JP2024508714A - スーパーオキシドジスムターゼ１－（ＳＯＤ１－）関連神経変性疾患を治療または予防するためのスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 - Google Patents

スーパーオキシドジスムターゼ１－（ＳＯＤ１－）関連神経変性疾患を治療または予防するためのスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡｉ）剤および組成物、ならびにＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法、ならびにそのようなｄｓＲＮＡ剤および組成物を使用して、ＳＯＤ１関連神経変性疾患または障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）などを有する対象を治療する方法に関する。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１４８，９９１号、および２０２１年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，１７６号に対する優先権の利益を主張する。先述の出願の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩの写しは、２０２２年２月８日に作成され、１２１３０１＿１２７２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは３６５，２１３バイトである。
スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤ）としても知られ、細胞代謝中に産生されるスーパーオキシドラジカルを酸素分子および過酸化水素に代謝するユビキタスに発現する抗酸化酵素であり、細胞を酸化的損傷から保護する上で重要な役割を果たしている（ＭｃＣｏｒｄ ＪＭ ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ Ｉ．（１９６９）Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ．２４４：６０４９－６０５５；Ｒｏｓｅｎ ＤＲ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ．３６４：３６２；Ｔｒｉｓｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．受理された著者の原稿）。ヒトＳＯＤ１遺伝子は、染色体２１ｑ２２．１１に位置し、通常は３２ｋＤａのホモ二量体を形成する１６ｋＤａのタンパク質を産生する。哺乳類細胞では、ＳＯＤ１は、サイトゾル、核、リソソーム、ペルオキシソーム、およびミトコンドリアの膜間腔（ＩＭＳ）に広く分布している（Ｆｕｋａｉ Ｔ ａｎｄ Ｕｓｈｉｏ－Ｆｕｋａｉ Ｍ．（２０１１）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．１５（６）：１５８３－１６０６；Ｚｈａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．８５：３３－４４；Ｈｕａｉ Ｊ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｚ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０：５２７）。ＳＯＤ１はサイトゾルに多く存在するため、同じくスーパーオキシドラジカルの代謝に関与する他の二つの哺乳類スーパーオキシドジスムターゼ、すなわちミトコンドリア四量体マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ２）および細胞外四量体Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ３）と区別される。しかしながら、ＳＯＤ１の活性は、哺乳類細胞における総ＳＯＤ活性の約５０～８０％を占める（Ｍｉｎｄｏｌａ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７：５９４）。
各ＳＯＤ１サブユニットの構造は、分子内ジスルフィド結合によって一緒に保持されるβ－バレルコアおよび端の七つのループ、ＳＯＤ１の触媒活性に関与する銅イオンおよび亜鉛イオンを保持する二核金属結合部位、ならびにグローバルな水素結合ネットワークからなる（Ｈｕａｉ Ｊ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｚ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０：５２７）。これまでの研究では、ＳＯＤ１の安定性、構造、および機能は、その翻訳後修飾、金属イオン結合、およびジスルフィド結合状態によって制御されることが示されている。金属コファクタの喪失および／またはジスルフィド結合の破壊は、しばしばＳＯＤ１遺伝子の変異に関連しており、ＳＯＤ１タンパク質の病原性ミスフォールディング、凝集、および／または機能障害をもたらす可能性がある（Ｈｕａｉ Ｊ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｚ．（２０１９）Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０：５２７）。
ＳＯＤ１遺伝子のコード領域と非コード領域全体を通して、約２００の変異が記録されている。変異ＳＯＤ１タンパク質は、ミスフォールディングの影響を受けやすく、保護的抗酸化機能を損ない、異常な分子相互作用（例えば、ミスフォールディングした複数のＳＯＤ１ユニット間（凝集）や、ミスフォールディングしたＳＯＤ１と他の細胞構成成分との間など）の形成を引き起こす可能性があり、それにより、機能喪失作用（例えば、抗酸化活性の低下、核内移行とプロモーター結合の障害、およびＳＯＤ１の酸化還元シグナル伝達の障害など）と機能獲得作用（例えば、神経毒性）の両方を通じて病状に寄与する（Ｔｒｉｓｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．受理された著者の原稿）。ＳＯＤ１は、例えば、心不全、癌（例えば、肺腺癌、非小細胞肺癌、および乳癌）、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、およびダウン症候群（ＤＳ）などの様々な疾患の病態に関与していると考えられている（Ｂａｎｋｓ ＣＪ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ ＪＬ．（２０１９）Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．２６：１０１２７０；Ｔｒｉｓｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．受理された著者の原稿）。神経変性疾患の文脈では、ＳＯＤ１は、プロテアソーム機能の破壊、微小管およびマイクロフィラメントの分解、小胞体ストレス、および酸化還元恒常性異常を含む、ニューロンおよび周囲のグリアの両方において損傷経路の開始および／または加速に関与していると考えられている。より具体的には、変異型ＳＯＤ１は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）に関係しており、様々なＳＯＤ１変異は、ＳＯＤ１の凝集傾向を増加させ、運動ニューロン死を誘発すると理解されている。さらに、野生型ＳＯＤ１のミスフォールディングおよび機能障害は、散発性ＡＬＳ（ａＡＬＳ）における脊髄運動ニューロンの死、パーキンソン病における黒質緻密部（ＳＮｃ）ドーパミンニューロンの死、およびアルツハイマー病における前頭皮質および海馬内のニューロンの死に関連している（Ｔｒｉｓｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．受理された著者の原稿）。さらに、ＳＯＤ１は、アルツハイマー病におけるＡβプラーク形成、およびパーキンソン病におけるα－シヌクレイン沈着を含む、他の有害な細胞病態を悪化させることによって、ニューロンの死に関係している。
スーパーオキシドジスムターゼ１－関連神経変性疾患に対する効果的な治療は現在のところなく、あるとしても緩和的なものである。したがって、高い生物学的活性およびインビボ安定性を有し、標的ＳＯＤ１遺伝子の発現を効果的に阻害することができる、細胞自身のＲＮＡｉ機序を使用してＳＯＤ１遺伝子を選択的かつ効率的にサイレンシングすることができる薬剤が依然として要望されている。
本開示は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を行うＲＮＡｉ剤組成物を提供する。当該ＳＯＤ１遺伝子は、細胞内に、例えば、ヒトなどである対象内の細胞内にあり得る。本開示はまた、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するため、および／またはＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害または減少から利益を得るであろう対象、例えば、ＳＯＤ１関連神経変性疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）に罹患しているか、または罹患しやすい対象を治療するために、本開示のＲＮＡｉ剤組成物を使用する方法を提供する。
したがって、一態様では、本発明は、二本鎖領域を形成する、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、
ａ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＣ、Ｇ、およびＴであり；ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、
ｂ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡおよびｄＴは、２’－デオキシＡおよびＴであり；ＡｆおよびＣｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＣであり、
ｃ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣは、２’－デオキシＣであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｄ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは、２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；
ｅ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から４塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｇ２ｐ）はグアノシン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｆ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、Ｔであり、Ａｆ、Ｃｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、およびＵであり；
ｇ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から４塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｈ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；ＡｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＵであり、
ｉ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から４塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；または
ｊ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から４塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から４塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは、２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである。
一実施形態では、
ａ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から３塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＣ、Ｇ、およびＴであり；ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、
ｂ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から３塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡおよびｄＴは、２’－デオキシＡおよびＴであり；ＡｆおよびＣｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＣであり、
ｃ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から３塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣは、２’－デオキシＣであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｄ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から３塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは、２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；
ｅ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から３塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｇ２ｐ）はグアノシン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；ｆ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から３塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－リン酸であり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；Ａｆ、Ｃｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、およびＵであり；
ｇ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から３塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｈ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から３塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；ＡｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＵであり、
ｉ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から３塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；または
ｊ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から３塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から３塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは、２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである。
一実施形態では、
ａ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＣ、Ｇ、およびＴであり；ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、
ｂ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡおよびｄＴは、２’－デオキシＡおよびＴであり；ＡｆおよびＣｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＣであり、
ｃ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣは、２’－デオキシＣであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｄ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは、２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；
ｅ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から２塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｇ２ｐ）はグアノシン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｆ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、Ｔであり、Ａｆ、Ｃｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、およびＵであり；
ｇ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から２塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｈ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；ＡｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＵであり、
ｉ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から２塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；または
ｊ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から２塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から２塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは、２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである。
一実施形態では、
ａ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から１塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＣ、Ｇ、およびＴであり；ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、
ｂ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から１塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡおよびｄＴは、２’－デオキシＡおよびＴであり；ＡｆおよびＣｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＣであり、
ｃ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から１塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣは、２’－デオキシＣであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｄ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から１塩基以下異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から１塩基以下異なり、式中、ＶＰは、５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）は、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、
ｓはホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり、
ｅ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から１塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｇ２ｐ）はグアノシン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｆ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から１塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、Ｔであり、Ａｆ、Ｃｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、およびＵであり；
ｇ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から１塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｈ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から１塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；ＡｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＵであり、
ｉ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から１塩基以下だけ異なり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；または
ｊ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から１塩基以下だけ異なり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から１塩基以下だけ異なり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは、２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである。
一実施形態では、
ａ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）を含み、式中、
ＶＰは、５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＣ、Ｇ、およびＴであり、ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、
ｂ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡおよびｄＴは、２’－デオキシＡおよびＴであり；ＡｆおよびＣｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＣであり、
ｃ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣは、２’－デオキシＣであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｄ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは、２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；
ｅ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）を含み、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｇ２ｐ）はグアノシン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｆ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、Ｔであり、Ａｆ、Ｃｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、およびＵであり；
ｇ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）を含み、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｈ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；ＡｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＵであり、
ｉ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）を含み、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；または
ｊ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）を含み、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）を含み、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは、２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである。
一実施形態では、
ａ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＣ、Ｇ、およびＴであり；ＣｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＣおよびＵであり、
ｂ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡおよびｄＴは、２’－デオキシＡおよびＴであり；ＡｆおよびＣｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＣであり、
ｃ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＣは、２’－デオキシＣであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｄ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは、２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；
ｅ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）からなり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｇ２ｐ）はグアノシン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡは２’－デオキシＡであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｆ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－ホスフェートであり、（Ｔｇｎ）はチミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、Ｔであり、Ａｆ、Ｃｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、およびＵであり；
ｇ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）からなり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵであり；
ｈ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃおよびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＡ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｇ、およびＴであり；ＡｆおよびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）ＡおよびＵであり、
ｉ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）からなり、およびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり、ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｇｆ、およびＵｆは２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｇ、およびＵであり；または
ｊ）センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）からなり、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）からなり、式中、ＶＰは５’－ビニルホスホネートであり、（Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、（Ｃ２ｐ）はシチジン－２’－ホスフェートであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり、ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；ｄＴは、２’－デオキシＴであり、Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、ナトリウム塩形態である。
一態様では、本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド２０１～２２３、２０４～２２６、２０７～２２９、２１６～２３８、２１９～２４１、３２８～３５０、３３３～３５５、３３６～３５８、３７２～３９４、または３７３～３９５のヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、、アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含み、、式中、（ｉ）ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含み、（ｉｉ）二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さであり、および（ｉｉｉ）センス鎖またはアンチセンス鎖は、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる。
一実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０７～２２９、２１９～２４１、３２８～３５０、または３３６～３５８のヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０７～２２９、３２８～３５０、または３３６～３５８のヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド３３６～３５８から少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、ＡＤ－１３９５７３１、ＡＤ－１３９５７４３、ＡＤ－１３９５７７１、ＡＤ－１３９５７３８、ＡＤ－１３９５７１８、ＡＤ－１３９５７６０、ＡＤ－１３９５７６４、またはＡＤ－１３９５７２４からなる群から選択される二重鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、ＡＤ－１３９５７３１、およびＡＤ－１３９５７４３からなる群から選択される二重鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１からなる群から選択される二重鎖のうちのアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
別の実施形態では、アンチセンス鎖は、二重鎖ＡＤ－１３９５７６２のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列から少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドのすべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドのすべては、修飾を含む。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、２’－５’－結合リボヌクレオチド（３’－ＲＮＡ）、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ異性体、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に連結する末端ヌクレオチド、およびドデカン酸ビスデシルアミド基、およびそれらの組み合わせである群から選択される。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
別の実施形態では、ヌクレオチド上の修飾は、独立して、２’－デオキシ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、３’－ＲＮＡ修飾、ＧＮＡ修飾、Ｓ－ＧＮＡ修飾、および２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾からなる群から選択される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む。
一実施形態では、少なくとも一つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
別の実施形態では、少なくとも一つの鎖が、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
一実施形態では、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さである。
別の実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。
一実施形態では、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである。
一実施形態では、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。
一実施形態では、一つまたは複数の親油性部分は、少なくとも一本鎖上の一つまたは複数の内側位置にコンジュゲートされる。
一実施形態では、一つの親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびにアンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される内側位置にコンジュゲートされる。
一実施形態では、内側位置は、鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５、および１７位からなる群から選択される。
別の実施形態では、内側位置は、鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖上の１５および１７位からなる群から選択される。
一実施形態では、内側位置は、センス鎖の６および７位からなる群から選択される。
一実施形態では、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。
一実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される随意の官能基とを含有する。
一実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する。
一実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する。
一実施形態では、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖は、センス鎖の５’末端から数えて、センス鎖の６または７位にコンジュゲートされる。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む。
一実施形態では、ホスフェート模倣体は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
別の実施形態では、ホスフェート模倣体は、５’－Ｅ－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
一実施形態では、二重鎖のアンチセンス鎖の５’－末端の１位置における塩基対が、ＡＵ塩基対である。
一実施形態では、センス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する。
本発明はまた、細胞、および本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ剤を含む薬学的に許容可能な希釈剤を含む医薬組成物も提供する。
一態様では、本発明は、細胞内でＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、ｄｓＲＮＡ剤または本発明の医薬組成物と接触させることと、工程（ａ）で産生された細胞をＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害することとを含む。
一実施形態では、細胞は、ヒト対象内にある。
一実施形態では、対象は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患の少なくとも一つの診断基準を満たすか、またはＳＯＤ１関連神経変性疾患と診断されている。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される。
一態様では、本発明は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患と診断された対象を治療する方法を提供し、本方法は、ｄｓＲＮＡ剤または本発明の医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより、対象を治療することを含む。
一実施形態では、治療することには、疾患の少なくとも一つの兆候または症状の改善が含まれる。
別の実施形態では、治療することには、疾患の進行の予防が含まれる。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患の少なくとも一つの診断基準を満たす対象においてＳＯＤ１関連神経変性疾患の発症を防止する方法を提供し、本方法は、治療有効量のｄｓＲＮＡ剤または本発明の医薬組成物を対象に投与し、それによって、ＳＯＤ１関連神経変性疾患に対する少なくとも一つの診断基準を満たす対象におけるＳＯＤ１関連神経変性疾患の発症を予防することを含む。
一実施形態では、対象はヒトである。
一実施形態では、対象は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患と診断されている。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に髄腔内または脳室内投与される。
一態様では、本開示は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つに列挙されたアンチセンス配列のいずれか一つから、３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む、相補性領域を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つに列挙されたアンチセンス配列のいずれか一つの少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む、相補性領域を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つに列挙されたアンチセンス配列のいずれか一つから、３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１９、例えば、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む、相補性領域を含む。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つに列挙されたアンチセンス配列のいずれか一つの少なくとも１９、例えば、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む、相補性領域を含む。特定の実施形態では、アラインされた（比較された）配列間のチミン対ウラシルまたはウラシル対チミンの差異は、アラインされた（比較された）配列間で異なるヌクレオチドとしてカウントされない。
一部の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖は、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、薬剤は、任意にリンカーまたはキャリアを介して、一つまたは複数の内側ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた一つまたは複数の親油性部分を含む。
他の実施形態では、薬剤は、肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意でコンジュゲートされた、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態では、薬剤は、任意でリンカーまたはキャリアを介して一つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた一つまたは複数の親油性部分、および肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意にコンジュゲートされた一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
本開示の別の態様は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提示されるセンス鎖配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提示されるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下、例えば、３、２、１、または１だけ異なる、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提示されるセンス鎖配列のいずれか一つの少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提示されるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つの少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、センス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提示されるセンス鎖配列のいずれか一つの少なくとも１９、例えば、１９、２０、または２１の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提示されるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つの少なくとも１９、例えば、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、薬剤は、任意にリンカーまたはキャリアを介して、一つまたは複数の内側ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた一つまたは複数の親油性部分を含む。
他の実施形態では、薬剤は、肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意でコンジュゲートされた、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態では、薬剤は、任意でリンカーまたはキャリアを介して一つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた一つまたは複数の親油性部分、および肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意にコンジュゲートされた一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
本開示の追加の態様は、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、もしくは９のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５の連続するヌクレオチド、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号１、３、５、７、および９のいずれかのチミンに対するウラシルの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号１、３、５、７、もしくは９のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下の差異（すなわち、３、２、１、もしくは０ヌクレオチドの差）、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列に寄与する差としてカウントされず、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、もしくは１０のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる少なくとも１５の連続するヌクレオチド、または配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれかのチミンに対するウラシルの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれか一つのヌクレオチド配列から３ヌクレオチド以下の差異、または配列番号２、４、６、８、もしくは１０のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列に寄与する差としてカウントされず、センス鎖およびアンチセンス鎖のうちの少なくとも一つは、任意でリンカーまたはキャリアを介して、一つまたは複数の内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた一つまたは複数の親油性部分を含む。
一実施形態では、ＳＯＤ１を標的とする二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表２～７、１２、１３、および１８～２０の二重鎖のセンス鎖ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列から３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
一実施形態では、ＳＯＤ１を標的とする二本鎖ＲＮＡｉ剤は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のうちの一つで二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列から３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。
一部の実施形態では、薬剤は、肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意でコンジュゲートした、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
任意で、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、親油性部分の親油性は、ｌｏｇＫｏｗで測定されて、０を超える。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける未結合画分で測定され、０．２を超える。関連する実施形態では、血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである。
特定の実施形態では、センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。任意で、センス鎖のすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。任意で、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
任意で、センス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシ－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシングリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、チミジングリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ異性体を含むヌクレオチド、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含むヌクレオチド、またはコレステリル誘導体に連結する末端ヌクレオチド、またはドデカン酸ビスデシルアミド基である。
関連する実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、または非天然塩基を含むヌクレオチドである。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）の短い配列を含む。
別の実施形態では、ヌクレオチドにおける修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾、２’フルオロ修飾、およびＧＮＡ修飾である。
追加的実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。任意で、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、６～８（例えば、６、７、または８）ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
特定の実施形態では、相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である。任意で、相補性の領域は、１９～２３ヌクレオチド長である。任意で、相補性の領域は、１９ヌクレオチド長である。
一実施形態では、各鎖は、３０ヌクレオチド以下の長さである。
別の実施形態では、少なくとも一つの鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。任意で、少なくとも一つの鎖は、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、一価または分岐した二価または三価のリンカーを介して、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされた親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンドをさらに含む。特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、一価または分岐した二価または三価のリンカーを介して、内側ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンドをさらに含む。
特定の実施形態では、リガンドは、Ｃ１６リガンドである。一実施形態では、リガンドは、センス鎖またはアンチセンス鎖内のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの２’－位置でコンジュゲートされる。例えば、Ｃ１６リガンドは、以下の構造に示されるようにコンジュゲートされてもよい：
式中、＊は隣接するヌクレオチドへの結合を表し、Ｂは、核酸塩基または核酸塩基類似体であり、任意に、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
他の実施形態では、薬剤は、肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意でコンジュゲートされた、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。特定の実施形態では、表３、５、７、１３、１８、および２０の修飾鎖のうちの一つは、肝組織を標的とする標的化リガンドにコンジュゲートされる。特定の実施形態では、標的化リガンドは、リンカーまたはキャリアを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤に任意でコンジュゲートされた、Ｌ９６リガンド、例えば、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。特定の実施形態では、Ｌ９６リガンドは、鎖の一つの末端にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、Ｌ９６リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
さらに他の実施形態では、薬剤は、例えば、一価または分岐の二価または三価リンカーを介して、内部ヌクレオチド位置にコンジュゲートされた親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンド、および例えば、一価または分岐の二価または三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされた一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体など、肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む。
さらに他の実施形態では、薬剤は、例えば、一価または分岐の二価または三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされた親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンド、および例えば、一価または分岐の二価または三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされた一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体など、肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む。
別の実施形態では、ＳＯＤ１に対する相補性領域は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つのアンチセンス配列のいずれか一つを含む。
追加の実施形態では、ＳＯＤ１に対する相補性の領域は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つのアンチセンス配列のいずれか一つの領域である。一部の実施形態では、内側ヌクレオチド位置は、鎖の各末端からの末端の二つの位置を除くすべての位置を含む。
関連する実施形態では、内側位置は、鎖の各末端から末端の三つの位置を除くすべての位置を含む。任意で、内側位置は、センス鎖の切断部位領域を除外する。
一部の実施形態では、内側位置は、センス鎖の５’末端から数えて９～１２位を除く。特定の実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長である。
他の実施形態では、内側位置は、センス鎖の３’末端から数えて１１～１３位を除く。任意で、内側位置は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く。特定の実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、内側位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２～１４位を除く。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は２３ヌクレオチド長である。
別の実施形態では、内側位置は、３’末端から数えてセンス鎖上の１１～１３位と、５’末端から数えてアンチセンス鎖上の１２～１４位とを除く。特定の実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、またアンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。
追加の実施形態では、一つまたは複数の親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびにアンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位の内側位置のうちの一つまたは複数にコンジュゲートされる。任意で、一つまたは複数の親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５、および１７位ならびにアンチセンス鎖上の１５および１７位の内側位置のうちの一つまたは複数にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチド長であり、またアンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。
特定の実施形態では、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。任意で、親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール（ｇｅｒａｎｙｌｏｘｙｈｅｘｙａｎｏｌ）、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸（Ｏ３－（ｏｌｅｏｙｌ）ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンである。
一部の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、またはアルキンから選択される任意の官能基とを含有する。
特定の実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する。任意で、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する。関連する実施形態では、親油性部分は、内側位置における一つまたは複数のヌクレオチドに置き換わるキャリアを介してコンジュゲートされる。特定の実施形態では、キャリアは、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、もしくはデカリニルである環式基であるか、またはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格系の非環式部分である。
一部の実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。
一実施形態では、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる。
別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’末端にホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む。任意で、ホスフェート模倣体は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。ホスフェート模倣体が５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である場合、５’末端ヌクレオチドは以下の構造を有してもよく、
式中、ＸはＯまたはＳであり、
Ｒは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、またはＣ１～２０アルコキシ（例えば、メトキシまたはｎ－ヘキサデシルオキシ）であり、
Ｒ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素とＲ５’との間の二重結合が、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）であり、また
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、随意に、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＣＮＳ組織への送達を媒介する受容体を標的とする標的化リガンドを、例えば親水性リガンドをさらに含む。特定の実施形態では、標的化リガンドは、Ｃ１６リガンドである。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、脳組織、例えば、線条体を標的とする標的化リガンドをさらに含む。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、肝組織または細胞型、例えば、肝細胞を標的とする標的化リガンドをさらに含む。
一実施形態では、親油性部分または標的化リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、またはそれらの組合せである生物切断可能な（ｂｉｏ－ｃｌｅｖａｂｌｅ）リンカーを介してコンジュゲートされる。
関連する実施形態では、センス鎖の３’末端は、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、該環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、またはデカリニルである。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、またはビニルホスホネートを含むヌクレオチドである少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。任意で、ＲＮＡｉ剤は、以下の修飾のそれぞれのうちの少なくとも一つを含む：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、およびビニルホスホネートを含むヌクレオチド。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表示されたＲＮＡｉ剤の個々のヌクレオチド塩基配列とは関係なく、２’－Ｃ１６、２’－Ｏ－メチル、ＧＮＡ、ホスホロチオエート、および２’－フルオロ修飾の位置が、表２～７、１２、１３、および１８～２０に提供されるように、修飾ヌクレオチドのパターンを含む。
本開示の別の態様は、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖のＲＮＡｉ剤を提供し、二本鎖のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖のＲＮＡｉ剤は式（ＩＩＩ）で表され、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表し、
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
センス鎖が、少なくとも一つのリガンドにコンジュゲートされている。
一実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり、ｉは１であり、ｊは１であり、ｉおよびｊは両方とも０であり、またはｉおよびｊは両方とも１である。
別の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０であり、ｋは１であり、ｌは１であり、ｋおよびｌは両方とも０であり、またはｋおよびｌは両方とも１である。
特定の実施形態では、ＸＸＸはＸ’Ｘ’Ｘ’に対して相補的であり、ＹＹＹはＹ’Ｙ’Ｙ’に対して相補的であり、ＺＺＺはＺ’Ｚ’Ｚ’に対して相補的である。
別の実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍に生じる。
追加の実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、５’末端からのアンチセンス鎖の１１、１２、および１３位で発生する。任意で、Ｙ’は２’－Ｏ－メチルである。
一部の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩａ）によって表される。
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
別の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｂ）によって表される。
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｂ）
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
追加の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｃ）によって表される。
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｃ）
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）によって表される。
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩｄ）
式中、各ＮｂおよびＮｂ’は独立して、１～５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各ＮａおよびＮａ’は独立して、２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
別の実施形態では、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さである。任意で、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さである。
特定の実施形態では、二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対の長さである。任意で、二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対の長さである。
一部の実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。任意で、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである。
特定の実施形態では、各鎖は独立して、１５～３０のヌクレオチドを有する。任意で、各鎖は独立して１９～３０のヌクレオチドを有する。任意で、各鎖は独立して１９～２３のヌクレオチドを有する。
特定の実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さであり、各鎖は１９～２３のヌクレオチドを有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のヌクレオチドにおける修飾は、ＬＮＡ、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－デオキシまたは２’－ヒドロキシル、およびそれらの組み合わせである。任意で、ヌクレオチドにおける修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、またはＧＮＡ、およびそれらの組み合わせを含む。関連する実施形態では、ヌクレオチドにおける修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、二価または三価の分岐リンカーを介して結合された、一つまたは複数の親油性部分、例えば、Ｃ１６であるリガンド、またはそれを含むリガンドを含む。
他の実施形態では、薬剤は、肝組織を標的とする標的化リガンド、例えば、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体をさらに含む。
さらに他の実施形態では、薬剤は、例えば、一価または分岐の二価または三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされた親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンド、および例えば、一価または分岐の二価または三価リンカーを介して、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされた一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体など、肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む。
特定の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結またはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含む。関連する実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の３’末端にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。関連する実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。
別の実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端および３’末端の両方にある。随意に、この鎖はアンチセンス鎖である。別の実施形態では、この鎖は、センス鎖である。
追加の実施形態では、ＲＮＡｉ剤二重鎖のアンチセンス鎖の５’－末端の１つの位置における塩基対が、Ａ：Ｕ塩基対である。
特定の実施形態では、Ｙヌクレオチドは、２－’フルオロ修飾を含有する。
一部の実施形態では、Ｙ’ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含有する。
特定の実施形態では、ｐ’＞０である。任意で、ｐ’＝２である。
一部の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、およびｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して相補的である。
特定の実施形態では、ｑ’＝０、ｐ＝０、ｑ＝０、およびｐ’オーバーハングヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに対して非相補的である。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する。
別の実施形態では、少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。任意で、すべてのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結される。
特定の実施形態では、本開示のＳＯＤ１ ＲＮＡｉ剤は、表２～７、１２、１３、および１８～２０に列挙されるもののうちの一つである。一部の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドのすべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドのすべては、修飾を含む。
本開示の別の態様は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖のＲＮＡｉ剤を提供し、二本鎖のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、細胞におけるＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖のＲＮＡｉ剤は式（ＩＩＩ）で表され、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑおよびｎｑ’は、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
センス鎖は、少なくとも一つのリガンドにコンジュゲートされ、任意でリガンドは、一つまたは複数の親油性、例えば、Ｃ１６、リガンド、または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
本開示の追加の態様は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖のＲＮＡｉ剤を提供し、二本鎖のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖のＲＮＡｉ剤は式（ＩＩＩ）で表され、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は各々独立して０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾、グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾、または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
センス鎖は、少なくとも一つのリガンドにコンジュゲートされ、任意でリガンドは、一つまたは複数の親油性、例えば、Ｃ１６、リガンド、または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
本開示の別の態様は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１（配列番号１、または配列番号１のヌクレオチド配列全体に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列）をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）によって表され、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は各々独立して０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
センス鎖は、少なくとも一つのリガンドにコンジュゲートされ、任意でリガンドは、一つまたは複数の親油性、例えば、Ｃ１６、リガンド、または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
本開示の追加の態様は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１（配列番号１、または配列番号１のヌクレオチド配列全体に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列）をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）によって表され、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は各々独立して０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
Ｎｂに対する修飾はＹに対する修飾とは異なり、Ｎｂ’に対する修飾はＹ’に対する修飾とは異なり、
センス鎖が、少なくとも一つのホスホロチオエート結合を含み、
センス鎖は、少なくとも一つのリガンドにコンジュゲートされ、任意でリガンドは、一つまたは複数の親油性、例えば、Ｃ１６、リガンド、または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
本開示の別の態様は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１（配列番号１、または配列番号１のヌクレオチド配列全体に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列）をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖は約１４～約３０ヌクレオチド長であり、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）によって表され、
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’（ＩＩＩａ）
式中、
各ｎｐ、ｎｑおよびｎｑ’は、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ｐ、ｑおよびｑ’は各々独立して０～６であり、
ｎｐ’＞０であり、少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート結合を介して隣接ヌクレオチドに連結され、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、修飾もしくは未修飾のいずれか、またはそれらの組み合わせである０～２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表し、修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾であり、
センス鎖が、少なくとも一つのホスホロチオエート結合を含み、
センス鎖は、少なくとも一つのリガンドにコンジュゲートされ、任意でリガンドは、一つまたは複数の親油性、例えば、Ｃ１６リガンド、または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
本開示の追加の態様は、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ＳＯＤ１を標的とする二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１の連続するヌクレオチド、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３の連続するヌクレオチド、または配列番号２、４、６、８、および１０のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号１～６に提供される配列におけるいずれかのチミンに対するウラシルの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号１～６に提供されるヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下の差異に寄与する差としてカウントされず、センス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾、ＧＮＡ修飾、または２’－フルオロ修飾である修飾を含み、センス鎖は、５’末端に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖の実質的にすべてのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾および２’－フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および３’末端に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は一つまたは複数の親油性リガンド、例えば、Ｃ１６リガンドにコンジュゲートされ、任意で、肝臓標的化リガンド、例えば、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含むリガンドをさらに含む。
本開示の別の態様は、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供し、ＳＯＤ１を標的とする二本鎖ＲＮＡｉ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１の連続するヌクレオチド、または配列番号１、３、５、７、もしくは９のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のヌクレオチド配列のいずれか一つから３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３の連続するヌクレオチド、または配列番号２、４、６、８、および１０のいずれか一つのヌクレオチド配列全体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性、例えば、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、配列番号１～１０に提供される配列におけるいずれかのチミンに対するウラシルの置換（アラインされた配列を比較する場合）は、配列番号１～１０に提供されるいずれか一つのヌクレオチド配列から３ヌクレオチド以下の差異に寄与する差としてカウントされず、センス鎖は、少なくとも一つの３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）を含み、アンチセンス鎖は、少なくとも一つの３’末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）を含む。
一実施形態では、センス鎖のヌクレオチドのすべておよびアンチセンス鎖のヌクレオチド のすべては、修飾ヌクレオチドである。
別の実施形態では、各鎖は、１９～３０ヌクレオチドを有する。
ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、５’領域またはその前駆体の最初の９ヌクレオチドの位置内に、二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含む。任意で、二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下のうちの一つまたは複数であり、
式中、Ｂは核酸塩基である。
本開示の別の態様は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含有する細胞を提供する。
本開示の追加の態様は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含むＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、非緩衝液中で投与される。随意に、非緩衝液は、生理食塩水または水である。
別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、緩衝液と共に投与される。随意に、緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはホスフェート、またはそれらのいずれかの組合せを含む。別の実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
本開示の別の態様は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤と脂質製剤とを含む医薬組成物を提供する。
一実施形態では、脂質製剤は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。
本開示のさらなる態様は、細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、（ａ）細胞を、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本開示の医薬組成物と接触させること、ならびに（ｂ）工程（ａ）で生じた細胞を、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害することを含む方法を提供する。
一実施形態では、細胞は、対象内にある。随意に、対象はヒトである。
特定の実施形態では、対象は、アカゲザル、カニクイザル（ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅとしても知られる）、マウス、イヌ、またはラットである。
特定の実施形態では、ヒト対象は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）に罹患する。
特定の実施形態では、本方法は、追加の治療剤または療法を対象に投与することをさらに含む。例示的な追加の治療薬および治療としては、例えば、鎮静薬、抗うつ薬、クロナゼパム、バルプロ酸ナトリウム、鎮痛剤、抗てんかん薬、コリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン、ベンゾジアゼピン、レボドパ、ＣＯＭＴ阻害剤（例えば、トルカポンおよびエンタカポン）、ドーパミン作動薬（例えば、ブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、ピリベジル、カベルゴリン、アポモルヒネおよびリスリド）、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤（例えば、サフィナミド、セレギリンおよびラサギリン）、アマンタジン、抗コリン薬、モダフィニル、ピマバンセリン、ドキセピン、ラサグリン（ｒａｓａｇｌｉｎｅ）、抗精神病薬、非定型抗精神病薬（例えば、アミスルプリド、オランザピン、リスペリドン、およびクロザピン）、リルゾール、エダラボン、脳深部の刺激、非侵襲的換気（ＮＩＶ）、侵襲的換気理学療法、作業療法、発話療法、食事の変化と嚥下法、栄養チューブ、ＰＥＧチューブ、プロバイオティクス、および心理療法が挙げられる。
特定の実施形態では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で、二本鎖ＲＮＡｉ剤が投与される。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に髄腔内投与される。
一実施形態では、本方法は、脳（例えば、線条体）または脊椎の組織内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を減少させる。随意に、脳または脊椎の組織は、線条体、前頭皮質、側頭皮質、小脳、海馬、頚椎、腰椎、または胸椎である。
一実施形態では、本方法は、眼（レンズの有無を問わず）、心臓、腎臓、肝臓、肺および／または筋組織もしくは細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を減少させる。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に皮下投与される。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に脳室内投与される。
一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、対象に髄腔内投与される。
一実施形態では、本方法は、肝臓におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を減少させる。
他の実施形態では、本方法は、肝臓および脳におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を減少させる。
本開示の別の態様は、対象においてＳＯＤ１の発現を阻害する方法であって、対象に、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本開示の医薬組成物の治療有効量を投与し、それによって該対象におけるＳＯＤ１の発現を阻害することを伴う方法を提供する。
本開示の追加の態様は、対象の障害またはＳＯＤ１関連神経変性疾患または障害を治療または予防する方法を提供し、本方法は、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤または本開示の医薬組成物の治療有効量を、対象に投与することを含み、それによって、対象のＳＯＤ１関連神経変性疾患または障害を治療または予防することを含む。
特定の実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患または障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される。
本開示の別の態様は、本開示の方法を実施するためのキットを提供し、当該キットは、ａ）本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤、およびｂ）使用説明書、およびｃ）任意に、二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための装置を含む。
本開示の追加の態様は、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ＲＮＡｉ）剤を提供し、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を有し、アンチセンス鎖は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のアンチセンス鎖核酸塩基配列のいずれか一つから、３ヌクレオチド以下だけ異なる（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３の連続するヌクレオチド、例えば、少なくとも１５、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３のヌクレオチド（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）、少なくとも１９、例えば、１９、２０、２１、２２、または２３のヌクレオチド（すなわち、３、２、１、または０ヌクレオチドだけ異なる）を含む相補性領域を含む。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、一つまたは複数の以下の修飾を含む：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、ホスホロチオエート（ＰＳ）、およびビニルホスホネート（ＶＰ）。任意で、ＲＮＡｉ剤は、以下の修飾のそれぞれのうちの少なくとも一つを含む：２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）を含むヌクレオチド、ホスホロチオエート、およびビニルホスホネート（ＶＰ）。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、四つ以上のＰＳ修飾、適宜、六つから十のＰＳ修飾、適宜、八つのＰＳ修飾を含む。
追加の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、５’－末端および３’－末端を有し、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれの３’－末端および５’－末端から、最後から二番目と最後のヌクレオチド間連結のそれぞれに位置する八つのＰＳ修飾を含む。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、５’－末端および３’－末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、ＧＮＡを含むヌクレオチドを一つだけ含む。任意で、ＧＮＡを含むヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’－末端から七番目の核酸塩基残基においてアンチセンス鎖上に位置付けられる。
追加の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、５’－末端および３’－末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、一つから四つの２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチドを含む。任意で、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチドは、２’－Ｃ１６－修飾ヌクレオチドである。任意で、ＲＮＡｉ剤は、単一の２’－Ｃ－アルキル、例えば、Ｃ１６－修飾ヌクレオチドを含む。任意で、単一の２’－Ｃ－アルキル、例えば、Ｃ１６－修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’－末端から六番目の核酸塩基残基においてセンス鎖上に位置される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、５’－末端および３’－末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、二つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。任意で、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、二つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。任意で、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、センス鎖上ではセンス鎖の５’－末端から７、９、１０、および１１位の核酸塩基に、アンチセンス鎖上ではアンチセンス鎖の５’－末端から２、１４、および１６位の核酸塩基に位置する。
追加の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、５’－末端および３’－末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、一つまたは複数のＶＰ修飾を含む。任意で、ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’－末端における単一のＶＰ修飾を含む。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれは、５’－末端および３’－末端を含み、ＲＮＡｉ剤は、二つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。任意で、ＲＮＡｉ剤は、２’－フルオロ、２’－Ｃ－アルキル、またはグリコール核酸（ＧＮＡ）によって修飾されていないすべての核酸塩基位置において、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。任意で、二つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端から１、２、３、４、５、８、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、および２１位、ならびにアンチセンス鎖の５’末端から１、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、および２３位に位置する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤はその薬学的に許容可能な塩である。本明細書のＲＮＡｉ剤の各々の「薬学的に許容可能な塩」としては、これに限定されないが、ナトリウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩、それらの混合物が含まれる。当業者であれば、ＲＮＡｉ剤は、ポリカチオン性塩として提供される場合、修飾されていてもよいホソホジエステル骨格および／または任意の他の酸性修飾（例えば、５’末端のホスホネート基）の遊離酸基当たり一つのカチオンを有することを理解するであろう。例えば、長さが「ｎ」ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドは、ｎ－１の任意に修飾されたホスホジエステルを含有し、その結果、長さ２１ｎｔのオリゴヌクレオチドは、最大２０のカチオン（例えば、２０のナトリウムカチオン）を有する塩として提供され得る。同様に、長さ２１ｎｔのセンス鎖と長さ２３ｎｔのアンチセンス鎖とを有するＲＮＡｉ剤は、最大４２のカチオン（例えば、４２のナトリウムカチオン）を有する塩として提供され得る。前述の実施例では、ＲＮＡｉ剤はまた、５’末端のホスフェート基または５’末端のビニルホスホネート基も含む場合、ＲＮＡｉ剤は、最大４４のカチオン（例えば、４４のナトリウムカチオン）を有する塩として提供され得る。
別の実施形態では、表３、５、７、１３、１８、および２０のいずれか一つに列挙されたアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか一つであるが、３’末端ヌクレオチド（３’Ｎ－１ ＡＳ）を欠くヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される（例えば、図５を参照）。別の実施形態では、表３、５、７、１３、１８、および２０のいずれか一つに列挙されたアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか一つであるが、３’末端ヌクレオチド（３’Ｎ－１ ＡＳ）を欠くヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、アンチセンスオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態では、アンチセンスヌクレオチド配列が、３’末端ヌクレオチド（３’Ｎ－１ ＡＳ）を欠くアンチセンスオリゴヌクレオチド配列で置換される、表３、５、７、１３、１８、または２０のいずれか一つに二重鎖のいずれか一つを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。
一実施形態では、配列番号１３６９～１３７８（表２３を参照）のいずれか一つのヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。一実施形態では、配列番号１３６９のヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。一実施形態では、配列番号１３７０のヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。一実施形態では、配列番号１３７１のヌクレオチド配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。
別の実施形態では、配列番号１３６９のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、アンチセンスオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態では、配列番号１３７０のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、アンチセンスオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態では、配列番号１３７１のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、アンチセンスオリゴヌクレオチドに実質的に相補的なセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。
別の実施形態では、配列番号１３６９のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、配列番号１１の配列を有するセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態では、配列番号１３７０のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、配列番号１３７１のヌクレオチド配列を有するセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。別の実施形態では、配列番号１３７１のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、配列番号１５のヌクレオチド配列を有するセンス鎖とを含むｄｓＲＮＡ二重鎖、またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。
本発明は、以下の詳細な説明および図面によってさらに図示される。
図１は、指示されたｄｓＲＮＡ二重鎖の単回の３ｍｇ／ｋｇ用量を皮下投与されたマウスにおけるヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ処理で検出された対照レベルと比較して示されている。 図２は、単回で２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、または３００μｇの用量のＡＤ－４０１８２４、または人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）の脳室内注射（ＩＣＶ）後のマウスの脳および脊髄の指示された領域におけるヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。 図３Ａは、投与後１４日目のＢＥ（２）ｃ細胞におけるｈＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現に対する、指示された二重鎖の単回用量、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、または０．１ｎＭの効果を示すグラフである。 図３Ｂは、投与後１４日目に、Ｇ９３Ａラットの腰部、胸部、および頸部の脊髄領域におけるｈＳＯＤ１ ｍＲＮＡ発現に対する、指示された二重鎖の髄腔内０．９ｍｇ単回用量の効果を示すグラフである。 図４Ａは、指示された二重鎖の単回用量を投与されたラットの頸部、胸部または腰部の脊髄における指示された二重鎖の濃度を示すグラフである。 図４Ｂは、指示された二重鎖の単回用量を投与されたラットの大脳皮質または脳幹における指示された二重鎖の濃度を示すグラフである。 図４Ｃは、指示された二重鎖の単回用量を投与されたラットの頸髄、胸髄、腰髄、大脳皮質、または脳幹における指示された二重鎖の保持時間を示す表である。 同上。 図５は、指示された二重鎖の単回用量を投与されたラットの大脳皮質および腰髄における代謝物プロファイルを示す表である。図５は、配列番号１３６６、１３６６、１３６６、１３６６－１３６７、１３６７、１３６７－１３６８、および１３６８をそれぞれ出現順に開示する。 図６は、二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１の組織曝露および代謝物プロファイリングを要約した表である。 図７は、非ヒト霊長類におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現に対する、指示された二重鎖の効果を評価する研究プロトコールを示す表である。 図８Ａは、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の７０ｍｇの髄腔内単回投与に対して、「悪い曝露」（２４時間でのＣＳＦ試料中の二重鎖レベルが＜１，０００ｎｇ／ｍＬ）、「良い曝露」（２４時間でのＣＳＦ試料中の二重鎖レベルが＞３，０００ｎｇ／ｍＬ）、または「部分曝露」（２４時間でのＣＳＦ試料中の二重鎖レベルが１，０００～３，０００ｎｇ／ｍＬ）を受けたと考えられる非ヒト霊長類の数を示す表である。 図８Ｂは、投与後３１日目および８５日目に指示された二重鎖の単回７０ｍｇの髄腔内投与後の非ヒト霊長類における、腰髄（Ｌ３）、胸髄（Ｔ１～Ｔ５）、頸髄（Ｃ７）、前頭皮質（ＦＣ）、脳幹（ＢＳ）、または脳橋試料のＳＯＤ１ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 図８Ｃは、投与後８５日目に指示された二重鎖の単回７０ｍｇの髄腔内投与後の非ヒト霊長類における、腰髄（Ｌ３）、胸髄（Ｔ１～Ｔ５）、頸髄（Ｃ７）、前頭皮質（ＦＣ）、脳幹（ＢＳ）、または脳橋試料のＳＯＤ１ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。図８Ｃは、配列番号１２８１、１２８４、７１、および１３６６～１３６８をそれぞれ出現順に開示する。 同上。 図９Ａは、投与後０日目、８日目、１４日目、２９日目、５７日目、および８５日目に指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の、個々の非ヒト霊長類からのＣＳＦ試料中のＳＯＤ１タンパク質レベルを示すグラフである。 図９Ａは、投与後０日目、８日目、１４日目、２９日目、５７日目、および８５日目に指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の、個々の非ヒト霊長類からのＣＳＦ試料中のＳＯＤ１タンパク質レベルを示すグラフである。 図９Ｂは、投与後８５日目までの指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の個々の非ヒト霊長類からのＣＦＳ試料中のＳＯＤ１タンパク質レベル（上）、および投与後８５日目が１４１日目まで延長された指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の個々の非ヒト霊長類からのＣＳＦ試料中の指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の三頭の個々の非ヒト霊長類からのＣＦＳ試料中のＳＯＤ１タンパク質レベルを示すグラフである。 図９Ｃは、投与後８５日目に指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の、非ヒト霊長類の前頭前野、胸髄（Ｔ９－１２）およびＣＳＦ試料中のＳＯＤ１タンパク質レベルを示すグラフである。 同上。 同上。 図１０は、指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後のＮＨＰにおいて、前頭前皮質試料および胸髄（Ｔ９－１２）試料で観察されたｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの減少が、高度かつ有意に相関していることを示すグラフである。 図１１Ａは、指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の前頭前野、脳幹、脳橋、頸髄（ＳＣ＿Ｃ５－Ｃ６）、頸髄（ＳＣ＿Ｃ７）、胸髄（ＳＣ＿Ｔ１－Ｔ５）、胸髄（ＳＣ＿Ｔ９－Ｔ１２）、および腰髄（ＳＣ＿Ｌ３）組織における、ｍＲＮＡ残存量対ｓｉＲＮＡ曝露量を示すグラフである。 図１１Ｂは、指示された二重鎖の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の前頭前野皮質および胸髄（ＳＣ＿Ｔ０－Ｔ１２）の両試料において、ｓｉＲＮＡ曝露量に対するｍＲＮＡとタンパク質の両方の減少の間に強い相関があることを示すグラフである。 同上。 図１２Ａ～１２Ｈは、１９９～２２５位（図１２Ａ、ＰＣＨ；図１２Ｂ、Ｂｅ（２）Ｃ）、３１９～３３７位（図１２Ｃ、ＰＣＨ；図１２Ｄ、Ｂｅ（２）Ｃ）、３６４～３８２位（図１２Ｅ、ＰＣＨ；図１２Ｆ、Ｂｅ（２）Ｃ）、および５１６～５４０位（図１２Ｇ、ＰＣＨ；図１２Ｈ、Ｂｅ（２）Ｃ）で始まる標的配列を有する二重鎖について、ＮＭ＿０００４５４．４に対してマッピングされたＰＣＨまたはＢｅ（２）Ｃ細胞における表１４および１５の二重鎖のそれぞれについてのインビトロＳＯＤ１ノックダウンを示す積み重ね棒グラフである。 同上。 同上。 同上。 図１３は、髄腔内投与後３１日目および８５日目における、ＮＨＰの腎臓および肝臓に投与された指示されたｄｓＲＮＡ剤の薬力学的効果の実質的な欠如を示すグラフである。
本開示は、ＳＯＤ１遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介切断を行うＲＮＡｉ組成物を提供する。当該ＳＯＤ１遺伝子は、細胞内に、例えば、ヒトなどである対象内の細胞内にあり得る。本開示はまた、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するため、またはＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害または減少から利益を得るであろう障害を有する対象、例えば、ＳＯＤ１関連神経変性疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）を治療するために、本開示のＲＮＡｉ組成物を使用する方法を提供する。
本開示のＲＮＡｉ剤は、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、その領域は、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対し実質的に相補的である。特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、約２１～２３ヌクレオチドの長さである領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、該領域が、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である。
特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、例えば長さが最大６６ヌクレオチド、例えば３６～６６、２６～３６、２５～３６、３１～６０、２２～４３、２７～５３ヌクレオチドであるより長い長さを含み得るＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、これが、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である少なくとも１９の連続するヌクレオチドの領域を伴う。より長い長さのアンチセンス鎖をもつこれらＲＮＡｉ剤は、好ましくは、長さが２０～６０ヌクレオチドの第二のＲＮＡ鎖（センス鎖）を含み、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖が、１８～３０の連続するヌクレオチドの二重鎖を形成する。
これらＲＮＡｉ剤の使用は、哺乳動物におけるＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡの標的分解を可能にする。したがって、これらのＲＮＡｉ剤を含む方法および組成物は、ＳＯＤ１タンパク質のレベルまたは活性の減少によって利益を得る対象、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）などのＳＯＤ１関連神経変性疾患を有する対象を治療するのに有用である。
以下の詳細な説明は、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤を含有する組成物を作製および使用する方法、ならびに遺伝子の発現の阻害または減少から恩恵を受けることとなる疾患および障害を有する対象を治療するための組成物および方法を開示する。
Ｉ．定義
本開示がさらに容易に理解され得るために、最初に特定の用語を定義する。加えて、パラメータの値または値の範囲が列記される場合にはいつでも、列記された値の中間の値および範囲も、本開示の一部であることが意図されることが意図される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法上の目的語の一つまたは複数（すなわち、少なくとも一つ）を意味するために使用する。例えば、「ある要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、一つの要素または複数の要素、例えば、複数の要素を意味する。
用語「～を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、語句「～を含むが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味するために本明細書において使用され、また当該語句と区別なく使用する。
用語「または」は、文脈において別途明示しない限り、用語「および／または」を意味するために本明細書において使用され、また当該用語と区別なく使用する。
用語「約」は、当技術分野において、典型的な許容誤差の範囲内であることを意味するために本明細書で使用する。例えば、「約」は、平均から約２の標準偏差として理解され得る。特定の実施形態では、約は、±１０％を意味する。特定の実施形態では、約は、±５％を意味する。一連の数字または範囲の前に約がある場合、「約」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
ある数字または連続する数字の前にある用語「少なくとも」、「以上」または「またはそれ以上」は、文脈から明白な場合、用語「少なくとも」に隣接する数字、および論理的に含まれ得るそれに続くすべての数字または整数を含むことが理解される。例えば、ある核酸分子内のヌクレオチドの数は、整数であるはずである。例えば、「２１ヌクレオチド核酸分子の少なくとも１８ヌクレオチド」は、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。連続する数字または範囲の前に少なくともがある場合、「少なくとも」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用する場合、「～以下」または「以下」は、その語句に隣接する値と、文脈から論理的である場合はゼロまでのその値より論理的により小さい値または整数として理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二重鎖は、２、１、または０ヌクレオチドのオーバーハングを有する。連続する数字または範囲の前に「～以下」がある場合、「～以下」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。本明細書において使用する場合、範囲は、上限および下限の両方を含む。
本明細書において使用する場合、検出の方法は、存在する分析物の量がその方法の検出レベルを下回る判定を含み得る。
示した標的部位と、センス鎖またはアンチセンス鎖に関するヌクレオチド配列と矛盾する場合には、示した配列を優先する。
化学構造と化学名称が一致しない場合、化学構造を優先する。
本明細書で使用される場合、用語「ＳＯＤ１」と互換的に使用される用語「スーパーオキシドジスムターゼ１」は、スーパーオキシドジスムターゼ［Ｃｕ－Ｚｎ］、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ、精巣上体分泌タンパク質Ｌｉ ４４、ＥＣ １．１５．１．１、およびインドフェノールオキシダーゼＡとしても当技術分野で知られる、周知の遺伝子およびポリペプチドを指す。用語「ＳＯＤ１」はヒトＳＯＤ１を含み、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００４５４．４（ＧＩ：４８７６２９４５；配列番号１）に見られ、マウスＳＯＤ１、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１１４３４．１（ＧＩ：４５５９７４４６；配列番号３）に見られ、カニクイザル（ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅ、ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙとしても知られる）ＳＯＤ１、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１２８５４０６．１（ＧＩ：５４９４３２９８８；配列番号５）に見られ、イヌＳＯＤ１、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１００３０３５．１（ＧＩ：５０９７８６７３；配列番号７）に見られ、ラットＳＯＤ１、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１７０５０．１（ＧＩ：８３９４３２７；配列番号９）に見られ得る。
ＳＯＤ１のｍＲＮＡ配列のさらなる例としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＯＭＩＭ、およびＭａｃａｃａゲノムプロジェクトウェブサイトを使用して容易に入手可能である。
例示的なＳＯＤ１ヌクレオチド配列はまた、配列番号１～１０に見られ得る。配列番号２、４、６、８、および１０はそれぞれ、配列番号１、３、５、７、および９の逆相補的配列である。
ＳＯＤ１に関する詳細情報は、例えば、ＮＣＢＩ遺伝子データベースに提供されているｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６６４７。
先述のＧｅｎＢａｎｋ登録番号および遺伝子データベース番号のそれぞれの内容全体は、本願出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用する場合、用語「スーパーオキシドジスムターゼ１」および「ＳＯＤ１」はまた、ＳＯＤ１遺伝子の天然由来のＤＮＡ配列バリエーションを指す。ＳＯＤ１遺伝子内の多数の配列バリエーションは特定されており、例えば、ＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰおよびＵｎｉＰｒｏｔにおいて見られ得る（例えば、その内容全体が本願出願日の時点で参照により本明細書に組み込まれる、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ／？ＬｉｎｋＮａｍｅ＝ｇｅｎｅ＿ｓｎｐ＆ｆｒｏｍ＿ｕｉｄ＝６６４７を参照）。
本明細書において使用する場合、「標的配列」は、例えば一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡなどである、ＳＯＤ１遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列における連続する部分を意味する。一実施形態では、配列の標的部分は、少なくとも、ＳＯＤ１遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の一部分において、またはその近傍におけるＲＮＡｉ依存性の切断のための基質として機能するのに十分な長さであることとなる。一実施形態では、標的配列は、ＳＯＤ１遺伝子のタンパク質コード領域内にある。別の実施形態では、標的配列は、ＳＯＤ１遺伝子の３’ＵＴＲ内にある。
標的配列は、長さが約９～３６ヌクレオチド、例えば、長さが約１５～３０ヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、約１５～３０ヌクレオチド、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、標的配列は、長さが約１９～約３０ヌクレオチドである。他の実施形態では、標的配列は、長さが約１９～約２５ヌクレオチドである。さらに他の実施形態では、標的配列は、長さが約１９～約２３ヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的配列は、長さが約２１～約２３ヌクレオチドである。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本発明の一部であることを意図している。
本明細書において使用する場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチドの用語体系を使用して言及される配列によって説明するヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ｚ」、「Ｔ」、および「Ｕ」はそれぞれ、概して、修飾ヌクレオチドまたは未修飾ヌクレオチドの文脈において、それぞれ、塩基としてのグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代替置換部分（例えば、表１を参照）も指し得ることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変更することなく、他の部分で置換できることを十分に意識している。例えば、これらに限定されるものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本開示において取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置換することができる。別の実施例では、オリゴヌクレオチド内のいずれの箇所にあるアデニンおよびシトシンも、標的ｍＲＮＡと対合するＧ－Ｕ揺らぎ塩基を形成するために、それぞれグアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示において取り上げる組成物および方法にとって好適である。
本明細書において区別なく使用する、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」は、本明細書において用語が定義されるＲＮＡを含有し、かつＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的切断を媒介するような、薬剤を指す。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｍＲＮＡの配列特異的分解を司るプロセスである。ＲＮＡｉは、細胞内の、例えば、哺乳動物対象などの対象内の細胞内におけるＳＯＤ１の発現を調節、例えば、阻害する。
一実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を司るために、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＳＯＤ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用する一本鎖ＲＮＡｉを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと分解されると考えられる（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ＤｉｃｅｒであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、これらｄｓＲＮＡを、特徴的な二つの塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。その後これらｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで一つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を解き、それによって相補的アンチセンス鎖に対して標的認識を誘導することが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の一つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。すなわち、一態様においては、本開示は、細胞内において生成されて、かつＲＩＳＣ複合体の形成を促進して標的遺伝子、すなわちＳＯＤ１遺伝子のサイレンシングを行うものである、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」は、上記において説明したＲＮＡｉも意味するために本明細書において使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または有機体に導入された一本鎖ＲＮＡであり得る。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼであるアルゴノート２に結合し、それは次いで、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、概して、１５～３０ヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載されており、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において記載するアンチセンスヌクレオチド配列はいずれも、本明細書において記載する一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される方法によって化学的に修飾されるような一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用され得る。
別の実施形態では、本開示の組成物および方法で使用する「ＲＮＡｉ剤」は、二本鎖ＲＮＡであり、また本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、または「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。用語「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡ、すなわちＳＯＤ１遺伝子に関して「センス」または「アンチセンス」配向を有するとして言及する、二本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本開示の一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、本明細書においてＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称する転写後遺伝子サイレンシング機序を経て、標的ＲＮＡの、例えば、ｍＲＮＡの分解を誘発する。
概して、ｄｓＲＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含むことができるが、本明細書において詳細に説明されるように、それぞれの鎖または両方の鎖は、一つまたは複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、も含み得る。加えて、本明細書において使用する場合、「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得、ＲＮＡｉ剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結、または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドなる用語は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基に対する、例えば、官能基または原子などの置換、付加、または除去を包含する。本開示の薬剤における使用に好適な修飾は、本明細書において開示する修飾または当技術分野で公知の修飾のすべてのタイプを包む。ｓｉＲＮＡタイプの分子において使用する、任意のそのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
本開示の特定の実施形態では、ヌクレオチドの天然の形態として認識されているものであるデオキシ－ヌクレオチドを包含することが、それがＲＮＡｉ剤内に存在する場合には、修飾ヌクレオチドを構成していると見なすことができる。
二重鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介して所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能にする任意の長さであってもよく、約９～３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０塩基対の長さ、例えば、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対の長さ、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さの範囲であってもよい。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本発明の一部であることを意図している。
二重鎖構造を形成する二本の鎖は、一つのより大きいＲＮＡ分子にのうちの異なる部分であり得るか、またはそれらは、別個のＲＮＡ分子であり得る。二本の鎖が、一つのより大きい分子のうちの部分であり、そのために二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応するもう一方の鎖の５’末端との間にある中断されないヌクレオチドの鎖でつながっている場合、その接続しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも一つの不対のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の、不対のヌクレオチドまたはｄｓＲＮＡの標的部位に向けられないヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、１０以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、８以下の不対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～１０の不対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、ヘアピンループは、４～８のヌクレオチドであり得る。
特定の実施形態では、二本鎖オリゴマー化合物の二本の鎖が、互いに連結し得る。この二本の鎖は、両端において、または一端のみにおいて、互いに連結し得る。一端で連結するということは、第一の鎖の５’末端が第二の鎖の３’末端に連結されていること、または第一の鎖の３’末端が第二の鎖の５’末端に連結されていることを意味する。二本の鎖が両端で互いに連結している場合は、第一の鎖の５’末端が第二の鎖の３’末端に連結され、また第一の鎖の３’末端が第二の鎖の５’末端に連結されている。二本の鎖は、（Ｎ）ｎを含むがこれに限定されないオリゴヌクレオチドリンカーによって一緒に連結され得、式中、Ｎは独立に修飾ヌクレオチドまたは未修飾ヌクレオチドであり、またｎは３～２３である。一部の実施形態では、ｎは３～１０であり、例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドリンカーは、ＧＮＲＡ、（Ｇ）４、（Ｕ）４、および（ｄＴ）４からなる群から選択されるものであり、式中Ｎは、修飾ヌクレオチドまたは未修飾ヌクレオチドであり、またＲは、修飾プリンヌクレオチドまたは未修飾プリンヌクレオチドである。リンカー中のヌクレオチドの一部は、リンカー中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。二本の鎖はまた、非ヌクレオシドのリンカーによって、例えば、本明細書に記載するリンカーによって、一緒に連結され得る。当業者であれば、本明細書に記載するいずれかのオリゴヌクレオチドの化学修飾またはバリエーションを、オリゴヌクレオチドリンカーで使用できることを理解するであろう。
ヘアピンおよびダンベル型オリゴマー化合物は、１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５のヌクレオチド対と同等の、または少なくとも１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５のヌクレオチド対の二重鎖領域を有することとなる。二重鎖領域は、長さが２００、１００、または５０以下であり得る。一部の実施形態では、二重鎖領域の範囲は、長さが１５～３０、１７～２３、１９～２３、および１９～２１ヌクレオチド対である。
ヘアピンオリゴマー化合物は、一部の実施形態では３’に、また一部の実施形態ではヘアピンのアンチセンス側上に、一本鎖のオーバーハングまたは末端非対領域を有し得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、長さが１～４ヌクレオチド、より広くは２～３ヌクレオチドである。ＲＮＡ干渉を誘発することができるヘアピンオリゴマー化合物は、本明細書では「ｓｈＲＮＡ」とも称する。
ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な二本の鎖が、別個のＲＮＡ分子で構成される場合、それら分子は必ずしもそうではないが、共有結合で結合することができる。二本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端とそれに対応するもう一方の鎖の５’末端との間にある中断されないヌクレオチドの鎖とは異なる手段で共有結合によりつながっている場合、その接続している構造を「リンカー」と称する。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖にあるヌクレオチドの数から二重鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、一つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤はｄｓＲＮＡであり、その各鎖は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＳＯＤ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する２４～３０ヌクレオチド長である。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ（ダイサー）として知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡへと分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ＤｉｃｅｒであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、このｄｓＲＮＡを、特徴的な二つの塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。その後ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで一つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を解き、それによって相補的アンチセンス鎖に対して標的認識を誘導することが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の一つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤はｄｓＲＮＡ剤であり、その各鎖は、ＳＯＤ１ ＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する１９～２３ヌクレオチドを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ（ダイサー）として知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡへと分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。ＤｉｃｅｒであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、このｄｓＲＮＡを、特徴的な二つの塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。その後ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで一つまたは複数のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二重鎖を解き、それによって相補的アンチセンス鎖に対して標的認識を誘導することが可能になる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の一つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、ＳＯＤ１ ＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する２４～３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。
本明細書において使用する場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出する少なくとも一つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、もう一方の鎖の５’末端を越えて延びる場合、またはその逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも一つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得、あるいは該オーバーハングは、少なくとも二つのヌクレオチド、少なくとも三つのヌクレオチド、少なくとも四つのヌクレオチド、少なくとも五つのヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどであるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組合せ上にあり得る。さらに、あるオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドの一つまたは複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドの一つまたは複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖上のオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長い伸長した長さを含み得、例えば、長さが１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、オーバーハングにおけるヌクレオチドの一つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。特定の実施形態では、オーバーハングは、オーバーハングが生理学的条件下において安定なヘアピン構造を形成することができるような自己相補性部分を含む。
特定の実施形態では、少なくとも一本の鎖の少なくとも一方の末端は二重鎖ターゲティング領域を超えて伸長するものであり、これには両鎖のうちの一方が熱力学的に安定なテトラループ構造を含む構造が挙げられる（例えば、そのそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５１３，２０７号および第８，９２７，７０５号ならびに国際公開第２０１００３３２２５号を参照）。そのような構造は、一本鎖伸長（当該分子の片側または両側における）ならびに二本鎖伸長を含み得る。
特定の実施形態では、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方を含むポリヌクレオチド配列によって接合され、随意にポリヌクレオチド配列は、テトラループ配列を含む。特定の実施形態では、センス鎖は、２５～３５ヌクレオチドの長さである。
テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、およびそれらの組合せを含み得る。典型的には、テトラループは、４から５ヌクレオチドを有する。一部の実施形態では、ループは、ＧＡＡＡと記載する配列を含む。一部の実施形態では、ループのヌクレオチド（ＧＡＡＡ）のうちの少なくとも一つは、ヌクレオチド修飾を含む。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’修飾を含む。一部の実施形態では、２’修飾は、２’－アミノエチル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－アミノジエトキシメタノール、２’－アデム（ａｄｅｍ）、および２’－デオキシ－２’－フィオロ（ｆｈｉｏｒｏ）－－ｄ－アラビノ核酸（ａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択される修飾である。一部の実施形態では、ループのすべてのヌクレオチドが修飾される。一部の実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のＧは、２’－ＯＨを含む。一部の実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のそれぞれのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。一部の実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のそれぞれのＡは、２’－ＯＨを含み、またＧＡＡＡ配列内のＧは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。好ましい実施形態では、一部の実施形態では、ＧＡＡＡ配列内のそれぞれのＡは、２’－Ｏ－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾を含み、またＧＡＡＡ配列内のＧは、２’－Ｏ－メチル修飾を含むか、またはＧＡＡＡ配列内のそれぞれのＡは、２’－アデム（ａｄｅｍ）修飾を含み、またＧＡＡＡ配列内のＧは、２’－Ｏ－メチル修飾を含む。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開公報である国際公開第２０２０／２０６３５０号を参照されたい。
例示的な２’アデム（ａｄｅｍ）修飾ヌクレオチドを以下に示す。
ｄｓＲＮＡの一実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。別の実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの、３’オーバーハングを含む。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの５’オーバーハングを含む。特定の実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの、例えば、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの、５’オーバーハングを含む。さらに他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’末端および５’末端の両方が、少なくとも１ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、０～３、１～３、２～４、２～５、４～１０、５～１０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、３’末端または５’末端において１～１０ヌクレオチドの、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドの、オーバーハングを有する。別の実施形態では、オーバーハング内のヌクレオチドの一つまたは複数が、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
特定の実施形態では、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはその両方の上のオーバーハングは、１０ヌクレオチドより長い伸長した長さを含み得、例えば、長さが１～３０ヌクレオチド、２～３０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、または１０～１５ヌクレオチドである。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖上にある。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖上にある。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、伸長したオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、オーバーハングにおけるヌクレオチドの一つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。特定の実施形態では、オーバーハングは、オーバーハングが生理学的条件下において安定なヘアピン構造を形成することができるような自己相補性部分を含む。
用語「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書において使用する場合、ｄｓＲＮＡの所定の末端において不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方の末端または両末端が、平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両末端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは、平滑末端であると言う。明瞭化のため、「平滑末端」のｄｓＲＮＡは、両末端が平滑であるｄｓＲＮＡ、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、こうした分子は、その全長にわたって二本鎖となることとなる。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えば、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡに対して実質的に相補的な領域を含む、例えば、ｄｓＲＮＡであるＲＮＡｉ剤の鎖を指す。
本明細書において使用する場合、用語「相補性の領域」は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＳＯＤ１ヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、そのミスマッチは、分子の内側領域内または末端領域内にあり得る。概して、最も許容できるミスマッチは、末端領域内、例えば、ＲＮＡｉ剤の５’末端または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチドの範囲内にある。
一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖内のヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡとの４以下のミスマッチを含み、例えば、アンチセンス鎖が、標的ｍＲＮＡとの４、３、２、１、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明のアンチセンス鎖の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖との４以下のミスマッチを含み、例えば、アンチセンス鎖が、センス鎖との４、３、２、１、または０のミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤は、センス鎖内にヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡ剤のセンス鎖は、アンチセンス鎖との４以下のミスマッチを含み、例えば、センス鎖が、アンチセンス鎖との４、３、２、１または０のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡの３’末端から５、４、３ヌクレオチドの範囲内にある。別の実施形態では、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、ｉＲＮＡ剤の３’末端ヌクレオチド内にある。一部の実施形態では、ミスマッチは、シード領域にはない。
したがって、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、標的配列に対する一つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、３以下のミスマッチ（すなわち、３、２、１、または０のミスマッチ）を含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、２以下のミスマッチを含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、１以下のミスマッチを含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、０のミスマッチを含有する。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含有する場合、該ミスマッチは、随意に、相補性領域の５’末端または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチドの範囲内にあるように制限することができる。例えば、そのような実施形態では、２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤の場合、ＳＯＤ１遺伝子の領域に対して相補的な鎖は、概して、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書において記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対してミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害において効果的であるか否かを判定することができる。とりわけ、ＳＯＤ１遺伝子における相補性の特定の領域が、集団内での多形配列バリエーションを有することがわかっている場合には、ＳＯＤ１の発現を阻害するミスマッチを有するＲＮＡｉ剤の有効性を考慮することが重要である。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書において使用する場合、本明細書において用語が定義されるようなアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むＲＮＡｉ剤の鎖を意味する。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドの実質的にすべてが修飾されている」は、広く修飾されているが全体が修飾されているものではなく、また５、４、３、２、もしくは１以下であり、または未修飾のヌクレオチドを含み得る。
本明細書において使用する場合、用語「切断領域」は、切断部位に直接隣接して位置する領域を指す。切断部位は、切断が生じる箇所である標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のどちらかの末端における直接隣接している三つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のどちらかの末端における直接隣接している二つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位において特異的に生じ、またこの切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。
本明細書において使用する場合、特に別段に示さない限り、用語「相補的」は、第二のヌクレオチド配列との関連において第一のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合には、当業者によって理解されることとなるとおり、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと特定の条件下においてハイブリダイズして二重鎖構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば「ストリンジェントな条件」であり得、該ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２～１６時間、その後の洗浄を含み得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照）。生物体内で遭遇し得るような生理学的に関連のある条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、二つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができる。
ＲＮＡｉ剤内の、例えば、本明細書において説明されるｄｓＲＮＡ内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の長さ全体にわたって、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」であると称し得る。しかしながら、本明細書において、第一の配列が第二の配列に対して「実質的に相補的」であるという場合、この二つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらはその最終的な用途に、例えば、インビトロまたはインビボで、遺伝子発現の阻害に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を維持しつつ、最大３０塩基対の二重鎖についてのハイブリダイゼーションの際に、一つまたは複数であるが、概して５、４、３、または２以下である、ミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、二つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に一つまたは複数の一本鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合には、かかるオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチとはみなさないものとする。例えば、長さが２１ヌクレオチドである一方のオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドであるもう一方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むようなｄｓＲＮＡは、依然として、本明細書において記載する目的に関しては「完全に相補的」と称し得る。
「相補的」配列は、本明細書において使用する場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件を満足する限り、非ワトソン・クリック塩基対、または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、または全体的にそれらから形成され得る。かかる非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるものではないが、Ｇ：Ｕ揺らぎ塩基対またはフーグスティーン塩基対が挙げられる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらの使用の文脈から理解されることとなるとおり、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖と標的配列などである二つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド間における塩基マッチングに関連して使用され得る。
本明細書において使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの中断されない部分に対して実質的に相補的である場合、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
したがって、一部の実施形態では、本明細書において開示されるアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＳＯＤ１配列に対して完全に相補的である。
他の実施形態では、本明細書において開示するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、標的ＳＯＤ１配列に対して実質的に相補的であり、ＳＯＤ１についての配列番号１、３、５、７、もしくは９のヌクレオチド配列、または配列番号１、３、５、７、もしくは９の断片の等価領域対して、その全長にわたって少なくとも約８０％相補的、例えば、約８５％、約９０％、または約９５％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
他の実施形態では、本明細書において開示するアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ＳＯＤ１配列に対して実質的に相補的であり、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つ、または表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの断片に対して、その全長に対して少なくとも約８０％相補的、例えば約８５％、約９０％、または約９５％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、同様に標的ＳＯＤ１配列と同じであるアンチセンスポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であるセンス鎖を含み、また該センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、または１０のヌクレオチド配列の等価領域、または配列番号２、４、６、８、または１０のいずれかの一つの断片に対して、その全長に対して少なくとも約８０％相補的、例えば約８５％、約９０％、または約９５％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、同様に標的ＳＯＤ１配列に対して相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドに実質的に相補的であるセンス鎖を含み、また該センス鎖ポリヌクレオチドは、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つのうちのいずれか一つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つ、または表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のうちのいずれか一つの断片に対して、その全長に対して少なくとも約８０％相補的、例えば約８５％、約９０％、または約９５％相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、長さが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれ以上のヌクレオチド対と等しいか、または少なくとも等しい。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、長さが、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドと等しいか、または少なくとも等しい。
一部の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、長さが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドと等しいか、または少なくとも等しい。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが、それぞれ独立して、１５～３０ヌクレオチドである。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが、それぞれ独立して、１９～２５、または１９～３０ヌクレオチドである。
一実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、長さが、それぞれ独立して、２１～２３ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、長さが、２１ヌクレオチドであり、またアンチセンス鎖は、長さが、２３ヌクレオチドであり、この場合において当該鎖は、３’末端に２ヌクレオチド長の一本鎖のオーバーハングを有する２１の連続する塩基対の二本鎖領域を形成する。
本発明の一態様では、本発明の方法および組成物で使用するための薬剤が、アンチセンス阻害機構を介して標的ｍＲＮＡを阻害する一本鎖アンチセンス核酸分子である。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ内の配列に対して相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡと塩基対形成し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７－３５５を参照されたい。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１５～約３０ヌクレオチド長であってもよく、標的配列に対して相補的な配列を有する。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか一つから少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドである配列を含んでもよい。
一実施形態では、ＳＯＤ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの量の減少で評価されるものであって、ＳＯＤ１遺伝子が転写されており、またＳＯＤ１遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第一の細胞または細胞の群から単離することができるか、またはそれらにおいて検出することができる該ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの量が、第一の細胞または細胞の群と実質的に同一だが第一の細胞または細胞の群のようには処理されていない第二の細胞または細胞の群（対照細胞）と比較して、減少していることによって評価される。阻害の程度は、以下によって表すことができる。
一実施形態では、発現の阻害は、ＲＮＡｉ剤が１０ｎＭで存在する、実施例１の二重ルシフェラーゼ法によって決定される。
ｄｓＲＮＡなどの「細胞をＲＮＡｉ剤と接触させること」なる語句は、本明細書において使用する場合、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを包含する。細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることは、細胞をインビトロでＲＮＡｉ剤と接触させることまたは細胞をインビボでＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。接触させることは、直接的または間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、方法を個別に実施することによって、細胞と物理的に接触させ得るか、あるいはＲＮＡｉ剤は、その後に細胞と接触することを可能にし得るまたは引き起こし得るような状況に置かれ得る。
細胞をインビトロで接触させることは、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させることは、例えば、ＲＮＡｉ剤を細胞が位置している組織中もしくはその近傍に注入することによって、または別の領域に、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）に、随意に髄腔内注入、脳室内注入もしくは他の注入によって、ＲＮＡｉ剤を注入することによって、または薬剤がその後に接触対象の細胞が位置している組織に到達することとなるように、血流もしくは皮下腔にＲＮＡｉ剤を注入することによって、行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位に、例えば、ＣＮＳにおいてＲＮＡｉ剤を向かわせるかまたはそうでなければ安定化するリガンド、例えば、下記において説明され、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公報第ＷＯ２０１９／２１７４５９号においてさらに詳述されるような親油性部分、を含み得るかまたはそれにカップリングされ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、対象部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を向けるか、またはそうでなければ安定化させるリガンド、例えば、以下に記載される一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含有するか、またはそれらに結合することができる。他の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、親油性部分または一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含有するか、またはそれらに結合することができる。インビトロおよびインビボでの接触方法の組合せもまた可能である。例えば、細胞をインビトロにおいてＲＮＡｉ剤と接触させて、その後に対象に移してもよい。
一実施形態では、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を促進または実施することによって「導入すること」または「ＲＮＡｉ剤を細胞内に送達すること」を含む。ＲＮＡｉ剤の吸収または取り込みは、自発的拡散性のもしくは活性な細胞プロセスによって、または助剤もしくはデバイスによって生じ得る。ＲＮＡｉ剤を細胞内に導入することは、インビトロまたはインビボであり得る。例えば、インビボでの導入の場合、ＲＮＡｉ剤は、組織部位に注入され得るかまたは全身的に投与され得る。インビトロでの細胞内への導入としては、当技術分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーション法およびリポフェクション法などが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書の下記において説明されるか、または当技術分野で公知である。
用語「脂溶性」または「親油性部分」は、脂質に対して親和性を有する任意の化合物または化学部分を広く意味する。親油性部分の親油性を特徴付ける方法の一つは、オクタノール－水分配係数ｌｏｇＫｏｗによるものであり、この場合Ｋｏｗは、平衡状態にある二相系のうちの水相の化学物質の濃度に対するオクタノール相の化学物質の濃度の比である。オクタノール－水分配係数は、物質の実験室測定される特性である。しかしながら、それは、第一原理または経験的方法を使用して算出される化学物質の構造成分に起因する係数を使用することによっても予想され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．４１：１４０７－２１（２００１）を参照）。それは、水よりもむしろ非水性または油性環境を好む物質の傾向の熱力学的尺度（すなわち、その親水性／親油性バランス）をもたらす。原則として、化学物質は、そのｌｏｇＫｏｗが０を超える場合、性質が親油性である。典型的には、親油性部分は、１を超える、１．５を超える、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、または１０を超える、ｌｏｇＫｏｗをもつ。例えば、６－アミノヘキサノールのｌｏｇＫｏｗは、例えばおよそ０．７であると予測される。同じ方法を使用することにより、Ｎ－（ヘキサン－６－オール）カルバミン酸コレステリルのｌｏｇＫｏｗは、１０．７であると予測される。
分子の親油性は、分子が有する官能基に応じて変化し得る。例えば、親油性部分の末端にヒドロキシル基またはアミン基を付加することにより、親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫｏｗ）の値が増加または減少し得る。
あるいは、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイの非結合画分が、二本鎖ＲＮＡｉ剤の相対的疎水性に対して正に相関することを判定することとなれば、それは次いで二本鎖ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性に対して正に相関することとなる。
一実施形態では、判定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的プロトコールは、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ２０１９／２１７４５９号において詳細に説明される。結合アッセイにおけるｓｉＲＮＡの非結合画分によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、増強されたｓｉＲＮＡのインビボでの送達の場合では、０．１５を超える、０．２を超える、０．２５を超える、０．３を超える、０．３５を超える、０．４を超える、０．４５を超える、または０．５を超える。
したがって、親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ剤の内側位置にコンジュゲートすることにより、ｓｉＲＮＡにおける増強されたインビボでの送達のために最適の疎水性がもたらされる。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、薬学的に活性な分子を、例えば核酸分子、例えば、ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤の転写元のプラスミドなどを、封入する脂質層を含むベシクルである。ＬＮＰは、例えば米国特許第６，８５８，２２５号、第６，８１５，４３２号、８，１５８，６０１号、および第８，０５８，０６９号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用する場合、「対象」は、例えば哺乳動物などである動物であり、霊長類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルおよびチンパンジー）または非霊長類（例えば、ラットまたはマウスなど）が含まれる。好ましい実施形態では、対象はヒトであり、例えばＳＯＤ１発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患、障害または症状に関して治療または評価されるヒト、ＳＯＤ１発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患、障害または症状のリスクがあるヒト、ＳＯＤ１発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患、障害または症状を有するヒト、または本明細書に記載されるＳＯＤ１発現の減少により恩恵を受けることとなる疾患、障害または症状が治療されるヒトなどである。
本明細書で使用される場合、用語「治療する」または「治療」は、ＳＯＤ１遺伝子発現またはＳＯＤ１タンパク質産生に関連する一つまたは複数の兆候または症状、例えば、ＳＯＤ１関連神経変性疾患例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ダウン症候群（ＤＳ）の軽減または改善、そのような神経変性疾患を有する対象におけるニューロン死の増加領域におけるＳＯＤ１の発現、堆積、および／または活性の低下を含むが、これらに限定されない、有益または望ましい結果を指す。「「治療」はまた、治療が行われない場合に予測される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことも意味し得る。
対象におけるＳＯＤ１のレベルまたは疾患マーカーまたは症状の文脈での用語「低下させる（ｌｏｗｅｒ）」は、こうしたレベルの統計学的に有意な減少を指す。減少は、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、減少は、少なくとも２０％である。特定の実施形態では、減少は、疾患マーカーにおいて、例えば、タンパク質レベルまたは遺伝子発現レベルにおいて、少なくとも５０％である。対象におけるＳＯＤ１のレベルの文脈で「低下させる」は、好ましくは、こうした障害のない個体に関して正常な範囲内として受け入れられるレベルまで下げることである。特定の実施形態では、「低下させる」は、疾患を患っている対象におけるマーカーまたは症状のレベルと、個体が正常な範囲内で受け入れられるレベルとの間の差の減少、例えば、肥満である個体と正常な範囲内に受容される体重の個体との間での体重の減少のレベルである。
本明細書において使用する場合、「予防」または「予防すること」は、ＳＯＤ１遺伝子の発現またはＳＯＤ１タンパク質産生の減少から恩恵を受けるであろう疾患、障害、またはその状態に関して使用する場合、対象が、こうした疾患、障害、または状態に関連する症状、例えば、ＳＯＤ１関連神経変性疾患の症状を発症することとなる可能性が減少することを指す。疾患、障害、または状態を発症しないこと、またはこうした疾患、障害、または状態に関連する症状の発症の減少、例えば、神経性炎症（例えば、その疾患または障害に対して臨床的に受け入れられる規模の少なくとも約１０％の減少）、または遅延された症状の提示の遅延（例えば、数日、数週間、数か月、または数年の遅延）は、有効な予防とみなされる。
本明細書において使用する場合、用語「ＳＯＤ１関連神経変性疾患」または「ＳＯＤ１関連神経変性障害」は、ＳＯＤ１の発現または活性の減少から恩恵を受けることとなるあらゆる疾患または障害として理解される。そのようなＳＯＤ１－神経変性疾患は、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）などの疾患における神経細胞死に関連する脳の領域における、例えば、ＳＯＤ１沈着の増加など、ＳＯＤ１タンパク質のミスフォールディングによって特徴付けられる（例えば、Ｔｒｉｓｔ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．受理された著者の原稿を参照）。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、ルー・ゲーリック病としても知られる「筋萎縮性側索硬化症」（「ＡＬＳ」）である。
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脊髄および脳の運動ニューロンに影響を及ぼす進行性疾患である。ＡＬＳでは、運動ニューロンは経時的に死滅（萎縮）し、筋力低下、筋肉量の喪失、および運動の制御不能につながる。
ＳＯＤ１遺伝子の変異は、遺伝性家族性筋萎縮性側索硬化症（ｆＡＬＳ）症例の約２０％、および散発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）症例の最大約５％を引き起こす。例えば、アミノ酸置換、挿入、欠失、および／または遺伝子多型などの結果として生じる変異は、ＳＯＤ１のタンパク質構造を不安定化し、そのミスフォールディングおよび神経毒性オリゴマーおよび凝集体への自己組織化をもたらし、このプロセスが罹患者における特徴的な運動ニューロン変性の一因となる。
散発性ＡＬＳ患者は、通常、５０代後半または６０代前半に初めて症状の特徴を発症する。散発性および家族性ＡＬＳは、類似の病理学的および臨床的プロファイルを呈する。
ＡＬＳの最も初期の症状には、筋攣縮、筋痙攣、筋硬直、または筋力低下が含まれる。罹患者は、不明瞭な発話（構音障害）を発症し、その後、噛むことや嚥下が困難（嚥下障害）になる可能性がある。ＡＬＳ患者の多くは、嚥下障害による食物摂取量の減少と、長期にわたる疾患による身体のエネルギー需要（代謝）の増加により栄養失調を経験する。疾患が進行するにつれて筋肉は弱まり、筋組織の萎縮と共に腕と脚は細く見え始める。ＡＬＳ患者は最終的に筋力と歩行能力を失う。罹患者は、最終的に車椅子依存となり、身の回りの世話やその他の日常生活動作に介助を必要とするようになる。時間の経過と共に筋力は低下し、罹患者は手や腕が使えなくなる。呼吸系の筋肉が弱くなるため、呼吸が困難になる。ＡＬＳ患者のほとんどが、ＡＬＳの徴候および症状が現れてから２～１０年以内に呼吸不全により死亡するが、疾患進行は罹患者間で大きく異なる。
ＳＯＤ１蓄積は、死後の変異型ＳＯＤ１トランスジェニックマウスおよびヒトＡＬＳ患者組織の運動ニューロン、脊髄、および関連細胞で見つかっている。さらに、内因性マウスタンパク質と同様または高いレベルで変異型ＳＯＤ１形態を発現する、ＡＬＳの当技術分野で認識されたモデルであるＳＯＤ１トランスジェニックマウスは、ＡＬＳ－表現型を再現することが示されている。これらのマウスは、ＡＬＳヒト患者において見られるように、運動ニューロンの重度の変性を発症し、後肢および前肢の進行性の麻痺および死につながる。これらのマウスは、ＳＯＤ１細胞質封入体、グリオーシス、グルタミン酸興奮毒性、ミトコンドリアの空胞化、および軸索輸送の障害など、ヒト患者由来の死後組織に見られる病理も呈する（Ｍｉｎａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：９）。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、「アルツハイマー病」（「ＡＤ」）である。ＡＤは慢性神経変性疾患であり、通常、徐々に始まり、経時的に徐々に悪化する。最もよく見られる初期症状は、最近の出来事を記憶することが困難である。疾患が進行するにつれ、言語の問題、見当識障害（道に迷いやすいなど）、気分の変動、意欲の喪失、セルフケアができない、行動上の問題などの症状が現れる。状態が衰えるにつれ、家族や社会から身を引くことが多い。徐々に身体機能が失われ、最終的に死に至る。
神経病理学的には、ＡＤは大脳皮質および特定の皮質下領域のニューロンおよびシナプスの喪失によって特徴付けられる。この喪失により、側頭葉および頭頂葉、ならびに前頭皮質および帯状回の一部の変性など、罹患領域の萎縮が顕著になる。変性はまた、青斑核のような脳幹核にも存在する。ＭＲＩおよびＰＥＴを使用した研究では、軽度な認知障害からアルツハイマー病へと進行するにつれて、健康な高齢者からの類似の画像と比較して、ＡＤ患者の特定の脳領域のサイズの減少が実証されている。
ＡＤに罹患した脳では、アミロイド斑および神経原線維変化は両方とも、顕微鏡検査によりはっきりと見える。プラークは、ニューロンの外側および周囲にある、ベータアミロイドペプチドおよび細胞物質の高密度でほとんどが不溶性の沈着物である。タングル（神経原線維変化）は、過剰にリン酸化された微小管結合タンパク質タウの凝集体であり、細胞内に蓄積する。高齢者の多くは、加齢の結果としていくつかのプラークやタングルを生じるが、ＡＤ患者の脳では、側頭葉などの特定の脳領域に多く見られる。レビー小体は、ＡＤ患者の脳では珍しくない。
ＡＤを有する患者の死後およびインビボ試験でも、中枢神経系および末梢組織におけるフリーラジカル損傷の生成物の蓄積が示されている。さらに、ＳＯＤ１凝集体は、ＡＤ脳において特定されており、アミロイド老人斑および神経原線維変化と関連していることが示されている（Ｃｈｏｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００５）ＪＢＣ．２８０：１１６４８－１１６５５）。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、「パーキンソン病」（「ＰＤ」）である。パーキンソン病は、神経系の進行性障害である。この障害は、脳のいくつかの領域、特にバランスと動きを制御する黒質と呼ばれる領域に影響を及ぼす。ＰＤは、基底核内のドーパミン作動性ニューロンの喪失をもたらす。
多くの場合、パーキンソン病の最初の症状は、特に体が安静にしている時の手足の震えや振戦である。典型的には、振戦は身体の片側、通常は片手で始まる。振戦はまた、腕、脚、足、および顔に影響を及ぼす可能性がある。パーキンソン病の他の特徴的な症状には、手足および胴体の硬直またはこわばり、動作の緩慢（運動緩慢）または動作不能（無動）、およびバランスと協調性の障害（姿勢不安定）が含まれる。これらの症状は経時的にゆっくりと悪化する。
パーキンソン病はまた、感情および思考能力（認知）に影響を及ぼす可能性がある。罹患者の中には、うつ病および幻覚などの精神医学的状態を発症する者もいる。パーキンソン病患者はまた、判断力や記憶力を含む知的機能の低下である認知症を発症するリスクも高まる。
これまでの研究では、ＰＤ患者の脳でＳＯＤ１タンパク質の総レベルが著しく増加することが示されている（Ｃｈｏｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００５）ＪＢＣ．２８０：１１６４８－１１６５５）。さらに、ＰＤ患者の脳内のレビー小体におけるＳＯＤ１の沈着が検出された（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ、８９：４７１～４７４）。
一実施形態では、ＳＯＤ１関連神経変性疾患は、「ダウン症候群（ＤＳ）」である。ダウン症候群（「ＤＳ」）は、ヒト２１番染色体（Ｈｓａ２１）のトリソミー、およびコードされた遺伝子の一部のサブセットの用量による発現の増加によって引き起こされる。ＤＳ患者は、例えば、低身長、肥満、および両側内眼角贅皮など、異なる形態学的特徴を呈する。さらに、加齢に伴う筋緊張低下および神経変性が、生涯にわたって認められることがある。この症候群は、精神遅滞、先天性心疾患、免疫系障害、消化器系障害、内分泌系障害、および様々な生化学的障害と関連している。インビボ、インビトロ、および動物モデル研究からの証拠が、酸化ストレスがＤＳに関与していることを示している。したがって、これらの対象で観察された酸化ストレスの増加は主に、ＨＳＡ２１（２１ｑ２２．１）にコードされる酵素であるＳＯＤ１の過剰な活性に起因することが提唱されている。ＤＳ患者はまた、ＳＯＤ１レベルの上昇も示しており、グルタチオンペルオキシダーゼ活性の上昇に加え、脂質過酸化およびＤＮＡへの酸化的損傷が増加しているようである（Ｃａｍｐｏｓ Ｃ ａｎｄ Ｃａｓａｄｏ Ａ．（２０１５）Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ．１４２（２）：１１３－１１９）。
「治療有効量」は、本明細書において使用する場合、ＳＯＤ１関連神経変性疾患がある対象に投与されたときに、（例えば、既存の疾患または疾患の一つもしくは複数の症状を減少、改善、または維持することによって）疾患の治療を行うのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、当該剤の投与方法、疾患およびその重症度および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ある場合には先行するまたは併用する治療の種類、および治療しようとする対象の他の個人的特徴、に応じて変動し得る。
「予防有効量」は、本明細書において使用する場合、ＳＯＤ１関連神経変性疾患を有する対象に投与されたときに、疾患または疾患の一つもしくは複数の症状を予防または改善するのに十分である、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。疾患の改善は、疾患の経過を鈍化させるこ と、またはこれから発症する疾患の重症度を減少させることを含む。「予防的有効量」は、ＲＮＡｉ剤、当該剤の投与方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ある場合には先行するまたは併用する治療の種類、および治療しようとする患者の他の個人的特徴、に応じて変動し得る。
「治療有効量」または「予防有効量」は、任意の処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比においていくつかの所望の局所的または全身的効果を生じるＲＮＡｉ剤の量も包含する。本開示の方法において用いられるＲＮＡｉ剤は、こうした処置に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比を生じるのに十分な量で投与され得る。
語句「薬学的に許容可能」は、本明細書において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、合理的なベネフィット／リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内でのヒト対象および動物対象の組織との接触での使用に好適であるそれら化合物（塩類を含む）、材料、組成物または剤形を指すために用いる。
語句「薬学的に許容可能な担体」は、本明細書において使用する場合、一つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分への主題化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容可能な材料、組成物、またはビヒクルであって、例えば液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材料など、を意味する。各担体は、製剤の他の原材料に対して適合性であり、かつ治療される対象に対して有害であってはならないという意味において「許容可能」であるものでなければならない。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる：（１）糖類、例えば乳糖、グルコースおよびショ糖など、（２）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど、（３）セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど、（４）トラガカント末、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）潤滑剤、例えばマグネシウムステート（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなど、（８）賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックスなど、（９）オイル、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブオイル、トウモロコシ油および大豆油など、（１０）グリコール、例えばプロピレングリコールなど、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど、（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど、（１５）アルギニン酸、（１６）発熱因子なしの水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝溶液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、またはポリ酸無水物、（２２）充填剤、例えばポリペプチド、およびアミノ酸など、（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなど、ならびに（２２）医薬品製剤に採用される他の非毒性の適合性物質。
用語「試料」は、本明細書において使用する場合、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織、および対象内に存在する体液、細胞、または組織の採取物を包含する。生体液の例としては、血液、血清、および漿液、血漿、髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器、または局所領域からの試料を含み得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の部分、またはそれら臓器内の体液もしくは細胞に由来するものであり得る。特定の実施形態では、試料は、脳（例えば、全脳または脳の特定のセグメント、例えば、線条体、または脳内の特定のタイプの細胞、例えば、ニューロンおよびグリア細胞（星状細胞、乏突起膠細胞、小グリア細胞））から得られ得る。他の実施形態では、「対象から得られた試料」は、対象から得られた肝組織（またはその副成分）を指す。一部の実施形態では、「対象から得られた試料」は、対象から得られた血液またはそれらから得られた血漿もしくは血清を指す。さらなる実施形態では、「対象から得られた試料」は、対象から得られた脳組織（またはその副成分）または網膜組織（またはその副成分）を指す。
ＩＩ．本開示のＲＮＡｉ剤
本明細書においては、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤について記載する。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）を有するヒトなどの対象、例えば、哺乳類動物などの細胞など、細胞内のＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１遺伝子の発現の際に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約１５～３０ヌクレオチド以下の長さである。ＲＮＡｉ剤は、ＳＯＤ１遺伝子を発現する細胞と接触させると、ＳＯＤ１遺伝子（例えば、ヒト遺伝子、霊長類遺伝子、非霊長類遺伝子）の発現を少なくとも５０％阻害するが、これは例えばＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）による方法によって、またはタンパク質による方法、例えば免疫蛍光法などによって、例えばウエスタンブロット法またはフローサイトメトリー技術を使用して、検定した場合である。好ましい実施形態では、発現の阻害は、ｓｉＲＮＡが１０ｎＭの濃度である、実施例１のＤｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイによってアッセイされるように、少なくとも５０％である。
ｄｓＲＮＡは、二本のＲＮＡ鎖を含み、それらは、相補的であり、またｄｓＲＮＡが使用されることとなる条件下においてハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して、実質的に相補的であり、また概して完全に相補的である、相補性領域を含む。標的配列は、ＳＯＤ１遺伝子の発現の際に形成されたｍＲＮＡの配列から得られ得る。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に対して相補的である領域を含むため、当該二本の鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合に、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所で説明し、また当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上において相対するように、単一の核酸分子の自己相補領域として含有させることもできる。
概して、二重鎖構造は、１５～３０塩基対の長さ、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対の長さである。特定の好ましい実施形態では、二重鎖構造は、１８～２５塩基対の長さ、例えば、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～２５、２３～２４または２４～２５塩基対の長さであり、例えば１９～２１塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。
同様に標的配列に対する相補性の領域が、１５～３０ヌクレオチド長、例えば、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２ヌクレオチド長であり、例えば、１９～２３ヌクレオチド長、または２１～２３ヌクレオチド長である。上記に列記した範囲および長さの間に存在する範囲および長さもまた、本開示の一部であることを意図している。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５～２３ヌクレオチド長、２５～３０ヌクレオチド長、２０～３０ヌクレオチド長、または１９～３０ヌクレオチド長である。概して、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として機能するのに十分に長い。例えば、約２１～２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒのための基質として機能し得ることは、当技術分野において周知である。当業者も認識することとなるように、切断のために標的とされるＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より長いＲＮＡ分子の一部、多くの場合ｍＲＮＡ分子となることとなる。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ依存性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を経る切断）のための基質となることを可能にさせるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
当業者であれば、二重鎖領域がｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約１５～３６塩基対、例えば、１５～３６、１５～３５、１５～３４、１５～３３、１５～３２、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、または２１～２２塩基対、例えば １９～２１塩基対の二重鎖領域であることも認識するであろう。すなわち、一実施形態では、切断のために所望のＲＮＡを標的とする、例えば、１５～３０塩基対の機能性二重鎖へとプロセシングされる限り、３０超の塩基対の二重鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態では、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に生じるｍｉＲＮＡではない。別の実施形態では、ＳＯＤ１発現を標的とするのに有用なＲＮＡｉ剤は、より大きなｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書において説明されるｄｓＲＮＡは、例えば、１、２、３、または４ヌクレオチドの、一つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどであるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組合せ上にあり得る。さらに、あるオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。特定の実施形態では、より長い延長オーバーハングが可能である。
ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．などから市販されているような、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて、以下でさらに論じるように、当技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。
本発明のｉＲＮＡ化合物は、二段階手法を使用して調製され得る。最初に、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が、別個に調製される。次いで、当該構成要素の鎖がアニーリングされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相または固相の有機合成またはその両方を使用して調製することができる。有機合成は、非天然のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相の有機合成またはその両方を使用して調製することができる。
ｓｉＲＮＡは、例えば、バルクで、様々な方法によって生成することができる。例示的な方法には、有機合成およびＲＮＡ切断、例えば、インビトロでの切断が含まれる。
ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子、または二本鎖ＲＮＡ分子の各鎖を別々に合成することによって作製することができ、その後、構成要素の鎖をアニールすることができる。
大型バイオリアクター、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩを使用して、所与のｓｉＲＮＡに対して特定のＲＮＡ鎖を大量に生産することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩリアクターは、わずか１．５モル過剰のホスホルアミダイトヌクレオチドを使用して、効率的にヌクレオチドを結合することができる。ＲＮＡ鎖を作るために、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。単量体付加の標準サイクルを使用して、ｓｉＲＮＡの２１～２３ヌクレオチド鎖を合成することができる。典型的には、二つの相補鎖は別々に生成され、その後、例えば、固体支持体からの解放および脱保護後にアニールされる。
有機合成を使用して、個別のｓｉＲＮＡ種を生産することができる。ＳＯＤ１遺伝子に対する種の相補性を正確に特定することができる。例えば、種は、多型、例えば、一塩基多型を含む領域に対して相補的であり得る。さらに、多型の位置を正確に定義することができる。一部の実施形態では、多型は、内部領域、例えば、末端の一方または両方から少なくとも４、５、７、または９ヌクレオチド内に位置する。
一実施形態では、生成されたＲＮＡは、注意深く精製され、末端ｓｉＲＮＡが除去され、例えば、Ｄｉｃｅｒまたは同等のＲＮＡｓｅ ＩＩＩベースの活性を使用して、インビトロでｓｉＲＮＡに切断される。例えば、ｄｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエからのインビトロで抽出物中で、または精製された成分、例えば、精製されたＲＮＡｓｅまたはＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）を使用して、インキュベートすることができる。例えば、Ｋｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１ Ｏｃｔ １５；１５（２０）：２６５４－９ ａｎｄ Ｈａｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ Ａｕｇ １０；２９３（５５３２）：１１４６－５０を参照のこと。
ｄｓｉＲＮＡ切断は一般に、複数のｓｉＲＮＡ種を生成し、各々がソースｄｓｉＲＮＡ分子の特定の２１～２３ｎｔ断片である。例えば、ソースｄｓｉＲＮＡ分子の重複領域および隣接領域に対して相補的な配列を含むｓｉＲＮＡが存在する可能性がある。
合成方法に関係なく、ｓｉＲＮＡ調製物は、剤形に適切な溶液（例えば、水溶液または有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｓｉＲＮＡ調製物は、沈殿させ、純粋な再蒸留水中に再溶解し、凍結乾燥させることができる。次いで、乾燥させたｓｉＲＮＡを、意図される製剤化プロセスに適切な溶液中に再懸濁することができる。
一態様においては、本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも二つのヌクレオチド配列、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＳＯＤ１のためのセンス鎖配列は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のうちのいずれか一つに提供される配列群から選択され得、また該センス鎖のアンチセンス鎖の対応するヌクレオチド配列は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のうちのいずれか一つの配列群から選択され得る。この態様においては、二つの配列の一方は、二つの配列の他方に対して相補的であり、この場合、配列の一方は、ＳＯＤ１遺伝子の発現の際に生じたｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。このように、この態様においては、ｄｓＲＮＡは、二つのオリゴヌクレオチドを含むこととなるが、一つのオリゴヌクレオチドは、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つにおいてセンス鎖（パッセンジャー鎖）として記載され、第二のオリゴヌクレオチドは、ＳＯＤ１については表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つにおいて該センス鎖の対応するアンチセンス鎖（ガイド鎖）として記載される。
一実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチド上に含有される。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、単一のオリゴヌクレオチド上に含まれる。
本明細書に提供される配列は、修飾された配列またはコンジュゲートされた配列として記述されているが、本開示のＲＮＡｉ剤のＲＮＡ、例えば、本開示のｄｓＲＮＡは、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つに明記される配列のうちのいずれか一つを含み得、それらは、修飾されていない、コンジュゲートされていない、またはその中に記載されるものとは異なるように修飾もしくはコンジュゲートされたものであることが理解されるであろう。一つもしくは複数の親油性リガンドまたは一つもしくは複数のＧａｌＮＡｃリガンドは、本出願で提供されるＲＮＡｉ剤のいずれかの位置に含まれ得る。
当業者は、約２０～２３塩基対、例えば、２１塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を導入する際に特に有効であるとして歓迎されてきたことを十分に意識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ Ｊ．，２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、他の者らは、それよりも短いまたは長いＲＮＡ二重鎖構造も有効であり得ることを発見してきた（Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ １４：１７１４－１７１９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：２２２－２２６）。上記に記載した実施形態では、本明細書において提供するオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書に記載するｄｓＲＮＡが、最小で２１ヌクレオチドの長さである少なくとも一つの鎖を含むことができる。一方の末端または両末端におけるいくつかのヌクレオチドだけを差し引いたより短い二重鎖は、上記に記載したｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることは、合理的に予測することができる。したがって、本明細書において提供する配列のうちの一つから得られる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの配列を有し、かつＣｏｓ７および１０ｎＭ濃度のＲＮＡ剤によるインビトロアッセイならびに本明細書の実施例において提供されるＰＣＲアッセイを使用して、完全配列を含むｄｓＲＮＡから１０、１５、２０、２５、または３０％以下の阻害によってＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が異なるものであるｄｓＲＮＡは、本開示の範囲内であることを意図する。
加えて、本明細書に記載するＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介切断を受けやすいＳＯＤ１転写物内の部位を特定する。そのため、本開示は、この部位の範囲内を標的とするＲＮＡｉ剤をさらに取り上げる。本明細書において使用する場合、ＲＮＡｉ剤が特定の部位内のいずれかにおける転写物の切断を促進する場合、該ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ転写物の特定の部位の範囲内を標的としていると言う。こうしたＲＮＡｉ剤は、概して、ＳＯＤ１遺伝子内の選択された配列に隣接する領域から取られた追加的なヌクレオチド配列に結合した本明細書において提供される配列のうちの一つから、少なくとも約１５の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも１９のヌクレオチド、を含むこととなる。
本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、標的配列に対する一つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、３以下のミスマッチ（すなわち、３、２、１、または０のミスマッチ）を含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、２以下のミスマッチを含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、１以下のミスマッチを含有する。一実施形態では、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤は、０のミスマッチを含有する。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含有する場合、該ミスマッチは、随意に、相補性領域の５’末端または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチドの範囲内にあるように制限することができる。例えば、そのような実施形態では、２３ヌクレオチドのＲＮＡｉ剤の場合、ＳＯＤ１遺伝子の領域に対して相補的な鎖は、概して、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書において記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対してミスマッチを含有するＲＮＡｉ剤が、ＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害において効果的であるか否かを判定することができる。とりわけ、ＳＯＤ１遺伝子における相補性の特定の領域が、集団内での多形配列バリエーションを有することがわかっている場合には、ＳＯＤ１の発現を阻害するミスマッチを有するＲＮＡｉ剤の有効性を考慮することが重要である。
ＩＩＩ．本開示の修飾ＲＮＡｉ剤
一実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤のＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、未修飾であり、また例えば、当技術分野で公知かつ本明細書に記載する化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。好ましい実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤のＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学修飾される。本開示の特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤のヌクレオチドの実質的にすべてが修飾される。本開示の他の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤のヌクレオチドのすべてが修飾される。「ヌクレオチドの実質的にすべてが修飾されている」本開示のＲＮＡｉ剤は、広く修飾されているが全体が修飾されているものではなく、また５、４、３、２、もしくは１以下の未修飾のヌクレオチドを含み得る。本開示のさらに他の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、５、４、３、２または１以下の修飾ヌクレオチドを含み得る。
本開示において特徴とされる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参 照により本明細書に組み込まれる“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ、に記載されるものなどによって合成または修飾できる。修飾としては、例えば末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆方向連結）または３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆方向連結など）や、塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは伸長したレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）もしくはコンジュゲートされた塩基や、糖修飾（例えば、２’位または４’位における）もしくは糖の置換や、またはホスホジエステル連結の修飾もしくは置換をはじめとする骨格修飾が挙げられる。本明細書において記載される実施形態において有用なＲＮＡｉ剤の具体例として、それだけには限らないが、修飾骨格を含有する、または天然ヌクレオシド間連結を含有しないＲＮＡが挙げられる。修飾骨格を有するＲＮＡとしては、中でも、骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、また時には当技術分野で言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。一部の実施形態では、修飾ＲＮＡｉ剤は、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有することとなる。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルのホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを含むホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が連結された３’－５’と５’－３’または２’－５’と５’－２’であるものである反転した極性を有するものが挙げられる。様々な塩、例えば、ナトリウム塩、混合塩および遊離酸の形態も挙げられる。
上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号、および米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれ、それら各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
骨格内にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結または一つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合した構成要素部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、これらに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が挙げられ、このそれぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結の両方、すなわち、骨格が新規基と置き換えられている、ＲＮＡｉ剤において使用するために適したＲＮＡ模倣体が考察される。この塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の一つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物においては、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格で、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基が、保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のＲＮＡｉ剤において使用するのに適したさらなるＰＮＡ化合物は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に記載されている。
本開示で取り上げる一部の実施形態には、ホスホロチオエート骨格をもつＲＮＡおよびヘテロ原子骨格をもつオリゴヌクレオシドが挙げられ、特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の、－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－、および上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格、が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書において取り上げるＲＮＡは、上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。天然のホスホジエステル骨格は、Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－ＯＣＨ２－として表され得る。
修飾ＲＮＡはまた、一つまたは複数の置換された糖部分を含有し得る。本明細書において取り上げるＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの一つを含み得る：ＯＨ、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルであって、式中アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中ｎおよびｍは、１から約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位において以下のうちの一つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、ＲＮＡｉ剤の薬物動態特性を改善するための基またはＲＮＡｉ剤の薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。一部の実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基、が挙げられる。別の例示的な修飾には、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下の実施例において記載されるような、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２、がある。さらなる例示的な修飾としては、５’－Ｍｅ－２’－Ｆヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－ＯＭｅヌクレオチド、５’－Ｍｅ－２’－デオキシヌクレオチド、（これら三つのファミリー内のＲおよびＳ異性体の両方）、２’－アルコキシアルキル、および２’－ＮＭＡ（Ｎ－メチルアセトアミド）が挙げられる。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－Ｏ－ヘキサデシル、および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、ＲＮＡｉ剤のＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’－５’連結ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位でも行うことができる。ＲＮＡｉ剤はまた、糖模倣体を有し得、例えばペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などを有し得る。こうした修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、これに限定されないが、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が挙げられ、それらのうちいくつかは、本願と共同所有される。前述のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のＲＮＡｉ剤はまた、核酸塩基（当技術分野では簡単に「塩基」と呼ばれることも多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用する場合、「未修飾の（修飾されていない）」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙げられ、例えば５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換のアデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換のウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（７－ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどである。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるもの、が挙げられる。これら核酸塩基のうちのいくつかは、本開示において取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０～６置換のプリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸の二重鎖安定性を０．６～１．２℃高めることがわかっており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、そしてさらにより具体的には２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、模範的な塩基置換である。
上記の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちの特定のものの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、上記に記載の米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第５，７５０，６９２号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号が挙げられ、そのそれぞれの内容全体が、参照により本明細書において組み込まれる。
本開示のＲＮＡｉ剤をまた、一つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾できる。「二環式糖」は、隣接するかまたは非隣接かにかかわらず、二つの炭素の架橋によって形成される環によって修飾されるフラノシル環である。「二環式のヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、隣接するかまたは非隣接かにかかわらず糖環の二つの炭素原子を架橋して形成される環を含み、それによって二環式環系を形成する糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋が、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続するが、これは随意に２’－非環式酸素原子を介する。したがって、一部の実施形態では、本開示の薬剤は、一つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する追加の架橋を含むものである、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、ＬＮＡは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、３’－ｅｎｄｏ構造立体配座内にリボースを効率的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の付加により、血清中でのｓｉＲＮＡ安定性が増大し、オフターゲット効果が低減するとわかっている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７、Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３、Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。本開示のポリヌクレオチドにおいて使用するため の二環式ヌクレオシドの例として、制限するものではないが、４’と２’リボシル環原子 の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある特定の実施形態では、本開示のアンチセンスポリヌクレオチド剤として、４’から２’への架橋を含む一つまたは複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。
ロックされたヌクレオシドは、この構造（立体化学は省略する）によって表すことができ、
式中、Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、Ｌは、リボース環の２’－炭素と４’－炭素とを結合する連結基である。かかる４’から２’の架橋された二環式ヌクレオシドの例としては、これに限定するものではないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）、４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束されたエチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照）、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’であって式中ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキルまたは窒素保護基（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６，ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照）、および４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照）、が挙げられる。前述のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許公開としては、それだけには限らないが、以下：米国特許第６，２６８，４９０号、第６，５２５，１９１号、第６，６７０，４６１号、第６，７７０，７４８号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０３４，１３３号、第７，０８４，１２５号、第７，３９９，８４５号、第７，４２７，６７２号、第７，５６９，６８６号、第７，７４１，４５７号、第８，０２２，１９３号、第８，０３０，４６７号、第８，２７８，４２５号、第８，２７８，４２６号、第８，２７８，２８３号、米国特許２００８／００３９６１８、および米国特許２００９／００１２２８１が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースをはじめとする一つまたは複数の立体化学的な糖立体配座を有する前述の二環式ヌクレオシドのいずれもが、調製可能である（国際公開第９９／１４２２６号を参照）。
本開示のＲＮＡｉ剤をまた、一つまたは複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾 できる。本明細書において使用される場合、「拘束されたエチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋（すなわち、先述の構造におけるＬ）を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、拘束されたエチルヌクレオチドは、Ｓ立体配座であり、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と称する。
本開示のＲＮＡｉ剤はまた、一つまたは複数の「立体配座制限ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’炭素およびＣ４’炭素を、またはリボースのＣ３炭素および－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配座にロックして、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環のパッカリングを少なくさせる。
上記のＣＲＮのある特定のものの調製を教示する代表的な刊行物として、それだけには限らないが、ＵＳ２０１３／０１９０３８３および国際公開第２０１３／０３６８６８号が挙げら れ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである一つまたは複数のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロック非環式核酸であり、その糖の結合のいずれもが除去されていて、アンロック「糖」残基を形成しているものである。一実施例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーも包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の共有結合による炭素－酸素－炭素間結合）。別の実施例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の共有結合による炭素－炭素間結合）が除去されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、これに限定されるものではないが、ＵＳ８，３１４，２２７、および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号、第２０１３／００１１９２２号、および第２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、この各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ分子の末端に対する安定化修飾として可能性があるものとしては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’－ホスフェート、逆方向２’－デオキシ－修飾リボヌクレオチド、例えば逆方向ｄＴ（ｉｄＴ）および逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）など、ならびに逆方向脱塩基２’－デオキシリボヌクレオチド（ｉＡｂ）およびその他のものなどが挙げられ得る。この修飾の開示内容は、国際公開第２０１１／００５８６１号に見ることができる。
一実施例では、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端は、例えば逆方向ｄＴ（ｉｄＴ）、逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）、または逆方向脱塩基２’－デオキシリボヌクレオチド（ｉＡｂ）などである逆方向２’－デオキシ修飾リボヌクレオチドに連結される。一つの特定の実施例では、逆方向２’－デオキシ－修飾リボヌクレオチドは、本明細書に記載するセンス鎖の３’末端など、オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、ここで当該連結は、３’－３’ホスホジエステル連結または３’－３’－ホスホロチオエート連結を介している。
別の実施例では、センス鎖の３’末端は、３’－３’－ホスホロチオエート連結を介して、逆方向脱塩基リボヌクレオチド（ｉＡｂ）に連結される。別の実施例では、センス鎖の３’末端は、３’－３’－ホスホロチオエート連結を介して、逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）に連結される。
一つの特定の実施例では、逆方向２’－デオキシ－修飾リボヌクレオチドは、本明細書に記載するセンス鎖の３’末端など、オリゴヌクレオチドの３’末端に連結され、ここで当該連結は、３’－３’ホスホジエステル連結または３’－３’－ホスホロチオエート連結を介している。
別の実施例では、センス鎖の３’末端ヌクレオチドは、逆方向ｄＡ（ｉｄＡ）であり、また３’－３’－連結（例えば、３’－３’－ホスホロチオエート連結）を介して先行するヌクレオチドに連結されている。
本開示のＲＮＡｉ剤の他の修飾として、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体が挙げられる。適したホスフェート模倣体は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１２／０１５７５１１に開示されている。
Ａ．本開示のモチーフを含む修飾ＲＮＡｉ剤
本開示の特定の態様においては、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えばその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０７５０３５号において開示されるような化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書および国際公開第２０１３／０７５０３５号において示されるように、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一修飾のうちの一つまたは複数のモチーフを、特に切断部位においてまたはその近傍において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入することによって、優れた結果が得られ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうでなければ完全に修飾され得る。これらモチーフの導入は、存在する場合にはセンス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンを中断する。ＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばセンス鎖上の、親油性リガンドと、例えば、Ｃ１６リガンドとコンジュゲートし得る。ＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばアンチセンス鎖の一つまたは複数の残基において、（Ｓ）－グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾で修飾され得る。
したがって、本開示は、インビボで標的遺伝子（すなわち、ＳＯＤ１遺伝子）の発現を阻害可能な二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。このＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１５～３０ヌクレオチドの長さであり得る。各鎖は、例えば、長さが１６～３０ヌクレオチド、長さが１７～３０ヌクレオチド、長さが２５～３０ヌクレオチド、長さが２７～３０ヌクレオチド、長さが１７～２３ヌクレオチド、長さが１７～２１ヌクレオチド、長さが１７～１９ヌクレオチド、長さが１９～２５ヌクレオチド、長さが１９～２３ヌクレオチド、長さが１９～２１ヌクレオチド、長さが２１～２５ヌクレオチド、または長さが２１～２３ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、各鎖は、長さが１９～２３ヌクレオチドである。
センス鎖およびアンチセンス鎖は通常、本明細書において「ＲＮＡｉ剤」とも呼ばれる二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は、長さが１５～３０ヌクレオチド対であり得る。例えば、二重鎖領域は、長さが１６～３０ヌクレオチド対、長さが１７～３０ヌクレオチド対、長さが２７～３０ヌクレオチド対、長さが１７～２３ヌクレオチド対、長さが１７～２１ヌクレオチド対、長さが１７～１９ヌクレオチド対、長さが１９～２５ヌクレオチド対、長さが１９～２３ヌクレオチド対、長さが１９～２１ヌクレオチド対、長さが２１～２５ヌクレオチド対、または長さが２１～２３ヌクレオチド対であり得る。別の実施例では、二重鎖領域は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチドから選択される。好ましい実施形態では、二重鎖領域は、長さが１９～２１ヌクレオチド対である。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、一方または両方の鎖の３’末端、５’末端または両末端に一つまたは複数のオーバーハング領域またはキャッピング基を含有し得る。オーバーハングは、１～６ヌクレオチドの長さであり得、例えば２～６ヌクレオチドの長さ、１～５ヌクレオチドの長さ、２～５ヌクレオチドの長さ、１～４ヌクレオチドの長さ、２～４ヌクレオチドの長さ、１～３ヌクレオチドの長さ、２～３ヌクレオチドの長さまたは１～２ヌクレオチドの長さであり得る。好ましい実施形態では、ヌクレオチドオーバーハング領域は、２ヌクレオチドの長さである。オーバーハングは、一方の鎖がもう一方よりも長い結果、または同一の長さの二本の鎖がねじれている結果であり得る。このオーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的とする遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。第一および第二の鎖を、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、連結することもできる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドは、それぞれ独立して、修飾または未修飾のヌクレオチドであり得、これには、限定されるものではないが２’－糖修飾されたもの、例えば２－Ｆ、２’－Ｏ－メチル、チミジン（Ｔ）およびそれらのいずれかの組合せが含まれる。
例えばＴＴは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のためのオーバーハング配列であり得る。このオーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的とする遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の５’－または３’－オーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する二つのヌクレオチドを含有し、当該二つのヌクレオチドは、同一であり得るか、または異なり得る。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一実施形態では、この３’－オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、その安定性全体に影響を及ぼすことなくＲＮＡｉの干渉活性を強化できる単一のオーバーハングのみを含有し得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）に位置する、または逆も同じである、平滑末端を有し得る。概して、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、そして５’末端は平滑である。理論に拘束されることを望むことなく、こうしたアンチセンス鎖の５’末端にある平滑末端とアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングとが非対称であることが、ＲＩＳＣプロセスへのガイド鎖挿入に好都合である。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、長さが１９ヌクレオチドの二重平滑末端であり、このセンス鎖は、５’末端から７、８、９位の三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、長さが２０ヌクレオチドの二重平滑末端であり、このセンス鎖は、５’末端から８、９、１０位の三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。
さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、長さが２１ヌクレオチドの二重平滑末端であり、このセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、５’末端から９、１０、１１位の三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、アンチセンス鎖は、５’末端から１１、１２、１３位の三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、ＲＮＡｉ剤の一方の末端は、平滑であり、もう一方の末端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合には、末端の三つのヌクレオチドの間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結があり得るものであり、該三つのヌクレオチドのうち二つが、オーバーハングヌクレオチドであり、三番目のヌクレオチドが、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合したヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、さらに、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方において末端の三つのヌクレオチドの間に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖内のどのヌクレオチドも、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基は、独立して、例えば、交互モチーフ内において、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで修飾されている。随意に、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（例えば、親油性リガンド、随意にＣ１６リガンド）をさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むものであり、このセンス鎖が、長さが２５～３０ヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、第一の鎖の１位～２３位が、少なくとも８リボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、長さが３６～６６ヌクレオチド残基であり、また３’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の１～２３位と対合した位置において少なくとも８リボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成するものであり、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、また最大６の連続する３’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合せず、それによって１～６ヌクレオチドの３’の一本鎖オーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の５’末端が、センス鎖と対合しない１０～３０の連続するヌクレオチドを含み、それによって１０～３０ヌクレオチドの一本鎖の５’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドが、センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性で整列する場合にアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによってセンス鎖およびアンチセンス鎖間の実質的に二重鎖の領域を形成し、またアンチセンス鎖が、アンチセンス鎖長の少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減させ、またセンス鎖が、三つの連続するヌクレオチド上に三つの２’－Ｆ修飾の少なくとも一つのモチーフを含有するものであり、モチーフのうちの少なくとも一つが、切断部位においてまたは切断部位の近傍で生じる。アンチセンス鎖は、切断部位においてまたはその近傍で三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフを含有する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、このＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５ヌクレオチドであり最大でも２９ヌクレオチドである長さを有する第一の鎖と、５’末端から１１、１２、１３位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの２’－Ｏ－メチル修飾の少なくとも一つのモチーフをもつ最大でも３０ヌクレオチドである長さを有する第二の鎖を含むものであり、この第一の鎖の３’末端および第二の鎖の５’末端が平滑末端を形成し、また第二の鎖が、その３’末端において第一の鎖よりも長い１～４ヌクレオチドであるものであり、二重鎖領域が長さが少なくとも２５ヌクレオチドであり、また第二の鎖が、第二の鎖の長さのうちの少なくとも１９ヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減するものであり、またＲＮＡｉ剤のＤｉｃｅｒ切断が、優先的に、第二の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡを結果として生じ、それによって哺乳類細胞において標的遺伝子の発現が低減する。随意に、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し、そのモチーフのうちの一つは、センス鎖内の切断部位に生じる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖もまた、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有することができ、このモチーフのうちの一つは、アンチセンス鎖内の切断部位にまたはその近傍に生じる。
１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有するＲＮＡｉ剤について、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には、５’末端からおよそ１０、１１および１２位である。したがって、三つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、この数字はアンチセンス鎖の５’末端から最初のヌクレオチドから開始し、またはこの数字はアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域の範囲内の最初の対合ヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖内の切断部位はまた、５’末端からのＲＮＡｉの二重鎖領域の長さに応じて変化し得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、その鎖の切断部位において三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを含有し得、またアンチセンス鎖は、鎖の切断部位においてまたはその近傍において三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の少なくとも一つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の三つのヌクレオチドの一つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の三つのヌクレオチドの一つのモチーフが、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーラップを有するように、すなわち、センス鎖内のモチーフの三つのヌクレオチドの少なくとも一つが、アンチセンス鎖内のモチーフの三つのヌクレオチドの少なくとも一つと塩基対合を形成するように、整列され得る。あるいは、少なくとも二つのヌクレオチドが重複してもよく、または三つのヌクレオチドのすべてが重複してもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の複数のモチーフを含有し得る。第一のモチーフは、鎖の切断部位においてまたはその近傍に生じ得、またその他のモチーフが、ウイング修飾であり得る。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同一の鎖の切断部位においてまたはその近傍においてのモチーフから分離されている鎖の別の部分において生じるモチーフを指す。ウイング修飾は、第一のモチーフに隣接しているか、または少なくとも一つまたは複数のヌクレオチドで分離されている。モチーフが互いに直ぐ隣に隣接する場合には、モチーフの化学的性質は、互いに別個であり、またモチーフが一つまたは複数のヌクレオチドで分離されている場合には、化学的性質は、同一であることもあり、または異なっていることもある。二以上のウイング修飾が存在する場合もある。例えば、二つのウイング修飾が存在する場合には、各ウイング修飾は、切断部位においてもしくはその近傍における第一のモチーフに対して一つの末端において生じ得、またはリードモチーフのいずれかの側で生じ得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の複数のモチーフを含有する場合があり、そのモチーフの少なくとも一つはその鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウイング修飾と同様のアラインメント内に一つまたは複数のウイング修飾を含有し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端における最初の一または二の末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端または両末端における二重鎖領域内の最初の一または二の対合ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも一つのウイング修飾を含有する場合には、そのウイング修飾は、二重鎖領域の同一末端に入り得、そして一、二または三のヌクレオチドのオーバーラップを有する。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも二つのウイング修飾を含有する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれの一本鎖に由来する二つの修飾が、一、二または三のヌクレオチドのオーバーラップを有する二重鎖領域の一方の末端に入り、一本鎖からの二つの修飾がそれぞれ、一、二または三のヌクレオチドのオーバーラップを有する二重鎖領域のうちのもう一方の末端に入り、一本鎖からの二つの修飾が、二重鎖領域内の一、二または三のヌクレオチドのオーバーラップを有するリードモチーフの両側に入るように、整列され得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的との、二重鎖内のミスマッチまたはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域内に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するそれらがもつ傾向に基づいて格付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づくものであり、最も単純なアプローチとしては、個々の対ごとに対を調べることであるが、次に、隣接するまたは同様の分析も使用可能である）。解離の促進の点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、またＩ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準の対合または標準以外の対合（本明細書において別の箇所に記載される）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく、またユニバーサル塩基を含む対合が、標準の対合より好ましい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択されるアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対、および例えば、非標準の対合または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合であるミスマッチ対のうちの少なくとも一つを含み、二重鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の解離を促進する。
一実施形態では、アンチセンス鎖内の５’末端から二重鎖領域内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２または３の塩基対のうち少なくとも一つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
別の実施形態では、センス鎖の３’末端にあるヌクレオチドは、デオキシチミジン（ｄＴ）である。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端にあるヌクレオチドは、デオキシチミジン（ｄＴ）である。一実施形態では、デオキシチミジンヌクレオチドの短い配列が存在し、例えばセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端上の二つのｄＴヌクレオチドが存在する。
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
で表され得、
式中、
ｉおよびｊは各々独立に、０または１であり、
ｐおよびｑは各々独立に、０～６であり、
各Ｎａは独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであって、各配列は少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂは独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐおよびｎｑは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表すものであり、
式中、ＮｂおよびＹは、同一の修飾を有さず、ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。好ましくは、ＹＹＹは、すべて２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ＮａまたはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍に生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じ得（例えば、６、７、８位、７、８、９位、８、９、１０位、９、１０、１１位、１０、１１、１２位、または１１、１２、１３位において生じ得る）、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドにおいて開始する。
一実施形態では、ｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊの両方が１である。したがって、センス鎖は、以下の式、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）、または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）
で表され得る。
センス鎖が式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｄ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。
他の実施形態では、ｉは０であり、かつｊは０であり、またセンス鎖は、式
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）
で表され得る。
センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（ＩＩ）
で表され得、
式中、
ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ’およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各Ｎａ’は独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであり、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂ’は独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
式中、Ｎｂ’およびＹ’は、同一の修飾を有さず、ならびに
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のうちの一つのモチーフを表す。
一実施形態では、Ｎａ’またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二重鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、この数字は、５’末端から、最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドにおいて開始する。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位で生じる。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、すべて２’－ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１であり、ｌは０であるか、またはｋは０であり、ｌは１であるか、またはｋおよびｌは両方とも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｂ）、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（ＩＩｃ）、または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（ＩＩｄ）
で表され得る。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎｂ ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）で表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）で表される場合、各Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５または６である。
他の実施形態では、ｋは０であり、かつｌは０であり、またアンチセンス鎖は、式
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉａ）
で表され得る。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）で表される場合、各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで独立に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１ｎｔである場合に、鎖の９、１０および１１位で生じるＹＹＹモチーフを含有し得、この数字は５’末端から最初のヌクレオチドから開始するか、または随意に、この数字は５’末端から二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドで開始し、またＹは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有し得、またＸＸＸおよびＺＺＺは各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位で生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得、この数字は５’末端から最初のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は５’末端から二重鎖領域内の最初の対合ヌクレオチドで開始し、またＹ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有し得、またＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）および（Ｉｄ）のいずれか一つで表されるセンス鎖は、それぞれ式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）および（ＩＩｄ）のいずれか一つで表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本開示の方法において使用するＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、その各鎖は、１４～３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩ）
で表され、
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ ’は独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ ’は独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
式中、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉは０であり、かつｊは０であり、またはｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊは両方とも０であり、またはｉおよびｊは両方とも１である。別の実施形態では、ｋは０であり、かつｌは０であり、またはｋは１であり、かつｌは０であり、ｋは０であり、かつｌは１であり、またはｋおよびｌは両方とも０であり、またはｋおよびｌは両方とも１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ ’ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ ’－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ ’－Ｎａ ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ－ｎｑ ’５’
（ＩＩＩｄ）
を含む。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｂ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、およびＮｂ ’の各々は独立に、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、またｎｐ’＞０および少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結する。さらに別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、また少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカー（以下に記載する）を介して結合した一つまたは複数のＣ１６（またはそれと関連する）部分にコンジュゲートする。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、また少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも一つのホスホロチオエート連結を含み、またセンス鎖は、一つまたは複数の親油性部分に、例えば、Ｃ１６（またはそれと関連する）部分にコンジュゲートし、これは二価または三価の分枝リンカーを介して結合してもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、また少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも一つのホスホロチオエート連結を含み、またセンス鎖は、一つまたは複数の親油性部分に、例えば、Ｃ１６（またはそれと関連する）部分にコンジュゲートし、これは二価または三価の分枝リンカーを介して結合してもよい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される少なくとも二つの二重鎖を含有する多量体であり、これら二重鎖は、リンカーで接続されている。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二重鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される三、四、五、六、またはそれ以上の二重鎖を含有する多量体であり、該二重鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二重鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）および（ＩＩＩｄ）で表される二つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに連結され、また３’末端の一方または両方が、随意にリガンドにコンジュゲートされる。当該剤は各々、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的とし得、または当該剤の各々は、二つの異なる標的部位において同一の遺伝子を標的にし得る。
様々な公開公報には、本開示の方法において使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。当該公開公報としては、国際公開第２００７／０９１２６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、国際公開第２００７／１１７６８６号、国際公開第２００９／０１４８８７号、および国際公開第２０１１／０３１５２０号、および米国特許第７８５８７６９号が挙げられ、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、本明細書において記載するようなＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的実施形態では、本開示の５’－ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドが、以下の構造を有し、
式中、ＸはＯまたはＳであり、
Ｒは、水素、ヒドロキシ、フルオロ、またはＣ１～２０アルコキシ（例えば、メトキシまたはｎ－ヘキサデシルオキシ）であり、
Ｒ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素とＲ５’との間の二重結合が、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）であり、また
Ｂは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、随意に、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
一実施形態では、Ｒ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、Ｃ５’炭素とＲ５’との間の二重結合はＥ配座である。別の実施形態では、Ｒは、メトキシであり、またＲ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素とＲ５’との間の二重結合はＥ配座である。別の実施形態では、Ｘは、Ｓであり、Ｒは、メトキシであり、またＲ５’は、＝Ｃ（Ｈ）－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素とＲ５’との間の二重結合はＥ配座である。
本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに結合し得る。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のビニルホスホネートを、適宜、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’端でｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に付着させる。
本開示の組成物および方法のためにビニルホスフェート修飾も企図される。例示的なビニルホスフェート構造は、前述した構造を含み、式中、Ｒ５’は＝Ｃ（Ｈ）－ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２であり、またＣ５’炭素およびＲ５’間の二重結合は、Ｅ配座またはＺ配座（例えば、Ｅ配座）である。
Ｅ．熱的不安定化修飾
特定の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域中に熱的不安定化修飾を組み込むことによって、ｄｓＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉のために最適化できる。本明細書で使用される場合、「シード領域」は、参照される鎖の５’末端の２～９位を意味する。例えば、熱的不安定化修飾をアンチセンス鎖のシード領域に組み込み、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することができる。
「熱的不安定化修飾」という用語は、そうした修飾を有していないｄｓＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）よりも低い全体的な融解温度（Ｔｍ）を有するｄｓＲＮＡをもたらすこととなる修飾を含む。例えば、熱的不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡのＴｍを、例えば摂氏一度、二度、三度、または四度など、１～４℃だけ減少させることができる。また、用語「熱的不安定化ヌクレオチド」は、一つまたは複数の熱的不安定化修飾を含有するヌクレオチドを指す。
アンチセンス鎖の５’末端から数えて最初の９ヌクレオチドの位置内にある二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことを発見した。したがって、一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチドの位置内に、二重鎖の少なくとも一つ（例えば、一、二、三、四、五またはそれより多い）の熱的不安定化修飾を含む。一部の実施形態では、一つまたは複数の二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２～９位、または好ましくは４～８位に位置する。一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。さらに一部のさらなる実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５または９位に位置する。
熱的不安定化修飾としては、これに限定されないが、脱塩基修飾、対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および例えば２’－デオキシ修飾などの糖修飾、例えば、アンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）である非環式ヌクレオチド、および２’－５’－連結リボヌクレオチド（「３’－ＲＮＡ」）を挙げることができる。
例示の脱塩基修飾としては、これに限定されないが、以下が挙げられ、
式中、Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ、Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ、Ｒ”＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
例示の糖修飾としては、これに限定されないが、
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下からなる群から選択され：
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、また各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す。
一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下からなる群から選択され：
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、またアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミ（例えば、Ｓ）のいずれかを表す。
用語「非環式ヌクレオチド」は、非環式のリボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えばリボース炭素環の結合（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’、またはＣ１’－Ｏ４’）のいずれかが、存在しないか、またはリボース炭素もしくは酸素のうち少なくとも一方（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、またはＯ４’）が独立に、もしくは組み合わせて、ヌクレオチドに存在しないものである。一部の実施形態では、非環式ヌクレオチドは
であり、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３またはアルキルであり、またＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）。「ＵＮＡ」という用語は、糖の結合のいずれかが除去されて、アンロックド「糖」残基を形成するものである、非環式のアンロックド核酸を指す。一実施例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーを包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の炭素－酸素－炭素の共有結合）。別の実施例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の炭素－炭素の共有結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）、およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非環式誘導体は、ワトソン－クリック対合に影響を及ぼすことなく、より大きな骨格柔軟性を与える。非環式ヌクレオチドは、２’－５’または３’－５’連結を介して連結され得る。
「ＧＮＡ」という用語は、グリコール核酸を指し、これはＤＮＡまたはＲＮＡと類似のポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復するグリセロール単位から構成される点でその「骨格」の組成が異なる。
二重鎖の熱的不安定化修飾は、熱的不安定化ヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ二重鎖内の対向する鎖内の対向するヌクレオチドとの間のミスマッチ（すなわち、非相補的な塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に従う。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間に生じ得、すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは独立してそれぞれのヌクレオチドに由来する核酸塩基間で生じ得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－デオキシ核酸塩基であるミスマッチ対合内の少なくとも一つの核酸塩基を含有し、例えば、２’－デオキシ核酸塩基は、センス鎖内にある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二重鎖の熱的不安定化修飾は、修飾された核酸塩基など、標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基とのワトソン－クリック水素結合が損なわれたヌクレオチドを含む。
脱塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）およびミスマッチ修飾のより多くの例は、国際公開第２０１１／１３３８７６号に詳細に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
熱的不安定化修飾はまた、対向し合う塩基と水素結合を形成する能力が低減または消失したユニバーサル塩基およびリン酸修飾を含み得る。
一部の実施形態では、二重鎖の熱的不安定化修飾には、非標準塩基を有するヌクレオチド、例えばこれに限定されないが、対向する鎖内の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれた、または完全に消失した核酸塩基修飾が含まれる。これら核酸塩基修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／００１１８９５号に記載されるように、ｄｓＲＮＡ二重鎖の中心領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基の修飾としては、以下がある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二重鎖の熱的不安定化修飾としては、標的ｍＲＮＡ上の塩基と相補的である一つまたは複数のα－ヌクレオチドを含み、例えば以下があり：
式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ－アルキルである。
天然のホスホジエステル連結と比較して、ｄｓＲＮＡ二重鎖の熱的安定性を低下させることがわかっている例示的なリン酸修飾としては以下のものがある。
Ｒ基のアルキルは、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとしては、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
当業者が認識することとなるように、核酸塩基の機能的役割が本開示のＲＮＡｉ剤の特異性を規定しているということを考慮して、核酸塩基修飾は本明細書に記載するような種々の手法で、例えば、オフターゲット効果に対してオンターゲット効果を増強する目的のために、例えば、本開示のＲＮＡｉ剤に不安定化修飾を導入することを実施することが可能であるが、利用可能であって、概して本開示のＲＮＡｉ剤上に存在する修飾の範囲は、例えば、ポリリボヌクレオチドの糖基またはホスフェート骨格に対する修飾である非核酸塩基修飾に対してずっと大きい傾向がある。こうした修飾は、本開示の他の項でより詳細に記載するものであり、また本明細書において上記または他の場所で記載されるような天然の核酸塩基または修飾核酸塩基のいずれかを有する本開示のＲＮＡｉ剤のために明確に企図される。
ｄｓＲＮＡはまた、熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、一つまたは複数の安定化修飾を含み得る。例えばｄｓＲＮＡは、少なくとも二つ（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上）の安定化修飾を含み得る。限定するものではないが、安定化修飾はすべて、一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも二つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチドで生じ得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターン内で両方の安定化修飾を含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンに対して相対的な移動がある場合がある。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４および１６位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４および１６位に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４、および１６位に安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも一つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端または３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位または＋１位にある、ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位および＋１位にある、安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から＋１位および＋２位にある、少なくとも二つの安定化修飾を含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも二（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定されるものではないが、センス鎖内の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、１０および１１位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、二、三または四つの安定化修飾のブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二重鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に安定化修飾を含まない。
例示的な熱的安定化修飾としては、これに限定されないが、２’－フルオロ修飾が挙げられる。他の熱的安定化修飾としては、これに限定されないが、ＬＮＡが挙げられる。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも四つ（例えば、四、五、六、七、八、九、十またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されないが、２’－フルオロヌクレオチドはすべて、一方の鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも二つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じる得、各２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上の交互パターンにおいて生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンにおいて２’－フルオロ修飾を含む。センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも一つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端または３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位または＋１位の位置にある、ヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々に、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位および＋１位の位置に、２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端に、すなわち、不安定化修飾の位置から＋１位および＋２位に、少なくとも二つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されるものではないが、センス鎖内の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から７、１０および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、二、三または四つの２’－フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二重鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎＴ）のセンス鎖と２３ヌクレオチド（ｎＴ）のアンチセンスとを含み、該アンチセンス鎖は少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、該少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドはアンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位にある）内で生じるものであり、ｄｓＲＮＡの一方の末端が平滑である一方で他方の末端は２ｎＴのオーバーハングを含み、またｄｓＲＮＡは随意に、少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、または七つすべて）の以下の特徴をさらに含むものである：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。好ましくは、２ｎＴのオーバーハングは、アンチセンスの３’末端にある。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該センス鎖は２５～３０ヌクレオチド残基の長さであり、５’末端ヌクレオチド（１位）から開始して、当該センス鎖の１から２３位が少なくとも８のリボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は３６～６６ヌクレオチド残基の長さであり、また３’末端ヌクレオチドから開始して、当該位置における少なくとも８のリボヌクレオチドがセンス鎖の１～２３位と対合して二重鎖を形成し、アンチセンス鎖の少なくとも３’末端のヌクレオチドはセンス鎖と対合せず、また最大６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それによって１～６ヌクレオチドの３’の一本鎖オーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０～３０の連続するヌクレオチドから構成され、それによって１０～３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が相補性が最大となるようにアラインされる場合にアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによってセンスおよびアンチセンス鎖の間に実質的に二重鎖の領域を形成し、またアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも１９リボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的であり、当該二本鎖の核酸が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減させ、またアンチセンス鎖は、少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位に）にある。例えば、熱的不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４～１７位に対向する位置または相補的な位置の間で生じ、またｄｓＲＮＡは、随意に、以下の特徴のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つまたは七つすべて）をさらに有する：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４、または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、および（ｖＩ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～３０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、該ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも２５ヌクレオチドであり最大で２９ヌクレオチドである長さを有するセンス鎖と、最大３０ヌクレオチドの長さであるアンチセンス鎖とを含み、このセンス鎖は、５’末端から１１位にある酵素分解に感受性がある修飾ヌクレオチドを含むものであり、当該センス鎖の３’末端と当該アンチセンス鎖の５’末端とが平滑末端を形成し、そして当該アンチセンス鎖は、その３’末端においてセンス鎖よりも１～４ヌクレオチド長いものであり、二重鎖領域は少なくとも２５ヌクレオチドの長さであり、また該アンチセンス鎖は、該アンチセンス鎖の少なくとも１９ｎＴに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であり、当該ｄｓＲＮＡ分子が哺乳類細胞に導入されたときに標的遺伝子発現を低減させ、また該ｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ切断が、優先的に、当該アンチセンス鎖の当該３’末端を含むｓｉＲＮＡを結果としてもたらし、それによって哺乳類細胞において標的遺伝子の発現が低減されるものであり、該アンチセンスは、少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、この少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンスアのシード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位に）にあり、またｄｓＲＮＡは随意に、以下の特徴のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つまたは七つすべて）をさらに有する：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４、または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、また（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、また（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～２９ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を有する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖内のどのヌクレオチドも修飾され得る。各ヌクレオチドは、同一または異なる修飾で修飾され得、当該修飾としては、非連結ホスフェート酸素の一方もしくは両方の、または連結ホスフェート酸素の一つもしくは複数のうちの一つまたは複数の変更、リボース糖の構成成分の変更、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、ホスフェート部分の「脱リン酸化」リンカーでの大規模な置換、天然に存在する塩基の修飾または置換、およびリボースホスフェート骨格の置換または修飾が挙げられ得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じ、例えば、塩基またはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非連結のＯの修飾である。一部の場合においては、修飾は、核酸中の対象位置のすべてにおいて生じることとなるが、多くの場合、生じることとならない。例として、修飾は、３’末端または５’末端の位置においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内においてのみ生じ得、またはＲＮＡの一本鎖領域内においてのみ生じ得る。例えば、非連結のＯの位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じ得る、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置または最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチド内において生じ得る、または二本鎖および一本鎖領域において、特に末端において、生じ得る。５’末端をリン酸化することが可能である。
それにより、例えば、安定性を増強すること、オーバーハング内に特定の塩基を含めること、または一本鎖のオーバーハング内、例えば、５’オーバーハングもしくは３’オーバーハング内、または両オーバーハング内に、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング内にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態では、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング内の塩基のすべてまたは一部が、例えば、本明細書において記載する修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された、デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチルの使用、およびホスフェート基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾、を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これら鎖は、二つ以上の修飾を含有し得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これら修飾は、アンチセンス鎖内に存在する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾に付加されるということを理解されたい。
少なくとも二つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それらの二つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、非環式ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシから選択される二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチド、または２’－アラ－Ｆヌクレオチド（２’－ａｒａ－Ｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で修飾される。ここでも、これら修飾は、アンチセンス鎖内に存在する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾に付加されるということを理解されたい。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、本明細書で使用する場合、一つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾は、一本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じる。交互ヌクレオチドとは、一つ置きのヌクレオチド毎に一つまたは三つのヌクレオチド毎に一つまたは類似のパターンを指し得る。例えばＡ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドに対する一タイプの修飾を表す場合、当該交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ・・・」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ・・・」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ・・・」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ・・・」などであり得る。
交互モチーフ内に含有されるこのタイプの修飾は、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の一タイプの修飾を表す場合、交互パターンが、すなわち、一つ置きのヌクレオチド上の修飾が、同一であり得るが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々が、例えば「ＡＢＡＢＡＢ・・・」、「ＡＣＡＣＡＣ・・・」、「ＢＤＢＤＢＤ・・・」、または「ＣＤＣＤＣＤ・・・」などである交互モチーフの範囲内のいくつかの可能性のある修飾から選択され得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対して相対的に移動されているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。当該移動は、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なるように修飾された基に対応するようになされたものであり得、逆もまた同様である。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖内のアンチセンス鎖と対合される場合には、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始し得る。別の例としては、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始し得、その結果、センス鎖およびアンチセンス鎖間の修飾パターンの完全な移動または部分的な移動が存在する。
一つの特定の実施例では、センス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、各Ａは、未修飾リボヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一つの特定の実施例では、センス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、各Ａは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
別の特定の実施例では、アンチセンス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」であり、各Ａは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一つの特定の実施例では、センス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の３’－５から「ＢＡＢＡＢＡ」であり、各Ａは、未修飾リボヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
一つの特定の実施例では、センス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」であり、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、当該鎖の３’－５から「ＢＡＢＡＢＡ」であり、各Ａは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドであり、また各Ｂは、２’－Ｏメチル修飾ヌクレオチドである。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置にあるセンス鎖またはアンチセンス鎖または両鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じ得る、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得る、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一または異なり得、またセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチドを含むものであって、該二つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を有する二つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の対合されるヌクレオチドと連結させるようになされ得る。例えば、少なくとも２、３、４またはすべてのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結によって連結され得、随意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対合したヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結が存在し得る。例えば、三つのヌクレオチドのうち二つがオーバーハングヌクレオチドであり、三番目が、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドであるような、末端の三つのヌクレオチド間に、少なくとも二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し得る。好ましくは、これら末端の三つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にあり得る。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される二～十のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の１～１０ブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むアンチセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される二つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される三つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される四つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される六つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、または８のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される七つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、または６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される八つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、または４のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される九つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の末端の１～１０ヌクレオチドの範囲内に一つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センスまたはアンチセンス鎖の一方の末端または両末端においてホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を介して連結され得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の各々の二重鎖の内側領域の１～１０の範囲内に一つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくともヌクレオチド２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドが、センス鎖の５’末端から数えて二重鎖領域の８～１６位にあるホスホロチオエートメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を介して連結され得、当該ｄｓＲＮＡ分子は、随意に、その末端の１～１０位の範囲内に一つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含み得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一～五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一～五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一～五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一～五つをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１または２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１または２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１または２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１または２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つ、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２０および２１位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つをさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２０および２１位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１および２２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１および２２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２２および２３位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２３および２３位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも５つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも６つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも７つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも８つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも９つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１０のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１１のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１２のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１３のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１４のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１５のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１６のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置で少なくとも１７のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置で少なくとも１８のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置で少なくとも１９のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で８以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で７以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で６以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で５以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で４以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で３以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で２以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置で１以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない８以下のヌクレオチド間連結を含む（限定されない例として、ホスホジエステル）。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない７以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない６以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない５以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない４以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない３以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない２以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない１以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１０のヌクレオチド間連結と、キラルでない８以下のヌクレオチド間連結とを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１１のヌクレオチド間連結と、キラルでない７以下のヌクレオチド間連結とを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１２のヌクレオチド間連結と、キラルでない６以下のヌクレオチド間連結とを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１３のヌクレオチド間連結と、キラルでない６以下のヌクレオチド間連結とを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１４のヌクレオチド間連結と、キラルでない５以下のヌクレオチド間連結とを含む。一部の実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置での少なくとも１５のヌクレオチド間連結と、キラルでない４以下のヌクレオチド間連結とを含む。一部の実施形態では、Ｓｐ立体配置でのヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、または連続でなくてもよい。一部の実施形態では、Ｒｐ立体配置でのヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、または連続でなくてもよい。一部の実施形態では、キラルでないヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、または連続でなくてもよい。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＲｐである点でＲｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、Ｒｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、Ｒｐブロックである。一部の実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＳｐである点でＳｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲｐブロックおよびＳｐブロックの両方を含む。一部の実施形態では、提供されたオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のＲｐブロックを含むが、Ｓｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のＳｐブロックを含むが、Ｒｐブロックを含まない。一部の実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のＰＯブロックであって、各ヌクレオチド間連結が天然のホスフェート連結であるＰＯブロックを含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである５’－ブロックを含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が修飾ヌクレオチド間連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々がホスホロチオエート連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、５’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、５’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が修飾ヌクレオチド間連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々がホスホロチオエート連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。一部の実施形態では、３’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態では、３’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。
一部の実施形態では、本開示の化合物は、ある領域内にあるタイプのヌクレオシドを含むか、またはオリゴヌクレオチドに、特定のタイプのヌクレオチド間連結が続くものであり、それは例えば、天然のホスフェート連結、修飾ヌクレオチド間連結、Ｒｐキラルヌクレオチド間連結、Ｓｐキラルヌクレオチド間連結などである。一部の実施形態では、Ａに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ａに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ａに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、Ｕに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ｕに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ｕに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、Ｃに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ｃに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ｃに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、Ｇに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、Ｇに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、Ｇに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、ＣおよびＵに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、ＣおよびＵに、Ｒｐが続く。一部の実施形態では、ＣおよびＵに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。一部の実施形態では、ＡおよびＧに、Ｓｐが続く。一部の実施形態では、ＡおよびＧに、Ｒｐが続く。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位と２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むものであり、このアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位に）に位置する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含有し、またｄｓＲＮＡは、随意に、以下の特徴のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、または八つすべて）をさらに有する：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４、または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、ならびに（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位と２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むものであり、このアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位に）に位置する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含有し、またｄｓＲＮＡは、随意に、以下の特徴のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、または八つすべて）をさらに有する：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４、または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、ならびに（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むものであり、このアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位に）に位置する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含有し、またｄｓＲＮＡは、随意に、以下の特徴のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、または八つすべて）をさらに有する：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５、または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンス鎖は、１、２、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４、または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、ならびに（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１位と２位の間、およびヌクレオチドの２位と３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１位と２位の間、ヌクレオチドの２位と３位の間、ヌクレオチドの２１位と２２位の間、およびヌクレオチドの２２位と２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むものであり、このアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位に）に位置する二重鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含有し、またｄｓＲＮＡは、随意に、以下の特徴のうちの少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、または七つすべて）をさらに有する：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４、または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｖ）センス鎖は、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも二つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２～４０ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、ならびに（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端において平滑末端を有する。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、標的との、二重鎖内のミスマッチ、またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域内に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて格付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づくものであり、最も単純なアプローチとしては、個々の対ごとに対を調べることであるが、次に、隣接するまたは同様の分析も使用可能である）。解離の促進の点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、またＩ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準の対合または標準以外の対合（本明細書において別の箇所に記載される）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく、またユニバーサル塩基を含む対合が、標準の対合より好ましい。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択され得るアンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対、および例えば、非標準の対合または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合であるミスマッチ対のうちの少なくとも一つを含み、二重鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の解離を促進する。
一部の実施形態では、アンチセンス鎖内の５’末端から二重鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の１、２または３の塩基対のうち少なくとも一つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドの任意の位置において、ヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）連結の３’末端に、４’－修飾または５’－修飾のヌクレオチドを導入することで、ヌクレオチド間連結に対する立体効果を発揮させ得、それによってヌクレアーゼに対してそれを保護または安定化させるということがわかった。
一部の実施形態では、５’－修飾ヌクレオチドが、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、５’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の５’位にあるアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとしては、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－修飾ヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の４’位にあるアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドが挙げられる。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、５’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとしては、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。４’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドが挙げられる。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２’－５’連結（２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有し、またＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓを有する）を含み得る。例えば、２’ －５’連結修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用可能であり、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端において使用可能である。
別の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ－アラビノース）を含み得る。例えば、これらＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用可能であり、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端において使用可能である。
種々の刊行物に多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、これらはすべて、本開示のｄｓＲＮＡとともに使用できる。当該公開公報としては、国際公開第２００７／０９１２６９号、米国特許第７８５８７６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、国際公開第２００７／１１７６８６号、国際公開第２００９／０１４８８７号、および国際公開第２０１１／０３１５２０号が挙げられ、それら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
以下により詳細に記載するように、ＲＮＡｉ剤への一つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含有するＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の一つまたは複数の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合させることとなる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の一つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分で、例えば、炭水化物リガンドが結合する非炭水化物（好ましくは、環式の）のキャリアで置換することができる。リボヌクレオチドのサブユニットであって、該サブユニットリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書においては、リボース置換修飾サブユニット（ＰＲＭＳ）と称する。環式キャリアは、環状炭素系であり得、すなわち、すべての環原子が炭素原子であるか、または複素環系であり得、すなわち、一つまたは複数の環原子が例えば、窒素、酸素、硫黄であるヘテロ原子であり得る。環式キャリアは、単環式環系であり得、または二以上の環、例えば、縮合環、を含有し得る。環式キャリアは、完全に飽和の環系であり得、または一つもしくは複数の二重結合を含有し得る。
リガンドは、キャリアを介してポリヌクレオチドに結合し得る。キャリアは、（ｉ）少なくとも一つの「骨格結合点」、好ましくは二つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも一つの「係留結合点」を含む。「骨格結合点」とは、本明細書で使用する場合、例えば、ヒドロキシル基である官能基を指し、または概して結合であって、リボ核酸の骨格、例えば、ホスフェート、もしくは例えば、硫黄含有である修飾ホスフェートの骨格である骨格内にキャリアを組み込むために利用可能であり好適である結合を指す。一部の実施形態における「係留結合点」（ＴＡＰ）とは、選択された部分を接続する環式キャリアの構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは別の）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。随意に、選択部分は、介在する係留によって環式キャリアに接続される。したがって環式キャリアは、しばしば、例えば、アミノ基である官能基を含む、または概して結合であって、構成する環への、例えば、リガンドである別の化学的実体の組み込みもしくは係留に適している結合を提供することとなる。
ＲＮＡｉ剤は、キャリアを介してリガンドにコンジュゲートされ得るものであり、キャリアは、環式基または非環式基であり得、好ましくは環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリン、好ましくは非環式の基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
特定の実施形態では、本開示の方法で使用するＲＮＡｉ剤は、表２～７、１２、１３、および１８～２０のいずれか一つに列挙された剤の群から選択される剤である。これらの薬剤は、一つもしくは複数の親油性部分、一つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体、または一つもしくは複数の親油性部分と一つもしくは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体の両方などのリガンドをさらに含み得る。
ＩＶ．リガンドにコンジュゲートするｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布または例えば、細胞内への細胞取り込みを増強する一つまたは複数のリガンド、部分またはコンジュゲートと、ｉＲＮＡを化学的に連結することを含む。こうした部分としては、これに限定されるものではないが、例えばコレステロール部分などである脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（ｂｅｒｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム １，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）が挙げられる。
特定の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティング、または寿命を変化させる。一部の実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較した場合に、選択された標的に対する、例えば、分子、細胞または細胞型、例えば、細胞または臓器のコンパートメントなどのコンパートメント、組織、身体の器官または領域に対する、親和性の増強をもたらす。通常のリガンドは、二重鎖核酸において二重鎖対合に関与しない。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（Ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｐｏｌｙ（２－ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、ターゲティング基が含まれ得、例えば、細胞または組織ターゲティング剤であり、例えば、レクチンであり、例えば腎細胞など特定の細胞型に結合する糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体である。ターゲティング基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。特定の実施形態では、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、Ｎ－アセチル－ガラクトサミンである。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）、サフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレンブタン酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞または骨細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクタ、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコース、が含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのアクチベーターまたはＮＦ－κＢのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格系を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維または中間径線維を破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大し得る物質、例えば薬物であり得る。該薬物は、例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ（ｓｗｉｎｈｏｌｉｄｅ Ａ）、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
一部の実施形態では、本明細書において記載するｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、これに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することがわかっており、したがって骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）を結合するアプタマーもまた、本明細書において記載する実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適している。
本発明のリガンドがコンジュゲートしたｉＲＮＡは、反応性官能性ペンダント側鎖を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成でき、例えば該ペンダント側鎖は該オリゴヌクレオチド（以下に記載される）上への連結分子の結合に由来するものなどである。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合する連結部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本発明のコンジュゲートにおいて使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に、ごく普通に作製できる。こうした合成のための機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）社（カリフォルニア州、フォスターシティ）をはじめとするいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知の当該合成のための任意の他の手段を、追加的にまたは代替的に採用してもよい。例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などである、他のオリゴヌクレオチドを調製する同様の技術を使用することも知られている。
本発明のリガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドおよびリガンド分子を保有する配列特異的な連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシドの前駆体を利用する好適なＤＮＡシンセサイザー、または連結部分を既に保有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に保有するリガンドヌクレオチドもしくはリガンドヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド保有構成単位上において組み立てられ得る。
連結部分を既に保有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合には、典型的に、配列特異的に連結されるヌクレオシドの合成が完了してから、次いで、リガンド分子が連結部分と反応して、リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを形成する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販の、オリゴヌクレオチド合成でごく普通に使用する標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導したホスホラミダイトを使用して、自動化シンセサイザーによって合成される。
Ａ．脂質コンジュゲート
特定の実施形態では、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、通常、血清タンパク質を、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合できる。ＨＳＡ結合性リガンドは、身体の標的組織への、例えば、腎臓でない標的組織への、コンジュゲートの分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓であり得る。ＨＳＡを結合可能である他の分子もまた、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、（ｂ）標的の細胞もしくは細胞膜内へのターゲティングもしくは輸送を増大できる、または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用できる。
脂質系リガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合を調節、例えば、制御（例えば、阻害）することができる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、したがって身体から排除される可能性が低くなる。コンジュゲートが腎臓を標的とするように、あまり強力にＨＳＡに結合しない脂質または脂質系リガンドを使用することができる。
特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡを結合する。例えばリガンドは、十分な親和性でＨＳＡに結合でき、その結果、非腎臓組織へのコンジュゲートの分布が増強される。しかしながら、この親和性は、通常、ＨＳＡ－リガンド間結合を元に戻すことができないほど強力ではない。
特定の実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合せず、その結果腎臓へのコンジュゲートの分布が増強される。脂質系リガンドの代わりに、または脂質系リガンドに加えて、腎臓細胞を標的とする他の部分も使用できる。
別の態様においては、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる、例えば、ビタミンである部分である。これらは、例えば、悪性または非悪性種の、例えば、がん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、またはがん細胞に取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低比重リポタンパク（ＬＤＬ）もまた挙げられる。
Ｂ．細胞透過剤
別の態様においては、リガンドは、細胞透過剤、例えばヘリックス細胞透過剤などである。特定の実施形態では、細胞透過剤は、両親媒性である。例示的な細胞透過剤としては、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドがある。該細胞透過剤がペプチドである場合、それは修飾可能であり、これにはぺプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチドの連結およびＤ－アミノ酸の使用が挙げられる。ヘリックス剤は、通常、α－ヘリックス剤であり、親油性および疎油性相を有し得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも称する）は、天然ペプチドと類似する規定された三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長であり得、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長である。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチドまたは架橋されたペプチドであり得る。別の選択肢としては、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドとしては、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３１）を有するＲＦＧＦがある。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３２））も、ターゲティング部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を横断してペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を運搬することができる、「送達」ペプチドであり得る。例えば、送達ペプチドとして機能することができることがわかっているのは、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３３））およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３４））よりの配列である。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたはｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）から同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。通常、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体として、細胞ターゲティングペプチド、例えばアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などがある。ペプチド部分は、長さが、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性を増大させるまたは立体配座特性を司るなどの構造的な修飾を有し得る。以下に記載する構造的な修飾のいずれもが利用可能である。
本発明の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状であっても環状であってもよく、また特定の組織へのターゲティングを促進するように修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化、されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチジオ模倣体（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃ）は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用可能である。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。
ＲＧＤペプチド部分を、特定の細胞種、例えば腫瘍細胞、例えば、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞、を標的とするために使用可能である（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９－４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、ｄｓＲＮＡ剤の肺、腎臓、脾臓または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍へのターゲティングを促進できる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３－７８７，２００１）。通常、ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓へのターゲティングを促進することとなる。ＲＧＤペプチドは、直鎖状または環状であり得、また特定の組織へのターゲティングを促進するように修飾され得、例えば、グリコシル化またはメチル化される得る。例えばグリコシル化ＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達可能である（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６－３３６，２００１）。
「細胞透過ペプチド」は、細胞に、例えば、バクテリア細胞もしくは真菌細胞などである微生物細胞、または例えばヒト細胞などである哺乳類細胞に、透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））または一つもしくは二つの支配的なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとの融合ペプチドドメインに由来する、例えばＭＰＧなどである二部分の両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法の一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物をコンジュゲートしたｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、核酸のインビボでの送達に有利であると同時にインビボでの治療的使用に適した組成物である。本明細書において使用する場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも６個の炭素原子を有する一つもしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体（直鎖状、分枝または環状であり得る）、またはその一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々が少なくとも六個の炭素原子を有する一つまたは複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分（直鎖状、分枝または環状であり得る）を有する化合物、のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖、および約４、５、６、７、８または９の単糖単位を含有するオリゴ糖）ならびに多糖、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖類樹脂、が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５、および上記の（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）糖が挙げられ、二糖および三糖としては、二または三の単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を有する糖が挙げられる。
特定の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、単糖を含む。
特定の実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一つまたは複数のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば米国特許第８，１０６，０２２号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡが特定の細胞を標的にするリガンドとして機能する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして機能することによって、ｉＲＮＡが肝臓の細胞を標的にする。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、一つまたは複数のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカーを介して、例えば、二価または三価の分枝リンカーを介して、結合させることができる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば、本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’末端に）コンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば、本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の５’末端に）コンジュゲートされる。
本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明の他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、四価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤に結合した一つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数（例えば、２、３、４、５または６）のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、この各々は、独立して、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する。
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。このヘアピンループはまた、二重鎖のうち一方の鎖内の伸長したオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。このヘアピンループはまた、二重鎖のうち一方の鎖内の伸長したオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、
である。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図で示すようなリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに結合し、式中Ｘは、ＯまたはＳである。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１において規定され、以下に示す、Ｌ９６にコンジュゲートする。
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される。
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６であり（式ＸＸＩＶ）、
式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３～６であり（式ＸＸＶ）、
式中、ＸはＯまたはＳであり（式ＸＸＶＩＩ）、
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用する炭水化物コンジュゲートは、単糖である。特定の実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミンであり、例えば、
である。
本明細書において記載する実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、これに限定されないが、
ＸまたはＹのうち一方がオリゴヌクレオチドである場合、もう一方は、水素である。
一部の実施形態では、適したリガンドは、国際公開第２０１９／０５５６３３号において開示されるリガンドであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、リガンドは、以下の構造を含む。
特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＧａｌＮＡｃリガンドを、このようなＧａｌＮＡｃリガンドが本開示の好ましい髄腔内／脳室内／ＣＮＳ送達経路にとっては価値が制限されることが現在予測される場合であっても、含み得る。
本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。本発明の他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、四価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合する。
特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端、または本明細書に記載される二重標的化ＲＮＡｉ剤の一方もしくは両方のセンス鎖の５’末端など、ｉＲＮＡ剤に結合された一つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。特定の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数の（例えば、２、３、４、５または６の）ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、この各々は、独立して、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合する。
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の二本の鎖が、複数の対合しないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続した一つのより大きな分子の一部である場合には、該ヘアピンループ内の対合しないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して結合したＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を独立に含み得る。
一部の実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、これに限定されないがＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドなどである、上記のような一つまたは複数のさらなるリガンドをさらに含む。
本発明において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲートおよびリンカーとしては、国際公開第２０１４／１７９６２０号および国際公開第２０１４／１７９６２７号に記載されるものが挙げられ、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｄ．リンカー
一部の実施形態では、本明細書において記載するコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の二つの部分を接続する、例えば、化合物の二つの部分を共有結合で結合させる、有機部分を意味する。典型的には、リンカーは、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどのユニット、または原子の鎖であって、例えばこれに限定されるものではないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）など、を含み、一つまたは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環によって中断または終結され得、式中、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族、または置換された脂肪族である。特定の実施形態では、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６、または８～１６原子である。
切断可能な連結基とは、細胞の外部で十分に安定であるが、標的細胞内に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している二つの部分を放出する基である。好ましい実施形態では、切断可能な連結基は、対象の血液中または第二の参照条件下（例えば、血液または血清中で見られる条件を模倣または表すように選択され得る）よりも、標的細胞中または第一の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る）において、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、またはそれ以上、または少なくとも約１００倍速い速度で切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在、の影響を受け易い。概して切断剤は、血清または血液中においてよりも、細胞の内部で、より広範に広がっているかまたはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解剤の例としては、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤、例えば還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、例えば、メルカプタンなどの酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤や、エステラーゼや、エンドソームまたは酸性環境を作出できる試薬、例えば、５以下のｐＨをもたらす試薬や、一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素が挙げられる。
切断可能な連結基、例えばジスルフィド結合などは、ｐＨの影響を受け易い場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨであり、またリソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨである。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断され、それによって、リガンドからのカチオン性脂質を細胞の内側または細胞の所望のコンパートメント内に放出する切断可能な連結基を有することとなる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的にする細胞に左右され得る。例えば、肝臓標的化リガンドは、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結できる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であるため、リンカーは、肝細胞中では、エステラーゼが豊富でない細胞型においてよりも効率的に切断されることとなる。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。
肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞型を標的とする場合には、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
概して、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤が候補連結基を切断する能力（または条件）を試験することによって評価可能である。また、血液中で、または他の非標的組織と接触したときに、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することもまた望ましいであろう。したがって、第一および第二の条件の間での切断に対する相対的な感受性を決定することができるものであり、ここで第一の条件は、標的細胞において切断を示すように選択され、第二の条件は、他の組織または生物学的流体中で、例えば、血液もしくは血清中で、切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養液において、臓器または組織の培養液において、または動物全身において、実施され得る。無細胞条件または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全身におけるさらなる評価によって確認することが、有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞において（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速い速度で切断される。
ｉ．酸化還元切断可能な連結基
特定の実施形態では、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例としては、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）が挙げられる。候補の切断可能な連結基が、適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書において記載する方法に目を向けることができる。例えば、細胞中であって、例えば、標的細胞中で観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。ある条件においては、候補化合物は、血液中で最大約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速い速度で分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準酵素動態アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．ホスフェート系の切断可能な連結基
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、ホスフェート系の切断可能な連結基を含む。ホスフェート系の切断可能な連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する試薬により切断される。細胞内においてホスフェート基を切断する試薬の例としては、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－があり、式中、Ｒｋはそれぞれの出現において、独立に、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２０ハロアルキル、Ｃ６～Ｃ１０アリール、またはＣ７～Ｃ１２アラルキルであり得る。例示的な実施形態としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、および－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－が挙げられる。特定の実施形態では、ホスフェート系連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｉｉ．酸切断可能な連結基
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な連結基は、ｐＨが約６．５以下である酸性環境（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）において、または一般酸として作用できる酵素などの薬剤によって、切断される。細胞内においては、特定の低ｐＨオルガネラ、例えばエンドソームおよびリソソームが、酸切断可能な連結基のための切断環境をもたらすことができる。酸切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態では、エステル（アルコキシ基）の酸素に結合する炭素は、アリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基、例えばジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｖ．エステル系切断可能な連結基
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステル系の切断可能な連結基を含む。エステル系の切断可能な連結基は、細胞内においてエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルの切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｖ．ペプチド系切断可能な連結基
さらに別の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチド系の切断可能な連結基を含む。ペプチド系の切断可能な連結基は、細胞内においてペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドが得られるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質が得られるアミド結合の特殊な型である。ペプチド系の切断基は、概して、アミノ酸の間で形成されてペプチドおよびタンパク質が得られるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定されて、すべてのアミド官能基を含むものではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有するものであり、式中、ＲＡおよびＲＢは、二つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの限定されない例としては、これに限定されないが、
が挙げられ、ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、もう一方は、水素である。
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して結合した一つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ－アセチルガラクトサミン）誘導体である。
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＬＶ）～（ＸＬＶＩ）のいずれかで示される構造の群から選択される二価または三価の分枝リンカーにコンジュゲートされる：
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、出現ごとに独立に、０～２０を表し、また繰り返し単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、出現ごとに独立に、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり、
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、出現ごとに独立に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、式中一つまたは複数のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうち一つまたは複数によって中断または終結され得、
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、出現ごとにそれぞれ独立に、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり、
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、リガンドを表し、すなわち、出現ごとにそれぞれ独立に、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖を表し、またＲａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。三価のコンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためにＲＮＡｉ剤と共に使用するのに一部有用であり、例えば以下の式（ＸＬＩＸ）のものなどであり、
式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする二価および三価の分枝のリンカー基の例としては、これに限定されないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩのような上記で列挙した構造が挙げられる。
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号、および第８，１０６，０２２号が挙げられ、この各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物においてすべての位置について均一に修飾される必要はなく、実際には、先述の修飾のうち二つ以上を単一の化合物内に、またはさらにｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいて組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本発明の文脈で、「キメラの」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、ｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡ剤であり、これは二以上の化学的に別個の領域を含有し、そのそれぞれが少なくとも一つのモノマーユニットから、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合ではヌクレオチドから、構成される。これらｉＲＮＡは、典型的には、少なくとも一つの領域であって、そこでＲＮＡが、ｉＲＮＡに対してヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するように修飾されるものである、少なくとも一つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡの複合型を切断可能である酵素のための基質として機能し得る。例として、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化が、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果的に、これに匹敵する結果は、しばしば、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合により短いｉＲＮＡで得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、ごく普通に検出可能である。
特定の例においては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンドの基によって修飾できる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンドの分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされてきたので、当該コンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。こうした非リガンドの部分には、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（ｈｅｘｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）、が含まれてきた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列挙している。典型的なコンジュゲーションプロトコールは、配列の一つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基が、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用することによってコンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡがまだ固体支持部に結合している状態で、または溶液相でＲＮＡが切断された後で実施可能である。典型的には、ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製によって、純粋なコンジュゲートが得られる。
Ｖ．ＳＯＤ１ノックダウンのインビボ試験
ＳＯＤ１関連神経変性疾患のマウスモデルが作製されており、本明細書に提供されるＲＮＡｉ剤のインビボ有効性を実証するためにさらに使用することができる。
かかるモデルは、一部の例では、ＡＬＳ関連変異（例えば、Ｇ９３Ａ、Ｇ３７Ｒ、Ｇ８６Ｒ、Ｇ８５Ｒ、Ｌ８４Ｖ、Ｇ１２７Ｘ、Ｈ４６Ｒ、Ｄ９０Ａ、Ｌ１２６Ｚ、Ａ４Ｖ 、またはＡ４Ｖ／ＳＯＤ１ＷＴ変異）を含む、例えば、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）を発現、例えば、過剰発現し得る（例えば、Ｍｉｎａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：９を参照）。さらに、かかるモデルは、一部の例では、病原性変異（例えば、スウェーデン変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬ））を含む、例えば、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の恒常性または誘導性発現、例えば、過剰発現、一部の例では、病原性変異（例えば、ｄＥ９変異）（参照：例えば、Ｇａｒｃｉａ－Ａｌｌｏｚａ、Ｍ ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ２４（３）：５１６～２４）を含む、ヒトプレセニリン１（ＰＳ１）の恒常性または誘導性発現、例えば、過剰発現、および／または、一部の例では、病原性変異（例えば、Ｐ３０１Ｓ変異）（Ｗｕ、Ｔ ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２８（８）：２１１１－２１２３）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）トランスジェニックマウス（参照：例えば、Ａｚｉｚａ（２０１８）インビボ３２（９８３））、パーキンソン病のマウス毒素モデル（例えば、ＭＰＴＰ）、および／またはα、シヌクレイントランスジェニックマウス（Ｂｌｅｓａ ａｎｄ Ｐｒｚｅｄｂｏｒｓｋｉ（２０１４）Ｆｒｏｎｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８：１５５）を含む、例えば、１Ｎ４Ｒヒトタウタンパク質の恒常性または誘導性発現、例えば、過剰発現を含有し得る。
ＶＩ．本開示のＲＮＡｉ剤の送達
ヒト対象（例えば、それを必要とする対象、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）などのＳＯＤ１－関連神経変性障害を有する対象）など、細胞、例えば、対象中の細胞への本開示のＲＮＡｉ剤の送達は、様々な方法で達成され得る。例えば、送達は、細胞をインビトロまたはインビボのどちらかで本開示のＲＮＡｉ剤と接触させることによって実施され得る。インビボでの送達は、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施され得る。あるいは、インビボでの送達は、ＲＮＡｉ剤をコードしてその発現を誘導する一つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施され得る。これら選択肢は、以下においてさらに説明される。
概して、核酸分子を送達する任意の方法（インビトロまたはインビボで）は、本開示のＲＮＡｉ剤の使用に適合させることができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号を参照されたく、これは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。インビボでの送達の場合、ＲＮＡｉ剤を送達するために考慮する因子としては、例えば、送達された薬剤の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織内での送達された薬剤の蓄積が挙げられる。ＲＮＡｉ剤の非特異的効果は、局所投与によって、例えば組織への直接注入もしくは移植または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。処置部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化して、それとは別に薬剤によって害され得るかまたは薬剤を分解することができる全身組織への薬剤の曝露を制限し、また投与しようとするＲＮＡｉ剤のより少ない投与総量を可能にする。いくつかの研究では、ＲＮＡｉ剤が局所的に投与された場合の遺伝子産物のノックダウンの成功が示されている。例えば、カニクイザルにおける硝子体内への注入によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）およびマウスにおける網膜下への注入（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）がいずれも、加齢黄斑変性症の実験モデルにおいて、新生血管形成を予防することを示した。加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接の腫瘍内注入が、腫瘍体積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、また腫瘍を有するマウスの生存を長引かせることができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０、Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入によるＣＮＳへの局所送達によって成功することがわかっており（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６、Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ ａ．ｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８、Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８、Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５、Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、また肺に対しては鼻腔内投与によって成功することがわかっている（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４、Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４、Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）。疾患の処置のためにＲＮＡｉ剤を全身投与する場合、ＲＮＡを修飾するか、または代替として、薬物送達システムを使用して送達することができ、いずれの方法も、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによってｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐように機能する。ＲＮＡまたは医薬キャリアを修飾することによっても、標的組織へのＲＮＡｉ剤のターゲティングを可能にすることができ、また望ましくないオフターゲット効果を回避することができる（例えば、理論に拘束されることを望むわけではないが、本明細書に記載のＧＮＡの使用は、ｄｓＲＮＡのシード領域を不安定化させることが特定されているが、これにより当該ｄｓＲＮＡのオフターゲット効果と比較してオンターゲット効果への優先性が向上することとなり、それによりオフターゲット効果が、こうしたシード領域の不安定化によって有意に低下することとなる）。ＲＮＡｉ剤は、細胞取り込みを増強し、分解を防ぐように、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾することができる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたＡｐｏＢへと誘導されるＲＮＡｉ剤を、マウスに全身注入したところ、結果として、肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを生じた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。アプタマーへのＲＮＡｉ剤のコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害し、腫瘍縮小を媒介することが分かっている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代替的な実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達させることができる。正に帯電したカチオン性送達システムにより、分子ＲＮＡｉ剤（負に帯電した）の結合が促進され、また負に帯電した細胞膜での相互作用も向上し、それによって細胞によるＲＮＡｉ剤の効率的な取り込みが可能になる。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーを、ＲＮＡｉ剤に結合することができるか、またはＲＮＡｉ剤を封入するベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ１２９（２）：１０７－１１６を参照）。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与したときのＲＮＡｉの分解をさらに防止する。カチオン性のＲＮＡｉ剤複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００、Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたく、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡｉ剤の全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、同上、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）、同上）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子（ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ、Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７、Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ＲＮＡｉ剤とシクロデキストリンの投与方法およびＲＮＡｉ剤とシクロデキストリンとによる医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号に見ることができ、これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
本開示の特定の態様は、細胞内においてＳＯＤ１標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、該細胞を本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることを含む方法に関する。一実施形態では、細胞は肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ）、任意で肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）である。一実施形態では、細胞は、肝外細胞（ｅｘｔｒａｈｅｐｔｉｃ ｃｅｌｌ）であり、随意にＣＮＳ細胞である。
本開示の別の態様は、対象においてＳＯＤ１標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤を対象に投与することを含む方法に関する。
本開示の別の態様は、ＳＯＤ１関連神経変性障害を有する対象を治療する方法であって、対象に本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤の治療有効量を投与し、それによって対象を治療することを含む方法に関する。本開示の方法によって治療され得る例示的なＣＮＳ障害としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）が挙げられる。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、皮下投与される。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）投与される。
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、髄腔内投与される。一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒｌｙ）投与される。この方法は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の髄腔内投与または脳室内投与によって、脳（例えば、線条体）または脊柱組織、例えば皮質、小脳、頚椎、腰椎、および胸椎におけるＳＯＤ１標的遺伝子の発現を減少させることができる。
説明を簡単にするため、この項における製剤、組成物、および方法は、主として修飾ｓｉＲＮＡ化合物に関して述べる。しかしながら、これら製剤、組成物、および方法は、他のｓｉＲＮＡ化合物、例えば、未修飾ｓｉＲＮＡ化合物で実施することができ、そして当該実施は、本開示の範囲内であることは理解され得る。ＲＮＡｉ剤を含む組成物は、様々な経路によって対象に送達することができる。例示的な経路としては、髄腔内、皮下、静脈内、脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）としても知られる）、腹腔内、硝子体内、局所、直腸、肛門、膣、および眼が挙げられる。
本開示のＲＮＡｉ剤は、投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。こうした組成物は、通常、一以上の種のＲＮＡｉ剤と薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書において使用する場合、語句「薬学的に許容可能な担体」は、医薬投与に適合性の、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、組成物におけるそれらの使用は意図される。補足的な有効成分もまた組成物に組み込まれ得る。
本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、ならびに処置される面積に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所（例えば、眼内、経膣、経直腸、経皮など）、経口、または非経口投与であり得る。非経口投与は、点滴静注、皮下、腹腔内、もしくは筋肉注射、または髄腔内または脳室内の投与を含む。
投与の経路および部位は、ターゲティングを増強するように選択され得る。例えば、筋肉細胞を標的とするため、目的の筋肉内への筋肉注射が、論理的な選択となるであろう。肺細胞は、粉末またはエアロゾル形態でのＲＮＡｉ剤の投与によって標的とすることができる。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをＲＮＡｉ剤でコーティングすること、およびＲＮＡを機械的に導入することによって標的とすることができる。
局所投与用製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末、または油状の基剤、増粘剤なども必要であり得、または望ましくあり得る。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であり得る。
経口投与用組成物としては、散剤または顆粒剤、水中の懸濁剤または溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤または非水性媒体、タブレット剤、カプセル剤、ドロップ剤、またはトローチ剤を含む。錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩が挙げられる。錠剤中には、例えばデンプンなどの種々の崩壊剤、および例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどである潤滑剤が、通常使用される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。経口投与のために水性懸濁剤が必要な場合は、核酸組成物を、乳化剤および懸濁剤と組み合わせることができる。所望の場合、特定の甘味剤または風味剤を加えることができる。
髄腔内または脳室内に投与されるための組成物は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌の水溶液を含み得る。
非経口投与用の製剤は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌の水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えばリザーバに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進され得る。静脈内での使用の場合、溶質の総濃度は、調製物を等張にするように制御され得る。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物、またはｓｓｉＲＮＡ化合物、組成物の投与は、非経口であり、例えば、静脈内（例えば、ボーラスとして、または拡散性注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡下、経直腸、経口、経膣、局所、経尿道、または眼内である。投与は、対象自身によって、または他の者、例えば、医療提供者などによって提供され得る。医薬品は、測定された用量で、または計量された用量を送達するディスペンサーで、提供することができる。選択される送達形態は、以下においてより詳細に説明する。
髄腔内投与
一実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、髄腔内注入（すなわち、脳および脊髄組織を浸す脳脊髄液への注入）によって送達される。脳脊髄液へのＲＮＡｉ剤の髄腔内注入は、ボーラス注入として、または皮下に植え込み可能であり、それによって脳脊髄液へのｓｉＲＮＡの規則正しい一定の送達を提供することができるミニポンプによって、実施することができる。脳脊髄液が産生される脈絡叢からの脳脊髄液の循環は、脊髄および後根神経節の周りを下り、その後上がって小脳を通過して、皮質を越えてクモ膜顆粒へと入り、そこで脳脊髄液はＣＮＳを出ることができるものであり、注入された化合物のサイズ、安定性、および溶解性に応じて、髄腔内より送達される分子は、ＣＮＳ全体を通して標的を攻撃することとなる。
一部の実施形態では、髄腔内投与は、ポンプを介して行われる。ポンプは、外科手術によって植え込んだ浸透圧ポンプであり得る。一実施形態では、浸透圧ポンプは、髄腔内投与を容易にするために、脊柱管のクモ膜下腔内に植え込まれる。
一部の実施形態では、髄腔内投与は、ある量の医薬品を収容するリザーバと、リザーバに収容された医薬品の一部を送達するように構成されたポンプを含む、製薬品の髄腔内送達システムを介して行われる。この髄腔内送達系についてのさらなる詳細は、国際公開第２０１５／１１６６５８号で見られ得、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
髄腔内注入されたＲＮＡｉ剤の量は、一つの標的遺伝子から別の標的遺伝子で変動し得、ならびに適用されるべき適切な量は、標的遺伝子ごとに個別に決定しなければならない場合がある。典型的には、この量は、１０μｇから２ｍｇ、好ましくは５０μｇから１５００μｇ、より好ましくは１００μｇから１０００μｇの範囲である。
本開示のベクターコードＲＮＡｉ剤
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写物ユニットから発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０、国際公開第００／２２１１３号、国際公開第００／２２１１４号、および米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。発現は、使用される特定の構築物ならびに標的の組織または細胞種に応じて持続することが好ましい（数か月またはそれ以上）。これら導入遺伝子は、直鎖状の構築物、環状プラスミド、または統合ベクターもしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子はまた、染色体外プラスミドとして継代されることが可能になるように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２９２）。
ＲＮＡｉ剤の個々の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写させることができる。二つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡを生成するように発現される場合、二つの別々の発現ベクターを、標的細胞内に同時導入することができる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個別の鎖を、プロモーターによって転写させることができ、プロモーターのいずれもが同じ発現プラスミド上に位置される。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム－アンド－ループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向リピートポリヌクレオチドとして発現される。
ＲＮＡｉ剤発現ベクターは、概して、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞に適合性がある発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に対して適合性がある発現ベクターを使用することにより、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤の発現のための組換え構築物を産生することができる。ＲＮＡｉ剤発現ベクターの送達は、例えば静脈内または筋肉内投与によって、患者から取り出された標的細胞への投与とその後の患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって、全身的になされ得る。
本明細書において記載する方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるものではないが、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レトロウイルスベクター、例えばこれに限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えばオルソポックスなどであり、例えば、ワクシニアウイルスベクターなど、またはトリポックスであり、例えば、カナリアポックスもしくは鶏痘など、ならびに（ｊ）ヘルパー依存性アデノウイルスまたはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスもまた有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるようになるかまたは組み込まれるようにならないであろう。当該構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含めることができる。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター内に、例えば、ＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター内に、組み込むことができる。ＲＮＡｉ剤の組換え発現のための構築物は、概して、標的細胞におけるＲＮＡｉ剤の発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とすることとなる。ベクターおよび構築物を検討するための他の態様は、当技術分野で公知である。
ＶＩＩ．本発明の医薬組成物
本開示は、本開示のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態では、本明細書において説明されるＲＮＡｉ剤と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。ＲＮＡｉ剤を含有する医薬組成物は、ＳＯＤ１の発現または活性に関連する疾患または障害、例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）などのＳＯＤ１関連神経変性疾患の治療に有用である。
こうした医薬組成物は、送達の態様に基づいて製剤化される。一実施例としては、非経口送達を介して、例えば、静脈内（ＩＶ）送達、筋肉内（ＩＭ）送達、または皮下（ｓｕｂＱ）送達によって、全身投与用に製剤化される組成物がある。別の実施例としては、例えば、髄腔内または脳室内の注入経路によって、随意に脳（例えば、線条体）内への注入、例えば連続ポンプ注入などによって、ＣＮＳ内への直接送達用に製剤化された組成物がある。
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、発熱因子なしであるか、または非発熱性である。
本開示の医薬組成物は、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量で投与され得る。概して、本開示のＲＮＡｉ剤の適切な用量は、約０．００１～約２００．０ｍｇの範囲の固定用量を、１か月に約１回～１年に約１回、典型的には、１／４年に約１回（すなわち、３か月に約１回）～１年に約１回、概して、１～５０ｇの範囲の固定容量を、１か月に約１回～１年に約１回、典型的には、１／４年に約１回～１年に約１回である。
初回治療レジメン（例えば、初回負荷量）の後、治療は、少ない頻度で施与することができる。
当業者は、例えばこれらに限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、過去の治療、対象の健康全般または年齢、および存在する他の疾患などである特定のファクターが、対象を効果的に治療するために必要な投薬量および投薬のタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。その上、治療有効量の組成物での対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。
マウス遺伝学における進歩は、ＳＯＤ１の発現の減少から恩恵を受けることとなる、様々なＳＯＤ１関連神経変性疾患の研究のために多くのマウスモデルを生み出した。こうしたモデルは、ＲＮＡｉ剤のインビボ試験のため、ならびに治療有効用量を決定するために使用することができる。好適なマウスモデルは当該技術分野で公知であり、例えば、本明細書の他の箇所に記載されるマウスモデルを含む。
本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、および処置される面積に応じて、いくつかの方法で施与され得る。投与は、局所（例えば、経皮吸収剤による）、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内の注射または注入、例えば、植込みデバイスによって皮下への投与、または例えば、実質内、髄腔内、または脳室内の投与によって頭蓋内への投与を含む。
ＲＮＡｉ剤は、特定の組織、例えば、肝臓、ＣＮＳ（例えば、脳のニューロン、膠細胞、または血管内皮組織）、または肝臓とＣＮＳの両方などを標的とする方式で送達することができる。
局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、増粘剤などは、必要であり得るか、または望ましいものであり得る。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤としては、本開示で取り上げるＲＮＡｉ剤が、局所送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂質酸、脂質酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤との混合物となっているものを含める。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本開示において取り上げるＲＮＡｉ剤は、リポソーム内においてカプセル化することができ、またはリポソームと、特にカチオン性リポソームと複合体を形成することができる。あるいは、ＲＮＡｉ剤は、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、これに限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１～２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．膜性分子アセンブリを含むＲＮＡｉ剤製剤
本開示の組成物および方法で使用するためのＲＮＡｉ剤は、膜性分子アセンブリでの、例えば、リポソームまたはミセルでの送達用に製剤化することができる。本明細書において使用する場合、用語「リポソーム」は、少なくとも一つの二分子層、例えば、一つの二分子層または複数の二分子層内に整列した両親媒性脂質で構成されたベシクルを指す。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性の内部とを有する単層膜および多重膜のベシクルを含む。水性部分が、ＲＮＡｉ剤組成物を含有する。親油性材料は、典型的にはＲＮＡｉ剤組成物を含まないが一部の実施例では含む場合もある水性の外側部分から、水性の内側部分を隔離する。リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用されるとリポソーム二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、ＲＮＡｉ剤を含む内側水性部分の内容物は、細胞内へと送達されて、そこでＲＮＡｉ剤が、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、そしてＲＮＡｉを媒介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ＲＮＡｉ剤を特定の細胞種に誘導するために、特異的に標的とされる。
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製することができる。一実施例では、リポソームの脂質成分が界面活性剤に溶解され、それによって脂質成分でミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得、また非イオン性であり得る。例示的な界面活性剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ＲＮＡｉ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質上のカチオン性基が、ＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、界面活性剤は、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物を得るために、例えば、透析などによって、除去される。
必要であれば、凝集反応の際に、例えば、制御された添加によって、凝集を補助する担体化合物を加えることもできる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマーであり得る（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）。ｐＨはまた、縮重に都合よく調節可能である。
送達ビヒクルの構造的な成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込んだ安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを産生する方法が、例えば、国際公開第９６／３７１９４号にさらに記載されて、その内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム形成はまた、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、米国特許第４，８９７，３５５号、米国特許第５，１７１，６７８号、Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９；および Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７、に記載される例示的な方法の一つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズの脂質凝集体を調製するために通常使用される技術としては、超音波処理および凍結融解に加えて押出成形が挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１を参照されたい。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が望ましいときには、顕微溶液化を使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９。これら方法は、ＲＮＡｉ剤の調製物をリポソームに包含させるために容易に適合される。
リポソームは、二つの広いクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正に帯電したリポソームであって、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成するリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合して、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中へと放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９８０－９８５）。
リポソームは、ｐＨ感受性であるかまたは負に帯電しており、それらとの複合体ではなく核酸を捕捉する。核酸および脂質の両方が、同様の電荷であるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、一部の核酸は、これらリポソームの水性内側部分内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を、培養液中の細胞単一層に送達するために、ｐＨ感応性リポソームが使用され てきた。外因性遺伝子の発現が、標的遺伝子内において検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９：２６９－２７４）。
リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成され、例えば大豆製ＰＣおよび卵製ＰＣなどである。別のタイプは、リン脂質またはホスファチジルコリンまたはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロおよびインビボでリポソームを細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号、米国特許第５，１７１，６７８号、国際公開第９４／００５６９号、国際公開第９３／２４６４０号、国際公開第９１／１６０２４号、Ｆｅｌｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９、Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３、およびＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
非イオン性リポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系は、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するためにも試験されてきた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮中にシクロスポリンＡを送達するために使用された。結果として、こうした非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリンＡの蓄積を促進する際に有効であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，４（６）：４６６）。
リポソームはまた、「立体的に安定化した」リポソームも含み、当該用語は、本明細書において使用する場合、一つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームであって、リポソームに組み込まれた場合に、結果として当該特化された脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命の向上が生じるような一つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化したリポソームの例としては、リポソームのベシクル形成脂質部分が（Ａ）例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１などである一つまたは複数の糖脂質を含むか、または（Ｂ）例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などである一つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されている、リポソームである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームの場合、これら立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の向上は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来するということが、当技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３：４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３７６５）。
一つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８７），５０７：６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を向上させる能力について報告した。これら知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５，：６９４９）によって解説された。いずれもＡｌｌｅｎらによる米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開第８８／０４９２４号では、（１）スフィンゴミエリンと（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）では、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示している。１，２－ＳＮ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）において開示されている。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的には融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれるため、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性および生分解性であること、リポソームは広範囲の水および脂質溶解性薬物を組み込むことができること、リポソームはそれらの内部コンパートメント内のカプセル化されたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護することができること、が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討事項は、脂質表面の電荷、ベシクルのサイズ、およびリポソームの水の量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、小リポソームを形成するために使用することができ、該小リポソームは、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することができる脂質－核酸複合体を形成する核酸と自発的に相互作用して、結果としてＲＮＡｉ剤の送達がなされる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、ならびにＤＯＴＭＡの説明およびＤＮＡとのその使用については米国特許第４，８９７，３５５号を参照）。
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用することにより、ＤＮＡ複合体化ベシクルを形成することができる。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ゲイザースバーグ、メリーランド州）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正に帯電し たＤＯＴＭＡリポソームを含む、生組織培養細胞内へのアニオン性の核酸の高度な送達に有効な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームを使用すると、結果として得られる複合体上の正味電荷も正である。この方法において調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に結合し、原形質膜と融合して、機能的核酸を、例えば組織培養細胞内へと効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナポリス、インディアナ州）は、オレオイル部分が、エーテル連結ではなくエステルで連結している点がＤＯＴＭＡと異なる。
他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、様々な部分にコンジュゲートしているものが挙げられ、例えば二つのタイプの脂質の一方にコンジュゲートしているカルボキシスペルミンなどが挙げられ、また例えば５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（トランスフェクタム（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ）（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン ５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム中へと製剤化されているコレステロールでの脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに効果的であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８）。特定の細胞系の場合、コンジュゲートしたカチオン性脂質を含むこれらリポソームは、低い毒性を示すと言われており、またＤＯＴＭＡ含有組成物よりもより効率的なトランスフェクションをもたらす。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ社、ラホヤ、カリフォルニア州）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社、ゲイザースバーグ、メリーランド州）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号および国際公開第９６／３７１９４号に記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に勝るいくつかの利点をもたらす。こうした利点としては、投与された薬物の高い体内吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、およびＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実践形態においては、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を上皮細胞に送達するため、および真皮組織内、例えば、皮膚内へのＲＮＡｉ剤の浸透を増強するために、使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所的な送達は、文献 に報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｖｏｌ．２，４０５－４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２５９－２６５、Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０、Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６、Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７－１７６、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２－５２７、Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５を参照）。
非イオン性リポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系は、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するためにも試験されてきた。マウスの皮膚の真皮内に薬物を送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０ －ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこうした製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
ＲＮＡｉ剤を含むリポソームは、非常に変形可能に作製することができる。こうした変形能は、リポソームがリポソームの平均半径より小さい孔を通って浸透することを可能にする。例えば、トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なタイプのリポソームである。トランスファーソームは、表面エッジ活性化剤（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常は界面活性剤、を標準のリポソーム組成物に加えることによって作製することができる。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、ＲＮＡｉ剤を皮膚のケラチン生成細胞に送達するために、感染によって、例えば皮下に送達することができる。脂質ベシクルは、インタクトな哺乳動物の皮膚を通過するために、好適な経皮勾配の影響下において、それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。加えて、脂質特性に起因して、これらトランスファーソームは、自己最適性（例えば、皮膚などにおいて、孔の形状に順応性のある）で、自己修復性であり得、ならびに断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達することができ、また多くの場合、自己負荷性（ｓｅｌｆ－ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本開示に適合する他の製剤は、ＰＣＴ公開公報である国際公開第２００８／０４２９７３号に記載されている。
トランスファーソームは、さらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルの関心ある候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質滴であって、該脂質滴より小さい孔を通って容易に浸透することができるほど高度に変形可能である脂質滴として説明することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは、自己最適性（皮膚において孔の形状に順応性のある）で、自己修復性であり、断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達し、また多くの場合自己負荷性である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤、を標準リポソーム組成物に加えることができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同じくらい有効であることが分かっている。
界面活性剤は、本明細書において説明されるような製剤において、特にエマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームにおいて、広い応用が見出される。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最もよくある手法としては、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を使用するものがある。親水性基（「頭」としても知られる）の性質が、製剤中で使用される様々な界面活性剤を分類するのに最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧製品において広い応用が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルが挙げられる。例えば脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコールおよびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどである非イオン性のアルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も普及した要素である。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、例えばセッケンなどであるカルボン酸エステル、アシル乳酸エステル、アミノ酸のアシルアミド、例えばアルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなどである硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステルなどであるスルホン酸エステル、アシルイセチオン酸エステル、アシルタウリン酸塩、およびスルホコハク酸塩、およびリン酸塩が挙げられる。アニオン性剤のクラスの最も重要な要素は、アルキル硫酸エステルおよびセッケンである。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される要素である。
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤、およびエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本開示の方法での使用のためのＲＮＡｉ剤は、ミセル製剤としても提供することができる。「ミセル」は、本明細書においては、分子のすべての疎水性部分が内側に向くように両親媒性分子が球状構造で整列され、それによって親水性部分が周囲の水相に接触したままになる、特定のタイプの分子アセンブリとして定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置で存在する。
経皮的な膜を通る送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液と、アルカリ金属のＣ８～Ｃ２２アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物とを混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリジサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン（ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ ｏｘｏ ｃｈｏｌａｎｙｌ ｇｌｙｃｉｎｅ）およびその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩（ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、デオキシコール酸塩、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属のアルキル硫酸塩と同時に加えてもよく、またはそれらを加えた後に加えてもよい。混合ミセルは、原材料の、実質的に任意の種類の混合によって形成されることとなるが、より小さいサイズのミセルを提供するために激しい混合によって形成されることとなる。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と少なくともアルカリ金属のアルキル硫酸塩とを含む第一のミセル組成物が調製される。次いで、第一のミセル組成物を、少なくとも三種のミセル形成化合物と混合し、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属のアルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物のうちの少なくとも一つとを混合して、その後に激しく混合しながら、残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
製剤を安定化させるため、および細菌増殖から保護するために、フェノールまたはｍ－クレゾールを混合ミセル組成物に加えてもよい。あるいは、フェノールまたはｍ－クレゾールを、ミセル形成原材料と共に加えてもよい。グリセリンなどの等張剤を、混合ミセル組成物の形成後に加えてもよい。
ミセル製剤を噴霧剤として送達する場合には、当該製剤を、エアゾールディスペンサーに入れることができ、そしてディスペンサーには、噴射剤が装填される。噴射剤は、加圧されており、ディスペンサー中では液体状態である。原材料の比率は、水相および噴射剤の相が一つになるように、すなわち、一相で存在するように、調節される。二相で存在する場合には、例えば、計量弁などによって、内容物の一部を噴出する前に、ディスペンサーを振る必要がある。医薬品の分配用量が、微細な噴霧で計量弁から射出される。
噴射剤は、含水素クロロフルオロカーボン、含水素フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用され得る。
必須の原材料の特定の濃度は、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔による吸収の場合には、注射でのまたは胃腸管経由の投与のための投与量を、例えば、少なくとも二倍または三倍に、増加させることが望ましいことが多い。
脂質粒子
ＲＮＡｉ剤は、例えば、本開示のｄｓＲＮＡは、例えば、ＬＮＰなどである脂質製剤において、または他の核酸－脂質粒子において、完全にカプセル化され得る。
本明細書において使用される場合、用語「ＬＮＰ」は、安定な核酸－脂質粒子を指す。ＬＮＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＬＮＰは、静脈（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を呈し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）において蓄積するため、全身投与に極めて有用である。ＬＮＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含むものであり、それは国際公開第００／０３６８３号に記載されるようなカプセル化された縮合剤－核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には、平均粒径が約５０ｎｍから約１５０ｎｍであり、より典型的には約６０ｎｍから約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍから約１１０ｎｍであり、最も典型的には約７０ｎｍから約９０ｎｍであり、また実質的には無毒性である。加えて、核酸は、本開示の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を有する。核酸－脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号、および国際公開第９６／４０９６４号において開示されている。
一実施形態では、薬物に対する脂質の比（質量／質量比）（例えば、ｄｓＲＮＡに対する脂質の比）は、約１：１から約５０：１、約１：１から約２５：１、約３：１から約１５：１、約４：１から約１０：１、約５：１から約９：１、または約６：１から約９：１の範囲とすることとなる。上記に列記した範囲の中間にある範囲も、本開示の一部であることが企図される。
ＲＮＡｉ剤の送達用のある特定のＬＮＰ製剤は、当技術分野において記述されてきたものであり、例えば、国際公開第２００８／０４２９７３号において説明されるような例えば、「ＬＮＰ０１」製剤が挙げられ、当該公開公報は参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤を、下記の表で特定している。
製剤を含むＳＮＡＬＰ（１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））は、国際公開第２００９／１２７０６０号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＸＴＣは、国際公開第２０１０／０８８５３７号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＭＣ３は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＡＬＮＹ－１００は、国際公開第２０１０／０５４４０６号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＣ１２－２００は、国際公開第２０１０／１２９７０９号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁剤または溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましい場合がある。一部の実施形態では、経口製剤は、本開示において取り上げるｄｓＲＮＡが一つまたは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と共に投与される製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、浸透促進剤の組合せが用いられ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。例示的な組み合わせの一つには、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩がある。さらに、浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示において取り上げるｄｓＲＮＡは、噴霧された乾燥粒子などの粒状形態で、経口で送達することができ、またはマイクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化することができる。ｄｓＲＮＡ複合体化薬剤としては、ポリ－アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン、ポリアルキルシアノアクリレート、ＤＥＡＥ誘導ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。好適な複合体化薬剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミン、およびＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口製剤およびその調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３／００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号において詳細に記載されており、それぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内へ）、髄腔内、脳室内、または肝内への投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤、例えばこれらに限定されるものではないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などを含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。
本開示の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤を含む。これら組成物は、予め形成した液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含めるがこれらに限定されない様々な構成要素から生成することができる。特に好ましいのは、ＳＯＤ－１関連の疾患または障害を治療する場合において脳を標的とする製剤である。
本開示の医薬製剤は、単位剤形において簡便にもたらされ得、製薬産業において周知の従来技術に従って調製することができる。こうした技術としては、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程を含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化された固体担体またはその両方と均一にかつ密接に混合し、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
本開示の組成物は、例えば、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化することができる。本開示の組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどをさらに含有することができる。懸濁剤はまた、安定剤を含有し得る。
さらなる製剤
ｉ．エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態でのもう一方の液体中に分散した不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに密に混合し分散した二種の不混和性液相を含む二相系である。概して、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかのものであり得る。水相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の油相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ぶ。あるいは、油相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の水相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ぶ。エマルションは、分散相と、水相、油相、または別個の相としてのそれ自体のいずれかの中に溶液として存在し得る活性薬物とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの医薬賦形剤も、必要に応じてエマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合などで、二相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。こうした複合剤形によれば、多くの場合、単純な二相エマルションでは与えられない一定の利点がもたらされる。ｗ／ｏ／ｗエマルションは、ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小水滴を封入する多相エマルションにより構成される。同様に、ｏ／ｗ／ｏエマルションは、連続油相中で安定化した水の小滴中に封入された油滴の系によりもたらされる。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことが特徴である。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中に良好に分散しており、乳化剤によって、または製剤の粘度によってこの形態で維持される。エマルション形態の軟膏基剤およびクリーム剤の場合と同様に、エマルションの相のいずれかは、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段としては、該エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、以下の四つのカテゴリ、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体、に大きく分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの剤形において広い適用可能性が見出されており、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であるので、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
エマルション製剤において使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。吸収基剤は、親水特性を有するため、それらは水を吸収してｗ／ｏエマルションを形成し、それでもなおそれらの半固体の稠度を維持することができるものであり、例えば無水ラノリンおよび親水ワセリンなどである。微粒子となった固体も、とりわけ界面活性剤との併用で、および粘性調製物として、良好な乳化剤として使用されている。これらとしては、例えば重金属水酸化物などである極性無機固体、非膨潤性粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど、顔料、および非極性固体、例えば炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどが挙げられる。
非常に多様な非乳化材料もまた、エマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムおよび合成ポリマー、例えば多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエステル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中で分散または膨潤して、コロイド状溶液を形成し、それが、分散相液滴の周囲に強力な界面膜を形成することと、外側相の粘度を増加させることとによって、エマルションを安定化する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支援することができる多くの成分、例えば炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどを含有し、これら製剤はしばしば、防腐剤を組み込んでいる。エマルション製剤に含まれる通常使用される防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防止するために、通常、抗酸化剤もエマルション製剤に加えられる。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどであるフリーラジカル捕捉剤、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどである還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどである酸化防止共力薬であり得る。
経皮、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性を理由に、非常に広く使用されてきた（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。ｏ／ｗエマルションとして通常は経口投与されている材料の中には、鉱油系の緩下剤、脂溶性ビタミン、および高脂肪栄養製剤がある。
ｉｉ．マイクロエマルション
本開示の一実施形態では、ＲＮＡｉ剤および核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の、光学的等方性で熱力学的に安定した液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として規定され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、はじめに油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで十分な量の第四の成分、概して中鎖のアルコール、を加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化される、二つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に透明な分散液として説明されてもいる（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、コサーファクタント、および電解質を含めた三～五の成分を組み合わせることによって調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれであるかは、使用する油および界面活性剤の特性ならびに界面活性剤分子の極性の頭と炭化水素の尾との構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用する現象学的アプローチが、広く研究されており、それはマイクロエマルションをどのようにして製剤化するかの包括的な知識を当業者に与えた（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を、自発的に形成された熱力学的に安定な液滴の製剤中で可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、単独での、またはコサーファクタントと組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テ トラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｏｌ ｍｏｎｏｃａｐｒａｔｅ）（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオリエート（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。コサーファクタントは、通常、エタノール、１－プロパノールおよび１－ブタノールなどである単鎖アルコールであり、界面活性剤フィルムに浸透して、その結果界面活性剤分子の間で生じる空間を理由に乱れた膜が生じることによって、界面の流動性を増大させる働きをする。しかしながらマイクロエマルションは、コサーファクタントを用いずに調製することもでき、アルコールを含まない自己乳化性マイクロエマルション系は、当技術分野で公知である。水相は、典型的には、これらに限定されるものではないが、水、薬物の水溶液、グリセリン、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相は、これらに限定されるものではないが、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油が挙げられ得る。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物吸収の向上の見地から、特に興味深い。脂質系マイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏいずれも）は、薬物の経口バイオアベイラビリティを向上するために提案されてきたものであり、ペプチドが挙げられる（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照）。マイクロエマルションは、薬物の可溶化の向上、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤によって誘導される膜流動性および浸透性の変化に起因する薬物吸収の可能な増強、調製の容易さ、固体剤形よりも経口投与が容易であること、臨床効力の向上、および毒性の減少という利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３）。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度において一緒にされたときに自然発生的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物であるペプチドまたはＲＮＡｉ剤を製剤化する場合に、特に有利であり得る。さらにマイクロエマルションは、美容および医薬的な用途の両方で、活性成分の経皮送達にとっても有効であるとされている。本開示のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのＲＮＡｉ剤および核酸の全身吸収の増加を促進し、ならびにＲＮＡｉ剤および核酸の局所的な細胞取り込みの向上することとなることが予想される。
本開示のマイクロエマルションは、製剤の性質を向上させるため、および本開示のＲＮＡｉ剤および核酸の吸収を高めるために、追加の成分および添加剤、例えばモノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透 促進剤なども含有することができる。本開示のマイクロエマルションにおいて使用される浸透促進剤は、五つの広いカテゴリ、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの一つに属するとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらクラスのそれぞれは、上記で説明している。
ｉｉｉ．マイクロ粒子
本開示のＲＮＡｉ剤は、粒子に、例えば、マイクロ粒子などに組み込まれ得る。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって製造することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組合せなどの他の方法によっても製造され得る。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本開示は、動物の皮膚への、核酸、特にＲＮＡｉ剤の効率的な送達を実施するために、様々な浸透促進剤を採用する。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断しようとする膜が、浸透促進剤で処理されていれば、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断することができることが分かっている。浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を横断して拡散するのを補助することに加えて、親油性薬剤の透過性も高める。
浸透促進剤は、五つの広いカテゴリ、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤、のうちの一つに属するものとして分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上述のクラスのそれぞれについては、以下においてより詳細に説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」」は、水溶液中に溶解されたとき、溶液の表面張力 または水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、結果として、粘膜を通過するＲＮＡｉ剤の吸収を高める化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これら浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエー テル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）、および過フルオロ化合物エマルション、例えばＦＣ－４３など Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）、が挙げられる。
浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（Ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセリン）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、１－モノカプリン酸グリセリン、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１～２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－グリセリドおよびジ－グリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウホスフェート、カプホスフェート、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアホスフェート、リノール酸塩など）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照）。
胆汁の生理的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げ られる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれら の合成誘導体が、浸透促進剤としての役割を果たす。したがって用語「胆汁酸塩」は、胆汁の天然に存在する成分のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを包含する。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照）が挙げられる。
キレート化剤は、本開示に関連して使用する場合、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として粘膜を通るＲＮＡｉ剤の吸収を高めるものである化合物として定義され得る。本開示における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴的なＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、結果としてキレート化剤によって阻害されるため、キレート化剤は、ＤＮＡＳｅ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。好適なキレート化剤としては、これらに限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチレートおよびホモバニホスフェート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、ベータ－ジケトンのラウレス－９およびＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照）。
本明細書で使用する場合、非キレート化の非界面活性剤である浸透促進剤は、キレート剤としてまたは界面活性剤として有意でない活性を示すが、それでもなお消化器粘膜を介したＲＮＡｉ剤の吸収を増強する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照）。この浸透促進剤の分類は、例えば不飽和環状尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）、ならびに非ステロイド性抗炎症剤、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなど（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
細胞レベルでのＲＮＡｉ剤の取り込みを増強する薬剤も、本開示の医薬組成物および他の組成物に加えることができる。例えば、カチオン性脂質、例えばリポフェクチンなど（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリジンなど（国際公開第９７／３０７３１号）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを増強することが知られている。
投与された核酸の浸透を高めるために、他の薬剤が利用され得、例えばグリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコールなど、ピロール、例えば２－ピロールなど、アゾン、およびテルペン、例えばリモネンおよびメントンなどが挙げられる。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、一つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤またはその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、また核酸および所定の医薬組成物を他の成分と併用される場合に、所望の体積、稠度などをもたらするように計画された投与の様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体としては、これらに限定されるものではないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、経口投与にとって好適な薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤も、本開示の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容可能な担体としては、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの通常の溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固体油基剤に中の核酸の溶液を含むことができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有することができる。核酸と有害に反応しない、経口投与にとって好適な薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤を、使用することができる。
好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の成分
本開示の組成物は、医薬組成物中に従来見られる他の補助成分を、当技術分野において確立されたそれらの使用レベルでさらに含有することができる。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の、薬学的に活性な材料、例えば止痒剤、収斂剤、局部麻酔薬、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料、例えば色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などを含有することができる。ただし、そのような材料は、添加したときに本開示の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌され、また所望により、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、または芳香物質などである、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤と混合され得る。
水性懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。懸濁剤はまた、安定剤を含有し得る。
一部の実施形態では、本開示において取り上げられる医薬組成物は、（ａ）一つまたは複数のＲＮＡｉ剤、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序で機能し、ＳＯＤ１関連神経変性障害を治療する際に有用である一つまたは複数の薬剤を含む。そのような薬剤の例としては、ＳＳＲＩ、ベンラファキシン、ブプロピオン、および非定型抗精神病薬が挙げられるが、これらに限定されない。
こうした化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的有効である用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のためにある範囲の投薬量を製剤化する際に使用することができる。本開示における本明細書において取り上げる組成物の投与量は、概して、わずかな毒性かまたは毒性が全くないＥＤ５０である循環濃度の範囲内である。投与量は、用いる剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本開示において取り上げる方法で使用する任意の化合物に対して、最初に、細胞培養アッセイから治療有効用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）ように、ある用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。こうした情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
本開示において取り上げるＲＮＡｉ剤は、上記において説明したようなそれらの投与に加えて、ヌクレオチドリピートの発現によって媒介される病理学的プロセスの治療において有効な他の公知の薬物と併用して投与することもできる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書において記載した、有効性の標準尺度を使用して観察された結果に基づいて、ＲＮＡｉ剤投与の量およびタイミングを調節することができる。
ＶＩＩＩ．キット
特定の態様においては、本開示は、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物またはｓｉＲＮＡ化合物であるｓｉＲＮＡ化合物（例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物にプロセシングすることができるより大きなｓｉＲＮＡ化合物、または例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物もしくはｓｉＲＮＡ化合物またはその前駆体であるｓｉＲＮＡ化合物をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を含有する適切な容器を含むキットを提供する。特定の実施形態では、医薬製剤の個々の成分は、一容器で提供され得る。あるいは、医薬製剤の成分を別々に二以上の容器で、例えば、ｓｉＲＮＡ化合物調製物用の一つの容器とキャリア化合物のための少なくとももう一つの容器とで、提供することが望ましいものであり得る。キットは、単一の箱内に一つまたは複数の容器などであるいくつかの様々な構成で包装され得る。この様々な構成要素は、例えば、キットと共に提供される使用説明書に従って、組み合わせることができる。当該構成要素は、例えば、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書において説明した方法に従って組み合わせることができる。キットはまた、送達デバイスも含むことができる。
ＩＸ．ＳＯＤ１発現を阻害する方法
本開示はまた、細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞を、細胞内でＳＯＤ１の発現を阻害するのに有効である量のＲＮＡｉ剤と、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させ、それによって細胞においてＳＯＤ１の発現を阻害することを含む。本開示の特定の実施形態では、ＳＯＤ１は、ＣＮＳ（例えば、脳）細胞において優先的に阻害される。本開示の他の実施形態では、ＳＯＤ１は肝臓（例えば、肝細胞）で優先的に阻害される。本開示の特定の実施形態では、ＳＯＤ１は、ＣＮＳ（例えば、脳）細胞および肝臓（例えば、肝細胞）細胞で阻害される。
ＲＮＡｉ剤と、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤と、細胞を接触させることは、インビトロまたはインビボで行うことができる。細胞をインビボでＲＮＡｉ剤と接触させることは、対象内の、例えば、ヒト対象内の細胞または細胞の群を、ＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。インビトロおよびインビボで細胞を接触させる方法を組み合せることも可能である。
細胞を接触させることは、上記に記載したように直接的であっても間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載する、または当技術分野で公知の任意のリガンドをはじめとする標的化リガンドを介して達成できる。一部の実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドであるか、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位に向ける任意の他のリガンドである。
「阻害すること」という用語は、本明細書において使用する場合、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」および他の同様の用語と同義的に使用され、阻害の任意のレベルを含む。特定の実施形態では、例えば、本開示のＲＮＡｉ剤の阻害のレベルは、細胞培養条件で評価され得、例えば、細胞培養物中の細胞が、１０ｎｍ以下、１ｎｍ以下などの近傍の濃度でのリポフェクタミン（商標）媒介性トランスフェクションによってトランスフェクトされる細胞培養条件である。所与のＲＮＡｉ剤のノックダウンは、細胞培養物中で前処置されたレベル対細胞培養物中で後処置されたレベルを比較することによって決定でき、随意に、スクランブルされたまたは他の形態の対照ＲＮＡｉ剤を用いて並行して処置された細胞に対して比較してもよい。例えば、好ましくは５０％以上の細胞培養物中でのノックダウンは、それによって「阻害すること」または「低減すること」、「下方制御すること」または「抑制すること」などが生じたことを示すものとして特定され得る。標的ｍＲＮＡまたはコードされるタンパク質レベル（および従って、本開示のＲＮＡｉ剤によって引き起こされる「阻害すること」の程度など）はまた、当技術分野で述べられているように適切に制御された条件下で、本開示のＲＮＡｉ剤のためのインビボの系で評価され得るということが明示的に意図される。
本明細書において使用する場合、「ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害すること」または「ＳＯＤ１の発現を阻害すること」という語句は、任意のＳＯＤ１遺伝子（例えば、マウスＳＯＤ１遺伝子、ラットＳＯＤ１遺伝子、サルＳＯＤ１遺伝子またはヒトＳＯＤ１遺伝子など）ならびにＳＯＤ１タンパク質をコードするＳＯＤ１遺伝子のバリアントまたは変異体の発現を阻害することを含む。したがって、ＳＯＤ１遺伝子は、遺伝子操作された細胞、細胞の群または生物の文脈で、野生型ＳＯＤ１遺伝子、変異ＳＯＤ１遺伝子、または遺伝子導入ＳＯＤ１遺伝子であり得る。
「ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害すること」は、任意のレベルでのＳＯＤ１遺伝子の阻害、例えば、ＳＯＤ１遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制、例えば少なくとも２０％の阻害を含む。特定の実施形態では、阻害は、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％なされるか、またはアッセイ方法の検出のレベルを下回るまでなされる。好ましい方法では、阻害は、実施例１に提供されるルシフェラーゼアッセイを使用して、１０ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡで測定される。
ＳＯＤ１遺伝子の発現は、ＳＯＤ１遺伝子発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルもしくはＳＯＤ１タンパク質レベル、または例えば、神経炎症のレベル、例えば、ミクログリアおよび星状細胞の活性化、ならびに神経細胞死に関連する脳領域におけるＳＯＤ１沈着に基づいて評価されてもよい。
阻害は、対照レベルと比較した、これら変数のうち一つまたは複数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価され得る。対照レベルは、当技術分野で利用される任意の種類の対照レベルであり得、例えば、投与前ベースラインレベル、または未処理であるかもしくは対照（例えば、バッファーのみの対照または不活性薬剤対照など）で処理された同様の対象、細胞もしくは試料から決定されるレベルであり得る。
本開示の方法の一部の実施形態では、ＳＯＤ１遺伝子の発現は、少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％だけ阻害されるか、またはアッセイの検出レベルを下回るまで阻害される。特定の実施形態では、方法は、例えば、ＳＯＤ１の発現を低減する薬剤で対象を処理した後で臨床的に関連する転帰によって実証されるような、ＳＯＤ１の発現の臨床的に関連する阻害を含む。
ＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害は、第一の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第二の細胞または細胞の群（ＲＮＡｉ剤で処理されていない、または目的の遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤で処理されていない対照細胞）と比較した、ＳＯＤ１遺伝子が転写され、ＳＯＤ１遺伝子の発現が阻害されるように処理（例えば、細胞を本開示のＲＮＡｉ剤と接触させることによって、または本開示のＲＮＡｉ剤を、細胞が存在しているもしくは存在していた対象に投与することによって）されている第一の細胞または細胞の群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の低減によって現れ得る。阻害の程度は、以下によって表すことができる。
他の実施形態では、ＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害は、ＳＯＤ１遺伝子発現、例えば、ＳＯＤ１タンパク質発現に機能的に関連付けられるパラメータの減少の点で評価され得る。ＳＯＤ１遺伝子サイレンシングは、発現コンストラクトからの内因性または異種性いずれかのＳＯＤ１を発現する任意の細胞において、当技術分野で公知の任意のアッセイによって決定され得る。
ＳＯＤ１タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞の群によって発現されるＳＯＤ１タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料中で発現されたタンパク質のレベル）が減少することによって維持され得る。上記において説明するように、ｍＲＮＡの抑制を評価する場合、処置された細胞または細胞の群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、対照細胞または細胞の群におけるタンパク質のレベルの百分率として同様に表現され得る。
ＳＯＤ１遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できる対照細胞または細胞の群としては、本開示のＲＮＡｉ剤とまだ接触していない細胞または細胞の群が含まれる。例えば、対照細胞または細胞の群は、ＲＮＡｉ剤で対象を処理する前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）から得られ得る。
細胞または細胞の群によって発現されるＳＯＤ１ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を 評価するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。一実施形態では、試料中のＳＯＤ１の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部を、例えば、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば酸性フェノール／イソチアン酸グアニジン抽出物（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社）、ＲＮｅａｓｙ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）社）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ社、スイス国）を使用することを含む、ＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ラン－オンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ＳＯＤ１ ｍＲＮＡは、国際公開第２０１２／１７７９０６号において記載される方法を使用して検出することができる、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＳＯＤ１の発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。「プローブ」という用語は、本明細書において使用する場合、特定のＳＯＤ１核酸またはタンパク質もしくはその断片に選択的に結合可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成できる、または適切な生物学的調製物から誘導できる。プローブは、標識されるように特異的に設計してもよい。プローブとして利用できる分子の例としては、これに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡは、これに限定されるものではないが、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイをはじめとする、ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルを決定する方法の一つとしては、単離されたｍＲＮＡを、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲルにかけてｍＲＮＡをゲルから膜へ、例えばニトロセルロースに移行させることによって、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替的な実施形態では、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）遺伝子チップアレイにおいて、プローブを固体表面に固定化して、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者ならば、公知のｍＲＮＡ検出方法を、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡのレベルを決定する際に使用するために容易に適応させることができる。
試料中のＳＯＤ１の発現レベルを決定する代替的な方法は、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓによる１９８７年の米国特許第４，６８３，２０２号に記載の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉらによる米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅法と、その後に当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出を行うことによる、試料中の例えばｍＲＮＡの核酸増幅または反転転写（ｃＤＮＡを調製するため）のプロセスを伴う。これら検出スキームは、特に、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合に該核酸分子の検出のために有用である。本開示の特定の態様では、ＳＯＤ１の発現のレベルは、定量的蛍光発生的ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイによって、またはＳＯＤ１発現もしくはｍＲＮＡレベルの測定のための他の技術分野によって認識された方法によって決定される。
ＳＯＤ１ ｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどといったハイブリダイゼーション分析において使用されるような）またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズまたは繊維（または結合している核酸を含む任意の固相支持体）を使用して観察され得る。米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号、および第５，４４５，９３４号を参照されたく、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。ＳＯＤ１発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価される。このＰＣＲ方法の使用は、本明細書において示される実施例において記載され、例示されている。このような方法はまた、ＳＯＤ１核酸の検出のために使用できる。
ＳＯＤ１タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で公知 の任意の方法を使用して決定され得る。こうした方法としては、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色分析、分光学的定量法、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一重または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが挙げられる。このようなアッセイはまた、ＳＯＤ１タンパク質の存在または複製を示すタンパク質の検出のために使用できる。
一部の実施形態では、ＳＯＤ１関連疾患の治療における本開示の方法の有効性は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルの低下によって（例えば、ＳＯＤ１レベルについてのＣＳＦ試料の評価によって、脳生検または別の方法によって）評価される。
一部の実施形態では、ＳＯＤ１関連疾患の治療における本開示の方法の有効性は、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルの低下によって（例えば、ＳＯＤ１レベルについての肝臓試料の評価によって、生検または別の方法によって）評価される。
本開示の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が、対象内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＳＯＤ１の発現の阻害は、対象内の特定の部位に、例えば、ＣＮＳ細胞に由来する試料中のＳＯＤ１ ｍＲＮＡまたはＳＯＤ１タンパク質のレベルまたはレベルの変化の測定を使用して評価され得る。特定の実施形態では、方法は、例えば、ＳＯＤ１の発現を低減する薬剤で対象を処理した後で臨床的に関連する転帰によって実証されるような、ＳＯＤ１の発現の臨床的に関連する阻害を含む。
本明細書において使用する場合、分析物のレベルを検出することまたは決定することという用語は、物質が、例えば、タンパク質、ＲＮＡが存在するか否かを決定する工程を実施することを意味すると理解される。本明細書において使用する場合、検出するまたは決定する方法は、使用する方法の検出のレベルを下回る分析物のレベルの検出または決定を含む。
Ｘ．ＳＯＤ１関連神経変性疾患を治療または予防する方法
本開示はまた、細胞においてＳＯＤ１発現を低減または阻害するために本開示のＲＮＡｉ 剤または本開示のＲＮＡｉ剤を含有する組成物を使用する方法を提供する。本方法は、細胞 を本開示のｄｓＲＮＡと接触させることおよび細胞をＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分 解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞においてＳＯＤ１遺伝子の発現を 阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価され得る。例えばＳＯＤ１の発現の低減は、当業者にとってごく普通の方法、例えば、ノーザンブロッティング、ｑＲＴ－ＰＣＲを使用してＳＯＤ１のｍＲＮＡ発現レベルを決定することによって決定され得、当業者にとってごく普通の方法、例えばウエスタンブロッティング、免疫学的技術を使用してＳＯＤ１のタンパク質レベルを決定することによって決定される。
本開示の方法では、細胞をインビトロまたはインビボで接触させることができ、すなわち、細胞は、対象内にあり得る。
本開示の方法を使用する治療に適した細胞は、ＳＯＤ１遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。本開示の方法における使用に適した細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞（ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（ラット細胞またはマウス細胞など）であり得る。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒトＣＮＳ細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト肝臓細胞である。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒトＣＮＳ細胞およびヒト肝臓細胞である。
ＳＯＤ１発現は、細胞において、少なくとも約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または約１００％だけ、すなわち、検出レベル未満に、阻害される。好ましい実施形態では、ＳＯＤ１発現は、少なくとも５０％阻害される。
本開示のインビボ法は、対象に、ＲＮＡｉ剤を含有する組成物を投与することを含むことができ、ＲＮＡｉ剤は、処置されるべき哺乳動物のＳＯＤ１遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。処理しようとする生物が哺乳動物、例えばヒトである場合には、組成物は、これに限定されるものではないが、経口、腹腔内、または頭蓋内（例えば、頭蓋内（脳室内とも呼ばれる）、実質内および髄腔内）、静脈内の、筋肉内の、皮下、経皮、直腸および局所（頬側および舌下を含む）の投与を含む非経口経路を含む、当技術分野で公知の任意の手段によって投与され得る。特定の実施形態では、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は、髄腔内注射によって投与される。特定の実施形態では、組成物は、脳室内注射によって投与される。
一部の実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期的な時間にわたって一貫した態様でＲＮＡｉ剤を放出し得る。したがって、蓄積注射は、所望の効果、例えば、所望のＳＯＤ１阻害または治療的もしくは予防的な効果を得るために必要とされる投薬の回数を減らすことができる。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することもできる。蓄積注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態では、蓄積注射は、皮下注射である。
一部の実施形態では、投与は、ポンプによる。該ポンプは、外部ポンプまたは外科的に植え込んだポンプであり得る。特定の実施形態では、ポンプは、皮下に植え込んだ浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、頭蓋内、静脈内、皮下、動脈性または硬膜外注入のために使用され得る。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉ剤をＣＮＳに送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
投与様式は、局所的な治療または全身的な治療のいずれが望まれるかに応じて、また処理しようとする面積に基づいて選択され得る。投与の経路および部位は、ターゲティングを増強するように選択され得る。
一態様においては、本開示はまた、哺乳動物においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞内においてＳＯＤ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含む組成物を投与することおよび哺乳動物をＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また本明細書において記載される方法、例えば、ｑＲＴ－ＰＣＲによって評価できる。タンパク質産生の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また本明細書において記載される方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって評価され得る。一実施形態では、ＣＮＳ生検試料または脳脊髄液（ＣＳＦ）試料は、ＳＯＤ１遺伝子またはタンパク質発現の（またはしたがってプロキシの）低減を観察するための組織材料として機能する。
本開示は、それを必要とする対象の治療方法をさらに提供する。本開示の治療方法は、対象に、例えば、ＳＯＤ１発現の阻害から恩恵を受けることとなる対象に、本開示のＲＮＡｉ剤を、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤またはＳＯＤ１遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物の治療有効量で投与することを含む。
さらに本開示は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）などのＳＯＤ１関連神経変性疾患または障害の進行を予防、治療、または阻害する方法を提供する。
方法は、対象に、本明細書において提供されるＲＮＡｉ剤の、例えば、ｄｓＲＮＡ剤または本明細書において提供する医薬組成物のいずれかの治療有効量を投与し、それによって対象においてＳＯＤ１関連神経変性疾患または障害の進行を予防、治療または阻害することを含む。
本開示のＲＮＡｉ剤は、「フリーのＲＮＡｉ剤」として投与され得る。フリーのＲＮＡｉ剤は、医薬組成物の不在下で投与される。そのままのＲＮＡｉ剤は、適したバッファー溶液中にある場合がある。該バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはそれらのいずれかの組合せを含み得る。一実施形態では、バッファー溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ剤を含有するバッファー溶液のｐＨおよび浸透圧は、対象へ投与に好適であるように調整できる。
あるいは、本開示のＲＮＡｉ剤は、医薬組成物として、例えばｄｓＲＮＡリポソーム製剤として投与され得る。
ＳＯＤ１遺伝子発現の低減または阻害から恩恵を受けることとなる対象は、ＳＯＤ１関連神経変性疾患を有する者である。
本開示は、例えばＳＯＤ１発現の低減もしくは阻害から恩恵を受けることとなる対象を、例えば、ＳＯＤ１関連神経変性障害を有する対象を治療するために、他の医薬または他の治療方法と、例えば、公知の医薬または公知の治療方法、例えば、これらの障害を治療するために現在使用されているものなどと組み合わせた、ＲＮＡｉ剤またはその医薬組成物の使用のための方法をさらに提供する。例えば、特定の実施形態では、ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡｉ剤は、例えば、本明細書において別の場所に記載されるような、またはそうでければ当技術分野で公知であるような、ＳＯＤ１関連神経変性障害の治療に有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、ＳＯＤ１発現の低減から恩恵を受けることとなる対象を、例えば、ＳＯＤ１関連神経変性障害を有する対象を治療するのに適した追加の薬剤および治療は、ＳＯＤ１の症状を治療するために現在使用されている薬剤を含み得る。ＲＮＡｉ剤および追加の治療薬は、同時にまたは同じ組合せで、例えば、髄腔内投与され得、または追加の治療薬は、別個の組成物の一部として、もしくは別個の時間で、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載する別の方法によって投与され得る。ＲＮＡｉ剤および追加の治療薬は、同時にもしくは同じ組合せで投与され得、または追加の治療薬は、別個の組成物の一部として、もしくは別個の時間で、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載する別の方法によって投与され得る。
例示的な追加の治療薬および治療としては、例えば、鎮静薬、抗うつ薬、クロナゼパム、バルプロ酸ナトリウム、鎮痛剤、抗てんかん薬、コリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン、ベンゾジアゼピン、レボドパ、ＣＯＭＴ阻害剤（例えば、トルカポンおよびエンタカポン）、ドーパミン作動薬（例えば、ブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、ピリベジル、カベルゴリン、アポモルヒネおよびリスリド）、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤（例えば、サフィナミド、セレギリンおよびラサギリン）、アマンタジン、抗コリン薬、モダフィニル、ピマバンセリン、ドキセピン、ラサグリン（ｒａｓａｇｌｉｎｅ）、抗精神病薬、非定型抗精神病薬（例えば、アミスルプリド、オランザピン、リスペリドン、およびクロザピン）、リルゾール、エダラボン、脳深部の刺激、非侵襲的換気（ＮＩＶ）、侵襲的換気理学療法、作業療法、発話療法、食事の変化と嚥下法、栄養チューブ、ＰＥＧチューブ、プロバイオティクス、および心理療法が挙げられる。
一実施形態では、本方法は、標的ＳＯＤ１遺伝子の発現が少なくとも一か月間低下するように本明細書において取り上げる組成物を投与することを含む。好ましい実施形態では、発現は、少なくとも２か月または６か月間低下する。
好ましくは、本明細書において取り上げる方法および組成物に有用なＲＮＡｉ剤は、標的ＳＯＤ１遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的とする。ＲＮＡｉ剤を使用してこれら遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書において記載するように調製および実施できる。
本開示の方法によるｄｓＲＮＡの投与は、ＳＯＤ１関連神経変性障害である患者においてこのような疾患または障害の重症度、徴候、症状またはマーカーの低減をもたらし得る。この文脈での「低減」とは、当該レベルの統計的に有意なまたは臨床的に有意な減少を意味する。低減は、例えば少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％とすることができる。
疾患の治療または予防の有効性は、例えば疾患進行、疾患緩解、症状の重症度、疼痛の低減、生活の質、処置効果を持続するために必要とされる投薬の用量、疾患マーカーまたは治療されているまたは予防のために標的とされる所与の疾患に適切な任意の他の測定可能なパラメータのレベルを測定することによって評価できる。このようなパラメータのうちいずれか一つまたはパラメータのいずれかの組合せを測定することによって、治療または予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＳＯＤ１関連神経変性障害の治療の有効性は、例えば、対象の認知、学習、または記憶の定期的な観察よって評価され得る。後期の読み取り値を、初期の読み取り値と比較することによって、治療が有効であるか否かの指標が医師に提供される。このようなパラメータのうちいずれか一つまたはパラメータのいずれかの組合せを測定することによって、治療または予防の有効性を観察することは、十分に当業者の能力の範囲内である。ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡｉ剤またはその医薬組成物の投与に関連して、ＳＯＤ１関連神経変性障害「に対して有効な」は、臨床的に適切な様式での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者にとって有益な効果が、例えば症状の改善、治癒、疾患の低減、寿命の延長、生活の質の改善またはＳＯＤ１関連神経変性障害および関連原因の治療に精通している医師によって肯定的であると通常認識される他の効果が結果的に生じることを示す。
治療または予防的効果は、疾患状態の一つまたは複数のパラメータにおいて統計的に有意な改善がある場合に、または悪化しなかったこともしくはそうでなければ予測される症状を発症しなかったときに明白である。例として、疾患の測定可能なパラメータが少なくとも１０％好ましく変化すること、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上好ましく変化することが、有効な治療の指標であり得る。所与のＲＮＡｉ剤の薬物またはその薬物の製剤の有効性はまた、当技術分野で公知のような所与の疾患の実験動物モデルを使用して判断できる。実験動物モデルを使用する場合には、治療の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な減少が観察されたときに明白である。
あるいは、有効性は、臨床的に許容された疾患重症度類別スケールに基づいて、診断の当業者によって決定されるような疾患の重症度の低減によって測定できる。例えば、適切なスケールを使用して測定される疾患の重症度の減少をもたらす任意の肯定的な変化は、本明細書において記載するようなＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤製剤を使用する妥当な治療を表している。
対象は、ｄｓＲＮＡの治療量が、例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇが投与され得る。
ＲＮＡｉ剤は、一定期間にわたって定期的に、髄腔内、脳室内、または静脈内注入によって投与できる。特定の実施形態では、最初の治療レジメン後に、より少ない頻度で治療を施与することができる。ＲＮＡｉ剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、ＣＳＦ試料、または他の区画におけるＳＯＤ１レベルを少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％以上低減させ得る。好ましい実施形態では、ＲＮＡｉ剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、ＣＳＦ試料または他の区画においてＳＯＤ１レベルを少なくとも５０％低減させ得る。
ＲＮＡｉ剤の全用量の投与の前に、患者は、より少ない用量で、例えば５％の注入反応で投与され、そして有害作用を、例えばアレルギー反応を観察できる。別の実施例では、患者を、望まれない免疫賦活性効果を、例えばサイトカイン（例えば、ＴＮＦ－アルファまたはＩＮＦ－アルファ）レベルの増大を観察できる。
あるいは、ＲＮＡｉ剤を、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与できる。
ＲＮＡｉ剤の所望の、例えば、毎月の用量を対象に送達するために、一回または複数回の注射を使用できる。一定期間にわたって、注射を反復してもよい。投与を定期的に反復してもよい。特定の実施形態では、最初の治療レジメン後に、より少ない頻度で治療を施与することができる。反復用量レジメンは、定期的な、例えば毎月の、または四半期に一回、年に二回、年に一回にわたる、ＲＮＡｉ剤の治療量の投与を含み得る。特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、月に約一回～四半期に約一回（すなわち、約三ヵ月毎に一回）投与される。
別段の定義がない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または同等の方法および材料を、本発明において取り上げるＲＮＡｉ剤および方法の実施または試験において使用できるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及するすべての公開公報、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が統制することとなる。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであり、限定となることを意図するものではない。
非公式の配列表は、本明細書にファイルされ、出願された明細書の一部を形成する。
実施例１．ＲＮＡｉ剤の設計、合成、選択、およびインビトロでの評価
この実施例は、ＳＯＤ１ ＲＮＡｉ剤の設計、合成、選択およびインビトロでの評価の方法を記載する。
試薬の供給元
本明細書において試薬の供給元が具体的に与えられていない場合には、当該試薬は、分子生物学で応用するための品質／純度基準にある分子生物学用の試薬の任意の供給元から得ることができる。
バイオインフォマティクス
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０００４５４．４、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：６６４７）、マウスＳＯＤ１遺伝子（ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０１１４３４．１、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：２０６５５）、またはＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＳＯＤ１遺伝子（ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿００１２８５４０６．１、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：１０２１１８６８７）を、カスタムＲおよびＰｙｔｏｎスクリプトを用いて設計した。ヒトＮＭ＿０００４５４．４ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、９８１塩基の長さを有し、マウスＮＭ＿０１１４３４．１ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、６６１塩基の長さを有し、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ＳＯＤ１ ＮＭ＿００１２８５４０６．１ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、４６５塩基の長さを有する。
この未修飾ＳＯＤ１のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表２、４、および６に示す。この修飾ＳＯＤ１のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表３、５、および７に示す。
本願全体にわたって、小数のない二重鎖名は、小数付きの二重鎖名と同等であり、単に二重鎖のバッチ番号を指しているということを理解されたい。例えば、ＡＤ－２６６８５９は、ＡＤ－２６６８５９．１と同等である。
ｓｉＲＮＡの合成
簡潔に述べると、ｓｉＲＮＡ配列を、固体支持体上でホスホラミダイトの化学的性質を用いてＭｅｒｍａｄｅ １９２シンセサイザー（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ社）を使用して１μｍｏｌスケールで合成した。固体支持体は、カスタムＧａｌＮＡｃリガンド（３’－ＧａｌＮＡｃコンジュゲート）、ユニバーサル固体支持体（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）、または目的の第一ヌクレオチドを装填した制御された細孔ガラス（５００～１０００Å）とした。補助合成試薬および標準的な２－シアノエチルホスホラミダイトモノマー（２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、ＲＮＡ、ＤＮＡ）を、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、Ｈｏｎｇｅｎｅ社（中華人民共和国）、またはＣｈｅｍｇｅｎｅｓ社（米国マサチューセッツ州ウィルミントン）から取得した。追加のホスホラミダイトモノマーを、市販の供給元から調達するか、組織内で調製するか、または様々なＣＭＯからのカスタム合成を使用して調達した。ホスホラミダイトを、アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦのいずれかの中で１００ｍＭの濃度で調製し、反応時間４００秒で、５－エチルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中０．２５Ｍ）を使用して結合した。無水アセトニトリル／ピリジン（９：１ｖ／ｖ）中の３－（（ジメチルアミノ－メチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン（ＤＤＴＴ、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ社（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）より取得）の１００ｍＭ溶液を使用して、ホスホロチオエート連結を生成した。酸化時間は５分であった。すべての配列を、ＤＭＴ基の最終的な除去（「ＤＭＴ－Ｏｆｆ」）で合成した。
固相合成が完了したら、固体支持したオリゴリボヌクレオチドを、９６ウェルプレート中、室温で、３００μＬのメチルアミン（４０％水溶液）で約２時間にわたって処理し、固体支持体から切断させ、その後追加的な塩基不安定性保護基をすべて除去した。ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基で保護された任意の天然リボヌクレオチド連結（２’－ＯＨ）を含有する配列に関しては、ＴＥＡ．３ＨＦ（トリエチルアミントリヒドロフルオリド）を使用して第二の脱保護工程を実施した。メチルアミン水溶液中の各オリゴヌクレオチド溶液に、２００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および３００μＬのＴＥＡ．３ＨＦを加えて、この溶液を６０℃で約３０分間インキュベートした。インキュベート後、プレートを室温まで自然に戻し、１ｍＬの９：１アセトニトリル：エタノールまたは１：１エタノール：イソプロパノールの添加によって、粗オリゴヌクレオチドを沈殿させた。次いでプレートを４℃で４５分間遠心分離し、上清を、マルチチャネルピペットの補助により慎重にデカントした。オリゴヌクレオチドペレットを、２０ｍＭのＮａＯＡｃ中に再懸濁し、その後、オートサンプラー、ＵＶ検出器、電気伝導度計、およびフラクションコレクターを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣシステム上で、ＨｉＴｒａｐ分子ふるいカラム（５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して脱塩した。脱塩した試料を９６ウェルプレートに回収し、次いでＬＣ－ＭＳおよびＵＶ分光分析法により分析して、それぞれで同一性を確認し、物質の量を定量した。
一本鎖の二重化を、Ｔｅｃａｎ社のリキッドハンドリングロボットで行った。センス鎖とアンチセンス鎖のそれぞれの単鎖を、９６ウェルプレートにおいて１×ＰＢＳ中１０μＭの最終濃度まで等モル比で合わせて、このプレートを密封し、１００℃で１０分間インキュベートし、その後２～３時間かけてゆっくりと室温まで自然に戻した。各二重鎖の濃度および同一性を確認し、その後インビトロスクリーニングアッセイに利用した。
細胞培養およびトランスフェクション
細胞は、３８４ウェルプレートに、ウェル当たり４．９μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μＬのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッドカタログ番号１３７７８－１５０）を、ウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖に加え、各ｓｉＲＮＡ二重鎖を４回複製してトランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。に約５×１０３個細胞を含有する４０μＬのＭＥＤＩＡを添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後ＲＮＡの精製を行った。実験は、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）または初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）において、１０ｎＭおよび０．１ｎＭで実施された。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡの単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号６１０１２）を使用するＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームで自動化プロトコールを使用し、ＲＮＡを単離した。簡潔には、細胞を含んだプレートに、７０μＬの溶解／結合バッファー、および３μＬの磁性ビーズを含有する１０μＬの溶解バッファーを添加した。プレートを、電磁振とう機上で、室温で１０分間インキュベートし、次いで磁性ビーズを捕捉して上清を除去した。次いでビーズに結合したＲＮＡを、１５０μＬの洗浄バッファーＡで２回、洗浄バッファーＢで一回洗浄した。次いでビーズを、１５０μＬの溶出バッファーで洗浄し、再捕捉し、上清を除去する。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ、カタログ番号＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
１反応当たり、１μＬの１０×緩衝液、０．４μＬの２５×ｄＮＴＰ、１μＬの１０×ランダムプライマー、０．５μＬの逆転写酵素、０．５μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤および６．６μＬのＨ２Ｏを含有するマスターミックス１０μＬを、上記で単離したＲＮＡに加えた。プレートを密封し、混合し、電磁振とう機上で、室温で１０分間インキュベートし、その後３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅカタログ番号０４８８７３０１００１）中、１ウェル当たり、０．５μＬのヒトまたはマウスのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社カタログ４３５２９３４Ｅまたは４３５１３０９）および０．５μＬの適切なＳＯＤ１プローブ（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社から市販されている）および５μＬのライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに、２μＬのｃＤＮＡを添加した。リアルタイムＰＣＲは、ライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社）で実施した。各二重鎖は、Ｎ＝４で供試し、データは、非ターゲティング対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。相対変化倍数を算出するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を用いて実施されたアッセイに対して正規化した。
表２および３の二重鎖の初代カニクイザル（ＰＣＨ）における単回投与スクリーニングの結果を、表８に提示する。表２および３の二重鎖の初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）における単回投与スクリーニングの結果を、表９に提示する。表４および５の二重鎖の初代カニクイザル（ＰＣＨ）における単回投与スクリーニングの結果を、表１０に提示する。表６および表７の二重鎖の初代カニクイザル（ＰＣＨ）における単回投与スクリーニングの結果を、表１１に提示する。
表１．核酸配列表現で使用されるヌクレオチドモノマーの略語。これらモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在するとき、５’－３’－ホスホジエステル結合によって相互に連結されることが理解され、またヌクレオチドが２’－フルオロ修飾を含有するとき、フルオロが親ヌクレオチド内のその位置においてヒドロキシを置換する（すなわち、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチドである）ことが理解されるであろう。

実施例２．追加のｄｓＲＮＡ二重鎖の設計、合成、およびインビトロスクリーニング
実施例１に提供された結果に基づいて、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡ中の特定されたホットスポットを標的とする追加のｓｉＲＮＡを、当該技術分野で公知の方法を使用して設計、合成、および調製し、実施例１に上述した。
追加の未修飾ＳＯＤ１センス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細な一覧を、表１２に示す。この修飾されたＳＯＤ１のセンス鎖とアンチセンス鎖のヌクレオチド配列の詳細なリストを、表１３に示す。
追加的な当該剤の単回投与スクリーニングは、トランスフェクションによって実施された。実験は、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）または神経芽腫Ｂｅ（２）Ｃ細胞において、５０ｍＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭで実施された。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳを使用して全ＲＮＡの単離を行った。簡潔には、細胞を、ウェル当たり３μＬのビーズを含有する１０μｌの溶解／結合バッファーで溶解し、静電式振とう機上で１０分間混合した。洗浄工程は、磁気プレート支持体を使用して、Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６上で自動化した。ビーズを、バッファーＡ中で一回、バッファーＢ中で一回、およびバッファーＥ中で二回、それぞれの間に吸引工程を入れて洗浄した（３μＬ中で）。最後の吸引後、以下に説明するように、完全な１２μＬのＲＴ混合物を各ウェルに加えた。
ｃＤＮＡ合成のため、１反応当たり、１．５μｌの１０×バッファー、０．６μｌの１０×ｄＮＴＰ、１．５μｌのランダムプライマー、０．７５μｌの逆転写酵素、０．７５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤および９．９μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを、各ウェルに加えた。プレートを密封し、静電式振とう機で１０分間振とうし、次いで３７℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを８０℃で８分間振とうした。
ＲＴ－ｑＰＣＲを上述のように行い、相対的な倍率変化を上述のように計算した。
ＰＣＨ細胞におけるトランスフェクションアッセイの結果を表１４に示し、ＢＥ（２）Ｃ細胞におけるトランスフェクションアッセイの結果を表１５に示し、積み重ね棒グラフとして図１２Ａ－１２Ｈに示す（ＮＭ＿００４５４．６にマッピング）。
実施例３．マウスにおけるインビボ評価
上記の研究から同定された目的の二重鎖を、さらにインビボで評価した。特に、投与前－１４日目に、ヒトＳＯＤ１をコードするアデノ随伴ウイルス８（ＡＡＶ８）ベクターの２×１０１０のウイルス粒子の後眼窩（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ）投与によって野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に形質導入した。
０日目に、３匹のマウスの群に、目的の薬剤またはＰＢＳ対照の単回の３ｍｇ／ｋｇ用量を皮下投与した。表１６は、治療群を提供し、表１８は、目的の二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の修飾された、および未修飾のヌクレオチド配列を提供する。投与後７日目に、動物を犠牲にし、後眼窩出血を実施した。投与後７日目に肝臓試料を採取し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法によって分析した。
ヒトＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨと比較した。次いで、値をＰＢＳビヒクル対照群の平均に対して正規化した。データは、ベースライン値のパーセントとして表され、平均＋標準偏差として示された。表１７に列挙され、図１に示される結果は、試験された例示的二重鎖剤が、インビボでヒトＳＯＤ１メッセンジャーＲＮＡのレベルを効果的に低減することを実証する。
実施例４．Ｇ９３Ａ－ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおけるＳＯＤ１を標的とするＲＮＡｉ剤のインビボ評価
ｄｓＲＮＡ剤の単回脳室内注射（ＩＣＶ）が、脳および脊髄の治療関連領域でＳＯＤ１の発現を同様に阻害することを実証するために、０日目に、オスのＧ９３Ａ－ＳＯＤ１トランスジェニックマウスに、５μｌのＡＤ－４０１８２４の容量中、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、または３００μｇを単回投与するか、または５μｌの人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照（各群ｎ＝３）を、ハミルトン注射器と角度付３０Ｇの針を使用してＩＣＶ注射した。Ｇ９３Ａ－ＳＯＤ１マウスは、シストロニックヒトＳＯＤ１プロモーターの制御下で、Ｇ９３Ａ変異を有するヒトＳＯＤ１を発現する。この遺伝子の変異は、家族性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳまたはＬｏｕ Ｇｅｈｒｉｇ病）と関連している。ＳＯＤ１－Ｇ９３Ａマウスは、ヒトにおける筋萎縮性側索硬化症と類似した表現型を示す。生後数週間以内に一つまたは複数の肢に麻痺が生じる（例えば、Ｈｅｎｒｉｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１１）：ｅ１５４４５）を参照）。
投与後１４日目に、動物を犠牲にし、脳試料（右半球、左半球、小脳および脳幹）および脊髄試料を採取し、液体窒素中で急速凍結した。組織からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により分析した。
図２に示す結果は、５０～３００ｕｇのｄｓＲＮＡ剤の単回ＩＣＶ注射が、用量依存的な様式でＣＮＳにおけるＳＯＤ１の一貫した確実なノックダウンをもたらすことを示す。結果はまた、１５０～３００ｕｇのｄｓＲＮＡ剤の単回投与が、すべての組織型にわたってＳＯＤ１ ｍＲＮＡを、その最低レベルにノックダウンすることも実証している。
実施例５．Ｇ９３Ａ－ＳＯＤ１トランスジェニックラットにおけるＳＯＤ１を標的とするＲＮＡｉ剤のインビボ評価
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて、さらに分析するために、三つの二重鎖、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１を選択した（例えば、表２１を参照）。図３Ａは、インビトロで観察されたこれら三つの二重鎖の効果を要約し、検証された全用量（５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭ）にわたって、投与後１４日目に、ＢＥ（２）ｃ細胞において、三つすべての二重鎖がヒトＳＯＤ１（ｈＳＯＤ１）ｍＲＮＡ発現を９０％超減少させることを実証する。
これら三つの二重鎖を、Ｇ９３Ａラットにおけるインビボ活性についてさらに評価した。変異型ｈＳＯＤ１Ｇ９３Ａ遺伝子を過剰発現するこのトランスジェニックラットモデルは、ＡＬＳ患者に観察される病理および症状、例えば、生後数週間以内の一つまたは複数の肢の麻痺を再現する（例えば、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃ Ｒｅｓ ８３：１１９－１３３を参照）。
簡潔に述べると、０日目に、オスのＧ９３Ａ－ＳＯＤ１ラットに、５μｌのＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、もしくはＡＤ－１３９５７３１の容量中、０．９ｍｇを単回投与をするか、または５μｌの人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ）対照（各郡ｎ＝３）を、ハミルトン注射器と角度付３０Ｇの針を使用して髄腔内注射した。投与後１４日目に、動物を犠牲にし、腰髄（ｌｉｍｂａｒ）、胸髄および頸髄を含む組織試料を採取し、急速凍結した。組織からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＱＰＣＲ法により分析した。
図３Ｂに図示された結果は、三つの二重鎖すべてが、０．９ｍｇの二重鎖を単回髄腔内投与した後、投与後１４日目のＧ９３Ａラットの脊髄の三つの領域（腰部、胸部、および頸部）すべてにおいて、標的ＳＯＤ１（ｈＳＯＤ１）ｍＲＮＡ発現を９０％超減少させることを実証する。
実施例６．ＳＯＤ１を標的とするＲＮＡｉ剤の前臨床評価
代謝物同定（ＭｅｔＩＤ）を使用して、二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１のそれぞれを投与した後に形成された代謝物の量とその量、ならびに治療した野生型ラットの脳および脊椎における親二重鎖の曝露の割合（曲線下面積（ＡＵＣ））を測定した。
ＬＣ－ＨＲＭＳを介して、投与後４～１３４４時間で採取されたプールされたラット大脳皮質、および投与後４～１３４４時間で採取されたプールされた腰髄について、代謝物の同定を実施した（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（２０１９）１１（２１），１９６７～１９８１の方法を参照）。
これらの研究の結果を図４～５に示す。
図４Ａおよび図４Ｂは、三つの二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１のすべてが、ラットの脊椎（頸椎、胸椎、および腰椎；図４Ａ）および脳（大脳皮質および脳幹；図４Ｂ）において同様の曝露を有することを実証する。
図４Ｃは、三つの二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１のすべてが、ラットの脊椎（頸椎、胸椎、および腰椎；図４Ａ）および脳（大脳皮質および脳幹；図４Ｂ）において同様の保持を有することを実証する。
さらに、これら三つの二重鎖のそれぞれの半減期（ｔ１／２）は長く（２０日超）、潜在的な動物間投与の変動を考慮した場合でもｔ１／２が同等であることが判明した。
図５は、三つの二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１のすべてが、脳と脊椎の両方で類似した代謝物プロファイルを有し、３’末端ヌクレオチド（３’Ｎ－１ ＡＳ）を欠くアンチセンス鎖が主要な活性代謝物であることを示す。
図６は、二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１の組織曝露および代謝物プロファイリングを要約した表である。表２３は、本明細書に記載される特定の二重鎖について、観察または予測される例示的３’Ｎ－１ ＡＳ代謝物のヌクレオチド配列を示す。
実施例７．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＲＮＡｉ剤のインビボ評価
二重鎖ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１の効果も、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）においてインビボで評価された。
図７に示すように、０日目に、非ヒト霊長類を、２ｍＬの容量中、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇ用量、または２ｍＬの容量中、ＡＤ－１３９５７３１の単回１２０ｍｇ用量、または２ｍＬの人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）を髄腔内投与した。動物を、投与後３１日目、８５日目、または１６９日目に犠牲にし、組織試料を採取し、上述のようにＳＯＤ１ ｍＲＮＡレベルを定量した。
動物の投与の違い（図８Ａ）により、各二重鎖の相対的な効力は不明であった。しかし、データは、最適用量以下と見なされる、１５００ｎｇ／ｍｌ未満であった、ＣＳＦ中で２４時間後の薬物曝露レベルを有する試料を除去することによって、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与が、様々なＣＮＳ組織においてＳＯＤ１ ｍＲＮＡの減少をもたらし、様々なＣＮＳ組織におけるＳＯＤ１ ｍＲＮＡの減少が投与後８５日まで持続し、維持されたことを示す（図８Ｂ）。驚くべきことに、図８Ｃに示すように、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇの髄腔内投与は、投与後８５日目に頸髄において７５％、および投与後８５日目までに皮質において６０％、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを減少させた（図８Ｃ）。
さらに、図９Ａ～図９Ｃに示すように、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇの髄腔内投与は、投与後８５日目までＣＳＦ試料中のＳＯＤ１タンパク質を６０％減少させ、試験を延長した三匹の動物では、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇの髄腔内投与は、投与後１４１日までＣＳＦ試料中のＳＯＤ１タンパク質を６０％減少させた。
図１０に示すように、ＮＨＰにおいて、前頭前皮質試料および胸髄試料で観察されたｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの減少は、高度かつ有意に相関している。図１３は、三つの試験された二重鎖の髄腔内投与後３１日目および８５日目に、腎臓および肝臓におけるＳＯＤ１の実質的なノックダウンはなかったことを示す。さらに、二重鎖の間で腎臓および肝臓における最小限の効果に有意差は見られなかった。
図１１Ａは、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後に試験された組織におけるｍＲＮＡ残存量対ｓｉＲＮＡ曝露量を示す一連のグラフを示す。データの分析は、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、またはＡＤ－１３９５７３１の単回７０ｍｇ用量の髄腔内投与後の前頭前野皮質および胸髄の両試料において、ｓｉＲＮＡ曝露量に対するｍＲＮＡとタンパク質の両方の減少の間に強い相関があることを示した（図１１Ｂ）。

Claims (57)

  1. 二本鎖領域を形成する、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤またはその薬学的に許容可能な塩であって、
    ａ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から４塩基以下だけ異なり、
    ｂ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から４塩基以下だけ異なり、
    ｃ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から４塩基以下だけ異なり、
    ｄ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から４塩基以下だけ異なり、
    ｅ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から４塩基以下だけ異なり、
    ｆ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から４塩基以下だけ異なり、
    ｇ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から４塩基以下だけ異なり、
    ｈ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から４塩基以下だけ異なり、
    ｉ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から４塩基以下だけ異なり、または
    ｊ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から４塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から４塩基以下だけ異なり、
    式中、
    ＶＰは、５’－ビニルホスホネートであり、
    （Ａｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－アデノシン－３’－ホスフェートであり、
    （Ｃｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－シチジン－３’－ホスフェートであり、
    （Ｕｈｄ）は、２’－Ｏ－ヘキサデシル－ウリジン－３’－ホスフェートであり、
    （Ａｇｎ）は、アデノシン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、
    （Ｔｇｎ）は、チミジン－グリコール核酸（ＧＮＡ）、Ｓ異性体であり、
    （Ｃ２ｐ）は、シチジン－２’－ホスフェートであり、
    （Ｇ２ｐ）は、グアノシン－２’－ホスフェートであり、
    ｓは、ホスホロチオエート連結であり、
    ａ、ｇ、ｃ、およびｕは、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり、
    ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴは、２’－デオキシＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴであり、
    Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵである、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤またはその薬学的に許容可能な塩。
  2. ａ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から３塩基以下だけ異なり、
    ｂ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から３塩基以下だけ異なり、
    ｃ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から３塩基以下だけ異なり、
    ｄ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から３塩基以下だけ異なり、
    ｅ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）と３塩基以下だけ異なり、
    前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から３塩基以下だけ異なり、
    ｆ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から３塩基以下だけ異なり、
    ｇ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から３塩基以下だけ異なり、
    ｈ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から３塩基以下だけ異なり、
    ｉ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から３塩基以下だけ異なり、または
    ｊ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から３塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から３塩基以下だけ異なる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤、またはその薬学的に許容可能な塩。
  3. ａ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から２塩基以下だけ異なり、
    ｂ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａｕａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から２塩基以下だけ異なり、
    前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から２塩基以下だけ異なり、
    ｃ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から２塩基以下だけ異なり、
    ｄ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から２塩基以下だけ異なり、
    ｅ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から２塩基以下だけ異なり、
    ｆ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から２塩基以下だけ異なり、
    ｇ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から２塩基以下だけ異なり、
    ｈ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から２塩基以下だけ異なり、
    ｉ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から２塩基以下だけ異なり、または
    ｊ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から２塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から２塩基以下だけ異なる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤、またはその薬学的に許容可能な塩。
  4. ａ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）から１塩基以下だけ異なり、
    ｂ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）から１塩基以下だけ異なり、
    ｃ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）から１塩基以下だけ異なり、
    ｄ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）から１塩基以下だけ異なり、
    ｅ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）から１塩基以下だけ異なり、
    ｆ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）から１塩基以下だけ異なり、
    ｇ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）から１塩基以下だけ異なり、
    ｈ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）から１塩基以下だけ異なり、
    ｉ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）から１塩基以下だけ異なり、または
    ｊ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）から１塩基以下だけ異なり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）から１塩基以下だけ異なる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤、またはその薬学的に許容可能な塩。
  5. ａ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）を含み、
    ｂ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）を含み、
    ｃ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）を含み、
    ｄ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）を含み、
    ｅ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）を含み、
    ｆ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）を含み、
    ｇ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）を含み、
    ｈ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）を含み、
    ｉ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）を含み、または
    ｊ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）を含み、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤、またはその薬学的に許容可能な塩。
  6. ａ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｃｕｕ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＣｆＣｆｕｃｕａｕｃｃａｓｇｓａ－３’（配列番号１１）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＣｓｕｇｄＧａｄＴａｇａｇｄＧａＵｆｕａａａｇｕｇｓａｓｇ－３’（配列番号１２）からなり、
    ｂ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓａｓｇｇｕ（Ｃｈｄ）ｃｕＣｆＡｆＣｆｕｕｕａａｕｃｃｓｕｓａ－３’（配列番号１３）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｇｇｄＡｕｄＴａａａｇｄＴｇＡｆｇｇａｃｃｕｇｓｃｓｇ－３’（配列番号１４）からなり、
    ｃ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｕｓｕｓｃｇａｇ（Ｃｈｄ）ａＧｆＡｆＡｆｇｇａａａｇｕａｓａｓａ－３’（配列番号１５）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕａｄＣｕ（Ｔｇｎ）ｕｃｃｕｕｃＵｆｇＣｆｕｃｇａａｓａｓｕ－３’（配列番号１６）からなり、
    ｄ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｇｓａｓａａｇ（Ｕｈｄ）ａａＵｆＧｆＧｆａｃｃａｇｕｇａｓａｓａ－３’（配列番号１７）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｕｃｄＡｃ（Ｔｇｎ）ｇｇｕｃｃａＵｆｕＡｆｃｕｕｕｃｓｃｓｕ－３’（配列番号１８）からなり、
    ｅ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｇｓｇａ（Ｕｈｄ）ｇａａＧｆＡｆＧｆａｇｇｃａｕｇｕｓｕｓａ－３’（配列番号１９）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓａｃｄＡｕ（Ｇ２ｐ）ｃｃｕｃｕｃＵｆｕＣｆａｕｃｃｕｓｕｓｕ－３’（配列番号２０）からなり、
    ｆ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ａｈｄ）ａｇＵｆＡｆＡｆｕｇｇａｃｃａｇｓｕｓａ－３’（配列番号２１）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＡｓｃｕｄＧｇ（Ｔｇｎ）ｃｃａｕｄＴａＣｆｕｕｕｃｃｕｕｓｃｓｕ－３’（配列番号２２）からなり、
    ｇ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓｕｓｃａａ（Ｕｈｄ）ｕｕＣｆＧｆＡｆｇｃａｇａａｇｇｓａｓａ－３’（配列番号２３）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＵｆｓｃｃｄＴｕ（Ｃ２ｐ）ｕｇｃｕｃｇＡｆａＡｆｕｕｇａｕｓｇｓｇ－３’（配列番号２４）からなり、
    ｈ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ｃｓｃｓｕｃａ（Ｃｈｄ）ｕｕＵｆＡｆＡｆｕｃｃｕｃｕａｕｓｃｓａ－３’（配列番号２５）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓｄＧｓａｕｄＡｇ（Ａｇｎ）ｇｇａｕｄＴａＡｆａｇｕｇａｇｇｓａｓｃ－３’（配列番号２６）からなり、
    ｉ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｇｇａ（Ｕｈｄ）ｇａＡｆＧｆＡｆｇａｇｇｃａｕｇｓｕｓａ－３’（配列番号２７）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＡｆｓｃａｄＴｇ（Ｃ２ｐ）ｃｕｃｕｃｕＵｆｃＡｆｕｃｃｕｕｓｕｓｇ－３’（配列番号２８）からなり、または
    ｊ）前記センス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ａｓａｓｕｕｕ（Ｃｈｄ）ｇａＧｆＣｆＡｆｇａａｇｇａａａｓｇｓａ－３’（配列番号２９）からなり、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列５’－ＶＰｕｓＣｆｓｕｕｄＴｃ（Ｃ２ｐ）ｕｕｃｕｇｃＵｆｃＧｆａａａｕｕｓｇｓｇ－３’（配列番号３０）からなる、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤、またはその薬学的に許容可能な塩。
  7. ナトリウム塩である、請求項１～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  8. スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）の発現を阻害する二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド２０１～２２３、２０４～２２６、２０７～２２９、２１６～２３８、２１９～２４１、３２８～３５０、３３３～３５５、３３６～３５８、３７２～３９４、または３７３～３９５のヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、
    （ｉ）前記ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含み、
    （ｉｉ）前記二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さであり、
    （ｉｉｉ）前記センス鎖または前記アンチセンス鎖が、一つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされている、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤。
  9. 前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド２０７～２２９、２１９～２４１、３２８～３５０、または３３６～３５８のいずれか一つのヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. 前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド２０７～２２９、３２８～３５０、または３３６～３５８のいずれか一つのヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. 前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド３３６～３５８から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号２の対応するヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. 前記アンチセンス鎖が、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、ＡＤ－１３９５７３１、ＡＤ－１３９５７４３、ＡＤ－１３９５７７１、ＡＤ－１３９５７３８、ＡＤ－１３９５７１８、ＡＤ－１３９５７６０、ＡＤ－１３９５７６４、またはＡＤ－１３９５７２４からなる群から選択される二重鎖のうちの前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  13. 前記アンチセンス鎖が、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、ＡＤ－１３９５７３１、およびＡＤ－１３９５７４３からなる群から選択される二重鎖のうちの前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 前記アンチセンス鎖が、ＡＤ－１３９５７６２、ＡＤ－１３９５７５６、およびＡＤ－１３９５７３１からなる群から選択される二重鎖のうちの前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか一つから少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. 前記アンチセンス鎖が、二重鎖ＡＤ－１３９５７６２の前記アンチセンス鎖ヌクレオチド配列から少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. 前記センス鎖の前記ヌクレオチドのすべておよび前記アンチセンス鎖の前記ヌクレオチドのすべてが、修飾を含む、請求項８～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、２’－５’－連結リボヌクレオチド（３’－ＲＮＡ）、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル－修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル－修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル－修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、５’－ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’－メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、グリコール核酸（ＧＮＡ）、グリコール核酸Ｓ異性体（Ｓ－ＧＮＡ）、２－ヒドロキシメチル－テトラヒドロフラン－５－ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシチミジン－３’ホスフェートを含むヌクレオチド、２’－デオキシグアノシン－３’－ホスフェートを含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体に連結する末端ヌクレオチド、およびドデカン酸ビスデシルアミド基、およびそれらの組み合わせである群から選択される、請求項８～１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 前記修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ－修飾ヌクレオチド、３’－末端デオキシチミジンヌクレオチド（ｄＴ）、ロックヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ－修飾ヌクレオチド、２’－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミダート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 前記ヌクレオチド上の前記修飾は、独立して、２’－デオキシ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、３’－ＲＮＡ修飾、ＧＮＡ修飾、Ｓ－ＧＮＡ修飾、および２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾からなる群から選択される、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. 少なくとも一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む、請求項８～１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. 前記ｄｓＲＮＡ剤は、６～８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、請求項２０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 少なくとも一つの鎖は、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項８～２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 少なくとも一つの鎖は、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 前記二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項８～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 前記二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 前記二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  27. 各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、請求項８～２６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  28. 前記一つまたは複数の親油性部分が、少なくとも一つの鎖における一つまたは複数の内側位置にコンジュゲートされる、請求項８～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  29. 一つの親油性部分が、各鎖の５’末端から数えて、前記センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびに前記アンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される内側位置にコンジュゲートされる、請求項２８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  30. 前記内側位置が、前記鎖の５’末端から数えて、前記センス鎖上の５、６、７、１５、および１７位からなる群から選択される、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  31. 前記内側位置が、前記鎖の５’末端から数えて、前記アンチセンス鎖上の１５および１７位からなる群から選択される、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  32. 前記内側位置が、前記センス鎖の６および７位からなる群から選択される、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  33. 前記親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式（ｐｏｌｙａｌｉｃｙｃｌｉｃ）の化合物である、請求項２８～３２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  34. 前記親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される随意の官能基とを含有する、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  35. 前記親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  36. 前記親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  37. 前記飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖は、前記センス鎖の５’末端から数えて、前記センス鎖の６または７位にコンジュゲートされる、請求項３３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  38. 前記薬剤が、前記アンチセンス鎖の５’末端においてホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む、請求項８～３７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  39. 前記ホスフェート模倣体が、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  40. 前記ホスフェート模倣体が、５’－Ｅ－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  41. 二重鎖の前記アンチセンス鎖の５’末端の１つの位置における塩基対が、ＡＵ塩基対である、請求項８～４０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  42. 前記センス鎖が、合計２１ヌクレオチドを有し、また前記アンチセンス鎖が、合計２３ヌクレオチドを有する、請求項８～４１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  43. 請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する、細胞。
  44. 請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤と薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
  45. 細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、
    （ａ）前記細胞を、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４４に記載の医薬組成物と接触させることと、
    （ｂ）工程（ａ）において産生された前記細胞を、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それによって前記細胞内においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害することと、を含む、方法。
  46. 前記細胞が、ヒト対象内にある、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記対象が、ＳＯＤ１関連神経変性疾患の少なくとも一つの診断基準を満たすか、またはＳＯＤ１関連神経変性疾患と診断されている、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記ＳＯＤ１関連神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. ＳＯＤ１関連神経変性疾患と診断された対象を治療する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４４に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療することを含む、方法。
  50. 治療することは、前記疾患の少なくとも一つの兆候または症状の改善を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 治療することは、前記疾患の進行の予防を含む、請求項４９に記載の方法。
  52. 前記ＳＯＤ１関連神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  53. ＳＯＤ１関連神経変性疾患の少なくとも一つの診断基準を満たす対象においてＳＯＤ１関連神経変性疾患の発症を予防する方法であって、請求項１～４２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項４４に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって、ＳＯＤ１関連神経変性疾患に対する少なくとも一つの診断基準を満たす前記対象におけるＳＯＤ１関連神経変性疾患の発症を予防することを含む、方法。
  54. 前記対象がヒトである、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記対象が、ＳＯＤ１関連神経変性疾患と診断されている、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ＳＯＤ１関連神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、およびダウン症候群（ＤＳ）からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、前記対象に髄腔内または脳室内投与される、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の方法。
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