BR112021011895A2 - Agente de ácido ribonucleico de duplo filamento (rnai), agente de rnai de duplo filamento, célula, composição farmacêutica, método e kit - Google Patents

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Kevin Fitzgerald
Kirk Brown
Jayaprakash Nair
Martin Maier
Vasant Jadhav
Mark Keating
Adam Castoreno
Patrick Haslett
Mangala Meenakshi Soundarapandian
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Abstract

agente de ácido ribonucleico de duplo filamento (rnai), agente de rnai de duplo filamento, célula, composição farmacêutica, método e kit. a revelação refere-se a agentes de ácido ribonucleico de duplo filamento (dsrnai) e às composições que têm como alvo o gene de app, assim como aos métodos para inibir a expressão de um gene de app e aos métodos para tratar indivíduos que têm uma doença ou distúrbio associados à app, tais como angiopatia amiloide cerebral (caa) e doença de alzheimer familiar de início precoce (eofad ou efad), com o uso de tais agentes e composições de dsrnai.

Description

AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, CÉLULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO E KIT
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente revelação refere-se geralmente a agentes de RNAi que têm como alvo a APP e métodos.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi depositada eletronicamente no formato ASCII e é, através deste, incorporada a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 18 de dezembro de 2019, é nomeada 53433_500WO01_SequenceListing_ST25.txt e tem 632 kB de tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] O gene de proteína precursora de amiloide (APP) codifica uma proteína de membrana integral expressa em neurônios e glia. Embora a função primária da APP seja desconhecida, as formas clivadas pela secretase de APP - particularmente as formas de clivagem Aβ de APP, por exemplo, Aβ (1-42) (também conhecido como Aβ42) e Aβ (1-40) (também conhecido como Aβ40) comumente encontradas como proteína predominante nas placas de beta amiloide - há muito tempo são descritas como associadas ao desenvolvimento e progressão da doença de Alzheimer (DA) em indivíduos afetados. De fato, a identificação de placas de beta amiloide em um sujeito é necessária para o diagnóstico patológico de DA. As formas de clivagem Aβ de APP foram particularmente descritas como desempenhando um papel crítico e até causal no desenvolvimento de duas doenças relacionadas/associadas à DA: angiopatia amiloide cerebral (CAA) e doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD ou eFAD).
[004] A inibição da expressão e/ou atividade de APP com um agente que pode inibir de forma seletiva e eficaz a APP e, assim, bloquear ou amortecer a produção e/ou níveis de formas de clivagem de Aβ de APP, seria útil para prevenir ou tratar uma variedade de doenças e distúrbios associados à APP, incluindo DA, CAA e EOFAD, entre outros.
[005] As opções de tratamento atuais para doenças e distúrbios associados à APP são limitadas e amplamente ineficazes. Não existem terapias existentes para CAA hereditário e as tentativas de tratar as formas esporádicas de DA e EOFAD até agora não tiveram sucesso - por exemplo, todos os ensaios de inibidores de BACE1 (β-secretase) para o tratamento de DA esporádica falharam até agora (Egan et al. The New England Journal of Medicine, 378: 1.691 a 1.703; Hung e Fu. Journal of Biomedical Science, 24: 47). Enquanto isso, uma série de imunoterapias direcionadas por Aβ estão em várias fases de desenvolvimento, enquanto uma série de programas de inibidores da γ-secretase humana foram interrompidos por toxicidade (Selkoe e Hardy. EMBO Molecular Medicine, 8: 595 a 608). Até o momento, os tratamentos farmacológicos aprovados para doenças ou distúrbios associados à APP são direcionados ao tratamento de sintomas, não à prevenção ou cura, e tais tratamentos são de eficácia limitada, particularmente conforme doenças ou distúrbios associados à APP avançam em um indivíduo afetado. Portanto, há uma necessidade de terapias para sujeitos que sofrem de doenças e distúrbios associados à APP, incluindo uma necessidade particular de terapias para sujeitos que sofrem de CAA e EOFAD hereditários.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[006] A presente revelação fornece composições de RNAi que afetam a clivagem de transcritos de RNA mediada por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de um gene de proteína precursora de amiloide (APP). O gene de APP pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um sujeito, como um humano. A presente revelação também fornece métodos de uso das composições de RNAi da revelação para inibir a expressão de um gene de APP e/ou para tratar um sujeito que poderia se beneficiar da inibição ou redução da expressão de um gene de APP, por exemplo, um sujeito que está sofrendo ou propenso a sofrer de uma doença associada à APP, por exemplo, angiopatia amiloide cerebral (CAA) ou doença de Alzheimer (DA), por exemplo, doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
[007] Consequentemente, em um aspecto, a presente revelação fornece um agente de ácido ribonucleico de duplo filamento (RNAi) para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), onde o agente de RNAi inclui um filamento sensor e um filamento antissenso, e onde o filamento antissenso inclui uma região de complementaridade que inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissenso listadas em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26 e 30. Em determinadas modalidades, diferenças de timina para uracila e/ou uracila para timina entre sequências alinhadas (comparadas) não contam como nucleotídeos que se diferem entre as sequências alinhadas (comparadas).
[008] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de dsRNA inclui um filamento sensor e um filamento antissenso, em que o filamento sensor inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de filamento sensor apresentadas nas Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10- 15, 16A, 16B, 26 e 30; e em que o filamento antissenso inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos de filamento antissenso apresentadas nas Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26 e 30.
[009] Em uma modalidade, pelo menos um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi de duplo filamento inclui um ou mais grupamentos lipofílicos conjugados a uma ou mais posições internas de nucleotídeo, opcionalmente por meio de um ligante ou carreador.
[010] Um aspecto adicional da revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de dsRNA inclui um filamento sensor e um filamento antissenso, em que o filamento sensor inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1-14, em que uma substituição de uma uracila por qualquer timina das SEQ ID NOs: 1-14 (ao comparar sequências alinhadas) não conta como uma diferença que contribui para a diferença em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1- 14; e em que o filamento antissenso inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 15-28, em que uma substituição de uma uracila por qualquer timina das SEQ ID NOs: 15-28 (ao comparar sequências alinhadas) não conta como uma diferença que contribui para a diferença em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 15-28, em que pelo menos um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso inclui um ou mais grupamentos lipofílicos conjugados a uma ou mais posições internas de nucleotídeo, opcionalmente por meio de um ligante ou carreador.
[011] Em uma modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento sensor inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de filamento sensor de um AD-392911, AD-392912, AD-392816, AD- 392704, AD-392843, AD-392855, AD-392840, AD-392835, AD-392729, AD-392916, AD-392876, AD-392863, AD-392917, AD-392783, AD- 392765, AD-392791, AD-392800, AD-392711, AD-392801, AD-392826, AD-392818, AD-392792, AD-392802, AD-392766, AD-392767, AD- 392834, AD-392974, AD-392784, AD-392744, AD-392752, AD-392737, AD-392918, AD-392919, AD-392803, AD-392804, AD-392827, AD- 392828, AD-392785, AD-392829, AD-392920, AD-392921, AD-392768, AD-392805, AD-392769, AD-392753, AD-392714, AD-392703, AD- 392715, AD-392836, AD-392966, AD-392832, AD-392972, AD-392961, AD-392967, AD-392894, AD-392864, AD-392865, AD-392922, AD- 392833, AD-392968, AD-392962, AD-392963, AD-392969, AD-392973, AD-392923, AD-392866, AD-392877, AD-392707, AD-392926, AD- 392927, AD-392717, AD-392700, AD-392878, AD-392718, AD-392929, AD-392819, AD-392745, AD-392770, AD-392806, AD-392771, AD- 392820, AD-392821, AD-392786, AD-392772, AD-392699, AD-392868,
AD-392719, AD-392880, AD-392930, AD-392932, AD-392869, AD- 392870, AD-392896, AD-392720, AD-392746, AD-392773, AD-392807, AD-392730, AD-392721, AD-392933, AD-392881, AD-392897, AD- 392898, AD-392899, AD-392935, AD-392882, AD-392738, AD-392739, AD-392936, AD-392900, AD-392901, AD-392937, AD-392883, AD- 392975, AD-392938, AD-392902, AD-392941, AD-392942, AD-392943, AD-392944, AD-392903, AD-392775, AD-392758, AD-392945, AD- 392884, AD-392947, AD-392748, AD-392759, AD-392837, AD-392970, AD-392976, AD-392965, AD-392831, AD-392904, AD-392885, AD- 392886, AD-392776, AD-392887, AD-392722, AD-392760, AD-392731, AD-392709, AD-392723, AD-392948, AD-392724, AD-392949, AD- 392725, AD-392950, AD-392732, AD-392726, AD-392862, AD-392951, AD-392871, AD-392872, AD-397183, AD-397175, AD-397177, AD- 397176, AD-397260, AD-397266, AD-397267, AD-397178, AD-397180, AD-397184, AD-397179, AD-397224, AD-397225, AD-397203, AD- 397185, AD-397195, AD-397204, AD-397191, AD-397251, AD-397240, AD-397205, AD-397254, AD-397259, AD-397247, AD-397233, AD- 397181, AD-397196, AD-397197, AD-397226, AD-397212, AD-397182, AD-397227, AD-397217, AD-397213, AD-397229, AD-397264, AD- 397265, AD-397209, AD-397192, AD-397210, AD-397219, AD-397214, AD-397220, AD-397230, AD-397231, AD-397193, AD-397190, AD- 397200, AD-397248, AD-397207, AD-397211, AD-397243, AD-397246, AD-397223, AD-397202, AD-397256, AD-397257, AD-397258, AD- 397250, AD-397244, AD-454972, AD-454973, AD-454842, AD-454843, AD-454844, AD-994379, AD-961583, AD-961584, AD-961585 ou AD- 961586 duplex.
[012] Em outra modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento antissenso inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos antissenso de um AD-392911, AD-
392912, AD-392816, AD-392704, AD-392843, AD-392855, AD-392840, AD-392835, AD-392729, AD-392916, AD-392876, AD-392863, AD- 392917, AD-392783, AD-392765, AD-392791, AD-392800, AD-392711, AD-392801, AD-392826, AD-392818, AD-392792, AD-392802, AD- 392766, AD-392767, AD-392834, AD-392974, AD-392784, AD-392744, AD-392752, AD-392737, AD-392918, AD-392919, AD-392803, AD- 392804, AD-392827, AD-392828, AD-392785, AD-392829, AD-392920, AD-392921, AD-392768, AD-392805, AD-392769, AD-392753, AD- 392714, AD-392703, AD-392715, AD-392836, AD-392966, AD-392832, AD-392972, AD-392961, AD-392967, AD-392894, AD-392864, AD- 392865, AD-392922, AD-392833, AD-392968, AD-392962, AD-392963, AD-392969, AD-392973, AD-392923, AD-392866, AD-392877, AD- 392707, AD-392926, AD-392927, AD-392717, AD-392700, AD-392878, AD-392718, AD-392929, AD-392819, AD-392745, AD-392770, AD- 392806, AD-392771, AD-392820, AD-392821, AD-392786, AD-392772, AD-392699, AD-392868, AD-392719, AD-392880, AD-392930, AD- 392932, AD-392869, AD-392870, AD-392896, AD-392720, AD-392746, AD-392773, AD-392807, AD-392730, AD-392721, AD-392933, AD- 392881, AD-392897, AD-392898, AD-392899, AD-392935, AD-392882, AD-392738, AD-392739, AD-392936, AD-392900, AD-392901, AD- 392937, AD-392883, AD-392975, AD-392938, AD-392902, AD-392941, AD-392942, AD-392943, AD-392944, AD-392903, AD-392775, AD- 392758, AD-392945, AD-392884, AD-392947, AD-392748, AD-392759, AD-392837, AD-392970, AD-392976, AD-392965, AD-392831, AD- 392904, AD-392885, AD-392886, AD-392776, AD-392887, AD-392722, AD-392760, AD-392731, AD-392709, AD-392723, AD-392948, AD- 392724, AD-392949, AD-392725, AD-392950, AD-392732, AD-392726, AD-392862, AD-392951, AD-392871, AD-392872, AD-397183, AD- 397175, AD-397177, AD-397176, AD-397260, AD-397266, AD-397267, AD-397178, AD-397180, AD-397184, AD-397179, AD-397224, AD-
397225, AD-397203, AD-397185, AD-397195, AD-397204, AD-397191, AD-397251, AD-397240, AD-397205, AD-397254, AD-397259, AD- 397247, AD-397233, AD-397181, AD-397196, AD-397197, AD-397226, AD-397212, AD-397182, AD-397227, AD-397217, AD-397213, AD- 397229, AD-397264, AD-397265, AD-397209, AD-397192, AD-397210, AD-397219, AD-397214, AD-397220, AD-397230, AD-397231, AD- 397193, AD-397190, AD-397200, AD-397248, AD-397207, AD-397211, AD-397243, AD-397246, AD-397223, AD-397202, AD-397256, AD- 397257, AD-397258, AD-397250, AD-397244, AD-454972, AD-454973, AD-454842, AD-454843, AD-454844, AD-994379, AD-961583, AD- 961584, AD-961585 ou AD-961586 duplex.
[013] Opcionalmente, o agente de RNAi de duplo filamento inclui pelo menos um nucleotídeo modificado.
[014] Em determinadas modalidades, a lipofilicidade do grupamento lipofílico, medida por logKow, excede 0.
[015] Em algumas modalidades, a hidrofobicidade do agente de RNAi de duplo filamento, medida pela fração não ligada em um ensaio de ligação de proteína de plasma do agente de RNAi de duplo filamento, excede 0,2. Em uma modalidade relacionada, o ensaio de ligação de proteína de plasma é um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética usando proteína humana de albumina sérica.
[016] Em determinadas modalidades, todos os nucleotídeos do filamento sensor são nucleotídeos modificados.
[017] Em algumas modalidades, substancialmente todos os nucleotídeos do filamento antissenso são nucleotídeos modificados. Opcionalmente, todos os nucleotídeos do filamento sensor são nucleotídeos modificados.
[018] Em determinadas modalidades, todos os nucleotídeos do filamento antissenso são nucleotídeos modificados. Opcionalmente, todos os nucleotídeos do filamento sensor e todos os nucleotídeos do filamento antissenso são nucleotídeos modificados.
[019] Em uma modalidade, pelo menos um dos nucleotídeos modificados é um desoxinucleotídeo, um nucleotídeo de 3’-terminal desoxitimina (dT), um nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’- flúor, um 2’-desoxinucleotídeo modificado, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo restrito de forma conformacional, um nucleotídeo de etila restringida, um nucleotídeo abásico, um 2’-amino-nucleotídeo modificado, um nucleotídeo modificado de 2’-O-alila, nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, nucleotídeo modificado de 2’-hidroxila, um nucleotídeo modificado de 2’-metoxietila, um nucleotídeo modificado de 2’-O-alquila, um nucleotídeo de morfolina, um fosforamidato, um nucleotídeo que compreende uma base não natural, um nucleotídeo modificado de tetraidropirano, um nucleotídeo modificado de 1,5-anidro- hexitol, um nucleotídeo modificado de ciclo-hexenila, um nucleotídeo que compreende um grupo 5’-fosforotioato, um nucleotídeo que compreende um grupo 5’-metilfosfonato, um nucleotídeo que compreende um 5’ fosfato ou mímico de 5’ fosfato, um nucleotídeo que compreende fosfato de vinila, um nucleotídeo que compreende ácido glicolnucleico de adenosina (GNA), um nucleotídeo que compreende isômero S de ácido glicolnucleico de timidina (GNA), um nucleotídeo que compreende 2-hidroximetil-tetraidrofurano-5-fosfato, um nucleotídeo que compreende 2’-desoxitimidina-3’fosfato, um nucleotídeo que compreende 2’-desoxiguanosina-3’-fosfato ou um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila e/ou um grupo de ácido dodecanoico de bisdecilamida.
[020] Em uma modalidade relacionada, o nucleotídeo modificado é um nucleotídeo modificado de 2’- desoxi-2’-flúor, um 2’-desoxinucleotídeo modificado, nucleotídeos de 3’-terminal desoxitimina (dT), um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um 2’-amino-nucleotídeo modificado, um nucleotídeo modificado de 2’-alquila, um nucleotídeo de morfolina, um fosforamidato e/ou um nucleotídeo que compreende uma base não natural.
[021] Em uma modalidade, o nucleotídeo modificado inclui uma sequência curta de nucleotídeos de 3’- terminal desoxitimina (dT).
[022] Em outra modalidade, as modificações nos nucleotídeos são modificações de 2’-O-metila, 2’flúor e GNA.
[023] Em uma modalidade adicional, o agente de RNAi de duplo filamento inclui pelo menos uma ligação de internucleotídeo de fosforotioato. Opcionalmente, o agente de RNAi de duplo filamento inclui 6 a 8 ligações de internucleotídeo de fosforotioato.
[024] Em determinadas modalidades, a região de complementaridade é de pelo menos 17 nucleotídeos em comprimento. Opcionalmente, a região de complementaridade é de 19 a 23 nucleotídeos em comprimento. Opcionalmente, a região de complementaridade é de 19 nucleotídeos em comprimento.
[025] Em uma modalidade, cada filamento é de não mais que 30 nucleotídeos em comprimento.
[026] Em outra modalidade, pelo menos um filamento inclui uma projeção 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo. Opcionalmente, pelo menos um filamento inclui uma projeção 3’
de pelo menos 2 nucleotídeos.
[027] Em determinadas modalidades, o agente de RNAi de duplo filamento inclui ainda um ligante C16 conjugado à extremidade 3’, à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ e à extremidade 5’ do filamento sensor através de um ligante monovalente ou bivalente ramificado ou trivalente.
[028] Em uma modalidade, o ligante é ,
[029] em que B é uma base de nucleotídeo ou um análogo de base de nucleotídeo, em que B é opcionalmente adenina, guanina, citosina, timina ou uracila.
[030] Em outra modalidade, a região de complementaridade inclui qualquer uma das sequências antissenso em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26 e 30.
[031] Em uma modalidade adicional, a região de complementaridade é aquela de qualquer uma das sequências antissenso em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26 e 30.
[032] Em algumas modalidades, as posições internas de nucleotídeo incluem todas as posições, exceto as duas posições terminais de cada extremidade do filamento.
[033] Em uma modalidade relacionada, as posições internas incluem todas as posições, exceto as três posições terminais de cada extremidade do filamento. Opcionalmente, as posições internas excluem a região de sítio de clivagem do filamento sensor.
[034] Em uma modalidade, as posições internas excluem as posições 9 a 12, contando a partir da extremidade 5’ do filamento sensor.
[035] Em outra modalidade, as posições internas excluem as posições 11 a 13, contando a partir da extremidade 3’ do filamento sensor. Opcionalmente, as posições internas excluem a região de sítio de clivagem do filamento antissenso.
[036] Em uma modalidade, as posições internas excluem as posições 12 a 14, contando a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso.
[037] Em outra modalidade, as posições internas excluem as posições 11 a 13 no filamento sensor, contando a partir da extremidade 3’, e as posições 12 a 14 no filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’.
[038] Em uma modalidade adicional, um ou mais grupamentos lipofílicos são conjugados a uma ou mais das seguintes posições internas: posições 4 a 8 e 13 a 18 no filamento sensor, e posições 6 a 10 e 15 a 18 no filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’ de cada filamento. Opcionalmente, um ou mais grupamentos lipofílicos são conjugados a uma ou mais das seguintes posições internas: posições 5, 6, 7, 15 e 17 no filamento sensor, e posições 15 e 17 no filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’ de cada filamento.
[039] Em determinadas modalidades, o grupamento lipofílico é um composto alifático, alicíclico ou polialicíclico. Opcionalmente, o grupamento lipofílico é lipídio, colesterol, ácido retinoico, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1-pireno butírico, di- idrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, geraniloxi- hexianol, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3- (oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina.
[040] Em algumas modalidades, o grupamento lipofílico contém uma cadeia de hidrocarboneto C4-C30 saturada ou insaturada, e um grupo funcional opcional selecionado que é hidroxila, amina, ácido carboxílico, sulfonato, fosfato, tiol, azida e/ou alquino.
[041] Em determinadas modalidades, o grupamento lipofílico contém uma cadeia de hidrocarboneto C6-C18 saturada ou insaturada. Opcionalmente, o grupamento lipofílico contém uma cadeia de hidrocarboneto C16 saturada ou insaturada. Em uma modalidade relacionada, o grupamento lipofílico é conjugado por meio de um carreador que substitui um ou mais nucleotídeos na posição interna (ou nas posições internas). Em determinadas modalidades, o carreador é um grupo cíclico que é pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolanila, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetra-hidrofuranila ou decalinila; ou é um grupamento acíclico com base em uma cadeia principal de serinol ou uma cadeia principal de dietanolamina.
[042] Em algumas modalidades, o grupamento lipofílico é conjugado ao agente de RNAi de duplo filamento por meio de um ligante contendo um éter, tioéter, ureia, carbonato, amina, amida, tioéter de maleimida, dissulfeto,
fosfodiéster, ligação de sulfonamida, um produto de uma reação click ou carbamato.
[043] Em uma modalidade, o grupamento lipofílico é conjugado a uma nucleobase, grupamento de açúcar ou ligação internucleosídica.
[044] Em outra modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento inclui ainda um fosfato ou mímico de fosfato na extremidade 5’ do filamento antissenso. Opcionalmente, o mímico de fosfato é um fosfonato de 5’-vinila (VP).
[045] Em determinadas modalidades, o agente de RNAi de duplo filamento inclui ainda um ligante de alvejamento que se direciona a um receptor que medeia a aplicação a um tecido CNS. Em uma modalidade, o ligante de alvejamento é um ligante C16.
[046] Em algumas modalidades, o agente de RNAi de duplo filamento inclui ainda um ligante de alvejamento que se direciona a um tecido cerebral.
[047] Em uma modalidade, o grupamento lipofílico ou ligante de alvejamento é conjugado por meio de um ligante bioclivável que é DNA, RNA, dissulfeto, amida, monossacarídeos ou oligossacarídeos funcionalizados de galactosamina, glicosamina, glicose, galactose, manose e/ou uma combinação dos mesmos.
[048] Em uma modalidade relacionada, a extremidade 3’ do filamento sensor é protegida por meio de uma tampa de extremidade que é um grupo cíclico com uma amina, em que o grupo cíclico é pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolanila, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila,
isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetra- hidrofuranila ou decalinila.
[049] Em uma modalidade, o agente de RNAi inclui pelo menos um nucleotídeo modificado que é um nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’- flúor, um nucleotídeo que inclui um ácido glicolnucleico (GNA) e/ou um nucleotídeo que inclui um fosfato de vinila. Opcionalmente, o agente de RNAi inclui pelo menos um dentre cada uma das seguintes modificações: nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’-flúor, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA) e um nucleotídeo que compreende fosfato de vinila.
[050] Em outra modalidade, o agente de RNAi inclui um padrão de nucleotídeos modificados como mostrado na Figura 1A, Figura 1B, Tabela 2A, Tabela 5A ou Tabela 9 (em que as localizações das modificações 2’-C16, 2’-O-metila, GNA, fosforotioato e 2’-flúor são como apresentadas na Figura 1A, Figura 1B, Tabela 2A, Tabela 5A ou Tabela 9, independentemente das sequências de base de nucleotídeo individual dos agentes de RNAi apresentados).
[051] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o filamento antissenso inclui uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cada filamento é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de duplo filamento é representado pela fórmula (III):
[052] sensora: 5' np -Na -(XXX)i-Nb-YYY-Nb -(ZZZ)j -Na - nq 3'
[053] antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III)
[054] em que:
[055] i, j, k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1;
[056] p, p’, q e q′ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[057] cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 25 nucleotídeos, que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, em que cada sequência inclui pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[058] cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos que inclui 0 a 10 nucleotídeos, que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[059] cada np, np′, nq e nq′, cada um dos quais pode ou pode não estar presente, representa, independentemente, um nucleotídeo de projeção;
[060] XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′, representam, cada um, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos;
[061] modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e
[062] em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante.
[063] Em uma modalidade, i é 0; j é 0; i é 1; j é 1; tanto i quanto j são 0; ou i e j são 1.
[064] Em outra modalidade, k é 0; l é 0; k é 1; l é 1; k e l são 0; ou k e l são 1.
[065] Em determinadas modalidades, XXX é complementar a X′X′X′, YYY é complementar a Y′Y′Y′ e ZZZ é complementar a Z′Z′Z′.
[066] Em outra modalidade, o motivo YYY ocorre em ou próximo ao sítio de clivagem do filamento sensor.
[067] Em uma modalidade adicional, o motivo Y′Y′Y′ ocorre nas posições 11, 12 e 13 do filamento antissenso a partir da extremidade 5’. Opcionalmente, o Y′ é 2′-O-metila.
[068] Em algumas modalidades, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIa):
[069] sensora: 5' np -Na -Y Y Y -Na - nq 3'
[070] antissenso: 3' np′-Na′- Y′Y′Y′- Na′- nq′ 5' (IIIa).
[071] Em outra modalidade, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIb):
[072] sensora: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3'
[073] antissenso: 3' np′-Na′- Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′- Na′- nq′ 5' (IIIb)
[074] em que cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 1 a 5 nucleotídeos modificados.
[075] Em uma modalidade adicional, a fórmula (III) é representada pela fórmula (IIIc):
[076] sensora: 5' np -Na –X X X -Nb -Y Y Y -Na - nq 3'
[077] antissenso: 3' np′-Na′- X′X′X′-Nb′- Y′Y′Y′- Na′- nq′ 5' (IIIc)
[078] em que cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 1 a 5 nucleotídeos modificados.
[079] Em determinadas modalidades, fórmula (III) é representada pela fórmula (IIId):
[080] sensora: 5' np -Na –X X X- Nb -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3'
[081] antissenso: 3' np′-Na′- X′X′X′- Nb′-Y′Y′Y′- Nb′-Z′Z′Z′- Na′- nq′ 5' (IIId)
[082] em que cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 1 a 5 nucleotídeos modificados e cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[083] Em outra modalidade, a região de duplo filamento tem 15 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento. Opcionalmente, a região de duplo filamento tem 17 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento.
[084] Em determinadas modalidades, a região de duplo filamento tem 17 a 25 pares de nucleotídeo em comprimento. Opcionalmente, a região de duplo filamento tem 23 a 27 pares de nucleotídeo em comprimento.
[085] Em algumas modalidades, a região de duplo filamento tem 19 a 21 pares de nucleotídeo em comprimento. Opcionalmente, a região de duplo filamento tem 21 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento.
[086] Em determinadas modalidades, cada filamento tem 15 a 30 nucleotídeos. Opcionalmente, cada filamento tem 19 a 30 nucleotídeos.
[087] Em outra modalidade, as modificações nos nucleotídeos do agente de RNAi são LNA, ácido glicolnucleico (GNA), HNA, CeNA, 2′-metoxietila, 2′-O-alquila, 2′-O-alila, 2′- C-alila, 2′-flúor, 2′-desóxi e/ou 2’-hidroxila, e combinações dos mesmos. Opcionalmente, as modificações em nucleotídeos incluem 2'-O-metila, 2'-flúor e/ou GNA, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade relacionada, as modificações nos nucleotídeos são modificações 2′-O-metila ou 2′-flúor.
[088] Em uma modalidade, o agente de RNAi inclui um ligante que é ou inclui um ou mais grupamentos C16 fixados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[089] Em determinadas modalidades, o ligante é fixado à extremidade 3′ do filamento sensor.
[090] Em algumas modalidades, o agente de RNAi inclui ainda pelo menos uma ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato. Em uma modalidade relacionada, o ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato está na terminação 3’ de um filamento. Opcionalmente, o filamento é o filamento antissenso. Em outra modalidade, o filamento é o filamento sensor. Em uma modalidade relacionada, o ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato está na terminação 5’ de um filamento. Opcionalmente, o filamento é o filamento antissenso. Em outra modalidade, o filamento é o filamento sensor.
[091] Em outra modalidade, o ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato está nos terminais 5’ e 3’ de um filamento. Opcionalmente, o filamento é o filamento antissenso. Em outra modalidade, o filamento é o filamento sensor.
[092] Em uma modalidade adicional, o par de base na posição 1 da extremidade 5′ do filamento antissenso do duplex de agente de RNAi é um par de base A:U.
[093] Em determinadas modalidades, os nucleotídeos Y contêm uma modificação 2′-flúor.
[094] Em algumas modalidades, os nucleotídeos Y′ contêm uma modificação 2′-O-metila.
[095] Em determinadas modalidades, p′>0. Opcionalmente, p′=2.
[096] Em algumas modalidades, nucleotídeos de projeção q’=0, p=0, q=0 e p’ são complementares ao mRNA-alvo.
[097] Em determinadas modalidades, nucleotídeos de projeção q’=0, p=0, q=0 e p’ são não complementares ao mRNA- alvo.
[098] Em uma modalidade, o filamento sensor do agente de RNAi tem um total de 21 nucleotídeos e o filamento antissenso tem um total de 23 nucleotídeos.
[099] Em outra modalidade, pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato. Opcionalmente, todos os np′ são ligados a nucleotídeos vizinhos por meio de ligação de fosforotioatos.
[100] Em determinadas modalidades, o agente de RNAi da presente revelação é um daqueles listados na Tabela 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6 e/ou 9.
[101] Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos do filamento sensor e todos os nucleotídeos do filamento antissenso incluem uma modificação.
[102] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o filamento antissenso inclui uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cada filamento é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de duplo filamento é representado pela fórmula (III):
[103] sensora: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'
[104] antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III)
[105] em que:
[106] i, j, k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1;
[107] p, p’, q e q′ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[108] cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, em que cada sequência inclui pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[109] cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 10 nucleotídeos, que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[110] cada np, np′, nq, e nq′, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção;
[111] XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2′-O-metila ou 2′-flúor;
[112] modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e
[113] em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante.
[114] Um aspecto adicional da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o filamento antissenso inclui uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cada filamento é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de duplo filamento é representado pela fórmula (III):
[115] sensora: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'
[116] antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III)
[117] em que:
[118] i, j, k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1;
[119] cada np, nq, e nq′, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção;
[120] p, q e q′ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[121] np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato;
[122] cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, em que cada sequência inclui pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[123] cada Nb e Nb′ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[124] XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2′-O-metila, ácido glicolnucleico (GNA) ou 2′-flúor;
[125] modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e
[126] em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante.
[127] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o filamento antissenso inclui uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cada filamento é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de duplo filamento é representado pela fórmula (III):
[128] sensora: 5’ np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'
[129] antissenso: 3’ np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III)
[130] em que:
[131] i, j, k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1;
[132] cada np, nq e nq′, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção;
[133] p, q e q′ são. cada um, independentemente 0 a 6;
[134] np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato;
[135] cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, em que cada sequência inclui pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[136] cada Nb e Nb′ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[137] XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2′-O-metila ou 2′-flúor;
[138] modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e
[139] em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ou mais ligantes C16.
[140] Um aspecto adicional da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o filamento antissenso inclui uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cada filamento é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de duplo filamento é representado pela fórmula (III):
[141] sensora: 5’ np -Na -(X X X)i-Nb -Y Y Y -Nb - (Z Z Z)j -Na - nq 3'
[142] antissenso: 3’ np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III)
[143] em que:
[144] i, j, k e l são, cada um, independentemente 0 ou 1;
[145] cada np, nq e nq′, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção;
[146] p, q e q′ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[147] np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato;
[148] cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, em que cada sequência inclui pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[149] cada Nb e Nb′ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos;
[150] XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2′-O-metila ou 2′-flúor;
[151] modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′;
[152] em que o filamento sensor inclui pelo menos uma ligação de fosforotioato; e
[153] em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ou mais ligantes C16.
[154] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o filamento antissenso inclui a região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cada filamento é de cerca de 14 a cerca de 30 nucleotídeos em comprimento, em que o agente de RNAi de duplo filamento é representado pela fórmula (III):
[155] sensora: 5’ np -Na -Y Y Y - Na - nq 3'
[156] antissenso: 3’ np′-Na′- Y′Y′Y′- Na′- nq′ 5' (IIIa)
[157] em que:
[158] cada np, nq e nq′, cada um dos quais pode ou não estar presente, representa independentemente um nucleotídeo de projeção;
[159] p, q e q′ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[160] np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato;
[161] cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeos incluindo 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, em que cada sequência inclui pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[162] YYY e Y′Y′Y′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações 2’-O-metila ou 2’-flúor;
[163] em que o filamento sensor inclui pelo menos uma ligação de fosforotioato; e
[164] em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ou mais ligantes C16.
[165] Um aspecto adicional da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor e um filamento antissenso formador de uma região de duplo filamento, em que o filamento sensor inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1-14 e o filamento antissenso inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 15-28, em que substancialmente todos os nucleotídeos do filamento sensor incluem uma modificação que é uma modificação 2’-O-metila, um GNA e/ou uma modificação 2’- flúor, em que o filamento sensor inclui duas ligações internucleotídicas de fosforotioato na terminação 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos do filamento antissenso incluem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação 2’-O-metila e uma modificação 2’- flúor, em que o filamento antissenso inclui duas ligações internucleotídicas de fosforotioato na terminação 5’ e duas ligações internucleotídicas de fosforotioato na terminação 3’, e em que o filamento sensor é conjugado a um ou mais ligantes C16.
[166] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de RNAi de duplo filamento inclui um filamento sensor e um filamento antissenso formador de uma região de duplo filamento, em que o filamento sensor inclui pelo menos
15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1-14 e o filamento antissenso inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 15-28, em que o filamento sensor inclui pelo menos um nucleotídeo de desoxitimina 3’-terminal (dT), e em que o filamento antissenso inclui pelo menos um nucleotídeo de desoxitimina 3’-terminal (dT).
[167] Em uma modalidade, todos os nucleotídeos do filamento sensor e todos os nucleotídeos do filamento antissenso são nucleotídeos modificados.
[168] Em outra modalidade, cada filamento tem 19 a 30 nucleotídeos.
[169] Em determinadas modalidades, o filamento antissenso do agente de RNAi inclui pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex dentro das primeiras 9 posições de nucleotídeo da região 5’ ou um precursor das mesmas. Opcionalmente, a modificação de termodesestabilização do duplex é uma ou mais de
[170] em que B é nucleobase.
[171] Outro aspecto da presente revelação fornece uma célula contendo um agente de RNAi de duplo filamento da presente revelação.
[172] Um aspecto adicional da presente revelação fornece uma composição farmacêutica para inibir a expressão de um gene de APP que inclui um agente de RNAi de duplo filamento da presente revelação.
[173] Em uma modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento é administrado em uma solução não tamponada. Opcionalmente, a solução não tamponada é salina ou água.
[174] Em outra modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento é administrado com uma solução tampão. Opcionalmente, a solução tampão inclui acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos. Em outra modalidade, a solução tampão é tampão fosfato- salino (PBS).
[175] Outro aspecto da revelação fornece uma composição farmacêutica que inclui um agente de RNAi de duplo filamento da presente revelação e uma formulação de lipídio.
[176] Em uma modalidade, a formulação de lipídio inclui uma LNP.
[177] Um aspecto adicional da revelação fornece um método de inibição da expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o método envolve: (a) colocar a célula em contato com um agente de RNAi de duplo filamento da presente revelação ou uma composição farmacêutica da presente revelação; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) por um tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA de um gene de APP, inibindo assim a expressão do gene de APP na célula.
[178] Em uma modalidade, a célula está dentro de um sujeito. Opcionalmente, o sujeito é um humano.
[179] Em determinadas modalidades, o sujeito é um macaco rhesus, um macaco cinomolgo, um camundongo ou um rato.
[180] Em uma modalidade, o sujeito humano sofre de um distúrbio associado à APP. Opcionalmente, a doença associada à APP é angiopatia amiloide cerebral (CAA).
[181] Em outra modalidade, o distúrbio associado à APP é doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD). Em uma modalidade adicional, o distúrbio associado à APP é doença de Alzheimer (DA).
[182] Em determinadas modalidades, a expressão de APP é inibida por pelo menos cerca de 30% pelo agente de RNAi.
[183] Outro aspecto da revelação fornece um método de tratamento de um sujeito com um distúrbio que poderia se beneficiar de uma redução na expressão de APP, em que o método envolve administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de duplo filamento da revelação ou uma composição farmacêutica da revelação, tratando assim o sujeito.
[184] Em determinadas modalidades, o método envolve ainda administrar um agente terapêutico adicional ao sujeito.
[185] Em determinadas modalidades, o agente de RNAi de duplo filamento é administrado a uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.
[186] Em algumas modalidades, o agente de RNAi de duplo filamento é administrado ao sujeito intratecalmente.
[187] Em determinadas modalidades, a administração do RNAi de duplo filamento ao sujeito causa uma diminuição no acúmulo de Aβ. Opcionalmente, a administração do RNAi de duplo filamento ao sujeito causa uma diminuição no acúmulo de Aβ(1-40) e/ou Aβ(1-42).
[188] Em modalidades relacionadas, a administração do dsRNA ao sujeito causa uma diminuição na formação e/ou acúmulo de placa amiloide no sujeito.
[189] Em uma modalidade, o método reduz a expressão de um gene-alvo em um tecido cerebral ou espinhal. Opcionalmente, o tecido cerebral ou espinhal é córtex, cerebelo, estriado, coluna cervical, coluna lombar e/ou coluna torácica.
[190] Outro aspecto da presente revelação fornece um método de inibição da expressão de APP em um sujeito, em que o método envolve: administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de duplo filamento da revelação ou uma composição farmacêutica da revelação, inibindo assim a expressão de APP no sujeito.
[191] Um aspecto adicional da revelação fornece um método para tratar ou prevenir uma doença ou distúrbio associado à APP em um sujeito, em que o método envolve administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi de duplo filamento da revelação ou uma composição farmacêutica da revelação, tratando ou prevenindo assim uma doença ou distúrbio associado à APP no sujeito.
[192] Em determinadas modalidades, a doença ou distúrbio associado à APP é angiopatia amiloide cerebral (CAA) e/ou doença de Alzheimer (DA). Opcionalmente, a DA é doença de
Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
[193] Outro aspecto da presente revelação fornece um kit para realizar um método da presente revelação, em que o kit inclui: a) um agente de RNAi de duplo filamento da presente revelação, e b) instruções para uso, e c) opcionalmente, um meio para administrar o agente de RNAi de duplo filamento ao sujeito.
[194] Um aspecto adicional da presente revelação fornece um agente de ácido ribonucleico de duplo filamento (RNAi) para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de RNAi possui um filamento sensor e um filamento antissenso, e em que o filamento antissenso inclui uma região de complementaridade que inclui pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem em não mais de 3 nucleotídeos a partir de qualquer uma das sequências de nucleobase de filamento antissenso de AD-392911, AD-392912, AD-392816, AD-392704, AD-392843, AD-392855, AD- 392840, AD-392835, AD-392729, AD-392916, AD-392876, AD-392863, AD-392917, AD-392783, AD-392765, AD-392791, AD-392800, AD- 392711, AD-392801, AD-392826, AD-392818, AD-392792, AD-392802, AD-392766, AD-392767, AD-392834, AD-392974, AD-392784, AD- 392744, AD-392752, AD-392737, AD-392918, AD-392919, AD-392803, AD-392804, AD-392827, AD-392828, AD-392785, AD-392829, AD- 392920, AD-392921, AD-392768, AD-392805, AD-392769, AD-392753, AD-392714, AD-392703, AD-392715, AD-392836, AD-392966, AD- 392832, AD-392972, AD-392961, AD-392967, AD-392894, AD-392864, AD-392865, AD-392922, AD-392833, AD-392968, AD-392962, AD- 392963, AD-392969, AD-392973, AD-392923, AD-392866, AD-392877, AD-392707, AD-392926, AD-392927, AD-392717, AD-392700, AD- 392878, AD-392718, AD-392929, AD-392819, AD-392745, AD-392770,
AD-392806, AD-392771, AD-392820, AD-392821, AD-392786, AD- 392772, AD-392699, AD-392868, AD-392719, AD-392880, AD-392930, AD-392932, AD-392869, AD-392870, AD-392896, AD-392720, AD- 392746, AD-392773, AD-392807, AD-392730, AD-392721, AD-392933, AD-392881, AD-392897, AD-392898, AD-392899, AD-392935, AD- 392882, AD-392738, AD-392739, AD-392936, AD-392900, AD-392901, AD-392937, AD-392883, AD-392975, AD-392938, AD-392902, AD- 392941, AD-392942, AD-392943, AD-392944, AD-392903, AD-392775, AD-392758, AD-392945, AD-392884, AD-392947, AD-392748, AD- 392759, AD-392837, AD-392970, AD-392976, AD-392965, AD-392831, AD-392904, AD-392885, AD-392886, AD-392776, AD-392887, AD- 392722, AD-392760, AD-392731, AD-392709, AD-392723, AD-392948, AD-392724, AD-392949, AD-392725, AD-392950, AD-392732, AD- 392726, AD-392862, AD-392951, AD-392871, AD-392872, AD-397183, AD-397175, AD-397177, AD-397176, AD-397260, AD-397266, AD- 397267, AD-397178, AD-397180, AD-397184, AD-397179, AD-397224, AD-397225, AD-397203, AD-397185, AD-397195, AD-397204, AD- 397191, AD-397251, AD-397240, AD-397205, AD-397254, AD-397259, AD-397247, AD-397233, AD-397181, AD-397196, AD-397197, AD- 397226, AD-397212, AD-397182, AD-397227, AD-397217, AD-397213, AD-397229, AD-397264, AD-397265, AD-397209, AD-397192, AD- 397210, AD-397219, AD-397214, AD-397220, AD-397230, AD-397231, AD-397193, AD-397190, AD-397200, AD-397248, AD-397207, AD- 397211, AD-397243, AD-397246, AD-397223, AD-397202, AD-397256, AD-397257, AD-397258, AD-397250, AD-397244 AD-454972, AD- 454973, AD-454842, AD-454843, AD-454844, AD-994379, AD-961583, AD-961584, AD-961585 ou AD-961586.
[195] Em uma modalidade, o agente de RNAi inclui uma ou mais das seguintes modificações: um nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’-
flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato (PS) e um fosfonato de vinila (VP). Opcionalmente, o agente de RNAi inclui pelo menos um de cada uma das seguintes modificações: um nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’-flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato e um fosfonato de vinila (VP).
[196] Em outra modalidade, o agente de RNAi inclui quatro ou mais modificações PS, opcionalmente seis a dez modificações PS, opcionalmente oito modificações PS.
[197] Em uma modalidade adicional, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi possui uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e o agente de RNAi inclui oito modificações PS posicionadas em cada uma dentre a penúltima e última ligações internucleotídicas a partir das respectivas terminações 3’ e 5’ de cada um dos filamentos senso e antissenso do agente de RNAi.
[198] Em outra modalidade, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi inclui uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e o agente de RNAi inclui apenas um nucleotídeo incluindo um GNA. Opcionalmente, o nucleotídeo que inclui um GNA é posicionado no filamento antissenso no sétimo resíduo de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
[199] Em uma modalidade adicional, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi inclui uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e o agente de RNAi inclui entre um e quatro nucleotídeos modificados de 2’-C-alquila. Opcionalmente, o nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila é um nucleotídeo modificado de 2’- C16. Opcionalmente, o agente de RNAi inclui um único nucleotídeo modificado de 2’-C16. Opcionalmente, o único nucleotídeo modificado de 2’-C16 está localizado no filamento sensor na sexta posição de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento sensor ou na posição de nucleobase terminal da extremidade 5’.
[200] Em outra modalidade, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi inclui uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e o agente de RNAi inclui dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor. Opcionalmente, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi inclui dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor. Opcionalmente, os nucleotídeos modificados de 2’-flúor estão localizados no filamento sensor em posições de nucleobase 7, 9, 10 e 11 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso em posições de nucleobase 2, 14 e 16 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
[201] Em uma modalidade adicional, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi inclui uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e o agente de RNAi inclui uma ou mais modificações VP. Opcionalmente, o agente de RNAi inclui uma única modificação VP na terminação 5’ do filamento antissenso.
[202] Em outra modalidade, cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi inclui uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e o agente de
RNAi inclui dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-O- metila. Opcionalmente, o agente de RNAi inclui nucleotídeos modificados de 2’-O-metila em todos os locais de nucleobase não modificados por um 2'-flúor, uma 2’-C-alquila ou um ácido glicolnucleico (GNA). Opcionalmente, os dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-O-metila estão localizados no filamento sensor nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21 a partir da 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
[203] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de ácido ribonucleico de duplo filamento (RNAi) para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o agente de RNAi inclui um filamento sensor e um filamento antissenso, e em que o filamento antissenso inclui uma região de pelo menos 15 nucleobases contíguas em comprimento que é suficientemente complementar a uma sequência de APP-alvo de APP NM_00484 posições 1891 a 1919; APP NM_00484 posições 2282 a 2306; APP NM_00484 posições 2464 a 2494; APP NM_00484 posições 2475 a 2638; APP NM_00484 posições 2621 a 2689; APP NM_00484 posições 2682 a 2725; APP NM_00484 posições 2705 a 2746; APP NM_00484 posições 2726 a 2771; APP NM_00484 posições 2754 a 2788; APP NM_00484 posições 2782 a 2813; APP NM_00484 posições 2801 a 2826; APP NM_00484 posições 2847 a 2890; APP NM_00484 posições 2871 a 2896; APP NM_00484 posições 2882 a 2960; APP NM_00484 posições 2942 a 2971; APP NM_00484 posições 2951 a 3057; APP NM_00484 posições 3172 a 3223; APP NM_00484 posições 3209 a 3235; NM_00484 posições 3256 a 3289; NM_00484 posições 3302 a
3338; APP NM_00484 posições 3318 a 3353; APP NM_00484 posições 3334 a 3361, APP NM_001198823.1 posições 251 a 284; APP NM_001198823.1 posições 362 a 404; APP NM_001198823.1 posições 471 a 510; APP NM_001198823.1 posições 532 a 587; APP NM_001198823.1 posições 601 a 649; APP NM_001198823.1 posições 633 a 662; APP NM_001198823.1 posições 1351 a 1388; APP NM_001198823.1 posições 1609 a 1649; APP NM_001198823.1 posições 1675 a 1698; APP NM_001198823.1 posições 1752 a 1787; APP NM_001198823.1 posições 2165 a 2217; APP NM_001198823.1 posições 2280 a 2344; ou APP NM_001198823.1 posições 2403 a 2431 para efetuar o knockdown de APP e que se difere em não mais de 3 nucleotídeos através das pelo menos 15 nucleobases contíguas de modo suficiente complementar à sequência-alvo de APP para efetuar o knockdown de APP.
[204] Outro aspecto da presente revelação fornece um agente de RNAi de duplo filamento que inclui uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’-flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C- alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato (PS) e um fosfonato de vinila (VP), opcionalmente em que o dito agente de RNAi compreende pelo menos uma de cada modificação selecionada a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2’-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2’-flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato e um fosfonato de vinila (VP).
[205] Outro aspecto da presente revelação fornece o agente de RNAi que compreende quatro ou mais modificações PS, opcionalmente seis a dez modificações PS, opcionalmente oito modificações PS.
[206] Outro aspecto da presente revelação fornece cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi que compreende uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende oito modificações PS posicionadas na penúltima e última ligações de internucleotídeo a partir das respectivas terminações 3’ e 5’ de cada um dentre o filamento senso e filamento antissenso do agente de RNAi.
[207] Outro aspecto da presente revelação fornece cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi compreende uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende apenas um nucleotídeo que compreende um GNA, opcionalmente em que o nucleotídeo que compreende um GNA é posicionado no filamento antissenso no sétimo resíduo de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
[208] Outro aspecto da presente revelação fornece cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi que compreende uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende entre um e quatro nucleotídeos modificados de 2’-C-alquila, opcionalmente em que o nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila é um nucleotídeo modificado de 2’-C16, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende um único nucleotídeo modificado de 2’-C16, opcionalmente o único nucleotídeo modificado de 2’-C16 está localizado no filamento sensor na sexta posição de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento sensor ou na posição terminal de nucleobase da extremidade 5’.
[209] Outro aspecto da presente revelação fornece cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi compreende uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor, opcionalmente em que cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor, opcionalmente em que os nucleotídeos modificados de 2’-flúor estão localizados no filamento sensor nas posições de nucleobase 7, 9, 10 e 11 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições de nucleobase 2, 14 e 16 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
[210] Outro aspecto da presente revelação fornece cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi que compreende uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende uma ou mais modificações VP, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende uma única modificação VP na terminação 5’ do filamento antissenso.
[211] Outro aspecto da presente revelação fornece cada um dentre o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi que compreende uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-O-metila, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende nucleotídeos modificados de 2’-O-metila em todas as localizações de nucleobase não modificadas por um 2’-flúor, uma 2’-C-alquila ou um ácido glicolnucleico (GNA), opcionalmente em que os dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-O-metila estão localizadas no filamento sensor nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[212] A descrição detalhada a seguir, dada a título de exemplo, mas sem se destinar a limitar a revelação apenas às modalidades específicas descritas, pode ser mais bem compreendida em conjunto com os desenhos anexos, nos quais:
[213] A Figura 1A e a Figura 1B mostram uma imagem esquemática de agentes de RNAi modificados testados para atividade de knockdown hsAPP in vivo.
[214] A Figura 2A e Figura 2B mostram resultados da atividade de knockdown hsAPP in vivo observados para os agentes de RNAi modificados mostrados na Figura 1A e Figura 1B.
[215] A Figura 3A é um esquema que demonstra a estratégia para identificar siRNAs de APP humana potente (hAPP) no alvejamento de angiopatia amiloide cerebral hereditária (hCAA).
[216] A Figura 3B é um gráfico da porcentagem de mRNA restante em uma triagem endógena in vitro de siRNAs de hAPP a uma concentração de 10 nM em células Be 2)C.
[217] A Figura 4A é um esquema que demonstra o momento da transfecção de siRNA de APP em células neuronais BE(2)C. O siRNA de APP foi transfectado a 10, 1 e 0,1 nM e avaliado 24 e 48 horas após a transfecção.
[218] A Figura 4B é um gráfico que mostra a concentração aplicada de siRNA de duplex de APP versus a porcentagem de mRNA restante em células BE(2)C 48 horas após a transfecção.
[219] A Figura 4C são dois gráficos de espécies solúveis de APP alfa (topo) e beta (baixo) em sobrenadantes de células BE(2)C 48 horas após a transfecção.
[220] A Figura 5A é um esquema que demonstra o desenho do estudo de triagem de primatas não humanos (NHP) para siRNA de APP. 5 compostos foram avaliados, e 5 animais foram usados para cada experimento. Uma única injeção intratecal (IT) de 72 mg do composto de interesse foi dada no início.
[221] A Figura 5B são dois gráficos de espécies solúveis de APP alfa (superior) e beta (inferior) em BE(2)C (inferior), administração pós-TI em macacos cino de 72 mg de AD-454972 direcionado à APP.
[222] A Figura 5C é um gráfico que mostra os resultados do knockdown de mRNA de tecido no dia 29 após a administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454972 direcionado à APP.
[223] A Figura 5D é um esquema que demonstra a estrutura do composto AD-454972 direcionado à APP (topo) e uma tabela que mostra os níveis de administração do composto AD- 454972 em tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454972 direcionado à APP (parte inferior).
[224] A Figura 6 são dois gráficos que mostram os resultados de APP alfa e beta solúvel no LCR (topo) e espécies beta amiloide do LCR (parte inferior) coletados 2-3 meses após a administração de IT em macacos cino de 72 mg de AD-454972 direcionado à APP.
[225] A Figura 7A são dois gráficos que mostram os resultados do LCR coletado nos dias 8, 15 e 29 e analisados para APP alfa e beta solúvel (topo) e beta amiloide 38,40 e 42 (abaixo), pós-administração IT em macacos cino de 72 mg de AD- 454842 direcionado à APP.
[226] A Figura 7B é uma tabela que mostra os níveis de entrega de composto AD-454842 em tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454842 direcionado à APP.
[227] A Figura 8A são dois gráficos que mostram os resultados do LCR coletado nos dias 8, 15 e 29 e analisado para APP alfa e beta solúvel (topo) e beta amiloide 38,40 e 42 (abaixo), pós-administração IT em macacos cino de 72 mg de AD- 454843 direcionado à APP.
[228] A Figura 8B é um gráfico que mostra os resultados de knockdown de mRNA de tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454843 direcionado à APP.
[229] A Figura 8C é uma tabela que mostra os níveis de entrega de composto AD-454843 em tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454843 direcionado à APP.
[230] A Figura 9A são dois gráficos que mostram os resultados da APP alfa e beta solúvel no CSF (topo) e espécies beta amiloide do CSF (parte inferior) coletados 2 a 3 meses após a administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454843 direcionado à APP.
[231] A Figura 9B é um gráfico que mostra os resultados de knockdown de mRNA de tecido no dia 85 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454843 direcionado à APP.
[232] A Figura 10A são dois gráficos que mostram os resultados CSF coletados nos dias 8, 15 e 29 e analisados para APP alfa e beta solúvel (topo) e beta amiloide 38,40 e 42 (abaixo), pós-administração IT em macacos cino de 72 mg de AD- 454844 direcionado à APP.
[233] A Figura 10B é um gráfico que mostra os resultados de knockdown de mRNA de tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454844 direcionado à APP.
[234] A Figura 10C é um esquema que demonstra a estrutura do composto AD-454844 direcionado à APP (topo) e uma tabela mostrando os níveis de administração do composto AD- 454844 em tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de AD-454844 direcionado à APP (parte inferior).
[235] A Figura 11A é uma tabela que mostra um alto nível de entrega de composto no tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de 72 mg de siRNA direcionado à APP.
[236] A Figura 11B é um gráfico que mostra os resultados do knockdown de mRNA de tecido no dia 29 após administração IT em macacos cino de um alto nível (Figura 11A) de entrega de composto direcionado à APP.
[237] A Figura 11C são dois gráficos que mostram os resultados do LCR coletado nos dias 8, 15 e 29 e analisados para APP alfa e beta solúvel (topo) e beta amiloide 38, 40 e 42 (abaixo), pós-administração IT em macacos cino de 72 mg de um alto nível de entrega de composto (Figura 11A) direcionado à APP.
[238] A Figura 12A são dois gráficos que mostram a média de 5 estudos de duplex de miRNA. O painel superior é um gráfico de caixa dos resultados de 5 compostos no dia 29 após a administração IT em macacos cino de 72 mg de siRNA. O painel inferior é um gráfico de caixa da quantidade de mRNA restante em cada tecido em relação a um controle 29 dias após administração IT em macacos cino.
[239] A Figura 12B são dois gráficos que mostram estudos de duplex de miRNA repetidos nos quais o CSF foi coletado nos dias 8, 15 e 29 e analisado para APP alfa e beta solúvel (topo) e beta amiloide 38, 40 e 42 (parte inferior), pós-administração IT em macacos cino de 72 mg de compostos de siRNA direcionados à APP.
[240] A Figura 13A é um gráfico que demonstra a porcentagem de mRNA de APP restante no tecido estriado 29 dias após a administração IT em macacos cino de AD-454972 direcionado à APP.
[241] A Figura 13B é um gráfico que demonstra a porcentagem de mRNA de APP restante no tecido estriado 29 dias após a administração IT em macacos cino de AD-454973 direcionado à APP.
[242] A Figura 13C é um gráfico que demonstra a porcentagem de mRNA de APP remanescente no tecido estriado 29 dias após a administração IT em macacos cino de AD-454842 direcionado à APP.
[243] A Figura 13D é um gráfico que demonstra a porcentagem de mRNA de APP restante no tecido estriado 29 dias após a administração IT em macacos cino de AD-454843 direcionado à APP.
[244] A Figura 13E é um gráfico que demonstra a porcentagem de mRNA de APP restante no tecido estriado 29 dias após a administração IT em macacos cino de AD-454844 direcionado à APP.
[245] A Figura 14A e Figura 14B são imagens esquemáticas de agentes de RNAi modificados com sementes ricas em AU que foram triadas para atividade de knockdown de hsAPP in vivo em camundongos.
[246] A Figura 15 é um gráfico que representa a % de knockdown de hsAPP no fígado de camundongos AAV8.HsAPP- CDS3TRNC tratados com sementes ricas em AU. Os controles PBS, Naïve e AD-392927 (RLD592) estão incluídos no gráfico.
[247] As Figuras 16A a 16D são imagens esquemáticas de agentes de RNAi principais modificados que foram triados para atividade de knockdown de hsAPP in vivo em camundongos AAV.
[248] A Figura 17A e a Figura 17B são gráficos que representam a % de knockdown de hsAPP no fígado de camundongos AAV8.HsAPP-CDS3TRNC tratados com oligonucleotídeos principais. PBS e Naïve, os controles estão incluídos nos gráficos.
[249] As Figuras 18A a 18D são imagens esquemáticas de agentes de RNAi principais modificados que foram triados para atividade de knockdown de hsAPP in vivo em camundongos AAV e que foram agrupados como famílias com base no progenitor AD-886864 (Figura 18A), progenitor AD-886899 (Figura 18B), progenitor AD-886919 (Figura 18 C) e progenitor AD-886823 (Figura 18D), respectivamente.
[250] A Figura 19 é um esquema que demonstra o projeto de estudo de triagem de primata não humano (NHP) de knockdown de APP do estudo de 4 meses de AD-454844 em que uma única injeção intratecal (IT) de 60 mg do composto de interesse foi dada a macacos cino no início.
[251] As Figuras 20A a 20G 6 mostram dados de triagem in vivo de conjugados de siRNA C16, incluindo o progenitor AD-454855, e 5 conjugados de siRNA adicionais derivados de estudos de relação de atividade de estrutura de AD-454855. Os gráficos representam a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do LCR nos dias 8, 15 e 19 após a administração intratecal de 60 mg de cada composto. A Figura 20A é um gráfico de APP alfa e beta solúvel 4 meses após a dose de AD-454844 para dois sujeitos primatas não humanos. A Figura 20B é um gráfico que representa a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do LCR nos dias 8, 15 e 19 após a dose de AD-454844. A Figura 20C é um gráfico que representa a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do CSF nos dias 8, 15 e 19 após a dose do conjugado de siRNA C16 5'- terminal, AD-994379. A Figura 20D é um gráfico que representa a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do LCR nos dias 8, 15 e 19 após a dose de AD-961583. A Figura 20E é um gráfico que representa a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do LCR nos dias 8, 15 e 19 após a dose de AD-961584. A Figura 20F é um gráfico que representa a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do LCR nos dias 8, 15 e 19 após a dose de AD-961585. A Figura 20G é um gráfico que representa a porcentagem de APP alfa e beta solúvel coletada do LCR nos dias 8, 15 e 19 após a dose de AD-961586.
[252] As Figuras 21A e 21B são imagens esquemáticas de agentes de RNAi C16 principais modificados que foram selecionados para atividade de knockdown de APP in vivo em primatas não humanos. A Figura 21A é um esquema do agente de RNAi C16 interno AD-454844 e o agente de siRNA C16 5'- terminal AD-994379. A Figura 21B é um esquema dos agentes de
RNAi AD-961583, AD-961584, AD-961585 e AD-961586.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[253] A presente revelação fornece composições de RNAi, que afetam a clivagem de transcritos de RNA mediada por complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) de um gene de proteína precursora de amiloide (APP). O gene de APP pode estar dentro de uma célula, por exemplo, uma célula dentro de um sujeito, como um humano. A presente revelação também fornece métodos de uso das composições de RNAi da revelação para inibir a expressão de um gene de APP e/ou para tratar um sujeito com um distúrbio que poderia se beneficiar da inibição ou redução da expressão de um gene de APP, por exemplo, uma doença associada à APP, por exemplo, angiopatia amiloide cerebral (CAA) ou doença de Alzheimer (AD), por exemplo, doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
[254] Os agentes de RNAi da revelação incluem um filamento de RNA (o filamento antissenso) com uma região que é cerca de 30 nucleotídeos ou menos em comprimento, por exemplo, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15- 23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20- 24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21- 25, 21-24, 21-23 ou 21-22 nucleotídeos em comprimento, cuja região é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA de um gene de APP.
[255] Em determinadas modalidades, os agentes de RNAi da revelação incluem um filamento de RNA (o filamento antissenso) que pode incluir comprimentos maiores, por exemplo, até 66 nucleotídeos, por exemplo, 36-66, 26-36, 25- 36, 31-60, 22-43, 27-53 nucleotídeos em comprimento com uma região de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos que é substancialmente complementar a pelo menos uma parte de um transcrito de mRNA de um gene de APP. Esses agentes de RNAi com os filamentos antissenso de comprimento maior incluem preferencialmente um segundo filamento de RNA (o filamento sensor) de 20-60 nucleotídeos em comprimento, em que os filamentos senso e antissenso formam um duplex de 18-30 nucleotídeos contíguos.
[256] O uso desses agentes de RNAi permite a degradação direcionada de mRNAs de um gene de APP em mamíferos. Doses muito baixas de agentes de RNAi de APP, em particular, podem mediar de forma específica e eficiente a interferência de RNA (RNAi), resultando na inibição significativa da expressão de um gene de APP. Usando ensaios baseados em células, os presentes inventores demonstraram que agentes de RNAi direcionados à APP podem mediar RNAi, resultando na inibição significativa da expressão de um gene de APP. Assim, métodos e composições incluindo esses agentes de RNAi são úteis para tratar um sujeito que se beneficiaria com uma redução nos níveis e/ou atividade de uma proteína de APP, como um sujeito com uma doença associada à APP, por exemplo, CAA ou DA, incluindo, por exemplo, EOFAD.
[257] A seguinte descrição detalhada revela como fazer e usar composições contendo agentes de RNAi para inibir a expressão de um gene de APP, bem como composições e métodos para tratar indivíduos com doenças e distúrbios que se beneficiariam da inibição e/ou redução da expressão desse gene. I. DEFINIÇÕES
[258] Para que a presente revelação possa ser mais facilmente compreendida, certos termos são definidos primeiro. Além disso, deve-se notar que sempre que um valor ou faixa de valores de um parâmetro for recitado, pretende-se que valores e faixas intermediárias aos valores recitados também façam parte desta revelação.
[259] Os artigos “um” e “uma” são usados neste documento para se referir a um ou a mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento, por exemplo, uma pluralidade de elementos.
[260] O termo “incluindo” é usado neste documento para significar, e é usado indistintamente com a frase “incluindo, mas sem limitação a”. O termo “ou” é usado neste documento para significar, e é usado indistintamente com o termo “e/ou”, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[261] O termo “cerca de” é usado neste documento para significar dentro das faixas típicas de tolerâncias na técnica. Por exemplo, “cerca de” pode ser entendido como cerca de 2 desvios padrão da média. Em determinadas modalidades, cerca de médias ± 10%. Em determinadas modalidades, cerca de médias ± 5%. Quando cerca está presente antes de uma série de números ou intervalo, entende-se que “cerca” pode modificar cada um dos números da série ou intervalo.
[262] O termo “pelo menos” antes de um número ou série de números é entendido como incluindo o número adjacente ao termo “pelo menos”, e todos os números ou inteiros subsequentes que poderiam logicamente ser incluídos, conforme claro do contexto. Por exemplo, o número de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico deve ser um número inteiro. Por exemplo, “pelo menos 18 nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico de 21 nucleotídeo” significa que 18, 19, 20, ou 21 nucleotídeos têm a propriedade indicada. Quando pelo menos estiver presente antes de uma série de números ou faixa, entende-se que “pelo menos” pode modificar cada um dos números da série ou faixa.
[263] Conforme usado neste documento, “não mais que” ou “menos que” é entendido como o valor adjacente à frase e valores lógicos inferiores ou intermediários, como lógico do contexto, a zero. Por exemplo, um duplex com uma saliência de “não mais que 2 nucleotídeos” tem uma saliência de 2, 1, ou 0 nucleotídeos. Quando “não mais que” está presente antes de uma série de números ou um intervalo, entende-se que “não mais que” pode modificar cada um dos números na série ou intervalo.
[264] O termo “APP” proteína precursora de amiloide (APP), também conhecida como proteína precursora de beta amiloide, proteína amiloide de doença de Alzheimer e peptídeo amiloide vascular cerebral, entre outros nomes, tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer vertebrado ou fonte de mamífero, incluindo, mas sem limitação a humano, bovino, ave, roedor, camundongo, rato, suíno, ovino, primata, macaco, e cobaia, a menos que especificado de outra forma. O termo também se refere a fragmentos e variantes de APP nativa que mantêm pelo menos uma atividade in vivo ou in vitro de uma APP nativa (incluindo, por exemplo, as formas de peptídeo de beta- amiloide(1-40), peptídeo de beta-amiloide(1-38) e peptídeo de beta-amiloide(1-42) do peptídeo Aβ, entre outros), incluindo variantes de fragmentos de APP que mantêm uma ou mais atividades de um fragmento de APP que têm caráter neurotóxico
(por exemplo, formas variantes do peptídeo Aβ42 que mantêm caráter neurotóxico são expressamente contempladas). O termo abrange formas de APP precursoras não processadas de comprimento total, bem como formas maduras, resultando da clivagem pós-translação do peptídeo sinal. O termo também abrange peptídeos que derivam da APP por meio de clivagem adicional, incluindo, por exemplo, peptídeos Aβ. A sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma APP humana pode ser encontrada, por exemplo, no nº de acesso GenBank GI: 228008405 (NM_201414; SEQ ID NO: 1). A sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma APP humana também pode ser encontrada, por exemplo, em nº de acesso GenBank GI: 228008403 (NM_000484.3; SEQ ID NO: 2); nº de acesso GenBank GI: 228008404 (NM_201413.2; SEQ ID NO: 3); nº de acesso GenBank GI: 324021746 (NM_001136016.3; SEQ ID NO: 4); nº de acesso GenBank GI: 228008402 (NM_001136129.2; SEQ ID NO: 5); nº de acesso GenBank GI: 228008401 (NM_001136130.2; SEQ ID NO: 6); nº de acesso GenBank GI: 324021747 (NM_001136131.2; SEQ ID NO: 7); nº de acesso GenBank GI: 324021737 (NM_001204301.1; SEQ ID NO: 8); nº de acesso GenBank GI: 324021735 (NM_001204302.1; SEQ ID NO: 9); e nº de acesso GenBank GI: 324021739 (NM_001204303.1; SEQ ID NO: 10); e nº de acesso GenBank GI: 1370481385 (XM_024452075.1; SEQ ID NO: 11).
[265] A sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma APP de macaco cinomolgo pode ser encontrada, por exemplo, em nº de acesso GenBank GI: 982237868 (XM_005548883.2; SEQ ID NO: 12). A sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma APP de camundongo pode ser encontrada, por exemplo, em nº de acesso GenBank GI: 311893400 (NM_001198823; SEQ ID NO: 13). A sequência de nucleotídeos e aminoácidos de uma APP de rato pode ser encontrada, por exemplo, em nº de acesso GenBank GI: 402692725 (NM_019288.2; SEQ ID NO: 14). Exemplos adicionais de sequências de APP são prontamente disponíveis usando bancos de dados disponíveis publicamente, por exemplo, GenBank, UniProt e OMIM.
[266] O termo “APP” como usado no presente documento também se refere a um polipeptídeo particular expresso em uma célula por variações de sequência de DNA de ocorrência natural do gene de APP, como um único polimorfismo de nucleotídeo no gene de APP. Vários SNPs dentro do gene de APP foram identificados e podem ser encontrados em, por exemplo, NCBI dbSNP (consulte, por exemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/snp). Exemplos não limitativos de SNPs dentro do gene de APP podem ser encontrados nos números de acesso dbSNP do NCBI rs193922916, rs145564988, rs193922916, rs214484, rs281865161, rs364048, rs466433, rs466448, rs532876832, rs63749810, rs63749964, rs63750064, rs63750066, rs63750151, rs63750264, rs63750363, rs63750399, rs63750445, rs63750579, rs63750643, rs63750671, rs63750734, rs63750847, rs63750851, rs63750868, rs63750921, rs63750973, rs63751039, rs63751122 e rs63751263. Certas variantes raras de APP exemplificativas que foram anteriormente descritas para desempenhar um papel no desenvolvimento de EOFAD foram identificadas em Hooli et al. (Neurology 78: 1.250 a 1.257). Além disso, várias variantes de APP “não clássicas” que abrigam uma junção intraexônica dentro de cDNA sequenciado foram recentemente identificadas como associadas à ocorrência de recombinação de genes somáticos nos cérebros de pacientes com DA (PCT/US2018/030520, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade). Exemplos dessas variantes de APP “não clássicas” incluem cAPP-R3/16 (SEQ ID NO: 1865), cAPP-R3/16-2 (SEQ ID NO: 1866), cAPP-R2/18 (SEQ ID NO: 1867), cAPP-R6/18 (SEQ ID NO: 1868), cAPP-R3/14 (SEQ ID NO: 1869), cAPP-R3/17 (SEQ ID NO: 1870), cAPP-R1/11 (SEQ ID NO: 1871), cAPP-R1/13 (SEQ ID NO: 1872), cAPP-R1/11-2 (SEQ ID NO: 1873), cAPP-R1/14 (SEQ ID NO: 1874), cAPP-R2/17 (SEQ ID NO: 1875), cAPP-R2/16 (SEQ ID NO: 1876), cAPP-R6/17 (SEQ ID NO: 1877), cAPP-R2/14 (SEQ ID NO: 1878), cAPP-R14/17-d8 (SEQ ID NO: 1879) e cAPP- D2/18-3 (SEQ ID NO: 1880). É expressamente contemplado que agentes de RNAi da revelação da presente podem ser usados para direcionar variantes de APP “não clássicas” e/ou que agentes de RNAi opcionalmente específicos para tais variantes de APP “não clássicas” podem ser projetados e usados, opcionalmente em combinação com outros agentes de RNAi da presente revelação, incluindo aqueles que visam formas nativas de APP. Essas variantes de APP “não clássicas” foram descritas como notavelmente ausentes de uma população de pacientes com HIV testada, com prevalência de DA na população de pacientes com HIV significativamente diminuída em comparação com os níveis esperados, o que indicava que os inibidores da transcriptase reversa e/ou outros antirretrovirais as terapias comumente usadas para tratar pacientes com HIV provavelmente também exerceram um papel terapêutico/preventivo contra a DA. Fica, portanto, expressamente contemplado que os agentes de RNAi da revelação do presente podem ser opcionalmente empregados em combinação com inibidores da transcriptase reversa e/ou outras terapias antirretrovirais, para fins terapêuticos e/ou preventivos.
[267] Tal como aqui utilizado, “sequência-alvo” refere-se a uma porção contígua da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene de APP, incluindo mRNA que é um produto do processamento de RNA de um produto de transcrição primário. Em uma modalidade, a porção-alvo da sequência será pelo menos longa o suficiente para servir como um substrato para clivagem dirigida por RNAi em ou perto daquela porção da sequência de nucleotídeos de uma molécula de mRNA formada durante a transcrição de um gene de APP.
[268] A sequência-alvo pode ser de cerca de 9 a 36 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, cerca de 15 a 30 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a sequência alvo pode ser de cerca de 15 a 30 nucleotídeos, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21 , 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21 , 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23 ou 21 a 22 nucleotídeos em comprimento. Faixas e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos citados acima também são contemplados como parte da revelação.
[269] Conforme utilizado neste documento, o termo “filamento compreendendo uma sequência” se refere a um oligonucleotídeo que compreende uma cadeia de nucleotídeos que é descrita pela sequência referida utilizando a nomenclatura de nucleotídeo padrão.
[270] “G,” “C,” “A”, “T” e “U” representa, cada um, geralmente um nucleotídeo que contém guanina, citosina,
adenina, timidina e uracila como base, respectivamente. No entanto, será entendido que o termo “ribonucleotídeo” ou “nucleotídeo” também pode se referir a um nucleotídeo modificado, conforme mais detalhadamente a seguir, ou um grupamento de substituição substituto (ver, por exemplo, Tabela 1). O especialista está bem ciente de que guanina, citosina, adenina, timidina e uracila podem ser substituídas por outros grupamentos sem alterar substancialmente as propriedades de emparelhamento de bases de um oligonucleotídeo que compreende um nucleotídeo portador desse grupamento de substituição. Por exemplo, sem limitação, um nucleotídeo que compreende inosina como sua base pode par de base com nucleotídeos contendo adenina, citosina ou uracila. Assim, nucleotídeos contendo uracila, guanina ou adenina podem ser substituídos nas sequências de nucleotídeos de dsRNA apresentados na revelação por um nucleotídeo contendo, por exemplo, inosina. Em outro exemplo, adenina e citosina em qualquer parte do oligonucleotídeo podem ser substituídas por guanina e uracila, respectivamente, para formar emparelhamento de bases de G-U Wobble com o mRNA-alvo. Sequências contendo tais grupamentos de substituição são adequadas para as composições e métodos apresentados na revelação.
[271] Os termos “iRNA”, “agente de RNAi”, “agente de iRNA”, “agente de interferência de RNA” como usado indistintamente aqui, referem-se a um agente que contém RNA como esse termo é definido neste documento, e que medeia a clivagem direcionada de um transcrito de RNA por meio de uma via de complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). A interferência de RNA (RNAi) é um processo que direciona a degradação específica da sequência do mRNA. O RNAi modula, por exemplo, inibe a expressão de APP em uma célula, por exemplo, a célula dentro de um sujeito, tal como um sujeito mamífero.
[272] Em uma modalidade, um agente de RNAi da revelação inclui um RNAi de filamento único que interage com uma sequência de RNA-alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA- alvo de APP, para direcionar a clivagem do RNA-alvo. Sem querer ser limitado pela teoria, acredita-se que o RNA de duplo filamento longo introduzido nas células é dividido em RNAs de interferência curtos de duplo filamento (siRNAs) compreendendo um filamento sensor e um filamento antissenso por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485). Dicer, uma enzima semelhante à ribonuclease III, processa esses dsRNA em RNAs de interferência curtos de 19-23 par de base com saliências características de duas bases 3' (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). Esses siRNAs são então incorporados a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de siRNA, permitindo que o filamento antissenso complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). Após a ligação ao mRNA-alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). Assim, em um aspecto a revelação se refere a um RNA de filamento único (ssRNA) (o filamento antissenso de um duplex de siRNA) gerado dentro de uma célula e que promove a formação de um complexo RISC para efetuar o silenciamento do gene-alvo, ou seja, um gene de APP. Consequentemente, o termo “siRNA” também é usado neste documento para se referir a um RNAi conforme descrito acima.
[273] Em outra modalidade, o agente de RNAi pode ser um RNA de filamento único que é introduzido em uma célula ou organismo para inibir um mRNA-alvo. Os agentes de RNAi de filamento único se ligam à endonuclease RISC, Argonaute 2, que então cliva o mRNA-alvo. Os siRNAs de filamento único têm geralmente 15 a 30 nucleotídeos e são modificados quimicamente. O projeto e o teste de RNA de filamento único são descritos na patente nº US 8.101.348 e em Lima et al., (2012) Cell 150: 883 a 894, sendo que o conteúdo completo de cada um é aqui incorporado a título de referência. Qualquer uma das sequências de nucleotídeos antissenso descritas neste documento pode ser usada como um siRNA de filamento único conforme descrito neste documento ou como quimicamente modificado pelos métodos descritos em Lima et al., (2012) Cell 150: 883 a 894.
[274] Em outra modalidade, um “agente de RNAi” para uso nas composições e métodos da revelação é um RNA de duplo filamento e é aqui referido como “agente de RNAi de duplo filamento”, “molécula de RNA de duplo filamento (dsRNA)”, “agente de dsRNA” ou “dsRNA”. O termo “dsRNA” se refere a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico, tendo uma estrutura de duplex compreendendo dois filamentos de ácido nucleico antiparalelo e complementar, referido como tendo orientações “senso” e “antissenso” em relação a um RNA-alvo, ou seja, um gene de APP. Em algumas modalidades da revelação, um RNA de duplo filamento (dsRNA) desencadeia a degradação de um RNA-alvo, por exemplo, um mRNA, por meio de um mecanismo de silenciamento de gene pós-transcricional aqui referido como RNA de interferência ou RNAi.
[275] Em geral, uma série de nucleotídeos de cada filamento de uma molécula de dsRNA são ribonucleotídeos, mas conforme descrito em detalhes neste documento, cada um dos dois filamentos também pode incluir um ou mais não ribonucleotídeos, por exemplo, um desoxirribonucleotídeo e/ou um nucleotídeo modificado. Além disso, conforme utilizado neste relatório descritivo, um “agente de RNAi” pode incluir ribonucleotídeos com modificações químicas; um agente de RNAi pode incluir modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos. Tal como aqui utilizado, o termo “nucleotídeo modificado” se refere a um nucleotídeo possuindo, independentemente, um grupamento de açúcar modificado, uma ligação internucleotídeo modificada e/ou uma nucleobase modificada. Assim, o termo nucleotídeo modificado engloba substituições, adições ou remoções de, por exemplo, um grupo funcional ou átomo, a ligações internucleosídicas, grupamentos de açúcar ou nucleobases. As modificações adequadas para uso nos agentes da revelação incluem todos os tipos de modificações aqui reveladas ou conhecidas na técnica. Quaisquer modificações, conforme usadas em uma molécula do tipo siRNA, são abrangidas por “agente de RNAi” para os fins deste relatório descritivo e reivindicações.
[276] Em formas modalidades da presente revelação, a inclusão de um desoxinucleotídeo - que é reconhecido como uma forma natural de nucleotídeo - se presente dentro de um agente de RNAi, pode ser considerada um nucleotídeo modificado.
[277] A região de duplex pode ser de qualquer comprimento que permita a degradação específica de um RNA-alvo desejado através de uma trajetória de RISC, e pode se situar na faixa de cerca de 9 a 36 pares de base em comprimento, por exemplo, cerca de 15 a 30 pares de base em comprimento, por exemplo, cerca de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 pares de base em comprimento, como cerca de 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23 ou 21 a 22 pares de base em comprimento. Faixas e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos citados acima também são contemplados como parte da revelação.
[278] Os dois filamentos que formam a estrutura do duplex podem ser porções diferentes de uma molécula de RNA maior, ou podem ser moléculas de RNA separadas. Onde os dois filamentos fazem parte de uma molécula maior e, portanto, são conectados por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de um filamento e a extremidade 5' do respectivo outro filamento formando a estrutura de duplex, a cadeia de RNA de ligação é referida como um “laço em gancho”. Um laço em gancho pode compreender pelo menos um nucleotídeo não pareado. Em algumas modalidades, o laço em gancho pode incluir pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 23 ou mais nucleotídeos desemparelhados. Em algumas modalidades, o laço em gancho pode ter 10 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, o laço em gancho pode ser 8 ou menos nucleotídeos não pareados. Em algumas modalidades, o laço em gancho pode ser de 4 a 10 nucleotídeos desemparelhados. Em algumas modalidades, o laço em gancho pode ser de 4 a 8 nucleotídeos.
[279] [00279] Onde os dois filamentos secundários de um dsRNA são compostos por moléculas de RNA separadas, essas moléculas não precisam, mas podem ser conectadas covalentemente. Em determinadas modalidades em que os dois filamentos são conectados covalentemente por outros meios que não uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de um filamento e a extremidade 5' do respectivo outro filamento formando a estrutura de duplex, a estrutura de conexão é referida como um “ligante” (embora seja notado que certas outras estruturas definidas em outro lugar neste documento também podem ser referidas como um “ligante”). Os filamentos de RNA podem ter o mesmo ou um número diferente de nucleotídeos. O número máximo de par de bases é o número de nucleotídeos no menor filamento do dsRNA menos quaisquer saliências que estejam presentes no duplex. Além da estrutura de duplex, um RNAi pode compreender uma ou mais projeções de nucleotídeo. Em uma modalidade do agente de RNAi, pelo menos um filamento compreende uma projeção 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo. Em outra modalidade, pelo menos um filamento compreende uma projeção 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 nucleotídeos. Em outras modalidades, pelo menos um filamento do agente de RNAi compreende uma projeção 5’ pelo menos 1 nucleotídeo. Em determinadas modalidades, pelo menos um filamento compreende uma projeção 5’ de pelo menos 2 nucleotídeos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 nucleotídeos. Em ainda outras modalidades, tanto a extremidade 3' quanto a extremidade 5' de um filamento do agente de RNAi compreendem uma projeção de pelo menos 1 nucleotídeo.
[280] Em uma modalidade, um agente de RNAi da revelação é um dsRNA, cada filamento do qual compreende 19 a 23 nucleotídeos, que interage com uma sequência de RNA-alvo, por exemplo, uma sequência de mRNA-alvo de APP, a direcionar a clivagem do RNA-alvo. Sem desejar estar limitado pela teoria, o RNA de duplo filamento longo introduzido nas células é dividido em siRNA por uma endonuclease Tipo III conhecida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, uma enzima semelhante à ribonuclease III, processa o dsRNA em RNAs de interferência curtos de 19 a 23 pares de base com duas projeções 3’de base características (Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). Os siRNAs são então incorporados a um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), onde uma ou mais helicases desenrolam o duplex de siRNA, permitindo que o filamento antissenso complementar guie o reconhecimento do alvo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). Após a ligação ao mRNA-alvo apropriado, uma ou mais endonucleases dentro do RISC clivam o alvo para induzir o silenciamento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188).
[281] Conforme usado neste documento, o termo “projeção de nucleotídeo” se refere a pelo menos um nucleotídeo desemparelhado que se projeta da estrutura de duplex de um agente de RNAi, por exemplo, um dsRNA. Por exemplo, quando uma extremidade 3' de um filamento de um dsRNA se estende além da extremidade 5' do outro filamento, ou vice-versa, ocorre uma projeção de nucleotídeo. Um dsRNA pode compreender uma projeção de pelo menos um nucleotídeo; alternativamente a projeção pode compreender pelo menos dois nucleotídeos, pelo menos três nucleotídeos, pelo menos quatro nucleotídeos, pelo menos cinco nucleotídeos ou mais. Uma projeção de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A projeção pode (ou as projeções podem) ser sem filamento sensor, o filamento antissenso ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, o nucleotídeo de uma projeção pode (ou os nucleotídeos de uma projeção podem) estar presente na extremidade 5', 3' ou em ambas as extremidades de um filamento antissenso ou sensor de um dsRNA.
[282] Em uma modalidade, o filamento antissenso de um dsRNA tem uma projeção de 1 a 10 nucleotídeo, por exemplo, uma projeção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em uma modalidade, o filamento sensor de um dsRNA tem uma projeção de 1 a 10, por exemplo, uma projeção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na projeção são substituídos por um tiofosfato de nucleosídeo.
[283] Em determinadas modalidades, o filamento antissenso de um dsRNA tem uma projeção de 1 a 10 nucleotídeos, por exemplo, 0 a 3, 1 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 4 a 10, 5 a 10, por exemplo, uma projeção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em uma modalidade, o filamento sensor de um dsRNA tem uma projeção de 1 a 10 nucleotídeos, por exemplo, uma projeção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos, na extremidade 3’ e/ou na extremidade 5’. Em outra modalidade, um ou mais dos nucleotídeos na projeção são substituídos por um tiofosfato de nucleosídeo.
[284] Em determinadas modalidades, a projeção no filamento sensor ou no filamento antissenso, ou em ambos, pode incluir comprimentos estendidos mais longos que 10 nucleotídeos, por exemplo, 1 a 30 nucleotídeos, 2 a 30 nucleotídeos, 10 a 30 nucleotídeos ou 10 a 15 nucleotídeos em comprimento. Em determinadas modalidades, uma projeção estendida está no filamento sensor do duplex. Em determinadas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 3’ do filamento sensor do duplex. Em determinadas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 5’ do filamento sensor do duplex. Em determinadas modalidades, uma projeção estendida está no filamento antissenso do duplex. Em determinadas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 3’ do filamento antissenso do duplex. Em determinadas modalidades, uma projeção estendida está presente na extremidade 5’ do filamento antissenso do duplex. Em determinadas modalidades, um ou mais dos nucleotídeos na projeção são substituídos por um tiofosfato de nucleosídeo. Em determinadas modalidades, a projeção inclui uma porção autocomplementar, de modo que a projeção seja capaz de formar uma estrutura de laço em gancho que é estável sob condições fisiológicas.
[285] Os termos “cego” ou “ponta cega” como usado no presente documento em referência a um dsRNA significam que não há nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo desemparelhados em uma determinada extremidade terminal de um dsRNA, ou seja, na projeção de nucleotídeo. Uma ou ambas as extremidades de um dsRNA podem ser cegas. Quando ambas as extremidades de um dsRNA são cegas, diz-se que o dsRNA é cego. Para ficar claro, um dsRNA de “extremidade cega” é um dsRNA cego em ambas as extremidades, ou seja, não há projeção de nucleotídeo em nenhuma das extremidades da molécula. Na maioria das vezes, essa molécula terá duplo filamento em todo o seu comprimento.
[286] O termo “filamento antissenso” ou “filamento-guia” refere-se ao filamento de um agente de RNAi, por exemplo, um dsRNA, que inclui uma região que é complementar a uma sequência-alvo, por exemplo, um mRNA de APP.
[287] Conforme usado neste documento, o termo “região de complementaridade” refere-se à região no filamento antissenso que é complementar a uma sequência, por exemplo, uma sequência-alvo, por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de APP, conforme definido neste documento. Onde a região de complementaridade não é totalmente complementar à sequência- alvo, as incompatibilidades podem ser nas regiões internas ou terminais da molécula. Geralmente, as incompatibilidades mais toleradas estão nas regiões terminais, por exemplo, dentro de 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos da terminação 5’ e/ou terminação 3’ do agente de RNAi.
[288] O termo “filamento sensor” ou “filamento passageiro” como usado no presente documento, refere-se ao filamento de um agente de RNAi que inclui uma região que é complementar a uma região do filamento antissenso como esse termo é definido neste documento.
[289] Conforme usado neste documento, o termo “região de clivagem” se refere a uma região que está localizada imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. O sítio de clivagem é o sítio do alvo em que ocorre a clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende três bases em cada extremidade e imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, a região de clivagem compreende duas bases em cada extremidade e imediatamente adjacente ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o sítio de clivagem ocorre especificamente no local delimitado pelos 10 e 11 nucleotídeos do filamento antissenso, e a região de clivagem compreende 11, 12 e 13 nucleotídeos.
[290] Tal como aqui utilizado, e salvo indicação em contrário, o termo “complementar”, quando usado para descrever uma primeira sequência de nucleotídeos em relação a uma segunda sequência de nucleotídeos, refere-se à capacidade de um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende a primeira sequência de nucleotídeos de se hibridizar e formar uma estrutura de duplex sob certas condições com um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende a segunda sequência de nucleotídeos, como será entendido pelo versado na técnica. Tais condições podem, por exemplo, ser condições rigorosas, onde as condições rigorosas podem incluir: 400 mM de NaCl, 40 mM de PIPES e pH 6,4, 1 mM de EDTA, 50 ºC ou 70 ºC por 12 a 16 horas seguido de lavagem (ver, por exemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Outras condições, tais como condições fisiologicamente relevantes que podem ser encontradas dentro de um organismo, podem ser aplicadas. O especialista poderá determinar o conjunto de condições mais adequadas para um teste de complementaridade de duas sequências, de acordo com a aplicação final dos nucleotídeos hibridizados.
[291] As sequências complementares dentro de um agente de RNAi, por exemplo, dentro de um dsRNA como aqui descrito, incluem o emparelhamento de bases do oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende uma primeira sequência de nucleotídeos a um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que compreende uma segunda sequência de nucleotídeos ao longo de todo o comprimento de uma ou de ambas as sequências de nucleotídeos. Essas sequências podem ser referidas como “totalmente complementares” umas em relação às outras neste documento. No entanto, onde uma primeira sequência é referida como “acessório complementar” em relação a uma segunda sequência aqui, as duas sequências podem ser totalmente complementares, ou podem formar uma ou mais, mas geralmente não mais do que 5, 4, 3 ou 2 pares de base incompatíveis na hibridização para um duplex de até 30 pares de base, mantendo a capacidade de hibridizar nas condições mais relevantes para sua aplicação final, por exemplo, inibição da expressão por meio de uma trajetória de RISC do gene. No entanto, quando dois oligonucleotídeos são projetados para formar, após a hibridização, uma ou mais projeções de filamento único, essas projeções não devem ser consideradas como incompatibilidades no que diz respeito à determinação de complementaridade. Por exemplo, um dsRNA compreendendo um oligonucleotídeo de 21 nucleotídeos em comprimento e outro oligonucleotídeo de 23 nucleotídeos em comprimento, em que o oligonucleotídeo mais longo compreende uma sequência de 21 nucleotídeos que é totalmente complementar ao oligonucleotídeo mais curto, pode ainda ser referido como “totalmente complementar” para os propósitos aqui descritos.
[292] As sequências “complementares”, como usado no presente documento, também podem incluir, ou ser formadas inteiramente a partir de pares de base não Watson-Crick e/ou pares de base formados a partir de nucleotídeos modificados não naturais, até o momento uma vez que os requisitos acima no que diz respeito à sua capacidade de hibridizar são cumpridos. Esses pares de base não Watson-Crick incluem, mas sem limitação a emparelhamento de bases de G:U Wobble ou Hoogstein.
[293] Os termos “complementar”, “totalmente complementar” e “acessório complementar” neste documento podem ser usados com relação à base de correspondência entre o filamento sensor e o filamento antissenso de um dsRNA, ou entre o filamento antissenso de um agente de RNAi cada sequência de destino, como será entendido a partir do contexto de seu uso.
[294] Conforme usado neste documento, um polinucleotídeo que é “acessório complementar a pelo menos parte de” um RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um polinucleotídeo que é complementar a uma porção contígua do mRNA de interesse (por exemplo, uma APP codificadora de mRNA). Por exemplo, um polinucleotídeo é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA de APP se a sequência for complementar a uma porção não interrompida de uma codificadora de mRNA de APP.
[295] Consequentemente, em algumas modalidades, os polinucleotídeos de filamento antissenso aqui revelados são totalmente complementares à sequência-alvo de APP. Em outras modalidades, os polinucleotídeos de filamento antissenso aqui revelados são consequência complementar à sequência-alvo de APP e compreendem uma sequência de nucleotídeos contígua que é pelo menos cerca de 80% complementar em todo o seu comprimento à região equivalente da sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 1-14, ou um fragmento das SEQ ID NOs: 1-14, como cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% complementar.
[296] Em outras modalidades, os polinucleotídeos antissenso aqui revelados são complementares à sequência-alvo de APP e compreendem uma sequência de nucleotídeos contígua que é pelo menos cerca de 80% complementar em todo o seu comprimento a qualquer uma das sequências de nucleotídeos de filamento sensor em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B ou 26, ou um fragmento de qualquer uma das sequências de nucleotídeos de filamento sensor em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B ou 26, tal como cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% complementar.
[297] Em uma modalidade, um agente de RNAi da revelação inclui um filamento sensor que é complementar a um polinucleotídeo antissenso que, por sua vez, é o mesmo que uma sequência-alvo de APP, e em que o polinucleotídeo do filamento sensor compreende uma sequência de nucleotídeos contígua que é pelo menos cerca de 80% complementar ao longo de seu comprimento em relação à região equivalente da sequência de nucleotídeos das SEQ ID NOs: 15-28, ou um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NOs: 15-28, como cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97 %, cerca de 98% ou cerca de 99% complementar.
[298] Em uma modalidade, a supressão pelo menos parcial da expressão de um gene de APP, é avaliada por uma redução da quantidade de mRNA de APP que pode ser isolada a partir de ou detectada em uma primeira célula ou grupo de células em que um gene de APP é transcrito, e que é ou foi tratado, de modo que a expressão de um gene de APP seja inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células, mas que não é ou não foi tratado (células de controle). O grau de inibição pode ser expresso em termos de: (mRNA em células de controle) - (mRNA em células tratadas) ● 100% (mRNA em células de controle)
[299] A frase “colocar uma célula em contato com um agente de RNAi”, como um dsRNA, como usado no presente documento, inclui o contato de uma célula por qualquer meio possível. O contato de uma célula com um agente de RNAi inclui o contato de uma célula in vitro com o agente de RNAi ou o contato de uma célula in vivo com o agente de RNAi. O contato pode ser feito direta ou indiretamente. Assim, por exemplo, o agente de RNAi pode ser colocado em contato físico com a célula pelo indivíduo que realiza o método, ou alternativamente, o agente de RNAi pode ser colocado em uma situação que permitirá ou fará com que ele entre posteriormente em contato com a célula.
[300] O contato com uma célula in vitro pode ser feito, por exemplo, incubando a célula com o agente de RNAi. O contato com uma célula in vivo pode ser feito, por exemplo, pela injeção do agente de RNAi em ou próximo ao tecido onde a célula está localizada, ou pela injeção do agente de RNAi em outra área, por exemplo, o sistema nervoso central (SNC), opcionalmente por meio de intratecal, intravítreo ou outra injeção, ou à corrente sanguínea ou ao espaço subcutâneo, de forma que o agente chegará posteriormente ao tecido onde está localizada a célula a ser contatada. Por exemplo, o agente de RNAi pode conter e/ou ser acoplado a um ligante, por exemplo, um grupamento ou grupamentos lipofílicos, conforme descrito abaixo, e mais detalhadamente, por exemplo, nos Pedidos de Patente US 62/668.072, 62/738.747 e/ou 62/773.082, que direciona e/ou de outra forma estabiliza o agente de RNAi em um local de interesse, por exemplo, o SNC. Combinações de métodos de contato in vitro e in vivo também são possíveis. Por exemplo, uma célula também pode entrar em contato in vitro com um agente de RNAi e subsequentemente transplantada em um sujeito.
[301] Em uma modalidade, colocar uma célula em contato com um agente de RNAi inclui “introduzir” ou “entregar o agente de RNAi na célula”, facilitando ou efetuando a captação ou absorção na célula. A absorção ou captação de um agente de RNAi pode ocorrer por meio de processos celulares difusivos ou ativos sem auxílio, ou por agentes ou dispositivos auxiliares. A introdução de um agente de RNAi em uma célula pode ser in vitro e/ou in vivo. Por exemplo, para introdução in vivo, um agente de RNAi pode ser injetado em um local de tecido ou administrado sistemicamente. A introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica, como eletroporação e lipofecção. Outras abordagens são descritas aqui abaixo e/ou são conhecidas na técnica.
[302] O termo “lipófilo” ou “grupamento lipofílico” refere-se amplamente a qualquer composto ou fração química com afinidade por lipídios. Uma forma de caracterizar a lipofilicidade do grupamento lipofílico é pelo coeficiente de partição octanol-água, logKow, onde Kow é a razão entre a concentração de um produto químico na fase octanol e sua concentração na fase aquosa de um sistema bifásico em equilíbrio. O coeficiente de partição octanol-água é uma propriedade de uma substância medida em laboratório. No entanto, também pode ser previsto usando coeficientes atribuídos aos componentes estruturais de um produto químico que são calculados usando o primeiro princípio ou métodos empíricos (ver, por exemplo, Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41: 1.407 a 1.421 (2001), que é incorporado aqui por referência em sua totalidade). Ele protege uma medida termodinâmica da tendência da substância de preferir um meio não aquoso ou oleoso em vez de água (ou seja, seu equilíbrio hidrofílico/lipofílico). Em princípio, uma substância química é de caráter lipofílico quando seu logKow excede 0. Normalmente, o grupamento lipofílico possui um logKow superior a 1, superior a 1,5, superior a 2, superior a 3, superior a 4, superior a 5, ou superior a 10. Por exemplo, o logKow do 6- amino hexanol, por exemplo, está previsto em aproximadamente 0,7. Usando o mesmo método, o logKow de carbamato de colesteril N-(hexan-6-ol) está previsto para ser 10,7.
[303] A lipofilicidade de uma molécula pode mudar em relação ao grupo funcional que ela carrega. Por exemplo, adicionar um grupo hidroxila ou grupo amina ao final de um grupamento lipofílico pode aumentar ou diminuir o valor do coeficiente de partição (por exemplo, logKow) do grupamento lipofílico.
[304] Alternativamente, a hidrofobicidade do agente de RNAi de duplo filamento, conjugada a um ou mais grupamentos lipofílicos, pode ser medida por suas características de ligação a proteínas. Por exemplo, em certas modalidades, a fração não ligada no ensaio de ligação de proteína de plasma do agente de RNAi de duplo filamento poderia ser determinada como correlacionada positivamente à hidrofobicidade relativa do agente de RNAi de duplo filamento, que poderia então correlacionar positivamente com a atividade silenciadora do agente de RNAi de duplo filamento.
[305] Em uma modalidade, o ensaio de ligação de proteína de plasma determinado é um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) usando proteína humana de albumina sérica. Um protocolo exemplificativo deste ensaio de ligação é ilustrado em detalhes, por exemplo, nos Pedidos de Patente US 62/668.072, 62/738.747 e/ou 62/773.082. A hidrofobicidade do agente de RNAi de duplo filamento, medida pela fração de siRNA não ligada no ensaio de ligação, excede 0,15, excede 0,2, excede 0,25, excede 0,3, excede 0,35, excede 0,4, excede 0,45, ou excede 0,5 para uma entrega aprimorada in vivo de siRNA.
[306] Consequentemente, a conjugação dos grupamentos lipofílicos à posição interna (ou às posições internas) do agente de RNAi de duplo filamento oferece ótima hidrofobicidade para a entrega aprimorada in vivo de siRNA.
[307] O termo “nanopartícula lipídica” ou “LNP” é uma vesícula que compreende uma camada lipídica que encapsula uma molécula farmaceuticamente ativa, como uma molécula de ácido nucleico, por exemplo, um agente rNAi ou um plasmídeo a partir do qual um agente de RNAi é transcrito. Os LNPs são descritos, por exemplo, nas Patentes nos US 6.858.225,
6.815.432, 8.158.601 e 8.058.069, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[308] Como usado no presente documento, um “sujeito” é um animal, como um mamífero, incluindo um primata (como um humano, um primata não humano, por exemplo, um macaco, um chimpanzé), um não primata (como uma vaca, um porco, um camelo, uma lhama, um cavalo, uma cabra, um coelho, uma ovelha, um hamster, uma cobaia, um gato, um cachorro, um rato, um camundongo, um cavalo e uma baleia), ou um pássaro (por exemplo, um pato ou um ganso). Em uma modalidade, o sujeito é um ser humano, como um ser humano tratado ou avaliado para uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução na expressão de APP; um ser humano em risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria com a redução da expressão de APP; um ser humano com uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria com a redução na expressão de APP; e/ou ser humano tratado para uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria da redução na expressão de APP, conforme descrito neste documento.
[309] Como usado no presente documento, os termos “tratando” ou “tratamento” referem-se a um resultado benéfico ou desejado, incluindo, mas não se limitando a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas associados ao gene de expressão de APP e/ou produção de proteína de APP, por exemplo, doenças associadas à APP ou doenças como DA, CAA (por exemplo, CAA hereditária) e EOFAD, entre outras. “Tratamento” também pode significar o prolongamento da sobrevida em comparação com a sobrevida esperada na ausência de tratamento.
[310] O termo “inferior” no contexto do nível de APP em um sujeito ou um marcador de doença ou sintoma se refere a uma diminuição estatisticamente significativa desse nível. A diminuição pode ser, por exemplo, pelo menos 10%, pelo menos
15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais. Em determinadas modalidades, uma diminuição é pelo menos 20%. “Inferior” no contexto do nível de APP em um sujeito é preferencialmente baixo para um nível aceito como dentro da faixa normal para um indivíduo sem esse transtorno.
[311] Como usado no presente documento, “prevenção” ou “prevenindo”, quando usado em referência a uma doença, distúrbio ou condição da mesma, que se beneficiaria de uma redução na expressão de um gene de APP e/ou produção de proteína de APP, refere-se a uma redução na probabilidade de que um sujeito desenvolverá um sintoma associado a tal doença, distúrbio, ou condição, por exemplo, um sintoma de expressão do gene de APP, como a presença de várias formas de Aβ (por exemplo, Aβ38, Aβ40 e/ou Aβ42, etc.), placas amiloides e/ou angiopatia amiloide cerebral (CAA) ou doença de Alzheimer (DA), incluindo, por exemplo, doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD). O não desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição, ou a redução no desenvolvimento de um sintoma associado a tal doença, distúrbio ou condição (por exemplo, pelo menos cerca de 10% em uma escala clinicamente aceita para aquela doença ou distúrbio), ou a exibição de sintomas retardados (por exemplo, por dias, semanas, meses ou anos) é considerada prevenção eficaz.
[312] Como usado no presente documento, o termo “doença associada à APP” é uma doença ou distúrbio que é causado por, ou está associado à expressão do gene APP ou à produção de proteína de APP. O termo “doença associada à APP”
inclui uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria de uma diminuição no gene de expressão, replicação ou atividade proteica de APP. Exemplos não limitativos de doenças associadas à APP incluem, por exemplo, angiopatia amiloide cerebral (CAA) e doença de Alzheimer (DA), incluindo, por exemplo, doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
[313] “Quantidade terapeuticamente eficaz”, como usado no presente documento, destina-se a incluir a quantidade de um agente de RNAi que, quando administrado a um sujeito com um distúrbio associado à APP, é suficiente para efetuar o tratamento da doença (por exemplo, diminuindo, melhorando ou mantendo a doença existente ou um ou mais sintomas da doença). A “quantidade terapeuticamente eficaz” pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, a doença e sua gravidade e a história, idade, peso, história familiar, composição genética, tipos de tratamentos anteriores ou concomitantes, se houver, e outras características individuais do assunto a ser tratado.
[314] “Quantidade profilaticamente eficaz”, como usado no presente documento, destina-se a incluir a quantidade de um agente de RNAi que, quando administrado a um sujeito com um distúrbio associado à APP, é suficiente para prevenir ou melhorar a doença ou um ou mais sintomas da doença. A melhora da doença inclui retardar o curso da doença ou reduzir a gravidade da doença de desenvolvimento posterior. A “quantidade profilaticamente eficaz” pode variar dependendo do agente de RNAi, como o agente é administrado, o grau de risco de doença, e o histórico, idade, peso, histórico familiar, composição genética, tipos de tratamentos anteriores ou concomitantes, se houver, e outras características individuais do paciente a ser tratado.
[315] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade profilaticamente eficaz” também inclui uma quantidade de um agente de RNAi que produz algum efeito local ou sistêmico desejado a uma relação risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento. Um agente de RNAi empregado nos métodos da presente revelação pode ser administrado em uma quantidade suficiente para produzir uma relação risco/benefício razoável aplicável a tal tratamento.
[316] A frase “farmaceuticamente aceitável” é empregada neste documento para se referir a esses compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do bom julgamento médico, adequados para uso em contato com os tecidos de sujeitos humanos e sujeitos animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional a uma relação risco/benefício razoável.
[317] A frase “carreador farmaceuticamente aceitável” como usado no presente documento significa um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um enchimento líquido ou sólido, diluente, excipiente, auxiliar de fabricação (por exemplo, lubrificante, talco magnésio, cálcio ou estearato de zinco ou ácido estérico), ou material encapsulante de solvente, envolvido no transporte ou transporte do composto em questão de um órgão, ou porção do corpo, para outro órgão ou porção do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de ser compatível com os demais ingredientes da formulação e não prejudicar o sujeito a ser tratado. Alguns exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1)
açúcares, como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose, e seus derivados, tais como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estado de magnésio, laurilsulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de sésamo, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propilenoglicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietilenoglicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes tamponantes, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água apirogênica; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções com pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, como polipeptídeos e aminoácidos; (23) componente do soro, como albumina sérica, HDL e LDL; e (22) outras substâncias não tóxicas compatíveis empregadas em formulações farmacêuticas.
[318] O termo “amostra”, como usado no presente documento, inclui uma coleção de fluidos, células ou tecidos semelhantes isolados de um sujeito, bem como fluidos, células ou tecidos presentes dentro de um sujeito. Exemplos de fluidos biológicos incluem sangue, soro e fluidos serosos, plasma, líquido cefalorraquidiano, fluidos oculares, linfa, urina, saliva e semelhantes. As amostras de tecido podem incluir amostras de tecidos, órgãos ou regiões localizadas. Por exemplo, as amostras podem ser derivadas de órgãos específicos,
partes de órgãos ou fluidos ou células desses órgãos. Em determinadas modalidades, as amostras podem ser derivadas do cérebro (por exemplo, cérebro inteiro ou certos segmentos do cérebro ou certos tipos de células no cérebro, como, por exemplo, neurônios e células gliais (astrócitos, oligodendrócitos, células microgliais)). Em algumas modalidades, uma “amostra derivada de um sujeito” refere-se ao sangue ou plasma extraído do sujeito. Em outras modalidades, uma “amostra derivada de um sujeito” se refere ao tecido cerebral (ou subcomponentes do mesmo) ou tecido retinal (ou subcomponentes do mesmo) derivado do sujeito. II. AGENTES DE RNAI DA REVELAÇÃO
[319] São descritos aqui agentes de RNAi que inibem a expressão de um gene de APP. Em uma modalidade, o agente de RNAi inclui moléculas de ácido ribonucleico de duplo filamento (dsRNA) para inibir a expressão de um gene de APP em uma célula, como uma célula dentro de um sujeito, por exemplo, um mamífero, como um humano tendo um distúrbio associado à APP, por exemplo, angiopatia amiloide cerebral (CAA) ou doença de Alzheimer (AD), incluindo, por exemplo, doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD). O dsRNA inclui um filamento antissenso com uma região de complementaridade que é complementar a pelo menos uma parte de um mRNA formado na expressão de um gene de APP. A região de complementaridade tem cerca de 30 nucleotídeos ou menos em comprimento (por exemplo, cerca de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, ou 18 nucleotídeos ou menos em comprimento). Ao entrar em contato com uma célula expressando o gene de APP, o agente de RNAi inibe a expressão do gene de APP (por exemplo, um gene de APP humano, primata, não primata ou de ave) por pelo menos cerca de 10% conforme determinado por, por exemplo, um método à base de PCR ou DNA ramificado (bDNA), ou por método à base de proteínas, como por análise de imunofluorescência, utilizando, por exemplo, Western Blotting ou técnicas de citometria de fluxo.
[320] Um dsRNA inclui dois filamentos de RNA que são complementares e hibridizam para formar uma estrutura de duplex sob condições nas quais o dsRNA será usado. Um filamento de um dsRNA (o filamento antissenso) inclui uma região de complementaridade que é acessório complementar, e geralmente totalmente complementar, a uma sequência-alvo. A sequência alvo pode ser derivada da sequência de um mRNA formado durante a expressão de um gene de APP. O outro filamento (o filamento sensor) inclui uma região que é complementar ao filamento antissenso, de modo que os dois filamentos hibridizem e formem uma estrutura de duplex quando combinados em condições adequadas. Conforme descrito em outro lugar aqui e como conhecido na técnica, as sequências complementares de um dsRNA também podem estar contidas como regiões autocomplementares de uma única molécula de ácido nucleico, em oposição a estar em oligonucleotídeos separados.
[321] Geralmente, a estrutura de duplex é entre 15 e 30 pares de base em comprimento, por exemplo, entre 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25 , 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a
27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23 ou 21 a 22 pares de base em comprimento. Em certas modalidades preferenciais, a estrutura de duplex é entre 18 e 25 pares de base em comprimento, por exemplo, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 25 , 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23, 21 a 22, 22 a 25, 22 a 24, 22 a 23, 23 a 25, 23 a 24 ou 24 a 25 pares de base em comprimento. Faixas e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos citados acima também são contemplados como parte da revelação.
[322] Da mesma forma, a região de complementaridade à sequência-alvo é entre 15 e 30 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, entre 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23 ou 21 a 22 nucleotídeos em comprimento. Faixas e comprimentos intermediários aos intervalos e comprimentos citados acima também são contemplados como parte da revelação.
[323] Em algumas modalidades, o dsRNA está entre cerca de 15 e cerca de 23 nucleotídeos em comprimento ou entre cerca de 25 e cerca de 30 nucleotídeos em comprimento. Em geral, o dsRNA é longo o suficiente para servir como substrato para a enzima Dicer. Por exemplo, é bem conhecido na técnica que dsRNAs maiores que cerca de 21 a 23 nucleotídeos podem servir de substratos para Dicer. Como o versado na técnica também reconhecerá, a região de um RNA direcionado para clivagem será na maioria das vezes parte de uma molécula de RNA maior, frequentemente uma molécula de mRNA. Quando relevante, uma “parte” de um alvo de mRNA é uma sequência contígua de um alvo de mRNA de comprimento suficiente para permitir que seja um substrato para clivagem dirigida por RNAi (isto é, clivagem através de uma via RISC).
[324] [00324] Um versado na técnica também reconhecerá que a região duplex é uma porção funcional primária de um dsRNA, por exemplo, uma região duplex de cerca de 9 a 36 par de bases, por exemplo, cerca de 10 a 36, 11 a 36, 12 a 36, 13 a 36, 14 a 36, 15 a 36, 9 a 35, 10 a 35, 11 a 35, 12 a 35, 13 a 35, 14 a 35, 15 a 35, 9 a 34, 10 a 34, 11 a 34, 12 a 34, 13 a 34, 14 a 34, 15 a 34, 9 a 33, 10 a 33, 11 a 33, 12 a 33, 13 a 33, 14 a 33, 15 a 33, 9 a 32, 10 a 32, 11 a 32, 12 a 32, 13 a 32, 14 a 32, 15 a 32, 9 a 31, 10 a 31, 11 a 31, 12 a 31, 13 a 32, 14 a 31, 15 a 31, 15 a 30, 15 a 29, 15 a 28, 15 a 27, 15 a 26, 15 a 25, 15 a 24, 15 a 23, 15 a 22, 15 a 21, 15 a 20, 15 a 19, 15 a 18, 15 a 17, 18 a 30, 18 a 29, 18 a 28, 18 a 27, 18 a 26, 18 a 25, 18 a 24, 18 a 23, 18 a 22, 18 a 21, 18 a 20, 19 a 30, 19 a 29, 19 a 28, 19 a 27, 19 a 26, 19 a 25, 19 a 24, 19 a 23, 19 a 22, 19 a 21, 19 a 20, 20 a 30, 20 a 29, 20 a 28, 20 a 27, 20 a 26, 20 a 25, 20 a 24,20 a 23, 20 a 22, 20 a 21, 21 a 30, 21 a 29, 21 a 28, 21 a 27, 21 a 26, 21 a 25, 21 a 24, 21 a 23 ou 21 a 22 pares de base. Assim, em uma modalidade, na medida em que se torna processado para um duplex funcional, por exemplo, 15 a 30 pares de base, que visa um RNA desejado para clivagem, uma molécula de RNA ou complexo de moléculas de RNA tendo uma região de duplex maior de 30 par de bases é um dsRNA. Assim, um versado na técnica irá reconhecer que em uma modalidade, um miRNA é um dsRNA. Em outra modalidade, um dsRNA não é um miRNA de ocorrência natural. Em outra modalidade, um agente de RNAi útil para a expressão de APP-alvo não é gerado na célula-alvo por clivagem de um dsRNA maior.
[325] Um dsRNA como aqui descrito pode incluir ainda uma ou mais projeção de nucleotídeos de filamento único, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos. Os dsRNAs com pelo menos uma projeção de nucleotídeo podem ter propriedades inibitórias inesperadamente superiores em relação às suas contrapartes sem corte. Uma projeção de nucleotídeo pode compreender ou consistir em um análogo de nucleotídeo/nucleosídeo, incluindo um desoxinucleotídeo/nucleosídeo. A projeção pode (ou as projeções podem) ser sem filamento sensor, o filamento antissenso ou qualquer combinação dos mesmos. Além disso, o nucleotídeode uma projeção pode estar presente (ou os nucleotídeos de uma projeção podem estar presentes) na extremidade 5', extremidade 3' ou em ambas as extremidades de um filamento antissenso ou sensor de um dsRNA.
[326] Um dsRNA pode ser sintetizado por métodos padrão conhecidos na técnica, conforme discutido abaixo, por exemplo, pelo uso de um sintetizador de DNA automatizado, tal como estão disponíveis comercialmente em, por exemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
[327] Os agentes de RNAi da revelação podem ser preparados usando um procedimento de duas etapas. Primeiro, as fitas individuais da molécula de RNA de duplo filamento são preparadas separadamente. Em seguida, os fios componentes são recozidos. Os filamentos únicos do composto de siRNA podem ser preparados usando síntese orgânica em fase de solução ou em fase sólida ou ambas. A síntese orgânica oferece a vantagem de que os filamentos de oligonucleotídeos compreendendo nucleotídeos não naturais ou modificados podem ser facilmente preparados. Os oligonucleotídeos de filamento único da revelação podem ser preparados usando síntese orgânica em fase de solução ou sólida ou ambos.
[328] Em um aspecto, um dsRNA da revelação inclui pelo menos duas sequências de nucleotídeos, uma sequência senso e uma sequência antissenso. A sequência do filamento sensor pode ser selecionada a partir do grupo de sequências fornecidas em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26 e a sequência de nucleotídeos correspondente do filamento antissenso do filamento sensor pode ser selecionada a partir do grupo de sequências de qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26. Nesse aspecto, uma das duas sequências é complementar à outra das duas sequências, sendo uma das sequências complementar a uma sequência de um mRNA gerado na expressão de um gene de APP. Como tal, nesse aspecto, um dsRNA incluirá dois oligonucleotídeos, onde um oligonucleotídeo é descrito como o filamento sensor (filamento passageiro) em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26, e o segundo oligonucleotídeo é descrito como o filamento antissenso correspondente (filamento-guia) do filamento sensor em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26. Consequentemente, a título de exemplo, as seguintes seleções de pares de sequências de filamento senso e antissenso da Tabela 3 são expressamente contempladas como formadoras de duplexes da presente revelação: SEQ ID NOs: 855 e 856; SEQ ID NOs: 857 e 858; SEQ ID NOs: 859 e 860; SEQ ID
NOs: 861 e 862; SEQ ID NOs: 863 e 864; SEQ ID NOs: 865 e 866; SEQ ID NOs: 867 e 868; SEQ ID NOs: 869 e 870; SEQ ID NOs: 871 e 872; SEQ ID NOs: 873 e 874; SEQ ID NOs: 875 e 876; SEQ ID NOs: 877 e 878; SEQ ID NOs: 879 e 880; SEQ ID NOs: 881 e 882; SEQ ID NOs: 883 e 884; SEQ ID NOs: 885 e 886; SEQ ID NOs: 887 e 888; SEQ ID NOs: 889 e 890; SEQ ID NOs: 891 e 892; SEQ ID NOs: 893 e 894; SEQ ID NOs: 895 e 896; SEQ ID NOs: 897 e 898; SEQ ID NOs: 899 e 900; SEQ ID NOs: 901 e 902; SEQ ID NOs: 903 e 904; SEQ ID NOs: 905 e 906; SEQ ID NOs: 907 e 908; SEQ ID NOs: 909 e 910; SEQ ID NOs: 911 e 912; SEQ ID NOs: 913 e 914; SEQ ID NOs: 915 e 916; SEQ ID NOs: 917 e 918; SEQ ID NOs: 919 e 920; SEQ ID NOs: 921 e 922; SEQ ID NOs: 923 e 924; SEQ ID NOs: 925 e 926; SEQ ID NOs: 927 e 928; SEQ ID NOs: 929 e 930; SEQ ID NOs: 931 e 932; SEQ ID NOs: 933 e 934; SEQ ID NOs: 935 e 936; SEQ ID NOs: 937 e 938; SEQ ID NOs: 939 e 940; SEQ ID NOs: 941 e 942; SEQ ID NOs: 943 e 944; SEQ ID NOs: 945 e 946; SEQ ID NOs: 947 e 948; SEQ ID NOs: 949 e 950; SEQ ID NOs: 951 e 952; SEQ ID NOs: 953 e 954; SEQ ID NOs: 955 e 956; SEQ ID NOs: 957 e 958; SEQ ID NOs: 959 e 960; SEQ ID NOs: 961 e 962; SEQ ID NOs: 963 e 964; SEQ ID NOs: 965 e 966; SEQ ID NOs: 967 e 968; SEQ ID NOs: 969 e 970; SEQ ID NOs: 971 e 972; SEQ ID NOs: 973 e 974; SEQ ID NOs: 975 e 976; SEQ ID NOs: 977 e 978; SEQ ID NOs: 979 e 980; SEQ ID NOs: 981 e 982; SEQ ID NOs: 983 e 984; SEQ ID NOs: 985 e 986; SEQ ID NOs: 987 e 988; SEQ ID NOs: 989 e 990; SEQ ID NOs: 991 e 992; SEQ ID NOs: 993 e 994; SEQ ID NOs: 995 e 996; SEQ ID NOs: 997 e 998; SEQ ID NOs: 999 e 1000; SEQ ID NOs: 1001 e 1002; SEQ ID NOs: 1003 e 1004; SEQ ID NOs: 1005 e 1006; SEQ ID NOs: 1007 e 1008; SEQ ID NOs: 1009 e 1010; SEQ ID NOs: 1011 e 1012; SEQ ID NOs: 1013 e 1014; SEQ ID NOs: 1015 e 1016; SEQ ID NOs: 1017 e 1018; SEQ ID NOs: 1019 e 1020; SEQ ID NOs: 1021 e 1022; SEQ ID NOs: 1023 e 1024; SEQ ID NOs: 1025 e 1026; SEQ ID NOs: 1027 e 1028; SEQ ID NOs: 1029 e 1030; SEQ ID NOs: 1031 e 1032; SEQ ID NOs: 1033 e 1034; SEQ ID NOs: 1035 e 1036; SEQ ID NOs: 1037 e 1038; SEQ ID NOs: 1039 e 1040; SEQ ID NOs: 1041 e 1042; SEQ ID NOs: 1043 e 1044; SEQ ID NOs: 1045 e 1046; SEQ ID NOs: 1047 e 1048; SEQ ID NOs: 1049 e 1050; SEQ ID NOs: 1051 e 1052; SEQ ID NOs: 1053 e 1054; SEQ ID NOs: 1055 e 1056; SEQ ID NOs: 1057 e 1058; SEQ ID NOs: 1059 e 1060; SEQ ID NOs: 1061 e 1062; SEQ ID NOs: 1063 e 1064; SEQ ID NOs: 1065 e 1066; SEQ ID NOs: 1067 e 1068; SEQ ID NOs: 1069 e 1070; SEQ ID NOs: 1071 e 1072; SEQ ID NOs: 1073 e 1074; SEQ ID NOs: 1075 e 1076; SEQ ID NOs: 1077 e 1078; SEQ ID NOs: 1079 e 1080; SEQ ID NOs: 1081 e 1082; SEQ ID NOs: 1083 e 1084; SEQ ID NOs: 1085 e 1086; SEQ ID NOs: 1087 e 1088; SEQ ID NOs: 1089 e 1090; SEQ ID NOs: 1091 e 1092; SEQ ID NOs: 1093 e 1094; SEQ ID NOs: 1095 e 1096; SEQ ID NOs: 1097 e 1098; SEQ ID NOs: 1099 e 1100; SEQ ID NOs: 1101 e 1102; SEQ ID NOs: 1103 e 1104; SEQ ID NOs: 1105 e 1106; SEQ ID NOs: 1107 e 1108; SEQ ID NOs: 1109 e 1110; SEQ ID NOs: 1111 e 1112; SEQ ID NOs: 1113 e 1114; 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Da mesma forma, combinações de pares de filamentos senso e antissenso das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26 da revelação de presente também são expressamente contempladas, incluindo, por exemplo, um filamento sensor selecionado da Tabela 2A junto com um filamento antissenso selecionado da Tabela 2B, ou vice-versa, etc.
[329] Em uma modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em oligonucleotídeos separados. Em outra modalidade, as sequências substancialmente complementares do dsRNA estão contidas em um único oligonucleotídeo.
[330] Será entendido que, embora as sequências nas Tabelas 2A, 2B, 5A, 5B, 9, 10, 12, 14, 16A, 16B e 26 sejam descritas como sequências conjugadas e/ou modificadas, o RNA do agente de RNAi da revelação, por exemplo, um dsRNA da revelação, pode compreender qualquer uma das sequências estabelecidas em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26 que é não modificado, não conjugado e/ou modificado e/ou conjugado de forma diferente do que aqui descrito.
[331] O versado na técnica está bem ciente de que dsRNAs com uma estrutura de duplex de entre cerca de 20 e 23 pares de base, por exemplo, 21 pares de base foram saudados como particularmente eficazes na indução de interferência de RNA (Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20: 6.877 a 6.888). No entanto, outros revelaram que uma estrutura de duplexes de RNA mais curta ou mais longa também pode ser eficaz (Chu e Rana (2007) RNA 14: 1.714 a 1.719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23: 222 a 226). Nas modalidades descritas acima, em virtude da natureza das sequências de oligonucleotídeos aqui fornecidas, os dsRNAs aqui descritos podem incluir pelo menos um filamento com comprimento mínimo de 21 nucleotídeos. Pode-se razoavelmente esperar que duplexes mais curtos sem apenas alguns nucleotídeos em uma ou em ambas as extremidades possam ser igualmente eficazes em comparação com os dsRNAs descritos acima. Assim, dsRNAs possuindo sequência de pelo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos contíguos derivados de uma das sequências aqui fornecidas, e diferindo na capacidade de inibir a expressão de um gene de APP por não mais do que cerca de 5, 10, 15, 20, 25 ou 30% de inibição de um dsRNA compreendendo a sequência completa, são contemplados como estando dentro do escopo da presente revelação.
[332] Além disso, os RNAs aqui descritos identificam um ou mais locais em um transcrito de APP que é suscetível à clivagem mediada por RISC. Dessa forma, a presente revelação apresenta ainda agentes de RNAi direcionados a este local (ou a estes locais). Como usado no presente documento, diz-se que um agente de RNAi atinge um determinado local de uma transcrição de RNA se o agente de RNAi promover a clivagem da transcrição em qualquer parte desse local específico. Tal agente de RNAi geralmente incluirá pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos de uma das sequências aqui fornecidas acopladas a sequências de nucleotídeos adicionais retiradas da região contígua à sequência selecionada em um gene de APP.
[333] Um agente de RNAi, como descrito no presente documento, pode conter uma ou mais incompatibilidades com a sequência-alvo. Em uma modalidade, um agente de RNAi, como descrito no presente documento, contém não mais do que 3 incompatibilidades. Em determinadas modalidades, se o filamento antissenso do agente de RNAi contiver incompatibilidades com a sequência-alvo, a incompatibilidade pode opcionalmente ser restrita para estar dentro dos últimos 5 nucleotídeos a partir da extremidade 5’ ou extremidade 3’ da região de complementaridade. Por exemplo, em tais modalidades, para um agente de RNAi de 23 nucleotídeos, o filamento que é complementar a uma região de um gene de APP, geralmente não contém nenhuma incompatibilidade dentro dos 13 nucleotídeos centrais. Os métodos aqui descritos ou métodos conhecidos na técnica podem ser utilizados para determinar se um agente de RNAi contendo uma incompatibilidade com a sequência-alvo é eficaz na inibição da expressão de um gene de APP. A consideração da eficácia de agentes de RNAi com incompatibilidades na inibição da expressão de um gene de APP é importante, especialmente se a região de complementaridade particular em um gene de APP é conhecida por ter variação de sequência polimórfica dentro da população. III. AGENTES DE RNAI MODIFICADOS DA REVELAÇÃO
[334] Em uma modalidade, o RNA do agente de RNAi da revelação por exemplo, um dsRNA, é não modificado, e não compreende, por exemplo, modificações químicas e/ou conjugações conhecidas na técnica e aqui descritas. Em outra modalidade, o RNA de um agente de RNAi da revelação, por exemplo, um dsRNA, é quimicamente modificado para aumentar a estabilidade ou outras características benéficas. Em modificações da revelação, são modificados todos os nucleotídeos de um agente de RNAi da revelação. Em outras modalidades da revelação, todos os nucleotídeos de um agente de RNAi da revelação são modificados. Os agentes de RNAi da revelação em que “substancialmente todos os nucleotídeos são modificados” são amplamente, mas não totalmente modificados, e podem incluir no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos não modificados. Em ainda outras modalidades da revelação, agentes de RNAi da revelação podem incluir no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeos modificados.
[335] Os ácidos nucleicos apresentados na revelação podem ser sintetizados e/ou modificados por métodos bem estabelecidos na técnica, como aqueles descritos em “Current protocols in nucleic acid chemistry,” Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, NY, EUA, que está aqui incorporado a título de referência. As modificações incluem, por exemplo, modificações de extremidade, por exemplo, modificações de extremidade 5’ (fosforilação, conjugação, ligações invertidas) ou modificações de extremidade 3’ (conjugação, nucleotídeos de DNA, ligações invertidas, etc.); modificações de base, por exemplo, substituição por bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras ou bases que realizam pareamento de base com um repertório expandido de parceiros, remoção de bases (nucleotídeos abásicos) ou bases conjugadas; modificações de açúcar (por exemplo, na posição 2’ ou posição 4’) ou substituição do açúcar; e/ou modificações de cadeia principal, incluindo modificação ou substituição das ligações de fosfodiéster. Os exemplos específicos de agentes de RNAi úteis nas modalidades descritas no presente documento incluem, mas sem limitação a RNAs contendo cadeias principais modificadas ou ligações internucleosídicas não naturais. Os RNAs com cadeias principais modificadas incluem, entre outros, aqueles que não têm um átomo de fósforo na cadeia principal. Para os fins deste relatório descritivo, e como às vezes referenciado na técnica, os RNAs modificados que não têm um átomo de fósforo em sua cadeia principal de internucleosídeo também podem ser considerados oligonucleosídeos. Em algumas modalidades, um agente de RNAi modificado terá um átomo de fósforo em sua cadeia principal de internucleosídeo.
[336] As cadeias principais de RNA modificadas incluem, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilafosfotriésteres, metila e outros fosfonatos de alquila incluindo fosfonatos de 3’-alquileno e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo fosforamidato de 3'-amino e fosforamidatos de aminoalquila, tionofosforamidatos, tionoalquilafosfonatos, tionoalquilafosfotriésteres e boranofosfatos com ligações 3'-
5' normais, análogos ligados a 2'-5' dos mesmos, e aqueles com polaridade invertida, em que os pares adjacentes de unidades de núcleosídeos têm ligações 3'-5' a 5'-3' ou 2'-5' a 5'-2'. Vários sais, sais misturados e formas de ácido livre também estão incluídos.
[337] As patentes US representativas que ensinam a preparação das ligações contendo fósforo acima incluem, mas sem limitação, patentes nos US 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301;
5.023.243; 5.177.195; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019;
5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939;
5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126;
5.536.821; 5.541.316; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799;
5.587.361; 5.625.050; 6.028.188; 6.124.445; 6.160.109;
6.169.170; 6.172.209; 6.239.265; 6.277.603; 6.326.199;
6.346.614; 6.444.423; 6.531.590; 6.534.639; 6.608.035;
6.683.167; 6.858.715; 6.867.294; 6.878.805; 7.015.315;
7.041.816; 7.273.933; 7.321.029; e patente US RE39464, cujo todo o conteúdo de cada uma dessas está aqui incorporado a título de referência.
[338] As cadeias principais de RNA modificadas que não incluem um átomo de fósforo nelas têm cadeias principais que são formadas por ligações de internucleosídeos de cadeia curta alquila ou cicloalquila, heteroátomos mistos e ligações de internucleosídeos alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações de heteroátomos internucleosídeos ou heterocíclicos de cadeia curta. Esses incluem aqueles que possuem ligações morfolino (formados em parte a partir da porção de açúcar de um nucleosídeo); cadeias principais de siloxano; estruturas de sulfeto, sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetila e tioformacetila; cadeias principais de metilenoformacetila e tioformacetila; alceno contendo cadeias principais; cadeias principais de sulfamato; cadeias principais de metilenoimino e metilenodrazino; cadeias principais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e outras tendo misturas de componentes N, O, S e CH2.
[339] As patentes US representativas que ensinam a preparação dos oligonucleosídeos acima incluem, mas não se limitam a patentes nos US 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444;
5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.64.562; 5.264.564;
5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677;
5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.608.046;
5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360;
5.677.437; e 5.677.439, cujo conteúdo das mesmas está aqui incorporado a título de referência.
[340] Em outras modalidades, os miméticos de RNA adequados são contemplados para uso em agentes de RNAi, nos quais tanto o açúcar quanto a ligação internucleosídica, ou seja, a cadeia principal, das unidades de nucleotídeo são substituídos por novos grupos. As unidades de base são mantidas para hibridização com um composto-alvo de ácido nucleico apropriado. Um desses compostos oligoméricos, um mimético de RNA que demonstrou ter excelentes propriedades de hibridização, é referido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos de PNA, a estrutura de açúcar de um RNA é substituída por uma estrutura contendo amida, em particular uma estrutura de aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e ligadas direta ou indiretamente aos átomos de nitrogênio aza da porção amida da cadeia principal. As patentes US representativas que ensinam a preparação de compostos de PNA incluem, mas não estão limitadas a patentes nos US 5.539.082;
5,714,331; e 5.719.262, cujo todo o conteúdo de cada uma dessas é aqui incorporado por referência. Os compostos de PNA adicionais adequados para uso em agentes de RNAi da revelação são descritos, por exemplo, em Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1.497 a 1.500.
[341] Algumas modalidades apresentadas na revelação incluem RNAs com cadeias principais de fosforotioato e oligonucleosídeos com cadeias principais de heteroátomo e, em particular, --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2-- [conhecido como um metileno (metilimino) ou cadeia principal de MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- e --N(CH3)--CH2--CH2--[em que a cadeia principal de fosfodiéster nativo é representada como --O--P--O--CH2--] da patente nº US
5.489.677 acima referenciada, e as cadeias principais de amida da patente nº US 5.602.240 acima referenciada. Em algumas modalidades, os RNAs apresentados no presente documento têm estruturas de cadeia principal de morfolino da patente nº US
5.034.506 acima referenciada.
[342] Os RNAs modificados também podem conter um ou mais grupamentos de açúcar substituídos. Os agentes de RNAi, por exemplo, dsRNAs, apresentados no presente documento podem incluir um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-, S- ou N- alquila; O-, S- ou N-alquenila; O-, S- ou N-alquinila; ou O- alquil-O-alquila, em que a alquila, alquenila e alquinila podem ser C1 a C10 alquila ou C2 a C10 alquenila e alquinila substituídas ou não substituídas. As modificações adequadas exemplificativas incluem O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2) nCH3, O(CH2)nONH2 e O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, em que n e m são de 1 a cerca de 10. Em outras modalidades, os dsRNAs incluem um dos seguintes na posição 2': C1 a C10 alquila inferior, alquila inferior substituída, alcarila, aralquila, O-alcarila ou O-aralquila, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquila, heterocicloalcarila, aminoalquilamino, polialquilamino, silila substituída, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para aprimorar as propriedades farmacocinéticas de um agente de RNAi, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um agente de RNAi, e outros substituintes com propriedades similares. Em algumas modalidades, a modificação inclui um 2'-metoxietoxi (2'-O--CH2CH2OCH3, também conhecido como 2'-O-(2-metoxietila) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486 a 504), ou seja, um grupo alcóxi-alcóxi. Outra modificação exemplificativa é 2'-dimetilaminoxietoxi, ou seja, um grupo O(CH2)2ON(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, como descrito nos exemplos no presente documento abaixo, e 2'- dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na técnica como 2'- O-dimetilaminoetoxietila ou 2'-DMAEOE), ou seja, 2'-O--CH2--O- -CH2--N(CH2)2. As modificações adicionalmente exemplificativas incluem: nucleotídeos 5’-Me-2’-F, nucleotídeos 5’-Me-2’-OMe, 5’-Me-2’-desoxinucleotídeos, (os isômeros R e S nessas três famílias); 2’-alcoxialquila; e 2’-NMA (N-metilacetamida).
[343] Outras modificações incluem 2'-metóxi (2'- OCH3), 2'-aminopropóxi (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2’-O-hexadecila e 2'-fluoro (2'-F). As modificações similares também podem ser feitas em outras posições no RNA de um agente de RNAi, particularmente a posição 3' do açúcar no nucleotídeo 3' terminal ou em dsRNAs ligados em 2'-5' e a posição 5' do nucleotídeo 5' terminal. Os agentes de RNAi também podem ter miméticos de açúcar como grupamentos de ciclobutila no lugar do açúcar pentofuranosila. As patentes US representativas que ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas incluem, mas não se limitam a patentes nos US 4.981.957;
5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137;
5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427;
5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873;
5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; e 5.700.920, alguns dos quais são comumente pertencentes ao presente pedido. Todo o conteúdo de cada uma das anteriores está aqui incorporado por referência.
[344] Um agente de RNAi da revelação também pode incluir modificações ou substituições de nucleobase (frequentemente referida na técnica simplesmente como “base”). Como usado no presente documento, nucleobases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases purina adenina (A) e guanina (G), e as bases pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). As nucleobases modificadas incluem outras nucleobases sintéticas e naturais como 5-metilcitosina (5-me- C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5- halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4- tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-deazaguanina e 7-daazaadenina e 3-deazaguanina e 3-deaza-adenina. As nucleobases adicionais incluem aquelas reveladas na patente nº US 3.687.808, aquelas reveladas em Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; aquelas reveladas em The Concise Enciclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858 a 859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, essas reveladas por Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613, e aquelas reveladas por Sanghvi, Y S., Capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289 a 302, Crooke, S. T. e Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Determinadas dessas nucleobases são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos apresentados na revelação. Essas incluem pirimidinas 5-substituídas, 6- azapirimidinas e N-2, N-6 e 0 a 6 purinas substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5- propinilcitosina. As substituições de 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6 a 1,2 °C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., Eds., dsRNA Research e Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, páginas 276 a 278) e são substituições de base exemplificativas, ainda mais particularmente quando combinadas com modificações de açúcar de 2'-O-metoxietila.
[345] As patentes US representativas que ensinam a preparação de determinadas das nucleobases modificadas observadas acima, bem como outras nucleobases modificadas incluem, mas não se limitam às patentes observadas acima nos US 3.687.808; 4.845.205; 5.130.30; 5.134.066; 5.175.273;
5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908;
5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.594.121.
5.596.091; 5.614.617; 5.681.941; 5.750.692; 6.015.886;
6.147.200; 6.166.197; 6.222.025; 6.235.887; 6.380.368;
6.528.640; 6.639.062; 6.617.438; 7.045.610; 7.427.672; e
7.495.088, cujo conteúdo de cada uma dessas está aqui incorporado por referência.
[346] Um agente de RNAi da revelação também pode ser modificado para incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo que possui uma fração ribose modificada em que a fração ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2' e 4'. Essa estrutura “bloqueia” eficazmente a ribose na conformação estrutural 3'-endo. A adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs demonstrou aumentar a estabilidade do siRNA no soro e reduzir os efeitos fora do alvo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439 a 447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833 a 843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3.185 a 3.193).
[347] Um agente de RNAi da revelação também pode ser modificado para incluir uma ou mais porções de açúcar bicíclicas. Um “açúcar bicíclico” é um anel furanosil modificado pela ligação de dois átomos. Um “nucleosídeo bicíclico” (“BNA”) é um nucleosídeo tendo um grupamento de açúcar compreendendo uma ponte conectando dois átomos de carbono do anel de açúcar, formando assim um sistema de anel bicíclico. Em determinadas modalidades, a ponte conecta o carbono 4′ e o carbono 2′ do anel do açúcar. Assim, em algumas modalidades, um agente da revelação pode incluir um ou mais ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Um ácido nucleico bloqueado é um nucleotídeo que possui uma fração ribose modificada em que a fração ribose compreende uma ponte extra conectando os carbonos 2' e 4'. Ou seja, um LNA é um nucleotídeo que compreende um grupamento de açúcar bicíclico composto por uma ponte 4'-CH2-O-2'. Essa estrutura “bloqueia” eficazmente a ribose na conformação estrutural 3'-endo. Foi demonstrado que a adição de ácidos nucleicos bloqueados a siRNAs aumenta a estabilidade de siRNA no soro e reduz os efeitos fora do alvo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439 a 447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6 (3): 833 a 843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31 (12: 3.185 a 3.193). Exemplos de nucleosídeos bicíclicos para uso nos polinucleotídeos da revelação incluem, sem limitação, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos do anel ribosila 4' e 2'. Em determinadas modalidades, os agentes polinucleotídicos antissenso da revelação incluem um ou mais nucleosídeos bicíclicos compreendendo uma ponte de 4′ a 2′. Exemplos de tais 4' a 2' nucleosídeos bicíclicos em ponte, incluem, mas não estão limitados a 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4′- (CH2)-S-2′; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4′-CH(CH3)—O-2′ (também referido como “etila restrita” ou “cEt”) e 4′-CH(CH2OCH3)—O- 2′ (e seus análogos; ver, por exemplo, patente nº US
7.399.845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(e seus análogos; ver, por exemplo, Patente nº US 8.278.283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (e seus análogos; ver, por exemplo, Patente nº US 8.278.425); 4′-CH2— O—N(CH3)-2′ (ver, por exemplo, Publicação de Patente nº US 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', em que R é H, C1-C12 alquila, ou um grupo de proteção (ver, por exemplo, Patente nº US
7.427.672); 4′-CH2—C(H)(CH3)-2′ (ver, por exemplo, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118 a 134); e 4′-CH2—C(═CH2)-2′ (e seus análogos; ver, por exemplo, Patente nº US 8.278.426). Todo o conteúdo de cada uma dessas está aqui incorporado por referência.
[348] As patentes US e publicações de patentes US representativas adicionais que ensinam a preparação de nucleotídeos de ácido nucleico bloqueados incluem, mas não estão limitadas às seguintes: Patentes nos US 6.268.490;
6.525.191; 6.670.461; 6.770.748; 6.794.499; 6.998.484;
7.053.207; 7.034.133; 7.084.125; 7.399.845; 7.427.672;
7.569.686; 7.741.457; 8.022.193; 8.030.467; 8.278.425;
8.278.426; 8.278.283; US 2008/0039618; e US 2009/0012281, cujo todo o conteúdo de cada uma dessas está aqui incorporado por referência.
[349] Qualquer um dos nucleosídeos bicíclicos anteriores pode ser preparado tendo uma ou mais configurações de açúcar estereoquímico incluindo, por exemplo, α-L- ribofuranose e β-D-ribofuranose (ver WO 99/14226).
[350] Um agente de RNAi da revelação também pode ser modificado para incluir um ou mais nucleotídeos de etil restritos. Como usado no presente documento, um “nucleotídeo de etila restringida” ou “cEt” é um ácido nucleico bloqueado constituído por um grupamento de açúcar bicíclico constituído por uma ponte 4'-CH(CH3)-0-2'. Em uma modalidade, um nucleotídeo de etila restringida está na conformação S aqui referida como “S-cEt”.
[351] Um agente de RNAi da revelação também pode incluir um ou mais “nucleotídeo restrito de forma conformacional” (“CRN”). Os CRN são análogos do nucleotídeo com um ligante conectando os carbonos C2'e C4' da ribose ou os carbonos C3 e -C5' da ribose. O CRN trava o anel da ribose em uma conformação estável e aumenta a afinidade de hibridização com o mRNA. O ligante tem comprimento suficiente para colocar o oxigênio em uma posição ideal para estabilidade e afinidade,
resultando em menos enrugamento do anel de ribose.
[352] As publicações representativas que ensinam a preparação de alguns dos CRN mencionados acima incluem, mas não estão limitados à Publicação de Patente nº US 2013/0190383; e publicação PCT WO 2013/036868, cujo conteúdo de cada um desses está aqui incorporado a título de referência.
[353] Em algumas modalidades, um agente de RNAi da revelação compreende um ou mais monômeros que são nucleotídeos UNA (ácido nucleico desbloqueado). UNA é ácido nucleico acíclico desbloqueado, em que qualquer uma das ligações do açúcar foi removida, formando um resíduo de “açúcar” desbloqueado. Em um exemplo, UNA também abrange monômero com ligações entre C1'-C4' foram removidas (isto é, a ligação covalente carbono-oxigênio-carbono entre os carbonos C1' e C4'). Em outro exemplo, a ligação C2'-C3'(ou seja, a ligação carbono-carbono covalente entre os carbonos C2' e C3') do açúcar foi removida (ver Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133 a 134 (2008) e Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 aqui incorporado por referência).
[354] As publicações US representativas que ensinam a preparação de UNA incluem, mas não estão limitadas a Patente nº US 8.314.227; e Publicação de Patente nº US 2013/0096289; 2013/0011922; e 2011/0313020, cujo todo o conteúdo de cada um dos quais está aqui incorporado por referência.
[355] As modificações potencialmente estabilizadoras para as extremidades de moléculas de RNA podem incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6- NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4- hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina
(éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2- docosanoil-uridina-3”-fosfato, dT de base invertida (idT) e outras. A revelação dessa modificação pode ser encontrada na Publicação PCT nº WO 2011/005861.
[356] Outras modificações de um agente de RNAi da revelação incluem um fosfato 5’ ou mímico de fosfato 5’, por exemplo, um fosfato 5’-terminal ou mímico de fosfato no filamento antissenso de um agente de RNAi. Os mímicos de fosfato adequados são revelados, por exemplo, na Publicação de Patente US 2012/0157511, cujo conteúdo completo é incorporado aqui por referência. A. AGENTES DE RNAI MODIFICADOS QUE COMPREENDEM
MOTIVOS DA REVELAÇÃO
[357] Em certos aspectos da revelação, os agentes de RNAi de duplo filamento da revelação incluem agentes com modificações químicas conforme revelado, por exemplo, no documento WO 2013/075035, protocolado em 16 de novembro de 2012, cujo conteúdo total está incorporado neste documento por referência. Conforme mostrado neste documento e na Publicação PCT nº WO 2013/075035, um resultado superior pode ser obtido pela introdução de um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em um filamento sensor e/ou filamento antissenso de um agente de RNAi, particularmente em ou perto do sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi podem ser completamente modificados. A introdução desses motivos interrompe o padrão de modificação, se presente, do filamento senso e/ou antissenso. O agente de RNAi pode ser opcionalmente conjugado com um ligante C16, por exemplo, sem filamento sensor. O agente de RNAi pode ser opcionalmente modificado com uma modificação de (S)-ácido glicolnucleico (GNA), por exemplo, em um ou mais resíduos do filamento antissenso. Os agentes de RNAi resultantes apresentam atividade de silenciamento gênico superior.
[358] Mais especificamente, foi surpreendentemente revelado que quando o filamento sensor e filamento antissenso do agente de RNAi de duplo filamento são completamente modificados para ter um ou mais motivos de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em ou perto do sítio de clivagem de pelo menos um filamento de um agente de RNAi, a atividade de silenciamento gênico do agente de RNAi foi superiormente aumentada.
[359] Consequentemente, a revelação fornece agente de RNAi de duplo filamentos capazes de inibir a expressão de um gene-alvo (isto é, um gene de APP) in vivo. O agente de RNAi compreende um filamento sensor e um filamento antissenso. Cada filamento do agente de RNAi pode se situar na faixa de 12 a 30 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, cada filamento pode estar entre 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, 17 a 30 nucleotídeos em comprimento, 25 a 30 nucleotídeos em comprimento, 27 a 30 nucleotídeos em comprimento, 17 a 23 nucleotídeos em comprimento, 17 a 21 nucleotídeos em comprimento, 17 a 19 nucleotídeos em comprimento, 19 a 25 nucleotídeos em comprimento, 19 a 23 nucleotídeos em comprimento, 19 a 21 nucleotídeos em comprimento, 21 a 25 nucleotídeos em comprimento, ou 21 a 23 nucleotídeos em comprimento.
[360] O filamento sensor e filamento antissenso formam tipicamente um RNA de duplo filamento de duplex (“dsRNA”), também referido no presente documento como um
“agente de RNAi.” A região de duplex de um agente de RNAi pode ser 12 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento. Por exemplo, a região de duplex pode estar entre 14 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento, 17 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento, 27 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento, 17 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento, 17 a 21 pares de nucleotídeo em comprimento, 17 a 19 pares de nucleotídeo em comprimento, 19 a 25 pares de nucleotídeo em comprimento, 19 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento, 19 a 21 pares de nucleotídeo em comprimento, 21 a 25 pares de nucleotídeo em comprimento, ou 21 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento. Em outro exemplo, a região de duplex é selecionada a partir de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 e 27 nucleotídeos em comprimento.
[361] Em uma modalidade, o agente de RNAi pode conter uma ou mais regiões de projeção e/ou grupos de cobertura na extremidade 3’, extremidade 5’ ou em ambas as extremidades de um ou de ambos os filamentos. A projeção pode ser 1 a 6 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, 2 a 6 nucleotídeos em comprimento, 1 a 5 nucleotídeos em comprimento, 2 a 5 nucleotídeos em comprimento, 1 a 4 nucleotídeos em comprimento, 2 a 4 nucleotídeos em comprimento, 1 a 3 nucleotídeos em comprimento, 2 a 3 nucleotídeos em comprimento, ou 1 a 2 nucleotídeos em comprimento. As projeções podem ser o resultado de um filamento sendo mais longo que o outro, ou o resultado de dois filamentos do mesmo comprimento sendo escalonado. A projeção pode formar uma incompatibilidade com o mRNA-alvo ou pode ser complementar a sequências de gene sendo alvejadas ou pode ser outra sequência. O primeiro e segundo filamentos também podem ser unidos, por exemplo, por bases adicionais para formar um laço em gancho, ou por outros ligantes de não base.
[362] Em uma modalidade, os nucleotídeos na região de projeção do agente de RNAi podem, cada um, independentemente ser um nucleotídeo modificado ou não modificado incluindo, mas sem limitação, 2’-açúcar modificado, como, 2-F, 2’-O-metila, timidina (T), e quaisquer combinações dos mesmos.
[363] Por exemplo, TT pode ser uma sequência de projeção para qualquer ponta de qualquer filamento. A projeção pode formar uma incompatibilidade com o mRNA-alvo ou pode ser complementar às sequências do gene a ser alvejado ou pode ser outra sequência.
[364] [00364] As projeções 5' ou 3' no filamento sensor, filamento antissenso ou ambas as fitas do agente de RNAi podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a região de projeção (ou a região de projeções) contém dois nucleotídeos tendo um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma modalidade, a projeção está presente na extremidade 3’ do filamento sensor, filamento antissenso, ou em ambos os fios. Em uma modalidade, essa projeção 3’ está presente no filamento antissenso. Em uma modalidade, essa projeção 3' está presente no filamento sensor.
[365] O agente de RNAi pode conter apenas uma única projeção, o que pode fortalecer a atividade de interferência do RNAi, sem afetar sua estabilidade geral. Por exemplo, a projeção de filamento único pode estar localizada na extremidade 3'-terminal do filamento sensor ou, alternativamente, na extremidade 3'-terminal do filamento antissenso. O RNAi também pode ter uma extremidade cega,
localizada na extremidade 5' do filamento antissenso (ou extremidade 3' do filamento sensor) ou vice-versa. Geralmente, o filamento antissenso do RNAi tem uma projeção de nucleotídeo na extremidade 3’, e a extremidade 5’ é cega. Embora não desejando ser limitado pela teoria, a extremidade cega assimétrica na extremidade 5’ do filamento antissenso e a projeção de extremidade 3’ do filamento antissenso favorece o carregamento do filamento-guia no processo RISC.
[366] Em uma modalidade, o agente de RNAi é uma ponta dupla cega de 19 nucleotídeos em comprimento, em que o filamento sensor contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 7, 8, 9 da extremidade 5’. O filamento antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.
[367] Em outra modalidade, o agente de RNAi é uma ponta dupla cega de 20 nucleotídeos em comprimento, em que o filamento sensor contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 8, 9, 10 da extremidade 5’. O filamento antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’.
[368] Em ainda outra modalidade, o agente de RNAi é uma ponta dupla cega de 21 nucleotídeos em comprimento, em que o filamento sensor contém pelo menos um motivo de três modificações 2'-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 da extremidade 5'. O filamento antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 da extremidade 5’.
[369] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende um filamento sensor de 21 nucleotídeos e um filamento antissenso de 23 nucleotídeos, em que o filamento sensor contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos nas posições 9, 10, 11 a partir da extremidade 5’; o filamento antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos nas posições 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’, em que uma extremidade do agente de RNAi é cega, enquanto a outra extremidade compreende 2 projeções de nucleotídeo. De preferência, as 2 projeções de nucleotídeo estão na extremidade 3’ do filamento antissenso. Quando as 2 projeções de nucleotídeo estão na extremidade 3’ do filamento antissenso, pode haver duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são as projeções de nucleotídeo, e o terceiro nucleotídeo é um nucleotídeo emparelhado próximo ao nucleotídeo de projeção. Em uma modalidade, o agente de RNAi tem adicionalmente duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais na extremidade 5’ do filamento sensor e na extremidade 5’ do filamento antissenso. Em uma modalidade, cada nucleotídeo no filamento sensor e no filamento antissenso do agente de RNAi, incluindo os nucleotídeos que são parte dos motivos são nucleotídeos modificados. Em uma modalidade, cada resíduo é independentemente modificado com uma 2’-O-metila ou 3’-flúor, por exemplo, em um motivo alternativo. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende ainda um ligante (opcionalmente um ligante
C16).
[370] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende um filamento sensor e antissenso, em que o filamento sensor são 25 a 30 resíduos de nucleotídeo em comprimento, em que partindo do nucleotídeo 5' terminal (posição 1), as posições 1 a 23 do primeiro filamento compreendem pelo menos 8 ribonucleotídeos; o filamento antissenso tem 36 a 66 resíduos de nucleotídeo em comprimento e, a partir do nucleotídeo 3' terminal, compreende pelo menos 8 ribonucleotídeos nas posições emparelhadas com posições 1 a 23 do filamento sensor para formar um duplex; em que pelo menos o nucleotídeo terminal 3' do filamento antissenso é desemparelhado com o filamento sensor, e até 6 nucleotídeos terminais 3' consecutivos são desemparelhados com filamento sensor, formando assim uma projeção de filamento único 3' de 1 a 6 nucleotídeos; em que a terminação 5' do filamento antissenso compreende de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos que são desemparelhados com o filamento sensor, formando assim uma projeção de 5' de filamento único de 10 a 30 nucleotídeos de filamento único; em que pelo menos os nucleotídeos 5' terminal e 3' terminal de filamento sensor são pares de base com nucleotídeos de filamento antissenso quando os filamento sensor e antissenso estão alinhados para complementaridade máxima, formando assim uma região substancialmente duplexada entre filamentos sensor e antissenso; o filamento antissenso é suficientemente complementar a um RNA-alvo ao longo de pelo menos 19 ribonucleotídeos de comprimento de filamento antissenso para reduzir a expressão do gene-alvo quando o ácido nucleico de duplo filamento é introduzido em uma célula de mamífero; e em que o filamento sensor contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-F em três nucleotídeos consecutivos, em que pelo menos um dos motivos ocorre em ou próximo ao sítio de clivagem. O filamento antissenso contém pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos em ou perto do sítio de clivagem.
[371] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende filamentos sensor e antissenso, em que o agente de RNAi compreende um primeiro filamento com um comprimento que é pelo menos 25 e no máximo 29 nucleotídeos e um segundo filamento com um comprimento que é no máximo 30 nucleotídeos com pelo menos um motivo de três modificações 2’-O-metila em três nucleotídeos consecutivos na posição 11, 12, 13 a partir da extremidade 5’; em que a extremidade 3’ do primeiro filamento e a extremidade 5’ do segundo filamento formam uma ponta dupla e o segundo filamento são 1 a 4 nucleotídeos mais longos em sua extremidade 3’ do que o primeiro filamento, em que a região de região de duplex que é pelo menos 25 nucleotídeos em comprimento, e o segundo filamento é suficientemente complementar a um mRNA-alvo ao longo de pelo menos 19 nucleotídeos do segundo comprimento de filamento para reduzir a expressão de gene-alvo, quando o agente de RNAi é introduzido em uma célula de mamífero, e em que a clivagem de dicer do agente de RNAi resulta preferencialmente em um siRNA compreendendo a extremidade 3' do segundo filamento, reduzindo assim a expressão do gene-alvo no mamífero. Opcionalmente, o agente de RNAi compreende ainda um ligante.
[372] Em uma modalidade, o filamento sensor do agente de RNAi contém pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que um dos motivos ocorre no sítio de clivagem no filamento sensor.
[373] Em uma modalidade, o filamento antissenso do agente de RNAi também pode conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, em que um dos motivos ocorre em ou próximo ao sítio de clivagem no filamento antissenso.
[374] Para um agente de RNAi com uma região de duplex de 17 a 23 nucleotídeos em comprimento, o sítio de clivagem do filamento antissenso é tipicamente em torno de 10, 11 e 12 posições da extremidade 5’. Assim, os motivos de três idênticas podem ocorrer nas posições 9, 10, 11; 10, 11, 12; posições 11, 12, 13; posições 12, 13, 14; ou posições 13, 14, 15 do filamento antissenso, a contagem a partir do 1º nucleotídeo da extremidade 5' do filamento antissenso, ou seja, a contagem a partir do 1º nucleotídeo emparelhado dentro da região de duplex a partir da extremidade 5' do filamento antissenso. O sítio de clivagem no filamento antissenso também pode mudar de acordo com o comprimento da região de duplex do RNAi da extremidade 5’.
[375] O filamento sensor do agente de RNAi pode conter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos no sítio de clivagem do filamento; e o filamento antissenso pode ter pelo menos um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos em ou perto do sítio de clivagem do filamento. Quando o filamento sensor e o filamento antissenso formam um duplex de dsRNA, o filamento sensor e o filamento antissenso podem ser alinhados de modo que um motivo dos três nucleotídeos no filamento sensor e um motivo dos três nucleotídeos no filamento antissenso tenham pelo menos uma sobreposição de nucleotídeo, ou seja, pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo no filamento sensor forma um par de base com pelo menos um dos três nucleotídeos do motivo no filamento antissenso. Alternativamente, pelo menos dois nucleotídeos podem se sobrepor, ou todos os três nucleotídeos podem se sobrepor.
[376] Em uma modalidade, o filamento sensor do agente de RNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. O primeiro motivo pode ocorrer em ou próximo ao sítio de clivagem do filamento e os outros motivos podem ser uma modificação de asa. O termo “modificação de asa” aqui se refere a um motivo que ocorre em outra porção do filamento que é separado do motivo em ou próximo ao sítio de clivagem do mesmo filamento. A modificação da asa é adjacente ao primeiro motivo ou é separada por pelo menos um ou mais nucleotídeos. Quando os motivos são imediatamente adjacentes uns aos outros, então a química dos motivos é distinta e quando os motivos são separados por um ou mais nucleotídeos do que as químicas podem ser iguais ou diferentes. Duas ou mais modificações de asas podem estar presentes. Por exemplo, quando duas modificações de asa estão presentes, cada modificação de asa pode ocorrer em uma extremidade em relação ao primeiro motivo que está em ou próximo ao sítio de clivagem ou em ambos os lados do motivo principal.
[377] Como o filamento sensor, o filamento antissenso do agente de RNAi pode conter mais de um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, com pelo menos um dos motivos ocorrendo em ou próximo ao sítio de clivagem do filamento. Esse filamento antissenso também pode conter uma ou mais modificações de asa em um alinhamento semelhante às modificações de asa que podem estar presentes no filamento sensor.
[378] Em uma modalidade, a modificação de asa no filamento sensor ou filamento antissenso do agente de RNAi tipicamente não inclui o primeiro ou dois nucleotídeos terminais na extremidade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades do filamento.
[379] Em outra modalidade, a modificação de asa no filamento sensor ou filamento antissenso do agente de RNAi normalmente não inclui o primeiro ou dois nucleotídeos pareados dentro da região de duplex na extremidade 3’, extremidade 5’ ou ambas as extremidades do filamento.
[380] Quando o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi contiverem cada um pelo menos uma modificação de asa, as modificações de asa podem cair na mesma extremidade da região de duplex, e ter uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos.
[381] Quando o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi contêm, cada um, pelo menos duas modificações de asa, o filamento sensor e o filamento antissenso podem ser tão alinhados que duas modificações, cada uma de um filamento, caem em uma extremidade da região de duplex, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações, cada uma de um filamento, caem na outra extremidade da região de duplex, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos; duas modificações, cada uma de um filamento, caem de cada lado do motivo principal, tendo uma sobreposição de um, dois ou três nucleotídeos na região de duplex.
[382] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende incompatibilidade (es) com o alvo, dentro do duplex,
ou fabricados dos mesmos. A incompatibilidade pode ocorrer na região de projeção ou região de duplex. O par de base pode ser classificado com base na sua propensão para promover a dissociação ou fusão (por exemplo, na energia livre de associação ou dissociação de um par em particular, a abordagem mais simples é examinar os pares em uma base de par individual, embora próximo vizinho ou análise semelhante também pode ser usada). Em termos de promoção da dissociação: A:U é preferencial a G:C; G:U é preferido em relação a G:C; e I:C é preferencial em relação a G:C (I = inosina). Desemparelhamentos, por exemplo, não canônicos ou outros que não os emparelhamentos canônicos (conforme descrito em outro lugar neste documento) são preferenciais aos emparelhamentos canônicos (A:T, A:U, G:C); e emparelhamentos que incluem uma base universal são preferíveis aos emparelhamentos canônicos.
[383] Em uma modalidade, o agente de RNAi compreende pelo menos um dos primeiros 1, 2, 3, 4 ou 5 pares de base dentro das regiões de duplex da extremidade 5' do filamento antissenso independentemente selecionado do grupo de: A:U, G:U, I:C, e pares incompatíveis, por exemplo, não canônicos ou outros que emparelhamentos não canônicos ou emparelhamentos que incluem uma base universal, para promover a dissociação do filamento antissenso na extremidade 5' do duplex.
[384] Em uma modalidade, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região de duplex da extremidade 5’ no filamento antissenso é selecionado a partir do grupo que consiste em A, dA, dU, U e dT. Alternativamente, pelo menos um dos primeiros 1, 2 ou 3 pares de base dentro da região de duplex da extremidade 5' do filamento antissenso é um par de base AU. Por exemplo, o primeiro par de base dentro da região de duplex da extremidade 5’ do filamento antissenso é um par de base AU.
[385] Em outra modalidade, o nucleotídeo na extremidade 3’ do filamento sensor é desoxitimina (dT). Em outra modalidade, o nucleotídeo da extremidade 3’ do filamento antissenso é desoxitimina (dT). Em uma modalidade, há uma sequência curta de desoxitimina nucleotídeos, por exemplo, dois dT nucleotídeos na extremidade 3’ do filamento sensor sentido e/ou antissenso.
[386] Em uma modalidade, a sequência de filamento sensor pode ser representada pela fórmula (I):
[387] 5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j- Na-nq 3' (I)
[388] em que:
[389] i e j são, cada um, independentemente 0 ou 1;
[390] p e q são, cada um, independentemente 0 a 6;
[391] cada Na independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 25 nucleotídeos modificados, em que cada sequência compreende pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[392] cada Nb independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10 nucleotídeos modificados;
[393] cada np e nq independentemente representa um nucleotídeo de projeção;
[394] em que Nb e Y não têm a mesma modificação; e
[395] XXX, YYY e ZZZ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos. De preferência, YYY são todos os nucleotídeos 2’-F modificados.
[396] Em uma modalidade, o Na e/ou Nb compreende modificações de padrão alternativo.
[397] Em uma modalidade, o motivo YYY ocorre em ou próximo ao sítio de clivagem do filamento sensor. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região de duplex de 17 a 23 nucleotídeos em comprimento, o motivo YYY pode ocorrer nas proximidades do sítio de clivagem (por exemplo: pode ocorrer nas posições 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 ou 11, 12, 13) do filamento sensor, a contagem a partir do 1º nucleotídeo, da extremidade 5'; ou opcionalmente, a contagem a partir do 1º nucleotídeo emparelhado dentro da região de duplex, a partir da extremidade 5’.
[398] Em uma modalidade, i é 1 e j é 0, ou i é 0 e j é 1 ou i e j são 1. O filamento sensor pode, portanto, ser representado pelas seguintes fórmulas:
[399] 5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
[400] 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); ou
[401] 5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
[402] Quando o filamento sensor é representado pela fórmula (Ib), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados.
[403] Cada Na independentemente pode representar uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[404] Quando o filamento sensor é representado como fórmula (Ic), Nb representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na pode independentemente representar uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[405] Quando o filamento sensor é representado como fórmula (Id), cada Nb independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. De preferência, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Cada Na pode independentemente representar uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[406] Cada dentre X, Y e Z pode ser igual ou diferente entre si.
[407] Em outras modalidades, i é 0 e j é 0, e o filamento sensor pode ser representado pela fórmula:
[408] 5' np-Na-YYY- Na-nq 3' (Ia).
[409] Quando o filamento sensor é representado pela fórmula (Ia), cada Na independentemente pode representar uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[410] Em uma modalidade, a sequência de filamento antissenso do RNAi pode ser representada pela fórmula (II):
[411] 5' nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′- (X′X′X′)l-N′a-np′ 3' (II)
[412] em que:
[413] k e l são, cada um, independentemente 0 ou
1;
[414] p’ e q’ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[415] cada Na′ independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 25 nucleotídeos modificados, em que cada sequência compreende pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[416] cada Nb′ independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10 nucleotídeos modificados;
[417] cada np′ e nq′ independentemente representa um nucleotídeo de projeção;
[418] em que Nb’ e Y’ não têm a mesma modificação;
[419] e
[420] X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[421] Em uma modalidade, a Na’ e/ou Nb’ compreende modificações de padrão alternativo.
[422] O motivo Y′Y′Y′ ocorre em ou próximo ao sítio de clivagem do filamento antissenso. Por exemplo, quando o agente de RNAi tem uma região de duplex de 17 a 23 nucleotídeos em comprimento, o motivo Y′Y′Y′ pode ocorrer nas posições 9, 10, 11, 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ou 13, 14, 15 do filamento antissenso, com a contagem a partir do 1º nucleotídeo, da extremidade 5’; ou opcionalmente, a contagem a partir do 1º nucleotídeo emparelhado dentro da região de duplex, a partir da extremidade 5’. De preferência, o motivo Y′Y′Y ′ ocorre nas posições 11, 12, 13.
[423] Em uma modalidade, o motivo Y′Y′Y′ são todos os 2’-OMe nucleotídeos modificados.
[424] Em uma modalidade, k é 1 e l é 0 ou k é 0 e l é 1 ou k e l são 1.
[425] O filamento antissenso pode, portanto, ser representado pelas seguintes fórmulas:
[426] 5' nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’ 3' (IIb);
[427] 5' nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’ 3' (IIc); ou
[428] 5' nq’-Na′- Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′- X′X′X′- Na′-np’ 3' (IId).
[429] Quando o filamento antissenso é representado pela fórmula (IIb), Nb' representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[430] Quando o filamento antissenso é representado como fórmula (IIc), Nb' representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ independentemente representa uma sequência de oligonucleotídeos compreendendo 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[431] Quando o filamento antissenso é representado como fórmula (IId), cada Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados. De preferência, Nb é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[432] Em outras modalidades, k é 0 e l é 0 e o filamento antissenso pode ser representado pela fórmula:
[433] 5' np’-Na’-Y’Y’Y’- Na’-nq’ 3' (Ia).
[434] Quando o filamento antissenso é representado como fórmula (IIa), cada Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[435] Cada um dentre X′, Y′ e Z′ pode ser igual ou diferente entre si.
[436] Cada nucleotídeo do filamento sensor e filamento antissenso pode ser independentemente modificado com LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietila, 2'-O-metila, 2'-O-alila, 2'- C-alila, 2'-hidroxila ou 2'-flúor. Por exemplo, cada nucleotídeo do filamento sensor e filamento antissenso é independentemente modificado com 2’-O-metila ou 2’-flúor. Cada X, Y, Z, X′, Y′ e Z′, em particular, pode representar uma modificação 2'-O-metila ou uma modificação 2'-flúor.
[437] Em uma modalidade, o filamento sensor do agente de RNAi pode conter o motivo YYY ocorrendo em 9,10 e 11 posições do filamento quando a região de duplex é 21 nt, a contagem inicia-se no 1º nucleotídeo da extremidade 5 ', ou opcionalmente, inicia-se a contagem no 1º nucleotídeo pareado dentro da região de duplex, a partir da extremidade 5 '; e Y representa 2'-F modificação. O filamento sensor pode conter adicionalmente motivo XXX ou motivos ZZZ como modificações de asas na extremidade oposta da região de duplex; e XXX e ZZZ,
independentemente, representam uma modificação 2'-OMe ou modificação 2'-F.
[438] Em uma modalidade, o filamento antissenso pode conter o motivo Y′Y′Y′ que ocorre nas posições 11, 12, 13 do filamento, iniciando a contagem a partir do 1º nucleotídeo a partir da extremidade 5’, ou opcionalmente, a contagem iniciando no 1º nucleotídeo emparelhado dentro da região de duplex, a partir da extremidade 5’; e Y′ representa a modificação 2’-O-metila. O filamento antissenso pode conter adicionalmente o motivo X′X′X′ ou motivos Z′Z′Z′ como modificações de asa na extremidade oposta da região de duplex; e X′X′X′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente uma modificação 2’-OMe ou modificação 2’-F.
[439] O filamento sensor representado por qualquer uma das fórmulas acima (Ia), (Ib), (Ic) e (Id) forma um duplex com um filamento antissenso sendo representado por qualquer uma das fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) e (IId), respectivamente.
[440] Consequentemente, os agentes de RNAi para uso nos métodos da revelação podem compreender um filamento sensor e um filamento antissenso, em que cada filamento tem 14 a 30 nucleotídeos, o duplex de RNAi representado pela fórmula (III):
[441] sensora: 5’ np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb - (Z Z Z)j-Na-nq 3'
[442] antissenso: 3’ np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′- Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’ 5'
[443] (III)
[444] em que:
[445] i, j, k, e l são, cada um,
independentemente 0 ou 1;
[446] p, p′, q, e q′ são, cada um, independentemente 0 a 6;
[447] cada Na e Na’ representa, independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 25 nucleotídeos modificados, em que cada sequência compreende pelo menos dois nucleotídeos diferentemente modificados;
[448] cada Nb e Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10 nucleotídeos modificados;
[449] em que
[450] cada np’, np, nq’, e nq, cada um dos quais pode ou não estar presente, independentemente representa um nucleotídeo de projeção; e
[451] XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ representam, cada um, independentemente um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos.
[452] Em uma modalidade, i é 0 e j é 0; ou i é 1 e j é 0; ou i é 0 e j é 1; ou i e j são 0; ou i e j são 1. Em outra modalidade, k é 0 e l é 0; ou k é 1 e l é 0; k é 0 e l é 1; ou k e l são 0; ou k e l são 1.
[453] As combinações exemplificativas do filamento sensor e filamento antissenso que formam um duplex de RNAi incluem as fórmulas abaixo: 5' np - Na -Y Y Y -Na-nq 3' 3' np’-Na’-Y′Y′Y′ -Na’nq’ 5' (IIIa) 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3' 3' np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’ 5' (IIIb)
5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3' 3' np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’ 5' (IIIc) 5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3' 3' np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’ 5' (IIId)
[454] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[455] Quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIb), cada Nb representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 1 a 10, 1 a 7, 1 a 5 ou 1 a 4 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[456] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIIc), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados.
[457] Quando o agente de RNAi é representado como fórmula (IIId), cada Nb, Nb’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 0 a 10, 0 a 7, 0 a 10, 0 a 7, 0 a 5, 0 a 4, 0 a 2 ou 0 nucleotídeos modificados. Cada Na, Na’ representa independentemente uma sequência de oligonucleotídeos que compreende 2 a 20, 2 a 15 ou 2 a 10 nucleotídeos modificados. Cada um dentre Na, Na’, Nb e Nb’
independentemente compreende modificações de padrão alternativo.
[458] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2’-O-metila ou 2’-flúor. Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2’-O-metila ou 2’-flúor e np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de uma ligação de fosforotioato. Em ainda outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2’-O-metila ou 2’- flúor , np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de ligação de fosforotioato, e o filamento sensor é conjugado a um ou mais grupamentos C16 (ou relacionados) fixados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente (descrito abaixo). Em outra modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIId), as modificações Na são modificações 2’-O-metila ou 2’- flúor , np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de ligação de fosforotioato, o filamento sensor compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e o filamento sensor é conjugado a um ou mais grupamentos C16 (ou relacionados), opcionalmente fixados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[459] Em uma modalidade, quando o agente de RNAi é representado pela fórmula (IIIa), as modificações Na são modificações 2’-O-metila ou 2’-flúor, np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo vizinho por meio de ligação de fosforotioato, o filamento sensor compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato, e o filamento sensor é conjugado a um ou mais grupamentos C16 (ou relacionados) fixados através de um ligante ramificado bivalente ou trivalente.
[460] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo pelo menos dois duplexes representados pela fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), em que os duplexes são conectados por um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende ainda um ligante. Cada um dos duplexes pode ter como alvo o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplexes pode ter como alvo o mesmo gene em dois sítios- alvo diferentes.
[461] Em uma modalidade, o agente de RNAi é um multímero contendo três, quatro, cinco, seis ou mais duplexes representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId), em que os duplexes são conectados por um ligante. O ligante pode ser clivável ou não clivável. Opcionalmente, o multímero compreende ainda um ligante. Cada um dos duplexes pode ter como alvo o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos duplexes pode ter como alvo o mesmo gene em dois sítios-alvo diferentes.
[462] Em uma modalidade, dois agentes de RNA são representados pelas fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) e (IIId) são ligados entre si na extremidade 5’, e uma ou ambas as extremidades 3’, e são opcionalmente conjugadas a um ligante. Cada um dos agentes pode ter como alvo o mesmo gene ou dois genes diferentes; ou cada um dos genes pode ter como alvo o mesmo gene em dois sítios-alvo diferentes.
[463] Várias publicações descrevem agentes de RNAi multiméricos que podem ser usados nos métodos de revelação. Tais publicações incluem WO2007/091269, Patente nº
US 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 e WO2011/031520, sendo o conteúdo total dessas está aqui incorporado a título de referência. Em determinadas modalidades, os agentes de RNAi da revelação podem incluir ligantes GalNAc, mesmo que tais ligantes GalNAc sejam atualmente projetados para ter valor limitado para a rota de entrega intratecal/CNS preferencial (ou as rotas de entrega intratecal/CNS preferenciais) da presente revelação.
[464] Conforme descrito com mais detalhes a seguir, o agente de RNAi que contém conjugações de um ou mais grupamentos de carboidratos a um agente de RNAi pode otimizar uma ou mais propriedades do agente de RNAi. Em muitos casos, a porção de carboidrato será anexada a uma subunidade modificada do agente de RNAi. Por exemplo, o açúcar ribose de uma ou mais subunidades de ribonucleotídeo de um agente de dsRNA pode ser substituído por outra fração, por exemplo, um carreador não carboidrato (de preferência cíclico) ao qual está ligado um ligante carboidrato. Uma subunidade de ribonucleotídeo na qual o açúcar ribose da subunidade foi assim substituído é referida aqui como uma subunidade de modificação de substituição de ribose (RRMS). Um carreador cíclico pode ser um sistema de anel carbocíclico, isto é, todos os átomos do anel são átomos de carbono, ou um sistema de anel heterocíclico, ou seja, um ou mais átomos do anel podem ser um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, enxofre. O carreador cíclico pode ser um sistema de anéis monocíclicos, ou pode conter dois ou mais anéis, por exemplo anéis fundidos. O carreador cíclico pode ser um sistema de anéis totalmente saturado, ou pode conter uma ou mais ligações duplas.
[465] O ligante pode ser anexado ao polinucleotídeo por meio de um carreador. Os carreadores incluem (i) pelo menos um “ponto de fixação de cadeia principal”, de preferência dois “pontos de fixação de cadeia principal” e (ii) pelo menos um “ponto de fixação de amarração”. Um “ponto de ligação principal da cadeia” como usado no presente documento refere-se a um grupo funcional, por exemplo, um grupo hidroxila, ou geralmente, um vínculo disponível para, e que é adequado para incorporação do carreador na cadeia principal, por exemplo, o fosfato, ou fosfato modificado, por exemplo, enxofre contendo, cadeia principal, de um ácido ribonucleico. Um “ponto de fixação de amarração” (TAP) em algumas modalidades refere-se a um átomo do anel constituinte do carreador cíclico, por exemplo, um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que constitui um ponto de fixação de cadeia principal), que conecta uma metade. A porção pode ser, por exemplo, um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo e polissacarídeo. Opcionalmente, a porção selecionada é conectada por uma corda intermediária ao carreador cíclico. Assim, o carreador cíclico irá frequentemente incluir um grupo funcional, por exemplo, um grupo amino, ou geralmente fornecer uma ligação que é adequada para incorporação ou amarração de outra entidade química, por exemplo, um ligante ao anel constituinte.
[466] Os agentes de RNAi podem ser conjugados a um ligante por meio de um carreador, em que o carreador pode ser grupo cíclico ou grupo acíclico; preferencialmente, o grupo cíclico é selecionado a partir de pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila,
morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetra-hidrofurila e decalina; preferencialmente, o grupo acíclico é selecionado a partir de cadeia principal de serinol ou cadeia principal de dietanolamina.
[467] Em determinadas modalidades específicas, o agente de RNAi para uso nos métodos da revelação é um agente selecionado a partir do grupo de agentes listados em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26. Esses agentes podem ainda compreender um ligante. IV. KNOCKDOWN DE APP PARA TRATAR DOENÇAS ASSOCIADAS
À APP
[468] Determinados aspectos da presente revelação são direcionados a knockdown de doenças ou distúrbios associados à APP mediado por agente de RNAi, que incluem CAA e DA, incluindo CAA e EOFAD hereditários, bem como DA esporádica e/ou de início tardio.
[469] CAA hereditário (hCAA) é uma proteinopatia vascular, para a qual a hipótese terapêutica amiloide é relativamente simples e clinicamente testável. É uma doença rara e devastadora, sem terapia existente. Existem biomarcadores bioquímicos e de imagem para validação clínica do tratamento de hCAA mediado por siRNA anti-APP.
[470] Um tipo particular de hCAA contemplado para tratamento usando os agentes de RNAi da presente revelação é o hCAA Aβ “tipo holandês”, que tem uma população estimada de pacientes na casa das centenas, principalmente localizados na Holanda e na Austrália Ocidental. Entre as doenças associadas às APPs, o hCAA é o único por ser puramente vascular: no CAA, as fibrilas amiloides depositam-se nas arteríolas e capilares do parênquima e leptomeninges do SNC, levando ao declínio cognitivo devido à isquemia cerebral e micro-hemorragias em indivíduos com CAA. CAA está presente em mais de 80% de todos os indivíduos com DA (com 25% dos indivíduos com DA de CAA moderada a grave), e a incidência de CAA aumenta com a idade de um indivíduo, com aproximadamente 50% de incidência em idosos com mais de 70 anos de era.
[471] A seguir estão manifestações exemplificadoras de CAA hereditário:
[472] Amiloide-beta – CAA esporádico, HCHWA tipo holandês e EOFAD tipo italiano, LOAD, Trissomia 21
[473] ABri – Demência familiar britânica
[474] ADan - Demência familiar dinamarquesa
[475] Cistatina C – HCHWA tipo islandês (HCHWA- hemorragia cerebral hereditária com amiloidose)
[476] Gelsolina - Amiloidose familiar tipo finlandês
[477] Proteína príon - doença de príon
[478] Transtiretina - Amiloidose sistêmica hereditária
[479] Como observado acima, Aβ-hCAA (também conhecido como APP-hCAA) é uma doença demencial rapidamente progressiva associada à hemorragia intracerebral. As indicações conhecidas de CAA incluem APP-hCAA e CAA esporádico. As possíveis indicações adicionais de CAA incluem: CAA associado a EOFAD (PSEN1; APP; PSEN2); CAA associado à síndrome de Down; e AAC associada à doença de Alzheimer de início tardio (para a qual a prevalência é comum, conforme observado acima).
[480] Para APP-hCAA como uma indicação, a prevalência de APP-hCAA não é conhecida; no entanto, APP-hCAA puro é menos comum do que EOFAD (hCAA tipo holandês (envolvendo uma mutação APP E693Q) foi relatado em várias centenas de indivíduos). Normalmente, o início dos sintomas de APP-hCAA ocorre entre os 35 a 45 anos; O APP-hCAA normalmente progride para AVC grave em 2 a 5 anos, resultando em um pico de idade na morte por AVC aos 55 anos.
[481] O CAA esporádico como uma indicação exibe prevalência relativamente alta: é a causa comum de hemorragia intracerebral lobar (HIL) em idosos. É também uma doença de progressão rápida, com 86 (36%) de 316 pacientes desenvolveram HIC recorrente ao longo de um tempo médio de acompanhamento de 5 anos (Van Etten et al. 2016 Neurology). A incidência de demência cumulativa em CAA esporádico foi observada em um estudo como sendo 14% em 1 ano e 73% em 5 anos (Xiong et al. 2017 J Cerebr Blood Flow Metab). O CAA esporádico também se sobrepõe amplamente ao AD, pois o CAA avançado foi identificado como presente em aproximadamente 25% dos cérebros com DA; no entanto, menos de 50% dos casos de CAA realmente atendem aos critérios patológicos para DA.
[482] Para avaliar a eficácia do knockdown de APP em um sujeito tratado com um agente de RNAi da presente revelação, é expressamente contemplado que as formas solúveis de APP, particularmente incluindo APPα e APPβ, podem servir como biomarcadores de líquido cefalorraquidiano (LCR) para avaliação de APP eficiência de knockdown.
[483] [00483] Produção, eliminação e deposição de β-amiloide em CAA: evidências convergentes indicam que a principal fonte de Aβ é neuronal. É gerado por clivagem sequencial da proteína precursora de amiloide (APP) por β e γ- secretases, em proporção à atividade neuronal. O Aβ é eliminado do cérebro por quatro vias principais: (a) degradação proteolítica por endopeptidases (como a neprilisina e a enzima degradadora da insulina (IDE)); (b) depuração mediada por receptor por células no parênquima cerebral (microglia, astrócitos e, em menor extensão, neurônios); (c) transporte ativo para o sangue através da barreira hematoencefálica (BBB); (d) eliminação ao longo das vias perivasculares pelas quais o fluido intersticial é drenado do cérebro. Carreadores especializados (por exemplo, ApoE) e/ou mecanismos de transporte do receptor (por exemplo, o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR) e a proteína relacionada ao LDLR (LRP1)) estão envolvidos em todas as principais vias de eliminação celular. A deposição vascular é facilitada por fatores que aumentam a razão Aβ40: Aβ42 (enquanto o aumento Aβ42 leva à oligomerização e placas amiloides) e impedem a passagem perivascular. Como os mecanismos de depuração falham com a idade, o Aβ é cada vez mais aprisionado das vias de drenagem perivascular para as membranas basais dos capilares e arteríolas do cérebro, levando ao CAA. Os alelos ApoE têm um efeito diferencial nos diferentes processos moleculares e celulares de produção, eliminação e deposição de Aβ de forma que aumentem ou diminuam o risco de desenvolver CAA (Charidimou A et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2012; 83: 124 a 137).
[484] A clivagem sequencial de APP ocorre por duas vias. A família de proteínas APP é observada como tendo ectodomínios N-terminais grandes e biologicamente ativos, bem como um terminal C mais curto que contém um domínio de classificação de proteínas de ácido tirosina-glutâmico- asparagina-prolina-treonina-tirosina (YENPTY; SEQ ID NO: 1863)) ao qual as proteínas adaptadoras X11 e Fe65 se ligam.
O produto de clivagem do peptídeo Aβ resultante começa dentro do ectodomínio e continua na região transmembrana. Em uma via, a APP é clivada pela α-secretase seguida pela γ-secretase na realização do processamento não amiloidogênico de APP. Em uma segunda via, o processamento amiloidogênico de APP envolve a clivagem de BACE1 seguida por γ-secretase. Ambos os processos geram ectodomínios solúveis (sAPPα e sAPPβ) e fragmentos C- terminais intracelulares idênticos (AICD; SEQ ID NO: 1864; Thinakaran e Koo. J. Biol. Chem. 283: 29.615 a 29.619; Reinhard et al. The EMBO Journal, 24: 3.996 a 4.006; Walsh et al. Biochemical Society Transactions, 35: 416 a 420; O'Brien e Wong. Annu Rev Neurosci. 34: 185 a 204).
[485] A histopatologia de CAA inclui alterações morfológicas das paredes dos vasos (conforme revelado pela coloração com hematoxilina-eosina) e deposição de Aβ. Nas arteríolas leptomeníngeas, foram observadas alterações estruturais significativas e dupla tubulação (Charidimou et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 83: 124 a 137). Em CAA leve e moderado, apenas mudanças estruturais mínimas foram detectadas; entretanto, no CAA avançado, alterações estruturais significativas foram detectadas, a mais extrema das quais é o duplo cano (descolamento e delaminação da parte externa da túnica média). Uma gama patológica semelhante de alterações relacionadas com CAA em arteríolas leptomeníngeas também foi observada usando a detecção imuno-histoquímica de Aβ. No CAA leve, foi observada deposição irregular de amiloide na parede dos vasos examinados. O CAA moderado mostrou deposição amiloide mais densa que se estende por toda a parede do vaso, enquanto o CAA grave mostrou vasos com dupla bola e envolvimento endotelial. Os achados patológicos de CAA em arteríolas corticais revelaram deposição progressiva de Aβ em proporção à gravidade da doença. O CAA moderado mostrou deposição pan-mural de Aβ junto com a deposição de Aβ no parênquima cerebral circundante, enquanto no CAA grave, um vaso de cilindro duplo foi observado, embora isso fosse menos comum em comparação com os vasos leptomeníngeos (Charidimou et al.).
[486] A patogênese do CAA também foi examinada. A beta amiloide produzida pelo parênquima cerebral é normalmente eliminada por meio de uma via perivascular. Observou-se que a produção excessiva de expressão Aβ de variantes específicas de Aβ propensas a CAA e a drenagem retardada de Aβ levam à deposição de amiloide na mídia de pequenas artérias no SNC. As fibrilas amiloides solúveis e insolúveis têm sido identificadas como tóxicas para o músculo liso vascular e substituem essas células, impossibilitando a reatividade vascular. Observou-se que danos adicionais ao endotélio podem levar a micro-hemorragias, microinfartos e destruição de tecido levando à demência. A progressão posterior causou hemorragia intracerebral, que frequentemente foi considerada letal. Foi observado que CAA ocorre mais frequentemente no lobo occipital, menos frequentemente no hipocampo, cerebelo, gânglios da base e não normalmente na substância cinzenta central profunda, substância branca subcortical e tronco encefálico (Charidimou et al.).
[487] Muitos marcadores de resultados potenciais foram identificados para o desempenho de estudos humanos CAA. Além disso, a hemorragia intracerebral sintomática, micro- hemorragias, hiperintensidades da substância branca (WMH) e imagens amiloides têm sido associadas à gravidade e progressão da doença (Greenburg et al., Lancet Neurol 13: 419 a 428).
[488] Os ensaios disponíveis também podem ser usados para detectar os níveis de APP solúvel em amostras de CSF humano. Em particular, sAPPα e sAPPβ são formas solúveis de APP e foram identificados como servindo como biomarcadores PD (farmacodinâmicos). Analitos também foram detectados em amostras de CSF de primatas não humanos (NHP), e tais ensaios podem permitir estudos de eficácia em NHPs. A detecção de peptídeos Aβ40/42/38 e Tau total/Tau P181 também foi descrita e está sendo implementada nos estudos atuais.
[489] Os biomarcadores de imagem também estão disponíveis para estudos de CAA, uma vez que a função cerebrovascular foi identificada para refletir a patologia em CAA. A imagem foi usada especificamente para medir o sinal dependente do nível de oxigênio no sangue (BOLD) após a estimulação visual (Van Opstal et al., The lancet Neurology; 16 (2); 2017; Peca S et al., Neurology. 2013; 81 (19); Switzer A et al., NeuroImage Clinical; 2016). Ao realizar BOLD fMRI em indivíduos com CAA (avaliando as respostas funcionais de IRM dependentes do nível de oxigênio no sangue do grupo para tarefas motoras e visuais), foi observada uma ativação funcional reduzida da IRM em pacientes com CAA. Em particular, observou-se que a atividade BOLD fMRI no córtex visual está correlacionada com maior volume de WMH e maior contagem de microssangue (Peca et al., Neurology 2013; 81 (19); Switzer et al. NeuroImage Clinical 2016).
[490] Os modelos animais de CAA também foram descritos, os quais permitem a determinação do efeito do knockdown de APP na patologia de CAA e identificação de biomarcadores transladáveis. Em particular, vários modelos de roedores que expressam a mutante APP humana e mostram a patologia de CAA foram desenvolvidos, incluindo Tg-SwDI/NOS2 -/-. Em camundongos modelo Tg-SwDI/NOS2 -/-, níveis aumentados de Aβ foram identificados com o aumento da idade dos camundongos modelo. A proteína tau hiperfosforilada perivascular também foi associada à amiloide capilar não apenas em camundongos Tg-SwDI/NOS2 -/-, mas também em amostras humanas CAA tipo 1 (Hall e Roberson. Brain Res Bull. 2012; 88 (1): 3 a 12; Attems et al., Nephrology and Applied Neurobiology, 2011, 37, 75 a 93). Um modelo de DA de camundongo CVN (APPSDI/NOS2 KO) também exibiu fenótipos incluindo placas amiloides no hipocampo, tálamo e córtex, inflamação tecidual aumentada e déficits comportamentais. Um modelo de camundongo transgênico (abrigando mutações hAPP) também foi desenvolvido.
[491] Assim, a APP foi identificada como alvo para angiopatia amiloide cerebral hereditária (CAA). As mutações em APP que foram relatadas como causadoras de formas graves de CAA incluem A692G (flamengo), E693Q (holandês), E693K (italiano) e D694N (Iowa). Enquanto isso, as mutações em APP que foram descritas como causadoras de AD de início precoce incluem E665D, K670N, M671L (sueco), T714A (iraniano), T714I (austríaco), V715M (francês), V715A (alemão), I716V (Flórida), I716T , V717I (Londres), V717F, V717G e V717L. Em particular, a mutação APP E693Q (holandês) causa CAA grave com poucos emaranhados neurofibrilares do parênquima; E693Q aumenta a agregação de beta amiloide e toxicidade; E693K (italiano) é semelhante, mas as mutações E693G (ártico), E693A e E693delta causam EOFAD com pouco ou nenhum CAA; e APP D694N (Iowa) causa CAA grave com patologia de DA típica. Além disso, às mutações pontuais anteriores, as duplicações de APP que resultam em superexpressão de APP também foram identificadas como causadoras de deposição de Aβ. Enquanto isso, nenhuma mutação conhecida de APP foi descrita para prevenir ou atrasar APP- hCAA. Além disso para mutantes APP, Aβ CAA também foi observado para as mutações PSEN1 (L282V) e PSEN2 (N141I). Enquanto isso, ApoE ε2 (independente de DA) e ApoE ε4 (dependente de DA) também foram relatados como fatores de risco para CAA (Rensink A et al., Brain Research Reviews, 43(2) 2003).
[492] Certos aspectos da presente revelação são direcionados ao alvejamento de APP para knockdown em indivíduos com APP-hCAA. Existe a necessidade de tais agentes porque atualmente não existem terapias modificadoras da doença para CAA. Em determinadas modalidades, a revelação dos agentes de RNAi da presente deve fornecer aproximadamente 60 a 80% de knockdown de ambos os níveis de APP mutante e WT em todo o SNC.
[493] Os humanos com mutações de APP heterozigotas existem na população em geral com pontuação de pLI de 0,3; no entanto, nenhum nocaute de APP humano foi identificado até agora.
[494] Tentativas farmacológicas para tratar CAA humano incluem o seguinte:
[495] Ponezumabe, um anticorpo beta amiloide 40 foi estudado pela Pfizer em 36 indivíduos com CAA de início tardio. Três infusões de ponezumabe ou placebo ao longo de 60 dias foram avaliadas quanto a mudanças na reatividade cerebrovascular medida por BOLD fMRI, bem como para edema cerebral, infartos, Aβ, alteração cognitiva e outros resultados secundários. O ponezumabe mostrou diferenças entre o medicamento e o placebo, mas não atingiu o desfecho primário.
[496] BAN2401-. Os anticorpos terapêuticos beta amiloide administrados sistemicamente foram identificados como seguros, mas também podem causar edema cerebral local. Em um recente ensaio clínico de fase II de 18 meses de BAN2401 em LOAD, a incidência de SAEs foi de 17,6% para o placebo e 15,5% para a dose mais alta (10 mg/kg a cada duas semanas). As anormalidades-edema de imagem relacionadas à amiloide (ARIA- E) foram de 14,6% na dose mais alta em portadores de APOE4.
[497] Contra modelos animais de CAA, o ponezumabe foi observado como eficaz em um modelo de camundongo de CAA em relação à redução da carga de beta amiloide e reatividade vascular (Bales, 2018). Enquanto isso, camundongos knockout global de APP foram ainda considerados viáveis.
[498] O seguinte biomarcador exemplificador e dados patológicos também forneceram validação adicional para o papel principal da proteína beta amiloide na patogênese de CAA:
[499] As formas hereditárias de CAA “puro” (ou seja, sem placa parenquimatosa amiloide) foram observadas como caracterizadas por deposição de Aβ40 predominante em amiloide, em oposição a Aβ42 em DA parenquimatoso;
[500] O CAA foi observado como uma não “tauopatia”, com níveis normais de T-tau e P-tau no LCR, em contraste com os níveis elevados observados na DA;
[501] A correlação inversa da carga amiloide cerebral crescente, medida por PiB PET, com níveis decrescentes de Aβ40 no CSF foi identificada como única para CAA; e
[502] Dados experimentais in vitro e in vivo forneceram suporte crescente para uma hipótese de príon em CAA, em que Aβ40 contendo mutações CAA hereditárias tem uma propensão a dobramento incorreto e induzir o dobramento incorreto na proteína WT, de modo que ambos estão presentes em fibrilas amiloides (semelhantes a transtirretina (TTR)).
[503] Conforme revelado nos exemplos abaixo, a presente revelação oferece uma série de duplexes de alvejamento de APP de reação cruzada de camundongo/rato (incluindo, por exemplo, AD-397177, AD397192, AD-397196, AD-397182, AD397190, AD-397265 e AD-397203), com base nos resultados de triagem obtidos para o mRNA do fígado de APP, quando duplexes foram administrados a 2 mg/kg em dose única, conforme avaliado no dia 21 pós-dosagem. A presente revelação também oferece uma série de duplexes de reação cruzada humana/cinomolgos (incluindo, por exemplo, AD-392911, AD-392912, AD-392703, AD- 392866, AD-392927, AD-392913, AD-392843, AD -392916, AD- 392714, AD-392844, AD-392926, AD-392824, AD-392704 e AD- 392790), com base nos resultados de triagem obtidos para o tratamento de hepatócitos de cinomolgos primários e células BE(2)C humanas.
[504] O knockdown de EOFAD mediado por agente de RNAi também está expressamente contemplado. Assim como o hCAA, o EOFAD é uma doença rara e devastadora e - assim como para o hCAA - o papel causal da APP está bem estabelecido e a fenotipagem da doença pode ser realizada com maior precisão e em um período de tempo mais curto do que, por exemplo, esporádico e/ou DA de início tardio (opcionalmente DA de início tardio com CAA grave como uma subclasse da DA de início tardio). EOFAD é uma doença neurodegenerativa demencial progressiva em adultos jovens, possuindo uma idade de início antes dos 60 a 65 anos e frequentemente antes dos 55 anos de idade.
[505] A prevalência de EOFAD foi estimada em 41,2 por 100.000 para a população em risco (ou seja, pessoas com idades entre 40 a 59 anos), com 61% das pessoas afetadas por EOFAD tendo uma história familiar positiva de EOFAD (entre estes, 13% afetaram indivíduos em três gerações). EOFAD compreende menos de 3% de todas as DAs (Bird, Genetics in Medicine, 10: 231 a 239; Brien e Wang. Annu Rev Neu Sci, 2011, 34: 185 a 204; NCBI Gene Reviews).
[506] Fornecendo validação genética humana do alvo APP (OMIM 104300), certas mutações APP foram identificadas que causam EOFAD, incluindo E665D, K670N, M671L (sueco), T714A (iraniano), T714I (austríaco), V715M (francês), V715A (alemão), I716V (Flórida), I716T, V717I (Londres), V717F, V717G e V717L, conforme descrito acima. Além disso, mutações da proteína precursora beta amiloide dominante também foram identificadas que causam EOFAD e CAA.
[507] Sem desejar ser limitado pela teoria, acredita-se que a patogênese da DA começa no hipocampo, uma crista de substância cinzenta imediatamente superior a ambos os ventrículos laterais. Acredita-se que a degeneração desse tecido cause a perda de memória característica das primeiras doenças. Embora o mecanismo de neurodegeneração no nível da proteína tenha sido motivo de grande debate, as duplicações de APP associadas a EOFAD indicaram que a superexpressão de APP pode ser suficiente para causar DA. (Haass e Selkoe. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 8: 101 a 112).
[508] Em contraste com EOFAD e CAA, os mecanismos patogênicos da DA esporádica ainda não são compreendidos e a população de DA esporádica definida clinicamente é provavelmente mecanicamente heterogênea.
[509] Certos aspectos da revelação do presente são direcionados ao alvejamento de APP para knockdown em indivíduos com EOFAD. Existe uma necessidade de tais agentes porque apenas os tratamentos direcionados aos sintomas (de eficácia limitada) existem para DA mais geralmente e EOFAD em particular. Em determinadas modalidades, a revelação dos agentes de RNAi da presente deve fornecer aproximadamente 60 a 80% de knockdown de ambos os níveis de APP mutante e WT em todo o SNC. Uma outra observação da genética humana que fala sobre a provável eficácia terapêutica de uma terapia direcionada a APP capaz de derrubar os níveis de APP em células do SNC é que uma mutação A673T foi identificada que protegeu portadores de AD e demência na população em geral (Jonsson et al Nature Letter, 488. doi: 10.1038/nature11283). A substituição A673T é adjacente a um sítio de clivagem de β- secretase, e foi descrito como resultando em uma redução de 40% na beta amiloide em ensaios de células. Assim, um ponto mutante de APP negativo dominante pareceu proteger as famílias de DA, reforçando ainda mais que o knockdown de APP mediado por agente de RNAi poderia exercer um efeito protetor e/ou terapêutico semelhante em pelo menos certas formas de DA, incluindo EOFAD.
[510] Auxiliando nos estágios iniciais de desenvolvimento de agente de RNAi de alvejamento de APP, observou-se que camundongos knockout de APP são viáveis (OMIM 104300), o que se espera que permita o uso viável de camundongo como um sistema modelo durante o desenvolvimento do composto principal. Em contraste com os camundongos, embora os humanos possuindo mutações de APP heterozigotas existam na população geral com pontuação EXAC de 0,3, nenhum nocaute de APP humana foi identificado até o momento. Os biomarcadores disponíveis para o desenvolvimento de agentes de RNAi que têm como alvo APP incluem os peptídeos APP e MAPT no LCR, que devem permitir uma avaliação rápida e eficácia útil, mesmo em uma população geneticamente homogênea (Mo et al. (2017) Alzheimers & Dementia: Diagnosis, Assessment & Disease Monitoring, 6: 201 a 209.
[511] Como observado acima, as tentativas de tratar as formas esporádicas de DA e EOFAD até agora não tiveram sucesso - por exemplo, todos os ensaios de inibidores de BACE1 (β-secretase) (BACE1i) para o tratamento de DA esporádica falharam até agora (Egan et al. The New England Journal of Medicine, 378: 1.691 a 1.703; Hung e Fu. Journal of Biomedical Science, 24: 47). Em tais testes BACEi, não houve estudos concluídos em populações geneticamente definidas (apenas estudos iniciados). Notavelmente, o estudo BACE1i mais recente mostrou que o verubecestato reduziu os níveis de beta amiloide em 60% em uma população selecionada com base na idade e em critérios clínicos que sugeriram um diagnóstico provável de DA (Egan et al. The New England Journal of Medicine, 378:
1.691 a 1.703; Hung e Fu. Journal of Biomedical Science, 24: 47). Enquanto isso, entre as imunoterapias dirigidas por Aβ, uma dessas imunoterapias demonstrou prova de conceito em um estudo recente em DA esporádica, apoiando o início de um estudo de Fase III em andamento (Selkoe e Hardy. EMBO Molecular Medicine, 8: 595 a 608). Dado o seu papel na clivagem de APP, a γ-secretase também foi alvo de certos ensaios direcionados à DA. No entanto, até o momento, nenhum ensaio com o inibidor da γ-secretase foi concluído em uma população geneticamente definida; Os vários programas foram interrompidos por toxicidade (Selkoe e Hardy).
[512] Existe, portanto, a necessidade de agentes que possam tratar ou prevenir doença associada a APPs ou distúrbios em um indivíduo afetado.
[513] É expressamente contemplado que toda doença associada à APPs ou distúrbios podem, em última análise, ser direcionados usando os agentes de RNAi da presente revelação - especificamente, o alvejamento de CAA esporádico e DA esporádico e/ou de início tardio também é contemplado para os agentes de RNAi da presente revelação, mesmo tendo em vista as questões de diagnóstico/fenotipagem atualmente enfrentadas por essas doenças associadas a APPs (considera-se ainda que os diagnósticos para essas doenças também continuarão a melhorar). V. AGENTES DE RNAI CONJUGADOS A LIGANTES
[514] Outra modificação do RNA de um agente de RNAi da revelação envolve a ligação química ao RNA de um ou mais ligantes, grupamentos ou conjugados que potencializam a atividade, distribuição celular ou captação celular do RNAi. Esses grupamentos incluem, mas não estão limitados a grupamentos de lipídios, como uma fração de colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 86: 6.553 a 6.556), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Biorg. Med. Chem. Let., 4: 1.053 a 1.060), um tioéter, por exemplo, beril- S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. NY Acad. Sci., 660: 306 a 309; Manoharan et al., (1993) Biorg. Med. Chem. Let., 3: 2.765 a 2.770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20: 533 a 538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecil (Saison- Behmoaras et al., (1991) EMBO J, 10: 1.111 a 1.118; Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259: 327 a 330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie, 75: 49 a 54), um fosfolipídio, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2-di-O- hexadecil-rac-glicero-3-fosfonato (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36: 3.651 a 3.654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18: 3.777 a 3.783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14: 969 a 973) ou ácido acético de adamantano (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36: 3.651 a
3.654), uma porção palmitilo (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264: 229 a 237), ou uma porção octadecilamina ou hexilamino-carboniloxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277: 923 a 937).
[515] Em uma modalidade, um ligante altera a distribuição, visando ou ao tempo de vida de um agente de RNAi ao qual é incorporado. Em modalidades preferidas, um ligante oferece uma afinidade aumentada para um alvo selecionado, por exemplo, molécula, célula ou tipo de célula, compartimento, por exemplo, um compartimento celular ou órgão, tecido, órgão ou região do corpo, como, por exemplo, comparado a uma espécie sem tal ligante. Os ligantes preferenciais não farão parte do emparelhamento duplex em um ácido nucleico duplexado.
[516] Os ligantes podem incluir uma substância de ocorrência natural, tal como uma proteína (por exemplo, albumina de soro humano (HSA), lipoproteína de baixa densidade (LDL), ou globulina); carboidrato (por exemplo, um dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina, N- acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina ou ácido hialurônico); ou um lipídio. O ligante também pode ser uma molécula recombinante ou sintética, como um polímero sintético, por exemplo, um poliaminoácido sintético. Exemplos de poliaminoácidos incluem poliaminoácido é uma polilisina (PLL), ácido poli-L-aspártico, ácido poli-L-glutâmico, copolímero de anidrido de estireno-ácido maleico, copolímero de poli (L-lactídeo-co-glicolizado), copolímero de divinila éter-anidrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HMPA), polietilenoglicol (PEG), álcool polivinílico (PVA), poliuretano, poli (ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida ou polifosfazina. Exemplos de poliaminas incluem: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopeptídeo-poliamina, poliamina peptidomimética, dendrímero de poliamina, arginina, amidina, protamina, lipídio catiônico, porfirina catiônica, sal quaternário de uma poliamina alfa peptídeo.
[517] Os ligantes também podem incluir grupos de direcionamento, por exemplo, uma célula ou agente de alvejamento de tecido, por exemplo, uma lectina, glicoproteína, lipídio ou proteína, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula especificado, como uma célula de rim. Um grupo-alvo pode ser uma tireotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína A tensoativo, carboidrato de mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N- acetil-galactosamina, N-acetil-gulucosamina manose multivalente, fucose multivalente, galactose multivalente, poliaminoacino-galactose, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, um lipídio, colesterol, um esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina ou um peptídeo RGD ou mimético de peptídeo RGD.
[518] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercalantes (por exemplo, acridinas),
reticulantes (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, di- hidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), lipofílico moléculas, por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1-pireno butírico, di- idrotestosterona, 1,3-Bis-O (hexadecil) glicerol, grupo geraniloxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3- propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil) litocólico, ácido O3-(oleoil) colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina) e conjugados de peptídeos (por exemplo, peptídeo de Antennapedia, peptídeo Tat), alquilantes, fosfato, amino , mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina, vitamina E, ácido fólico), r sintético ibonucleases (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, aglomerados de imidazol, conjugados de acridina-imidazol, complexos Eu3+ de tetra-azamacrociclos), dinitrofenil, HRP ou AP.
[519] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas, ou peptídeos, por exemplo, moléculas com afinidade específica para um coligante, ou anticorpos, por exemplo, um anticorpo, que se liga a um tipo de célula especificado, como uma célula do SNC . Os ligantes também podem incluir hormônios e receptores de hormônios. Eles também podem incluir espécies não peptídicas, como lipídios, lectinas, carboidratos, vitaminas, cofatores, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-
gulucosamina manose multivalente ou fucose multivalente.
[520] O ligante pode ser uma substância, por exemplo, um medicamento, que pode aumentar a absorção do agente de RNAi pela célula, por exemplo, ao romper o citoesqueleto da célula, por exemplo, ao romper os microtúbulos, microfilamentos da célula e/ou filamentos intermediários. O fármaco pode ser, por exemplo, táxon, vincristina, vimblastina, citocalasina, nocodazol, japlacinolida, latrunculina A, faloidina, swinholide A, indanocina ou mioservina.
[521] Em algumas modalidades, um ligante ligado a um agente de RNAi como descrito no presente documento atua como um modulador farmacocinético (modulador de PK). Os moduladores de PK incluem lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídios, peptídeos, agentes de ligação de proteínas, PEG, vitaminas, etc. Os moduladores de PK exemplificadores incluem, mas não estão limitados a colesterol, ácidos graxos, ácido eólico, ácido litocólico, dialquilaglicerídeos, diacilglicerídeo, fosfolipídios, esfingolipídios, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina etc. Os oligonucleotídeos que compreendem uma série de ligação de fosforotioatos também são conhecidos por se ligarem à proteína do soro, portanto, oligonucleotídeos curtos, por exemplo, oligonucleotídeos de cerca de 5 bases, 10 bases, 15 bases ou 20 bases, compreendendo múltiplas ligações de fosforotioatos na cadeia principal, também são passíveis da presente revelação como ligantes (por exemplo, como ligantes moduladores de PK). Além disso, aptâmeros que se ligam a componentes de soro (por exemplo, proteínas de soro) também são adequados para uso como ligantes moduladores de PK nas modalidades aqui descritas.
[522] Os oligonucleotídeos da revelação conjugados ao ligante podem ser sintetizados pelo uso de um oligonucleotídeo que carrega uma funcionalidade reativa pendente, tal como aquela derivada da ligação de uma molécula de ligação ao oligonucleotídeo (descrito abaixo). Este oligonucleotídeo reativo pode ser reagido diretamente com ligantes disponíveis comercialmente, ligantes que são sintetizados carregando qualquer um de uma variedade de grupos de proteção, ou ligantes que têm uma fração de ligação ligada a eles.
[523] Os oligonucleotídeos usados na revelação de conjugados da presente podem ser convenientemente e rotineiramente feitos através da técnica bem conhecida de síntese em fase sólida. O equipamento para tal síntese é vendido por vários fornecedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Qualquer outro meio para tal síntese conhecido na técnica pode, adicionalmente ou alternativamente, ser empregado. Também é conhecida a utilização de técnicas semelhantes para preparar outros oligonucleotídeos, como os fosforotioatos e derivados alquilados.
[524] Nos oligonucleotídeos conjugados com ligante e molécula de ligante contendo nucleosídeos ligados da presente revelação, os oligonucleotídeos e oligonucleosídeos podem ser montados em um sintetizador de DNA adequado utilizando precursores de nucleotídeo ou nucleosídeo padrão, ou nucleotídeo ou precursores de conjugado de nucleosídeo que já conter a porção de ligação, nucleotídeo nucleotídeo-ligante ou precursores de conjugado de nucleosídeo que já carregam a molécula de ligante, ou blocos de construção não contendo ligante de nucleosídeo.
[525] Ao usar precursores de conjugado de nucleotídeo que já carregam uma fração de ligação, a síntese dos nucleosídeos ligados a sequência específica é tipicamente concluída, e a molécula de ligante é então reagida com a fração de ligação para formar o oligonucleotídeo conjugado de ligante. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos ou nucleosídeos ligados da presente revelação são sintetizados por um sintetizador automatizado usando fosforamiditos derivados de conjugados ligante-nucleosídeo além dos fosforamiditos padrão e fosforamiditos não padrão que estão comercialmente disponíveis e rotineiramente usados na síntese de oligonucleotídeos. A. PORÇÕES LIPOFÍLICAS
[526] Em determinadas modalidades, o grupamento lipofílico é um alifático, cíclico como alicíclico ou policíclico como composto polialicíclico, como um esteroide (por exemplo, esterol) ou um hidrocarboneto alifático linear ou ramificado. O grupamento lipofílico pode compreender em geral uma cadeia de hidrocarbonetos, que pode ser cíclica ou acíclica. A cadeia de hidrocarbonetos pode compreender vários substituintes e/ou um ou mais heteroátomos, como um átomo de oxigênio ou nitrogênio. Tais grupamentos alifáticos lipofílicos incluem, sem limitação, hidrocarboneto C4-C30 saturado ou insaturado (por exemplo, hidrocarboneto C6-C18), ácidos graxos saturados ou insaturados, ceras (por exemplo, ésteres de álcool monoídrico de ácidos graxos e diamidas graxas), terpenos (por exemplo, terpenos C10, sesquiterpenos C15, diterpenos C20, triterpenos C30 e tetraterpenos C40), e outros hidrocarbonetos polialicíclicos. Por exemplo, o grupamento lipofílico pode conter uma cadeia de hidrocarbonetos C4-C30 (por exemplo, C4-C30 alquila ou alquenila). Em alguma forma de realização o grupamento lipofílico contém uma cadeia de hidrocarbonetos C6-C18 saturada ou insaturada (por exemplo, uma alquila ou alquila C6-C18 linear). Em uma modalidade, o grupamento lipofílico contém uma cadeia de hidrocarboneto C16 saturada ou insaturada (por exemplo, uma C16 alquila ou alquila linear).
[527] O grupamento lipofílico pode ser anexado ao agente de RNAi por qualquer método conhecido na técnica, incluindo por meio de um agrupamento funcional já presente no grupamento lipofílico ou introduzido no agente de RNAi, como um grupo hidróxi (por exemplo, —CO—CH2—OH). Os grupos funcionais já presentes no grupamento lipofílico ou introduzidos no agente de RNAi incluem, mas não se limitam a hidroxila, amina, ácido carboxílico, sulfonato, fosfato, tiol, azida e alquino.
[528] A conjugação do agente de RNAi e do grupamento lipofílico pode ocorrer, por exemplo, através da formação de um éter ou uma ligação éster carboxílico ou carbamoil entre o hidroxi e um grupo R— alquila, um grupo RCO— alcanoil ou um grupo RNHCO— carbamoil substituído. O grupo R alquila pode ser cíclico (por exemplo, ciclo-hexila) ou acíclico (por exemplo, de cadeia linear ou ramificada; e saturado ou insaturado). O grupo R alquila pode ser um grupo butila, pentila, hexila, heptila, octila, nonila, decila, undecil, dodecila, tridecila, tetradecila, pentadecila, hexadecil, heptadecila ou octadecila ou semelhantes.
[529] Em algumas modalidades, o grupamento lipofílico é conjugado ao agente de RNAi de duplo filamento por meio de um ligante, um ligante contendo um éter, tioéter, ureia, carbonato, amina, amida, tioéter de maleimida, dissulfeto, fosfodiéster, ligação de sulfonamida, a produto de uma reação click (por exemplo, um triazol da cicloadição azida- alquino), ou carbamato.
[530] Em outra modalidade, o grupamento lipofílico é um esteroide, como o esterol. Os esteroides são compostos policíclicos contendo um sistema de anel peridro- 1,2-ciclopentanofenantreno. Os esteroides incluem, sem limitação, ácidos biliares (por exemplo, ácido cólico, ácido desoxicólico e ácido desidrocólico), cortisona, digoxigenina, testosterona, colesterol, esteroides catiônicos, como cortisona. Um “derivado de colesterol” se refere a um composto derivado de colesterol, por exemplo, por substituição, adição ou remoção de substituintes.
[531] Em outra modalidade, o grupamento lipofílico é uma porção aromática. Neste contexto, o termo “aromático” se refere amplamente a hidrocarbonetos mono e poliaromáticos. Os grupos aromáticos incluem, sem limitação, grupamentos C6-C14 arila compreendendo de um a três anéis aromáticos, que podem ser opcionalmente substituídos; Grupos “aralquila” ou “arilalquila” compreendendo um grupo arila covalentemente ligado a um grupo alquila, qualquer um dos quais pode ser opcionalmente substituído ou não substituído; e grupos “heteroarila”. Como usado no presente documento, o termo “heteroarila” se refere a grupos com 5 a 14 átomos no anel, preferencialmente 5, 6, 9 ou 10 átomos no anel; tendo 6, 10, ou 14π elétrons compartilhados em um arranjo cíclico, e tendo, além de átomos de carbono, entre um e cerca de três heteroátomos selecionados a partir do grupo que consiste em nitrogênio (N), oxigênio (O) e enxofre (S).
[532] Conforme empregado neste documento, um grupo alquila “substituído”, cicloalquila, arila, heteroarila ou heterocíclico é aquele que tem entre um e cerca de quatro, preferencialmente entre um e cerca de três, mais preferencialmente um ou dois, substituintes não hidrogênio. Os substituintes adequados incluem, sem limitação, grupos halo, hidróxi, nitro, haloalquila, alquila, alcarila, arila, aralquila, alcóxi, arilóxi, amino, acilamino, alquilacarbamoíla, arilcarbamoíla, aminoalquila, alcoxicarbonila, carbóxi, hidroxialquila, alcanossulfonila, arenosulfonila, arenosulfonila, arenosulfonila, aralquilasulfonamido, alquilacarbonila, acilóxi, ciano e ureído.
[533] Em algumas modalidades, o grupamento lipofílico é um grupo aralquila, por exemplo, uma porção 2- arilpropanoila. As características estruturais do grupo aralquila são selecionadas para que o grupamento lipofílico se ligue ao pelo menos uma proteína in vivo. Em determinadas modalidades, as características estruturais do grupo aralquila são selecionadas de forma que o grupamento lipofílico se ligue a proteínas séricas, vasculares ou celulares. Em determinadas modalidades, as características estruturais do grupo aralquila promovem a ligação à albumina, uma imunoglobulina, uma lipoproteína, α-2-macroglubulina ou α-1-glicoproteína.
[534] Em determinadas modalidades, o ligante é o naproxeno ou um derivado estrutural do naproxeno. Os procedimentos para a síntese de naproxeno podem ser encontrados na Patente nº 3.904.682 e Patente nº 4.009.197, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. O naproxeno tem o nome químico de ácido (S)-6-Metoxi-α-metil-2- naftalenoacético e a estrutura é .
[535] Em determinadas modalidades, o ligante é o ibuprofeno ou um derivado estrutural do ibuprofeno. Os procedimentos para a síntese de ibuprofeno podem ser encontrados na Patente nº 3.228.831, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. A estrutura do ibuprofeno é .
[536] Os grupos aralquila exemplares adicionais são ilustrados na patente nº US 7.626.014, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[537] Em outra modalidade, os grupamentos lipofílicos adequados incluem lipídio, colesterol, ácido retinoico, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1- pireno butírico, di-idrotestosterona, 1,3-bis- O(hexadecil)glicerol, geraniloxiexanol, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colênico, ibuprofeno, naproxeno, dimetoxitritila ou fenoxazina.
[538] Em determinadas modalidades, mais de um grupamento lipofílico pode ser incorporado ao agente de RNAi de duplo filamento, principalmente quando o grupamento lipofílico tem baixa lipofilicidade ou hidrofobicidade. Em uma modalidade, dois ou mais grupamentos lipofílicos são incorporados ao mesmo filamento do agente de RNAi de duplo a filamento. Em uma modalidade, cada filamento do agente de RNAi de duplo filamento tem um ou mais grupamentos lipofílicos incorporados. Em uma modalidade, dois ou mais grupamentos lipofílicos são incorporados na mesma posição (ou seja, a mesma nucleobase, mesmo grupamento de açúcar, ou mesma ligação internucleosídica) do agente de duplo filamento de RNAi. Isso pode ser alcançado, por exemplo, conjugando os dois ou mais grupamentos lipofílicos por meio de um carreador, e/ou conjugando os dois ou mais grupamentos lipofílicos por meio de um ligante ramificado, e/ou conjugando os dois ou mais grupamentos lipofílicos por meio de um ou mais ligantes, com um ou mais ligantes ligando os grupamentos lipofílicos consecutivamente.
[539] O grupamento lipofílico pode ser conjugado ao agente de RNAi por meio de uma fixação direta ao açúcar ribose do agente de RNAi. Alternativamente, o grupamento lipofílico pode ser conjugado ao agente de RNAi de duplo filamento por meio de um ligante ou carreador.
[540] Em determinadas modalidades, o grupamento lipofílico pode ser conjugado ao agente de RNAi por meio de um ou mais ligantes (amarras).
[541] Em uma modalidade, o grupamento lipofílico é conjugado ao agente de RNAi de duplo filamento por meio de um ligante contendo um éter, tioéter, ureia, carbonato, amina, amida, tioéter de maleimida, dissulfeto, fosfodiéster, ligação de sulfonamida, um produto de uma reação clique (por exemplo, um triazol da condição de ciclo azida-alquino), ou carbamato.
[542] Exemplos de ligantes, amarras, carreadores, modificações de ácidos nucleicos, conjugados, ligantes e outros grupamentos úteis para alcançar a entrega dirigida ao sistema nervoso central dos agentes de RNAi que têm como alvo a APP da presente revelação são descritos em detalhes adicionais, por exemplo, nos Pedidos de Patente US 62/668.072, 62/738.747 e/ou 62/773.082, cujo conteúdo total é aqui incorporado por esta referência. B. CONJUGADOS LIPÍDICOS
[543] Em uma modalidade, o ligante ou conjugado é uma molécula de base lipídica ou lipídica. Tal lipídio ou molécula à base de lipídio liga-se preferencialmente a uma proteína do soro, por exemplo, albumina do soro humano (HSA). Um ligante de ligação de HSA permite a distribuição vascular do conjugado para um tecido-alvo, por exemplo, um tecido-alvo não renal do corpo. Em determinadas modalidades, o tecido-alvo pode ser o SNC, incluindo as células gliais do cérebro. Outras moléculas que podem ligar HSA também podem ser usadas como ligantes. Por exemplo, pode-se usar neproxina ou aspirina. Um ligante à base de lipídio ou lipídio pode (a) aumentar a resistência à degradação do conjugado, (b) aumentar o direcionamento ou transporte para uma célula ou membrana celular-alvo, e/ou (c) pode ser usado para ajustar a ligação a uma proteína sérica, por exemplo, HSA.
[544] Um ligante à base de lipídios pode ser usado para inibir, por exemplo, controlar a ligação do conjugado a um tecido-alvo. Por exemplo, um lípido ou ligante à base de lípido que se liga à HSA mais fortemente terá menos probabilidade de ser direcionado para o rim e, portanto, menos provável de ser eliminado do corpo. Um lipídio ou ligante à base de lipídio que se liga à HSA menos fortemente pode ser usado para direcionar o conjugado para o rim.
[545] Opcionalmente, o ligante à base de lipídios liga-se a HSA. De preferência, ele se liga a HSA com uma afinidade suficiente para que o conjugado seja preferencialmente distribuído a um tecido não renal. No entanto, é preferido que a afinidade não seja tão forte que a ligação HSA-ligante não possa ser revertida.
[546] Em outra modalidade preferencial, o ligante à base de lipídios se liga à HSA fracamente ou não liga HSA, de modo que o conjugado seja preferencialmente distribuído ao rim. Outros grupamentos que visam células renais também podem ser usados no lugar de ou além do ligante à base de lipídios.
[547] Em outro aspecto, o ligante é uma porção, por exemplo, uma vitamina, que é retomada por uma célula-alvo, por exemplo, uma célula em proliferação. Esses são particularmente úteis para o tratamento de distúrbios caracterizados por proliferação de células indesejadas, por exemplo, do tipo maligno ou não maligno, por exemplo, células cancerosas. Vitaminas exemplificadoras incluem vitamina A, E, e K. Outras vitaminas exemplificadoras incluem vitamina B, por exemplo, ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal ou outras vitaminas ou nutrientes absorvidos por células-alvo, como células cerebrais. Também estão incluídos HSA e lipoproteína de baixa densidade (LDL). C. AGENTES DE PERMEAÇÃO CELULAR
[548] Em outro aspecto, o ligante é um agente de permeação de célula, preferencialmente um agente de permeação de célula helicoidal. De preferência, o agente é anfipático.
Um exemplo de agente é um peptídeo tal como antenopédia ou tat. Se o agente for um peptídeo, ele pode ser modificado, incluindo um peptidilimético, invertômeros, ligações não peptídicas ou pseudo-peptídicas, e uso de D-aminoácidos. O agente helicoidal é preferencialmente um agente alfa- helicoidal, que preferencialmente possui uma fase lipofílica e uma lipofóbica.
[549] O ligante pode ser um peptídeo ou peptídeo mimético. Um peptidomimético (também referido aqui como um oligopeptidomimético) é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida semelhante a um peptídeo natural. A ligação de peptídeos e peptidomiméticos aos agentes de RNAi pode afetar a distribuição farmacocinética do agente de RNAi, por exemplo, aumentando o reconhecimento e a absorção celular. O peptídeo ou porção peptidomimética pode ter cerca de 5 a 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 aminoácidos de comprimento.
[550] Um peptídeo ou peptídeo mimético pode ser, por exemplo, um peptídeo de permeação de célula, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático ou hidrofóbico (por exemplo, consistindo principalmente de Tyr, Trp ou Phe). A porção de peptídeo pode ser um peptídeo dendrímero, peptídeo restrito ou peptídeo reticulado. Em outra alternativa, a porção de peptídeo pode incluir uma sequência de translocação de membrana hidrofóbica (MTS). Um exemplo de peptídeo hidrofóbico contendo MTS é RFGF tendo a sequência de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 29). Um análogo de RFGF (por exemplo, sequência de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 30) contendo um MTS hidrofóbico também pode ser uma fração de direcionamento. A fração de peptídeo pode ser um peptídeo de “entrega”, que pode transportar grandes moléculas polares, incluindo peptídeos, oligonucleotídeos, proteína e através das membranas da célula. Por exemplo, sequências da proteína HIV Tat (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 31) e a proteína Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 32) foram encontrados para serem capazes de funcionar como peptídeos de entrega . Um peptídeo ou peptidomimético pode ser codificado por uma sequência aleatória de DNA, como um peptídeo identificado a partir de uma biblioteca de exibição de fago, ou biblioteca combinatória de um grânulo-um-composto (OBOC) (Lam et al., Nature, 354: 82 a 84, 1991). Exemplos de um peptídeo ou peptidomimético amarrado a um agente de dsRNA por meio de uma unidade de monômero incorporada para fins de alvejamento de célula é um peptídeo de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) ou mimetizador de RGD. Um peptídeo a porção pode variar em comprimento de cerca de 5 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos. Os grupamentos de peptídeos podem ter uma modificação estrutural, de forma a aumentar a estabilidade ou propriedades conformacionais diretas. Qualquer uma das modificações estruturais descritas abaixo pode ser utilizada.
[551] Um peptídeo RGD para uso nas composições e métodos de revelação pode ser linear ou cíclico, e pode ser modificado, por exemplo, glicosilado ou metilado, para facilitar o direcionamento a um tecido específico (ou a uns tecidos específicos). Os peptídeos e peptidiomiméticos contendo RGD podem incluir D-aminoácidos, bem como miméticos de RGD sintéticos. Além do RGD, pode-se utilizar outros grupamentos que visam o ligante integrina. Conjugados preferenciais desse ligante-alvo PECAM-1 ou VEGF.
[552] Um “peptídeo de permeação de célula” é capaz de permear uma célula, por exemplo, uma célula microbiana, como uma célula bacteriana ou fúngica, ou uma célula de mamífero, como uma célula humana. Um peptídeo que permeia a célula microbiana pode ser, por exemplo, um peptídeo linear α-helicoidal (por exemplo, LL-37 ou Ceropin P1), um peptídeo contendo uma ligação dissulfeto (por exemplo, α- defensina, β-defensina ou bactenecina), ou um peptídeo contendo apenas um ou dois aminoácidos dominantes (por exemplo, PR-39 ou indolicidina). Um peptídeo de permeação de célula também pode incluir um sinal de localização nuclear (NLS). Por exemplo, um peptídeo de permeação de célula pode ser um peptídeo anfipático bipartido, como MPG, que é derivado do domínio do peptídeo de fusão de HIV-1 gp41 e o NLS do antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31: 2.717 a 2.724, 2003). D. CONJUGADOS DE CARBOIDRATOS E LIGANTES
[553] Em algumas modalidades das composições e métodos de revelação, um oligonucleotídeo agente de RNAi compreende ainda um carboidrato. Os agentes de RNAi conjugados a carboidratos são vantajosos para a entrega in vivo de ácidos nucleicos, bem como composições adequadas para uso terapêutico in vivo, como descrito no presente documento. Como usado no presente documento, “carboidrato” se refere a um composto que é um carboidrato per se feito de uma ou mais unidades de monossacarídeo tendo pelo menos 6 átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificados ou cíclicos) com um oxigênio, nitrogênio ou átomo de enxofre ligado a cada átomo de carbono; ou um composto tendo como parte dele uma fração de carboidrato composta por uma ou mais unidades de monossacarídeo, cada uma tendo pelo menos seis átomos de carbono (que podem ser lineares, ramificados ou cíclicos), com um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado a cada átomo de carbono . Os carboidratos representativos incluem os açúcares (mono, di, tri e oligossacarídeos contendo cerca de 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 unidades de monossacarídeos), e polissacarídeos como amidos, glicogênio, celulose e gomas de polissacarídeos. Monossacarídeos específicos incluem açúcares C5 e acima (por exemplo, C5, C6, C7 ou C8); di e trissacarídeos incluem açúcares com duas ou três unidades de monossacarídeos (por exemplo, C5, C6, C7 ou C8).
[554] Em uma modalidade, um conjugado de carboidrato para uso nas composições e métodos da revelação é um monossacarídeo.
[555] Em determinadas modalidades, as composições e métodos da revelação incluem um ligante C16. Em modalidades exemplificativas, o ligante C16 da revelação tem a seguinte estrutura (exemplificada aqui abaixo para uma base de uracila, porém a fixação do ligante C16 é contemplada para um nucleotídeo apresentando qualquer base (C, G, A, etc.) e/ou possuindo qualquer outra modificação tal como aqui apresentada, desde que a fixação do 2'-ribo seja preservada) e seja fixada na posição 2'-ribo dentro de um resíduo que é assim modificado:
[556] Como mostrado acima, um resíduo modificado de ligante C16 apresenta uma alquila de cadeia linear na posição 2'-ribo de um resíduo exemplificativo (aqui, uma uracila) que é assim modificado.
[557] Em algumas modalidades, um conjugado de carboidrato de um agente de RNAi da presente revelação compreende ainda um ou mais ligantes adicionais conforme descrito acima, tais como, mas não se limitando a um modulador de PK e/ou um peptídeo de permeação de célula.
[558] Os conjugados de carboidratos adicionais (e ligantes) adequados para uso na presente revelação incluem aqueles descritos nas Publicações PCT nos WO 2014/179620 e WO 2014/179627, cujo todo o conteúdo de cada um desses é aqui incorporado por referência.
[559] Em determinadas modalidades, as composições e métodos da revelação incluem uma modificação de fosfonato de vinila (VP) de um agente de RNAi como descrito no presente documento. Em modalidades exemplificativas, um fosfonato de vinila da revelação tem a estrutura a seguir:
[560] Um fosfonato de vinila da revelação do presente pode ser anexado ao antissenso ou ao filamento sensor de um dsRNA da revelação. Em certas modalidades preferenciais, um fosfonato de vinila da revelação do presente é anexado ao filamento antissenso de um dsRNA, opcionalmente na extremidade 5' do filamento antissenso do dsRNA.
[561] As modificações de vinila fosfato também são contempladas para as composições e métodos da presente revelação. Uma estrutura exemplificativa de fosfato de vinila é: E. MODIFICAÇÕES DE TERMODESESTABILIZAÇÃO
[562] Em determinadas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser otimizada para interferência de RNA através da incorporação de modificações de termodesestabilização na região de semente do filamento antissenso (isto é, nas posições 2 a 9 da extremidade 5' do filamento antissenso) para reduzir ou inibir o silenciamento fora do gene-alvo. Foi revelado que os dsRNAs com um filamento antissenso compreendendo pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex dentro das primeiras 9 posições de nucleotídeos, contando a partir da extremidade 5’, do filamento antissenso têm reduzido a atividade de silenciamento fora do gene-alvo. Consequentemente, em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco ou mais) modificação de termodesestabilização do duplex dentro das primeiras 9 posições de nucleotídeo da região 5’ do filamento antissenso. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de termodesestabilização do duplex estão localizadas nas posições 2 a 9, ou preferencialmente posições 4 a 8, a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso. Em algumas outras modalidades, as modificações de termodesestabilização do duplex estão localizadas na posição 6, 7 ou 8 a partir da extremidade 5’do filamento antissenso. Em ainda algumas outras modalidades, a modificação de termodesestabilização do duplex está localizada na posição 7 a partir da extremidade 5' do filamento antissenso. O termo “modificação (ões) de termodesestabilização” inclui modificação (ões) que resultaria (m)com um dsRNA com uma temperatura geral de fusão (Tm) mais baixa (preferencialmente uma Tm com um, dois, três ou quatro graus abaixo da Tm do dsRNA sem ter tal modificação (ões). Em algumas modalidades, a modificação de termodesestabilização do duplex está localizada na posição 2, 3, 4, 5 ou 9 a partir da extremidade 5' do filamento antissenso.
[563] As modificações de termodesestabilização podem incluir, mas sem limitação, modificação abásica; incompatibilidade com o nucleotídeo oposto no filamento oposto; e modificação de açúcar como modificação 2’-desóxi ou nucleotídeo acíclico, por exemplo, ácidos nucleicos desbloqueados (UNA) ou ácido glicolnucleico (GNA).
[564] As modificações abásicas exemplificativas incluem, mas não estão limitadas ao seguinte:
R O O O O O N O O O O O O O O O O * * R' R" * R' R R * R * O O O
[565] em que R = H, Me, Et ou OMe; R’ = H, Me, Et ou OMe; R” = H, Me, Et ou OMe
[566] em que B é uma nucleobase modificada ou não modificada.
[567] Os açúcares modificados exemplificados incluem, mas não estão limitados ao seguinte:
[568] Em que B é uma nucleobase modificada ou não modificada.
[569] Em algumas modalidades, a modificação de termodesestabilização do duplex é selecionada a partir do grupo que consiste em:
[570] em que B é uma nucleobase modificada ou não modificada e o asterisco em cada estrutura representa R, S ou racêmico.
[571] O termo “nucleotídeo acíclico” se refere a qualquer nucleotídeo com um açúcar ribose acíclico, por exemplo, onde qualquer uma das ligações entre os carbonos ribose (por exemplo, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4' ou C1'-O4') está ausente e/ou pelo menos um dos carbonos ribose ou oxigênio (por exemplo, C1', C2', C3', C4' ou O4') são ausentes independentemente ou em combinação a partir do nucleotídeo. Em algumas modalidades, o nucleotídeo acíclico é
O B
O 2 R1 R
O , , , ou , em que B é uma nucleobase modificada ou não modificada, R1 e R2 independentemente são H, halogênio, OR3 ou alquila; e R3 é H, alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar). O termo “UNA” se refere ao ácido nucleico acíclico desbloqueado, em que qualquer uma das ligações do açúcar foi removida, formando um resíduo de “açúcar” desbloqueado. Em um exemplo, UNA também abrange monômeros com ligações entre C1'- C4' sendo removidas (isto é, a ligação covalente carbono- oxigênio-carbono entre os carbonos C1' e C4'). Em outro exemplo, a ligação C2'-C3' (ou seja, a ligação carbono-carbono covalente entre os carbonos C2' e C3') do açúcar é removida (ver Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); e Fluiter et. al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009), que são aqui incorporados por referência na sua totalidade). O derivado acíclico oferece maior flexibilidade da cadeia principal sem afetar os emparelhamentos Watson-Crick. O nucleotídeo acíclico pode ser ligado por meio de ligação 2'-
5' ou 3'-5'.
[572] O termo ‘GNA’ se refere a ácido glicolnucleico que é um polímero semelhante a DNA ou RNA, mas diferindo na composição de sua “cadeia principal” por ser composta por unidades repetitivas de glicerol ligadas por ligações fosfodiéster: .
[573] A modificação de termodesestabilização do duplex pode ser incompatibilidades (ou seja, par de bases não complementares) entre o nucleotídeo termicamente desestabilizador e o nucleotídeo oposto no filamento oposto dentro do duplex de dsRNA. A incompatibilidade exemplificativa de bases inclui G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T ou uma combinação dos mesmos. Outras incompatibilidades de emparelhamentos de base conhecidas na técnica também são passíveis de aplicação à presente invenção. Pode ocorrer uma incompatibilidade entre nucleotídeos que são nucleotídeos ou nucleotídeos modificados de ocorrência natural, ou seja, a incompatibilidade de emparelhamento de bases pode ocorrer entre as nucleobases dos respectivos nucleotídeos independentemente da modificação nos açúcares ribose dos nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a molécula de dsRNA contém pelo menos uma nucleobase no emparelhamento de incompatibilidade que é uma 2’-desoxi nucleobase; por exemplo, a 2'-desoxi nucleobase está no filamento sensor.
[574] Em algumas modalidades, a modificação de termodesestabilização do duplex na região de semente do filamento antissenso inclui nucleotídeos com ligação W-C H- prejudicada à base complementar no mRNA-alvo, como: .
[575] Mais exemplos de nucleotídeo abásico, modificações de nucleotídeos acíclicos (incluindo UNA e GNA), e incompatibilidade de modificações foram descritos em detalhes no documento WO 2011/133876, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[576] As modificações de termodesestabilização também podem incluir bases universais com capacidade reduzida ou abolida de formar ligações de hidrogênio com as bases opostas, e fosfato de modificações.
[577] Em algumas modalidades, a modificação de termodesestabilização do duplex inclui nucleotídeos com bases não canônicas como, mas sem limitação a modificações de nucleobase com capacidade prejudicada ou completamente abolida de formar ligações de hidrogênio com bases no filamento oposto. Essas modificações de nucleobases foram avaliadas quanto à desestabilização da região central do duplex de dsRNA como descrito em WO 2010/0011895, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. As modificações de nucleobases exemplificativas são:
[578] Em algumas modalidades, a modificação de termodesestabilização do duplex na região de semente do filamento antissenso inclui um ou mais α-nucleotídeos complementares à base no mRNA-alvo, como:
[579] em que R é H, OH, OCH3, F, NH2, NHMe, NMe2 ou O-alquila.
[580] Fosfato modificados exemplificativos conhecidos por diminuir a termoestabilidade de duplexes de dsRNA em comparação com ligações de fosfodiéster naturais são:
[581] A alquila para o grupo R pode ser um C1-C6 alquila. Alquilas específicas para o grupo R incluem, mas não estão limitadas à metila, etila, propila, isopropila, butila, pentila e hexila.
[582] Como o versado na técnica reconhecerá, em vista do papel funcional das nucleobases é definir a especificidade de um agente de RNAi da revelação, enquanto as modificações das nucleobases podem ser realizadas das várias maneiras como descrito no presente documento, por exemplo, para apresentar modificações desestabilizadoras em um agente de RNAi da revelação, por exemplo, com o propósito de aumentar o efeito no alvo em relação ao efeito fora do alvo, a gama de modificações disponíveis e, em geral, presentes em agentes de RNAi da revelação tende a ser muito maior para modificações não-nucleobases, por exemplo, modificações para grupos de açúcar e/ou cadeias principais de fosfato de polirribonucleotídeos. Tais modificações são descritas com mais detalhes em outras seções da presente revelação e são expressamente contempladas para agentes de RNAi da revelação, quer possuindo nucleobases nativas ou modificadas como descrito acima e/ou em outro lugar aqui.
[583] Além de o filamento antissenso compreender uma modificação de termodesestabilização, o dsRNA também pode compreender uma ou mais modificações de estabilização. Por exemplo, o dsRNA pode compreender pelo menos dois (por exemplo,
dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) modificações de estabilização. Sem limitações, as modificações de estabilização podem estar todas presentes em um filamento. Em algumas modalidades, tanto o sentido quanto o antissensos de filamento compreendem pelo menos duas modificações de estabilização. A modificação de estabilização pode ocorrer em qualquer nucleotídeo do filamento sensor ou filamento antissenso. Por exemplo, a modificação de estabilização pode ocorrer em cada nucleotídeo no filamento sensor e/ou filamento antissenso; cada modificação de estabilização pode ocorrer em um padrão alternado no filamento sensor ou filamento antissenso; ou o filamento sensor ou filamento antissenso compreende tanto a modificação de estabilização em um padrão alternado. O padrão alternado das modificações de estabilização no filamento sensor pode ser o mesmo ou diferente do filamento antissenso, e o padrão alternado das modificações de estabilização no filamento sensor pode ter uma mudança em relação ao padrão alternado das modificações de estabilização no filamento antissenso.
[584] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) modificações de estabilização. Sem limitações, uma modificação de estabilização no filamento antissenso pode estar presente em quaisquer posições. Em algumas formas, os compostos antissenso de estabilização nas posições 2, 6, 8, 9, 14 e 16 a partir da extremidade 5’. Em algumas outras modalidades, o antissenso compreende modificações de estabilização nas posições 2, 6, 14 e 16 a partir da extremidade 5’. Em ainda algumas outras modalidades, o antissenso compreende modificações de estabilização nas posições 2, 14 e 16 a partir da extremidade 5’.
[585] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos uma modificação de estabilização adjacente à modificação de desestabilização. Por exemplo, a modificação de estabilização pode ser o nucleotídeo na extremidade 5' ou na extremidade 3' da modificação de desestabilização, ou seja, na posição -1 ou +1 da posição de modificação de desestabilização. Em algumas formas, o filamento antissenso compreende uma modificação de estabilização em cada extremidade 5' e a extremidade 3' da modificação de desestabilização, ou seja, posições -1 e +1 da posição da modificação de desestabilização.
[586] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos duas modificações de estabilização na extremidade 3' da modificação de desestabilização, ou seja, nas posições +1 e +2 a partir da posição de modificação de desestabilização.
[587] Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) modificações de estabilização. Sem limitações, uma modificação de estabilização no filamento sensor pode estar presente em quaisquer posições. Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende a estabilização nas posições 7, 10 e 11 a partir da extremidade 5’. Em algumas outras modalidades, o filamento sensor compreende modificações de estabilização nas posições 7, 9, 10 e 11 a partir da extremidade 5’. Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende modificações de estabilização nas posições opostas ou complementares às posições 11, 12 e 15 do filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso. Em algumas outras modalidades, o filamento sensor compreende modificações de estabilização nas posições opostas ou complementares às posições 11, 12, 13 e 15 do filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5' do filamento antissenso. Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende um bloco de dois, três ou quatro modificações de estabilização.
[588] Em algumas modalidades, o filamento sensor não compreende uma modificação de estabilização na posição oposta ou complementar à modificação de termodesestabilização do duplex no filamento antissenso.
[589] Exemplos de modificações térmicas de estabilização incluem, mas não estão limitados a modificações 2'-flúor. Outras modificações de estabilização térmica incluem, mas não estão limitadas a LNA.
[590] Em algumas modalidades, o dsRNA da revelação compreende pelo menos quatro (por exemplo, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) 2’-flúor nucleotídeos. Sem limitações, os 2’-flúor nucleotídeos podem estar todos presentes em um filamento. Em algumas modalidades, tanto o filamento sensor quanto o filamento antissenso compreendem pelo menos dois nucleotídeos 2’-flúor. A modificação 2'-flúor pode ocorrer em qualquer nucleotídeo do filamento sensor ou filamento antissenso. Por exemplo, a modificação 2'-flúor pode ocorrer em cada nucleotídeo no filamento sensor e/ou filamento antissenso; cada modificação 2'-flúor pode ocorrer em um padrão alternado no filamento sensor ou filamento antissenso; ou o filamento sensor ou filamento antissenso compreende modificações 2'-flúor em um padrão alternado. O padrão alternado das modificações 2'-flúor no filamento sensor pode ser o mesmo ou diferente do filamento antissenso, e o padrão alternado das modificações 2'-flúor no filamento sensor pode ter um deslocamento em relação ao padrão alternado das modificações 2'-flúor no filamento antissenso.
[591] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) nucleotídeos de 2’-flúor. Sem limitações, uma modificação 2'- flúor no filamento antissenso pode estar presente em quaisquer posições. Em algumas formas, o antissenso compreende 2’-flúor nucleotídeos nas posições 2, 6, 8, 9, 14 e 16 a partir da extremidade 5’. Em algumas outras modalidades, o antissenso compreende 2’-flúor nucleotídeos nas posições 2, 6, 14 e 16 a partir da extremidade 5’. Em ainda algumas outras modalidades, o antissenso compreende nucleotídeos 2’-flúor nas posições 2, 14 e 16 a partir da extremidade 5’.
[592] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos um nucleotídeo 2’-flúor adjacente à modificação de desestabilização. Por exemplo, o nucleotídeo 2’-flúor pode ser o nucleotídeo na extremidade 5’ ou na extremidade 3’ da modificação de desestabilização, ou seja, na posição -1 ou +1 da posição da modificação de desestabilização. Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende um nucleotídeo 2’-flúor em cada extremidade 5 ’e a extremidade 3’ da modificação de desestabilização, ou seja, posições -1 e +1 a partir da posição da modificação de desestabilização.
[593] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende pelo menos dois nucleotídeos 2’-flúor na extremidade 3’ da modificação de desestabilização, ou seja, nas posições +1 e +2 a partir da posição de modificação de desestabilização.
[594] Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende pelo menos dois (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) nucleotídeos 2’- flúor. Sem limitações, uma modificação 2'-flúor no filamento sensor pode estar presente em quaisquer posições. Em algumas modalidades, o antissenso compreende nucleotídeos 2’-flúor nas posições 7, 10 e 11 a partir da extremidade 5’. Em algumas outras modalidades, o filamento sensor compreende nucleotídeos 2’-flúor nas posições 7, 9, 10 e 11 a partir da extremidade 5’. Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende nucleotídeos 2'-flúor nas posições opostas ou complementares às posições 11, 12 e 15 do filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5' do filamento antissenso. Em algumas outras modalidades, o filamento sensor compreende nucleotídeos 2'-flúor nas posições opostas ou complementares às posições 11, 12, 13 e 15 do filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5 'do filamento antissenso. Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende um bloco de dois, três ou quatro 2’-flúor nucleotídeos.
[595] Em algumas modalidades, o filamento sensor não compreende um nucleotídeo 2’-flúor em posição oposta ou complementar à modificação de termodesestabilização do duplex no filamento antissenso.
[596] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende um filamento sensor de 21 nucleotídeos (nt) e os antissenso de 23 nucleotídeos (nt), em que o filamento antissenso contém pelo menos um nucleotídeo termicamente desestabilizador, em que o pelo menos um nucleotídeo termicamente desestabilizador ocorre na região de semente do filamento antissenso (ou seja, na posição 2-9 da extremidade 5’ do filamento antissenso), em que uma extremidade do dsRNA é cega, enquanto a outra extremidade compreende uma projeção de 2 nt, e em que o dsRNA opcionalmente ainda tem pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis ou todos os sete) das seguintes características: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2'-flúor; (ii) o antissenso compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (iii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iv) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2'-flúor; (v) o filamento sensor compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (vi) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; e (vii) o dsRNA compreende uma extremidade cega na extremidade 5' do filamento antissenso. De preferência, a projeção de 2 nt está na extremidade 3' do antissenso.
[597] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação que compreende filamentos sensor e antissenso, em que: o filamento sensor é 25 a 30 resíduos de nucleotídeo em comprimento, em que começando a partir do nucleotídeo 5' terminal (posição 1), posições 1 a 23 do dito filamento sensor compreendem pelo menos 8 ribonucleotídeos; filamento antissenso é 36 a 66 resíduos de nucleotídeo em comprimento e, começando a partir do nucleotídeo 3' terminal, pelo menos 8 ribonucleotídeos nas posições emparelhadas com as posições 1 a 23 do filamento sensor para formar um duplex; em que pelo menos o nucleotídeo 3' terminal do filamento antissenso é não emparelhado com o filamento sensor, e até 6 nucleotídeos 3' terminal consecutivos são não emparelhados com o filamento sensor, formando assim uma única projeção de filamento único 3' de 1 a 6 nucleotídeos; em que a terminação 5' do filamento antissenso compreende de 10 a 30 nucleotídeos consecutivos que são não emparelhados com o filamento sensor, formando assim uma projeção de filamento único 5' de 10 a 30 nucleotídeos; em que pelo menos os nucleotídeos de filamento sensor 5' terminal e 3' terminal são emparelhados em base com nucleotídeos de filamento antissenso quando filamentos sensor e antissenso são alinhados para a complementaridade máxima, formando assim uma região substancialmente duplexada entre filamentos sensor e antissenso; e o filamento antissenso é suficientemente complementar a um RNA-alvo ao longo de pelo menos 19 ribonucleotídeos de filamento antissenso comprimento para reduzir a expressão do gene alvo quando o referido ácido nucleico de duplo filamento é introduzido em uma célula de mamífero; e em que o filamento antissenso contém pelo menos um nucleotídeo termicamente desestabilizador, onde pelo menos um nucleotídeo termicamente desestabilizador está na região da semente do filamento antissenso (ou seja, na posição 2 a 9 da extremidade 5’ do filamento antissenso). Por exemplo, o nucleotídeo termicamente desestabilizador ocorre entre posições opostas ou complementares às posições 14 a 17 da extremidade 5' do filamento sensor, e em que o dsRNA opcionalmente tem ainda pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis ou todas as sete) das seguintes características: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2’-flúor; (ii) o antissenso compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (iii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iv) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2’-flúor; (v) o filamento sensor compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; e (vi) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; e (vii) o dsRNA compreende uma região de duplex de 12 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento.
[598] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende filamentos sensor e antissenso, em que a dita molécula de dsRNA compreende um filamento sensor com um comprimento que é pelo menos 25 e no máximo 29 nucleotídeos e um filamento antissenso com um comprimento que é no máximo 30 nucleotídeos com o filamento sensor compreende um nucleotídeo modificado que é suscetível à degradação enzimática na posição 11 a partir da extremidade 5’, em que a extremidade 3’ do dito filamento sensor e a extremidade 5’ do dito filamento antissenso formam uma extremidade cega e o dito filamento antissenso é 1 a 4 nucleotídeos mais longo e, sua extremidade 3’ do que o filamento sensor, em que a região de duplex que é pelo menos 25 nucleotídeos em comprimento, e o dito filamento antissenso é suficientemente complementar a um mRNA-alvo ao longo de pelo menos 19 nt do dito comprimento do filamento antissenso para reduzir a expressão do gene-alvo quando a dita molécula de dsRNA é introduzida em uma célula de mamífero, e em que a clivagem de dicer do dito dsRNA resulta preferencialmente em um siRNA que compreende a dita extremidade 3’ do dito filamento antissenso, reduzindo assim a expressão do gene-alvo no mamífero, em que o filamento antissenso contém pelo menos um nucleotídeo de termodesestabilização, em que o pelo menos um nucleotídeo de termodesestabilização está na região de semente do filamento antissenso (isto é, na posição 2 a 9 da extremidade 5’ do filamento antissenso), e em que o dsRNA opcionalmente tem ainda pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou todas as sete) das características a seguir: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2’-flúor; (ii) o antissenso compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (iii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iv) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2’-flúor; (v) o filamento sensor compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; e (vi) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; e (vii) o dsRNA tem uma região de duplex de 12 a 29 pares de nucleotídeo em comprimento.
[599] Em algumas modalidades, todo nucleotídeo no filamento sensor e filamento antissenso da molécula de dsRNA pode ser modificado. Cada nucleotídeo pode ser modificado com a mesma ou diferente modificação que pode incluir uma ou mais alterações de um ou de ambos os fosfato-oxigênios não ligantes e/ou de um ou mais dos fosfato-oxigênios ligantes; alteração de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da 2′ hidroxila no açúcar ribose; substituição grossista da porção fosfato por ligantes “defosfo”; modificação ou substituição de uma base natural; e substituição ou modificação da cadeia principal de ribose-fosfato.
[600] Como os ácidos nucleicos são polímeros de subunidades, muitas das modificações ocorrem em uma posição que se repete dentro de um ácido nucleico, por exemplo, uma modificação de uma base, ou uma porção fosfato, ou um O não ligante de um meio fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições sujeitas no ácido nucleico, mas em muitos casos não. A título de exemplo, uma modificação só pode ocorrer em uma posição terminal 3' ou 5', só pode ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5, ou 10 nucleotídeos de um filamento. Uma modificação pode ocorrer em um duplo filamento da região, um único filamento da região, ou em ambos. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de duplo filamento de um RNA ou pode ocorrer apenas em uma região de filamento único de um RNA. Por exemplo, uma modificação de fosforotioato em uma posição não vinculante só pode ocorrer em um ou ambos os terminais, só pode ocorrer em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de um filamento, ou podem ocorrer em regiões de filamento duplo e único filamento, particularmente em terminais. A extremidade 5' ou extremidades podem ser fosforiladas.
[601] Pode ser possível, por exemplo, aumentar a estabilidade, incluir bases particulares em projeções, ou incluir nucleotídeos modificados ou substitutos de nucleotídeo, em projeções de filamento único, por exemplo, na projeção 5' ou 3', ou em ambas. Por exemplo, pode ser desejável incluir nucleotídeos de purinas nas projeções. Em algumas modalidades, todas as bases em uma projeção de 3' ou 5' podem ser modificadas, por exemplo, com uma modificação aqui descrita. As modificações podem incluir, por exemplo, o uso de modificações na posição 2' do açúcar ribose com modificações que são conhecidas na técnica, por exemplo, o uso de desoxirribonucleotídeos, 2'-desoxi-2'-flúor (2'- F) ou 2'-O- metila modificado em vez do açúcar ribose da nucleobase, e modificações no grupo fosfato, por exemplo, modificações de fosforotioato. As projeções não precisam ser homólogas à sequência-alvo.
[602] Em algumas modalidades, cada resíduo do filamento sensor e filamento antissenso é independentemente modificado com LNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietila, 2'-O-metila, 2'-O-alila, 2'-C-alila, 2'-desoxi ou 2'-flúor. Os filamentos podem conter mais de uma modificação. Em algumas modalidades, cada resíduo do filamento sensor e do filamento antissenso é independentemente modificado com 2'-O-metila ou 2'-flúor. Deve ser entendido que essas modificações são adicionais a pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex presente no filamento antissenso.
[603] Pelo menos duas modificações diferentes estão tipicamente presentes no filamento sensor e filamento antissenso. Essas duas modificações podem ser modificações 2’- desoxi, 2’-O-metila ou 2’-flúor, nucleotídeos acíclicos ou outros. Em algumas modalidades, o filamento sensor e filamento antissenso compreendem, cada um, dois nucleotídeos diferentemente modificados selecionados de 2’-O-metila ou 2’- desóxi. Em algumas modalidades, cada resíduo do filamento sensor e filamento antissenso é independentemente modificado com nucleotídeo 2'-O-metila, nucleotídeo 2'-desóxi, nucleotídeo 2´-desoxi-2'-flúor, nucleotídeo 2'-ON- metilacetamido (2'-O-NMA), um nucleotídeo 2'-O- dimetilaminoetoxietila (2'-O-DMAEOE), nucleotídeo 2'-O- aminopropila (2'-O-AP) ou nucleotídeo 2'-ara-F. Novamente, deve-se entender que essas modificações são adicionais a pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex presente no filamento antissenso.
[604] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação modificações de um padrão alternativo, particular nas regiões B1, B2, B3, B1’, B2’, B3’, B4’. O termo “motivo alternado” ou “padrão alternativo” como usado no presente documento refere-se a um motivo tendo uma ou mais modificações, cada modificação ocorrendo em nucleotídeos alternados de um filamento. O nucleotídeo alternado pode referir-se a um a cada três nucleotídeos ou a um a cada três nucleotídeos, ou um padrão semelhante. Por exemplo, se A, B e C cada um representa um tipo de modificação ao nucleotídeo, o motivo alternado pode ser “ABABABABABAB…,” “AABBAABBAABB…,” “AABAABAABAAB…,” “AAABAAABAAAB…,” “AAABBBAAABBB…,” ou “ABCABCABCABC…,” etc.
[605] Os tipos de modificações contidos no motivo alternado podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, se A, B, C, D representam, cada um, um tipo de modificação no nucleotídeo, o padrão alternado, ou seja, modificações em todos os outros nucleotídeos, pode ser o mesmo, mas cada um dentre o filamento sensor ou filamento antissenso pode ser selecionado a partir de várias possibilidades de modificações dentro do motivo alternado como “ABABAB…”, “ACACAC…” “BDBDBD…” ou “CDCDCD…,” etc.
[606] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende o padrão de modificação para o motivo alternado no filamento sensor em relação ao padrão de modificação para o motivo alternado no filamento antissenso é deslocado. O deslocamento pode ser tal que o grupo modificado de nucleotídeos do filamento sensor corresponda a um grupo de nucleotídeos do filamento antissenso modificado de maneira diferente e vice-versa. Por exemplo, o filamento sensor quando emparelhado com o filamento antissenso no duplex de dsRNA, o motivo alternado no filamento sensor pode começar com “ABABAB” de 5'-3' do filamento e o motivo alternado no filamento antissenso pode começar com “BABABA” de 3'-5' do filamento dentro da região de duplex. Como outro exemplo, o motivo alternado no filamento sensor pode começar com “AABBAABB” de 5'-3' do filamento e o motivo alternado no filamento antissenso pode começar com “BBAABBAA” de 3'-5' do filamento dentro da região de duplex, de modo que haja uma mudança completa ou parcial dos padrões de modificação entre o filamento sensor e o filamento antissenso.
[607] A molécula de dsRNA da revelação pode compreender ainda pelo menos um ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato. A modificação de ligante internucleotídico de fosforotioato ou de metilfosfonato pode ocorrer em qualquer nucleotídeo do filamento sensor ou filamento antissenso ou ambos em qualquer posição do filamento. Por exemplo, a modificação da ligação internucleotídeo pode ocorrer em cada nucleotídeo no filamento sensor e/ou filamento antissenso; cada modificação de ligação internucleotídica pode ocorrer em um padrão alternado no filamento sensor ou filamento antissenso; ou o filamento sensor ou filamento antissenso compreende ambas as modificações de ligação internucleotídicas em um padrão alternado. O padrão alternado de modificação de ligação internucleotídeo no filamento sensor pode ser o mesmo ou diferente do filamento antissenso, e o padrão alternado de modificação de ligação internucleotídeo no filamento sensor pode ter uma mudança em relação ao padrão alternado de ligação internucleotídeo no filamento antissenso.
[608] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA compreende a modificação de ligante internucleotídico de fosforotioato ou de metilfosfonato na região de projeção. Por exemplo, a região de projeção compreende dois nucleotídeos possuindo um ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato entre os dois nucleotídeos. As modificações de ligação de internucleotídeos também podem ser feitas para ligar os nucleotídeos de projeção com os nucleotídeos pareados terminais dentro da região de duplex. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4 ou todos os nucleotídeos de projeção podem ser ligados através de ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato, e opcionalmente, pode haver ligações de internucleotídico de fosforotioato ou de metilfosfonato adicionais ligando o nucleotídeo de projeção com um nucleotídeo pareado que fica ao lado do nucleotídeo de projeção. Por exemplo, pode haver pelo menos duas ligações internucleotídicas de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais, em que dois dos três nucleotídeos são nucleotídeos de projeção, e o terceiro é um nucleotídeo par próximo ao nucleotídeo de projeção. De preferência, esses três nucleotídeos terminais podem estar na extremidade 3’ do filamento antissenso.
[609] Em algumas modalidades, o filamento sensor da molécula de dsRNA compreende 1 a 10 blocos de dois a dez ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonatos separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonatos é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento sensor é emparelhado com um filamento antissenso compreendendo qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e de fosfato ou um filamento antissenso compreendendo uma ligação fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[610] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de dois ligantes internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonatos separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonatos é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é emparelhado com um filamento sensor compreendendo qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e fosfato ou um filamento antissenso compreendendo ligações de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[611] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de três ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15 ou 16 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é pareado com um filamento sensor compreendendo qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e fosfato ou um filamento antissenso compreendendo ligação fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[612] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de quatro ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é pareado com um filamento sensor que compreende qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e fosfato ou um filamento antissenso compreendendo ligação de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[613] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de cinco ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é emparelhado com um filamento sensor que compreende qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e de fosfato ou um filamento antissenso que compreende ligação de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[614] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de seis ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é emparelhado com um filamento sensor que compreende qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e de fosfato ou um filamento antissenso que compreende ligação de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[615] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de sete ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é emparelhado com um filamento sensor que compreende qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e de fosfato ou um filamento antissenso que compreende ligação de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[616] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de oito ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é emparelhado com um filamento sensor que compreende qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e de fosfato ou um filamento antissenso que compreende ligação de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[617] Em algumas modalidades, o filamento antissenso da molécula de dsRNA compreende dois blocos de nove ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato separados por 1, 2, 3 ou 4 ligações de internucleotídeo de fosfato, em que um dos ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato é colocado em qualquer posição na sequência de oligonucleotídeos e o dito filamento antissenso é emparelhado com um filamento sensor que compreende qualquer combinação de ligações de internucleotídeo de fosforotioato, metilfosfonato e de fosfato ou um filamento antissenso que compreende ligação de fosforotioato ou metilfosfonato ou fosfato.
[618] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma ou mais modificações de ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato dentro de 1 a 10 da posiçãoterminal (ou das posições terminais) do filamento sensor e/ou antissenso. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos podem ser ligados através do ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato em uma extremidade ou em ambas as extremidades do filamento senso e/ou antissenso.
[619] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma ou mais modificações de ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato dentro de 1 a 10 da região interna do duplex de cada um dos filamentos sensor e/ou antissenso. Por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos podem ser ligados através de ligação de internucleotídeo de fosforotioato ou metilfosfonato na posição 8 a 16 da região de duplex contando a partir da extremidade 5' do filamento sensor; a molécula de dsRNA pode opcionalmente compreender ainda uma ou mais modificações de ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato dentro de 1 a 10 das posições terminais).
[620] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma a cinco modificações de ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato dentro da posição 1 a 5 e uma a cinco modificações de ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma a cinco modificações de ligantes internucleotídicos de fosforotioato ou metilfosfonato nas posições 1 e 2 e uma a cinco dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[621] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma modificação de ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligante internucleotídico de fosforotioato ou metilfosfonato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[622] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[623] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[624] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[625] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[626] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[627] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 (contando a partir da extremidade 5’) do filamento sensor, e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[628] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 (contando a partir da extremidade 5’) do filamento sensor, e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade
5’).
[629] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[630] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[631] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 1 a 5 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro da posição 18 a 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato dentro das posições 18 a 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[632] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2, e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 20 e 21 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e uma na posição 21 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[633] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 1, e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 21 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 20 e 21 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[634] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2, e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 21 e 22 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 21 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[635] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 1, e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 21 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 21 e 22 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[636] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2, e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 22 e 23 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 21 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[637] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende ainda uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 1, e uma modificação de ligação de internucleotídeo de fosforotioato na posição 21 do filamento sensor (contando a partir da extremidade 5’), e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 1 e 2 e duas modificações de ligação de internucleotídeo de fosforotioato nas posições 23 e 23 do filamento antissenso (contando a partir da extremidade 5’).
[638] Em algumas modalidades, composto da revelação compreende um padrão de centros quirais de cadeia principal.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 5 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 6 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 7 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 8 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 9 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 10 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 11 ligação internucleotídica na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 12 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 13 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 14 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 15 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 16 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 17 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 18 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 19 ligações internucleotídicas na configuração Sp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 8 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 7 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 6 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 5 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 4 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 3 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 2 ligações internucleotídicas na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 1 ligação internucleotídica na configuração Rp.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 8 ligações internucleotídicas que não são quirais (como um exemplo não limitador, um fosfodiéster). Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 7 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 6 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 5 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 4 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 3 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 2 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende não mais do que 1 ligação internucleotídica que não é quiral.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 10 ligações internucleotídicas na configuração Sp, e não mais do que 8 ligações internucleotídicas que não são quirais.
Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 11 ligações internucleotídicas na configuração Sp, e não mais do que 7 ligações internucleotídicas que não são quirais. Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 12 ligações internucleotídicas na configuração Sp, e não mais do que 6 ligações internucleotídicas que não são quirais. Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 13 ligações internucleotídicas na configuração Sp, e não mais do que 6 ligações internucleotídicas que não são quirais. Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 14 ligações internucleotídicas na configuração Sp, e não mais do que 5 ligações internucleotídicas que não são quirais. Em algumas modalidades, um padrão comum de centros quirais de cadeia principal compreende pelo menos 15 ligações internucleotídicas na configuração Sp, e não mais do que 4 ligações internucleotídicas que não são quirais. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas na configuração Sp são opcionalmente contíguas ou não contíguas. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas na configuração Rp são opcionalmente contíguas ou não contíguas. Em algumas modalidades, as ligações internucleotídicas que não são quirais são opcionalmente contíguas ou não contíguas.
[639] Em algumas modalidades, o composto da revelação compreende um bloco que é um bloco estereoquímico. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Rp em que cada ligação internucleotídica do bloco é Rp. Em algumas modalidades, um bloco 5’ é um bloco Rp. Em algumas modalidades, um bloco 3’ é um bloco Rp. Em algumas modalidades, um bloco é um bloco Sp em que cada ligação internucleotídica do bloco é Sp. Em algumas modalidades, um bloco 5’ é um bloco Sp. Em algumas modalidades, um bloco 3’ é um bloco Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem blocos Rp e Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos Rp, mas não blocos Sp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos Sp, mas não blocos Rp. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos fornecidos compreendem um ou mais blocos PO, em que cada ligação internucleotídica é uma ligação de fosfato natural.
[640] Em algumas modalidades, o composto da revelação compreende um bloco 5’ que é um bloco Sp, em que cada grupamento de açúcar compreende uma modificação 2’-F. Em algumas modalidades, um bloco 5’ é um bloco Sp, em que cada ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica modificada e cada grupamento de açúcar compreende uma modificação 2’-F. Em algumas modalidades, um bloco 5’ é um bloco Sp, em que cada ligação internucleotídica é uma ligação de fosforotioato e cada grupamento de açúcar compreende uma modificação 2’-F. Em algumas modalidades, um bloco 5’ compreende 4 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 5’ compreende 5 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 5’ compreende 6 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 5’ compreende 7 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 3’ é um bloco Sp, em que cada grupamento de açúcar compreende uma modificação 2’-F. Em algumas modalidades, um bloco 3’ é um bloco Sp, em que cada ligação internucleotídica é uma ligação internucleotídica modificada e cada grupamento de açúcar compreende uma modificação 2’-F. Em algumas modalidades, um bloco 3’ é um bloco Sp, em que cada ligação internucleotídica é uma ligação de fosforotioato e cada grupamento de açúcar compreende uma modificação 2’-F. Em algumas modalidades, um bloco 3’ compreende 4 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 3’ compreende 5 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 3’ compreende 6 ou mais unidades nucleosídicas. Em algumas modalidades, um bloco 3’ compreende 7 ou mais unidades nucleosídicas.
[641] Em algumas modalidades, o composto da revelação compreende um tipo de nucleosídeo em uma região ou um oligonucleotídeo é seguido por um tipo específico de ligação internucleotídica, por exemplo, ligação de fosfato natural, ligação internucleotídica modificada, ligação internucleotídica Rp quiral, ligação internucleotídica Sp quiral, etc. Em algumas modalidades, A é seguido por Sp. Em algumas modalidades, A é seguido por Rp. Em algumas modalidades, A é seguido por ligação de fosfato natural (PO). Em algumas modalidades, U é seguido por Sp. Em algumas modalidades, U é seguido por Rp. Em algumas modalidades, U é seguido por ligação de fosfato natural (PO). Em algumas modalidades, C é seguido por Sp. Em algumas modalidades, C é seguido por Rp. Em algumas modalidades, C é seguido por ligação de fosfato natural (PO). Em algumas modalidades, G é seguido por Sp. Em algumas modalidades, G é seguido por Rp. Em algumas modalidades, G é seguido por ligação de fosfato natural (PO). Em algumas modalidades, C e U são seguidos por Sp. Em algumas modalidades, C e U são seguidos por Rp. Em algumas modalidades, C e U são seguidos por ligação de fosfato natural (PO). Em algumas modalidades, A e G são seguidos por Sp. Em algumas modalidades, A e G são seguidos por Rp.
[642] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende ligações de internucleotídeo de fosforotioato entre posições 21 e 22 de nucleotídeo, e entre posições 22 e 23 de nucleotídeo, em que o filamento antissenso contém pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex localizado na região de semente do filamento antissenso (ou seja, na posição 2 a 9 da extremidade 5’ do filamento antissenso), e em que o dsRNA opcionalmente tem ainda pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou todas as oito) das seguintes características: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2’-flúor; (ii) o antissenso compreende 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (iii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iv) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2’-flúor; (v) o filamento sensor compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (vi) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; (vii) o dsRNA compreende uma região de duplex de 12 a 40 pares de nucleotídeo em comprimento; e (viii) o dsRNA tem uma ponta cega na extremidade 5’ do filamento antissenso.
[643] Em algumas modalidades, o filamento antissenso compreende ligações de internucleotídeo de fosforotioato entre posições 1 e 2 de nucleotídeo, entre posições 2 e 3 de nucleotídeo, entre posições 21 e 22 de nucleotídeo e entre posições 22 e 23 de nucleotídeo, em que o filamento antissenso contém pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex localizada na região de semente do filamento antissenso (ou seja, na posição 2 a 9 da extremidade 5’ do filamento antissenso), e em que o dsRNA opcionalmente tem ainda pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou todas as oito) das seguintes características: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2’-flúor; (ii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iii) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2’-flúor; (iv) o filamento sensor compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (v) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; (vi) o dsRNA compreende uma região de duplex de 12 a 40 pares de nucleotídeo em comprimento; (vii) o dsRNA compreende uma região de duplex de 12 a 40 pares de nucleotídeo em comprimento; e (viii) o dsRNA tem uma ponta cega na extremidade 5’ do filamento antissenso.
[644] Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende ligações de internucleotídeo de fosforotioato entre posições 1 e 2 de nucleotídeo, e entre posições 2 e 3 de nucleotídeo, em que o filamento antissenso contém pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex localizada na região de semente do filamento antissenso (ou seja, na posição 2 a 9 da extremidade 5’ do filamento antissenso), e em que o dsRNA opcionalmente tem ainda pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete ou todas as oito) das seguintes características: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2’-flúor; (ii) o antissenso compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (iii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iv) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2’-flúor; (v) o filamento sensor compreende 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (vi) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; (vii) o dsRNA compreende uma região de duplex de 12 a 40 pares de nucleotídeo em comprimento; e (viii) o dsRNA tem uma ponta cega na extremidade 5’ do filamento antissenso.
[645] Em algumas modalidades, o filamento sensor compreende ligações de internucleotídeo de fosforotioato entre posições 1 e 2 de nucleotídeo, e entre posições 2 e 3 de nucleotídeo, o filamento antissenso compreende ligações de internucleotídeo de fosforotioato entre posições 1 e 2 de nucleotídeo, entre posições 2 e 3 de nucleotídeo, entre posições 21 e 22 de nucleotídeo, e entre posições 22 e 23 de nucleotídeo, em que o filamento antissenso contém pelo menos uma modificação de termodesestabilização do duplex localizada na região de semente do filamento antissenso (ou seja, na posição 2 a 9 da extremidade 5’ do filamento antissenso), e em que o dsRNA opcionalmente tem ainda pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou todas as sete) das seguintes características: (i) o antissenso compreende 2, 3, 4, 5 ou 6 modificações 2’-flúor; (ii) o filamento sensor é conjugado com um ligante; (iii) o filamento sensor compreende 2, 3, 4 ou 5 modificações 2’-flúor; (iv) o filamento sensor compreende 3, 4 ou 5 ligações de internucleotídeo de fosforotioato; (v) o dsRNA compreende pelo menos quatro modificações 2’-flúor; (vi) o dsRNA compreende uma região de duplex de 12 a 40 pares de nucleotídeo em comprimento; e (vii) o dsRNA tem uma ponta cega na extremidade 5’ do filamento antissenso.
[646] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende incompatibilidade(ou incompatibilidades) com o alvo, dentro do duplex ou combinações dos mesmos. A incompatibilidade pode ocorrer na região de projeção ou na região de duplex. O par de base pode ser classificado na base de sua propensão para promover a dissociação ou fundição (por exemplo, na energia livre de associação ou dissociação de um emparelhamento particular, a abordagem mais simples é examinar os pares em uma base de par individual, através do próximo vizinho ou análise similar pode ser usada). Em termos de promoção da dissociação: A:U é preferencial a G:C; G:U é preferencial em relação a G:C; e I:C é preferencial em relação a G:C (I = inosina). Incompatibilidades, por exemplo, não canônicas ou outras que não os emparelhamentos canônicos (conforme descrito em outro lugar neste documento) são preferenciais aos emparelhamentos canônicos (A:T, A:U, G:C); e emparelhamentos que incluem uma base universal são preferenciais aos emparelhamentos canônicos.
[647] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação compreende pelo menos um dos primeiros 1, 2, 3, 4 ou 5 pares de base dentro das regiões de duplex a partir da extremidade 5' do filamento antissenso pode ser escolhida independentemente do grupo de: A:U, G:U, I:C, e pares incompatíveis, por exemplo, não canônicos ou outros que emparelhamentos ou emparelhamentos canônicos que incluem uma base universal, para promover a dissociação do filamento antissenso na extremidade 5' do duplex.
[648] Em algumas modalidades, o nucleotídeo na posição 1 dentro da região de duplex a partir da extremidade 5’ no filamento antissenso é selecionado a partir do grupo que consiste em A, dA, dU, U, e dT. Alternativamente, pelo menos um do primeiro 1, 2 ou 3 pares de base dentro da região de duplex a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso é um par de base AU. Por exemplo, o primeiro par de base dentro da região de duplex a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso é um par de base AU.
[649] Verificou-se que a introdução de nucleotídeo modificado 4’ e/ou 5' modificado na extremidade 3' de uma ligação fosfodiéster (PO), fosforotioato (PS) e/ou fosforoditioato (PS2) de um dinucleotídeo em qualquer posição de oligonucleotídeo de filamento simples ou duplo pode exercer efeito estérico na ligação internucleotídeo e, portanto, protegendo ou estabilizando-o contra nucleases.
[650] Em algumas modalidades, o nucleosídeo 5’ modificado é introduzido na extremidade 3’ de um dinucleotídeo em qualquer posição de siRNA de filamento único ou duplo filamento. Por exemplo, um nucleosídeo 5’ alquilado pode ser introduzido na extremidade 3’ de um dinucleotídeo em qualquer posição de siRNA de filamento único ou duplo filamento. O grupo alquila na posição 5’ do açúcar de ribose pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Um nucleosídeo exemplificativo 5’ alquilado é nucleosídeo 5’-metila. O 5’- metila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro.
[651] Em algumas modalidades, nucleosídeo 4’ modificado é introduzido na extremidade 3’ de um dinucleotídeo em qualquer posição de siRNA de filamento único ou duplo filamento. Por exemplo, um nucleosídeo 4’ alquilado pode ser introduzido na extremidade 3’ de um dinucleotídeo em qualquer posição de siRNA de filamento único ou duplo filamento. O grupo alquila na posição 4’ do açúcar de ribose pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Um nucleosídeo 4’ alquilado exemplificativo é nucleosídeo 4’-metila. O 4’-metila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Alternativamente, um nucleosídeo 4’-O-alquilado pode ser introduzido na extremidade 3’ de um dinucleotídeo em qualquer posição de siRNA de filamento único ou duplo filamento. O 4’- O-alquila do açúcar de ribose pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Um nucleosídeo 4’-O-alquilado exemplificativo é nucleosídeo 4’-O-metila. O 4’-O-metila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro.
[652] Em algumas modalidades, o nucleosídeo 5’ alquilado é introduzido em qualquer posição no filamento sensor ou filamento antissenso de um dsRNA, e essa modificação mantém ou aprimora a potência do dsRNA. O 5’-alquila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Um nucleosídeo 5’ alquilado exemplificativo é nucleosídeo 5’-metila. O 5’-metila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro.
[653] Em algumas modalidades, o nucleosídeo 4’ alquilado é introduzido em qualquer posição no filamento sensor ou filamento antissenso de um dsRNA, e essa modificação mantém ou aprimora a potência do dsRNA. O 4’-alquila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Um nucleosídeo 4’ alquilado exemplificativo é nucleosídeo 4’-metila. O 4’-metila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro.
[654] Em algumas modalidades, o nucleosídeo 4’- O-alquilado é introduzido em qualquer posição no filamento sensor ou filamento antissenso de um dsRNA, e essa modificação mantém ou aprimora a potência do dsRNA. O 5’-alquila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro. Um nucleosídeo 4’-O-alquilado exemplificativo é nucleosídeo 4’-O-metila. O
4’-O-metila pode ser R ou S isômero racêmico ou quiralmente puro.
[655] Em algumas modalidades, a molécula de dsRNA da revelação pode compreender ligações 2’-5’ (com 2’-H, 2’-OH e 2’-OMe e com P=O ou P=S). Por exemplo, as modificações de ligações 2’-5’ podem ser usadas para promover resistência de nuclease ou para inibir a ligação do filamento sensor ao filamento antissenso, ou podem ser usadas na extremidade 5’ do filamento sensor para impedir a ativação do filamento sensor por RISC.
[656] Em outra modalidade, a molécula de dsRNA da revelação pode compreender açúcares L (por exemplo, L- ribose, L-arabinose com 2’-H, 2’-OH e 2’-OMe). Por exemplo, essas modificações de açúcares L podem ser usadas para promover a resistência de nuclease ou para inibir a ligação do filamento sensor ao filamento antissenso, ou podem ser usadas na extremidade 5’ do filamento sensor para impedir a ativação do filamento sensor por RISC.
[657] [00657] Várias publicações descrevem siRNA multimérico que podem ser usados com o dsRNA da revelação. Tais publicações incluem WO2007/091269, Patente nº US 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 e WO2011/031520 que são aqui incorporados inteiramente.
[658] A molécula de dsRNA que contém conjugações de um ou mais grupamentos de carboidrato a uma molécula de dsRNA pode otimizar uma ou mais propriedades da molécula de dsRNA. Em muitos casos, a porção de carboidrato será ligada a uma subunidade modificada da molécula de dsRNA. Por exemplo, o açúcar de ribose de uma ou mais subunidades de ribonucleotídeo de uma molécula de dsRNA pode ser substituído por outra porção, por exemplo, um carreador não carboidrato (preferencialmente cíclico) ao qual está ligado um ligante carboidrato. Uma subunidade de ribonucleotídeo na qual o açúcar de ribose da subunidade foi assim substituído é referida aqui como uma subunidade de modificação de substituição de ribose (RRMS). Um carreador cíclico pode ser um sistema de anel carbocíclico, isto é, todos os átomos do anel são átomos de carbono, ou um sistema de anel heterocíclico, ou seja, um ou mais átomos do anel podem ser um heteroátomo, por exemplo, nitrogênio, oxigênio, enxofre. O carreador cíclico pode ser um sistema de anéis monocíclicos, ou pode conter dois ou mais anéis, por exemplo, anéis fundidos. O carreador cíclico pode ser um sistema de anéis totalmente saturado, ou pode conter uma ou mais ligações duplas.
[659] O ligante pode ser anexado ao polinucleotídeo por meio de um carreador. Os transportadores incluem (i) pelo menos um “ponto de fixação de cadeia principal”, preferencialmente dois “pontos de fixação e cadeia principal” e (ii) pelo menos um “ponto de fixação de amarração”. Um “ponto de ligação de cadeia principal” como usado no presente documento refere-se a um grupo funcional, por exemplo, um grupo hidroxila, ou geralmente, um vínculo disponível para, e que é adequado para incorporação do carreador na cadeia principal, por exemplo, o fosfato, ou fosfato modificado, por exemplo, enxofre contendo, cadeia principal, de um ácido ribonucleico. Um “ponto de fixação de amarração” (TAP) em algumas modalidades refere-se a um átomo do anel constituinte do carreador cíclico, por exemplo, um átomo de carbono ou um heteroátomo (distinto de um átomo que constitui um ponto de fixação de cadeia principal), que conecta um determinado grupamento. O grupamento pode ser, por exemplo, um carboidrato, por exemplo, monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tetrassacarídeo, oligossacarídeo e polissacarídeo. Opcionalmente, o grupamento selecionado é conectado por uma amarração de intervenção ao carreador cíclico. Desse modo, o carreador cíclico irá muitas vezes incluir um grupo funcional, por exemplo, um grupo amino ou, em geral, fornecer uma ligação, que é adequado para incorporar ou amarrar outra entidade química, por exemplo, um ligante ao anel constituinte.
[660] Em uma modalidade, a molécula de dsRNA da revelação é conjugada a um ligante por meio de um carreador, em que o carreador pode ser grupo cíclico ou grupo acíclico; preferencialmente, o grupo cíclico é selecionado a partir de pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolano, oxazolidinila, isoxazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetra- hidrofurila e decalina; preferencialmente, o grupo acíclico é selecionado a partir de cadeia principal de serinol ou cadeia principal de dietanolamina.
[661] O agente de revelação de RNA de duplo filamento (dsRNA) pode opcionalmente ser conjugado a um ou mais ligantes. O ligante pode ser anexado ao sensor de filamento, filamento antissenso ou ambos os fios, na extremidade 3', extremidade 5' ou em ambas as extremidades. Por exemplo, o ligante pode ser conjugado ao sensor de filamento, em particular, a extremidade 3' do sensor de filamento.
[662] Em algumas modalidades, as moléculas de dsRNA da revelação são 5’ fosforiladas ou incluem um análogo fosforila na terminação iniciadora 5’. As modificações 5'- fosfato incluem aquelas que são compatíveis com o silenciamento de gene mediado por RISC. As modificações adequadas incluem: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-difosfato ((HO)2(O)P-O- P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O- P(HO)(O)-O-5'); tampa de 5'-guanosina (7-metilada ou não metilada) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); tampa de 5'-adenosina (Appp), e qualquer estrutura de tampa de nucleotídeo modificado ou não modificado (N-O-5'-(HO)(O)P-O- (HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); qualquer combinação adicional de monofosfato, difosfato e trifosfato substituído por oxigênio/enxofre, (por exemplo 5'- alfa-tiotrifosfato, 5'-gama-tiotrifosfato, etc.), 5'- fosforamidatos ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'- alquilfosfonatos (R=alquila=metila, etila, isopropila, propila, etc., por exemplo, RP(OH)(O)-O-5'-, 5'- alquenilfosfonatos (isto é, vinila, vinila substituída), (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-alquileterfosfonatos (R=alquileter=metoximetil (MeOCH2-), etoximetila, etc., por exemplo, RP(OH)(O)-O-5'-). Em um exemplo, a modificação pode estar no lugar do filamento antissenso de uma molécula de dsRNA. F. LIGANTES
[663] Em algumas modalidades, o conjugado ou ligante descrito no presente documento pode ser fixado a um oligonucleotídeo de agente de RNAi com vários ligantes que podem ser cliváveis ou não cliváveis.
[664] O termo “ligante” ou “grupo ligante” significa um grupamento orgânico que conecta duas partes de um composto, por exemplo, fixa covalentemente duas partes de um composto.
Os ligantes compreendem tipicamente uma ligação direta ou um átomo como oxigênio ou enxofre, uma unidade como NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH ou uma cadeia de átomos, como, mas sem limitação a, alquila substituída ou não substituída, alquenila substituída ou não substituída, alquinila substituída ou não substituída, arilalquila, arilalquenila, arilalquinila, heteroarilalquila, heteroarilalquenila, heteroarilalquinila, heterociclilalquila, heterociclilalquenila, heterociclilalquinila, arila, heteroarila, heterociclila, cicloalquila, cicloalquenila, alquilrilalquila, alquilarilalquenila, alquilarilalquinila, alquenilarilalquila, alquenilarilalquenila, alquenilarilalquinila, alquinilarilalquila, alquinilarilalquenila, alquinilarilalquinila, alquil- heteroarilalquila, alquil-heteroarilalquenila, alquil- heteroarilalquinila, alquenil-heteroarilalquila, alquenilaheteroarilalquenila, alquenil-heteroarilalquinila, alquinil-heteroarilalquila, alquinil-heteroarilalquenila, alquinil-heteroarilalquinila, alquil-heterociclilalquila, alquil-heterociclilalquenila, alquil-hererociclilalquinila, alquenil-heterociclilalquila, alquenil-heterociclilalquenila, alquenil-heterociclilalquinila, alquinil-heterociclilalquila, alquinil-heterociclilalquenila, alquinil- heterociclilalquinila, alquilarila, alquenilarila, alquinilarila, alquil-heteroarila, alquenil-heteroarila, alquinil-hereroarila, em que um ou mais metilenos podem ser interrompidos ou terminados por O, S, S (O), SO2, N (R8), C (O), arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou heteroarila não substituída, heterocíclico substituído ou não substituído; onde R8 é hidrogênio, acila, alifático ou alifático substituído. Em uma modalidade, o ligante está entre cerca de 1 a 24 átomos, 2 a 24, 3 a 24, 4 a 24, 5 a 24, 6 a 24, 6 a 18, 7 a 18, 8 a 18 átomos, 7 a 17 , 8 a 17, 6 a 16, 7 a 17 ou 8 a 16 átomos.
[665] Um grupo de ligação clivável é aquele que é suficientemente estável fora da célula, mas que ao entrar em uma célula-alvo é clivado para liberar as duas partes que o ligante está segurando juntas. Em uma modalidade preferencial, o grupo de ligação clivável é clivado pelo menos cerca de 10 vezes, 20, vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes ou mais, ou pelo menos cerca de 100 vezes mais rápido em uma célula-alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um sujeito, ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para mimetizar ou representar as condições encontradas no sangue ou no soro).
[666] Os grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou a presença de moléculas degradativas. Geralmente, os agentes de clivagem são mais prevalentes ou encontrados em níveis mais elevados ou atividades dentro das células do que no soro ou sangue. Exemplos de tais agentes degradantes incluem: agentes redóx que são selecionados para substratos particulares ou que não têm especificidade de substrato, incluindo, por exemplo, enzimas oxidativas ou redutoras ou agentes redutores, como mercaptanos, presentes nas células, que podem degradar um grupo de ligação clivável redóx por redução; esterases; endossomos ou agentes que podem criar um ambiente ácido, por exemplo, aqueles que resultam em um pH cinco ou inferior; enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido agindo como um ácido geral, peptidases (que podem ser específicas de substrato), e fosfatases.
[667] Um grupo de ligação clivável, como uma ligação dissulfeto pode ser suscetível ao pH. O pH do soro humano é 7,4, enquanto o pH intracelular médio é ligeiramente inferior, variando de cerca de 7,1 a 7,3. Os endossomos têm um pH mais ácido, na faixa de 5,5 a 6,0, e os lisossomas têm um pH ainda mais ácido em torno de 5,0. Alguns ligantes terão um grupo de ligação clivável que é clivado em um pH preferencial, liberando assim um lipídio catiônico do ligante dentro da célula, ou no compartimento desejado da célula.
[668] Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima particular. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligante pode depender da célula a ser direcionada.
[669] Em geral, a adequação de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente degradativo (ou condição) para clivar o grupo de ligação candidato. Também será desejável testar o grupo de ligação clivável candidato quanto à capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Assim, pode-se determinar a suscetibilidade relativa à clivagem entre uma primeira e segunda condição, em que a primeira é selecionada para ser indicativa de clivagem em uma célula-alvo e a segunda é selecionada para ser indicativa de clivagem em outros tecidos ou fluidos biológicos, por exemplo, sangue ou soro. As avaliações podem ser realizadas em sistemas livres de células, em células, em cultura de células, em cultura de órgãos ou tecidos, ou em animais inteiros. Pode ser útil fazer avaliações iniciais em condições livres de células ou de cultura e para confirmar por avaliações posteriores em animais inteiros. Em modalidades preferidas, os compostos candidatos úteis são clivados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizar condições intracelulares) em comparação com sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizar condições extracelulares). I. GRUPOS DE LIGAÇÃO CLIVÁVEIS REDÓX
[670] Em uma modalidade, um grupo de ligação clivável é um grupo de ligação clivável redóx que é clivado na redução ou oxidação. Um exemplo de grupo de ligação clivável redutivamente é um grupo de ligação dissulfeto (-S-S-). Para determinar se um candidato, grupo de ligação clivável é um “redutivamente grupo de ligação clivável” ou, por exemplo, é adequado para uso com um determinado grupo de iRNA e um determinado agente de direcionamento, pode-se recorrer aos métodos descritos neste documento. Por exemplo, um candidato pode ser avaliado por incubação com ditiotreitol (DTT), ou outro agente redutor utilizando reagentes conhecidos na técnica, que mimetizam a taxa de clivagem que seria observada em uma célula, por exemplo, uma célula-alvo. Os candidatos também podem ser avaliados em condições selecionadas para simular as condições do sangue ou do soro. Em outras modalidades, os compostos candidatos são clivados em, no máximo, cerca de 10% no sangue. Em outras modalidades, os compostos candidatos úteis são degradados pelo menos cerca de 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou cerca de 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizar condições intracelulares) em comparação com o sangue (ou sob condições in vitro selecionadas para mimetizar condições extracelulares). A taxa de clivagem de compostos candidatos pode ser determinada usando ensaios de cinética enzimática padrão sob condições escolhidas para imitar o meio intracelular e em comparação com as condições escolhidas para imitar o meio extracelular. II. GRUPOS DE LIGAÇÃO CLIVÁVEIS À BASE DE FOSFATO
[671] Em outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável baseado em fosfato. Um grupo de ligação clivável à base de fosfato é clivado por agentes que degradam ou hidrolisam o grupo fosfato. Um exemplo de um agente que cliva os grupos fosfato nas células são as enzimas, como as fosfatases nas células. Exemplos de grupos de ligação baseados em fosfato são -OP(O)(ORk) -O-, -OP(S)(ORk) -O-, -OP(S)(SRk)-O-, -SP(O)(ORk)-O-, -OP(O)(ORk)-S-, - SP(O)(ORk)-S-, -OP(S)(ORk)-S-, -SP(S)(ORk) -O-, -OP(O)(Rk)-O- , -OP(S)(Rk)-O-, -SP(O)(Rk)-O-, -SP(S)(Rk)-O-, -SP(O)(Rk)-S-, -OP(S)(Rk)-S-. As modalidades preferenciais são -OP(O)(OH)-O- , -OP(S)(OH)-O-, -OP(S)(SH)-O-, -SP(O)(OH)-O- , -OP(O)(OH)-S- , -SP(O)(OH)-S-, -OP(S)(OH)-S-, -SP(S)(OH)-O-, -OP(O)(H)-O-, -OP(S)(H)-O-, -SP(O)(H)-O-, -SP(S)(H)-O-, -SP(O)(H)-S-, -OP(S) (H)-S-. Uma modalidade preferencial, é -O-P(O)(OH)-O-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
III. GRUPOS DE LIGAÇÃO CLIVÁVEIS ÁCIDOS
[672] Em outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável ácido. Um grupo de ligação clivável ácido é um grupo de ligação que é clivado em condições ácidas. Em modalidades preferenciais, grupos de ligação cliváveis ácidos são clivados em um ambiente ácido com um pH de cerca de 6,5 ou inferior (por exemplo, cerca de 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0, ou inferior), ou por agentes como enzimas que podem atuar como um ácido geral. Em uma célula, organelas específicas de baixo pH, como endossomos e lisossomos, podem fornecer um ambiente de clivagem para ácido grupo de ligação clivávels. Exemplos de grupos de ligação cliváveis ácidos incluem, mas não estão limitados a hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Os grupos cliváveis ácidos podem ter a fórmula geral -C=NN-, C(O)O, ou -OC(O). Uma modalidade preferencial é quando o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído ou grupo alquila terciário tal como dimetilpentila ou t-butila. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima. IV. GRUPOS DE LIGAÇÃO À BASE DE ÉSTER
[673] Em outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de éster. Um grupo de ligação clivável à base de éster é clivado por enzimas como esterases e amidases nas células. Exemplos de grupos de ligação cliváveis à base de éster incluem, mas não estão limitados a grupos ésteres alquileno, alquenileno e alquinileno. Os grupos de ligação cliváveis à base de éster têm a fórmula geral -C(O)O- ou -OC(O)-. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
V. GRUPOS CLIVÁVEIS À BASE DE PEPTÍDEO
[674] Em ainda outra modalidade, um ligante clivável compreende um grupo de ligação clivável à base de peptídeo. Um grupo de ligação clivável à base de peptídeos é clivado por enzimas como peptidases e proteases nas células. O grupo de ligação clivável à base de peptídeos são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para produzir oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. Os grupos cliváveis à base de peptídeo não incluem o grupo amida (-C(O)NH-). O grupo amida pode ser formado entre qualquer alquileno, alquenileno ou alquineleno. Uma ligação peptídica é um tipo especial de ligação amida formada entre os aminoácidos para produzir peptídeos e proteínas. O grupo de clivagem com base em peptídeos é geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação amida) formada entre os aminoácidos que produzem peptídeos e proteínas e não inclui todo o grupo funcional amida. Os grupos de ligação cliváveis à base de peptídeos têm a fórmula geral -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes. Esses candidatos podem ser avaliados usando métodos análogos aos descritos acima.
[675] As patentes US representativas que ensinam a preparação de conjugados de RNA incluem, mas sem limitação, patentes nos US 4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465;
5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.717. 5.580.731;
5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077;
5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044;
4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941;
4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830;
5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136;
5.245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250;
5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.723; 5.416.203.
5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552;
5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726;
5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 e 5.688.941; 6.294.664;
6.320.017; 6.576.752; 6.783.931; 6.900.297; 7.037.646;
8.106.022, cujo conteúdo de cada um desses está aqui incorporado a título de referência.
[676] Não é necessário que todas as posições em um dado composto sejam uniformemente modificadas, e de fato mais de uma das modificações acima mencionadas pode ser incorporada em um único composto ou mesmo em um único nucleosídeo dentro de um agente de RNAi. A presente revelação também inclui agentes de RNAi que são compostos quiméricos.
[677] “Agentes quiméricos” de RNAi ou “quimeras”, no contexto desta revelação, são agentes de RNAi, preferencialmente dsRNAs, que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma composta por pelo menos uma unidade monomérica, ou seja, um nucleotídeo no caso de um composto de dsRNA. Esses agentes de RNAi normalmente contêm pelo menos uma região em que o RNA é modificado de modo a conferir ao agente de RNAi aumento da resistência à degradação da nuclease, aumento da captação celular e/ou aumento da afinidade de ligação para o ácido nucleico-alvo. Uma região adicional do agente de RNAi pode servir como substrato para enzimas capazes de clivar híbridos de RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, a RNase H é uma endonuclease celular que cliva o filamento de RNA de um duplex de RNA:DNA. A ativação da RNase H, portanto, resulta na clivagem do RNA-alvo, aumentando assim muito a eficiência da inibição da expressão gênica mediada pelo agente de RNAi. Consequentemente, resultados comparáveis podem frequentemente ser obtidos com agentes de RNAi mais curtos quando dsRNAs quiméricos são usados, em comparação com dsRNAs fosforotioato desóxi que hibridizam com a mesma região-alvo. A clivagem do RNA-alvo pode ser rotineiramente detectada por eletroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridização de ácido nucleico associadas conhecidas na técnica.
[678] Em certos casos, o RNA de um agente de RNAi pode ser modificado por um grupo não ligante. Várias moléculas não ligantes foram conjugadas a agentes de RNAi a fim de aumentar a atividade, distribuição celular ou captação celular do agente de RNAi, e procedimentos para realizar tais conjugações estão disponíveis na literatura científica. Esses grupamentos não ligantes incluem grupamentos lipídicos, como o colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54 a 61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), um tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), uma cadeia lifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecila (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), um fosfolipídio, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamônio 1,2- di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), ou ácido acético de adamantano (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), um grupamento de palmitila (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), ou um grupamento de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Patentes dos Estados Unidos representativas que ensinam a preparação de tais conjugados de RNA foram listadas acima. Os protocolos de conjugação típicos envolvem a síntese de um RNA portador de um aminoligador em uma ou mais posições da sequência. O grupo amino é então feito reagir com a molécula sendo conjugada usando acoplamento apropriado ou reagentes de ativação. A reação de conjugação pode ser realizada tanto com o RNA ainda ligado ao suporte sólido quanto após a clivagem do RNA, em fase de solução. A purificação do conjugado de RNA por HPLC normalmente fornece o conjugado puro. VI. ENTREGA DE UM AGENTE DE RNAI DA REVELAÇÃO
[679] A entrega de um agente de RNAi da revelação a uma célula por exemplo, uma célula dentro de um sujeito, como um sujeito humano (por exemplo, um sujeito que dele necessite, como um sujeito com um distúrbio associado à APP , por exemplo, CAA e/ou DA, por exemplo, EOFAD) podem ser alcançados de várias maneiras diferentes. Por exemplo, a entrega pode ser realizada entrando em contato com uma célula com um agente de RNAi da revelação in vitro ou in vivo. A entrega in vivo também pode ser realizada diretamente pela administração de uma composição compreendendo um agente de RNAi, por exemplo, um dsRNA, a um sujeito. Alternativamente, a entrega in vivo pode ser realizada indiretamente pela administração de um ou mais vetores que codificam e dirigem a expressão do agente de RNAi. Essas alternativas são discutidas mais adiante.
[680] Em geral, qualquer método de entrega de uma molécula de ácido nucleico (in vitro ou in vivo) pode ser adaptado para uso com um agente de RNAi da revelação (ver, por exemplo, Akhtar S. e Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2 (5): 139 a 144 e WO94/02595, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade). Para a distribuição in vivo, os fatores a serem considerados para a distribuição de um agente de RNAi incluem, por exemplo, estabilidade biológica do agente distribuído, prevenção de efeitos não específicos e acúmulo do agente distribuído no tecido-alvo. Os efeitos não específicos de um agente de RNAi podem ser minimizados por administração local, por exemplo, por injeção direta ou implantação em um tecido ou administração tópica da preparação. A administração local para um local de tratamento maximiza a concentração local do agente, limita a exposição do agente a tecidos sistêmicos que podem ser prejudicados pelo agente ou que podem degradar o agente, e permite que uma dose total mais baixa do agente de RNAi seja administrado. Vários estudos têm demonstrado o sucesso do knockdown de produtos gênicos quando um agente de RNAi é administrado localmente. Por exemplo, a entrega intraocular de um dsRNA de VEGF por injeção intravítrea em macacos cinomolgos (Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24: 132 a 138) e injeções subretinianas em camundongos (Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9: 210 a 216) foram ambos mostrados para prevenir a neovascularização em um modelo experimental de degeneração macular relacionada à idade. Além disso, a injeção intratumoral direta de um dsRNA em camundongos reduz o volume do tumor (Pille, J. et al. (2005) Mol.
Ther. 11: 267 a 274) e pode prolongar a sobrevivência de camundongos com tumor (Kim, WJ. et al., (2006) Mol.
Ther. 14: 343 a 350; Li, S. et al., (2007) Mol.
Ther. 15: 515 a 523). A interferência de RNA também mostrou sucesso com a entrega local ao SNC por injeção direta (Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32: e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12: 59 a 66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129: 521 a 528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc.
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USA 101: 17.270 a 17.275; Akaneya, Y., et al. (2005) J.
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Chem. 279: 10.677 a 10.684; Bitko, V. et al., (2005) Nat.
Med. 11: 50 a 55). Para administrar um agente de RNAi sistemicamente para o tratamento de uma doença, o RNA pode ser modificado ou, alternativamente, entregue usando um sistema de entrega de medicamento; ambos os métodos atuam para prevenir a rápida degradação do dsRNA por endo e exonucleases in vivo.
A modificação do RNA ou do carreador farmacêutico também pode permitir o direcionamento do agente de RNAi para o tecido-alvo e evitar efeitos indesejáveis fora do alvo (por exemplo, sem desejar ser limitado pela teoria, o uso de GNAs como descrito no presente documento foi identificado para desestabilizar a região de semente de um dsRNA, resultando em preferência aumentada de tais dsRNAs para eficácia no alvo, em relação aos efeitos fora do alvo, uma vez que tais efeitos fora do alvo são significativamente enfraquecidos por tal desestabilização da região de semente). Agentes de RNAi podem ser modificados por conjugação química a grupos lipofílicos, como o colesterol,
para aumentar a absorção celular e prevenir a degradação. Por exemplo, um agente de RNAi direcionado contra ApoB conjugado a um grupamento de colesterol lipofílico foi injetado sistemicamente em camundongos e resultou no knockdown de apoB mRNA no fígado e no jejuno (Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432: 173 a 178). A conjugação de um agente de RNAi a um aptâmero mostrou inibir o crescimento do tumor e mediar a regressão do tumor em um modelo de câncer de próstata em camundongo (McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1.005 a
1.015). Em uma modalidade alternativa, o agente de RNAi pode ser distribuído usando sistemas de distribuição de fármacos, como uma nanopartícula, um dendrímero, um polímero, lipossomas ou um sistema de distribuição catiônica. Os sistemas de entrega catiônica carregados positivamente facilitam a ligação da molécula agente de RNAi (carregada negativamente) e também aumentam as interações na membrana da célula carregada negativamente para permitir a absorção eficiente de um agente de RNAi pela célula. Lipídios catiônicos, dendrímeros ou polímeros podem ser ligados a um agente de RNAi, ou induzidos a formar uma vesícula ou micela (ver, por exemplo, Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129 (2): 107 a 116) que envolve um agente de RNAi. A formação de vesículas ou micelas previne ainda mais a degradação do agente de RNAi quando administrado sistemicamente. Os métodos para preparar e administrar complexos catiônicos e agente de RNAi estão dentro das habilidades de um especialista na técnica (ver, por exemplo, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327: 761 a 766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9: 1.291 a
1.300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25: 197 a 205, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade).
Alguns exemplos não limitativos de sistemas de distribuição de fármacos úteis para distribuição sistêmica de agentes de RNAi incluem DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra), Oligofectamina, “partículas sólidas de lipídios de ácido nucleico” (Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441: 111 a 114), cardiolipina (Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12: 321 a 328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26: 1.087 a 1.091), polietilenoimina (Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. 16 de agosto, publicado eletronicamente antes da versão impressa; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), peptídeos Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3: 472 a 487), e poliamidoaminas (Tomalia, DA. et al. , (2007) Biochem. Soc. Trans. 35: 61 a 67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res. 16: 1.799 a 1.804). Em algumas modalidades, um agente de RNAi forma um complexo com ciclodextrina para administração sistêmica. Métodos para administração e composição farmacêutica de agentes de RNAi e ciclodextrinas podem ser encontrados na patente nº US
7.427.605, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[681] Certos aspectos da presente revelação estão relacionados a um método de redução da expressão de um gene de APP-alvo em uma célula, compreendendo o contato dessa célula com o agente de RNAi de duplo filamento da revelação. Em uma modalidade, a célula é uma célula extra-hepática, opcionalmente uma célula CNS.
[682] Outro aspecto da revelação refere-se a um método de redução da expressão de um gene de APP-alvo em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de RNAi de duplo filamento da revelação.
[683] Outro aspecto da revelação está relacionado a um método de tratamento de um sujeito com um distúrbio do SNC, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi da revelação, tratando assim o sujeito de APP de duplo filamento. Os distúrbios do SNC exemplificativos que podem ser tratados pelo método da revelação incluem Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica (ELA), demência frontotemporal, huntington, Parkinson, espinocerebelar, príon e lafora.
[684] Em uma modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento é administrado intratecalmente. Por administração intratecal do agente de RNAi de duplo filamento, o método pode reduzir a expressão de um gene de APP-alvo em um tecido cerebral ou espinhal, por exemplo, córtex, cerebelo, estriado, coluna cervical, coluna lombar e coluna torácica.
[685] Para facilitar a exposição das formulações, as composições e métodos nesta seção são amplamente discutidos com relação aos compostos de siRNA modificados. Pode ser entendido, no entanto, que essas formulações, composições e métodos podem ser praticados com outros compostos de siRNA, por exemplo, compostos de siRNA não modificados, e tal prática está dentro da revelação. Uma composição que inclui um agente de RNAi pode ser fornecida a um sujeito por uma variedade de rotas. As vias exemplificativas incluem: intratecal, intravenosa, tópica, retal, anal, vaginal, nasal, pulmonar, ocular.
[686] Os agentes de RNAi da revelação podem ser incorporados à composição farmacêutica adequada para administração. Essas composições incluem tipicamente uma ou mais espécies de agente de RNAi e um carreador farmaceuticamente aceitável. Como usado no presente documento, a linguagem “carreador farmaceuticamente aceitável” se destina a incluir todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições é contemplado. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[687] As composições farmacêuticas da presente revelação podem ser administradas de várias maneiras dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica, vaginal, retal, intranasal, transdérmica), oral ou parenteral. A administração parenteral inclui gotejamento intravenoso, injeção subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular, administração intratecal ou intraventricular.
[688] A rota e o local de administração podem ser escolhidos para melhorar o direcionamento. Por exemplo, para direcionar as células musculares, a injeção intramuscular nos músculos de interesse seria uma escolha lógica. As células pulmonares podem ser direcionadas pela administração do agente de RNAi na forma de aerossol. As células endoteliais vasculares podem ser direcionadas revestindo um cateter balão com o agente de RNAi e introduzindo mecanicamente o DNA.
[689] As formulações para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes,
géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Podem ser necessários ou desejáveis veículos farmacêuticos convencionais, aquosos, em pó ou oleosos, espessantes e semelhantes. Preservativos revestidos, luvas e semelhantes também podem ser úteis.
[690] As composições para administração oral incluem pós ou grânulos, suspensões ou soluções em água, xaropes, elixires ou meios não aquosos, comprimidos, cápsulas, pastilhas ou trociscos. No caso de comprimidos, os veículos que podem ser utilizados incluem lactose, citrato de sódio e sais de ácido fosfórico. Vários desintegrantes, como amido, e agentes lubrificantes, como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco, são comumente usados em comprimidos. Para administração oral em forma de cápsula, os diluentes úteis são lactose e polietilenoglicóis de alto peso molecular. Quando suspensões aquosas são necessárias para uso oral, as composições de ácido nucleico podem ser combinadas com agentes emulsionantes e de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes e/ou aromatizantes podem ser adicionados.
[691] As composições para administração intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados.
[692] As formulações para administração parenteral podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. A injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, acoplado a um reservatório. Para uso intravenoso, a concentração total de solutos pode ser controlada para tornar a preparação isotônica.
[693] Em uma modalidade, a administração do composto de siRNA, por exemplo, um composto de siRNA de filamento duplo ou composto de ssiRNA, a composição é parenteral, por exemplo, intravenosa (por exemplo, como um bolo ou como uma infusão difusível), intradérmica, intraperitoneal, intramuscular, intratecal, intraventricular, intracraniana, subcutânea, transmucosa, bucal, sublingual, endoscópica, retal, oral, vaginal, tópica, pulmonar, intranasal, uretral ou ocular. A administração pode ser feita pelo próprio sujeito ou por outra pessoa, por exemplo, um prestador de cuidados de saúde. O medicamento pode ser fornecido em doses medidas ou em um dispensador que fornece uma dose medida. Os modos de entrega selecionados são discutidos em mais detalhes abaixo.
[694] Administração intratecal. Em uma modalidade, o agente de RNAi de duplo filamento é administrado por injeção intratecal (ou seja, injeção no fluido espinhal que banha o cérebro e o tecido da medula espinhal). A injeção intratecal de agentes de RNAi no líquido espinhal pode ser realizada como uma injeção em bolus ou por meio de minibombas que podem ser implantadas sob a pele, proporcionando uma distribuição regular e constante de siRNA no líquido espinhal. A circulação do fluido espinhal do plexo coroide, onde é produzido, desce ao redor da medula espinhal e gânglios da raiz dorsal e, subsequentemente, sobe além do cerebelo e sobre o córtex até as granulações da aracnoide, onde o fluido pode sair do SNC, que, dependendo do tamanho, estabilidade e solubilidade dos compostos injetados, as moléculas entregues intratecalmente podem atingir alvos em todo o SNC.
[695] Em algumas modalidades, a administração intratecal é por meio de uma bomba. A bomba pode ser uma bomba osmótica implantada cirurgicamente. Em uma modalidade, a bomba osmótica é implantada no espaço subaracnoideo do canal vertebral para facilitar a administração intratecal.
[696] Em algumas modalidades, a administração intratecal é por meio de um sistema de administração intratecal para um fármaco incluindo um reservatório contendo um volume do fármaco, e uma bomba configurada para administrar uma porção do fármaco contido no reservatório. Mais detalhes sobre este sistema de entrega intratecal podem ser encontrados em PCT/US2015/013253, depositado em 28 de janeiro de 2015, que é incorporado por referência em sua totalidade.
[697] A quantidade de agentes de RNAi injetados intratecalmente pode variar de um gene-alvo para outro gene- alvo e a quantidade apropriada que deve ser aplicada pode ter que ser determinada individualmente para cada gene-alvo. Normalmente, essa quantidade varia entre 10 μg a 2 mg, preferencialmente 50 μg a 1.500 μg, mais preferencialmente 100 μg a 1.000 μg.
[698] Agentes de RNAi Codificados por Vetor da Revelação
[699] Os agentes de RNAi direcionados ao gene de APP podem ser expressos a partir de unidades de transcrição inseridas em vetores de DNA ou RNA (ver, por exemplo, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12: 5 a 10; Skillern, A., et al., publicação PCT internacional nº WO 00/22113, Conrad, publicação PCT internacional nº WO 00/22114, e Conrad, patente nº US 6.054.299). A expressão pode ser transitória (na ordem de horas a semanas) ou sustentada (semanas a meses ou mais), dependendo da construção específica usada e do tecido-alvo ou tipo de célula. Esses transgenes podem ser introduzidos como um construto linear, um plasmídeo circular ou um vetor viral, que pode ser um vetor integrador ou não integrante. O transgene também pode ser construído para permitir que seja herdado como um plasmídeo extracromossômico (Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1292).
[700] O filamento ou filamentos individuais de um agente de RNAi podem ser transcritos a partir de um promotor em um vetor de expressão. Onde dois filamentos separados devem ser expressos para gerar, por exemplo, um dsRNA, dois vetores de expressão separados podem ser cointroduzidos (por exemplo, por transfecção ou infecção) em uma célula-alvo. Alternativamente, cada filamento individual de um dsRNA pode ser transcrito por promotores, ambos os quais estão localizados no mesmo plasmídeo de expressão. Em uma modalidade, um dsRNA é expresso como polinucleotídeos de repetição invertida unidos por uma sequência de polinucleotídeos ligantes, de modo que o dsRNA tenha uma estrutura de haste e laço.
[701] Os vetores de expressão de agente de RNAi são geralmente plasmídeos de DNA ou vetores virais. Os vetores de expressão compatíveis com células eucarióticas, preferencialmente aquelas compatíveis com células de vertebrados, podem ser usados para produzir construtos recombinantes para a expressão de um agente de RNAi como descrito no presente documento. Os vetores de expressão da célula eucariótica são bem conhecidos na técnica e estão disponíveis em várias fontes comerciais. Normalmente, tais vetores são fornecidos contendo locais de restrição convenientes para a inserção do segmento de ácido nucleico desejado. A distribuição de vetores que expressam o agente de
RNAi pode ser sistêmica, como por administração intravenosa ou intramuscular, por administração em células-alvo explantadas do paciente seguida por reintrodução no paciente, ou por qualquer outro meio que permita a introdução em uma célula- alvo desejada.
[702] Os sistemas de vetores virais que podem ser utilizados com os métodos e composições aqui descritos incluem, mas não estão limitados a, (a) vetores de adenovírus; (b) vetores de retrovírus, incluindo, mas não se limitando a vetores lentivirais, vírus da leucemia murina moloney, etc.; (c) vetores de vírus adenoassociados; (d) vetores de vírus herpes simplex; (e) vetores SV 40; (f) vetores de vírus de polioma; (g) vetores do vírus do papiloma; (h) vetores de picornavírus; (i) vetores de vírus da varíola, como um orthopox, por exemplo, vetores do vírus da vaccínia ou avipox, por exemplo, varíola canária ou varíola aviária; e (j) um adenovírus dependente de ajudante ou sem intestino. Os vírus com defeito de replicação também podem ser vantajosos. Diferentes vetores não serão incorporados ao genoma das células. Os construtos podem incluir sequências virais para transfecção, se desejado. Alternativamente, o construto pode ser incorporado em vetores capazes de replicação epissomal, por exemplo, vetores EPV e EBV. Os construtos para a expressão recombinante de um agente de RNAi geralmente requerem elementos reguladores, por exemplo, promotores, intensificadores, etc., para garantir a expressão do agente de RNAi em células-alvo. Outros aspectos a considerar para vetores e construtos são conhecidos na técnica. VII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DA REVELAÇÃO
[703] A presente revelação também inclui composições farmacêuticas e formulações que incluem os agentes de RNAi da revelação. Em uma modalidade, são fornecidas no presente documento composições farmacêuticas contendo um agente de RNAi, como descrito no presente documento, e um carreador farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas contendo o agente de RNAi são úteis para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado à expressão ou à atividade de um gene de APP, por exemplo, uma doença associada à APP, por exemplo, CAA ou DA, por exemplo, EOFAD.
[704] Essas composições farmacêuticas são formuladas com base no modo de entrega. Um exemplo são as composições que são formuladas para administração por meio de administração parenteral sistêmica, por exemplo, por administração intravenosa (IV), intramuscular (IM) ou para administração subcutânea (subQ). Outro exemplo são composições que são formuladas para entrega direta no SNC, por exemplo, por vias de injeção intratecal ou intravítrea, opcionalmente por infusão no cérebro, como por infusão de bomba contínua.
[705] As composições farmacêuticas da revelação podem ser administradas em dosagens suficientes para inibir a expressão de um gene de APP. Em geral, uma dose adequada de um agente de RNAi da revelação estará na faixa de cerca de 0,001 a cerca de 200,0 miligramas por quilograma de peso corporal do receptor por dia, geralmente na faixa de cerca de 1 a 50 mg por quilograma de peso corporal por dia. Normalmente, uma dose adequada de um agente de RNAi da revelação estará na faixa de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 5,0 mg/kg, preferencialmente cerca de 0,3 mg/kg e cerca de 3,0 mg/kg.
[706] Um regime de dose repetida pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica de um agente de
RNAi em uma base regular, tal como bimestral ou mensalmente a uma vez por ano. Em determinadas modalidades, o agente de RNAi é administrado cerca de uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (ou seja, cerca de uma vez a cada três meses).
[707] Após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados em uma base menos frequente.
[708] A unidade de dosagem pode ser composta para entrega durante um período prolongado, por exemplo, usando uma formulação de liberação sustentada convencional que oferece liberação sustentada do agente de RNAi durante um período prolongado. As formulações de liberação sustentada são bem conhecidas na técnica e são particularmente úteis para a entrega de agentes em um local específico, tal como poderia ser usado com a revelação de agentes da presente. Nesta modalidade, a unidade de dosagem contém um múltiplo correspondente de, por exemplo, uma dose mensal.
[709] Em outras modalidades, uma única dose das composições farmacêuticas pode ser de longa duração, de modo que as doses subsequentes sejam administradas em intervalos não superiores a 1, 2, 3 ou 4 ou mais semanas. Em algumas modalidades da revelação, uma dose única das composições farmacêuticas da revelação é administrada uma vez por semana. Em outras modalidades da revelação, uma única dose das composições farmacêuticas da revelação é administrada bimestralmente.
[710] O versado na técnica apreciará que certos fatores podem influenciar a dosagem e o tempo necessário para tratar efetivamente um sujeito, incluindo, mas não se limitando à gravidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores,
saúde geral e/ou idade do sujeito , e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um sujeito com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma série de tratamentos. As estimativas de dosagens eficazes e meias-vidas in vivo para os agentes de RNAi individuais abrangidos pela revelação podem ser feitas usando metodologias convencionais ou com base em testes in vivo usando um modelo animal apropriado, conforme descrito em outro lugar neste documento.
[711] Avanços na genética de camundongos geraram uma série de modelos de camundongos para o estudo de várias doenças humanas, como distúrbios associados à APP, que se beneficiariam com a redução na expressão de APP. Esses modelos podem ser usados para testes in vivo de agentes de RNAi, bem como para determinar uma dose terapeuticamente eficaz. Modelos de camundongos adequados são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, os modelos DA e/ou CAA descritos em outro lugar neste documento.
[712] As composições farmacêuticas da revelação da presente podem ser administradas de várias maneiras dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (por exemplo, por adesivo transdérmico), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, inclusive por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmico e transdérmico, oral ou parenteral. A administração parenteral inclui injeção ou infusão intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; subdérmica, por exemplo, por meio de um dispositivo implantado; ou intracraniana, por exemplo, por administração intraparenquimatosa, intratecal ou intraventricular.
[713] Os agentes de RNAi podem ser administrados de forma a atingir um determinado tecido, como o SNC (por exemplo, tecido neuronal, glial e/ou vascular do cérebro).
[714] As composições farmacêuticas e formulações para administração tópica podem incluir adesivos transdérmicos, pomadas, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, aerossóis, líquidos e pós. Veículos farmacêuticos convencionais, bases aquosas, em pó ou oleosas, espessantes e similares podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos revestidos, luvas e semelhantes também podem ser úteis. As formulações tópicas adequadas incluem aquelas em que os agentes de RNAi apresentados na revelação estão em mistura com um agente de entrega tópica, como lipídios, lipossomas, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, esteroides, agentes quelantes e tensoativos. Os lipídios e lipossomas adequados incluem neutro (por exemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, distearolifosfatidilcolina) negativo (por exemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiônico (por exemplo, dioleoiltetrametilaminopropilDOTAP e dioleoilfosfatidiletanolamina). Os agentes de RNAi apresentados na revelação podem ser encapsulados dentro de lipossomas ou podem formar complexos com eles, em particular lipossomas catiônicos. Alternativamente, agentes de RNAi podem ser complexados a lipídios, em particular a lipídios catiônicos. Ácidos graxos e ésteres adequados incluem, mas não estão limitados a ácido araquidônico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1- dodecilazacicloheptan-2-ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um éster C1-20 alquila (por exemplo, isopropilmiristato IPM), monoglicerídeo, diglicerídeo ou sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos. As formulações tópicas são descritas em detalhes na patente nº US 6.747.014, que é incorporada neste documento por referência. A. FORMULAÇÕES DO AGENTE DE RNAI QUE COMPREENDEM
MONTAGENS MOLECULARES MEMBRANOSAS
[715] Um agente de RNAi para uso nas composições e métodos de revelação pode ser formulado para entrega em um conjunto molecular membranoso, por exemplo, um lipossoma ou uma micela. Como usado no presente documento, o termo “lipossoma” refere-se a uma vesícula composta por lipídios anfifílicos dispostos em pelo menos uma bicamada, por exemplo, uma bicamada ou uma pluralidade de bicamadas. Os lipossomas incluem vesículas unilamelares e multilamelares que possuem uma membrana formada por um material lipofílico e um interior aquoso. A porção aquosa contém a composição do agente de RNAi. O material lipofílico isola o interior aquoso de um exterior aquoso, que normalmente não inclui a composição do agente de RNAi, embora em alguns exemplos, possa. Os lipossomas são úteis para a transferência e entrega de ingredientes ativos ao local de ação. Como a membrana lipossomal é estruturalmente semelhante às membranas biológicas, quando os lipossomas são aplicados a um tecido, a bicamada lipossomal se funde com a bicamada das membranas celulares. Conforme a fusão do lipossoma e célula progride, o conteúdo aquoso interno que inclui o agente de RNAi é entregue na célula onde o agente de RNAi pode se ligar especificamente a um RNA-alvo e pode mediar o RNAi. Em alguns casos, os lipossomas também são especificamente direcionados, por exemplo, para direcionar o agente de RNAi para determinados tipos de células.
[716] Um lipossoma contendo um agente de RNAi pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente de modo que micelas sejam formadas com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um conjugado lipídico catiônico ou lipídico anfipático. O detergente pode ter uma concentração micelar crítica elevada e pode ser não iônico. Detergentes exemplificativos incluem colato, CHAPS, octilglicosídeo, desoxicolato e lauroil sarcosina. A preparação do agente de RNAi é então adicionada às micelas que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos no lipídio interagem com o agente de RNAi e condensam-se ao redor do agente de RNAi para formar um lipossoma. Após a condensação, o detergente é removido, por exemplo, por diálise, para render uma preparação lipossomal de agente de RNAi.
[717] Se necessário, um composto de carreador que auxilie na condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, por adição controlada. Por exemplo, o composto de carreador pode ser um polímero diferente de um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.
[718] Métodos para a produção de veículos de entrega de polinucleotídeo estáveis, que incorporam um complexo de polinucleotídeo/lipídio catiônico como componentes estruturais do veículo de entrega, são ainda descritos, por exemplo, em WO 96/37194, cujo conteúdo completo é incorporado aqui por referência. A formação de lipossomas também pode incluir um ou mais aspectos de métodos exemplificativos descritos em Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7.413 a 7.417; Patente nº US 4.897.355; Patente nº US 5.171.678; Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23: 238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557: 9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728: 339; e Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115: 757. As técnicas comumente usadas para preparar agregados lipídicos de tamanho apropriado para uso como veículos de entrega incluem sonicação e congelamento- descongelamento mais extrusão (ver, por exemplo, Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858: 161. A microfluidização pode ser usada quando consistentemente pequenos (50 a 200 nm) e agregados relativamente uniformes são desejados (Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775: 169. Esses métodos são prontamente adaptados para embalar preparações de agente de RNAi em lipossomas.
[719] Os lipossomas caem em duas classes amplas. Os lipossomas catiônicos são lipossomas carregados positivamente que interagem com as moléculas de ácido nucleico carregadas negativamente para formar um complexo estável. O complexo ácido nucleico/lipossoma carregado positivamente liga-se à superfície da célula carregada negativamente e é internalizado em um endossomo. Devido ao pH ácido dentro do endossoma, os lipossomas são rompidos, liberando seu conteúdo no citoplasma da célula (Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147: 980 a 985).
[720] Os lipossomas, que são sensíveis ao pH ou carregados negativamente, prendem os ácidos nucleicos em vez de complexos com eles. Uma vez que tanto o ácido nucleico quanto o lipídio têm carga semelhante, ocorre repulsão em vez de formação de complexo. No entanto, algum ácido nucleico é aprisionado no interior aquoso desses lipossomas. Os lipossomas sensíveis ao pH têm sido usados para distribuir ácidos nucleicos que codificam o gene da timidina quinase para monocamadas de células em cultura. A expressão do gene exógeno foi detectada nas células-alvo (Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19: 269 a 274).
[721] Um tipo principal de composição lipossomal inclui fosfolipídios além de fosfatidilcolina derivada naturalmente. As composições de lipossomas neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Composições de lipossomas aniônicos geralmente são formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto os lipossomas fusogênicos aniônicos são formados principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formado a partir de fosfatidilcolina (PC) como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídio e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[722] Exemplos de outros métodos para introduzir lipossomas em células in vitro e in vivo incluem a patente nº US 5.283.185; patente nº US 5.171.678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269: 2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3: 649; Gershon, (1993) Biochem. 32:
7143; e Strauss, (1992) EMBO J. 11: 417.
[723] Os sistemas lipossomais não iônicos também foram examinados para determinar sua utilidade na distribuição de fármacos à pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. Formulações lipossomais não iônicas compreendendo NovasomeTM I (gliceril dilaurato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e NovasomeTM II (gliceril diestearato/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para entregar ciclosporina-A na derme da pele de camundongo. Os resultados indicaram que tais sistemas lipossomais não iônicos foram eficazes em facilitar a deposição de ciclosporina A em diferentes camadas da pele (Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4 (6): 466).
[724] Os lipossomas também incluem lipossomas “estericamente estabilizados”, um termo que, como usado no presente documento, refere-se a lipossomas que compreendem um ou mais lipídios especializados que, quando incorporados em lipossomas, resultam em tempos de vida de circulação aprimorados em relação aos lipossomas sem tais lipídios especializados. Exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles em que parte da porção lipídica formadora de vesículas do lipossoma (A) compreende um ou mais glicolipídios, como o monossialogangliosídeo GM1, ou (B) é derivatizado com um ou mais polímeros hidrofílicos, como um grupamento polietilenoglicol (PEG). Embora não desejando ser limitado por nenhuma teoria em particular, acredita-se na técnica que, pelo menos para lipossomas estericamente estabilizados contendo gangliósidos, esfingomielina ou lipídios derivatizados de PEG, a meia-vida de circulação aprimorada desses lipossomas estericamente estabilizados deriva de uma absorção reduzida em células do sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223: 42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53: 3.765).
[725] Vários lipossomas compreendendo um ou mais glicolipídios são conhecidos na técnica. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sei., (1987), 507: 64) relataram a capacidade do monossialogangliosídeo GM1, sulfato de galactocerebrosídeo e fosfatidilinositol para melhorar a meia- vida sanguínea dos lipossomas. Esses achados foram expostos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A., (1988), 85: 6.949). Patente nº US 4.837.028 e WO 88/04924, ambos de Allen et al., revelam lipossomas compreendendo (1) esfingomielina e (2) o gangliosídio GM1 ou um sulfato éster de galactocerebrosida. A patente nº US 5.543.152 (Webb et al.) revela lipossomas compreendendo esfingomielina. Os lipossomas que compreendem 1,2-sn-dimiristoilfosfatidilcolina são revelados no documento WO 97/13499 (Lim et al.).
[726] Em uma modalidade, os lipossomas catiônicos são usados. Os lipossomas catiônicos possuem a vantagem de poderem se fundir à membrana da célula. Os lipossomas não catiônicos, embora não sejam capazes de se fundir tão eficientemente com a membrana plasmática, são absorvidos pelos macrófagos in vivo e podem ser usados para entregar agentes de RNAi aos macrófagos.
[727] Outras vantagens dos lipossomas incluem: os lipossomas obtidos a partir de fosfolípidos naturais são biocompatíveis e biodegradáveis; os lipossomas podem incorporar uma ampla gama de fármacos solúveis em água e lipídios; lipossomas podem proteger agentes de RNAi encapsulados em seus compartimentos internos do metabolismo e degradação (Rosoff, em “Pharmaceutical Dosage Forms,” Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, volume 1, página 245). As considerações importantes na preparação de formulações de lipossomas são a carga superficial do lipídio, o tamanho da vesícula e o volume aquoso dos lipossomas.
[728] Um lipídio catiônico sintético carregado positivamente, cloreto de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N, N, N-trimetilamônio (DOTMA) pode ser usado para formar pequenos lipossomas que interagem espontaneamente com o ácido nucleico para formam complexos de lípido-ácido nucleico que são capazes de se fundir com os lípidos carregados negativamente das membranas celulares de células de cultura de tecidos, resultando na entrega de agente de RNAi (ver, por exemplo, Felgner, PL et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7.413 a 7.417, e Patente nº US 4.897.355 para uma descrição de DOTMA e seu uso com DNA).
[729] Um análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3- (trimetilamônia)propano (DOTAP) pode ser usado em combinação com um fosfolipídio para formar vesículas complexantes de DNA. Lipofectin™ Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) É um agente eficaz para a entrega de ácidos nucleicos altamente aniônicos em células de cultura de tecidos vivas que compreendem lipossomas DOTMA carregados positivamente que interagem espontaneamente com polinucleotídeos carregados negativamente para formar complexos. Quando um número suficiente de lipossomas carregados positivamente é usado, a carga líquida nos complexos resultantes também é positiva. Complexos carregados positivamente preparados desta forma ligam-se espontaneamente a superfícies de células carregadas negativamente, fundem-se com a membrana plasmática e entregam ácidos nucleicos funcionais de forma eficiente, por exemplo, em células de cultura de tecidos. Outro lipídio catiônico disponível comercialmente, 1,2-bis(oleoiloxi)-3,3- (trimetilamônia) propano (“DOTAP”) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difere do DOTMA em que os grupamentos de oleoíla estão ligados por éster, em vez de ligações éter.
[730] Outros compostos lipídio catiônico relatados incluem aqueles que foram conjugados a uma variedade de grupamentos, incluindo, por exemplo, carboxiespermina que foi conjugada a um dos dois tipos de lipídios e inclui compostos como 5-carboxiespermilglicina dioctaoleoilamida (“DOGS”) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) e dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermil-amida (“DPPES”) (ver, por exemplo, Patente nº US 5.171.678).
[731] Outro conjugado de lipídio catiônico inclui derivatização do lipídio com colesterol (“DC-Chol”) que foi formulado em lipossomas em combinação com DOPE (ver, Gao, X. e Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179: 280). A lipopolilisina, feita por conjugação de polilisina com DOPE, foi relatada como sendo eficaz para transfecção na presença de soro (Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065: 8). Para certas linhagens de células, esses lipossomas contendo conjugados de lipídios catiônicos apresentam menor toxicidade e proporcionam uma transfecção mais eficiente do que as composições contendo DOTMA. Outros produtos de lipídio catiônico disponíveis no mercado incluem DMRIE e DMRIE-HP (Vical, La Jolla, Califórnia) e lipofectamina (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Mariland). Outros lipídios catiônicos adequados para a entrega de oligonucleotídeos são descritos em WO 98/39359 e WO 96/37194.
[732] As formulações lipossomais são particularmente adequadas para administração tópica, os lipossomas apresentam várias vantagens sobre outras formulações. Essas vantagens incluem redução dos efeitos colaterais relacionados à alta absorção sistêmica do fármaco administrado, aumento do acúmulo do fármaco administrado no alvo desejado e capacidade de administrar agente de RNAi na pele. Em algumas implementações, os lipossomas são usados para fornecer agente de RNAi às células epidérmicas e também para aumentar a penetração do agente de RNAi nos tecidos dérmicos, por exemplo, na pele. Por exemplo, os lipossomas podem ser aplicados topicamente. A distribuição tópica de fármacos formulados como lipossomas na pele foi documentada (ver, por exemplo, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2, 405 a 410 e du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18: 259 a 265; Mannino, RJ e Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6: 682 a 690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56: 267 a 276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol. 149: 157 a 176; Straubinger, RM e Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101: 512 a 527; Wang, CY e Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7.851 a 7.855).
[733] Os sistemas lipossomais não iônicos também foram examinados para determinar sua utilidade na distribuição de fármacos para a pele, em particular sistemas compreendendo tensoativo não iônico e colesterol. As formulações lipossomais não iônicas compreendendo Novasome I (dilaurato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) e Novassoma II (diestearato de glicerila/colesterol/polioxietileno-10-estearil éter) foram usadas para distribuir um fármaco na derme da pele de camundongo. Tais formulações com agente de RNAi são úteis para o tratamento de um distúrbio dermatológico.
[734] Os lipossomas que incluem agentes de RNAi podem se tornar altamente deformáveis. Essa deformabilidade pode permitir que os lipossomas penetrem através dos poros que são menores do que o raio médio do lipossoma. Por exemplo, os transferssomas são um tipo de lipossomas deformáveis. Os transferossomas podem ser feitos adicionando ativadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Os transferossomas que incluem agente de RNAi podem ser administrados, por exemplo, por via subcutânea por infecção, a fim de administrar agente de RNAi aos queratinócitos da pele. Para atravessar a pele intacta de mamíferos, as vesículas lipídicas devem passar por uma série de poros finos, cada um com um diâmetro inferior a 50 nm, sob a influência de um gradiente transdérmico adequado. Além disso, devido às propriedades lipídicas, esses transferossomas podem ser auto-otimizantes (adaptativos ao formato dos poros, por exemplo, na pele), autorreparáveis, podendo frequentemente atingir seus alvos sem se fragmentar, muitas vezes se autocarregando.
[735] Outras formulações passíveis de revelação do presente são descritas no pedido provisório de nos de série US 61/018.616, depositado em 2 de janeiro de 2008; 61/018.611, depositado em 2 de janeiro de 2008; 61/039.748, depositado em 26 de março de 2008; 61/047.087, depositado em 22 de abril de 2008 e 61/051.528, depositado em 8 de maio de 2008. O pedido PCT nº PCT/US2007/080331, depositado em 3 de outubro de 2007 também descreve formulações que são passíveis da presente revelação.
[736] Os transferossomas são ainda outro tipo de lipossomas, e são agregados lipídicos altamente deformáveis que são candidatos atraentes para veículos de distribuição de fármacos. Os transferossomas podem ser descritos como gotículas lipídicas que são tão altamente deformáveis que são facilmente capazes de penetrar através dos poros que são menores do que a gotícula. Os transferossomas são adaptáveis ao ambiente em que são utilizados, por exemplo, são auto- otimizantes (adaptáveis ao formato dos poros da pele), autorreparáveis, frequentemente atingem seus alvos sem se fragmentar, e muitas vezes se autocarregam. Para fazer transferossomas, é possível adicionar ativadores de borda de superfície, geralmente tensoativos, a uma composição lipossomal padrão. Os transferossomas têm sido usados para fornecer albumina sérica à pele. A administração de albumina sérica mediada por transferossomas demonstrou ser tão eficaz quanto a injeção subcutânea de uma solução contendo albumina sérica.
[737] Os tensoativos encontram ampla aplicação em formulações tais como aquelas aqui descritas, particularmente em emulsões (incluindo microemulsões) e lipossomas. A forma mais comum de classificar e hierarquizar as propriedades dos diversos tipos de tensoativos, tanto naturais quanto sintéticos, é pelo uso do balanço hidrófilo/lipófilo (HLB). A natureza do grupo hidrofílico (também conhecido como “cabeça”) oferece o meio mais útil para categorizar os diferentes tensoativos usados nas formulações (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, página 285).
[738] Se a molécula de tensoativo não for ionizada, ela é classificada como um tensoativo não iônico. Os tensoativos não iônicos têm ampla aplicação em produtos farmacêuticos e cosméticos e podem ser usados em uma ampla faixa de valores de pH. Em geral, seus valores de HLB variam de 2 a cerca de 18, dependendo de sua estrutura. Os tensoativos não iônicos incluem ésteres não iônicos, tais como ésteres de etilenoglicol, ésteres de propilenoglicol, ésteres glicerílicos, ésteres poliglicerílicos, ésteres de sorbitano, ésteres de sacarose, ésteres e etoxilados. Alcanolamidas não iônicas e éteres, tais como etoxilatos de álcool graxo, álcoois propoxilados, polímeros em bloco e etoxilados/propoxilados, também estão incluídos nessa classe. Os tensoativos polioxietileno são os membros mais populares da classe dos tensoativos não iônicos.
[739] Se a molécula do tensoativo carrega uma carga negativa quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como aniônico. Os tensoativos aniônicos incluem carboxilatos, como sabões, acil lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico, como alquila sulfatos e alquila sulfatos etoxilados, sulfonatos, como alquila benzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfosuccinatos e fosfatos. Os membros mais importantes da classe dos tensoativos aniônicos são os sulfatos de alquila e os sabões.
[740] Se a molécula de tensoativo carrega uma carga positiva quando é dissolvida ou dispersa em água, o tensoativo é classificado como catiônico. Os tensoativos catiônicos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas. Os sais de amônio quaternário são os membros mais usados desta classe.
[741] Se a molécula de tensoativo tem a capacidade de carregar uma carga positiva ou negativa, o tensoativo é classificado como anfotérico. Os tensoativos anfotéricos incluem derivados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilabetainas e fosfatídeos.
[742] O uso de tensoativos em produtos farmacêuticos, formulações e em emulsões foi revisado (Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, página 285).
[743] O agente de RNAi para uso nos métodos de revelação também pode ser fornecido como formulações micelares. “Micelas” são definidas neste documento como um tipo particular de montagem molecular em que as moléculas anfipáticas são dispostas em uma estrutura esférica de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas sejam direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa circundante. O arranjo inverso existe se o ambiente for hidrofóbico.
[744] Uma formulação micelar mista adequada para distribuição através de membranas transdérmicas pode ser preparada pela mistura de uma solução aquosa da composição de siRNA, um alquil sulfato de metal alcalino C8 a C22, e um composto formador de micela. Compostos formadores de micelas exemplares incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido lático, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, monooleína, monooleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula da noite, mentol, tri-hidróxi oxo colanil glicina e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e seus análogos, éteres de polidocanol alquila e seus análogos, quenodesoxicolato, desoxicolato e suas misturas. Os compostos formadores de micelas podem ser adicionados ao mesmo tempo ou após a adição do alquil sulfato de metal alcalino. As micelas mistas se formarão com praticamente qualquer tipo de mistura dos ingredientes, mas com mistura vigorosa, a fim de fornecer micelas de tamanho menor.
[745] Em um método é preparada uma primeira composição micelar que contém a composição de siRNA e pelo menos o alquil sulfato de metal alcalino. A primeira composição micelar é então misturada com pelo menos três compostos formadores de micelas para formar uma composição micelar mista. Em outro método, a composição micelar é preparada pela mistura da composição de siRNA, o alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um dos compostos formadores de micela, seguido pela adição dos compostos formadores de micela restantes, com mistura vigorosa.
[746] Fenol e/ou m-cresol pode ser adicionado à composição micelar mista para estabilizar a formulação e proteger contra o crescimento bacteriano. Alternativamente, fenol e/ou m-cresol pode ser adicionado com os ingredientes formadores de micelas. Um agente isotônico, como glicerina, também pode ser adicionado após a formação da composição micelar mista.
[747] Para a entrega da formulação micelar como um spray, a formulação pode ser colocada em um dispensador de aerossol e o dispensador é carregado com um propulsor. O propulsor, que está sob pressão, está na forma líquida no dispensador. As proporções dos ingredientes são ajustadas de modo que as fases aquosa e do propulsor se tornem uma, ou seja, haja uma fase. Se houver duas fases, é necessário agitar o dispensador antes de dispensar uma parte do conteúdo, por exemplo, através de uma válvula dosadora. A dose dispensada de agente farmacêutico é impulsionada a partir da válvula dosadora em um spray fino.
[748] Os propulsores podem incluir clorofluorocarbonos contendo hidrogênio, fluorocarbonos contendo hidrogênio, dimetil éter e dietil éter. Em determinadas modalidades, HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) pode ser usado.
[749] As concentrações específicas dos ingredientes essenciais podem ser determinadas por experimentação relativamente simples. Para absorção pela cavidade oral, muitas vezes é desejável aumentar, por exemplo, pelo menos duas ou três vezes, a dosagem por meio de injeção ou administração pelo trato gastrointestinal.
PARTÍCULAS LIPÍDICAS
[750] Os agentes de RNAi, por exemplo, dsRNAs da revelação podem ser totalmente encapsulados em uma formulação de lipídio, por exemplo, um LNP ou outra partícula lipídica de ácido nucleico.
[751] Como usado no presente documento, o termo “LNP” refere-se a uma partícula lipídica de ácido nucleico estável. Os LNPs normalmente contêm um lipídio catiônico, um lipídio não catiônico e um lipídio que impede a agregação da partícula (por exemplo, um conjugado PEG-lipídio). Os LNPs são extremamente úteis para aplicações sistêmicas, pois exibem tempos de vida de circulação prolongados após a injeção intravenosa (i.v.) e se acumulam em locais distais (por exemplo, locais fisicamente separados do local de administração). Os LNPs incluem “pSPLP”, que inclui um complexo encapsulado de agente de condensação-ácido nucleico conforme estabelecido na Publicação PCT nº WO 00/03683. As partículas da revelação do presente tipicamente têm um diâmetro médio de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 90 nm, e são substancialmente não tóxicos. Além disso, os ácidos nucleicos quando presentes nas partículas de ácido nucleico- lipídio da presente revelação são resistentes em solução aquosa à degradação com uma nuclease. As partículas lipídicas de ácido nucleico e seu método de preparação são revelados, por exemplo, nas patentes nos US 5.976.567; 5.981.501; 6.534.484; 6.586.410;
6.815.432; publicação nº US 2010/0324120 e Publicação PCT nº WO 96/40964.
[752] Em uma modalidade, a razão de lípido para fármaco (proporção de massa/massa) (por exemplo, razão de lípido para dsRNA) estará na gama de cerca de 1:1 a cerca de 50:1, de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1, ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. Faixas intermediárias às faixas citadas acima também são contempladas como parte da revelação.
[753] Certas formulações específicas de LNP para entrega de agentes de RNAi foram descritas na técnica, incluindo, por exemplo, formulações “LNP01” conforme descrito, por exemplo, na publicação de pedido internacional nº WO
2008/042973, que é aqui incorporada por referência.
[754] As formulações de lipídio-dsRNA exemplificativas adicionais são identificadas na tabela abaixo. lipídio catiônico/lipídio não Lipídio Ionizável/Catiônico catiônico/colesterol/con jugado PEG-lipídio razão lipídio:siRNA DLinDMA/DPPC/Colesterol/ SNAL l,2-Dilinoleniloxi-N,N- PEG-cDMA P-1 dimetilaminopropano (DLinDMA) (57,1/7,1/34,4/1,4) lipídio:siRNA ~ 7:1 XTC/DPPC/Colesterol/PEG- 2,2-Dilinoleil-4- 2- cDMA dimetilaminoetil-[1,3]- XTC 57,1/7,1/34,4/1,4 dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 7:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG- 2,2-Dilinoleil-4- LNP0 DMG dimetilaminoetil-[1,3]- 5 57,5/7,5/31,5/3,5 dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 6:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG- 2,2-Dilinoleil-4- LNP0 DMG dimetilaminoetil-[1,3]- 6 57,5/7,5/31,5/3,5 dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 11:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG- 2,2-Dilinoleil-4- LNP0 DMG dimetilaminoetil-[1,3]- 7 60/7,5/31/1,5, dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 6:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG- 2,2-Dilinoleil-4- LNP0 DMG dimetilaminoetil-[1,3]- 8 60/7,5/31/1,5, dioxolano (XTC) lipídio:siRNA ~ 11:1 XTC/DSPC/Colesterol/PEG- 2,2-Dilinoleil-4- LNP0 DMG dimetilaminoetil-[1,3]- 9 50/10/38,5/1,5 dioxolano (XTC) Lipídio:siRNA 10:1 LNP1 (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2- ALN100/DSPC/Colesterol/P 0 di((9Z,12Z)-octadeca-9,12- EG-DMG lipídio catiônico/lipídio não Lipídio Ionizável/Catiônico catiônico/colesterol/con jugado PEG-lipídio razão lipídio:siRNA dienil)tetra-hidro-3aH- 50/10/38,5/1,5 ciclopenta[d][1,3]dioxol-5- Lipídio:siRNA 10:1 amina (ALN100) MC- Butanoato (6Z,9Z,28Z,31Z)- 3/DSPC/Colesterol/PEG- LNP1 heptatriaconta-6,9,28,31-
DMG 1 tetraen-19-il 4- 50/10/38,5/1,5 (dimetilamino) (MC3) Lipídio:siRNA 10:1 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2- Tech hidroxidodecil)amino)etil)(2- G1/DSPC/Colesterol/PEG- LNP1 hidroxidodecil)amino)etil)pip
DMG 2 erazin-1- 50/10/38,5/1,5 il)etilazanediil)didodecan-2- Lipídio:siRNA 10:1 ol (Tech G1) XTC/DSPC/Col/PEG-DMG LNP1 XTC 50/10/38,5/1,5 3 Lipídio:siRNA: 33:1 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG LNP1 MC3 40/15/40/5 4 Lipídio:siRNA: 11:1 MC3/DSPC/Col/PEG- LNP1 DSG/GalNAc-PEG-DSG MC3 5 50/10/35/4,5/0,5 Lipídio:siRNA: 11:1 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG LNP1 MC3 50/10/38,5/1,5 6 Lipídio:siRNA: 7:1 MC3/DSPC/Col/PEG-DSG LNP1 MC3 50/10/38,5/1,5 7 Lipídio:siRNA: 10:1 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG LNP1 MC3 50/10/38,5/1,5 8 Lipídio:siRNA: 12:1 LNP1 MC3/DSPC/Col/PEG-DMG MC3 9 50/10/35/5 lipídio catiônico/lipídio não Lipídio Ionizável/Catiônico catiônico/colesterol/con jugado PEG-lipídio razão lipídio:siRNA Lipídio:siRNA: 8:1 MC3/DSPC/Col/PEG-DPG LNP2 MC3 50/10/38,5/1,5 0 Lipídio:siRNA: 10:1 C12-200/DSPC/Col/PEG-DSG LNP2 C12-200 50/10/38,5/1,5 1 Lipídio:siRNA: 7:1 XTC/DSPC/Col/PEG-DSG LNP2 XTC 50/10/38,5/1,5 2 Lipídio:siRNA: 10:1
[755] DSPC: distearoilfosfatidilcolina.
[756] DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina.
[757] PEG-DMG: PEG-didimiristoil glicerol (C14- PEG ou PEG-C14) (PEG com peso molecular médio de 2.000).
[758] PEG-DSG: PEG-distiril glicerol (C18-PEG, ou PEG-C18) (PEG com peso molecular médio de 2.000).
[759] PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2- dimiristiloxipropilamina (PEG com peso molecular médio de
2.000).
[760] SNALP (1,2-Dilinoleniloxi-N,N- dimetilaminopropano (DLinDMA)) compreendendo formulações são descritos na publicação internacional nº WO2009/127060, depositada em 15 de abril de 2009, que é aqui incorporada por referência.
[761] XTC compreendendo formulações são descritos na publicação PCT nº WO 2010/088537, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência.
[762] MC3 compreendendo são descritas, por exemplo, na publicação nº US 2010/0324120, depositada em 10 de junho de 2010, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[763] ALNY-100 compreendendo formulações são descritos na publicação PCT nº WO 2010/054406, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[764] C12-200 compreendendo formulações são descritos na publicação PCT nº WO 2010/129709, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência.
[765] As composições e formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, micropartículas, nanopartículas, suspensões ou soluções em água ou meio não aquoso, cápsulas, cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsificantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. Em algumas modalidades, as formulações orais são aquelas em que os dsRNAs apresentados na revelação são administrados em conjunto com um ou mais tensoativos e quelantes potenciadores de penetração. Os tensoativos adequados incluem ácidos graxos e/ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos biliares e/ou sais dos mesmos. Ácidos/sais biliares adequados incluem ácido quenodesoxicólico (CDCA) e ácido ursodeoxicenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido desidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, ácido tauro-24,25-diidro-fusidato e glicodidrofusidato de sódio. Os ácidos graxos adequados incluem ácido araquidônico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, gliceril 1-monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan-2- ona, uma acilcarnitina, uma acilcolina ou um monoglicerídeo, um diglicerídeo ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos (por exemplo, sódio). Em algumas modalidades, combinações de intensificadores de penetração são usadas, por exemplo, ácidos/sais graxos em combinação com ácidos/sais biliares.
Uma combinação exemplificativa é o sal de sódio de ácido láurico, ácido cáprico e UDCA.
Outros intensificadores de penetração incluem polioxietileno-9-lauril éter, polioxietileno-20-cetil éter.
Os DsRNAs apresentados na revelação podem ser administrados por via oral, na forma granular, incluindo partículas secas pulverizadas, ou complexados para formar micro ou nanopartículas.
Os agentes complexantes de DsRNA incluem poli-aminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos, polioxetanos, polialquilcianoacrilatos; gelatinas, albuminas, amidos, acrilatos, polietilenoglicois (PEG) e amidos cationizados; polialquilcianoacrilatos; poliiminas, polulanos, celuloses e amidos derivados de DEAE.
Os agentes complexantes adequados incluem quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, poli- histidina, poliornitina, polisperminas, protamina, polivinilapiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminoestireno (por exemplo, p-amino, poliacrilato), poli (metilcianoacrilato)), poli (butilcianoacrilato), poli (isobutilcianoacrilato), poli (isohexilcianoacrilato), DEAE- metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE- albumina e DEAE-polilacrilato, polimetilacrilato (ácido metilacrilato), poli (ácido DL-lático-co-glicólico (PLGA),
alginato e polietilenoglicol (PEG). As formulações orais para dsRNAs e sua preparação são descritas em detalhes na patente US 6.887.906, publicação nº US e patente nº US 6.747.014, cada uma das quais é aqui incorporada por referência.
[766] As composições e formulações para administração parenteral, intraparenquimal (no cérebro), intratecal, intraventricular ou intra-hepática podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, mas não se limitando a intensificadores de penetração, compostos de carreador e outros veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[767] As composições farmacêuticas da presente revelação incluem, mas não estão limitadas a soluções, emulsões e formulações contendo lipossomas. Essas composições podem ser geradas a partir de uma variedade de componentes que incluem, mas não estão limitados a líquidos pré-formados, sólidos autoemulsificantes e semissólidos autoemulsificantes. São particularmente preferenciais as formulações que têm como alvo o cérebro no tratamento de doenças associadas à APP ou distúrbios.
[768] As formulações farmacêuticas da presente revelação, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Essas técnicas incluem a etapa de associar os ingredientes ativos ao carreador ou excipiente farmacêutico (ou aos carreadores ou excipientes farmacêuticos). Em geral, as formulações são preparadas associando de maneira uniforme e íntima os princípios ativos com veículos líquidos ou sólidos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, modelando o produto.
[769] As composições da presente revelação podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis, tais como, mas não se limitando a comprimidos, cápsulas, cápsulas gelatinosas, xaropes líquidos, géis moles, supositórios e enemas. As composições da presente revelação também podem ser formuladas como suspensões em meio aquoso, não aquoso ou misto. As suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizadores.
FORMULAÇÕES ADICIONAIS I. EMULSÕES
[770] As composições da presente revelação podem ser preparadas e formuladas como emulsões. As emulsões são sistemas tipicamente heterogêneos de um líquido disperso em outro na forma de gotículas geralmente excedendo 0,1 µm de diâmetro (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 199; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, Volume 1, página 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 2, página 335; Higuchi et al., em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, página 301).
As emulsões são frequentemente sistemas bifásicos que compreendem duas fases líquidas imiscíveis intimamente misturadas e dispersas uma na outra. Em geral, as emulsões podem ser da variedade água em óleo (a/o) ou óleo em água (o/a). Quando uma fase aquosa é finamente dividida em e dispersa como gotículas diminutas em uma fase oleosa em massa, a composição resultante é chamada de emulsão água-em-óleo (a/o). Alternativamente, quando uma fase oleosa é finamente dividida em e dispersa como gotículas diminutas em uma fase aquosa a granel, a composição resultante é chamada de emulsão óleo-em-água (o/a). As emulsões podem conter componentes adicionais além das fases dispersas, e o fármaco ativo pode estar presente como uma solução em qualquer fase aquosa, fase oleosa ou ele próprio como uma fase separada. Excipientes farmacêuticos, como emulsificantes, estabilizantes, corantes e antioxidantes também podem estar presentes em emulsões, conforme necessário. Emulsões farmacêuticas também podem ser emulsões múltiplas que são compostas por mais de duas fases, como, por exemplo, no caso de emulsões de óleo em água em óleo (o/a/o) e água em óleo em água (a/o/a). Essas formulações complexas frequentemente fornecem certas vantagens que as emulsões binárias simples não oferecem. Emulsões múltiplas em que gotículas de óleo individuais de uma emulsão o/a encerram pequenas gotículas de água constituem uma emulsão a/o/a. Da mesma forma, um sistema de gotículas de óleo encerradas em glóbulos de água estabilizados em uma fase oleosa contínua oferece uma emulsão o/a/o.
[771] As emulsões são caracterizadas por pouca ou nenhuma estabilidade termodinâmica. Muitas vezes, a fase dispersa ou descontínua da emulsão é bem dispersa na fase externa ou contínua e mantida nesta forma por meio de emulsificantes ou da viscosidade da formulação. Qualquer uma das fases da emulsão pode ser semissólida ou sólida, como é o caso das bases para pomadas e cremes do tipo emulsão. Outros meios de estabilizar emulsões envolvem o uso de emulsificantes que podem ser incorporados em qualquer uma das fases da emulsão. Os emulsificantes podem ser amplamente classificados em quatro categorias: tensoativos sintéticos, emulsificantes naturais, bases de absorção e sólidos finamente dispersos (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC. , 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1 , página 199).
[772] Os tensoativos sintéticos, também conhecidos como agentes tensoativos, encontraram ampla aplicabilidade na formulação de emulsões e foram revisados na literatura (ver, por exemplo, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems de Ansel, Allen, LV., Popovich NG ., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 285; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, volume 1, página 199). Os tensoativos são tipicamente anfifílicos e compreendem uma porção hidrofílica e hidrofóbica. A razão da natureza hidrofílica para a hidrofóbica do tensoativo foi denominada equilíbrio hidrófilo/lipófilo (HLB) e é uma ferramenta valiosa na categorização e seleção de tensoativos na preparação de formulações. Os tensoativos podem ser classificados em diferentes classes com base na natureza do grupo hidrofílico: não iônico, aniônico, catiônico e anfotérico (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), Nova York, NY Rieger, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 285).
[773] Os emulsionantes de ocorrência natural usados em formulações de emulsão incluem lanolina, cera de abelha, fosfatídeos, lecitina e acácia. As bases de absorção possuem propriedades hidrofílicas, de modo que possam absorver água para formar emulsões a/o e, ainda assim, reter suas consistências semissólidas, como a lanolina anidra e o petrolato hidrofílico. Os sólidos finamente divididos também têm sido usados como bons emulsionantes, especialmente em combinação com tensoativos e em preparações viscosas. Esses incluem sólidos inorgânicos polares, como hidróxidos de metais pesados, argilas sem dilatação, como bentonita, atapulgita, hectorita, caulim, montmorilonita, silicato de alumínio coloidal e silicato de alumínio de magnésio coloidal, pigmentos e sólidos não polares, como carbono ou triestearato de glicerila.
[774] Uma grande variedade de materiais não emulsificantes também está incluída nas formulações de emulsões e contribui para as propriedades das emulsões. Essas incluem gorduras, óleos, ceras, ácidos graxos, álcoois graxos, ésteres graxos, umectantes, coloides hidrofílicos,
conservantes e antioxidantes (Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 335; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 199).
[775] Os coloides ou hidrocoloides hidrofílicos incluem gomas e polímeros sintéticos de ocorrência natural, tais como polissacarídeos (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, carragenina, goma guar, goma karaya e tragacanto), derivados de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose e carboxipropilcelulose) e polímeros sintéticos (por exemplo, carbômeros, éteres de celulose e polímeros de carboxivinila). Esses se dispersam ou incham na água para formar soluções coloidais que estabilizam as emulsões, formando fortes filmes interfaciais em torno das gotículas da fase dispersa e aumentando a viscosidade da fase externa.
[776] Uma vez que as emulsões geralmente contêm uma série de ingredientes, como carboidratos, proteínas, esteróis e fosfatídeos que podem apoiar prontamente o crescimento de micróbios, essas formulações frequentemente incorporam conservantes. Os conservantes comumente usados incluídos em formulações de emulsão incluem metil parabeno, propil parabeno, sais de amônio quaternário, cloreto de benzalcônio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico e ácido bórico. Os antioxidantes também são comumente adicionados às formulações de emulsão para prevenir a deterioração da formulação. Os antioxidantes utilizados podem ser sequestrantes de radicais livres como tocoferois, galatos de alquila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ou agentes redutores como ácido ascórbico e metabissulfito de sódio, e antioxidantes sinérgicos como ácido cítrico, ácido tartárico e lecitina.
[777] A aplicação de formulações de emulsão por meio de vias dermatológicas, orais e parenterais e métodos para sua fabricação foram revisados na literatura (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG, e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York , NY, volume 1, página 199). As formulações de emulsão para administração oral têm sido amplamente utilizadas devido à facilidade de formulação, bem como à eficácia do ponto de vista de absorção e biodisponibilidade (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., e Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY , volume 1, página 245; Idson, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 199). Laxantes à base de óleo mineral, vitaminas solúveis em óleo e preparações nutritivas com alto teor de gordura estão entre os materiais que têm sido comumente administrados por via oral como emulsões o/w. II. MICROEMULSÕES
[778] Em uma modalidade da presente revelação, as composições de agentes de RNAi e ácidos nucleicos são formuladas como microemulsões. Uma microemulsão pode ser definida como um sistema de água, óleo e anfifilo que é uma única solução líquida opticamente isotrópica e termodinamicamente estável (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms e Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., E Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 245). Normalmente, as microemulsões são sistemas que são preparados dispersando primeiro um óleo em uma solução tensoativa aquosa e, em seguida, adicionando uma quantidade suficiente de um quarto componente, geralmente um álcool de comprimento de cadeia intermediário para formar um sistema transparente. Portanto, as microemulsões também foram descritas como dispersões termodinamicamente estáveis e isotropicamente claras de dois líquidos imiscíveis que são estabilizados por filmes interfaciais de moléculas tensoativas (Leung e Shah, em: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, páginas 185 a 215). As microemulsões comumente são preparadas por meio de uma combinação de três a cinco componentes que incluem óleo, água, tensoativo, cotensoativo e eletrólito. Se a microemulsão é do tipo água-em-óleo (a/o) ou óleo-em-água (o/a) é dependente das propriedades do óleo e do tensoativo utilizado e da estrutura e empacotamento geométrico das cabeças de polos e caudas de hidrocarbonetos das moléculas tensoativas (Schott, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, página 271).
[779] A abordagem fenomenológica que utiliza diagramas de fase foi extensivamente estudada e rendeu um conhecimento abrangente, para alguém versado na técnica, de como formular microemulsões (ver, por exemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., E Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8ª ed.), New York, NY; Rosoff, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 245; Block, em Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger e Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, volume 1, página 335) Em comparação com as emulsões convencionais, as microemulsões oferecem a vantagem de solubilizar fármacos insolúveis em água em uma formulação de gotículas termodinamicamente estáveis que são formadas espontaneamente.
[780] Os tensoativos usados na preparação de microemulsões incluem, mas não estão limitados a tensoativos iônicos, tensoativos não iônicos, Brij 96, éteres de oleil de polioxietileno, ésteres de ácido graxo de poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaglicerol decaoleato (DAO750), isoladamente. O cotensoativo, geralmente um álcool de cadeia curta como o etanol, 1-propanol e 1-butanol, serve para aumentar a fluidez interfacial por penetrar no filme tensoativo e consequentemente criar um filme desordenado devido ao espaço vazio gerado entre as moléculas tensoativas. As microemulsões podem, no entanto, ser preparadas sem o uso de sistemas de microemulsão autoemulsionantes cotensoativos e sem álcool que são conhecidos na técnica. A fase aquosa pode ser tipicamente, mas não está limitada à água, uma solução aquosa do fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceróis, propilenoglicóis e derivados de etilenoglicol. A fase oleosa pode incluir, mas não está limitada a materiais como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos graxos, mono, di e triglicerídeos de cadeia média (C8-C12), ésteres de ácidos graxos gliceril polioxietilados, álcoois graxos, glicerídeos poliglicolizados, glicerídeos C8-C10 poliglicolizados saturados, óleos vegetais e óleo de silicone.
[781] As microemulsões são particularmente de interesse do ponto de vista da solubilização de fármacos e da absorção aumentada de fármacos. As microemulsões à base de lipídios (ambos o/a e a/o) foram propostas para aumentar a biodisponibilidade oral de fármacos, incluindo peptídeos (ver, por exemplo, patentes nos US 6.191.105; 7.063.860; 7.070.802;
7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1.385 a 1.390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). As microemulsões proporcionam vantagens de melhor solubilização do fármaco, proteção do fármaco contra hidrólise enzimática, possível aumento da absorção do fármaco devido a alterações induzidas por tensoativo na fluidez e permeabilidade da membrana, facilidade de preparação, facilidade de administração oral sobre formas farmacêuticas sólidas, potência clínica melhorada e toxicidade diminuída (ver, por exemplo, patentes nos US 6.191.105;
7.063.860; 7.070.802; 7.157.099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138 a 143). Muitas vezes, as microemulsões podem se formar espontaneamente quando seus componentes são colocados juntos em temperatura ambiente. Isso pode ser particularmente vantajoso ao formular fármacos termolábeis, peptídeos ou agentes de RNAi. As microemulsões também têm sido eficazes na entrega transdérmica de componentes ativos em aplicações cosméticas e farmacêuticas. Espera-se que as composições e formulações de microemulsões da presente revelação facilitem o aumento da absorção sistêmica de agentes de RNAi e ácidos nucleicos do trato gastrointestinal, bem como melhorem a captação celular local de agentes de RNAi e ácidos nucleicos.
[782] As microemulsões da presente revelação também podem conter componentes e aditivos adicionais, como monoestearato de sorbitano (Grill 3), Labrasol e potenciadores de penetração para melhorar as propriedades da formulação e aumentar a absorção dos agentes de RNAi e ácidos nucleicos da presente revelação. Os intensificadores de penetração usados nas microemulsões da presente revelação podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco grandes categorias - tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não tensoativos não quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92). Cada uma dessas classes foi discutida acima. III. MICROPARTÍCULAS
[783] Um agente de RNAi da revelação pode ser incorporado em uma partícula, por exemplo, uma micropartícula. As micropartículas podem ser produzidas por secagem por pulverização, mas também podem ser produzidas por outros métodos, incluindo liofilização, evaporação, secagem em leito fluido, secagem a vácuo ou uma combinação dessas técnicas. IV. INTENSIFICADORES DE PENETRAÇÃO
[784] Em uma modalidade, a presente revelação emprega vários intensificadores de penetração para efetuar a entrega eficiente de ácidos nucleicos, particularmente agentes de RNAi, à pele de animais. A maioria dos fármacos está presente em solução nas formas ionizada e não ionizada. No entanto, geralmente apenas fármacos lipofílicos ou lipossolúveis atravessam facilmente as membranas celulares. Foi revelado que mesmo fármacos não lipofílicos podem atravessar membranas celulares se a membrana a ser cruzada for tratada com um intensificador de penetração. Além disso, ao auxiliar na difusão de fármacos não lipofílicos pelas membranas da célula, os intensificadores de penetração também aumentam a permeabilidade dos fármacos lipofílicos.
[785] Os intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma das cinco grandes categorias, ou seja, tensoativos, ácidos graxos, sais biliares, agentes quelantes e não tensoativos não quelantes (ver por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92). Cada uma das classes de intensificadores de penetração mencionadas acima é descrita a seguir em maiores detalhes.
[786] Os tensoativos (ou “agentes tensoativos”) são entidades químicas que, quando dissolvidas em uma solução aquosa, reduzem a tensão superficial da solução ou a tensão interfacial entre a solução aquosa e outro líquido, resultando na absorção de agentes de RNAi através da mucosa são aumentados. Além dos sais biliares e ácidos graxos, esses intensificadores de penetração incluem, por exemplo, lauril sulfato de sódio, polioxietileno-9-lauril éter e polioxietileno-20-cetil éter) (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e emulsões perfluorquímicas, como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
[787] Vários ácidos graxos e seus derivados que atuam como intensificadores de penetração incluem, por exemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n- decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolênico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidônico, glicerol 1-monocaprato, 1- dodecilazaciclo-heptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres C1-20 alquila dos mesmos (por exemplo, metila, isopropila e t-butila), e mono e diglicerídeos dos mesmos (ou seja, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (ver, por exemplo, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 a 33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651 a 654).
[788] O papel fisiológico da bile inclui a facilitação da dispersão e absorção de lipídios e vitaminas lipossolúveis (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38, em: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ª Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, páginas 934 a 935). Vários sais biliares naturais, e seus derivados sintéticos, atuam como intensificadores de penetração. Assim, o termo “sais biliares” inclui qualquer um dos componentes naturais da bile, bem como qualquer um de seus derivados sintéticos. Os sais biliares adequados incluem, por exemplo, ácido cólico (ou seu sal de sódio farmaceuticamente aceitável, colato de sódio), ácido desidrocolato (desidrocolato de sódio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sódio), ácido glucólico (glucolato de sódio), ácido glicólico (glicocolato de sódio), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato de sódio), ácido taurocólico (taurocolato de sódio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato de sódio), ácido quenodesoxicólico (quenodeoxicolato de sódio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-diidro-fusidato de sódio (STD-Hidroglicidrato de sódio) e polioxietileno-9-lauril éter (POE) (ver, por exemplo, Malmsten, M. Surfactants e polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39, em: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782 a 783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 a 33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579 a 583).
[789] Os agentes quelantes, conforme usados em conexão com a presente revelação, podem ser definidos como compostos que removem íons metálicos da solução formando complexos com os mesmos, com o resultado de que a absorção de agentes de RNAi através da mucosa é aumentada. Com relação ao seu uso como intensificadores de penetração na presente revelação, os agentes quelantes têm a vantagem de servir também como inibidores da DNase, pois a maioria das nucleases de DNA caracterizadas requer um íon metálico divalente para a catálise e é, portanto, inibida por agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315 a 339). Os agentes quelantes adequados incluem, mas não estão limitados a etilenodiaminotetraacetato dissódico (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por exemplo, salicilato de sódio, 5- metoxisalicilato e homovanilato), derivados de N-acil de colágeno, lauriléter-9 e derivados de N-aminoacil de beta- dicetonas (enaminas) (ver, por exemplo, Katdare, A. et al., Excipient development for Pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 a 33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43 a 51).
[790] Como usado no presente documento, compostos não tensoativos não quelantes que aumentam a penetração podem ser definidos como compostos que demonstram atividade insignificante como agentes quelantes ou como tensoativos, mas que, no entanto, aumentam a absorção de agentes de RNAi através da mucosa alimentar (ver, por exemplo, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1 a 33). Essa classe de intensificadores de penetração inclui, por exemplo, ureias cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquila- e 1-alquenilazaciclo-alcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); e agentes anti-inflamatórios não esteroides, tais como diclofenaco de sódio, indometacina e fenilbutazona
(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621 a 626).
[791] Os agentes que aumentam a absorção de agentes de RNAi no nível celular também podem ser adicionados às composições farmacêuticas e outras composições da presente revelação. Por exemplo, lipídios catiônicos, como a lipofectina (Junichi et al, patente US 5.705.188), derivados catiônicos de glicerol e moléculas policatiônicas, como a polilisina (Lollo et al., pedido PCT WO 97/30731), também são conhecidos para aumentar a captação celular de dsRNAs. Exemplos de reagentes de transfecção comercialmente disponíveis incluem, por exemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStyle™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 CD (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Reagente de Transfecção X- tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente de Transfecção Lipossomal DOTAP (Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente de Transfecção Lipossomal DOSPER (Grenzacherstrasse, Suíça) ou Fugene (Grenzacherstrasse, Suíça), Reagente Transfectam® (Promega; Madison, WI), Reagente de Transfecção TransFast™ (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), Reagente Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, França), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, França), Reagente de Transfecção TransPassª D1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EUA), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EUA), Reagente de
Transfecção PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção de Citofectina (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EUA), Reagente de Transfecção TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EUA), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EUA), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EUA) ou HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EUA), entre outros.
[792] Outros agentes podem ser utilizados para aumentar a penetração dos ácidos nucleicos administrados, incluindo glicóis, como etilenoglicol e propilenoglicol, pirróis, como 2-pirrol, azonas e terpenos, como limoneno e mentona. V. CARREADORES
[793] Certas composições da presente revelação também incorporam compostos carreadores na formulação. Como usado no presente documento, “composto carreador” ou “carreador” pode se referir a um ácido nucleico, ou análogo deste, que é inerte (ou seja, não possui atividade biológica por si só), mas é reconhecido como um ácido nucleico por processos in vivo que reduzem a biodisponibilidade de um ácido nucleico com atividade biológica, por exemplo, degradando o ácido nucleico biologicamente ativo ou promovendo sua remoção da circulação. A coadministração de um ácido nucleico com um composto carreador, tipicamente com excesso dessa última substância, pode resultar em uma redução substancial da quantidade de ácido nucleico recuperado no fígado, rim ou outros reservatórios extracirculatórios, presumivelmente devido à competição entre o composto carreador e o ácido nucleico de um receptor comum. Por exemplo, a recuperação de um dsRNA parcialmente fosforotioato no tecido hepático pode ser reduzida quando ele é coadministrado com ácido polinossínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico ou ácido 4-acetamido-4'isotiociano-estilbeno-2,2'-dissulfônico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115 a 121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177 a 183. VI. EXCIPIENTES
[794] Ao contrário de um composto carreador, um “carreador farmacêutico” ou “excipiente” é um solvente farmaceuticamente aceitável, agente de suspensão ou qualquer outro veículo farmacologicamente inerte para a entrega de um ou mais ácidos nucleicos a um animal. O excipiente pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com a forma planejada de administração em mente, de modo a fornecer o volume, consistência desejados, etc., quando combinado com um ácido nucleico e os outros componentes de uma dada composição farmacêutica. Os carreadores farmacêuticos típicos incluem, mas não estão limitados a agentes ligantes (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilapirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose, etc.); cargas (por exemplo, lactose e outros açúcares, celulose microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de cálcio, etilcelulose, poliacrilatos ou fosfato de hidrogênio de cálcio, etc.); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica, dióxido de silício coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, óleos vegetais hidrogenados, amido de milho, polietileno glicóis, benzoato de sódio, acetato de sódio, etc.); desintegrantes (por exemplo, amido, glicolato de amido sódico, etc.); e agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio, etc.).
[795] Os excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem de forma deletéria com ácidos nucleicos também podem ser usados para formular as composições da presente revelação. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados à água, soluções de sal, álcoois, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilapirrolidona e semelhantes.
[796] As formulações para administração tópica de ácidos nucleicos podem incluir soluções aquosas estéreis e não estéreis, soluções não aquosas em solventes comuns, como álcoois ou soluções de ácidos nucleicos em bases líquidas ou sólidas de óleo. As soluções também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. Os excipientes orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis adequados para administração não parenteral que não reagem de forma deletéria com ácidos nucleicos podem ser usados.
[797] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados à água, soluções de sal, álcool, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulose, polivinilapirrolidona e semelhantes.
VII. OUTROS COMPONENTES
[798] As composições da presente revelação podem conter adicionalmente outros componentes adjuntos convencionalmente encontrados nas composições farmacêuticas, em seus níveis de uso estabelecidos na técnica. Assim, por exemplo, as composições podem conter materiais farmaceuticamente ativos adicionais compatíveis, tais como, por exemplo, antipruríticos, adstringentes, anestésicos locais ou agentes anti-inflamatórios, ou podem conter materiais adicionais úteis na formulação física de várias formas de dosagem das composições da presente revelação, como corantes, aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, espessantes e estabilizantes. Porém, tais materiais, quando adicionados, não devem interferir indevidamente nas atividades biológicas dos componentes das composições da presente revelação. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e semelhantes que fazem não interagir de forma deletéria com o ácido nucleico (ou os ácidos nucleicos) da formulação.
[799] As suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizadores.
[800] Em algumas modalidades, AS composições farmacêuticas apresentadas na revelação incluem (a) um ou mais agentes de RNAi e (b) um ou mais agentes que funcionam por um mecanismo não RNAi e que são úteis no tratamento de um distúrbio associado à APP. Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados a um agente anti-inflamatório, agente antiesteatose, agente antiviral e/ou antifibrose ou outro agente incluído para tratar DA (incluindo EOFAD) e/ou CAA em um sujeito.
[801] A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão da dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Os compostos que exibem altos índices terapêuticos são preferenciais.
[802] Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para uso em humanos. A dosagem das composições aqui apresentadas na revelação encontra-se geralmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto usado nos métodos apresentados na revelação, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de célula. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir um intervalo de concentração plasmática circulante do composto ou, quando apropriado, do produto polipeptídico de sequência- alvo (por exemplo, alcançar uma concentração reduzida do polipeptídeo) que inclui a IC50 (ou seja, a concentração do composto de teste que atinge metade do máximo de inibição dos sintomas) conforme determinado na cultura da célula. Essas informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.
[803] Além de sua administração, conforme discutido acima, os agentes de RNAi apresentados na revelação podem ser administrados em combinação com outros agentes conhecidos eficazes no tratamento de processos patológicos mediados pela expressão de APP. Em qualquer caso, o médico assistente pode ajustar a quantidade e o tempo de administração do agente de RNAi com base nos resultados observados usando medidas padrão de eficácia conhecidas na técnica ou aqui descritas. VIII. KITS
[804] Em certos aspectos, a presente revelação oferece kits que incluem um recipiente adequado contendo uma formulação farmacêutica de um composto de siRNA, por exemplo, um composto de siRNA de duplo filamento ou composto de ssiRNA, (por exemplo, um precursor, por exemplo, um composto de siRNA maior que pode ser processado em um composto de ssiRNA, ou um DNA que codifica um composto de siRNA, por exemplo, um composto de siRNA de duplo filamento ou composto de ssiRNA ou seu precursor). Em determinadas modalidades, os componentes individuais da formulação farmacêutica podem ser fornecidos em um recipiente. Alternativamente, pode ser desejável fornecer os componentes da formulação farmacêutica separadamente em dois ou mais recipientes, por exemplo, um recipiente para uma preparação do composto de siRNA, e pelo menos outro para um composto carreador. O kit pode ser embalado em várias configurações diferentes, como um ou mais recipientes em uma única caixa. Os diferentes componentes podem ser combinados, por exemplo, de acordo com as instruções fornecidas com o kit. Os componentes podem ser combinados de acordo com um método aqui descrito, por exemplo, para preparar e administrar uma composição farmacêutica. O kit também pode incluir um dispositivo de entrega. IX. MÉTODOS PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE APP
[805] a presente revelação também oferece métodos de inibição da expressão de um gene de APP em uma célula. Os métodos incluem o contato de uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, agente de RNAi de duplo filamento, em uma quantidade eficaz para inibir a expressão de APP na célula, inibindo assim uma expressão de APP na célula. Em determinadas modalidades da revelação, a APP é inibida preferencialmente em células do SNC (por exemplo, cérebro).
[806] O contato de uma célula com um agente de RNAi, por exemplo, um agente de RNAi de duplo filamento, pode ser feito in vitro ou in vivo. O contato de uma célula in vivo com o agente de RNAi inclui o contato de uma célula ou grupo de células dentro de um sujeito, por exemplo, um sujeito humano, com o agente de RNAi. Combinações de métodos in vitro e in vivo de contato com uma célula também são possíveis.
[807] O contato com uma célula pode ser direto ou indireto, conforme discutido acima. Além disso, o contato com uma célula pode ser realizado por meio de um ligante de alvejamento, incluindo qualquer ligante aqui descrito ou conhecido na técnica. Em algumas modalidades, o ligante de alvejamento é um grupamento de carboidrato, por exemplo, um ligante C16 ou qualquer outro ligante que direcione o agente de RNAi para um local de interesse.
[808] O termo “inibir”, como usado no presente documento, é usado alternadamente com “reduzir”, “silenciar”, “regular para baixo”, “suprimir” e outros termos semelhantes, e inclui qualquer nível de inibição. Em determinadas modalidades, um nível de inibição, por exemplo, para um agente de RNAi da presente revelação, pode ser avaliada em condições de cultura de célula, por exemplo, em que as células em cultura celular são transfectadas por meio de transfecção mediada por LipofectamineTM em uma concentração nas proximidades de uma célula de 10 nM ou menos, 1 nM ou menos, etc. O knockdown de um determinado agente de RNAi pode ser determinado por meio de comparação de níveis pré-tratados na cultura da célula versus níveis pós-tratados na cultura da célula, opcionalmente também comparando com células tratadas em paralelo com um agente de RNAi misturado ou outra forma de controle. O knockdown em cultura de células, por exemplo, de pelo menos 10% ou mais, pelo menos 20% ou mais, etc. pode, assim, ser identificado como indicativo de que a “inibição” e/ou “redução”, “diminuição” ou “supressão”, etc., tenha ocorrido. É expressamente contemplado que a avaliação dos níveis de proteína codificada e/ou de mRNA direcionado (e, portanto, uma extensão de “inibição”, etc., causada por um agente de RNAi da revelação) também pode ser avaliada em sistemas in vivo para os agentes de RNAi da presente revelação, sob condições devidamente controladas conforme descrito na técnica.
[809] A frase “inibindo a expressão de uma APP”, como usado no presente documento, inclui a inibição da expressão de qualquer gene de APP (como, por exemplo, um gene de rato de APP, um gene de rato de APP, um gene de macaco de APP, ou um gene humano de APP), bem como variantes ou mutantes de um gene de APP que codificam uma proteína de APP. Assim, o gene de APP pode ser um gene de APP de tipo selvagem, um gene mutante de APP ou um gene transgênico de APP no contexto de uma célula, grupo de células ou organismo geneticamente manipulado.
[810] “Inibição de expressão de um gene de APP” inclui qualquer nível de inibição de um gene de APP, por exemplo, pelo menos supressão parcial da expressão de um gene de APP, como uma inibição por pelo menos cerca de 20%. Em determinadas modalidades, a inibição é pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99%.
[811] A expressão de um gene de APP pode ser avaliada com base no nível de qualquer variável associada ao gene de expressão de APP, por exemplo, nível de mRNA de APP ou nível de proteína de APP (incluindo produtos de clivagem de APP). A expressão de uma APP também pode ser avaliada indiretamente com base nos níveis de biomarcadores associados à APP como descrito no presente documento.
[812] A inibição pode ser avaliada por uma diminuição em um nível absoluto ou relativo de uma ou mais dessas variáveis em comparação com um nível de controle. O nível de controle pode ser qualquer tipo de nível de controle que é utilizado na técnica, por exemplo, um nível de linha de base pré-dose ou um nível determinado a partir de um sujeito semelhante, célula, ou amostra que não é tratada ou tratada com um controle (tal como, por exemplo, controle apenas de tampão ou controle de agente inativo).
[813] Em determinadas modalidades, os marcadores substitutos podem ser usados para detectar a inibição de APP. Por exemplo, a prevenção ou tratamento eficaz de um distúrbio associado à APP, por exemplo, um distúrbio do SNC, como EOFAD, CAA ou outro distúrbio, conforme demonstrado por critérios de diagnóstico e monitoramento aceitáveis com um agente para reduzir a expressão de APP, pode ser entendido como demonstrando uma redução clinicamente relevante na APP.
[814] Em algumas modalidades dos métodos de revelação, a expressão de um gene de APP é inibida por pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%, ou abaixo do nível de detecção do ensaio. Em determinadas modalidades, os métodos incluem uma inibição clinicamente relevante da expressão de APP, por exemplo, conforme demonstrado por um resultado clinicamente relevante após o tratamento de um sujeito com um agente para reduzir a expressão de APP.
[815] A inibição da expressão de um gene de APP pode ser manifestada por uma redução da quantidade de mRNA expresso por uma primeira célula ou grupo de células (tais células podem estar presentes, por exemplo, em uma amostra derivada de um sujeito) em que um gene de APP é transcrito e que já foi tratado (por exemplo, colocando a célula ou células em contato com um agente de RNAi da revelação, ou administrando um agente de RNAi da revelação a um sujeito em que as células estão ou estavam presentes), de modo que a expressão de um gene de APP seja inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idêntico à primeira célula ou grupo de células, mas que não foi ou não foi tratado (célula de controle não tratada (ou células de controle não tratadas) com agente de RNAi ou não tratada (ou não tratadas) com agente de RNAi direcionado ao gene de interesse). O grau de inibição pode ser expresso em termos de: (mRNA em células de controle) - (mRNA em células ● tratadas) 100% (mRNA em células de controle)
[816] Em outras modalidades, a inibição da expressão de um gene de APP pode ser avaliada em termos de uma redução de um parâmetro que está funcionalmente ligado ao gene de expressão de APP, por exemplo, expressão da proteína de APP, formação e/ou níveis de produtos de clivagem de APP, ou sinalização de trajetórias de APP. O silenciamento do gene de APP pode ser determinado em qualquer célula que expressa APP, endógena ou heteróloga de um construto de expressão e por qualquer ensaio conhecido na técnica.
[817] A inibição da expressão de uma proteína APP pode ser manifestada por uma redução no nível da proteína APP que é expressa por uma célula ou grupo de células (por exemplo, o nível de proteína expressa em uma amostra derivada de um sujeito). Conforme explicado acima, para a avaliação da supressão de mRNA, a inibição dos níveis de expressão de proteína em uma célula tratada ou grupo de células pode ser expressa de forma semelhante como uma porcentagem do nível de proteína em uma célula de controle ou grupo de células.
[818] Uma célula de controle ou grupo de células que pode ser usada para avaliar a inibição da expressão de um gene de APP inclui uma célula ou grupo de células que ainda não foi contatado com um agente de RNAi da revelação. Por exemplo, a célula de controle ou grupo de células pode ser derivada de um sujeito individual (por exemplo, um sujeito humano ou animal) antes do tratamento do sujeito com um agente de RNAi.
[819] O nível de mRNA de APP que é expresso por uma célula ou grupo de células pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para avaliar a expressão de mRNA. Em uma modalidade, o nível de expressão de APP em uma amostra é determinado pela detecção de um polinucleotídeo transcrito, ou sua porção, por exemplo, mRNA do gene de APP. O RNA pode ser extraído de células usando técnicas de extração de RNA, incluindo, por exemplo, usando extração de isotiocianato de fenol ácido/guanidina (RNAzol B; Biogenesis), kits de preparação de RNA RNeasyTM (Qiagen®) ou PAXgene (PreAnalytix, Suíça). Os formatos de ensaio típicos que utilizam hibridização de ácido ribonucleico incluem ensaios de execução nuclear, RT-PCR, ensaios de proteção de RNase, Northern blotting, hibridização in situ e análise de microarranjo. O mRNA de APP circulante pode ser detectado usando métodos descritos na publicação PCT WO2012/177906, cujo conteúdo completo é aqui incorporado por referência.
[820] Em algumas modalidades, o nível de expressão de APP é determinado usando uma sonda de ácido nucleico. O termo “sonda”, como usado no presente documento, refere-se a qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a uma APP específica. As sondas podem ser sintetizadas por um especialista na técnica ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. As sondas podem ser especificamente projetadas para serem rotuladas. Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, mas não estão limitados a RNA, DNA, proteínas, anticorpos e moléculas orgânicas.
[821] O mRNA isolado pode ser usado em ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, mas não estão limitados a análises Southern ou Northern, análises de reação em cadeia da polimerase (PCR) e matrizes de sondas. Um método para a determinação dos níveis de mRNA envolve o contato do mRNA isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridizar com o mRNA de APP. Em uma modalidade, o mRNA é imobilizado em uma superfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo, executando o mRNA isolado em um gel de agarose e transferindo o mRNA do gel para uma membrana, como a nitrocelulose. Em uma modalidade alternativa, a sonda é imobilizada (ou as sondas são imobilizadas) em uma superfície sólida e o mRNA é colocado em contato com a sonda (ou as sondas), por exemplo, em uma matriz de chip de gene Affymetrix. Um versado na técnica pode facilmente adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na determinação do nível de mRNA de APP.
[822] Um método alternativo para determinar o nível de expressão de APP em uma amostra envolve o processo de amplificação de ácido nucleico e/ou transcriptase reversa (para preparar cDNA) de, por exemplo, mRNA na amostra, por exemplo, por RT-PCR ( a concretização experimental apresentada em Mullis, 1987, patente nº US 4.683.202), reação em cadeia da ligase (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 189 a 193), replicação de sequência autossustentada (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1.874 a 1.878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1.173 a 1.177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197), replicação por círculo rolante (Lizardi et al., patente nº US 5.854.033) ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando boas técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Esses esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estiverem presentes em números muito baixos. Em aspectos específicos da revelação, o nível de expressão de APP é determinado por RT-PCR fluorogênico quantitativo (ou seja, o TaqManTM System), por um ensaio Dual- Glo® Luciferase ou por outro método reconhecido pela técnica para medição de expressão de APP/ou nível de mRNA.
[823] Os níveis de expressão de mRNA de APP podem ser monitorados usando um blot de membrana (tal como usado em análise de hibridização, como Northern, Southern, dot e similares), ou micropoços, tubos de amostra, géis, grânulos ou fibras (ou qualquer suporte sólido compreendendo ácidos nucleicos ligados). Ver patentes nos US 5.770.722, 5.874.219,
5.744.305, 5.677.195 e 5.445.934, que são aqui incorporadas por referência. A determinação do nível de expressão de APP também pode compreender o uso de sondas de ácido nucleico em solução.
[824] Em algumas modalidades, o nível de expressão de mRNA é avaliado usando ensaios de DNA ramificado (bDNA) ou PCR em tempo real (qPCR). A utilização deste método de PCR é descrita e exemplificada nos exemplos aqui apresentados. Tais métodos também podem ser usados para a detecção de ácidos nucleicos de APP, ácidos nucleicos de SREBP ou ácidos nucleicos de PNPLA3.
[825] O nível de expressão da proteína APP pode ser determinado usando qualquer método conhecido na técnica para a medição dos níveis de proteína. Tais métodos incluem, por exemplo, eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia de hipodifusão, reações de precipitina de fluido ou gel, espectroscopia de absorção, ensaios colorimétricos, ensaios espectrofotométricos, citometria de fluxo, imunodifusão (simples ou dupla), imunoeletroforese, western blotting, radioimunoensaio (RIA), ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), ensaios de imunofluorescência, ensaios de eletroquimioluminescência e semelhantes. Tais ensaios também podem ser usados para a detecção de proteínas indicativas da presença ou replicação de proteínas de APP, produtos de clivagem de APP ou outras proteínas associadas à APP, por exemplo, PSEN1, PSEN2, etc.
[826] Em algumas modalidades, a eficácia dos métodos de revelação no tratamento de uma doença relacionada à APP é avaliada por uma diminuição no nível de mRNA de APP (por exemplo, pela avaliação de uma amostra de CSF para os níveis de Aβ, por biópsia cerebral ou de outra forma).
[827] Em algumas modalidades dos métodos da revelação, o agente de RNAi é administrado a um sujeito de forma que o agente de RNAi seja entregue em um local específico no sujeito. A inibição da expressão de APP pode ser avaliada usando medições do nível ou alteração no nível de mRNA de APP ou proteína de APP em uma amostra derivada de um local específico no sujeito, por exemplo, células do SNC. Em determinadas modalidades, os métodos incluem uma inibição clinicamente relevante da expressão de APP, por exemplo, conforme demonstrado por um resultado clinicamente relevante após o tratamento de um sujeito com um agente para reduzir a expressão de APP.
[828] Como usado no presente documento, os termos detecção ou determinação de um nível de um analito são entendidos como significando realizar as etapas para determinar se um material, por exemplo, proteína, RNA, está presente. Como usado no presente documento, os métodos de detecção ou determinação incluem a detecção ou determinação de um nível de analito que está abaixo do nível de detecção do método usado. X. MÉTODOS DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS
ASSOCIADAS À APP
[829] A presente revelação também oferece métodos de uso de um agente de RNAi da revelação e/ou uma composição contendo um agente de RNAi da revelação para reduzir e/ou inibir a expressão de APP em uma célula. Os métodos incluem contatar a célula com um dsRNA da revelação e manter a célula por um tempo suficiente para obter degradação do transcrito de mRNA de um gene de APP, inibindo assim uma expressão do gene de APP na célula. A redução na expressão do gene pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma redução na expressão de APP pode ser determinada determinando o nível de expressão de mRNA de APP usando métodos de rotina para um versado na técnica, por exemplo, Northern blotting, qRT-PCR; determinando o nível de proteína de APP usando métodos de rotina para um versado na técnica, tais como Western blotting, técnicas imunológicas. Uma redução na expressão de APP também pode ser avaliada indiretamente medindo uma diminuição nos níveis de um produto de clivagem solúvel de APP, por exemplo, uma diminuição no nível de APPα solúvel, APPβ e/ou um peptídeo Aβ solúvel, opcionalmente em uma amostra de CSF de um sujeito.
[830] Nos métodos de revelação, a célula pode ser contatada in vitro ou in vivo, ou seja, a célula pode estar dentro de um sujeito.
[831] Uma célula adequada para tratamento usando os métodos da revelação pode ser qualquer célula que expressa um gene de APP. Uma célula adequada para uso nos métodos de revelação pode ser uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula primata (como uma célula humana ou uma célula primata não humana, por exemplo, uma célula de macaco ou uma célula de chimpanzé), uma célula não primata (como uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de camelo, uma célula de lhama, uma célula de cavalo, uma célula de cabra, uma célula de coelho, uma célula de ovelha, uma célula de hamster, uma célula de cobaia, uma célula de gato, uma célula de cachorro, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de leão, uma célula de tigre, uma célula de urso ou uma célula de búfalo), uma célula de pássaro (por exemplo, uma célula de pato ou uma célula de ganso) ou uma célula de baleia. Em uma modalidade, a célula é uma célula humana, por exemplo, uma célula CNS humana.
[832] A expressão de APP é inibida na célula por pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou cerca de 100%. Em modalidades preferenciais, a expressão de APP é inibida por pelo menos 20%.
[833] Os métodos da revelação in vivo podem incluir a administração a um sujeito de uma composição contendo um agente de RNAi, onde o agente de RNAi inclui uma sequência de nucleotídeos que é complementar a pelo menos uma parte de uma transcrição de RNA do gene de APP do mamífero a ser tratado. Quando o organismo a ser tratado é um mamífero, como um humano, a composição pode ser administrada por qualquer meio conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando a vias oral, intraperitoneal, ou parenteral, incluindo intracraniana (por exemplo, intraventricular, intraparenquimatosa e administração intratecal, intravenosa, intramuscular, intravítrea, subcutânea, transdérmica, via aérea (aerossol), nasal, retal e tópica (incluindo bucal e sublingual). Em determinadas modalidades, as composições são administradas por infusão ou injeção intravenosa. Em determinadas modalidades, as composições são administradas por injeção subcutânea.
[834] Em algumas modalidades, a administração é por meio de uma injeção de depósito. Uma injeção de depósito pode liberar o agente de RNAi de maneira consistente por um período de tempo prolongado. Assim, uma injeção de depósito pode reduzir a frequência de dosagem necessária para obter um efeito desejado, por exemplo, uma inibição desejada de APP, ou um efeito terapêutico ou profilático. Uma injeção de depósito também pode fornecer concentrações séricas mais consistentes. As injeções de depósito podem incluir injeções subcutâneas ou intramusculares. Em modalidades preferenciais, a injeção de depósito é uma injeção subcutânea.
[835] Em algumas modalidades, a administração é por meio de uma bomba. A bomba pode ser uma bomba externa ou uma bomba implantada cirurgicamente. Em determinadas modalidades, a bomba é uma bomba osmótica implantada subcutaneamente. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba de infusão. Uma bomba de infusão pode ser usada para infusões intravenosas, subcutâneas, arteriais ou epidurais. Em modalidades preferenciais, a bomba de infusão é uma bomba de infusão subcutânea. Em outras modalidades, a bomba é uma bomba implantada cirurgicamente que entrega o agente de RNAi ao SNC.
[836] O modo de administração pode ser escolhido com base em se o tratamento local ou sistêmico é desejado e com base na área a ser tratada. A rota e o local de administração podem ser escolhidos para melhorar a segmentação.
[837] Em um aspecto, a presente revelação também oferece métodos para inibir a expressão de um gene de APP em um mamífero. Os métodos incluem a administração ao mamífero de uma composição compreendendo um dsRNA que tem como alvo um gene de APP em uma célula do mamífero e manter o mamífero por um tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA do gene de APP, inibindo assim a expressão do gene de APP na célula. A redução na expressão do gene pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica e por métodos, por exemplo qRT-PCR, aqui descritos. A redução na produção de proteínas pode ser avaliada por quaisquer métodos conhecidos na técnica e por métodos, por exemplo, ELISA, aqui descritos. Em uma modalidade, uma amostra de biópsia do SNC ou uma amostra de líquido cefalorraquidiano (LCR) serve como material de tecido para monitorar a redução no gene de APP e/ou expressão da proteína (ou de um proxy, portanto, como descrito no presente documento ou como conhecido na técnica).
[838] A presente revelação oferece outros métodos de tratamento de um sujeito em necessidade. Os métodos de tratamento da revelação incluem a administração de um agente de RNAi da revelação a um sujeito, por exemplo, um sujeito que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição da expressão de APP, em uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi visando um gene de APP ou uma composição farmacêutica compreendendo um agente de RNAi direcionado a um gene de APP.
[839] A presente revelação também oferece métodos para diminuir os níveis de Aβ40 e/ou Aβ42 em um sujeito. Os métodos incluem a administração de um agente de RNAi da revelação a um sujeito, por exemplo, um sujeito que se beneficiaria de uma redução e/ou inibição da expressão de APP, na quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de RNAi visando um gene de APP ou a composição farmacêutica compreendendo um agente de RNAi direcionado a um gene de APP.
[840] Além disso, a presente revelação oferece métodos de prevenção, tratamento e/ou inibição da progressão de uma doença ou distúrbio associado à APP (por exemplo, CAA e/ou DA, opcionalmente EOFAD) em um sujeito, como a progressão de uma doença ou distúrbio associado à APP para neurodegeneração, aumento da formação de placa amiloide e/ou declínio cognitivo em um sujeito com doença ou distúrbio associado à APP ou sujeito em risco de desenvolver uma doença ou distúrbio associado à APP. Os métodos incluem a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos dsRNAs ou da composição farmacêutica aqui fornecida, prevenindo, tratando e/ou inibindo a progressão de uma doença ou distúrbio associado à APP no sujeito.
[841] Um agente de RNAi da revelação pode ser administrado como um “agente de RNAi livre”. Um agente de RNAi livre é administrado na ausência de uma composição farmacêutica. O agente de RNAi nu pode estar em um tampão de solução adequado. O tampão de solução pode conter acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a solução tampão é tampão fosfato-salino (PBS). O pH e osmolaridade do tampão da solução contendo o agente de RNAi podem ser ajustados de modo que sejam adequados para administração a um sujeito.
[842] Alternativamente, um agente de RNAi da revelação pode ser administrado como uma composição farmacêutica, como uma formulação de dsRNA lipossomal.
[843] Os indivíduos que se beneficiariam de uma redução e/ou inibição do gene de expressão de APP são aqueles que possuem um distúrbio associado à APP. O termo “doença associada à APP” inclui uma doença, distúrbio ou condição que se beneficiaria de uma diminuição no gene de expressão, replicação ou atividade proteica de APP. Exemplos não limitativos de doença associada à APPs incluem, por exemplo, CAA (incluindo hCAA e CAA esporádico) e DA (incluindo EOFAD, esporádico e/ou DA de início tardio, opcionalmente com CAA).
[844] A revelação também oferece métodos para o uso de um agente de RNAi ou uma composição farmacêutica do mesmo, por exemplo, para o tratamento de um sujeito que se beneficiaria da redução e/ou inibição da expressão de APP, por exemplo, um sujeito com um distúrbio associado à APP, em combinação com outros fármacos e/ou outros métodos terapêuticos, por exemplo, com fármacos conhecidos e/ou métodos terapêuticos conhecidos, tais como, por exemplo, aqueles que são atualmente empregados para o tratamento desses distúrbios. Por exemplo, em certas modalidades, um agente de RNAi direcionado a APP é administrado em combinação com, por exemplo, um agente útil no tratamento de um distúrbio associado à APP como descrito em outro lugar aqui ou como de outra forma conhecido na técnica. Por exemplo, agentes adicionais adequados para tratar um sujeito que se beneficiaria da redução na expressão de APP, por exemplo, um sujeito com um distúrbio associado à APP, pode incluir agentes atualmente usados para tratar sintomas de DA. Exemplos não limitativos de tais agentes podem incluir inibidores de colinasterase (tais como donepezil, rivastigmato e galantamina), memantina, BACE1i, imunoterapias, inibidores de secretase. O agente terapêutico adicional pode ser administrado ao mesmo tempo e/ou na mesma combinação, por exemplo, intratecalmente, ou o agente terapêutico adicional pode ser administrado como parte de uma composição separada ou em momentos separados e/ou por outro método conhecido na técnica ou aqui descrito.
[845] Em uma modalidade, o método inclui a administração de uma composição aqui apresentada, de modo que a expressão do gene-alvo de APP seja diminuída, como por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24 horas, 28, 32 ou cerca de 36 horas. Em uma modalidade, a expressão do gene-alvo de APP é diminuída por um período prolongado, por exemplo, pelo menos cerca de dois, três, quatro dias ou mais, por exemplo, cerca de uma semana, duas semanas, três semanas ou quatro semanas ou mais.
[846] De preferência, os agentes de RNAi úteis para os métodos e composições aqui apresentados especificamente alvos de RNAs (primários ou processados) do gene-alvo de APP. As composições e métodos para inibir a expressão desses genes usando agentes de RNAi podem ser preparados e realizados como descrito no presente documento.
[847] A administração do dsRNA de acordo com os métodos da revelação pode resultar em uma redução da gravidade, sinais, sintomas e/ou marcadores de tais doenças ou distúrbios em um paciente com distúrbio associado à APP. Por “redução” neste contexto entende-se por uma diminuição estatisticamente significativa em tal nível. A redução pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou cerca de 100%.
[848] A eficácia do tratamento ou prevenção da doença pode ser avaliada, por exemplo, medindo a progressão da doença, remissão da doença, gravidade dos sintomas, redução da dor, qualidade de vida, dose de um medicamento necessário para sustentar um efeito de tratamento, nível de uma doença marcador ou qualquer outro parâmetro mensurável apropriado para uma determinada doença em tratamento ou direcionado para prevenção. Está bem dentro da capacidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Por exemplo, a eficácia do tratamento de um distúrbio associado à APP pode ser avaliada, por exemplo, por monitoramento periódico da cognição de um sujeito, níveis de Aβ no LCR, etc. As comparações das leituras posteriores com as leituras iniciais fornecem ao médico uma indicação se o tratamento é eficaz. Está bem dentro da capacidade de um versado na técnica monitorar a eficácia do tratamento ou prevenção medindo qualquer um de tais parâmetros, ou qualquer combinação de parâmetros. Em conexão com a administração de um agente de RNAi direcionado à APP ou sua composição farmacêutica, “eficaz contra” um distúrbio associado à APP indica que a administração de uma maneira clinicamente apropriada resulta em um efeito benéfico para pelo menos uma fração estatisticamente significativa de pacientes, tal como melhora dos sintomas, cura, redução da doença, extensão da vida, melhora da qualidade de vida ou outro efeito geralmente reconhecido como positivo por médicos familiarizados com o tratamento de distúrbios associados à APP e as causas relacionadas.
[849] Um tratamento ou efeito preventivo é evidente quando há uma melhora estatisticamente significativa em um ou mais parâmetros do estado da doença, ou por uma falha em piorar para desenvolver sintomas onde de outra forma seriam previstos. A título de exemplo, uma mudança favorável de pelo menos 10% em um parâmetro mensurável da doença, e preferencialmente pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou mais pode ser indicativo de tratamento eficaz. A eficácia para um determinado fármaco do agente de RNAi ou formulação desse fármaco também pode ser avaliada usando um modelo animal experimental para a dada doença, conforme conhecido na técnica.
Ao usar um modelo animal experimental, a eficácia do tratamento é evidenciada quando uma redução estatisticamente significativa em um marcador ou sintoma é observada.
[850] Alternativamente, a eficácia pode ser medida por uma redução na gravidade da doença, conforme determinado por um versado na técnica de diagnóstico com base em uma escala de graduação de gravidade da doença clinicamente aceita, como apenas um exemplo de testes de capacidade mental para demência. Qualquer mudança positiva que resulte, por exemplo, na diminuição da gravidade da doença medida usando a escala apropriada, representa o tratamento adequado usando uma formulação de agente de RNAi ou agente de RNAi como descrito no presente documento.
[851] Os indivíduos podem ser administrados com uma quantidade terapêutica de dsRNA, tal como cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 200 mg/kg.
[852] O agente de RNAi pode ser administrado por via intratecalmente, por meio de injeção intravítrea e/ou por infusão intravenosa durante um período de tempo, de forma regular. Em determinadas modalidades, após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência. A administração do agente de RNAi pode reduzir os níveis de APP, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, amostra de LCR ou outro compartimento do paciente em pelo menos cerca de 5%, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 39, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou pelo menos cerca de 99% ou mais. Em uma modalidade preferencial, a administração do agente de RNAi pode reduzir os níveis de APP, por exemplo, em uma célula, tecido, sangue, amostra de LCR ou outro compartimento do paciente em pelo menos 20%.
[853] Antes da administração de uma dose completa do agente de RNAi, os pacientes podem receber uma dose menor, como uma reação à infusão de 5%, e monitorados para efeitos adversos, como uma reação alérgica. Em outro exemplo, o paciente pode ser monitorado para efeitos imunoestimuladores indesejados, como níveis aumentados de citocina (por exemplo, TNF-alfa ou INF-alfa).
[854] Alternativamente, o agente de RNAi pode ser administrado por via subcutânea, isto é, por injeção subcutânea. Uma ou mais injeções podem ser usadas para administrar a desejada, por exemplo, dose mensal de agente de RNAi a um indivíduo. As injeções podem ser repetidas durante um período de tempo. A administração pode ser repetida regularmente. Em determinadas modalidades, após um regime de tratamento inicial, os tratamentos podem ser administrados com menos frequência. A regimina de dose repetida pode incluir a administração de uma quantidade terapêutica de agente de RNAi em uma base regular, como mensal ou estendendo-se para uma vez por ano ou uma vez a cada 2, 3, 4 e/ou 5 anos. Em determinadas modalidades, o agente de RNAi é administrado cerca de uma vez por mês a cerca de uma vez por trimestre (ou seja, cerca de uma vez a cada três meses).
[855] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste dos métodos de agentes de RNAi e apresentados na invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência em sua totalidade. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes.
EXEMPLOS EXEMPLO 1. PROJETO, SÍNTESE, SELEÇÃO E AVALIAÇÃO IN
VITRO DE AGENTE DE RNAI
[856] Este exemplo descreve métodos para o projeto, síntese, seleção e avaliação in vitro de agentes de RNAi de APP.
FONTE DOS REAGENTES
[857] Quando a fonte de um reagente não é especificamente fornecida aqui, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular em um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular.
BIOINFORMÁTICA
[858] Um conjunto de agentes de siRNA direcionados ao gene da proteína precursora de beta amiloide humana (APP; NCBI refseq NM_201414; NCBI GeneID: 351; SEQ ID NO: 1), bem como o ortólogo de APP da espécie toxicológica de Macaca fascicularis (macaco cinomolgos: XM_005548883.2; SEQ ID NO: 12) foi projetado usando scripts R e Python personalizados. Todos os projetos de siRNA têm uma combinação perfeita com a transcrição da APP humana e um subconjunto tanto de combinações perfeitas quanto quase perfeitas com o ortólogo de cinomolgos. O mRNA humano NM_201414 REFSEQ, versão 2, tem um comprimento de 3.423 bases. A lógica e método para o conjunto de designs de siRNA são os seguintes: a eficácia prevista para cada siRNA 23mer potencial da posição 10 até o final foi determinada com um modelo de floresta aleatório derivado da medida direta de knockdown de mRNA de vários milhares de projetos distintos de siRNA visando um conjunto diversificado de genes de vertebrados. Para cada filamento do siRNA, um script Python customizado foi usado em uma busca de força bruta para medir o número e posições de incompatibilidades entre o siRNA e todos os alinhamentos potenciais no transcriptoma humano. Foi dado peso extra às incompatibilidades na região da semente, definidas aqui como posições 2 a 9 do oligonucleotídeo antissenso, bem como o sítio de clivagem do siRNA, definido aqui como posições 10 a 11 do oligonucleotídeo antissenso. O peso relativo das incompatibilidades foi de 2,8, 1,2, 1 para incompatibilidades de sementes, sítio de clivagem, e outras posições até a posição 19 do antissenso. Os desajustes na primeira posição foram ignorados. Foi calculado um escore de especificidade para cada filamento somando o valor de cada incompatibilidade ponderada. Foi dada preferência a siRNAs cuja pontuação antissenso em humanos e macacos foi ≥3 com uma eficácia prevista de ≥50% de knockdown (161 sequências), ou com uma pontuação antissenso ≥2 e ≥60% de knockdown prevista (118 sequências).
[859] Um segundo conjunto de siRNAs direcionados à proteína precursora de beta amiloide da espécie Mus musculus (camundongo) (App, um ortólogo da APP humana; camundongo NCBI refseq NM_001198823; NCBI GeneID: 11820; SEQ ID NO: 13) também como ortólogo App Rattus norvegicus (rato): NM_019288.2 (SEQ ID NO: 14) foi projetado usando scripts R e Python personalizados. Todos os projetos de siRNA possuíam uma correspondência perfeita com a transcrição do aplicativo do mouse e um subconjunto possuía correspondências perfeitas ou quase perfeitas com o ortólogo do rato. O mouse NM_001198823 REFSEQ mRNA, versão 1, tem um comprimento de 3.377 bases. O mesmo processo de seleção foi usado conforme indicado acima para sequências humanas, mas com os seguintes critérios de seleção aplicados: Foi dada preferência a siRNAs cuja pontuação antissenso em camundongo e rato foi ≥2,8 com uma eficácia prevista de ≥50% de knockdown (85 sequências), ou com uma pontuação antissenso ≥2 e ≥61% de knockdown prevista (8 sequências).
SÍNTESE DE SEQUÊNCIAS DE APP SÍNTESE DE FILAMENTOS ÚNICOS E DUPLEXES DE APP
[860] Todos os oligonucleotídeos foram preparados em um sintetizador MerMade 192 em uma escala de 1 µmol usando suportes universais ou personalizados. Todos os fosforamiditos foram usados na concentração de 100 mM em 100% de acetonitrila ou 9:1 de acetonitrila:DMF com um protocolo padrão para 2-cianoetil fosforamiditos, exceto que o tempo de acoplamento foi estendido para 400 segundos. A oxidação das ligações recém-formadas foi alcançada usando uma solução de 50 mM I2 em 9:1 de Acetonitrila:Água para criar ligações fosfato e 100 mM DDTT em 9:1 de Piridina:Acetonitrila para criar ligação de fosforotioatos. Após a síntese de tritil-off, as colunas foram incubadas com 150 µl de metilamina aquosa a 40% por 45 minutos e a solução drenada por meio de vácuo para uma placa de 96 poços. Após repetição da incubação e drenagem com nova porção de metilamina aquosa, a placa contendo a solução de oligonucleotídeo bruto foi selada e agitada em temperatura ambiente por mais 60 minutos para a remoção completa de todos os grupos protetores. A precipitação dos oligonucleotídeos brutos foi realizada por meio da adição de 1,2 ml de 9:1 de Acetonitrila:EtOH a cada poço seguido de incubação a -20 °C durante a noite. A placa foi então centrifugada a 3.000 RPM durante 45 minutos, o sobrenadante removido de cada poço e os peletes ressuspensos em 950 µl de NaOAc aquoso 20 mM. Cada solução bruta foi finalmente dessalinizada sobre uma coluna dessalinizadora GE Hi-Trap (Sephadex G25 Superfine) usando água para eluir os produtos oligonucleotídicos finais. Todas as identidades e purezas foram confirmadas usando ESI-MS e IEX HPLC, respectivamente.
[861] O recozimento de filamentos simples de APP foi realizado em um robô de manuseio de líquidos Tecan. Os filamentos simples sensor e antissenso foram combinados em uma razão equimolar em placas de 96 poços e tamponadas com 10x PBS para fornecer uma concentração duplex final de 10 μM em 1x PBS. Após a combinação dos filamentos simples complementares, a placa de 96 poços foi hermeticamente selada e aquecida em um forno a 100 °C por 40 minutos e deixada voltar lentamente à temperatura ambiente por um período de 2 a 3 horas e subsequentemente usada diretamente para ensaios de triagem in vitro nas concentrações apropriadas.
[862] Uma lista detalhada das sequências de filamento sensor e antissenso de APP modificadas é mostrada nas Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B e 26 e uma lista detalhada das sequências de filamento sensor e antissenso de APP não modificadas é mostrada nas Tabelas 3, 6, 11, 13, 15 e 26. TRIAGEM DE HEPATÓCITOS, BE(2)C E NEURON2A DE CAMUNDONGO PRIMÁRIOS E CINOMOLGO PRIMÁRIOS IN VITRO: CULTURA CELULAR E TRANSFECÇÕES:
[863] Hepatócitos de Be(2)C humano (ATCC), de Neuro2A de camundongo (ATCC), hepatócitos de camundongo primários (BioreclamationIVT) e hepatócitos de cino primários (BioreclamationIVT) foram transfectados pela adição de 4,9 µl de Opti-MEM mais 0,1 µl de RNAiMAX por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat nº 13778-150) a 5 µl de duplexes de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubados em temperatura ambiente por 15 minutos. 40 µl de meio contendo ~5x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas durante 24 horas antes da purificação do RNA. Os experimentos multidose foram realizados a 10 nM e 0,1 nM.
ISOLAMENTO TOTAL DE RNA USANDO O KIT DE ISOLAMENTO DE MRNA DYNABEADS (INVITROGEN, PARTE Nº: 610-12):
[864] O RNA foi isolado usando um protocolo automatizado em uma plataforma BioTek-EL406 usando DYNABEADs (Invitrogen, cat nº 61012). Resumidamente, 70 µl de tampão de lise/ligação e 10 µl de tampão de lise contendo 3 µl de esferas magnéticas foram adicionados à placa com as células. As placas foram incubadas em agitador eletromagnético por 10 minutos em temperatura ambiente e em seguida as esferas magnéticas foram capturadas e o sobrenadante foi removido. O RNA ligado ao grânulo foi então lavado 2 vezes com 150 µl de tampão de lavagem A e uma vez com tampão de lavagem B. Os grânulos foram então lavados com 150 µl de tampão de eluição, recapturados e o sobrenadante removido.
SÍNTESE DE CDNA USANDO KIT DE TRANSCRIÇÃO REVERSA DE CDNA DE ALTA CAPACIDADE ABI (APPLIED BIOSYSTEMS, FOSTER CITY, CA, CAT Nº 4368813):
[865] 10 µl de uma mistura principal contendo 1 µl de tampão 10X, 0,4 µl 25X dNTPs, 1 µl 10x iniciadores aleatórios, 0,5 µl de transcriptase reversa, 0,5 µl de inibidor de RNase e 6,6 µl de H2O por reação foram adicionados ao RNA isolado acima. As placas foram seladas, misturadas e incubadas em agitador eletromagnético por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de 2 h a 37 °C. PCR EM TEMPO REAL:
[866] Dois µl de cDNA foram adicionados a uma mistura principal contendo 0,5 µl de sonda GAPDH TaqMan humana (4326317E), e 0,5 µl de sonda humana APP (Hs00169098_m1) e 5 µl de mistura principal de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat nº 04887301001) por poço em placas de 384 poços (Roche cat nº 04887301001). Ou 2 µl de cDNA foram adicionados a uma mistura principal contendo 0,5 µl de sonda GAPDH TaqMan de camundongo (4352339E), e 0,5 µl de sonda de camundongo APP (Mm01344172_m1) e 5 µl de mistura principal de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat nº 04887301001) por poço em um Placas de 384 poços (Roche cat nº 04887301001). Ou 2 µl de cDNA foram adicionados a uma mistura principal contendo 0,5 µl de sonda TaqMan GAPDH de cino (iniciador direto: 5'-GCATCCTGGGCTACACTGA-3', iniciador reverso: 5'-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3', sonda: 5'HEX- CCAGGTCCCTCGT 3'BHQ-1) e 0,5 µl de sonda APP cinomolgos (Mf01552291_m1) e 5 µl de mistura de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat nº 04887301001) por poço em placas de 384 poços (Roche cat nº 04887301001). A PCR em tempo real foi realizada em um sistema LightCycler480 Real Time PCR (Roche). Cada duplex foi testado pelo menos duas vezes e os dados foram normalizados para células transfectadas com um siRNA de controle sem direcionamento.
[867] Para calcular a mudança de dobra relativa, os dados em tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizado para ensaios realizados com células transfectadas com um siRNA de controle sem direcionamento. Os resultados dos ensaios são mostrados nas Tabelas 4 e 7. TABELA 1: ABREVIAÇÕES DOS MONÔMEROS DE NUCLEOTÍDEO USADOS NA REPRESENTAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
[868] [00868] Será entendido que esses monômeros, quando presentes em um oligonucleotídeo, estão mutuamente ligados por ligações 5'-3'-fosfodiéster. Abreviação Nucleotídeo (ou Nucleotídeos) A Adenosina-3’-fosfato Agn (S)-glicol-adenosina Ahd 2’-O-hexadecil adenosina-3’-fosfato Af 2’-fluoroadenosina-3’-fosfato Afs 2’-fluoroadenosina-3’-fosforotioato As adenosina-3’-fosforotioato C citidina-3’-fosfato Cgn (S)-glicol-citidina Chd 2’-O-hexadecil citidina-3’-fosfato Cf 2’-fluorocitidina-3’-fosfato Cfs 2’-fluorocitidina-3’-fosforotioato Cs citidina-3’-fosforotioato G guanosina-3’-fosfato Ggn (S)-glicol-guanosina Ghd 2’-O-hexadecil guanosina-3’-fosfato
Abreviação Nucleotídeo (ou Nucleotídeos) Gf 2’-fluoroguanosina-3’-fosfato Gfs 2’-fluoroguanosina-3’-fosforotioato Gs guanosina-3’-fosforotioato T 5’-metiluridina-3’-fosfato Tgn (S)-glicol-5’-metiluridina Tf 2’-flúor-5-metiluridina-3’-fosfato Tfs 2’-flúor-5-metiluridina-3’-fosforotioato Ts 5-metiluridina-3’-fosforotioato U Uridina-3’-fosfato Uhd 2’-O-hexadecil uridina-3’-fosfato Uf 2’-fluorouridina-3’-fosfato Ufs 2’-fluorouridina -3’-fosforotioato Us uridina -3’-fosforotioato N qualquer nucleotídeo (G, A, C, T ou U) a 2'-O-metiladenosina-3’-fosfato as 2'-O-metiladenosina-3’-fosforotioato c 2'-O-metilcitidina-3’-fosfato cs 2'-O-metilcitidina-3’- fosforotioato g 2'-O-metilguanosina-3’-fosfato gs 2'-O-metilguanosina-3’- fosforotioato t 2’-O-metil-5-metiluridina-3’-fosfato ts 2’-O-metil-5-metiluridina-3’-fosforotioato u 2'-O-metiluridina-3’-fosfato us 2'-O-metiluridina-3’-fosforotioato s ligação de fosforotioato N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4- L96 hidroxiprolinol Hyp-(GalNAc-alquil)3 dT 2`-desoxitimidina-3`-fosfato dC 2`-desoxicitidina-3`-fosfato P Fosfato
Abreviação Nucleotídeo (ou Nucleotídeos) VP Vinil-fosfonato TABELA 2A. SEQUÊNCIAS MODIFICADAS DE APP HUMANA
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O gsasccc(Ahd)AfuUfAfAfg 3 asAfsagua(Ggn)gacuuaAf 3 GUGACCCAAUUAAG 3 AD-392699 uccuacuuuL96 3 uUfgggucsasc 4 UCCUACUUU 5 uscsucc(Uhd)GfaUfUfAfu 3 asUfsguga(Tgn)aaauaaUf 3 UCUCUCCUGAUUAU 3 AD-392700 uuaucacauL96 6 cAfggagasgsa 7 UUAUCACAU 8 cscsuga(Ahd)CfuUfGfAfa 3 asUfsggau(Tgn)aauucaAf 4 UGCCUGAACUUGAA 4 AD-392703 uuaauccauL96 9 gUfucaggscsa 0 UUAAUCCAC 1 gsgsuuc(Ahd)AfaCfAfAfa 4 asAfsuugc(Agn)ccuuugUf 4 UGGGUUCAAACAAA 4 AD-392704 ggugcaauuL96 2 uUfgaaccscsa 3 GGUGCAAUC 4 ususuac(Uhd)CfaUfUfAfu 4 csAfsaaag(Ggn)cgauaaUf 4 GAUUUACUCAUUAU 4 AD-392705 cgccuuuugL96 5 gAfguaaasusc 6 CGCCUUUUG 7 asusuua(Ghd)CfuGfUfAfu 4 asCfsuagu(Tgn)ugauacAf 4 GAAUUUAGCUGUAU 5 AD-392707 caaacuaguL96 8 gCfuaaaususc 9 CAAACUAGU 0 asgsuau(Uhd)CfcUfUfUfc 5 asGfsugau(Cgn)aggaaaGf 5 UAAGUAUUCCUUUC 5 AD-392708 cugaucacuL96 1 gAfauacususa 2 CUGAUCACU 3 gscsuua(Uhd)GfaCfAfUfg 5 gsAfsaagc(Ggn)aucaugUf 5 UUGCUUAUGACAUG 5 AD-392709 aucgcuuucL96 4 cAfuaagcsasa 5 AUCGCUUUC 6 asasgau(Ghd)UfgUfCfUfu 5 usAfscaaa(Tgn)ugaagaCf 5 UUAAGAUGUGUCUU 5 AD-392710 caauuuguaL96 7 aCfaucuusasa 8 CAAUUUGUA 9 gscsaaa(Ahd)CfcAfUfUfg 6 asUfsagug(Agn)agcaauGf 6 CAGCAAAACCAUUG 6 AD-392711 cuucacuauL96 0 gUfuuugcsusg 1 CUUCACUAC 2 asusuua(Chd)UfcAfUfUfa 6 asAfsaagg(Cgn)gauaauGf 6 UGAUUUACUCAUUA 6 AD-392712 ucgccuuuuL96 3 aGfuaaauscsa 4 UCGCCUUUU 5 usascuc(Ahd)UfuAfUfCfg 6 asUfscaaa(Agn)ggcgauAf 6 UUUACUCAUUAUCG 6 AD-392713 ccuuuugauL96 6 aUfgaguasasa 7 CCUUUUGAC 8 usgsccu(Ghd)AfaCfUfUfg 6 asGfsauua(Agn)uucaagUf 7 GAUGCCUGAACUUG 7 AD-392714 aauuaaucuL96 9 uCfaggcasusc 0 AAUUAAUCC 1 csusgaa(Chd)UfuGfAfAfu 7 usGfsugga(Tgn)uaauucAf 7 GCCUGAACUUGAAU 7 AD-392715 uaauccacaL96 2 aGfuucagsgsc 3 UAAUCCACA 4 ususuag(Chd)UfgUfAfUfc 7 asAfscuag(Tgn)uugauaCf 7 AAUUUAGCUGUAUC 7 AD-392716 aaacuaguuL96 5 aGfcuaaasusu 6 AAACUAGUG 7 gsasaua(Ghd)AfuUfCfUfc 7 usAfsauca(Ggn)gagagaAf 7 AUGAAUAGAUUCUC 8 AD-392717 uccugauuaL96 8 uCfuauucsasu 9 UCCUGAUUA 0 uscscug(Ahd)UfuAfUfUfu 8 asUfsaugu(Ggn)auaaauAf 8 UCUCCUGAUUAUUU 8 AD-392718 aucacauauL96 1 aUfcaggasgsa 2 AUCACAUAG 3
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O cscscaa(Uhd)UfaAfGfUfc 8 asUfsaaag(Tgn)aggacuUf 8 GACCCAAUUAAGUC 8 AD-392719 cuacuuuauL96 4 aAfuugggsusc 5 CUACUUUAC 6 csasuau(Ghd)CfuUfUfAfa 8 asAfsucga(Tgn)ucuuaaAf 8 UACAUAUGCUUUAA 8 AD-392720 gaaucgauuL96 7 gCfauaugsusa 8 GAAUCGAUG 9 csusucu(Chd)UfuGfCfCfu 9 asGfsaaua(Cgn)uuaggcAf 9 UGCUUCUCUUGCCU 9 AD-392721 aaguauucuL96 0 aGfagaagscsa 1 AAGUAUUCC 2 csasuug(Chd)UfuAfUfGfa 9 asCfsgauc(Agn)ugucauAf 9 AUCAUUGCUUAUGA 9 AD-392722 caugaucguL96 3 aGfcaaugsasu 4 CAUGAUCGC 5 csusuau(Ghd)AfcAfUfGfa 9 asGfsaaag(Cgn)gaucauGf 9 UGCUUAUGACAUGA 9 AD-392723 ucgcuuucuL96 6 uCfauaagscsa 7 UCGCUUUCU 8 1 1 usasuga(Chd)AfuGfAfUfc 9 asUfsagaa(Agn)gcgaucAf CUUAUGACAUGAUC AD-392724 0 0 gcuuucuauL96 9 uGfucauasasg GCUUUCUAC 0 1 1 1 1 usgsaca(Uhd)GfaUfCfGfc asUfsguag(Agn)aagcgaUf UAUGACAUGAUCGC AD-392725 0 0 0 uuucuacauL96 cAfugucasusa UUUCUACAC 2 3 4 1 1 1 gsasucg(Chd)UfuUfCfUfa asAfsuaca(Ggn)uguagaAf AUGAUCGCUUUCUA AD-392726 0 0 0 cacuguauuL96 aGfcgaucsasu CACUGUAUU 5 6 7 1 1 1 asasaac(Uhd)AfuUfCfAfg asGfsacgu(Cgn)aucugaAf GCAAAACUAUUCAG AD-392727 0 0 1 augacgucuL96 uAfguuuusgsc AUGACGUCU 8 9 0 1 1 1 asasacu(Ahd)UfuCfAfGfa asAfsgacg(Tgn)caucugAf CAAAACUAUUCAGA AD-392728 1 1 1 ugacgucuuL96 aUfaguuususg UGACGUCUU 1 2 3 1 1 1 ascsgaa(Ahd)AfuCfCfAfa asCfsuugu(Agn)gguuggAf CUACGAAAAUCCAA AD-392729 1 1 1 ccuacaaguL96 uUfuucgusasg CCUACAAGU 4 5 6 1 1 1 usgscuu(Chd)UfcUfUfGfc asAfsuacu(Tgn)aggcaaGf GCUGCUUCUCUUGC AD-392730 1 1 1 cuaaguauuL96 aGfaagcasgsc CUAAGUAUU 7 8 9 1 1 1 usgscuu(Ahd)UfgAfCfAfu asAfsagcg(Agn)ucauguCf AUUGCUUAUGACAU AD-392731 2 2 2 gaucgcuuuL96 aUfaagcasasu GAUCGCUUU 0 1 2 1 1 1 usgsauc(Ghd)CfuUfUfCfu asUfsacag(Tgn)guagaaAf CAUGAUCGCUUUCU AD-392732 2 2 2 acacuguauL96 gCfgaucasusg ACACUGUAU 3 4 5 1 1 1 asuscgc(Uhd)UfuCfUfAfc usAfsauac(Agn)guguagAf UGAUCGCUUUCUAC AD-392733 2 2 2 acuguauuaL96 aAfgcgauscsa ACUGUAUUA 6 7 8 1 1 1 uscsuuu(Ghd)AfcCfGfAfa asGfsuuuu(Cgn)guuucgGf CAUCUUUGACCGAA AD-392734 2 3 3 acgaaaacuL96 uCfaaagasusg ACGAAAACC 9 0 1
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 1 1 1 gsusucu(Ghd)GfgUfUfGfa usGfsauau(Tgn)ugucaaCf AGGUUCUGGGUUGA AD-392735 3 3 3 caaauaucaL96 cCfagaacscsu CAAAUAUCA 2 3 4 1 1 1 usgsggu(Uhd)GfaCfAfAfa asUfscuug(Agn)uauuugUf UCUGGGUUGACAAA AD-392736 3 3 3 uaucaagauL96 cAfacccasgsa UAUCAAGAC 5 6 7 1 1 1 gsasuuu(Ahd)CfuCfAfUfu asAfsaggc(Ggn)auaaugAf AUGAUUUACUCAUU AD-392737 3 3 4 aucgccuuuL96 gUfaaaucsasu AUCGCCUUU 8 9 0 1 1 1 uscscuu(Uhd)CfcUfGfAfu usGfscaua(Ggn)ugaucaGf AUUCCUUUCCUGAU AD-392738 4 4 4 cacuaugcaL96 gAfaaggasasu CACUAUGCA 1 2 3 1 1 1 csusuuc(Chd)UfgAfUfCfa asAfsugca(Tgn)agugauCf UCCUUUCCUGAUCA AD-392739 4 4 4 cuaugcauuL96 aGfgaaagsgsa CUAUGCAUU 4 5 6 1 1 1 asusugc(Uhd)UfaUfGfAfc asGfscgau(Cgn)augucaUf UCAUUGCUUAUGAC AD-392740 4 4 4 augaucgcuL96 aAfgcaausgsa AUGAUCGCU 7 8 9 1 1 1 uscsuuu(Ahd)AfcCfAfGfu asAfsacuu(Cgn)agacugGf UUUCUUUAACCAGU AD-392741 5 5 5 cugaaguuuL96 uUfaaagasasa CUGAAGUUU 0 1 2 1 1 1 gsgsauc(Ahd)GfuUfAfCfg asAfsucgu(Tgn)uccguaAf AAGGAUCAGUUACG AD-392742 5 5 5 gaaacgauuL96 cUfgauccsusu GAAACGAUG 3 4 5 1 1 1 csusggg(Uhd)UfgAfCfAfa usCfsuuga(Tgn)auuuguCf UUCUGGGUUGACAA AD-392743 5 5 5 auaucaagaL96 aAfcccagsasa AUAUCAAGA 6 7 8 1 1 1 asusgau(Uhd)UfaCfUfCfa asGfsgcga(Tgn)aaugagUf UUAUGAUUUACUCA AD-392744 5 6 6 uuaucgccuL96 aAfaucausasa UUAUCGCCU 9 0 1 1 1 1 csusugu(Ghd)GfuUfUfGfu asAfsuugg(Ggn)ucacaaAf UUCUUGUGGUUUGU AD-392745 6 6 6 gacccaauuL96 cCfacaagsasa GACCCAAUU 2 3 4 1 1 1 asusaug(Chd)UfuUfAfAfg asCfsaucg(Agn)uucuuaAf ACAUAUGCUUUAAG AD-392746 6 6 6 aaucgauguL96 aGfcauausgsu AAUCGAUGG 5 6 7 1 1 1 ususugu(Chd)CfaCfGfUfa asCfsccaa(Agn)gauacgUf UUUUUGUCCACGUA AD-392747 6 6 7 ucuuuggguL96 gGfacaaasasa UCUUUGGGU 8 9 0 1 1 1 uscsauu(Ghd)UfaAfGfCfa asCfsguaa(Agn)agugcuUf GUUCAUUGUAAGCA AD-392748 7 7 7 cuuuuacguL96 aCfaaugasasc CUUUUACGG 1 2 3 gsgscca(Ahd)CfaUfGfAfu 1 asGfsuuca(Cgn)uaaucaUf 1 UUGGCCAACAUGAU 1 AD-392749 uagugaacuL96 7 gUfuggccsasa 7 UAGUGAACC 7
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 4 5 6 1 1 1 gsasuca(Ghd)UfuAfCfGfg asCfsaucg(Tgn)uuccguAf AGGAUCAGUUACGG AD-392750 7 7 7 aaacgauguL96 aCfugaucscsu AAACGAUGC 7 8 9 1 1 1 usascgg(Ahd)AfaCfGfAfu asAfsugag(Agn)gcaucgUf GUUACGGAAACGAU AD-392751 8 8 8 gcucucauuL96 uUfccguasasc GCUCUCAUG 0 1 2 1 1 1 usgsauu(Uhd)AfcUfCfAfu asAfsggcg(Agn)uaaugaGf UAUGAUUUACUCAU AD-392752 8 8 8 uaucgccuuL96 uAfaaucasusa UAUCGCCUU 3 4 5 1 1 1 gsusaga(Uhd)GfcCfUfGfa asAfsuuca(Agn)guucagGf AAGUAGAUGCCUGA AD-392753 8 8 8 acuugaauuL96 cAfucuacsusu ACUUGAAUU 6 7 8 1 1 1 ususgua(Uhd)AfuUfAfUfu asAfsccac(Agn)agaauaAf AGUUGUAUAUUAUU AD-392754 8 9 9 cuugugguuL96 uAfuacaascsu CUUGUGGUU 9 0 1 1 1 1 asusugc(Uhd)GfcUfUfCfu asAfsauau(Agn)gcagaaGf AGAUUGCUGCUUCU AD-392755 9 9 9 gcuauauuuL96 cAfgcaauscsu GCUAUAUUU 2 3 4 1 1 1 usgscua(Uhd)AfuUfUfGfu usCfscuau(Agn)ucacaaAf UCUGCUAUAUUUGU AD-392756 9 9 9 gauauaggaL96 uAfuagcasgsa GAUAUAGGA 5 6 7 1 1 2 ascsaca(Uhd)UfaGfGfCfa asAfsgucu(Cgn)aaugccUf GCACACAUUAGGCA AD-392757 9 9 0 uugagacuuL96 aAfugugusgsc UUGAGACUU 8 9 0 2 2 2 asasgaa(Uhd)CfcCfUfGfu usUfsacaa(Tgn)gaacagGf AAAAGAAUCCCUGU AD-392758 0 0 0 ucauuguaaL96 gAfuucuususu UCAUUGUAA 1 2 3 2 2 2 csasuug(Uhd)AfaGfCfAfc asCfscgua(Agn)aagugcUf UUCAUUGUAAGCAC AD-392759 0 0 0 uuuuacgguL96 uAfcaaugsasa UUUUACGGG 4 5 6 2 2 2 ususgcu(Uhd)AfuGfAfCfa asAfsgcga(Tgn)caugucAf CAUUGCUUAUGACA AD-392760 0 0 0 ugaucgcuuL96 uAfagcaasusg UGAUCGCUU 7 8 9 2 2 2 csasagg(Ahd)UfcAfGfUfu asGfsuuuc(Cgn)guaacuGf ACCAAGGAUCAGUU AD-392761 1 1 1 acggaaacuL96 aUfccuugsgsu ACGGAAACG 0 1 2 2 2 2 asgsguu(Chd)UfgGfGfUfu asUfsauuu(Ggn)ucaaccCf CCAGGUUCUGGGUU AD-392762 1 1 1 gacaaauauL96 aGfaaccusgsg GACAAAUAU 3 4 5 2 2 2 asasgau(Ghd)UfgGfGfUfu asUfsuugu(Tgn)ugaaccCf AGAAGAUGUGGGUU AD-392763 1 1 1 caaacaaauL96 aCfaucuuscsu CAAACAAAG 6 7 8
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 2 2 2 csusgaa(Ghd)AfaGfAfAfa usGfsugua(Cgn)uguuucUf UGCUGAAGAAGAAA AD-392764 1 2 2 caguacacaL96 uCfuucagscsa CAGUACACA 9 0 1 2 2 2 asasguu(Ghd)GfaCfAfGfc asAfsuggu(Tgn)uugcugUf UGAAGUUGGACAGC AD-392765 2 2 2 aaaaccauuL96 cCfaacuuscsa AAAACCAUU 2 3 4 2 2 2 asuscgg(Uhd)GfuCfCfAfu asUfsucua(Tgn)aaauggAf CCAUCGGUGUCCAU AD-392766 2 2 2 uuauagaauL96 cAfccgausgsg UUAUAGAAU 5 6 7 2 2 2 uscsggu(Ghd)UfcCfAfUfu usAfsuucu(Agn)uaaaugGf CAUCGGUGUCCAUU AD-392767 2 2 3 uauagaauaL96 aCfaccgasusg UAUAGAAUA 8 9 0 2 2 2 gscsugu(Ahd)AfcAfCfAfa asGfscauc(Tgn)acuuguGf GUGCUGUAACACAA AD-392768 3 3 3 guagaugcuL96 uUfacagcsasc GUAGAUGCC 1 2 3 2 2 2 asasgua(Ghd)AfuGfCfCfu usUfscaag(Tgn)ucaggcAf ACAAGUAGAUGCCU AD-392769 3 3 3 gaacuugaaL96 uCfuacuusgsu GAACUUGAA 4 5 6 2 2 2 ususgug(Ghd)UfuUfGfUfg usAfsauug(Ggn)gucacaAf UCUUGUGGUUUGUG AD-392770 3 3 3 acccaauuaL96 aCfcacaasgsa ACCCAAUUA 7 8 9 2 2 2 gsusuug(Uhd)GfaCfCfCfa asGfsacuu(Agn)auugggUf UGGUUUGUGACCCA AD-392771 4 4 4 auuaagucuL96 cAfcaaacscsa AUUAAGUCC 0 1 2 2 2 2 gsusgac(Chd)CfaAfUfUfa asGfsuagg(Agn)cuuaauUf UUGUGACCCAAUUA AD-392772 4 4 4 aguccuacuL96 gGfgucacsasa AGUCCUACU 3 4 5 2 2 2 usasugc(Uhd)UfuAfAfGfa asCfscauc(Ggn)auucuuAf CAUAUGCUUUAAGA AD-392773 4 4 4 aucgaugguL96 aAfgcauasusg AUCGAUGGG 6 7 8 2 2 2 ususugu(Ghd)AfuAfUfAfg usCfsuuaa(Tgn)uccuauAf UAUUUGUGAUAUAG AD-392774 4 5 5 gaauuaagaL96 uCfacaaasusa GAAUUAAGA 9 0 1 2 2 2 asasaga(Ahd)UfcCfCfUfg usAfscaau(Ggn)aacaggGf GAAAAGAAUCCCUG AD-392775 5 5 5 uucauuguaL96 aUfucuuususc UUCAUUGUA 2 3 4 2 2 2 usgsauu(Ghd)UfaCfAfGfa asGfscaau(Ggn)auucugUf GAUGAUUGUACAGA AD-392776 5 5 5 aucauugcuL96 aCfaaucasusc AUCAUUGCU 5 6 7 2 2 2 usgsccu(Ghd)GfaCfAfAfa asAfsagaa(Ggn)gguuugUf CAUGCCUGGACAAA AD-392777 5 5 6 cccuucuuuL96 cCfaggcasusg CCCUUCUUU 8 9 0 gsasgca(Ahd)AfaCfUfAfu 2 asUfscauc(Tgn)gaauagUf 2 AAGAGCAAAACUAU 2 AD-392778 ucagaugauL96 6 uUfugcucsusu 6 UCAGAUGAC 6
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 1 2 3 2 2 2 asgsuga(Ahd)CfcAfAfGfg asUfsaacu(Ggn)auccuuGf UUAGUGAACCAAGG AD-392779 6 6 6 aucaguuauL96 gUfucacusasa AUCAGUUAC 4 5 6 2 2 2 usgsaac(Chd)AfaGfGfAfu asCfsguaa(Cgn)ugauccUf AGUGAACCAAGGAU AD-392780 6 6 6 caguuacguL96 uGfguucascsu CAGUUACGG 7 8 9 2 2 2 csasguu(Ahd)CfgGfAfAfa asGfsagca(Tgn)cguuucCf AUCAGUUACGGAAA AD-392781 7 7 7 cgaugcucuL96 gUfaacugsasu CGAUGCUCU 0 1 2 2 2 2 asgsaag(Ahd)UfgUfGfGfg usUfsguuu(Ggn)aacccaCf GCAGAAGAUGUGGG AD-392782 7 7 7 uucaaacaaL96 aUfcuucusgsc UUCAAACAA 3 4 5 2 2 2 cscsucu(Ghd)AfaGfUfUfg usUfsugcu(Ggn)uccaacUf AGCCUCUGAAGUUG AD-392783 7 7 7 gacagcaaaL96 uCfagaggscsu GACAGCAAA 6 7 8 2 2 2 ususaug(Ahd)UfuUfAfCfu asCfsgaua(Agn)ugaguaAf UUUUAUGAUUUACU AD-392784 7 8 8 cauuaucguL96 aUfcauaasasa CAUUAUCGC 9 0 1 2 2 2 ascsagc(Uhd)GfuGfCfUfg asUfsugug(Tgn)uacagcAf UGACAGCUGUGCUG AD-392785 8 8 8 uaacacaauL96 cAfgcuguscsa UAACACAAG 2 3 4 2 2 2 usgsuga(Chd)CfcAfAfUfu asUfsagga(Cgn)uuaauuGf UUUGUGACCCAAUU AD-392786 8 8 8 aaguccuauL96 gGfucacasasa AAGUCCUAC 5 6 7 2 2 2 usascau(Ahd)UfgCfUfUfu usCfsgauu(Cgn)uuaaagCf UUUACAUAUGCUUU AD-392787 8 8 9 aagaaucgaL96 aUfauguasasa AAGAAUCGA 8 9 0 2 2 2 gsusaaa(Uhd)AfaAfUfAfc usCfscaag(Agn)auguauUf AUGUAAAUAAAUAC AD-392788 9 9 9 auucuuggaL96 uAfuuuacsasu AUUCUUGGA 1 2 3 2 2 2 uscsagu(Uhd)AfcGfGfAfa asAfsgcau(Cgn)guuuccGf GAUCAGUUACGGAA AD-392789 9 9 9 acgaugcuuL96 uAfacugasusc ACGAUGCUC 4 5 6 2 2 2 csusucc(Chd)GfuGfAfAfu asAfsacuc(Tgn)ccauucAf UCCUUCCCGUGAAU AD-392790 9 9 9 ggagaguuuL96 cGfggaagsgsa GGAGAGUUC 7 8 9 3 3 3 asgsuug(Ghd)AfcAfGfCfa asAfsaugg(Tgn)uuugcuGf GAAGUUGGACAGCA AD-392791 0 0 0 aaaccauuuL96 uCfcaacususc AAACCAUUG 0 1 2 3 3 3 cscscau(Chd)GfgUfGfUfc asUfsauaa(Agn)uggacaCf UACCCAUCGGUGUC AD-392792 0 0 0 cauuuauauL96 cGfaugggsusa CAUUUAUAG 3 4 5
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
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O O O 3 3 3 usgscac(Ahd)CfaUfUfAfg usCfsucaa(Tgn)gccuaaUf UGUGCACACAUUAG AD-392793 0 0 0 gcauugagaL96 gUfgugcascsa GCAUUGAGA 6 7 8 3 3 3 cscsaac(Ahd)UfgAfUfUfa usUfsgguu(Cgn)acuaauCf GGCCAACAUGAUUA AD-392794 0 1 1 gugaaccaaL96 aUfguuggscsc GUGAACCAA 9 0 1 3 3 3 asusgau(Uhd)AfgUfGfAfa asAfsuccu(Tgn)gguucaCf ACAUGAUUAGUGAA AD-392795 1 1 1 ccaaggauuL96 uAfaucausgsu CCAAGGAUC 2 3 4 3 3 3 ususagu(Ghd)AfaCfCfAfa asAfscuga(Tgn)ccuuggUf GAUUAGUGAACCAA AD-392796 1 1 1 ggaucaguuL96 uCfacuaasusc GGAUCAGUU 5 6 7 3 3 3 asascca(Ahd)GfgAfUfCfa usUfsccgu(Agn)acugauCf UGAACCAAGGAUCA AD-392797 1 1 2 guuacggaaL96 cUfugguuscsa GUUACGGAA 8 9 0 3 3 3 gsusuac(Ghd)GfaAfAfCfg usGfsagag(Cgn)aucguuUf CAGUUACGGAAACG AD-392798 2 2 2 augcucucaL96 cCfguaacsusg AUGCUCUCA 1 2 3 3 3 3 gsasugc(Ahd)GfaAfUfUfc asUfscaug(Tgn)cggaauUf UGGAUGCAGAAUUC AD-392799 2 2 2 cgacaugauL96 cUfgcaucscsa CGACAUGAC 4 5 6 3 3 3 ususgga(Chd)AfgCfAfAfa asGfscaau(Ggn)guuuugCf AGUUGGACAGCAAA AD-392800 2 2 2 accauugcuL96 uGfuccaascsu ACCAUUGCU 7 8 9 3 3 3 asasacc(Ahd)UfuGfCfUfu usGfsggua(Ggn)ugaagcAf CAAAACCAUUGCUU AD-392801 3 3 3 cacuacccaL96 aUfgguuususg CACUACCCA 0 1 2 3 3 3 cscsauc(Ghd)GfuGfUfCfc usCfsuaua(Agn)auggacAf ACCCAUCGGUGUCC AD-392802 3 3 3 auuuauagaL96 cCfgauggsgsu AUUUAUAGA 3 4 5 3 3 3 ususauc(Ghd)CfcUfUfUfu asCfsagcu(Ggn)ucaaaaGf CAUUAUCGCCUUUU AD-392803 3 3 3 gacagcuguL96 gCfgauaasusg GACAGCUGU 6 7 8 3 3 3 asuscgc(Chd)UfuUfUfGfa asCfsacag(Cgn)ugucaaAf UUAUCGCCUUUUGA AD-392804 3 4 4 cagcuguguL96 aGfgcgausasa CAGCUGUGC 9 0 1 3 3 3 ascsaca(Ahd)GfuAfGfAfu asGfsuuca(Ggn)gcaucuAf UAACACAAGUAGAU AD-392805 4 4 4 gccugaacuL96 cUfugugususa GCCUGAACU 2 3 4 3 3 3 usgsugg(Uhd)UfuGfUfGfa usUfsaauu(Ggn)ggucacAf CUUGUGGUUUGUGA AD-392806 4 4 4 cccaauuaaL96 aAfccacasasg CCCAAUUAA 5 6 7 gsgsgau(Ghd)CfuUfCfAfu 3 asAfscguu(Cgn)acaugaAf 3 GGGGGAUGCUUCAU 3 AD-392807 gugaacguuL96 4 gCfaucccscsc 4 GUGAACGUG 5
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 8 9 0 3 3 3 usgsugc(Ahd)CfaCfAfUfu usCfsaaug(Cgn)cuaaugUf UAUGUGCACACAUU AD-392808 5 5 5 aggcauugaL96 gUfgcacasusa AGGCAUUGA 1 2 3 3 3 3 asasaug(Ghd)AfaGfUfGfg asUfsuaua(Tgn)ugccacUf GAAAAUGGAAGUGG AD-392809 5 5 5 caauauaauL96 uCfcauuususc CAAUAUAAG 4 5 6 3 3 3 asusgga(Ahd)GfuGfGfCfa asCfscuua(Tgn)auugccAf AAAUGGAAGUGGCA AD-392810 5 5 5 auauaagguL96 cUfuccaususu AUAUAAGGG 7 8 9 3 3 3 usgsccc(Ghd)AfgAfUfCfc asGfsuuua(Agn)caggauCf CUUGCCCGAGAUCC AD-392811 6 6 6 uguuaaacuL96 uCfgggcasasg UGUUAAACU 0 1 2 3 3 3 asusuag(Uhd)GfaAfCfCfa asCfsugau(Cgn)cuugguUf UGAUUAGUGAACCA AD-392812 6 6 6 aggaucaguL96 cAfcuaauscsa AGGAUCAGU 3 4 5 3 3 3 gsasacc(Ahd)AfgGfAfUfc usCfscgua(Agn)cugaucCf GUGAACCAAGGAUC AD-392813 6 6 6 aguuacggaL96 uUfgguucsasc AGUUACGGA 6 7 8 3 3 3 asasgga(Uhd)CfaGfUfUfa usCfsguuu(Cgn)cguaacUf CCAAGGAUCAGUUA AD-392814 6 7 7 cggaaacgaL96 gAfuccuusgsg CGGAAACGA 9 0 1 3 3 3 csasaca(Chd)AfgAfAfAfa usCfsaacu(Tgn)cguuuuCf GCCAACACAGAAAA AD-392815 7 7 7 cgaaguugaL96 uGfuguugsgsc CGAAGUUGA 2 3 4 3 3 3 usgsggu(Uhd)CfaAfAfCfa usUfsgcac(Cgn)uuuguuUf UGUGGGUUCAAACA AD-392816 7 7 7 aaggugcaaL96 gAfacccascsa AAGGUGCAA 5 6 7 3 3 3 csasgug(Ahd)UfcGfUfCfa asCfsaagg(Tgn)gaugacGf GACAGUGAUCGUCA AD-392817 7 7 8 ucaccuuguL96 aUfcacugsusc UCACCUUGG 8 9 0 3 3 3 ascscca(Uhd)CfgGfUfGfu usAfsuaaa(Tgn)ggacacCf CUACCCAUCGGUGU AD-392818 8 8 8 ccauuuauaL96 gAfugggusasg CCAUUUAUA 1 2 3 3 3 3 uscsuug(Uhd)GfgUfUfUfg asUfsuggg(Tgn)cacaaaCf AUUCUUGUGGUUUG AD-392819 8 8 8 ugacccaauL96 cAfcaagasasu UGACCCAAU 4 5 6 3 3 3 ususugu(Ghd)AfcCfCfAfa asGfsgacu(Tgn)aauuggGf GGUUUGUGACCCAA AD-392820 8 8 8 uuaaguccuL96 uCfacaaascsc UUAAGUCCU 7 8 9 3 3 3 ususgug(Ahd)CfcCfAfAfu usAfsggac(Tgn)uaauugGf GUUUGUGACCCAAU AD-392821 9 9 9 uaaguccuaL96 gUfcacaasasc UAAGUCCUA 0 1 2
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 3 3 3 ususcag(Ahd)UfgAfCfGfu usUfsggcc(Agn)agacguCf UAUUCAGAUGACGU AD-392822 9 9 9 cuuggccaaL96 aUfcugaasusa CUUGGCCAA 3 4 5 3 3 3 asuscag(Uhd)UfaCfGfGfa asGfscauc(Ggn)uuuccgUf GGAUCAGUUACGGA AD-392823 9 9 9 aacgaugcuL96 aAfcugauscsc AACGAUGCU 6 7 8 3 4 4 usgsgau(Ghd)CfaGfAfAfu asAfsuguc(Ggn)gaauucUf GAUGGAUGCAGAAU AD-392824 9 0 0 uccgacauuL96 gCfauccasusc UCCGACAUG 9 0 1 4 4 4 gsuscca(Ahd)GfaUfGfCfa asCfsguuc(Tgn)gcugcaUf CUGUCCAAGAUGCA AD-392825 0 0 0 gcagaacguL96 cUfuggacsasg GCAGAACGG 2 3 4 4 4 4 usasccc(Ahd)UfcGfGfUfg asUfsaaau(Ggn)gacaccGf ACUACCCAUCGGUG AD-392826 0 0 0 uccauuuauL96 aUfggguasgsu UCCAUUUAU 5 6 7 4 4 4 ususuug(Ahd)CfaGfCfUfg asUfsuaca(Ggn)cacagcUf CCUUUUGACAGCUG AD-392827 0 0 1 ugcuguaauL96 gUfcaaaasgsg UGCUGUAAC 8 9 0 4 4 4 ususgac(Ahd)GfcUfGfUfg asUfsguua(Cgn)agcacaGf UUUUGACAGCUGUG AD-392828 1 1 1 cuguaacauL96 cUfgucaasasa CUGUAACAC 1 2 3 4 4 4 asgscug(Uhd)GfcUfGfUfa usAfscuug(Tgn)guuacaGf ACAGCUGUGCUGUA AD-392829 1 1 1 acacaaguaL96 cAfcagcusgsu ACACAAGUA 4 5 6 4 4 4 gsusuuu(Ahd)UfgUfGfCfa asCfsuaau(Ggn)ugugcaCf CUGUUUUAUGUGCA AD-392830 1 1 1 cacauuaguL96 aUfaaaacsasg CACAUUAGG 7 8 9 4 4 4 ususcaa(Uhd)UfaCfCfAfa asGfsagaa(Tgn)ucuuggUf UCUUCAAUUACCAA AD-392831 2 2 2 gaauucucuL96 aAfuugaasgsa GAAUUCUCC 0 1 2 4 4 4 csascac(Ahd)UfcAfGfUfa asGfsaaua(Cgn)auuacuGf UCCACACAUCAGUA AD-392832 2 2 2 auguauucuL96 aUfgugugsgsa AUGUAUUCU 3 4 5 4 4 4 usgsguc(Uhd)CfuAfUfAfc asAfsuaau(Ggn)uaguauAf UUUGGUCUCUAUAC AD-392833 2 2 2 uacauuauuL96 gAfgaccasasa UACAUUAUU 6 7 8 4 4 4 ascsccg(Uhd)UfuUfAfUfg usGfsagua(Agn)aucauaAf AAACCCGUUUUAUG AD-392834 2 3 3 auuuacucaL96 aAfcgggususu AUUUACUCA 9 0 1 4 4 4 usascga(Ahd)AfaUfCfCfa asUfsugua(Ggn)guuggaUf GCUACGAAAAUCCA AD-392835 3 3 3 accuacaauL96 uUfucguasgsc ACCUACAAG 2 3 4 uscscac(Ahd)CfaUfCfAfg 4 asAfsuaca(Tgn)uacugaUf 4 AAUCCACACAUCAG 4 AD-392836 uaauguauuL96 3 gUfguggasusu 3 UAAUGUAUU 3
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 5 6 7 4 4 4 csusggu(Chd)UfuCfAfAfu usUfscuug(Ggn)uaauugAf UGCUGGUCUUCAAU AD-392837 3 3 4 uaccaagaaL96 aGfaccagscsa UACCAAGAA 8 9 0 4 4 4 gscscau(Chd)UfuUfGfAfc usUfscguu(Tgn)cggucaAf AUGCCAUCUUUGAC AD-392838 4 4 4 cgaaacgaaL96 aGfauggcsasu CGAAACGAA 1 2 3 4 4 4 cscsauc(Uhd)UfuGfAfCfc usUfsucgu(Tgn)ucggucAf UGCCAUCUUUGACC AD-392839 4 4 4 gaaacgaaaL96 aAfgauggscsa GAAACGAAA 4 5 6 4 4 4 csusacg(Ahd)AfaAfUfCfc usUfsguag(Ggn)uuggauUf GGCUACGAAAAUCC AD-392840 4 4 4 aaccuacaaL96 uUfcguagscsc AACCUACAA 7 8 9 4 4 4 asuscca(Chd)AfcAfUfCfa asUfsacau(Tgn)acugauGf UAAUCCACACAUCA AD-392841 5 5 5 guaauguauL96 uGfuggaususa GUAAUGUAU 0 1 2 4 4 4 csasugc(Chd)AfuCfUfUfu asUfsuucg(Ggn)ucaaagAf CUCAUGCCAUCUUU AD-392842 5 5 5 gaccgaaauL96 uGfgcaugsasg GACCGAAAC 3 4 5 4 4 4 gsgscua(Chd)GfaAfAfAfu asUfsaggu(Tgn)ggauuuUf ACGGCUACGAAAAU AD-392843 5 5 5 ccaaccuauL96 cGfuagccsgsu CCAACCUAC 6 7 8 4 4 4 uscsaug(Chd)CfaUfCfUfu usUfsucgg(Tgn)caaagaUf UCUCAUGCCAUCUU AD-392844 5 6 6 ugaccgaaaL96 gGfcaugasgsa UGACCGAAA 9 0 1 4 4 4 csasgua(Chd)AfcAfUfCfc asUfsgaug(Agn)auggauGf AACAGUACACAUCC AD-392845 6 6 6 auucaucauL96 uGfuacugsusu AUUCAUCAU 2 3 4 4 4 4 asascgg(Chd)UfaCfGfAfa asGfsuugg(Agn)uuuucgUf AGAACGGCUACGAA AD-392846 6 6 6 aauccaacuL96 aGfccguuscsu AAUCCAACC 5 6 7 4 4 4 gsasagu(Uhd)UfcAfUfUfu usUfsguau(Cgn)auaaauGf CUGAAGUUUCAUUU AD-392847 6 6 7 augauacaaL96 aAfacuucsasg AUGAUACAA 8 9 0 4 4 4 asusgcc(Ahd)UfcUfUfUfg asGfsuuuc(Ggn)gucaaaGf UCAUGCCAUCUUUG AD-392848 7 7 7 accgaaacuL96 aUfggcausgsa ACCGAAACG 1 2 3 4 4 4 gsasacg(Ghd)CfuAfCfGfa asUfsugga(Tgn)uuucguAf CAGAACGGCUACGA AD-392849 7 7 7 aaauccaauL96 gCfcguucsusg AAAUCCAAC 4 5 6 4 4 4 uscsuuc(Ghd)UfgCfCfUfg asAfscaua(Agn)aacaggCf UUUCUUCGUGCCUG AD-392850 7 7 7 uuuuauguuL96 aCfgaagasasa UUUUAUGUG 7 8 9
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 4 4 4 ususgcc(Chd)GfaGfAfUfc asUfsuuaa(Cgn)aggaucUf UCUUGCCCGAGAUC AD-392851 8 8 8 cuguuaaauL96 cGfggcaasgsa CUGUUAAAC 0 1 2 4 4 4 csusucg(Uhd)GfcCfUfGfu asCfsacau(Agn)aaacagGf UUCUUCGUGCCUGU AD-392852 8 8 8 uuuauguguL96 cAfcgaagsasa UUUAUGUGC 3 4 5 4 4 4 gscsgcc(Ahd)UfgUfCfCfc asUfsaaac(Tgn)uugggaCf CAGCGCCAUGUCCC AD-392853 8 8 8 aaaguuuauL96 aUfggcgcsusg AAAGUUUAC 6 7 8 4 4 4 gsuscau(Ahd)GfcGfAfCfa asAfscgau(Cgn)acugucGf UUGUCAUAGCGACA AD-392854 8 9 9 gugaucguuL96 cUfaugacsasa GUGAUCGUC 9 0 1 4 4 4 gscsuac(Ghd)AfaAfAfUfc usGfsuagg(Tgn)uggauuUf CGGCUACGAAAAUC AD-392855 9 9 9 caaccuacaL96 uCfguagcscsg CAACCUACA 2 3 4 4 4 4 asusagc(Ghd)AfcAfGfUfg asAfsugac(Ggn)aucacuGf UCAUAGCGACAGUG AD-392856 9 9 9 aucgucauuL96 uCfgcuausgsa AUCGUCAUC 5 6 7 4 4 5 csusugc(Chd)CfgAfGfAfu usUfsuaac(Agn)ggaucuCf CUCUUGCCCGAGAU AD-392857 9 9 0 ccuguuaaaL96 gGfgcaagsasg CCUGUUAAA 8 9 0 5 5 5 csuscau(Ghd)CfcAfUfCfu usUfscggu(Cgn)aaagauGf CUCUCAUGCCAUCU AD-392858 0 0 0 uugaccgaaL96 gCfaugagsasg UUGACCGAA 1 2 3 5 5 5 ascsggc(Uhd)AfcGfAfAfa asGfsguug(Ggn)auuuucGf GAACGGCUACGAAA AD-392859 0 0 0 auccaaccuL96 uAfgccgususc AUCCAACCU 4 5 6 5 5 5 csasuca(Ahd)AfaAfUfUfg asAfsagaa(Cgn)accaauUf AUCAUCAAAAAUUG AD-392860 0 0 0 guguucuuuL96 uUfugaugsasu GUGUUCUUU 7 8 9 5 5 5 asuscca(Ahd)CfcUfAfCfa csAfsaaga(Agn)cuuguaGf AAAUCCAACCUACA AD-392861 1 1 1 aguucuuugL96 gUfuggaususu AGUUCUUUG 0 1 2 5 5 5 csgscuu(Uhd)CfuAfCfAfc usGfsuaau(Agn)caguguAf AUCGCUUUCUACAC AD-392862 1 1 1 uguauuacaL96 gAfaagcgsasu UGUAUUACA 3 4 5 5 5 5 uscscaa(Chd)CfuAfCfAfa usCfsaaag(Agn)acuuguAf AAUCCAACCUACAA AD-392863 1 1 1 guucuuugaL96 gGfuuggasusu GUUCUUUGA 6 7 8 5 5 5 uscsucu(Chd)UfuUfAfCfa asGfsacca(Agn)aauguaAf UAUCUCUCUUUACA AD-392864 1 2 2 uuuuggucuL96 aGfagagasusa UUUUGGUCU 9 0 1 csuscuc(Uhd)UfuAfCfAfu 5 asAfsgacc(Agn)aaauguAf 5 AUCUCUCUUUACAU 5 AD-392865 uuuggucuuL96 2 aAfgagagsasu 2 UUUGGUCUC 2
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
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D D D N N N
O O O 2 3 4 5 5 5 ususugu(Ghd)UfaCfUfGfu asAfsauuc(Tgn)uuacagUf GUUUUGUGUACUGU AD-392866 2 2 2 aaagaauuuL96 aCfacaaasasc AAAGAAUUU 5 6 7 5 5 5 gsusgua(Chd)UfgUfAfAfa asCfsuaaa(Tgn)ucuuuaCf UUGUGUACUGUAAA AD-392867 2 2 3 gaauuuaguL96 aGfuacacsasa GAAUUUAGC 8 9 0 5 5 5 ascscca(Ahd)UfuAfAfGfu usAfsaagu(Agn)ggacuuAf UGACCCAAUUAAGU AD-392868 3 3 3 ccuacuuuaL96 aUfuggguscsa CCUACUUUA 1 2 3 5 5 5 uscscua(Chd)UfuUfAfCfa usAfsaagc(Agn)uauguaAf AGUCCUACUUUACA AD-392869 3 3 3 uaugcuuuaL96 aGfuaggascsu UAUGCUUUA 4 5 6 5 5 5 cscsuac(Uhd)UfuAfCfAfu usUfsaaag(Cgn)auauguAf GUCCUACUUUACAU AD-392870 3 3 3 augcuuuaaL96 aAfguaggsasc AUGCUUUAA 7 8 9 5 5 5 ususcua(Chd)AfcUfGfUfa usUfsuaug(Tgn)aauacaGf CUUUCUACACUGUA AD-392871 4 4 4 uuacauaaaL96 uGfuagaasasg UUACAUAAA 0 1 2 5 5 5 uscsuac(Ahd)CfuGfUfAfu asUfsuuau(Ggn)uaauacAf UUUCUACACUGUAU AD-392872 4 4 4 uacauaaauL96 gUfguagasasa UACAUAAAU 3 4 5 5 5 5 csusuuu(Ahd)AfgAfUfGfu asUfsugaa(Ggn)acacauCf UUCUUUUAAGAUGU AD-392873 4 4 4 gucuucaauL96 uUfaaaagsasa GUCUUCAAU 6 7 8 5 5 5 asusgug(Uhd)CfuUfCfAfa usUfsauac(Agn)aauugaAf AGAUGUGUCUUCAA AD-392874 4 5 5 uuuguauaaL96 gAfcacauscsu UUUGUAUAA 9 0 1 5 5 5 asuscaa(Ahd)AfaUfUfGfg csAfsaaga(Agn)caccaaUf UCAUCAAAAAUUGG AD-392875 5 5 5 uguucuuugL96 uUfuugausgsa UGUUCUUUG 2 3 4 5 5 5 asasauc(Chd)AfaCfCfUfa asAfsgaac(Tgn)uguaggUf GAAAAUCCAACCUA AD-392876 5 5 5 caaguucuuL96 uGfgauuususc CAAGUUCUU 5 6 7 5 5 5 gsusacu(Ghd)UfaAfAfGfa asAfsgcua(Agn)auucuuUf GUGUACUGUAAAGA AD-392877 5 5 6 auuuagcuuL96 aCfaguacsasc AUUUAGCUG 8 9 0 5 5 5 csusccu(Ghd)AfuUfAfUfu usAfsugug(Agn)uaaauaAf CUCUCCUGAUUAUU AD-392878 6 6 6 uaucacauaL96 uCfaggagsasg UAUCACAUA 1 2 3 5 5 5 gscscag(Uhd)UfgUfAfUfa asAfsagaa(Tgn)aauauaCf UAGCCAGUUGUAUA AD-392879 6 6 6 uuauucuuuL96 aAfcuggcsusa UUAUUCUUG 4 5 6
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
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O O O 5 5 5 asasuua(Ahd)GfuCfCfUfa usAfsugua(Agn)aguaggAf CCAAUUAAGUCCUA AD-392880 6 6 6 cuuuacauaL96 cUfuaauusgsg CUUUACAUA 7 8 9 5 5 5 csusugc(Chd)UfaAfGfUfa asGfsaaag(Ggn)aauacuUf CUCUUGCCUAAGUA AD-392881 7 7 7 uuccuuucuL96 aGfgcaagsasg UUCCUUUCC 0 1 2 5 5 5 asusucc(Uhd)UfuCfCfUfg asAfsuagu(Ggn)aucaggAf GUAUUCCUUUCCUG AD-392882 7 7 7 aucacuauuL96 aAfggaausasc AUCACUAUG 3 4 5 5 5 5 ascsuau(Ghd)CfaUfUfUfu usUfsuaac(Tgn)uuaaaaUf UCACUAUGCAUUUU AD-392883 7 7 7 aaaguuaaaL96 gCfauagusgsa AAAGUUAAA 6 7 8 5 5 5 usgsuuc(Ahd)UfuGfUfAfa usAfsaaag(Tgn)gcuuacAf CCUGUUCAUUGUAA AD-392884 7 8 8 gcacuuuuaL96 aUfgaacasgsg GCACUUUUA 9 0 1 5 5 5 asasuua(Chd)CfaAfGfAfa usUfsugga(Ggn)aauucuUf UCAAUUACCAAGAA AD-392885 8 8 8 uucuccaaaL96 gGfuaauusgsa UUCUCCAAA 2 3 4 5 5 5 ususacc(Ahd)AfgAfAfUfu asUfsuuug(Ggn)agaauuCf AAUUACCAAGAAUU AD-392886 8 8 8 cuccaaaauL96 uUfgguaasusu CUCCAAAAC 5 6 7 5 5 5 uscsauu(Ghd)CfuUfAfUfg asGfsauca(Tgn)gucauaAf AAUCAUUGCUUAUG AD-392887 8 8 9 acaugaucuL96 gCfaaugasusu ACAUGAUCG 8 9 0 5 5 5 ususuua(Ahd)GfaUfGfUfg asAfsuuga(Agn)gacacaUf UCUUUUAAGAUGUG AD-392889 9 9 9 ucuucaauuL96 cUfuaaaasgsa UCUUCAAUU 1 2 3 5 5 5 asusccu(Ghd)UfuAfAfAfc usUfsguag(Ggn)aaguuuAf AGAUCCUGUUAAAC AD-392890 9 9 9 uuccuacaaL96 aCfaggauscsu UUCCUACAA 4 5 6 5 5 5 ascsuau(Uhd)CfaGfAfUfg asCfsaaga(Cgn)gucaucUf AAACUAUUCAGAUG AD-392891 9 9 9 acgucuuguL96 gAfauagususu ACGUCUUGG 7 8 9 6 6 6 gsusuca(Uhd)CfaUfCfAfa asAfsccaa(Tgn)uuuugaUf AAGUUCAUCAUCAA AD-392892 0 0 0 aaauugguuL96 gAfugaacsusu AAAUUGGUG 0 1 2 6 6 6 usasucu(Chd)UfcUfUfUfa asCfscaaa(Agn)uguaaaGf UCUAUCUCUCUUUA AD-392893 0 0 0 cauuuugguL96 aGfagauasgsa CAUUUUGGU 3 4 5 6 6 6 asuscuc(Uhd)CfuUfUfAfc asAfsccaa(Agn)auguaaAf CUAUCUCUCUUUAC AD-392894 0 0 0 auuuugguuL96 gAfgagausasg AUUUUGGUC 6 7 8 usgsugu(Ahd)CfuGfUfAfa 6 asUfsaaau(Tgn)cuuuacAf 6 UUUGUGUACUGUAA 6 AD-392895 agaauuuauL96 0 gUfacacasasa 1 AGAAUUUAG 1
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 9 0 1 6 6 6 csusacu(Uhd)UfaCfAfUfa asUfsuaaa(Ggn)cauaugUf UCCUACUUUACAUA AD-392896 1 1 1 ugcuuuaauL96 aAfaguagsgsa UGCUUUAAG 2 3 4 6 6 6 usgsccu(Ahd)AfgUfAfUfu asAfsggaa(Agn)ggaauaCf CUUGCCUAAGUAUU AD-392897 1 1 1 ccuuuccuuL96 uUfaggcasasg CCUUUCCUG 5 6 7 6 6 6 asasgua(Uhd)UfcCfUfUfu asUfsgauc(Agn)ggaaagGf CUAAGUAUUCCUUU AD-392898 1 1 2 ccugaucauL96 aAfuacuusasg CCUGAUCAC 8 9 0 6 6 6 gsusauu(Chd)CfuUfUfCfc usAfsguga(Tgn)caggaaAf AAGUAUUCCUUUCC AD-392899 2 2 2 ugaucacuaL96 gGfaauacsusu UGAUCACUA 1 2 3 6 6 6 ususccu(Ghd)AfuCfAfCfu asAfsaaug(Cgn)auagugAf CUUUCCUGAUCACU AD-392900 2 2 2 augcauuuuL96 uCfaggaasasg AUGCAUUUU 4 5 6 6 6 6 csusgau(Chd)AfcUfAfUfg usUfsuaaa(Agn)ugcauaGf UCCUGAUCACUAUG AD-392901 2 2 2 cauuuuaaaL96 uGfaucagsgsa CAUUUUAAA 7 8 9 6 6 6 csascgu(Ahd)UfcUfUfUfg usCfsaaag(Agn)cccaaaGf UCCACGUAUCUUUG AD-392902 3 3 3 ggucuuugaL96 aUfacgugsgsa GGUCUUUGA 0 1 2 6 6 6 usgsggu(Chd)UfuUfGfAfu asUfsuuuc(Tgn)uuaucaAf UUUGGGUCUUUGAU AD-392903 3 3 3 aaagaaaauL96 aGfacccasasa AAAGAAAAG 3 4 5 6 6 6 uscsaau(Uhd)AfcCfAfAfg usGfsgaga(Agn)uucuugGf CUUCAAUUACCAAG AD-392904 3 3 3 aauucuccaL96 uAfauugasasg AAUUCUCCA 6 7 8 6 6 6 uscsgcu(Uhd)UfcUfAfCfa asUfsaaua(Cgn)aguguaGf GAUCGCUUUCUACA AD-392906 3 4 4 cuguauuauL96 aAfagcgasusc CUGUAUUAC 9 0 1 6 6 6 asusuuu(Chd)UfuUfAfAfc usUfscaga(Cgn)ugguuaAf CAAUUUUCUUUAAC AD-392907 4 4 4 cagucugaaL96 aGfaaaaususg CAGUCUGAA 2 3 4 6 6 6 csusuua(Ahd)CfcAfGfUfc gsAfsaacu(Tgn)cagacuGf UUCUUUAACCAGUC AD-392908 4 4 4 ugaaguuucL96 gUfuaaagsasa UGAAGUUUC 5 6 7 6 6 6 usasaga(Uhd)GfuGfUfCfu asCfsaaau(Tgn)gaagacAf UUUAAGAUGUGUCU AD-392909 4 4 5 ucaauuuguL96 cAfucuuasasa UCAAUUUGU 8 9 0 6 6 6 gsasucc(Uhd)GfuUfAfAfa usGfsuagg(Agn)aguuuaAf GAGAUCCUGUUAAA AD-392910 5 5 5 cuuccuacaL96 cAfggaucsusc CUUCCUACA 1 2 3
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 6 6 6 csusgcu(Uhd)CfaGfAfAfa asUfsuuug(Cgn)ucuuucUf AGCUGCUUCAGAAA AD-392911 5 5 5 gagcaaaauL96 gAfagcagscsu GAGCAAAAC 4 5 6 6 6 6 csasgaa(Ahd)GfaGfCfAfa usGfsaaua(Ggn)uuuugcUf UUCAGAAAGAGCAA AD-392912 5 5 5 aacuauucaL96 cUfuucugsasa AACUAUUCA 7 8 9 6 6 6 usasuga(Ahd)GfuUfCfAfu usUfsuuug(Agn)ugaugaAf GAUAUGAAGUUCAU AD-392913 6 6 6 caucaaaaaL96 cUfucauasusc CAUCAAAAA 0 1 2 6 6 6 csasuca(Uhd)CfaAfAfAfa asAfsacac(Cgn)aauuuuUf UUCAUCAUCAAAAA AD-392914 6 6 6 uugguguuuL96 gAfugaugsasa UUGGUGUUC 3 4 5 6 6 6 uscsaaa(Ahd)AfuUfGfGfu asCfsaaag(Agn)acaccaAf CAUCAAAAAUUGGU AD-392915 6 6 6 guucuuuguL96 uUfuuugasusg GUUCUUUGC 6 7 8 6 6 6 asasaau(Chd)CfaAfCfCfu asGfsaacu(Tgn)guagguUf CGAAAAUCCAACCU AD-392916 6 7 7 acaaguucuL96 gGfauuuuscsg ACAAGUUCU 9 0 1 6 6 6 cscsaac(Chd)UfaCfAfAfg asUfscaaa(Ggn)aacuugUf AUCCAACCUACAAG AD-392917 7 7 7 uucuuugauL96 aGfguuggsasu UUCUUUGAG 2 3 4 6 6 6 ascsuca(Uhd)UfaUfCfGfc usGfsucaa(Agn)aggcgaUf UUACUCAUUAUCGC AD-392918 7 7 7 cuuuugacaL96 aAfugagusasa CUUUUGACA 5 6 7 6 6 6 csuscau(Uhd)AfuCfGfCfc asUfsguca(Agn)aaggcgAf UACUCAUUAUCGCC AD-392919 7 7 8 uuuugacauL96 uAfaugagsusa UUUUGACAG 8 9 0 6 6 6 usgsugc(Uhd)GfuAfAfCfa asUfscuac(Tgn)uguguuAf GCUGUGCUGUAACA AD-392920 8 8 8 caaguagauL96 cAfgcacasgsc CAAGUAGAU 1 2 3 6 6 6 gsusgcu(Ghd)UfaAfCfAfc asAfsucua(Cgn)uuguguUf CUGUGCUGUAACAC AD-392921 8 8 8 aaguagauuL96 aCfagcacsasg AAGUAGAUG 4 5 6 6 6 6 uscsuuu(Ahd)CfaUfUfUfu asUfsagag(Agn)ccaaaaUf UCUCUUUACAUUUU AD-392922 8 8 8 ggucucuauL96 gUfaaagasgsa GGUCUCUAU 7 8 9 6 6 6 asusggg(Uhd)UfuUfGfUfg usUfsuaca(Ggn)uacacaAf UAAUGGGUUUUGUG AD-392923 9 9 9 uacuguaaaL96 aAfcccaususa UACUGUAAA 0 1 2 6 6 6 ususgug(Uhd)AfcUfGfUfa usAfsaauu(Cgn)uuuacaGf UUUUGUGUACUGUA AD-392924 9 9 9 aagaauuuaL96 uAfcacaasasa AAGAAUUUA 3 4 5 gscsugu(Ahd)UfcAfAfAfc 6 asAfsugca(Cgn)uaguuuGf 6 UAGCUGUAUCAAAC 6 AD-392925 uagugcauuL96 9 aUfacagcsusa 9 UAGUGCAUG 9
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 6 7 8 6 7 7 csusagu(Ghd)CfaUfGfAfa asAfsgaau(Cgn)uauucaUf AACUAGUGCAUGAA AD-392926 9 0 0 uagauucuuL96 gCfacuagsusu UAGAUUCUC 9 0 1 7 7 7 usasgug(Chd)AfuGfAfAfu asGfsagaa(Tgn)cuauucAf ACUAGUGCAUGAAU AD-392927 0 0 0 agauucucuL96 uGfcacuasgsu AGAUUCUCU 2 3 4 7 7 7 csuscuc(Chd)UfgAfUfUfa usGfsugau(Agn)aauaauCf UUCUCUCCUGAUUA AD-392928 0 0 0 uuuaucacaL96 aGfgagagsasa UUUAUCACA 5 6 7 7 7 7 cscsuga(Uhd)UfaUfUfUfa asCfsuaug(Tgn)gauaaaUf CUCCUGAUUAUUUA AD-392929 0 0 1 ucacauaguL96 aAfucaggsasg UCACAUAGC 8 9 0 7 7 7 usasagu(Chd)CfuAfCfUfu asCfsauau(Ggn)uaaaguAf AUUAAGUCCUACUU AD-392930 1 1 1 uacauauguL96 gGfacuuasasu UACAUAUGC 1 2 3 7 7 7 asgsucc(Uhd)AfcUfUfUfa asAfsgcau(Agn)uguaaaGf UAAGUCCUACUUUA AD-392931 1 1 1 cauaugcuuL96 uAfggacususa CAUAUGCUU 4 5 6 7 7 7 gsusccu(Ahd)CfuUfUfAfc asAfsagca(Tgn)auguaaAf AAGUCCUACUUUAC AD-392932 1 1 1 auaugcuuuL96 gUfaggacsusu AUAUGCUUU 7 8 9 7 7 7 ususcuc(Uhd)UfgCfCfUfa asGfsgaau(Agn)cuuaggCf GCUUCUCUUGCCUA AD-392933 2 2 2 aguauuccuL96 aAfgagaasgsc AGUAUUCCU 0 1 2 7 7 7 csuscuu(Ghd)CfcUfAfAfg asAfsagga(Agn)uacuuaGf UUCUCUUGCCUAAG AD-392934 2 2 2 uauuccuuuL96 gCfaagagsasa UAUUCCUUU 3 4 5 7 7 7 usasuuc(Chd)UfuUfCfCfu asUfsagug(Agn)ucaggaAf AGUAUUCCUUUCCU AD-392935 2 2 2 gaucacuauL96 aGfgaauascsu GAUCACUAU 6 7 8 7 7 7 ususucc(Uhd)GfaUfCfAfc asAfsaugc(Agn)uagugaUf CCUUUCCUGAUCAC AD-392936 2 3 3 uaugcauuuL96 cAfggaaasgsg UAUGCAUUU 9 0 1 7 7 7 csascua(Uhd)GfcAfUfUfu usUfsaacu(Tgn)uaaaauGf AUCACUAUGCAUUU AD-392937 3 3 3 uaaaguuaaL96 cAfuagugsasu UAAAGUUAA 2 3 4 7 7 7 csusgca(Uhd)UfuUfAfCfu asAfsucug(Tgn)acaguaAf GACUGCAUUUUACU AD-392938 3 3 3 guacagauuL96 aAfugcagsusc GUACAGAUU 5 6 7 7 7 7 ususcug(Chd)UfaUfAfUfu usAfsuauc(Agn)caaauaUf GCUUCUGCUAUAUU AD-392939 3 3 4 ugugauauaL96 aGfcagaasgsc UGUGAUAUA 8 9 0
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 7 7 7 uscsugc(Uhd)AfuAfUfUfu asUfsauau(Cgn)acaaauAf CUUCUGCUAUAUUU AD-392940 4 4 4 gugauauauL96 uAfgcagasasg GUGAUAUAG 1 2 3 7 7 7 ascsgua(Uhd)CfuUfUfGfg asUfscaaa(Ggn)acccaaAf CCACGUAUCUUUGG AD-392941 4 4 4 gucuuugauL96 gAfuacgusgsg GUCUUUGAU 4 5 6 7 7 7 uscsuuu(Ghd)GfgUfCfUfu usCfsuuua(Tgn)caaagaCf UAUCUUUGGGUCUU AD-392942 4 4 4 ugauaaagaL96 cCfaaagasusa UGAUAAAGA 7 8 9 7 7 7 csusuug(Ghd)GfuCfUfUfu usUfscuuu(Agn)ucaaagAf AUCUUUGGGUCUUU AD-392943 5 5 5 gauaaagaaL96 cCfcaaagsasu GAUAAAGAA 0 1 2 7 7 7 ususggg(Uhd)CfuUfUfGfa usUfsuucu(Tgn)uaucaaAf CUUUGGGUCUUUGA AD-392944 5 5 5 uaaagaaaaL96 gAfcccaasasg UAAAGAAAA 3 4 5 7 7 7 asgsaau(Chd)CfcUfGfUfu asUfsuaca(Agn)ugaacaGf AAAGAAUCCCUGUU AD-392945 5 5 5 cauuguaauL96 gGfauucususu CAUUGUAAG 6 7 8 7 7 7 gsasauc(Chd)CfuGfUfUfc asCfsuuac(Agn)augaacAf AAGAAUCCCUGUUC AD-392946 5 6 6 auuguaaguL96 gGfgauucsusu AUUGUAAGC 9 0 1 7 7 7 gsusuca(Uhd)UfgUfAfAfg asUfsaaaa(Ggn)ugcuuaCf CUGUUCAUUGUAAG AD-392947 6 6 6 cacuuuuauL96 aAfugaacsasg CACUUUUAC 2 3 4 7 7 7 ususaug(Ahd)CfaUfGfAfu usAfsgaaa(Ggn)cgaucaUf GCUUAUGACAUGAU AD-392948 6 6 6 cgcuuucuaL96 gUfcauaasgsc CGCUUUCUA 5 6 7 7 7 7 asusgac(Ahd)UfgAfUfCfg usGfsuaga(Agn)agcgauCf UUAUGACAUGAUCG AD-392949 6 6 7 cuuucuacaL96 aUfgucausasa CUUUCUACA 8 9 0 7 7 7 csasuga(Uhd)CfgCfUfUfu asCfsagug(Tgn)agaaagCf GACAUGAUCGCUUU AD-392950 7 7 7 cuacacuguL96 gAfucaugsusc CUACACUGU 1 2 3 7 7 7 csusuuc(Uhd)AfcAfCfUfg usAfsugua(Agn)uacaguGf CGCUUUCUACACUG AD-392951 7 7 7 uauuacauaL96 uAfgaaagscsg UAUUACAUA 4 5 6 7 7 7 gsasuuc(Ahd)AfuUfUfUfc asUfsgguu(Agn)aagaaaAf CAGAUUCAAUUUUC AD-392952 7 7 7 uuuaaccauL96 uUfgaaucsusg UUUAACCAG 7 8 9 7 7 7 ususucu(Uhd)UfaAfCfCfa asCfsuuca(Ggn)acugguUf AUUUUCUUUAACCA AD-392953 8 8 8 gucugaaguL96 aAfagaaasasu GUCUGAAGU 0 1 2 ususuaa(Ghd)AfuGfUfGfu 7 asAfsauug(Agn)agacacAf 7 CUUUUAAGAUGUGU 7 AD-392954 cuucaauuuL96 8 uCfuuaaasasg 8 CUUCAAUUU 8
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 3 4 5 7 7 7 ususaag(Ahd)UfgUfGfUfc csAfsaauu(Ggn)aagacaCf UUUUAAGAUGUGUC AD-392955 8 8 8 uucaauuugL96 aUfcuuaasasa UUCAAUUUG 6 7 8 7 7 7 asgsaug(Uhd)GfuCfUfUfc asUfsacaa(Agn)uugaagAf UAAGAUGUGUCUUC AD-392956 8 9 9 aauuuguauL96 cAfcaucususa AAUUUGUAU 9 0 1 7 7 7 usgsucu(Uhd)CfaAfUfUfu asUfsuuua(Tgn)acaaauUf UGUGUCUUCAAUUU AD-392957 9 9 9 guauaaaauL96 gAfagacascsa GUAUAAAAU 2 3 4 7 7 7 csusuca(Ahd)UfuUfGfUfa asCfscauu(Tgn)uauacaAf GUCUUCAAUUUGUA AD-392958 9 9 9 uaaaaugguL96 aUfugaagsasc UAAAAUGGU 5 6 7 7 7 8 asusggu(Ghd)UfuUfUfCfa usUfsauuu(Agn)caugaaAf AAAUGGUGUUUUCA AD-392959 9 9 0 uguaaauaaL96 aCfaccaususu UGUAAAUAA 8 9 0 8 8 8 ususcuu(Uhd)UfaAfGfAfu usGfsaaga(Cgn)acaucuUf CCUUCUUUUAAGAU AD-392960 0 0 0 gugucuucaL96 aAfaagaasgsg GUGUCUUCA 1 2 3 8 8 8 usgsuau(Uhd)CfuAfUfCfu usGfsuaaa(Ggn)agagauAf AAUGUAUUCUAUCU AD-392961 0 0 0 cucuuuacaL96 gAfauacasusu CUCUUUACA 4 5 6 8 8 8 gsuscuc(Uhd)AfuAfCfUfa usUfsaaua(Agn)uguaguAf UGGUCUCUAUACUA AD-392962 0 0 0 cauuauuaaL96 uAfgagacscsa CAUUAUUAA 7 8 9 8 8 8 uscsucu(Ahd)UfaCfUfAfc asUfsuaau(Agn)auguagUf GGUCUCUAUACUAC AD-392963 1 1 1 auuauuaauL96 aUfagagascsc AUUAUUAAU 0 1 2 8 8 8 csuscua(Uhd)AfcUfAfCfa asAfsuuaa(Tgn)aauguaGf GUCUCUAUACUACA AD-392964 1 1 1 uuauuaauuL96 uAfuagagsasc UUAUUAAUG 3 4 5 8 8 8 csusuca(Ahd)UfuAfCfCfa asAfsgaau(Tgn)cuugguAf GUCUUCAAUUACCA AD-392965 1 1 1 agaauucuuL96 aUfugaagsasc AGAAUUCUC 6 7 8 8 8 8 cscsaca(Chd)AfuCfAfGfu asAfsauac(Agn)uuacugAf AUCCACACAUCAGU AD-392966 1 2 2 aauguauuuL96 uGfuguggsasu AAUGUAUUC 9 0 1 8 8 8 csusauc(Uhd)CfuCfUfUfu asCfsaaaa(Tgn)guaaagAf UUCUAUCUCUCUUU AD-392967 2 2 2 acauuuuguL96 gAfgauagsasa ACAUUUUGG 2 3 4 8 8 8 gsgsucu(Chd)UfaUfAfCfu usAfsauaa(Tgn)guaguaUf UUGGUCUCUAUACU AD-392968 2 2 2 acauuauuaL96 aGfagaccsasa ACAUUAUUA 5 6 7
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 8 8 8 uscsuau(Ahd)CfuAfCfAfu asCfsauua(Agn)uaauguAf UCUCUAUACUACAU AD-392969 2 2 3 uauuaauguL96 gUfauagasgsa UAUUAAUGG 8 9 0 8 8 8 gsgsucu(Uhd)CfaAfUfUfa asAfsuucu(Tgn)gguaauUf CUGGUCUUCAAUUA AD-392970 3 3 3 ccaagaauuL96 gAfagaccsasg CCAAGAAUU 1 2 3 8 8 8 csasgga(Uhd)AfuGfAfAfg asAfsugau(Ggn)aacuucAf CUCAGGAUAUGAAG AD-392971 3 3 3 uucaucauuL96 uAfuccugsasg UUCAUCAUC 4 5 6 8 8 8 ascsaca(Uhd)CfaGfUfAfa usAfsgaau(Agn)cauuacUf CCACACAUCAGUAA AD-392972 3 3 3 uguauucuaL96 gAfugugusgsg UGUAUUCUA 7 8 9 8 8 8 csusaua(Chd)UfaCfAfUfu asCfscauu(Agn)auaaugUf CUCUAUACUACAUU AD-392973 4 4 4 auuaaugguL96 aGfuauagsasg AUUAAUGGG 0 1 2 8 8 8 cscscgu(Uhd)UfuAfUfGfa asUfsgagu(Agn)aaucauAf AACCCGUUUUAUGA AD-392974 4 4 4 uuuacucauL96 aAfacgggsusu UUUACUCAU 3 4 5 8 8 8 ususcca(Uhd)GfaCfUfGfc asAfsguaa(Agn)augcagUf UUUUCCAUGACUGC AD-392975 4 4 4 auuuuacuuL96 cAfuggaasasa AUUUUACUG 6 7 8 8 8 8 uscsuuc(Ahd)AfuUfAfCfc asGfsaauu(Cgn)uugguaAf GGUCUUCAAUUACC AD-392976 4 5 5 aagaauucuL96 uUfgaagascsc AAGAAUUCU 9 0 1 8 8 8 csusgaa(Ghd)UfuUfCfAfu asUfsauca(Tgn)aaaugaAf GUCUGAAGUUUCAU AD-392977 5 5 5 uuaugauauL96 aCfuucagsasc UUAUGAUAC 2 3 4 TABELA 2B. SEQUÊNCIAS MODIFICADAS DE APP HUMANA, SEM LIGANTE “L96”
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O gsasccc(Ahd)AfuUfAfA 3 asAfsagua(Ggn)gacuuaAf 3 GUGACCCAAUUAAGU 3 AD-392699 fguccuacuuu 3 uUfgggucsasc 4 CCUACUUU 5 uscsucc(Uhd)GfaUfUfA 3 asUfsguga(Tgn)aaauaaUf 3 UCUCUCCUGAUUAUU 3 AD-392700 fuuuaucacau 6 cAfggagasgsa 7 UAUCACAU 8 AD-392703 cscsuga(Ahd)CfuUfGfA 3 asUfsggau(Tgn)aauucaAf 4 UGCCUGAACUUGAAU 4
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O fauuaauccau 9 gUfucaggscsa 0 UAAUCCAC 1 gsgsuuc(Ahd)AfaCfAfA 4 asAfsuugc(Agn)ccuuugUf 4 UGGGUUCAAACAAAG 4 AD-392704 faggugcaauu 2 uUfgaaccscsa 3 GUGCAAUC 4 ususuac(Uhd)CfaUfUfA 4 csAfsaaag(Ggn)cgauaaUf 4 GAUUUACUCAUUAUC 4 AD-392705 fucgccuuuug 5 gAfguaaasusc 6 GCCUUUUG 7 asusuua(Ghd)CfuGfUfA 4 asCfsuagu(Tgn)ugauacAf 4 GAAUUUAGCUGUAUC 5 AD-392707 fucaaacuagu 8 gCfuaaaususc 9 AAACUAGU 0 asgsuau(Uhd)CfcUfUfU 5 asGfsugau(Cgn)aggaaaGf 5 UAAGUAUUCCUUUCC 5 AD-392708 fccugaucacu 1 gAfauacususa 2 UGAUCACU 3 gscsuua(Uhd)GfaCfAfU 5 gsAfsaagc(Ggn)aucaugUf 5 UUGCUUAUGACAUGA 5 AD-392709 fgaucgcuuuc 4 cAfuaagcsasa 5 UCGCUUUC 6 asasgau(Ghd)UfgUfCfU 5 usAfscaaa(Tgn)ugaagaCf 5 UUAAGAUGUGUCUUC 5 AD-392710 fucaauuugua 7 aCfaucuusasa 8 AAUUUGUA 9 gscsaaa(Ahd)CfcAfUfU 6 asUfsagug(Agn)agcaauGf 6 CAGCAAAACCAUUGC 6 AD-392711 fgcuucacuau 0 gUfuuugcsusg 1 UUCACUAC 2 asusuua(Chd)UfcAfUfU 6 asAfsaagg(Cgn)gauaauGf 6 UGAUUUACUCAUUAU 6 AD-392712 faucgccuuuu 3 aGfuaaauscsa 4 CGCCUUUU 5 usascuc(Ahd)UfuAfUfC 6 asUfscaaa(Agn)ggcgauAf 6 UUUACUCAUUAUCGC 6 AD-392713 fgccuuuugau 6 aUfgaguasasa 7 CUUUUGAC 8 usgsccu(Ghd)AfaCfUfU 6 asGfsauua(Agn)uucaagUf 7 GAUGCCUGAACUUGA 7 AD-392714 fgaauuaaucu 9 uCfaggcasusc 0 AUUAAUCC 1 csusgaa(Chd)UfuGfAfA 7 usGfsugga(Tgn)uaauucAf 7 GCCUGAACUUGAAUU 7 AD-392715 fuuaauccaca 2 aGfuucagsgsc 3 AAUCCACA 4 ususuag(Chd)UfgUfAfU 7 asAfscuag(Tgn)uugauaCf 7 AAUUUAGCUGUAUCA 7 AD-392716 fcaaacuaguu 5 aGfcuaaasusu 6 AACUAGUG 7 gsasaua(Ghd)AfuUfCfU 7 usAfsauca(Ggn)gagagaAf 7 AUGAAUAGAUUCUCU 8 AD-392717 fcuccugauua 8 uCfuauucsasu 9 CCUGAUUA 0 uscscug(Ahd)UfuAfUfU 8 asUfsaugu(Ggn)auaaauAf 8 UCUCCUGAUUAUUUA 8 AD-392718 fuaucacauau 1 aUfcaggasgsa 2 UCACAUAG 3 cscscaa(Uhd)UfaAfGfU 8 asUfsaaag(Tgn)aggacuUf 8 GACCCAAUUAAGUCC 8 AD-392719 fccuacuuuau 4 aAfuugggsusc 5 UACUUUAC 6 csasuau(Ghd)CfuUfUfA 8 asAfsucga(Tgn)ucuuaaAf 8 UACAUAUGCUUUAAG 8 AD-392720 fagaaucgauu 7 gCfauaugsusa 8 AAUCGAUG 9 csusucu(Chd)UfuGfCfC 9 asGfsaaua(Cgn)uuaggcAf 9 UGCUUCUCUUGCCUA 9 AD-392721 fuaaguauucu 0 aGfagaagscsa 1 AGUAUUCC 2 csasuug(Chd)UfuAfUfG 9 asCfsgauc(Agn)ugucauAf 9 AUCAUUGCUUAUGAC 9 AD-392722 facaugaucgu 3 aGfcaaugsasu 4 AUGAUCGC 5 csusuau(Ghd)AfcAfUfG 9 asGfsaaag(Cgn)gaucauGf 9 UGCUUAUGACAUGAU 9 AD-392723 faucgcuuucu 6 uCfauaagscsa 7 CGCUUUCU 8 AD-392724 usasuga(Chd)AfuGfAfU 9 asUfsagaa(Agn)gcgaucAf 1 CUUAUGACAUGAUCG 1
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O fcgcuuucuau 9 uGfucauasasg 0 CUUUCUAC 0 0 1 1 1 1 usgsaca(Uhd)GfaUfCfG asUfsguag(Agn)aagcgaUf UAUGACAUGAUCGCU AD-392725 0 0 0 fcuuucuacau cAfugucasusa UUCUACAC 2 3 4 1 1 1 gsasucg(Chd)UfuUfCfU asAfsuaca(Ggn)uguagaAf AUGAUCGCUUUCUAC AD-392726 0 0 0 facacuguauu aGfcgaucsasu ACUGUAUU 5 6 7 1 1 1 asasaac(Uhd)AfuUfCfA asGfsacgu(Cgn)aucugaAf GCAAAACUAUUCAGA AD-392727 0 0 1 fgaugacgucu uAfguuuusgsc UGACGUCU 8 9 0 1 1 1 asasacu(Ahd)UfuCfAfG asAfsgacg(Tgn)caucugAf CAAAACUAUUCAGAU AD-392728 1 1 1 faugacgucuu aUfaguuususg GACGUCUU 1 2 3 1 1 1 ascsgaa(Ahd)AfuCfCfA asCfsuugu(Agn)gguuggAf CUACGAAAAUCCAAC AD-392729 1 1 1 faccuacaagu uUfuucgusasg CUACAAGU 4 5 6 1 1 1 usgscuu(Chd)UfcUfUfG asAfsuacu(Tgn)aggcaaGf GCUGCUUCUCUUGCC AD-392730 1 1 1 fccuaaguauu aGfaagcasgsc UAAGUAUU 7 8 9 1 1 1 usgscuu(Ahd)UfgAfCfA asAfsagcg(Agn)ucauguCf AUUGCUUAUGACAUG AD-392731 2 2 2 fugaucgcuuu aUfaagcasasu AUCGCUUU 0 1 2 1 1 1 usgsauc(Ghd)CfuUfUfC asUfsacag(Tgn)guagaaAf CAUGAUCGCUUUCUA AD-392732 2 2 2 fuacacuguau gCfgaucasusg CACUGUAU 3 4 5 1 1 1 asuscgc(Uhd)UfuCfUfA usAfsauac(Agn)guguagAf UGAUCGCUUUCUACA AD-392733 2 2 2 fcacuguauua aAfgcgauscsa CUGUAUUA 6 7 8 1 1 1 uscsuuu(Ghd)AfcCfGfA asGfsuuuu(Cgn)guuucgGf CAUCUUUGACCGAAA AD-392734 2 3 3 faacgaaaacu uCfaaagasusg CGAAAACC 9 0 1 1 1 1 gsusucu(Ghd)GfgUfUfG usGfsauau(Tgn)ugucaaCf AGGUUCUGGGUUGAC AD-392735 3 3 3 facaaauauca cCfagaacscsu AAAUAUCA 2 3 4 1 1 1 usgsggu(Uhd)GfaCfAfA asUfscuug(Agn)uauuugUf UCUGGGUUGACAAAU AD-392736 3 3 3 fauaucaagau cAfacccasgsa AUCAAGAC 5 6 7 1 1 1 gsasuuu(Ahd)CfuCfAfU asAfsaggc(Ggn)auaaugAf AUGAUUUACUCAUUA AD-392737 3 3 4 fuaucgccuuu gUfaaaucsasu UCGCCUUU 8 9 0 1 1 1 uscscuu(Uhd)CfcUfGfA usGfscaua(Ggn)ugaucaGf AUUCCUUUCCUGAUC AD-392738 4 4 4 fucacuaugca gAfaaggasasu ACUAUGCA 1 2 3
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 1 1 1 csusuuc(Chd)UfgAfUfC asAfsugca(Tgn)agugauCf UCCUUUCCUGAUCAC AD-392739 4 4 4 facuaugcauu aGfgaaagsgsa UAUGCAUU 4 5 6 1 1 1 asusugc(Uhd)UfaUfGfA asGfscgau(Cgn)augucaUf UCAUUGCUUAUGACA AD-392740 4 4 4 fcaugaucgcu aAfgcaausgsa UGAUCGCU 7 8 9 1 1 1 uscsuuu(Ahd)AfcCfAfG asAfsacuu(Cgn)agacugGf UUUCUUUAACCAGUC AD-392741 5 5 5 fucugaaguuu uUfaaagasasa UGAAGUUU 0 1 2 1 1 1 gsgsauc(Ahd)GfuUfAfC asAfsucgu(Tgn)uccguaAf AAGGAUCAGUUACGG AD-392742 5 5 5 fggaaacgauu cUfgauccsusu AAACGAUG 3 4 5 1 1 1 csusggg(Uhd)UfgAfCfA usCfsuuga(Tgn)auuuguCf UUCUGGGUUGACAAA AD-392743 5 5 5 faauaucaaga aAfcccagsasa UAUCAAGA 6 7 8 1 1 1 asusgau(Uhd)UfaCfUfC asGfsgcga(Tgn)aaugagUf UUAUGAUUUACUCAU AD-392744 5 6 6 fauuaucgccu aAfaucausasa UAUCGCCU 9 0 1 1 1 1 csusugu(Ghd)GfuUfUfG asAfsuugg(Ggn)ucacaaAf UUCUUGUGGUUUGUG AD-392745 6 6 6 fugacccaauu cCfacaagsasa ACCCAAUU 2 3 4 1 1 1 asusaug(Chd)UfuUfAfA asCfsaucg(Agn)uucuuaAf ACAUAUGCUUUAAGA AD-392746 6 6 6 fgaaucgaugu aGfcauausgsu AUCGAUGG 5 6 7 1 1 1 ususugu(Chd)CfaCfGfU asCfsccaa(Agn)gauacgUf UUUUUGUCCACGUAU AD-392747 6 6 7 faucuuugggu gGfacaaasasa CUUUGGGU 8 9 0 1 1 1 uscsauu(Ghd)UfaAfGfC asCfsguaa(Agn)agugcuUf GUUCAUUGUAAGCAC AD-392748 7 7 7 facuuuuacgu aCfaaugasasc UUUUACGG 1 2 3 1 1 1 gsgscca(Ahd)CfaUfGfA asGfsuuca(Cgn)uaaucaUf UUGGCCAACAUGAUU AD-392749 7 7 7 fuuagugaacu gUfuggccsasa AGUGAACC 4 5 6 1 1 1 gsasuca(Ghd)UfuAfCfG asCfsaucg(Tgn)uuccguAf AGGAUCAGUUACGGA AD-392750 7 7 7 fgaaacgaugu aCfugaucscsu AACGAUGC 7 8 9 1 1 1 usascgg(Ahd)AfaCfGfA asAfsugag(Agn)gcaucgUf GUUACGGAAACGAUG AD-392751 8 8 8 fugcucucauu uUfccguasasc CUCUCAUG 0 1 2 1 1 1 usgsauu(Uhd)AfcUfCfA asAfsggcg(Agn)uaaugaGf UAUGAUUUACUCAUU AD-392752 8 8 8 fuuaucgccuu uAfaaucasusa AUCGCCUU 3 4 5 gsusaga(Uhd)GfcCfUfG 1 asAfsuuca(Agn)guucagGf 1 AAGUAGAUGCCUGAA 1 AD-392753 faacuugaauu 8 cAfucuacsusu 8 CUUGAAUU 8
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 6 7 8 1 1 1 ususgua(Uhd)AfuUfAfU asAfsccac(Agn)agaauaAf AGUUGUAUAUUAUUC AD-392754 8 9 9 fucuugugguu uAfuacaascsu UUGUGGUU 9 0 1 1 1 1 asusugc(Uhd)GfcUfUfC asAfsauau(Agn)gcagaaGf AGAUUGCUGCUUCUG AD-392755 9 9 9 fugcuauauuu cAfgcaauscsu CUAUAUUU 2 3 4 1 1 1 usgscua(Uhd)AfuUfUfG usCfscuau(Agn)ucacaaAf UCUGCUAUAUUUGUG AD-392756 9 9 9 fugauauagga uAfuagcasgsa AUAUAGGA 5 6 7 1 1 2 ascsaca(Uhd)UfaGfGfC asAfsgucu(Cgn)aaugccUf GCACACAUUAGGCAU AD-392757 9 9 0 fauugagacuu aAfugugusgsc UGAGACUU 8 9 0 2 2 2 asasgaa(Uhd)CfcCfUfG usUfsacaa(Tgn)gaacagGf AAAAGAAUCCCUGUU AD-392758 0 0 0 fuucauuguaa gAfuucuususu CAUUGUAA 1 2 3 2 2 2 csasuug(Uhd)AfaGfCfA asCfscgua(Agn)aagugcUf UUCAUUGUAAGCACU AD-392759 0 0 0 fcuuuuacggu uAfcaaugsasa UUUACGGG 4 5 6 2 2 2 ususgcu(Uhd)AfuGfAfC asAfsgcga(Tgn)caugucAf CAUUGCUUAUGACAU AD-392760 0 0 0 faugaucgcuu uAfagcaasusg GAUCGCUU 7 8 9 2 2 2 csasagg(Ahd)UfcAfGfU asGfsuuuc(Cgn)guaacuGf ACCAAGGAUCAGUUA AD-392761 1 1 1 fuacggaaacu aUfccuugsgsu CGGAAACG 0 1 2 2 2 2 asgsguu(Chd)UfgGfGfU asUfsauuu(Ggn)ucaaccCf CCAGGUUCUGGGUUG AD-392762 1 1 1 fugacaaauau aGfaaccusgsg ACAAAUAU 3 4 5 2 2 2 asasgau(Ghd)UfgGfGfU asUfsuugu(Tgn)ugaaccCf AGAAGAUGUGGGUUC AD-392763 1 1 1 fucaaacaaau aCfaucuuscsu AAACAAAG 6 7 8 2 2 2 csusgaa(Ghd)AfaGfAfA usGfsugua(Cgn)uguuucUf UGCUGAAGAAGAAAC AD-392764 1 2 2 facaguacaca uCfuucagscsa AGUACACA 9 0 1 2 2 2 asasguu(Ghd)GfaCfAfG asAfsuggu(Tgn)uugcugUf UGAAGUUGGACAGCA AD-392765 2 2 2 fcaaaaccauu cCfaacuuscsa AAACCAUU 2 3 4 2 2 2 asuscgg(Uhd)GfuCfCfA asUfsucua(Tgn)aaauggAf CCAUCGGUGUCCAUU AD-392766 2 2 2 fuuuauagaau cAfccgausgsg UAUAGAAU 5 6 7 2 2 2 uscsggu(Ghd)UfcCfAfU usAfsuucu(Agn)uaaaugGf CAUCGGUGUCCAUUU AD-392767 2 2 3 fuuauagaaua aCfaccgasusg AUAGAAUA 8 9 0
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 2 2 2 gscsugu(Ahd)AfcAfCfA asGfscauc(Tgn)acuuguGf GUGCUGUAACACAAG AD-392768 3 3 3 faguagaugcu uUfacagcsasc UAGAUGCC 1 2 3 2 2 2 asasgua(Ghd)AfuGfCfC usUfscaag(Tgn)ucaggcAf ACAAGUAGAUGCCUG AD-392769 3 3 3 fugaacuugaa uCfuacuusgsu AACUUGAA 4 5 6 2 2 2 ususgug(Ghd)UfuUfGfU usAfsauug(Ggn)gucacaAf UCUUGUGGUUUGUGA AD-392770 3 3 3 fgacccaauua aCfcacaasgsa CCCAAUUA 7 8 9 2 2 2 gsusuug(Uhd)GfaCfCfC asGfsacuu(Agn)auugggUf UGGUUUGUGACCCAA AD-392771 4 4 4 faauuaagucu cAfcaaacscsa UUAAGUCC 0 1 2 2 2 2 gsusgac(Chd)CfaAfUfU asGfsuagg(Agn)cuuaauUf UUGUGACCCAAUUAA AD-392772 4 4 4 faaguccuacu gGfgucacsasa GUCCUACU 3 4 5 2 2 2 usasugc(Uhd)UfuAfAfG asCfscauc(Ggn)auucuuAf CAUAUGCUUUAAGAA AD-392773 4 4 4 faaucgauggu aAfgcauasusg UCGAUGGG 6 7 8 2 2 2 ususugu(Ghd)AfuAfUfA usCfsuuaa(Tgn)uccuauAf UAUUUGUGAUAUAGG AD-392774 4 5 5 fggaauuaaga uCfacaaasusa AAUUAAGA 9 0 1 2 2 2 asasaga(Ahd)UfcCfCfU usAfscaau(Ggn)aacaggGf GAAAAGAAUCCCUGU AD-392775 5 5 5 fguucauugua aUfucuuususc UCAUUGUA 2 3 4 2 2 2 usgsauu(Ghd)UfaCfAfG asGfscaau(Ggn)auucugUf GAUGAUUGUACAGAA AD-392776 5 5 5 faaucauugcu aCfaaucasusc UCAUUGCU 5 6 7 2 2 2 usgsccu(Ghd)GfaCfAfA asAfsagaa(Ggn)gguuugUf CAUGCCUGGACAAAC AD-392777 5 5 6 facccuucuuu cCfaggcasusg CCUUCUUU 8 9 0 2 2 2 gsasgca(Ahd)AfaCfUfA asUfscauc(Tgn)gaauagUf AAGAGCAAAACUAUU AD-392778 6 6 6 fuucagaugau uUfugcucsusu CAGAUGAC 1 2 3 2 2 2 asgsuga(Ahd)CfcAfAfG asUfsaacu(Ggn)auccuuGf UUAGUGAACCAAGGA AD-392779 6 6 6 fgaucaguuau gUfucacusasa UCAGUUAC 4 5 6 2 2 2 usgsaac(Chd)AfaGfGfA asCfsguaa(Cgn)ugauccUf AGUGAACCAAGGAUC AD-392780 6 6 6 fucaguuacgu uGfguucascsu AGUUACGG 7 8 9 2 2 2 csasguu(Ahd)CfgGfAfA asGfsagca(Tgn)cguuucCf AUCAGUUACGGAAAC AD-392781 7 7 7 facgaugcucu gUfaacugsasu GAUGCUCU 0 1 2 asgsaag(Ahd)UfgUfGfG 2 usUfsguuu(Ggn)aacccaCf 2 GCAGAAGAUGUGGGU 2 AD-392782 fguucaaacaa 7 aUfcuucusgsc 7 UCAAACAA 7
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 3 4 5 2 2 2 cscsucu(Ghd)AfaGfUfU usUfsugcu(Ggn)uccaacUf AGCCUCUGAAGUUGG AD-392783 7 7 7 fggacagcaaa uCfagaggscsu ACAGCAAA 6 7 8 2 2 2 ususaug(Ahd)UfuUfAfC asCfsgaua(Agn)ugaguaAf UUUUAUGAUUUACUC AD-392784 7 8 8 fucauuaucgu aUfcauaasasa AUUAUCGC 9 0 1 2 2 2 ascsagc(Uhd)GfuGfCfU asUfsugug(Tgn)uacagcAf UGACAGCUGUGCUGU AD-392785 8 8 8 fguaacacaau cAfgcuguscsa AACACAAG 2 3 4 2 2 2 usgsuga(Chd)CfcAfAfU asUfsagga(Cgn)uuaauuGf UUUGUGACCCAAUUA AD-392786 8 8 8 fuaaguccuau gGfucacasasa AGUCCUAC 5 6 7 2 2 2 usascau(Ahd)UfgCfUfU usCfsgauu(Cgn)uuaaagCf UUUACAUAUGCUUUA AD-392787 8 8 9 fuaagaaucga aUfauguasasa AGAAUCGA 8 9 0 2 2 2 gsusaaa(Uhd)AfaAfUfA usCfscaag(Agn)auguauUf AUGUAAAUAAAUACA AD-392788 9 9 9 fcauucuugga uAfuuuacsasu UUCUUGGA 1 2 3 2 2 2 uscsagu(Uhd)AfcGfGfA asAfsgcau(Cgn)guuuccGf GAUCAGUUACGGAAA AD-392789 9 9 9 faacgaugcuu uAfacugasusc CGAUGCUC 4 5 6 2 2 2 csusucc(Chd)GfuGfAfA asAfsacuc(Tgn)ccauucAf UCCUUCCCGUGAAUG AD-392790 9 9 9 fuggagaguuu cGfggaagsgsa GAGAGUUC 7 8 9 3 3 3 asgsuug(Ghd)AfcAfGfC asAfsaugg(Tgn)uuugcuGf GAAGUUGGACAGCAA AD-392791 0 0 0 faaaaccauuu uCfcaacususc AACCAUUG 0 1 2 3 3 3 cscscau(Chd)GfgUfGfU asUfsauaa(Agn)uggacaCf UACCCAUCGGUGUCC AD-392792 0 0 0 fccauuuauau cGfaugggsusa AUUUAUAG 3 4 5 3 3 3 usgscac(Ahd)CfaUfUfA usCfsucaa(Tgn)gccuaaUf UGUGCACACAUUAGG AD-392793 0 0 0 fggcauugaga gUfgugcascsa CAUUGAGA 6 7 8 3 3 3 cscsaac(Ahd)UfgAfUfU usUfsgguu(Cgn)acuaauCf GGCCAACAUGAUUAG AD-392794 0 1 1 fagugaaccaa aUfguuggscsc UGAACCAA 9 0 1 3 3 3 asusgau(Uhd)AfgUfGfA asAfsuccu(Tgn)gguucaCf ACAUGAUUAGUGAAC AD-392795 1 1 1 faccaaggauu uAfaucausgsu CAAGGAUC 2 3 4 3 3 3 ususagu(Ghd)AfaCfCfA asAfscuga(Tgn)ccuuggUf GAUUAGUGAACCAAG AD-392796 1 1 1 faggaucaguu uCfacuaasusc GAUCAGUU 5 6 7
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 3 3 3 asascca(Ahd)GfgAfUfC usUfsccgu(Agn)acugauCf UGAACCAAGGAUCAG AD-392797 1 1 2 faguuacggaa cUfugguuscsa UUACGGAA 8 9 0 3 3 3 gsusuac(Ghd)GfaAfAfC usGfsagag(Cgn)aucguuUf CAGUUACGGAAACGA AD-392798 2 2 2 fgaugcucuca cCfguaacsusg UGCUCUCA 1 2 3 3 3 3 gsasugc(Ahd)GfaAfUfU asUfscaug(Tgn)cggaauUf UGGAUGCAGAAUUCC AD-392799 2 2 2 fccgacaugau cUfgcaucscsa GACAUGAC 4 5 6 3 3 3 ususgga(Chd)AfgCfAfA asGfscaau(Ggn)guuuugCf AGUUGGACAGCAAAA AD-392800 2 2 2 faaccauugcu uGfuccaascsu CCAUUGCU 7 8 9 3 3 3 asasacc(Ahd)UfuGfCfU usGfsggua(Ggn)ugaagcAf CAAAACCAUUGCUUC AD-392801 3 3 3 fucacuaccca aUfgguuususg ACUACCCA 0 1 2 3 3 3 cscsauc(Ghd)GfuGfUfC usCfsuaua(Agn)auggacAf ACCCAUCGGUGUCCA AD-392802 3 3 3 fcauuuauaga cCfgauggsgsu UUUAUAGA 3 4 5 3 3 3 ususauc(Ghd)CfcUfUfU asCfsagcu(Ggn)ucaaaaGf CAUUAUCGCCUUUUG AD-392803 3 3 3 fugacagcugu gCfgauaasusg ACAGCUGU 6 7 8 3 3 3 asuscgc(Chd)UfuUfUfG asCfsacag(Cgn)ugucaaAf UUAUCGCCUUUUGAC AD-392804 3 4 4 facagcugugu aGfgcgausasa AGCUGUGC 9 0 1 3 3 3 ascsaca(Ahd)GfuAfGfA asGfsuuca(Ggn)gcaucuAf UAACACAAGUAGAUG AD-392805 4 4 4 fugccugaacu cUfugugususa CCUGAACU 2 3 4 3 3 3 usgsugg(Uhd)UfuGfUfG usUfsaauu(Ggn)ggucacAf CUUGUGGUUUGUGAC AD-392806 4 4 4 facccaauuaa aAfccacasasg CCAAUUAA 5 6 7 3 3 3 gsgsgau(Ghd)CfuUfCfA asAfscguu(Cgn)acaugaAf GGGGGAUGCUUCAUG AD-392807 4 4 5 fugugaacguu gCfaucccscsc UGAACGUG 8 9 0 3 3 3 usgsugc(Ahd)CfaCfAfU usCfsaaug(Cgn)cuaaugUf UAUGUGCACACAUUA AD-392808 5 5 5 fuaggcauuga gUfgcacasusa GGCAUUGA 1 2 3 3 3 3 asasaug(Ghd)AfaGfUfG asUfsuaua(Tgn)ugccacUf GAAAAUGGAAGUGGC AD-392809 5 5 5 fgcaauauaau uCfcauuususc AAUAUAAG 4 5 6 3 3 3 asusgga(Ahd)GfuGfGfC asCfscuua(Tgn)auugccAf AAAUGGAAGUGGCAA AD-392810 5 5 5 faauauaaggu cUfuccaususu UAUAAGGG 7 8 9 usgsccc(Ghd)AfgAfUfC 3 asGfsuuua(Agn)caggauCf 3 CUUGCCCGAGAUCCU 3 AD-392811 fcuguuaaacu 6 uCfgggcasasg 6 GUUAAACU 6
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
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O O O 7 8 9 4 4 4 asuscca(Chd)AfcAfUfC asUfsacau(Tgn)acugauGf UAAUCCACACAUCAG AD-392841 5 5 5 faguaauguau uGfuggaususa UAAUGUAU 0 1 2 4 4 4 csasugc(Chd)AfuCfUfU asUfsuucg(Ggn)ucaaagAf CUCAUGCCAUCUUUG AD-392842 5 5 5 fugaccgaaau uGfgcaugsasg ACCGAAAC 3 4 5 4 4 4 gsgscua(Chd)GfaAfAfA asUfsaggu(Tgn)ggauuuUf ACGGCUACGAAAAUC AD-392843 5 5 5 fuccaaccuau cGfuagccsgsu CAACCUAC 6 7 8 4 4 4 uscsaug(Chd)CfaUfCfU usUfsucgg(Tgn)caaagaUf UCUCAUGCCAUCUUU AD-392844 5 6 6 fuugaccgaaa gGfcaugasgsa GACCGAAA 9 0 1 4 4 4 csasgua(Chd)AfcAfUfC asUfsgaug(Agn)auggauGf AACAGUACACAUCCA AD-392845 6 6 6 fcauucaucau uGfuacugsusu UUCAUCAU 2 3 4 4 4 4 asascgg(Chd)UfaCfGfA asGfsuugg(Agn)uuuucgUf AGAACGGCUACGAAA AD-392846 6 6 6 faaauccaacu aGfccguuscsu AUCCAACC 5 6 7 4 4 4 gsasagu(Uhd)UfcAfUfU usUfsguau(Cgn)auaaauGf CUGAAGUUUCAUUUA AD-392847 6 6 7 fuaugauacaa aAfacuucsasg UGAUACAA 8 9 0 4 4 4 asusgcc(Ahd)UfcUfUfU asGfsuuuc(Ggn)gucaaaGf UCAUGCCAUCUUUGA AD-392848 7 7 7 fgaccgaaacu aUfggcausgsa CCGAAACG 1 2 3 4 4 4 gsasacg(Ghd)CfuAfCfG asUfsugga(Tgn)uuucguAf CAGAACGGCUACGAA AD-392849 7 7 7 faaaauccaau gCfcguucsusg AAUCCAAC 4 5 6 4 4 4 uscsuuc(Ghd)UfgCfCfU asAfscaua(Agn)aacaggCf UUUCUUCGUGCCUGU AD-392850 7 7 7 fguuuuauguu aCfgaagasasa UUUAUGUG 7 8 9 4 4 4 ususgcc(Chd)GfaGfAfU asUfsuuaa(Cgn)aggaucUf UCUUGCCCGAGAUCC AD-392851 8 8 8 fccuguuaaau cGfggcaasgsa UGUUAAAC 0 1 2 4 4 4 csusucg(Uhd)GfcCfUfG asCfsacau(Agn)aaacagGf UUCUUCGUGCCUGUU AD-392852 8 8 8 fuuuuaugugu cAfcgaagsasa UUAUGUGC 3 4 5 4 4 4 gscsgcc(Ahd)UfgUfCfC asUfsaaac(Tgn)uugggaCf CAGCGCCAUGUCCCA AD-392853 8 8 8 fcaaaguuuau aUfggcgcsusg AAGUUUAC 6 7 8 4 4 4 gsuscau(Ahd)GfcGfAfC asAfscgau(Cgn)acugucGf UUGUCAUAGCGACAG AD-392854 8 9 9 fagugaucguu cUfaugacsasa UGAUCGUC 9 0 1
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
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O O O 4 4 4 gscsuac(Ghd)AfaAfAfU usGfsuagg(Tgn)uggauuUf CGGCUACGAAAAUCC AD-392855 9 9 9 fccaaccuaca uCfguagcscsg AACCUACA 2 3 4 4 4 4 asusagc(Ghd)AfcAfGfU asAfsugac(Ggn)aucacuGf UCAUAGCGACAGUGA AD-392856 9 9 9 fgaucgucauu uCfgcuausgsa UCGUCAUC 5 6 7 4 4 5 csusugc(Chd)CfgAfGfA usUfsuaac(Agn)ggaucuCf CUCUUGCCCGAGAUC AD-392857 9 9 0 fuccuguuaaa gGfgcaagsasg CUGUUAAA 8 9 0 5 5 5 csuscau(Ghd)CfcAfUfC usUfscggu(Cgn)aaagauGf CUCUCAUGCCAUCUU AD-392858 0 0 0 fuuugaccgaa gCfaugagsasg UGACCGAA 1 2 3 5 5 5 ascsggc(Uhd)AfcGfAfA asGfsguug(Ggn)auuuucGf GAACGGCUACGAAAA AD-392859 0 0 0 faauccaaccu uAfgccgususc UCCAACCU 4 5 6 5 5 5 csasuca(Ahd)AfaAfUfU asAfsagaa(Cgn)accaauUf AUCAUCAAAAAUUGG AD-392860 0 0 0 fgguguucuuu uUfugaugsasu UGUUCUUU 7 8 9 5 5 5 asuscca(Ahd)CfcUfAfC csAfsaaga(Agn)cuuguaGf AAAUCCAACCUACAA AD-392861 1 1 1 faaguucuuug gUfuggaususu GUUCUUUG 0 1 2 5 5 5 csgscuu(Uhd)CfuAfCfA usGfsuaau(Agn)caguguAf AUCGCUUUCUACACU AD-392862 1 1 1 fcuguauuaca gAfaagcgsasu GUAUUACA 3 4 5 5 5 5 uscscaa(Chd)CfuAfCfA usCfsaaag(Agn)acuuguAf AAUCCAACCUACAAG AD-392863 1 1 1 faguucuuuga gGfuuggasusu UUCUUUGA 6 7 8 5 5 5 uscsucu(Chd)UfuUfAfC asGfsacca(Agn)aauguaAf UAUCUCUCUUUACAU AD-392864 1 2 2 fauuuuggucu aGfagagasusa UUUGGUCU 9 0 1 5 5 5 csuscuc(Uhd)UfuAfCfA asAfsgacc(Agn)aaauguAf AUCUCUCUUUACAUU AD-392865 2 2 2 fuuuuggucuu aAfgagagsasu UUGGUCUC 2 3 4 5 5 5 ususugu(Ghd)UfaCfUfG asAfsauuc(Tgn)uuacagUf GUUUUGUGUACUGUA AD-392866 2 2 2 fuaaagaauuu aCfacaaasasc AAGAAUUU 5 6 7 5 5 5 gsusgua(Chd)UfgUfAfA asCfsuaaa(Tgn)ucuuuaCf UUGUGUACUGUAAAG AD-392867 2 2 3 fagaauuuagu aGfuacacsasa AAUUUAGC 8 9 0 5 5 5 ascscca(Ahd)UfuAfAfG usAfsaagu(Agn)ggacuuAf UGACCCAAUUAAGUC AD-392868 3 3 3 fuccuacuuua aUfuggguscsa CUACUUUA 1 2 3 uscscua(Chd)UfuUfAfC 5 usAfsaagc(Agn)uauguaAf 5 AGUCCUACUUUACAU 5 AD-392869 fauaugcuuua 3 aGfuaggascsu 3 AUGCUUUA 3
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
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O O O 4 5 6 5 5 5 cscsuac(Uhd)UfuAfCfA usUfsaaag(Cgn)auauguAf GUCCUACUUUACAUA AD-392870 3 3 3 fuaugcuuuaa aAfguaggsasc UGCUUUAA 7 8 9 5 5 5 ususcua(Chd)AfcUfGfU usUfsuaug(Tgn)aauacaGf CUUUCUACACUGUAU AD-392871 4 4 4 fauuacauaaa uGfuagaasasg UACAUAAA 0 1 2 5 5 5 uscsuac(Ahd)CfuGfUfA asUfsuuau(Ggn)uaauacAf UUUCUACACUGUAUU AD-392872 4 4 4 fuuacauaaau gUfguagasasa ACAUAAAU 3 4 5 5 5 5 csusuuu(Ahd)AfgAfUfG asUfsugaa(Ggn)acacauCf UUCUUUUAAGAUGUG AD-392873 4 4 4 fugucuucaau uUfaaaagsasa UCUUCAAU 6 7 8 5 5 5 asusgug(Uhd)CfuUfCfA usUfsauac(Agn)aauugaAf AGAUGUGUCUUCAAU AD-392874 4 5 5 fauuuguauaa gAfcacauscsu UUGUAUAA 9 0 1 5 5 5 asuscaa(Ahd)AfaUfUfG csAfsaaga(Agn)caccaaUf UCAUCAAAAAUUGGU AD-392875 5 5 5 fguguucuuug uUfuugausgsa GUUCUUUG 2 3 4 5 5 5 asasauc(Chd)AfaCfCfU asAfsgaac(Tgn)uguaggUf GAAAAUCCAACCUAC AD-392876 5 5 5 facaaguucuu uGfgauuususc AAGUUCUU 5 6 7 5 5 5 gsusacu(Ghd)UfaAfAfG asAfsgcua(Agn)auucuuUf GUGUACUGUAAAGAA AD-392877 5 5 6 faauuuagcuu aCfaguacsasc UUUAGCUG 8 9 0 5 5 5 csusccu(Ghd)AfuUfAfU usAfsugug(Agn)uaaauaAf CUCUCCUGAUUAUUU AD-392878 6 6 6 fuuaucacaua uCfaggagsasg AUCACAUA 1 2 3 5 5 5 gscscag(Uhd)UfgUfAfU asAfsagaa(Tgn)aauauaCf UAGCCAGUUGUAUAU AD-392879 6 6 6 fauuauucuuu aAfcuggcsusa UAUUCUUG 4 5 6 5 5 5 asasuua(Ahd)GfuCfCfU usAfsugua(Agn)aguaggAf CCAAUUAAGUCCUAC AD-392880 6 6 6 facuuuacaua cUfuaauusgsg UUUACAUA 7 8 9 5 5 5 csusugc(Chd)UfaAfGfU asGfsaaag(Ggn)aauacuUf CUCUUGCCUAAGUAU AD-392881 7 7 7 fauuccuuucu aGfgcaagsasg UCCUUUCC 0 1 2 5 5 5 asusucc(Uhd)UfuCfCfU asAfsuagu(Ggn)aucaggAf GUAUUCCUUUCCUGA AD-392882 7 7 7 fgaucacuauu aAfggaausasc UCACUAUG 3 4 5 5 5 5 ascsuau(Ghd)CfaUfUfU usUfsuaac(Tgn)uuaaaaUf UCACUAUGCAUUUUA AD-392883 7 7 7 fuaaaguuaaa gCfauagusgsa AAGUUAAA 6 7 8
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
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O O O 5 5 5 usgsuuc(Ahd)UfuGfUfA usAfsaaag(Tgn)gcuuacAf CCUGUUCAUUGUAAG AD-392884 7 8 8 fagcacuuuua aUfgaacasgsg CACUUUUA 9 0 1 5 5 5 asasuua(Chd)CfaAfGfA usUfsugga(Ggn)aauucuUf UCAAUUACCAAGAAU AD-392885 8 8 8 fauucuccaaa gGfuaauusgsa UCUCCAAA 2 3 4 5 5 5 ususacc(Ahd)AfgAfAfU asUfsuuug(Ggn)agaauuCf AAUUACCAAGAAUUC AD-392886 8 8 8 fucuccaaaau uUfgguaasusu UCCAAAAC 5 6 7 5 5 5 uscsauu(Ghd)CfuUfAfU asGfsauca(Tgn)gucauaAf AAUCAUUGCUUAUGA AD-392887 8 8 9 fgacaugaucu gCfaaugasusu CAUGAUCG 8 9 0 5 5 5 ususuua(Ahd)GfaUfGfU asAfsuuga(Agn)gacacaUf UCUUUUAAGAUGUGU AD-392889 9 9 9 fgucuucaauu cUfuaaaasgsa CUUCAAUU 1 2 3 5 5 5 asusccu(Ghd)UfuAfAfA usUfsguag(Ggn)aaguuuAf AGAUCCUGUUAAACU AD-392890 9 9 9 fcuuccuacaa aCfaggauscsu UCCUACAA 4 5 6 5 5 5 ascsuau(Uhd)CfaGfAfU asCfsaaga(Cgn)gucaucUf AAACUAUUCAGAUGA AD-392891 9 9 9 fgacgucuugu gAfauagususu CGUCUUGG 7 8 9 6 6 6 gsusuca(Uhd)CfaUfCfA asAfsccaa(Tgn)uuuugaUf AAGUUCAUCAUCAAA AD-392892 0 0 0 faaaauugguu gAfugaacsusu AAUUGGUG 0 1 2 6 6 6 usasucu(Chd)UfcUfUfU asCfscaaa(Agn)uguaaaGf UCUAUCUCUCUUUAC AD-392893 0 0 0 facauuuuggu aGfagauasgsa AUUUUGGU 3 4 5 6 6 6 asuscuc(Uhd)CfuUfUfA asAfsccaa(Agn)auguaaAf CUAUCUCUCUUUACA AD-392894 0 0 0 fcauuuugguu gAfgagausasg UUUUGGUC 6 7 8 6 6 6 usgsugu(Ahd)CfuGfUfA asUfsaaau(Tgn)cuuuacAf UUUGUGUACUGUAAA AD-392895 0 1 1 faagaauuuau gUfacacasasa GAAUUUAG 9 0 1 6 6 6 csusacu(Uhd)UfaCfAfU asUfsuaaa(Ggn)cauaugUf UCCUACUUUACAUAU AD-392896 1 1 1 faugcuuuaau aAfaguagsgsa GCUUUAAG 2 3 4 6 6 6 usgsccu(Ahd)AfgUfAfU asAfsggaa(Agn)ggaauaCf CUUGCCUAAGUAUUC AD-392897 1 1 1 fuccuuuccuu uUfaggcasasg CUUUCCUG 5 6 7 6 6 6 asasgua(Uhd)UfcCfUfU asUfsgauc(Agn)ggaaagGf CUAAGUAUUCCUUUC AD-392898 1 1 2 fuccugaucau aAfuacuusasg CUGAUCAC 8 9 0 gsusauu(Chd)CfuUfUfC 6 usAfsguga(Tgn)caggaaAf 6 AAGUAUUCCUUUCCU 6 AD-392899 fcugaucacua 2 gGfaauacsusu 2 GAUCACUA 2
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Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
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O O O 1 2 3 6 6 6 ususccu(Ghd)AfuCfAfC asAfsaaug(Cgn)auagugAf CUUUCCUGAUCACUA AD-392900 2 2 2 fuaugcauuuu uCfaggaasasg UGCAUUUU 4 5 6 6 6 6 csusgau(Chd)AfcUfAfU usUfsuaaa(Agn)ugcauaGf UCCUGAUCACUAUGC AD-392901 2 2 2 fgcauuuuaaa uGfaucagsgsa AUUUUAAA 7 8 9 6 6 6 csascgu(Ahd)UfcUfUfU usCfsaaag(Agn)cccaaaGf UCCACGUAUCUUUGG AD-392902 3 3 3 fgggucuuuga aUfacgugsgsa GUCUUUGA 0 1 2 6 6 6 usgsggu(Chd)UfuUfGfA asUfsuuuc(Tgn)uuaucaAf UUUGGGUCUUUGAUA AD-392903 3 3 3 fuaaagaaaau aGfacccasasa AAGAAAAG 3 4 5 6 6 6 uscsaau(Uhd)AfcCfAfA usGfsgaga(Agn)uucuugGf CUUCAAUUACCAAGA AD-392904 3 3 3 fgaauucucca uAfauugasasg AUUCUCCA 6 7 8 6 6 6 uscsgcu(Uhd)UfcUfAfC asUfsaaua(Cgn)aguguaGf GAUCGCUUUCUACAC AD-392906 3 4 4 facuguauuau aAfagcgasusc UGUAUUAC 9 0 1 6 6 6 asusuuu(Chd)UfuUfAfA usUfscaga(Cgn)ugguuaAf CAAUUUUCUUUAACC AD-392907 4 4 4 fccagucugaa aGfaaaaususg AGUCUGAA 2 3 4 6 6 6 csusuua(Ahd)CfcAfGfU gsAfsaacu(Tgn)cagacuGf UUCUUUAACCAGUCU AD-392908 4 4 4 fcugaaguuuc gUfuaaagsasa GAAGUUUC 5 6 7 6 6 6 usasaga(Uhd)GfuGfUfC asCfsaaau(Tgn)gaagacAf UUUAAGAUGUGUCUU AD-392909 4 4 5 fuucaauuugu cAfucuuasasa CAAUUUGU 8 9 0 6 6 6 gsasucc(Uhd)GfuUfAfA usGfsuagg(Agn)aguuuaAf GAGAUCCUGUUAAAC AD-392910 5 5 5 facuuccuaca cAfggaucsusc UUCCUACA 1 2 3 6 6 6 csusgcu(Uhd)CfaGfAfA asUfsuuug(Cgn)ucuuucUf AGCUGCUUCAGAAAG AD-392911 5 5 5 fagagcaaaau gAfagcagscsu AGCAAAAC 4 5 6 6 6 6 csasgaa(Ahd)GfaGfCfA usGfsaaua(Ggn)uuuugcUf UUCAGAAAGAGCAAA AD-392912 5 5 5 faaacuauuca cUfuucugsasa ACUAUUCA 7 8 9 6 6 6 usasuga(Ahd)GfuUfCfA usUfsuuug(Agn)ugaugaAf GAUAUGAAGUUCAUC AD-392913 6 6 6 fucaucaaaaa cUfucauasusc AUCAAAAA 0 1 2 6 6 6 csasuca(Uhd)CfaAfAfA asAfsacac(Cgn)aauuuuUf UUCAUCAUCAAAAAU AD-392914 6 6 6 fauugguguuu gAfugaugsasa UGGUGUUC 3 4 5
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I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 6 6 6 uscsaaa(Ahd)AfuUfGfG asCfsaaag(Agn)acaccaAf CAUCAAAAAUUGGUG AD-392915 6 6 6 fuguucuuugu uUfuuugasusg UUCUUUGC 6 7 8 6 6 6 asasaau(Chd)CfaAfCfC asGfsaacu(Tgn)guagguUf CGAAAAUCCAACCUA AD-392916 6 7 7 fuacaaguucu gGfauuuuscsg CAAGUUCU 9 0 1 6 6 6 cscsaac(Chd)UfaCfAfA asUfscaaa(Ggn)aacuugUf AUCCAACCUACAAGU AD-392917 7 7 7 fguucuuugau aGfguuggsasu UCUUUGAG 2 3 4 6 6 6 ascsuca(Uhd)UfaUfCfG usGfsucaa(Agn)aggcgaUf UUACUCAUUAUCGCC AD-392918 7 7 7 fccuuuugaca aAfugagusasa UUUUGACA 5 6 7 6 6 6 csuscau(Uhd)AfuCfGfC asUfsguca(Agn)aaggcgAf UACUCAUUAUCGCCU AD-392919 7 7 8 fcuuuugacau uAfaugagsusa UUUGACAG 8 9 0 6 6 6 usgsugc(Uhd)GfuAfAfC asUfscuac(Tgn)uguguuAf GCUGUGCUGUAACAC AD-392920 8 8 8 facaaguagau cAfgcacasgsc AAGUAGAU 1 2 3 6 6 6 gsusgcu(Ghd)UfaAfCfA asAfsucua(Cgn)uuguguUf CUGUGCUGUAACACA AD-392921 8 8 8 fcaaguagauu aCfagcacsasg AGUAGAUG 4 5 6 6 6 6 uscsuuu(Ahd)CfaUfUfU asUfsagag(Agn)ccaaaaUf UCUCUUUACAUUUUG AD-392922 8 8 8 fuggucucuau gUfaaagasgsa GUCUCUAU 7 8 9 6 6 6 asusggg(Uhd)UfuUfGfU usUfsuaca(Ggn)uacacaAf UAAUGGGUUUUGUGU AD-392923 9 9 9 fguacuguaaa aAfcccaususa ACUGUAAA 0 1 2 6 6 6 ususgug(Uhd)AfcUfGfU usAfsaauu(Cgn)uuuacaGf UUUUGUGUACUGUAA AD-392924 9 9 9 faaagaauuua uAfcacaasasa AGAAUUUA 3 4 5 6 6 6 gscsugu(Ahd)UfcAfAfA asAfsugca(Cgn)uaguuuGf UAGCUGUAUCAAACU AD-392925 9 9 9 fcuagugcauu aUfacagcsusa AGUGCAUG 6 7 8 6 7 7 csusagu(Ghd)CfaUfGfA asAfsgaau(Cgn)uauucaUf AACUAGUGCAUGAAU AD-392926 9 0 0 fauagauucuu gCfacuagsusu AGAUUCUC 9 0 1 7 7 7 usasgug(Chd)AfuGfAfA asGfsagaa(Tgn)cuauucAf ACUAGUGCAUGAAUA AD-392927 0 0 0 fuagauucucu uGfcacuasgsu GAUUCUCU 2 3 4 7 7 7 csuscuc(Chd)UfgAfUfU usGfsugau(Agn)aauaauCf UUCUCUCCUGAUUAU AD-392928 0 0 0 fauuuaucaca aGfgagagsasa UUAUCACA 5 6 7 cscsuga(Uhd)UfaUfUfU 7 asCfsuaug(Tgn)gauaaaUf 7 CUCCUGAUUAUUUAU 7 AD-392929 faucacauagu 0 aAfucaggsasg 0 CACAUAGC 1
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 8 9 0 7 7 7 usasagu(Chd)CfuAfCfU asCfsauau(Ggn)uaaaguAf AUUAAGUCCUACUUU AD-392930 1 1 1 fuuacauaugu gGfacuuasasu ACAUAUGC 1 2 3 7 7 7 asgsucc(Uhd)AfcUfUfU asAfsgcau(Agn)uguaaaGf UAAGUCCUACUUUAC AD-392931 1 1 1 facauaugcuu uAfggacususa AUAUGCUU 4 5 6 7 7 7 gsusccu(Ahd)CfuUfUfA asAfsagca(Tgn)auguaaAf AAGUCCUACUUUACA AD-392932 1 1 1 fcauaugcuuu gUfaggacsusu UAUGCUUU 7 8 9 7 7 7 ususcuc(Uhd)UfgCfCfU asGfsgaau(Agn)cuuaggCf GCUUCUCUUGCCUAA AD-392933 2 2 2 faaguauuccu aAfgagaasgsc GUAUUCCU 0 1 2 7 7 7 csuscuu(Ghd)CfcUfAfA asAfsagga(Agn)uacuuaGf UUCUCUUGCCUAAGU AD-392934 2 2 2 fguauuccuuu gCfaagagsasa AUUCCUUU 3 4 5 7 7 7 usasuuc(Chd)UfuUfCfC asUfsagug(Agn)ucaggaAf AGUAUUCCUUUCCUG AD-392935 2 2 2 fugaucacuau aGfgaauascsu AUCACUAU 6 7 8 7 7 7 ususucc(Uhd)GfaUfCfA asAfsaugc(Agn)uagugaUf CCUUUCCUGAUCACU AD-392936 2 3 3 fcuaugcauuu cAfggaaasgsg AUGCAUUU 9 0 1 7 7 7 csascua(Uhd)GfcAfUfU usUfsaacu(Tgn)uaaaauGf AUCACUAUGCAUUUU AD-392937 3 3 3 fuuaaaguuaa cAfuagugsasu AAAGUUAA 2 3 4 7 7 7 csusgca(Uhd)UfuUfAfC asAfsucug(Tgn)acaguaAf GACUGCAUUUUACUG AD-392938 3 3 3 fuguacagauu aAfugcagsusc UACAGAUU 5 6 7 7 7 7 ususcug(Chd)UfaUfAfU usAfsuauc(Agn)caaauaUf GCUUCUGCUAUAUUU AD-392939 3 3 4 fuugugauaua aGfcagaasgsc GUGAUAUA 8 9 0 7 7 7 uscsugc(Uhd)AfuAfUfU asUfsauau(Cgn)acaaauAf CUUCUGCUAUAUUUG AD-392940 4 4 4 fugugauauau uAfgcagasasg UGAUAUAG 1 2 3 7 7 7 ascsgua(Uhd)CfuUfUfG asUfscaaa(Ggn)acccaaAf CCACGUAUCUUUGGG AD-392941 4 4 4 fggucuuugau gAfuacgusgsg UCUUUGAU 4 5 6 7 7 7 uscsuuu(Ghd)GfgUfCfU usCfsuuua(Tgn)caaagaCf UAUCUUUGGGUCUUU AD-392942 4 4 4 fuugauaaaga cCfaaagasusa GAUAAAGA 7 8 9 7 7 7 csusuug(Ghd)GfuCfUfU usUfscuuu(Agn)ucaaagAf AUCUUUGGGUCUUUG AD-392943 5 5 5 fugauaaagaa cCfcaaagsasu AUAAAGAA 0 1 2
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 7 7 7 ususggg(Uhd)CfuUfUfG usUfsuucu(Tgn)uaucaaAf CUUUGGGUCUUUGAU AD-392944 5 5 5 fauaaagaaaa gAfcccaasasg AAAGAAAA 3 4 5 7 7 7 asgsaau(Chd)CfcUfGfU asUfsuaca(Agn)ugaacaGf AAAGAAUCCCUGUUC AD-392945 5 5 5 fucauuguaau gGfauucususu AUUGUAAG 6 7 8 7 7 7 gsasauc(Chd)CfuGfUfU asCfsuuac(Agn)augaacAf AAGAAUCCCUGUUCA AD-392946 5 6 6 fcauuguaagu gGfgauucsusu UUGUAAGC 9 0 1 7 7 7 gsusuca(Uhd)UfgUfAfA asUfsaaaa(Ggn)ugcuuaCf CUGUUCAUUGUAAGC AD-392947 6 6 6 fgcacuuuuau aAfugaacsasg ACUUUUAC 2 3 4 7 7 7 ususaug(Ahd)CfaUfGfA usAfsgaaa(Ggn)cgaucaUf GCUUAUGACAUGAUC AD-392948 6 6 6 fucgcuuucua gUfcauaasgsc GCUUUCUA 5 6 7 7 7 7 asusgac(Ahd)UfgAfUfC usGfsuaga(Agn)agcgauCf UUAUGACAUGAUCGC AD-392949 6 6 7 fgcuuucuaca aUfgucausasa UUUCUACA 8 9 0 7 7 7 csasuga(Uhd)CfgCfUfU asCfsagug(Tgn)agaaagCf GACAUGAUCGCUUUC AD-392950 7 7 7 fucuacacugu gAfucaugsusc UACACUGU 1 2 3 7 7 7 csusuuc(Uhd)AfcAfCfU usAfsugua(Agn)uacaguGf CGCUUUCUACACUGU AD-392951 7 7 7 fguauuacaua uAfgaaagscsg AUUACAUA 4 5 6 7 7 7 gsasuuc(Ahd)AfuUfUfU asUfsgguu(Agn)aagaaaAf CAGAUUCAAUUUUCU AD-392952 7 7 7 fcuuuaaccau uUfgaaucsusg UUAACCAG 7 8 9 7 7 7 ususucu(Uhd)UfaAfCfC asCfsuuca(Ggn)acugguUf AUUUUCUUUAACCAG AD-392953 8 8 8 fagucugaagu aAfagaaasasu UCUGAAGU 0 1 2 7 7 7 ususuaa(Ghd)AfuGfUfG asAfsauug(Agn)agacacAf CUUUUAAGAUGUGUC AD-392954 8 8 8 fucuucaauuu uCfuuaaasasg UUCAAUUU 3 4 5 7 7 7 ususaag(Ahd)UfgUfGfU csAfsaauu(Ggn)aagacaCf UUUUAAGAUGUGUCU AD-392955 8 8 8 fcuucaauuug aUfcuuaasasa UCAAUUUG 6 7 8 7 7 7 asgsaug(Uhd)GfuCfUfU asUfsacaa(Agn)uugaagAf UAAGAUGUGUCUUCA AD-392956 8 9 9 fcaauuuguau cAfcaucususa AUUUGUAU 9 0 1 7 7 7 usgsucu(Uhd)CfaAfUfU asUfsuuua(Tgn)acaaauUf UGUGUCUUCAAUUUG AD-392957 9 9 9 fuguauaaaau gAfagacascsa UAUAAAAU 2 3 4 csusuca(Ahd)UfuUfGfU 7 asCfscauu(Tgn)uauacaAf 7 GUCUUCAAUUUGUAU 7 AD-392958 fauaaaauggu 9 aUfugaagsasc 9 AAAAUGGU 9
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 5 6 7 7 7 8 asusggu(Ghd)UfuUfUfC usUfsauuu(Agn)caugaaAf AAAUGGUGUUUUCAU AD-392959 9 9 0 fauguaaauaa aCfaccaususu GUAAAUAA 8 9 0 8 8 8 ususcuu(Uhd)UfaAfGfA usGfsaaga(Cgn)acaucuUf CCUUCUUUUAAGAUG AD-392960 0 0 0 fugugucuuca aAfaagaasgsg UGUCUUCA 1 2 3 8 8 8 usgsuau(Uhd)CfuAfUfC usGfsuaaa(Ggn)agagauAf AAUGUAUUCUAUCUC AD-392961 0 0 0 fucucuuuaca gAfauacasusu UCUUUACA 4 5 6 8 8 8 gsuscuc(Uhd)AfuAfCfU usUfsaaua(Agn)uguaguAf UGGUCUCUAUACUAC AD-392962 0 0 0 facauuauuaa uAfgagacscsa AUUAUUAA 7 8 9 8 8 8 uscsucu(Ahd)UfaCfUfA asUfsuaau(Agn)auguagUf GGUCUCUAUACUACA AD-392963 1 1 1 fcauuauuaau aUfagagascsc UUAUUAAU 0 1 2 8 8 8 csuscua(Uhd)AfcUfAfC asAfsuuaa(Tgn)aauguaGf GUCUCUAUACUACAU AD-392964 1 1 1 fauuauuaauu uAfuagagsasc UAUUAAUG 3 4 5 8 8 8 csusuca(Ahd)UfuAfCfC asAfsgaau(Tgn)cuugguAf GUCUUCAAUUACCAA AD-392965 1 1 1 faagaauucuu aUfugaagsasc GAAUUCUC 6 7 8 8 8 8 cscsaca(Chd)AfuCfAfG asAfsauac(Agn)uuacugAf AUCCACACAUCAGUA AD-392966 1 2 2 fuaauguauuu uGfuguggsasu AUGUAUUC 9 0 1 8 8 8 csusauc(Uhd)CfuCfUfU asCfsaaaa(Tgn)guaaagAf UUCUAUCUCUCUUUA AD-392967 2 2 2 fuacauuuugu gAfgauagsasa CAUUUUGG 2 3 4 8 8 8 gsgsucu(Chd)UfaUfAfC usAfsauaa(Tgn)guaguaUf UUGGUCUCUAUACUA AD-392968 2 2 2 fuacauuauua aGfagaccsasa CAUUAUUA 5 6 7 8 8 8 uscsuau(Ahd)CfuAfCfA asCfsauua(Agn)uaauguAf UCUCUAUACUACAUU AD-392969 2 2 3 fuuauuaaugu gUfauagasgsa AUUAAUGG 8 9 0 8 8 8 gsgsucu(Uhd)CfaAfUfU asAfsuucu(Tgn)gguaauUf CUGGUCUUCAAUUAC AD-392970 3 3 3 faccaagaauu gAfagaccsasg CAAGAAUU 1 2 3 8 8 8 csasgga(Uhd)AfuGfAfA asAfsugau(Ggn)aacuucAf CUCAGGAUAUGAAGU AD-392971 3 3 3 fguucaucauu uAfuccugsasg UCAUCAUC 4 5 6 8 8 8 ascsaca(Uhd)CfaGfUfA usAfsgaau(Agn)cauuacUf CCACACAUCAGUAAU AD-392972 3 3 3 fauguauucua gAfugugusgsg GUAUUCUA 7 8 9
S S S E E E
Q Q Q Nome do Sequência Sensora Sequência Antissenso Sequência-alvo
I I I Duplex (5’ a 3’) (5’ a 3’) de mRNA
D D D N N N
O O O 8 8 8 csusaua(Chd)UfaCfAfU asCfscauu(Agn)auaaugUf CUCUAUACUACAUUA AD-392973 4 4 4 fuauuaauggu aGfuauagsasg UUAAUGGG 0 1 2 8 8 8 cscscgu(Uhd)UfuAfUfG asUfsgagu(Agn)aaucauAf AACCCGUUUUAUGAU AD-392974 4 4 4 fauuuacucau aAfacgggsusu UUACUCAU 3 4 5 8 8 8 ususcca(Uhd)GfaCfUfG asAfsguaa(Agn)augcagUf UUUUCCAUGACUGCA AD-392975 4 4 4 fcauuuuacuu cAfuggaasasa UUUUACUG 6 7 8 8 8 8 uscsuuc(Ahd)AfuUfAfC asGfsaauu(Cgn)uugguaAf GGUCUUCAAUUACCA AD-392976 4 5 5 fcaagaauucu uUfgaagascsc AGAAUUCU 9 0 1 8 8 8 csusgaa(Ghd)UfuUfCfA asUfsauca(Tgn)aaaugaAf GUCUGAAGUUUCAUU AD-392977 5 5 5 fuuuaugauau aCfuucagsasc UAUGAUAC 2 3 4 TABELA 3. SEQUÊNCIAS NÃO MODIFICADAS DE APP, ALVEJAMENTO DE NM_000484 HUMANO Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 1228- 1226- GCGCCAUGUCCCAAAGUUUAU 855 AUAAACTUUGGGACAUGGCGCUG 856 392853 1248 1248 AD- 1269- 1267- CUUGCCCGAGAUCCUGUUAAA 857 UUUAACAGGAUCUCGGGCAAGAG 858 392857 1289 1289 AD- 1270- 1268- UUGCCCGAGAUCCUGUUAAAU 859 AUUUAACAGGAUCUCGGGCAAGA 860 392851 1290 1290 AD- 1271- 1269- UGCCCGAGAUCCUGUUAAACU 861 AGUUUAACAGGAUCUCGGGCAAG 862 392811 1291 1291 AD- 1278- 1276- GAUCCUGUUAAACUUCCUACA 863 UGUAGGAAGUUUAACAGGAUCUC 864 392910 1298 1298 AD- 1279- 1277- AUCCUGUUAAACUUCCUACAA 865 UUGUAGGAAGUUUAACAGGAUCU 866 392890 1299 1299 AD- 1893- 1891- CUGCUUCAGAAAGAGCAAAAU 867 AUUUUGCUCUUUCUGAAGCAGCU 868 392911 1913 1913 AD- 1899- 1897- CAGAAAGAGCAAAACUAUUCA 869 UGAAUAGUUUUGCUCUUUCUGAA 870 392912 1919 1919 AD- 1905- 1903- GAGCAAAACUAUUCAGAUGAU 871 AUCAUCTGAAUAGUUUUGCUCUU 872 392778 1925 1925
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 1909- 1907- AAAACUAUUCAGAUGACGUCU 873 AGACGUCAUCUGAAUAGUUUUGC 874 392727 1929 1929 AD- 1910- 1908- AAACUAUUCAGAUGACGUCUU 875 AAGACGTCAUCUGAAUAGUUUUG 876 392728 1930 1930 AD- 1912- 1910- ACUAUUCAGAUGACGUCUUGU 877 ACAAGACGUCAUCUGAAUAGUUU 878 392891 1932 1932 AD- 1916- 1914- UUCAGAUGACGUCUUGGCCAA 879 UUGGCCAAGACGUCAUCUGAAUA 880 392822 1936 1936 AD- 1931- 1929- GGCCAACAUGAUUAGUGAACU 881 AGUUCACUAAUCAUGUUGGCCAA 882 392749 1951 1951 AD- 1933- 1931- CCAACAUGAUUAGUGAACCAA 883 UUGGUUCACUAAUCAUGUUGGCC 884 392794 1953 1953 AD- 1938- 1936- AUGAUUAGUGAACCAAGGAUU 885 AAUCCUTGGUUCACUAAUCAUGU 886 392795 1958 1958 AD- 1941- 1939- AUUAGUGAACCAAGGAUCAGU 887 ACUGAUCCUUGGUUCACUAAUCA 888 392812 1961 1961 AD- 1942- 1940- UUAGUGAACCAAGGAUCAGUU 889 AACUGATCCUUGGUUCACUAAUC 890 392796 1962 1962 AD- 1944- 1942- AGUGAACCAAGGAUCAGUUAU 891 AUAACUGAUCCUUGGUUCACUAA 892 392779 1964 1964 AD- 1946- 1944- UGAACCAAGGAUCAGUUACGU 893 ACGUAACUGAUCCUUGGUUCACU 894 392780 1966 1966 AD- 1947- 1945- GAACCAAGGAUCAGUUACGGA 895 UCCGUAACUGAUCCUUGGUUCAC 896 392813 1967 1967 AD- 1948- 1946- AACCAAGGAUCAGUUACGGAA 897 UUCCGUAACUGAUCCUUGGUUCA 898 392797 1968 1968 AD- 1951- 1949- CAAGGAUCAGUUACGGAAACU 899 AGUUUCCGUAACUGAUCCUUGGU 900 392761 1971 1971 AD- 1952- 1950- AAGGAUCAGUUACGGAAACGA 901 UCGUUUCCGUAACUGAUCCUUGG 902 392814 1972 1972 AD- 1954- 1952- GGAUCAGUUACGGAAACGAUU 903 AAUCGUTUCCGUAACUGAUCCUU 904 392742 1974 1974 AD- 1955- 1953- GAUCAGUUACGGAAACGAUGU 905 ACAUCGTUUCCGUAACUGAUCCU 906 392750 1975 1975 AD- 1956- 1954- AUCAGUUACGGAAACGAUGCU 907 AGCAUCGUUUCCGUAACUGAUCC 908 392823 1976 1976 AD- 1957- 1955- UCAGUUACGGAAACGAUGCUU 909 AAGCAUCGUUUCCGUAACUGAUC 910 392789 1977 1977 AD- 1958- 1956- CAGUUACGGAAACGAUGCUCU 911 AGAGCATCGUUUCCGUAACUGAU 912 392781 1978 1978 AD- 1960- 1958- GUUACGGAAACGAUGCUCUCA 913 UGAGAGCAUCGUUUCCGUAACUG 914 392798 1980 1980 AD- UACGGAAACGAUGCUCUCAUU 915 1962- AAUGAGAGCAUCGUUUCCGUAAC 916 1960-
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 392751 1982 1982 AD- 1977- 1975- CUCAUGCCAUCUUUGACCGAA 917 UUCGGUCAAAGAUGGCAUGAGAG 918 392858 1997 1997 AD- 1978- 1976- UCAUGCCAUCUUUGACCGAAA 919 UUUCGGTCAAAGAUGGCAUGAGA 920 392844 1998 1998 AD- 1979- 1977- CAUGCCAUCUUUGACCGAAAU 921 AUUUCGGUCAAAGAUGGCAUGAG 922 392842 1999 1999 AD- 1980- 1978- AUGCCAUCUUUGACCGAAACU 923 AGUUUCGGUCAAAGAUGGCAUGA 924 392848 2000 2000 AD- 1982- 1980- GCCAUCUUUGACCGAAACGAA 925 UUCGUUTCGGUCAAAGAUGGCAU 926 392838 2002 2002 AD- 1983- 1981- CCAUCUUUGACCGAAACGAAA 927 UUUCGUTUCGGUCAAAGAUGGCA 928 392839 2003 2003 AD- 1986- 1984- UCUUUGACCGAAACGAAAACU 929 AGUUUUCGUUUCGGUCAAAGAUG 930 392734 2006 2006 AD- 2019- 2017- CUUCCCGUGAAUGGAGAGUUU 931 AAACUCTCCAUUCACGGGAAGGA 932 392790 2039 2039 AD- 2093- 2091- CAACACAGAAAACGAAGUUGA 933 UCAACUTCGUUUUCUGUGUUGGC 934 392815 2113 2113 AD- 2162- 2160- AGGUUCUGGGUUGACAAAUAU 935 AUAUUUGUCAACCCAGAACCUGG 936 392762 2182 2182 AD- 2164- 2162- GUUCUGGGUUGACAAAUAUCA 937 UGAUAUTUGUCAACCCAGAACCU 938 392735 2184 2184 AD- 2167- 2165- CUGGGUUGACAAAUAUCAAGA 939 UCUUGATAUUUGUCAACCCAGAA 940 392743 2187 2187 AD- 2168- 2166- UGGGUUGACAAAUAUCAAGAU 941 AUCUUGAUAUUUGUCAACCCAGA 942 392736 2188 2188 AD- 2212- 2210- UGGAUGCAGAAUUCCGACAUU 943 AAUGUCGGAAUUCUGCAUCCAUC 944 392824 2232 2232 AD- 2214- 2212- GAUGCAGAAUUCCGACAUGAU 945 AUCAUGTCGGAAUUCUGCAUCCA 946 392799 2234 2234 AD- 2236- 2234- CAGGAUAUGAAGUUCAUCAUU 947 AAUGAUGAACUUCAUAUCCUGAG 948 392971 2256 2256 AD- 2241- 2239- UAUGAAGUUCAUCAUCAAAAA 949 UUUUUGAUGAUGAACUUCAUAUC 950 392913 2261 2261 AD- 2247- 2245- GUUCAUCAUCAAAAAUUGGUU 951 AACCAATUUUUGAUGAUGAACUU 952 392892 2267 2267 AD- 2250- 2248- CAUCAUCAAAAAUUGGUGUUU 953 AAACACCAAUUUUUGAUGAUGAA 954 392914 2270 2270 AD- 2253- 2251- CAUCAAAAAUUGGUGUUCUUU 955 AAAGAACACCAAUUUUUGAUGAU 956 392860 2273 2273 AD- 2254- 2252- AUCAAAAAUUGGUGUUCUUUG 957 CAAAGAACACCAAUUUUUGAUGA 958 392875 2274 2274
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 2255- 2253- UCAAAAAUUGGUGUUCUUUGU 959 ACAAAGAACACCAAUUUUUGAUG 960 392915 2275 2275 AD- 2276- 2274- AGAAGAUGUGGGUUCAAACAA 961 UUGUUUGAACCCACAUCUUCUGC 962 392782 2296 2296 AD- 2278- 2276- AAGAUGUGGGUUCAAACAAAU 963 AUUUGUTUGAACCCACAUCUUCU 964 392763 2298 2298 AD- 2284- 2282- UGGGUUCAAACAAAGGUGCAA 965 UUGCACCUUUGUUUGAACCCACA 966 392816 2304 2304 AD- 2286- 2284- GGUUCAAACAAAGGUGCAAUU 967 AAUUGCACCUUUGUUUGAACCCA 968 392704 2306 2306 AD- 2331- 2329- GUCAUAGCGACAGUGAUCGUU 969 AACGAUCACUGUCGCUAUGACAA 970 392854 2351 2351 AD- 2334- 2332- AUAGCGACAGUGAUCGUCAUU 971 AAUGACGAUCACUGUCGCUAUGA 972 392856 2354 2354 AD- 2341- 2339- CAGUGAUCGUCAUCACCUUGU 973 ACAAGGTGAUGACGAUCACUGUC 974 392817 2361 2361 AD- 2367- 2365- CUGAAGAAGAAACAGUACACA 975 UGUGUACUGUUUCUUCUUCAGCA 976 392764 2387 2387 AD- 2379- 2377- CAGUACACAUCCAUUCAUCAU 977 AUGAUGAAUGGAUGUGUACUGUU 978 392845 2399 2399 AD- 2447- 2445- GUCCAAGAUGCAGCAGAACGU 979 ACGUUCTGCUGCAUCUUGGACAG 980 392825 2467 2467 AD- 2462- 2460- GAACGGCUACGAAAAUCCAAU 981 AUUGGATUUUCGUAGCCGUUCUG 982 392849 2482 2482 AD- 2463- 2461- AACGGCUACGAAAAUCCAACU 983 AGUUGGAUUUUCGUAGCCGUUCU 984 392846 2483 2483 AD- 2464- 2462- ACGGCUACGAAAAUCCAACCU 985 AGGUUGGAUUUUCGUAGCCGUUC 986 392859 2484 2484 AD- 2466- 2464- GGCUACGAAAAUCCAACCUAU 987 AUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 988 392843 2486 2486 AD- 2467- 2465- GCUACGAAAAUCCAACCUACA 989 UGUAGGTUGGAUUUUCGUAGCCG 990 392855 2487 2487 AD- 2468- 2466- CUACGAAAAUCCAACCUACAA 991 UUGUAGGUUGGAUUUUCGUAGCC 992 392840 2488 2488 AD- 2469- 2467- UACGAAAAUCCAACCUACAAU 993 AUUGUAGGUUGGAUUUUCGUAGC 994 392835 2489 2489 AD- 2470- 2468- ACGAAAAUCCAACCUACAAGU 995 ACUUGUAGGUUGGAUUUUCGUAG 996 392729 2490 2490 AD- 2473- 2471- AAAAUCCAACCUACAAGUUCU 997 AGAACUTGUAGGUUGGAUUUUCG 998 392916 2493 2493 AD- 2474- 100 2472- AAAUCCAACCUACAAGUUCUU 999 AAGAACTUGUAGGUUGGAUUUUC 392876 2494 0 2494 AD- AUCCAACCUACAAGUUCUUUG 100 2476- CAAAGAACUUGUAGGUUGGAUUU 100 2474-
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 392861 1 2496 2 2496 AD- 100 2477- 100 2475-
UCCAACCUACAAGUUCUUUGA UCAAAGAACUUGUAGGUUGGAUU 392863 3 2497 4 2497 AD- 100 2478- 100 2476-
CCAACCUACAAGUUCUUUGAU AUCAAAGAACUUGUAGGUUGGAU 392917 5 2498 6 2498 AD- 100 2530- 100 2528-
CCUCUGAAGUUGGACAGCAAA UUUGCUGUCCAACUUCAGAGGCU 392783 7 2550 8 2550 AD- 100 2536- 101 2534-
AAGUUGGACAGCAAAACCAUU AAUGGUTUUGCUGUCCAACUUCA 392765 9 2556 0 2556 AD- 101 2537- 101 2535-
AGUUGGACAGCAAAACCAUUU AAAUGGTUUUGCUGUCCAACUUC 392791 1 2557 2 2557 AD- 101 2539- 101 2537-
UUGGACAGCAAAACCAUUGCU AGCAAUGGUUUUGCUGUCCAACU 392800 3 2559 4 2559 AD- 101 2546- 101 2544-
GCAAAACCAUUGCUUCACUAU AUAGUGAAGCAAUGGUUUUGCUG 392711 5 2566 6 2566 AD- 101 2549- 101 2547-
AAACCAUUGCUUCACUACCCA UGGGUAGUGAAGCAAUGGUUUUG 392801 7 2569 8 2569 AD- 101 2564- 102 2562-
UACCCAUCGGUGUCCAUUUAU AUAAAUGGACACCGAUGGGUAGU 392826 9 2584 0 2584 AD- 102 2565- 102 2563-
ACCCAUCGGUGUCCAUUUAUA UAUAAATGGACACCGAUGGGUAG 392818 1 2585 2 2585 AD- 102 2566- 102 2564-
CCCAUCGGUGUCCAUUUAUAU AUAUAAAUGGACACCGAUGGGUA 392792 3 2586 4 2586 AD- 102 2567- 102 2565-
CCAUCGGUGUCCAUUUAUAGA UCUAUAAAUGGACACCGAUGGGU 392802 5 2587 6 2587 AD- 102 2569- 102 2567-
AUCGGUGUCCAUUUAUAGAAU AUUCUATAAAUGGACACCGAUGG 392766 7 2589 8 2589 AD- 102 2570- 103 2568-
UCGGUGUCCAUUUAUAGAAUA UAUUCUAUAAAUGGACACCGAUG 392767 9 2590 0 2590 AD- 103 2607- 103 2605-
ACCCGUUUUAUGAUUUACUCA UGAGUAAAUCAUAAAACGGGUUU 392834 1 2627 2 2627 AD- 103 2608- 103 2606-
CCCGUUUUAUGAUUUACUCAU AUGAGUAAAUCAUAAAACGGGUU 392974 3 2628 4 2628 AD- 103 2614- 103 2612-
UUAUGAUUUACUCAUUAUCGU ACGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAA 392784 5 2634 6 2634 AD- 103 2616- 103 2614-
AUGAUUUACUCAUUAUCGCCU AGGCGATAAUGAGUAAAUCAUAA 392744 7 2636 8 2636 AD- 103 2617- 104 2615-
UGAUUUACUCAUUAUCGCCUU AAGGCGAUAAUGAGUAAAUCAUA 392752 9 2637 0 2637 AD- 104 2618- 104 2616-
GAUUUACUCAUUAUCGCCUUU AAAGGCGAUAAUGAGUAAAUCAU 392737 1 2638 2 2638 AD- 104 2619- 104 2617-
AUUUACUCAUUAUCGCCUUUU AAAAGGCGAUAAUGAGUAAAUCA 392712 3 2639 4 2639
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 104 2620- 104 2618-
UUUACUCAUUAUCGCCUUUUG CAAAAGGCGAUAAUGAGUAAAUC 392705 5 2640 6 2640 AD- 104 2622- 104 2620-
UACUCAUUAUCGCCUUUUGAU AUCAAAAGGCGAUAAUGAGUAAA 392713 7 2642 8 2642 AD- 104 2623- 105 2621-
ACUCAUUAUCGCCUUUUGACA UGUCAAAAGGCGAUAAUGAGUAA 392918 9 2643 0 2643 AD- 105 2624- 105 2622-
CUCAUUAUCGCCUUUUGACAU AUGUCAAAAGGCGAUAAUGAGUA 392919 1 2644 2 2644 AD- 105 2628- 105 2626-
UUAUCGCCUUUUGACAGCUGU ACAGCUGUCAAAAGGCGAUAAUG 392803 3 2648 4 2648 AD- 105 2630- 105 2628-
AUCGCCUUUUGACAGCUGUGU ACACAGCUGUCAAAAGGCGAUAA 392804 5 2650 6 2650 AD- 105 2636- 105 2634-
UUUUGACAGCUGUGCUGUAAU AUUACAGCACAGCUGUCAAAAGG 392827 7 2656 8 2656 AD- 105 2638- 106 2636-
UUGACAGCUGUGCUGUAACAU AUGUUACAGCACAGCUGUCAAAA 392828 9 2658 0 2658 AD- 106 2641- 106 2639-
ACAGCUGUGCUGUAACACAAU AUUGUGTUACAGCACAGCUGUCA 392785 1 2661 2 2661 AD- 106 2643- 106 2641-
AGCUGUGCUGUAACACAAGUA UACUUGTGUUACAGCACAGCUGU 392829 3 2663 4 2663 AD- 106 2646- 106 2644-
UGUGCUGUAACACAAGUAGAU AUCUACTUGUGUUACAGCACAGC 392920 5 2666 6 2666 AD- 106 2647- 106 2645-
GUGCUGUAACACAAGUAGAUU AAUCUACUUGUGUUACAGCACAG 392921 7 2667 8 2667 AD- 106 2649- 107 2647-
GCUGUAACACAAGUAGAUGCU AGCAUCTACUUGUGUUACAGCAC 392768 9 2669 0 2669 AD- 107 2655- 107 2653-
ACACAAGUAGAUGCCUGAACU AGUUCAGGCAUCUACUUGUGUUA 392805 1 2675 2 2675 AD- 107 2659- 107 2657-
AAGUAGAUGCCUGAACUUGAA UUCAAGTUCAGGCAUCUACUUGU 392769 3 2679 4 2679 AD- 107 2661- 107 2659-
GUAGAUGCCUGAACUUGAAUU AAUUCAAGUUCAGGCAUCUACUU 392753 5 2681 6 2681 AD- 107 2666- 107 2664-
UGCCUGAACUUGAAUUAAUCU AGAUUAAUUCAAGUUCAGGCAUC 392714 7 2686 8 2686 AD- 107 2668- 108 2666-
CCUGAACUUGAAUUAAUCCAU AUGGAUTAAUUCAAGUUCAGGCA 392703 9 2688 0 2688 AD- 108 2669- 108 2667-
CUGAACUUGAAUUAAUCCACA UGUGGATUAAUUCAAGUUCAGGC 392715 1 2689 2 2689 AD- 108 2683- 108 2681-
AUCCACACAUCAGUAAUGUAU AUACAUTACUGAUGUGUGGAUUA 392841 3 2703 4 2703 AD- 108 2684- 108 2682-
UCCACACAUCAGUAAUGUAUU AAUACATUACUGAUGUGUGGAUU 392836 5 2704 6 2704 AD- CCACACAUCAGUAAUGUAUUU 108 2685- AAAUACAUUACUGAUGUGUGGAU 108 2683-
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 392966 7 2705 8 2705 AD- 108 2686- 109 2684-
CACACAUCAGUAAUGUAUUCU AGAAUACAUUACUGAUGUGUGGA 392832 9 2706 0 2706 AD- 109 2687- 109 2685-
ACACAUCAGUAAUGUAUUCUA UAGAAUACAUUACUGAUGUGUGG 392972 1 2707 2 2707 AD- 109 2699- 109 2697-
UGUAUUCUAUCUCUCUUUACA UGUAAAGAGAGAUAGAAUACAUU 392961 3 2719 4 2719 AD- 109 2705- 109 2703-
CUAUCUCUCUUUACAUUUUGU ACAAAATGUAAAGAGAGAUAGAA 392967 5 2725 6 2725 AD- 109 2706- 109 2704-
UAUCUCUCUUUACAUUUUGGU ACCAAAAUGUAAAGAGAGAUAGA 392893 7 2726 8 2726 AD- 109 2707- 110 2705-
AUCUCUCUUUACAUUUUGGUU AACCAAAAUGUAAAGAGAGAUAG 392894 9 2727 0 2727 AD- 110 2708- 110 2706-
UCUCUCUUUACAUUUUGGUCU AGACCAAAAUGUAAAGAGAGAUA 392864 1 2728 2 2728 AD- 110 2709- 110 2707-
CUCUCUUUACAUUUUGGUCUU AAGACCAAAAUGUAAAGAGAGAU 392865 3 2729 4 2729 AD- 110 2712- 110 2710-
UCUUUACAUUUUGGUCUCUAU AUAGAGACCAAAAUGUAAAGAGA 392922 5 2732 6 2732 AD- 110 2723- 110 2721-
UGGUCUCUAUACUACAUUAUU AAUAAUGUAGUAUAGAGACCAAA 392833 7 2743 8 2743 AD- 110 2724- 111 2722-
GGUCUCUAUACUACAUUAUUA UAAUAATGUAGUAUAGAGACCAA 392968 9 2744 0 2744 AD- 111 2725- 111 2723-
GUCUCUAUACUACAUUAUUAA UUAAUAAUGUAGUAUAGAGACCA 392962 1 2745 2 2745 AD- 111 2726- 111 2724-
UCUCUAUACUACAUUAUUAAU AUUAAUAAUGUAGUAUAGAGACC 392963 3 2746 4 2746 AD- 111 2727- 111 2725-
CUCUAUACUACAUUAUUAAUU AAUUAATAAUGUAGUAUAGAGAC 392964 5 2747 6 2747 AD- 111 2728- 111 2726-
UCUAUACUACAUUAUUAAUGU ACAUUAAUAAUGUAGUAUAGAGA 392969 7 2748 8 2748 AD- 111 2729- 112 2727-
CUAUACUACAUUAUUAAUGGU ACCAUUAAUAAUGUAGUAUAGAG 392973 9 2749 0 2749 AD- 112 2745- 112 2743-
AUGGGUUUUGUGUACUGUAAA UUUACAGUACACAAAACCCAUUA 392923 1 2765 2 2765 AD- 112 2751- 112 2749-
UUUGUGUACUGUAAAGAAUUU AAAUUCTUUACAGUACACAAAAC 392866 3 2771 4 2771 AD- 112 2752- 112 2750-
UUGUGUACUGUAAAGAAUUUA UAAAUUCUUUACAGUACACAAAA 392924 5 2772 6 2772 AD- 112 2753- 112 2751-
UGUGUACUGUAAAGAAUUUAU AUAAAUTCUUUACAGUACACAAA 392895 7 2773 8 2773 AD- 112 2754- 113 2752-
GUGUACUGUAAAGAAUUUAGU ACUAAATUCUUUACAGUACACAA 392867 9 2774 0 2774
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 113 2756- 113 2754-
GUACUGUAAAGAAUUUAGCUU AAGCUAAAUUCUUUACAGUACAC 392877 1 2776 2 2776 AD- 113 2768- 113 2766-
AUUUAGCUGUAUCAAACUAGU ACUAGUTUGAUACAGCUAAAUUC 392707 3 2788 4 2788 AD- 113 2769- 113 2767-
UUUAGCUGUAUCAAACUAGUU AACUAGTUUGAUACAGCUAAAUU 392716 5 2789 6 2789 AD- 113 2773- 113 2771-
GCUGUAUCAAACUAGUGCAUU AAUGCACUAGUUUGAUACAGCUA 392925 7 2793 8 2793 AD- 113 2784- 114 2782-
CUAGUGCAUGAAUAGAUUCUU AAGAAUCUAUUCAUGCACUAGUU 392926 9 2804 0 2804 AD- 114 2785- 114 2783-
UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCU AGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 392927 1 2805 2 2805 AD- 114 2793- 114 2791-
GAAUAGAUUCUCUCCUGAUUA UAAUCAGGAGAGAAUCUAUUCAU 392717 3 2813 4 2813 AD- 114 2802- 114 2800-
CUCUCCUGAUUAUUUAUCACA UGUGAUAAAUAAUCAGGAGAGAA 392928 5 2822 6 2822 AD- 114 2803- 114 2801-
UCUCCUGAUUAUUUAUCACAU AUGUGATAAAUAAUCAGGAGAGA 392700 7 2823 8 2823 AD- 114 2804- 115 2802-
CUCCUGAUUAUUUAUCACAUA UAUGUGAUAAAUAAUCAGGAGAG 392878 9 2824 0 2824 AD- 115 2805- 115 2803-
UCCUGAUUAUUUAUCACAUAU AUAUGUGAUAAAUAAUCAGGAGA 392718 1 2825 2 2825 AD- 115 2806- 115 2804-
CCUGAUUAUUUAUCACAUAGU ACUAUGTGAUAAAUAAUCAGGAG 392929 3 2826 4 2826 AD- 115 2833- 115 2831-
GCCAGUUGUAUAUUAUUCUUU AAAGAATAAUAUACAACUGGCUA 392879 5 2853 6 2853 AD- 115 2838- 115 2836-
UUGUAUAUUAUUCUUGUGGUU AACCACAAGAAUAAUAUACAACU 392754 7 2858 8 2858 AD- 115 2849- 116 2847-
UCUUGUGGUUUGUGACCCAAU AUUGGGTCACAAACCACAAGAAU 392819 9 2869 0 2869 AD- 116 2850- 116 2848-
CUUGUGGUUUGUGACCCAAUU AAUUGGGUCACAAACCACAAGAA 392745 1 2870 2 2870 AD- 116 2851- 116 2849-
UUGUGGUUUGUGACCCAAUUA UAAUUGGGUCACAAACCACAAGA 392770 3 2871 4 2871 AD- 116 2852- 116 2850-
UGUGGUUUGUGACCCAAUUAA UUAAUUGGGUCACAAACCACAAG 392806 5 2872 6 2872 AD- 116 2856- 116 2854-
GUUUGUGACCCAAUUAAGUCU AGACUUAAUUGGGUCACAAACCA 392771 7 2876 8 2876 AD- 116 2857- 117 2855-
UUUGUGACCCAAUUAAGUCCU AGGACUTAAUUGGGUCACAAACC 392820 9 2877 0 2877 AD- 117 2858- 117 2856-
UUGUGACCCAAUUAAGUCCUA UAGGACTUAAUUGGGUCACAAAC 392821 1 2878 2 2878 AD- UGUGACCCAAUUAAGUCCUAU 117 2859- AUAGGACUUAAUUGGGUCACAAA 117 2857-
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 392786 3 2879 4 2879 AD- 117 2860- 117 2858-
GUGACCCAAUUAAGUCCUACU AGUAGGACUUAAUUGGGUCACAA 392772 5 2880 6 2880 AD- 117 2862- 117 2860-
GACCCAAUUAAGUCCUACUUU AAAGUAGGACUUAAUUGGGUCAC 392699 7 2882 8 2882 AD- 117 2863- 118 2861-
ACCCAAUUAAGUCCUACUUUA UAAAGUAGGACUUAAUUGGGUCA 392868 9 2883 0 2883 AD- 118 2864- 118 2862-
CCCAAUUAAGUCCUACUUUAU AUAAAGTAGGACUUAAUUGGGUC 392719 1 2884 2 2884 AD- 118 2867- 118 2865-
AAUUAAGUCCUACUUUACAUA UAUGUAAAGUAGGACUUAAUUGG 392880 3 2887 4 2887 AD- 118 2870- 118 2868-
UAAGUCCUACUUUACAUAUGU ACAUAUGUAAAGUAGGACUUAAU 392930 5 2890 6 2890 AD- 118 2872- 118 2870-
AGUCCUACUUUACAUAUGCUU AAGCAUAUGUAAAGUAGGACUUA 392931 7 2892 8 2892 AD- 118 2873- 119 2871-
GUCCUACUUUACAUAUGCUUU AAAGCATAUGUAAAGUAGGACUU 392932 9 2893 0 2893 AD- 119 2874- 119 2872-
UCCUACUUUACAUAUGCUUUA UAAAGCAUAUGUAAAGUAGGACU 392869 1 2894 2 2894 AD- 119 2875- 119 2873-
CCUACUUUACAUAUGCUUUAA UUAAAGCAUAUGUAAAGUAGGAC 392870 3 2895 4 2895 AD- 119 2876- 119 2874-
CUACUUUACAUAUGCUUUAAU AUUAAAGCAUAUGUAAAGUAGGA 392896 5 2896 6 2896 AD- 119 2882- 119 2880-
UACAUAUGCUUUAAGAAUCGA UCGAUUCUUAAAGCAUAUGUAAA 392787 7 2902 8 2902 AD- 119 2884- 120 2882-
CAUAUGCUUUAAGAAUCGAUU AAUCGATUCUUAAAGCAUAUGUA 392720 9 2904 0 2904 AD- 120 2885- 120 2883-
AUAUGCUUUAAGAAUCGAUGU ACAUCGAUUCUUAAAGCAUAUGU 392746 1 2905 2 2905 AD- 120 2886- 120 2884-
UAUGCUUUAAGAAUCGAUGGU ACCAUCGAUUCUUAAAGCAUAUG 392773 3 2906 4 2906 AD- 120 2906- 120 2904-
GGGAUGCUUCAUGUGAACGUU AACGUUCACAUGAAGCAUCCCCC 392807 5 2926 6 2926 AD- 120 2937- 120 2935-
UGCUUCUCUUGCCUAAGUAUU AAUACUTAGGCAAGAGAAGCAGC 392730 7 2957 8 2957 AD- 120 2939- 121 2937-
CUUCUCUUGCCUAAGUAUUCU AGAAUACUUAGGCAAGAGAAGCA 392721 9 2959 0 2959 AD- 121 2940- 121 2938-
UUCUCUUGCCUAAGUAUUCCU AGGAAUACUUAGGCAAGAGAAGC 392933 1 2960 2 2960 AD- 121 2942- 121 2940-
CUCUUGCCUAAGUAUUCCUUU AAAGGAAUACUUAGGCAAGAGAA 392934 3 2962 4 2962 AD- 121 2944- 121 2942-
CUUGCCUAAGUAUUCCUUUCU AGAAAGGAAUACUUAGGCAAGAG 392881 5 2964 6 2964
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 121 2946- 121 2944-
UGCCUAAGUAUUCCUUUCCUU AAGGAAAGGAAUACUUAGGCAAG 392897 7 2966 8 2966 AD- 121 2951- 122 2949-
AAGUAUUCCUUUCCUGAUCAU AUGAUCAGGAAAGGAAUACUUAG 392898 9 2971 0 2971 AD- 122 2952- 122 2950-
AGUAUUCCUUUCCUGAUCACU AGUGAUCAGGAAAGGAAUACUUA 392708 1 2972 2 2972 AD- 122 2953- 122 2951-
GUAUUCCUUUCCUGAUCACUA UAGUGATCAGGAAAGGAAUACUU 392899 3 2973 4 2973 AD- 122 2954- 122 2952-
UAUUCCUUUCCUGAUCACUAU AUAGUGAUCAGGAAAGGAAUACU 392935 5 2974 6 2974 AD- 122 2955- 122 2953-
AUUCCUUUCCUGAUCACUAUU AAUAGUGAUCAGGAAAGGAAUAC 392882 7 2975 8 2975 AD- 122 2957- 123 2955-
UCCUUUCCUGAUCACUAUGCA UGCAUAGUGAUCAGGAAAGGAAU 392738 9 2977 0 2977 AD- 123 2959- 123 2957-
CUUUCCUGAUCACUAUGCAUU AAUGCATAGUGAUCAGGAAAGGA 392739 1 2979 2 2979 AD- 123 2960- 123 2958-
UUUCCUGAUCACUAUGCAUUU AAAUGCAUAGUGAUCAGGAAAGG 392936 3 2980 4 2980 AD- 123 2961- 123 2959-
UUCCUGAUCACUAUGCAUUUU AAAAUGCAUAGUGAUCAGGAAAG 392900 5 2981 6 2981 AD- 123 2964- 123 2962-
CUGAUCACUAUGCAUUUUAAA UUUAAAAUGCAUAGUGAUCAGGA 392901 7 2984 8 2984 AD- 123 2969- 124 2967-
CACUAUGCAUUUUAAAGUUAA UUAACUTUAAAAUGCAUAGUGAU 392937 9 2989 0 2989 AD- 124 2970- 124 2968-
ACUAUGCAUUUUAAAGUUAAA UUUAACTUUAAAAUGCAUAGUGA 392883 1 2990 2 2990 AD- 124 3029- 124 3027-
UUCCAUGACUGCAUUUUACUU AAGUAAAAUGCAGUCAUGGAAAA 392975 3 3049 4 3049 AD- 124 3037- 124 3035-
CUGCAUUUUACUGUACAGAUU AAUCUGTACAGUAAAAUGCAGUC 392938 5 3057 6 3057 AD- 124 3055- 124 3053-
AUUGCUGCUUCUGCUAUAUUU AAAUAUAGCAGAAGCAGCAAUCU 392755 7 3075 8 3075 AD- 124 3063- 125 3061-
UUCUGCUAUAUUUGUGAUAUA UAUAUCACAAAUAUAGCAGAAGC 392939 9 3083 0 3083 AD- 125 3064- 125 3062-
UCUGCUAUAUUUGUGAUAUAU AUAUAUCACAAAUAUAGCAGAAG 392940 1 3084 2 3084 AD- 125 3066- 125 3064-
UGCUAUAUUUGUGAUAUAGGA UCCUAUAUCACAAAUAUAGCAGA 392756 3 3086 4 3086 AD- 125 3073- 125 3071-
UUUGUGAUAUAGGAAUUAAGA UCUUAATUCCUAUAUCACAAAUA 392774 5 3093 6 3093 AD- 125 3111- 125 3109-
UCUUCGUGCCUGUUUUAUGUU AACAUAAAACAGGCACGAAGAAA 392850 7 3131 8 3131 AD- CUUCGUGCCUGUUUUAUGUGU 125 3112- ACACAUAAAACAGGCACGAAGAA 126 3110-
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 392852 9 3132 0 3132 AD- 126 3122- 126 3120-
GUUUUAUGUGCACACAUUAGU ACUAAUGUGUGCACAUAAAACAG 392830 1 3142 2 3142 AD- 126 3128- 126 3126-
UGUGCACACAUUAGGCAUUGA UCAAUGCCUAAUGUGUGCACAUA 392808 3 3148 4 3148 AD- 126 3130- 126 3128-
UGCACACAUUAGGCAUUGAGA UCUCAATGCCUAAUGUGUGCACA 392793 5 3150 6 3150 AD- 126 3133- 126 3131-
ACACAUUAGGCAUUGAGACUU AAGUCUCAAUGCCUAAUGUGUGC 392757 7 3153 8 3153 AD- 126 3168- 127 3166-
UUUGUCCACGUAUCUUUGGGU ACCCAAAGAUACGUGGACAAAAA 392747 9 3188 0 3188 AD- 127 3174- 127 3172-
CACGUAUCUUUGGGUCUUUGA UCAAAGACCCAAAGAUACGUGGA 392902 1 3194 2 3194 AD- 127 3175- 127 3173-
ACGUAUCUUUGGGUCUUUGAU AUCAAAGACCCAAAGAUACGUGG 392941 3 3195 4 3195 AD- 127 3180- 127 3178-
UCUUUGGGUCUUUGAUAAAGA UCUUUATCAAAGACCCAAAGAUA 392942 5 3200 6 3200 AD- 127 3181- 127 3179-
CUUUGGGUCUUUGAUAAAGAA UUCUUUAUCAAAGACCCAAAGAU 392943 7 3201 8 3201 AD- 127 3183- 128 3181-
UUGGGUCUUUGAUAAAGAAAA UUUUCUTUAUCAAAGACCCAAAG 392944 9 3203 0 3203 AD- 128 3184- 128 3182-
UGGGUCUUUGAUAAAGAAAAU AUUUUCTUUAUCAAAGACCCAAA 392903 1 3204 2 3204 AD- 128 3201- 128 3199-
AAAGAAUCCCUGUUCAUUGUA UACAAUGAACAGGGAUUCUUUUC 392775 3 3221 4 3221 AD- 128 3202- 128 3200-
AAGAAUCCCUGUUCAUUGUAA UUACAATGAACAGGGAUUCUUUU 392758 5 3222 6 3222 AD- 128 3203- 128 3201-
AGAAUCCCUGUUCAUUGUAAU AUUACAAUGAACAGGGAUUCUUU 392945 7 3223 8 3223 AD- 128 3204- 129 3202-
GAAUCCCUGUUCAUUGUAAGU ACUUACAAUGAACAGGGAUUCUU 392946 9 3224 0 3224 AD- 129 3211- 129 3209-
UGUUCAUUGUAAGCACUUUUA UAAAAGTGCUUACAAUGAACAGG 392884 1 3231 2 3231 AD- 129 3212- 129 3210-
GUUCAUUGUAAGCACUUUUAU AUAAAAGUGCUUACAAUGAACAG 392947 3 3232 4 3232 AD- 129 3214- 129 3212-
UCAUUGUAAGCACUUUUACGU ACGUAAAAGUGCUUACAAUGAAC 392748 5 3234 6 3234 AD- 129 3215- 129 3213-
CAUUGUAAGCACUUUUACGGU ACCGUAAAAGUGCUUACAAUGAA 392759 7 3235 8 3235 AD- 129 3258- 130 3256-
CUGGUCUUCAAUUACCAAGAA UUCUUGGUAAUUGAAGACCAGCA 392837 9 3278 0 3278 AD- 130 3260- 130 3258-
GGUCUUCAAUUACCAAGAAUU AAUUCUTGGUAAUUGAAGACCAG 392970 1 3280 2 3280
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 130 3262- 130 3260-
UCUUCAAUUACCAAGAAUUCU AGAAUUCUUGGUAAUUGAAGACC 392976 3 3282 4 3282 AD- 130 3263- 130 3261-
CUUCAAUUACCAAGAAUUCUU AAGAAUTCUUGGUAAUUGAAGAC 392965 5 3283 6 3283 AD- 130 3264- 130 3262-
UUCAAUUACCAAGAAUUCUCU AGAGAATUCUUGGUAAUUGAAGA 392831 7 3284 8 3284 AD- 130 3265- 131 3263-
UCAAUUACCAAGAAUUCUCCA UGGAGAAUUCUUGGUAAUUGAAG 392904 9 3285 0 3285 AD- 131 3267- 131 3265-
AAUUACCAAGAAUUCUCCAAA UUUGGAGAAUUCUUGGUAAUUGA 392885 1 3287 2 3287 AD- 131 3269- 131 3267-
UUACCAAGAAUUCUCCAAAAU AUUUUGGAGAAUUCUUGGUAAUU 392886 3 3289 4 3289 AD- 131 3304- 131 3302-
UGAUUGUACAGAAUCAUUGCU AGCAAUGAUUCUGUACAAUCAUC 392776 5 3324 6 3324 AD- 131 3317- 131 3315-
UCAUUGCUUAUGACAUGAUCU AGAUCATGUCAUAAGCAAUGAUU 392887 7 3337 8 3337 AD- 131 3318- 132 3316-
CAUUGCUUAUGACAUGAUCGU ACGAUCAUGUCAUAAGCAAUGAU 392722 9 3338 0 3338 AD- 132 3319- 132 3317-
AUUGCUUAUGACAUGAUCGCU AGCGAUCAUGUCAUAAGCAAUGA 392740 1 3339 2 3339 AD- 132 3320- 132 3318-
UUGCUUAUGACAUGAUCGCUU AAGCGATCAUGUCAUAAGCAAUG 392760 3 3340 4 3340 AD- 132 3321- 132 3319-
UGCUUAUGACAUGAUCGCUUU AAAGCGAUCAUGUCAUAAGCAAU 392731 5 3341 6 3341 AD- 132 3322- 132 3320-
GCUUAUGACAUGAUCGCUUUC GAAAGCGAUCAUGUCAUAAGCAA 392709 7 3342 8 3342 AD- 132 3323- 133 3321-
CUUAUGACAUGAUCGCUUUCU AGAAAGCGAUCAUGUCAUAAGCA 392723 9 3343 0 3343 AD- 133 3324- 133 3322-
UUAUGACAUGAUCGCUUUCUA UAGAAAGCGAUCAUGUCAUAAGC 392948 1 3344 2 3344 AD- 133 3325- 133 3323-
UAUGACAUGAUCGCUUUCUAU AUAGAAAGCGAUCAUGUCAUAAG 392724 3 3345 4 3345 AD- 133 3326- 133 3324-
AUGACAUGAUCGCUUUCUACA UGUAGAAAGCGAUCAUGUCAUAA 392949 5 3346 6 3346 AD- 133 3327- 133 3325-
UGACAUGAUCGCUUUCUACAU AUGUAGAAAGCGAUCAUGUCAUA 392725 7 3347 8 3347 AD- 133 3330- 134 3328-
CAUGAUCGCUUUCUACACUGU ACAGUGTAGAAAGCGAUCAUGUC 392950 9 3350 0 3350 AD- 134 3332- 134 3330-
UGAUCGCUUUCUACACUGUAU AUACAGTGUAGAAAGCGAUCAUG 392732 1 3352 2 3352 AD- 134 3333- 134 3331-
GAUCGCUUUCUACACUGUAUU AAUACAGUGUAGAAAGCGAUCAU 392726 3 3353 4 3353 AD- AUCGCUUUCUACACUGUAUUA 134 3334- UAAUACAGUGUAGAAAGCGAUCA 134 3332-
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 392733 5 3354 6 3354 AD- 134 3335- 134 3333-
UCGCUUUCUACACUGUAUUAU AUAAUACAGUGUAGAAAGCGAUC 392906 7 3355 8 3355 AD- 134 3336- 135 3334-
CGCUUUCUACACUGUAUUACA UGUAAUACAGUGUAGAAAGCGAU 392862 9 3356 0 3356 AD- 135 3338- 135 3336-
CUUUCUACACUGUAUUACAUA UAUGUAAUACAGUGUAGAAAGCG 392951 1 3358 2 3358 AD- 135 3340- 135 3338-
UUCUACACUGUAUUACAUAAA UUUAUGTAAUACAGUGUAGAAAG 392871 3 3360 4 3360 AD- 135 3341- 135 3339-
UCUACACUGUAUUACAUAAAU AUUUAUGUAAUACAGUGUAGAAA 392872 5 3361 6 3361 AD- 135 3456- 135 3454-
GAUUCAAUUUUCUUUAACCAU AUGGUUAAAGAAAAUUGAAUCUG 392952 7 3476 8 3476 AD- 135 3462- 136 3460-
AUUUUCUUUAACCAGUCUGAA UUCAGACUGGUUAAAGAAAAUUG 392907 9 3482 0 3482 AD- 136 3464- 136 3462-
UUUCUUUAACCAGUCUGAAGU ACUUCAGACUGGUUAAAGAAAAU 392953 1 3484 2 3484 AD- 136 3466- 136 3464-
UCUUUAACCAGUCUGAAGUUU AAACUUCAGACUGGUUAAAGAAA 392741 3 3486 4 3486 AD- 136 3467- 136 3465-
CUUUAACCAGUCUGAAGUUUC GAAACUTCAGACUGGUUAAAGAA 392908 5 3487 6 3487 AD- 136 3478- 136 3476-
CUGAAGUUUCAUUUAUGAUAU AUAUCATAAAUGAAACUUCAGAC 392977 7 3498 8 3498 AD- 136 3480- 137 3478-
GAAGUUUCAUUUAUGAUACAA UUGUAUCAUAAAUGAAACUUCAG 392847 9 3500 0 3500 AD- 137 3511- 137 3509-
AAAUGGAAGUGGCAAUAUAAU AUUAUATUGCCACUUCCAUUUUC 392809 1 3531 2 3531 AD- 137 3513- 137 3511-
AUGGAAGUGGCAAUAUAAGGU ACCUUATAUUGCCACUUCCAUUU 392810 3 3533 4 3533 AD- 137 3547- 137 3545-
UGCCUGGACAAACCCUUCUUU AAAGAAGGGUUUGUCCAGGCAUG 392777 5 3567 6 3567 AD- 137 3562- 137 3560-
UUCUUUUAAGAUGUGUCUUCA UGAAGACACAUCUUAAAAGAAGG 392960 7 3582 8 3582 AD- 137 3564- 138 3562-
CUUUUAAGAUGUGUCUUCAAU AUUGAAGACACAUCUUAAAAGAA 392873 9 3584 0 3584 AD- 138 3565- 138 3563-
UUUUAAGAUGUGUCUUCAAUU AAUUGAAGACACAUCUUAAAAGA 392889 1 3585 2 3585 AD- 138 3566- 138 3564-
UUUAAGAUGUGUCUUCAAUUU AAAUUGAAGACACAUCUUAAAAG 392954 3 3586 4 3586 AD- 138 3567- 138 3565-
UUAAGAUGUGUCUUCAAUUUG CAAAUUGAAGACACAUCUUAAAA 392955 5 3587 6 3587 AD- 138 3568- 138 3566-
UAAGAUGUGUCUUCAAUUUGU ACAAAUTGAAGACACAUCUUAAA 392909 7 3588 8 3588
Posição Posição
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ em Sequência Antissenso (5’ em
ID ID Duplex a 3’) NM_0004 a 3’) NM_0004
NO NO 84 84 AD- 138 3569- 139 3567-
AAGAUGUGUCUUCAAUUUGUA UACAAATUGAAGACACAUCUUAA 392710 9 3589 0 3589 AD- 139 3570- 139 3568-
AGAUGUGUCUUCAAUUUGUAU AUACAAAUUGAAGACACAUCUUA 392956 1 3590 2 3590 AD- 139 3572- 139 3570-
AUGUGUCUUCAAUUUGUAUAA UUAUACAAAUUGAAGACACAUCU 392874 3 3592 4 3592 AD- 139 3575- 139 3573-
UGUCUUCAAUUUGUAUAAAAU AUUUUATACAAAUUGAAGACACA 392957 5 3595 6 3595 AD- 139 3578- 139 3576-
CUUCAAUUUGUAUAAAAUGGU ACCAUUTUAUACAAAUUGAAGAC 392958 7 3598 8 3598 AD- 139 3594- 140 3592-
AUGGUGUUUUCAUGUAAAUAA UUAUUUACAUGAAAACACCAUUU 392959 9 3614 0 3614 AD- 140 3607- 140 3605-
GUAAAUAAAUACAUUCUUGGA UCCAAGAAUGUAUUUAUUUACAU 392788 1 3627 2 3627 TABELA 4. TRIAGEM DE DOSE ÚNICA DA APP EM LINHAGEM CELULAR DE BE(2)C E HEPATÓCITOS CINOMOLGOS PRIMÁRIOS
[869] Os dados são expressos como porcentagem de mensagem restante em relação ao controle de não segmentação AD-1955. Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392853 92 5 89,9 1,5 97 2,5 99,3 8,8 AD-392857 86,7 3,3 98,9 6,1 85,1 4,4 103,8 5,9 AD-392851 90,5 1,5 97,9 10,1 100,1 4 103,9 7,8 AD-392811 90,5 10,5 87,8 2,5 89,1 6,8 98 5,1 AD-392910 52,3 3 99,2 32,4 66,1 6,1 101,3 9,7 AD-392890 57,4 4,8 108,5 23,1 63,9 1,5 100,3 10,6 AD-392911 16,4 3,4 85,7 4 10,6 3,5 71,2 10,3 AD-392912 16,7 2,7 84,8 4,5 9,7 1,7 57,7 4,1 AD-392778 46,1 19,2 96 23,4 7,9 0,9 82,4 7,4 AD-392727 52,9 5,8 98,9 11,4 48,3 4,5 94 5,7 AD-392728 43,8 20,3 91,5 10,2 17,6 2,2 86,2 6,5 AD-392891 52 7 142,2 35,1 34,8 1,7 93,5 5,8 AD-392822 53,9 3,8 75,2 2,9 30,1 3,2 83,7 5,8
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392749 46,3 11,7 97,6 2,6 14,9 1,7 95,7 5,3 AD-392794 108,8 17,9 86,9 2,7 92,9 7,9 87,4 6,7 AD-392795 39,5 13,2 78,1 11,8 15,5 1,8 79,9 7,9 AD-392812 87,2 4,3 90,4 2,5 79,8 3,3 78,5 13,8 AD-392796 48 17,6 82,6 2,8 17,1 2,5 80,2 3,5 AD-392779 100 30,9 95,9 4,8 99,6 4 98,6 3,3 AD-392780 80,7 29,5 93,2 4,5 47,4 4,4 101,6 5,2 AD-392813 91,6 2,9 85,1 4 84,8 4,7 88,9 7 AD-392797 98 6,6 88,7 11,1 79 3,3 84 12 AD-392761 73,9 18,4 94,2 4,3 77,9 4,4 101 6,4 AD-392814 56,9 2,9 84,4 5,4 47,5 2,6 83,8 6,6 AD-392742 89 21,9 99,4 8,2 48,1 5,8 96,6 3,7 AD-392750 110,7 44,7 99,9 13,2 25,4 1,2 95 4,7 AD-392823 65,5 3 73,7 2,9 38,8 4,1 84,9 3,8 AD-392789 103,7 4 105 3,8 88,1 7 79,5 4 AD-392781 81 39,1 94,9 5,8 21,2 3,1 95 8,9 AD-392798 119,2 16,3 85,3 10,9 73,1 6,3 83,2 7,4 AD-392751 48,5 12,9 93,9 7,9 15,6 3 87,2 2,5 AD-392858 90 1,5 95 2,6 90,7 4,7 103 7,7 AD-392844 21,8 0,4 93 3,6 6,2 0,6 51,8 5,3 AD-392842 88,9 0,5 98,2 1,6 67,7 4,1 102 2,7 AD-392848 91,7 9,1 90,1 2,6 70,9 7,5 96,5 16,7 AD-392838 68 3,6 90,2 3,3 20,2 2 84,3 6,2 AD-392839 69 2,6 84,8 3,9 62,7 3,1 85,8 7,6 AD-392734 103 32,4 112,8 23,5 86,6 6,6 98,6 3,1 AD-392790 34 4,8 99,2 1,2 10,9 1,4 72,6 2,5 AD-392815 37,4 1,7 82,5 2,9 21,5 1,9 79,8 0,9 AD-392762 72,2 21,3 95 12,3 91,2 4,6 102,6 7,7 AD-392735 47 9,7 101,5 9,2 29,6 4,4 94 7,4 AD-392743 73,6 23,4 105,5 16,6 58,5 2,6 100,1 11,3 AD-392736 50,5 9 97,3 8,2 19,6 2,4 91,7 7 AD-392824 22,6 6,7 65,8 4,9 6,4 1,6 54,9 5 AD-392799 90,1 23,6 75,8 4,5 35,7 5,4 78,2 7,5 AD-392971 89,2 13,4 92,1 0,3 57,1 3,6 91,8 5,8 AD-392913 18,4 2,7 78,1 8 7,4 0,2 45,7 2,1
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392892 61 12,4 113,2 8,6 57,4 5,4 89,7 13,2 AD-392914 80,3 6,3 103,2 5,9 86,5 3,4 111,4 19,7 AD-392860 91,8 4,8 89,4 6,1 106,1 6,2 98,6 5,6 AD-392875 96,2 4,8 107,9 2,5 66,1 2,9 83,5 8,4 AD-392915 48,1 1,8 101,9 4,8 38,3 3,4 103 5,4 AD-392782 109,4 4,8 95,4 5,3 72,2 4,3 101,6 2,7 AD-392763 60 17,6 93 6,3 26,7 2,2 91,6 3,8 AD-392816 40,2 1,5 74,6 2,2 15,6 1,2 78,9 2,4 AD-392704 28,7 12,1 94,1 6,8 15,8 1,5 65,7 9,7 AD-392854 89 3,5 84,9 2,9 99 7 97,9 5,8 AD-392856 93,7 2,5 88,4 2,8 101 7,8 94,2 3,5 AD-392817 101,6 3 85 5,2 77,5 11,4 98,6 11,6 AD-392764 69,5 12,1 87,2 5,9 10,6 1,4 79,4 5,7 AD-392845 89,5 2 99 8,2 50,4 5 90,5 2,9 AD-392825 38,1 2,5 98 8,4 14,7 4,7 91,4 4 AD-392849 89,4 4,1 92,3 11,4 30,3 2,3 103,4 7,4 AD-392846 83,1 1,9 99,7 6,3 17,6 3,2 77,7 4,2 AD-392859 82 2,5 91,4 5,5 69,7 1,5 98,6 2,1 AD-392843 18,8 2,1 88,9 5,4 7,4 2,5 37,2 2,2 AD-392855 64 5,2 85,9 12,4 23,4 2,6 85,6 9,1 AD-392840 74,3 2,3 91,2 6,4 27,7 2,5 94,3 15,6 AD-392835 18,2 2,3 84,3 5,4 12,7 3,1 53,5 4,5 AD-392729 46,9 13,7 100,9 20,5 13,3 2,3 82,4 4,2 AD-392916 20 1,6 63,7 3,6 7,5 2 44,4 2,1 AD-392876 45,8 4,6 100,8 2,6 16,4 3,6 67,4 7,2 AD-392861 91,9 3,9 89,3 2,6 89,9 10,9 91,5 4,3 AD-392863 22,8 0,6 90,1 9,3 9,9 1,9 72,2 8 AD-392917 30,6 1,8 99,7 2,1 21,7 3,5 82,5 7,5 AD-392783 22,8 1,7 90,4 11,1 13,1 1,4 69,8 5,7 AD-392765 79 22 83,3 6,4 22,4 2,8 68,1 5,7 AD-392791 31,9 7,6 84,1 4,8 11,2 1,2 52,3 2,4 AD-392800 38,2 3,6 72,3 7,6 8 1,5 65,4 7,2 AD-392711 38,1 24,1 115,1 21 18,8 0,6 67,2 2,2 AD-392801 18,7 0,6 87 6,3 11,7 3 66,3 17,5 AD-392826 69 4,6 95,1 10 31,9 3,3 88,4 8
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392818 31,5 2,2 77,8 6,6 18,6 3 80,7 6,2 AD-392792 35,8 6,7 87,7 4,1 10,7 1,1 58,3 4,7 AD-392802 43,8 4,1 81,8 7,5 26,5 3,7 90,3 2,6 AD-392766 32,8 11,5 75,2 4,1 8,4 2 38,1 3,5 AD-392767 64 23,5 87,5 5,2 10,7 1,5 66,1 5,8 AD-392834 84,6 2,8 85,1 6,9 7,8 0,8 68,1 4,7 AD-392974 118,3 5,4 105,4 6,3 9,3 0,9 53,1 4,5 AD-392784 63,6 14,9 92,8 0,8 28,1 3,4 96,7 6,5 AD-392744 59,6 17,2 96,6 7,4 18,3 1 92,7 7,7 AD-392752 38,2 11,6 92,8 4,9 7,7 1,2 57,6 2,3 AD-392737 44,8 38,6 103,9 27,2 9,7 0,7 57,3 3,4 AD-392712 73 38,4 102,8 6,1 37,2 1,9 67,4 16 AD-392705 25,2 9,4 88,7 4,3 6,6 0,9 47,7 6,3 AD-392713 81,8 33,4 101,1 7,3 61,7 5,8 92,7 9,8 AD-392918 25,1 1,8 93,5 5,3 18,5 1 95 11,2 AD-392919 24,3 3,3 95 8,6 13,8 4 78 9,1 AD-392803 51,5 3,1 89,5 9,4 19,8 2 72 3 AD-392804 72 3,3 97,2 11,3 22,9 1,2 83,1 3,2 AD-392827 24,1 1,5 87 9,2 11,7 1,7 72,7 5,9 AD-392828 67,5 3,7 102,4 13,8 33,7 3,2 81,9 3,9 AD-392785 39,5 14,4 70,2 15 5,6 1,2 37,4 3,9 AD-392829 26,5 2,8 87,5 7,5 16,1 1,6 73 7,4 AD-392920 35,8 3,5 108,1 4,7 19,9 4,3 94,4 6,7 AD-392921 30 3,8 100,7 9,1 11,9 2,8 75 7,6 AD-392768 66,5 21,9 94,1 6,6 13,1 2,7 84,9 5,8 AD-392805 20,5 0,9 88,7 13,4 7,9 2,2 43,5 3,9 AD-392769 41,9 21,5 74,6 4,6 4,9 2,1 32,5 3,9 AD-392753 40,4 7,6 113,9 21,9 12,5 0,9 72,5 7,6 AD-392714 21,7 8,1 99,5 7,2 6,9 0,8 40,8 3,2 AD-392703 17,6 1,5 90,5 6,9 6,2 1,4 37,7 3,9 AD-392715 25,5 10,3 78,8 4,8 6,4 1,7 38,9 2,7 AD-392841 89,6 3,9 93,6 9 36,8 4,1 96,6 6,9 AD-392836 88,5 1,6 97,7 8,6 7,6 2 51,5 2 AD-392966 71,5 4,6 92,4 3,4 6,4 1 47,6 4,2 AD-392832 94,7 7,9 85,4 14,4 23,8 3,2 76,2 2,6
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392972 84,1 10,8 89,8 7,1 8,3 2 57,1 3,5 AD-392961 82,6 7,5 111,3 9,9 8 0,4 51,7 5,1 AD-392967 81,6 7,1 93,2 6,8 20,2 1,6 89,4 4,9 AD-392893 64,8 11,7 118,8 19,7 59,9 2,6 80,7 5,1 AD-392894 68,4 10,3 111,4 10,8 21,9 1,5 88,4 15,6 AD-392864 62,7 15,4 88,4 6,2 8,2 0,8 55,9 4,5 AD-392865 45,8 2,4 103,8 12,6 13,6 3,1 35,8 5,4 AD-392922 43,3 5 106,5 2,2 11,1 5,2 53,1 4,9 AD-392833 95,1 5,1 93,9 4,1 21,2 0,7 86,2 0,8 AD-392968 54,3 3,1 94,8 9,3 8,2 0,7 51,9 2,5 AD-392962 82,3 10,9 103 10 8,5 0,5 55 3,8 AD-392963 63,9 8,9 99,6 10,3 19,5 0,5 71,2 1,1 AD-392964 94,4 8,6 97,5 9,2 52,4 3,7 87,1 2,8 AD-392969 73,3 6,6 99 6,2 11,7 1,1 69,4 2,5 AD-392973 69 12,8 87,7 8 7,6 0,7 67,3 1,7 AD-392923 28,6 3,3 106 8,2 13,2 3,5 69,6 12,7 AD-392866 18 4,3 86,5 14,1 9,1 0,8 29,1 8,6 AD-392924 79,7 3,1 108,3 5,2 89 3,1 94,8 7,7 AD-392895 63,4 13,8 109 4,4 31,6 2,9 86,7 8,9 AD-392867 95,2 11,6 99,8 15,8 45,3 1,7 77,1 6,6 AD-392877 74,8 23,6 102,2 7,6 14,3 2 54,1 1,7 AD-392707 27,1 7,6 87,9 5,5 6 1,4 68,8 1,9 AD-392716 107,6 19,9 100,9 7,9 45,4 4 94,6 3,6 AD-392925 47 5,6 106,8 5,1 23,1 2,4 80,7 9,3 AD-392926 22,1 2,5 93,7 8,7 7,7 0,7 67 9,8 AD-392927 18,2 5,4 80,1 8,7 9,7 2 44,2 6,4 AD-392717 57,4 16 84,6 9,4 8,7 0,9 52,2 3,7 AD-392928 71,3 4 95,4 4,1 35,3 2,7 103 8,5 AD-392700 23 7,6 88,4 4,8 6,3 0,6 45,3 10,7 AD-392878 29,9 18,4 89 4,4 8,4 1,6 34,5 4 AD-392718 40,3 14,5 105,4 25,7 10,8 0,6 68,5 2,3 AD-392929 42,4 3,7 99,5 1,2 15 4,9 88,8 14,1 AD-392879 102,2 14,5 97,7 3,5 59,6 3 67,3 8,1 AD-392754 97,1 14,7 102,1 17,6 27,3 2,5 108,6 5,7 AD-392819 22,3 2,2 79,6 4,9 11 2,5 58,4 4,9
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392745 13,8 2,2 74 13,1 7,1 1,9 28,2 4 AD-392770 36,9 18 80,3 8,1 6,7 1 34,1 4,1 AD-392806 44,9 3,3 84,2 3,9 17,7 2,6 54,3 1,9 AD-392771 49,4 18,6 89,4 1,6 9,5 0,4 60,1 2,9 AD-392820 54,4 3,3 88,1 3,9 19,6 1,1 78,1 6,4 AD-392821 61,1 2,2 79,8 3,1 15,5 1,6 80,1 5,3 AD-392786 72,2 9,8 109,4 4 19,8 1,9 65,3 2,2 AD-392772 58,9 11,7 88,9 2,6 11 0,6 62,2 3,1 AD-392699 37,9 9,1 102,9 8,7 8,1 3,4 55,6 4,4 AD-392868 52,9 1,4 95,8 11,1 18 1,8 61,5 4,3 AD-392719 37,4 20,3 94,7 12,4 7,3 1 38,9 2,4 AD-392880 21,9 2 83,2 3 10,9 1,5 32,7 3,3 AD-392930 31,4 2,5 95,8 2 9,9 2,4 42,2 6 AD-392931 75,2 7,7 98,4 4,5 44,3 4,1 108,6 12,5 AD-392932 34,7 5,5 99,6 4,9 12,2 0,8 54,5 5,1 AD-392869 21,4 1,8 92,5 12,4 6,9 1,6 29 2 AD-392870 22,1 3,8 86 13,5 9 1,2 20,7 1,6 AD-392896 50,7 6,7 112,8 8,3 21,9 3 75,9 9,4 AD-392787 100,4 6,1 114,6 11,3 54,7 3,4 61,6 28,7 AD-392720 61,7 30 87,6 4,6 6,6 0,2 34,6 4 AD-392746 54,4 23,1 102,1 22,9 5,7 0,7 59 6,3 AD-392773 101,8 22 97,6 6,3 30,3 1,5 97,4 6 AD-392807 56 3,3 76 4,9 11,2 1,4 64,2 4,3 AD-392730 53,3 8,2 102,8 22,2 28,4 1,9 91,9 5,4 AD-392721 43,9 21,8 93,3 6,7 7,4 0,1 58,1 1,5 AD-392933 51,7 6,2 88,8 3,3 22 4,4 86,3 7,8 AD-392934 71,4 7,1 100,9 5,6 53,7 3,7 100,1 14 AD-392881 34,6 2 104,5 1,5 11 3,9 55 11 AD-392897 47,9 5 103,3 2,7 19,2 1,9 91,7 7,3 AD-392898 24,7 4,3 98,9 6,7 11,6 2,4 76,1 11,5 AD-392708 79,7 6,2 99,5 3,8 57,8 2,5 95,7 6,3 AD-392899 20,7 3,4 75 4,2 12,6 3 57,9 5,9 AD-392935 25,8 2,6 85,8 2,4 9,5 1,6 44 8 AD-392882 47,9 2 101,9 4,4 15,9 2,3 77,6 9,3 AD-392738 43,3 10,3 98,8 7,3 9,7 1,4 88 4
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392739 42,8 13,3 124,4 28 16,6 0,8 82,1 4,9 AD-392936 26,9 3,9 91,3 2,5 11,7 0,6 45,7 11,4 AD-392900 36,6 1,9 96,1 5,9 11,7 1,5 64,5 4,1 AD-392901 49 0,9 106,8 6,4 46,2 4,3 81,8 7,1 AD-392937 36,7 2,7 89,6 3 12,4 1,4 53 7,9 AD-392883 30,8 2,2 96,6 4,4 8,5 1,2 55,2 3,5 AD-392975 112,8 2,1 106,9 2,2 27,9 1,3 95,3 5,5 AD-392938 33 7,9 88,1 3,2 13,2 2,9 61,6 6,9 AD-392755 100,8 38 105,8 17,6 38,6 2,2 93,2 5,9 AD-392939 36,8 8 96,2 4,8 9,8 3 59,1 9,1 AD-392940 81,3 12,4 97 3,1 84,6 8,1 93,8 7,5 AD-392756 101,7 14,9 94,9 5,7 43,2 4,2 98,9 11,3 AD-392774 99,6 34,8 97,3 2,2 87,9 3,8 98,6 7,7 AD-392850 89,3 3,3 95,3 4,2 37,4 3,2 102,2 11,6 AD-392852 91,8 4,8 88,2 5,9 59,9 5,6 103,8 8,7 AD-392830 89,2 1,9 83,6 9,6 68,2 2,5 89,6 3,7 AD-392808 44,2 17,6 76,1 6,5 9,1 1,1 67,3 3,3 AD-392793 72 2,1 84,9 2 33 3,4 68 19,8 AD-392757 71,3 28,8 98,5 1,7 24,4 1 87,5 5,9 AD-392747 86,8 27,4 99,9 7,2 33,1 0,9 97,6 4,3 AD-392902 29,3 3,3 134,2 36,1 17,9 1,7 87 6,6 AD-392941 36,9 13,1 82,5 5,4 13,3 1,4 70,6 13,1 AD-392942 22 3,6 89,2 5,2 6,5 0,8 56,2 4,4 AD-392943 28 4,2 95,1 4,5 11,3 1,5 57 6,2 AD-392944 27,9 3,5 85,8 4,4 12,9 0,6 53,4 4,1 AD-392903 16,4 1 76,8 2,7 7,9 1,1 29 9,1 AD-392775 61,4 30,1 91,8 4,8 15 0,7 85,1 5,4 AD-392758 53,8 35,1 83,4 8 11,1 0,9 51,6 6,6 AD-392945 33,3 4,7 101,9 4,9 10,6 1 76,2 3,7 AD-392946 71 6,7 99,6 3,1 39,7 2 90,3 4,5 AD-392884 30,2 1,9 90,5 8 10,8 2,3 53,3 2,9 AD-392947 51,8 6 95,8 1,8 12,4 0,7 68,4 3 AD-392748 84,5 29,8 114 35,3 27,9 1,8 92,7 18,9 AD-392759 87,4 36,2 96,7 8,4 22,7 2,7 97 7,7 AD-392837 37,8 0,6 91,9 4,6 7,9 2,4 36,9 1,6
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392970 84,2 7,5 93,4 4,1 7,5 1 41,3 4,2 AD-392976 112,8 16,8 112,7 5,3 19,8 1,4 84,1 1,7 AD-392965 82,2 14,1 96,1 5,9 8,2 1 54,3 1,8 AD-392831 87,9 4,2 82 12,3 12,6 2,8 55,5 5,9 AD-392904 74,2 2,8 105,9 7,1 26 3 102,4 14,2 AD-392885 30,3 3,2 82,9 6 5,5 1,6 29,9 3,8 AD-392886 26,6 3,3 87,3 2,6 9,7 2,2 40,1 4,5 AD-392776 60,2 17 95,7 8,6 9,4 1,5 69,4 6,5 AD-392887 20,8 3,3 102,3 11,9 8,1 2 34,5 4,7 AD-392722 68,7 26,2 95,3 4,1 12,3 2,1 73,8 2,3 AD-392740 93,3 22,3 94,2 5,3 50,7 2,6 100,4 8,3 AD-392760 68,1 23 96,7 5,6 8,5 0,5 57,3 5,9 AD-392731 39,8 10,9 99,6 12,7 4,5 2,5 41,1 11,1 AD-392709 74,4 24,7 107,4 13,6 11,8 0,7 78,2 5,3 AD-392723 58,8 23,6 119,7 22,1 14,2 3,1 72,1 3,9 AD-392948 32,8 7,4 84,3 2,3 6,5 0,5 33 2,3 AD-392724 59,7 13,5 93,8 7,2 13 1,6 58,3 5,5 AD-392949 49 2,8 92,9 2 15,8 1,7 70,8 2,6 AD-392725 40,2 6,5 95,7 5,9 10 2,8 54,4 2,5 AD-392950 25,1 4,1 83,7 5,5 8,2 0,9 50,2 3,9 AD-392732 27,6 5,2 92,4 16,7 7,4 1,1 30,6 1,5 AD-392726 57,8 9,3 96 4,8 9 0,6 70 5,9 AD-392733 79,3 18 92,3 5 40,3 1,9 96,6 7,5 AD-392906 75,4 3,6 104,5 2,1 37,2 4 107 18,3 AD-392862 33,1 2,3 84,5 4,2 10,7 2 54 5,2 AD-392951 41 6,5 94,1 8 13,4 0,5 70,5 4,1 AD-392871 46,6 11,3 95,8 14,3 12,2 1,8 35,7 5,2 AD-392872 69,6 11 92 7,4 17,5 3 55,4 6,7 AD-392952 74,8 6,9 101,1 5,8 73 4,1 94,5 4,3 AD-392907 74,8 4,4 99,4 4,5 71,4 6,2 102,2 16,2 AD-392953 79,5 5,3 101,7 4,3 72,4 3,5 90,6 3,7 AD-392741 85 16,2 93,1 4,3 90,3 5,6 97 5,7 AD-392908 71,7 5 105,4 2,3 72,2 1,6 95 9 AD-392977 93,7 7,9 111,3 3,2 68 2,7 80,1 2,5 AD-392847 92,1 1,9 97,9 1,8 82,4 5 85,7 8,1
Hepatócitos Cinomolgos Primários Linhagem celular de Be(2)C Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-392809 93,5 7 93,9 10 81,9 7,5 83,3 5,7 AD-392810 93 6,1 88,8 5,9 76,9 5,4 90,6 2,9 AD-392777 88,2 20,1 92,7 7,2 86 5 101,9 13 AD-392960 85 8,7 103,7 8,7 73 3,8 87 6 AD-392873 95,5 2,9 95,5 5,6 76,4 3,7 49,1 15,4 AD-392889 64,1 5,5 126,2 36,5 71,1 4,8 85,6 7,4 AD-392954 68,9 7,2 98,1 6 66,7 3,5 75,1 4,3 AD-392955 83 3,1 98,6 5,7 73,6 1,3 88,6 2,9 AD-392909 61,4 4,4 101,1 5,8 67,3 4,7 85,8 10,4 AD-392710 110 29,8 165,2 53,6 66,7 3,8 86 9,1 AD-392956 71,5 9,3 93,1 3,8 63,5 4,5 78,9 2,7 AD-392874 77,2 2,9 98,8 4,1 67,5 9,5 64,9 15,1 AD-392957 59,5 10,6 98,9 19 60,5 4,8 72,4 2 AD-392958 80,4 5,5 95,9 8,2 83,3 5 102,9 6,3 AD-392959 67,6 6,5 99 6,1 75,9 3,1 89,4 3,3 AD-392788 106,7 6 111,9 9,1 92,1 4 87,4 6,6
[870] Certos grupos de agentes foram identificados como residindo em regiões de alvejamento de knockdown de APP particularmente eficaz. Conforme mostrado nos resultados acima, algumas regiões da transcrição de APP parecem ser relativamente mais suscetíveis ao direcionamento com agentes de RNAi da revelação do que outras regiões - por exemplo, os agentes que direcionam posições de APP 2639 a 2689 na sequência NM_000484 (ou seja, agentes de RNAi AD-392785, AD-392829, AD-392920, AD-392921, AD-392768, AD-392805, AD- 392769, AD-392753, AD-392714, AD-392703 e AD-392715) apresentaram-se resultados particularmente robustos de knockdown na linha celular Be(2)C, sugerindo um possível “ponto de acesso”, com atividade provavelmente semelhante de outros agentes de RNAi sobrepostos, direcionados a essas posições do transcrito de APP. É, portanto, expressamente contemplado que quaisquer agentes de RNAi possuindo sequência-alvos que residam totalmente nas seguintes janelas de posições NM_000484 são susceptíveis de exibir efeito inibidor de APP robusto: APP NM_00484 posições 1891 a 1919; APP NM_00484 posições 2282 a 2306; APP NM_00484 posições 2464 a 2494; APP NM_00484 posições 2475 a 2638; APP NM_00484 posições 2621 a 2689; APP NM_00484 posições 2682 a 2725; APP NM_00484 posições 2705 a 2746; APP NM_00484 posições 2726 a 2771; APP NM_00484 posições 2754 a 2788; APP NM_00484 posições 2782 a 2813; APP NM_00484 posições 2801 a 2826; APP NM_00484 posições 2847 a 2890; APP NM_00484 posições 2871 a 2896; APP NM_00484 posições 2882 a 2960; APP NM_00484 posições 2942 a 2971; APP NM_00484 posições 2951 a 3057; APP NM_00484 posições 3172 a 3223; APP NM_00484 posições 3209 a 3235; NM_00484 posições 3256 a 3289; NM_00484 posições 3302 a 3338; APP NM_00484 posições 3318 a 3353; e APP NM_00484 posições 3334 a 3361. TABELA 5A. SEQUÊNCIAS MODIFICADAS DE APP DE
CAMUNDONGO
SE SE SE Nome do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO AD- csasugu(Uhd)CfuGfUfGf 14 VPusUfsgagUfuUfAfccac 14 GCCAUGUUCUGUGG 14 397175 guaaacucaaL96 03 AfgAfacaugsgsc 04 UAAACUCAA 05 AD- usgsuuc(Uhd)GfuGfGfUf 14 VPusGfsuugAfgUfUfuacc 14 CAUGUUCUGUGGUA 14 397176 aaacucaacaL96 06 AfcAfgaacasusg 07 AACUCAACA 08 AD- asusguu(Chd)UfgUfGfGf 14 VPusUfsugaGfuUfUfacca 14 CCAUGUUCUGUGGU 14 397177 uaaacucaaaL96 09 CfaGfaacausgsg 10 AAACUCAAC 11 AD- csusgug(Ghd)UfaAfAfCf 14 VPusGfscauGfuUfGfaguu 14 UUCUGUGGUAAACU 14 397178 ucaacaugcaL96 12 UfaCfcacagsasa 13 CAACAUGCA 14 AD- gsgsuaa(Ahd)CfuCfAfAf 14 VPusAfsuguGfcAfUfguug 14 GUGGUAAACUCAAC 14 397179 caugcacauaL96 15 AfgUfuuaccsasc 16 AUGCACAUG 17 AD- usgsugg(Uhd)AfaAfCfUf 14 VPusUfsgcaUfgUfUfgagu 14 UCUGUGGUAAACUC 14 397180 caacaugcaaL96 18 UfuAfccacasgsa 19 AACAUGCAC 20 AD- gsasaga(Ghd)CfaCfUfAf 14 VPusCfsgugCfaAfGfuuag 14 GAGAAGAGCACUAA 14
SE SE SE Nome do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO 397181 acuugcacgaL96 21 UfgCfucuucsusc 22 CUUGCACGA 23 AD- cscsgcu(Ghd)GfuAfCfUf 14 VPusUfsgacAfuCfAfaagu 14 UCCCGCUGGUACUU 14 397182 uugaugucaaL96 24 AfcCfagcggsgsa 25 UGAUGUCAC 26 AD- cscsaug(Uhd)UfcUfGfUf 14 VPusGfsaguUfuAfCfcaca 14 CGCCAUGUUCUGUG 14 397183 gguaaacucaL96 27 GfaAfcauggscsg 28 GUAAACUCA 29 AD- gsusggu(Ahd)AfaCfUfCf 14 VPusGfsugcAfuGfUfugag 14 CUGUGGUAAACUCA 14 397184 aacaugcacaL96 30 UfuUfaccacsasg 31 ACAUGCACA 32 AD- gsasacu(Ghd)CfaGfAfUf 14 VPusAfscguUfuGfUfgauc 14 CUGAACUGCAGAUC 14 397185 cacaaacguaL96 33 UfgCfaguucsasg 34 ACAAACGUG 35 AD- asasgag(Chd)AfcUfAfAf 14 VPusUfscguGfcAfAfguua 14 AGAAGAGCACUAAC 14 397186 cuugcacgaaL96 36 GfuGfcucuuscsu 37 UUGCACGAC 38 AD- asgscac(Uhd)AfaCfUfUf 14 VPusUfsaguCfgUfGfcaag 14 AGAGCACUAACUUG 14 397187 gcacgacuaaL96 39 UfuAfgugcuscsu 40 CACGACUAU 41 AD- gscsacu(Ahd)AfcUfUfGf 14 VPusAfsuagUfcGfUfgcaa 14 GAGCACUAACUUGC 14 397188 cacgacuauaL96 42 GfuUfagugcsusc 43 ACGACUAUG 44 AD- asasagu(Uhd)UfaCfUfCf 14 VPusGfsguaGfuCfUfugag 14 CCAAAGUUUACUCA 14 397189 aagacuaccaL96 45 UfaAfacuuusgsg 46 AGACUACCA 47 AD- csgscau(Ghd)AfaCfCfAf 14 VPusGfsacaGfaGfAfcugg 14 AGCGCAUGAACCAG 14 397190 gucucugucaL96 48 UfuCfaugcgscsu 49 UCUCUGUCC 50 AD- csascau(Chd)GfuGfAfUf 14 VPusCfsgguAfaGfGfaauc 14 CCCACAUCGUGAUU 14 397191 uccuuaccgaL96 51 AfcGfaugugsgsg 52 CCUUACCGU 53 AD- asusgcu(Ghd)AfaGfAfAf 14 VPusCfsggaCfgUfAfcuuc 14 ACAUGCUGAAGAAG 14 397192 guacguccgaL96 54 UfuCfagcausgsu 55 UACGUCCGU 56 AD- gsasgcg(Chd)AfuGfAfAf 14 VPusAfsgagAfcUfGfguuc 14 ACGAGCGCAUGAAC 14 397193 ccagucucuaL96 57 AfuGfcgcucsgsu 58 CAGUCUCUG 59 AD- gsasgca(Ghd)AfaCfUfAf 14 VPusUfscguCfgGfAfguag 14 AGGAGCAGAACUAC 14 397194 cuccgacgaaL96 60 UfuCfugcucscsu 61 UCCGACGAU 62 AD- csasccc(Ahd)CfaUfCfGf 14 VPusAfsaggAfaUfCfacga 14 CACACCCACAUCGU 14 397195 ugauuccuuaL96 63 UfgUfgggugsusg 64 GAUUCCUUA 65 AD- asgsagc(Ahd)CfuAfAfCf 14 VPusGfsucgUfgCfAfaguu 14 GAAGAGCACUAACU 14 397196 uugcacgacaL96 66 AfgUfgcucususc 67 UGCACGACU 68 AD- csascua(Ahd)CfuUfGfCf 14 VPusCfsauaGfuCfGfugca 14 AGCACUAACUUGCA 14 397197 acgacuaugaL96 69 AfgUfuagugscsu 70 CGACUAUGG 71 AD- csuscaa(Ghd)AfcUfAfCf 14 VPusGfsguuCfaCfUfggua 14 UACUCAAGACUACC 14 397198 cagugaaccaL96 72 GfuCfuugagsusa 73 AGUGAACCU 74 AD- asgscac(Ahd)CfcCfUfAf 14 VPusAfsaaaUfgCfUfuuag 14 ACAGCACACCCUAA 14 397199 aagcauuuuaL96 75 GfgUfgugcusgsu 76 AGCAUUUUG 77 AD- asasgga(Ghd)CfaGfAfAf 14 VPusUfscggAfgUfAfguuc 14 AGAAGGAGCAGAAC 14 397200 cuacuccgaaL96 78 UfgCfuccuuscsu 79 UACUCCGAC 80 AD- gsgsagc(Ahd)GfaAfCfUf 14 VPusCfsgucGfgAfGfuagu 14 AAGGAGCAGAACUA 14 397201 acuccgacgaL96 81 UfcUfgcuccsusu 82 CUCCGACGA 83 AD- gsasaac(Ahd)GfuAfCfAf 14 VPusGfsgauGfgAfUfgugu 14 AAGAAACAGUACAC 14 397202 cauccauccaL96 84 AfcUfguuucsusu 85 AUCCAUCCA 86
SE SE SE Nome do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO AD- csusgaa(Chd)UfgCfAfGf 14 VPusGfsuuuGfuGfAfucug 14 CCCUGAACUGCAGA 14 397203 aucacaaacaL96 87 CfaGfuucagsgsg 88 UCACAAACG 89 AD- cscsaca(Uhd)CfgUfGfAf 14 VPusGfsguaAfgGfAfauca 14 ACCCACAUCGUGAU 14 397204 uuccuuaccaL96 90 CfgAfuguggsgsu 91 UCCUUACCG 92 AD- gsusgcc(Chd)GfaCfAfAf 14 VPusAfsacuUfgCfAfcuug 14 UCGUGCCCGACAAG 14 397205 gugcaaguuaL96 93 UfcGfggcacsgsa 94 UGCAAGUUC 95 AD- gsascua(Chd)CfaGfUfGf 14 VPusGfsaagAfgGfUfucac 14 AAGACUACCAGUGA 14 397206 aaccucuucaL96 96 UfgGfuagucsusu 97 ACCUCUUCC 98 AD- gsusccg(Chd)CfaUfCfAf 14 VPusAfsccaGfuUfUfuuga 15 AAGUCCGCCAUCAA 15 397207 aaaacugguaL96 99 UfgGfcggacsusu 00 AAACUGGUG 01 AD- gsgsccc(Uhd)CfgAfGfAf 15 VPusUfsgauGfuAfAfuucu 15 CUGGCCCUCGAGAA 15 397208 auuacaucaaL96 02 CfgAfgggccsasg 03 UUACAUCAC 04 AD- csasugc(Uhd)GfaAfGfAf 15 VPusGfsgacGfuAfCfuucu 15 AACAUGCUGAAGAA 15 397209 aguacguccaL96 05 UfcAfgcaugsusu 06 GUACGUCCG 07 AD- usgscug(Ahd)AfgAfAfGf 15 VPusAfscggAfcGfUfacuu 15 CAUGCUGAAGAAGU 15 397210 uacguccguaL96 08 CfuUfcagcasusg 09 ACGUCCGUG 10 AD- uscscgc(Chd)AfuCfAfAf 15 VPusCfsaccAfgUfUfuuug 15 AGUCCGCCAUCAAA 15 397211 aaacuggugaL96 11 AfuGfgcggascsu 12 AACUGGUGU 13 AD- ususgca(Chd)GfaCfUfAf 15 VPusAfsgcaUfgCfCfauag 15 ACUUGCACGACUAU 15 397212 uggcaugcuaL96 14 UfcGfugcaasgsu 15 GGCAUGCUG 16 AD- uscscca(Ghd)GfuCfAfUf 15 VPusCfsauuCfuCfUfcaug 15 UGUCCCAGGUCAUG 15 397213 gagagaaugaL96 17 AfcCfugggascsa 18 AGAGAAUGG 19 AD- csusgaa(Ghd)AfaGfUfAf 15 VPusGfscacGfgAfCfguac 15 UGCUGAAGAAGUAC 15 397214 cguccgugcaL96 20 UfuCfuucagscsa 21 GUCCGUGCG 22 AD- csgsugu(Ghd)AfuCfUfAf 15 VPusAfsugcGfcUfCfguag 15 UCCGUGUGAUCUAC 15 397215 cgagcgcauaL96 23 AfuCfacacgsgsa 24 GAGCGCAUG 25 AD- usascug(Chd)CfaAfGfAf 15 VPusGfsgguAfgAfCfcucu 15 AGUACUGCCAAGAG 15 397216 ggucuacccaL96 26 UfgGfcaguascsu 27 GUCUACCCU 28 AD- csasccg(Ahd)GfaGfAfGf 15 VPusUfsgggAfcAfUfucuc 15 AGCACCGAGAGAGA 15 397217 aaugucccaaL96 29 UfcUfcggugscsu 30 AUGUCCCAG 31 AD- csasagg(Chd)CfuCfAfUf 15 VPusGfsaacAfcAfUfgaug 15 CCCAAGGCCUCAUC 15 397218 cauguguucaL96 32 AfgGfccuugsgsg 33 AUGUGUUCA 34 AD- gscsuga(Ahd)GfaAfGfUf 15 VPusCfsacgGfaCfGfuacu 15 AUGCUGAAGAAGUA 15 397219 acguccgugaL96 35 UfcUfucagcsasu 36 CGUCCGUGC 37 AD- asasgca(Uhd)UfuUfGfAf 15 VPusCfsgcaCfaUfGfuuca 15 UAAAGCAUUUUGAA 15 397220 acaugugcgaL96 38 AfaAfugcuususa 39 CAUGUGCGC 40 AD- csasccu(Chd)CfgUfGfUf 15 VPusUfscguAfgAfUfcaca 15 CACACCUCCGUGUG 15 397221 gaucuacgaaL96 41 CfgGfaggugsusg 42 AUCUACGAG 43 AD- gsasagg(Ahd)GfcAfGfAf 15 VPusCfsggaGfuAfGfuucu 15 CAGAAGGAGCAGAA 15 397222 acuacuccgaL96 44 GfcUfccuucsusg 45 CUACUCCGA 46 AD- gsasaga(Ahd)AfcAfGfUf 15 VPusUfsggaUfgUfGfuacu 15 AAGAAGAAACAGUA 15 397223 acacauccaaL96 47 GfuUfucuucsusu 48 CACAUCCAU 49 AD- gsusacu(Ghd)CfcAfAfGf 15 VPusGfsguaGfaCfCfucuu 15 CAGUACUGCCAAGA 15
SE SE SE Nome do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO 397224 aggucuaccaL96 50 GfgCfaguacsusg 51 GGUCUACCC 52 AD- ascsugc(Chd)AfaGfAfGf 15 VPusAfsgggUfaGfAfccuc 15 GUACUGCCAAGAGG 15 397225 gucuacccuaL96 53 UfuGfgcagusasc 54 UCUACCCUG 55 AD- ascsuaa(Chd)UfuGfCfAf 15 VPusCfscauAfgUfCfgugc 15 GCACUAACUUGCAC 15 397226 cgacuauggaL96 56 AfaGfuuagusgsc 57 GACUAUGGC 58 AD- gsusccc(Ahd)UfuCfUfUf 15 VPusCfscgcCfgUfAfaaag 15 GUGUCCCAUUCUUU 15 397227 uuacggcggaL96 59 AfaUfgggacsasc 60 UACGGCGGA 61 AD- asasgcu(Ghd)AfcAfAfGf 15 VPusAfsacgGfcCfUfucuu 15 CAAAGCUGACAAGA 15 397228 aaggccguuaL96 62 GfuCfagcuususg 63 AGGCCGUUA 64 AD- usgsaca(Ahd)GfaAfGfGf 15 VPusGfsgauAfaCfGfgccu 15 GCUGACAAGAAGGC 15 397229 ccguuauccaL96 65 UfcUfugucasgsc 66 CGUUAUCCA 67 AD- asgscau(Uhd)UfuGfAfAf 15 VPusGfscgcAfcAfUfguuc 15 AAAGCAUUUUGAAC 15 397230 caugugcgcaL96 68 AfaAfaugcususu 69 AUGUGCGCA 70 AD- usgsuga(Uhd)CfuAfCfGf 15 VPusUfscauGfcGfCfucgu 15 CGUGUGAUCUACGA 15 397231 agcgcaugaaL96 71 AfgAfucacascsg 72 GCGCAUGAA 73 AD- csasgcg(Ahd)GfaAfGfAf 15 VPusAfsguuAfgUfGfcucu 15 UGCAGCGAGAAGAG 15 397233 gcacuaacuaL96 74 UfcUfcgcugscsa 75 CACUAACUU 76 AD- asgscgu(Ghd)UfcAfAfCf 15 VPusAfsaacUfuUfGfgguu 15 GCAGCGUGUCAACC 15 397234 ccaaaguuuaL96 77 GfaCfacgcusgsc 78 CAAAGUUUA 79 AD- usgsuca(Ahd)CfcCfAfAf 15 VPusGfsaguAfaAfCfuuug 15 CGUGUCAACCCAAA 15 397235 aguuuacucaL96 80 GfgUfugacascsg 81 GUUUACUCA 82 AD- usgsucc(Chd)AfuUfCfUf 15 VPusCfsgccGfuAfAfaaga 15 UGUGUCCCAUUCUU 15 397236 uuuacggcgaL96 83 AfuGfggacascsa 84 UUACGGCGG 85 AD- gsusguc(Ahd)AfcCfCfAf 15 VPusAfsguaAfaCfUfuugg 15 GCGUGUCAACCCAA 15 397237 aaguuuacuaL96 86 GfuUfgacacsgsc 87 AGUUUACUC 88 AD- asasgau(Chd)CfuGfAfUf 15 VPusGfsggaAfgUfUfuauc 15 CCAAGAUCCUGAUA 15 397238 aaacuucccaL96 89 AfgGfaucuusgsg 90 AACUUCCCA 91 AD- asgsauc(Chd)UfgAfUfAf 15 VPusUfsgggAfaGfUfuuau 15 CAAGAUCCUGAUAA 15 397239 aacuucccaaL96 92 CfaGfgaucususg 93 ACUUCCCAC 94 AD- csusuac(Chd)GfuUfGfCf 15 VPusAfsccaAfcUfAfggca 15 UCCUUACCGUUGCC 15 397240 cuaguugguaL96 95 AfcGfguaagsgsa 96 UAGUUGGUG 97 AD- gsusgug(Uhd)CfcCfAfUf 15 VPusCfsguaAfaAfGfaaug 15 AAGUGUGUCCCAUU 16 397241 ucuuuuacgaL96 98 GfgAfcacacsusu 99 CUUUUACGG 00 AD- gsusguc(Chd)CfaUfUfCf 16 VPusGfsccgUfaAfAfagaa 16 GUGUGUCCCAUUCU 16 397242 uuuuacggcaL96 01 UfgGfgacacsasc 02 UUUACGGCG 03 AD- csasuag(Chd)AfaCfCfGf 16 VPusUfsgacAfaUfCfacgg 16 GUCAUAGCAACCGU 16 397243 ugauugucaaL96 04 UfuGfcuaugsasc 05 GAUUGUCAU 06 AD- gsasacg(Ghd)AfuAfUfGf 16 VPusUfsuggAfuUfCfucau 16 CAGAACGGAUAUGA 16 397244 agaauccaaaL96 07 AfuCfcguucsusg 08 GAAUCCAAC 09 AD- usgsugu(Chd)CfcAfUfUf 16 VPusCfscguAfaAfAfgaau 16 AGUGUGUCCCAUUC 16 397245 cuuuuacggaL96 10 GfgGfacacascsu 11 UUUUACGGC 12 AD- gscsaac(Chd)GfuGfAfUf 16 VPusGfsugaUfgAfCfaauc 16 UAGCAACCGUGAUU 16 397246 ugucaucacaL96 13 AfcGfguugcsusa 14 GUCAUCACC 15
SE SE SE Nome do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO AD- gscsagc(Ghd)AfgAfAfGf 16 VPusGfsuuaGfuGfCfucuu 16 AUGCAGCGAGAAGA 16 397247 agcacuaacaL96 16 CfuCfgcugcsasu 17 GCACUAACU 18 AD- csasgaa(Uhd)UfcGfGfAf 16 VPusUfsgaaUfcAfUfgucc 16 UGCAGAAUUCGGAC 16 397248 caugauucaaL96 19 GfaAfuucugscsa 20 AUGAUUCAG 21 AD- uscscug(Ahd)UfaAfAfCf 16 VPusUfscguGfgGfAfaguu 16 GAUCCUGAUAAACU 16 397249 uucccacgaaL96 22 UfaUfcaggasusc 23 UCCCACGAC 24 AD- asgsaac(Ghd)GfaUfAfUf 16 VPusUfsggaUfuCfUfcaua 16 GCAGAACGGAUAUG 16 397250 gagaauccaaL96 25 UfcCfguucusgsc 26 AGAAUCCAA 27 AD- cscsuua(Chd)CfgUfUfGf 16 VPusCfscaaCfuAfGfgcaa 16 UUCCUUACCGUUGC 16 397251 ccuaguuggaL96 28 CfgGfuaaggsasa 29 CUAGUUGGU 30 AD- asusccu(Ghd)AfuAfAfAf 16 VPusCfsgugGfgAfAfguuu 16 AGAUCCUGAUAAAC 16 397252 cuucccacgaL96 31 AfuCfaggauscsu 32 UUCCCACGA 33 AD- cscsuga(Uhd)AfaAfCfUf 16 VPusGfsucgUfgGfGfaagu 16 AUCCUGAUAAACUU 16 397253 ucccacgacaL96 34 UfuAfucaggsasu 35 CCCACGACA 36 AD- csgsgau(Ghd)GfaUfGfUf 16 VPusGfsucuCfaCfAfaaca 16 AGCGGAUGGAUGUU 16 397254 uugugagacaL96 37 UfcCfauccgscsu 38 UGUGAGACC 39 AD- gsascac(Ghd)GfaAfGfAf 16 VPusAfsugcAfgUfAfcucu 16 UUGACACGGAAGAG 16 397255 guacugcauaL96 40 UfcCfgugucsasa 41 UACUGCAUG 42 AD- gscsagc(Ahd)GfaAfCfGf 16 VPusUfscucAfuAfUfccgu 16 AUGCAGCAGAACGG 16 397256 gauaugagaaL96 43 UfcUfgcugcsasu 44 AUAUGAGAA 45 AD- gscsaga(Ahd)CfgGfAfUf 16 VPusGfsauuCfuCfAfuauc 16 CAGCAGAACGGAUA 16 397257 augagaaucaL96 46 CfgUfucugcsusg 47 UGAGAAUCC 48 AD- csasgaa(Chd)GfgAfUfAf 16 VPusGfsgauUfcUfCfauau 16 AGCAGAACGGAUAU 16 397258 ugagaauccaL96 49 CfcGfuucugscsu 50 GAGAAUCCA 51 AD- ascscgu(Chd)GfcCfAfAf 16 VPusCfsaugUfcUfCfuuug 16 ACACCGUCGCCAAA 16 397259 agagacaugaL96 52 GfcGfacggusgsu 53 GAGACAUGC 54 AD- gsusucu(Ghd)UfgGfUfAf 16 VPusUfsguuGfaGfUfuuac 16 AUGUUCUGUGGUAA 16 397260 aacucaacaaL96 55 CfaCfagaacsasu 56 ACUCAACAU 57 AD- gsgsuac(Uhd)UfuGfAfUf 16 VPusUfsucaGfuGfAfcauc 16 CUGGUACUUUGAUG 16 397261 gucacugaaaL96 58 AfaAfguaccsasg 59 UCACUGAAG 60 AD- cscscaa(Ahd)GfuUfUfAf 16 VPusAfsgucUfuGfAfguaa 16 AACCCAAAGUUUAC 16 397262 cucaagacuaL96 61 AfcUfuugggsusu 62 UCAAGACUA 63 AD- cscsaaa(Ghd)UfuUfAfCf 16 VPusUfsaguCfuUfGfagua 16 ACCCAAAGUUUACU 16 397263 ucaagacuaaL96 64 AfaCfuuuggsgsu 65 CAAGACUAC 66 AD- csasuca(Uhd)GfuGfUfUf 16 VPusAfsgcaUfgUfUfgaac 16 CUCAUCAUGUGUUC 16 397264 caacaugcuaL96 67 AfcAfugaugsasg 68 AACAUGCUG 69 AD- asascau(Ghd)CfuGfAfAf 16 VPusAfscguAfcUfUfcuuc 16 UCAACAUGCUGAAG 16 397265 gaaguacguaL96 70 AfgCfauguusgsa 71 AAGUACGUC 72 AD- ususcug(Uhd)GfgUfAfAf 16 VPusAfsuguUfgAfGfuuua 16 UGUUCUGUGGUAAA 16 397266 acucaacauaL96 73 CfcAfcagaascsa 74 CUCAACAUG 75 AD- uscsugu(Ghd)GfuAfAfAf 16 VPusCfsaugUfuGfAfguuu 16 GUUCUGUGGUAAAC 16 397267 cucaacaugaL96 76 AfcCfacagasasc 77 UCAACAUGC 78
TABELA 5B. SEQUÊNCIAS MODIFICADAS DE APP DE CAMUNDONGO, SEM LIGANTE “L96”, SEM FOSFATO DE VINILA
SE SE SE Nome do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO csasugu(Uhd)CfuGfUfG 14 usUfsgagUfuUfAfccacAf 14 GCCAUGUUCUGUGGU 14 AD-397175 fguaaacucaa 03 gAfacaugsgsc 04 AAACUCAA 05 usgsuuc(Uhd)GfuGfGfU 14 usGfsuugAfgUfUfuaccAf 14 CAUGUUCUGUGGUAA 14 AD-397176 faaacucaaca 06 cAfgaacasusg 07 ACUCAACA 08 asusguu(Chd)UfgUfGfG 14 usUfsugaGfuUfUfaccaCf 14 CCAUGUUCUGUGGUA 14 AD-397177 fuaaacucaaa 09 aGfaacausgsg 10 AACUCAAC 11 csusgug(Ghd)UfaAfAfC 14 usGfscauGfuUfGfaguuUf 14 UUCUGUGGUAAACUC 14 AD-397178 fucaacaugca 12 aCfcacagsasa 13 AACAUGCA 14 gsgsuaa(Ahd)CfuCfAfA 14 usAfsuguGfcAfUfguugAf 14 GUGGUAAACUCAACA 14 AD-397179 fcaugcacaua 15 gUfuuaccsasc 16 UGCACAUG 17 usgsugg(Uhd)AfaAfCfU 14 usUfsgcaUfgUfUfgaguUf 14 UCUGUGGUAAACUCA 14 AD-397180 fcaacaugcaa 18 uAfccacasgsa 19 ACAUGCAC 20 gsasaga(Ghd)CfaCfUfA 14 usCfsgugCfaAfGfuuagUf 14 GAGAAGAGCACUAAC 14 AD-397181 facuugcacga 21 gCfucuucsusc 22 UUGCACGA 23 cscsgcu(Ghd)GfuAfCfU 14 usUfsgacAfuCfAfaaguAf 14 UCCCGCUGGUACUUU 14 AD-397182 fuugaugucaa 24 cCfagcggsgsa 25 GAUGUCAC 26 cscsaug(Uhd)UfcUfGfU 14 usGfsaguUfuAfCfcacaGf 14 CGCCAUGUUCUGUGG 14 AD-397183 fgguaaacuca 27 aAfcauggscsg 28 UAAACUCA 29 gsusggu(Ahd)AfaCfUfC 14 usGfsugcAfuGfUfugagUf 14 CUGUGGUAAACUCAA 14 AD-397184 faacaugcaca 30 uUfaccacsasg 31 CAUGCACA 32 gsasacu(Ghd)CfaGfAfU 14 usAfscguUfuGfUfgaucUf 14 CUGAACUGCAGAUCA 14 AD-397185 fcacaaacgua 33 gCfaguucsasg 34 CAAACGUG 35 asasgag(Chd)AfcUfAfA 14 usUfscguGfcAfAfguuaGf 14 AGAAGAGCACUAACU 14 AD-397186 fcuugcacgaa 36 uGfcucuuscsu 37 UGCACGAC 38 asgscac(Uhd)AfaCfUfU 14 usUfsaguCfgUfGfcaagUf 14 AGAGCACUAACUUGC 14 AD-397187 fgcacgacuaa 39 uAfgugcuscsu 40 ACGACUAU 41 gscsacu(Ahd)AfcUfUfG 14 usAfsuagUfcGfUfgcaaGf 14 GAGCACUAACUUGCA 14 AD-397188 fcacgacuaua 42 uUfagugcsusc 43 CGACUAUG 44 asasagu(Uhd)UfaCfUfC 14 usGfsguaGfuCfUfugagUf 14 CCAAAGUUUACUCAA 14 AD-397189 faagacuacca 45 aAfacuuusgsg 46 GACUACCA 47 csgscau(Ghd)AfaCfCfA 14 usGfsacaGfaGfAfcuggUf 14 AGCGCAUGAACCAGU 14 AD-397190 fgucucuguca 48 uCfaugcgscsu 49 CUCUGUCC 50 csascau(Chd)GfuGfAfU 14 usCfsgguAfaGfGfaaucAf 14 CCCACAUCGUGAUUC 14 AD-397191 fuccuuaccga 51 cGfaugugsgsg 52 CUUACCGU 53 asusgcu(Ghd)AfaGfAfA 14 usCfsggaCfgUfAfcuucUf 14 ACAUGCUGAAGAAGU 14 AD-397192 fguacguccga 54 uCfagcausgsu 55 ACGUCCGU 56 gsasgcg(Chd)AfuGfAfA 14 usAfsgagAfcUfGfguucAf 14 ACGAGCGCAUGAACC 14 AD-397193 fccagucucua 57 uGfcgcucsgsu 58 AGUCUCUG 59 gsasgca(Ghd)AfaCfUfA 14 usUfscguCfgGfAfguagUf 14 AGGAGCAGAACUACU 14 AD-397194 fcuccgacgaa 60 uCfugcucscsu 61 CCGACGAU 62
SE SE SE Nome do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO csasccc(Ahd)CfaUfCfG 14 usAfsaggAfaUfCfacgaUf 14 CACACCCACAUCGUG 14 AD-397195 fugauuccuua 63 gUfgggugsusg 64 AUUCCUUA 65 asgsagc(Ahd)CfuAfAfC 14 usGfsucgUfgCfAfaguuAf 14 GAAGAGCACUAACUU 14 AD-397196 fuugcacgaca 66 gUfgcucususc 67 GCACGACU 68 csascua(Ahd)CfuUfGfC 14 usCfsauaGfuCfGfugcaAf 14 AGCACUAACUUGCAC 14 AD-397197 facgacuauga 69 gUfuagugscsu 70 GACUAUGG 71 csuscaa(Ghd)AfcUfAfC 14 usGfsguuCfaCfUfgguaGf 14 UACUCAAGACUACCA 14 AD-397198 fcagugaacca 72 uCfuugagsusa 73 GUGAACCU 74 asgscac(Ahd)CfcCfUfA 14 usAfsaaaUfgCfUfuuagGf 14 ACAGCACACCCUAAA 14 AD-397199 faagcauuuua 75 gUfgugcusgsu 76 GCAUUUUG 77 asasgga(Ghd)CfaGfAfA 14 usUfscggAfgUfAfguucUf 14 AGAAGGAGCAGAACU 14 AD-397200 fcuacuccgaa 78 gCfuccuuscsu 79 ACUCCGAC 80 gsgsagc(Ahd)GfaAfCfU 14 usCfsgucGfgAfGfuaguUf 14 AAGGAGCAGAACUAC 14 AD-397201 facuccgacga 81 cUfgcuccsusu 82 UCCGACGA 83 gsasaac(Ahd)GfuAfCfA 14 usGfsgauGfgAfUfguguAf 14 AAGAAACAGUACACA 14 AD-397202 fcauccaucca 84 cUfguuucsusu 85 UCCAUCCA 86 csusgaa(Chd)UfgCfAfG 14 usGfsuuuGfuGfAfucugCf 14 CCCUGAACUGCAGAU 14 AD-397203 faucacaaaca 87 aGfuucagsgsg 88 CACAAACG 89 cscsaca(Uhd)CfgUfGfA 14 usGfsguaAfgGfAfaucaCf 14 ACCCACAUCGUGAUU 14 AD-397204 fuuccuuacca 90 gAfuguggsgsu 91 CCUUACCG 92 gsusgcc(Chd)GfaCfAfA 14 usAfsacuUfgCfAfcuugUf 14 UCGUGCCCGACAAGU 14 AD-397205 fgugcaaguua 93 cGfggcacsgsa 94 GCAAGUUC 95 gsascua(Chd)CfaGfUfG 14 usGfsaagAfgGfUfucacUf 14 AAGACUACCAGUGAA 14 AD-397206 faaccucuuca 96 gGfuagucsusu 97 CCUCUUCC 98 gsusccg(Chd)CfaUfCfA 14 usAfsccaGfuUfUfuugaUf 15 AAGUCCGCCAUCAAA 15 AD-397207 faaaacuggua 99 gGfcggacsusu 00 AACUGGUG 01 gsgsccc(Uhd)CfgAfGfA 15 usUfsgauGfuAfAfuucuCf 15 CUGGCCCUCGAGAAU 15 AD-397208 fauuacaucaa 02 gAfgggccsasg 03 UACAUCAC 04 csasugc(Uhd)GfaAfGfA 15 usGfsgacGfuAfCfuucuUf 15 AACAUGCUGAAGAAG 15 AD-397209 faguacgucca 05 cAfgcaugsusu 06 UACGUCCG 07 usgscug(Ahd)AfgAfAfG 15 usAfscggAfcGfUfacuuCf 15 CAUGCUGAAGAAGUA 15 AD-397210 fuacguccgua 08 uUfcagcasusg 09 CGUCCGUG 10 uscscgc(Chd)AfuCfAfA 15 usCfsaccAfgUfUfuuugAf 15 AGUCCGCCAUCAAAA 15 AD-397211 faaacugguga 11 uGfgcggascsu 12 ACUGGUGU 13 ususgca(Chd)GfaCfUfA 15 usAfsgcaUfgCfCfauagUf 15 ACUUGCACGACUAUG 15 AD-397212 fuggcaugcua 14 cGfugcaasgsu 15 GCAUGCUG 16 uscscca(Ghd)GfuCfAfU 15 usCfsauuCfuCfUfcaugAf 15 UGUCCCAGGUCAUGA 15 AD-397213 fgagagaauga 17 cCfugggascsa 18 GAGAAUGG 19 csusgaa(Ghd)AfaGfUfA 15 usGfscacGfgAfCfguacUf 15 UGCUGAAGAAGUACG 15 AD-397214 fcguccgugca 20 uCfuucagscsa 21 UCCGUGCG 22 csgsugu(Ghd)AfuCfUfA 15 usAfsugcGfcUfCfguagAf 15 UCCGUGUGAUCUACG 15 AD-397215 fcgagcgcaua 23 uCfacacgsgsa 24 AGCGCAUG 25 AD-397216 usascug(Chd)CfaAfGfA 15 usGfsgguAfgAfCfcucuUf 15 AGUACUGCCAAGAGG 15
SE SE SE Nome do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO fggucuaccca 26 gGfcaguascsu 27 UCUACCCU 28 csasccg(Ahd)GfaGfAfG 15 usUfsgggAfcAfUfucucUf 15 AGCACCGAGAGAGAA 15 AD-397217 faaugucccaa 29 cUfcggugscsu 30 UGUCCCAG 31 csasagg(Chd)CfuCfAfU 15 usGfsaacAfcAfUfgaugAf 15 CCCAAGGCCUCAUCA 15 AD-397218 fcauguguuca 32 gGfccuugsgsg 33 UGUGUUCA 34 gscsuga(Ahd)GfaAfGfU 15 usCfsacgGfaCfGfuacuUf 15 AUGCUGAAGAAGUAC 15 AD-397219 facguccguga 35 cUfucagcsasu 36 GUCCGUGC 37 asasgca(Uhd)UfuUfGfA 15 usCfsgcaCfaUfGfuucaAf 15 UAAAGCAUUUUGAAC 15 AD-397220 facaugugcga 38 aAfugcuususa 39 AUGUGCGC 40 csasccu(Chd)CfgUfGfU 15 usUfscguAfgAfUfcacaCf 15 CACACCUCCGUGUGA 15 AD-397221 fgaucuacgaa 41 gGfaggugsusg 42 UCUACGAG 43 gsasagg(Ahd)GfcAfGfA 15 usCfsggaGfuAfGfuucuGf 15 CAGAAGGAGCAGAAC 15 AD-397222 facuacuccga 44 cUfccuucsusg 45 UACUCCGA 46 gsasaga(Ahd)AfcAfGfU 15 usUfsggaUfgUfGfuacuGf 15 AAGAAGAAACAGUAC 15 AD-397223 facacauccaa 47 uUfucuucsusu 48 ACAUCCAU 49 gsusacu(Ghd)CfcAfAfG 15 usGfsguaGfaCfCfucuuGf 15 CAGUACUGCCAAGAG 15 AD-397224 faggucuacca 50 gCfaguacsusg 51 GUCUACCC 52 ascsugc(Chd)AfaGfAfG 15 usAfsgggUfaGfAfccucUf 15 GUACUGCCAAGAGGU 15 AD-397225 fgucuacccua 53 uGfgcagusasc 54 CUACCCUG 55 ascsuaa(Chd)UfuGfCfA 15 usCfscauAfgUfCfgugcAf 15 GCACUAACUUGCACG 15 AD-397226 fcgacuaugga 56 aGfuuagusgsc 57 ACUAUGGC 58 gsusccc(Ahd)UfuCfUfU 15 usCfscgcCfgUfAfaaagAf 15 GUGUCCCAUUCUUUU 15 AD-397227 fuuacggcgga 59 aUfgggacsasc 60 ACGGCGGA 61 asasgcu(Ghd)AfcAfAfG 15 usAfsacgGfcCfUfucuuGf 15 CAAAGCUGACAAGAA 15 AD-397228 faaggccguua 62 uCfagcuususg 63 GGCCGUUA 64 usgsaca(Ahd)GfaAfGfG 15 usGfsgauAfaCfGfgccuUf 15 GCUGACAAGAAGGCC 15 AD-397229 fccguuaucca 65 cUfugucasgsc 66 GUUAUCCA 67 asgscau(Uhd)UfuGfAfA 15 usGfscgcAfcAfUfguucAf 15 AAAGCAUUUUGAACA 15 AD-397230 fcaugugcgca 68 aAfaugcususu 69 UGUGCGCA 70 usgsuga(Uhd)CfuAfCfG 15 usUfscauGfcGfCfucguAf 15 CGUGUGAUCUACGAG 15 AD-397231 fagcgcaugaa 71 gAfucacascsg 72 CGCAUGAA 73 csasgcg(Ahd)GfaAfGfA 15 usAfsguuAfgUfGfcucuUf 15 UGCAGCGAGAAGAGC 15 AD-397233 fgcacuaacua 74 cUfcgcugscsa 75 ACUAACUU 76 asgscgu(Ghd)UfcAfAfC 15 usAfsaacUfuUfGfgguuGf 15 GCAGCGUGUCAACCC 15 AD-397234 fccaaaguuua 77 aCfacgcusgsc 78 AAAGUUUA 79 usgsuca(Ahd)CfcCfAfA 15 usGfsaguAfaAfCfuuugGf 15 CGUGUCAACCCAAAG 15 AD-397235 faguuuacuca 80 gUfugacascsg 81 UUUACUCA 82 usgsucc(Chd)AfuUfCfU 15 usCfsgccGfuAfAfaagaAf 15 UGUGUCCCAUUCUUU 15 AD-397236 fuuuacggcga 83 uGfggacascsa 84 UACGGCGG 85 gsusguc(Ahd)AfcCfCfA 15 usAfsguaAfaCfUfuuggGf 15 GCGUGUCAACCCAAA 15 AD-397237 faaguuuacua 86 uUfgacacsgsc 87 GUUUACUC 88 asasgau(Chd)CfuGfAfU 15 usGfsggaAfgUfUfuaucAf 15 CCAAGAUCCUGAUAA 15 AD-397238 faaacuuccca 89 gGfaucuusgsg 90 ACUUCCCA 91
SE SE SE Nome do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO asgsauc(Chd)UfgAfUfA 15 usUfsgggAfaGfUfuuauCf 15 CAAGAUCCUGAUAAA 15 AD-397239 faacuucccaa 92 aGfgaucususg 93 CUUCCCAC 94 csusuac(Chd)GfuUfGfC 15 usAfsccaAfcUfAfggcaAf 15 UCCUUACCGUUGCCU 15 AD-397240 fcuaguuggua 95 cGfguaagsgsa 96 AGUUGGUG 97 gsusgug(Uhd)CfcCfAfU 15 usCfsguaAfaAfGfaaugGf 15 AAGUGUGUCCCAUUC 16 AD-397241 fucuuuuacga 98 gAfcacacsusu 99 UUUUACGG 00 gsusguc(Chd)CfaUfUfC 16 usGfsccgUfaAfAfagaaUf 16 GUGUGUCCCAUUCUU 16 AD-397242 fuuuuacggca 01 gGfgacacsasc 02 UUACGGCG 03 csasuag(Chd)AfaCfCfG 16 usUfsgacAfaUfCfacggUf 16 GUCAUAGCAACCGUG 16 AD-397243 fugauugucaa 04 uGfcuaugsasc 05 AUUGUCAU 06 gsasacg(Ghd)AfuAfUfG 16 usUfsuggAfuUfCfucauAf 16 CAGAACGGAUAUGAG 16 AD-397244 fagaauccaaa 07 uCfcguucsusg 08 AAUCCAAC 09 usgsugu(Chd)CfcAfUfU 16 usCfscguAfaAfAfgaauGf 16 AGUGUGUCCCAUUCU 16 AD-397245 fcuuuuacgga 10 gGfacacascsu 11 UUUACGGC 12 gscsaac(Chd)GfuGfAfU 16 usGfsugaUfgAfCfaaucAf 16 UAGCAACCGUGAUUG 16 AD-397246 fugucaucaca 13 cGfguugcsusa 14 UCAUCACC 15 gscsagc(Ghd)AfgAfAfG 16 usGfsuuaGfuGfCfucuuCf 16 AUGCAGCGAGAAGAG 16 AD-397247 fagcacuaaca 16 uCfgcugcsasu 17 CACUAACU 18 csasgaa(Uhd)UfcGfGfA 16 usUfsgaaUfcAfUfguccGf 16 UGCAGAAUUCGGACA 16 AD-397248 fcaugauucaa 19 aAfuucugscsa 20 UGAUUCAG 21 uscscug(Ahd)UfaAfAfC 16 usUfscguGfgGfAfaguuUf 16 GAUCCUGAUAAACUU 16 AD-397249 fuucccacgaa 22 aUfcaggasusc 23 CCCACGAC 24 asgsaac(Ghd)GfaUfAfU 16 usUfsggaUfuCfUfcauaUf 16 GCAGAACGGAUAUGA 16 AD-397250 fgagaauccaa 25 cCfguucusgsc 26 GAAUCCAA 27 cscsuua(Chd)CfgUfUfG 16 usCfscaaCfuAfGfgcaaCf 16 UUCCUUACCGUUGCC 16 AD-397251 fccuaguugga 28 gGfuaaggsasa 29 UAGUUGGU 30 asusccu(Ghd)AfuAfAfA 16 usCfsgugGfgAfAfguuuAf 16 AGAUCCUGAUAAACU 16 AD-397252 fcuucccacga 31 uCfaggauscsu 32 UCCCACGA 33 cscsuga(Uhd)AfaAfCfU 16 usGfsucgUfgGfGfaaguUf 16 AUCCUGAUAAACUUC 16 AD-397253 fucccacgaca 34 uAfucaggsasu 35 CCACGACA 36 csgsgau(Ghd)GfaUfGfU 16 usGfsucuCfaCfAfaacaUf 16 AGCGGAUGGAUGUUU 16 AD-397254 fuugugagaca 37 cCfauccgscsu 38 GUGAGACC 39 gsascac(Ghd)GfaAfGfA 16 usAfsugcAfgUfAfcucuUf 16 UUGACACGGAAGAGU 16 AD-397255 fguacugcaua 40 cCfgugucsasa 41 ACUGCAUG 42 gscsagc(Ahd)GfaAfCfG 16 usUfscucAfuAfUfccguUf 16 AUGCAGCAGAACGGA 16 AD-397256 fgauaugagaa 43 cUfgcugcsasu 44 UAUGAGAA 45 gscsaga(Ahd)CfgGfAfU 16 usGfsauuCfuCfAfuaucCf 16 CAGCAGAACGGAUAU 16 AD-397257 faugagaauca 46 gUfucugcsusg 47 GAGAAUCC 48 csasgaa(Chd)GfgAfUfA 16 usGfsgauUfcUfCfauauCf 16 AGCAGAACGGAUAUG 16 AD-397258 fugagaaucca 49 cGfuucugscsu 50 AGAAUCCA 51 ascscgu(Chd)GfcCfAfA 16 usCfsaugUfcUfCfuuugGf 16 ACACCGUCGCCAAAG 16 AD-397259 fagagacauga 52 cGfacggusgsu 53 AGACAUGC 54 AD-397260 gsusucu(Ghd)UfgGfUfA 16 usUfsguuGfaGfUfuuacCf 16 AUGUUCUGUGGUAAA 16
SE SE SE Nome do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duplex (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID
NO NO NO faacucaacaa 55 aCfagaacsasu 56 CUCAACAU 57 gsgsuac(Uhd)UfuGfAfU 16 usUfsucaGfuGfAfcaucAf 16 CUGGUACUUUGAUGU 16 AD-397261 fgucacugaaa 58 aAfguaccsasg 59 CACUGAAG 60 cscscaa(Ahd)GfuUfUfA 16 usAfsgucUfuGfAfguaaAf 16 AACCCAAAGUUUACU 16 AD-397262 fcucaagacua 61 cUfuugggsusu 62 CAAGACUA 63 cscsaaa(Ghd)UfuUfAfC 16 usUfsaguCfuUfGfaguaAf 16 ACCCAAAGUUUACUC 16 AD-397263 fucaagacuaa 64 aCfuuuggsgsu 65 AAGACUAC 66 csasuca(Uhd)GfuGfUfU 16 usAfsgcaUfgUfUfgaacAf 16 CUCAUCAUGUGUUCA 16 AD-397264 fcaacaugcua 67 cAfugaugsasg 68 ACAUGCUG 69 asascau(Ghd)CfuGfAfA 16 usAfscguAfcUfUfcuucAf 16 UCAACAUGCUGAAGA 16 AD-397265 fgaaguacgua 70 gCfauguusgsa 71 AGUACGUC 72 ususcug(Uhd)GfgUfAfA 16 usAfsuguUfgAfGfuuuaCf 16 UGUUCUGUGGUAAAC 16 AD-397266 facucaacaua 73 cAfcagaascsa 74 UCAACAUG 75 uscsugu(Ghd)GfuAfAfA 16 usCfsaugUfuGfAfguuuAf 16 GUUCUGUGGUAAACU 16 AD-397267 fcucaacauga 76 cCfacagasasc 77 CAACAUGC 78 TABELA 6. SEQUÊNCIAS NÃO MODIFICADAS DE APP, ALVEJAMENTO DE NM_001198823.1 DE CAMUNDONGO
SE SE Nome Posição em Posiçãoem Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q do NM_0011988 NM_0011988 (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID Duplex 23.1 23.1
NO NO AD- CCAUGUUCUGUGGUAAACU 16 UGAGUUUACCACAGAACAUGG 16 253-273 251-273 397183 CA 79 CG 80 AD- CAUGUUCUGUGGUAAACUC 16 UUGAGUUUACCACAGAACAUG 16 254-274 252-274 397175 AA 81 GC 82 AD- AUGUUCUGUGGUAAACUCA 16 UUUGAGUUUACCACAGAACAU 16 255-275 253-275 397177 AA 83 GG 84 AD- UGUUCUGUGGUAAACUCAA 16 UGUUGAGUUUACCACAGAACA 16 256-276 254-276 397176 CA 85 UG 86 AD- GUUCUGUGGUAAACUCAAC 16 UUGUUGAGUUUACCACAGAAC 16 257-277 255-277 397260 AA 87 AU 88 AD- UUCUGUGGUAAACUCAACA 16 UAUGUUGAGUUUACCACAGAA 16 258-278 256-278 397266 UA 89 CA 90 AD- UCUGUGGUAAACUCAACAU 16 UCAUGUUGAGUUUACCACAGA 16 259-279 257-279 397267 GA 91 AC 92 AD- CUGUGGUAAACUCAACAUG 16 UGCAUGUUGAGUUUACCACAG 16 260-280 258-280 397178 CA 93 AA 94 AD- UGUGGUAAACUCAACAUGC 16 UUGCAUGUUGAGUUUACCACA 16 261-281 259-281 397180 AA 95 GA 96 AD- GUGGUAAACUCAACAUGCA 16 262-282 UGUGCAUGUUGAGUUUACCAC 16 260-282
SE SE Nome Posição em Posiçãoem Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q do NM_0011988 NM_0011988 (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID Duplex 23.1 23.1
NO NO 397184 CA 97 AG 98 AD- GGUAAACUCAACAUGCACA 16 UAUGUGCAUGUUGAGUUUACC 17 264-284 262-284 397179 UA 99 AC 00 AD- GUACUGCCAAGAGGUCUAC 17 UGGUAGACCUCUUGGCAGUAC 17 362-382 360-382 397224 CA 01 UG 02 AD- UACUGCCAAGAGGUCUACC 17 UGGGUAGACCUCUUGGCAGUA 17 363-383 361-383 397216 CA 03 CU 04 AD- ACUGCCAAGAGGUCUACCC 17 UAGGGUAGACCUCUUGGCAGU 17 364-384 362-384 397225 UA 05 AC 06 AD- CUGAACUGCAGAUCACAAA 17 UGUUUGUGAUCUGCAGUUCAG 17 382-402 380-402 397203 CA 07 GG 08 AD- GAACUGCAGAUCACAAACG 17 UACGUUUGUGAUCUGCAGUUC 17 384-404 382-404 397185 UA 09 AG 10 AD- CACCCACAUCGUGAUUCCU 17 UAAGGAAUCACGAUGUGGGUG 17 473-493 471-493 397195 UA 11 UG 12 AD- CCACAUCGUGAUUCCUUAC 17 UGGUAAGGAAUCACGAUGUGG 17 476-496 474-496 397204 CA 13 GU 14 AD- CACAUCGUGAUUCCUUACC 17 UCGGUAAGGAAUCACGAUGUG 17 477-497 475-497 397191 GA 15 GG 16 AD- CCUUACCGUUGCCUAGUUG 17 UCCAACUAGGCAACGGUAAGG 17 489-509 487-509 397251 GA 17 AA 18 AD- CUUACCGUUGCCUAGUUGG 17 UACCAACUAGGCAACGGUAAG 17 490-510 488-510 397240 UA 19 GA 20 AD- GUGCCCGACAAGUGCAAGU 17 UAACUUGCACUUGUCGGGCAC 17 534-554 532-554 397205 UA 21 GA 22 AD- CGGAUGGAUGUUUGUGAGA 17 UGUCUCACAAACAUCCAUCCG 17 567-587 565-587 397254 CA 23 CU 24 AD- ACCGUCGCCAAAGAGACAU 17 UCAUGUCUCUUUGGCGACGGU 17 603-623 601-623 397259 GA 25 GU 26 AD- GCAGCGAGAAGAGCACUAA 17 UGUUAGUGCUCUUCUCGCUGC 17 622-642 620-642 397247 CA 27 AU 28 AD- CAGCGAGAAGAGCACUAAC 17 UAGUUAGUGCUCUUCUCGCUG 17 623-643 621-643 397233 UA 29 CA 30 AD- GAAGAGCACUAACUUGCAC 17 UCGUGCAAGUUAGUGCUCUUC 17 629-649 627-649 397181 GA 31 UC 32 AD- AAGAGCACUAACUUGCACG 17 UUCGUGCAAGUUAGUGCUCUU 17 630-650 628-650 397186 AA 33 CU 34 AD- AGAGCACUAACUUGCACGA 17 UGUCGUGCAAGUUAGUGCUCU 17 631-651 629-651 397196 CA 35 UC 36 AD- AGCACUAACUUGCACGACU 17 UUAGUCGUGCAAGUUAGUGCU 17 633-653 631-653 397187 AA 37 CU 38 AD- GCACUAACUUGCACGACUA 17 UAUAGUCGUGCAAGUUAGUGC 17 634-654 632-654 397188 UA 39 UC 40
SE SE Nome Posição em Posiçãoem Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q do NM_0011988 NM_0011988 (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID Duplex 23.1 23.1
NO NO AD- CACUAACUUGCACGACUAU 17 UCAUAGUCGUGCAAGUUAGUG 17 635-655 633-655 397197 GA 41 CU 42 AD- ACUAACUUGCACGACUAUG 17 UCCAUAGUCGUGCAAGUUAGU 17 636-656 634-656 397226 GA 43 GC 44 AD- UUGCACGACUAUGGCAUGC 17 UAGCAUGCCAUAGUCGUGCAA 17 642-662 640-662 397212 UA 45 GU 46 AD- CCGCUGGUACUUUGAUGUC 17 UUGACAUCAAAGUACCAGCGG 17 1064-1084 1062-1084 397182 AA 47 GA 48 AD- GGUACUUUGAUGUCACUGA 17 UUUCAGUGACAUCAAAGUACC 17 1069-1089 1067-1089 397261 AA 49 AG 50 AD- GUGUGUCCCAUUCUUUUAC 17 UCGUAAAAGAAUGGGACACAC 17 1094-1114 1092-1114 397241 GA 51 UU 52 AD- UGUGUCCCAUUCUUUUACG 17 UCCGUAAAAGAAUGGGACACA 17 1095-1115 1093-1115 397245 GA 53 CU 54 AD- GUGUCCCAUUCUUUUACGG 17 UGCCGUAAAAGAAUGGGACAC 17 1096-1116 1094-1116 397242 CA 55 AC 56 AD- UGUCCCAUUCUUUUACGGC 17 UCGCCGUAAAAGAAUGGGACA 17 1097-1117 1095-1117 397236 GA 57 CA 58 AD- GUCCCAUUCUUUUACGGCG 17 UCCGCCGUAAAAGAAUGGGAC 17 1098-1118 1096-1118 397227 GA 59 AC 60 AD- GACACGGAAGAGUACUGCA 17 UAUGCAGUACUCUUCCGUGUC 17 1143-1163 1141-1163 397255 UA 61 AA 62 AD- AGCGUGUCAACCCAAAGUU 17 UAAACUUUGGGUUGACACGCU 17 1176-1196 1174-1196 397234 UA 63 GC 64 AD- GUGUCAACCCAAAGUUUAC 17 UAGUAAACUUUGGGUUGACAC 17 1179-1199 1177-1199 397237 UA 65 GC 66 AD- UGUCAACCCAAAGUUUACU 17 UGAGUAAACUUUGGGUUGACA 17 1180-1200 1178-1200 397235 CA 67 CG 68 AD- CCCAAAGUUUACUCAAGAC 17 UAGUCUUGAGUAAACUUUGGG 17 1186-1206 1184-1206 397262 UA 69 UU 70 AD- CCAAAGUUUACUCAAGACU 17 UUAGUCUUGAGUAAACUUUGG 17 1187-1207 1185-1207 397263 AA 71 GU 72 AD- AAAGUUUACUCAAGACUAC 17 UGGUAGUCUUGAGUAAACUUU 17 1189-1209 1187-1209 397189 CA 73 GG 74 AD- CUCAAGACUACCAGUGAAC 17 UGGUUCACUGGUAGUCUUGAG 17 1197-1217 1195-1217 397198 CA 75 UA 76 AD- GACUACCAGUGAACCUCUU 17 UGAAGAGGUUCACUGGUAGUC 17 1202-1222 1200-1222 397206 CA 77 UU 78 AD- AAGAUCCUGAUAAACUUCC 17 UGGGAAGUUUAUCAGGAUCUU 17 1225-1245 1223-1245 397238 CA 79 GG 80 AD- AGAUCCUGAUAAACUUCCC 17 UUGGGAAGUUUAUCAGGAUCU 17 1226-1246 1224-1246 397239 AA 81 UG 82 AD- AUCCUGAUAAACUUCCCAC 17 1228-1248 UCGUGGGAAGUUUAUCAGGAU 17 1226-1248
SE SE Nome Posição em Posiçãoem Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q do NM_0011988 NM_0011988 (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID Duplex 23.1 23.1
NO NO 397252 GA 83 CU 84 AD- UCCUGAUAAACUUCCCACG 17 UUCGUGGGAAGUUUAUCAGGA 17 1229-1249 1227-1249 397249 AA 85 UC 86 AD- CCUGAUAAACUUCCCACGA 17 UGUCGUGGGAAGUUUAUCAGG 17 1230-1250 1228-1250 397253 CA 87 AU 88 AD- CACCGAGAGAGAAUGUCCC 17 UUGGGACAUUCUCUCUCGGUG 17 1353-1373 1351-1373 397217 AA 89 CU 90 AD- UCCCAGGUCAUGAGAGAAU 17 UCAUUCUCUCAUGACCUGGGA 17 1368-1388 1366-1388 397213 GA 91 CA 92 AD- AAGCUGACAAGAAGGCCGU 17 UAACGGCCUUCUUGUCAGCUU 17 1423-1443 1421-1443 397228 UA 93 UG 94 AD- UGACAAGAAGGCCGUUAUC 17 UGGAUAACGGCCUUCUUGUCA 17 1427-1447 1425-1447 397229 CA 95 GC 96 AD- GGCCCUCGAGAAUUACAUC 17 UUGAUGUAAUUCUCGAGGGCC 17 1562-1582 1560-1582 397208 AA 97 AG 98 AD- CAAGGCCUCAUCAUGUGUU 17 UGAACACAUGAUGAGGCCUUG 18 1603-1623 1601-1623 397218 CA 99 GG 00 AD- CAUCAUGUGUUCAACAUGC 18 UAGCAUGUUGAACACAUGAUG 18 1611-1631 1609-1631 397264 UA 01 AG 02 AD- AACAUGCUGAAGAAGUACG 18 UACGUACUUCUUCAGCAUGUU 18 1623-1643 1621-1643 397265 UA 03 GA 04 AD- CAUGCUGAAGAAGUACGUC 18 UGGACGUACUUCUUCAGCAUG 18 1625-1645 1623-1645 397209 CA 05 UU 06 AD- AUGCUGAAGAAGUACGUCC 18 UCGGACGUACUUCUUCAGCAU 18 1626-1646 1624-1646 397192 GA 07 GU 08 AD- UGCUGAAGAAGUACGUCCG 18 UACGGACGUACUUCUUCAGCA 18 1627-1647 1625-1647 397210 UA 09 UG 10 AD- GCUGAAGAAGUACGUCCGU 18 UCACGGACGUACUUCUUCAGC 18 1628-1648 1626-1648 397219 GA 11 AU 12 AD- CUGAAGAAGUACGUCCGUG 18 UGCACGGACGUACUUCUUCAG 18 1629-1649 1627-1649 397214 CA 13 CA 14 AD- AGCACACCCUAAAGCAUUU 18 UAAAAUGCUUUAGGGUGUGCU 18 1666-1686 1664-1686 397199 UA 15 GU 16 AD- AAGCAUUUUGAACAUGUGC 18 UCGCACAUGUUCAAAAUGCUU 18 1677-1697 1675-1697 397220 GA 17 UA 18 AD- AGCAUUUUGAACAUGUGCG 18 UGCGCACAUGUUCAAAAUGCU 18 1678-1698 1676-1698 397230 CA 19 UU 20 AD- CACCUCCGUGUGAUCUACG 18 UUCGUAGAUCACACGGAGGUG 18 1746-1766 1744-1766 397221 AA 21 UG 22 AD- CGUGUGAUCUACGAGCGCA 18 UAUGCGCUCGUAGAUCACACG 18 1752-1772 1750-1772 397215 UA 23 GA 24 AD- UGUGAUCUACGAGCGCAUG 18 UUCAUGCGCUCGUAGAUCACA 18 1754-1774 1752-1774 397231 AA 25 CG 26
SE SE Nome Posição em Posiçãoem Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q do NM_0011988 NM_0011988 (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID Duplex 23.1 23.1
NO NO AD- GAGCGCAUGAACCAGUCUC 18 UAGAGACUGGUUCAUGCGCUC 18 1764-1784 1762-1784 397193 UA 27 GU 28 AD- CGCAUGAACCAGUCUCUGU 18 UGACAGAGACUGGUUCAUGCG 18 1767-1787 1765-1787 397190 CA 29 CU 30 AD- GAAGGAGCAGAACUACUCC 18 UCGGAGUAGUUCUGCUCCUUC 18 1850-1870 1848-1870 397222 GA 31 UG 32 AD- AAGGAGCAGAACUACUCCG 18 UUCGGAGUAGUUCUGCUCCUU 18 1851-1871 1849-1871 397200 AA 33 CU 34 AD- GGAGCAGAACUACUCCGAC 18 UCGUCGGAGUAGUUCUGCUCC 18 1853-1873 1851-1873 397201 GA 35 UU 36 AD- GAGCAGAACUACUCCGACG 18 UUCGUCGGAGUAGUUCUGCUC 18 1854-1874 1852-1874 397194 AA 37 CU 38 AD- CAGAAUUCGGACAUGAUUC 18 UUGAAUCAUGUCCGAAUUCUG 18 2167-2187 2165-2187 397248 AA 39 CA 40 AD- GUCCGCCAUCAAAAACUGG 18 UACCAGUUUUUGAUGGCGGAC 18 2196-2216 2194-2216 397207 UA 41 UU 42 AD- UCCGCCAUCAAAAACUGGU 18 UCACCAGUUUUUGAUGGCGGA 18 2197-2217 2195-2217 397211 GA 43 CU 44 AD- CAUAGCAACCGUGAUUGUC 18 UUGACAAUCACGGUUGCUAUG 18 2282-2302 2280-2302 397243 AA 45 AC 46 AD- GCAACCGUGAUUGUCAUCA 18 UGUGAUGACAAUCACGGUUGC 18 2286-2306 2284-2306 397246 CA 47 UA 48 AD- GAAGAAACAGUACACAUCC 18 UUGGAUGUGUACUGUUUCUUC 18 2321-2341 2319-2341 397223 AA 49 UU 50 AD- GAAACAGUACACAUCCAUC 18 UGGAUGGAUGUGUACUGUUUC 18 2324-2344 2322-2344 397202 CA 51 UU 52 AD- GCAGCAGAACGGAUAUGAG 18 UUCUCAUAUCCGUUCUGCUGC 18 2405-2425 2403-2425 397256 AA 53 AU 54 AD- GCAGAACGGAUAUGAGAAU 18 UGAUUCUCAUAUCCGUUCUGC 18 2408-2428 2406-2428 397257 CA 55 UG 56 AD- CAGAACGGAUAUGAGAAUC 18 UGGAUUCUCAUAUCCGUUCUG 18 2409-2429 2407-2429 397258 CA 57 CU 58 AD- AGAACGGAUAUGAGAAUCC 18 UUGGAUUCUCAUAUCCGUUCU 18 2410-2430 2408-2430 397250 AA 59 GC 60 AD- GAACGGAUAUGAGAAUCCA 18 UUUGGAUUCUCAUAUCCGUUC 18 2411-2431 2409-2431 397244 AA 61 UG 62 TABELA 7. TRIAGEM DE DOSE ÚNICA DE APP NA LINHA CELULAR DE NEURO2A E HEPATÓCITOS DE CAMUNDONGO PRIMÁRIOS
[871] Os dados são expressos como porcentagem de mensagem restante em relação ao controle de não segmentação de
AD-1955. Hepatócitos de Camundongo Primários Linha celular de Neuro2A Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-397183 4,2 1,4 37,3 24,3 7,94 2,86 52,66 5,87 AD-397175 1,6 0,7 4,7 1,3 0,75 0,32 29,72 6,47 AD-397177 1,3 1,1 3,9 2,6 0,4 0,13 18,06 3,73 AD-397176 1,5 0,5 35,1 11,3 4,7 1,45 69,36 7,89 AD-397260 11,2 1,5 73,4 23,1 20,53 3,62 81,33 2,21 AD-397266 2,8 2 65,1 4,5 4,35 0,58 73,16 8,45 AD-397267 0,8 0,3 23,6 4,2 1,18 0,28 37,78 3,45 AD-397178 5,1 4,1 33,3 6,1 1,8 0,38 54,61 3,11 AD-397180 1,3 0,4 28 13,9 0,47 0,06 37,8 3,96 AD-397184 15,7 8,9 67,8 13,5 8,86 2,55 87,82 5,6 AD-397179 5,7 1,6 45,1 26 3,12 0,86 57,24 5,19 AD-397224 52,9 18,5 63,8 10,6 17,15 2,47 67,99 7,6 AD-397216 25,6 17,9 104,2 21,6 34,91 7,44 98,89 4,08 AD-397225 45,1 21,9 60,8 13,7 9,72 5,52 63,44 7,19 AD-397203 3,3 1,6 71,9 8,2 5,1 0,98 75,87 3,29 AD-397185 4,9 2,1 40,3 8,1 2,7 0,35 61,49 8,12 AD-397195 2,5 1,3 49,8 21,8 1,64 0,08 63,95 5,83 AD-397204 8,3 2 68 10,7 4,37 0,89 50,83 7,41 AD-397191 1,5 0,5 39,9 14,8 1,5 1,06 55,07 10,78 AD-397251 7,8 1,7 91,7 5,7 3,86 2,5 84,36 6,5 AD-397240 4,2 1,9 61,9 6,8 2,48 0,7 62,39 1,48 AD-397205 13,5 10,5 86 11,4 13,06 7,61 76,77 2,64 AD-397254 1,9 1,1 27,6 24,3 3,77 2,77 57,26 14,42 AD-397259 3,5 0,7 79 22,8 9,43 1,12 82,49 3,19 AD-397247 5,5 1 90,4 16,9 10,95 2,85 94,95 4,55 AD-397233 6,7 6,2 84,4 10,3 3,4 1,14 76,36 4,66 AD-397181 4,7 0,9 60,5 25,2 6,28 2,17 62,62 3,59 AD-397186 53 17 82 14,7 42,07 9,63 95,63 6,67 AD-397196 1,9 0,4 40,9 11,3 4,66 4,19 56,2 1,82 AD-397187 28,4 11,2 77,5 13,3 25,64 8,56 86,64 5,99 AD-397188 65,1 15,9 76,2 20 43,32 13,51 84,69 5,63 AD-397197 2 1 41,9 10,7 2,11 0,41 55,63 2,15 AD-397226 10,3 4,3 30 5 0,69 0,43 47,42 5,33 AD-397212 1,8 0,1 65,4 9,3 1,94 0,48 63 29,9
Hepatócitos de Camundongo Primários Linha celular de Neuro2A Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-397182 2,1 0,6 11,3 5,3 12,2 3,42 35,13 6,78 AD-397261 2,3 0,6 32,6 10 29,93 2,71 48,28 24,73 AD-397241 23 3,5 102,7 13,3 41,16 4,58 92,7 5,11 AD-397245 60,9 8,6 60,9 14,3 55,71 4,45 68,27 6,83 AD-397242 5,6 1,1 90,5 16,2 30,83 2,94 85,43 4,05 AD-397236 16,9 6,2 71,9 5,7 32,58 2,93 67,13 3,06 AD-397227 48,7 29,8 50,5 19,4 19,55 9,28 59,59 3,24 AD-397255 6,1 0,8 73,8 33 24,01 5 86,3 9,24 AD-397234 100,3 39,9 93,7 7,8 51,88 13,54 80,77 2,1 AD-397237 36,2 28,6 49,5 14 32,83 17,93 51,76 10,71 AD-397235 58 20,9 76,2 8 41,15 19,69 73,72 6 AD-397262 22,1 6,9 51,8 16,2 61,74 5,34 65,6 14,12 AD-397263 19,9 8 57,9 6,1 59,09 7,38 82,09 11,31 AD-397189 17 5,1 56,2 9,5 49,48 18,93 73,89 5,4 AD-397198 19,8 2,4 38,8 9,1 50,52 28,37 62,16 9,56 AD-397206 18,8 1,7 41 12,6 62,65 21,77 61,59 8,42 AD-397238 16,3 2 61,5 27,8 71,66 9,3 86,52 7,97 AD-397239 34,6 11,4 101 22,8 74,11 7,37 91,24 4,34 AD-397252 23,1 7,5 93,8 3,1 55,54 4,89 75,74 5,31 AD-397249 35,6 4 104,9 10,9 70,19 3,96 97,86 6,43 AD-397253 29,6 5,5 44,6 19,2 66,41 8,65 66,4 6,46 AD-397217 11,5 6,3 102,4 20,9 18,85 3,87 98,69 3,04 AD-397213 7,3 1,9 79,4 21,9 10,91 2,81 87,03 4,86 AD-397228 68,7 66,7 43,2 9,3 23,79 8,45 53,36 3,55 AD-397229 3,9 0,3 15,8 9,4 1,67 1,35 31,6 5,21 AD-397208 18,2 3,9 96,2 27,2 37,55 9,28 97,91 5,09 AD-397218 35 14,6 106 20,7 30,88 7,34 101,82 3,13 AD-397264 4,2 2,2 98 12,9 19,97 2,06 104,79 4,61 AD-397265 3 2,3 81,2 7,8 5,98 4,03 84,1 8,97 AD-397209 10,9 9,3 90,5 22,2 17,18 3,16 81,66 5,17 AD-397192 4,7 1,8 80,6 13 6,51 1,99 95,04 4,22 AD-397210 22,6 6,4 83,6 24,7 6,55 1,38 82,6 3,83 AD-397219 10,2 3,6 101,8 21,8 16,76 3,62 87,34 4,87 AD-397214 5,8 0,9 34,4 14,3 12,78 5,24 54,95 18,66 AD-397199 62,2 14,3 63,4 35 87,69 22,23 85,84 4,93
Hepatócitos de Camundongo Primários Linha celular de Neuro2A Nome do 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM 10nM 10nM 0,1nM 0,1nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD AD-397220 5,2 0,5 99,2 18,2 5,91 1,12 91,13 2,97 AD-397230 6,3 3,9 61,5 23,1 5,51 3,99 77,38 3,26 AD-397221 10,5 3,4 111,2 42,5 24,53 4,87 93,86 3,22 AD-397215 14,3 2,9 80,7 40 44,04 14,01 91,83 10,03 AD-397231 17,1 3,2 108,7 19,6 21,54 1,56 79,31 4,22 AD-397193 3,3 0,3 93,1 21,6 12,76 1,97 93,03 6,46 AD-397190 2,7 0,5 27,8 13,5 3,63 2,79 45,56 7,21 AD-397222 62,9 9,1 57,2 17 25,04 11,48 80,41 4,04 AD-397200 8,6 8,2 89,6 18,6 9,63 1,79 88,31 6,27 AD-397201 85,2 40,7 106 17,5 41,76 9,95 105,41 3,36 AD-397194 35,4 12,2 92 8,3 51,26 11,38 107,07 3,23 AD-397248 7,8 1,1 97,5 17,7 17,64 1,67 103,37 4,94 AD-397207 6,9 4 59,5 39,1 6,28 2,65 82,18 8,76 AD-397211 18,2 8,6 101,1 20,6 14,71 4,06 96,99 2,56 AD-397243 2,2 1,5 63,1 11,2 0,6 0,32 55,57 2,17 AD-397246 1,5 0,6 46,6 22,5 0,86 0,64 63,09 3,39 AD-397223 46,8 15,8 63,3 17,2 9,73 2,48 73,44 2,51 AD-397202 32,5 7,6 103,4 25,9 20,68 4,37 95,57 5,11 AD-397256 2,1 0,7 71,4 8 1,77 1,21 79,93 1,89 AD-397257 2,4 0,7 76,1 23,3 5,45 2,7 84,43 7,45 AD-397258 0,9 0,2 45,4 8,3 0,63 0,4 55,81 5,17 AD-397250 0,8 0,1 54,9 11,3 0,52 0,23 46,87 3,19 AD-397244 2,2 1,2 74,2 12 1,87 1,87 67,15 3,5
[872] Conforme observado para a Tabela 4 acima, é expressamente contemplado que quaisquer agentes de RNAi possuindo sequência-alvos que residam totalmente nas seguintes janelas de NM_001198823.1 posições são susceptíveis de exibir um efeito inibidor de APP robusto: APP NM_001198823.1 posições 251 a 284; APP NM_001198823.1 posições 362 a 404; APP NM_001198823.1 posições 471 a 510; APP NM_001198823.1 posições 532 a 587; APP NM_001198823.1 posições 601 a 649; APP NM_001198823.1 posições 633 a 662; APP NM_001198823.1 posições
1351 a 1388; APP NM_001198823.1 posições 1609 a 1649; APP NM_001198823.1 posições 1675 a 1698; APP NM_001198823.1 posições 1752 a 1787; APP NM_001198823.1 posições 2165 a 2217; APP NM_001198823.1 posições 2280 a 2344; e APP NM_001198823.1 posições 2403 a 2431. EXEMPLO 2. AVALIAÇÃO IN VIVO DE AGENTES DE RNAI
[873] Os agentes de RNAi que têm como alvo APP selecionados foram avaliados quanto à eficácia in vivo nas respectivas provas de conceito e telas de identificação de chumbo para knockdown de APP humana em camundongos AAV. Os agentes de RNAi selecionados para tais estudos incluíram AD- 392911, AD-392912, AD-392911, AD-392912, AD-392913, AD-392843, AD-392844, AD-392824, AD-392704, AD-392790, AD -392703, AD- 392866, AD-392927, AD-392916, AD-392714 e AD-392926, tendo sequências conforme recitado na Tabela 2A acima, sequências não modificadas correspondentes conforme mostrado na Tabela 3 acima, e conforme representado graficamente na Figura 1A e Figura 1B, com cada agente de RNAi testado no presente Exemplo apresentando ainda um grupamento triantenário de GalNAc ligado ao resíduo 3' do filamento sensor, com a finalidade de auxiliar o alvejamento de tais agentes de RNAi ao fígado quando administrados por via subcutânea a camundongos (para administração intratecal, agentes sem um grupamento GalNAc conjugado são expressamente contemplados).
[874] ] Em tais estudos, um vetor AAV abrigando Homo sapiens APP foi injetado por via intravenosa em camundongos fêmeas C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade, e em 14 dias após a administração de AAV, um agente de RNAi selecionado ou um agente de controle foram injetados por via subcutânea a 3 mg/kg para camundongos (n = 3 por grupo), com camundongos sacrificados e fígados avaliados quanto aos níveis de mRNA de APP 14 dias após a injeção subcutânea de agente de RNAi ou controle.
Níveis significativos de knockdown de APP humana in vivo no fígado foram observados para todos os agentes de RNAi testados, em comparação com controles PBS e Naïve (somente AAV), com níveis particularmente robustos de knockdown observados, por exemplo, para AD-392911, AD-392912, AD-392911, AD-392912, AD-392913, AD-392843, AD-392844, AD-392824, AD- 392866, AD-392927, AD-392916, AD-392714 e AD-392926 (Figura 2A e Figura 2B). Os resultados usados para gerar a Figura 2A e Figura 2B estão tabulados na Tabela 8 abaixo.
TABELA 8. RESULTADOS DA TRIAGEM DE KNOCKDOWN IN VIVO DE HSAPP (3 MG/KG, DIA 14, FÍGADO) % de mensagem Tratamento Desvio padrão restante PBS 100,00 15,77 naïve (AAV-somente) 104,17 1,89 AD-392911 53,75 8,76 AD-392912 46,47 14,18 AD-392913 42,34 7,95 AD-392843 27,25 0,46 AD-392844 44,25 9,04 AD-392824 42,64 0,87 AD-392704 72,99 8,76 AD-392790 72,71 11,66 AD-392703 69,60 4,70 AD-392866 35,94 23,08 AD-392927 38,91 10,60 AD-392916 43,27 7,17 AD-392714 58,08 9,55 AD-392926 50,26 10,29
EXAMPLE 3: IDENTIFICAÇÃO DE SIRNAS DE APP HUMANA
POTENTES CONTRA ANGIOPATIA AMILOIDE CEREBRAL HEREDITÁRIA (HCAA)
[875] A angiopatia amiloide cerebral hereditária (hCAA) é impulsionada por mutações autossômicas dominantes no gene que codifica a proteína precursora de amiloide (APP) (Van Etten et al. 2016 Neurology). Na doença, a beta amiloide derivada de neurônios é depositada na vasculatura, causando alterações estruturais significativas e uma distinta dupla tubulação dos vasos. hCAA parece ser uma angiopatia relativamente pura com presença mínima de placas parenquimatosas ou emaranhados de tau (Natte et al. 2012 Annals of Neurology). Em última análise, o aumento da deposição de beta amiloide leva a micro-hemorragias, demência e acidente vascular cerebral. hCAA é uma doença de progressão rápida com expectativa de vida de 7 a 10 anos após o início dos sintomas (Charidimou A et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2012; 83: 124 a 137). Conforme observado neste documento, não há atualmente terapias modificadoras da doença disponíveis. Na presente revelação, a combinação de projetos de siRNA estáveis com estratégias alternativas de conjugação proporcionou silenciamento potente e de longa duração em todo o SNC após uma única administração intratecal com 95% de knockdown-alvo observado em três meses. TRIAGEM DE CÉLULAS BE(2)C E TRIAGENS COM BASE NO
FÍGADO IN VIVO
[876] [00876] Para identificar siRNAs de hAPP potentes, os siRNAs foram primeiro rastreados in vitro em células Be(2)C. Conforme mostrado na Figura 3A e Figura 3B,
mais de 300 siRNAs foram transfectados em células Be (2) C em concentrações de 10 nM (Figura 3B) e 0,1 nM (dados não mostrados) e o percentual de mRNA restante foi analisado por qPCR. A triagem AAV-hAPP baseada no fígado in vivo foi então realizada em camundongos a fim de identificar compostos capazes de derrubar a APP humana. Os siRNAs de APP GalNAc concebidos contra hAPP ORF ou hAPP 3’ UTR foram administrados por via subcutânea a 3 mg/kg (como mostrado nas Figuras 2A e 2B, respectivamente). Um subconjunto selecionado de compostos foi então convertido em conjugados do SNC e usado em estudos de descoberta de primatas não humanos e em modelos de roedores de doença usando administração intratecal (IT). Como observado acima, níveis particularmente robustos de knockdown foram observados para, por exemplo, AD-392911, AD-392912, AD-392911, AD-392912, AD-392913, AD-392843, AD-392844, AD-392824, AD- 392866, AD-392927, AD-392916, AD-392714 e AD-392926 (Figura 2A e Figura 2B).
[877] O siRNA de APP transfectado a 10 nM, 1 nM, e 0,1 nM em células neuronais Be (2) C foi avaliado para knockdown de mRNA de APP, bem como níveis de AAP α/β solúvel, em 24 e 48 horas após a transfecção (ver por exemplo, Figura 4A, Figura 4B e Figura 4C). Um knockdown dependente da concentração de mRNA de APP foi observado para ambos os exemplos de siRNAs de interesse (por exemplo, siRNA 1 e siRNA 2 mostrado nas Figuras 4A a 4C). Além disso, uma redução da APP celular correspondeu a um knockdown de até 99% de AAP α/β solúvel na célula neuronal Be(2)C em 48 horas. EXEMPLO 4: DOSAGEM INTRATECAL (IT) DE SIRNA DE APP
ENTREGUE ATRAVÉS DA MEDULA ESPINHAL E CÉREBRO DE PRIMATAS NÃO HUMANOS. ESTUDOS DE PRIMATAS NÃO HUMANOS FORMULAÇÃO E PREPARAÇÃO DE DOSE OLIGONUCLEOTÍDEOS DE TESTE E INFORMAÇÕES DE VEÍCULO
[878] Oligonucleotídeos de teste: AD-454972
[879] AD-454973
[880] AD-454842
[881] AD-454843
[882] AD-454844
[883] O estado atual do conhecimento científico e as diretrizes aplicáveis citadas anteriormente neste protocolo não fornecem alternativas aceitáveis, in vitro ou de outro modo, ao uso de animais vivos para cumprir o objetivo deste estudo. O desenvolvimento dos conhecimentos necessários à melhoria da saúde e bem-estar dos humanos e de outros animais requer experimentação in vivo com uma grande variedade de espécies animais. Animais inteiros são essenciais em pesquisas e testes porque eles refletem melhor as interações dinâmicas entre as várias células, tecidos e órgãos que compõem o corpo humano. O beagle é o modelo não roedor usual usado para avaliar a toxicidade de vários artigos de teste e para os quais existe um grande banco de dados histórico. No entanto, o macaco também é um modelo animal usado para avaliar a toxicidade. O macaco foi selecionado especificamente para uso neste estudo porque é a espécie farmacologicamente relevante. O siRNA nos oligonucleotídeos de teste é direcionado contra a sequência- alvo de mRNA da proteína precursora amiloide (APP) em macacos e humanos.
PROJETO DE ESTUDO
Nível de Volume Número Dose Concentração de de Necropsia Necropsia Grupo Tratamento (mg/dose de Dose Dose Animais (Dia 29) (Dia 85) fixa de (mg/ml) (ml) (total) animal) 1 AD-454972 72 2,4 30 5 3 2 2 AD-454973 72 2,4 30 5 3 2 3 AD-454842 72 2,4 30 5 3 2 4 AD-454843 72 2,4 30 5 3 2 5 AD-454844 72 2,4 30 5 3 2 Sem 6* 0 0 0 2 2 0 Tratamento * Usado para coleta de tecidos para fornecer tecido normal, LCR e níveis plasmáticos de APP em primatas cinomolgos. Os animais dos grupos 1 a 5 com canulação intratecal malsucedida podem ter sido trocados pelos animais designados do Grupo 6 se nenhum oligonucleotídeo foi dado. Os animais foram necropsiados no ou antes do dia 29.
[884] A sequência e estrutura dos oligonucleotídeos usados nos estudos de primatas não humanos mencionados acima são descritos em mais detalhes na Tabela 9, abaixo. TABELA 9.
SEQ Filamento SEQ ID Agente Sequência de oligonucleotídeos Sequência de Transcritos ID (Alvo) NO: NO: Sens AD-454972 usasuga(Ahd)GfuUfCfAfucaucaaasasa 1863 UAUGAAGUUCAUCAUCAAAAA 1864 (APP) Antis VPusUfsuuug(Agn)ugaugaAfcUfucauas 1865 UUUUUGAUGAUGAACUUCAUAUC 1866 (APP) usc Sense AD-454973 gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaaccusasa 1867 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 1868 (APP) Antis VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuagccs 1869 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 1870 (APP) gsu Sense AD-454842 ususugu(Ghd)UfaCfUfGfuaaagaaususa 1871 UUUGUGUACUGUAAAGAAUUA 1872 (APP) Antis VPusAfsauuc(Tgn)uuacagUfaCfacaaas 1873 UAAUUCTUUACAGUACACAAAAC 1874 (APP) asc Sense AD-454843 usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauucuscsa 1875 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 1876 (APP) Antis VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcacuas 1877 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 1878 (APP) gsu AD-454844 Sense asasaau(Chd)CfaAfCfCfuacaaguuscsa 1879 AAAAUCCAACCUACAAGUUCA 1880
SEQ Filamento SEQ ID Agente Sequência de oligonucleotídeos Sequência de Transcritos ID (Alvo) NO: NO: (APP) Antis VPusGfsaacu(Tgn)guagguUfgGfauuuus 1881 UGAACUTGUAGGUUGGAUUUUCG 1882 (APP) csg
[885] Tabela 9 chave: U=uridina-3`-fosfato, u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`- fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato, VP=fosfato de Vinila 5', (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) Isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato.
[886] Os seguintes são exemplos não limitativos de knockdown do biomarcador de CSF e injeção de mRNA de tecido por meio de intratecal (IT) de 72 mg de droga nos tecidos do SNC de macacos cinomolgus. Uma única injeção IT, por meio de agulha percutânea, de 72 mg de um siRNA de APP de interesse foi administrada em macacos cinomolgus entre L2/L3 ou L4/L5 na cisterna lombar (ver Métodos e Materiais abaixo). Conforme mostrado na Figura 5A, 5 compostos foram avaliados, e 5 animais foram utilizados para cada experimento. Os tecidos coletados foram medula espinhal (lombar, torácica e cervical) e cérebro (córtex pré-frontal, córtex temporal, cerebelo, tronco encefálico, hipocampo e estriado). Além disso, os fluidos coletados incluíram tanto o líquido cefalorraquidiano (LCR) quanto o plasma. Os níveis de fármaco e o knockdown de mRNA foram avaliados no dia 29 após a dose. Conforme mostrado na Figura 5B, APP α/β, bem como beta amiloide 38, 40, e 42, serviram como biomarcadores de engajamento de alvo circulante no LCR e foram avaliados nos dias 8, 15, e 29 pós-dose. A queda no tecido correspondeu ao silenciamento dos biomarcadores de engajamento do alvo no LCR logo 7 dias após a dose. Conforme mostrado na Figura 5C, a dosagem de IT resultou na entrega de siRNA suficiente por toda a coluna e cérebro para resultar em knockdown do mRNA de APP no nível do tecido. Os níveis de droga testados foram avaliados por espectrometria de massa e são mostrados na Figura 5D. Em resumo, as Figuras 5A a 5D mostram a correlação entre os níveis de biomarcadores de CSF, o knockdown de mRNA e a liberação de fármaco no CNS do siRNA de APP AD-454972. Assim, foi revelado que os níveis do biomarcador no LCR e o knockdown do mRNA do tecido exibiram uma diminuição rápida, robusta e sustentada em resposta aos níveis do fármaco conjugado siRNA no SNC. A Figura 6 demonstra que há um efeito farmacodinâmico sustentado observado no LCR para biomarcadores de engajamento-alvo 2 a 3 meses após a dose de AD-454972.
[887] A Figura 7A mostra os resultados de AD- 454842 em sAPP CS/β no CSF, enquanto a Figura 7B mostra os níveis de fármaco de AD-454842 em tecidos avaliados por espectrometria de massa. Em resumo, as Figuras 7A-7B mostram que os níveis de biomarcadores de CSF se correlacionam com os níveis de fármacos no SNC para AD-454842, e resultam em uma redução significativa de sAPP em animais com níveis mais elevados de fármacos em tecidos.
[888] A Figura 8A mostra os resultados de AD-
454843 em espécies sAPP α/β e beta amiloide, respectivamente, em CSF. Conforme mostrado na Figura 8B, a dosagem IT resultou na entrega de siRNA suficiente por toda a coluna, hipocampo e regiões do córtex para resultar em knockdown do mRNA de APP no nível do tecido. Os níveis de fármacos testados foram avaliados por espectrometria de massa e são mostrados na Figura 8C. Consequentemente, as Figuras 8A a 8C mostram uma correlação clara entre os níveis de biomarcadores de CSF, o knockdown de mRNA e a entrega de fármaco no SNC de AD-454843.
[889] Como Figuras 9A a 9B demonstra um efeito farmacodinâmico sustentado observado no CSF para biomarcadores de engajamento-alvo 2 a 3 meses após a dose para AD-454843. Foi observado até 80% de knockdown no nível de mRNA no tecido do SNC no dia 85 após a dose em macacos cinomolgus.
[890] As Figuras 10A a 10C mostram a correlação entre os níveis de biomarcadores de CSF, o knockdown de mRNA e a distribuição de fármacos no SNC para AD-454844. Os níveis de fármacos testados foram avaliados por espectrometria de massa e são mostrados na Figura 10C.
[891] As Figuras 11A-11C mostram que a entrega ideal do siRNA principal de APP demonstra uma atividade robusta. Por exemplo, os resultados de níveis elevados do fármaco no knockdown do mRNA e silenciamento dos biomarcadores de engajamento-alvo mostram que níveis elevados de μg/g do fármaco no tecido se correlacionam com um knockdown de 75 a 90% em tecidos do SNC, como córtex e coluna vertebral. Surpreendentemente, a entrega ideal também mostrou knockdown significativo no corpo estriado.
[892] A Figura 12A mostra a média de 5 duplexes; coletivamente, a dosagem IT resultou na entrega de siRNA suficiente de modo que o mRNA de APP foi derrubado em 60 a 75% ao nível do tecido no dia 29. Além disso, como mostrado na Figura 12B, APP α/β, solúvel, bem como beta amiloide 38, 40 e 42, foram reduzidos em 75% no LCR no dia 29.
KNOCKDOWN DE MRNA DE APP EM ESTRIADO DE PRIMATA NÃO HUMANO NO DIA 29 PÓS-DOSE
[893] Uma única injeção intratecal (IT), por meio de agulha percutânea, de 72 mg do siRNA de APP de interesse foi administrada em macacos cinomolgos entre L2/L3 ou L4/L5 na cisterna lombar. Na presente revelação, foi feita a descoberta notável de que a entrega de composto de conjugado de siRNA resultou em knockdown de mRNA de APP dentro do corpo estriado. Os seguintes siRNAs foram observados para knockdown de mRNA de APP em estriado de primata não humano no dia 29 após a dose: AD-454972, AD-454973, AD-454842, AD-454843, e AD-454844 (como mostrado nas Figuras 13A a 13E).
MATERIAIS E MÉTODOS ALFA APP SOLÚVEL/BETA APP SOLÚVEL
[894] Os níveis de CSF de sAPPα e sAPPβ foram determinados utilizando um ensaio de imunoensaio sanduíche MULTI-SPOT sAPPα / sAPPβ de 96 poços MSD® (Catálogo nº K15120E; Meso Scale Discovery, Rockville, MD, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante com algumas modificações. Os padrões, brancos e amostras de LCR de primatas não humanos (diluição 8x) foram preparados com 1% de Blocker-A/TBST (fornecido no kit). A placa pré-revestida (fornecida no kit) foi bloqueada com 150 µl/poço de solução de Bloqueador A/TBST a 3% à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação. Após três lavagens com 1xTBST, 25 µl/poço do padrão preparado, brancos e amostras de LCR foram adicionadas à placa em duas repetições e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente com agitação. Após lavagens de placa subsequentes, 50 µl/poço de anticorpo de detecção preparado em 1% de Blocker A/TBST (diluição 50x) foram adicionados e incubados em temperatura ambiente por 1 hora com agitação. Após a lavagem da placa, 1X de tampão de leitura T foi adicionado à placa e incubado por 10 minutos em temperatura ambiente (sem agitação) antes da imagem e análise no MSD QuickPlex Imager.
[895] Os dados brutos foram analisados usando SoftMax Pro, versão 7.1 (Molecular Devices). Um ajuste de curva logística de 5 parâmetros com função de pesagem 1/Y2 foi usado para modelar as curvas de calibração individuais e calcular a concentração de analitos nas amostras. PAINEL DE BETA AMILOIDE (Aβ40, Aβ38, Aβ42)
[896] Os níveis de CSF de beta-amiloide (Aβ40, Aβ38, Aβ42) foram determinados utilizando um kit multiplex de imunoensaio sanduíche MULTI-SPOT 96 poços AB Peptide Panel 1 V-Plex MSD® (Catálogo nº K15200E, Meso Scale Discovery, Rockville, MD, USA) de acordo com o protocolo do fabricante com algumas modificações. Os padrões, brancos e LCR de primatas não humanos (diluição 8x) foram preparados com Diluente 35 (fornecido no kit). O anticorpo de detecção (fornecido a 50X) foi preparado a uma concentração de trabalho de 1X em Diluente 100 (fornecido no kit) combinado com 30 µl de Bloqueador Aβ40. A placa pré-revestida (fornecida no kit) foi bloqueada com 150 µl/poço com Diluente 35 durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação. Após três lavagens com 1xPBST, 25 µl/poço da solução de anticorpo de detecção preparada foram adicionados à placa. Em seguida, com a adição de 25 µl/poço de padrões preparados, brancos e amostras em duas repetições, a placa foi incubada em temperatura ambiente por 2 horas com agitação. Após as lavagens de placa subsequentes, 150 µl/poço de tampão de leitura T 2X foi adicionado e a placa foi fotografada e analisada no MSD QuickPlex Imager imediatamente.
[897] Os dados brutos foram analisados usando SoftMax Pro, versão 7.1 (Molecular Devices, San Jose, CA, EUA). Um ajuste de curva logística de 4 parâmetros com função de pesagem 1/Y2 foi usado para modelar as curvas de calibração individuais e calcular a concentração de analitos nas amostras.
MÉTODO DE ESPECTROMETRIA DE MASSA
[898] As concentrações de fármacos em amostras de tecido de plasma, CSF e CNS foram quantificadas usando um método LC-MS/MS qualificado. Resumidamente, amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de lise, em seguida, os oligonucleotídeos foram extraídos do plasma, LCR ou tecido lisado por extração em fase sólida e analisados por cromatografia líquida de fase reversa de par iônico acoplada à espectrometria de massa no modo de ionização negativa. A concentração do comprimento total do filamento antissenso do duplex dosado foi medida. As concentrações do medicamento foram relatadas como concentrações duplex baseadas no antissenso. A faixa de calibração é de 10 a 5.000 ng/ml para amostras de plasma e CSF e 100 a 50.000 ng/g para amostras de tecido do SNC. As concentrações que foram calculadas abaixo do LLOQ são relatadas como <LLOQ. Um duplex analógico com peso molecular diferente foi usado como padrão interno.
KNOCKDOWN DE MRNA POR MÉTODO DE QPCR
[899] [00899] O RNA total foi isolado de amostras de cérebro de rato e tecido da medula espinhal usando o kit miRNeasy Mini da (Qiagen, Catálogo nº 217004) de acordo com as instruções do fabricante. Após o isolamento, o RNA foi transcrito reversamente usando transcriptase reversa SuperScript™ IV VILO™ (Thermo Fisher Scientific). A análise quantitativa de PCR foi realizada usando um ViiA7 Real-Time PCR System da Thermo Fisher Scientific de Waltham MA 02451 (Catálogo nº 4453537) com Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems Catálogo nº 4352042), proteína precursora beta amiloide pré-validada (APP) (Mf01552291_m1) e Ensaios de expressão gênica de Taqman (Thermo Fisher Scientific) de peptidilprolil isomerase B (PPIB) (Mf02802985_m1).
[900] A redução relativa de mRNA de APP foi calculada usando o limite de ciclo comparativo (Ct) método. Durante qPCR, o instrumento define uma linha de base na fase exponencial da curva de amplificação e atribui um valor Ct com base no ponto de intersecção da linha de base com a curva de amplificação. A redução do mRNA de APP foi normalizada para o grupo de controle experimental não tratado como uma porcentagem para cada grupo respectivo usando os valores de Ct de acordo com os seguintes cálculos: ΔCtApp = CtApp - CtPpib ΔΔCtApp = ΔCtApp – ΔCtmédia de grupo de controle não tratado Nível de mRNA relativo = 2-ΔΔCt EXEMPLO 5: PROJETO DE AGENTE DE RNAI ADICIONAL, SÍNTESE, E RASTREIO IN VITRO EM LINHAS CELULARES DE COS-7, BE(2)-C E NEURO-2A.
[901] Esse exemplo descreve métodos para o projeto, síntese, seleção e triagem in vitro de agentes de RNAi de APP adicionais em células Cos-7 (vetor Dual-Luciferase psiCHECK2), Be(2)-C e Neuro-2a.
FONTE DE REAGENTES
[902] Quando a fonte de um reagente não é especificamente fornecida aqui, tal reagente pode ser obtido de qualquer fornecedor de reagentes para biologia molecular em um padrão de qualidade/pureza para aplicação em biologia molecular. CULTURA CELULAR E TRANSFECÇÕES:
[903] As células Cos-7 (ATCC) foram transfectadas pela adição de 5 µl de 1 ng/µl, diluídas em Opti- MEM, vetor C9orf72 íntron 1 psiCHECK2 (Blue Heron Biotechnology), 4,9 µl de Opti-MEM mais 0,1 µl de Lipofectamina 2000 por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat nº11668-019) a 5 µl de duplexes de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubado em temperatura ambiente por 15 minutos. Trinta e cinco µl de Meio Eagle Modificado por Dulbecco (ThermoFisher) contendo ~5x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 48 horas seguidas das medidas de luciferase Firefly (controle de transfecção) e Renilla (fusão com sequência-alvo). Três experimentos de dose foram realizados a 10 nM, 1 nM e 0,1 nM.
[904] As células Be(2)-C (ATCC) foram transfectadas pela adição de 4,9 µl de Opti-MEM mais 0,1 µl de RNAiMAX por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat nº 13778-150) a 5 µl de duplexes de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos. Quarenta µl de mistura 1:1 de Meio Essencial Mínimo e Meio F12 (ThermoFisher) contendo ~5x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 48 horas antes da purificação do
RNA. Dois experimentos de dose foram realizados a 10 nM e 0,1 nM.
[905] As células Neuro-2a (ATCC) foram transfectadas pela adição de 4,9 µl de Opti-MEM mais 0,1 µl de RNAiMAX por poço (Invitrogen, Carlsbad CA. cat nº 13778-150) a 5 µl de duplexes de siRNA por poço, com 4 réplicas de cada duplex de siRNA, em uma placa de 384 poços, e incubados em temperatura ambiente por 15 minutos. Quarenta µl de meio essencial mínimo (ThermoFisher) contendo ~5x103 células foram então adicionados à mistura de siRNA. As células foram incubadas por 48 horas antes da purificação do RNA. Dois experimentos de dose foram realizados a 10 nM e 0,1 nM.
ISOLAMENTO TOTAL DE RNA USANDO KIT DE ISOLAMENTO DE MRNA DYNABEADS:
[906] O RNA foi isolado usando um protocolo automatizado em uma plataforma BioTek-EL406 usando DYNABEADs (Invitrogen, cat n° 61012). Resumidamente, 70 µl de tampão de lise/ligação e 10 µl de tampão de lise contendo 3 µl de esferas magnéticas foram adicionados à placa com as células. As placas foram incubadas em agitador eletromagnético por 10 minutos em temperatura ambiente e em seguida as esferas magnéticas foram capturadas e o sobrenadante foi removido. O RNA ligado ao grânulo foi então lavado 2 vezes com 150 µl de tampão de lavagem A e uma vez com tampão de lavagem B. Os grânulos foram então lavados com 150 µl de tampão de eluição, recapturados e o sobrenadante foi removido.
SÍNTESE DE CDNA USANDO KIT DE TRANSCRIÇÃO REVERSA DE CDNA DE ALTA CAPACIDADE ABI (BIOSYSTEMS APLICADO, FOSTER CITY, CA, CAT Nº4368813):
[907] Dez µl de uma mistura principal contendo 1 µl de tampão 10X, 0,4 µl de 25X dNTPs, 1 µl de iniciadores aleatórios 10x, 0,5 µl de transcriptase reversa, 0,5 µl de inibidor de RNase e 6,6 µl de H2O por reação foram adicionados ao RNA isolado acima. As placas foram seladas, misturadas e incubadas em agitador eletromagnético por 10 minutos em temperatura ambiente, seguido de 2h 37 °C. PCR EM TEMPO REAL:
[908] Dois µl de cDNA e 5 µl de mistura principal de sonda Lightcycler 480 (Roche Cat nº 04887301001) foram adicionados a 0,5 µl de sonda GAPDH TaqMan humana (4326317E) e 0,5 µl de sonda humana C9orf72 (Hs00376619_m1, Thermo) ou 0,5 µl de sonda TaqMan GAPDH de camundongo (4352339E) e 0,5 µl de sonda de camundongo C9orf72 (Mm01216837_m1, Thermo) por poço em placas de 384 poços (Roche cat nº 04887301001). A PCR em tempo real foi realizada em um sistema LightCycler480 Real Time PCR (Roche). Cada duplex foi testado pelo menos duas vezes e os dados foram normalizados para células transfectadas com um siRNA de controle sem direcionamento. Para calcular a alteração relativa da dobra, os dados em tempo real foram analisados usando o método ΔΔCt e normalizado para ensaios realizados com células transfectadas com um siRNA de controle sem direcionamento. SEQUÊNCIAS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE APP ADICIONAIS:
[909] A Tabela 10 até a Tabela 16B lista sequências de APP-alvo e modificadas adicionais. TABELA 10. SEQUÊNCIAS MODIFICADAS DE APP HUMANA
ADICIONAIS Nome SE SE SE do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duple (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID x NO NO NO AD- asasagagCfaAfAfAfcua 18 asUfscugAfaUfAfguuuUfg 18 AGAAAGAGCAAAACUA 18
Nome SE SE SE do Sequência Sensora Q Sequência Antissenso Q Sequência-alvo Q Duple (5’ a 3’) ID (5’ a 3’) ID de mRNA ID x NO NO NO 50693 uucagauL96 83 Cfucuuuscsu 84 UUCAGAU 85
5.2 AD- ususggccAfaCfAfUfgau 18 asUfscacUfaAfUfcaugUfu 18 UCUUGGCCAACAUGAU 18 50706 uagugauL96 86 Gfgccaasgsa 87 UAGUGAA 88
5.2 AD- uscsugggUfuGfAfCfaaa 18 asUfsugaUfaUfUfugucAfa 18 GUUCUGGGUUGACAAA 18 50715 uaucaauL96 89 Cfccagasasc 90 UAUCAAG 91
9.2 AD- ususuaugAfuUfUfAfcuc 18 asGfsauaAfuGfAfguaaAfu 18 GUUUUAUGAUUUACUC 18 50753 auuaucuL96 92 Cfauaaasasc 93 AUUAUCG 94
8.2 AD- asusgccuGfaAfCfUfuga 18 asAfsuuaAfuUfCfaaguUfc 18 AGAUGCCUGAACUUGA 18 50762 auuaauuL96 95 Afggcauscsu 96 AUUAAUC 97
4.2 AD- asgsaugcCfuGfAfAfcuu 18 asUfsaauUfcAfAfguucAfg 18 GUAGAUGCCUGAACUU 19 50772 gaauuauL96 98 Gfcaucusasc 99 GAAUUAA 00
4.2 AD- gscscugaAfcUfUfGfaau 19 asGfsgauUfaAfUfucaaGfu 19 AUGCCUGAACUUGAAU 19 50772 uaauccuL96 01 Ufcaggcsasu 02 UAAUCCA 03
5.2 AD- gsusgguuUfgUfGfAfccc 19 asUfsuaaUfuGfGfgucaCfa 19 UUGUGGUUUGUGACCC 19 50778 aauuaauL96 04 Afaccacsasa 05 AAUUAAG 06
9.2 AD- csasgaugCfuUfUfAfgag 19 asAfsaauCfuCfUfcuaaAfg 19 UUCAGAUGCUUUAGAG 19 50787 agauuuuL96 07 Cfaucugsasa 08 AGAUUUU 09
4.2 AD- uscsuugcCfuAfAfGfuau 19 asAfsaagGfaAfUfacuuAfg 19 UCUCUUGCCUAAGUAU 19 50792 uccuuuuL96 10 Gfcaagasgsa 11 UCCUUUC 12
8.2 AD- ususgcugCfuUfCfUfgcu 19 asAfsaauAfuAfGfcagaAfg 19 GAUUGCUGCUUCUGCU 19 50794 auauuuuL96 13 Cfagcaasusc 14 AUAUUUG 15
9.2
[910] Tabela 10 chave: U=uridina-3`-fosfato, u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`-
fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato, VP=fosfato de vinila 5', (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato. TABELA 11. SEQUÊNCIAS NÃO MODIFICADAS DE APP HUMANA ADICIONAIS; ALVEJAMENTO DE NM_000484.3 E NM_201414.2 Nome SE SE Espéc Sequência Nome de Sequência Nome de do Q Q ie Sensora (5’ a origem Antissenso (5’ a origem Duple ID ID cruza 3’) (faixa) 3’) (faixa) x NO NO da AD- NM_000484.3_ NM_201414.2_ AAAGAGCAAAACUAU 19 AUCUGAAUAGUUUUGC 19 50693 1902-1922_s 1675-1697_as UNK UCAGAU 16 UCUUUCU 17
5.2 (1902-1922) (1900-1922) NM_201414.2_ NM_201414.2_ AD- UUGGCCAACAUGAUU 19 1704- AUCACUAAUCAUGUUG 19 1702- 50706 UNK AGUGAU 18 1724_A21U_s GCCAAGA 19 1724_U1A_as
5.2 (1704-1724) (1702-1724) NM_000484.3_ NM_201414.2_ AD- UCUGGGUUGACAAAU 19 2166- AUUGAUAUUUGUCAAC 19 1939- 50715 UNK AUCAAU 20 2186_G21U_s CCAGAAC 21 1961_C1A_as
9.2 (2166-2186) (2164-2186) NM_000484.3_ NM_201414.2_ AD- UUUAUGAUUUACUCA 19 2613- AGAUAAUGAGUAAAUC 19 2386- 50753 UNK UUAUCU 22 2633_G21U_s AUAAAAC 23 2408_C1A_as
8.2 (2613-2633) (2611-2633) NM_000484.3_ NM_201414.2_ AD- AUGCCUGAACUUGAA 19 2665- AAUUAAUUCAAGUUCA 19 2438- 50762 UNK UUAAUU 24 2685_C21U_s GGCAUCU 25 2460_G1A_as
4.2 (2665-2685) (2663-2685) NM_201414.2_ NM_201414.2_ AD- AGAUGCCUGAACUUG 19 2438- AUAAUUCAAGUUCAGG 19 2436- 50772 UNK AAUUAU 26 2458_A21U_s CAUCUAC 27 2458_U1A_as
4.2 (2438-2458) (2436-2458) NM_201414.2_ NM_201414.2_ AD- GCCUGAACUUGAAUU 19 2442- AGGAUUAAUUCAAGUU 19 2440- 50772 UNK AAUCCU 28 2462_A21U_s CAGGCAU 29 2462_U1A_as
5.2 (2442-2462) (2440-2462) NM_000484.3_ NM_201414.2_ AD- GUGGUUUGUGACCCA 19 2853- AUUAAUUGGGUCACAA 19 2626- 50778 UNK AUUAAU 30 2873_G21U_s ACCACAA 31 2648_C1A_as
9.2 (2853-2873) (2851-2873) AD- NM_000484.3_ NM_201414.2_ CAGAUGCUUUAGAGA 19 AAAAUCUCUCUAAAGC 19 50787 3006-3026_s 2779-2801_as UNK GAUUUU 32 AUCUGAA 33
4.2 (3006-3026) (3004-3026)
Nome SE SE Espéc Sequência Nome de Sequência Nome de do Q Q ie Sensora (5’ a origem Antissenso (5’ a origem Duple ID ID cruza 3’) (faixa) 3’) (faixa) x NO NO da NM_201414.2_ NM_201414.2_ AD- UCUUGCCUAAGUAUU 19 2718- AAAAGGAAUACUUAGG 19 2716- 50792 UNK CCUUUU 34 2738_C21U_s CAAGAGA 35 2738_G1A_as
8.2 (2718-2738) (2716-2738) NM_201414.2_ NM_201414.2_ AD- UUGCUGCUUCUGCUA 19 2831- AAAAUAUAGCAGAAGC 19 2829- 50794 UNK UAUUUU 36 2851_G21U_s AGCAAUC 37 2851_C1A_as
9.2 (2831-2851) (2829-2851) TABELA 12. SEQUÊNCIAS MODIFICADAS DE APP HUMANA ADICIONAIS.
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO AD- csgscuu(Uhd)CfuAfCfAfcuguauuac 193 VPusGfsuaaUfaCfAfguguAfgAfaagcg 193
738012. aL96 8 sasu 9 1 AD- gscsuuu(Chd)UfaCfAfCfuguauuaca 194 VPusUfsguaAfuAfCfagugUfaGfaaagc 194
738013. aL96 0 sgsa 1 1 AD- ususcua(Chd)AfcUfGfUfauuacauaa 194 VPusUfsuauGfuAfAfuacaGfuGfuagaa 194
738014. aL96 2 sasg 3 1 AD- ususucu(Ahd)CfaCfUfGfuauuacaua 194 VPusUfsaugUfaAfUfacagUfgUfagaaa 194
738015. aL96 4 sgsc 5 1 AD- asusuua(Ghd)CfuGfUfAfucaaacuag 194 VPusCfsuagUfuUfGfauacAfgCfuaaau 194
738016. aL96 6 susc 7 1 AD- ususccu(Ghd)AfuCfAfCfuaugcauuu 194 VPusAfsaauGfcAfUfagugAfuCfaggaa 194
738017. aL96 8 sasg 9 1 AD- gsusgcu(Ghd)UfaAfCfAfcaaguagau 195 VPusAfsucuAfcUfUfguguUfaCfagcac 195
738018. aL96 0 sasg 1 1 AD- ususuag(Chd)UfgUfAfUfcaaacuagu 195 VPusAfscuaGfuUfUfgauaCfaGfcuaaa 195
738019. aL96 2 susu 3 1 AD- ususucc(Uhd)GfaUfCfAfcuaugcauu 195 VPusAfsaugCfaUfAfgugaUfcAfggaaa 195
738020. aL96 4 sgsg 5 1 AD- asasugg(Ghd)UfuUfUfGfuguacugua 195 VPusUfsacaGfuAfCfacaaAfaCfccauu 195
738021. aL96 6 sasa 7 1
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO AD- asusugu(Ahd)CfaGfAfAfucauugcuu 195 VPusAfsagcAfaUfGfauucUfgUfacaau 195
738022. aL96 8 scsa 9 1 AD- ususgua(Chd)AfgAfAfUfcauugcuua 196 VPusUfsaagCfaAfUfgauuCfuGfuacaa 196
738023. aL96 0 susc 1 1 AD- ususacu(Ghd)UfaCfAfGfauugcugcu 196 VPusAfsgcaGfcAfAfucugUfaCfaguaa 196
738024. aL96 2 sasa 3 1 AD- asusaug(Chd)UfgAfAfGfaaguacguc 196 VPusGfsacgUfaCfUfucuuCfaGfcauau 196
738025. aL96 4 susg 5 1 AD- ascscau(Uhd)GfcUfUfCfacuacccau 196 VPusAfsuggGfuAfGfugaaGfcAfauggu 196
738026. aL96 6 susu 7 1 AD- csusgug(Chd)UfgUfAfAfcacaaguag 196 VPusCfsuacUfuGfUfguuaCfaGfcacag 196
738027. aL96 8 scsu 9 1 AD- usgscug(Uhd)AfaCfAfCfaaguagaug 197 VPusCfsaucUfaCfUfugugUfuAfcagca 197
738028. aL96 0 scsa 1 1 AD- ascsagc(Uhd)GfuGfCfUfguaacacaa 197 VPusUfsuguGfuUfAfcagcAfcAfgcugu 197
738029. aL96 2 scsa 3 1 AD- gscsugu(Ahd)AfcAfCfAfaguagaugc 197 VPusGfscauCfuAfCfuuguGfuUfacagc 197
738030. aL96 4 sasc 5 1 AD- uscsaaa(Chd)UfaGfUfGfcaugaauag 197 VPusCfsuauUfcAfUfgcacUfaGfuuuga 197
738031. aL96 6 susa 7 1 AD- csasaac(Uhd)AfgUfGfCfaugaauaga 197 VPusUfscuaUfuCfAfugcaCfuAfguuug 197
738032. aL96 8 sasu 9 1 AD- usgscag(Ghd)AfuGfAfUfuguacagaa 198 VPusUfsucuGfuAfCfaaucAfuCfcugca 198
738033. aL96 0 sgsa 1 1 AD- gscsagg(Ahd)UfgAfUfUfguacagaau 198 VPusAfsuucUfgUfAfcaauCfaUfccugc 198
738034. aL96 2 sasg 3 1 AD- csasgga(Uhd)GfaUfUfGfuacagaauc 198 VPusGfsauuCfuGfUfacaaUfcAfuccug 198
738035. aL96 4 scsa 5 1 AD- usasuca(Ahd)AfcUfAfGfugcaugaau 198 VPusAfsuucAfuGfCfacuaGfuUfugaua 198
738036. aL96 6 scsa 7 1 AD- ususugu(Ghd)CfcUfGfUfuuuaugugc 198 VPusGfscacAfuAfAfaacaGfgCfacaaa 198
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO
738037. aL96 8 sgsa 9 1 AD- ususgug(Chd)CfuGfUfUfuuaugugca 199 VPusUfsgcaCfaUfAfaaacAfgGfcacaa 199
738038. aL96 0 sasg 1 1 AD- csusgca(Ghd)GfaUfGfAfuuguacaga 199 VPusUfscugUfaCfAfaucaUfcCfugcag 199
738039. aL96 2 sasa 3 1 AD- csasggu(Chd)AfuGfAfGfagaauggga 199 VPusUfscccAfuUfCfucucAfuGfaccug 199
738040. aL96 4 sgsg 5 1 AD- usasugu(Ghd)CfaCfAfCfauuaggcau 199 VPusAfsugcCfuAfAfugugUfgCfacaua 199
738041. aL96 6 sasa 7 1 AD- usgsugc(Ahd)CfaCfAfUfuaggcauug 199 VPusCfsaauGfcCfUfaaugUfgUfgcaca 199
738042. aL96 8 susa 9 1 AD- gsgsaug(Ahd)UfuGfUfAfcagaaucau 200 VPusAfsugaUfuCfUfguacAfaUfcaucc 200
738043. aL96 0 susg 1 1 AD- ascscau(Chd)CfaGfAfAfcuggugcaa 200 VPusUfsugcAfcCfAfguucUfgGfauggu 200
738044. aL96 2 scsa 3 1 AD- usasugc(Uhd)GfaAfGfAfaguacgucc 200 VPusGfsgacGfuAfCfuucuUfcAfgcaua 200
738045. aL96 4 susu 5 1 AD- asusgcu(Ghd)AfaGfAfAfguacguccg 200 VPusCfsggaCfgUfAfcuucUfuCfagcau 200
738046. aL96 6 sasu 7 1 AD- asasacc(Ahd)UfuGfCfUfucacuaccc 200 VPusGfsgguAfgUfGfaagcAfaUfgguuu 200
738047. aL96 8 susg 9 1 AD- asascca(Uhd)UfgCfUfUfcacuaccca 201 VPusUfsgggUfaGfUfgaagCfaAfugguu 201
738048. aL96 0 susu 1 1 AD- csasccg(Ahd)GfaGfAfGfaauguccca 201 VPusUfsgggAfcAfUfucucUfcUfcggug 201
397217. aL96 2 scsu 3 2 AD- gsusugu(Ahd)UfaUfUfAfuucuugugg 201 VPusCfscacAfaGfAfauaaUfaUfacaac 201
738049. aL96 4 susg 5 1 AD- ususaug(Uhd)GfcAfCfAfcauuaggca 201 VPusUfsgccUfaAfUfguguGfcAfcauaa 201
738050. aL96 6 sasa 7 1 AD- asusgug(Chd)AfcAfCfAfuuaggcauu 201 VPusAfsaugCfcUfAfauguGfuGfcacau 201
738051. aL96 8 sasa 9
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO 1 AD- gsusgca(Chd)AfcAfUfUfaggcauuga 202 VPusUfscaaUfgCfCfuaauGfuGfugcac 202
738052. aL96 0 sasu 1 1 AD- usgsauu(Ghd)UfaCfAfGfaaucauugc 202 VPusGfscaaUfgAfUfucugUfaCfaauca 202
738053. aL96 2 susc 3 1 AD- gscsuuc(Ahd)CfuAfCfCfcaucggugu 202 VPusAfscacCfgAfUfggguAfgUfgaagc 202
738054. aL96 4 sasa 5 1 AD- ususuua(Uhd)GfuGfCfAfcacauuagg 202 VPusCfscuaAfuGfUfgugcAfcAfuaaaa 202
738055. aL96 6 scsa 7 1 AD- csgscuu(Uhd)CfuAfCfAfcuguauuac 202 VPusGfsuaau(Agn)caguguAfgAfaagc 202
738056. aL96 8 gsasu 9 1 AD- gscsuuu(Chd)UfaCfAfCfuguauuaca 203 VPusUfsguaa(Tgn)acagugUfaGfaaag 203
738057. aL96 0 csgsa 1 1 AD- ususcua(Chd)AfcUfGfUfauuacauaa 203 VPusUfsuaug(Tgn)aauacaGfuGfuaga 203
738058. aL96 2 asasg 3 1 AD- ususucu(Ahd)CfaCfUfGfuauuacaua 203 VPusUfsaugu(Agn)auacagUfgUfagaa 203
738059. aL96 4 asgsc 5 1 AD- asusuua(Ghd)CfuGfUfAfucaaacuag 203 VPusCfsuagu(Tgn)ugauacAfgCfuaaa 203
738060. aL96 6 ususc 7 1 AD- ususccu(Ghd)AfuCfAfCfuaugcauuu 203 VPusAfsaaug(Cgn)auagugAfuCfagga 203
738061. aL96 8 asasg 9 1 AD- gsusgcu(Ghd)UfaAfCfAfcaaguagau 204 VPusAfsucua(Cgn)uuguguUfaCfagca 204
738062. aL96 0 csasg 1 1 AD- ususuag(Chd)UfgUfAfUfcaaacuagu 204 VPusAfscuag(Tgn)uugauaCfaGfcuaa 204
738063. aL96 2 asusu 3 1 AD- ususucc(Uhd)GfaUfCfAfcuaugcauu 204 VPusAfsaugc(Agn)uagugaUfcAfggaa 204
738064. aL96 4 asgsg 5 1 AD- asasugg(Ghd)UfuUfUfGfuguacugua 204 VPusUfsacag(Tgn)acacaaAfaCfccau 204
738065. aL96 6 usasa 7 1 AD- ususacu(Ghd)UfaCfAfGfauugcugcu 204 VPusAfsgcag(Cgn)aaucugUfaCfagua 204
738066. aL96 8 asasa 9 1
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO AD- asusugu(Ahd)CfaGfAfAfucauugcuu 205 VPusAfsagca(Agn)ugauucUfgUfacaa 205
738067. aL96 0 uscsa 1 1 AD- ususgua(Chd)AfgAfAfUfcauugcuua 205 VPusUfsaagc(Agn)augauuCfuGfuaca 205
738068. aL96 2 asusc 3 1 AD- asusaug(Chd)UfgAfAfGfaaguacguc 205 VPusGfsacgu(Agn)cuucuuCfaGfcaua 205
738069. aL96 4 ususg 5 1 AD- ascscau(Uhd)GfcUfUfCfacuacccau 205 VPusAfsuggg(Tgn)agugaaGfcAfaugg 205
738070. aL96 6 ususu 7 1 AD- csusgug(Chd)UfgUfAfAfcacaaguag 205 VPusCfsuacu(Tgn)guguuaCfaGfcaca 205
738071. aL96 8 gscsu 9 1 AD- usgscug(Uhd)AfaCfAfCfaaguagaug 206 VPusCfsaucu(Agn)cuugugUfuAfcagc 206
738072. aL96 0 ascsa 1 1 AD- ascsagc(Uhd)GfuGfCfUfguaacacaa 206 VPusUfsugug(Tgn)uacagcAfcAfgcug 206
738073. aL96 2 uscsa 3 1 AD- gscsugu(Ahd)AfcAfCfAfaguagaugc 206 VPusGfscauc(Tgn)acuuguGfuUfacag 206
738074. aL96 4 csasc 5 1 AD- uscsaaa(Chd)UfaGfUfGfcaugaauag 206 VPusCfsuauu(Cgn)augcacUfaGfuuug 206
738075. aL96 6 asusa 7 1 AD- csasaac(Uhd)AfgUfGfCfaugaauaga 206 VPusUfscuau(Tgn)caugcaCfuAfguuu 206
738076. aL96 8 gsasu 9 1 AD- usgscag(Ghd)AfuGfAfUfuguacagaa 207 VPusUfsucug(Tgn)acaaucAfuCfcugc 207
738077. aL96 0 asgsa 1 1 AD- gscsagg(Ahd)UfgAfUfUfguacagaau 207 VPusAfsuucu(Ggn)uacaauCfaUfccug 207
738078. aL96 2 csasg 3 1 AD- csasgga(Uhd)GfaUfUfGfuacagaauc 207 VPusGfsauuc(Tgn)guacaaUfcAfuccu 207
738079. aL96 4 gscsa 5 1 AD- usasuca(Ahd)AfcUfAfGfugcaugaau 207 VPusAfsuuca(Tgn)gcacuaGfuUfugau 207
738080. aL96 6 ascsa 7 1 AD- ususugu(Ghd)CfcUfGfUfuuuaugugc 207 VPusGfscaca(Tgn)aaaacaGfgCfacaa 207
738081. aL96 8 asgsa 9 1 AD- ususgug(Chd)CfuGfUfUfuuaugugca 208 VPusUfsgcac(Agn)uaaaacAfgGfcaca 208
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO
738082. aL96 0 asasg 1 1 AD- csusgca(Ghd)GfaUfGfAfuuguacaga 208 VPusUfscugu(Agn)caaucaUfcCfugca 208
738083. aL96 2 gsasa 3 1 AD- csasggu(Chd)AfuGfAfGfagaauggga 208 VPusUfsccca(Tgn)ucucucAfuGfaccu 208
738084. aL96 4 gsgsg 5 1 AD- usasugc(Uhd)GfaAfGfAfaguacgucc 208 VPusGfsgacg(Tgn)acuucuUfcAfgcau 208
738085. aL96 6 asusu 7 1 AD- asusgcu(Ghd)AfaGfAfAfguacguccg 208 VPusCfsggac(Ggn)uacuucUfuCfagca 208
738086. aL96 8 usasu 9 1 AD- asasacc(Ahd)UfuGfCfUfucacuaccc 209 VPusGfsggua(Ggn)ugaagcAfaUfgguu 209
738087. aL96 0 ususg 1 1 AD- asascca(Uhd)UfgCfUfUfcacuaccca 209 VPusUfsgggu(Agn)gugaagCfaAfuggu 209
738088. aL96 2 ususu 3 1 AD- usasugu(Ghd)CfaCfAfCfauuaggcau 209 VPusAfsugcc(Tgn)aaugugUfgCfacau 209
738089. aL96 4 asasa 5 1 AD- usgsugc(Ahd)CfaCfAfUfuaggcauug 209 VPusCfsaaug(Cgn)cuaaugUfgUfgcac 209
738090. aL96 6 asusa 7 1 AD- gsgsaug(Ahd)UfuGfUfAfcagaaucau 209 VPusAfsugau(Tgn)cuguacAfaUfcauc 209
738091. aL96 8 csusg 9 1 AD- ascscau(Chd)CfaGfAfAfcuggugcaa 210 VPusUfsugca(Cgn)caguucUfgGfaugg 210
738092. aL96 0 uscsa 1 1 AD- csasccg(Ahd)GfaGfAfGfaauguccca 210 VPusUfsggga(Cgn)auucucUfcUfcggu 210
738093. aL96 2 gscsu 3 1 AD- gsusugu(Ahd)UfaUfUfAfuucuugugg 210 VPusCfscaca(Agn)gaauaaUfaUfacaa 210
738094. aL96 4 csusg 5 1 AD- ususaug(Uhd)GfcAfCfAfcauuaggca 210 VPusUfsgccu(Agn)auguguGfcAfcaua 210
738095. aL96 6 asasa 7 1 AD- asusgug(Chd)AfcAfCfAfuuaggcauu 210 VPusAfsaugc(Cgn)uaauguGfuGfcaca 210
738096. aL96 8 usasa 9 1 AD- gsusgca(Chd)AfcAfUfUfaggcauuga 211 VPusUfscaau(Ggn)ccuaauGfuGfugca 211
738097. aL96 0 csasu 1
SEQ SEQ Nome do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Duplex
NO NO 1 AD- usgsauu(Ghd)UfaCfAfGfaaucauugc 211 VPusGfscaau(Ggn)auucugUfaCfaauc 211
738098. aL96 2 asusc 3 1 AD- gscsuuc(Ahd)CfuAfCfCfcaucggugu 211 VPusAfscacc(Ggn)auggguAfgUfgaag 211
738099. aL96 4 csasa 5 1 AD- ususuua(Uhd)GfuGfCfAfcacauuagg 211 VPusCfscuaa(Tgn)gugugcAfcAfuaaa 211
738100. aL96 6 ascsa 7 1
[911] Tabela 12 chave: U=uridina-3`-fosfato, u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`- fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato, VP=fosfato de vinila 5’, (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato. TABELA 13. SEQUÊNCIAS NÃO MODIFICADAS DE APP HUMANA ADICIONAIS; ALVEJAMENTO DE XM_005548887.2 E NM_001198823.1. Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- 211 XM_005548887.2_ 73801 CGCUUUCUACACUGUAUUACA UGUAAUACAGUGUAGAAAGCGAU 2119 8 3401-3423_as
2.1 AD- 212 XM_005548887.2_ 73801 GCUUUCUACACUGUAUUACAA UUGUAAUACAGUGUAGAAAGCGA 2121 0 3402-3424_as
3.1
Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- 212 NM_001198823.1_ 73801 UUCUACACUGUAUUACAUAAA UUUAUGUAAUACAGUGUAGAAAG 2123 2 3306-3328_as
4.1 AD- 212 NM_001198823.1_ 73801 UUUCUACACUGUAUUACAUAA UUAUGUAAUACAGUGUAGAAAGC 2125 4 3305-3327_as
5.1 AD- 212 XM_005548887.2_ 73801 AUUUAGCUGUAUCAAACUAGA UCUAGUUUGAUACAGCUAAAUUC 2127 6 2837-2859_as
6.1 AD- 212 XM_005548887.2_ 73801 UUCCUGAUCACUAUGCAUUUA UAAAUGCAUAGUGAUCAGGAAAG 2129 8 3030-3052_as
7.1 AD- NM_001198823.1_ 213 73801 GUGCUGUAACACAAGUAGAUA UAUCUACUUGUGUUACAGCACAG 2131 2602- 0
8.1 2624_C1A_as AD- 213 XM_005548887.2_ 73801 UUUAGCUGUAUCAAACUAGUA UACUAGUUUGAUACAGCUAAAUU 2133 2 2838-2860_as
9.1 AD- 213 XM_005548887.2_ 73802 UUUCCUGAUCACUAUGCAUUA UAAUGCAUAGUGAUCAGGAAAGG 2135 4 3029-3051_as
0.1 AD- 213 XM_005548887.2_ 73802 AAUGGGUUUUGUGUACUGUAA UUACAGUACACAAAACCCAUUAA 2137 6 2813-2835_as
1.1 AD- 213 NM_001198823.1_ 73802 AUUGUACAGAAUCAUUGCUUA UAAGCAAUGAUUCUGUACAAUCA 2139 8 3272-3294_as
2.1 AD- 214 NM_001198823.1_ 73802 UUGUACAGAAUCAUUGCUUAA UUAAGCAAUGAUUCUGUACAAUC 2141 0 3273-3295_as
3.1 AD- 214 XM_005548887.2_ 73802 UUACUGUACAGAUUGCUGCUA UAGCAGCAAUCUGUACAGUAAAA 2143 2 3113-3135_as
4.1 AD- 214 XM_005548887.2_ 73802 AUAUGCUGAAGAAGUACGUCA UGACGUACUUCUUCAGCAUAUUG 2145 4 1740-1762_as
5.1 AD- NM_001198823.1_ 214 73802 ACCAUUGCUUCACUACCCAUA UAUGGGUAGUGAAGCAAUGGUUU 2147 2506- 6
6.1 2528_G1A_as AD- 214 NM_001198823.1_ 73802 CUGUGCUGUAACACAAGUAGA UCUACUUGUGUUACAGCACAGCU 2149 8 2600-2622_as
7.1 AD- NM_001198823.1_ 215 73802 UGCUGUAACACAAGUAGAUGA UCAUCUACUUGUGUUACAGCACA 2151 2603- 0
8.1 2625_G1A_as
Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- NM_001198823.1_ 215 73802 ACAGCUGUGCUGUAACACAAA UUUGUGUUACAGCACAGCUGUCA 2153 2596- 2
9.1 2618_C1A_as AD- NM_001198823.1_ 215 73803 GCUGUAACACAAGUAGAUGCA UGCAUCUACUUGUGUUACAGCAC 2155 2604- 4
0.1 2626_G1A_as AD- 215 NM_001198823.1_ 73803 UCAAACUAGUGCAUGAAUAGA UCUAUUCAUGCACUAGUUUGAUA 2157 6 2742-2764_as
1.1 AD- 215 NM_001198823.1_ 73803 CAAACUAGUGCAUGAAUAGAA UUCUAUUCAUGCACUAGUUUGAU 2159 8 2743-2765_as
2.1 AD- 216 NM_001198823.1_ 73803 UGCAGGAUGAUUGUACAGAAA UUUCUGUACAAUCAUCCUGCAGA 2161 0 3263-3285_as
3.1 AD- NM_001198823.1_ 216 73803 GCAGGAUGAUUGUACAGAAUA UAUUCUGUACAAUCAUCCUGCAG 2163 3264- 2
4.1 3286_G1A_as AD- 216 NM_001198823.1_ 73803 CAGGAUGAUUGUACAGAAUCA UGAUUCUGUACAAUCAUCCUGCA 2165 4 3265-3287_as
5.1 AD- 216 NM_001198823.1_ 73803 UAUCAAACUAGUGCAUGAAUA UAUUCAUGCACUAGUUUGAUACA 2167 6 2740-2762_as
6.1 AD- 216 NM_001198823.1_ 73803 UUUGUGCCUGUUUUAUGUGCA UGCACAUAAAACAGGCACAAAGA 2169 8 3070-3092_as
7.1 AD- NM_001198823.1_ 217 73803 UUGUGCCUGUUUUAUGUGCAA UUGCACAUAAAACAGGCACAAAG 2171 3071- 0
8.1 3093_G1A_as AD- 217 NM_001198823.1_ 73803 CUGCAGGAUGAUUGUACAGAA UUCUGUACAAUCAUCCUGCAGAA 2173 2 3262-3284_as
9.1 AD- 217 NM_001198823.1_ 73804 CAGGUCAUGAGAGAAUGGGAA UUCCCAUUCUCUCAUGACCUGGG 2175 4 1369-1391_as
0.1 AD- 217 NM_001198823.1_ 73804 UAUGUGCACACAUUAGGCAUA UAUGCCUAAUGUGUGCACAUAAA 2177 6 3083-3105_as
1.1 AD- 217 NM_001198823.1_ 73804 UGUGCACACAUUAGGCAUUGA UCAAUGCCUAAUGUGUGCACAUA 2179 8 3085-3107_as
2.1 AD- 218 NM_001198823.1_ 73804 GGAUGAUUGUACAGAAUCAUA UAUGAUUCUGUACAAUCAUCCUG 2181 0 3267-3289_as
3.1
Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- 218 NM_001198823.1_ 73804 ACCAUCCAGAACUGGUGCAAA UUUGCACCAGUUCUGGAUGGUCA 2183 2 424-446_C1A_as
4.1 AD- 218 XM_005548887.2_ 73804 UAUGCUGAAGAAGUACGUCCA UGGACGUACUUCUUCAGCAUAUU 2185 4 1741-1763_as
5.1 AD- 218 XM_005548887.2_ 73804 AUGCUGAAGAAGUACGUCCGA UCGGACGUACUUCUUCAGCAUAU 2187 6 1742-1764_as
6.1 AD- 218 XM_005548887.2_ 73804 AAACCAUUGCUUCACUACCCA UGGGUAGUGAAGCAAUGGUUUUG 2189 8 2614-2636_as
7.1 AD- 219 XM_005548887.2_ 73804 AACCAUUGCUUCACUACCCAA UUGGGUAGUGAAGCAAUGGUUUU 2191 0 2615-2637_as
8.1 AD- NM_001198823.1_ 219 39721 CACCGAGAGAGAAUGUCCCAA UUGGGACAUUCUCUCUCGGUGCU 2193 1351- 2
7.2 1373_C1A_as AD- 219 XM_005548887.2_ 73804 GUUGUAUAUUAUUCUUGUGGA UCCACAAGAAUAAUAUACAACUG 2195 4 2906-2928_as
9.1 AD- 219 NM_001198823.1_ 73805 UUAUGUGCACACAUUAGGCAA UUGCCUAAUGUGUGCACAUAAAA 2197 6 3082-3104_as
0.1 AD- NM_001198823.1_ 219 73805 AUGUGCACACAUUAGGCAUUA UAAUGCCUAAUGUGUGCACAUAA 2199 3084- 8
1.1 3106_C1A_as AD- NM_001198823.1_ 220 73805 GUGCACACAUUAGGCAUUGAA UUCAAUGCCUAAUGUGUGCACAU 2201 3086- 0
2.1 3108_C1A_as AD- 220 NM_001198823.1_ 73805 UGAUUGUACAGAAUCAUUGCA UGCAAUGAUUCUGUACAAUCAUC 2203 2 3270-3292_as
3.1 AD- 220 NM_001198823.1_ 73805 GCUUCACUACCCAUCGGUGUA UACACCGAUGGGUAGUGAAGCAA 2205 4 2512-2534_as
4.1 AD- NM_001198823.1_ 220 73805 UUUUAUGUGCACACAUUAGGA UCCUAAUGUGUGCACAUAAAACA 2207 3080- 6
5.1 3102_G1A_as AD- 220 XM_005548887.2_ 73805 CGCUUUCUACACUGUAUUACA UGUAAUACAGUGUAGAAAGCGAU 2209 8 3401-3423_as
6.1 AD- 221 XM_005548887.2_ 73805 GCUUUCUACACUGUAUUACAA UUGUAATACAGUGUAGAAAGCGA 2211 0 3402-3424_as
7.1
Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- 221 XM_005548887.2_ 73805 UUCUACACUGUAUUACAUAAA UUUAUGTAAUACAGUGUAGAAAG 2213 2 3405-3427_as
8.1 AD- 221 XM_005548887.2_ 73805 UUUCUACACUGUAUUACAUAA UUAUGUAAUACAGUGUAGAAAGC 2215 4 3404-3426_as
9.1 AD- 221 XM_005548887.2_ 73806 AUUUAGCUGUAUCAAACUAGA UCUAGUTUGAUACAGCUAAAUUC 2217 6 2837-2859_as
0.1 AD- 221 XM_005548887.2_ 73806 UUCCUGAUCACUAUGCAUUUA UAAAUGCAUAGUGAUCAGGAAAG 2219 8 3030-3052_as
1.1 AD- 222 XM_005548887.2_ 73806 GUGCUGUAACACAAGUAGAUA UAUCUACUUGUGUUACAGCACAG 2221 0 2716-2738_as
2.1 AD- 222 XM_005548887.2_ 73806 UUUAGCUGUAUCAAACUAGUA UACUAGTUUGAUACAGCUAAAUU 2223 2 2838-2860_as
3.1 AD- 222 XM_005548887.2_ 73806 UUUCCUGAUCACUAUGCAUUA UAAUGCAUAGUGAUCAGGAAAGG 2225 4 3029-3051_as
4.1 AD- 222 XM_005548887.2_ 73806 AAUGGGUUUUGUGUACUGUAA UUACAGTACACAAAACCCAUUAA 2227 6 2813-2835_as
5.1 AD- 222 XM_005548887.2_ 73806 UUACUGUACAGAUUGCUGCUA UAGCAGCAAUCUGUACAGUAAAA 2229 8 3113-3135_as
6.1 AD- 223 XM_005548887.2_ 73806 AUUGUACAGAAUCAUUGCUUA UAAGCAAUGAUUCUGUACAAUCA 2231 0 3371-3393_as
7.1 AD- 223 XM_005548887.2_ 73806 UUGUACAGAAUCAUUGCUUAA UUAAGCAAUGAUUCUGUACAAUC 2233 2 3372-3394_as
8.1 AD- 223 XM_005548887.2_ 73806 AUAUGCUGAAGAAGUACGUCA UGACGUACUUCUUCAGCAUAUUG 2235 4 1740-1762_as
9.1 AD- 223 XM_005548887.2_ 73807 ACCAUUGCUUCACUACCCAUA UAUGGGTAGUGAAGCAAUGGUUU 2237 6 2616-2638_as
0.1 AD- 223 XM_005548887.2_ 73807 CUGUGCUGUAACACAAGUAGA UCUACUTGUGUUACAGCACAGCU 2239 8 2714-2736_as
1.1 AD- 224 XM_005548887.2_ 73807 UGCUGUAACACAAGUAGAUGA UCAUCUACUUGUGUUACAGCACA 2241 0 2717-2739_as
2.1
Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- 224 XM_005548887.2_ 73807 ACAGCUGUGCUGUAACACAAA UUUGUGTUACAGCACAGCUGUCA 2243 2 2710-2732_as
3.1 AD- 224 XM_005548887.2_ 73807 GCUGUAACACAAGUAGAUGCA UGCAUCTACUUGUGUUACAGCAC 2245 4 2718-2740_as
4.1 AD- 224 XM_005548887.2_ 73807 UCAAACUAGUGCAUGAAUAGA UCUAUUCAUGCACUAGUUUGAUA 2247 6 2848-2870_as
5.1 AD- 224 XM_005548887.2_ 73807 CAAACUAGUGCAUGAAUAGAA UUCUAUTCAUGCACUAGUUUGAU 2249 8 2849-2871_as
6.1 AD- 225 XM_005548887.2_ 73807 UGCAGGAUGAUUGUACAGAAA UUUCUGTACAAUCAUCCUGCAGA 2251 0 3362-3384_as
7.1 AD- 225 XM_005548887.2_ 73807 GCAGGAUGAUUGUACAGAAUA UAUUCUGUACAAUCAUCCUGCAG 2253 2 3363-3385_as
8.1 AD- 225 XM_005548887.2_ 73807 CAGGAUGAUUGUACAGAAUCA UGAUUCTGUACAAUCAUCCUGCA 2255 4 3364-3386_as
9.1 AD- 225 XM_005548887.2_ 73808 UAUCAAACUAGUGCAUGAAUA UAUUCATGCACUAGUUUGAUACA 2257 6 2846-2868_as
0.1 AD- 225 XM_005548887.2_ 73808 UUUGUGCCUGUUUUAUGUGCA UGCACATAAAACAGGCACAAAGA 2259 8 3180-3202_as
1.1 AD- 226 XM_005548887.2_ 73808 UUGUGCCUGUUUUAUGUGCAA UUGCACAUAAAACAGGCACAAAG 2261 0 3181-3203_as
2.1 AD- 226 XM_005548887.2_ 73808 CUGCAGGAUGAUUGUACAGAA UUCUGUACAAUCAUCCUGCAGAA 2263 2 3361-3383_as
3.1 AD- 226 XM_005548887.2_ 73808 CAGGUCAUGAGAGAAUGGGAA UUCCCATUCUCUCAUGACCUGGG 2265 4 1487-1509_as
4.1 AD- 226 XM_005548887.2_ 73808 UAUGCUGAAGAAGUACGUCCA UGGACGTACUUCUUCAGCAUAUU 2267 6 1741-1763_as
5.1 AD- 226 XM_005548887.2_ 73808 AUGCUGAAGAAGUACGUCCGA UCGGACGUACUUCUUCAGCAUAU 2269 8 1742-1764_as
6.1 AD- 227 XM_005548887.2_ 73808 AAACCAUUGCUUCACUACCCA UGGGUAGUGAAGCAAUGGUUUUG 2271 0 2614-2636_as
7.1
Nome
SEQ SEQ do Sequência Sensora (5’ Sequência Antissenso (5’ ID ID Nome da fonte Duple a 3’) a 3’)
NO NO x AD- 227 XM_005548887.2_ 73808 AACCAUUGCUUCACUACCCAA UUGGGUAGUGAAGCAAUGGUUUU 2273 2 2615-2637_as
8.1 AD- 227 XM_005548887.2_ 73808 UAUGUGCACACAUUAGGCAUA UAUGCCTAAUGUGUGCACAUAAA 2275 4 3193-3215_as
9.1 AD- 227 XM_005548887.2_ 73809 UGUGCACACAUUAGGCAUUGA UCAAUGCCUAAUGUGUGCACAUA 2277 6 3195-3217_as
0.1 AD- 227 XM_005548887.2_ 73809 GGAUGAUUGUACAGAAUCAUA UAUGAUTCUGUACAAUCAUCCUG 2279 8 3366-3388_as
1.1 AD- 228 XM_005548887.2_ 73809 ACCAUCCAGAACUGGUGCAAA UUUGCACCAGUUCUGGAUGGUCA 2281 0 767-789_as
2.1 AD- 228 XM_005548887.2_ 73809 CACCGAGAGAGAAUGUCCCAA UUGGGACAUUCUCUCUCGGUGCU 2283 2 1469-1491_as
3.1 AD- 228 XM_005548887.2_ 73809 GUUGUAUAUUAUUCUUGUGGA UCCACAAGAAUAAUAUACAACUG 2285 4 2906-2928_as
4.1 AD- 228 XM_005548887.2_ 73809 UUAUGUGCACACAUUAGGCAA UUGCCUAAUGUGUGCACAUAAAA 2287 6 3192-3214_as
5.1 AD- 228 XM_005548887.2_ 73809 AUGUGCACACAUUAGGCAUUA UAAUGCCUAAUGUGUGCACAUAA 2289 8 3194-3216_as
6.1 AD- 229 XM_005548887.2_ 73809 GUGCACACAUUAGGCAUUGAA UUCAAUGCCUAAUGUGUGCACAU 2291 0 3196-3218_as
7.1 AD- 229 XM_005548887.2_ 73809 UGAUUGUACAGAAUCAUUGCA UGCAAUGAUUCUGUACAAUCAUC 2293 2 3369-3391_as
8.1 AD- 229 XM_005548887.2_ 73809 GCUUCACUACCCAUCGGUGUA UACACCGAUGGGUAGUGAAGCAA 2295 4 2622-2644_as
9.1 AD- 229 XM_005548887.2_ 73810 UUUUAUGUGCACACAUUAGGA UCCUAATGUGUGCACAUAAAACA 2297 6 3190-3212_as
0.1 TABELA 14. SEQUÊNCIAS MODIFIADAS DE APP HUMANA ADICIONAIS.
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO AD- usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauu 229 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcac 229 APP 886823 cucaL96 8 uasgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)AfugAfAfuagauuc 230 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcac 230 APP 886824 ucaL96 0 uasgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 230 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcac 230 APP 886825 cucaL96 2 uasgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGadAuagauuc 230 VPusGfsagaa(Tgn)cuauUfcAfuGfca 230 APP 886826 ucaL96 4 cuasgsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauu 230 VPusdGsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcac 230 APP 886827 cucaL96 6 uasgsu 7 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauu 230 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfugcacu 230 APP 886828 cucaL96 8 asgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauu 231 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfudGcac 231 APP 886829 cucaL96 0 uasgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfaAfuagauuc 231 VPusGfsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 231 APP 886830 ucaL96 2 cuasgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfaAfuagauuc 231 VPusGfsagaa(Tgn)cuaudTcAfugcac 231 APP 886831 ucaL96 4 uasgsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauu 231 VPusdGsagaa(Tgn)cuauucAfudGcac 231 APP 886832 cucaL96 6 uasgsu 7 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfaAfuagauuc 231 VPusdGsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 231 APP 886833 ucaL96 8 cuasgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 232 VPusdGsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcac 232 APP 886834 cucaL96 0 uasgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 232 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfudGcac 232 APP 886836 cucaL96 2 uasgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGaAfuagauuc 232 VPusGfsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 232 APP 886837 ucaL96 4 cuasgsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGaAfuagauuc 232 VPusGfsagaa(Tgn)cuaudTcAfugcac 232 APP 886838 ucaL96 6 uasgsu 7 .1 APP AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 232 VPusdGsagaa(Tgn)cuauucAfudGcac 232
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO 886839 cucaL96 8 uasgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 233 VPusdGsagaa(Tgn)cuauucAfudGcac 233 APP 886839 cucaL96 0 uasgsu 1 .2 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 233 VPusdGsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 233 APP 886840 cucaL96 2 cuasgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGaAfuagauuc 233 VPusdGsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 233 APP 886841 ucaL96 4 cuasgsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGadAuagauuc 233 VPusdGsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 233 APP 886842 ucaL96 6 cuasgsu 7 .1 AD- usasgug(Chd)audGadAuagauucu 233 VPusdGsagaa(Tgn)cuaudTcAfudGca 233 APP 886843 caL96 8 cuasgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)audGadAuagauucu 234 VPudGagaa(Tgn)cuaudTcAfudGcacu 234 APP 886844 caL96 0 asgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)audGadAuagauucu 234 VPudGagaa(Tgn)cuauUfcAfudGcacu 234 APP 886845 caL96 2 asgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)audGadAuagauucu 234 VPudGadGadAucuauUfcAfudGcacuas 234 APP 886846 caL96 4 gsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 234 VPudGagaa(Tgn)cuauucAfudGcacua 234 APP 886847 cucaL96 6 sgsu 7 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 234 VPusdGsagadA(Tgn)cuauucAfudGca 234 APP 886848 cucaL96 8 cuasgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 235 VPusdGsagdAa(Tgn)cuauucAfudGca 235 APP 886849 cucaL96 0 cuasgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 235 VPusdGsagadA(Tgn)cuaudTcAfudGc 235 APP 886850 cucaL96 2 acuasgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 235 VPusdGsagdAa(Tgn)cuaudTcAfudGc 235 APP 886851 cucaL96 4 acuasgsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 235 VPusdGsagadA(Tgn)cuaudTcAfugca 235 APP 886852 cucaL96 6 cuasgsu 7 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 235 VPusdGsagdAa(Tgn)cuaudTcAfugca 235
APP 886853 cucaL96 8 cuasgsu 9
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO .1 AD- usasgug(Chd)AfudGadAuagauuc 236 VPusdGsagdAa(Tgn)cuaudTcAfugca 236 APP 886854 ucaL96 0 cuasgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 236 VPudGagadA(Tgn)cuauucAfudGcacu 236 APP 886855 cucaL96 2 asgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 236 VPudGagdAa(Tgn)cuauucAfudGcacu 236 APP 886856 cucaL96 4 asgsu 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 236 VPudGagadA(Tgn)cuaudTcAfudGcac 236 APP 886857 cucaL96 6 uasgsu 7 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 236 VPudGagdAa(Tgn)cuaudTcAfudGcac 236 APP 886858 cucaL96 8 uasgsu 9 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 237 VPudGagadA(Tgn)cuaudTcAfugcacu 237 APP 886859 cucaL96 0 asgsu 1 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 237 VPudGagdAa(Tgn)cuaudTcAfugcacu 237 APP 886860 cucaL96 2 asgsu 3 .1 AD- usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauu 237 VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcac 237 APP 886861 cucaL96 4 uasusg 5 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 237 VPusdGsagadA(Tgn)cuaudTcAfudGc 237 APP 886862 cucaL96 6 acuasusg 7 .1 AD- usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauu 237 VPusdGsagdAa(Tgn)cuaudTcAfudGc 237 APP 886863 cucaL96 8 acuasusg 9 .1 AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 238 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuag 238 APP 886864 cuaaL96 0 ccsgsu 1 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 238 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuag 238 APP 886865 uaaL96 2 ccsgsu 3 .1 AD- gsgscua(Chd)dGaAfAfAfuccaac 238 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuag 238 APP 886866 cuaaL96 4 ccsgsu 5 .1 AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 238 VPuUfaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuagcc 238 APP 886867 cuaaL96 6 sgsu 7 .1 AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 238 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcguagc 238 APP 886868 cuaaL96 8 csgsu 9 .1
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 239 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcdGuag 239 APP 886869 cuaaL96 0 ccsgsu 1 .1 AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 239 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGua 239 APP 886870 cuaaL96 2 gccsgsu 3 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfaAfuccaaccu 239 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGua 239 APP 886871 aaL96 4 gccsgsu 5 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfaAfuccaaccu 239 VPusUfsaggu(Tgn)ggauUfuUfcdGua 239 APP 886872 aaL96 6 gccsgsu 7 .1 AD- gsgscua(Chd)gadAadAuccaaccu 239 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGua 239 APP 886873 aaL96 8 gccsgsu 9 .1 AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 240 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcguag 240 APP 886874 cuaaL96 0 ccsgsu 1 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfaAfuccaaccu 240 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcguag 240 APP 886875 aaL96 2 ccsgsu 3 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfaAfuccaaccu 240 VPusUfsaggu(Tgn)ggauUfuUfcguag 240 APP 886876 aaL96 4 ccsgsu 5 .1 AD- gsgscua(Chd)gadAadAuccaaccu 240 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcguag 240 APP 886877 aaL96 6 ccsgsu 7 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 240 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcguagc 240 APP 886878 uaaL96 8 csgsu 9 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 241 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcdGuag 241 APP 886879 uaaL96 0 ccsgsu 1 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 241 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGua 241 APP 886880 uaaL96 2 gccsgsu 3 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 241 VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcguag 241 APP 886881 uaaL96 4 ccsgsu 5 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 241 VPuUfaggdT(Tgn)ggauuuUfcguagcc 241 APP 886882 uaaL96 6 sgsu 7 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 241 VPuUfaggdT(Tgn)ggauuuUfcdGuagc 241 APP 886883 uaaL96 8 csgsu 9 .1 APP AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 242 VPuUfaggdT(Tgn)ggaudTuUfcdGuag 242
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO 886884 uaaL96 0 ccsgsu 1 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 242 VPuUfaggdT(Tgn)ggaudTuUfcguagc 242 APP 886885 uaaL96 2 csgsu 3 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 242 VPuUfagdGu(Tgn)ggauuuUfcguagcc 242 APP 886886 uaaL96 4 sgsu 5 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 242 VPuUfagdGu(Tgn)ggauuuUfcdGuagc 242 APP 886887 uaaL96 6 csgsu 7 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 242 VPuUfagdGu(Tgn)ggaudTuUfcdGuag 242 APP 886888 uaaL96 8 ccsgsu 9 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 243 VPuUfagdGu(Tgn)ggaudTuUfcguagc 243 APP 886889 uaaL96 0 csgsu 1 .1 AD- gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaac 243 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuag 243 APP 886890 cuaaL96 2 ccsusg 3 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 243 VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcdGuag 243 APP 886891 uaaL96 4 ccsusg 5 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 243 VPuUfaggdT(Tgn)ggaudTuUfcdGuag 243 APP 886892 uaaL96 6 ccsusg 7 .1 AD- gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaacc 243 VPuUfagdGu(Tgn)ggaudTuUfcdGuag 243 APP 886893 uaaL96 8 ccsusg 9 .1 AD- asasaga(Ghd)CfaAfAfAfcuauuc 244 VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuu 244 APP 886894 agaaL96 0 uscsu 1 .1 AD- asasag(Ahd)gCfaAfAfAfcuauuc 244 VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuu 244 APP 886895 agaaL96 2 uscsu 3 .1 AD- asasagag(Chd)aAfAfAfcuauuca 244 VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuu 244 APP 886896 gaaL96 4 uscsu 5 .1 AD- asasagagCfaAfAfAfcua(Uhd)uc 244 VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuu 244 APP 886897 agaaL96 6 uscsu 7 .1 AD- asasagagCfaAfAfAfcuau(Uhd)c 244 VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuu 244 APP 886898 agaaL96 8 uscsu 9 .1 AD- asasagagCfaAfAfAfcuauu(Chd) 245 VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuu 245
APP 886899 agaaL96 0 uscsu 1
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO .1 AD- asasaga(Ghd)CfaAfAfAfcuauuc 245 VPusUfscugAfauaguuuUfgCfucuuus 245 APP 886900 agaaL96 2 csu 3 .1 AD- asasaga(Ghd)CfaAfAfAfcuauuc 245 VPuUfcugAfaUfAfguuuUfgCfucuuus 245 APP 886901 agaaL96 4 csu 5 .1 AD- asasaga(Ghd)CfaAfAfAfcuauuc 245 VPuUfcugAfauaguuuUfgCfucuuuscs 245 APP 886902 agaaL96 6 u 7 .1 AD- asasag(Ahd)gCfaAfAfAfcuauuc 245 VPuUfcugAfaUfAfguuuUfgCfucuuus 245 APP 886903 agaaL96 8 csu 9 .1 AD- asasag(Ahd)gCfaAfAfAfcuauuc 246 VPuUfcugAfauaguuuUfgCfucuuuscs 246 APP 886904 agaaL96 0 u 1 .1 AD- asasagag(Chd)aAfAfAfcuauuca 246 VPuUfcugAfaUfAfguuuUfgCfucuuus 246 APP 886905 gaaL96 2 csu 3 .1 AD- asasagag(Chd)aAfAfAfcuauuca 246 VPuUfcugAfauaguuuUfgCfucuuuscs 246 APP 886906 gaaL96 4 u 5 .1 AD- asasagag(Chd)aAfaAfcuauucag 246 VPuUfcugAfauagudTuUfgCfucuuusc 246 APP 886907 aaL96 6 su 7 .1 AD- asasagag(Chd)adAadAcuauucag 246 VPuUfcugAfauagudTuUfgCfucuuusc 246 APP 886908 aaL96 8 su 9 .1 AD- asasagag(Chd)adAadAcuauucag 247 VPuUfcugdAauagudTuUfgdCucuuusc 247 APP 886909 aaL96 0 su 1 .1 AD- asasaga(Ghd)CfaAfAfAfcuauuc 247 VPusUfscugAfauaguuuUfgCfucuuus 247 APP 886910 agaaL96 2 usg 3 .1 AD- asasagagCfaAfAfAfcua(Uhd)uc 247 VPuUfcugAfauaguuuUfgCfucuuusus 247 APP 886911 agaaL96 4 g 5 .1 AD- asasagag(Chd)aAfAfAfcuauuca 247 VPuUfcugAfauaguuuUfgCfucuuusus 247 APP 886912 gaaL96 6 g 7 .1 AD- ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauu 247 VPusGfsauaAfuGfAfguaaAfuCfauaa 247 APP 886913 aucaL96 8 asasc 9 .1 AD- ususua(Uhd)gAfuUfUfAfcucauu 248 VPusGfsauaAfuGfAfguaaAfuCfauaa 248 APP 886914 aucaL96 0 asasc 1 .1
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO AD- ususuaug(Ahd)uUfUfAfcucauua 248 VPusGfsauaAfuGfAfguaaAfuCfauaa 248 APP 886915 ucaL96 2 asasc 3 .1 AD- ususuaugAfuUfUfAfcuc(Ahd)uu 248 VPusGfsauaAfuGfAfguaaAfuCfauaa 248 APP 886916 aucaL96 4 asasc 5 .1 AD- ususuaugAfuUfUfAfcuca(Uhd)u 248 VPusGfsauaAfuGfAfguaaAfuCfauaa 248 APP 886917 aucaL96 6 asasc 7 .1 AD- ususuaugAfuUfUfAfcucau(Uhd) 248 VPusGfsauaAfuGfAfguaaAfuCfauaa 248 APP 886918 aucaL96 8 asasc 9 .1 AD- ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauu 249 VPusGfsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 249 APP 886919 aucaL96 0 asc 1 .1 AD- ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauu 249 VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 249 APP 886920 aucaL96 2 asc 3 .1 AD- ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauu 249 VPudGauaAfugaguaaAfuCfauaaasas 249 APP 886921 aucaL96 4 c 5 .1 AD- ususua(Uhd)gAfuUfUfAfcucauu 249 VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 249 APP 886922 aucaL96 6 asc 7 .1 AD- ususua(Uhd)gAfuUfUfAfcucauu 249 VPudGauaAfugaguaaAfuCfauaaasas 249 APP 886923 aucaL96 8 c 9 .1 AD- ususuaug(Ahd)uUfUfAfcucauua 250 VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 250 APP 886924 ucaL96 0 asc 1 .1 AD- ususuaug(Ahd)uUfUfAfcucauua 250 VPudGauaAfugaguaaAfuCfauaaasas 250 APP 886925 ucaL96 2 c 3 .1 AD- ususuaug(Ahd)uUfuAfcucauuau 250 VPudGauadAugagudAaAfuCfauaaasa 250 APP 886926 caL96 4 sc 5 .1 AD- ususuaug(Ahd)uUfudAcucauuau 250 VPudGauadAugagudAaAfuCfauaaasa 250 APP 886927 caL96 6 sc 7 .1 AD- ususuaug(Ahd)uUfudAcucauuau 250 VPudGauadAugagudAaAfudCauaaasa 250 APP 886928 caL96 8 sc 9 .1 AD- ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauu 251 VPusGfsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 251 APP 886929 aucaL96 0 usg 1 .1 APP AD- ususuaugAfuUfUfAfcuc(Ahd)uu 251 VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 251
Nome SEQ SEQ Alv do Sequência Sensora (5’ a 3’) ID Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID o Duplex NO NO 886930 aucaL96 2 usg 3 .1 AD- ususuaug(Ahd)uUfUfAfcucauua 251 VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaas 251 APP 886931 ucaL96 4 usg 5 .1
[912] Tabela 14 chave: U=uridina-3’-fosfato, u=2’-O-metiluridina-3’-fosfato, us=2’-O-metiluridina-3’- fosforotioato, a=2’-O-metiladenosina-3’-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2’-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2’- fluoroguanosina-3’-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3’-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3’-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3’- fosfato, cs=2’-O-metilcitidina-3`-fosfato, VP=fosfato de vinila 5', (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2’- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato. TABELA 15. SEQUÊNCIAS NÃO MODIFICADAS DE APP ADICIONAIS. Nome do Sequência Sensora (5’ a SEQ ID Sequência Antissenso (5’ a SEQ ID Duplex 3’) NO 3’) NO AD-886823.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2516 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2517 AD-886824.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2518 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2519 AD-886825.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2520 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2521 AD-886826.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2522 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2523 AD-886827.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2524 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2525 AD-886828.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2526 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2527 AD-886829.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2528 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2529 AD-886830.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2530 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2531 AD-886831.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2532 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2533
Nome do Sequência Sensora (5’ a SEQ ID Sequência Antissenso (5’ a SEQ ID Duplex 3’) NO 3’) NO AD-886832.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2534 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2535 AD-886833.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2536 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2537 AD-886834.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2538 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2539 AD-886836.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2540 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2541 AD-886837.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2542 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2543 AD-886838.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2544 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2545 AD-886839.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2546 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2547 AD-886839.2 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2548 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2549 AD-886840.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2550 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2551 AD-886841.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2552 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2553 AD-886842.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2554 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2555 AD-886843.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2556 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2557 AD-886844.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2558 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2559 AD-886845.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2560 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2561 AD-886846.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2562 UGAGAAUCUAUUCAUGCACUAGU 2563 AD-886847.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2564 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2565 AD-886848.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2566 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2567 AD-886849.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2568 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2569 AD-886850.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2570 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2571 AD-886851.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2572 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2573 AD-886852.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2574 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2575 AD-886853.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2576 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2577 AD-886854.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2578 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2579 AD-886855.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2580 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2581 AD-886856.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2582 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2583 AD-886857.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2584 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2585 AD-886858.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2586 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2587 AD-886859.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2588 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2589 AD-886860.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2590 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2591 AD-886861.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2592 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAUG 2593 AD-886862.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2594 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAUG 2595 AD-886863.1 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2596 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAUG 2597 AD-886864.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2598 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2599 AD-886865.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2600 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2601 AD-886866.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2602 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2603
Nome do Sequência Sensora (5’ a SEQ ID Sequência Antissenso (5’ a SEQ ID Duplex 3’) NO 3’) NO AD-886867.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2604 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2605 AD-886868.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2606 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2607 AD-886869.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2608 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2609 AD-886870.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2610 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2611 AD-886871.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2612 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2613 AD-886872.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2614 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2615 AD-886873.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2616 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2617 AD-886874.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2618 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2619 AD-886875.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2620 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2621 AD-886876.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2622 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2623 AD-886877.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2624 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2625 AD-886878.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2626 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2627 AD-886879.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2628 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2629 AD-886880.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2630 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2631 AD-886881.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2632 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2633 AD-886882.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2634 UUAGGTTGGAUUUUCGUAGCCGU 2635 AD-886883.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2636 UUAGGTTGGAUUUUCGUAGCCGU 2637 AD-886884.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2638 UUAGGTTGGAUTUUCGUAGCCGU 2639 AD-886885.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2640 UUAGGTTGGAUTUUCGUAGCCGU 2641 AD-886886.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2642 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2643 AD-886887.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2644 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2645 AD-886888.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2646 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2647 AD-886889.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2648 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2649 AD-886890.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2650 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCUG 2651 AD-886891.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2652 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCUG 2653 AD-886892.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2654 UUAGGTTGGAUTUUCGUAGCCUG 2655 AD-886893.1 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2656 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCUG 2657 AD-886894.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2658 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2659 AD-886895.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2660 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2661 AD-886896.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2662 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2663 AD-886897.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2664 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2665 AD-886898.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2666 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2667 AD-886899.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2668 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2669 AD-886900.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2670 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2671 AD-886901.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2672 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2673
Nome do Sequência Sensora (5’ a SEQ ID Sequência Antissenso (5’ a SEQ ID Duplex 3’) NO 3’) NO AD-886902.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2674 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2675 AD-886903.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2676 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2677 AD-886904.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2678 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2679 AD-886905.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2680 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2681 AD-886906.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2682 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2683 AD-886907.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2684 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU 2685 AD-886908.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2686 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU 2687 AD-886909.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2688 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU 2689 AD-886910.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2690 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUUG 2691 AD-886911.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2692 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUUG 2693 AD-886912.1 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2694 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUUG 2695 AD-886913.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2696 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2697 AD-886914.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2698 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2699 AD-886915.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2700 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2701 AD-886916.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2702 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2703 AD-886917.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2704 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2705 AD-886918.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2706 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2707 AD-886919.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2708 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2709 AD-886920.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2710 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2711 AD-886921.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2712 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2713 AD-886922.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2714 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2715 AD-886923.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2716 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2717 AD-886924.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2718 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2719 AD-886925.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2720 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2721 AD-886926.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2722 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2723 AD-886927.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2724 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2725 AD-886928.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2726 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2727 AD-886929.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2728 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAUG 2729 AD-886930.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2730 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAUG 2731 AD-886931.1 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2732 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAUG 2733
TABELA 16A.
SEQUÊNCIAS SENSORAS MODIFICADAS DE APP HUMANA ADICIONAIS E ALVOS.
SEQ SEQ Nome do Sequência-alvo de Alvo Sequência Sensora (5’ a 3’) ID ID Duplex mRNA
NO NO AD- APP gsgscua(Chd)gadAadAuccaaccusasa 2734 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2735 961583 AD- APP asasagag(Chd)aAfaAfcuauucagsasa 2736 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2737 961584 AD- APP asasagag(Chd)adAadAcuauucagsasa 2738 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2739 961585 AD- APP ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauuauscsa 2740 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2741 961586
[913] Tabela 16A chave: U=uridina-3`-fosfato, u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`- fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato, VP=fosfato de vinila 5', (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato. TABELA 16B. SEQUÊNCIAS ANTISSENSO MODIFICADAS DE APP
HUMANA ADICIONAIS E ALVOS Nome
SEQ SEQ do alv Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Sequência-alvo de mRNA ID Duple o
NO NO x AD- VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGuagccsg 274 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCG 274 96158 APP su 2 U 3 3 AD- 274 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUC 274 96158 APP VPuUfcugAfauagudTuUfgCfucuuuscsu 4 U 5 4 AD- APP VPuUfcugdAauagudTuUfgdCucuuuscsu 274 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUC 274
Nome
SEQ SEQ do alv Sequência Antissenso (5’ a 3’) ID Sequência-alvo de mRNA ID Duple o
NO NO x 96158 6 U 7 5 AD- 274 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAU 274 96158 APP VPusGfsauaAfugaguaaAfuCfauaaasusg 8 G 9 6
[914] Tabela 16B chave: U=uridina-3`-fosfato, u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`- fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato , VP=fosfato de vinila 5', (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato.
[915] A Tabela 17 resume os resultados de uma triagem de AAP de multidose em células Be(2) conduzidas em 10 nM, 1 nM ou 0,1 nM. Os dados são expressos como porcentagem de mensagem restante em relação ao controle de não alvejamento de AD-1955. TABELA 17. ESTUDO DE TRIAGEM DE DOSE DE APP EM LINHAS CELULARES DE BE(2)C A 10 NM, 1 NM E 0,1 NM Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738012.1 12,47 3,92 10 nM AD-738013.1 8,78 1,74 10 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738014.1 10,27 3,95 10 nM AD-738015.1 9,84 3,00 10 nM AD-738016.1 11,79 4,10 10 nM AD-738017.1 12,85 2,41 10 nM AD-738018.1 13,22 2,40 10 nM AD-738019.1 14,57 2,64 10 nM AD-738020.1 9,06 2,84 10 nM AD-738021.1 12,95 6,42 10 nM AD-738022.1 10,55 1,29 10 nM AD-738023.1 8,22 1,41 10 nM AD-738024.1 13,51 4,75 10 nM AD-738025.1 48,96 7,46 10 nM AD-738026.1 11,78 2,88 10 nM AD-738027.1 10,71 2,22 10 nM AD-738028.1 18,52 2,12 10 nM AD-738029.1 17,74 4,49 10 nM AD-738030.1 25,60 5,77 10 nM AD-738031.1 28,70 6,14 10 nM AD-738032.1 13,38 9,34 10 nM AD-738033.1 10,13 1,96 10 nM AD-738034.1 15,22 6,91 10 nM AD-738035.1 14,59 5,75 10 nM AD-738036.1 19,64 12,56 10 nM AD-738037.1 21,74 10,22 10 nM AD-738038.1 27,23 3,73 10 nM AD-738039.1 28,08 5,99 10 nM AD-738040.1 60,35 0,96 10 nM AD-738041.1 38,29 15,92 10 nM AD-738042.1 25,54 7,15 10 nM AD-738043.1 12,59 4,84 10 nM AD-738044.1 44,57 13,69 10 nM AD-738045.1 218,56 104,83 10 nM AD-738046.1 263,77 29,64 10 nM AD-738047.1 35,84 3,46 10 nM AD-738048.1 34,43 4,01 10 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-397217.2 70,05 6,00 10 nM AD-738049.1 13,20 6,16 10 nM AD-738050.1 11,02 0,82 10 nM AD-738051.1 40,85 6,01 10 nM AD-738052.1 37,45 14,43 10 nM AD-738053.1 30,69 7,50 10 nM AD-738054.1 62,81 13,33 10 nM AD-738055.1 28,18 9,27 10 nM AD-738056.1 28,91 4,29 10 nM AD-738057.1 24,47 7,91 10 nM AD-738058.1 49,05 8,41 10 nM AD-738059.1 35,32 9,27 10 nM AD-738060.1 25,40 3,87 10 nM AD-738061.1 53,19 2,95 10 nM AD-738062.1 17,28 7,65 10 nM AD-738063.1 33,40 9,94 10 nM AD-738064.1 30,75 4,43 10 nM AD-738065.1 28,34 14,64 10 nM AD-738066.1 92,51 16,17 10 nM AD-738067.1 30,74 7,71 10 nM AD-738068.1 25,12 2,84 10 nM AD-738069.1 59,72 9,34 10 nM AD-738070.1 35,03 9,43 10 nM AD-738071.1 15,79 2,79 10 nM AD-738072.1 63,54 33,06 10 nM AD-738073.1 28,05 3,62 10 nM AD-738074.1 31,74 5,88 10 nM AD-738075.1 174,04 56,95 10 nM AD-738076.1 29,35 8,89 10 nM AD-738077.1 14,69 5,00 10 nM AD-738078.1 15,15 2,61 10 nM AD-738079.1 11,40 3,42 10 nM AD-738080.1 10,80 0,91 10 nM AD-738081.1 36,37 8,31 10 nM AD-738082.1 28,65 4,80 10 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738083.1 9,98 0,75 10 nM AD-738084.1 31,76 4,26 10 nM AD-738085.1 48,74 6,11 10 nM AD-738086.1 60,41 10,30 10 nM AD-738087.1 12,21 2,15 10 nM AD-738088.1 44,49 10,16 10 nM AD-738089.1 31,43 4,82 10 nM AD-738090.1 23,34 5,54 10 nM AD-738091.1 35,28 12,92 10 nM AD-738092.1 89,59 18,72 10 nM AD-738093.1 71,33 16,07 10 nM AD-738094.1 18,69 3,23 10 nM AD-738095.1 30,93 6,90 10 nM AD-738096.1 26,70 5,20 10 nM AD-738097.1 65,74 9,99 10 nM AD-738098.1 16,18 4,17 10 nM AD-738099.1 48,95 9,69 10 nM AD-738100.1 67,26 11,31 10 nM AD-738012.1 17,40 2,53 1 nM AD-738013.1 15,51 2,70 1 nM AD-738014.1 23,54 9,95 1 nM AD-738015.1 21,35 2,38 1 nM AD-738016.1 20,20 1,90 1 nM AD-738017.1 15,67 2,60 1 nM AD-738018.1 17,00 0,80 1 nM AD-738019.1 17,58 7,97 1 nM AD-738020.1 15,47 3,64 1 nM AD-738021.1 14,81 4,24 1 nM AD-738022.1 13,71 2,86 1 nM AD-738023.1 17,33 4,91 1 nM AD-738024.1 20,64 7,04 1 nM AD-738025.1 95,81 28,98 1 nM AD-738026.1 28,29 10,28 1 nM AD-738027.1 15,94 3,44 1 nM AD-738028.1 25,76 10,62 1 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738029.1 18,83 6,50 1 nM AD-738030.1 30,24 7,29 1 nM AD-738031.1 30,77 6,54 1 nM AD-738032.1 25,98 6,57 1 nM AD-738033.1 31,28 8,14 1 nM AD-738034.1 25,06 6,27 1 nM AD-738035.1 21,67 1,11 1 nM AD-738036.1 32,29 11,81 1 nM AD-738037.1 30,77 5,48 1 nM AD-738038.1 19,03 1,00 1 nM AD-738039.1 20,25 5,55 1 nM AD-738040.1 51,87 7,09 1 nM AD-738041.1 35,67 8,23 1 nM AD-738042.1 33,70 9,34 1 nM AD-738043.1 19,76 3,35 1 nM AD-738044.1 43,40 9,46 1 nM AD-738045.1 97,99 13,43 1 nM AD-738046.1 112,65 25,09 1 nM AD-738047.1 37,50 4,18 1 nM AD-738048.1 23,67 0,94 1 nM AD-397217.2 60,11 7,67 1 nM AD-738049.1 20,00 1,41 1 nM AD-738050.1 36,49 7,06 1 nM AD-738051.1 27,03 6,08 1 nM AD-738052.1 31,82 7,17 1 nM AD-738053.1 14,96 2,91 1 nM AD-738054.1 32,00 5,62 1 nM AD-738055.1 27,57 7,73 1 nM AD-738056.1 15,16 0,70 1 nM AD-738057.1 14,83 3,32 1 nM AD-738058.1 33,09 9,91 1 nM AD-738059.1 26,76 5,77 1 nM AD-738060.1 11,79 2,64 1 nM AD-738061.1 28,49 1,35 1 nM AD-738062.1 15,89 6,49 1 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738063.1 25,01 8,31 1 nM AD-738064.1 16,91 2,56 1 nM AD-738065.1 15,45 2,85 1 nM AD-738066.1 51,85 8,48 1 nM AD-738067.1 20,90 4,96 1 nM AD-738068.1 15,82 2,70 1 nM AD-738069.1 81,26 2,84 1 nM AD-738070.1 59,48 11,42 1 nM AD-738071.1 15,12 3,89 1 nM AD-738072.1 40,16 7,78 1 nM AD-738073.1 18,46 5,20 1 nM AD-738074.1 27,74 1,97 1 nM AD-738075.1 83,53 9,94 1 nM AD-738076.1 50,62 3,51 1 nM AD-738077.1 21,52 4,49 1 nM AD-738078.1 24,49 10,05 1 nM AD-738079.1 8,66 2,69 1 nM AD-738080.1 28,88 1,12 1 nM AD-738081.1 77,35 10,22 1 nM AD-738082.1 48,10 10,63 1 nM AD-738083.1 23,74 4,60 1 nM AD-738084.1 100,84 2,83 1 nM AD-738085.1 101,30 4,73 1 nM AD-738086.1 60,29 24,33 1 nM AD-738087.1 9,71 3,71 1 nM AD-738088.1 79,16 7,79 1 nM AD-738089.1 35,37 8,78 1 nM AD-738090.1 37,16 13,37 1 nM AD-738091.1 49,56 10,83 1 nM AD-738092.1 79,50 10,15 1 nM AD-738093.1 96,42 16,26 1 nM AD-738094.1 41,63 5,90 1 nM AD-738095.1 45,03 8,10 1 nM AD-738096.1 44,52 11,55 1 nM AD-738097.1 78,88 13,42 1 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738098.1 28,84 8,43 1 nM AD-738099.1 68,10 16,73 1 nM AD-738100.1 84,53 5,73 1 nM AD-738012.1 35,64 12,05 0.1 nM AD-738013.1 29,76 5,05 0.1 nM AD-738014.1 47,17 13,55 0.1 nM AD-738015.1 35,51 13,38 0.1 nM AD-738016.1 38,17 9,76 0.1 nM AD-738017.1 30,03 7,04 0.1 nM AD-738018.1 20,38 4,76 0.1 nM AD-738019.1 30,10 4,89 0.1 nM AD-738020.1 44,67 8,48 0.1 nM AD-738021.1 30,05 5,88 0.1 nM AD-738022.1 30,24 5,96 0.1 nM AD-738023.1 25,74 7,75 0.1 nM AD-738024.1 31,43 10,51 0.1 nM AD-738025.1 112,57 14,24 0.1 nM AD-738026.1 54,28 6,70 0.1 nM AD-738027.1 26,02 4,95 0.1 nM AD-738028.1 35,82 10,41 0.1 nM AD-738029.1 40,29 3,76 0.1 nM AD-738030.1 51,38 24,04 0.1 nM AD-738031.1 40,78 11,79 0.1 nM AD-738032.1 47,97 6,74 0.1 nM AD-738033.1 38,57 7,04 0.1 nM AD-738034.1 46,53 13,21 0.1 nM AD-738035.1 43,04 12,39 0.1 nM AD-738036.1 43,08 3,41 0.1 nM AD-738037.1 87,09 39,32 0.1 nM AD-738038.1 64,97 3,06 0.1 nM AD-738039.1 74,15 30,96 0.1 nM AD-738040.1 159,41 39,34 0.1 nM AD-738041.1 108,29 36,98 0.1 nM AD-738042.1 69,15 28,46 0.1 nM AD-738043.1 45,00 17,66 0.1 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738044.1 88,04 17,84 0.1 nM AD-738045.1 238,11 15,24 0.1 nM AD-738046.1 259,68 3,44 0.1 nM AD-738047.1 136,91 44,65 0.1 nM AD-738048.1 131,72 13,39 0.1 nM AD-397217.2 222,75 51,71 0.1 nM AD-738049.1 65,58 6,12 0.1 nM AD-738050.1 63,97 11,64 0.1 nM AD-738051.1 89,72 27,54 0.1 nM AD-738052.1 140,07 36,18 0.1 nM AD-738053.1 77,09 14,75 0.1 nM AD-738054.1 205,91 46,37 0.1 nM AD-738055.1 197,02 44,70 0.1 nM AD-738056.1 85,09 14,19 0.1 nM AD-738057.1 87,72 18,23 0.1 nM AD-738058.1 164,40 24,71 0.1 nM AD-738059.1 129,01 9,61 0.1 nM AD-738060.1 63,48 35,21 0.1 nM AD-738061.1 191,48 13,85 0.1 nM AD-738062.1 108,14 8,70 0.1 nM AD-738063.1 100,27 16,53 0.1 nM AD-738064.1 46,78 12,88 0.1 nM AD-738065.1 84,72 11,97 0.1 nM AD-738066.1 218,00 48,39 0.1 nM AD-738067.1 123,65 34,39 0.1 nM AD-738068.1 90,93 17,12 0.1 nM AD-738069.1 300,08 12,73 0.1 nM AD-738070.1 238,24 7,61 0.1 nM AD-738071.1 46,50 1,25 0.1 nM AD-738072.1 58,01 21,95 0.1 nM AD-738073.1 68,05 19,98 0.1 nM AD-738074.1 134,77 30,73 0.1 nM AD-738075.1 328,84 50,48 0.1 nM AD-738076.1 237,89 30,07 0.1 nM AD-738077.1 108,45 14,70 0.1 nM
Média de Mensagem Desvio Duplex Dose Unidade da Dose restante (%) padrão AD-738078.1 127,49 44,03 0.1 nM AD-738079.1 46,06 9,44 0.1 nM AD-738080.1 57,45 19,09 0.1 nM AD-738081.1 147,89 27,56 0.1 nM AD-738082.1 169,52 28,01 0.1 nM AD-738083.1 106,74 6,93 0.1 nM AD-738084.1 242,62 60,78 0.1 nM AD-738085.1 295,62 32,59 0.1 nM AD-738086.1 221,56 21,04 0.1 nM AD-738087.1 82,58 14,78 0.1 nM AD-738088.1 88,52 10,41 0.1 nM AD-738089.1 84,36 20,12 0.1 nM AD-738090.1 120,67 19,87 0.1 nM AD-738091.1 180,61 14,25 0.1 nM AD-738092.1 240,22 16,63 0.1 nM AD-738093.1 303,63 8,82 0.1 nM AD-738094.1 146,42 25,16 0.1 nM AD-738095.1 124,16 57,91 0.1 nM AD-738096.1 56,53 8,58 0.1 nM AD-738097.1 116,46 38,97 0.1 nM AD-738098.1 59,28 19,71 0.1 nM AD-738099.1 149,49 42,85 0.1 nM AD-738100.1 89,06 17,49 0.1 nM
[916] A Tabela 18 resume os resultados de uma triagem de APP multidose em células Neuro2A conduzida a 10 nM, 1 nM ou 0,1 nM. Os dados são expressos como porcentagem de mensagem restante em relação ao controle de não segmentação de AD-1955. TABELA 18. ESTUDO DE TRIAGEM DE DOSE DE APP EM LINHAS CELULARES DE NEURO2A A 10 NM, 1 NM E 0,1 NM. Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738012.1 0,11 0,07 10 nM AD-738013.1 0,20 0,06 10 nM AD-738014.1 1,12 0,42 10 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738015.1 1,72 1,20 10 nM AD-738016.1 0,98 0,31 10 nM AD-738017.1 0,32 0,24 10 nM AD-738018.1 0,14 0,07 10 nM AD-738019.1 0,63 0,25 10 nM AD-738020.1 0,11 0,08 10 nM AD-738021.1 1,20 0,52 10 nM AD-738022.1 1,86 0,95 10 nM AD-738023.1 1,18 0,53 10 nM AD-738024.1 3,13 1,81 10 nM AD-738025.1 11,77 3,21 10 nM AD-738026.1 0,81 0,44 10 nM AD-738027.1 0,23 0,10 10 nM AD-738028.1 0,15 0,15 10 nM AD-738029.1 1,48 0,93 10 nM AD-738030.1 1,45 0,99 10 nM AD-738031.1 2,72 0,68 10 nM AD-738032.1 3,04 0,84 10 nM AD-738033.1 2,71 0,98 10 nM AD-738034.1 4,98 3,47 10 nM AD-738035.1 1,51 0,77 10 nM AD-738036.1 1,18 1,21 10 nM AD-738037.1 2,87 1,38 10 nM AD-738038.1 1,52 0,43 10 nM AD-738039.1 5,43 2,42 10 nM AD-738040.1 12,15 3,03 10 nM AD-738041.1 4,14 2,38 10 nM AD-738042.1 4,41 2,78 10 nM AD-738043.1 0,67 0,51 10 nM AD-738044.1 1,21 0,74 10 nM AD-738045.1 21,32 2,05 10 nM AD-738046.1 8,41 3,63 10 nM AD-738047.1 1,92 1,96 10 nM AD-738048.1 0,83 0,24 10 nM AD-397217.2 14,29 4,68 10 nM AD-738049.1 4,40 2,05 10 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738050.1 1,46 0,17 10 nM AD-738051.1 1,48 1,43 10 nM AD-738052.1 4,60 0,68 10 nM AD-738053.1 3,92 1,90 10 nM AD-738054.1 6,95 1,84 10 nM AD-738055.1 2,82 0,53 10 nM AD-738056.1 4,83 3,07 10 nM AD-738057.1 4,79 3,01 10 nM AD-738058.1 12,43 4,84 10 nM AD-738059.1 5,66 1,40 10 nM AD-738060.1 4,24 0,94 10 nM AD-738061.1 10,85 2,10 10 nM AD-738062.1 1,34 0,51 10 nM AD-738063.1 31,40 6,43 10 nM AD-738064.1 0,77 0,71 10 nM AD-738065.1 6,43 1,80 10 nM AD-738066.1 30,73 12,64 10 nM AD-738067.1 3,79 0,76 10 nM AD-738068.1 4,60 1,19 10 nM AD-738069.1 36,14 12,51 10 nM AD-738070.1 34,99 13,86 10 nM AD-738071.1 1,84 1,71 10 nM AD-738072.1 1,29 1,22 10 nM AD-738073.1 0,65 0,14 10 nM AD-738074.1 1,28 0,51 10 nM AD-738075.1 75,00 22,72 10 nM AD-738076.1 19,31 2,56 10 nM AD-738077.1 5,21 1,66 10 nM AD-738078.1 7,24 5,26 10 nM AD-738079.1 1,64 0,72 10 nM AD-738080.1 2,17 1,31 10 nM AD-738081.1 13,03 2,64 10 nM AD-738082.1 3,37 1,05 10 nM AD-738083.1 5,36 2,87 10 nM AD-738084.1 22,04 7,85 10 nM AD-738085.1 6,81 1,80 10 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738086.1 35,05 12,18 10 nM AD-738087.1 0,14 0,10 10 nM AD-738088.1 34,43 18,92 10 nM AD-738089.1 11,16 1,48 10 nM AD-738090.1 4,55 0,77 10 nM AD-738091.1 9,04 2,02 10 nM AD-738092.1 48,12 5,51 10 nM AD-738093.1 47,41 11,32 10 nM AD-738094.1 25,25 3,17 10 nM AD-738095.1 8,80 1,79 10 nM AD-738096.1 4,36 5,22 10 nM AD-738097.1 28,80 6,91 10 nM AD-738098.1 10,91 3,70 10 nM AD-738099.1 25,30 5,42 10 nM AD-738100.1 43,27 10,46 10 nM AD-738012.1 3,70 3,79 1 nM AD-738013.1 6,87 3,98 1 nM AD-738014.1 16,20 4,78 1 nM AD-738015.1 15,97 3,04 1 nM AD-738016.1 11,33 4,08 1 nM AD-738017.1 3,91 2,43 1 nM AD-738018.1 9,79 5,33 1 nM AD-738019.1 5,90 4,65 1 nM AD-738020.1 4,29 7,33 1 nM AD-738021.1 11,55 7,48 1 nM AD-738022.1 12,06 4,21 1 nM AD-738023.1 10,50 4,50 1 nM AD-738024.1 12,71 3,60 1 nM AD-738025.1 42,61 8,91 1 nM AD-738026.1 7,13 2,81 1 nM AD-738027.1 1,14 0,44 1 nM AD-738028.1 2,99 4,01 1 nM AD-738029.1 8,81 4,91 1 nM AD-738030.1 15,88 4,68 1 nM AD-738031.1 14,42 9,04 1 nM AD-738032.1 12,11 3,28 1 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738033.1 17,47 13,61 1 nM AD-738034.1 18,58 6,98 1 nM AD-738035.1 7,64 6,58 1 nM AD-738036.1 2,84 2,90 1 nM AD-738037.1 11,17 3,62 1 nM AD-738038.1 10,23 4,82 1 nM AD-738039.1 9,61 2,76 1 nM AD-738040.1 54,47 14,10 1 nM AD-738041.1 15,86 6,31 1 nM AD-738042.1 15,96 6,61 1 nM AD-738043.1 2,26 2,61 1 nM AD-738044.1 4,54 4,76 1 nM AD-738045.1 25,51 7,28 1 nM AD-738046.1 30,32 10,02 1 nM AD-738047.1 16,25 7,68 1 nM AD-738048.1 9,07 3,25 1 nM AD-397217.2 48,16 12,70 1 nM AD-738049.1 7,97 3,33 1 nM AD-738050.1 5,60 4,81 1 nM AD-738051.1 1,49 1,05 1 nM AD-738052.1 10,13 2,72 1 nM AD-738053.1 10,82 4,44 1 nM AD-738054.1 21,52 8,71 1 nM AD-738055.1 12,40 3,31 1 nM AD-738056.1 5,93 4,14 1 nM AD-738057.1 7,63 2,80 1 nM AD-738058.1 18,21 4,26 1 nM AD-738059.1 14,39 6,00 1 nM AD-738060.1 6,71 2,99 1 nM AD-738061.1 13,63 3,65 1 nM AD-738062.1 6,08 3,37 1 nM AD-738063.1 9,63 8,05 1 nM AD-738064.1 6,51 4,83 1 nM AD-738065.1 9,97 1,82 1 nM AD-738066.1 50,95 5,44 1 nM AD-738067.1 9,69 2,74 1 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738068.1 9,39 1,51 1 nM AD-738069.1 43,67 8,07 1 nM AD-738070.1 37,85 4,96 1 nM AD-738071.1 2,81 2,93 1 nM AD-738072.1 10,65 9,82 1 nM AD-738073.1 5,64 2,45 1 nM AD-738074.1 10,00 4,11 1 nM AD-738075.1 78,16 11,76 1 nM AD-738076.1 44,11 8,21 1 nM AD-738077.1 11,42 0,98 1 nM AD-738078.1 7,65 1,23 1 nM AD-738079.1 1,78 2,66 1 nM AD-738080.1 7,03 8,36 1 nM AD-738081.1 27,43 6,11 1 nM AD-738082.1 21,57 4,04 1 nM AD-738083.1 10,77 3,72 1 nM AD-738084.1 76,60 10,91 1 nM AD-738085.1 36,65 7,82 1 nM AD-738086.1 26,34 11,70 1 nM AD-738087.1 0,56 0,52 1 nM AD-738088.1 52,50 10,17 1 nM AD-738089.1 12,77 1,25 1 nM AD-738090.1 12,92 5,28 1 nM AD-738091.1 20,70 1,73 1 nM AD-738092.1 58,85 6,24 1 nM AD-738093.1 84,82 9,95 1 nM AD-738094.1 59,17 6,38 1 nM AD-738095.1 12,86 8,99 1 nM AD-738096.1 10,61 4,77 1 nM AD-738097.1 35,98 1,81 1 nM AD-738098.1 14,76 3,12 1 nM AD-738099.1 37,99 2,57 1 nM AD-738100.1 46,62 7,08 1 nM AD-738012.1 11,95 6,41 0.1 nM AD-738013.1 11,70 2,86 0.1 nM AD-738014.1 33,48 9,61 0.1 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738015.1 25,02 5,00 0.1 nM AD-738016.1 22,29 4,67 0.1 nM AD-738017.1 21,12 5,92 0.1 nM AD-738018.1 15,82 5,90 0.1 nM AD-738019.1 22,54 18,17 0.1 nM AD-738020.1 12,05 9,08 0.1 nM AD-738021.1 19,21 0,85 0.1 nM AD-738022.1 24,55 5,38 0.1 nM AD-738023.1 17,43 5,05 0.1 nM AD-738024.1 24,48 1,96 0.1 nM AD-738025.1 72,34 16,04 0.1 nM AD-738026.1 44,09 2,91 0.1 nM AD-738027.1 16,46 9,70 0.1 nM AD-738028.1 13,92 9,68 0.1 nM AD-738029.1 25,75 5,87 0.1 nM AD-738030.1 42,80 8,11 0.1 nM AD-738031.1 43,85 2,58 0.1 nM AD-738032.1 29,64 6,11 0.1 nM AD-738033.1 42,40 1,69 0.1 nM AD-738034.1 49,71 3,53 0.1 nM AD-738035.1 30,30 20,42 0.1 nM AD-738036.1 12,98 4,90 0.1 nM AD-738037.1 13,01 5,34 0.1 nM AD-738038.1 15,19 8,17 0.1 nM AD-738039.1 18,24 10,33 0.1 nM AD-738040.1 60,24 13,10 0.1 nM AD-738041.1 26,49 7,47 0.1 nM AD-738042.1 18,54 6,11 0.1 nM AD-738043.1 5,91 5,08 0.1 nM AD-738044.1 14,74 6,15 0.1 nM AD-738045.1 55,58 16,72 0.1 nM AD-738046.1 68,30 11,74 0.1 nM AD-738047.1 40,80 6,70 0.1 nM AD-738048.1 32,28 7,47 0.1 nM AD-397217.2 76,28 11,27 0.1 nM AD-738049.1 22,10 8,60 0.1 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738050.1 8,56 5,26 0.1 nM AD-738051.1 19,62 9,00 0.1 nM AD-738052.1 29,60 6,17 0.1 nM AD-738053.1 19,82 6,73 0.1 nM AD-738054.1 48,02 6,33 0.1 nM AD-738055.1 26,00 8,90 0.1 nM AD-738056.1 34,85 7,55 0.1 nM AD-738057.1 30,60 9,35 0.1 nM AD-738058.1 49,45 11,76 0.1 nM AD-738059.1 40,24 4,74 0.1 nM AD-738060.1 37,94 10,19 0.1 nM AD-738061.1 49,79 3,08 0.1 nM AD-738062.1 28,19 1,51 0.1 nM AD-738063.1 30,80 15,24 0.1 nM AD-738064.1 25,32 2,67 0.1 nM AD-738065.1 34,43 9,76 0.1 nM AD-738066.1 87,77 14,39 0.1 nM AD-738067.1 36,47 9,15 0.1 nM AD-738068.1 28,08 4,14 0.1 nM AD-738069.1 97,43 7,31 0.1 nM AD-738070.1 82,37 8,24 0.1 nM AD-738071.1 27,61 7,94 0.1 nM AD-738072.1 37,34 2,31 0.1 nM AD-738073.1 25,85 9,17 0.1 nM AD-738074.1 41,19 13,50 0.1 nM AD-738075.1 93,48 11,50 0.1 nM AD-738076.1 66,05 10,10 0.1 nM AD-738077.1 32,71 5,69 0.1 nM AD-738078.1 35,64 5,42 0.1 nM AD-738079.1 20,48 3,52 0.1 nM AD-738080.1 36,41 7,72 0.1 nM AD-738081.1 65,34 19,91 0.1 nM AD-738082.1 53,82 8,31 0.1 nM AD-738083.1 30,04 5,11 0.1 nM AD-738084.1 88,32 9,40 0.1 nM AD-738085.1 78,53 7,08 0.1 nM
Duplex Média Desvio Padrão Dose Unidade da Dose AD-738086.1 82,59 7,90 0.1 nM AD-738087.1 13,94 6,27 0.1 nM AD-738088.1 73,47 18,72 0.1 nM AD-738089.1 48,21 8,12 0.1 nM AD-738090.1 43,23 12,93 0.1 nM AD-738091.1 52,45 4,67 0.1 nM AD-738092.1 75,75 31,47 0.1 nM AD-738093.1 88,99 10,31 0.1 nM AD-738094.1 82,41 6,94 0.1 nM AD-738095.1 51,05 7,29 0.1 nM AD-738096.1 31,49 12,31 0.1 nM AD-738097.1 64,39 13,12 0.1 nM AD-738098.1 33,73 10,09 0.1 nM AD-738099.1 69,09 9,27 0.1 nM AD-738100.1 75,77 15,74 0.1 nM EXAMPLE 6. TRIAGEM DE APP IN VIVO DE SEQUÊNCIAS COM
SEMENTES RICAS EM AU
[917] A triagem in vivo foi realizada em camundongos C57BL/6 para testar oligonucleotídeos com sementes ricas em AU. Um resumo do desenho do estudo é apresentado na Tabela 19. Conforme mostrado na Tabela 20A, os seguintes oligonucleotídeos com sementes ricas em AU foram testados: AD-
506935.2, AD-507065.2, AD-507159.2, AD-507538.2, AD-507624.2, AD -507724.2, AD-507725.2, AD-507789.2, AD-507874.2, AD-
507928.2, e AD-507949.2. Tabela 20A enumera as sequências de oligonucleotídeos de sensor, antissenso e alvo para cada um desses oligonucleotídeos ricos em AU. O oligonucleotídeo AD-
392927.2 (química GNA7 C16) de RLD592 foi usado como uma sequência de controle positiva. As estruturas dos oligonucleotídeos ricos em AU são mostradas nas Figuras 14A e 14B. Além disso, cada um dos oligonucleotídeos com sementes ricas em AU foi testado quanto à reatividade cruzada em humanos
(por exemplo, ensaio por meio da sequência NM_000484), macaco cinomolgo (ensaio por meio da sequência XM_005548883), camundongo (ensaio por meio de a sequência NM_001198823), rato (analisado por meio da sequência NM_019288), e cachorro (analisado por meio da sequência NM_001293279), e esses dados estão resumidos na Tabela 20B.
TABELA 19. PROJETO DO ESTUDO Visão rep in vitro 646 APP NM_201414.2 Geral Alvo hsAPP Triagem in vivo de sequências com Meta sementes ricas em AU AAV Nome AAV8.HsAPP-CDS3TRNC VCAV–04731 Dose 2E+11 Método de IV (retro-orbital) injeção Método de siRNA Subcutâneo injeção Dose 3 mg/kg Amostra Fígado Dias de coleta D14 Animais Sexo fêmea Cepa C57BL/6 Idade (na 6 a 8 semanas chegada) Fornecedor Charles River Nº do Duplex 12* n = 3 Total de 45 animais Método de Análise RT-qPCR análise
Visão rep in vitro 646 APP NM_201414.2 Geral Sonda Taqman APP: Hs00169098_m1 (FAM) Applied Biosystems 4351309 (VIC) GAPDH de camundongo *AD-392927.2 de RLD592 foi incluído Misc. Controles como controle positivo TABELA 20A. DUPLEX DE HSAPP E SEQUÊNCIAS-ALVO PARA CONTROLE DE C16 GNA7 E CANDIDATOS RICOS EM AU. Quím Nome SE SE SE Sequência-alvo ica do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Q de mRNA (5’ a (Alv Dupl a 3’) ID (5’ a 3’) ID ID 3’) o) ex NO NO NO GNA7 AD- C16 usasgug(Chd)AfuGfAfA 27 asGfsagaa(Tgn)cuauuc 27 n/ 3929 n/a (APP fuagauucucuL96 50 AfuGfcacuasgsu 51 a
27.2 ) seme nte rica AD- asasagagCfaAfAfAfcua 27 asUfscugAfaUfAfguuuU 27 AGAAAGAGCAAAAC 27 em 5069 uucagauL96 52 fgCfucuuuscsu 53 UAUUCAGAU 54 AU 35.2 (APP ) seme nte rica AD- ususggccAfaCfAfUfgau 27 asUfscacUfaAfUfcaugU 27 UCUUGGCCAACAUG 27 em 5070 uagugauL96 55 fuGfgccaasgsa 56 AUUAGUGAA 57 AU 65.2 (APP ) seme nte rica AD- uscsugggUfuGfAfCfaaa 27 asUfsugaUfaUfUfugucA 27 GUUCUGGGUUGACA 27 em 5071 uaucaauL96 58 faCfccagasasc 59 AAUAUCAAG 60 AU 59.2 (APP ) seme nte rica AD- ususuaugAfuUfUfAfcuc 27 asGfsauaAfuGfAfguaaA 27 GUUUUAUGAUUUAC 27 em 5075 auuaucuL96 61 fuCfauaaasasc 62 UCAUUAUCG 63 AU 38.2 (APP ) seme AD- asusgccuGfaAfCfUfuga 27 asAfsuuaAfuUfCfaaguU 27 AGAUGCCUGAACUU 27 nte 5076 auuaauuL96 64 fcAfggcauscsu 65 GAAUUAAUC 66
Quím Nome SE SE SE Sequência-alvo ica do Sequência Sensora (5’ Q Sequência Antissenso Q Q de mRNA (5’ a (Alv Dupl a 3’) ID (5’ a 3’) ID ID 3’) o) ex NO NO NO rica 24.2 em
AU (APP ) seme nte rica AD- asgsaugcCfuGfAfAfcuu 27 asUfsaauUfcAfAfguucA 27 GUAGAUGCCUGAAC 27 em 5077 gaauuauL96 67 fgGfcaucusasc 68 UUGAAUUAA 69 AU 24.2 (APP ) seme nte rica AD- gscscugaAfcUfUfGfaau 27 asGfsgauUfaAfUfucaaG 27 AUGCCUGAACUUGA 27 em 5077 uaauccuL96 70 fuUfcaggcsasu 71 AUUAAUCCA 72 AU 25.2 (APP ) seme nte rica AD- gsusgguuUfgUfGfAfccc 27 asUfsuaaUfuGfGfgucaC 27 UUGUGGUUUGUGAC 27 em 5077 aauuaauL96 73 faAfaccacsasa 74 CCAAUUAAG 75 AU 89.2 (APP ) seme nte rica AD- csasgaugCfuUfUfAfgag 27 asAfsaauCfuCfUfcuaaA 27 UUCAGAUGCUUUAG 27 em 5078 agauuuuL96 76 fgCfaucugsasa 77 AGAGAUUUU 78 AU 74.2 (APP ) seme nte rica AD- uscsuugcCfuAfAfGfuau 27 asAfsaagGfaAfUfacuuA 27 UCUCUUGCCUAAGU 27 em 5079 uccuuuuL96 79 fgGfcaagasgsa 80 AUUCCUUUC 81 AU 28.2 (APP ) seme nte rica AD- ususgcugCfuUfCfUfgcu 27 asAfsaauAfuAfGfcagaA 27 GAUUGCUGCUUCUG 27 em 5079 auauuuuL96 82 fgCfagcaasusc 83 CUAUAUUUG 84 AU 49.2 (APP )
[918] Tabela 20A chave: U=uridina-3`-fosfato,
u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`- fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato , VP=fosfato de vinila 5’, (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato, e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato.
[919] Os candidatos ricos em AU selecionados foram avaliados quanto à eficácia in vivo em telas de identificação de chumbo para knockdown de APP humana em camundongos AAV. Resumidamente, um vetor AAV abrigando APP Homo sapiens (por exemplo, hsAPP-CDS3TRNC) foi injetado por via intravenosa em camundongos fêmeas C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade, e 14 dias após a administração de AAV um agente de RNAi ou um agente de controle selecionado foi injetado subcutaneamente nos camundongos (n = 3 por grupo a uma dose de 3 mg/kg. Os grupos de triagem estão resumidos na Tabela 21. TABELA 21. GRUPOS DE TRIAGEM PARA CANDIDATOS RICOS EM AU EM CAMUNDONGOS AAV. Data do Nº do Nº do Ponto de Tratamento Dose siRNA grupo animal tempo 8-Mar-19 1 1 PBS N/A D14 8-Mar-19 1 2 PBS N/A D14 8-Mar-19 1 3 PBS N/A D14 8-Mar-19 1 4 PBS N/A D14
Data do Nº do Nº do Ponto de Tratamento Dose siRNA grupo animal tempo 8-Mar-19 1 5 PBS N/A D14 8-Mar-19 2 6 Naïve N/A D14 8-Mar-19 2 7 Naïve N/A D14 8-Mar-19 2 8 Naïve N/A D14 8-Mar-19 2 9 Naïve N/A D14 AD-392927.2 (de 8-Mar-19 3 10 3mg/kg D14 RLD592) AD-392927.2 (de 8-Mar-19 3 11 3mg/kg D14 RLD592) AD-392927.2 (de 8-Mar-19 3 12 3mg/kg D14 RLD592) 8-Mar-19 4 13 AD-506935.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 4 14 AD-506935.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 4 15 AD-506935.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 5 16 AD-507065.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 5 17 AD-507065.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 5 18 AD-507065.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 6 19 AD-507159.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 6 20 AD-507159.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 6 21 AD-507159.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 7 22 AD-507538.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 7 23 AD-507538.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 7 24 AD-507538.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 8 25 AD-507624.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 8 26 AD-507624.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 8 27 AD-507624.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 9 28 AD-507724.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 9 29 AD-507724.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 9 30 AD-507724.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 10 31 AD-507725.2 3mg/kg D14
Data do Nº do Nº do Ponto de Tratamento Dose siRNA grupo animal tempo 8-Mar-19 10 32 AD-507725.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 10 33 AD-507725.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 11 34 AD-507789.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 11 35 AD-507789.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 11 36 AD-507789.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 12 37 AD-507874.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 12 38 AD-507874.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 12 39 AD-507874.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 13 40 AD-507928.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 13 41 AD-507928.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 13 42 AD-507928.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 14 43 AD-507949.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 14 44 AD-507949.2 3mg/kg D14 8-Mar-19 14 45 AD-507949.2 3mg/kg D14
[920] Os camundongos foram sacrificados e seus fígados foram avaliados quanto aos níveis de mRNA de APP 14 dias após a injeção subcutânea de agente de controle de RNAi por qPCR. Conforme mostrado na Tabela 22 e Figura 15, níveis significativos de knockdown de APP humana in vivo no fígado foram observados para a maioria dos agentes de RNAi ricos em AU testados, em comparação com controles PBS e Naïve (somente AAV), com níveis particularmente robustos de knockdown observados para AD-507538.2, AD-507724.2, AD-392927.2 (RLD592), AD-507928.2, AD-506935.2 e AD-507874.2. TABELA 22. RESUMO DOS RESULTADOS DA TRIAGEM PARA CANDIDATOS RICOS EM AU EM CAMUNDONGOS AAV.
Semente rica em AU de hsAPP D14 qPCR de fígado a 3mg/kg % de mensagem de hsAPP restante em relação a PBS Tratamento Média do grupo Desvio padrão PBS 100,00 30,90 Naïve 91,48 6,43 AD-507538.2 24,23 8,73 AD-507724.2 30,90 2,95 AD-392927.2 (RLD592) 32,80 0,92 AD-507928.2 36,31 2,61 AD-506935.2 36,47 5,26 AD-507874.2 40,43 4,99 AD-507789.2 50,24 6,06 AD-507624.2 57,67 4,22 AD-507725.2 68,53 10,04 AD-507159.2 71,49 20,82 AD-507949.2 84,94 2,35 AD-507065.2 91,09 20,17
[921] A Tabela 23 mostra uma comparação de knockdown de mRNA de hsAPP humana in vivo no fígado pelos agentes de RNAi ricos em AU descritos acima a 3 mg/kg em comparação com o knockdown de APP in vitro dos mesmos agentes de RNAi ricos em AU em qualquer um 10 nM ou 0,1 nM em ambas as linhas de células DL e Be(2)C.
[922] Tabela 23. Comparação de knockdown de hsAPP in Vivo versus in Vitro.
RLD 646 RLD 701 (in vitro) % de hsAPP In (dual- (neurônio 3mg/kg DL Be(2)C restante vivo Luc) humano) Dose Dose - Dose Unidade Unidade Unidade Dose -- Unidade -- - -- 10 nM 10 nM 0,1 nM 0,1 nM 10 nM 10 nM 0,1 nM 0,1 nM Duplex Média SD Média SD Média SD Média SD Média SD AD-507538 24,2 8,7 22,5 5,5 106,2 45,3 16,6 3,8 23,3 2,5 AD-507724 30,9 2,9 38,5 9,2 119,8 24,6 21,2 1,9 43,5 9,6 AD-507928 36,3 2,6 10,6 1,8 101,1 23,8 25,1 2,7 39,8 22,1 AD-506935 36,5 5,3 37,4 10,1 75,9 18,4 19,7 3,9 22,3 2,2 AD-507874 40,4 5,0 13,6 10,9 105,7 29,1 21,9 2,4 31,3 13,1 AD-507789 50,2 6,1 34,3 12,0 121,2 30,9 24,0 6,0 38,3 3,6 AD-507624 57,7 4,2 32,7 7,0 116,5 28,6 22,1 1,0 68,0 26,2 AD-507725 68,5 10,0 68,6 13,1 107,8 43,5 31,1 5,4 34,1 9,7 AD-507159 71,5 20,8 56,8 20,2 119,7 42,4 26,2 4,6 42,7 8,6 AD-507949 84,9 2,3 57,1 25,6 99,7 29,8 23,3 3,1 42,9 15,2 AD-507065 91,1 20,2 52,5 11,6 106,1 19,2 25,3 7,2 39,4 5,8 EXEMPLO 7. TRIAGEM DE IN VIVO DE SEQUÊNCIAS
PRINICPAIS PARA ESTUDOS DE RELACIONAMENTO DE ATIVIDADE DE ESTRUTURA
[923] A triagem in vivo foi realizada em camundongos C57BL/6 para conduzir estudos de relação de atividade de estrutura em oligonucleotídeos principais. Um resumo do projeto do estudo é apresentado na Tabela 25. Conforme mostrado na Tabela 26, os seguintes oligonucleotídeos principais foram testados: AD-886823, AD-886839, AD-886845, AD-886853, AD-886858, AD-886864, AD-886873, AD-886877, AD- 886879, AD-886883, AD-886884, AD-886889, AD-886899, AD-886900, AD-886906, AD-886907, AD-886908, AD-886909, AD-886919 , AD- 886928, AD-886930 e AD-886931. A Tabela 26 lista os sentidos e sequências antissenso para cada oligonucleotídeo principal, bem como a sequência-alvo associada para cada oligonucleotídeo principal.
As estruturas dos oligonucleotídeos principais são mostradas na Figura 16A, Figura 16B, Figura 16C e Figura 16D.
TABELA 25. PROJETO DO ESTUDO AAV Nome AAV8.HsAPP-CDS3TRNC VCAV–04731 Dose 2E+11 Método de IV (retro-orbital) injeção Método de siRNA Subcutâneo injeção Dose 3 mg/kg Amostra fígado Dias de coleta D14 Animais Sexo Fêmea Cepa C57BL/6 idade (na 6 a 8 semanas chegada) fornecedor Jackson Lab Nº do duplex 16 AAV Nome AAV8.HsAPP-CDS3TRNC n = 3 Total de animais 72 Método de Análise RT-qPCR análise Applied Biosystems GAPDH de Sonda Taqman camundongo 4351309 APP: Hs00169098_m1 (FAM)
TABELA 26. DUPLEX DE HSAPP E SEQUÊNCIAS-ALVO PARA CANDIDATOS PRINCIPAIS DE SAR.
SEQ SEQ Duplex Filamento Sequência de Oligonucleotídeos ID Sequência-alvo ID NO: NO: AD- Sensor usasgug(Chd)AfuGfAfAfuagauucucaL96 2785 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2829
886823.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusGfsagaa(Tgn)cuauucAfuGfcacuasgsu 2786 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2830 (5’ a 3’) AD- Sensor usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauucucaL96 2787 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2831
886839.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusdGsagaa(Tgn)cuauucAfudGcacuasgsu 2788 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2832 (5’ a 3’) AD- Sensor usasgug(Chd)audGadAuagauucucaL96 2789 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2833
886845.2 (5’ a 3’) Antissenso VPudGagaa(Tgn)cuauUfcAfudGcacuasgsu 2790 UGAGAATCUAUUCAUGCACUAGU 2834 (5’ a 3’) AD- Sensor usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauucucaL96 2791 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2835
886853.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusdGsagdAa(Tgn)cuaudTcAfugcacuasgsu 2792 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2836 (5’ a 3’) AD- Sensor usasgug(Chd)AfudGAfAfuagauucucaL96 2793 UAGUGCAUGAAUAGAUUCUCA 2837
886858.2 (5’ a 3’) Antissenso VPudGagdAa(Tgn)cuaudTcAfudGcacuasgsu 2794 UGAGAATCUAUTCAUGCACUAGU 2838 (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)GfaAfAfAfuccaaccuaaL96 2795 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2839
886864.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcGfuagccsgsu 2796 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2840 (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)gadAadAuccaaccuaaL96 2797 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2841
886873.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGuagccsgsu 2798 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2842 (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)gadAadAuccaaccuaaL96 2799 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2843
886877.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcguagccsgsu 2800 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2844 (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaaccuaaL96 2801 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2845
886879.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfsaggu(Tgn)ggauuuUfcdGuagccsgsu 2802 UUAGGUTGGAUUUUCGUAGCCGU 2846 (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaaccuaaL96 2803 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2847
886883.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfaggdT(Tgn)ggauuuUfcdGuagccsgsu 2804 UUAGGTTGGAUUUUCGUAGCCGU 2848 (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaaccuaaL96 2805 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2849
886884.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfaggdT(Tgn)ggaudTuUfcdGuagccsgsu 2806 UUAGGTTGGAUTUUCGUAGCCGU 2850
SEQ SEQ Duplex Filamento Sequência de Oligonucleotídeos ID Sequência-alvo ID NO: NO: (5’ a 3’) AD- Sensor gsgscua(Chd)gaAfAfAfuccaaccuaaL96 2807 GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 2851
886889.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfagdGu(Tgn)ggaudTuUfcguagccsgsu 2808 UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU 2852 (5’ a 3’) AD- Sensor asasagagCfaAfAfAfcuauu(Chd)agaaL96 2809 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2853
886899.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfscugAfaUfAfguuuUfgCfucuuuscsu 2810 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2854 (5’ a 3’) AD- Sensor asasaga(Ghd)CfaAfAfAfcuauucagaaL96 2811 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2855
886900.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfscugAfauaguuuUfgCfucuuuscsu 2812 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2856 (5’ a 3’) AD- Sensor asasagag(Chd)aAfAfAfcuauucagaaL96 2813 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2857
886906.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfcugAfauaguuuUfgCfucuuuscsu 2814 UUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2858 (5’ a 3’) AD- Sensor asasagag(Chd)aAfaAfcuauucagaaL96 2815 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2859
886907.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfcugAfauagudTuUfgCfucuuuscsu 2816 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU 2860 (5’ a 3’) AD- Sensor asasagag(Chd)adAadAcuauucagaaL96 2817 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2861
886908.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfcugAfauagudTuUfgCfucuuuscsu 2818 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU 2862 (5’ a 3’) AD- Sensor asasagag(Chd)adAadAcuauucagaaL96 2819 AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 2863
886909.2 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfcugdAauagudTuUfgdCucuuuscsu 2820 UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU 2864 (5’ a 3’) AD- Sensor ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauuaucaL96 2821 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2865
886919.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusGfsauaAfugaguaaAfuCfauaaasasc 2822 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2866 (5’ a 3’) AD- Sensor ususuaug(Ahd)uUfudAcucauuaucaL96 2823 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2867
886928.2 (5’ a 3’) Antissenso VPudGauadAugagudAaAfudCauaaasasc 2824 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2868 (5’ a 3’) AD- Sensor ususuaugAfuUfUfAfcuc(Ahd)uuaucaL96 2825 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2869
886930.2 (5’ a 3’) Antissenso VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaasusg 2826 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAUG 2870 (5’ a 3’) AD- Sensor ususuaug(Ahd)uUfUfAfcucauuaucaL96 2827 UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 2871
886931.2 (5’ a 3’)
SEQ SEQ Duplex Filamento Sequência de Oligonucleotídeos ID Sequência-alvo ID NO: NO: Antissenso VPusdGsauaAfugaguaaAfuCfauaaasusg 2828 UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAUG 2872 (5’ a 3’)
[924] Tabela 26 chave: U=uridina-3`-fosfato, u=2`-O-metiluridina-3`-fosfato, us=2`-O-metiluridina-3`- fosforotioato, a=2`-O-metiladenosina-3`-fosfato, A=adenosina- 3`-fosfato, as=2`-O-metiladenosina-3`-fosforotioato, (Ahd)=2'-O-hexadecil-adenosina-3'-fosfato, Gf=2`- fluoroguanosina-3`-fosfato, Uf=2`-fluorouridina-3`-fosfato, Cf=2`-fluorocitidina-3`-fosfato, Af=2`-fluoroadenosina-3`- fosfato, cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosfato , VP=fosfato de vinila 5’, (Agn)=Adenosina-ácido glicolnucleico (GNA), gs=2`- O-metilguanosina-3`-fosforotioato, (Chd)=2'-O-hexadecil- citidina-3'-fosfato, (Tgn)=Timidina-ácido glicolnucleico (GNA) isômero S, (Ghd)=2'-O-hexadecil-guanosina-3'-fosfato, e cs=2`-O-metilcitidina-3`-fosforotioato. Os candidatos selecionados foram avaliados quanto à eficácia in vivo em triagens para knockdown de APP humana em camundongos AAV. Resumidamente, um vetor AAV abrigando APP Homo sapiens (por exemplo, AAV8.HsAPP-CDS3TRNC) foi injetado por via intravenosa em camundongos fêmeas C57BL/6 de 6-8 semanas de idade, e 14 dias após a administração de AAV de um agente de RNAi selecionado ou um controle o agente foi injetado subcutaneamente nos camundongos (n = 3 por grupo) a uma dose de 3 mg/kg. Os camundongos foram sacrificados e seus fígados avaliados quanto aos níveis de APP mRNA 14 dias pós-injeção subcutânea de agente de RNAi ou controle por qPCR. Conforme mostrado na Tabela 28, Figura 17A e Figura 17B, os níveis significativos de knockdown de mRNA de APP humana in vivo no fígado foram observados para a maioria dos agentes de RNAi chumbo testados, em comparação com controles PBS e Naïve (somente AAV), com níveis particularmente robustos de knockdown observado para AD-886864 (progenitor), AD-886873, AD-886879, AD-886883, AD-886884, AD-886889, AD-886899 (progenitor), AD-886900, AD-886906, AD-886907, AD-886919 (progenitor) e AD-886823 (progenitor). As Figuras 18A a 18D são representações esquemáticas dos principais agentes de RNAi classificados pela molécula progenitora: AD-886864 progenitor (Figura 18A), AD-886899 progenitor (Figura 18B), AD-886919 progenitor (Figura 18 C) e AD-886823 progenitor (Figura 18D), respectivamente.
TABELA 28. RESUMO DOS RESULTADOS DE TRIAGEM IN VIVO PARA CANDIDATOS PRINCIPAIS EM CAMUNDONGOS AAV.
D14 qPCR de fígado SC a 3mg/kg Tratamento % de mensagem restante Desvio Média do grupo padrão PBS 100,00 15,26 naïve (AAV-somente) 104,01 16,49 AD-886864 29,55 0,93 (progenitor) AD-886873 27,48 0,84 AD-886877 33,34 13,46 AD-886879 26,68 2,52 AD-886883 21,74 2,25 AD-886884 28,51 8,66 AD-886889 21,77 1,58 AD-886899 27,17 7,52 (progenitor)
D14 qPCR de fígado SC a 3mg/kg AD-886900 20,80 5,81 AD-886906 19,35 5,97 AD-886907 19,12 3,16 AD-886908 30,28 6,67 AD-886909 34,56 5,55 AD-886919 24,16 6,71 (progenitor) AD-886928 40,47 5,03 AD-886930 32,87 6,63 AD-886931 38,82 4,51 AD-886823 27,81 3,36 (progenitor) AD-886853 43,59 9,18 AD-886858 61,16 2,23 AD-886839 60,35 13,85 AD-886845 79,73 10,09
[925] A Tabela 29 mostra o knockdown de APP in vitro dos agentes principais descritos acima (por exemplo, Tabela 26) de RNAi em 10 nM ou 0,1 nM em linhas de células Be(2)C. TABELA 29. RESUMO DOS RESULTADOS DE TRIAGEM IN VITRO PARA CANDIDATOS PRINCIPAIS EM CEÉLULAS BE(2)C EM DOSES DE 10 NM E 0,1 NM. Desvio % de mensagem Desvio % de mensagem Duplex padrão restante – padrão de restante-10nM – 10 nM 0,1 nM - 0,1 nM AD-886823.1 7,0 5,4 91,0 25,7 AD-886845.1 13,3 3,2 67,4 7,9 AD-886839.2 10,2 7,7 74,7 39,5
Desvio % de mensagem Desvio % de mensagem Duplex padrão restante – padrão de restante-10nM – 10 nM 0,1 nM - 0,1 nM AD-886853.1 6,5 3,9 44,9 7,4 AD-886858.1 11,4 2,4 61,4 12,5 AD-886864.1 11,5 3,9 44,9 7,9 AD-886873.1 12,7 1,9 60,2 14,3 AD-886877.1 11,9 3,0 67,8 5,9 AD-886879.1 9,8 1,7 41,0 5,2 AD-886883.1 8,5 2,1 29,5 12,8 AD-886884.1 8,9 2,4 31,2 11,9 AD-886889.1 9,4 0,6 28,0 14,2 AD-886899.1 9,2 2,6 40,5 12,7 AD-886900.1 6,7 2,1 39,7 21,5 AD-886906.1 10,2 3,0 39,7 9,9 AD-886907.1 9,8 2,7 30,3 1,9 AD-886908.1 10,7 2,6 32,8 10,6 AD-886909.1 7,4 1,4 77,9 16,2 AD-886919.1 5,7 1,4 31,2 4,3 AD-886928.1 9,2 2,4 67,6 7,1 AD-886930.1 6,9 1,7 45,7 10,1 AD-886931.1 3,2 1,2 42,0 16,0 EXEMPLO 8. KNOCKDOWN IN VIVO DE APP POR MEIO DE CONJUGADOS DE SIRNA C-16 EM PRIMATAS NÃO HUMANOS
[926] Devido à eficácia do conjugado de siRNA AD-454844, estudos de relação estrutura/atividade foram realizados em AD-454844, e 5 novos compostos C16 foram então identificados como compostos principais com base em triagens in vivo de macaco cino de APP solúvel. Os efeitos de knockdown in vivo de conjugados de siRNA C16 foram avaliados em macacos cino que receberam 60 mg de AD-454844, AD-994379, AD-961583, AD-961584, AD-961585, ou AD-961586 por meio de administração intratecal entre L2/L3 ou L4/L5 por meio de punção de agulha percutânea na cisterna lombar (Figuras 20A a 20G). Os biomarcadores de engajamento-alvo alfa e beta solúveis foram avaliados a partir de LCR coletado em D8, D15 e D29 pós-dose. A dosagem IT resultou na entrega de siRNA suficiente por toda a coluna e cérebro, conforme demonstrado pelo silenciamento de biomarcadores de engajamento-alvo logo uma semana após a dose com atividade sustentada até D29. Notavelmente, a atividade de knockdown in vivo da extremidade 5' do conjugado C16 (AD- 994379) foi semelhante à do conjugado C16 interno (AD-454844). (A sequência antissenso é idêntica em ambas as moléculas testadas). Além disso, os conjugados de siRNA C16 exibiram um efeito significativo de knockdown de longa duração. Os efeitos farmacodinâmicos sustentados nos quais a APP solúvel permaneceu bem abaixo de 50% ao longo de um período de 4 meses foram observados após uma dose única de 60 mg de AD-454844 (Figuras 19 e 20A). TABELA 30. CONJUGADOS DE SIRNA C16 IDENTIFICADOS
PARA KNOCKDOWN DE APP EM ESTUDOS DE NHP IN VIVO
SEQ SEQ Duplex Filamento Sequência de Oligonucleotídeos ID Sequência-alvo ID NO: NO: AD- Sensor 994379 Q363sasaaaucCfaAfCfCfuacaaguuscsa 2873 CGAAAAUCCAACCUACAAGUUCU 2883 (5’ a 3’) Antissenso VPusGfsaacu(Tgn)guagguUfgGfauuuuscsg 2874 AGAACUUGUAGGUUGGAUUUUCG 2884 (5’ a 3’) AD- Sensor 961583 gsgscua(Chd)gadAadAuccaaccusasa 2875 ACGGCUACGAAAAUCCAACCUAC 2885 (5’ a 3’) Antissenso VPusUfsaggu(Tgn)ggaudTuUfcdGuagccsgsu 2876 GUAGGUUGGAUUUUCGUAGCCGU 2886 (5’ a 3’) AD- Sensor asasagag(Chd)aAfaAfcuauucagsasa 2877 AGAAAGAGCAAAACUAUUCAGAU 2887
SEQ SEQ Duplex Filamento Sequência de Oligonucleotídeos ID Sequência-alvo ID NO: NO: 961584 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfcugAfauagudTuUfgCfucuuuscsu 2878 AUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2888 (5’ a 3’) AD- Sensor 961585 asasagag(Chd)adAadAcuauucagsasa 2879 AGAAAGAGCAAAACUAUUCAGAU 2889 (5’ a 3’) Antissenso VPuUfcugdAauagudTuUfgdCucuuuscsu 2880 AUCUGAAUAGUUUUGCUCUUUCU 2890 (5’ a 3’) AD- Sensor 961586 ususuau(Ghd)AfuUfUfAfcucauuauscsa 2881 GUUUUAUGAUUUACUCAUUAUCG 2891 (5’ a 3’) Antissenso VPusGfsauaAfugaguaaAfuCfauaaasusg 2882 CGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAAC 2892 (5’ a 3’) TABELA 31. TRANSCRITOS DE BASE NÃO MODIFICADOS USADOS NOS CONJUGADOS C16 DA TABELA 30
SEQ ID Duplex Filamento Nome do Oligo Sequência de Transcritos NO: AD- Sensor AAAAUCCAACCUACAAGUUCA 994379 A-1701871.1 2893 (5’ a 3’) Antissenso UGAACUTGUAGGUUGGAUUUUCG A-882382.1 2894 (5’ a 3’) AD- Sensor GGCUACGAAAAUCCAACCUAA 961583 A-1770584.1 2895 (5’ a 3’) Antissenso UUAGGUTGGAUTUUCGUAGCCGU A-1683088.1 2896 (5’ a 3’) AD- Sensor AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 961584 A-1770585.1 2897 (5’ a 3’) Antissenso UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU A-1683116.1 2898 (5’ a 3’) AD- Sensor AAAGAGCAAAACUAUUCAGAA 961585 A-1770586.1 2899 (5’ a 3’) Antissenso UUCUGAAUAGUTUUGCUCUUUCU A-1683118.1 2900 (5’ a 3’)
SEQ ID Duplex Filamento Nome do Oligo Sequência de Transcritos NO: AD- Sensor UUUAUGAUUUACUCAUUAUCA 961586 A-1770587.1 2901 (5’ a 3’)
Antissenso UGAUAAUGAGUAAAUCAUAAAUG A-1683134.1 2902 (5’ a 3’)

Claims (168)

REIVINDICAÇÕES
1. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de RNAi compreende um filamento sensor e um filamento antissenso, e em que o dito filamento antissenso compreende uma região de complementaridade na qual compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências antissenso listadas em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26, e 30.
2. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de RNAi compreende um filamento sensor e um filamento antissenso, em que o dito filamento sensor compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de filamento sensor apresentadas nas Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26, e 30; e em que a dita o dito filamento antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeo de filamento antissenso apresentadas nas Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26, e 30.
3. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por pelo menos um dos ditos filamento sensor e filamento antissenso compreender um ou mais grupamentos lipofílicos conjugados a uma ou mais posições internas de nucleotídeo, opcionalmente por meio de um ligante ou carreador.
4. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de dsRNA compreende um filamento sensor e um filamento antissenso, em que o dito filamento sensor compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 1 a 14, em que uma substituição de uma uracila por qualquer timina nos SEQ ID nº: 1 a 14 não conta como uma diferença que contribui para a dita diferenciação por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 1 a 14; e em que o dito filamento antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 15 a 28, em que uma substituição de uma uracila por qualquer timina nos SEQ ID nº: 15 a 28 não conta como uma diferença que contribui para a dita diferenciação por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 15 a 28, em que pelo menos um dos ditos filamento sensor e filamento antissenso compreende um ou mais grupamentos lipofílicos conjugados a uma ou mais posições internas de nucleotídeo, opcionalmente por meio de um ligante ou carreador.
5. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo filamento sensor compreender pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos da sequência de nucleotídeos de filamento sensor de um duplex selecionado a partir do grupo que consiste em AD-392911, AD-392912, AD- 392816, AD-392704, AD-392843, AD-392855, AD-392840, AD-392835, AD-392729, AD-392916, AD-392876, AD-392863, AD-392917, AD- 392783, AD-392765, AD-392791, AD-392800, AD-392711, AD-392801, AD-392826, AD-392818, AD-392792, AD-392802, AD-392766, AD- 392767, AD-392834, AD-392974, AD-392784, AD-392744, AD-392752, AD-392737, AD-392918, AD-392919, AD-392803, AD-392804, AD- 392827, AD-392828, AD-392785, AD-392829, AD-392920, AD-392921, AD-392768, AD-392805, AD-392769, AD-392753, AD-392714, AD- 392703, AD-392715, AD-392836, AD-392966, AD-392832, AD-392972, AD-392961, AD-392967, AD-392894, AD-392864, AD-392865, AD- 392922, AD-392833, AD-392968, AD-392962, AD-392963, AD-392969, AD-392973, AD-392923, AD-392866, AD-392877, AD-392707, AD- 392926, AD-392927, AD-392717, AD-392700, AD-392878, AD-392718, AD-392929, AD-392819, AD-392745, AD-392770, AD-392806, AD- 392771, AD-392820, AD-392821, AD-392786, AD-392772, AD-392699, AD-392868, AD-392719, AD-392880, AD-392930, AD-392932, AD- 392869, AD-392870, AD-392896, AD-392720, AD-392746, AD-392773, AD-392807, AD-392730, AD-392721, AD-392933, AD-392881, AD- 392897, AD-392898, AD-392899, AD-392935, AD-392882, AD-392738, AD-392739, AD-392936, AD-392900, AD-392901, AD-392937, AD- 392883, AD-392975, AD-392938, AD-392902, AD-392941, AD-392942, AD-392943, AD-392944, AD-392903, AD-392775, AD-392758, AD- 392945, AD-392884, AD-392947, AD-392748, AD-392759, AD-392837, AD-392970, AD-392976, AD-392965, AD-392831, AD-392904, AD- 392885, AD-392886, AD-392776, AD-392887, AD-392722, AD-392760, AD-392731, AD-392709, AD-392723, AD-392948, AD-392724, AD- 392949, AD-392725, AD-392950, AD-392732, AD-392726, AD-392862,
AD-392951, AD-392871, AD-392872, AD-397183, AD-397175, AD- 397177, AD-397176, AD-397260, AD-397266, AD-397267, AD-397178, AD-397180, AD-397184, AD-397179, AD-397224, AD-397225, AD- 397203, AD-397185, AD-397195, AD-397204, AD-397191, AD-397251, AD-397240, AD-397205, AD-397254, AD-397259, AD-397247, AD- 397233, AD-397181, AD-397196, AD-397197, AD-397226, AD-397212, AD-397182, AD-397227, AD-397217, AD-397213, AD-397229, AD- 397264, AD-397265, AD-397209, AD-397192, AD-397210, AD-397219, AD-397214, AD-397220, AD-397230, AD-397231, AD-397193, AD- 397190, AD-397200, AD-397248, AD-397207, AD-397211, AD-397243, AD-397246, AD-397223, AD-397202, AD-397256, AD-397257, AD- 397258, AD-397250, AD-397244, AD-454972, AD-454973, AD-454842, AD-454843, AD-454844, AD-994379, AD-961583, AD-961584, AD- 961585, e AD-961586.
6. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo filamento antissenso compreender pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos da sequência de nucleotídeos antissenso de um duplex selecionado a partir do grupo que consiste em AD-392911, AD-392912, AD-392816, AD-392704, AD-392843, AD-392855, AD- 392840, AD-392835, AD-392729, AD-392916, AD-392876, AD-392863, AD-392917, AD-392783, AD-392765, AD-392791, AD-392800, AD- 392711, AD-392801, AD-392826, AD-392818, AD-392792, AD-392802, AD-392766, AD-392767, AD-392834, AD-392974, AD-392784, AD- 392744, AD-392752, AD-392737, AD-392918, AD-392919, AD-392803, AD-392804, AD-392827, AD-392828, AD-392785, AD-392829, AD- 392920, AD-392921, AD-392768, AD-392805, AD-392769, AD-392753, AD-392714, AD-392703, AD-392715, AD-392836, AD-392966, AD- 392832, AD-392972, AD-392961, AD-392967, AD-392894, AD-392864,
AD-392865, AD-392922, AD-392833, AD-392968, AD-392962, AD- 392963, AD-392969, AD-392973, AD-392923, AD-392866, AD-392877, AD-392707, AD-392926, AD-392927, AD-392717, AD-392700, AD- 392878, AD-392718, AD-392929, AD-392819, AD-392745, AD-392770, AD-392806, AD-392771, AD-392820, AD-392821, AD-392786, AD- 392772, AD-392699, AD-392868, AD-392719, AD-392880, AD-392930, AD-392932, AD-392869, AD-392870, AD-392896, AD-392720, AD- 392746, AD-392773, AD-392807, AD-392730, AD-392721, AD-392933, AD-392881, AD-392897, AD-392898, AD-392899, AD-392935, AD- 392882, AD-392738, AD-392739, AD-392936, AD-392900, AD-392901, AD-392937, AD-392883, AD-392975, AD-392938, AD-392902, AD- 392941, AD-392942, AD-392943, AD-392944, AD-392903, AD-392775, AD-392758, AD-392945, AD-392884, AD-392947, AD-392748, AD- 392759, AD-392837, AD-392970, AD-392976, AD-392965, AD-392831, AD-392904, AD-392885, AD-392886, AD-392776, AD-392887, AD- 392722, AD-392760, AD-392731, AD-392709, AD-392723, AD-392948, AD-392724, AD-392949, AD-392725, AD-392950, AD-392732, AD- 392726, AD-392862, AD-392951, AD-392871, AD-392872, AD-397183, AD-397175, AD-397177, AD-397176, AD-397260, AD-397266, AD- 397267, AD-397178, AD-397180, AD-397184, AD-397179, AD-397224, AD-397225, AD-397203, AD-397185, AD-397195, AD-397204, AD- 397191, AD-397251, AD-397240, AD-397205, AD-397254, AD-397259, AD-397247, AD-397233, AD-397181, AD-397196, AD-397197, AD- 397226, AD-397212, AD-397182, AD-397227, AD-397217, AD-397213, AD-397229, AD-397264, AD-397265, AD-397209, AD-397192, AD- 397210, AD-397219, AD-397214, AD-397220, AD-397230, AD-397231, AD-397193, AD-397190, AD-397200, AD-397248, AD-397207, AD- 397211, AD-397243, AD-397246, AD-397223, AD-397202, AD-397256, AD-397257, AD-397258, AD-397250, AD-397244, AD-454972, AD- 454973, AD-454842, AD-454843, AD-454844, AD-994379, AD-961583,
AD-961584, AD-961585, e AD-961586.
7. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo agente de RNAi de duplo filamento compreender pelo menos um nucleotídeo modificado.
8. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pela lipofilicidade do grupamento lipofílico, medida por meio de logKow, exceder 0.
9. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela hidrofobicidade do agente de RNAi de duplo filamento, medida por meio da fração não ligada no ensaio de ligação de proteína de plasma do agente de RNAi de duplo filamento, exceder 0,2.
10. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo ensaio de ligação de proteína de plasma ser um ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética que usa proteína humana de albumina sérica.
11. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por todos os nucleotídeos do filamento sensor serem nucleotídeos modificados.
12. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por substancialmente todos os nucleotídeos do filamento antissenso serem nucleotídeos modificados.
13. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por todos os nucleotídeos do filamento sensor serem nucleotídeos modificados.
14. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por todos os nucleotídeos do filamento antissenso serem nucleotídeos modificados.
15. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, caracterizado por todos os nucleotídeos do filamento sensor e todos os nucleotídeos do filamento antissenso serem nucleotídeos modificados.
16. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 11 a 15, caracterizado por pelo menos um dos nucleotídeos modificados serem selecionados a partir do grupo que consiste em um desoxinucleotídeo, um nucleotídeo de 3’-terminal desoxitimina (dT), um nucleotídeo modificado de 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2'-fluoro, um 2'-desoxinucleotídeo modificado, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo desbloqueado, um nucleotídeo restrito de forma conformacional, um nucleotídeo de etila restringida, um nucleotídeo abásico, um 2’-amino- nucleotídeo modificado, um nucleotídeo modificado de 2’-O- alquila, nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, nucleotídeo modificado de 2’-hidroxila, um nucleotídeo modificado de 2’- metoxietila, um nucleotídeo modificado de 2’-O-alquila, um nucleotídeo de morfolina, um fosforamidato, um nucleotídeo que compreende uma base não natural, um nucleotídeo modificado de tetra-hidropiran, um nucleotídeo modificado de 1,5- anidrohexitol , um nucleotídeo modificado de ciclohexenila, um nucleotídeo que compreende um grupo de 5'-fosforotioato, um nucleotídeo que compreende um 5'-metilfosfonato, um nucleotídeo que compreende um 5’ fosfato ou mímico de 5’ fosfato, um nucleotídeo que compreende fosfato de vinila, um nucleotídeo que compreende ácido glicolnucleico (GNA) de adenosina, um nucleotídeo que compreende um isômero S de ácido glicolnucleico (GNA) de timidina, um nucleotídeo que compreende 2-hidroximetil-tetra-hidrofurano-5-fosfato, um nucleotídeo que compreende 2’-deoxitimidina-3’fosfato, um nucleotídeo que compreende 2’-deoxiguanosina-3’-fosfato e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesteril e um grupo de ácido dodecanoico de bisdecilamida.
17. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo dito nucleotídeo modificado ser selecionado a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado d e 2'-desoxi-2'-flúor, um 2'- desoxi-nucleotídeo modificado, nucleotídeos de 3’-terminal desoxi-timina (dT), um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um 2’-amino-nucleotídeo modificado, um 2’-alquilo- nucleotídeo modificado, um nucleotídeo de morfolina, um fosforamidato, e um nucleotídeo que compreende uma base não natural.
18. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo dito nucleotídeo modificado compreender uma sequência curta de nucleotídeos de 3’-terminal desoxi-timina (dT).
19. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelas modificações nos nucleotídeos serem modificações de 2’-O-metila, GNA e 2’flúor.
20. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por ainda compreender pelo menos uma ligação de internucleotídeo de fosforotioato.
21. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo agente de RNAi de duplo filamento compreender de 6 a 8 ligações de internucleotídeo de fosforotioato.
22. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região de complementaridade ser de pelo menos 17 nucleotídeos em comprimento.
23. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região de complementaridade ser de 19 a 23 nucleotídeos em comprimento.
24. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região de complementaridade ser de 19 nucleotídeos em comprimento.
25. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por cado filamento ser de não mais que 30 nucleotídeos em comprimento.
26. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado por pelo menos um filamento compreender uma projeção 3’ de pelo menos 1 nucleotídeo.
27. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado por pelo menos um filamento compreender uma projeção 3’ de pelo menos 2 nucleotídeos.
28. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo agente de RNAi de duplo filamento ainda compreender um ligante C16 conjugado à extremidade 3’, à extremidade 5’ ou à extremidade 3’ e à extremidade 5’ do filamento sensor através de um ligante monovalente ou bivalente ramificado ou trivalente.
29. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo ligante ser , em que B é uma base de nucleotídeo ou um analógico de base de nucleotídeo, em que B é opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em adenina, guanina, citosina, timina e uracila.
30. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região de complementaridade compreender qualquer uma das sequências antissenso em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26 e 30.
31. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região de complementaridade consistir em qualquer uma das sequências antissenso em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, 9, 10-15, 16A, 16B, 26 e 30.
32. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6 e 8 a 10, caracterizado pelas posições internas incluírem todas as posições, exceto as duas posições terminas de cada extremidade do filamento.
33. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelas posições internas incluírem todas as posições exceto três posições terminais de cada extremidade do filamento.
34. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelas posições internas excluírem a região de sítio de clivagem do filamento sensor.
35. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelas posições internas excluírem as posições de 9 a 12, contando a partir da extremidade 5’ do filamento sensor.
36. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelas posições internas excluírem as posições de 11 a 13, contando a partir da extremidade 3’ do filamento sensor.
37. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelas posições internas excluírem a região de sítio de clivagem do filamento antissenso.
38. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelas posições internas excluírem as posições de 12 a 14, contando a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso.
39. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelas posições internasexcluírem as posições de 11 a 13 no filamento sensor, contando a partir da extremidade 3’, e as posições de 12 a 14 no filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’.
40. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado por um ou mais grupamentos lipofílicos serem conjugados a uma ou mais das seguintes posições internas: posições 4 a 8 e 13 a 18 no filamento sensor e posições 6 a 10 e 15 a 18 no filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’de cado filamento.
41. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por um ou mais grupamentos lipofílicos serem conjugados a uma ou mais das seguintes posições internas: posições 5, 6, 7, 15 e 17 no filamento sensor e posições 15 e 17 no filamento antissenso, contando a partir da extremidade 5’ de cado filamento.
42. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo grupamento lipofílico ser um composto alifático, alicíclico ou polialicíclico.
43. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo grupamento lipofílico ser lipídio, colesterol, ácido retinoico, ácido cólico, ácido acético de adamantano, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, geraniloxi-hexianol, hexadecilglicrecol, borneol, mentol, 1,3- propanediol, grupo de heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoíl)litocólico, ácido O3- (oleoíl)colênico de, di-metoxitritila ou fenoxazin.
44. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo grupamento lipofílico conter uma cadeia de hidrocarboneto C4-C30 saturada ou insaturada, e um grupo funcional opcional selecionado a partir do grupo que consiste em hidroxila, amina, ácido carboxílico, sulfonato, fosfato, tiol, azida e alquino.
45. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo grupamento lipofílico conter uma cadeia de hidrocarboneto C6-C18 saturada ou insaturada.
46. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo grupamento lipofílico conter uma cadeia de hidrocarboneto C16 saturada ou insaturada.
47. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo grupamento lipofílico ser conjugado por meio de um carreador que substitui um ou mais nucleotídeo(ou nucleotídeos) na posição interna(ou posições internas).
48. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo carreador ser um grupo cíclico selecionado a partir do grupo que consiste em pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolanila, oxazolidina, isoxazolidinila , morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinonila, tetra-hidrofuranila e decalinila; ou ser um grupamento acíclico com base em uma cadeia principal de serinol ou uma cadeia principal de dietanolamina.
49. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6 e 8 a 48, caracterizado pelo grupamento lipofílico ser conjugado ao agente de RNAi de duplo filamento através de um ligante que contém um éter, tioéter, ureia, carbonato, amina, amida, tioéter de maleimida, dissulfeto, fosfodiéster, ligação de sulfonamida, um produto de uma reação click ou carbamato.
50. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6 e 8 a 49, caracterizado pelo grupamento lipofílico ser conjugado a uma nucleobase, grupamento de açúcar ou ligação internucleosídica.
51. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado por ainda compreender um fosfato ou um mímico de fosfato na extremidade 5’ do filamento antissenso.
52. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo mímico de fosfato ser um fosfonato de 5’-vinila (VP).
53. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado por ainda compreender um ligante direcionador que se direciona a um receptor que media a aplicação a um tecido CNS.
54. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo ligante direcionador ser um ligante C16.
55. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 54, caracterizado por ainda compreender um ligante direcionador que se direciona a um tecido cerebral.
56. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 55, caracterizado pelo grupamento lipofílico ou ligante direcionador ser conjugado por meio de um ligante bio-clivável selecionado a partir do grupo que consiste em DNA, RNA, dissulfeto, amida, monossacarídeos funcionalizados ou oligossacarídeos de galactosamina, glucosamina, glicose, galactose, manose e combinações dos mesmos.
57. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6 e 8 a 56, caracterizado pela extremidade 3’ do filamento sensor ser protegido por meio de uma tampa de extremidade que é um grupo cíclico que tem uma amina, sendo que o dito grupo cíclico é selecionado a partir do grupo que consiste em pirrolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioxolanila, oxazolidinila, isoxalidinila, morfolinila, tiazolidinila, isotiazolidinila, quinoxalinila, piridazinolina, tetra-hidrofuranila e decalinila.
58. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo agente de RNAi compreender pelo menos um nucleotídeo modificado selecionado a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2'-O-metila , um nucleotídeo modificado de 2'- flúor, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA) e um nucleotídeo que compreende fosfato de vinila, em que o agente de RNAi compreende opcionalmente pelo menos uma dentre cada uma das seguintes modificações: nucleotídeo modificado de 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2'- flúor, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA) e um nucleotídeo que compreende fosfato de vinila.
59. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo agente de RNAi compreender um padrão de nucleotídeos modificados conforma mostrado na Figura 1A, Figura 1B, Tabela 2A ou Tabela 5A (em que as localizações das modificações 2’-C16, 2’-O-metila, GNA, fosforotioato e 2’-flúor são apresentadas na Figura 1A, Figura 1B, Tabela 2A ou Tabela 5A, independente das sequências de base de nucleotídeo individual dos agentes de RNAi apresentados).
60. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o dito filamento antissenso compreende uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cado filamento é de cerca de 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento é representado por meio da fórmula (III): sensora: 5' np -Na -(X X X)i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l- Na′- nq′ 5' (III) em que: i, j, k e l são, cada um, independentemente, 0 ou 1; p, p’, q e q′ são, cada um, independentemente, 0 a 6; cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; np, np′, nq e nq′, cada um dos quais podem ou podem não estar presentes, representam, independentemente, um nucleotídeo de projeção; XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′ cada um representando, independentemente, um tema ou três modificações idênticas nos três nucleotídeos consecutivos; modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante.
61. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por i ser 0; j ser 0; i ser 1; j ser 1; ambos i e j serem 0; ou ambos i e j serem 1.
62. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por k ser 0; l ser 0; k ser 1; l ser 1; ambos k e l serem 0; ou ambos k e l serem 1.
63. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por XXX ser complementar a X′X′X′, YYY ser complementar a Y′Y′Y′ e ZZZ ser complementar a Z′Z′Z′.
64. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo tema YYY ocorrer no ou próximo ao sítio de clivagem do filamento sensor.
65. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo motivo Y′Y′Y′ ocorrer nas posições 11, 12 e 13 do filamento antissenso a partir da extremidade 5'.
66. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo Y′ ser 2′-O-metila.
67. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela fórmula (III) ser representada por meio da fórmula (IIIa): sensora: 5' np -Na -Y Y Y -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′- Y′Y′Y′- Na′- nq′ 5' (IIIa).
68. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela fórmula (III) ser representada por meio da fórmula (IIIb): sensora: 5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′- Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′- Na′- nq′ 5'
(IIIb) em que Nb e Nb′, cada um, representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 1 a 5 nucleotídeos modificados.
69. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela fórmula (III) ser representada por meio da fórmula (IIIc): sensora: 5' np -Na –X X X -Nb -Y Y Y -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′- X′X′X′-Nb′- Y′Y′Y′- Na′- nq′ 5' (IIIc) em que Nb e Nb′, cada um, representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 1 a 5 nucleotídeos modificados.
70. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela fórmula (III) ser representada por meio da fórmula (IIId): sensora: 5' np -Na –X X X- Nb -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′- X′X′X′- Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′- Na′- nq′ 5' (IIId) em que Nb e Nb′, cada um, representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 1 a 5 nucleotídeos modificados e Na e Na′,cada um, representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 2 a 10 nucleotídeos modificados.
71. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela região de duplo filamento ser de 15 a 30 pares de nucleotídeo em comprimento.
72. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela região de duplo filamento ser de 17 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento.
73. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela região de duplo filamento ser de 17 a 25 pares de nucleotídeo em comprimento.
74. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela região de duplo filamento ser de 23 a 27 pares de nucleotídeo em comprimento.
75. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pela região de duplo filamento ser de 19 a 21 pares de nucleotídeo em comprimento.
76. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pela região de duplo filamento ser de 21 a 23 pares de nucleotídeo em comprimento.
77. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por cado filamento ter de 15 a 30 nucleotídeos.
78. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por cado filamento ter de 19 a 30 nucleotídeos.
79. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelas modificações nos nucleotídeos serem selecionadas a partir do grupo que consiste em LNA, ácido glicolnucleico (GNA), HNA, CeNA, 2-metoxietila, 2-O-alquila, 2-O-alila, 2-C-alila, 2-flúor, 2-desoxi, 2’- hidroxila e combinações dos mesmos, preferencialmente em que as modificações nos nucleotídeos sejam selecionadas a partir do grupo que consiste em 2'-O-metila, 2'-flúor, GNA e combinações dos mesmos.
80. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelas modificações nos nucleotídeos serem modificações de 2-O-metila ou 2-flúor.
81. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo ligante ser um ou mais grupamentos de C16 fixados através de um ligante bivalente ou trivalente ramificado.
82. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo ligante ser fixado à extremidade 3 , à extremidade 5’ ou às extremidades 3’ e 5’ do filamento sensor.
83. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo dito agente ainda compreender pelo menos uma ligação de fosforotioato ou de internucleotídeo de metilfosfonato.
84. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pela ligação de fosforotioato ou de internucleotídeo de metilfosfonato estar no terminal 3’- de um filamento.
85. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo dito filamento ser o filamento antissenso.
86. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo dito filamento ser o filamento sensor.
87. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pela ligação de fosforotioato ou de internucleotídeo de metilfosfonato estar no terminal 5’- de um filamento.
88. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo dito filamento ser o filamento antissenso.
89. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo dito filamento ser o filamento sensor.
90. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pela ligação de fosforotioato ou de internucleotídeo de metilfosfonato estar em ambos os terminais 5’ e 3’ de um filamento.
91. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo dito filamento ser o filamento antissenso.
92. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo par de base na posição 1 da extremidade 5do filamento antissenso do duplex ser um par de base AU.
93. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelos nucleotídeos Y conterem uma modificação de 2-flúor.
94. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelos nucleotídeos Y conterem uma modificação de 2-O-metila.
95. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por p′>0.
96. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado por p′=2.
97. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelos nucleotídeos de projeção q’=0, p=0, q=0 e p’ serem complementares ao mRNA direcionado.
98. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelos nucleotídeos de projeção q’=0, p=0, q=0, e p’ não serem complementares ao mRNA direcionado.
99. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo filamento sensor ter um total de 21 nucleotídeos e o filamento antissenso ter um total de 23 nucleotídeos.
100. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 95 a 99, caracterizado por pelo menos um np′ ser ligado a um nucleotídeo limítrofe por meio de uma ligação de fosforotioato.
101. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado por todos np′ serem ligados a nucleotídeos limítrofes por meio de ligações de fosforotioato.
102. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo dito agente de RNAi ser selecionado a partir do grupo que consiste em agentes de RNAi listados em qualquer uma das Tabelas 2A, 2B, 3, 5A, 5B, 6, e 9.
103. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que todos os nucleotídeos do dito filamento sensor e todos os nucleotídeos do dito filamento antissenso compreendem uma modificação.
104. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o dito filamento antissenso compreende uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cado filamento é de cerca de 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento ser representado por meio da fórmula (III): sensora: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y - Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III) em que: i, j, k e l são, cada um, independentemente, 0 ou 1; p, p’, q e q′ são, cada um, independentemente, 0 a 6; cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de forma diferente; cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; np, np′, nq, e nq′, cada um dos quais podem ou podem não estar presentes representam, independentemente, um nucleotídeo de projeção; XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′ e Z′Z′Z′, cada um representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações de 2-O-metil ou 2- flúor; modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante.
105. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o dito filamento antissenso compreende uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cado filamento é de cerca de 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento ser representado por meio da fórmula (III): sensora: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y - Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III) em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; np, nq, e nq′, cada um dos quais podem ou podem não estar presentes, representam, independentemente um nucleotídeo de projeção; p, q e q′ são, cada um, independentemente de 0 a 6; np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo limítrofe através de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de maneiras diferentes; cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′, e Z′Z′Z′, cada um representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações de 2-O-metila, ácido glicolnucleico (GNA) ou 2-flúor; modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante.
106. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o dito filamento antissenso compreende uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cado filamento é de cerca de 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento ser representado por meio da fórmula (III): sensora: 5' np -Na -(X X X) i-Nb -Y Y Y - Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III) em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente 0 ou 1; np, nq, e nq′, cada um dos quais podem ou podem não estar presentes, representam, independentemente um nucleotídeo de projeção; p, q e q′ são, cada um, independentemente de 0 a 6; np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo limítrofe através de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de maneiras diferentes; cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′, e Z′Z′Z′, cada um, representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações de 2-O-metila ou 2-flúor; modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; e em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ou mais ligantes C16 .
107. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o dito filamento antissenso compreende uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cado filamento é de cerca de 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento ser representado por meio da fórmula (III): sensora: 5' np -Na -(X X X)i-Nb -Y Y Y - Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′- Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′- nq′ 5' (III) em que: i, j, k, e l são, cada um, independentemente, 0 ou 1; np, nq, e nq′, cada um dos quais podem ou podem não estar presentes, representam, independentemente, um nucleotídeo de projeção; p, q e q′ são, cada um, independentemente de 0 a 6; np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo limítrofe através de uma ligação de fosforotioato; cada Na e Na′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de maneiras diferentes; cada Nb e Nb′ representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 10 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos; XXX, YYY, ZZZ, X′X′X′, Y′Y′Y′, e Z′Z′Z′, cada um, representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações de 2-O-metila ou 2-flúor; modificações em Nb se diferem da modificação em Y e modificações em Nb′ se diferem da modificação em Y′; em que o filamento sensor compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato; e em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ou mais ligantes C16.
108. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor complementar a um filamento antissenso, em que o dito filamento antissenso compreende uma região complementar à parte de uma APP codificadora de mRNA, em que cado filamento é de cerca de 14 a 30 nucleotídeos em comprimento, em que o dito agente de RNAi de duplo filamento ser representado por meio da fórmula (III): sensora: 5' np -Na -Y Y Y - Na - nq 3' antissenso: 3' np′-Na′- Y′Y′Y′- Na′- nq′ 5' (IIIa) em que: np, nq, e nq′, cada um das quais pode ou não pode estar presente, representa, independentemente, um nucleotídeo de projeção; p, q e q′ são, cada um, independentemente de 0 a 6; np′ >0 e pelo menos um np′ é ligado a um nucleotídeo limítrofe por meio de uma ligação de fosforotioato; Na e Na′, cada um, representa, independentemente, uma sequência de oligonucleotídeo que compreende de 0 a 25 nucleotídeos que são modificados ou não modificados ou combinações dos mesmos, cada sequência compreendendo pelo menos dois nucleotídeos modificados de formas diferentes; YYY e Y′Y′Y′, cada um, representa, independentemente, um motivo de três modificações idênticas em três nucleotídeos consecutivos, e em que as modificações são modificações de 2-O-metila ou 2-flúor; em que o filamento sensor compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato; e em que o filamento sensor é conjugado a pelo menos um ligante, opcionalmente em que o ligante é um ou mais ligantes C16.
109. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor e um filamento antissenso formando uma região de duplo filamento, em que o dito filamento sensor compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 1 a 14 e o dito filamento antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 15 a 28, em que substancialmente todos os nucleotídeos do dito filamento sensor compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação de 2’-O- metila e uma modificação de 2’-flúor, em que o dito filamento sensor compreende duas ligações de internucleotídeo de fosforotioato na terminação 5’, em que substancialmente todos os nucleotídeos do dito filamento antissenso compreendem uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em uma modificação de 2’-O-metila e uma modificação de 2’-flúor, em que o dito filamento antissenso compreende duas ligações de internucleotídeo de fosforotioato na terminação 5’ e duas ligações de internucleotídeo de fosforotioato na terminação 3’, e em que o dito filamento sensor é conjugado a um ou mais ligantes C16.
110. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de RNAi de duplo filamento compreende um filamento sensor e um filamento antissenso formando uma região de duplo filamento, em que o dito filamento sensor compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 1 a 14 e o dito filamento antissenso compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos dos SEQ ID nº: 15 a 28, em que o dito filamento sensor compreende pelo menos um nucleotídeo de desoxitimina (dT) 3’-terminal, e em que o dito filamento antissenso compreende pelo menos um nucleotídeo de desoxitimina (dT) 3’-terminal.
111. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado por todos os nucleotídeos do dito filamento sensor e todos os nucleotídeos do dito filamento antissenso são nucleotídeos modificados.
112. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado por cado filamento ter de 19 a 30 nucleotídeos.
113. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 112, caracterizado pelo filamento antissenso do agente de RNAi compreender pelo menos uma modificação desestabilizadora termicamente do duplex dentro das primeiras 9 posições de nucleotídeo da região 5′ ou um precursor da mesma.
114. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pela modificação desestabilizadora termicamente do duplex ser selecionada a partir do grupo que consiste em em que B é nucleobase.
115. CÉLULA, caracterizada por conter o agente de RNAi de duplo filamento, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 114 ou 151 a 168.
116. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por inibir a expressão de um gene de APP que compreende o agente RNAi de duplo filamento, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 114 ou 151 a 168.
117. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 116, caracterizada pelo agente RNAi de duplo filamento ser administrado em uma solução não-tamponada.
118. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 117, caracterizada pela dita solução não- tamponada ser água ou solução salina.
119. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 116, caracterizada pelo dito agente de RNAi de duplo filamento ser administrado com uma solução tampão.
120. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 119, caracterizada pela dita solução tampão compreender acetato, citrato, prolamina, carbonato ou fosfato ou qualquer combinação dos mesmos.
121. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 119, caracterizada pela dita solução tampão ser solução salina tamponada com fosfato (PBS).
122. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA caracterizada por compreender o agente RNAi de duplo filamento, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 114 ou 151 a 168, e uma formulação de lipídio.
123. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 122, caracterizada pela formulação de lipídio compreender um LNP.
124. MÉTODO para inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP) em uma célula, sendo que o método é caracterizado por compreender:
(a) colocar a célula em contato com o agente de RNAi de duplo filamento, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-114 ou 151-168, ou a composição farmacêutica, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 114- 121; e (b) manter a célula produzida na etapa (a) por um tempo suficiente para obter a degradação da transcrição de mRNA de um gene de APP, inibindo, portanto, a expressão do gene de APP na célula.
125. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pela dita célula estar dentro de um indivíduo.
126. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo dito indivíduo ser um humano.
127. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo indivíduo ser selecionado a partir do grupo que consiste em um macaco-rhesus, um macaco cinomolgo, um camundongo e um rato.
128. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo indivíduo humano sofrer de um distúrbio associado com APP.
129. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pela doença associada com APP ser angiopatia amiloide cerebral (CAA).
130. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo distúrbio associado com APP ser doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
131. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 128, caracterizado pelo distúrbio associado com APP ser doença de Alzheimer (AD).
132. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 124 a 131, caracterizado pela expressão de APP ser inibida por pelo menos cerca de 30%.
133. MÉTODO para tratar um indivíduo que tem um distúrbio que teria um benefício de uma redução na expressão de APP, caracterizado por compreender a administração, ao indivíduo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi de duplo filamento, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 114 ou 151 a 168 ou da composição farmacêutica, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 116 a 123, tratando, portanto, o dito indivíduo.
134. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo indivíduo sofrer de um distúrbio associado com APP.
135. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo dito indivíduo ser um humano.
136. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pela doença associada com APP ser angiopatia amiloide cerebral (CAA).
137. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pela doença associada com APP ser doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
138. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 134, caracterizado pela doença associada com APP ser doença de Alzheimer (AD).
139. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 138, caracterizado pela expressão de APP ser inibida por pelo menos cerca de 30%.
140. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 139, caracterizado por ainda compreender a administração de um agente terapêutico adicional ao indivíduo.
141. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 140, caracterizado pelo agente de RNAi de duplo filamento ser administrado em uma dose de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg.
142. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 141, caracterizado pelo agente de RNAi de duplo filamento ser administrado ao indivíduo de forma intratecal.
143. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 142, caracterizado pela administração do RNAi de duplo filamento ao indivíduo causar uma redução na acumulação de Aβ, a administração do RNAi de duplo filamento ao indivíduo causar opcionalmente uma redução em Aβ(1 a 40) e/ou acumulação em Aβ(1 a 42).
144. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 133 a 143, caracterizado pela administração do dsRNA ao indivíduo causar uma redução na formação de placa de amiloide e/ou acumulação no indivíduo.
145. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 133, caracterizado pelo método reduzir a expressão de um gene direcionado em um tecido cérebro ou dorso.
146. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 145, caracterizado pelo tecido de cérebro ou dorso ser selecionado a partir do grupo que consiste em córtex, cerebelo, estriado, coluna cervical, coluna lombar e coluna torácica.
147. MÉTODO para inibir a expressão de APP em um indivíduo, sendo que o método é caracterizado por compreender: administrar, ao dito indivíduo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi de duplo filamento,
conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-114 ou 151-168 ou a composição farmacêutica, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 116-123, inibindo, portanto, a expressão de APP no dito indivíduo.
148. MÉTODO para tratar ou prevenir uma doença associada com APP ou distúrbio in a indivíduo, sendo que o método é caracterizado por compreender administrar, ao dito indivíduo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de RNAi de duplo filamento, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1-114 ou 151-168 ou a composição farmacêutica, conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 116-123, tratando ou prevenindo, portanto, uma doença ou distúrbio associado com APP no indivíduo.
149. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 148, caracterizado pela doença ou distúrbio associado com APP ser selecionado a partir do grupo que consiste em angiopatia amiloide cerebral (CAA) e doença de Alzheimer (AD), opcionalmente em que a AD é doença de Alzheimer familiar de início precoce (EOFAD).
150. KIT para realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 124 a 149, caracterizado por compreender a) o agente de RNAi de duplo filamento, e b) instruções para o uso, e c) opcionalmente, um meio para administrar o agente de RNAi de duplo filamento ao indivíduo.
151. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de
RNAi compreende um filamento sensor e um filamento antissenso, e em que o dito filamento antissenso compreende uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que se diferem por não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências de nucleobase de filamento antissenso de um duplex selecionado a partir do grupo que consiste em AD-392911, AD-392912, AD-392816, AD-392704, AD-392843, AD-392855, AD-392840, AD-392835, AD-392729, AD- 392916, AD-392876, AD-392863, AD-392917, AD-392783, AD-392765, AD-392791, AD-392800, AD-392711, AD-392801, AD-392826, AD- 392818, AD-392792, AD-392802, AD-392766, AD-392767, AD-392834, AD-392974, AD-392784, AD-392744, AD-392752, AD-392737, AD- 392918, AD-392919, AD-392803, AD-392804, AD-392827, AD-392828, AD-392785, AD-392829, AD-392920, AD-392921, AD-392768, AD- 392805, AD-392769, AD-392753, AD-392714, AD-392703, AD-392715, AD-392836, AD-392966, AD-392832, AD-392972, AD-392961, AD- 392967, AD-392894, AD-392864, AD-392865, AD-392922, AD-392833, AD-392968, AD-392962, AD-392963, AD-392969, AD-392973, AD- 392923, AD-392866, AD-392877, AD-392707, AD-392926, AD-392927, AD-392717, AD-392700, AD-392878, AD-392718, AD-392929, AD- 392819, AD-392745, AD-392770, AD-392806, AD-392771, AD-392820, AD-392821, AD-392786, AD-392772, AD-392699, AD-392868, AD- 392719, AD-392880, AD-392930, AD-392932, AD-392869, AD-392870, AD-392896, AD-392720, AD-392746, AD-392773, AD-392807, AD- 392730, AD-392721, AD-392933, AD-392881, AD-392897, AD-392898, AD-392899, AD-392935, AD-392882, AD-392738, AD-392739, AD- 392936, AD-392900, AD-392901, AD-392937, AD-392883, AD-392975, AD-392938, AD-392902, AD-392941, AD-392942, AD-392943, AD- 392944, AD-392903, AD-392775, AD-392758, AD-392945, AD-392884,
AD-392947, AD-392748, AD-392759, AD-392837, AD-392970, AD- 392976, AD-392965, AD-392831, AD-392904, AD-392885, AD-392886, AD-392776, AD-392887, AD-392722, AD-392760, AD-392731, AD- 392709, AD-392723, AD-392948, AD-392724, AD-392949, AD-392725, AD-392950, AD-392732, AD-392726, AD-392862, AD-392951, AD- 392871, AD-392872, AD-397183, AD-397175, AD-397177, AD-397176, AD-397260, AD-397266, AD-397267, AD-397178, AD-397180, AD- 397184, AD-397179, AD-397224, AD-397225, AD-397203, AD-397185, AD-397195, AD-397204, AD-397191, AD-397251, AD-397240, AD- 397205, AD-397254, AD-397259, AD-397247, AD-397233, AD-397181, AD-397196, AD-397197, AD-397226, AD-397212, AD-397182, AD- 397227, AD-397217, AD-397213, AD-397229, AD-397264, AD-397265, AD-397209, AD-397192, AD-397210, AD-397219, AD-397214, AD- 397220, AD-397230, AD-397231, AD-397193, AD-397190, AD-397200, AD-397248, AD-397207, AD-397211, AD-397243, AD-397246, AD- 397223, AD-397202, AD-397256, AD-397257, AD-397258, AD-397250 AD-397244, AD-454972, AD-454973, AD-454842, AD-454843, AD- 454844, AD-994379, AD-961583, AD-961584, AD-961585, e AD-
961586.
152. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 151, caracterizado pelo agente de RNAi compreender uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2'-flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato (PS) e um fosfonato de vinila (VP), opcionalmente em que o dito agente de RNAi compreende pelo menos uma de cada modificação selecionada a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2'-
flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato e um fosfonato de vinila (VP).
153. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 151 ou reivindicação 152, caracterizado pelo agente de RNAi compreender quatro ou mais modificações de PS, opcionalmente de seis a dez modificações de PS, opcionalmente oito modificações de PS.
154. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende oito modificações de PS posicionadas nas penúltima e última ligações de internucleotídeo a partir das respectivas terminações 3’- e 5’- de cada um dos filamentos sensor e de antissenso do agente de RNAi.
155. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 151 a 154, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende apenas um nucleotídeo que compreende um GNA, opcionalmente em que o nucleotídeo que compreende um GNA é posicionado no filamento antissenso no sétimo resíduo de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
156. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 151 a 155, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dentre uma e quatro nucleotídeos modificados de 2’-C-alquila, opcionalmente em que o nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila é um nucleotídeo modificado de 2’-C16, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende um único nucleotídeo modificado de 2’-C16, opcionalmente, o único nucleotídeo modificado de 2’-C16 é localizado no filamento sensor na sexta posição de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento sensor ou na posição terminal de nucleobase da extremidade 5’.
157. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 151 a 156, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor, opcionalmente em que o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada uma, compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor, opcionalmente em que os nucleotídeos modificados de 2’-flúor são localizados no filamento sensor nas posições de nucleobase 7, 9, 10 e 11 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições de nucleobase 2, 14 e 16 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
158. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 151 a 157, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende um ou mais modificações de VP, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende uma única modificação de VP na terminação 5’ do filamento antissenso.
159. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 151 a 158, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2'-O-metila, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende nucleotídeos modificados de 2'-O- metila em todas as localizações de nucleobase não modificadas por um 2'-flúor, um 2’-C-alquila ou um ácido glicolnucleico (GNA), opcionalmente em que os dois ou mais nucleotídeos modificados 2'-O-metila são localizados no filamento sensor nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
160. AGENTE DE ÁCIDO RIBONUCLEICO DE DUPLO FILAMENTO (RNAi) caracterizado por inibir a expressão de um gene de proteína precursora de amiloide (APP), em que o dito agente de RNAi compreende um filamento sensor e um filamento antissenso, e em que o dito filamento antissenso compreende uma região de pelo menos 15 nucleobases contíguas em comprimento que é suficientemente complementar a uma sequência de APP direcionada, selecionada a partir do grupo que consiste em posições 1891 a 1919 de APP NM_00484 ; posições 2282 a 2306 de APP NM_00484 ; posições 2464 a 2494 de APP NM_00484; posições 2475 a 2638 de APP NM_00484; posições 2621 a 2689 de APP NM_00484; posições 2682 a 2725 de APP NM_00484; posições 2705 a 2746 de APP NM_00484; posições 2726 a 2771 de APP NM_00484; posições 2754 a 2788 de APP NM_00484; posições 2782 a 2813 de
APP NM_00484; posições 2801 a 2826 de APP NM_00484; posições 2847 a 2890 de APP NM_00484; posições 2871 a 2896 de APP NM_00484; posições 2882 a 2960 de APP NM_00484; posições 2942 a 2971 de APP NM_00484; posições 2951 a 3057 de APP NM_00484; posições 3172 a 3223 de APP NM_00484; posições 3209 a 3235 de APP NM_00484 ; posições 3256 a 3289 de NM_00484; posições 3302 a 3338 de NM_00484; posições 3318 a 3353 de APP NM_00484; posições 3334 a 3361 de APP NM_00484, posições 251 a 284 de APP NM_001198823.1; posições 362 a 404 de APP NM_001198823.1; posições 471 a 510 de APP NM_001198823.1; posições 532 a 587 de APP NM_001198823.1; posições 601 a 649 de APP NM_001198823.1; posições 633-662 de APP NM_001198823.1; posições 1351 a 1388 de APP NM_001198823.1; posições 1609 a 1649 de APP NM_001198823.1; posições 1675 a 1698 de APP NM_001198823.1; posições 1752 a 1787 de APP NM_001198823.1; posições 2165 a 2217 de APP NM_001198823.1; posições 2280 a 2344 de APP NM_001198823.1; e posições 2403 a 2431 de APP NM_001198823.1 para efetuar o knockdown de APP e que se difere por não mais que 3 nucleotídeos através das ditas pelo menos 15 nucleobases contíguas de modo suficientemente complementar à dita sequência de APP direcionada para efetuar o knockdown de APP.
161. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 160, caracterizado pelo agente de RNAi compreender uma ou mais modificações selecionadas a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2'-flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato (PS) e um fosfonato de vinila (VP), opcionalmente em que o dito agente de RNAi compreende pelo menos uma de cada modificação selecionada a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo modificado de 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado de 2'- flúor, um nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila, um nucleotídeo que compreende um ácido glicolnucleico (GNA), um fosforotioato e um fosfonato de vinila (VP).
162. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 160 ou reivindicação 161, caracterizado pelo agente de RNAi compreender quatro ou mais modificações de PS, opcionalmente de seis a dez modificações de PS, opcionalmente oito modificações de PS.
163. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com a reivindicação 162, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende oito modificações de PS posicionadas nas penúltima e última ligações de internucleotídeo a partir das respectivas terminações 3’- e 5’- de cada um dos filamentos sensor e de antissenso do agente de RNAi.
164. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 163, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende apenas um nucleotídeo que compreende um GNA, opcionalmente em que o nucleotídeo que compreende um GNA é posicionado no filamento antissenso no sétimo resíduo de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
165. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 164, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dentre uma e quatro nucleotídeos modificados de 2’-C-alquila, opcionalmente em que o nucleotídeo modificado de 2’-C-alquila é um nucleotídeo modificado de 2’-C16, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende um único nucleotídeo modificado de 2’-C16, opcionalmente, o único nucleotídeo modificado de 2’-C16 é localizado no filamento sensor na sexta posição de nucleobase a partir da terminação 5’ do filamento sensor ou na posição terminal de nucleobase da extremidade 5’.
166. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 165, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor, opcionalmente em que o filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada uma, compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2’-flúor, opcionalmente em que os nucleotídeos modificados de 2’-flúor são localizados no filamento sensor nas posições de nucleobase 7, 9, 10 e 11 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições de nucleobase 2, 14 e 16 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
167. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 166, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende um ou mais modificações de VP, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende uma única modificação de VP na terminação 5’ do filamento antissenso.
168. AGENTE DE RNAi DE DUPLO FILAMENTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 160 a 167, caracterizado pelo filamento sensor e o filamento antissenso do agente de RNAi, cada um, compreender uma terminação 5’ e uma terminação 3’, e em que o agente de RNAi compreende dois ou mais nucleotídeos modificados de 2'-O-metila, opcionalmente em que o agente de RNAi compreende nucleotídeos modificados de 2'-O- metila em todas as localizações de nucleobase não modificadas por um 2'-flúor, um 2’-C-alquila ou um ácido glicolnucleico (GNA), opcionalmente em que os dois ou mais nucleotídeos modificados 2'-O-metila são localizados no filamento sensor nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21 a partir da terminação 5’ do filamento sensor e no filamento antissenso nas posições 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22 e 23 a partir da terminação 5’ do filamento antissenso.
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