Delivery of oligonucleotides to the striatum

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005003350A2 (en) * 2003-06-27 2005-01-13 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF ALZHEIMER’S DISEASE USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)

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