JP2023521604A - 微小管関連タンパク質タウ(MAPT)iRNA剤組成物およびその使用方法 - Google Patents
微小管関連タンパク質タウ(MAPT)iRNA剤組成物およびその使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、微小管関連タンパク質タウ(MAPT)遺伝子を標的化する二本鎖リボ核酸干渉(dsRNAi)剤および組成物、ならびにそのようなdsRNAi剤および組成物を使用して、MAPT遺伝子の発現を阻害する方法、およびMAPT関連疾患または障害、例えば、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、進行性核上性麻痺、または他のタウオパチーを有する対象を処置する方法に関する。
Description
関連出願への相互参照
本願は、2020年3月30日に出願された米国特許仮出願第63/002,030号に対する優先権の利益を主張し、2021年3月22日に出願された米国特許仮出願第63/164,467号の利益を主張する。前記出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、2020年3月30日に出願された米国特許仮出願第63/002,030号に対する優先権の利益を主張し、2021年3月22日に出願された米国特許仮出願第63/164,467号の利益を主張する。前記出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列リスト
本願は、ASCIIフォーマットにおいて電子的に提出された配列リストを含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2021年3月24日に作成されたASCIIコピーは、A108868_1030WO_SL.txtと命名され、1,018,753バイトのサイズである。
本願は、ASCIIフォーマットにおいて電子的に提出された配列リストを含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2021年3月24日に作成されたASCIIコピーは、A108868_1030WO_SL.txtと命名され、1,018,753バイトのサイズである。
微小管関連タンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質Microtubule-Associated Protein Tau(Mapt)をコードする微小管関連タンパク質タウ(MAPT)遺伝子は、染色体領域17q21.31(染色体17上の塩基対45,894,382から46,028,334)に位置している。MAPT遺伝子は16個のエクソンからなる。選択的mRNAスプライシングが行われると、合計352~441個のアミノ酸を有する6種のMAPTアイソフォームが生じる。6種のMAPTアイソフォームのうち3種では、MAPTの微小管結合ドメインは3つの反復するセグメントを含有するが、他の3種のMAPTアイソフォームでは、対応するドメインは4つの反復するセグメントを含有する。
MAPT転写物は、全身に差次的に発現し、主として中枢および末梢神経系に発現する。野生型タウは、神経軸索中の微小管の安定化、樹状突起棘(dendric spine)の維持、ならびに軸索輸送、微小管動態、および細胞分裂の制御に関与している。MAPTの病原性変異体は、原発性タウオパチーを有する患者のおよそ10%に見出されている。変異体は主にミスセンス突然変異であり、エクソン9~13(微小管結合ドメイン)に局在しており、エクソン10の選択的スプライシングに多くの影響を与えている。
タウオパチーは、脳内でのタウ凝集物の存在によって病理学的に特徴付けられる、異種混合クラスの進行性神経変性障害である。表現型では、タウオパチーは、運動、認知、および行動障害の多様な進行を示す。タウオパチーとしては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、および進行性核上性麻痺(PSP)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。タウは、アルツハイマー病の特徴である、神経細胞質における神経原線維変化の主要成分である。タウの凝集および沈着は、パーキンソン病を有する患者の脳のおよそ50%にも観察された。
FTDとしては、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、および皮質基底核症候群(CBS)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
現在のところ、タウオパチーに対する治療的な療法は存在せず、処置は、症状を緩和し、患者の生活の質を改善することのみを目的としている。したがって、MAPT関連障害、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または別のタウオパチーを有する対象を効率的に処置することができるような、MAPT遺伝子の発現を選択的かつ効果的に阻害または調整することができる薬剤へのニーズが存在する。
本発明の開示は、MAPT遺伝子のRNA転写物のRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)媒介切断を実行する、RNAi組成物を提供する。MAPT遺伝子は、細胞内、例えば、対象、例えばヒト内の細胞にあってもよい。これらのiRNAの使用は、哺乳動物において、対応する遺伝子(MAPT遺伝子)のmRNAの標的化された分解を可能にする。
本発明のiRNAは、MAPT遺伝子、例えば、遺伝子のエクソン中にミスセンスおよび/または欠失突然変異を有し、ヌクレオチド修飾の組合せを有するMAPT遺伝子を標的化するように設計された。本発明のiRNAは、MAPT遺伝子の発現を対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%阻害し、センスおよびアンチセンス含有凝集体のレベルを低減させる。理論によって限定されることは意図しないが、これらのiRNAにおける前述の特性および特異的な標的部位、または特異的な修飾の組合せまたは部分的組合せは、本発明のiRNAに改善された効能、安定性、効力、耐久性、および安全性を付与すると考えられる。一態様において、本発明は、MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号1または配列番号3のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号2または配列番号4のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
別の態様において、本発明は、MAPTの発現を阻害するためのdsRNA剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、配列番号2または配列番号4のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、表3~8および16~28のいずれか1つに記載のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
一実施形態において、センス鎖は、配列番号3のヌクレオチド512~532、513~533、514~534、515~535、516~536、517~537、518~538、519~539、520~540、1063~1083、1067~1087、1072~1092、1074~1094、1075~1095、1125~1145、1126~1146、1127~1147、1129~1149、1170~1190、1395~1415、1905~1925、1906~1926、1909~1929、1911~1931、1912~1932、1913~1933、1914~1934、1915~1935、1916~1936、1919~1939、1951~1971、1954~1974、1958~1978、2387~2407、2409~2429、2410~2430、2469~2489、2471~2491、2472~2492、2476~2496、2477~2497、2478~2498、2480~2500、2481~2501、2482~2502、2484~2504、2762~2782、2764~2784、2766~2786、2767~2787、2768~2788、2769~2789、2819~2839、2821~2841、2828~2848、2943~2963、2944~2964、2946~2966、2947~2967、3252~3272、3277~3297、3280~3300、3281~3301、3282~3302、3284~3304、3285~3305、3286~3306、3331~3351、3332~3352、3333~3353、3334~3354、3335~3355、3336~3356、3338~3358、3340~3360、3342~3362、3343~3363、3344~3364、3345~3365、3346~3366、3347~3367、3349~3369、3350~3370、3353~3373、3364~3384、3366~3386、3367~3387、3368~3388、3369~3389、3370~3390、3412~3432、3414~3434、3415~3435、3416~3436、3417~3437、3419~3439、3420~3440、3424~3444、3425~3445、3426~3446、3427~3447、3428~3448、3429~3449、3430~3450、3431~3451、3434~3454、4132~4152、4134~4154、4179~4199、4182~4202、4184~4204、4395~4415、4425~4445、4426~4446、4429~4449、4469~4489、4470~4490、4471~4491、4472~4492、4473~4493、4474~4494、4569~4589、4571~4591、4572~4592、4596~4616、4623~4643、4721~4741、4722~4742、4725~4745、4726~4746、4766~4786、4767~4787、4768~4788、4769~4789、4770~4790、4779~4799、4805~4825、4806~4826、4807~4827、4808~4828、4809~4829、4812~4832、4813~4833、4814~4834、4936~4956、5072~5092、5073~5093、5345~5365、5346~5366、5349~5369、5350~5370、5351~5371、5460~5480、5461~5481、5463~5483、5465~5485、5467~5487、5468~5488、5469~5489、5470~5490、5471~5491、5505~5525、5506~5526、5507~5527、5508~5528、5509~5529、5511~5531、5513~5533、5514~5534、5541~5561、5544~5564、5546~5566、5547~5567、5548~5568、5550~5570、5551~5571、5574~5594、5576~5596、5614~5634、521~541、522~542、523~543、524~544、525~545、526~546、527~547、528~548、529~549、530~550、531~551、532~552、533~553、534~554、535~555、536~556、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、1044~1064、1045~1065、1046~1066、1047~1067、1048~1068、1049~1069、1050~1070、1051~1071、1052~1072、1053~1073、1054~1074、1062~1082、1064~1084、1065~1085、1066~1086、1068~1088、1069~1089、1070~1090、1071~1091、1073~1093、1076~1096、1077~1097、1078~1098、1079~1099、1080~1100、1081~1101、1082~1102、1128~1148、1129~1149、1130~1150、1131~1151、1132~1152、1133~1153、1134~1154、1135~1155、1136~1156、1137~1157、1138~1158、1139~1159、1140~1160、1141~1161、1142~1162、1143~1163、1144~1164、1145~1165、1146~1166、1147~1167、1148~1168、975~995、976~996、977~997、978~998、979~999、980~1000、981~1001、982~1002、983~1003、984~1004、985~1005、986~1006、987~1007、988~1008、989~1009、990~1010、991~1011、992~1012、993~1013、994~1014、995~1015、996~1016、997~1017、998~1018、999~1019、1000~1020、1001~1021、1002~1022、1003~1023、1004~1024、1005~1025、1006~1026、1007~1027、1008~1028、1009~1029、1010~1030、1011~1031、1012~1032、1013~1033、1014~1034、1015~1035、1016~1036、1017~1037、1018~1038、1019~1039、1020~1040、1021~1041、1022~1042、1023~1043、1024~1044、1025~1045、1026~1046、1027~1047、1028~1048、1029~1049、1030~1050、1031~1051、1032~1052、1033~1053、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、および1045~1065のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に対して実質的に相補的であり、ヌクレオチドの群から選択される配列番号4の断片に対してその全長にわたり相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、配列番号3のヌクレオチド520~541、520~556、510~534、512~536、516~541、516~540、520~544、524~547、526~551、529~556、532~556、1065~1089、1068~1095、1068~1094、1075~1100、1076~1100、1079~1103、1123~1147、1127~1151、1130~1155、1903~1934、1903~1930、1914~1940、1949~1975、2470~2497、2941~2965、3275~3302、3278~3302、3329~3353、3333~3357、3338~3367、3338~3366、3348~3390、3348~3388、3351~3385、5507~5562、および5549~5597のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、センス鎖は、配列番号1のヌクレオチド977~997、980~1000、973~993、988~1008、987~1007、972~992、979~999、1001~1021、976~996、994~1014、1002~1022、978~998、974~994、520~540、521~541、5464~5484、1813~1833、2378~2398、3242~3262、5442~5462、1665~1685、524~544、5207~5227、4670~4690、3420~3440、3328~3348、5409~5429、5439~5459、4527~4547、5441~5461、5410~5430、および5446~5466のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号2の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、AD-523796.1、AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、AD-535864.1、AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1、AD-526993.1、AD-1397070.1、AD-1397070.2、AD-1397071.1、AD-1397071.2、AD-1397072.1、AD-1397072.2、AD-1397073.1、AD-1397073.2、AD-1397074.1、AD-1397074.2、AD-1397075.1、AD-1397075.2、AD-1397076.1、AD-1397076.2、AD-1397077.1、AD-1397077.2、AD-1397078.1、AD-1397078.2、AD-1397250.1、AD-1397251.1、AD-1397252.1、AD-1397253.1、AD-1397254.1、AD-1397255.1、AD-1397256.1、AD-1397257.1、AD-1397258.1、AD-1397259.1、AD-1397260.1、AD-1397261.1、AD-1397262.1、AD-1397263.1、AD-1397264.1、AD-1397265.1、AD-1423242.1、AD-1423243.1、AD-1423244.1、AD-1423245.1、AD-1423246.1、AD-1423247.1、AD-1423248.1、AD-1423249.1、AD-1423250.1、AD-1423251.1、AD-1423252.1、AD-1423253.1、AD-1423254.1、AD-1423255.1、AD-1423256.1、AD-1423257.1、AD-1423258.1、AD-1423259.1、AD-1423260.1、AD-1423261.1、AD-1423262.1、AD-1423263.1、AD-1423264.1、AD-1423265.1、AD-1423266.1、AD-1423267.1、AD-1423268.1、AD-1423269.1、AD-1423270.1、AD-1423271.1、AD-1423272.1、AD-1423273.1、AD-1423274.1、AD-1423275.1、AD-1423276.1、AD-1423277.1、AD-1423278.1、AD-1423279.1、AD-1423280.1、AD-1423281.1、AD-1423282.1、AD-1423283.1、AD-1423284.1、AD-1423285.1、AD-1423286.1、AD-1423287.1、AD-1423288.1、AD-1423289.1、AD-1423290.1、AD-1423291.1、AD-1423292.1、AD-1423293.1、AD-1423294.1、AD-1423295.1、AD-1423296.1、AD-1423297.1、AD-1423298.1、AD-1423299.1、AD-1423300.1、AD-1397266.1、AD-1397266.2、AD-1397267.1、AD-1423301.1、AD-1397268.1、AD-1397268.2、AD-1397269.1、AD-1423302.1、AD-1397270.1、AD-1397270.2、AD-1397271.1、AD-1397271.2、AD-1397272.1、AD-1423303.1、AD-1397273.1、AD-1423304.1、AD-1397274.1、AD-1423305.1、AD-1397275.1、AD-1423306.1、AD-1397276.1、AD-1397277.1、AD-1397277.2、AD-1397278.1、AD-1397279.1、AD-1397280.1、AD-1397281.1、AD-1397282.1、AD-1397283.1、AD-1397284.1、AD-1397285.1、AD-1397286.1、AD-1397287.1、AD-1397079.1、AD-1397079.2、AD-1397288.1、AD-1397289.1、AD-1397290.1、AD-1397080.1、AD-1397080.2、AD-1397291.1、AD-1397292.1、AD-1397293.1、AD-1397294.1、AD-1397081.1、AD-1397081.2、AD-1397295.1、AD-1397082.1、AD-1397082.2、AD-1397083.1、AD-1397083.2、AD-1397296.1、AD-1397297.1、AD-1397298.1、AD-1397299.1、AD-1397300.1、AD-1397301.1、AD-1397302.1、AD-1397084.1、AD-1397085.1、AD-1397086.1、AD-1397303.1、AD-1397087.1、AD-1397087.2、AD-1397304.1、AD-1397305.1、AD-1397306.1、AD-1397307.1、AD-1397308.1、AD-1397309.1、AD-1397310.1、AD-1397311.1、AD-1397312.1、AD-1397313.1、AD-1397314.1、AD-1397315.1、AD-1397316.1、AD-1397317.1、AD-1397318.1、AD-1397319.1、AD-1397320.1、AD-1397321.1、AD-1397322.1、AD-1397088.1、AD-1397089.1、AD-1397090.1、AD-1397091.1、AD-1397092.1、AD-1397093.1、AD-1397094.1、AD-1397095.1、AD-1397096.1、AD-1397097.1、AD-1397098.1、AD-1397099.1、AD-1397101.1、AD-1397102.1、AD-1397103.1、AD-1397104.1、AD-1397105.1、AD-1397106.1、AD-1397107.1、AD-1397108.1、AD-1397109.1、AD-1397110.1、AD-1397111.1、AD-1397112.1、AD-1397113.1、AD-1397114.1、AD-1397115.1、AD-1397116.1、AD-1397117.1、AD-1397118.1、AD-1397119.1、AD-1397120.1、AD-1397121.1、AD-1397122.1、AD-1397123.1、AD-1397124.1、AD-1397125.1、AD-1397126.1、AD-1397127.1、AD-1397128.1、AD-1397129.1、AD-1397130.1、AD-1397131.1、AD-1397132.1、AD-1397133.1、AD-1397134.1、AD-1397135.1、AD-1397136.1、AD-1397137.1、AD-1397138.1、AD-1397139.1、AD-1397140.1、AD-1397141.1、AD-1397142.1、AD-1397143.1、AD-1397144.1、AD-1397145.1、AD-1397146.1、AD-1397147.1、AD-1397148.1、AD-1397149.1、AD-1397150.1、AD-1397151.1、AD-1397152.1、AD-1397153.1、AD-1397154.1、AD-1397155.1、AD-1397156.1、AD-1397157.1、AD-1397158.1、AD-1397159.1、AD-1397160.1、AD-1397161.1、AD-1397162.1、AD-1397163.1、AD-1397164.1、AD-1397165.1、AD-1397166.1、AD-1397167.1、AD-1397168.1、AD-1397169.1、AD-1397170.1、AD-1397171.1、AD-1397172.1、AD-1397173.1、AD-1397174.1、AD-1397175.1、AD-1397176.1、AD-1397177.1、AD-1397178.1、AD-1397179.1、AD-1397180.1、AD-1397181.1、AD-1397182.1、AD-1397183.1、AD-1397184.1、AD-1397185.1、AD-1397186.1、AD-1397187.1、AD-1397188.1、AD-1397189.1、AD-1397190.1、AD-1397191.1、AD-1397192.1、AD-1397193.1、AD-1397194.1、AD-1397195.1、AD-1397196.1、AD-1397197.1、AD-1397198.1、AD-1397199.1、AD-1397200.1、AD-1397201.1、AD-1397202.1、AD-1397203.1、AD-1397204.1、AD-1397205.1、AD-1397206.1、AD-1397207.1、AD-1397208.1、AD-1397209.1、AD-1397210.1、AD-1397211.1、AD-1397212.1、AD-1397213.1、AD-1397214.1、AD-1397215.1、AD-1397216.1、AD-1397217.1、AD-1397218.1、AD-1397219.1、AD-1397220.1、AD-1397221.1、AD-1397222.1、AD-1397223.1、AD-1397224.1、AD-1397225.1、AD-1397226.1、AD-1397227.1、AD-1397228.1、AD-1397229.1、AD-1397230.1、AD-1397231.1、AD-1397232.1、AD-1397233.1、AD-1397234.1、AD-1397235.1、AD-1397236.1、AD-1397237.1、AD-1397238.1、AD-1397239.1、AD-1397240.1、AD-1397241.1、AD-1397242.1、AD-1397243.1、AD-1397244.1、AD-1397245.1、AD-1397246.1、AD-1397247.1、AD-1397248.1、AD-1397249.1、AD-523565.1、AD-1397072.3、AD-1397073.3、AD-1397076.3、AD-1397077.3、AD-1397078.3、AD-1397252.2、AD-1397257.2、AD-1397258.2、AD-1397259.2、AD-1397263.2、AD-1397264.2、AD-1397309.2、AD-64958.114、AD-393758.4、AD-1397080.3、AD-1397293.2、AD-1397294.2、AD-1397081.3、AD-1397083.3、AD-1397298.2、AD-1397299.2、AD-
1397084.2、AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2、AD-1397088.2、AD-1566238、AD-1566239、AD-1566240、AD-1566241、AD-1566242、AD-1566243、AD-1566244、AD-1566245、AD-1566246、AD-1091965、AD-1566248、AD-1566249、AD-1566250、AD-1091966、AD-1566251、AD-1566252、AD-1566253、AD-1566254、AD-1566255、AD-1566256、AD-1566257、AD-1566258、AD-1566259、AD-692906、AD-1566575、AD-1566576、AD-1566577、AD-1566580、AD-1566581、AD-1566582、AD-1566583、AD-1566584、AD-1566586、AD-1566587、AD-1566588、AD-1566590、AD-1566591、AD-1566634、AD-1566635、AD-1566638、AD-1566639、AD-1566641、AD-1566642、AD-1566643、AD-1566679、AD-1566861、AD-1567153、AD-1567154、AD-1567157、AD-1567159、AD-1567160、AD-1567161、AD-1567164、AD-1567167、AD-1567199、AD-1567202、AD-1567550、AD-1567554、AD-1567784、AD-1567896、AD-1567897、AD-1568105、AD-1568108、AD-1568109、AD-1568139、AD-1568140、AD-1568143、AD-1568144、AD-1568148、AD-1568150、AD-1568151、AD-1568152、AD-1568153、AD-1568154、AD-1568158、AD-1568161、AD-1568172、AD-1568174、AD-1568175、AD-692908、AD-1568176、AD-1569830、AD-1569832、AD-1569834、AD-1569835、AD-1569862、AD-1569872、AD-1569890およびAD-1569892からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
1397084.2、AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2、AD-1397088.2、AD-1566238、AD-1566239、AD-1566240、AD-1566241、AD-1566242、AD-1566243、AD-1566244、AD-1566245、AD-1566246、AD-1091965、AD-1566248、AD-1566249、AD-1566250、AD-1091966、AD-1566251、AD-1566252、AD-1566253、AD-1566254、AD-1566255、AD-1566256、AD-1566257、AD-1566258、AD-1566259、AD-692906、AD-1566575、AD-1566576、AD-1566577、AD-1566580、AD-1566581、AD-1566582、AD-1566583、AD-1566584、AD-1566586、AD-1566587、AD-1566588、AD-1566590、AD-1566591、AD-1566634、AD-1566635、AD-1566638、AD-1566639、AD-1566641、AD-1566642、AD-1566643、AD-1566679、AD-1566861、AD-1567153、AD-1567154、AD-1567157、AD-1567159、AD-1567160、AD-1567161、AD-1567164、AD-1567167、AD-1567199、AD-1567202、AD-1567550、AD-1567554、AD-1567784、AD-1567896、AD-1567897、AD-1568105、AD-1568108、AD-1568109、AD-1568139、AD-1568140、AD-1568143、AD-1568144、AD-1568148、AD-1568150、AD-1568151、AD-1568152、AD-1568153、AD-1568154、AD-1568158、AD-1568161、AD-1568172、AD-1568174、AD-1568175、AD-692908、AD-1568176、AD-1569830、AD-1569832、AD-1569834、AD-1569835、AD-1569862、AD-1569872、AD-1569890およびAD-1569892からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、AD-523796.1、AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、AD-535864.1、AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1およびAD-526993.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、およびAD-523796.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、表3~8、および16~28のいずれか1つに記載のセンスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つを含む。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号1533において説明されるMAPT遺伝子エクソン10のセンス鎖配列に対応する少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖はそれに対して相補的な配列を含む。
一態様において、本発明は、MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号5のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号6のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
別の態様において、本発明は、MAPTの発現を阻害するためのdsRNA剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、配列番号6のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、MAPTの発現を阻害するためのdsRNA剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、表12~13のいずれか1つに記載のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
一実施形態において、センス鎖は、配列番号5のヌクレオチド1065~1085、1195~1215、1066~1086、1068~1088、705~725、1067~1087、4520~4540、3341~3361、4515~4535、5284~5304、5285~5305、344~364、5283~5303、5354~5374、2459~2479、1061~1081、706~726、972~992、4564~4584、995~1015、4546~4566、968~988、1127~1147、4534~4554、158~178、4494~4514、1691~1711、3544~3564、198~218、979~999、4548~4568、4551~4571、543~563、715~735、542~562、352~372、362~382、4556~4576、4547~4567、4542~4562、4558~4578、4549~4569、5074~5094、4552~4572、5073~5093、5076~5096、4550~4570、および2753~2773のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号6の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-393758.1、AD-393888.1、AD-393759.1、AD-393761.1、AD-393495.1、AD-393760.1、AD-396425.1、AD-395441.1、AD-396420.1、AD-397103.1、AD-397104.1、AD-393239.1、AD-397102.1、AD-397167.1、AD-394791.1、AD-393754.1、AD-393496.1、AD-393667.1、AD-396467.1、AD-393690.1、AD-396449.1、AD-393663.1、AD-393820.1、AD-396437.1、AD-393084.1、AD-396401.1、AD-394296.1、AD-395574.1、AD-393124.1、AD-393674.1、AD-396451.1、AD-396454.1、AD-393376.1、AD-393505.1、AD-393375.1、AD-393247.1、AD-393257.1、AD-396459.1、AD-396450.1、AD-396445.1、AD-396461.1、AD-396452.1、AD-396913.1、AD-396455.1、AD-396912.1、AD-396915.1、AD-396453.1およびAD-394991.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本明細書に記載されるセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方は、1つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートしている。
一実施形態において、親油性部分は、dsRNA剤の二本鎖領域における1つまたは複数の内部位置にコンジュゲートしている。
一実施形態において、親油性部分は、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートしている。
一実施形態において、logKowによって測定された親油性部分の親油性は、0を超える。
一実施形態において、二本鎖RNA剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける未結合分画によって測定された二本鎖RNA剤の疎水性は、0.2を超える。
一実施形態において、血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである。
一部の実施形態において、dsRNA剤は、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む。
一実施形態において、本発明に記載されるdsRNA剤におけるセンス鎖ヌクレオチドの5個以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの5個以下は、修飾されていないヌクレオチドである。
一実施形態において、dsRNA剤におけるセンス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全ては、修飾されたヌクレオチドである。
一部の実施形態において、dsRNA剤の修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つは、デオキシヌクレオチド、3’末端デオキシチミジン(dT)ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾されたヌクレオチド、2’-フルオロ修飾されたヌクレオチド、2’-デオキシ修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ変性ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾されたヌクレオチド、2’-C-アルキル修飾されたヌクレオチド、2’-ヒドロキシル(hydroxly)修飾されたヌクレオチド、2’-メトキシエチル修飾されたヌクレオチド、2’-O-アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾されたヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトール修飾されたヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾されたヌクレオチド、5’-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’-メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’リン酸または5’リン酸ミミックを含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシン-グリコール核酸(GNA)を含むヌクレオチド、チミジン-グリコール核酸(GNA)S-異性体を含むヌクレオチド、2-ヒドロキシメチル-テトラヒドロフラン-5-ホスフェートを含むヌクレオチド、2’-デオキシチミジン-3’ホスフェートを含むヌクレオチド、2’-デオキシグアノシン-3’-ホスフェートを含むヌクレオチド、ならびにコレステリル誘導体およびドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド;ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態において、dsRNA剤の修飾されたヌクレオチドは、2’-デオキシ-2’-フルオロ修飾されたヌクレオチド、2’-デオキシ修飾されたヌクレオチド、3’末端デオキシチミジンヌクレオチド(dT)、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ変性ヌクレオチド、2’-アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
一実施形態において、dsRNA剤の修飾されたヌクレオチドは、3’末端デオキシチミジンヌクレオチド(dT)の短い配列を含む。
一実施形態において、dsRNA剤のヌクレオチドへの修飾は、2’-O-メチル、GNAおよび2’フルオロ修飾である。
一部の実施形態において、dsRNA剤は、少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに含む。
一実施形態において、dsRNA剤は、6~8個のホスホロチオエートインターヌクレオチド連結を含む。
一実施形態において、dsRNAの各鎖は、30ヌクレオチド以下の長さである。
一実施形態において、dsRNA剤の少なくとも1つの鎖は、少なくとも1ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。別の実施形態において、dsRNA剤の少なくとも1つの鎖は、少なくとも2ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。
一部の実施形態において、dsRNA剤の二本鎖領域は、15~30ヌクレオチド対の長さ;17~23ヌクレオチド対の長さ;17~25ヌクレオチド対の長さ;23~27ヌクレオチド対の長さ;19~21ヌクレオチド対の長さ;または21~23ヌクレオチド対の長さであってもよい。
一部の実施形態において、dsRNAの各鎖は、19~30ヌクレオチド;19~23ヌクレオチド;または21~23ヌクレオチドを有してもよい。
一実施形態において、1つまたは複数の親油性部分は、少なくとも1つの鎖上の1つまたは複数の内部位置に、例えばリンカーまたは担体を介してコンジュゲートしている。
一実施形態において、内部位置は、少なくとも1つの鎖の各末端からの末端の2つの位置を除く全ての位置を含む。
別の実施形態において、内部位置は、少なくとも1つの鎖の各末端からの末端の3つの位置を除く全ての位置を含む。
一実施形態において、内部位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。
一実施形態において、内部位置は、センス鎖の5’端から数えて位置9~12を除く全ての位置を含む。
別の実施形態において、内部位置は、センス鎖の3’端から数えて位置11~13を除く全ての位置を含む。
一実施形態において、内部位置は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く。
一実施形態において、内部位置は、アンチセンス鎖の5’端から数えて位置12~14を除く全ての位置を含む。
一実施形態において、内部位置は、センス鎖の3’端から数えて位置11~13とアンチセンス鎖の5’端から数えて位置12~14とを除く全ての位置を含む。
一実施形態において、1つまたは複数の親油性部分は、各鎖の5’端から数えて、センス鎖における位置4~8および13~18ならびにアンチセンス鎖における位置6~10および15~18からなる群から選択される内部位置の1つまたは複数にコンジュゲートされる。
別の実施形態において、1つまたは複数の親油性部分は、各鎖の5’端から数えて、センス鎖における位置5、6、7、15、および17ならびにアンチセンス鎖における位置15および17からなる群から選択される内部位置の1つまたは複数にコンジュゲートされる。
一実施形態において、二本鎖領域における内部位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。
一実施形態において、センス鎖は、21ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、23ヌクレオチド長であり、親油性部分は、センス鎖の位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6、もしくは位置2またはアンチセンス鎖の位置16にコンジュゲートされる。
一実施形態において、親油性部分は、センス鎖の位置21、位置20、位置15、位置1、または位置7にコンジュゲートされる。
別の実施形態において、親油性部分は、センス鎖の21位、20位、または15位にコンジュゲートしている。
さらに別の実施形態において、親油性部分は、センス鎖の20位または15位にコンジュゲートしている。
一実施形態において、親油性部分は、アンチセンス鎖の位置16にコンジュゲートされる。
一実施形態において、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。
一実施形態において、親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される。
一実施形態において、親油性部分は、飽和または不飽和C4~C30炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される適宜の官能基とを含有する。
一実施形態において、親油性部分は、飽和または不飽和C6~C18炭化水素鎖を含有する。
一実施形態において、親油性部分は、飽和または不飽和C16炭化水素鎖を含有する。
一実施形態において、飽和または不飽和C16炭化水素鎖は、鎖の5’端から数えて位置6にコンジュゲートされる。
一実施形態において、親油性部分は、内部位置または二本鎖領域における1つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる。
一実施形態において、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環状基であるか;またはセリノール骨格もしくはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である。
一実施形態において、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド-チオエーテル、ジスルフィド、リン酸ジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して、二本鎖iRNA剤にコンジュゲートしている。
一実施形態において、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる。
一実施形態において、親油性部分または標的化リガンドは、DNA、RNA、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される生物リンカーを介してコンジュゲートされる。
一実施形態において、センス鎖の3’端は、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される。
一実施形態において、dsRNA剤は、神経細胞を標的化する標的化リガンドをさらに含む。
一実施形態において、dsRNA剤は、肝臓細胞を標的化する標的化リガンドをさらに含む。
一実施形態において、標的化リガンドは、GalNAcコンジュゲートである。
一実施形態において、dsRNA剤は、Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびRp立体配置またはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
別の実施形態において、dsRNA剤は、Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびRpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
さらに別の実施形態において、dsRNA剤は、Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1、第2、および第3のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびRpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
別の実施形態において、dsRNA剤は、Sp配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’末端における第1および第2のインターヌクレオチド連結で起こる末端キラル修飾、Rp配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’末端における第3のインターヌクレオチド連結で起こる末端キラル修飾、Rp配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’末端における第1のインターヌクレオチド連結で起こる末端キラル修飾、およびRpまたはSp配置のいずれかで連結リン原子を有する、センス鎖の5’末端における第1のインターヌクレオチド連結で起こる末端キラル修飾をさらに含む。
別の実施形態において、dsRNA剤は、Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、およびRpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾をさらに含む。
一実施形態において、dsRNA剤は、アンチセンス鎖の5’端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣物をさらに含む。
一実施形態において、リン酸ミミックは、5’-ビニルホスホネート(VP)である。
一実施形態において、二重鎖のアンチセンス鎖の5’端の1つの位置の塩基対は、AU塩基対である。
一実施形態において、センス鎖は、合計21のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計23のヌクレオチドを有する。
本発明はまた、本発明のdsRNA剤と脂質製剤とを含む細胞および医薬組成物も提供する。
本発明はまた、本発明のdsRNA剤を含む、MAPTをコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物も提供する。
本発明はまた、本発明のdsRNA剤を含む、エクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害するための医薬組成物も提供する。
一実施形態において、dsRNA剤は、緩衝化されていない溶液、例えば生理食塩水または水中である。
別の実施形態において、dsRNA剤は、緩衝溶液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらのあらゆる組合せを含む緩衝溶液;またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中である。
一態様において、本発明は、細胞におけるMAPT遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を、本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物と接触させること、それによって細胞におけるMAPT遺伝子の発現を阻害することを含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害することを含む方法であって、細胞を、本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物と接触させること、それによって細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に分解することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、細胞は、対象内にある。
一実施形態において、対象はヒトである。
一実施形態において、対象は、MAPT関連障害を有する。
一実施形態において、対象は、神経変性障害であるMAPT関連障害を有する。
一実施形態において、対象の神経変性障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連する。
一実施形態において、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす。
一実施形態において、神経変性障害は家族性障害である。
一実施形態において、神経変性障害は孤発性障害である。
一実施形態において、MAPT関連障害は、タウオパチー、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)からなる群から選択される。
一部の実施形態において、細胞をdsRNA剤と接触させることは、MAPTの発現を対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%阻害する。一実施形態において、dsRNA剤は、MAPTの発現を少なくとも約25%阻害する。
一部の実施形態において、MAPTの発現を阻害することは、対象の血清中のタウタンパク質レベルを対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%減少させる。一実施形態において、dsRNA剤は、対象の血清中のタウタンパク質レベルを少なくとも約25%減少させる。
一態様において、本発明は、MAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物を対象に投与すること、それによってMAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象を処置することを含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、MAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象における少なくとも1つの症状を防止する方法であって、予防有効量の本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物を対象に投与すること、それによってMAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象における少なくとも1つの症状を防止することを含む、方法を提供する。
一実施形態において、障害は、MAPT関連障害である。
一実施形態において、障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連する。
一実施形態において、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす。
一実施形態において、MAPT関連障害は、タウオパチー、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)からなる群から選択される。
一実施形態において、対象は、ヒトである。
一実施形態において、本発明のdsRNA剤、または本発明の医薬組成物の投与が、対象の脳内でのタウの凝集の減少をもたらす。
一実施形態において、対象への薬剤の投与が、タウの凝集の減少をもたらす。
一実施形態において、dsRNA剤は、約0.01mg/kgから約50mg/kgの用量において対象に投与される。
別の実施形態において、dsRNA剤は、髄腔内において対象に投与される。
さらに別の実施形態において、dsRNA剤は、対象に大槽内投与される。限定されない例示的な大槽内投与は、後頭下穿刺法による大槽(小脳延髄槽)内への注入を含む。
一実施形態において、本発明の方法は、対象からの試料中のMAPTのレベルを決定することをさらに含む。
一実施形態において、対象試料におけるMAPTのレベルは、血液、血清、または髄液試料中のタウタンパク質レベルである。
一実施形態において、本発明の方法は、追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。
一態様において、本発明は、本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物を含むバイアルを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のdsRNA剤または本発明の医薬組成物を含むシリンジを提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のdsRNA剤、または本発明の医薬組成物を含む、髄腔内ポンプを提供する。
本発明の開示は、MAPT遺伝子のRNA転写物のRNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)媒介切断を実行する、RNAi組成物を提供する。MAPT遺伝子は、細胞内、例えば、ヒトなどの対象内の細胞内にあり得る。これらのiRNAの使用は、哺乳動物における対応する遺伝子(MAPT遺伝子)のmRNAの標的化された分解を可能にする。
本発明のiRNAは、MAPT遺伝子、例えば、ヌクレオチド修飾を有するまたは有しないMAPT遺伝子を標的化するように設計された。本発明のiRNAは、MAPT遺伝子の発現を少なくとも約25%阻害し、センスおよびアンチセンス含有凝集体のレベルを低減させる。理論によって制限されることを意図するわけではないが、先述の特性と、特定の標的部位、またはこれらのiRNAsの特定の修飾との組合せまたは部分的組合せは、本発明のiRNAに、改良された効率、安定性、効力、耐久性、および安全性を付与すると考えられる。
したがって、本開示はまた、MAPT遺伝子の発現を阻害するための、またはMAPT遺伝子の発現の阻害もしくは低減が有益であろう障害、例えば、MAPT関連疾患、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、もしくは別のタウオパチーを有する対象を処置するための、本開示のRNAi組成物の使用方法も提供する。
本開示のRNAi剤は、約30ヌクレオチドまたはそれ未満の長さ、例えば、15~30、15~29、15~28、15~27、15~26、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、18~30、18~29、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~30、21~29、21~28、21~27、21~26、21~25、21~24、21~23、または21~22ヌクレオチドの長さの領域を有するRNA鎖(アンチセンス鎖)を含み、この領域は、MAPT遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部、例えば、MAPTエクソンに対して実質的に相補的である。ある特定の実施形態において、本開示のRNAi剤は、約21~23ヌクレオチド長である領域を有し、領域が、MAPT遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である、RNA鎖(アンチセンス鎖)を含む。
ある特定の実施形態において、本開示のRNAi剤は、MAPT遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部に対して実質的に相補的である、少なくとも19の連続するヌクレオチドの領域を有する、より長い長さ、例えば、最大でも66ヌクレオチドまで、例えば、36~66、26~36、25~36、31~60、22~43、27~53ヌクレオチド長を含むことができる、RNA鎖(アンチセンス鎖)を含む。より長い長さのアンチセンス鎖を有するこれらのRNAi剤は、好ましくは、20~60ヌクレオチド長の第2のRNA鎖(センス鎖)を含み、この場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、18~30の連続するヌクレオチドの二重鎖を形成する。
これらのRNAi剤の使用は、哺乳動物におけるMAPT遺伝子のmRNAの標的化された分解および/または阻害を可能にする。したがって、これらのRNAi剤を含む方法および組成物は、タウのレベルまたは活性の低減が有益であろう対象、例えば、MAPT関連疾患、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または別のタウオパチーを有する対象を処置するのに有用である。
以下の詳細な説明は、MAPT遺伝子の発現を阻害するためにRNAi剤を含有する組成物を作製および使用する方法、ならびに遺伝子の発現の阻害または減少が有益であろう、疾患または障害を有する対象を処置するための組成物または方法を開示する。
I.定義
本開示がさらに容易に理解され得るために、ある特定の用語が、最初に定義される。加えて、パラメータの値または値の範囲が列記される場合にはいつでも、列記された値の中間の値および範囲も、本開示の一部であることが意図されることが意図される。
本開示がさらに容易に理解され得るために、ある特定の用語が、最初に定義される。加えて、パラメータの値または値の範囲が列記される場合にはいつでも、列記された値の中間の値および範囲も、本開示の一部であることが意図されることが意図される。
冠詞「a」および「an」は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の1つまたは2つ以上(すなわち、少なくとも一つ)を意味するために使用される。例えば、「要素(an element)」は、1つの要素または2つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
用語「を含む(including)」は、語句「を含むが、これらに限定されるわけではない(including but not limited to)」を意味するために本明細書において使用され、当該語句と相互互換的に使用される。用語「または」は、文脈において明確に示されない限り、用語「および/または」を意味するために本明細書において使用され、当該語句と相互互換的に使用される。
用語「約」は、当技術分野において、典型的な交差の範囲内であることを意味するために、本明細書において使用される。例えば、「約」は、平均から約2標準偏差として理解することができる。ある特定の実施形態において、約は、±10%を意味する。ある特定の実施形態において、約は、±5%を意味する。約が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「約」は、一連における数または範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
数または一連の数の前の用語「少なくとも」は、文脈から明白な場合、用語「少なくとも」に隣接する数、および論理的に含まれ得るその後の全ての数または整数を含むと理解される。例えば、核酸分子におけるヌクレオチドの数は、整数でなければならない。例えば、「21ヌクレオチド核酸分子の少なくとも18ヌクレオチド」は、18、19、20、または21ヌクレオチドが、示された特性を有することを意味する。少なくとも、なる用語が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「少なくとも」は、一連における数および範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
本明細書において使用される場合、「以下」または「未満」は、当該語句に隣接する値およびその値より論理的により小さい値または整数から、文脈から論理的である場合、ゼロまでとして理解される。例えば、「2ヌクレオチド以下」のオーバーハングを有する二重鎖は、2、1、または0ヌクレオチドのオーバーハングを有する。「以下」が、一連の数または範囲の前に存在する場合、「以下」は、一連における数または範囲のそれぞれを修飾することができることは理解されよう。
本明細書において使用される場合、用語「少なくとも約」は、測定可能な値、例えば、パラメータ、量などを指す場合、指定された値から+/-20%、好ましくは+/-10%、より好ましくは+/-5%、さらにより好ましくは+/-1%の偏差を包含することを意味するが、そのような偏差が、開示される発明において機能するのに適切である場合に限られる。例えば、MAPT遺伝子の発現の「少なくとも約25%」の阻害とは、MAPT遺伝子の発現の阻害が、指定された25%の+/-20%の任意の値、すなわち、20%、30%、または20~30%の間の任意の中間の値と測定できることを意味する。
本明細書において使用される場合、「対照レベル」は、本明細書に記載されるRNAi剤が発現される細胞、組織、または系と同一な、調節されていない細胞、組織、または系における遺伝子の発現のレベル、またはRNA分子の発現レベル、または1つもしくは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの発現レベルを指す。RNAi剤が発現される細胞、組織、または系は、RNAi剤の非存在下で観察されるものと比べて少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、またはそれ以上の本明細書に記載される遺伝子、RNA、および/またはタンパク質の発現を有する。対照レベルに対する%および/または倍の差は、例えば、
[RNAi剤有りの発現-RNAi剤無しの発現]
差(%)=------------------------×100
RNAi剤無しの発現
であり得る。
[RNAi剤有りの発現-RNAi剤無しの発現]
差(%)=------------------------×100
RNAi剤無しの発現
であり得る。
本明細書において使用される場合、検出の方法は、存在する分析物の量が方法の検出レベル未満であることの判定を含むことができる。
示された標的部位と、センス鎖またはアンチセンス鎖に対するヌクレオチド配列とが一致しない場合、示された配列が優先する。
化学構造と化学名称が一致しない場合、化学構造が優先する。
用語「MAPT」遺伝子は、「DDPAC」、「FTDP-17」、「MAPTL」、「MSTD」、「MTBT1」、「MTBT2」、「PPND」、「PPP1R103」、「TAU」、および「微小管関連タンパク質タウ」としても知られており、微小管関連タンパク質タウ(MAPT)と呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子を指す。
MAPT mRNAは、全身に発現し、主として中枢神経系(すなわち、脳および脊髄)および末梢神経系に発現する。野生型タウは、神経軸索中の微小管の安定化、軸索輸送および微小管動態の制御、樹状突起棘の維持、ならびにゲノムDNAの完全性への寄与に関与している。
タウオパチーは、脳内でのタウ凝集物の存在によって病理学的に特徴付けられる、異種混合クラスの進行性神経変性障害である。細胞内および細胞外の神経細胞タウ凝集物は、微小管の解離および軸索変性、シナプス小胞放出の障害、および「シーディング」と呼ばれるタウ凝集物のプリオン様神経細胞間伝播を引き起こす。
表現型では、タウオパチーは、運動、認知、および行動障害の多様な進行を示す。タウオパチーとしては、アルツハイマー病[主に選択的記憶障害から始まり、脳の前頭葉、側頭葉(海馬が含まれる)、および頭頂葉の変性に関連する、最も多い形態の初老期認知症];前頭側頭型認知症(FTD)(前頭葉および側頭葉の神経細胞の萎縮に関連し、幅広い行動、言語、および運動障害を呈する、2番目に多い形態の初老期認知症);および進行性核上性麻痺(PSP)[(注視障害、錐体外路症状(四肢の失行、無動/動作緩慢、硬直、および筋緊張異常を含めたパーキンソニズム症状)、および認知機能障害を呈する、脳幹および基底核の変性であり、米国ではおよそ20,000人が罹患している)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
FTDとしてさらに、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)(病理学的には前頭前野および前側頭葉における進行性の萎縮に関連し、臨床的には複合思考、人格、および行動の変化に関連し、米国ではおよそ30,000人が罹患している);意味型原発性進行性失語(PPA-S)(言葉の理解における困難、呼称の苦労に関連する、前頭葉および側頭葉の変性);非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)[左後前頭葉および島葉の変性に関与し、失文法および複雑な文章の理解不能を呈し、米国ではおよそ1,000人が罹患している];ロゴペニック型原発性進行性失語[PPA-L)(言葉の復唱の困難および頻繁な中断に関連する、左後/上部(spur)側頭葉および頭頂葉内側(medial)の変性);17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)(病理学的には前頭葉および側頭葉の変性に関連し、臨床的には発語障害および運動障害に関連する);ピック病(PiD)(言語および思考の困難、ならびに行動の変化に関連する、前頭葉および側頭葉の変性、);運動ニューロン疾患を伴うFTD(皮質および運動ニューロンの変性に関与する);および皮質基底核症候群(CBS)[錐体外路症状(パーキンソン病およびPSPにおけるものと同様)および認知機能障害を呈する、後前頭葉および側頭葉ならびに基底核の変性(すなわち、皮質基底核変性症(CBD))、米国ではおよそ2,000人が罹患している]が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。MAPTの突然変異は、bvFTD、nfvPPA、CBS、およびPSPを有する患者のそれぞれおよそ10%で報告されている。MAPTは、アルツハイマー病の特徴である、神経細胞質における神経原線維変化の主要成分である。MAPTの凝集および沈着は、パーキンソン病を有する患者の脳のおよそ50%にも観察された。タウの関与は、他の疾患の病理発生に示されており、それらとしては、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
MAPT遺伝子は、16個のエクソン(E1~E16)からなる。E2、E3、およびE10の選択的mRNAスプライシングによって、6種のタウアイソフォーム(352~441個のアミノ酸)が生じる。E1、E4、E5、E7、E9、E11、E12、E13は、恒常的にスプライスされるエクソンである。E6およびE8は、ヒトの脳では転写されない。E4aは、末梢神経系にしか発現しない。E0(プロモーターの一部)およびE14は非コードエクソンである。
MAPTの病原性変異体は、原発性タウオパチーを有する患者のおよそ10%に見出されている。変異体は主にミスセンスであり、エクソン9~13(微小管結合ドメイン)に局在しており、エクソン10の選択的スプライシングに多くの影響を与えている。コード領域の突然変異の例としては、MAPT遺伝子のE1におけるR5HおよびR5L;E9におけるK257T、I260V、L266V、G272V、およびG273R;E10におけるN279K、L284L、ΔN296、N296N、N296H、ΔN298、P301L、P301S、P301T、G303V、G304S、S305I、S305N、およびS305S;E11におけるL315R、K317M、S320F、P332S;E12におけるG335S、G335V、Q336R、V337M、E342V、S352L、S356T、V363I、P364S、G366R、およびK369I;E13におけるG389R、R406W、およびT427Mが挙げられる。MAPT(タウ)ヌル(-/-)のヒトは、おそらく生きることができない。MAPTヘテロ接合体(+/-)のヒトは、不明瞭または不明な表現型を有する。MAPT過剰発現(+/+/+)のヒトは、早期発症の認知症、FTD、PSP、およびCBDに関連している。
MAPT(タウ)タンパク質の6種のアイソフォームの各々は、その微小管結合ドメインに3つまたは4つの反復するセグメント(R1、R2、R3、およびR4)を含有する。各リピートは、31または32アミノ酸の長さである。E9、E10、E11、およびE12のスプライシングによって、MAPTの微小管結合ドメインに反復するセグメントであるR1、R2、R3、およびR4がそれぞれ生じる。E10がスプライスインされた3種のMAPT(タウ)アイソフォームは、4つの反復するセグメント(4R)を含有し、それに対してE10がスプライスアウトされた他の3種のMAPTアイソフォームは、3つの反復セグメント(3R)を含有する。
E2およびE3の翻訳によって、N1およびN2セグメントがそれぞれ生じる。E2およびE3の選択的スプライシングによって、タウのアイソフォーム0N(E2およびE3がスプライスアウトされるため、Nセグメントがなくなる)、1N(E2がスプライスインされ、E3がスプライスアウトされるため、Nセグメントが1つとなる)および2N(E2およびE3がスプライスインされるため、Nセグメントが2つとなる)が生じる。したがって、選択的スプライシングの結果生じる6種のMAPT(タウ)アイソフォームは、2N4R、1N4R、0N4R、2N3R、1N3R、および0N3Rである。
健常な個体では、3Rおよび4R MAPT転写物のアイソフォームは1:1の比率で存在する。3R/4Rアイソフォーム比は、病態において歪みがあり、その比によってタウ凝集物の型が予測される。4リピートタウのアセンブリーが線維になることは、PSP、CBD、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、および球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTD)に特徴的であり、それらはFTDスペクトラム(4Rタウオパチー)に属する。対照的に、ピック病では、神経細胞封入体において3リピートタウが優勢である(3Rタウオパチー)。アルツハイマー病、または神経原線維変化を有する他の神経変性疾患(NFT認知症)では、3リピートタウアイソフォームと4リピートタウアイソフォームの両方が神経原線維病変を構成する(3/4Rタウオパチー)。MAPT突然変異を伴うFTLDは、3R、4R、または3/4Rタウオパチーであり得る。
運動ニューロン疾患を伴うFTDは、FTLD-TDP43およびFTLD-FUSの病理に関連している。それは、C9ORF72、FUS、TARDBP、およびVCPの遺伝子突然変異に関連している。
bvFTDは、FTLD-Tau(3R)およびFTLD-TDP43の病理に関連している。症例の10パーセントが、MAPTの突然変異に関与している。それは、C9ORF72、GRN、およびVCPの遺伝子突然変異に関連している。
PPA-Sは、孤発性であり得る。それは、FTLD-TDP43の病理に関連している。
nfvPPAは、有意性の順に、FTLD-Tau(4R)、アルツハイマー病、およびFTLD-TDP43の病理に関連している。症例の10パーセントが、MAPTの突然変異に関与している。nfvPPAは、GRNの突然変異にさらに関連している。
PPA-Lは、孤発性であり得る。それは、有意性の順に、アルツハイマー病およびFTLD-Tauの病理に関連している。
CBSは、有意性の順に、FTLD-Tau(4R)およびアルツハイマー病の病理に関連している。症例の10パーセントが、MAPTの突然変異に関連している。残りの症例は、孤発性であり得る。
PSPは、FTLD-Tau(4R)の病理に関与している。症例の10パーセントが、MAPTの突然変異に関連している。症例の残りは、孤発性であり得る。
タウオパチーは一般に、60~80歳で始まり、6~10年の余命に影響を与える。タウオパチーは、表現型が異種混合であり、運動、認知、および行動障害が多様に関与している。特に、運動症状の進行は多様である。
現在のところ、タウオパチーに対する認可された疾患修飾療法は存在しない。利用可能な処置は、症状を緩和し、疾患が進行すると共に患者の生活の質を改善することのみを目的としている。前臨床または臨床開発中の薬物としては、能動および受動免疫療法;O-脱グリコシル、凝集、キナーゼ、アセチル化、カスパーゼ、またはタウ発現の阻害剤;ホスファターゼ活性化剤;微小管安定剤;および自食作用またはプロテアソーム(proteosomal)分解のモジュレーターが挙げられる。タウオパチーを評価するために臨床試験に使用されるバイオマーカーおよび試験としては、トレオニン181でリン酸化されたタウタンパク質(pTau)、総タウタンパク質(tTau)、ニューロフィラメント軽鎖(NfL)、および容積測定MRI(vMRI)が挙げられる。
MAPTの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、GenBank受託番号NM_016841.4[ヒト(Homo sapiens)MAPT変異体4、配列番号1、逆相補物、配列番号2];GenBank受託番号NM_005910(ヒトMAPT変異体2、配列番号3、逆相補物、配列番号4);GenBank受託番号NM_001038609.2[ハツカネズミ(Mus musculus)MAPT、配列番号5;逆相補物、配列番号6];GenBank受託番号:XM_005584540.1[カニクイザル(Macaca fascicularis)MAPT変異体X13、配列番号7、逆相補物、配列番号8];GenBank受託番号:XM_008768277.2[ラット(Rattus norvegicus)MAPT、変異体X7、配列番号9、逆相補物、配列番号10]、およびGenBank受託番号:XM_005624183.3[ハイイロオオカミ(Canis lupus)MAPT変異体X23、配列番号11、逆相補物、配列番号12]に見出すことができる。
MAPT遺伝子を内包するヒト染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列は、例えば、GenBankで入手可能なGenome Reference Consortium Human Build 38(ヒトゲノムbuild38またはGRCh38とも称される)に見出すことができる。MAPT遺伝子を内包するヒト第17染色体のゲノム領域のヌクレオチド配列はまた、例えば、ヒト第17染色体のヌクレオチド45894382~46028334に対応する、GenBank受託番号NC_000017.11に見出すこともできる。ヒトMAPT遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、GenBank受託番号NG_007398.2に見出すことができる。
MAPT配列のさらなる例は、公共的に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、OMIM、およびUniProtに見出すことができる。
MAPTに関する追加の情報は、例えば、遺伝子100128977に言及するNCBIのウェブサイトに見出すことができる。用語MAPTは、本明細書において使用される場合、例えば、臨床変異体データベースに提供される変異体、例えば、用語maptに言及するNCBI臨床変異体ウェブサイトに提供される変異体を含めた、MAPT遺伝子のバリエーションも指す。
先述のGenBank受託番号およびGeneデータベース番号のそれぞれの内容全体は、本出願の出願日において参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「標的配列」は、MAPT遺伝子の転写の際に形成されるmRNA分子、例えば、一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNA(例えば、選択的スプライシングの結果生じるMAPT mRNA)。などのヌクレオチド配列における連続する一部分を意味する。一実施形態において、配列の標的部分は、MAPT遺伝子の転写の際に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の一部分またはその付近におけるRNAi依存性切断のための基質として機能するのに、少なくとも十分に長いであろう。
標的配列は、約15~30個のヌクレオチドの長さである。例えば、標的配列は、約15~30ヌクレオチド長、15~29、15~28、15~27、15~26、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、18~30、18~29、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~30、21~29、21~28、21~27、21~26、21~25、21~24、21~23、または21~22ヌクレオチド長であり得る。ある特定の実施形態において、標的配列は、19~23ヌクレオチド長であり、適宜、21~23ヌクレオチド長であってもよい。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
本明細書において使用される場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的ヌクレオチド用語体系を使用して言及される配列によって説明されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
「G」、「C」、「A」、「T」、および「U」はそれぞれ、一般的に、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドとの関連において、それぞれ塩基としての、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代理の置換部分(例えば、表1を参照されたい)も意味することができることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変更することなく、他の部分で置き換えることができることを十分に意識している。例えば、これらに限定されるわけではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本開示において特徴とされるdsRNAのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置換することができる。別の例において、オリゴヌクレオチドのいずれかにおけるアデニンおよびシトシンは、標的mRNAとG-UWobble塩基対合を形成するために、それぞれ、グアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示において特徴とされる組成物および方法にとって好適である。
本明細書において相互互換的に使用される、用語「iRNA」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」は、本明細書において用語が定義されるRNAを含有し、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)経路を介して、RNA転写における標的化された切断を媒介するような、薬剤を意味する。RNA干渉(RNAi)は、mRNAの配列特異的な分解を指示するプロセスである。RNAiは、細胞中で、例えば対象、例えば哺乳類対象内の細胞中で、MAPTの発現をモジュレートする、例えば阻害する。
一実施形態において、本開示のRNAi剤は、標的RNAの切断を指示するために、標的RNA配列、例えば、MAPT標的mRNA配列と相互作用する一本鎖RNAiを含む。理論に束縛されることを望むわけではないが、細胞内に導入された長い二本鎖RNAは、Dicerとして知られるIII型エンドヌクレアーゼによって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)へと分解されると考えられる[Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485]。リボヌクレアーゼIII様酵素であるDicerは、このdsRNAを、特徴的な2つの塩基3’オーバーハングを有する19~23塩基対の低分子干渉RNAへとプロセシングする[Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363]。次いで、これらのsiRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)へと導入され、この場合、1つまたは複数のヘリカーゼが、siRNA二重鎖を解き、相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする[Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309]。適切な標的mRNAへの結合の際に、RISC内の1つまたは複数のエンドヌクレアーゼは、サイレンシングを誘導するために、標的を切断する[Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188]。したがって、一態様では、本開示は、細胞内において生成され、RISC複合体の形成を促進し、それとにより標的遺伝子、すなわちMAPT遺伝子のサイレンシングを行う、一本鎖RNA(ssRNA)(siRNA二重鎖のアンチセンス鎖)に関する。したがって、用語「siRNA」は、上記において説明されたRNAiも意味するために本明細書において使用される。
別の実施形態において、RNAi剤は、標的mRNAを阻害するために細胞または有機体に導入された一本鎖RNAであり得る。一本鎖RNAi剤は、RISCエンドヌクレアーゼであるアルゴノート2に結合し、次いで、標的mRNAを切断する。一本鎖siRNAは、概して、15~30ヌクレオチドであり、化学的に修飾される。一本鎖RNAの設計および試験は、米国特許第8,101,348号およびLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載されており、そのそれぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において説明されるアンチセンスヌクレオチド配列はいずれも、本明細書において説明される一本鎖siRNAとして、またはLima et al., (2012) Cell 150:883-894に記載される方法によって化学的に修飾される一本鎖siRNAとして使用され得る。
別の実施形態において、本開示の組成物および方法における使用のための「RNAi剤」は、二本鎖RNAであり、本明細書において「二本鎖RNAi剤」、「二本鎖RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA剤」、または「dsRNA」と呼ばれる。用語「dsRNA」は、標的RNA、すなわち、MAPT遺伝子に関して「センス」または「アンチセンス」配向を有すると言われる、2本の逆平行の実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を意味する。本開示の一部の実施形態において、二本鎖RNA(dsRNA)は、本明細書においてRNA干渉またはRNAiと呼ばれる転写後遺伝子サイレンシングメカニズムによって、標的RNA、例えば、mRNAの分解を誘導する。
概して、dsRNA分子は、リボヌクレオチドを含むことができるが、本明細書において詳細に説明されるように、それぞれの鎖または両方の鎖は、1つまたは複数のリボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、も含むことができる。加えて、本明細書において使用される場合、「RNAi剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得;RNAi剤は、複数のヌクレオチドにおける実質的な修飾を含み得る。本明細書において使用される場合、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間連結、または修飾核酸塩基を独立して有するヌクレオチドを意味する。したがって、修飾ヌクレオチドなる用語は、ヌクレオシド間連結、糖部分、または核酸塩基への、例えば、官能基または原子などの置換、付加、または除去を包含する。本開示の薬剤における使用にとって好適な修飾は、本明細書に開示される修飾または当技術分野で公知の修飾の全てのタイプを包含する。siRNAタイプの分子において使用される、任意のそのような修飾は、本明細書および特許請求の範囲の目的のために「RNAi剤」によって包含される。
本開示のある特定の実施形態において、RNAi剤内に存在する場合、デオキシヌクレオチドの包含は、修飾ヌクレオチドを構成するとみなすことができる。
二重鎖領域は、RISC経路による所望の標的RNAの特異的分解を可能にする任意の長さであり得、ならびに約15~36塩基対の長さ、例えば、約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36塩基対の長さ、例えば、約15~30、15~29、15~28、15~27、15~26、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、18~30、18~29、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~30、21~29、21~28、21~27、21~26、21~25、21~24、21~23、または21~22の塩基対の長さに及び得る。ある特定の実施形態において、二重鎖領域は、19~21塩基対の長さ、例えば、21塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
二重鎖構造を形成する2つの鎖は、1つのより大きなRNA分子における異なる一部分であり得るか、またはそれらは、別々のRNA分子であり得る。2つの鎖が、1つのより大きい分子の一部であり、したがって、1つの鎖の3’端と、二重鎖構造を形成するそれぞれ他の鎖の5’端との間において、割り込まれていないヌクレオチドの鎖によって接続され、その場合、接続するRNA鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも1つの無対のヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも23またはそれ以上の無対のヌクレオチドまたはdsRNAの標的部位を対象としないヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、ヘアピンループは、10以下のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ヘアピンループは、8以下の無対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ヘアピンループは、4~10の無対のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、ヘアピンループは、4~8の無対のヌクレオチドであり得る。
dsRNAの2つの実質的に相補的な鎖は、別々のRNA分子に含まれ、それらの分子は、必ずしも必要ではないが、共有結合することができる。2つの鎖が、1つの鎖の3’端と、二重鎖構造を形成するそれぞれ他の鎖の5’端との間において、割り込まれないヌクレオチドの鎖以外の手段によって共有結合される、ある特定の実施形態において、接続構造は、「リンカー」と呼ばれる(本明細書の他の箇所において定義されるある特定の他の構造も「リンカー」と呼ばれ得るが)。RNA鎖は、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、dsRNAの最も短い鎖におけるヌクレオチドの数から二重鎖に存在する全てのオーバーハングを引いた数である。二重鎖構造に加えて、RNAiは、1つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。RNAi剤の一実施形態において、少なくとも1つの鎖は、少なくとも1ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。別の実施形態において、少なくとも1つの鎖は、少なくとも2ヌクレオチド、例えば、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。他の実施形態において、RNAi剤の少なくとも1つの鎖は、少なくとも1ヌクレオチドの5’オーバーハングを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも1つの鎖は、少なくとも2ヌクレオチド、例えば、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、または15ヌクレオチドの5’オーバーハングを含む。さらなる他の実施形態において、RNAi剤の1つの鎖の3’および5’端の両方は、少なくとも1ヌクレオチドのオーバーハングを含む。
一実施形態において、本開示のRNAi剤は、dsRNAであり、その各鎖は、独立して、標的RNAの切断を誘導するために、標的RNA配列、例えば、MAPT標的mRNA配列と相互作用する19~23ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本発明のiRNAは、標的RNA配列、例えば、MAPT標的化mRNA配列と相互作用して標的RNAの切断を指示する24~30ヌクレオチドのdsRNAである。
本明細書において使用される場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、RNAi剤、例えばdsRNAの二重鎖構造から突出する少なくとも1つの無対のヌクレオチドを意味する。例えば、dsRNAの一方の鎖の3’端が、他方の鎖の5’端を越えて延びる場合、その逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。dsRNAは、少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングを含むことができ;あるいは、オーバーハングは、少なくとも2つのヌクレオチド、少なくとも3つのヌクレオチド、少なくとも4つのヌクレオチド、少なくとも5つのヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドなどのヌクレオチド/ヌクレオシドアナログを含み得、またはそれらからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそれらの任意の組合せの上にあり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかの5’端、3’端、またはその両方に存在し得る。
一実施形態において、dsRNAのアンチセンス鎖は、3’端または5’端に1~10ヌクレオチドオーバーハング、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、dsRNAのセンス鎖は、3’端または5’端に1~10ヌクレオチドオーバーハング、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの1つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
ある特定の実施形態において、dsRNAのアンチセンス鎖は、3’端または5’端に1~10ヌクレオチドオーバーハング、例えば、0~3、1~3、2~4、2~5、4~10、5~10ヌクレオチドオーバーハング、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドのオーバーハングを有する。一実施形態において、dsRNAのセンス鎖は、3’端または5’端に1~10ヌクレオチドオーバーハング、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドのオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの1つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。
ある特定の実施形態において、センス鎖またはアンチセンス鎖におけるオーバーハングは、10ヌクレオチドより長い、例えば、1~30ヌクレオチド長、2~30ヌクレオチド長、10~30ヌクレオチド長、または10~15ヌクレオチド長の、伸長された長さを含み得る。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖にある。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の3’端に存在する。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のセンス鎖の5’端に存在する。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖にある。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の3’端に存在する。ある特定の実施形態において、伸長されたオーバーハングは、二重鎖のアンチセンス鎖の5’端に存在する。ある特定の実施形態において、オーバーハングにおけるヌクレオチドの1つまたは複数は、ヌクレオシドチオホスフェートで置き換えられる。ある特定の実施形態において、オーバーハングは、オーバーハングが、生理学的条件下において安定なヘアピン構造を形成することができるような自己相補性部分を含む。
用語「ブラント(blunt)」または「ブラントエンド(blunt ended)」は、dsRNAに関して本明細書において使用される場合、dsRNAの所定の末端において無対ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。dsRNAの片端または両端は、ブラントであり得る。dsRNAの両端がブラントである場合、dsRNAは、ブラントエンドであると言われる。明瞭化のため、「ブラントエンド」dsRNAは、両端がブラントであるdsRNA、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないdsRNAである。ほとんどの場合、そのような分子は、その全長にわたって二本鎖であろう。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えば、MAPT mRNAに対して実質的に相補的な領域を含む、RNAi剤、例えば、dsRNAの鎖を意味する。
本明細書において使用される場合、用語「相補性の領域」は、本明細書において定義されるように、配列、例えば、標的配列、例えば、MAPTヌクレオチド配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を意味する。相補性の領域が、標的配列に対して完全には相補的でない場合、そのミスマッチは、分子の内部領域または末端領域においてであり得る。一般に、最も許容できるミスマッチは、末端領域、例えば、RNAi剤の5’末端または3’末端の5、4、3、または2ヌクレオチド以内においてである。一部の実施形態において、本発明の二本鎖RNA剤は、アンチセンス鎖におけるヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖RNA剤のアンチセンス鎖は、標的mRNAとの4つ以下のミスマッチを含み、例えば、アンチセンス鎖は、標的mRNAとの4つ、3つ、2つ、1つ、または0のミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖RNA剤のアンチセンス鎖は、センス鎖との4つ以下のミスマッチを含み、例えば、アンチセンス鎖は、センス鎖との4つ、3つ、2つ、1つ、または0のミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖RNA剤は、センス鎖におけるヌクレオチドミスマッチを含む。一部の実施形態において、本発明の二本鎖RNA剤のセンス鎖は、アンチセンス鎖との4つ以下のミスマッチを含み、例えば、センス鎖は、アンチセンス鎖との4つ、3つ、2つ、1つ、または0のミスマッチを含む。一部の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、iRNAの3’端から5、4、3ヌクレオチド以内である。別の実施形態において、ヌクレオチドミスマッチは、例えば、iRNA剤の3’末端ヌクレオチドにおいてである。一部の実施形態において、ミスマッチは、シード領域にはない。
したがって、本明細書において説明されるRNAi剤は、標的配列に対する1つまたは複数のミスマッチを含むことができる。一実施形態において、本明細書において説明されるRNAi剤は、3つ以下のミスマッチ(すなわち、3つ、2つ、1つ、または0のミスマッチ)を含む。一実施形態において、本明細書において説明されるRNAi剤は、2つ以下のミスマッチを含む。一実施形態において、本明細書において説明されるRNAi剤は、1つ以下のミスマッチを含む。一実施形態において、本明細書において説明されるRNAi剤は、0のミスマッチを含む。ある特定の実施形態において、RNAi剤のアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含む場合、ミスマッチは、適宜、相補性の領域の5’端または3’端から最後の5ヌクレオチド以内に制限することもできる。例えば、そのような実施形態において、23ヌクレオチドのRNAi剤の場合、MAPT遺伝子の領域に対して相補的な鎖は、概して、中央の13ヌクレオチド以内にいかなるミスマッチも含まない。本明細書に記載される方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対するミスマッチを含有するRNAi剤が、MAPT遺伝子の発現の阻害において有効であるか否かを判定することができる。例えば、Jackson et al. (Nat. Biotechnol. 2003;21: 635-637)は、MAPK14 siRNAに対して12~18ntのセンス鎖のみで配列同一性を有する小さい遺伝子セットの発現がMAPK14と同様の動態で下方制御された発現プロファイル研究について記載している。同様に、Lin et al., (Nucleic Acids Res. 2005; 33(14): 4527-4535)は、qPCRおよびレポーターのアッセイを使用して、siRNAと標的の間に7ntの相補性があれば標的のmRNA分解を引き起こすのに十分であることを示した。とりわけ、MAPT遺伝子における相補性の特定の領域が、集団内での多形配列バリエーションを有することが知られている場合、MAPTの発現を阻害するミスマッチを有するRNAi剤の有効性を考慮することは重要である。
「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」は、本明細書において使用される場合、全部ではないが大部分が修飾されていることであり、例としては、5、4、3、2、または1個以下の修飾されていないヌクレオチドが挙げられる。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書において使用される場合、用語が本明細書において定義されるようなアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むRNAi剤の鎖を意味する。
本明細書において使用される場合、用語「切断領域」は、切断部位に直接隣接して位置される領域を意味する。切断部位は、切断が生じる標的上の部位である。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位のどちらかの末端において直接隣接している3つの塩基を含む。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位のどちらかの末端において直接隣接している2つの塩基を含む。一部の実施形態において、詳細には、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド10および11によって結合される部位において生じ、切断領域は、ヌクレオチド11、12、および13を含む。
本明細書において使用される場合、特に明記されない限り、用語「相補的」は、当業者によって理解されるように、第2のヌクレオチド配列との関連において第1のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、ある特定の条件下において、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖を形成する第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を意味する。このような条件は、例えば、「ストリンジェントな条件」であってもよく、そのような条件としては、400mMのNaCl、40mMのPIPES pH6.4、1mMのEDTA、50℃または70℃で12~16時間、それに続き洗浄することが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。(例えば、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照)。本明細書において使用される場合、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下においてアンチセンス化合物はその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列には最小限の数である条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なることとなり、アンチセンス化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物の性質および組成、ならびにそれらが調査されているアッセイによって決定される。他の条件、例えば生物の内部で遭遇し得るような生理的に適切な条件も適用することができる。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従って2つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを決定することができるであろう。
RNAi剤内、例えば、本明細書において説明されるdsRNA内の相補配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたっての、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。そのような配列は、本明細書において、お互いに関して「完全に相補的」であると呼ぶことができる。しかしながら、本明細書において、第1の配列が、第2の配列に対して「実質的に相補的」であるとみなされる場合、2つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらは、30までの塩基対の二重鎖の場合、ハイブリダイゼーションの際に1つまたは複数、しかし、概して、5、4、3、または2以下のミスマッチの塩基対を形成し得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される「実質的に相補的な」配列は、標的MAPT配列の同等の領域に対してその全長にわたり少なくとも約80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に1つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関して、ミスマッチとはみなされない。例えば、21ヌクレオチド長の1つのオリゴヌクレオチドと23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNAであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むようなdsRNAは、依然として、本明細書において説明される目的に対して、「完全に相補的」とみなすことができる。
「相補的」配列は、本明細書において使用される場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対、または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、またはそれらから完全に形成され得る。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるわけではないが、G:UWobbleまたはHoogstein塩基対合が挙げられる。
用語「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」は、本明細書において、それらの使用との関連から理解できるように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはRNAi剤のアンチセンス鎖と標的配列との間における塩基マッチングに関連して使用することができる。
本明細書において使用される場合、メッセンジャーRNA(mRNA)「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のmRNA(例えば、タウをコードするmRNA)の連続部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを意味する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、タウをコードするmRNAの割り込みされていない部分に対して実質的に相補的である場合、MAPT mRNAの少なくとも一部に対して相補的である。
したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列に対して完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列に対して実質的に相補的であり、配列番号1、3、5、7、9、および11のいずれか1つ、または配列番号1、3、5、7、9、および11のいずれか1つの断片のヌクレオチド配列の同等の領域に対してその全長にわたり少なくとも80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号1のヌクレオチド977~997、980~1000、973~993、988~1008、987~1007、972~992、979~999、1001~1021、976~996、994~1014、1002~1022、978~998、974~994、981~1001、995~1015、1003~1023、989~1009、1031~1051、975~995、983~1003、992~1012、982~1002、1236~1256、1023~1043、986~1006、1014~1034、1237~1257、1030~1050、997~1017、1009~1029、1013~1033、1027~1047、998~1018、1026~1046、1022~1042、1065~1085、1025~1045、1017~1037、1006~1026、1000~1020、984~1004、1010~1030、1064~1084、1016~1036、993~1013、1033~1053、971~991、1008~1028、1032~1052、1015~1035、1063~1083、1020~1040、985~1005、999~1019、1004~1024、1024~1044、1104~1124、990~1010、1005~1025、1021~1041、1028~1048、996~1016、1011~1031、991~1011、1018~1038、1228~1248、1230~1250、1029~1049、1019~1039、1012~1032、1062~1082、1231~1251、1229~1249、1226~1246、1227~1247、975~997、978~1000、971~993、986~1008、985~1007、977~999、999~1021、974~996、992~1014、1000~1022、976~998、972~994、979~1001、993~1015、1001~1023、987~1009、1029~1051、973~995、981~1003、990~1012、980~1002、1234~1256、1021~1043、984~1006、1012~1034、1235~1257、1028~1050、995~1017、1007~1029、1011~1033、1025~1047、996~1018、1024~1046、1020~1042、1063~1085、1023~1045、1015~1037、1004~1026、998~1020、982~1004、1008~1030、1062~1084、1014~1036、991~1013、1031~1053、1006~1028、1030~1052、1013~1035、1018~1040、983~1005、997~1019、1002~1024、1022~1044、988~1010、1003~1025、1019~1041、1026~1048、994~1016、1009~1031、989~1011、1016~1038、1226~1248、1228~1250、1027~1049、1017~1039、1010~1032、1229~1251、1227~1249、1224~1246、および1225~1247の群から選択される配列番号1の断片に、少なくとも80%相補的な、例えば約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的な、連続するヌクレオチド配列を含む。上記の列挙された範囲の間にある範囲も本開示の一部であることが企図される。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に対して実質的に相補的であり、配列番号1のヌクレオチド520~540、521~541、5464~5484、1813~1833、2378~2398、3242~3262、5442~5462、1665~1685、1816~1836、4667~4687、3183~3203、3422~3442、3326~3346、2379~2399、3338~3358、5446~5466、5440~5460、5410~5430、3246~3266、3181~3201、2297~2317、2380~2400、3328~3348、5460~5480、3184~3204、3420~3440、3321~3341、4529~4549、5473~5493、5466~5486、5439~5459、5369~5389、4528~4548、3338~3358、4670~4690、3421~3441、2298~2318、5444~5464、5448~5468、3337~3357、5415~5435、3340~3360、3318~3338、5207~5227、1812~1832、5409~5429、4629~4649、4628~4648、3344~3364、1809~1829、5443~5463、3244~3264、3180~3200、3327~3347、4522~4542、2667~2687、4668~4688、4083~4103、5445~5465、2294~2314、4842~4862、5438~5458、4084~4104、2668~2688、4526~4546、4521~4541、5459~5479、3188~3208、5467~5487、5441~5461、4519~4539、4669~4689、5450~5470、3341~3361、5458~5478、4520~4540、4329~4349、4525~4545、4524~4544、5208~5228、5305~5325、4475~4495、2666~2686、4086~4106、4523~4543、4527~4547、4085~4105、5259~5279、518~540、519~541、5462~5484、1811~1833、2376~2398、3240~3262、5440~5462、1663~1685、1814~1836、4665~4687、3181~3203、3420~3442、3324~3346、2377~2399、3336~3358、5444~5466、5438~5460、5408~5430、3244~3266、3179~3201、2295~2317、2378~2400、3326~3348、5458~5480、3182~3204、3418~3440、3319~3341、4527~4549、5471~5493、5464~5486、5437~5459、5367~5389、4526~4548、4668~4690、3419~3441、2296~2318、5442~5464、5446~5468、3335~3357、5413~5435、3338~3360、3316~3338、1810~1832、5407~5429、4627~4649、4626~4648、3342~3364、1807~1829、5441~5463、3242~3264、3178~3200、3325~3347、4520~4542、2665~2687、4666~4688、4081~4103、5443~5465、2292~2314、4840~4862、5436~5458、4082~4104、2666~2688、4524~4546、4519~4541、5457~5479、3186~3208、5465~5487、5439~5461、4517~4539、4667~4689、5448~5470、3339~3361、5456~5478、4518~4540、4327~4349、4523~4545、4522~4544、5206~5228、5303~5325、4473~4495、2664~2686、4084~4106、4521~4543、4525~4547、4083~4105、および5257~5279の群から選択される配列番号1の断片に対してその全長にわたり少なくとも80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。上記の列挙された範囲の間にある範囲も本開示の一部であることが企図される。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に対して実質的に相補的であり、配列番号1のヌクレオチド520~540、524~544、521~541、5207~5227、4670~4690、3420~3440、3328~3348、1665~1685、5409~5429、5439~5459、4527~4547、5441~5461、5410~5430、5446~5466、5467~5487、5369~5389、3421~3441、5442~5462、2379~2399、4715~4735、5464~5484、3244~3264、5440~5460、1812~1832、3181~3201、3327~3347、5448~5468、4529~4549、2378~2398、4668~4688、5438~5458、5465~5485、3326~3346、3180~3200、5458~5478、3321~3341、3338~3358、3188~3208、2294~2314、4628~4648、5415~5435、5459~5479、3184~3204、2375~2395、3422~3442、3246~3266、3337~3357、2297~2317、4528~4548、3183~3203、5450~5470、5444~5464、5466~5486、2380~2400、3242~3262、4520~4540、5445~5465、3318~3338、1816~1836、5443~5463、5460~5480、4842~4862、3338~3358、1809~1829、3423~3443、4720~4740、5259~5279、4084~4104、1813~1833、4522~4542、4822~4842、4523~4543、2298~2318、4521~4541、4086~4106、4524~4544、2668~2688、4667~4687、4083~4103、4085~4105、4629~4649、4329~4349、2667~2687、4475~4495、3344~3364、4669~4689、3340~3360、4519~4539、2666~2686、5208~5228、4526~4546、4525~4545、3341~3361、518~540、522~544、519~541、4668~4690、3418~3440、3326~3348、1663~1685、5407~5429、5437~5459、4525~4547、5439~5461、5408~5430、5444~5466、5465~5487、5367~5389、3419~3441、5440~5462、2377~2399、4713~4735、5462~5484、3242~3264、5438~5460、1810~1832、3179~3201、3325~3347、5446~5468、4527~4549、2376~2398、4666~4688、5436~5458、5463~5485、3324~3346、3178~3200、5456~5478、3319~3341、3336~3358、3186~3208、2292~2314、4626~4648、5413~5435、5457~5479、3182~3204、2373~2395、3420~3442、3244~3266、3335~3357、2295~2317、4526~4548、3181~3203、5448~5470、5442~5464、5464~5486、2378~2400、3240~3262、4518~4540、5443~5465、3316~3338、1814~1836、5441~5463、5458~5480、4840~4862、1807~1829、3421~3443、4718~4740、5257~5279、4082~4104、1811~1833、4520~4542、4820~4842、4521~4543、2296~2318、4519~4541、4084~4106、4522~4544、2666~2688、4665~4687、4081~4103、4083~4105、4627~4649、4327~4349、2665~2687、4473~4495、3342~3364、4667~4689、3338~3360、4517~4539、2664~2686、5206~5228、4524~4546、4523~4545、および3339~3361の群から選択される配列番号1の断片に対してその全長にわたり少なくとも80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。上記の列挙された範囲の間にある範囲も本開示の一部であることが企図される。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号1のヌクレオチド977~997、980~1000、973~993、988~1008、987~1007、972~992、979~999、1001~1021、976~996、994~1014、1002~1022、978~998、974~994、520~540、521~541、5464~5484、1813~1833、2378~2398、3242~3262、5442~5462、1665~1685、524~544、5207~5227、4670~4690、3420~3440、3328~3348、5409~5429、5439~5459、4527~4547、5441~5461、5410~5430、および5446~5466の群から選択される配列番号1の断片に、少なくとも80%相補的な、例えば約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的な、連続するヌクレオチド配列を含む。上記の列挙された範囲の間にある範囲も本開示の一部であることが企図される。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に対して実質的に相補的であり、配列番号3のヌクレオチド512~532、513~533、514~534、515~535、516~536、517~537、518~538、519~539、520~540、1063~1083、1067~1087、1072~1092、1074~1094、1075~1095、1125~1145、1126~1146、1127~1147、1129~1149、1170~1190、1395~1415、1905~1925、1906~1926、1909~1929、1911~1931、1912~1932、1913~1933、1914~1934、1915~1935、1916~1936、1919~1939、1951~1971、1954~1974、1958~1978、2387~2407、2409~2429、2410~2430、2469~2489、2471~2491、2472~2492、2476~2496、2477~2497、2478~2498、2480~2500、2481~2501、2482~2502、2484~2504、2762~2782、2764~2784、2766~2786、2767~2787、2768~2788、2769~2789、2819~2839、2821~2841、2828~2848、2943~2963、2944~2964、2946~2966、2947~2967、3252~3272、3277~3297、3280~3300、3281~3301、3282~3302、3284~3304、3285~3305、3286~3306、3331~3351、3332~3352、3333~3353、3334~3354、3335~3355、3336~3356、3338~3358、3340~3360、3342~3362、3343~3363、3344~3364、3345~3365、3346~3366、3347~3367、3349~3369、3350~3370、3353~3373、3364~3384、3366~3386、3367~3387、3368~3388、3369~3389、3370~3390、3412~3432、3414~3434、3415~3435、3416~3436、3417~3437、3419~3439、3420~3440、3424~3444、3425~3445、3426~3446、3427~3447、3428~3448、3429~3449、3430~3450、3431~3451、3434~3454、4132~4152、4134~4154、4179~4199、4182~4202、4184~4204、4395~4415、4425~4445、4426~4446、4429~4449、4469~4489、4470~4490、4471~4491、4472~4492、4473~4493、4474~4494、4569~4589、4571~4591、4572~4592、4596~4616、4623~4643、4721~4741、4722~4742、4725~4745、4726~4746、4766~4786、4767~4787、4768~4788、4769~4789、4770~4790、4779~4799、4805~4825、4806~4826、4807~4827、4808~4828、4809~4829、4812~4832、4813~4833、4814~4834、4936~4956、5072~5092、5073~5093、5345~5365、5346~5366、5349~5369、5350~5370、5351~5371、5460~5480、5461~5481、5463~5483、5465~5485、5467~5487、5468~5488、5469~5489、5470~5490、5471~5491、5505~5525、5506~5526、5507~5527、5508~5528、5509~5529、5511~5531、5513~5533、5514~5534、5541~5561、5544~5564、5546~5566、5547~5567、5548~5568、5550~5570、5551~5571、5574~5594、5576~5596、5614~5634、521~541、522~542、523~543、524~544、525~545、526~546、527~547、528~548、529~549、530~550、531~551、532~552、533~553、534~554、535~555、536~556、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、1044~1064、1045~1065、1046~1066、1047~1067、1048~1068、1049~1069、1050~1070、1051~1071、1052~1072、1053~1073、1054~1074、1062~1082、1064~1084、1065~1085、1066~1086、1068~1088、1069~1089、1070~1090、1071~1091、1073~1093、1076~1096、1077~1097、1078~1098、1079~1099、1080~1100、1081~1101、1082~1102、1128~1148、1129~1149、1130~1150、1131~1151、1132~1152、1133~1153、1134~1154、1135~1155、1136~1156、1137~1157、1138~1158、1139~1159、1140~1160、1141~1161、1142~1162、1143~1163、1144~1164、1145~1165、1146~1166、1147~1167、1148~1168、975~995、976~996、977~997、978~998、979~999、980~1000、981~1001、982~1002、983~1003、984~1004、985~1005、986~1006、987~1007、988~1008、989~1009、990~1010、991~1011、992~1012、993~1013、994~1014、995~1015、996~1016、997~1017、998~1018、999~1019、1000~1020、1001~1021、1002~1022、1003~1023、1004~1024、1005~1025、1006~1026、1007~1027、1008~1028、1009~1029、1010~1030、1011~1031、1012~1032、1013~1033、1014~1034、1015~1035、1016~1036、1017~1037、1018~1038、1019~1039、1020~1040、1021~1041、1022~1042、1023~1043、1024~1044、1025~1045、1026~1046、1027~1047、1028~1048、1029~1049、1030~1050、1031~1051、1032~1052、1033~1053、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、および1045~1065の群から選択される配列番号3の断片に対してその全長にわたり少なくとも80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。上記の列挙された範囲の間にある範囲も本開示の一部であることが企図される。
一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に実質的に相補的であり、その全長にわたり、配列番号5のヌクレオチド1065~1085、1195~1215、1066~1086、1068~1088、705~725、1067~1087、4520~4540、3341~3361、4515~4535、5284~5304、5285~5305、344~364、5283~5303、5354~5374、2459~2479、1061~1081、706~726、972~992、4564~4584、995~1015、4546~4566、968~988、1127~1147、4534~4554、158~178、4494~4514、1691~1711、3544~3564、198~218、979~999、4548~4568、4551~4571、543~563、715~735、542~562、352~372、362~382、4556~4576、4547~4567、4542~4562、4558~4578、4549~4569、5074~5094、4552~4572、5073~5093、5076~5096、4550~4570、および2753~2773の群から選択される配列番号5の断片に、少なくとも80%相補的な、例えば約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的な、連続するヌクレオチド配列を含む。上記の列挙された範囲の間にある範囲も本開示の一部であることが企図される。
他の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列に対して実質的に相補的であり、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つのいずれか1におけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つ、または表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つにおけるセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つの断片に対してその全長にわたって少なくとも80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本開示のRNAi剤は、標的MAPT配列と同じであるアンチセンスポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であるセンス鎖を含み、センス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9および11、または配列番号1、3、5、7、9および11のいずれか1つの断片の同等の領域に対してその全長にわたって少なくとも約80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本発明のiRNAは、標的MAPT配列に対して相補的であるアンチセンスポリヌクレオチドに対して実質的に相補的であるセンス鎖を含み、センス鎖ポリヌクレオチドは、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つのいずれか1つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つ、または表3~8、および16~28のいずれか1つにおけるアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つの断片に対してその全長にわたって少なくとも80%、例えば、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、または100%相補的である、連続するヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、AD-523796.1、AD-523803.1、AD-523817.1、AD-523825.1、AD-523811.1、AD-523854.1、AD-523797.1、AD-523805.1、AD-523814.1、AD-523804.1、AD-1019356.1、AD-523846.1、AD-523808.1、AD-523835.1、AD-1019357.1、AD-523853.1、AD-523819.1、AD-523830.1、AD-523834.1、AD-523850.1、AD-523820.1、AD-523849.1、AD-523845.1、AD-393758.3、AD-523848.1、AD-523840.1、AD-523828.1、AD-523822.1、AD-523806.1、AD-523831.1、AD-393757.1、AD-523839.1、AD-523815.1、AD-523856.1、AD-1019330.1、AD-523829.1、AD-523855.1、AD-523836.1、AD-1019329.1、AD-523843.1、AD-523807.1、AD-523821.1、AD-523826.1、AD-523847.1、AD-523786.1、AD-523812.1、AD-523827.1、AD-523844.1、AD-523851.1、AD-523818.1、AD-523832.1、AD-523813.1、AD-523841.1、AD-1019352.1、AD-1019354.1、AD-523852.1、AD-523842.1、AD-523833.1、AD-1019328.1、AD-1019355.1、AD-1019353.1、AD-1019350.1、およびAD-1019351.1のいずれか1つから選択される。特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1およびAD-535864.1のいずれか1つから選択される。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、AD-535864.1、AD-535925.1、AD-538012.1、AD-536872.1、AD-536954.1、AD-536964.1、AD-536318.1、AD-536976.1、AD-538630.1、AD-538624.1、AD-538594.1、AD-536915.1、AD-536870.1、AD-536236.1、AD-536319.1、AD-536966.1、AD-538643.1、AD-536873.1、AD-536952.1、AD-536959.1、AD-537921.1、AD-538652.1、AD-538649.1、AD-538623.1、AD-538573.1、AD-537920.1、AD-536939.1、AD-538015.1、AD-536953.1、AD-536237.1、AD-538628.1、AD-538632.1、AD-536975.1、AD-538599.1、AD-536978.1、AD-536956.1、AD-538571.1、AD-535921.1、AD-538593.1、AD-537974.1、AD-537973.1、AD-536982.1、AD-535918.1、AD-538627.1、AD-536913.1、AD-536869.1、AD-536965.1、AD-537914.1、AD-536504.1、AD-538013.1、AD-537579.1、AD-538629.1、AD-536233.1、AD-538141.1、AD-538622.1、AD-537580.1、AD-536505.1、AD-537918.1、AD-537913.1、AD-538642.1、AD-536877.1、AD-538650.1、AD-538625.1、AD-537911.1、AD-538014.1、AD-538634.1、AD-536979.1、AD-538641.1、AD-537912.1、AD-537761.1、AD-537917.1、AD-537916.1、AD-538432.1、AD-538529.1、AD-537867.1、AD-536503.1、AD-537582.1、AD-537915.1、AD-537919.1、AD-537581.1、およびAD-538483.1のいずれか1つから選択される。特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、およびAD-535864.1のいずれか1つから選択される。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1、AD-526993.1、AD-527013.1、AD-526936.1、AD-395453.1、AD-526989.1、AD-524719.1、AD-526423.1、AD-527010.1、AD-525305.1、AD-526987.1、AD-524331.1、AD-525266.1、AD-525342.1、AD-526995.1、AD-526298.1、AD-524718.1、AD-526392.1、AD-526985.1、AD-527011.1、AD-525341.1、AD-525265.1、AD-527004.1、AD-525336.1、AD-525353.1、AD-525273.1、AD-524638.1、AD-526350.1、AD-526962.1、AD-527005.1、AD-525269.1、AD-524715.1、AD-395454.1、AD-525307.1、AD-525352.1、AD-524641.1、AD-526297.1、AD-525268.1、AD-526997.1、AD-526991.1、AD-527012.1、AD-524720.1、AD-525303.1、AD-526289.1、AD-526992.1、AD-525333.1、AD-524335.1、AD-526990.1、AD-527006.1、AD-526505.1、AD-525309.1、AD-524328.1、AD-395455.1、AD-526428.1、AD-526847.1、AD-525957.1、AD-524332.1、AD-526291.1、AD-526485.1、AD-526292.1、AD-524642.1、AD-526290.1、AD-525959.1、AD-526293.1、AD-524899.1、AD-526391.1、AD-525956.1、AD-525958.1、AD-526351.1、AD-526138.1、AD-524898.1、AD-526244.1、AD-525359.1、AD-526393.1、AD-525355.1、AD-526288.1、AD-524897.1、AD-526796.1、AD-526295.1、AD-526294.1、およびAD-525356.1のいずれか1つから選択される。特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1、およびAD-526993.1のいずれか1つから選択される。
特定の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-393758.1、AD-393888.1、AD-393759.1、AD-393761.1、AD-393495.1、AD-393760.1、AD-396425.1、AD-395441.1、AD-396420.1、AD-397103.1、AD-397104.1、AD-393239.1、AD-397102.1、AD-397167.1、AD-394791.1、AD-393754.1、AD-393496.1、AD-393667.1、AD-396467.1、AD-393690.1、AD-396449.1、AD-393663.1、AD-393820.1、AD-396437.1、AD-393084.1、AD-396401.1、AD-394296.1、AD-395574.1、AD-393124.1、AD-393674.1、AD-396451.1、AD-396454.1、AD-393376.1、AD-393505.1、AD-393375.1、AD-393247.1、AD-393257.1、AD-396459.1、AD-396450.1、AD-396445.1、AD-396461.1、AD-396452.1、AD-396913.1、AD-396455.1、AD-396912.1、AD-396915.1、AD-396453.1、およびAD-394991.1のいずれか1つから選択される。
一実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖は、二重鎖AD-1397070.1、AD-1397070.2、AD-1397071.1、AD-1397071.2、AD-1397072.1、AD-1397072.2、AD-1397073.1、AD-1397073.2、AD-1397074.1、AD-1397074.2、AD-1397075.1、AD-1397075.2、AD-1397076.1、AD-1397076.2、AD-1397077.1、AD-1397077.2、AD-1397078.1、AD-1397078.2、AD-1397250.1、AD-1397251.1、AD-1397252.1、AD-1397253.1、AD-1397254.1、AD-1397255.1、AD-1397256.1、AD-1397257.1、AD-1397258.1、AD-1397259.1、AD-1397260.1、AD-1397261.1、AD-1397262.1、AD-1397263.1、AD-1397264.1、AD-1397265.1、AD-1423242.1、AD-1423243.1、AD-1423244.1、AD-1423245.1、AD-1423246.1、AD-1423247.1、AD-1423248.1、AD-1423249.1、AD-1423250.1、AD-1423251.1、AD-1423252.1、AD-1423253.1、AD-1423254.1、AD-1423255.1、AD-1423256.1、AD-1423257.1、AD-1423258.1、AD-1423259.1、AD-1423260.1、AD-1423261.1、AD-1423262.1、AD-1423263.1、AD-1423264.1、AD-1423265.1、AD-1423266.1、AD-1423267.1、AD-1423268.1、AD-1423269.1、AD-1423270.1、AD-1423271.1、AD-1423272.1、AD-1423273.1、AD-1423274.1、AD-1423275.1、AD-1423276.1、AD-1423277.1、AD-1423278.1、AD-1423279.1、AD-1423280.1、AD-1423281.1、AD-1423282.1、AD-1423283.1、AD-1423284.1、AD-1423285.1、AD-1423286.1、AD-1423287.1、AD-1423288.1、AD-1423289.1、AD-1423290.1、AD-1423291.1、AD-1423292.1、AD-1423293.1、AD-1423294.1、AD-1423295.1、AD-1423296.1、AD-1423297.1、AD-1423298.1、AD-1423299.1、AD-1423300.1、AD-1397266.1、AD-1397266.2、AD-1397267.1、AD-1423301.1、AD-1397268.1、AD-1397268.2、AD-1397269.1、AD-1423302.1、AD-1397270.1、AD-1397270.2、AD-1397271.1、AD-1397271.2、AD-1397272.1、AD-1423303.1、AD-1397273.1、AD-1423304.1、AD-1397274.1、AD-1423305.1、AD-1397275.1、AD-1423306.1、AD-1397276.1、AD-1397277.1、AD-1397277.2、AD-1397278.1、AD-1397279.1、AD-1397280.1、AD-1397281.1、AD-1397282.1、AD-1397283.1、AD-1397284.1、AD-1397285.1、AD-1397286.1、AD-1397287.1、AD-1397079.1、AD-1397079.2、AD-1397288.1、AD-1397289.1、AD-1397290.1、AD-1397080.1、AD-1397080.2、AD-1397291.1、AD-1397292.1、AD-1397293.1、AD-1397294.1、AD-1397081.1、AD-1397081.2、AD-1397295.1、AD-1397082.1、AD-1397082.2、AD-1397083.1、AD-1397083.2、AD-1397296.1、AD-1397297.1、AD-1397298.1、AD-1397299.1、AD-1397300.1、AD-1397301.1、AD-1397302.1、AD-1397084.1、AD-1397085.1、AD-1397086.1、AD-1397303.1、AD-1397087.1、AD-1397087.2、AD-1397304.1、AD-1397305.1、AD-1397306.1、AD-1397307.1、AD-1397308.1、AD-1397309.1、AD-1397310.1、AD-1397311.1、AD-1397312.1、AD-1397313.1、AD-1397314.1、AD-1397315.1、AD-1397316.1、AD-1397317.1、AD-1397318.1、AD-1397319.1、AD-1397320.1、AD-1397321.1、AD-1397322.1、AD-1397088.1、AD-1397089.1、AD-1397090.1、AD-1397091.1、AD-1397092.1、AD-1397093.1、AD-1397094.1、AD-1397095.1、AD-1397096.1、AD-1397097.1、AD-1397098.1、AD-1397099.1、AD-1397101.1、AD-1397102.1、AD-1397103.1、AD-1397104.1、AD-1397105.1、AD-1397106.1、AD-1397107.1、AD-1397108.1、AD-1397109.1、AD-1397110.1、AD-1397111.1、AD-1397112.1、AD-1397113.1、AD-1397114.1、AD-1397115.1、AD-1397116.1、AD-1397117.1、AD-1397118.1、AD-1397119.1、AD-1397120.1、AD-1397121.1、AD-1397122.1、AD-1397123.1、AD-1397124.1、AD-1397125.1、AD-1397126.1、AD-1397127.1、AD-1397128.1、AD-1397129.1、AD-1397130.1、AD-1397131.1、AD-1397132.1、AD-1397133.1、AD-1397134.1、AD-1397135.1、AD-1397136.1、AD-1397137.1、AD-1397138.1、AD-1397139.1、AD-1397140.1、AD-1397141.1、AD-1397142.1、AD-1397143.1、AD-1397144.1、AD-1397145.1、AD-1397146.1、AD-1397147.1、AD-1397148.1、AD-1397149.1、AD-1397150.1、AD-1397151.1、AD-1397152.1、AD-1397153.1、AD-1397154.1、AD-1397155.1、AD-1397156.1、AD-1397157.1、AD-1397158.1、AD-1397159.1、AD-1397160.1、AD-1397161.1、AD-1397162.1、AD-1397163.1、AD-1397164.1、AD-1397165.1、AD-1397166.1、AD-1397167.1、AD-1397168.1、AD-1397169.1、AD-1397170.1、AD-1397171.1、AD-1397172.1、AD-1397173.1、AD-1397174.1、AD-1397175.1、AD-1397176.1、AD-1397177.1、AD-1397178.1、AD-1397179.1、AD-1397180.1、AD-1397181.1、AD-1397182.1、AD-1397183.1、AD-1397184.1、AD-1397185.1、AD-1397186.1、AD-1397187.1、AD-1397188.1、AD-1397189.1、AD-1397190.1、AD-1397191.1、AD-1397192.1、AD-1397193.1、AD-1397194.1、AD-1397195.1、AD-1397196.1、AD-1397197.1、AD-1397198.1、AD-1397199.1、AD-1397200.1、AD-1397201.1、AD-1397202.1、AD-1397203.1、AD-1397204.1、AD-1397205.1、AD-1397206.1、AD-1397207.1、AD-1397208.1、AD-1397209.1、AD-1397210.1、AD-1397211.1、AD-1397212.1、AD-1397213.1、AD-1397214.1、AD-1397215.1、AD-1397216.1、AD-1397217.1、AD-1397218.1、AD-1397219.1、AD-1397220.1、AD-1397221.1、AD-1397222.1、AD-1397223.1、AD-1397224.1、AD-1397225.1、AD-1397226.1、AD-1397227.1、AD-1397228.1、AD-1397229.1、AD-1397230.1、AD-1397231.1、AD-1397232.1、AD-1397233.1、AD-1397234.1、AD-1397235.1、AD-1397236.1、AD-1397237.1、AD-1397238.1、AD-1397239.1、AD-1397240.1、AD-1397241.1、AD-1397242.1、AD-1397243.1、AD-1397244.1、AD-1397245.1、AD-1397246.1、AD-1397247.1、AD-1397248.1、AD-1397249.1、AD-523565.1、AD-1397072.3、AD-1397073.3、AD-1397076.3、AD-1397077.3、AD-1397078.3、AD-1397252.2、AD-1397257.2、AD-1397258.2、AD-1397259.2、AD-1397263.2、AD-1397264.2、AD-1397309.2、AD-64958.114、AD-393758.4、AD-1397080.3、AD-1397293.2、AD-1397294.2、AD-1397081.3、AD-1397083.3、AD-1397298.2、AD-1397299.2、AD-1397084.2、AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2およびAD-1397088.2のいずれか1つから選択される。
一実施形態において、MAPT遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、MAPT mRNA、例えば、センスmRNA、アンチセンスmRNA、総MAPT mRNAの量の低減によって評価され、このようなmRNAは、MAPT遺伝子が転写されており、MAPT遺伝子の発現が阻害されるように処置された、または処置されている第1の細胞または細胞群から単離することができる、またはそのような細胞または細胞群において検出され、第1の細胞または細胞群に実質的に同一であるが、そのように処置されたまたは処置されていない第2の細胞または細胞群(対照細胞)と比較される。阻害の程度は、以下の単位で表すことができる:
dsRNAなどの「細胞をRNAi剤と接触させること」なる語句は、本明細書において使用される場合、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを包含する。細胞をRNAi剤と接触させることは、細胞をインビトロにおいてRNAi剤と接触させることまたは細胞をインビボにおいてRNAi剤と接触させることを含む。接触させることは、直接的または間接的に行われ得る。したがって、例えば、RNAi剤は、方法を個別に実施することによって、細胞と物理的に接触させ得るか、あるいはRNAi剤は、その後に細胞と接触することを可能にし得るまたは引き起こし得るような状況に置かれ得る。
細胞をインビトロにおいて接触させることは、例えば、細胞をRNAi剤と共にインキュベートすることによって為され得る。細胞をインビボ(in vivo)において接触させることは、例えば、RNAi剤を細胞が位置されている組織中もしくはその付近に注入することによって、または別の領域、例えば、中枢神経系(CNS)に、適宜、髄腔内注入、硝子体内注入、大槽内注入、もしくは他の注入によってRNAi剤を注入することによって、または薬剤がその後に、接触されるべき細胞が位置されている組織に到達するように、血流もしくは皮下腔にRNAi剤を注入することによって、為され得る。例えば、RNAi剤は、RNAi剤を目的の部位、例えば、CNSに向かわせるかまたは安定化するリガンド、例えば、下記において説明され、例えば、参照により本明細書に組み込まれるPCT/US2019/031170においてさらに詳述されるような親油性部分を含み得るかまたはそれにカップリングされ得る。接触させるためのインビトロでの方法およびインビボでの方法の組合せも可能である。例えば、細胞をインビトロにおいてRNAi剤と接触させ、その後に対象に移してもよい。
一実施形態において、細胞をRNAi剤と接触させることは、細胞内への取り込みまたは吸収を促進または実施することによって「導入すること」または「RNAi剤を細胞内にデリバリーすること」を含む。RNAi剤の吸収または取り込みは、自発的拡散性のもしくは活性な細胞プロセスによって、または助剤もしくはデバイスによって生じ得る。RNAi剤を細胞内に導入することは、インビトロまたはインビボにおいてであり得る。例えば、インビボ導入の場合、RNAi剤は、組織部位に注入され得るかまたは全身的に投与され得る。細胞内へのインビトロ導入としては、当技術分野で公知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションなどが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書の下記において説明されるか、または当技術分野で公知である。
用語「親油性」または「親油性部分」は、脂質に対して親和性を有する任意の化合物または化学部分を広く意味する。親油性部分の親油性を特徴付ける方法の1つは、オクタノール-水分配係数logKowによってであり、この場合、Kowは、平衡状態の2相系における水相の化学物質の濃度に対するオクタノール相の化学物質の濃度の比である。オクタノール-水分配係数は、物質における実験室測定された特性である。しかしながら、それは、第1原理または経験的方法を使用して算出される化学物質の構造成分に起因する係数を使用することによっても予想され得る[例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)を参照されたい]。それは、水よりもむしろ非水性または油性環境を好む物質の傾向の熱力学的尺度(すなわち、親水性/親油性のバランス)を提供する。原則として、化学物質は、logKowが0を超える場合、親油性の性質である。典型的には、親油性部分は、1を超える、1.5を超える、2を超える、3を超える、4を超える、5を超える、または10を超えるlogKowを有する。例えば、6-アミノヘキサノールのlogKowは、およそ0.7であることが予想される。同じ方法を使用することにより、コレステリルN-(ヘキサン-6-オール)カルバメートのlogKowは、10.7であることが予想される。
分子の親油性は、分子が有する官能基に関して変更することができる。例えば、親油性部分の末端にヒドロキシル基またはアミン基を加えることにより、親油性部分の分配係数(例えば、logKow)値を増加または減少させることができる。
あるいは、1つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖RNAi剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定することができる。例えば、ある特定の実施形態において、二本鎖RNAi剤の血漿タンパク質結合アッセイの非結合分率は、二本鎖RNAi剤のサイレンシング活性に正に相関し得る、二本鎖RNAi剤の相対的疎水性に正に相関することを判定することができる。
一実施形態において、判定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)である。この結合アッセイの例示的プロトコールは、例えば、PCT/US2019/031170において詳細に説明される。簡潔に述べれば、二重鎖をヒト血清アルブミンと共にインキュベートし、非結合分率を決定した。例示的なアッセイプロトコールは、10μMのストック濃度の二重鎖を、1×PBS中に0、20、または90%の血清を含有する0.5μMの最終濃度(総体積20μL)に希釈することを含む。試料は、混合し、30秒間遠心分離し、次に室温で10分間インキュベートし得る。インキュベーションステップが完了したら、4μLの6×EMSAゲル-ローディング溶液を各試料に添加し、30秒間遠心分離し、12μLの各試料を26ウェルのBioRad 10%PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)にロードし得る。ゲルを100ボルトで1時間泳動し得る。泳動の完了後に、ゲルをケーシングから取り出し、50mLの10%TBE(Tris塩基、ホウ酸、およびEDTA)中で洗浄した。洗浄が完了したら、5μLのSYBR Goldをゲルに添加し、次いでそれを室温で10分間インキュベートし、ゲルを50mLの10%TBE中で再度洗浄し得る。この例示的なアッセイでは、Gel Doc XR+ゲルドキュメンテーションシステムを使用して、以下のパラメータを使用してゲルを読み取ってもよい:イメージングアプリケーションはSYBR Goldに設定し、サイズはBio-Rad基準ゲルに設定し、露出は強いバンドのために自動に設定し、ハイライト飽和ピクセルは1にしてもよく、色はグレーに設定する。検出、分子量分析、および出力は、全て無効にし得る。ゲルの明瞭な写真が得られたら、Image Lab 5.2を用いて画像を処理し得る。レーンおよびバンドは手動で設定してバンド強度を測定し得る。各試料のバンド強度をPBSに対して正規化して非結合siRNAフラクションを得ることができる。この測定から相対的疎水性を決定することができる。結合アッセイにおける非結合siRNAのフラクションによって測定される二本鎖RNAi剤の疎水性は、増強されたsiRNAのインビボデリバリーの場合、0.15を超える、0.2を超える、0.25を超える、0.3を超える、0.35を超える、0.4を超える、0.45を超える、または0.5を超える。
したがって、親油性部分を二本鎖RNAi剤の内部位置にコンジュゲートすることにより、siRNAにおける増強されたインビボデリバリーに対する最適の疎水性が提供される。
用語「脂質ナノ粒子」または「LNP」は、薬学的に活性な分子、例えば、核酸分子、例えば、RNAi剤またはRNAi剤の転写元のプラスミドなどを封入する脂質層を含むベシクルである。LNPは、例えば、米国特許第6,858,225号、同第6,815,432、8,158,601号、および同第8,058,069号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「対象」は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サルおよびチンパンジーなど)、または非霊長類(例えば、ラットまたはマウスなど)である。好ましい実施形態において、対象は、ヒトであり、例えばMAPT発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態のために処置または評価されたヒト;MAPT発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態のリスクがあるヒト;MAPT発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態を有するヒト;または本明細書に記載されるようにMAPT発現の低減が有益であろう疾患、障害、または状態のために処置されたヒトである。一部の実施形態において、対象は、ヒトの女性である。他の実施形態において、対象は、ヒトの男性である。一実施形態において、対象は、ヒトの成人である。一実施形態において、対象は、ヒトの小児である。別の実施形態において、対象は、ヒトの年少者、すなわち、20歳未満の対象である。
本明細書において使用される場合、用語「処置すること」または「処置」は有益なまたは所望の結果を指し、それらとしては、MAPT関連疾患、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または他のタウオパチーにおけるMAPT遺伝子発現またはタウ産生に関連する1つまたは複数の兆候または症状の緩和または改善が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。「処置」は、処置が行われない場合に予想される生存と比較して、生存を延長することも意味し得る。
対象におけるMAPTのレベルまたは疾患マーカーまたは症状に関連する用語「低下させる(lower)」は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも10%、15%、20%、25%、30%、%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上であり得る。特定の実施形態において、減少は、少なくとも20%である。特定の実施形態において、減少は、疾患マーカー、例えば、センスもしくはアンチセンスを含有する凝集体のレベル、および/または異常なジペプチドリピートタンパク質のレベルにおける少なくとも50%の減少であり、例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ多くの減少である。一部の実施形態において、減少は、疾患マーカーにおける少なくとも約25%の減少であり、例えば、タウタンパク質および/または遺伝子発現レベルは、例えば、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%減少する。対象におけるMAPTのレベルに関連する場合、「低下させる」は、好ましくは、そのような障害のない個体における正常な範囲内として受け入れられるレベルまで下げることである。ある特定の実施形態において、「低下させる」は、疾患を患っている対象におけるマーカーまたは症状のレベルと、個体が正常な範囲内で受け入れられるレベルとの間の差の減少、例えば、肥満な個体と正常な範囲内で受け入れられる体重を有する個体との間での体重の減少のレベルである。
本明細書において使用される場合、「予防」または「予防すること」は、MAPT遺伝子の発現またはタウの産生の減少が有益であろう疾患、障害、またはそれらの状態に関して使用される場合、対象が、そのような疾患、障害、または状態に関連する症状、例えば、MAPT関連疾患の症状を発症する可能性の減少を意味する。疾患、障害、または状態を発症しないこと、またはそのような疾患、障害、または状態に関連する症状の発症の減少(例えば、その疾患または障害に対して臨床的に受け入れられる規模の少なくとも約10%の減少)、または遅延された症状の提示の遅延(例えば、数日、数週間、数か月、または数年の遅延)は、有効な予防とみなされる。
本明細書において使用される場合、用語「MAPT関連疾患」または「MAPT関連障害」または「タウオパチー」は、MAPTの発現および/または活性の低減が有益であろうあらゆる疾患または障害を含む。例示的なMAPT関連疾患としては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)が挙げられる。
「治療有効量」は、本明細書において使用される場合、MAPT関連疾患を有する対象に投与されたときに、疾患の処置(例えば、既存の疾患または疾患の1つもしくは複数の症状を減少、改善、または維持することによる)を実施するのに十分なRNA剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、RNAi剤、薬剤がどのように投与されるか、疾患およびその重症度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、先行または並行する処置のタイプ、存在するのであれば、処置される対象の他の個別の特性に応じて変わり得る。
「予防有効量」は、本明細書において使用される場合、MAPT関連疾患を有する対象に投与されたときに、疾患または疾患の1つまたは複数の症状を予防または改善するのに十分なRNAi剤の量を含むことが意図される。疾患の改善は、疾患の経過を鈍化させること、または後で発症する疾患の重症度を減少させることを含む。「予防有効量」は、RNAi剤、薬剤がどのように投与されるか、疾患のリスクの程度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、先行または並行する処置のタイプ、存在するのであれば、処置される患者の他の個別の特性に応じて変わり得る。
「治療有効量」または「予防有効量」は、任意の処置に適用可能な合理的な恩恵/リスク比においていくつかの所望の局所的または全身的効果を生じるRNAi剤の量も包含する。本開示の方法において用いられるRNAi剤は、そのような処置に適用可能な合理的な恩恵/リスク比を生じるのに十分な量において投与され得る。
語句「薬学的に許容される」は、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、合理的な恩恵/リスク比に見合う、健全な医学的判断の範囲内でのヒト対象および動物対象の組織との接触における使用にとって好適な、化合物、材料、組成物、または剤形を意味するために本明細書において用いられる。
語句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において使用される場合、1つの臓器、または身体の一部分から、他の臓器、例えば、身体の一部分への対象化合物の搬送または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤など、希釈剤、賦形剤、製造助剤(例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸)、または溶媒封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の原材料に対して適合性であるという意味において「許容され」なければならず、ならびに処置される対象に対して有害であってはならない。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、(1)糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびショ糖など;(2)デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど;(3)セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど;(4)トラガント末;(5)モルト;(6)ゼラチン;(7)潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなど;(8)賦形剤、例えば、ココアバターおよび座剤ワックスなど;(9)オイル、例えば、落花生油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油など;(10)グリコール、例えば、プロピレングリコールなど;(11)ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなど;(12)エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど;(13)寒天;(14)緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど;(15)アルギン酸;(16)発熱物質不含水;(17)等張食塩水;(18)リンガー溶液;(19)エチルアルコール;(20)pH緩衝溶液;(21)ポリエステル、ポリカーボネート、またはポリ無水物;(22)充填剤(bulking agent)、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸など;(23)血清成分、例えば、血清アルブミン、HDL、およびLDLなど;ならびに(22)医薬製剤に用いられるその他の無毒の親和性物質が挙げられる。
用語「試料」は、本明細書において使用される場合、対象から単離された同様の体液、細胞、または組織、ならびに対象内に存在する体液、細胞、または組織のコレクションを包含する。生体液の例としては、血液、血清、および漿膜液、血漿、髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液、などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器、または局所領域からの試料を含み得る。例えば、試料は、特定の臓器、臓器の一部、またはそれらの臓器内の体液または細胞から得られ得る。ある特定の実施形態において、試料は、脳(例えば、脳全体または脳におけるあるセグメント、例えば、線状体、または脳におけるあるタイプの細胞、例えば、ニューロンおよびグリア細胞(星状細胞、オリゴデンドロサイト、小グリア細胞))から得られ得る。一部の実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から得られた血液またはそれらから得られた血漿もしくは血清を意味する。さらなる実施形態において、「対象から得られた試料」は、対象から得られた脳組織(またはその副成分)または網膜組織(またはその副成分)を意味する。
用語「置換されている」は、所与の構造における1つまたは複数の水素ラジカルが特定の置換基のラジカルで置き換えられていることを指す。それらとしては、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、ハロ、チオール、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、ヘテロアリール、複素環式、および脂肪族が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。置換基をさらに置換することができることは理解されよう。
用語「アルキル」は、示された数の炭素原子を含有する、直鎖でも分岐鎖でもよい飽和および不飽和非芳香族炭化水素鎖(これらとしては、限定するものではないが、プロピル、アリル、またはプロパルギルが挙げられる)を指し、それらは、N、O、またはSが挿入されていてもよい。例えば、「(C1~C6)アルキル」は、線状または分岐状に配置された1~6個の炭素原子を有するラジカルを意味する。「(C1~C6)アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソ-プロピル、n-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。ある特定の実施形態において、本開示の親油性部分は、C6~C18アルキル炭化水素鎖を含み得る。
用語「アルキレン」は、指定された数の炭素原子を有する、置換されていてもよい飽和脂肪族分岐鎖または直鎖の二価炭化水素ラジカルを指す。例えば、「(C1~C6)アルキレン」は、線状に配置された1~6個の炭素原子を有する二価飽和脂肪族ラジカル、例えば、[(CH2)n](式中、nは1~6の整数である)を意味する。「(C1~C6)アルキレン」としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、およびヘキシレンが挙げられる。あるいは、「(C1~C6)アルキレン」は、分岐状に配置された1~6個の炭素原子を有する二価飽和ラジカル、例えば:[(CH2CH2CH2CH2CH(CH3)]、[(CH2CH2CH2CH2C(CH3)2]、[(CH2C(CH3)2CH(CH3))]などを意味する。用語「アルキレンジオキソ」は、構造-O-R-O-(式中、Rはアルキレンを表す)の二価の種を指す。
用語「メルカプト」は、-SHラジカルを指す。用語「チオアルコキシ」は、-S-アルキルラジカルを指す。
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のいずれかのラジカルを指す。「ハロゲン」および「ハロ」は、本明細書において相互互換的に使用される。
本明細書において使用される場合、用語「シクロアルキル」は、特に指定されない限り3~14個の炭素原子を有する、飽和または不飽和非芳香族炭化水素環基を意味する。例えば、「(C3~C10)シクロアルキル」は、(3~10)員の飽和脂肪族環状炭化水素環の炭化水素ラジカルを意味する。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、メチル-シクロプロピル、2,2-ジメチル-シクロブチル、2-エチル-シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。シクロアルキルには、複数のスピロ環または縮合環が含まれてもよい。シクロアルキル基は、通常の価数によって許容される限り、任意の位置で一、二、三、四、または五置換されていてもよい。
本明細書において使用される場合、用語「アルケニル」は、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含有し、特に指定されない限り2~10個の炭素原子を有する、直鎖状または分岐状の非芳香族炭化水素ラジカルを指す。そのような基には5個までの炭素-炭素二重結合が存在してもよい。例えば、「C2~C6」アルケニルは、2~6個の炭素原子を有するアルケニルラジカルとして定義される。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、およびシクロヘキセニルが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。アルケニル基の直鎖状、分岐状、または環状部分は、二重結合を含有してもよく、通常の価数によって許容される限り、任意の位置で一、二、三、四、または五置換されていてもよい。用語「シクロアルケニル」は、指定された数の炭素原子を有し、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を有する単環式炭化水素基を意味する。
本明細書において使用される場合、用語「アルキニル」は、特に指定されない限り2~10個の炭素原子を含有し、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含有する、直鎖状または分岐状の炭化水素ラジカルを指す。5個までの炭素-炭素三重結合が存在してもよい。したがって、「C2~C6アルキニル」は、2~6個の炭素原子を有するアルキニルラジカルを意味する。アルキニル基の例としては、エチニル、2-プロピニル、および2-ブチニルが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。アルキニル基の直鎖状または分岐状部分は、通常の価数によって許容される限り三重結合を含有してもよく、通常の価数によって許容される限り、任意の位置で一、二、三、四、または五置換されていてもよい。
本明細書において使用される場合、「アルコキシル」または「アルコキシ」は、示した数の炭素原子が酸素架橋を通して結合された、上に定義される通りのアルキル基を指す。例えば、「(C1~C3)アルコキシ」には、メトキシ、エトキシ、およびプロポキシが含まれる。例えば、「(C1~C6)アルコキシ」には、C1、C2、C3、C4、C5、およびC6アルコキシ基が含まれることが意図される。例えば、「(C1~C8)アルコキシ」には、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、およびC8アルコキシ基が含まれることが意図される。アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、i-プロポキシ、n-ブトキシ、s-ブトキシ、t-ブトキシ、n-ペントキシ、s-ペントキシ、n-ヘプトキシ、およびn-オクトキシが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。「アルキルチオ」は、硫黄連結原子を通して結合されたアルキルラジカルを意味する。用語「アルキルアミノ」または「アミノアルキル」は、NH連結を通して結合されたアルキルラジカルを意味する。「ジアルキルアミノ」は、窒素連結原子を通して結合された2個のアルキルラジカルを意味する。アミノ基は、非置換であっても、一置換されていても、または二置換されていてもよい。一部の実施形態において、2個のアルキルラジカルは同じである(例えば、N,N-ジメチルアミノ)。一部の実施形態において、2個のアルキルラジカルは異なっている(例えば、N-エチル-N-メチルアミノ)。
本明細書において使用される場合、「アリール」または「芳香族」は、各環に7個までの原子を有する任意の安定な単環式または多環式炭素環であって、少なくとも1個の環が芳香族であるものを意味する。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、テトラヒドロナフチル、インダニル、およびビフェニルが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。アリール置換基が二環式であり、一方の環が非芳香族である場合、結合が芳香族環を介することは理解されよう。アリール基は、通常の価数によって許容される限り、任意の位置で一、二、三、四、または五置換されていてもよい。用語「アリールアルキル」または用語「アラルキル」は、アリールで置換されているアルキルを指す。用語「アリールアルコキシ」は、アリールで置換されているアルコキシを指す。
「ヘテロ」は、環構造における少なくとも1個の炭素原子が、N、S、およびOから選択される少なくとも1個のヘテロ原子で置き換えられたものを指す。「ヘテロ」は、非環構造における少なくとも1個の炭素原子が置き換えられたものも指す。ヘテロ環構造またはヘテロ非環構造は、例えば、ヘテロ原子によって置き換えられた1、2、または3個の炭素原子を有し得る。
本明細書において使用される場合、用語「ヘテロアリール」は、各環に7個までの原子を有する安定な単環式または多環式環であって、少なくとも1個の環が芳香族であり、O、N、およびSからなる群から選択される1~4個のヘテロ原子を含有するものを表す。ヘテロアリール基の例としては、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル(pyrrazolyl)、インドリル、ベンゾトリアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ベンズイミダゾロニル、ベンゾオキサゾロニル、キノリニル、イソキノリニル、ジヒドロイソインドロニル、イミダゾピリジニル、イソインドロニル、インダゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラヒドロキノリンが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。「ヘテロアリール」には、任意の窒素含有ヘテロアリールのN-オキシド誘導体が含まれることは理解されよう。ヘテロアリール置換基が二環式であり、一方の環が非芳香族であるかヘテロ原子を含有しない場合、結合が、芳香族環を介するか、またはヘテロ原子を含有する環を介することは理解されよう。ヘテロアリール基は、通常の価数によって許容される限り、任意の位置で一、二、三、四、または五置換されていてもよい。
本明細書において使用される場合、用語「複素環」、「複素環式」、または「ヘテロシクリル」は、O、N、およびSからなる群から選択される1~4個のヘテロ原子を含有する、多環式基を含めた3~14員の芳香族または非芳香族複素環を意味する。本明細書において使用される場合、用語「複素環式」はまた、用語「複素環」および「ヘテロシクリル」と同義であるとみなされ、それもまた本明細書において説明されるものと同じ定義を有すると理解される。「ヘテロシクリル」には、上述のヘテロアリール、ならびにそのジヒドロおよびテトラヒドロ類似体が含まれる。ヘテロシクリル基の例としては、アゼチジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、フラニル、イミダゾリル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキソオキサゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリン、オキソピペラジニル、オキソピロリジニル、オキソモルホリニル、イソキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリジノニル、ピリミジル、ピリミジノニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、1,4-ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピリジン-2-オニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、ジオキシドチオモルホリニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、およびテトラヒドロチエニル、ならびにそれらのN-オキシドが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ヘテロシクリル置換基の結合は、炭素原子を介するか、またはヘテロ原子を介して生じ得る。ヘテロシクリル基は、通常の価数によって許容される限り、任意の位置で一、二、三、四、または五置換されていてもよい。
「ヘテロシクロアルキル」は、炭素の1~4個が、酸素、窒素、または硫黄などのヘテロ原子によって置き換えられたシクロアルキル残基を指す。ラジカルがヘテロシクリル基である複素環の例としては、テトラヒドロピラン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、チアゾリジン、オキサゾール、オキサゾリン、イソオキサゾール、ジオキサン、テトラヒドロフランなどが挙げられる。
用語「ヘテロアリール」は、単環式であれば1~3個のヘテロ原子、二環式であれば1~6個のヘテロ原子、または三環式であれば1~9個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子が、O、N、またはSから選択される(例えば、炭素原子と、単環式、二環式、または三環式ならばそれぞれ1~3個、1~6個、または1~9個の、N、O、またはSのヘテロ原子とを有する)、芳香族5~8員単環式、8~12員二環式、または11~14員三環式環構造を指し、各環の0、1、2、3、または4個の原子は、置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが挙げられる。用語「ヘテロアリールアルキル」または用語「ヘテロアラルキル」は、ヘテロアリールで置換されたアルキルを指す。用語「ヘテロアリールアルコキシ」は、ヘテロアリールで置換されたアルコキシを指す。
用語「シクロアルキル」には、本明細書において用いられる場合、3~12個の炭素、例えば3~8個の炭素、例えば3~6個の炭素を有する、飽和および部分的不飽和の環式炭化水素基が含まれ、該シクロアルキル基は追加的に適宜置換されていてもよい。シクロアルキル基としては、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
用語「アシル」は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、これらのいずれも置換基によってさらに置換されていてもよい。
本明細書において使用される場合、「ケト」は、カルボニル架橋を通して結合された、本明細書に定義される通りの任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはアリール基を指す。
ケト基の例としては、アルカノイル(例えば、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル)、アルケノイル(例えば、アクリロイル)、アルキノイル(例えば、エチノイル、プロピノイル、ブチノイル、ペンチノイル、ヘキシノイル)、アリーロイル(例えば、ベンゾイル)、ヘテロアリーロイル(例えば、ピロロリル、イミダゾロイル、キノリノイル、ピリジノイル)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
本明細書において使用される場合、「アルコキシカルボニル」は、カルボニル架橋を通して結合された、上に定義される通りの任意のアルコキシ基(すなわち、-C(O)O-アルキル)を指す。アルコキシカルボニル基の例としては、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソ-プロポキシカルボニル、n-プロポキシカルボニル、t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、またはn-ペントキシカルボニルが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
本明細書において使用される場合、「アリールオキシカルボニル」は、オキシカルボニル架橋を通して結合された、本明細書に定義される通りの任意のアリール基(すなわち、-C(O)O-アリール)を指す。アリールオキシカルボニル基の例としては、フェノキシカルボニルおよびナフチルオキシカルボニルが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
本明細書において使用される場合、「ヘテロアリールオキシカルボニル」は、オキシカルボニル架橋を通して結合された、本明細書に定義される通りの任意のヘテロアリール基(すなわち、-C(O)O-ヘテロアリール)を指す。ヘテロアリールオキシカルボニル基の例としては、2-ピリジルオキシカルボニル、2-オキサゾリルオキシカルボニル、4-チアゾリルオキシカルボニル、またはピリミジニルオキシカルボニルが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
用語「オキソ」は、炭素に結合されたときはカルボニルを形成し、窒素に結合されたときはN-オキシドを形成し、硫黄に結合されたときはスルホキシドまたはスルホンを形成する、酸素原子を指す。
本明細書に開示される化合物および組成物は、その化合物または組成物が置かれた環境に応じて、特定の原子(例えば、N、O、またはS原子)がプロトン化または脱プロトン化された状態で有する場合があることを、当業者であれば容易に理解および認識するであろう。したがって、本明細書において使用される場合、本明細書に開示される構造は、ある特定の官能基、例えば、OH、SH、またはNHなどがプロトン化または脱プロトン化されている場合があることが想定される。本発明における開示は、当業者によって容易に理解されるように、開示される化合物および組成物を、環境のpHに基づいたそれらのプロトン化の状態にかかわらず網羅することが意図される。
II.本開示のRNAi剤
本明細書に記載されるのは、MAPT遺伝子の発現を阻害するRNAi剤である。一実施形態において、RNAi剤は、細胞、例えば対象(例えば、哺乳動物、例えば、MAPT関連疾患、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または別のタウオパチーを有するヒト)内の細胞におけるMAPT遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNAは、MAPT遺伝子の発現の際に形成されるmRNAの少なくとも一部に対して相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約15~30ヌクレオチド長またはそれ以下である。MAPT遺伝子を発現する細胞と接触すると、RNAi剤は、MAPT遺伝子(例えば、ヒト遺伝子、霊長類遺伝子、非霊長類遺伝子)の発現を、RNAi剤と接触していない同様の細胞またはMAPT遺伝子と相補的ではないRNAi剤と比較して少なくとも25%または本明細書に記載されるようにそれ以上阻害する。MAPT遺伝子の発現は、例えば、PCRもしくは分岐DNA(bDNA)ベースの方法によって、またはタンパク質ベースの方法によって、例えば、ウェスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などによってアッセイすることができる。一実施形態において、ノックダウンのレベルは、以下の実施例1に提供されるアッセイ方法を使用して、BE(2)-C細胞でアッセイされる。一部の実施形態において、ノックダウンのレベルは、一次マウス肝細胞でアッセイされる。一部の実施形態において、ノックダウンのレベルは、Neuro-2a細胞でアッセイされる。
本明細書に記載されるのは、MAPT遺伝子の発現を阻害するRNAi剤である。一実施形態において、RNAi剤は、細胞、例えば対象(例えば、哺乳動物、例えば、MAPT関連疾患、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または別のタウオパチーを有するヒト)内の細胞におけるMAPT遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNAは、MAPT遺伝子の発現の際に形成されるmRNAの少なくとも一部に対して相補的である相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性の領域は、約15~30ヌクレオチド長またはそれ以下である。MAPT遺伝子を発現する細胞と接触すると、RNAi剤は、MAPT遺伝子(例えば、ヒト遺伝子、霊長類遺伝子、非霊長類遺伝子)の発現を、RNAi剤と接触していない同様の細胞またはMAPT遺伝子と相補的ではないRNAi剤と比較して少なくとも25%または本明細書に記載されるようにそれ以上阻害する。MAPT遺伝子の発現は、例えば、PCRもしくは分岐DNA(bDNA)ベースの方法によって、またはタンパク質ベースの方法によって、例えば、ウェスタンブロッティングもしくはフローサイトメトリー技術を使用する免疫蛍光分析などによってアッセイすることができる。一実施形態において、ノックダウンのレベルは、以下の実施例1に提供されるアッセイ方法を使用して、BE(2)-C細胞でアッセイされる。一部の実施形態において、ノックダウンのレベルは、一次マウス肝細胞でアッセイされる。一部の実施形態において、ノックダウンのレベルは、Neuro-2a細胞でアッセイされる。
dsRNAは、2つのRNA鎖を含み、それらは、相補的であり、dsRNAが使用される条件下においてハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。dsRNAの一方の鎖(アンチセンス鎖)は、実質的に相補的で、概して標的配列に対して完全に相補的である、相補性の領域を含む。標的配列は、MAPT遺伝子の発現の際に形成されたmRNAの配列から得ることができる。他方の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に対して相補的な領域を含み、それにより、2つの鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所で説明され、当技術分野で公知であるように、dsRNAの相補配列は、別々のオリゴヌクレオチド上において相対するように、単一の核酸分子の自己相補領域として含ませることもできる。
概して、二重鎖構造は、15から30塩基対の長さ、例えば、15~29、15~28、15~27、15~26、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、18~30、18~29、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~30、21~29、21~28、21~27、21~26、21~25、21~24、21~23、または21~22塩基対の長さである。ある特定の好ましい実施形態において、二重鎖構造は、18から25塩基対の長さ、例えば、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~25、21~24、21~23、21~22、22~25、22~24、22~23、23~25、23~24、または24~25塩基対の長さ、例えば、19~21塩基対の長さである。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
同様に、標的配列に対する相補性の領域は、15から30ヌクレオチド長、例えば、15~29、15~28、15~27、15~26、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、18~30、18~29、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~30、21~29、21~28、21~27、21~26、21~25、21~24、21~23、または21~22ヌクレオチド長、例えば、19~23ヌクレオチド長または21~23ヌクレオチド長である。上記に列記した範囲および長さの中間的な範囲および長さも、本開示の一部であることが想到される。
一部の実施形態において、二重鎖構造は、19から30塩基対の長さである。同様に、標的配列に対する相補性の領域は、19から30ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、dsRNAは、15から23ヌクレオチド長、19から23ヌクレオチド長、または25から30ヌクレオチド長である。概して、dsRNAは、Dicer酵素のための基質として機能するのに十分に長い。例えば、約21~23ヌクレオチドより長いdsRNAは、Dicerのための基質として機能することができることは、当技術分野において周知である。当業者も認識するであろうように、切断のために標的化されるRNAの領域は、ほとんどの場合、より長いRNA分子、多くの場合、mRNA分子の一部である。関連する場合、mRNA標的の「一部」は、RNAi依存性切断(すなわち、RISC経路による切断)のための基質であることを可能にするのに十分な長さのmRNA標的の連続配列である。
当業者は、二重鎖領域が、dsRNAの一次機能部分、例えば、15から36塩基対、例えば、15~36、15~35、15~34、15~33、15~32、15~31、15~30、15~29、15~28、15~27、15~26、15~25、15~24、15~23、15~22、15~21、15~20、15~19、15~18、15~17、18~30、18~29、18~28、18~27、18~26、18~25、18~24、18~23、18~22、18~21、18~20、19~30、19~29、19~28、19~27、19~26、19~25、19~24、19~23、19~22、19~21、19~20、20~30、20~29、20~28、20~27、20~26、20~25、20~24、20~23、20~22、20~21、21~30、21~29、21~28、21~27、21~26、21~25、21~24、21~23、または21~22塩基対、例えば、19~21塩基対の二重鎖領域であることも認識するであろう。したがって、一実施形態において、切断のために所望のRNAを標的化する、例えば、15~30塩基対の、機能的二重鎖へとプロセシングされる限り、30超の塩基対の二重鎖領域を有するRNA分子またはRNA分子の複合体は、dsRNAである。したがって、当業者は、一実施形態において、miRNAがdsRNAであることを認識するであろう。別の実施形態において、dsRNAは、天然に存在するmiRNAではない。別の実施形態において、MAPT発現を標的化するために有用なRNAi剤は、より大きなdsNRAの切断によって標的細胞において生成されない。
本明細書において説明されるdsRNAは、例えば、1、2、3、または4ヌクレオチドの、1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド/ヌクレオシドなどのヌクレオチド/ヌクレオシドアナログを含み得るかまたはそれらからなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらの任意の組合せであり得る。その上、オーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンス鎖またはセンス鎖のどちらかの5’端上、3’端上、またはその両方に存在し得る。
dsRNAは、当技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。本発明の二本鎖RNAi化合物は、二段階手法を使用して調製され得る。最初に、二本鎖RNA分子の個々の鎖が、別々に調製される。次いで、当該成分の鎖がアニールされる。siRNA化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機合成またはその両方を使用して調製することができる。有機合成は、非天然のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。同様に、本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成またはその両方を使用して調製することができる。
一態様では、本開示のdsRNAは、少なくとも2つのヌクレオチド配列、すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。MAPTに対するセンス鎖配列は、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つにおいて提供される配列の群から選択され得、ならびにセンス鎖の、アンチセンス鎖の対応するヌクレオチドは、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つの配列の群から選択され得る。この態様では、2つの配列の一方は、2つの配列の他方に対して相補的であり、この場合、配列の一方は、MAPT遺伝子の発現の際に生じたmRNAの配列に対して実質的に相補的である。そのため、この態様では、dsRNAは、一方のオリゴヌクレオチドが、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つにおけるセンス鎖(パッセンジャー鎖)として説明され、第2のオリゴヌクレオチドが、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つにおけるセンス鎖に対する対応するアンチセンス鎖(ガイド鎖)として説明される、2つのオリゴヌクレオチドを含むであろう。
一実施形態において、センス鎖は、配列番号3のヌクレオチド512~532、513~533、514~534、515~535、516~536、517~537、518~538、519~539、520~540、1063~1083、1067~1087、1072~1092、1074~1094、1075~1095、1125~1145、1126~1146、1127~1147、1129~1149、1170~1190、1395~1415、1905~1925、1906~1926、1909~1929、1911~1931、1912~1932、1913~1933、1914~1934、1915~1935、1916~1936、1919~1939、1951~1971、1954~1974、1958~1978、2387~2407、2409~2429、2410~2430、2469~2489、2471~2491、2472~2492、2476~2496、2477~2497、2478~2498、2480~2500、2481~2501、2482~2502、2484~2504、2762~2782、2764~2784、2766~2786、2767~2787、2768~2788、2769~2789、2819~2839、2821~2841、2828~2848、2943~2963、2944~2964、2946~2966、2947~2967、3252~3272、3277~3297、3280~3300、3281~3301、3282~3302、3284~3304、3285~3305、3286~3306、3331~3351、3332~3352、3333~3353、3334~3354、3335~3355、3336~3356、3338~3358、3340~3360、3342~3362、3343~3363、3344~3364、3345~3365、3346~3366、3347~3367、3349~3369、3350~3370、3353~3373、3364~3384、3366~3386、3367~3387、3368~3388、3369~3389、3370~3390、3412~3432、3414~3434、3415~3435、3416~3436、3417~3437、3419~3439、3420~3440、3424~3444、3425~3445、3426~3446、3427~3447、3428~3448、3429~3449、3430~3450、3431~3451、3434~3454、4132~4152、4134~4154、4179~4199、4182~4202、4184~4204、4395~4415、4425~4445、4426~4446、4429~4449、4469~4489、4470~4490、4471~4491、4472~4492、4473~4493、4474~4494、4569~4589、4571~4591、4572~4592、4596~4616、4623~4643、4721~4741、4722~4742、4725~4745、4726~4746、4766~4786、4767~4787、4768~4788、4769~4789、4770~4790、4779~4799、4805~4825、4806~4826、4807~4827、4808~4828、4809~4829、4812~4832、4813~4833、4814~4834、4936~4956、5072~5092、5073~5093、5345~5365、5346~5366、5349~5369、5350~5370、5351~5371、5460~5480、5461~5481、5463~5483、5465~5485、5467~5487、5468~5488、5469~5489、5470~5490、5471~5491、5505~5525、5506~5526、5507~5527、5508~5528、5509~5529、5511~5531、5513~5533、5514~5534、5541~5561、5544~5564、5546~5566、5547~5567、5548~5568、5550~5570、5551~5571、5574~5594、5576~5596、5614~5634、521~541、522~542、523~543、524~544、525~545、526~546、527~547、528~548、529~549、530~550、531~551、532~552、533~553、534~554、535~555、536~556、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、1044~1064、1045~1065、1046~1066、1047~1067、1048~1068、1049~1069、1050~1070、1051~1071、1052~1072、1053~1073、1054~1074、1062~1082、1064~1084、1065~1085、1066~1086、1068~1088、1069~1089、1070~1090、1071~1091、1073~1093、1076~1096、1077~1097、1078~1098、1079~1099、1080~1100、1081~1101、1082~1102、1128~1148、1129~1149、1130~1150、1131~1151、1132~1152、1133~1153、1134~1154、1135~1155、1136~1156、1137~1157、1138~1158、1139~1159、1140~1160、1141~1161、1142~1162、1143~1163、1144~1164、1145~1165、1146~1166、1147~1167、1148~1168、975~995、976~996、977~997、978~998、979~999、980~1000、981~1001、982~1002、983~1003、984~1004、985~1005、986~1006、987~1007、988~1008、989~1009、990~1010、991~1011、992~1012、993~1013、994~1014、995~1015、996~1016、997~1017、998~1018、999~1019、1000~1020、1001~1021、1002~1022、1003~1023、1004~1024、1005~1025、1006~1026、1007~1027、1008~1028、1009~1029、1010~1030、1011~1031、1012~1032、1013~1033、1014~1034、1015~1035、1016~1036、1017~1037、1018~1038、1019~1039、1020~1040、1021~1041、1022~1042、1023~1043、1024~1044、1025~1045、1026~1046、1027~1047、1028~1048、1029~1049、1030~1050、1031~1051、1032~1052、1033~1053、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、および1045~1065のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に対して実質的に相補的であり、ヌクレオチドの群から選択される配列番号4の断片に対してその全長にわたり少なくとも80%相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、配列番号3のヌクレオチド520~541、520~556、510~534、512~536、516~541、516~540、520~544、524~547、526~551、529~556、532~556、1065~1089、1068~1095、1068~1094、1075~1100、1076~1100、1079~1103、1123~1147、1127~1151、1130~1155、1903~1934、1903~1930、1914~1940、1949~1975、2470~2497、2941~2965、3275~3302、3278~3302、3329~3353、3333~3357、3338~3367、3338~3366、3348~3390、3348~3388、3351~3385、5507~5562、および5549~5597のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的MAPT配列の断片に対して実質的に相補的であり、ヌクレオチドの群から選択される配列番号4の断片に対してその全長にわたり相補的である連続するヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、配列番号3のヌクレオチド520~541、520~556、510~534、512~536、516~541、516~540、520~544、524~547、526~551、529~556、532~556、1065~1089、1068~1095、1068~1094、1075~1100、1076~1100、1079~1103、1123~1147、1127~1151、1130~1155、1903~1934、1903~1930、1914~1940、1949~1975、2470~2497、2941~2965、3275~3302、3278~3302、3329~3353、3333~3357、3338~3367、3338~3366、3348~3390、3348~3388、3351~3385、5507~5562、および5549~5597のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、センス鎖は、配列番号1のヌクレオチド977~997、980~1000、973~993、988~1008、987~1007、972~992、979~999、1001~1021、976~996、994~1014、1002~1022、978~998、974~994、520~540、521~541、5464~5484、1813~1833、2378~2398、3242~3262、5442~5462、1665~1685、524~544、5207~5227、4670~4690、3420~3440、3328~3348、5409~5429、5439~5459、4527~4547、5441~5461、5410~5430、および5446~5466のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号2の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、AD-523796.1、AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、AD-535864.1、AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1、AD-526993.1、AD-1397070.1、AD-1397070.2、AD-1397071.1、AD-1397071.2、AD-1397072.1、AD-1397072.2、AD-1397073.1、AD-1397073.2、AD-1397074.1、AD-1397074.2、AD-1397075.1、AD-1397075.2、AD-1397076.1、AD-1397076.2、AD-1397077.1、AD-1397077.2、AD-1397078.1、AD-1397078.2、AD-1397250.1、AD-1397251.1、AD-1397252.1、AD-1397253.1、AD-1397254.1、AD-1397255.1、AD-1397256.1、AD-1397257.1、AD-1397258.1、AD-1397259.1、AD-1397260.1、AD-1397261.1、AD-1397262.1、AD-1397263.1、AD-1397264.1、AD-1397265.1、AD-1423242.1、AD-1423243.1、AD-1423244.1、AD-1423245.1、AD-1423246.1、AD-1423247.1、AD-1423248.1、AD-1423249.1、AD-1423250.1、AD-1423251.1、AD-1423252.1、AD-1423253.1、AD-1423254.1、AD-1423255.1、AD-1423256.1、AD-1423257.1、AD-1423258.1、AD-1423259.1、AD-1423260.1、AD-1423261.1、AD-1423262.1、AD-1423263.1、AD-1423264.1、AD-1423265.1、AD-1423266.1、AD-1423267.1、AD-1423268.1、AD-1423269.1、AD-1423270.1、AD-1423271.1、AD-1423272.1、AD-1423273.1、AD-1423274.1、AD-1423275.1、AD-1423276.1、AD-1423277.1、AD-1423278.1、AD-1423279.1、AD-1423280.1、AD-1423281.1、AD-1423282.1、AD-1423283.1、AD-1423284.1、AD-1423285.1、AD-1423286.1、AD-1423287.1、AD-1423288.1、AD-1423289.1、AD-1423290.1、AD-1423291.1、AD-1423292.1、AD-1423293.1、AD-1423294.1、AD-1423295.1、AD-1423296.1、AD-1423297.1、AD-1423298.1、AD-1423299.1、AD-1423300.1、AD-1397266.1、AD-1397266.2、AD-1397267.1、AD-1423301.1、AD-1397268.1、AD-1397268.2、AD-1397269.1、AD-1423302.1、AD-1397270.1、AD-1397270.2、AD-1397271.1、AD-1397271.2、AD-1397272.1、AD-1423303.1、AD-1397273.1、AD-1423304.1、AD-1397274.1、AD-1423305.1、AD-1397275.1、AD-1423306.1、AD-1397276.1、AD-1397277.1、AD-1397277.2、AD-1397278.1、AD-1397279.1、AD-1397280.1、AD-1397281.1、AD-1397282.1、AD-1397283.1、AD-1397284.1、AD-1397285.1、AD-1397286.1、AD-1397287.1、AD-1397079.1、AD-1397079.2、AD-1397288.1、AD-1397289.1、AD-1397290.1、AD-1397080.1、AD-1397080.2、AD-1397291.1、AD-1397292.1、AD-1397293.1、AD-1397294.1、AD-1397081.1、AD-1397081.2、AD-1397295.1、AD-1397082.1、AD-1397082.2、AD-1397083.1、AD-1397083.2、AD-1397296.1、AD-1397297.1、AD-1397298.1、AD-1397299.1、AD-1397300.1、AD-1397301.1、AD-1397302.1、AD-1397084.1、AD-1397085.1、AD-1397086.1、AD-1397303.1、AD-1397087.1、AD-1397087.2、AD-1397304.1、AD-1397305.1、AD-1397306.1、AD-1397307.1、AD-1397308.1、AD-1397309.1、AD-1397310.1、AD-1397311.1、AD-1397312.1、AD-1397313.1、AD-1397314.1、AD-1397315.1、AD-1397316.1、AD-1397317.1、AD-1397318.1、AD-1397319.1、AD-1397320.1、AD-1397321.1、AD-1397322.1、AD-1397088.1、AD-1397089.1、AD-1397090.1、AD-1397091.1、AD-1397092.1、AD-1397093.1、AD-1397094.1、AD-1397095.1、AD-1397096.1、AD-1397097.1、AD-1397098.1、AD-1397099.1、AD-1397101.1、AD-1397102.1、AD-1397103.1、AD-1397104.1、AD-1397105.1、AD-1397106.1、AD-1397107.1、AD-1397108.1、AD-1397109.1、AD-1397110.1、AD-1397111.1、AD-1397112.1、AD-1397113.1、AD-1397114.1、AD-1397115.1、AD-1397116.1、AD-1397117.1、AD-1397118.1、AD-1397119.1、AD-1397120.1、AD-1397121.1、AD-1397122.1、AD-1397123.1、AD-1397124.1、AD-1397125.1、AD-1397126.1、AD-1397127.1、AD-1397128.1、AD-1397129.1、AD-1397130.1、AD-1397131.1、AD-1397132.1、AD-1397133.1、AD-1397134.1、AD-1397135.1、AD-1397136.1、AD-1397137.1、AD-1397138.1、AD-1397139.1、AD-1397140.1、AD-1397141.1、AD-1397142.1、AD-1397143.1、AD-1397144.1、AD-1397145.1、AD-1397146.1、AD-1397147.1、AD-1397148.1、AD-1397149.1、AD-1397150.1、AD-1397151.1、AD-1397152.1、AD-1397153.1、AD-1397154.1、AD-1397155.1、AD-1397156.1、AD-1397157.1、AD-1397158.1、AD-1397159.1、AD-1397160.1、AD-1397161.1、AD-1397162.1、AD-1397163.1、AD-1397164.1、AD-1397165.1、AD-1397166.1、AD-1397167.1、AD-1397168.1、AD-1397169.1、AD-1397170.1、AD-1397171.1、AD-1397172.1、AD-1397173.1、AD-1397174.1、AD-1397175.1、AD-1397176.1、AD-1397177.1、AD-1397178.1、AD-1397179.1、AD-1397180.1、AD-1397181.1、AD-1397182.1、AD-1397183.1、AD-1397184.1、AD-1397185.1、AD-1397186.1、AD-1397187.1、AD-1397188.1、AD-1397189.1、AD-1397190.1、AD-1397191.1、AD-1397192.1、AD-1397193.1、AD-1397194.1、AD-1397195.1、AD-1397196.1、AD-1397197.1、AD-1397198.1、AD-1397199.1、AD-1397200.1、AD-1397201.1、AD-1397202.1、AD-1397203.1、AD-1397204.1、AD-1397205.1、AD-1397206.1、AD-1397207.1、AD-1397208.1、AD-1397209.1、AD-1397210.1、AD-1397211.1、AD-1397212.1、AD-1397213.1、AD-1397214.1、AD-1397215.1、AD-1397216.1、AD-1397217.1、AD-1397218.1、AD-1397219.1、AD-1397220.1、AD-1397221.1、AD-1397222.1、AD-1397223.1、AD-1397224.1、AD-1397225.1、AD-1397226.1、AD-1397227.1、AD-1397228.1、AD-1397229.1、AD-1397230.1、AD-1397231.1、AD-1397232.1、AD-1397233.1、AD-1397234.1、AD-1397235.1、AD-1397236.1、AD-1397237.1、AD-1397238.1、AD-1397239.1、AD-1397240.1、AD-1397241.1、AD-1397242.1、AD-1397243.1、AD-1397244.1、AD-1397245.1、AD-1397246.1、AD-1397247.1、AD-1397248.1、AD-1397249.1、AD-523565.1、AD-1397072.3、AD-1397073.3、AD-1397076.3、AD-1397077.3、AD-1397078.3、AD-1397252.2、AD-1397257.2、AD-1397258.2、AD-1397259.2、AD-1397263.2、AD-1397264.2、AD-1397309.2、AD-64958.114、AD-393758.4、AD-1397080.3、AD-1397293.2、AD-1397294.2、AD-1397081.3、AD-1397083.3、AD-1397298.2、AD-1397299.2、AD-
1397084.2、AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2、AD-1397088.2、AD-1566238、AD-1566239、AD-1566240、AD-1566241、AD-1566242、AD-1566243、AD-1566244、AD-1566245、AD-1566246、AD-1091965、AD-1566248、AD-1566249、AD-1566250、AD-1091966、AD-1566251、AD-1566252、AD-1566253、AD-1566254、AD-1566255、AD-1566256、AD-1566257、AD-1566258、AD-1566259、AD-692906、AD-1566575、AD-1566576、AD-1566577、AD-1566580、AD-1566581、AD-1566582、AD-1566583、AD-1566584、AD-1566586、AD-1566587、AD-1566588、AD-1566590、AD-1566591、AD-1566634、AD-1566635、AD-1566638、AD-1566639、AD-1566641、AD-1566642、AD-1566643、AD-1566679、AD-1566861、AD-1567153、AD-1567154、AD-1567157、AD-1567159、AD-1567160、AD-1567161、AD-1567164、AD-1567167、AD-1567199、AD-1567202、AD-1567550、AD-1567554、AD-1567784、AD-1567896、AD-1567897、AD-1568105、AD-1568108、AD-1568109、AD-1568139、AD-1568140、AD-1568143、AD-1568144、AD-1568148、AD-1568150、AD-1568151、AD-1568152、AD-1568153、AD-1568154、AD-1568158、AD-1568161、AD-1568172、AD-1568174、AD-1568175、AD-692908、AD-1568176、AD-1569830、AD-1569832、AD-1569834、AD-1569835、AD-1569862、AD-1569872、AD-1569890およびAD-1569892からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
1397084.2、AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2、AD-1397088.2、AD-1566238、AD-1566239、AD-1566240、AD-1566241、AD-1566242、AD-1566243、AD-1566244、AD-1566245、AD-1566246、AD-1091965、AD-1566248、AD-1566249、AD-1566250、AD-1091966、AD-1566251、AD-1566252、AD-1566253、AD-1566254、AD-1566255、AD-1566256、AD-1566257、AD-1566258、AD-1566259、AD-692906、AD-1566575、AD-1566576、AD-1566577、AD-1566580、AD-1566581、AD-1566582、AD-1566583、AD-1566584、AD-1566586、AD-1566587、AD-1566588、AD-1566590、AD-1566591、AD-1566634、AD-1566635、AD-1566638、AD-1566639、AD-1566641、AD-1566642、AD-1566643、AD-1566679、AD-1566861、AD-1567153、AD-1567154、AD-1567157、AD-1567159、AD-1567160、AD-1567161、AD-1567164、AD-1567167、AD-1567199、AD-1567202、AD-1567550、AD-1567554、AD-1567784、AD-1567896、AD-1567897、AD-1568105、AD-1568108、AD-1568109、AD-1568139、AD-1568140、AD-1568143、AD-1568144、AD-1568148、AD-1568150、AD-1568151、AD-1568152、AD-1568153、AD-1568154、AD-1568158、AD-1568161、AD-1568172、AD-1568174、AD-1568175、AD-692908、AD-1568176、AD-1569830、AD-1569832、AD-1569834、AD-1569835、AD-1569862、AD-1569872、AD-1569890およびAD-1569892からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、AD-523796.1、AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、AD-535864.1、AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1、およびAD-526993.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1およびAD-523796.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本発明は、MAPTの発現を阻害するためのdsRNA剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、表12~13のいずれか1つに記載のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤を提供する。
一実施形態において、センス鎖は、配列番号5のヌクレオチド1065~1085、1195~1215、1066~1086、1068~1088、705~725、1067~1087、4520~4540、3341~3361、4515~4535、5284~5304、5285~5305、344~364、5283~5303、5354~5374、2459~2479、1061~1081、706~726、972~992、4564~4584、995~1015、4546~4566、968~988、1127~1147、4534~4554、158~178、4494~4514、1691~1711、3544~3564、198~218、979~999、4548~4568、4551~4571、543~563、715~735、542~562、352~372、362~382、4556~4576、4547~4567、4542~4562、4558~4578、4549~4569、5074~5094、4552~4572、5073~5093、5076~5096、4550~4570および2753~2773のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号6の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、AD-393758.1、AD-393888.1、AD-393759.1、AD-393761.1、AD-393495.1、AD-393760.1、AD-396425.1、AD-395441.1、AD-396420.1、AD-397103.1、AD-397104.1、AD-393239.1、AD-397102.1、AD-397167.1、AD-394791.1、AD-393754.1、AD-393496.1、AD-393667.1、AD-396467.1、AD-393690.1、AD-396449.1、AD-393663.1、AD-393820.1、AD-396437.1、AD-393084.1、AD-396401.1、AD-394296.1、AD-395574.1、AD-393124.1、AD-393674.1、AD-396451.1、AD-396454.1、AD-393376.1、AD-393505.1、AD-393375.1、AD-393247.1、AD-393257.1、AD-396459.1、AD-396450.1、AD-396445.1、AD-396461.1、AD-396452.1、AD-396913.1、AD-396455.1、AD-396912.1、AD-396915.1、AD-396453.1およびAD-394991.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。
一実施形態において、センス鎖のヌクレオチド配列は、配列番号1533において説明されるMAPT遺伝子エクソン10のセンス鎖配列に対応する少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖はそれに対して相補的な配列を含む。
一実施形態において、dsRNAに対する実質的に相補的な配列は、別々のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、dsRNAに対する実質的に相補的な配列は、単一のオリゴヌクレオチドに含まれる。
表6~8、13、17、19、21、23、26および28における配列は、修飾配列またはコンジュゲートされた配列として説明されるが、本開示のRNAi剤のRNA、例えば、本開示のdsRNAは、修飾されていない、コンジュゲートされていない、または説明されるものとは異なって修飾もしくはコンジュゲートされている、表3~8、12、13、および16~28のいずれか1つにおいて説明される配列のいずれか1つを含み得ることは理解されよう。例えば、本発明の薬剤のセンス鎖は、GalNAcリガンドにコンジュゲートされてもよいが、これらの薬剤は、デリバリーをCNSに誘導する部分、例えば、本明細書に記載されるようなC16リガンドにコンジュゲートされてもよい。一実施形態において、この親油性部分は、飽和または不飽和C16炭化水素鎖(例えば、線状C16アルキルまたはアルケニル)を含有する。親油性リガンドは、本願に提供される位置のいずれに含まれてもよい。一部の実施形態において、親油性部分は、二本鎖iRNA剤の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートされる。例えば、C16リガンドは、以下の構造に示されるようにリボヌクレオチドの2’-酸素を介してコンジュゲートされてもよい。
一部の実施形態において、二本鎖iRNA剤は、アンチセンス鎖の5’端にリン酸またはリン酸ミミックをさらに含む。一実施形態において、リン酸ミミックは、5’-ビニルホスホネート(VP)である。一部の実施形態において、二本鎖iRNA剤のアンチセンス鎖の5’端は、5’-ビニルホスホネート(VP)を含有しない。
当業者は、約20から23塩基対、例えば、21塩基対の二重鎖構造を有するdsRNAは、RNA干渉の導入において特に有効であるとして歓迎されていることを十分に意識している[Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888]。しかしながら、他のものは、より短いまたはより長いRNA二重鎖構造も有効であり得ることを分かっている[Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226]。上記において説明した実施形態において、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書において説明されるdsRNAは、最小21ヌクレオチド長さの少なくとも1つの鎖を含むことができる。片端または両端のいくつかのヌクレオチドを差し引いたより短い二重鎖は、上記において説明されるdsRNAと比較して、同様に有効であり得ることは、合理的に予想することができる。したがって、本明細書に提供される配列の1つに由来する少なくとも15、16、17、18、19、20個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドの配列を有するdsRNAであって、本明細書の実施例に提供されるような、例えばA549細胞および10nMの濃度のRNA剤を用いたインビトロ(in vitro)アッセイならびにPCRアッセイを使用したときに、MAPT遺伝子の発現を対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%阻害するそれらの能力が、全長配列を含むdsRNAとは異なるdsRNAは、本開示の範囲内であることが企図される。一部の実施形態において、全長配列を含むdsRNAからの阻害は、一次マウス肝細胞を用いたインビトロアッセイを使用して測定した。
加えて、本明細書において説明されるRNAは、RISC媒介切断を受けやすいMAPT転写物の部位を特定する。そのため、本開示は、この部位内を標的化するRNAi剤をさらに特徴とする。本明細書において使用される場合、RNAi剤は、特定の部位内のいずれかにおける転写物の切断を促進する場合、RNA転写物の特定の部位内を標的化すると言われる。そのようなRNAi剤は、概して、MAPT遺伝子における選択された配列に隣接する領域から取られた追加のヌクレオチド配列にカップリングした本明細書において提供される配列の1つから、少なくとも約15のヌクレオチド、好ましくは少なくとも19のヌクレオチドを含むであろう。
III.本開示の修飾されたRNAi剤
一実施形態において、本開示のRNAi剤のRNA、例えば、dsRNAは、未修飾であり、例えば、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。好ましい実施形態において、本開示のRNAi剤のRNA、例えば、dsRNAは、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学修飾される。本開示のある特定の実施形態において、本開示のRNAi剤のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本開示の他の実施形態において、本開示のRNAi剤のヌクレオチドの全てが修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本開示のRNAi剤は、全体的にではないが大部分が修飾され、5、4、3、2または未修飾ヌクレオチドを含み得る。本開示のさらに他の実施形態において、本開示のRNAi剤は、5、4、3、2または1つの修飾されたヌクレオチドを含み得る。
一実施形態において、本開示のRNAi剤のRNA、例えば、dsRNAは、未修飾であり、例えば、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される化学修飾またはコンジュゲーションを含まない。好ましい実施形態において、本開示のRNAi剤のRNA、例えば、dsRNAは、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学修飾される。本開示のある特定の実施形態において、本開示のRNAi剤のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本開示の他の実施形態において、本開示のRNAi剤のヌクレオチドの全てが修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本開示のRNAi剤は、全体的にではないが大部分が修飾され、5、4、3、2または未修飾ヌクレオチドを含み得る。本開示のさらに他の実施形態において、本開示のRNAi剤は、5、4、3、2または1つの修飾されたヌクレオチドを含み得る。
本開示において特徴とされる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる"Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されるものによって合成または修飾できる。修飾には、例えば、末端修飾、例えば、5’端修飾(リン酸化、コンジュゲーション、逆連結)または3’端修飾(コンジュゲーション、DNAヌクレオチド、逆連結など)、塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基もしくは拡大されたレパートリーのパートナーと塩基対形成する塩基との置き換え、塩基の除去(脱塩基ヌクレオチド)またはコンジュゲートされた塩基、糖修飾(例えば、2’位置または4’位置での)もしくは糖の置き換え、またはホスホジエステル結合の修飾もしくは置き換えを含む骨格修飾が含まれる。本明細書に記載される実施形態において有用なRNAi剤の具体例として、それだけには限らないが、修飾された骨格を含有する、または天然ヌクレオシド間連結を含有しないRNAが挙げられる。修飾された骨格を有するRNAとして、中でも、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、時には、当技術分野で言及されるように、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾されたRNAもまた、オリゴヌクレオシドであると考えることができる。一部の実施形態において、修飾されたRNAi剤は、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
修飾されたRNA骨格として、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートならびに3’-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステルおよび通常の3’-5’連結を有するボラノホスフェート、2’-5’連結されたこれらの類似体およびヌクレオシド単位の隣接する対が、3’-5’から5’-3’または2’-5’から5’-2’に連結される逆極性を有するものが挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。本発明の一部の実施形態において、本発明のdsRNA剤は、遊離酸形態である。本発明の他の実施形態において、本発明のdsRNA剤は、塩形態である。一実施形態において、本発明のdsRNA剤は、ナトリウム塩形態である。ある特定の実施形態において、本発明のdsRNA剤がナトリウム塩形態である場合には、ナトリウムイオンが、薬剤中に存在するホスホジエステルおよび/またはホスホロチオエート(phosphorothiotate)基の実質的に全てに対する対イオンとして薬剤中に存在する。ホスホジエステルおよび/またはホスホロチオエート連結の実質的に全てがナトリウム対イオンを有する薬剤は、5、4、3、2または1つ以下の、ナトリウム対イオンを有さないホスホジエステルおよび/またはホスホロチオエート連結を含む。一部の実施形態において、本発明のdsRNA剤がナトリウム塩形態である場合は、ナトリウムイオンは、薬剤中に存在するホスホジエステルおよび/またはホスホロチオエート(phosphorothiotate)基の全ての対イオンとして存在する。
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第3,687,808号、同4,469,863号、同4,476,301号、同5,023,243号、同5,177,195号、同5,188,897号、同5,264,423号、同5,276,019号、同5,278,302号、同5,286,717号、同5,321,131号、同5,399,676号、同5,405,939号、同5,453,496号、同5,455,233号、同5,466,677号、同5,476,925号、同5,519,126号、同5,536,821号、同5,541,316号、同5,550,111号、同5,563,253号、同5,571,799号、同5,587,361号、同5,625,050号、同6,028,188号、同6,124,445号、同6,160,109号、同6,169,170号、同6,172,209号、同6,239,265号、同6,277,603号、同6,326,199号、同6,346,614号、同6,444,423号、同6,531,590号、同6,534,639号、同6,608,035号、同6,683,167号、同6,858,715号、同6,867,294号、同6,878,805号、同7,015,315号、同7,041,816号、同7,273,933号、同7,321,029号および米国再発行特許第RE39464号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
中にリン原子を含まない修飾されたRNA骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結または1つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとして、モルホリノ連結(幾分かはヌクレオシドの糖部分から形成される)、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するものならびに混合N、O、SおよびCH2構成成分部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第5,034,506号、同5,166,315号、同5,185,444号、同5,214,134号、同5,216,141号、同5,235,033号、同5,64,562号、同5,264,564号、同5,405,938号、同5,434,257号、同5,466,677号、同5,470,967号、同5,489,677号、同5,541,307号、同5,561,225号、同5,596,086号、同5,602,240号、同5,608,046号、同5,610,289号、同5,618,704号、同5,623,070号、同5,663,312号、同5,633,360号、同5,677,437号および同5,677,439号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態において、RNAi剤での使用に適したRNAミメティックが企図され、このRNAミメティックでは、ヌクレオチド単位の糖とヌクレオシド間連結の両方、すなわち骨格が代替の基で置き換えられている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。1つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているRNAミメティックは、ペプチド核酸(PNA)と呼ばれる。PNA化合物では、RNAの糖骨格は、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格と置き換えられている。核酸塩基は、保持され、直接的または間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合される。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第5,539,082号、同5,714,331号および同5,719,262号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示のRNAi剤において使用するために適したさらなるPNA化合物は、例えば、Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500に記載されている。
本開示において特徴とされるいくつかの実施形態には、ホスホロチオエート骨格を有するRNAおよびヘテロ原子骨格、特に、上記で参照された米国特許第5,489,677号の--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[メチレン(メチルイミノ)またはMMI骨格として知られる]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--および--N(CH3)--CH2--[天然のホスホジエステル骨格は、--O--P--O--CH2--として表される]および上記で参照された米国特許第5,602,240号のアミド骨格を有するオリゴヌクレオシドが含まれる。一部の実施形態において、本明細書において特徴とされるRNAは、上記で参照されたUS5,034,506のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾されたRNAはまた、1つまたは複数の置換された糖部分を含有し得る。本明細書において特徴とされるRNAi剤、例えば、dsRNAは、2’位置に以下:OH;F;O-、S-もしくはN-アルキル;O-、S-もしくはN-アルケニル;O-、S-もしくはN-アルキニルまたはO-アルキル-O-アルキルのうち1つを含む場合があり、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換C1~C10アルキルまたはC2~C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適した修飾として、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2が挙げられ、式中、nおよびmは、1~約10である。他の実施形態において、dsRNAは、2’位置に以下:C1~C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルまたはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、干渉物質、RNAi剤の薬物動態特性を改善するための基またはRNAi剤の薬動力学特性を改善するための基および同様の特性を有する他の置換基のうち1つを含む。一部の実施形態において、修飾は、2’-メトキシエトキシ(2’-O-(2-メトキシエチル)または2’-MOEとしても知られる2’-O--CH2CH2OCH3)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)、すなわち、アルコキシ-アルコキシ基を含む。別の例示的修飾として、2’-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書において以下に実施例において記載されるような2’-DMAOEとしても知られるO(CH2)2ON(CH3)2基および2’-ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’-O-ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’-DMAEOEとしても当技術分野で公知の)、すなわち、2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2がある。さらなる例示的修飾として、5’-Me-2’-Fヌクレオチド、5’-Me-2’-OMeヌクレオチド、5’-Me-2’-デオキシヌクレオチド(これら3つのファミリー中のRおよびS異性体の両方)、2’-アルコキシアルキルおよび2’-NMA(N-メチルアセトアミド)が挙げられる。
他の修飾として、2’-メトキシ(2’-OCH3)、2’-アミノプロポキシ(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-O-ヘキサデシルおよび2’-フルオロ(2’-F)が挙げられる。同様の修飾はまた、RNAi剤のRNA上の他の位置、特に、3’末端ヌクレオチド上または2’-5’連結dsRNA中の糖の3’位置および5’末端ヌクレオチドの5’位置でも行うことができる。RNAi剤はまた、糖ミメティック、例えば、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第4,981,957号、同5,118,800号、同5,319,080号、同5,359,044号、同5,393,878号、同5,446,137号、同5,466,786号、同5,514,785号、同5,519,134号、同5,567,811号、同5,576,427号、同5,591,722号、同5,597,909号、同5,610,300号、同5,627,053号、同5,639,873号、同5,646,265号、同5,658,873号、同5,670,633号および同5,700,920号が挙げられ、それらのうちある特定のものは、本出願と共同所有されている。前記のものの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のRNAi剤はまた、核酸塩基(当技術分野では簡単に「塩基」と呼ばれることも多い)修飾または置換を含み得る。本明細書において使用される場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、ピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が含まれる。修飾された核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシルおよび(anal)他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に、5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニン(daazaadenine)ならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンが含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されるもの、Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008において開示されるもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990において開示されるもの、Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613によって開示されるものおよびSanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993によって開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちある特定のものは、本開示において特徴とされるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するために特に有用である。これらには、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6および0-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6~1.2℃だけ増大するとわかっており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、さらにより詳しくは、2’-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に例示的塩基置換である。
上記の修飾された核酸塩基ならびに他の修飾された核酸塩基のある特定のものの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、上記の米国特許第3,687,808号、同4,845,205号、同5,130,30号、同5,134,066号、同5,175,273号、同5,367,066号、同5,432,272号、同5,457,187号、同5,459,255号、同5,484,908号、同5,502,177号、同5,525,711号、同5,552,540号、同5,587,469号、同5,594,121号、同5,596,091号、同5,614,617号、同5,681,941号、同5,750,692号、同6,015,886号、同6,147,200号、同6,166,197号、同6,222,025号、同6,235,887号、同6,380,368号、同6,528,640号、同6,639,062号、同6,617,438号、同7,045,610号、同7,427,672号および同7,495,088号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のRNAi剤をまた、1つまたは複数のロックド核酸(LNA)を含むように修飾できる。ロックド核酸は、リボース部分が2’および4’炭素を接続する追加の架橋を含む、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、リボースを3’-エンド構造立体配座に効率的に「ロックする」。siRNAへのロックド核酸の付加は、血清におけるsiRNA安定性を増大し、オフターゲット効果を低減するとわかっている[Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447、Mook, OR. et al., (2007) Mol anc Ther 6(3):833-843、Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193]。
本開示のRNAi剤をまた、1つまたは複数の二環式糖部分を含むように修飾できる。「二環式糖」は、2つの原子を架橋することによって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」(「BNA」)は、糖環の2つの炭素原子を接続し、それによって二環式環構造を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。ある特定の実施形態において、架橋は、糖環の4’-炭素と2’-炭素を接続する。したがって、一部の実施形態において、本開示の薬剤は、1つまたは複数のロックド核酸(LNA)を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が2’および4’炭素を接続する追加の架橋を含む、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドである。言い換えれば、LNAは、4’-CH2-O-2’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを3’-エンド構造立体配座に効率的に「ロックする」。siRNAへのロックド核酸の付加は、血清におけるsiRNA安定性を増大し、オフターゲット効果を低減するとわかっている[Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447、Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843、Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193]。本開示のポリヌクレオチドにおいて使用するための二環式ヌクレオシドの例として、制限するものではないが、4’と2’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。ある特定の実施形態において、本開示のアンチセンスポリヌクレオチド剤として、4’から2’への架橋を含む1つまたは複数の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような4’から2’へ架橋された二環式ヌクレオシドの例として、それだけには限らないが、4’-(CH2)-O-2’(LNA)、4’-(CH2)-S-2’、4’-(CH2)2-O-2’(ENA)、4’-CH(CH3)-O-2’(「拘束エチル」または「cEt」とも呼ばれる)および4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(およびその類似体、例えば、米国特許第7,399,845号を参照されたい)、4’-C(CH3)(CH3)-O-2’(およびその類似体、例えば、米国特許第8,278,283号を参照されたい)、4’-CH2-N(OCH3)-2’(およびその類似体、例えば、米国特許第8,278,425号を参照されたい)、4’-CH2-O-N(CH3)-2’(例えば、米国特許公開第2004/0171570号を参照されたい)、4’-CH2-N(R)-O-2’(式中、Rは、H、C1~C12アルキルまたは保護基である)(例えば、米国特許第7,427,672号を参照されたい)、4’-CH2-C(H)(CH3)-2’(例えば、Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134を参照されたい)および4’-CH2-C(-CH2)-2’(およびその類似体、例えば、米国特許第8,278,426号を参照されたい)が挙げられる。前記の各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許公開として、それだけには限らないが、以下:米国特許第6,268,490号、同6,525,191号、同6,670,461号、同6,770,748号、同6,794,499号、同6,998,484号、同7,053,207号、同7,034,133号、同7,084,125号、同7,399,845号、同7,427,672号、同7,569,686号、同7,741,457号、同8,022,193号、同8,030,467号、同8,278,425号、同8,278,426号、同8,278,283号、US2008/0039618およびUS2009/0012281が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、α-L-リボフラノースおよびβ-D-リボフラノースを含む1つまたは複数の立体化学的糖立体配置を有する前記の二環式ヌクレオシドのいずれも、調製できる(WO99/14226を参照されたい)。
本開示のRNAi剤をまた、1または複数の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾できる。本明細書において使用される場合、「拘束エチルヌクレオチド」または「cEt」は、4’-CH(CH3)-0~2’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、S立体配座にあり、本明細書において「S-cEt」と呼ばれる。
本開示のRNAi剤はまた、1つまたは複数の「立体配座制限ヌクレオチド」(「CRN」)を含み得る。CRNは、リボースのC2’とC4’炭素を、またはリボースのC3と-C5’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。CRNは、リボース環を安定な立体配座にロックし、mRNAに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性のために最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環パッカリングを少なくなる。
上記のCRNのある特定のものの調製を教示する代表的な刊行物として、それだけには限らないが、US2013/0190383およびWO2013/036868が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本開示のRNAi剤は、UNA(非ロックド核酸)ヌクレオチドである1つまたは複数のモノマーを含む。UNAは、非ロックド非環式核酸であり、糖の結合のいずれも除去されており、非ロックド「糖」残基を形成する。一例では、UNAはまた、C1’-C4’の間の結合(すなわち、C1’とC4’炭素の間の共有結合の炭素-酸素-炭素結合)が除去されているモノマーも包含する。別の例では、糖のC2’-C3’結合(すなわち、C2’とC3’炭素の間の共有結合の炭素-炭素結合)が除去されている[参照により本明細書に組み込まれる、Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)およびFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたい]。
UNAの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、それだけには限らないが、US8,314,227および米国特許公開第2013/0096289号、同2013/0011922号および同2011/0313020号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のRNAi剤は、1つまたは複数の「シクロヘキセン核酸」または(「CeNA」)も含んでもよい。CeNAは、DNAのフラノース部分がシクロヘキセン環に置き換えられたヌクレオチド類似体である。DNA鎖にシクロヘキセニルヌクレオシドを組み込むと、DNA/RNAハイブリッドの安定性が増大する。CeNAは血清中での分解に対して安定であり、CeNA/RNAハイブリッドは、大腸菌(E.Coli)RNase Hを活性化し、それによってRNA鎖を切断することができる。(参照により本明細書に組み込まれる、Wang et al., Am. Chem. Soc. 2000, 122, 36, 8595-8602を参照されたい)。
RNA分子の末端への潜在的に安定化する修飾として、N-(アセチルアミノカプロイル)-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-C6-NHAc)、N-(カプロイル-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-C6)、N-(アセチル-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-NHAc)、チミジン-2’-0-デオキシチミジン(エーテル)、N-(アミノカプロイル)-4-ヒドロキシプロリノール(Hyp-C6-アミノ)、2-ドコサノイル-ウリジン-3”-ホスフェート、逆塩基dT(idT)および他のものを挙げることができる。この修飾の開示内容は、WO2011/005861に見出すことができる。
本開示のRNAi剤の他の修飾として、5’ホスフェートまたは5’ホスフェートミミック、例えば、RNAi剤のアンチセンス鎖上の5’末端ホスフェートまたはホスフェートミミックが挙げられる。適したホスフェートミミックは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるUS2012/0157511に開示されている。
A.本開示のモチーフを含む修飾されたRNAi剤
本開示のある特定の態様では、本開示の二本鎖RNAi剤は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2013/075035において開示されるような化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書に、およびWO2013/075035において示されるように、3連続ヌクレオチド上の3つの同一修飾の1つまたは複数のモチーフを、切断部位でまたはその付近でRNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖中に導入することによって優れた結果を得ることができる。一部の実施形態において、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうでなければ完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入は、存在する場合にはセンスまたはアンチセンス鎖の修飾パターンを妨げる。RNAi剤を、親油性リガンド、例えば、センス鎖上の例えば、C16リガンドとコンジュゲートしてもよい。RNAi剤を、例えば、アンチセンス鎖の1つまたは複数の残基で(S)-グリコール核酸(GNA)修飾で修飾してもよい。得られたRNAi剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
本開示のある特定の態様では、本開示の二本鎖RNAi剤は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2013/075035において開示されるような化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書に、およびWO2013/075035において示されるように、3連続ヌクレオチド上の3つの同一修飾の1つまたは複数のモチーフを、切断部位でまたはその付近でRNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖中に導入することによって優れた結果を得ることができる。一部の実施形態において、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうでなければ完全に修飾され得る。これらのモチーフの導入は、存在する場合にはセンスまたはアンチセンス鎖の修飾パターンを妨げる。RNAi剤を、親油性リガンド、例えば、センス鎖上の例えば、C16リガンドとコンジュゲートしてもよい。RNAi剤を、例えば、アンチセンス鎖の1つまたは複数の残基で(S)-グリコール核酸(GNA)修飾で修飾してもよい。得られたRNAi剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
したがって、本開示は、インビボで標的遺伝子(すなわち、MAPT遺伝子)の発現を阻害可能な二本鎖RNAi剤を提供する。RNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。RNAi剤の各鎖は、15~30ヌクレオチド長であり得る。例えば、各鎖は、16~30ヌクレオチド長、17~30ヌクレオチド長、25~30ヌクレオチド長、27~30ヌクレオチド長、17~23ヌクレオチド長、17~21ヌクレオチド長、17~19ヌクレオチド長、19~25ヌクレオチド長、19~23ヌクレオチド長、19~21ヌクレオチド長、21~25ヌクレオチド長または21~23ヌクレオチド長であり得る。ある特定の実施形態において、各鎖は、19~23ヌクレオチド長である。
センス鎖およびアンチセンス鎖は通常、「RNAi剤」とも本明細書において呼ばれる二重鎖の二本鎖RNA(「dsRNA」)を形成する。RNAi剤の二重鎖領域は、15~30ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二重鎖領域は、16~30ヌクレオチド対の長さ、17~30ヌクレオチド対の長さ、27~30ヌクレオチド対の長さ、17~23ヌクレオチド対の長さ、17~21ヌクレオチド対の長さ、17~19ヌクレオチド対の長さ、19~25ヌクレオチド対の長さ、19~23ヌクレオチド対の長さ、19~21ヌクレオチド対の長さ、21~25ヌクレオチド対の長さまたは21~23ヌクレオチド対の長さであり得る。別の例では、二重鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26および27ヌクレオチド長から選択される。好ましい実施形態において、二重鎖領域は、19~21ヌクレオチド対の長さである。
一実施形態において、RNAi剤は、一方または両方の鎖の3’端、5’端または両端に1つまたは複数のオーバーハング領域またはキャッピング基を含有し得る。オーバーハングは、1~6ヌクレオチド長、例えば、2~6ヌクレオチド長、1~5ヌクレオチド長、2~5ヌクレオチド長、1~4ヌクレオチド長、2~4ヌクレオチド長、1~3ヌクレオチド長、2~3ヌクレオチド長または1~2ヌクレオチド長であり得る。好ましい実施形態において、ヌクレオチドオーバーハング領域は、2ヌクレオチド長である。オーバーハングは、一方の鎖が他方よりも長い結果または同一の長さの2つの鎖がねじれ形である結果であり得る。オーバーハングは、標的mRNAとミスマッチを形成し得る、または標的化される遺伝子配列と相補的であり得る、または別の配列であり得る。また、第1のおよび第2の鎖を、例えば、ヘアピンを形成する追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによってつなぐこともできる。
一実施形態において、RNAi剤のオーバーハング領域中のヌクレオチドは各々独立に、2’-糖修飾された、例えば、2-F、2’-O-メチル、チミジン(T)およびそれらの任意の組合せを含むがそれに限定されるわけではない、修飾されたまたは未修飾のヌクレオチドであり得る。
例えば、TTは、いずれかの鎖上のいずれかの末端のオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的mRNAとミスマッチを形成し得る、または標的化される遺伝子配列と相補的であり得る、または別の配列であり得る。
RNAi剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の5’-または3’-オーバーハングは、リン酸化され得る。一部の実施形態において、オーバーハング領域(複数可)は、2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する2つのヌクレオチドを含有し、2つのヌクレオチドは、同一である場合も、異なる場合もある。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖の3’端に存在する。一実施形態において、この3’-オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態において、この3’-オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
RNAi剤は、その安定性全体に影響を及ぼすことなくRNAiの干渉活性を強化できる単一のオーバーハングのみを含有し得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の3’末端に、あるいは、アンチセンス鎖の3’末端に位置し得る。RNAiはまた、アンチセンス鎖の5’端(またはセンス鎖の3’端)に位置する平滑末端を有し得る、または逆も同じである。一般に、RNAiのアンチセンス鎖は、3’端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5’端は平滑である。理論に捉われようとは思わないが、非対称のアンチセンス鎖の5’端の平滑末端およびアンチセンス鎖の3’端オーバーハングは、RISCプロセスへのガイド鎖積み込みに好都合である。
一実施形態において、RNAi剤は、両端が平滑末端化され、19ヌクレオチドの長さであり、センス鎖は、5’端から位置7、8、9の3連続ヌクレオチド上に3つの2’-F修飾を有する少なくとも1つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、5’端から位置11、12、13の3連続ヌクレオチド上に3つの2’-O-メチル修飾を有する少なくとも1つのモチーフを含有する。
別の実施形態において、RNAi剤は、両端が平滑末端化され、20ヌクレオチドの長さであり、センス鎖は、5’端から位置8、9、10の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-F修飾の少なくとも1つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、5’端から位置11、12、13の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-O-メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含有する。
さらに別の実施形態において、RNAi剤は、両端が平滑末端化され、21ヌクレオチドの長さであり、センス鎖は、5’端から位置9、10、11の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-F修飾の少なくとも1つのモチーフを含有する。アンチセンス鎖は、5’端から位置11、12、13の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-O-メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含有する。
一実施形態において、RNAi剤は、21ヌクレオチドのセンス鎖および23ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、5’端から位置9、10、11の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-F修飾の少なくとも1つのモチーフを含有し、アンチセンス鎖は、5’端から位置11、12、13の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-O-メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含有し、RNAi剤の一方の末端は、平滑であり、もう一方の末端は、2ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、2ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の3’端にある。2ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の3’端にある場合には、末端の3つのヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結がある場合があり、3つのヌクレオチドのうち2つは、オーバーハングヌクレオチドであり、3番目のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の対形成されたヌクレオチドである。一実施形態において、RNAi剤は、センス鎖の5’端およびアンチセンス鎖の5’端の両方で末端の3つのヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結をさらに有する。一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含むRNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖中のどのヌクレオチドも、修飾されたヌクレオチドである。一実施形態において、各残基は独立に、例えば、交互モチーフ中で2’-O-メチルまたは3’-フルオロで修飾されている。RNAi剤は、リガンド(例えば、親油性リガンド、適宜、C16リガンド)をさらに含んでもよい。
一実施形態において、RNAi剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、25~30ヌクレオチド残基の長さであり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖の位置1~23は、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、36~66ヌクレオチド残基の長さであり、3’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の位置1~23と対形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含んで、二本鎖を形成し、アンチセンス鎖の少なくとも3’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、最大6つの連続3’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、それによって、1~6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の5’末端は、センス鎖と対形成しない10~30の連続ヌクレオチドを含み、それによって、10~30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖5’末端および3’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のためにアラインされる場合に、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対形成される塩基であり、それによって、センスおよびアンチセンス鎖の間に実質的に二本鎖の領域を形成し、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、センス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの2’-F修飾の少なくとも1つのモチーフを含有し、モチーフのうち少なくとも1つは、切断部位でまたはその付近で生じる。アンチセンス鎖は、切断部位にまたはその付近に3連続ヌクレオチド上の3つの2’-O-メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを含有する。
一実施形態において、RNAi剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、RNAi剤は、少なくとも25かつ多くとも29ヌクレオチドである長さを有する第1の鎖と、多くとも30ヌクレオチドである長さを有し、5’端から位置11、12、13の3連続ヌクレオチド上の3つの2’-O-メチル修飾の少なくとも1つのモチーフを有する第2の鎖とを含み、第1の鎖の3’端と、第2の鎖の5’端は平滑末端を形成し、第2の鎖は、第1の鎖よりもその3’端で1~4ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも25ヌクレオチド長であり、第2の鎖は、少なくとも19ヌクレオチドの第2の鎖の長さに沿って標的mRNAと十分に相補的であり、RNAi剤が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、RNAi剤のダイサー切断は、第2の鎖の3’端を含むsiRNAを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減する。適宜、RNAi剤は、リガンドをさらに含んでもよい。
一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを含有し、モチーフのうち1つは、センス鎖中の切断部位に生じる。
一実施形態において、RNAi剤のアンチセンス鎖もまた、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを含有することができ、モチーフのうち1つは、アンチセンス鎖中の切断部位にまたはその付近に生じる。
17~23ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するRNAi剤について、アンチセンス鎖の切断部位は通常、5’端からおよそ位置10、11および12である。したがって、3つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の位置9、10、11、位置10、11、12、位置11、12、13、位置12、13、14または位置13、14、15に生じる場合がある、数はアンチセンス鎖の5’端から最初のヌクレオチドから開始する、または数はアンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドから開始する。アンチセンス鎖中の切断部位はまた、5’端からのRNAiの二重鎖領域の長さに応じて変化し得る。
RNAi剤のセンス鎖は、鎖の切断部位に3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを含有し得る、アンチセンス鎖は、鎖の切断部位にまたはその付近に3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の少なくとも1つのモチーフを有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がdsRNA二本鎖を形成する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖を、センス鎖上の3つのヌクレオチドの1つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の3つのヌクレオチドの1つのモチーフが、少なくとも1つのヌクレオチド重複を有するように、すなわち、センス鎖中のモチーフの3つのヌクレオチドの少なくとも1つが、アンチセンス鎖中のモチーフの3つのヌクレオチドの少なくとも1つと塩基対を形成するように配列できる。あるいは、少なくとも2つのヌクレオチドが重複する場合がある、または3つのヌクレオチド全てが重複する場合がある。
一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の2つ以上のモチーフを含有し得る。第1のモチーフは、鎖の切断部位にまたはその付近に生じる場合があり、他のモチーフは、ウイング修飾であり得る。本明細書において「ウイング修飾」という用語は、同一の鎖の切断部位のまたはその付近のモチーフから離れている鎖の別の部分に生じるモチーフを指す。ウイング修飾は、第1のモチーフに隣接しているか、または少なくとも1つもしくはより多くのヌクレオチドだけ離れている。モチーフが互いにすぐ隣接する場合には、モチーフの化学は、互いに別個であり、モチーフが1つまたは複数のヌクレオチドだけ離れている場合には、化学は、同一である場合も異なっている場合もある。2以上のウイング修飾が存在する場合もある。例えば、2つのウイング修飾が存在する場合には、各ウイング修飾は、切断部位にもしくはその付近にある第1のモチーフに対して1つの末端に、またはリードモチーフのいずれかの側に生じ得る。
センス鎖と同様に、RNAi剤のアンチセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の2つ以上のモチーフを含有する場合があり、モチーフの少なくとも1つは鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウイング修飾と同様の配列で1つまたは複数のウイング修飾を含有し得る。
一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は通常、鎖の3’端、5’端または両端に最初の1つまたは2つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態において、RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウイング修飾は通常、鎖の3’端、5’端または両端に二重鎖領域内の最初の1つまたは2つの対形成されるヌクレオチドを含まない。
RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が各々、少なくとも1つのウイング修飾を含有する場合には、ウイング修飾は、二重鎖領域の同一末端に入る場合があり、1、2または3つのヌクレオチドの重複を有する。
RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖が各々、少なくとも2つのウイング修飾を含有する場合には、センス鎖およびアンチセンス鎖を、1つの鎖に由来する2つの修飾が各々、二重鎖領域の1つの末端に入り、1、2または3つのヌクレオチドの重複を有し、1つの鎖に由来する2つの修飾が各々、二重鎖領域のもう一方の末端に入り、1、2または3つのヌクレオチドの重複を有し、2つの修飾1つの鎖がリードモチーフの各側に入り、二重鎖領域中に1、2または3つのヌクレオチドの重複を有するように配列できる。
一実施形態において、RNAi剤は、標的との、二本鎖内のミスマッチ(複数可)またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域中に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいてランク付けできる(例えば、特定の対形成の会合または解離の自由エネルギーで、最も簡単なアプローチは、個々の対に基づいて対を調べることであるが、次の隣接分析または同様の分析も使用できる)。解離の促進の点では:A:UはG:Cを上回って好ましく、G:UはG:Cを上回って好ましく、I:CはG:Cを上回って好ましい(I=イノシン)。ミスマッチ、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のもの(本明細書において別の場所で記載されるような)は、正準(A:T、A:U、G:C)対形成を上回って好ましく、ユニバーサル塩基を含む対形成は正準対形成を上回って好ましい。
一実施形態において、RNAi剤は、二本鎖の5’端でのアンチセンス鎖の解離を促進するために、A:U、G:U、I:Cおよびミスマッチ対、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のものまたはユニバーサル塩基を含む対形成の群から独立に選択される、アンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の1、2、3、4または5つの塩基対のうち少なくとも1つを含む。
一実施形態において、アンチセンス鎖中の5’端から二重鎖領域内の1位置のヌクレオチドは、A、dA、dU、UおよびdTからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の1、2または3つの塩基対のうち少なくとも1つは、AU塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、AU塩基対である。
別の実施形態において、センス鎖の3’端のヌクレオチドは、デオキシ-チミン(dT)である。別の実施形態において、アンチセンス鎖の3’端のヌクレオチドは、デオキシ-チミン(dT)である。一実施形態において、デオキシ-チミンヌクレオチドの短い配列、例えば、センスまたはアンチセンス鎖の3’端の2つのdTヌクレオチドがある。
一実施形態において、センス鎖配列は、式(I):
5’np-Na-(X X)i-Nb-Y Y -Nb-(Z)j-Na-nq 3’ (I)
[式中、
iおよびjは各々独立に、0または1であり、
pおよびqは各々独立に、0~6であり、
各Naは独立に、0~25の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Nbは独立に、0~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各npおよびnqは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
NbおよびYは、同一修飾を有さず、ならびに
XXX、YYYおよびZZZは各々独立に、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す]
によって表すことができる。好ましくは、YYYは、全て2’-F修飾されたヌクレオチドである。
5’np-Na-(X X)i-Nb-Y Y -Nb-(Z)j-Na-nq 3’ (I)
[式中、
iおよびjは各々独立に、0または1であり、
pおよびqは各々独立に、0~6であり、
各Naは独立に、0~25の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Nbは独立に、0~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各npおよびnqは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
NbおよびYは、同一修飾を有さず、ならびに
XXX、YYYおよびZZZは各々独立に、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す]
によって表すことができる。好ましくは、YYYは、全て2’-F修飾されたヌクレオチドである。
一実施形態において、NaまたはNbは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態において、YYYモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。例えば、RNAi剤が17~23ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合には、YYYモチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその近傍に生じ得る(例えば、位置6、7、8、7、8、9、8、9、10、9、10、11、10、11、12または11、12、13に生じ得る)、数は5’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は5’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよい。
一実施形態において、iは1であり、jは0である、またはiは0であり、jは1である、またはiおよびjは両方とも1である。したがって、センス鎖は、以下の式:
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib)、
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic)、または
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id)
によって表すことができる。
5’ np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Ib)、
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’ (Ic)、または
5’ np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’ (Id)
によって表すことができる。
センス鎖が式(Ib)によって表される場合は、Nbは、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
各Naは独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が式(Ic)として表される場合は、Nbは、0~10、0~7、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは、独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合もある。
センス鎖が、式(Id)として表される場合には、各Nbは独立に、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Nbは、0、1、2、3、4、5または6である。各Naは独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す場合もある。
X、YおよびZの各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
他の実施形態において、iは0であり、jは0であり、センス鎖は、次式:
5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia)
によって表すことができる。
5’ np-Na-YYY-Na-nq 3’ (Ia)
によって表すことができる。
センス鎖が、式(Ia)によって表される場合には、各Naは独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態において、RNAiのアンチセンス鎖配列は、式(II):
5’ nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’ 3’ (II)
[式中、
kおよびlは各々独立に、0または1であり、
p’およびq’は各々独立に、0~6であり、
各Na’は独立に、0~25の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Nb’独立に、0~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各np’およびnq’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
Nb’およびY’は、同一修飾を有さず、
X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は各々独立に、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す]
によって表すことができる。
5’ nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’ 3’ (II)
[式中、
kおよびlは各々独立に、0または1であり、
p’およびq’は各々独立に、0~6であり、
各Na’は独立に、0~25の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各Nb’独立に、0~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各np’およびnq’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
Nb’およびY’は、同一修飾を有さず、
X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は各々独立に、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す]
によって表すことができる。
一実施形態において、Na’またはNb’は、交互パターンの修飾を含む。
Y’Y’Y’モチーフは、センス鎖の切断部位にまたはその付近に生じる。例えば、RNAi剤が、17~23ヌクレオチド長の二重鎖領域を有する場合には、Y’Y’Y’モチーフは、アンチセンス鎖の位置9、10、11、位置10、11、12、位置11、12、13、位置12、13、14または一13、14、15で生じる場合があり、数は5’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は5’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよい。好ましくは、Y’Y’Y’モチーフは、位置11、12、13で生じる。
一実施形態において、Y’Y’Y’モチーフは、全て2’-OMe修飾されたヌクレオチドである。
一実施形態において、kは1であり、lは0であるか、またはkは0であり、lは1であるか、またはkおよびlは両方とも1である。
したがって、アンチセンス鎖は、次式:
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb)、
5’ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc)、または
5’ nq’-Na’- Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’- X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId)
によって表すことができる。
5’ nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’ 3’ (IIb)、
5’ nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’ 3’ (IIc)、または
5’ nq’-Na’- Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’- X’X’X’-Na’-np’ 3’ (IId)
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が式(IIb)によって表される場合には、Nb
’は、0~10、0~7、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式(IIc)として表される場合には、Nb’は、0~10、0~7、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式(IId)として表される場合には、各Nb’は独立に、0~10、0~7、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na’は独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Nbは、0、1、2、3、4、5または6である。
他の実施形態において、kは0であり、lは0であり、アンチセンス鎖は、次式:
5’ np’-Na’-Y’Y’Y’- Na’-nq’ 3’ (Ia)
によって表すことができる。
5’ np’-Na’-Y’Y’Y’- Na’-nq’ 3’ (Ia)
によって表すことができる。
アンチセンス鎖が、式(IIa)として表される場合には、各Na’は独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
X’、Y’およびZ’の各々は、互いに同一である場合も、異なっている場合もある。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、LNA、HNA、CeNA、2’-メトキシエチル、2’-O-メチル、2’-O-アリル、2’-C-アリル、2’-ヒドロキシルまたは2’-フルオロで独立に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、2’-O-メチルまたは2’-フルオロで独立に修飾される。各X、Y、Z、X’、Y’およびZ’は、特に、2’-O-メチル修飾または2’-フルオロ修飾を表す場合がある。
一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、二重鎖領域が21ntである場合に、鎖の位置9、10および11で生じるYYYモチーフを含有し得る、数は5’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は5’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよく、Yは、2’-F修飾を表す。センス鎖は、二重鎖領域の対向端にウイング修飾としてXXXモチーフまたはZZZモチーフをさらに含有する場合があり、XXXおよびZZZは各々独立に、2’-OMe修飾または2’-F修飾を表す。
一実施形態において、アンチセンス鎖は、鎖の位置11、12、13で生じるY’Y’Y’モチーフを含有し得る、数は5’端から最初のヌクレオチドから開始する、または適宜、数は5’端から二重鎖領域内の最初の対形成されたヌクレオチドで開始してもよく、Y’は、2’-O-メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の対向端にウイング修飾としてX’X’X’モチーフまたはZ’Z’Z’モチーフをさらに含有する場合があり、X’X’X’およびZ’Z’Z’は各々独立に、2’-OMe修飾または2’-F修飾を表す。
上記の式(Ia)、(Ib)、(Ic)および(Id)のいずれか1つによって表されるセンス鎖は、それぞれ式(IIa)、(IIb)、(IIc)および(IId)のいずれか1つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
したがって、本開示の方法において使用するためのRNAi剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むことができ、各鎖は、14~30ヌクレオチドを有し、RNAi二重鎖は、式(III):
センス:5’ np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np ’-Na ’-(X’X’X’)k-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-(Z’Z’Z’)l-Na ’-nq ’ 5’ (III)
[式中、
i、j、kおよびlは各々独立に、0または1であり、
p、p’、qおよびq’は各々独立に、0~6であり、
各NaおよびNa ’は独立に、0~25の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb ’は独立に、0~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各np’、np、nq’およびnqは、それらの各々は存在する場合も存在しない場合もあるが、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は各々独立に、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す]
によって表される。
センス:5’ np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3’
アンチセンス:3’ np ’-Na ’-(X’X’X’)k-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-(Z’Z’Z’)l-Na ’-nq ’ 5’ (III)
[式中、
i、j、kおよびlは各々独立に、0または1であり、
p、p’、qおよびq’は各々独立に、0~6であり、
各NaおよびNa ’は独立に、0~25の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み、
各NbおよびNb ’は独立に、0~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各np’、np、nq’およびnqは、それらの各々は存在する場合も存在しない場合もあるが、オーバーハングヌクレオチドを独立に表し、
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’およびZ’Z’Z’は各々独立に、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表す]
によって表される。
一実施形態において、iは0であり、jは0であるか、またはiは1であり、jは0であるか、またはiは0であり、jは1であるか、またはiおよびjは両方とも0であるか、またはiおよびjは両方とも1である。別の実施形態において、kは0であり、lは0であるか、またはkは1であり、lは0であり、kは0であり、lは1であるか、またはkおよびlは両方とも0であるか、またはkおよびlは両方とも1である。
RNAi二重鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的組合せは、以下の式:
5’ np - Na -Y Y Y -Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’ -Na ’nq ’ 5’ (IIIa)
5’ np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na ’nq ’5’
(IIIb)
5’ np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Na ’-nq ’ 5’ (IIIc)
5’ np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na-nq ’ 5’
(IIId)
を含む。
5’ np - Na -Y Y Y -Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’ -Na ’nq ’ 5’ (IIIa)
5’ np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na ’nq ’5’
(IIIb)
5’ np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Na ’-nq ’ 5’ (IIIc)
5’ np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3’
3’ np ’-Na ’-X’X’X’-Nb ’-Y’Y’Y’-Nb ’-Z’Z’Z’-Na-nq ’ 5’
(IIId)
を含む。
RNAi剤が式(IIIa)によって表される場合には、各Naは独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
RNAi剤が式(IIIb)によって表される場合には、各Nbは独立に、1~10、1~7、1~5または1~4の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは独立に、2~20、2~15、または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
RNAi剤が式(IIIc)として表される場合には、各Nb、Nb’は独立に、0~10、0~7、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Naは独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
RNAi剤が式(IIId)として表される場合には、各Nb、Nb’は独立に、0~10、0~7、0~10、0~7、0~5、0~4、0~2または0の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Na、Na
’は独立に、2~20、2~15または2~10の修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Na、Na’、NbおよびNb
’の各々は独立に、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態において、RNAi剤が式(IIId)によって表される場合には、Na修飾は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾である。別の実施形態において、RNAi剤が式(IIId)によって表される場合には、Na修飾は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結される。さらに別の実施形態において、RNAi剤が式(IIId)によって表される場合には、Na修飾は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、二価または三価の分岐リンカー(以下に記載される)によって付着された1つまたは複数のC16(または関連)部分にコンジュゲートされる。別の実施形態において、RNAi剤が式(IIId)によって表される場合には、Na修飾は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分岐リンカーによって付着されてもよい、1つまたは複数の親油性の、例えば、C16(または関連)部分にコンジュゲートされる。
一実施形態において、RNAi剤が式(IIIa)によって表される場合には、Na修飾は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾であり、np’>0であり、少なくとも1つのnp’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、センス鎖は、少なくとも1つのホスホロチオエート連結を含み、センス鎖は、二価または三価の分岐リンカーによって付着された1つまたは複数の親油性の、例えば、C16(または関連)部分にコンジュゲートされる。
一実施形態において、RNAi剤は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)および(IIId)によって表される少なくとも2つの二重鎖を含有する多量体であり、二重鎖は、リンカーによって接続される。リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、2つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または二重鎖の各々は、2つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
一実施形態において、RNAi剤は、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)および(IIId)によって表される、3、4、5、6またはそれより多い二重鎖を含有する多量体であり、二重鎖は、リンカーによって接続される。リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。多量体は、リガンドをさらに含んでもよい。二重鎖の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、2つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または二重鎖の各々は、2つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
一実施形態において、式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)および(IIId)によって表される2つのRNAi剤は、5’端で互いに連結され、3’端の一方または両方は、リガンドにコンジュゲートされてもよい。薬剤の各々は、同一の遺伝子を標的化する場合も、2つの異なる遺伝子を標的化する場合もあり、または薬剤の各々は、2つの異なる標的部位の同一遺伝子を標的化する場合もある。
種々の刊行物には、本開示の方法において使用され得る多量体RNAi剤が記載されている。このような刊行物には、WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887およびWO2011/031520ならびにUS7858769が含まれ、それらの各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物および方法は、本明細書に記載されるようなRNAi剤のビニルホスホネート(VP)修飾を含む。例示的実施形態において、本開示のビニルホスホネートは、以下の構造:
本開示のビニルホスホネートは、本開示のdsRNAのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに付着させることができる。ある特定の実施形態において、本開示のビニルホスホネートを、適宜、dsRNAのアンチセンス鎖の5’端でdsRNAのアンチセンス鎖に付着させる。dsRNA剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の5’端にリン含有基を含むことができる。5’端リン含有基は、5’端リン酸(5’-P)、5’端ホスホロチオエート(5’-PS)、5’端ホスホロジチオエート(5’-PS2)、5’端ビニルホスホネート(5’-VP)、5’端メチルホスホネート(MePhos)、または5’-デオキシ-5’-C-マロニルであり得る。5’端リン含有基が5’端ビニルホスホネート(5’-VP)であるとき、5’-VPは、5’-E-VP異性体(すなわち、trans-ビニルホスフェート、その異性体(すなわち、cis-ビニルホスフェート)、またはそれらの混合物であり得る。
例えば、リン酸ミミックが5’-ビニルホスホネート(VP)であるとき、5’末端ヌクレオチドは、以下の構造
Rは、水素、ヒドロキシ、メトキシ、またはフルオロ(例えば、ヒドロキシ)であり;
Bは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり、ここでは、Bは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルであってもよい)。
本開示の組成物および方法のためにビニルホスフェート修飾も企図される。例示的ビニルホスフェート構造として:
i.熱的不安定化修飾
ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9)中に熱的不安定化修飾を組み込んで、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することによって、dsRNA分子をRNA干渉のために最適化できる。アンチセンス鎖の5’端から数えて最初の9ヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するdsRNAが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことが発見されている。したがって、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5’領域の最初の9ヌクレオチド位置内に少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5またはそれより多い)二重鎖の熱的不安定化修飾を含む。一部の実施形態において、1つまたは複数の二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5’端から位置2~9、または好ましくは、位置4~8中に位置する。一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾(複数可)は、アンチセンス鎖の5’端から位置6、7または8に位置する。さらに一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5’端から位置7に位置する。「熱的不安定化修飾(複数可)」という用語は、より低い全体の融解温度(Tm)を有するdsRNAをもたらすであろう修飾(複数可)を含む(好ましくは、このような修飾(複数可)を有さないdsRNAのTmよりも1、2、3または4度低い。一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5’端から位置2、3、4、5または9に位置する。
ある特定の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9)中に熱的不安定化修飾を組み込んで、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することによって、dsRNA分子をRNA干渉のために最適化できる。アンチセンス鎖の5’端から数えて最初の9ヌクレオチド位置内に二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するdsRNAが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことが発見されている。したがって、一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の5’領域の最初の9ヌクレオチド位置内に少なくとも1つの(例えば、1、2、3、4、5またはそれより多い)二重鎖の熱的不安定化修飾を含む。一部の実施形態において、1つまたは複数の二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5’端から位置2~9、または好ましくは、位置4~8中に位置する。一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾(複数可)は、アンチセンス鎖の5’端から位置6、7または8に位置する。さらに一部のさらなる実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5’端から位置7に位置する。「熱的不安定化修飾(複数可)」という用語は、より低い全体の融解温度(Tm)を有するdsRNAをもたらすであろう修飾(複数可)を含む(好ましくは、このような修飾(複数可)を有さないdsRNAのTmよりも1、2、3または4度低い。一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の5’端から位置2、3、4、5または9に位置する。
熱的不安定化修飾として、それだけには限らないが、脱塩基修飾、対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および糖修飾、例えば、2’-デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えば、非ロックド核酸(UNA)またはグリコール核酸(GNA)を挙げることができる。
例示される脱塩基修飾として、それだけには限らないが、以下:
例示される糖修飾として、それだけには限らないが、以下:
一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾は、以下:
「非環式ヌクレオチド」という用語は、例えば、リボース炭素間の結合のいずれか(例えば、C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’またはC1’-O4’)が存在しないか、またはリボース炭素もしくは酸素のうち少なくとも1つ(例えば、C1’、C2’、C3’、C4’またはO4’)が独立に、もしくは組み合わせてヌクレオチドに存在しない、非環式リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態において、非環式ヌクレオチドは、
「GNA」という用語は、DNAまたはRNAと類似のポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復するグリセロール単位から構成される点でその「骨格」の組成が異なっているグリコール核酸を指す:
二重鎖の熱的不安定化修飾は、熱的不安定化ヌクレオチドと、dsRNA二本鎖内の対向鎖中の対向するヌクレオチドの間のミスマッチ(すなわち、非相補的塩基対)であり得る。例示的ミスマッチ塩基対として、G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:Tまたはそれらの組合せが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対形成も本発明に適している。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間に生じ得る、すなわち、ミスマッチ塩基対形成は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは独立してそれぞれのヌクレオチドに由来する核酸塩基間で生じ得る。ある特定の実施形態において、dsRNA分子は、2’-デオキシ核酸塩基である、ミスマッチ対形成中の少なくとも1つの核酸塩基を含有する、例えば、2’-デオキシ核酸塩基は、センス鎖中にある。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域中の二重鎖の熱的不安定化修飾は、標的mRNA上の相補的塩基とのW-C H結合が損なわれたヌクレオチド、例えば:
脱塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド修飾(UNAおよびGNAを含む)およびミスマッチ修飾のより多くの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO2011/133876に詳細に記載されている。
熱的不安定化修飾はまた、対向する塩基と水素結合を形成する能力が低減または消失したユニバーサル塩基およびリン酸修飾を含み得る。
一部の実施形態において、二重鎖の熱的不安定化修飾には、非正準塩基を有するヌクレオチド、例えば、それだけには限らないが、対向鎖中の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれた、または完全に消失した核酸塩基修飾が含まれる。これらの核酸塩基修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWO2010/0011895に記載されるように、dsRNA二重鎖の中心領域の不安定化について評価されている。例示的核酸塩基修飾として、以下:
一部の実施形態において、アンチセンス鎖のシード領域における二重鎖の熱的不安定化修飾には、標的mRNA上の塩基と相補的である1つまたは複数のα-ヌクレオチド、例えば、以下:
天然のホスホジエステル結合と比較して、dsRNA二重鎖の熱的安定性を低下させると知られている例示的リン酸修飾として:
R基のアルキルは、C1~C6アルキルであり得る。R基の具体的なアルキルとして、それだけには限らないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
当業者は認識するであろうが、核酸塩基の機能的役割が本開示のRNAi剤の特異性を定義していることを考慮して、核酸塩基修飾は、例えば、オフターゲット効果に対してオンターゲット効果を増強する目的のために、例えば、本開示のRNAi剤中に不安定化修飾を導入するために、本明細書に記載されるような種々の方法で実施できるが、利用可能な、一般に、本開示のRNAi剤上に存在する修飾の範囲は、非核酸塩基修飾、例えば、ポリリボヌクレオチドの糖基またはリン酸骨格への修飾についてより大きいものとなる傾向がある。このような修飾は、本開示の他の節においてより詳細に記載されており、上記または本明細書において他の場所で記載されるような、天然の核酸塩基または修飾された核酸塩基のいずれかを有する本開示のRNAi剤のために明確に企図される。
熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、dsRNAはまた、1または複数の安定化修飾を含み得る。例えば、dsRNAは、少なくとも2つの(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多い)安定化修飾を含み得る。制限するものではないが、安定化修飾は全て、一方の鎖中に存在する場合がある。一部の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖両方が、少なくとも2つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる場合があり、各安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じる場合があり、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンで安定化修飾を含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンと比較してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも2つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多い)の安定化修飾を含む。制限するものではないが、アンチセンス鎖中の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置2、6、8、9、14および16に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置2、6、14および16に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置2、14および16に安定化修飾を含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも1つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の5’端または3’端の、すなわち、不安定化修飾の位置から位置-1または+1のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の5’端および3’端の各々、すなわち、不安定化修飾の位置から位置-1および+1に安定化修飾を含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の3’端に、すなわち、不安定化修飾の位置から位置+1および+2に少なくとも2つの安定化修飾を含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、少なくとも2つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多い)の安定化修飾を含む。制限するものではないが、センス鎖中の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、センス鎖は、5’端から位置7、10および11に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、5’端から位置7、9、10および11に安定化修飾を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の5’端から数えてアンチセンス鎖の位置11、12および15に対して対向するまたは相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の5’端から数えてアンチセンス鎖の位置11、12、13および15に対して対向するまたは相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態において、センス鎖は、2、3または4つの安定化修飾のブロックを含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱的不安定化修飾に対抗するまたは相補的な位置に安定化修飾を含まない。
例示的な熱的安定化修飾として、それだけには限らないが、2’-フルオロ修飾が挙げられる。他の熱的安定化修飾として、それだけには限らないが、LNAが挙げられる。
一部の実施形態において、本開示のdsRNAは、少なくとも4つの(例えば、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多い)2’-フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、2’-フルオロヌクレオチドは全て、一方の鎖中に存在する場合がある。一部の実施形態において、センスおよびアンチセンス鎖両方が、少なくとも2つの2’-フルオロヌクレオチドを含む。2’-フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、2’-フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる場合があり、各2’-フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じる場合があり、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンで2’-フルオロ修飾を含む。センス鎖上の2’-フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、センス鎖上の2’-フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の2’-フルオロ修飾の交互パターンと比較してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、少なくとも2つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多い)の2’-フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、アンチセンス鎖中の2’-フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置2、6、8、9、14および16に2’-フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置2、6、14および16に2’-フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置2、14および16に2’-フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも1つの2’-フルオロヌクレオチドを含む。例えば、2’-フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の5’端または3’端の、すなわち、不安定化修飾の位置から位置-1または+1のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の5’端および3’端の各々、すなわち、不安定化修飾の位置から位置-1および+1に2’-フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の3’端に、すなわち、不安定化修飾の位置から位置+1および+2に少なくとも2つの2’-フルオロヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、少なくとも2つ(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多い)の2’-フルオロヌクレオチドを含む。制限するものではないが、センス中の2’-フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態において、アンチセンスは、5’端から位置7、10および11に2’-フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、5’端から位置7、9、10および11に2’-フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の5’端から数えてアンチセンス鎖の位置11、12および15に対して対向するまたは相補的な位置に2’-フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖の5’端から数えてアンチセンス鎖の位置11、12、13および15に対して対向するまたは相補的な位置に2’-フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス鎖は、2、3または4つの2’-フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
一部の実施形態において、センス鎖は、アンチセンス鎖中の二重鎖の熱的不安定化修飾に対抗するまたは相補的な位置に2’-フルオロヌクレオチドを含まない。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、21ヌクレオチド(nt)のセンス鎖および23ヌクレオチド(nt)のアンチセンスを含み、アンチセンス鎖は、少なくとも1つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも1つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中に(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9に)生じ、dsRNAの一方の末端は平滑であり、もう一方の末端は2ntのオーバーハングを含み、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6または7つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)アンチセンスは、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(iii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iv)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(v)センス鎖は、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(vi)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、および(vii)dsRNAは、アンチセンス鎖の5’端に平滑末端を含む。好ましくは、2ntのオーバーハングは、アンチセンスの3’端にある。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、25~30ヌクレオチド残基の長さであり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、前記センス鎖の位置1~23は、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、36~66ヌクレオチド残基の長さであり、3’末端ヌクレオチドから開始して、センス鎖の位置1~23と対形成される位置中の少なくとも8のリボヌクレオチドは、二本鎖を形成し、アンチセンス鎖の少なくとも3’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、最大6つの連続3’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対形成せず、それによって、1~6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し、アンチセンス鎖の5’末端は、センス鎖と対形成しない10~30の連続ヌクレオチドを含み、それによって、10~30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し、少なくともセンス鎖5’末端および3’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のためにアラインされる場合に、アンチセンス鎖のヌクレオチドと対形成される塩基であり、それによって、センスおよびアンチセンス鎖の間に実質的に二本鎖の領域を形成し、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の長さの少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的であり、二本鎖核酸が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、アンチセンス鎖は、少なくとも1つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも1つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9に)にある。例えば、熱的不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の5’端の位置14~17に対抗するまたは相補的な位置の間に生じ、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6または7つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)アンチセンスは、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(iii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iv)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(v)センス鎖は、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(vi)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、および(vii)dsRNAは、12~30ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、前記dsRNA分子は、少なくとも25かつ多くとも29ヌクレオチドである長さを有するセンス鎖と、多くとも30ヌクレオチドである長さを有するアンチセンス鎖を含み、センス鎖は5’端から位置11に酵素分解に対して感受性である修飾されたヌクレオチドを含み、前記センス鎖の3’端と前記アンチセンス鎖の5’端は平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、センス鎖よりもその3’端で1~4ヌクレオチド長く、二重鎖領域は少なくとも25ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖は、少なくとも19ヌクレオチドの前記アンチセンス鎖の長さに沿って標的mRNAと十分に相補的であり、前記dsRNA分子が哺乳動物細胞中に導入される場合に標的遺伝子発現を低減させ、前記dsRNAのダイサー切断は、前記アンチセンス鎖の3’端を含むsiRNAを優先的にもたらし、それによって、哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減し、アンチセンス鎖は、少なくとも1つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、少なくとも1つの熱的不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域中(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9)にあり、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6または7つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)アンチセンスは、アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)アンチセンスは、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(iii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iv)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(v)センス鎖は、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(vi)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、および(vii)dsRNAは、12~29ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を有する。
一部の実施形態において、dsRNA分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖中のどのヌクレオチドも修飾され得る。各ヌクレオチドは、非連結性リン酸酸素の、または連結性リン酸酸素の1つもしくは複数の一方または両方の1つまたは複数の変更、リボース糖の構成成分の、例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルの変更、リン酸部分の「デホスホ」リンカーとの大規模な置き換え、天然に存在する塩基の修飾または置き換え、およびリボース-リン酸骨格の置き換えまたは修飾を含み得る同一または異なる修飾で修飾され得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じる、例えば、塩基またはリン酸部分またはリン酸部分の非連結性Oの修飾。一部の場合には、修飾は、核酸中の対象位置の全てで生じるが、多くの場合、生じない。例として、修飾は、3’または5’末端位置でのみ生じる場合があり、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置で、または最後の2、3、4、5もしくは10ヌクレオチドにおいて生じる場合がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じる場合がある。修飾は、RNAの二本鎖領域においてのみ生じる場合があり、またはRNAの一本鎖領域においてのみ生じる場合がある。例えば、非連結性O位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じる場合があり、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置で、または最後の2、3、4、5もしくは10ヌクレオチドにおいて生じる場合があり、または二本鎖および一本鎖領域において、特に、末端で生じる場合がある。5’端または両端がリン酸化され得る。
例えば、安定性を増強すること、オーバーハング中に特定の塩基を含めること、または一本鎖オーバーハング中、例えば、5’もしくは3’オーバーハング中、または両方中に修飾されたヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。一部の実施形態において、3’または5’オーバーハング中の塩基の全てまたは一部が、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の2’位置での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに、2’-デオキシ-2’-フルオロ(2’-F)または2’-O-メチル修飾された、デオキシリボヌクレオチドの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ロックド核酸(LNA)、非ロックド核酸(UNA)、シクロヘキセン核酸(CeNA)、2’-メトキシエチル、2’-O-メチル、2’-O-アリル、2’-C-アリル、2’-デオキシ、または2’-フルオロで独立に修飾される。鎖は、2以上の修飾を含有し得る。一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロで独立に修飾される。これらの修飾は、アンチセンス鎖中に存在する二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾に追加されるということは理解されるべきである。
少なくとも2つの異なる修飾は通常、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それらの2つの修飾は、2’-デオキシ、2’-O-メチルまたは2’-フルオロ修飾、非環式ヌクレオチドなどであり得る。一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、2’-O-メチルまたは2’-デオキシから選択される2つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、2’-O-メチルヌクレオチド、2’-デオキシヌクレオチド、2’-デオキシ-2’-フルオロヌクレオチド、2’-O-N-メチルアセトアミド(2’-O-NMA)ヌクレオチド、2’-O-ジメチルアミノエトキシエチル(2’-O-DMAEOE)ヌクレオチド、2’-O-アミノプロピル(2’-O-AP)ヌクレオチドまたは2’-アラ-Fヌクレオチドで独立に修飾される。やはり、これらの修飾は、アンチセンス鎖中に存在する二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾に追加されるということは理解されるべきである。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、特に、B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、B4’領域における交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、本明細書において使用される場合、1つまたは複数の修飾を有するモチーフを指し、各修飾は、1つの鎖の交互ヌクレオチドで生じる。交互ヌクレオチドとは、1つおきのヌクレオチド毎に1つまたは3ヌクレオチド毎に1つまたは同様のパターンを指す場合がある。例えば、A、BおよびCが各々、ヌクレオチドへの修飾の1つのタイプを表す場合には、交互モチーフは、「ABABABABABAB…」、「AABBAABBAABB…」、「AABAABAABAAB…」、「AAABAAABAAAB…」、「AABBBAAABBB…」または「ABCABCABCABC…」などであり得る。
交互モチーフ中に含有される修飾のタイプは、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、A、B、C、Dが各々、ヌクレオチド上の修飾の1つのタイプを表す場合には、交互ターン、すなわち、1つおきのヌクレオチド上の修飾は、同一である場合があるが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、「ABABAB…」、「ACACAC…」、「BDBDBD…」または「CDCDCD…」などといった交互モチーフ内の修飾のいくつかの可能性から選択され得る。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対してシフトされているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。シフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なって修飾された基に対応するようなものであり得る、逆もまた同様。例えば、センス鎖は、dsRNA二本鎖中のアンチセンス鎖と対形成される場合には、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の5’-3’から「ABABAB」で開始する場合があり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の3’-5’から「BABABA」で開始する場合がある。別の例として、センス鎖中の交互モチーフは、鎖の5’-3’から「AABBAABB」で開始する場合があり、アンチセンス鎖中の交互モチーフは、二重鎖領域内の鎖の3’-5’に「BBAABBAA」で開始する場合があり、その結果、センス鎖とアンチセンス鎖の間で修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトがある。
本開示のdsRNA分子は、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置においてセンス鎖またはアンチセンス鎖または両方の任意のヌクレオチドで生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じる可能性があり、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得る、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も、異なっている場合もあり、センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対してシフトを有する場合がある。
一部の実施形態において、dsRNA分子は、オーバーハング領域中にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、2つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結を有する2つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の対形成されるヌクレオチドと連結するように行われ得る。例えば、少なくとも2、3、4または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結でき、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対形成されるヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結があってもよい。例えば、3ヌクレオチドのうち2つがオーバーハングヌクレオチドであり、3番目は、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対形成されるヌクレオチドである、末端の3ヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結があり得る。好ましくは、これらの末端の3ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’端であり得る。
一部の実施形態において、dsRNA分子のセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、2~10のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の1~10のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むアンチセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17または18のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、2つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、3つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、4つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、5つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、6つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5、6、7または8つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、7つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3、4、5または6つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、8つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、dsRNA分子のアンチセンス鎖は、1、2、3または4つのリン酸ヌクレオチド間連結によってわけられる、9つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結の2つのブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結のうち1つは、オリゴヌクレオチド配列中の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびリン酸ヌクレオチド間連結の任意の組合せを含むセンス鎖と、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはリン酸連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対形成される。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センスまたはアンチセンス鎖の1~10の末端位置内に1つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが、センスまたはアンチセンス鎖の一方の末端または両端でホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結され得る。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センスまたはアンチセンス鎖の各々の二重鎖の内部領域の1~10内に1つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが、センス鎖の5’端から数えて二重鎖領域の位置8~16でホスホロチオエートメチルホスホネートヌクレオチド間連結によって連結され得る。dsRNA分子は、1~10の末端位置内に1つまたは複数のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾をさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に1~5つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1~5つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に1~5つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1~5つ(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1または2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1または2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1または2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1または2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つ(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1または2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つ(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1~5内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1または2に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置18~23内に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置20および21に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21に1つ(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置20および21に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21および22に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21および22に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置22および23に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、センス鎖の位置1に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置21に1つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)ならびにアンチセンス鎖の位置1および2に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾および位置23および23に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾(5’端から数えて)をさらに含む。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも5つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも6つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも7つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも8つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも9つのヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも10のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも11のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも12のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも13のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも14のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも15のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも16のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも17のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも18のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも19のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において8つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において7つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において6つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において5つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において4つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において3つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において2つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Rp立体配置において1つ以下のヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、8つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む(限定されるわけではない例として、ホスホジエステル)。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、7つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、6つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、5つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、4つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、3つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、2つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、1つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも10のヌクレオチド間連結および8つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも11のヌクレオチド間連結および7つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも12のヌクレオチド間連結および6つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも13のヌクレオチド間連結および6つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも14のヌクレオチド間連結および5つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、骨格キラル中心の一般的なパターンは、Sp立体配置において少なくとも15のヌクレオチド間連結および4つ以下のキラルではないヌクレオチド間連結を含む。一部の実施形態において、Sp立体配置におけるヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。一部の実施形態において、Rp立体配置におけるヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。一部の実施形態において、キラルではないヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、連続でなくてもよい。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。一部の実施形態において、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がRpである点でRpブロックである。一部の実施形態において、5’-ブロックは、Rpブロックである。一部の実施形態において、3’-ブロックは、Rpブロックである。一部の実施形態において、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がSpである点でSpブロックである。一部の実施形態において、5’-ブロックは、Spブロックである。一部の実施形態において、3’-ブロックは、Spブロックである。一部の実施形態において、提供されるオリゴヌクレオチドは、RpおよびSpブロックの両方を含む。一部の実施形態において、提供されたオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のRpを含むが、Spブロックを含まない。一部の実施形態において、提供されるオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数のSpを含むが、Rpブロックを含まない。一部の実施形態において、提供されるオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の、各ヌクレオチド間連結が天然リン酸連結であるPOブロックを含む。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、各糖部分が2’-F修飾を含むSpブロックである5’-ブロックを含む。一部の実施形態において、5’-ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、修飾されたヌクレオチド間連結であり、各糖部分が、2’-F修飾を含むSpブロックである。一部の実施形態において、5’-ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、ホスホロチオエート連結であり、各糖部分が、2’-F修飾を含むSpブロックである。一部の実施形態において、5’-ブロックは、4以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、5’-ブロックは、5以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、5’-ブロックは、6以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、5’-ブロックは、7以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、3’-ブロックは、各糖部分が、2’-F修飾を含むSpブロックである。一部の実施形態において、3’-ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、修飾されたヌクレオチド間連結であり、各糖部分が、2’-F修飾を含むSpブロックである。一部の実施形態において、3’-ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が、ホスホロチオエート連結であり、各糖部分が2’-F修飾を含むSpブロックである。一部の実施形態において、3’-ブロックは、4以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、3’-ブロックは、5以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、3’-ブロックは、6以上のヌクレオシド単位を含む。一部の実施形態において、3’-ブロックは、7以上のヌクレオシド単位を含む。
一部の実施形態において、本開示の化合物は、領域中にあるタイプのヌクレオシドを含み、またはオリゴヌクレオチドに、特定のタイプのヌクレオチド間連結、例えば、天然のリン酸連結、修飾されたヌクレオチド間連結、Rpキラルヌクレオチド間連結、Spキラルヌクレオチド間連結などが続く。一部の実施形態において、Aに、Spが続く。一部の実施形態において、Aに、Rpが続く。一部の実施形態において、Aに、天然のリン酸連結(PO)が続く。一部の実施形態において、Uに、Spが続く。一部の実施形態において、Uに、Rpが続く。一部の実施形態において、Uに、天然のリン酸連結(PO)が続く。一部の実施形態において、Cに、Spが続く。一部の実施形態において、Cに、Rpが続く。一部の実施形態において、Cに、天然のリン酸連結(PO)が続く。一部の実施形態において、Gに、Spが続く。一部の実施形態において、Gに、Rpが続く。一部の実施形態において、Gに、天然のリン酸連結(PO)が続く。一部の実施形態において、CおよびUに、Spが続く。一部の実施形態において、CおよびUに、Rpが続く。一部の実施形態において、CおよびUに、天然のリン酸連結(PO)が続く。一部の実施形態において、AおよびGに、Spが続く。一部の実施形態において、AおよびGに、Rpが続く。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置21と22の間およびヌクレオチド位置22と23の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9に)位置する二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾を含有し、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)アンチセンスは、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(iii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iv)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(v)センス鎖は、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(vi)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、(vii)dsRNAは、12~40ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および(viii)dsRNAは、アンチセンス鎖の5’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置1と2の間、ヌクレオチド位置2と3の間、ヌクレオチド位置21と22の間およびヌクレオチド位置22と23の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9に)位置する二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾を含有し、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iii)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(iv)センス鎖は、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(v)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、(vi)dsRNAは、12~40ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、(vii)dsRNAは、12~40ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および(viii)dsRNAは、アンチセンス鎖の5’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド位置1と2の間、ヌクレオチド位置2と3の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9に)位置する二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾を含有し、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7または8つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)アンチセンスは、1、2、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(iii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iv)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(v)センス鎖は、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(vi)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、(vii)dsRNAは、12~40ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および(viii)dsRNAは、アンチセンス鎖の5’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、センス鎖は、ヌクレオチド位置1と2の間およびヌクレオチド位置2と3の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチド位置1と2の間、ヌクレオチド位置2と3の間、ヌクレオチド位置21と22の間およびヌクレオチド位置22と23の間にホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域に(すなわち、アンチセンス鎖の5’端の位置2~9に)位置する二重鎖の少なくとも1つの熱的不安定化修飾を含有し、dsRNAは、以下の特徴のうち少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6または7つ全て)をさらに有してもよい:(i)アンチセンスは、2、3、4、5または6つの2’-フルオロ修飾を含む、(ii)センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、(iii)センス鎖は、2、3、4または5つの2’-フルオロ修飾を含む、(iv)センス鎖は、3、4または5つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、(v)dsRNAは、少なくとも4つの2’-フルオロ修飾を含む、(vi)dsRNAは、12~40ヌクレオチド対の長さの二重鎖領域を含む、および(vii)dsRNAは、アンチセンス鎖の5’端に平滑末端を有する。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、標的との、二本鎖内のミスマッチ(複数可)またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二重鎖領域中に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいてランク付けできる(例えば、特定の対形成の会合または解離の自由エネルギーで、最も簡単なアプローチは、個々の対に基づいて対を調べることであるが、次の隣接分析または同様の分析も使用できる)。解離の促進の点では:A:UはG:Cを上回って好ましく、G:UはG:Cを上回って好ましく、I:CはG:Cを上回って好ましい(I=イノシン)。ミスマッチ、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のもの(本明細書において別の場所で記載されるような)は、正準(A:T、A:U、G:C)対形成を上回って好ましく、ユニバーサル塩基を含む対形成は正準対形成を上回って好ましい。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、二本鎖の5’端でのアンチセンス鎖の解離を促進するために、A:U、G:U、I:Cおよびミスマッチ対、例えば、非正準対形成または正準対形成以外のものまたはユニバーサル塩基を含む対形成の群から独立に選択され得る、アンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の1、2、3、4または5つの塩基対のうち少なくとも1つを含む。
一部の実施形態において、アンチセンス鎖中の5’端から二重鎖領域内の1位置のヌクレオチドは、A、dA、dU、UおよびdTからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の1、2または3つの塩基対のうち少なくとも1つは、AU塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の5’端から二重鎖領域内の最初の塩基対は、AU塩基対である。
一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置で、ジヌクレオチドのホスホジエステル(PO)、ホスホロチオエート(PS)またはホスホロジチオエート(PS2)連結の3’端に、4’-修飾されたまたは5’-修飾されたヌクレオチドを導入することは、ヌクレオチド間連結に対して立体的効果を発揮し、ひいては、それをヌクレアーゼから保護し、安定化できるということが見出された。一部の実施形態において、4’-修飾されたまたは5’-修飾されたヌクレオチドをジヌクレオチドのPO、PS、またはPS2連結の3’端に導入することは、ジヌクレオチド対における第2のヌクレオチドを修飾する。他の実施形態において、4’-修飾されたまたは5’-修飾されたヌクレオチドをジヌクレオチドのPO、PS、またはPS2連結の3’端に導入することは、ジヌクレオチド対の3’端でヌクレオチドを修飾する。
一部の実施形態において、5’-修飾されたヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖siRNAの任意の位置でジヌクレオチドの3’端に導入される。例えば、5’-アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖siRNAの任意の位置でジヌクレオチドの3’端に導入できる。リボース糖の5’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体であり得る。例示的な5’-アルキル化ヌクレオシドとして、5’-メチルヌクレオシドがある。5’-メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、4’-修飾されたヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖siRNAの任意の位置でジヌクレオチドの3’端に導入される。例えば、4’-アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖siRNAの任意の位置でジヌクレオチドの3’端に導入できる。リボース糖の5’位置のアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体であり得る。例示的な4’-アルキル化ヌクレオシドとして、4’-メチルヌクレオシドがある。4’-メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。あるいは、4’-O-アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖siRNAの任意の位置でジヌクレオチドの3’端に導入できる。リボース糖の4’-O-アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体であり得る。例示的4’-O-アルキル化ヌクレオシドとして、4’-O-メチルヌクレオシドがある。4’-O-メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、5’-アルキル化ヌクレオシドが、dsRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、dsRNAの効力を維持または改良する。5’-アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。例示的5’-アルキル化ヌクレオシドとして、5’-メチルヌクレオシドがある。5’-メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、4’-アルキル化ヌクレオシドが、dsRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、dsRNAの効力を維持または改良する。4’-アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。例示的4’-アルキル化ヌクレオシドとして、4’-メチルヌクレオシドがある。4’-メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、4’-O-アルキル化ヌクレオシドは、dsRNAのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置で導入され、このような修飾は、dsRNAの効力を維持または改良する。5’-アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。例示的4’-O-アルキル化ヌクレオシドとして、4’-O-メチルヌクレオシドがある。4’-O-メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なRもしくはS異性体のいずれかであり得る。
一部の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、2’-5’連結(2’-H、2’-OHおよび2’-OMeを有し、P=OまたはP=Sである)を含み得る。例えば、2’-5’連結修飾を、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用できる、またはRISCによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の5’端で使用できる。
別の実施形態において、本開示のdsRNA分子は、L糖(例えば、2’-H、2’-OHおよび2’-OMeを有するLリボース、L-アラビノース)を含み得る。例えば、これらのL糖修飾を、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用できる、またはRISCによるセンス鎖活性化を避けるためにセンス鎖の5’端で使用できる。
種々の刊行物に多量体siRNAが記載されており、これらは全て、本開示のdsRNAとともに使用できる。このような刊行物には、その全体が本明細書に組み込まれるWO2007/091269、US7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887およびWO2011/031520が含まれる。
以下により詳細に記載されるように、RNAi剤への1つまたは複数の炭水化物部分のコンジュゲーションを含有するRNAi剤は、RNAi剤の1つまたは複数の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分を、RNAi剤の修飾されたサブユニットに付着させる。例えば、dsRNA剤の1つまたは複数のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を別の部分、例えば、炭水化物リガンドが付着される非炭水化物(好ましくは、環式)担体と置き換えることができる。サブユニットのリボース糖がそのように置き換えられているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書において、リボース置き換え修飾サブユニット(RRMS)と呼ばれる。環式担体は、炭素環系であり得る、すなわち、全ての環原子は、炭素原子であるか、または複素環式環構造、すなわち、1つまたは複数の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る。環式担体は、単環式環構造であり得る、または2つ以上の環、例えば、縮合環を含有し得る。環式担体は、完全飽和環構造であり得る、または1つもしくは複数の二重結合を含有し得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに付着させることができる。担体は、(i)少なくとも1つの「骨格付着点」、好ましくは、2つの「骨格付着点」ならびに(ii)少なくとも1つの「繋留付着点」を含む。「骨格付着点」とは、本明細書において使用される場合、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または、一般的に、骨格、例えば、リボ核酸のリン酸または修飾されたリン酸、例えば、硫黄含有骨格への担体の組み込みのために利用可能な、およびそれに適している結合を指す。「繋留付着点」(TAP)とは、一部の実施形態において、選択された部分を接続する環式担体の構成物環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子(骨格付着点を提供する原子とは別個)を指す。部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖および多糖であり得る。選択された部分は、介在するテザーによって環式担体に接続されてもよい。したがって、環式担体は、官能基、例えば、アミノ基を含む、または一般的に、構成物環への、別の化学実体、例えば、リガンドの組み込みもしくは繋留に適している結合を提供することが多いであろう。
RNAi剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされる場合があり、担体は、環式基または非環式基であり得る、好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され、好ましくは、非環式群は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
ある特定の具体的実施形態において、本開示の方法において使用するためのRNAi剤は、表2~5、9もしくは10のいずれか1つにおいて列挙される薬剤の群から選択される薬剤である。
IV.リガンドにコンジュゲートされたiRNA
本発明のiRNAのRNAの別の修飾は、iRNAを1つまたは複数のリガンド、iRNAの活性、細胞分布または例えば、細胞への細胞取り込みを増強する部分またはコンジュゲートと化学的に連結することを含む。このような部分として、それだけには限らないが、コレステロール部分などの脂質部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330、Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)が挙げられる。
本発明のiRNAのRNAの別の修飾は、iRNAを1つまたは複数のリガンド、iRNAの活性、細胞分布または例えば、細胞への細胞取り込みを増強する部分またはコンジュゲートと化学的に連結することを含む。このような部分として、それだけには限らないが、コレステロール部分などの脂質部分(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556)、コール酸(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060)、チオエーテル、例えば、ベリル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538)、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330、Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチル-アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783)、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237)またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニルオキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)が挙げられる。
ある特定の実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるiRNA剤の分布、標的化または寿命を変更する。一部の実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較されるように、選択された標的、例えば、分子、細胞または細胞種、コンパートメント、例えば、細胞のまたは臓器のコンパートメント、組織、器官または身体の領域に対する親和性の増強を提供する。通常のリガンドは、二本鎖核酸において二重鎖対形成に関与しない。
リガンドとして、天然に存在する物質、例えば、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)またはグロブリン)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン(PLL)、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸であるポリアミノ酸、スチレン-無水マレイン酸共重合体、ポリ(L-ラクチド-co-グリコリド(glycolied))共重合体、ジビニルエーテル-無水マレイン酸共重合体、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド共重合体(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸(ethylacryllic acid))、N-イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド-ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドにはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、特定の細胞種、例えば、腎臓細胞に結合する抗体が含まれ得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインA、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロールステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンB12、ビオチンまたはRGDペプチドもしくはRGDペプチドミメティックであり得る。ある特定の実施形態において、リガンドは、多価ガラクトース、例えば、N-アセチル-ガラクトサミンである。
リガンドの他の例として、色素、インターカレート剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サッフィリン(Sapphyrin))、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチルまたはフェノキサジン)およびペプチドコンジュゲート(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進物質(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状分子のEu3+複合体)、ジニトロフェニル、HRPまたはAPが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞または骨細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価マンノースまたは多価フコースが含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、p38 MAPキナーゼのアクチベーターまたはNF-κBのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維または中間径線維を破壊することによってiRNA剤の細胞への取り込みを増大し得る物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンA、ファロイジン、スウィンホリドA、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるようなiRNAに付着されるリガンドは、薬物動態モジュレーター(PKモジュレーター)として作用する。PKモジュレーターには、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミンなどが含まれる。例示的PKモジュレーターとして、それだけには限らないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンE、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合すると知られており、従って、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む、約5塩基、10塩基、15塩基または20塩基のオリゴヌクレオチドはまた、リガンドとして(例えば、PKモジュレーティングリガンドとして)本発明に適している。さらに、血清構成成分(例えば、血清タンパク質)に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてPKモジュレーティングリガンドとして使用するのに適している。
本発明のリガンドがコンジュゲートされたiRNAは、ペンダント反応性官能性を有する、例えば、オリゴヌクレオチド上への連結分子の付着に由来する(以下に記載される)オリゴヌクレオチドの使用によって合成できる。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されているリガンドまたはそれに付着された連結部分を有するリガンドと直接反応させることができる。
本発明のコンジュゲートにおいて使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の公知の技術によって好都合に、日常的に作製できる。このような合成のための機器は、例えば、Applied Biosystems(登録商標)(カリフォルニア州、フォスターシティ)を含むいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知のこのような合成のための任意の他の手段をさらに、または代わりに使用してもよい。他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体を調製するために同様の技術を使用することも公知である。
本発明のリガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドおよびリガンド-配列特異的な連結されたヌクレオシドを有する分子では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを、標準ヌクレオチドもしくはヌクレオシド前駆体または連結部分をすでに有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに有するリガンド-ヌクレオチドもしくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体またはビルディングブロックを有する非ヌクレオシドリガンドを利用して適したDNAシンセサイザーで組み立てることができる。
連結部分をすでに有するヌクレオチド-コンジュゲート前駆体を使用する場合には、配列特異的な連結されたヌクレオシドの合成が通常完了され、次いで、リガンド分子が連結部分と反応されて、リガンドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドが形成される。一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは連結されたヌクレオシドは、市販されており、オリゴヌクレオチド合成において日常的に使用される標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド-ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホラミダイトを使用して自動化シンセサイザーによって合成される。
A.脂質コンジュゲート
ある特定の実施形態において、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、通常、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合できる。HSA結合性リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合できる他の分子も、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、(b)標的細胞もしくは細胞膜中への標的化もしくは輸送を増大できる、または(c)血清タンパク質、例えば、HSAへの結合を調整できる。
ある特定の実施形態において、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、通常、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合できる。HSA結合性リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。HSAに結合できる他の分子も、リガンドとして使用できる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用できる。脂質または脂質ベースのリガンドは、(a)コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、(b)標的細胞もしくは細胞膜中への標的化もしくは輸送を増大できる、または(c)血清タンパク質、例えば、HSAへの結合を調整できる。
脂質ベースのリガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合をモジュレート、例えば、管理(例えば、阻害)できる。例えば、より強力にHSAに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓へ標的化される可能性が低く、したがって、身体から排除される可能性が低くなる。あまり強力にHSAに結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化するために使用できる。
ある特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、HSAに結合する。例えば、リガンドは、十分な親和性でHSAに結合でき、その結果、非腎臓組織へのコンジュゲートの分布が増強される。しかし、親和性は、通常、HSA-リガンド結合を元に戻すことができないほど強力ではない。
ある特定の実施形態において、脂質ベースのリガンドは、HSAに弱く結合するか、全く結合せず、その結果、腎臓へのコンジュゲートの分布が増強される。脂質ベースのリガンドの代わりに、またはそれに加えて、腎臓細胞を標的化する他の部分も使用できる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖している細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性種、例えば、がん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の処置にとって特に有用である。例示的ビタミンとして、ビタミンA、EおよびKが挙げられる。他の例示的ビタミンとして、Bビタミン、例えば、葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたはがん細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、HSAおよび低比重リポタンパク質(LDL)も含まれる。
B.細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えば、ヘリックス細胞透過剤である。ある特定の実施形態において、これらの細胞透過剤は、両親媒性である。例示的細胞透過剤として、ペプチド、例えば、tatまたはアンテナペディア(antennopedia)がある。薬剤がペプチドである場合は、修飾される場合があり、ぺプチジルミメティック、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド連結およびD-アミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、通常、α-ヘリックス剤であり、親油性および疎油性相を有し得る。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えば、ヘリックス細胞透過剤である。ある特定の実施形態において、これらの細胞透過剤は、両親媒性である。例示的細胞透過剤として、ペプチド、例えば、tatまたはアンテナペディア(antennopedia)がある。薬剤がペプチドである場合は、修飾される場合があり、ぺプチジルミメティック、逆転異性体、非ペプチドまたはシュードペプチド連結およびD-アミノ酸の使用を含む。ヘリックス剤は、通常、α-ヘリックス剤であり、親油性および疎油性相を有し得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチドミメティックであり得る。ペプチドミメティック(本明細書においてオリゴペプチドミメティックとも呼ばれる)は、天然ペプチドと類似する規定の三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチドミメティックのiRNA剤への付着は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、iRNAの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチドミメティック部分は、約5~50アミノ酸長、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45または50アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチドミメティックは、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド(例えば、主にTyr、TrpまたはPheからなる)であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代替法では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列(MTS)を含み得る。例示的な疎水性MTS含有ペプチドとして、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAP(配列番号1534)を有するRFGFがある。疎水性MTSを含有するRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP(配列番号1535))も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を横切ってペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであり得る。例えば、HIV Tatタンパク質に由来する配列(GRKKRRQRRRPPQ(配列番号1536))およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質に由来する配列(RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号1537))は、送達ペプチドとして機能化能であると見出されている。ペプチドまたはペプチドミメティックは、ファージディスプレイライブラリーまたは1-ビーズ-1-化合物(OBOC)コンビナトリアルライブラリー(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991)から同定されるペプチドなどの、DNAのランダム配列によってコードされ得る。通常、組み込まれたモノマー単位を介してdsRNA剤に繋留されるペプチドまたはペプチドミメティックとして、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)-ペプチドまたはRGDミミックがある。ペプチド部分は、約5アミノ酸~約40アミノ酸長の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体配座特性を増大する構造修飾を有し得る。以下に記載される構造修飾のいずれも利用できる。
本発明の組成物および方法において使用するためのRGDペプチドは、線状である場合も、環状である場合もあり、特定の組織(複数可)への標的化を促進するように修飾される、例えば、グリコシル化またはメチル化される場合もある。RGD含有ペプチドおよびペプチドミメティック(peptidiomimemtics)は、D-アミノ酸ならびに合成RGDミミックを含み得る。RGDに加えて、インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用できる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、PECAM-1またはVEGFを標的化する。
RGDペプチド部分を、特定の細胞種、例えば、腫瘍細胞、例えば、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞を標的化するために使用できる(Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002)。RGDペプチドは、dsRNA剤の肺、腎臓、脾臓または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍への標的化を促進できる(Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001)。通常、RGDペプチドは、iRNA剤の腎臓への標的化を促進する。RGDペプチドは、線状である場合も、環状である場合もあり、特定の組織(複数可)への標的化を促進するように修飾される、例えば、グリコシル化またはメチル化される場合もある。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、iRNA剤をαVβ3を発現する腫瘍細胞に送達できる(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001)。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌もしくは真菌細胞または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えば、α-ヘリックス線状ペプチド(例えば、LL-37またはセロピンP1)、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α-デフェンシン、β-デフェンシンまたはバクテネシン)または1つもしくは2つの優性アミノ酸のみを含有するペプチド(例えば、PR-39またはインドリシジン)であり得る。細胞透過ペプチドはまた、核局在性シグナル(NLS)を含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、例えば、HIV-1 gp41とSV40ラージT抗原のNLSの融合ペプチドドメインに由来するMPGなどの二分両親媒性ペプチドであり得る(Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003)。
C.炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物および方法の一部の実施形態において、iRNAは、炭水化物をさらに含む。炭水化物がコンジュゲートされたiRNAは、本明細書に記載されるような、核酸ならびにインビボ治療的使用に適した組成物のインビボ送達にとって有利である。本明細書において使用される場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも6個の炭素原子(線状、分岐または環状であり得る)を有する1つもしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体またはその一部として、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々少なくとも6個の炭素原子(線状、分岐または環状であり得る)を有する1または複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分を有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物として、糖(単糖、二糖、三糖および約4、5、6、7、8または9つの単糖単位を含有するオリゴ糖)ならびに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムが挙げられる。特定の単糖として、C5が挙げられ、上記の(例えば、C5、C6、C7またはC8)糖、二糖および三糖は、2つまたは3つの単糖単位有する糖(例えば、C5、C6、C7またはC8)を含む。
本発明の組成物および方法の一部の実施形態において、iRNAは、炭水化物をさらに含む。炭水化物がコンジュゲートされたiRNAは、本明細書に記載されるような、核酸ならびにインビボ治療的使用に適した組成物のインビボ送達にとって有利である。本明細書において使用される場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも6個の炭素原子(線状、分岐または環状であり得る)を有する1つもしくは複数の単糖単位で構成されている炭水化物自体またはその一部として、各炭素原子に結合された酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々少なくとも6個の炭素原子(線状、分岐または環状であり得る)を有する1または複数の単糖単位で構成されている炭水化物部分を有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物として、糖(単糖、二糖、三糖および約4、5、6、7、8または9つの単糖単位を含有するオリゴ糖)ならびに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムが挙げられる。特定の単糖として、C5が挙げられ、上記の(例えば、C5、C6、C7またはC8)糖、二糖および三糖は、2つまたは3つの単糖単位有する糖(例えば、C5、C6、C7またはC8)を含む。
ある特定の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、単糖を含む。
ある特定の実施形態において、単糖は、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)である。1つまたは複数のN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)誘導体を含むGalNAcコンジュゲートは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるUS8,106,022に記載されている。一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、iRNAを特定の細胞に標的化するリガンドとして働く。一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、例えば、肝臓細胞(例えば、肝細胞)のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして働くことによってiRNAを肝臓細胞に標的化する。
一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、1つまたは複数のGalNAc誘導体を含む。GalNAc誘導体は、リンカー、例えば、二価または三価分岐リンカーを介して付着させることができる。一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、センス鎖の3’端にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書に記載されるようなリンカーを介してiRNA剤に(例えば、センス鎖の3’端に)コンジュゲートされる。一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、センス鎖の5’端にコンジュゲートされる。一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、リンカー、例えば、本明細書に記載されるようなリンカーを介してiRNA剤に(例えば、センス鎖の5’端に)コンジュゲートされる。
本発明のある特定の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、一価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。一部の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、二価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。本発明のさらに他の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、三価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。本発明の他の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、四価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。
ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖RNAi剤は、iRNA剤に付着された1つのGalNAcまたはGalNAc誘導体を含む。ある特定の実施形態において、本発明の二本鎖RNAi剤は、複数の一価リンカーを介して二本鎖RNAi剤の複数のヌクレオチドに各々独立に付着された、複数の(例えば、2、3、4、5または6つの)GalNAcまたはGalNAc誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のiRNA剤の2つの鎖が、複数の対形成されないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の3’端と、それぞれのもう一方の鎖の5’端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続された1つの大きな分子の一部である場合には、ヘアピンループ内の対形成されないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して付着されたGalNAcまたはGalNAc誘導体を独立に含み得る。ヘアピンループはまた、二本鎖のうち1つの鎖における延長されたオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態において、例えば、本発明のiRNA剤の2つの鎖が、複数の対形成されないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の3’端と、それぞれのもう一方の鎖の5’端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続された1つの大きな分子の一部である場合には、ヘアピンループ内の対形成されないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して付着されたGalNAcまたはGalNAc誘導体を独立に含み得る。ヘアピンループはまた、二本鎖のうち1つの鎖における延長されたオーバーハングによって形成される場合もある。
一部の実施形態において、GalNAcコンジュゲートは、
一部の実施形態において、RNAi剤は、以下の模式図で示されるようにリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに付着され、式中、Xは、OまたはSである。
一部の実施形態において、RNAi剤は、表1において定義され、以下に示されるようにL96にコンジュゲートされる:
ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される:
ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。ある特定の実施形態において、単糖は、N-アセチルガラクトサミン、
本明細書に記載される実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとして、それだけには限らないが、
一部の実施形態において、適したリガンドは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるWO2019/055633において開示されるリガンドである。一実施形態において、リガンドは、以下の構造:
ある特定の実施形態において、本開示のRNAi剤は、GalNAcリガンドを、このようなGalNAcリガンドが現在、本開示の好ましい髄腔内/CNS送達経路(複数可)にとって限定された価値のものであると予測されている場合であっても含み得る。
本発明のある特定の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、一価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。一部の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、二価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。本発明のさらに他の実施形態において、GalNAcまたはGalNAc誘導体を、三価リンカーを介して本発明のiRNA剤に付着させる。
一実施形態において、本発明の二本鎖RNAi剤は、iRNA剤に付着された1つまたは複数のGalNAcまたはGalNAc誘導体を含む。GalNAcは、センス鎖またはアンチセンス(antsisense)鎖上のリンカーを介して任意のヌクレオチドに付着させることができる。GalNacは、センス鎖の5’端、センス鎖の3’端、アンチセンス鎖の5’端またはアンチセンス鎖の3’端に付着させることができる。一実施形態において、GalNAcを、例えば、三価リンカーを介してセンス鎖の3’端に付着させる。
他の実施形態において、本発明の二本鎖RNAi剤は、複数のリンカー、例えば、一価リンカーを介して二本鎖RNAi剤の複数のヌクレオチド各々独立に付着された、複数の(例えば、2、3、4、5または6つの)GalNAcまたはGalNAc誘導体を含む。
一部の実施形態において、例えば、本発明のiRNA剤の2つの鎖が、複数の対形成されないヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の3’端と、それぞれのもう一方の鎖の5’端の間のヌクレオチドの中断されない鎖によって接続された1つの大きな分子の一部である場合には、ヘアピンループ内の対形成されないヌクレオチドは各々、一価リンカーを介して付着されたGalNAcまたはGalNAc誘導体を独立に含み得る。
一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、それだけには限らないが、PKモジュレーターまたは細胞透過ペプチドなどの、上記のような1または複数のさらなるリガンドをさらに含む。
本発明において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲートおよびリンカーとして、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2014/179620およびWO2014/179627に記載されるものが挙げられる。
D.リンカー
一部の実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてiRNAオリゴヌクレオチドに付着させることができる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてiRNAオリゴヌクレオチドに付着させることができる。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の2つの部分を接続する、例えば、化合物の2つの部分を共有結合によって付着させる有機部分を意味する。リンカーは、通常、直接結合または酸素もしくは硫黄などの原子、NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NHなどの単位またはそれだけには限らないが、1つもしくは複数のメチレンがO、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)によって中断または終結され得る、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、へテロアリールアルケニル、へテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル(alkylhererocyclylalkynyl)、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール(alkynylhereroaryl)、R8が、水素、アシル、脂肪族もしくは置換脂肪族である、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換複素環式などの原子の鎖を含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、約1~24個原子、2~24、3~24、4~24、5~24、6~24、6~18、7~18、8~18個の原子、7~17、8~17、6~16、7~16または8~16個の原子である。
切断可能な連結基とは、細胞の外側で十分に安定であるが、標的細胞中に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している2つの部分を放出するものである。好ましい実施形態において、切断可能な連結基は、対象の血液において、または第2の参照条件下(血液または血清において見出される条件を模倣または表すように選択され得る)よりも、標的細胞において、または第1の参照条件下(例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る)で、少なくとも約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍またはそれより多く、または少なくとも約100倍速く切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、pH、酸化還元電位または分解性分子の存在の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清または血液においてよりも細胞の内側で、より一般的であるか、またはより高いレベルもしくは活性で見出される。このような分解剤の例として、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤が挙げられ、例えば、酸化酵素もしくは還元酵素または還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、メルカプタンなどの還元剤、エステラーゼ、エンドソームまたは酸性環境を作出できる薬剤、例えば、5以下のpHをもたらすもの、一般酸、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素を含む。
切断可能な連結基、例えば、ジスルフィド結合は、pHの影響を受けやすい場合がある。ヒト血清のpHは7.4であるが、平均細胞内pHはわずかに低く、約7.1~7.3の範囲である。エンドソームは、5.5~6.0の範囲のより酸性のpHを有し、リソソームは、およそ5.0のさらにより酸性のpHを有する。いくつかのリンカーは、好ましいpHで切断され、それによって、細胞の内側でリガンドからカチオン性脂質を細胞の所望のコンパートメント中に放出する切断可能な連結基を有するであろう。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的化されるべき細胞に応じて変わり得る。例えば、肝臓標的化リガンドを、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結できる。肝臓細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、肝臓細胞において、エステラーゼが豊富ではない細胞種よりも効率的に切断される。エステラーゼが豊富な他の細胞種として、肺、腎皮質および精巣の細胞が挙げられる。
肝臓細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼが豊富な細胞種を標的化する場合には、ペプチド結合を含有するリンカーを使用できる。
一般に、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤(または条件)の、候補連結基を切断する能力を試験することによって評価できる。また、血液中で、または他の非標的組織と接触する場合に、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することも望ましいであろう。したがって、第1および第2の条件の間の切断に対する相対的感受性を決定でき、第1のものは、標的細胞において切断を示すように選択され、第2のものは、他の組織または生物学的流体、例えば、血液もしくは血清において切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養物において、臓器においてまたは組織培養物において、または動物全体において実施できる。細胞不含または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全体におけるさらなる評価によって確認することは、有用であり得る。好ましい実施形態において、有用な候補化合物は、血液もしくは血清(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)と比較して、細胞において(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)少なくとも約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90または約100倍速く切断される。
i.酸化還元切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例として、ジスルフィド連結基(-S-S-)がある。候補の切断可能な連結基が適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または、例えば、特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法に目を向けることができる。例えば、細胞、例えば、標的細胞において観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオトレイトール(DTT)または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価できる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価できる。あるものでは、候補化合物は、血液において最大で約10%切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞において(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)少なくとも約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90または約100倍速く分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態学アッセイを使用して決定できる。
ある特定の実施形態において、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例として、ジスルフィド連結基(-S-S-)がある。候補の切断可能な連結基が適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または、例えば、特定のiRNA部分および特定の標的化剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書に記載される方法に目を向けることができる。例えば、細胞、例えば、標的細胞において観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオトレイトール(DTT)または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価できる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価できる。あるものでは、候補化合物は、血液において最大で約10%切断される。他の実施形態において、有用な候補化合物は、血液(または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)と比較して、細胞において(または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)少なくとも約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90または約100倍速く分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態学アッセイを使用して決定できる。
ii.リン酸ベースの切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な連結基を含む。リン酸ベースの切断可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞中のリン酸基を切断する薬剤の例として、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。リン酸ベースの連結基の例として、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-がある。好ましい実施形態として、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-がある。好ましい実施形態として、-O-P(O)(OH)-O-がある。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な連結基を含む。リン酸ベースの切断可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって切断される。細胞中のリン酸基を切断する薬剤の例として、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。リン酸ベースの連結基の例として、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-がある。好ましい実施形態として、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-がある。好ましい実施形態として、-O-P(O)(OH)-O-がある。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
iii.酸切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸切断可能な連結基は、約6.5以下の(例えば、約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0またはそれより低い)pHを有する酸性環境において、または一般酸として作用できる酵素などの薬剤によって切断される。細胞では、特定の低pHオルガネラ、例えば、エンドソームおよびリソソームは、酸切断可能な連結基のための切断環境を提供できる。酸切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)Oまたは-OC(O)を有し得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素と結合している炭素(アルコキシ基)が、アリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはt-ブチルである場合である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸切断可能な連結基は、約6.5以下の(例えば、約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0またはそれより低い)pHを有する酸性環境において、または一般酸として作用できる酵素などの薬剤によって切断される。細胞では、特定の低pHオルガネラ、例えば、エンドソームおよびリソソームは、酸切断可能な連結基のための切断環境を提供できる。酸切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)Oまたは-OC(O)を有し得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素と結合している炭素(アルコキシ基)が、アリール基、置換アルキル基または第三級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルもしくはt-ブチルである場合である。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
iv.エステルベースの切断可能な連結基
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な連結基を含む。エステルベースの切断可能な連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な連結基は、一般式-C(O)O-または-OC(O)-を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
ある特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な連結基を含む。エステルベースの切断可能な連結基は、細胞中のエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能な連結基の例として、それだけには限らないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な連結基は、一般式-C(O)O-または-OC(O)-を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
v.ペプチドベースの切断可能な連結基
さらに別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な連結基を含む。ペプチドベースの切断可能な連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成され、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドをもたらすペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらすアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらす、ペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-、(式中、RAおよびRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である)を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
さらに別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な連結基を含む。ペプチドベースの切断可能な連結基は、細胞中のペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成され、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)およびポリペプチドをもたらすペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらすアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸の間で形成され、ペプチドおよびタンパク質をもたらす、ペプチド結合(すなわち、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチドベースの切断可能な連結基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-、(式中、RAおよびRBは、2つの隣接するアミノ酸のR基である)を有する。これらの候補は、上記のものと類似の方法を使用して評価できる。
一部の実施形態において、本発明のiRNAは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲートされる。本発明の組成物および方法のリンカーを有するiRNA炭水化物コンジュゲートの限定されるわけではない例として、それだけには限らないが、
本発明の組成物および方法のある特定の実施形態において、リガンドは、二価または三価分岐リンカーを介して付着された1つまたは複数の「GalNAc」(N-アセチルガラクトサミン)誘導体である。
ある特定の実施形態において、本発明のdsRNAは、式(XLV)~(XLVI)のいずれかで示される構造の群から選択される二価または三価分岐リンカーにコンジュゲートされる:
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5Bおよびq5Cは、各出現について独立に、0~20を表し、反復単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5Cは、各出現について各々独立に、存在しない、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NHまたはCH2Oであり、
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5Cは、各出現について独立に、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、1つまたは複数のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R’’)、C≡CまたはC(O)のうち1つまたは複数によって中断または終結され得る、
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5Cは、各出現について各々独立に、存在しない、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5BおよびL5Cは、リガンド、すなわち、各出現について各々独立に、単糖(GalNAcなど)、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖または多糖を表し、Raは、Hまたはアミノ酸側鎖である]。三価コンジュゲート性GalNAc誘導体は、標的遺伝子、例えば、式(XLIX)のもの:
GalNAc誘導体をコンジュゲートする適した二価および三価分岐リンカー基の例として、それだけには限らないが、式II、VII、XI、XおよびXIIIのような上記で列挙された構造が挙げられる。
RNAコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許として、それだけには限らないが、米国特許第4,828,979号、同4,948,882号、同5,218,105号、同5,525,465号、同5,541,313号、同5,545,730号、同5,552,538号、同5,578,717号、同5,580,731号、同5,591,584号、同5,109,124号、同5,118,802号、同5,138,045号、同5,414,077号、同5,486,603号、同5,512,439号、同5,578,718号、同5,608,046号、同4,587,044号、同4,605,735号、同4,667,025号、同4,762,779号、同4,789,737号、同4,824,941号、同4,835,263号、同4,876,335号、同4,904,582号、同4,958,013号、同5,082,830号、同5,112,963号、同5,214,136号、同5,082,830号、同5,112,963号、同5,214,136号、同5,245,022号、同5,254,469号、同5,258,506号、同5,262,536号、同5,272,250号、同5,292,873号、同5,317,098号、同5,371,241号、同5,391,723号、同5,416,203号、同5,451,463号、同5,510,475号、同5,512,667号、同5,514,785号、同5,565,552号、同5,567,810号、同5,574,142号、同5,585,481号、同5,587,371号、同5,595,726号、同5,597,696号、同5,599,923号、同5,599,928号、同5,688,941号、同6,294,664号、同6,320,017号、同6,576,752号、同6,783,931号、同6,900,297号、同7,037,646号および同8,106,022号が挙げられ、それらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物において全ての位置について均一に修飾される必要はなく、実際、前記修飾のうち2つ以上を単一化合物中に、またはさらにiRNA内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。本発明はまた、キメラ化合物であるiRNA化合物を含む。
本発明との関連で「キメラ」iRNA化合物または「キメラ」とは、各々、少なくとも1つのモノマー単位、すなわち、dsRNA化合物の場合にはヌクレオチドで構成されている、2つ以上の化学的に別個の領域を含有する、iRNA化合物、好ましくは、dsRNA剤である。これらのiRNAは通常、iRNAに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するようにRNAが修飾される少なくとも1つの領域を含有する。iRNAのさらなる領域は、RNA:DNAまたはRNA:RNAハイブリッドを切断可能な酵素の基質として働くことができる。例として、RNアーゼHは、RNA:DNA二本鎖のRNA鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、RNアーゼHの活性化は、RNA標的の切断をもたらし、それによって、遺伝子発現のiRNA阻害の効率を大きく増強する。結果的に、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシdsRNAと比較して、キメラdsRNAが使用される場合により短いiRNAで比較できる結果を得ることができることが多い。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出できる。
ある特定の例では、iRNAのRNAは、非リガンド基によって修飾できる。iRNAの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンド分子がiRNAにコンジュゲートされており、このようなコンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。このような非リガンド部分には、コレステロールなどの脂質部分[Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553]、コール酸(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053)、チオエーテル、例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306、Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765)、チオコレステロール(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533)、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111、Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49)、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651、Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777)、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)またはアダマンタン酢酸(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)、パルミチル部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229)またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)が含まれていた。このようなRNAコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列挙されている。通常のコンジュゲーションプロトコールは、配列の1つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するRNAの合成を含む。次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基が、コンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、RNAがまだ固体支持体に結合している状態で、または溶液相でRNAが切断された後に実施できる。HPLCによるRNAコンジュゲートの精製によって、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。
V.本開示のRNAi剤のデリバリー
細胞、例えば、対象内の細胞、例えば、ヒト対象(例えば、それを必要とする対象、例えば、MAPT関連障害、例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または別のタウオパチーを有する対象)内の細胞への本開示のRNAi剤のデリバリーは、いくつかの異なる方法において達成することができる。例えば、デリバリーは、細胞をインビトロまたはインビボのどちらかにおいて本開示のRNAi剤と接触させることによって実施され得る。インビボデリバリーは、RNAi剤、例えば、dsRNAを含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施してもよい。あるいは、インビボデリバリーは、RNAi剤をコードしその発現を誘導する1つまたは複数のベクターを投与することによって間接的に実施してもよい。これらの代替策は、下記においてさらに説明される。
概して、核酸分子をデリバリーする任意の方法(インビトロまたはインビボ)は、本開示のRNAi剤の使用に適合させることができる[例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Akhtar S. and Julian RL., (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144およびWO94/02595を参照されたい]。インビボデリバリーの場合、RNAi剤をデリバリーするために考慮する要因としては、例えば、デリバリーされた薬剤の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織におけるデリバリーされた薬剤の蓄積が挙げられる。RNAi剤の非特異的効果は、局所投与、例えば、組織への直接注入もしくは移植または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。処置部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化し、薬剤によって害され得るかまたは薬剤を分解することができる全身組織への薬剤の曝露を制限し、投与されるRNAi剤のより少ない合計用量を可能にする。いくつかの研究は、RNAi剤が局所的に投与された場合での遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルでの硝子体注入によるVEGF dsRNAの眼内デリバリー[Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138]およびマウスでの網膜下注入[Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216]は、両方とも、加齢黄斑変性症の実験モデルにおいて、新生血管形成を予防することが示された。加えて、マウスへのdsRNAの直接的腫瘍内注入は、腫瘍体積を減少させ[Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274]、ならびに腫瘍を有するマウスの生存を長引かせることができる[Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15:515-523]。RNA干渉は、直接注入によるCNSへの[Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93 :594-602]、および鼻腔内投与による肺への[Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11:50-55]、局所デリバリーによる成功も示している。疾患の処置のためにRNAi剤を全身投与する場合、RNAを修飾することができ、またはその代わりに、薬物デリバリーシステムを使用してデリバリーすることができ;両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによるdsRNAの急速な分解を防ぐように機能する。RNAまたは医薬担体の修飾も、標的組織へのRNAi剤の標的化を可能にすることができ、望ましくないオフターゲット効果を避けることができる(例えば、理論に束縛されることを望むわけではないが、本明細書において説明されるGNAの使用は、dsRNAのシード領域を不安定化することが特定されており、そのようなオフターゲット効果は、そのようなシード領域の不安定化によって著しく弱められるため、結果として、オフターゲット効果と比較したときのオンターゲットの有効性に対する、そのようなdsRNAの優先性を高める)。RNAi剤は、細胞取り込みを増強し、分解を防ぐように、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾することができる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートさせたApoBへと誘導されたRNAi剤を、マウスに全身的に注入したところ、結果として、肝臓および空腸の両方においてapoB mRNAのノックダウンを生じた[Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432:173-178]。アプタマーへのRNAi剤のコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害し、腫瘍縮小を媒介することが分かっている[McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015]。代替の実施形態において、RNAi剤は、薬物デリバリーシステム、例えば、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性デリバリーシステムなどを使用してデリバリーすることができる。正に帯電したカチオン性デリバリーシステムは、分子RNAi剤(負に帯電した)の結合を促進し、負に帯電した細胞膜での相互作用も高め、それにより、細胞によるRNAi剤の効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、RNAi剤に結合することができるか、またはRNAi剤を封入するベシクルまたはミセルを形成するように誘導することができる[例えば、Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116を参照されたい]。ベシクルまたはミセルの形成はさらに、全身投与したときのRNAi剤の分解を防ぐ。カチオン性RNAi剤複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である[例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205を参照されたい]。RNAi剤の全身デリバリーにとって有用な薬物デリバリーシステムのいくつかの非限定的な例としては、DOTAP[Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra]、オリゴフェクタミン(Oligofectamine)、「固体核酸脂質粒子」[Zimmermann, TS. et al., (2006) Nature 441:111-114]、カルジオリピン[Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091]、ポリエチレンミン[Bonnet ME. et al., (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659]、Arg-Gly-Asp(RGD)ペプチド[Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487]、およびポリアミドアミン[Tomalia, DA. et al., (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804]が挙げられる。一部の実施形態において、RNAi剤は、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。投与の方法およびRNAi剤とシクロデキストリンとによる医薬組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,427,605号に見出すことができる。
本開示のある特定の態様は、細胞においてMAPT標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、細胞を本開示の二本鎖RNAi剤と接触させることを含む方法に関する。一実施形態において、細胞は、肝外細胞、適宜、CNS細胞である。他の実施形態において、細胞は肝細胞(heptic cell)である。
本開示の別の態様は、対象においてMAPT標的遺伝子の発現を減少させる方法であって、対象に本開示の二本鎖RNAi剤を投与することを含む方法に関する。
本開示の別の態様は、CNS障害(神経変性障害)を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の本開示の二本鎖MAPT標的化RNAi剤を対象に投与すること、それによって対象を処置することを含む方法に関する。対象の神経変性障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連している。MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こすおそれがある。
本開示の方法によって処置することができる例示的なCNS障害としては、MAPT関連疾患CNS障害、例えば、タウオパチー、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)が挙げられる。
一実施形態において、二本鎖RNAi剤は、髄腔内投与される。二本鎖RNAi剤の髄腔内投与によって、方法は、脳(例えば、線条体)または脊柱組織、例えば、皮質、小脳、頚椎、腰椎、および胸椎、免疫細胞、例えば、単球およびT細胞でのMAPT標的遺伝子の発現を低減させることができる。
解説の容易さのために、このセクションにおける製剤、組成物、および方法は、主に、修飾されたsiRNA化合物に関して説明される。しかしながら、これらの製剤、組成物、および方法は、他のsiRNA化合物、例えば、未修飾siRNA化合物によって実践することができ、そのような実践は、本開示内であることは理解され得る。RNAi剤を含む組成物は、様々な経路によって対象にデリバリーすることができる。例示的経路としては、髄腔内、静脈内、局所、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、経肺、および経眼が挙げられる。
本開示のRNAi剤は、投与にとって好適な医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、通常、1種または複数種のRNAi剤と薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において使用される場合、語句「薬学的に許容される担体」は、医薬投与に適合性の、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗真菌剤および防かび剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに同様のものを含むことが意図される。薬学的に活性な物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来的な媒質または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除き、組成物におけるそれらの使用は想到される。補足の有効成分もまた組成物に組み込まれ得る。
本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、ならびに処置されるエリアに応じて、いくつかの方法において投与され得る。投与は、局所(例えば、点眼、経膣、経直腸、鼻腔内、経皮など)、髄腔内、経口、または非経口投与であり得る。非経口投与は、点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉注射、または髄腔内または脳室内投与を含む。
投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択され得る。例えば、神経または脊柱組織を標的化するためには、髄腔内注射が論理的な選択であろう。肺細胞は、エアゾール形態でのRNAi剤の投与によって標的化され得る。血管内皮細胞は、RNAi剤によるバルーンカテーテルのコーティングおよびRNAの機械的導入によって標的化され得る。
局所投与用製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、または油状基剤、増粘剤なども必要であり得、または望ましくあり得る。被覆したコンドーム、手袋なども有用であり得る。
経口投与用組成物は、散剤または顆粒剤、水中における懸濁剤または溶液剤、シロップ剤、エキシル剤または非水性媒体、タブレット剤、カプセル剤、ドロップ剤、またはトローチ剤を含む。錠剤の場合、使用できる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸の塩が挙げられる。様々な崩壊剤、例えば、デンプンなど、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルクなどが、錠剤において一般的に使用される。カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。経口投与に水性懸濁液が必要な場合、核酸組成物は、乳化剤および懸濁剤と組み合わせることができる。所望の場合、ある特定の甘味剤または風味剤を加えることができる。
髄腔内または脳室内投与用の組成物は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌水溶液を含み得る。
非経口投与用の製剤は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る無菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えばリザーバーに取り付けられた、脳室内カテーテルによって促進され得る。静脈内使用の場合、溶質の総濃度は、調製物を等張にするように制御され得る。
一実施形態において、siRNA化合物、例えば、二本鎖siRNA化合物、またはssiRNA化合物、組成物の投与は、非経口、例えば、静脈内(例えば、ボーラスとして、または拡散性注入として)、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、心室内、脳内、皮下、経粘膜、頬側、舌下、内視鏡下、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、経尿道、または経眼である。投与は、本人によって、または他の人、例えば、医療提供者などによって提供され得る。医薬品は、測定された用量において、または秤量された用量をデリバリーするディスペンサーにおいて提供することができる。選択されたデリバリーのモードは、下記においてより詳細に説明される。
A.髄腔内投与
一実施形態において、二本鎖RNAi剤は、髄腔内注入(すなわち、脳および脊髄組織を浸す髄液への注入)によってデリバリーされる。髄液へのRNAi剤の髄腔内注入は、ボーラス注入として、または、皮下に注入することができるミニポンプによって、実施することができ、それにより、髄液中へのsiRNAの規則正しい一定のデリバリーを提供することができる。髄液が産生される脈絡叢からの髄液の循環は、脊髄および後根神経節の周りを下り、その後、小脳を通過して、クモ膜顆粒へと皮質を越え、そこで、体液はCNSを出ることができ、注入された化合物のサイズ、安定性、および溶解性に応じて、髄腔内によりデリバリーされる分子は、CNS全体を通して標的を攻撃することができる。
一実施形態において、二本鎖RNAi剤は、髄腔内注入(すなわち、脳および脊髄組織を浸す髄液への注入)によってデリバリーされる。髄液へのRNAi剤の髄腔内注入は、ボーラス注入として、または、皮下に注入することができるミニポンプによって、実施することができ、それにより、髄液中へのsiRNAの規則正しい一定のデリバリーを提供することができる。髄液が産生される脈絡叢からの髄液の循環は、脊髄および後根神経節の周りを下り、その後、小脳を通過して、クモ膜顆粒へと皮質を越え、そこで、体液はCNSを出ることができ、注入された化合物のサイズ、安定性、および溶解性に応じて、髄腔内によりデリバリーされる分子は、CNS全体を通して標的を攻撃することができる。
一部の実施形態において、髄腔内投与は、ポンプを介して行われる。ポンプは、外科手術によって移植された浸透圧ポンプであり得る。一実施形態において、浸透圧ポンプは、髄腔内投与を容易にするために、脊柱管の髄腔内に移植される。
一部の実施形態において、髄腔内投与は、ある量の医薬品を収容するリザーバーおよびリザーバーに収容された医薬品の一部をデリバリーするように構成されたポンプを含む、製薬品の髄腔内デリバリーシステムを介して行われる。この髄腔内デリバリーシステムについてのさらなる詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、WO2015/116658に見出され得る。
髄腔内注入されたRNAi剤の量は、一方の標的遺伝子から別の標的遺伝子へと変わり得、ならびに適用されるべき適切な量は、各標的遺伝子に対して個別に決定しなければならない場合がある。典型的には、この量は、10μgから2mg、好ましくは50μgから1500μg、より好ましくは100μgから1000μgの範囲である。
B.本開示のベクターコードRNAi剤
MAPT遺伝子を標的化するRNAi剤は、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写物ユニットから発現され得る[例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; WO 00/22113、WO 00/22114、およびUS 6,054,299を参照されたい]。発現は、好ましくは、使用される特定のコンストラクトならびに標的組織または細胞タイプに応じて継続される(数か月またはそれ以上)。これらの導入遺伝子は、直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、それらは、統合ベクターまたは非統合ベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継代されることを可能にするように構築することもできる[Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292]。
MAPT遺伝子を標的化するRNAi剤は、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写物ユニットから発現され得る[例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; WO 00/22113、WO 00/22114、およびUS 6,054,299を参照されたい]。発現は、好ましくは、使用される特定のコンストラクトならびに標的組織または細胞タイプに応じて継続される(数か月またはそれ以上)。これらの導入遺伝子は、直鎖状コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、それらは、統合ベクターまたは非統合ベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継代されることを可能にするように構築することもできる[Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292]。
RNAi剤の個々の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写させることができる。2つの別々の鎖が、例えば、dsRNAを産生するように発現される場合、2つの別々の発現ベクターを、標的細胞中に共導入することができる(例えば、トランスフェクションまたは感染によって)。あるいは、dsRNAのそれぞれ個別の鎖を、両方が同じ発現プラスミド上に位置されたプロモーターによって転写させることができる。一実施形態において、dsRNAは、dsRNAがステム-アンド-ループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
RNAi剤発現ベクターは、一般的に、DNAプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞に対して適合性の発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に対して適合性の発現ベクターを使用することにより、本明細書において説明されるRNAi剤の発現のための組換えコンストラクトを生成することができる。RNAi剤発現ベクターのデリバリーは、例えば、静脈内または筋肉内投与によって、患者から外植された標的細胞への投与とその後の患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって、全身性であり得る。
本明細書において説明される方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるわけではないが、(a)アデノウィルスベクター;(b)レトロウイルスベクター、例えば、これらに限定されるわけではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど;(c)アデノ随伴ウイルスベクター;(d)単純ヘルペスウイルスベクター;(e)SV40ベクター;(f)ポリオームウイルスベクター;(g)パピローマウイルスベクター;(h)ピコルナウイルスベクター;(i)水泡ウイルスベクター、例えば、オルソポックス、例えば、種痘疹ウイルスベクターなど、または鳥ポックス(avipox)、例えば、カナリア痘または家禽ジフテリアなど;ならびに(j)ヘルパー依存性またはガットレス(gutless)アデノウィルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるかまたは組み込まれないであろう。コンストラクトは、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含ませることができる。あるいは、コンストラクトは、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、EPVおよびEBVベクターなどに組み込むことができる。RNAi剤の組換え発現のためのコンストラクトは、概して、標的細胞におけるRNAi剤の発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、などを必要とするであろう。ベクターおよびコンストラクトを考慮する他の態様は、当技術分野で公知である。
VI.本発明の医薬組成物
本開示は、本開示のRNAi剤を含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態において、本明細書において説明されるRNAi剤と、薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物が本明細書において提供される。RNAi剤を含む医薬組成物は、MAPTの発現または活性に関連する疾患または障害、例えば、MAPT関連疾患の処置にとって有用である。
本開示は、本開示のRNAi剤を含む医薬組成物および製剤も含む。一実施形態において、本明細書において説明されるRNAi剤と、薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物が本明細書において提供される。RNAi剤を含む医薬組成物は、MAPTの発現または活性に関連する疾患または障害、例えば、MAPT関連疾患の処置にとって有用である。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、エクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害するためのdsRNA剤である。
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は、無菌である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、パイロジェンフリーである。
そのような医薬組成物は、デリバリーのモードに基づいて製剤化される。一例は、非経口デリバリー、例えば、静脈内(IV)、筋肉内(IM)、または皮下(subQ)デリバリーによる全身投与のために製剤化される組成物である。別の例は、例えば、注入の髄腔内または硝子体内経路、適宜、脳(例えば、線状体)内への注入、例えば、連続ポンプ注入などによる、CNS内への直接デリバリーのために製剤化された組成物である。
本開示の医薬組成物は、MAPT遺伝子の発現を阻害するのに十分な投薬量において投与され得る。概して、本開示のRNAi剤の好適な用量は、1日あたりレシピエントの体重1キログラムあたり約0.001ミリグラムから約200.0ミリグラムの範囲、概して、1日あたり体重1キログラムあたり約1mgから50mgの範囲であろう。
反復投薬計画は、定期的な、例えば、月1回から6か月毎に1回などのRNAi剤の治療量の投与を含み得る。ある特定の実施形態において、RNAi剤は、四半期に約1回(すなわち、3か月毎に約1回)から1年に約2回、投与される。
初期処置計画(例えば、初回負荷量)の後、処置は、低頻度において投与することができる。
他の実施形態において、医薬組成物の単回投与は、継続することができ、それにより、その後の用量は、1か月以下、2か月以下、3か月以下、もしくは4か月以下、またはそれ以上の間隔において投与される。本開示の一部の実施形態において、本開示の医薬組成物の単回投与は、月1回投与される。本開示の他の実施形態において、本開示の医薬組成物の単回投与は、四半期に1回から年に2回において投与される。
当業者は、ある特定の要因、例えば、これらに限定されるわけではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康全般または年齢、および他の存在する疾患など、は、対象を効果的に処置するために必要な投薬量および投薬のタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するだろう。その上、治療有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置または一連の処置を含み得る。
マウス遺伝学における進歩は、様々なヒト疾患、例えば、MAPTの発現の減少が有益であろうALSおよびFTDなどの研究のための多くのマウスモデルを生み出した。そのようなモデルは、RNAi剤のインビボ試験のため、ならびに治療有効用量を決定するために使用することができる。好適な齧歯類モデルは、当技術分野で公知であり、例えば、Cepeda, et al. (ASN Neuro (2010) 2(2):e00033)およびPouladi, et al. (Nat Reviews (2013) 14:708)に記載されるものなどが挙げられる。
本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、および処置されるエリアに応じて、いくつかの方法において投与することができる。投与は、局所(例えば、経皮貼布による)、経肺、(例えば、ネブライザーなどによる散剤またはエアゾール剤の吸入または吹送による);気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入;皮下(例えば、移植されたデバイスによる)、または脳内(例えば、実質内、髄腔内、または心室内投与による)を含む。
RNAi剤は、特定の組織、例えば、CNS(例えば、脳のニューロン、膠細胞、または維管束組織)などを標的化する方式においてデリバリーすることができる。
局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤、および散剤を含み得る。従来の、医薬担体、水性、粉末状、または油性基剤、増粘剤などは、必要であり得るか、または望ましくあり得る。被覆されたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所用製剤としては、本開示において特徴とされるRNAi剤が、局所デリバリー剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤、および界面活性物質との混合物であるような製剤が挙げられる。好適な脂質およびリポソームとしては、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOPE、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン)、陰性(例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールDMPG)、およびカチオン性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA)が挙げられる。本開示において特徴とされるRNAi剤は、リポソーム内においてカプセル化することができ、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成することができる。あるいは、RNAi剤は、脂質、特にカチオン性脂質に対して複合体化することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、これらに限定されるわけではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプロエート、1-ドデシルアザシクロヘプタナ-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはC1~20アルキルエステル(例えば、イソプロピルミリステートIPM)、モノグリセライド、ディグリセライド、またはそれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。局所用製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、US6,747,014において詳細に説明されている。
A.膜分子アセンブリを含むRNAi剤製剤
本開示の組成物および方法における使用のためのRNAi剤は、膜分子アセンブリ、例えば、リポソームまたはミセルでのデリバリー用に製剤化することができる。本明細書において使用される場合、用語「リポソーム」は、少なくとも1つの二層、例えば、1つの二層または複数の二層において整列された両親媒性脂質で構成されたベシクルを意味する。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性内部とを有する単層および多層ラメラベシクルを含む。水性部分は、RNAi剤組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を、典型的にはRNAi剤組成物を含まない(いくつかの例では、含む場合もある)水性外部から隔離する。リポソームは、作用部位への活性成分の移送およびデリバリーにとって有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用される場合、リポソーム二層は、細胞膜の二層と融合する。リポソームと細胞の併合が進行するため、RNAi剤を含む内部水性内容物は、細胞内へとデリバリーされ、そこで、RNAi剤は、標的RNAに特異的に結合することができ、RNAiを媒介することができる。場合によって、リポソームはまた、例えば、RNAi剤を特定の細胞タイプに誘導するために、特異的に標的化される。
本開示の組成物および方法における使用のためのRNAi剤は、膜分子アセンブリ、例えば、リポソームまたはミセルでのデリバリー用に製剤化することができる。本明細書において使用される場合、用語「リポソーム」は、少なくとも1つの二層、例えば、1つの二層または複数の二層において整列された両親媒性脂質で構成されたベシクルを意味する。リポソームは、親油性材料から形成された膜と水性内部とを有する単層および多層ラメラベシクルを含む。水性部分は、RNAi剤組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を、典型的にはRNAi剤組成物を含まない(いくつかの例では、含む場合もある)水性外部から隔離する。リポソームは、作用部位への活性成分の移送およびデリバリーにとって有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に似ているため、リポソームが組織に適用される場合、リポソーム二層は、細胞膜の二層と融合する。リポソームと細胞の併合が進行するため、RNAi剤を含む内部水性内容物は、細胞内へとデリバリーされ、そこで、RNAi剤は、標的RNAに特異的に結合することができ、RNAiを媒介することができる。場合によって、リポソームはまた、例えば、RNAi剤を特定の細胞タイプに誘導するために、特異的に標的化される。
RNAi剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製することができる。一例において、リポソームの脂質成分が界面活性剤に溶解され、それにより、脂質成分によってミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであり得る。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的界面活性剤としては、コレート、CHAPS、オクチルグルコシド、デオキシコレート、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、RNAi剤が、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質上のカチオン性基は、RNAi剤と相互作用し、RNAi剤の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、界面活性剤は、RNAi剤のリポソーム調製物を得るために、例えば、透析などによって除去される。
必要であれば、凝集反応の際に、例えば、制御された添加によって、凝集を補助する担体化合物を加えることもできる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマーであり得る(例えば、スペルミン、またはスペルミジン)。凝縮を支持するために、pHも調整することができる。
デリバリービヒクルの構造要素としてポリヌクレオチド/カチオン性脂質複合体を組み込む、安定なポリヌクレオチドデリバリービヒクルを生成する方法は、例えば、WO96/37194においてより詳細に説明されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。リポソームの形成は、Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417;米国特許第4,897,355号;国特許第5,171,678号;Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23:238; Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9; Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169; Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339; and Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757において説明される例示的方法の1つまたは複数の態様も含むことができる。デリバリービヒクルとしての使用のために適切なサイズの脂質集合体を調製するために一般的に使用される方法としては、超音波処理ならびに凍結融解および押出加工が挙げられる[例えば、Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161を参照されたい]。一貫して小さくて(50nmから200nm)比較的均一な集合体が所望される場合、顕微溶液化を使用することができる[Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169]。これらの方法は、RNAi剤調製物をリポソーム内にパッキングすることに容易に適合される。
リポソームは、2つの広いクラスに分類される。カチオン性リポソームは、正に帯電したリポソームであり、負に帯電した核酸分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正に帯電した核酸/リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性pHにより、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中へと放出する[Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985]。
リポソームは、pH感応性(pH-sensitive)であるかまたは負に帯電しており、それらとの複合体ではなく核酸を捕捉する。核酸および脂質の両方が、同じように荷電されるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、いくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部へと捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養中の細胞単層にデリバリーするために、pH感応性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的遺伝子において検出された[Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274]。
リポソーム組成物の主要なタイプの1つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン(PC)、例えば、大豆PCおよび卵PCなど、から形成される。別のタイプは、リン脂質またはホスファチジルコリンまたはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロおよびインビボにおいてリポソームを細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第5,283,185号;米国特許第5,171,678号;WO94/00569;WO93/24640;WO91/16024;Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550; Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649; Gershon, (1993) Biochem. 32:7143; and Strauss, (1992) EMBO J. 11:417が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールとを含む系も、皮膚への薬物のデリバリーにおけるそれらの有用性を判定するために調べられている。ノバソーム(Novasome)(商標) I(ジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル)およびノバソーム(商標) II(ジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮中にシクロスポリン-Aをデリバリーするために使用された。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリン-Aの蓄積を促進することにおいて有効であることを示した[Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466]。
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、当該用語は、本明細書において使用される場合、リポソームに組み込まれた場合に、結果としてそのような特化された脂質を欠くリポソームと比較して増強された循環寿命を生じるような1つまたは複数の特化された脂質を含むリポソームを意味する。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、(A)1つまたは複数の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシドGM1を含むもの、または(B):1つまたは複数の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)部分などによって誘導体化されるものである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはPEG誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームの場合、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系(RES)の細胞内への減少した取り込みに由来すると、当技術分野において考えられる[Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765]。
1つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Papahadjopoulosら[Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64]は、リポソームの血液半減期を改善する、モノシアロガングリオシドGM1、硫酸ガラクトセレブロシドサルフェート、およびホスファチジルイノシトールの能力について報告している。これらの知見は、Gabizonら[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85,:6949]によって解説されている。米国特許第4,837,028号およびWO88/04924(両方ともAllenらによる)では、(1)スフィンゴミエリン、および(2)ガングリオシドGM1またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第5,543,152号(Webbら)では、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示されている。1,2-sn-ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、WO97/13499(Limら)において開示されている。
一実施形態において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的には融合することができないが、インビボにおいてマクロファージによって取り込まれるため、RNAi剤をマクロファージにデリバリーするために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性および生分解性であること;リポソームは、様々な水および脂質溶解性薬物を組み込むことができること;リポソームは、それらの内部コンパートメント内のカプセル化されたRNAi剤を、代謝および劣化から保護することができることが挙げられる[Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245]。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事柄は、脂質表面の電荷、ベシクルのサイズ、およびリポソームの水の量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるN-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル塩化アンモニウム(DOTMA)は、小さいリポソームを形成するために使用することができ、リポソームは、自然に核酸と相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することができる脂質-核酸複合体を形成し、それにより、結果としてRNAi剤のデリバリーをもたらす(例えば、DOTMAおよびDNAによるその使用の説明は、Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417、および米国特許第4,897,355号を参照されたい)。
DOTMAアナログである1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニア)プロパン(DOTAP)は、リン脂質と組み合わせて使用することにより、DNA複合体化ベシクルを形成することができる。リポフェクチン(商標)(Bethesda Research Laboratories、ゲイザースバーグ、メリーランド州)は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したDOTMAリポソームを含む、生きた組織培養細胞内への高いアニオン性の核酸のデリバリーのための有効な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、結果として得られる複合体上の正味電荷も正である。この方法において調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜と融合して、機能的核酸を、例えば、組織培養細胞内へと効率的にデリバリーする。別の市販のカチオン性脂質である1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3,3-(トリメチルアンモニア)プロパン(「DOTAP」)(Boehringer Mannheim、インディアナポリス、インディアナ)は、オレオイル部分が、エーテル連結ではなくエステルによって連結されている点においてDOTMAとは異なっている。
他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、様々な部分にコンジュゲートしているもの、例えば、2つのタイプの脂質の一方にコンジュゲートしているカルボキシスペルミンなど、ならびに5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド(「DOGS」)(トランスフェクタム(商標)、Promega、マディソン、ウィスコンシン州)およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミル-アミド(「DPPES」)などの化合物が挙げられる(例えば、米国特許第5,171,678号を参照されたい)。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、DOPEと組み合わせてリポソーム中へと製剤化されているコレステロールによる脂質の誘導体化(「DC-Chol」)を含む[Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280を参照されたい]。ポリリジンをDOPEにコンジュゲートさせることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションにとって効果的であることが報告されている[Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8]。ある特定の細胞系にとって、コンジュゲートしたカチオン性脂質を含むこれらのリポソームは、低い毒性を示すと言われており、DOTMA含有組成物よりもより効率的なトランスフェクションを提供する。他の市販のカチオン性脂質製品としては、DMRIEおよびDMRIE-HP(Vical、ラ・ホーヤ、カリフォルニア)およびリポフェクタミン(DOSPA)(Life Technology, Inc.、ゲイザースバーグ、メリーランド州)が挙げられる。オリゴヌクレオチドのデリバリーにとって好適な他のカチオン性脂質は、WO98/39359およびWO96/37194に記載されている。
リポソーム製剤は、局所性投与に対して特に適しており、リポソームは、他の製剤に勝るいくつかの利点を提示する。そのような利点としては、投与された薬物の高い体内吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の累積の増加、およびRNAi剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。いくつかの実践形態において、リポソームは、RNAi剤を上皮細胞にデリバリーするため、および皮膚組織内、例えば、皮膚内へのRNAi剤の浸透を増強するためにも、使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所デリバリーは、文献に報告されている[例えば、Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56:267-276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol. 149:157-176; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527; Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855を参照されたい]。
非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系、も、皮膚への薬物のデリバリーにおけるそれらの有用性を判定するためにも調べられている。マウスの皮膚の真皮内に薬物をデリバリーするために、ノバソームI(ジラウリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル)およびノバソームII(ジステアリン酸グリセリル/コレステロール/ポリオキシエチレン-10-ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。RNAi剤を伴うそのような製剤は、皮膚科障害を処置するために有用である。
RNAi剤を含むリポソームは、非常に変形可能に作製することができる。そのような変形能は、リポソームがリポソームの平均半径より小さい孔を通って浸透することを可能にする。例えば、トランスファーソーム(transfersome)は、変形可能なタイプのリポソームである。トランスファーソームは、表面エッジ活性化剤(surface edge activator)、通常は界面活性剤を標準的リポソーム組成物に加えることによって作製することができる。RNAi剤を含むトランスファーソームは、RNAi剤を皮膚のケラチン生成細胞にデリバリーするために、感染によって、例えば皮下に、デリバリーすることができる。無傷の哺乳動物の皮膚を横断するために、脂質ベシクルは、好適な経皮勾配の影響下において、それぞれが50nm未満の直径を有する一連の微細な孔を通過しなければならない。加えて、脂質特性に起因して、これらのトランスファーソームは、自己最適性(例えば皮膚などにおける孔の形状に適応性のある)、自己修復性であり得、ならびに断片化することなく頻繁にそれらの標的に達することができ、多くの場合、自己装填することができる。
本開示に適した他の製剤は、2008年1月2日に出願された米国特許仮出願第61/018,616号;2008年1月2日に出願された米国特許仮出願第61/018,611号;2008年3月26日に出願された米国特許仮出願第61/039,748号;2008年4月22日に出願された米国特許仮出願第61/047,087号;および2008年5月8日に出願された米国特許仮出願第61/051,528号に記載される。2007年10月3日に出願されたPCT出願第PCT/US2007/080331号にも、本開示に適した製剤について記載されている。
トランスファーソームは、別のタイプのリポソームであり、薬物デリバリーシステムの魅力的な候補である、非常に変形可能な脂質集合体である。トランスファーソームは、非常に変形可能であるため、脂質滴より小さい孔を通って容易に浸透することができる、脂質滴として説明することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応し、例えば、それらは、自己最適性(皮膚における孔の形状に適応性のある)であり、自己修復性であり、断片化することなく頻繁にそれらの標的に達し、多くの場合、自動装填性である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤を標準的リポソーム組成物に加えることができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンをデリバリーするために使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介デリバリーは、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注入と同じくらい有効であることが分かっている。
界面活性剤は、本明細書において説明されるような製剤において、特にエマルション(マイクロエマルションを含む)において、広い応用を見い出す。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最も一般的な方法は、親水性/親油性バランス(HLB)の使用による方法である。親水性基(「ヘッド」としても知られる)の性質は、製剤に使用される様々な界面活性剤をカテゴライズするための最も有用な手段を提供する(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧製品において広い応用を見い出し、広い範囲のpH値において使用可能である。概して、それらのHLB値は、それらの構造に応じて2から約18の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化/プロポキシル化ブロックポリマーなど、も、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーである。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、例えば、石鹸など、アシルラクチレ-ト、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなど、スルホネート、例えば、アキルベンゼンスルホネート、など、アシルイセチオネート、アシルタウレート、ならびにスルホスクシネートおよびホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーは、アルキル硫酸エステルおよび石鹸である。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、N-アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。薬品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用は、概説されている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。
本開示の方法での使用のためのRNAi剤は、ミセル製剤としても提供することができる。「ミセル」は、本明細書において、分子の全ての疎水性基が内側を向くように両親媒性分子が球状構造において整列され、それにより、親水性部分を周囲の水相に接触させたままにする、特定のタイプの分子アセンブリとして定義される。環境が疎水性の場合、逆の配置も存在する。
経皮的な膜によるデリバリーにとって好適な混合ミセル製剤は、siRNA組成物の水溶液と、アルカリ金属のC8からC22アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物とを混合することによって調製され得る。例示的ミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリチシャ油、月見草油、メンソール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容される塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびそのアナログ、ポリドカノールアルキルエーテルおよびそのアナログ、ケノデオキシコレート(chenodeoxycholate)、デオキシコレート、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属のアルキル硫酸塩と同時に加えてもよく、またはそれらを加えた後に加えてもよい。混合ミセルは、原材料の、実質的に任意の種類の混合によって形成されるであろうが、より小さいサイズのミセルを提供するために、激しい混合によって形成されるであろう。
一方法において、第1のミセル組成物は、siRNA組成物と少なくともアルカリ金属アルキル塩酸塩とを含むように調製される。第1のミセル組成物は、次いで、少なくとも3つのミセル形成化合物と混合され、混合ミセル組成物を形成する。別の方法において、ミセル組成物は、siRNA組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と、ミセル形成化合物のうちの少なくとも1つとを混合し、その後に、激しく混合しながら、残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
製剤を安定化させるため、および細菌増殖から保護するために、フェノールまたはm-クレゾールを混合ミセル組成物に加えてもよい。あるいは、フェノールまたはm-クレゾールを、ミセル形成原材料と共に加えてもよい。グリセリンなどの等張剤を、混合ミセル組成物の形成後に加えてもよい。
噴霧剤としてのミセル製剤のデリバリーのために、製剤を、エアゾールディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーは、発射薬を装填される。加圧下の発射薬は、ディスペンサー内において液体状態である。原材料の比率は、水相および発射薬相が1つになるように、すなわち、1つの相が存在するように調整される。2つの相が存在する場合、例えば、計量式バルブなどによって、内容物の一部を分配する前に、ディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品の分配用量が、微細な噴霧において計量式バルブから射出される。
発射薬は、含水素クロロフルオロカーボン、含水素フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを含み得る。ある特定の実施形態において、HFA134a(1,1,1,2テトラフルオロエタン)が使用され得る。
必須の原材料の特定の濃度は、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔による吸収のために、射出のためまたは胃腸管を通る投与のために、投薬量を、例えば、少なくとも二倍または三倍に増加させることは、多くの場合、望ましい。
B.脂質粒子
RNAi剤、例えば、本開示のdsRNAは、脂質製剤、例えば、LNPなど、または他の核酸-脂質粒子において、完全にカプセル化され得る。
RNAi剤、例えば、本開示のdsRNAは、脂質製剤、例えば、LNPなど、または他の核酸-脂質粒子において、完全にカプセル化され得る。
本明細書において使用される場合、用語「LNP」は、安定な核酸-脂質粒子を意味する。LNPは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲート)を含む。LNPは、静脈内注射(i.v.)後に、延長された循環寿命を示し、遠位部位(例えば、投与部位から物理的に分離された部位)において蓄積するため、全身投与にとって非常に有用である。LNPは、「pSPLP」を含み、それは、WO00/03683において詳しく説明されるようなカプセル化された縮合剤-核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には、約50nmから約150nm、より典型的には約60nmから約130nm、より典型的には約70nmから約110nm、最も典型的には約70nmから約90nmの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、核酸は、本開示の核酸-脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を有する。核酸-脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第5,976,567号;同第5,981,501号;同第6,534,484号;同第6,586,410号;同第6,815,432号;米国特許出願公開第2010/0324120号、およびWO96/40964において開示されている。
一実施形態において、脂質と薬物の比率(質量/質量比)(例えば、脂質とdsRNAの比率)は、約1:1から約50:1、約1:1から約25:1、約3:1から約15:1、約4:1から約10:1、約5:1から約9:1、または約6:1から約9:1の範囲であるだろう。上記に列記した範囲の中間的な範囲も、本開示の一部であることが想到される。
RNAi剤のデリバリーのためのある特定のLNP製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、WO2008/042973などにおいて説明されるような「LNP01」製剤など、当技術分野において説明されている。
追加の例示的脂質-dsRNA製剤は、下記の表2において特定される。
表1
DSPC:ジステアロイルホスファチジルコリン;DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン;PEG-DMG:PEG-ジジミリストイルグリセロール(C14-PEG、またはPEG-C14)(PEGは2000の平均分子量を有する);PEG-DSG:PEG-ジスチリルグリセロール(C18-PEG、またはPEG-C18)(PEGは2000の平均分子量を有する);PEG-cDMA:PEG-カルバモイル-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(PEGは2000の平均分子量を有する)およびSNALP(1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA))を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、WO2009/127060に記載されている。
DSPC:ジステアロイルホスファチジルコリン;DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン;PEG-DMG:PEG-ジジミリストイルグリセロール(C14-PEG、またはPEG-C14)(PEGは2000の平均分子量を有する);PEG-DSG:PEG-ジスチリルグリセロール(C18-PEG、またはPEG-C18)(PEGは2000の平均分子量を有する);PEG-cDMA:PEG-カルバモイル-1,2-ジミリスチルオキシプロピルアミン(PEGは2000の平均分子量を有する)およびSNALP(1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA))を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、WO2009/127060に記載されている。
XTCを含む製剤は、WO2010/088537に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。MC3を含む製剤は、例えば、米国特許出願公開第2010/0324120号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ALNY-100を含む製剤は、WO2010/054406に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
C12-200を含む製剤は、WO2010/129709に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末剤または粒剤、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体における懸濁剤または溶液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サッシェ、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤は、望ましくあり得る。一部の実施形態において、経口製剤は、本開示において特徴とされるdsRNAが、1つまたは複数の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併せて投与される、製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸またはそれらの塩が挙げられる。好適な胆汁酸/塩としては、ケノデオキシコール酸(CDCA)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(UDCA)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸(glucholic acid)、グリコール酸(glycholic acid)、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル1-モノカプロエート、1-ドデシルアザシクロヘプタナ-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセライド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容される塩(例えば、ナトリウム)が挙げられる。一部の実施形態において、浸透促進剤の組合せ、例えば、胆汁酸/塩と組み合わされた脂肪酸/塩などが使用される。例示的組合せの1つは、ラウリン酸、カプリン酸、およびUDCAのナトリウム塩である。さらに、浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる。本開示において特徴とされるdsRNAは、噴霧された乾燥粒子などの粒状において、経口によりデリバリーすることができ、またはマイクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化することができる。dsRNA複合剤としては、ポリ-アミノ酸;ポリイミン;ポリアクリレート;ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート;カチオン化されたゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(PEG)、およびデンプン;ポリアルキルシアノアクリレート;DEAE誘導体化ポリイミン、プルラン(pollulan)、セルロース、およびデンプンが挙げられる。好適な複合剤としては、キトサン、N-トリメチルキトサン、ポリーLリジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンP(TDAE)、ポリアミノスチレン(例えば、p-アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、DEAE-メタクリレート、DEAE-ヘキシルアクリレート、DEAE-アクリルアミド、DEAE-アルブミン、およびDEAEデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(D,L-乳酸)、ポリ(DL-乳酸-コ-グリコール酸(PLGA)、アルギネート、およびポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。dsRNAのための経口製剤およびその調製は、米国特許第6,887,906号、米国特許出願公開第2003/0027780号、および米国特許第6,747,014号において詳細に説明されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内(脳内へ)、髄腔内、脳室内、または肝内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤、例えば、これらに限定されるわけではないが、浸透促進剤、担体化合物、他の薬学的に許容される担体または賦形剤などを含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。
本開示の医薬組成物は、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤を含む。これらの組成物は、これらに限定されるわけではないが、予め形成された液体、自己乳化性固体、および自己乳化性半固体を含む様々な成分から生成することができる。特に好ましいのは、MAPT関連疾患または障害を処置する場合において脳を標的化する製剤である。
本開示の医薬製剤は、単位剤形において簡便に提示することができ、製薬産業において周知の従来技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と混合する工程を含む。概して、製剤は、活性成分を液体担体または微粉化された固体担体またはその両方と均一にかつ密接に混合し、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
本開示の組成物は、例えば、これらに限定されるわけではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、軟質ゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化することができる。本開示の組成物は、水性媒質、非水性媒質、または混合媒質における懸濁液としても製剤化することができる。水懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどをさらに含有することができる。懸濁液は、安定化剤も含有することができる。
C.さらなる製剤
i.エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が通常は直径0.1μmを超える液滴の形態において別の液体に分散された不均質系である[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照されたい]。エマルションは、多くの場合、お互いに十分に混合され分散された2つの不混和性液相を含む二相系である。一般的に、エマルションは、油中水(w/o)種または水中油(o/w)種のどちらかであり得る。水相が、微細化されて微細な液滴として大量の油相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、油中水(w/o)エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が、微細化されて微細な液滴として大量の水相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、水中油(o/w)エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相および、水相中また油相中のどちらかの溶液としてまたはそれ自体別々の相として存在し得る活性薬物に加えて、追加の成分を含有することができる。乳化剤、安定化剤、染料、および抗酸化剤などの医薬品賦形剤も、必要であれば、エマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油(o/w/o)および水中油中水(w/o/w)エマルションの場合など、3相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二相エマルションでは提供することができないある特定の利点を提供する。o/wエマルションの個々の油滴が小さい水滴を封入する多相エマルションは、w/o/wエマルションを構成する。同様に、連続油相中において安定化された水の小滴中に封入された油滴の系は、o/w/oエマルションを提供する。
i.エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が通常は直径0.1μmを超える液滴の形態において別の液体に分散された不均質系である[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301を参照されたい]。エマルションは、多くの場合、お互いに十分に混合され分散された2つの不混和性液相を含む二相系である。一般的に、エマルションは、油中水(w/o)種または水中油(o/w)種のどちらかであり得る。水相が、微細化されて微細な液滴として大量の油相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、油中水(w/o)エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が、微細化されて微細な液滴として大量の水相中に分散されている場合、結果として得られる組成物は、水中油(o/w)エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相および、水相中また油相中のどちらかの溶液としてまたはそれ自体別々の相として存在し得る活性薬物に加えて、追加の成分を含有することができる。乳化剤、安定化剤、染料、および抗酸化剤などの医薬品賦形剤も、必要であれば、エマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油(o/w/o)および水中油中水(w/o/w)エマルションの場合など、3相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二相エマルションでは提供することができないある特定の利点を提供する。o/wエマルションの個々の油滴が小さい水滴を封入する多相エマルションは、w/o/wエマルションを構成する。同様に、連続油相中において安定化された水の小滴中に封入された油滴の系は、o/w/oエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことによって特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中によく分散されており、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態に維持される。エマルション様式の軟膏基剤およびクリーム剤の場合と同様に、エマルションの相のいずれかは、半固体または固体であってもよい。エマルションを安定化するその他の手段は、乳化剤の使用を伴い、それらは、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る。乳化剤は、以下の4つのカテゴリ:合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体に大きく分類することができる[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい]。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの製剤化において広い適用可能性を見出しており、文献において概説されている[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199を参照されたい]。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性性質に対する親水性性質の比は、親水性/親油性バランス(HLB)と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス:非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類することができる[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285を参照されたい]。
エマルション製剤において使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。脱水ラノリンおよび親水性ワセリンなどの吸収基剤は、親水特性を有し、そのため、それらは、水を吸い上げてw/oエマルションを形成し、それでもなお、それらの半固体の稠度を維持することができる。微粒子固体も、とりわけ界面活性剤との組合せにおいて、および粘性調製物において、良好な乳化剤として使用されている。これらは、極性無機固体、例えば、重金属水酸化物など、膨潤クレー、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど、顔料、および非極性固体、例えば、炭素またはトリステアリン酸グリセリンなどを含む。
非常に多様な非乳化材料も、エマルション製剤に含まれ、エマルションの特性に貢献する。そのようなものとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる[Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199]。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムおよび合成ポリマー、例えば、多糖(例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント)、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)、および合成ポリマー(例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー)などが挙げられる。これらは、水に分散または膨潤して、コロイド状溶液を形成し、それは、分散相液滴の周囲に強力な界面フィルムを形成すること、および外部相の粘度を増加することによって、エマルションを安定化する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支援することができる多くの成分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドなどを含有するため、これらの製剤は、多くの場合、保存料が組み込まれている。エマルション製剤に含まれる一般的に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、4級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、p-ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防ぐために、抗酸化剤も、一般的に、エマルション製剤に加えられる。使用される抗酸化剤は、フリーラジカル捕捉剤、例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなど、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなど、ならびに酸化防止相乗剤、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンなどであり得る。
皮膚、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において概説されている[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい]。経口デリバリー用のエマルション製剤は、製剤の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性により、非常に広く使用されている[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199を参照されたい]。鉱油系緩下剤、脂溶性ビタミン、および高脂肪栄養製剤は、o/wエマルションとして一般的に経口投与されている材料の1つである。
ii.マイクロエマルション
本開示の一実施形態において、RNAi剤および核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として定義することができる[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照されたい]。典型的には、マイクロエマルションは、油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで、十分な量の第4の成分、概して中鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される、2つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に澄明な分散液として説明されている(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。マイクロエマルションは、一般的に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質を含む3つから5つの成分を組み合わせることによって調製される。マイクロエマルションが油中水(w/o)タイプまたは水中油(o/w)タイプのどちらであるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何学的パッキングに依存する(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271)。
本開示の一実施形態において、RNAi剤および核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として定義することができる[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245を参照されたい]。典型的には、マイクロエマルションは、油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで、十分な量の第4の成分、概して中鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムによって安定化される、2つの不混和性液体の熱力学的に安定で等方的に澄明な分散液として説明されている(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。マイクロエマルションは、一般的に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質を含む3つから5つの成分を組み合わせることによって調製される。マイクロエマルションが油中水(w/o)タイプまたは水中油(o/w)タイプのどちらであるかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何学的パッキングに依存する(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271)。
状態図を利用する現象論的アプローチが、広く研究されており、それは、マイクロエマルションをどのようにして製剤化するかの包括的な知識を当業者にもたらした[例えば、Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335を参照されたい]。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を、自然発生的に形成された熱力学的に安定な液滴の製剤に可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤としては、これらに限定されるわけではないが、単独での、または補助界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート(ML310)、テトラグリセロールモノオレエート(MO310)、ヘキサグリセロールモノオレエート(PO310)、ヘキサグリセロールペンタオレエート(PO500)、デカグリセロールモノカプロエート(MCA750)、デカグリセロールモノオレエート(MO750)、デカグリセロールセスキオレエート(SO750)、デカグリセロールデカオレエート(DAO750)が挙げられる。補助界面活性剤は、通常はエタノール、1-プロパノール、および1-ブタノールなどの短鎖アルコールであり、界面活性剤フィルムに浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生じるボイドスペースにより、乱れたフィルムを作り出すことによって、界面の流動性を増加させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を用いずに調製することもでき、アルコール不含自己乳化性マイクロエマルション系は、当技術分野で公知である。水相は、典型的には、これらに限定されるわけではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、PEG300、PEG400、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相は、これらに限定されるわけではないが、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中鎖(C8~C12)モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化C8~C10グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料を含むことができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物の吸収増強の見地から、特に興味深い。脂質系マイクロエマルション(o/wおよびw/oの両方)は、ペプチドなどの薬物の経口バイオアベイラビリティを増強すると提唱されている(例えば、米国特許第6,191,105号;同第7,063,860号;同第7,070,802号;同第7,157,099号;Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205を参照されたい)。マイクロエマルションは、薬物の可溶化の向上、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤によって誘導される膜流動性および浸透性の変化に起因する、薬物吸収における可能な増強、調製の容易さ、固体剤形よりも経口投与の容易さ、臨床効力の向上、および毒性の減少の利点を提供する(例えば、米国特許第6,191,105号;同第7,063,860号;同第7,070,802号;同第7,157,099号;Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143を参照されたい)。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度において一緒にされたとき、自然発生的に形成され得る。これは、昜熱分解性の薬物であるペプチドまたはRNAi剤を製剤化する場合に、特に有利であり得る。さらに、マイクロエマルションは、美容および医薬的適用の両方における、活性成分の経皮デリバリーにとっても効果的であった。本開示のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのRNAi剤および核酸の全身吸収の増加、ならびにRNAi剤および核酸の局所細胞取り込みの向上を促進するであろうことが予想される。
本開示のマイクロエマルションは、製剤の性質を向上させるため、および本開示のRNAi剤および核酸の吸収を高めるために、追加の成分および添加剤、例えば、ソルビタンモノステアレート(Grill 3)、ラブラソール(Labrasol)、および浸透促進剤など、も含有することができる。本開示のマイクロエマルションにおいて使用される浸透促進剤は、5つのカテゴリ:界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの1つに属するとして分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92)。これらのクラスのそれぞれは、上記において説明されている。
iii.マイクロ粒子
本開示のRNAi剤は、粒子、例えば、マイクロ粒子などに組み込まれ得る。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって生成することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組合せなどの他の方法によっても生成され得る。
本開示のRNAi剤は、粒子、例えば、マイクロ粒子などに組み込まれ得る。マイクロ粒子は、噴霧乾燥によって生成することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動層乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組合せなどの他の方法によっても生成され得る。
iv.浸透促進剤
一実施形態において、本開示は、動物の皮膚への、核酸、特にRNAi剤の効率的なデリバリーを実施するために、様々な浸透促進剤を採用する。ほとんどの薬物は、イオン化状態および非イオン化状態の両方において存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が、浸透促進剤で処置されている場合、非親油性薬物も、細胞膜を横断することができることが分かっている。非親油性薬物が細胞膜を横断して拡散するのを支援することに加えて、浸透促進剤も、親油性薬物の透過性を高める。
一実施形態において、本開示は、動物の皮膚への、核酸、特にRNAi剤の効率的なデリバリーを実施するために、様々な浸透促進剤を採用する。ほとんどの薬物は、イオン化状態および非イオン化状態の両方において存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が、浸透促進剤で処置されている場合、非親油性薬物も、細胞膜を横断することができることが分かっている。非親油性薬物が細胞膜を横断して拡散するのを支援することに加えて、浸透促進剤も、親油性薬物の透過性を高める。
浸透促進剤は、5つの広いカテゴリ、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤のうちの1つに属するとして分類することができる(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92を参照されたい)。浸透促進剤の上記において言及されたクラスのそれぞれについては、以下においてより詳細に説明される。
界面活性剤(または「表面活性剤」」は、水溶液中に溶解されたとき、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、結果として、粘膜を通過するRNAi剤の吸収を高める化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン-20-セチルエーテルが挙げられる(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92); and perfluorochemical emulsions, such as FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252を参照されたい)。
浸透促進剤としての役割を果たす様々な脂肪酸およびその誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸(n-デカン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロエート、トリカプロエート、モノオレイン(1-モノオレオイル-rac-グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプロエート、1-ドデシルアザシクロヘプタナ-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのC1~20アルキルエステル(例えば、メチル、イソプロピル、およびt-ブチル)、ならびにそれらのモノ-およびジ-グリセリド(すなわち、オレエート、ラウレート、カプロエート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど)が挙げられる(例えば、Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654を参照されたい)。
胆汁の生理的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935を参照されたい)。様々な天然の胆汁塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤としての役割を果たす。したがって、用語「胆汁塩」は、胆汁の天然に存在する成分の全て、ならびにそれらの合成誘導体の全てを包含する。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸(またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール酸(グルコール酸ナトリウム)、グリコール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(UDCA)、タウロ-24,25-ジヒドロ-フシジン酸ナトリウム(STDHF)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル(POE)が挙げられる(例えば、Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583を参照されたい)。
キレート化剤は、本開示に関連して使用される場合、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として、粘膜を通るRNAi剤の吸収を高める化合物として定義することができる。本開示における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴的なDNAヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、結果として、キレート化剤によって阻害されるため、キレート化剤は、DNase阻害剤としても機能するさらなる利点を有する(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339)。好適なキレート化剤としては、これらに限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチレート(例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレート、およびホモバニレート(homovanilate))、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9、およびβ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体(エナミン)が挙げられる(例えば、Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51を参照されたい)。
本明細書において使用される場合、非キレート化非界面活性剤である浸透促進化合物は、キレート化剤または界面活性剤としてはわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通してのRNAi剤の吸収を高める化合物として定義することができる(例えば、Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33を参照されたい)。このクラスの浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニルアザシクロ-アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92);ならびに非ステロイド性抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなどが挙げられる(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)。
細胞レベルでのRNAi剤の取り込みを増強する薬剤も、本開示の医薬組成物および他の組成物に加えることができる。例えば、カチオン性脂質、例えば、リポフェクチンなど(Junichi et al, U.S. Pat. No. 5,705,188)、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えば、ポリリジンなど(WO97/30731)も、dsRNAの細胞取り込みを増強することが知られている。
投与された核酸の浸透を高めるために、他の薬剤、例えば、グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコールなど、ピロール、例えば、2-ピロールなど、アゾン、ならびにテルペン、例えば、リモネンおよびメントンなどを用いることができる。
v.賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、1つまたは複数の核酸を動物にデリバリーするための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、ならびに、核酸および所定の医薬組成物お他の成分を組み合わせたときに、所望の体積、稠度などを提供するように計画された投与の様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体としては、これらに限定されるわけではないが、結着剤(例えば、予めゼラチン化されたウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられる。
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、1つまたは複数の核酸を動物にデリバリーするための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、ならびに、核酸および所定の医薬組成物お他の成分を組み合わせたときに、所望の体積、稠度などを提供するように計画された投与の様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体としては、これらに限定されるわけではないが、結着剤(例えば、予めゼラチン化されたウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど);充填剤(例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど);潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど);崩壊剤(例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど);および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非経静脈投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤も、本開示の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの一般的な溶媒における非水溶液、または液体もしくは固体油基剤における核酸の溶液を含むことができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有することができる。核酸と有害に反応しない、非経静脈投与にとって好適な薬学的に許容される有機または無機賦形剤を、使用することができる。
好適な薬学的に許容される賦形剤としては、これらに限定されるわけではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
vi.他の成分
本開示の組成物は、さらに、医薬組成物中に従来的に見出される他の補助成分を、確立されたそれらの使用レベルにおいて含有することができる。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の、薬学的に活性な材料、例えば、止痒剤、収斂剤、局部麻酔薬、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料、例えば、染料、矯臭剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤などを含有することができる。ただし、そのような材料は、添加したときに、本開示の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌することができ、所望の場合は、製剤の核酸と有害に相互作用しない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味剤、または芳香族物質などと混合することができる。
本開示の組成物は、さらに、医薬組成物中に従来的に見出される他の補助成分を、確立されたそれらの使用レベルにおいて含有することができる。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の、薬学的に活性な材料、例えば、止痒剤、収斂剤、局部麻酔薬、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または、本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料、例えば、染料、矯臭剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定化剤などを含有することができる。ただし、そのような材料は、添加したときに、本開示の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌することができ、所望の場合は、製剤の核酸と有害に相互作用しない助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色剤、風味剤、または芳香族物質などと混合することができる。
水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加する物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどを含有することができる。懸濁液は、安定化剤も含有することができる。
一部の実施形態において、本開示において特徴とされる医薬組成物は、(a)1つまたは複数のRNAi剤、および(b)非RNAiメカニズムによって機能し、MAPT関連障害を使用する際に有用である、1つまたは複数の薬剤を含む。そのような薬剤の例としては、コリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン、モノアミン阻害剤、レセルピン、抗痙攣薬、抗精神病薬、および抗鬱薬が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、50%致死量(集団の50%に致死的である用量)およびED50(集団の50%において治療的有効な用量)を判定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法によって判定することができる。毒性と治療有効性との間の用量比は、治療指数であり、LD50/ED50の比として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトにおける使用のために様々な投薬量を製剤化する際に使用することができる。本開示における本明細書において特徴とされる組成物の投薬量は、概して、わずかな毒性かまたは毒性が全くないED50を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変更することができる。本開示において特徴とされる方法で使用される任意の化合物に対して、最初に、細胞培養アッセイから治療有効用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたIC50(すなわち、症状の1/2最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む、化合物、または、適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する(例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する)ように、用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
本開示において特徴とされるRNAi剤は、上記において説明されるようなそれらの投与以外に、ヌクレオチドリピートの発現によって媒介される病理学的プロセスの処置において有効な他の既知の薬物と併用して投与することもできる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書において説明された、有効性の標準的尺度を使用して観察された結果に基づいて、RNAi剤投与の量およびタイミングを調整することができる。
VII.キット
ある特定の態様では、本開示は、siRNA化合物、例えば、二本鎖siRNA化合物、またはssiRNA化合物(例えば、前駆体、例えば、ssiRNA化合物へとプロセシングすることができるより大きなsiRNA化合物、またはsiRNA化合物、例えば、二本鎖siRNA化合物、もしくはssiRNA化合物をコードするDNA、またはその前駆体)の医薬製剤を収容する好適な容器を含むキットを提供する。
ある特定の態様では、本開示は、siRNA化合物、例えば、二本鎖siRNA化合物、またはssiRNA化合物(例えば、前駆体、例えば、ssiRNA化合物へとプロセシングすることができるより大きなsiRNA化合物、またはsiRNA化合物、例えば、二本鎖siRNA化合物、もしくはssiRNA化合物をコードするDNA、またはその前駆体)の医薬製剤を収容する好適な容器を含むキットを提供する。
そのようなキットは、1つまたは複数のdsRNA剤と、使用のための使用説明書、例えば、予防有効量または治療有効量のdsRNA剤を投与するための使用説明書とを含む。dsRNA剤は、バイアル瓶または予め充填された注射器にあり得る。適宜、キットは、dsRNA剤を投与するための手段(例えば、予め充填された注射器または髄腔内ポンプなどの注入デバイス)またはMAPTの阻害を測定するための手段(例えば、MAPT mRNA、タウ、および/またはMAPT活性の阻害を測定するための手段)をさらに含んでもよい。MAPTの阻害を測定するためのそのような手段は、対象から試料、例えば、CSFおよび/または血漿試料を得るための手段を含み得る。適宜、本発明のキットは、治療有効量または予防有効量を判定するための手段をさらに含んでもよい。
ある特定の実施形態において、医薬製剤の個々の成分は、1つの容器において提供され得る。あるいは、医薬製剤の成分を別々に2つ以上の容器において、例えば、siRNA化合物調製物のための1つの容器と、担体化合物のための少なくとも別の容器において提供することは、望ましくあり得る。キットは、単一の箱における1つまたは複数の容器など、多数の異なる構成においてパッケージしてもよい。異なる成分は、例えば、キットと共に提供される使用説明書に従って、組み合わせることができる。成分は、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書において説明される方法に従って組み合わせることができる。キットは、デリバリーデバイスも含むことができる。
VIII.MAPT発現を阻害する方法
本開示はまた、細胞においてMAPT遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、細胞におけるMAPTの発現および/または活性を阻害するのに有効な量のRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤と接触させること、それによって、細胞におけるMAPTの発現および/または活性を阻害することを含む。本開示はまた、細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を、本開示のdsRNA剤、または本開示の医薬組成物と接触させること、それによって細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に分解することを含む。ある特定の実施形態において、細胞は対象内である。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。ある特定の実施形態において、対象は、MAPT関連障害を有する。ある特定の実施形態において、MAPT関連障害は、神経変性障害である。ある特定の実施形態において、神経変性障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連する。ある特定の実施形態において、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす。
本開示はまた、細胞においてMAPT遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞を、細胞におけるMAPTの発現および/または活性を阻害するのに有効な量のRNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤と接触させること、それによって、細胞におけるMAPTの発現および/または活性を阻害することを含む。本開示はまた、細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害する方法も提供する。本方法は、細胞を、本開示のdsRNA剤、または本開示の医薬組成物と接触させること、それによって細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に分解することを含む。ある特定の実施形態において、細胞は対象内である。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。ある特定の実施形態において、対象は、MAPT関連障害を有する。ある特定の実施形態において、MAPT関連障害は、神経変性障害である。ある特定の実施形態において、神経変性障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連する。ある特定の実施形態において、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす。
本開示のある特定の実施形態において、MAPTの発現および/または活性は、CNS(例えば、脳)細胞において優先的に少なくとも30%阻害される。特定の実施形態において、MAPTの発現および/または活性は、少なくとも30%阻害される。ある特定の実施形態において、対象の血清中のタウタンパク質レベルは、少なくとも30%阻害される。本開示のある特定の他の実施形態において、MAPTの発現および/または活性は、肝細胞において優先的に少なくとも30%阻害される。
細胞の、RNAi剤、例えば、二本鎖RNAi剤との接触は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビボで細胞を、RNAi剤と接触させることは、対象、例えば、ヒト対象内の細胞または細胞の群を、RNAi剤と接触させることを含む。細胞を接触させるインビトロおよびインビボ法の組合せも可能である。A108868_1030US_P2_Specification
細胞を接触させることは、上記で論じたように直接的である場合も間接的である場合もある。さらに、細胞を接触させることは、本明細書に記載される、または当技術分野で公知の任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して達成できる。一部の実施形態において、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、GalNAcリガンドまたはRNAi剤を目的の部位に向ける任意の他のリガンドである。
「阻害すること」という用語は、本明細書において使用される場合、「低減すること」、「サイレンシングすること」、「下方制御すること」、「抑制すること」および他の同様の用語と同義的に使用され、阻害の任意のレベルを含む。ある特定の実施形態において、例えば、本開示のRNAi剤の阻害のレベルは、例えば、細胞培養物中の細胞が、リポフェクタミン(商標)媒介性トランスフェクションによってトランスフェクトされる細胞培養条件において、10nM以下、1nM以下などの細胞の近傍における濃度で評価できる。所与のRNAi剤のノックダウンは、細胞培養物において前処置されたレベル対細胞培養物において後処置されたレベルの比較によって決定でき、また、スクランブルされたまたは他の形態の対照RNAi剤を用いて並行して処置された細胞に対して比較してもよい。例えば、少なくとも約30%の細胞培養物におけるノックダウンは、それによって、「阻害すること」または「低減すること」、「下方制御すること」または「抑制すること」などが生じたことを示すと同定され得る。標的化されたmRNAまたはコードされるタンパク質レベル(および従って、本開示のRNAi剤によって引き起こされる「阻害すること」などの程度)の評価も、当技術分野において記載されるような適切に制御された条件下で本開示のRNAi剤のインビボ系において評価できるということは明確に企図される。
語句「MAPTを阻害すること」、「MAPT遺伝子の発現を阻害すること」、または「MAPTの発現を阻害すること」は、本明細書において使用される場合、任意のMAPT遺伝子(例えば、マウスMAPT遺伝子、ラットMAPT遺伝子、サルMAPT遺伝子、またはヒトMAPT遺伝子など)、ならびにタウをコードするMAPT遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を含む。したがって、MAPT遺伝子は、遺伝子操作された細胞、細胞の群または生物との関連で、野生型MAPT遺伝子、突然変異体MAPT遺伝子またはトランスジェニックMAPT遺伝子であり得る。
「MAPT遺伝子の発現を阻害すること」は、任意のレベルのMAPT遺伝子の阻害、例えば、MAPT遺伝子の発現の少なくとも部分的抑制、例えば、少なくとも約25%までの阻害を含む。ある特定の実施形態において、阻害は、対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または少なくとも約99%である。MAPTの阻害は、例えば、本明細書における実施例に提供されるようなA549細胞および10nMの濃度のRNA剤を用いたインビトロアッセイならびにPCRアッセイを使用して測定することができ、本開示の範囲内であることが企図される。一部の実施形態において、MAPTの阻害は、BE(2)-C細胞を用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。一部の実施形態において、MAPTの阻害は、Neuro-2a細胞を用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。別の実施形態において、MAPTの阻害は、Cos-7(Dual-Luciferase psiCHECK2ベクター)を用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。さらに別の実施形態において、MAPTの阻害は、一次マウス肝細胞を用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。
MAPT遺伝子の発現は、MAPT遺伝子の発現に付随する任意の変数のレベル、例えばMAPT mRNAのレベル(例えばセンスmRNA、アンチセンスmRNA、総MAPT mRNA、センスMAPTリピート含有mRNA、および/またはアンチセンスMAPTリピート含有mRNA)、またはタウのレベル(例えば総タウ、野生型タウタンパク質、または伸張されたリピートを含有するタンパク質)、または例えばセンスもしくはアンチセンス含有凝集体のレベルおよび/または異常なジペプチドリピートタンパク質のレベルに基づいて評価してよい。
阻害は、対照レベルと比較した、これらの変数のうち1つまたは複数の絶対または相対レベルの低下によって評価できる。対照レベルは、当技術分野で利用される任意の種類の対照レベル、例えば、投与前ベースラインレベルまたは未処置であるか、もしくは対照(例えば、バッファーのみの対照または不活性の薬剤対照など)を用いて処置された同様の対象、細胞もしくは試料から決定されるレベルであり得る。
例えば、本開示の方法の一部の実施形態において、MAPT遺伝子の発現(例えば、センスもしくはアンチセンス含有凝集体および/または異常なジペプチドリピートタンパク質レベルによって評価される)は、対照レベルに対して少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、もしくは95%阻害されるか、またはアッセイの検出レベル未満まで阻害される。本開示の方法の他の実施形態において、MAPT遺伝子の発現(例えば、mRNAまたはタンパク質発現レベルによって評価される)は、対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%阻害される。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、MAPTの発現を低減する薬剤を用いる対象の処置後の臨床的に関連するアウトカムによって実証されるような、MAPTの発現の臨床的に関連する阻害を含む。
MAPT遺伝子の発現の阻害は、第1の細胞または細胞の群と実質的に同一であるが、そのように処置されていない第2の細胞または細胞の群(RNAi剤で処置されていない、または目的の遺伝子に標的化されるRNAi剤を用いて処置されていない対照細胞(複数可))と比較して、MAPT遺伝子の発現が阻害されるように、MAPT遺伝子が転写され、処置(例えば、細胞(単数または複数)を本開示のRNAi剤と接触させることによって、または本開示のRNAi剤を、細胞が存在しているもしくは存在していた対象に投与することによって)されている第1の細胞または細胞の群(このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る)によって発現されるmRNAの量の低減によって示される場合もある。阻害の程度は、以下の点で表すことができる:
他の実施形態において、MAPT遺伝子の発現の阻害は、MAPT遺伝子の発現に機能的に関連するパラメータ、例えばタウの発現、センスもしくはアンチセンス含有凝集体および/または異常なジペプチドリピートタンパク質のレベルの低減の観点で評価してよい。MAPT遺伝子のサイレンシングは、発現コンストラクトから内因性または異種性のMAPTを発現する任意の細胞において、当技術で既知の任意のアッセイによって決定してよい。
MAPT遺伝子の発現の阻害は、細胞または細胞の群によって発現されるタウタンパク質のレベル(例えば、対象に由来する試料中に発現されるタンパク質のレベル)の低減(または機能性パラメータ、例えば、微小管アセンブリーの低減)によって明らかにすることができる。上記で説明されたように、mRNA抑制の評価のために、処置された細胞または細胞の群におけるタンパク質発現レベルの阻害を、対照細胞または細胞の群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。一部の実施形態において、語句「MAPTを阻害すること」はまた、タウタンパク質発現の阻害、例えば、タウ発現の少なくとも部分的抑制、例えば少なくとも約25%の阻害も含むことができる。ある特定の実施形態において、MAPTの活性の阻害は、対照レベルに対して少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%、または少なくとも約99%である。タウタンパク質レベルは、例えば、(Rubenstein et al.(2015) J. Neurotrauma 2015 Mar1: 32 (5):342-352; Lim et al. (2014) Comput Struct Biotechnol J. 2014;12(20-21):7-13)に記載されるアッセイを用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。MAPTの発現は、例えば、(Caillet-Boudin et al. (2015) Mol Neurodegener. 2015; 10:28; Hefti et al. (2018) PLoS ONE 13(4): e0195771)に記載されるアッセイを用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。
MAPT遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できる対照細胞または細胞の群には、本開示のRNAi剤とまだ接触していない細胞または細胞の群が含まれる。例えば、対照細胞または細胞の群は、RNAi剤を用いる対照の処置の前の個々の対象(例えば、ヒトまたは動物対象)に由来し得る。
細胞または細胞の群によって発現されたMAPT mRNAのレベルは、mRNA発現を評価するための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。一実施形態において、試料中のMAPTの発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部、例えば、MAPT遺伝子のmRNAを検出することによって決定される。RNAは、例えば、酸フェノール/グアニジンイソチオシアネート抽出(RNAzol B; Biogenesis)、RNeasy(商標)RNA調製キット(Qiagen(登録商標))またはPAXgene(PreAnalytix、Switzerland)を使用することを含む、RNA抽出技術を使用して細胞から抽出できる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する通常のアッセイ形式には、核ランオンアッセイ、RT-PCR、RNアーゼ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、インサイツハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイ分析が含まれる。鎖特異的なMAPT mRNAは、例えば上記Jiang, et al.、上記Lagier-Tourenne, et al.、および上記Jiang, et al.に記載されている定量的RT-PCRおよび/または液滴デジタルPCR法を使用して検出してよい。循環するMAPT mRNAは、WO2012/177906に記載されている方法を使用して検出してよく、その全内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、MAPTの発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。「プローブ」という用語は、本明細書において使用される場合、特定のMAPT核酸またはタンパク質もしくはその断片に選択的に結合可能である任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成できる、または適切な生物学的調製物から誘導できる。プローブは、標識されるように具体的に設計できる。プローブとして利用できる分子の例として、それだけには限らないが、RNA、DNA、タンパク質、抗体および有機分子が挙げられる。
単離されたmRNAは、それだけには限らないが、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用できる。mRNAレベルを決定する1つの方法は、単離されたmRNAを、MAPT mRNAとハイブリダイズできる核酸分子(プローブ)と接触させることを含む。一実施形態において、例えば、単離されたmRNAをアガロースゲル上に流すことおよびmRNAをゲルからメンブレン、例えば、ニトロセルロースにトランスファーすることによって、mRNAを固体表面上に固定化し、プローブと接触させる。代替実施形態において、プローブ(複数可)を固体表面上に固定化し、例えば、Affymetrix(登録商標)遺伝子チップアレイにおいてmRNAをプローブ(複数可)と接触させる。当業者ならば、公知のmRNA検出方法を、MAPT mRNAのレベルの決定において使用するために容易に適応させることができる。
試料中のMAPTの発現のレベルを決定するための代替方法は、例えば、RT-PCR(Mullis、1987年、米国特許第4,683,202号に示された実験の実施形態)、リガーゼ連鎖反応[Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193]、自家持続配列複製法[Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878]、転写増幅システム[Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177]、Q-ベータレプリカーゼ[Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197]、ローリングサークル複製(Lizardi et al.、米国特許第5,854,033号)または任意のその他の核酸増幅法による、例えば、試料中のmRNAの核酸増幅または逆転写酵素(cDNAを調製するための)のプロセスと、それに続く、当業者に公知の技術を使用する増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、このような分子が、極めて少数で存在する場合には、核酸分子の検出のために特に有用である。本開示の特定の態様では、MAPTの発現のレベルは、定量的蛍光発生的RT-PCR(すなわち、TaqMan(商標)システム)によって、Dual-Glo(登録商標)ルシフェラーゼアッセイによって、またはMAPT発現もしくはmRNAレベルの測定のための他の技術分野によって認識された方法によって決定される。
MAPT mRNAの発現レベルは、メンブレンブロット(例えば、ノーザン、サザン、ドットなどといったハイブリダイゼーション分析において使用される)またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー(または結合している核酸を含む任意の固相支持体)を使用してモニタリングできる。参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第5,770,722号、同5,874,219号、同5,744,305号、同5,677,195号および同5,445,934号を参照されたい。MAPT発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することを含み得る。
一部の実施形態において、mRNA発現のレベルは、分岐DNA(bDNA)アッセイまたはリアルタイムPCR(qPCR)を使用して評価される。このPCR方法の使用は、本明細書において示される実施例において記載され、例示されている。このような方法はまた、MAPT核酸の検出のために使用できる。
タウ発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定できる。このような方法には、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、超拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降素反応、吸収分光法、比色アッセイ、分光光度的アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散法(一元または二元)、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどが含まれる。このようなアッセイはまた、タウの存在または複製を示すタンパク質の検出のために使用できる。タウタンパク質レベルは、例えば、(Rubenstein et al.(2015) J. Neurotrauma 2015 Mar1: 32 (5):342-352; Lim et al. (2014) Comput Struct Biotechnol J. 2014;12(20-21):7-13)に記載されるアッセイを用いたインビトロアッセイを使用して測定することができる。
センスまたはアンチセンス含有凝集体のレベルおよび異常なジペプチドリピートタンパク質のレベルは、例えば蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)、免疫組織化学および免疫アッセイを含む当業者には周知の方法を使用して評価してよい(例えば上記Jiang, et al.を参照)。一部の実施形態において、MAPT関連疾患の処置における本開示の方法の有効性は、MAPT mRNAレベルの低下によって(例えば、MAPTレベルについてのCSF試料および/または血漿試料の評価によって、脳生検または別の方法によって)評価される。
本開示の方法の一部の実施形態において、RNAi剤は、RNAi剤が、対象内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。MAPTの発現の阻害は、MAPT mRNA(例えばセンスmRNA、アンチセンスmRNA、総MAPT mRNA)、タウタンパク質(例えば総タウタンパク質、野生型タウタンパク質)、センス含有凝集体、アンチセンス含有凝集体、対象の中の特定の部位、例えばCNS細胞から誘導された試料中の異常なジペプチドリピートタンパク質のレベルまたはレベルの変化の測定を使用して評価してよい。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、MAPTの発現を低減する薬剤を用いる対象の処置後の臨床的に関連するアウトカム、例えば、尾状核萎縮(例えば、容積測定MRI(vMRI)によって評価されるような)の安定化または阻害、対象から得たCSF試料中の神経細線維軽鎖(Nfl)レベルの安定化または低減、突然変異体MAPT mRNAまたは切断された突然変異体タウ、例えば、全長突然変異体MAPT mRNAもしくはタンパク質および切断された突然変異体MAPT mRNAもしくはタンパク質の一方もしくは両方の低減などによって実証されるような、MAPTの発現の臨床的に関連する阻害を含む。
本明細書において使用される場合、分析物のレベルを検出することまたは決定することという用語は、材料、例えば、タンパク質、RNAが存在するか否かを決定する工程を実施することを意味すると理解される。本明細書において使用される場合、検出するまたは決定する方法は、使用される方法の検出のレベルを下回る分析物レベルの検出または決定を含む。
IX.MAPT関連疾患を処置または予防する方法
本開示はまた、細胞においてMAPT発現を低減または阻害するために本開示のRNAi剤または本開示のRNAi剤を含有する組成物を使用する方法を提供する。方法は、細胞を本開示のdsRNAと接触させることおよび細胞をMAPT遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞においてMAPT遺伝子の発現を阻害することを含む。
本開示はまた、細胞においてMAPT発現を低減または阻害するために本開示のRNAi剤または本開示のRNAi剤を含有する組成物を使用する方法を提供する。方法は、細胞を本開示のdsRNAと接触させることおよび細胞をMAPT遺伝子のmRNA転写物の分解を得るのに十分な時間の間維持し、それによって、細胞においてMAPT遺伝子の発現を阻害することを含む。
さらに、本開示はまた、細胞におけるセンスおよびアンチセンス含有凝集体のレベルを低減させるおよび/またはその形成を阻害するために、本開示のRNAi剤または本開示のRNAi剤を含有する組成物を使用する方法も提供する。本方法は、細胞を本開示のdsRNAと接触させること、それによって細胞におけるMAPTセンスおよびアンチセンス含有凝集体のレベルを低減させることを含む。
本開示はまた、細胞における異常なジペプチドリピートタンパク質を低減させるおよび/またはその形成を阻害するために、本開示のRNAi剤または本開示のRNAi剤を含有する組成物を使用する方法も提供する。本方法は、細胞を本開示のdsRNAと接触させること、それによって細胞における異常なジペプチドリピートタンパク質のレベルを低減させることを含む。
MAPTセンスおよびアンチセンス含有凝集体および/または異常なジペプチドリピートタンパク質の遺伝子発現、レベルの低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、MAPTの発現の低減は、当業者に常用される方法、例えば、ノーザンブロッティング、qRT-PCRを使用してMAPTのmRNA発現レベルを決定することによって;当業者に常用される方法、例えば、ウェスタンブロッティング、免疫学的技術を使用してMAPTのタンパク質レベルを決定することによって、決定してもよい。
本開示の方法では、細胞をインビトロまたはインビボで接触させることができる、すなわち、細胞は、対象内であり得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、MAPT関連障害を有し得る。MAPT関連障害は、神経変性障害であり得る。対象の神経変性障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連し得る。MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こすおそれがある。
本開示の方法を使用する処置のために好適な細胞は、MAPT遺伝子を発現する任意の細胞であってよい。本開示の方法における使用にとって適した細胞は、哺乳動物細胞、例えば、霊長類細胞(ヒト細胞または非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞またはチンパンジー細胞など)、非霊長類細胞(ラット細胞またはマウス細胞など)であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒトCNS細胞である。
MAPTの発現(例えば、センスmRNA、アンチセンスmRNA、総MAPT mRNA、総タウタンパク質によって評価される)は、対照細胞における発現に対して、細胞において約20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%阻害される。ある特定の実施形態において、MAPTの発現は、対照レベルに対して少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%阻害される。
好ましい実施形態において、MAPTの発現は、細胞において少なくとも30%阻害される。特定の実施形態において、MAPTの発現の阻害は、対象の血清中のタウタンパク質レベルを少なくとも30%減少させることができる。
センスもしくはアンチセンス含有凝集体および/または異常なジペプチドリピートタンパク質レベルによって評価される阻害は、細胞内において少なくとも20%、30%、40%、好ましくは少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、もしくは95%、またはアッセイの検出レベル未満にまで阻害される。
本開示のインビボ法は、対象に、RNAi剤を含有する組成物を投与することを含むことができ、RNAi剤は、処置されるべき哺乳動物のMAPT遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部と相補的であるヌクレオチド配列を含む。処置されるべき生物が哺乳動物、例えば、ヒトである場合には、組成物は、それだけには限らないが、経口、腹腔内または頭蓋内(例えば、脳室内、実質内および髄腔内)、静脈内の、筋肉内の、硝子体内、皮下、経皮、気道(エアロゾル)、鼻腔、直腸および局所(頬側および舌下を含む)投与を含む非経口経路を含む、当技術分野で公知の任意の手段によって投与され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。ある特定の実施形態において、組成物は、髄腔内注射によって投与される。
一部の実施形態において、投与は、デポー注射によってである。デポー注射は、長時間にわたって一貫した方法でRNAi剤を放出し得る。したがって、デポー注射は、所望の効果、例えば、所望のMAPTの阻害または治療的もしくは予防的効果を得るために必要とされる投薬の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供し得る。デポー注射は、皮下注射または筋肉内注射を含み得る。好ましい実施形態において、デポー注射は、皮下注射である。
一部の実施形態において、投与は、ポンプによってである。ポンプは、外部ポンプまたは外科的に埋め込まれたポンプであり得る。ある特定の実施形態において、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、頭蓋内、静脈内、皮下、動脈性または硬膜外注入のために使用され得る。好ましい実施形態において、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態において、ポンプは、RNAi剤をCNSに送達する外科的に埋め込まれたポンプである。
投与様式は、局所処置が望まれるか、または全身処置が望まれるかに基づいて、また処置されるべき領域に基づいて選択できる。投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択できる。
一態様では、本開示はまた、哺乳動物においてMAPT遺伝子の発現を阻害する方法を提供する。方法は、哺乳動物に、哺乳動物の細胞においてMAPT遺伝子を標的化するdsRNAを含む組成物を投与し、それによって、細胞においてMAPT遺伝子の発現を阻害することを含む。遺伝子発現の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また本明細書に記載される方法、例えば、qRT-PCRによって評価できる。タンパク質産生の低減は、当技術分野で公知の任意の方法によって、また本明細書に記載される方法、例えば、ELISAによって評価できる。一実施形態において、CNS生検試料または脳脊髄液(CSF)試料は、MAPT遺伝子またはタンパク質発現の(またはしたがって、プロキシの)低減をモニタリングするための組織材料として働く。
本開示は、それを必要とする対象の処置の方法をさらに提供する。本開示の処置方法は、対象、例えば、MAPTの発現の阻害が有益であろう対象、例えば、MAPT遺伝子にミスセンスおよび/または欠失突然変異を有する対象に、MAPT遺伝子を標的化するRNAi剤またはMAPT遺伝子を標的化するRNAi剤を含む医薬組成物の治療有効量で、本開示のRNAi剤を投与することを含む。
さらに、本開示は、対象におけるMAPT関連疾患または障害(例えば、アルツハイマー病、FTD、PSP、または別のタウオパチー)を防止する、処置する、またはその進行を阻害する方法を提供する。本方法は、対象に、治療有効量の本明細書に提供されるRNAi剤のいずれか、例えば、dsRNA剤、または医薬組成物を投与すること、それによって対象におけるMAPT関連疾患または障害を防止する、処置する、またはその進行を阻害することを含む。本開示の方法によって防止することができるMAPT関連疾患または障害は、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連し得る。MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常は、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす。対象はヒトであり得る。本開示のdsRNA剤または本開示の医薬組成物の投与は、対象の脳内でのタウの凝集の減少をもたらすことができる。
本開示のRNAi剤は、「遊離RNAi剤」として投与される場合がある。遊離RNAi剤は、医薬組成物の不在下で投与される。裸のRNAi剤は、適したバッファー溶液中にある場合がある。バッファー溶液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩またはリン鎖塩またはそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態において、バッファー溶液は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である。RNAi剤を含有するバッファー溶液のpHおよび浸透圧は、対象へ投与することに適しているように調整できる。
あるいは、本開示のRNAi剤は、医薬組成物、例えば、dsRNAリポソーム製剤として投与され得る。
MAPT遺伝子の発現の低減または阻害が有益であろう対象は、MAPT関連疾患を有する対象である。例示的なMAPT関連疾患としては、タウオパチー、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
本開示は、例えば、MAPT発現の低減もしくは阻害が有益であろう対象、例えば、MAPT関連障害を有する対象を処置するための、他の医薬または他の治療方法と、例えば、公知の医薬または公知の治療方法、例えば、これらの障害を処置するために現在使用されているものなどと組み合わせた、RNAi剤またはその医薬組成物の使用のための方法をさらに提供する。例えば、ある特定の実施形態において、MAPTを標的化するRNAi剤は、例えば、本明細書において別の場所に記載されるような、またはそうではなく当技術分野で公知のような、MAPT関連障害の処置において有用な薬剤と組み合わせて投与される。例えば、MAPT発現の低減が有益であろう対象、例えば、MAPT関連障害を有する対象を処置するのに適した追加の薬剤は、MAPT関連疾患の症状を処置するために現在使用されている薬剤を含み得る。RNAi剤および追加の治療薬は、同時にまたは同一組合せで、例えば、髄腔内に投与してもよく、または追加の治療薬は、別個の組成物の一部として、または別個の時間で、または当技術分野で公知のもしくは本明細書に記載される別の方法によって投与できる。
例示的な追加の治療薬として、例えば、モノアミン阻害剤、例えば、テトラベナジン(Xenazine)、デュテトラベナジン(Austedo)およびレセルピン、抗痙攣剤、例えば、バルプロ酸(Depakote、Depakene、Depacon)およびクロナゼパム(Klonopin)、抗精神病剤、例えば、リスペリドン(Risperdal)およびハロペリドール(Haldol)および抗うつ剤、例えば、パロキセチン(Paxil)が挙げられる。
一実施形態において、方法は、標的MAPT遺伝子の発現が少なくとも1か月間低下されるように本明細書において特徴とされる組成物を投与することを含む。好ましい実施形態において、発現は、少なくとも2か月、3か月または6か月間低下される。
好ましくは、本明細書において特徴とされる方法および組成物にとって有用なRNAi剤は、標的MAPT遺伝子のRNA(一次またはプロセシングされた)を特異的に標的化する。RNAi剤を使用してこれらの遺伝子の発現を阻害する組成物および方法は、本明細書に記載されるように調製および実施できる。
本開示の方法によるdsRNAの投与は、MAPT関連障害を有する患者においてこのような疾患または障害の重症度、徴候、症状またはマーカーの低減をもたらし得る。これに関連して「低減」とは、このようなレベルの統計的に有意なまたは臨床的に有意な低下を意味する。低減は、例えば、対照レベルに対して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%または約100%であり得る。疾患の処置または予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患緩解、症状の重症度、疼痛の低減、生活の質、処置効果を持続するために必要とされる投薬の用量、疾患マーカーまたは処置されているまたは予防のために標的化される所与の疾患にとって適切な任意の他の測定可能なパラメータのレベルを測定することによって評価できる。このようなパラメータのうち任意の1つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって、処置または予防の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、MAPT関連障害の処置の有効性は、例えば、対象のものの定期的なモニタリングによって評価できる。後の読み取り値を、最初の読み取り値と比較することによって、処置が有効であるか否かの指標が医師に提供される。このようなパラメータのうち任意の1つまたはパラメータの任意の組合せを測定することによって、処置または予防の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。MAPTを標的化するRNAi剤またはその医薬組成物の投与に関連して、MAPT関連障害「に対して有効な」は、臨床的に適切な方法での投与が、少なくとも統計的に有意な割合の患者にとって有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患の低減、寿命の延長、生活の質の改善またはMAPT関連障害および関連原因の処置に精通している医師によって肯定的であると一般的に認識される他の効果をもたらすことを示す。
処置または予防的効果は、疾患状態の1つまたは複数のパラメータにおいて統計的に有意な改善がある場合に、または悪化しなかったこともしくはそうでなければ予測される症状を発症しなかったことによって明らかである。例として、疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも10%の好都合な変化、好ましくは、少なくとも20%、30%、40%、50%またはそれより多くが、有効な処置を示し得る。所与のRNAi剤薬物またはその薬物の製剤の有効性はまた、当技術分野で公知のように、所与の疾患の実験動物モデルを使用して判断できる。実験動物モデルを使用する場合には、処置の有効性は、マーカーまたは症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
あるいは、有効性は、臨床的に許容された疾患重症度類別スケールに基づいて、診断の当業者によって決定されるような疾患の重症度の低減によって測定できる。例えば、適切なスケールを使用して測定される疾患の重症度の減少をもたらす任意の肯定的な変化は、本明細書に記載されるようなRNAi剤またはRNAi剤製剤を使用する妥当な処置を表す。
ある特定の実施形態において、対象には、dsRNAの治療量、例えば、約0.01mg/kg~約200mg/kgを投与することができる。他の実施形態において、対象には、dsRNAの治療量、例えば、約0.01mg/kg~約500mg/kgを投与することができる。さらに他の実施形態において、対象には、約500mg/kgまたはそれ以上のdsRNAの治療量を投与することができる。
RNAi剤は、一定期間にわたって定期的に、髄腔内に、硝子体内注射を介して、または静脈内注入によって投与できる。ある特定の実施形態において、最初の処置レジメン後に、より少ない頻度で処置を投与できる。RNAi剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、CSF試料または他のコンパートメントにおいてMAPTレベルを低減できる。一実施形態において、RNAi剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、CSF試料または他のコンパートメントにおいてMAPTレベルを対照レベルに対して少なくとも約25%、例えば約25%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、または約95%低減できる。
RNAi剤の全用量の投与の前に、患者により少ない用量、例えば、5%の注入反応を投与し、有害作用、例えば、アレルギー反応についてモニタリングできる。別の例では、患者を、望まれない免疫賦活性効果、例えば、サイトカイン(例えば、TNF-アルファまたはINF-アルファ)レベルの増大についてモニタリングできる。
あるいは、RNAi剤を、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与できる。RNAi剤の所望の、例えば、毎月の用量を対象に送達するために、1回または複数回の注射を使用できる。一定期間にわたって、注射を反復できる。投与を定期的に反復できる。ある特定の実施形態において、最初の処置レジメン後に、より少ない頻度で処置を投与できる。反復用量レジメンは、定期的な、例えば、毎月の、または四半期に1回、年に2回、年に1回に延長する、RNAi剤の治療量の投与を含み得る。ある特定の実施形態において、RNAi剤は、月に約1回~四半期に約1回(すなわち、3か月毎に約1回)投与される。
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を、本発明において特徴とされるRNAi剤および方法の実施または試験に使用できるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法および例は、単に例示的なものであり、制限であるように意図されない。
非公式な配列表が本明細書と共に提出され、出願される明細書の一部を形成する。
[実施例1]
RNAi剤設計、合成、選択およびインビトロ評価
この実施例は、MAPT RNAi剤の設計、合成、選択およびインビトロ評価のための方法を記載する。
RNAi剤設計、合成、選択およびインビトロ評価
この実施例は、MAPT RNAi剤の設計、合成、選択およびインビトロ評価のための方法を記載する。
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられない場合には、このような試薬は、分子生物学において適用するための品質/純度基準で分子生物学のための試薬の任意の供給者から得ることができる。
試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられない場合には、このような試薬は、分子生物学において適用するための品質/純度基準で分子生物学のための試薬の任意の供給者から得ることができる。
生物情報科学
ヒトMAPT転写物[ヒト(Homo sapiens)微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体4、mRNA、NCBI refseqID NM_016841.4;NCBI GeneID:4137およびヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体2、mRNA、NCBI refseqID NM_005910.6;NCBI GeneID:4137]を標的化するsiRNAを、カスタムRおよびPythonスクリプトを使用して設計した。ヒトNM_016841.4 mRNAは、5544塩基の長さを有する。ヒトNM_005910.6 mRNAは、5639塩基の長さを有する。
ヒトMAPT転写物[ヒト(Homo sapiens)微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体4、mRNA、NCBI refseqID NM_016841.4;NCBI GeneID:4137およびヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体2、mRNA、NCBI refseqID NM_005910.6;NCBI GeneID:4137]を標的化するsiRNAを、カスタムRおよびPythonスクリプトを使用して設計した。ヒトNM_016841.4 mRNAは、5544塩基の長さを有する。ヒトNM_005910.6 mRNAは、5639塩基の長さを有する。
ヒトMAPT転写物を標的化する未修飾のMAPTセンスおよびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳細なリストは、表3~5、16、18、20、22、25、および27に示されている。ヒトMAPT転写物を標的化する修飾されたMAPTセンスおよびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳細なリストは、表6~8、17、19、21、23、26、および28に示されている。
マウスMAPT転写物[ハツカネズミ(Mus musculus)微小管関連タンパク質タウ(Mapt)、mRNA、NCBI refseqID NM_001038609;NCBI GeneID:17762]を標的化するsiRNAを、カスタムRおよびPythonスクリプトを使用して設計した。マウスNM_001038609.2 mRNAは、5396塩基の長さを有する。
マカクMAPT転写物[カニクイザル(Macaca fascicularis)微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体X13、NCBI refseqID XM_005584540.1;NCBI GeneID:102119414]を標的化するsiRNAを、カスタムRおよびPythonスクリプトを使用して設計した。マウスXM_005584540.1 mRNAは、5790塩基の長さを有する。
マウスMAPT転写物を標的化する未修飾のMAPTセンスおよびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳細なリストは、表12に示されている。マウスMAPT転写物を標的化する修飾されたMAPTセンスおよびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列の詳細なリストは、表13に示されている。
本出願を通じて、小数点のない二重鎖名は、単に二本鎖のバッチ番号を言及する小数点を有する二重鎖名と同等であるということは理解されるべきである。例えば、AD-523561は、AD-523561.1と同等である。
BE(2)-CおよびNeuro-2a細胞におけるインビトロ(in vitro)スクリーニング
i. 細胞培養およびトランスフェクション:
384ウェルプレートで、各siRNA二重鎖につき4ウェルごと、ウェルあたり5μlのsiRNA二重鎖にウェルあたり5μlのOpti-MEMおよび0.1μlのリポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド カタログ番号13778-150)を添加することによって、BE(2)-C(ATCC)をトランスフェクトし、室温で15分間インキュベートした。次いで、siRNA混合物に約5×103個の細胞を含有する40μlの最小必須培地およびF12培地の1:1混合物(ThermoFisher)を添加した。細胞を24時間インキュベートした後にRNA精製を行った。BE(2)-C細胞における表3~8および12~13に列記されるdsRNA剤のスクリーニングの結果は、それぞれ表9~11および表14に示されている。表9に示されるスクリーン1では、4つの用量の実験を50nM、10nM、1nM、および0.1nMにおいて行った。表10~11に示されるスクリーン2~3では、3つの用量の実験を10nM、1nM、および0.1nMにおいて行った。表14に示されるスクリーン4では、2つの用量の実験を10nMおよび0.1nMにおいて行った。BE(2)-C細胞における表16~23に列記されるスクリーン5~8でのdsRNA剤のスクリーニングの結果は表24に示されている。スクリーン5~8では、3つの用量の実験を10nM、1nM、および0.1nMにおいて行った。
i. 細胞培養およびトランスフェクション:
384ウェルプレートで、各siRNA二重鎖につき4ウェルごと、ウェルあたり5μlのsiRNA二重鎖にウェルあたり5μlのOpti-MEMおよび0.1μlのリポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド カタログ番号13778-150)を添加することによって、BE(2)-C(ATCC)をトランスフェクトし、室温で15分間インキュベートした。次いで、siRNA混合物に約5×103個の細胞を含有する40μlの最小必須培地およびF12培地の1:1混合物(ThermoFisher)を添加した。細胞を24時間インキュベートした後にRNA精製を行った。BE(2)-C細胞における表3~8および12~13に列記されるdsRNA剤のスクリーニングの結果は、それぞれ表9~11および表14に示されている。表9に示されるスクリーン1では、4つの用量の実験を50nM、10nM、1nM、および0.1nMにおいて行った。表10~11に示されるスクリーン2~3では、3つの用量の実験を10nM、1nM、および0.1nMにおいて行った。表14に示されるスクリーン4では、2つの用量の実験を10nMおよび0.1nMにおいて行った。BE(2)-C細胞における表16~23に列記されるスクリーン5~8でのdsRNA剤のスクリーニングの結果は表24に示されている。スクリーン5~8では、3つの用量の実験を10nM、1nM、および0.1nMにおいて行った。
384ウェルプレートで、各siRNA二重鎖につき4ウェルごと、ウェルあたり5μlのsiRNA二重鎖にウェルあたり5μlのOpti-MEMおよび0.1μlのリポフェクタミンRNAiMAX(Invitrogen、カリフォルニア州、カールスバッド カタログ番号13778-150)を添加することによって、Neuro-2a(ATCC)をトランスフェクトし、室温で15分間インキュベートした。次いで、siRNA混合物に約5×103個の細胞を含有する40μlの最小必須培地(ThermoFisher)を添加した。細胞を24時間インキュベートした後にRNA精製を行った。Neuro-2a(マウス)細胞における表12~13に列記されるdsRNA剤のスクリーニングの結果は表15に示されている。表15に示されるスクリーン4では、2つの用量の実験を10nMおよび0.1nMにおいて行った。
ii. DYNABEADS mRNA単離キットを使用する総RNA単離
DYNABEAD(Invitrogen、カタログ番号61012)を使用するBioTek-EL406プラットフォームで自動化プロトコールを使用してRNAを単離した。手短には、細胞を有するプレートに、70μLの溶解/結合バッファーおよび3μLの磁性ビーズを含有する10μLの溶解バッファーを添加した。プレートを、電磁シェーカー上で室温で10分間インキュベートし、次いで、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズが結合しているRNAを、150μLの洗浄バッファーAを用いて2回および洗浄バッファーBを用いて1回洗浄した。次いで、150μLの溶出バッファーを用いてビーズを洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
DYNABEAD(Invitrogen、カタログ番号61012)を使用するBioTek-EL406プラットフォームで自動化プロトコールを使用してRNAを単離した。手短には、細胞を有するプレートに、70μLの溶解/結合バッファーおよび3μLの磁性ビーズを含有する10μLの溶解バッファーを添加した。プレートを、電磁シェーカー上で室温で10分間インキュベートし、次いで、磁性ビーズを捕捉し、上清を除去した。次いで、ビーズが結合しているRNAを、150μLの洗浄バッファーAを用いて2回および洗浄バッファーBを用いて1回洗浄した。次いで、150μLの溶出バッファーを用いてビーズを洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
iii ABI大容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティ、カタログ番号4368813)を使用するcDNA合成
上記で単離されたRNAに、反応あたり1μLの10×バッファー、0.4μLの25× dNTP、1μLの10×ランダムプライマー、0.5μLの逆転写酵素、0.5μLのRNアーゼ阻害剤および6.6μLのH2Oを含有する10μLのマスターミックスを添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁シェーカー上で室温で10分間インキュベートし、続いて、37℃で2時間インキュベートした。
上記で単離されたRNAに、反応あたり1μLの10×バッファー、0.4μLの25× dNTP、1μLの10×ランダムプライマー、0.5μLの逆転写酵素、0.5μLのRNアーゼ阻害剤および6.6μLのH2Oを含有する10μLのマスターミックスを添加した。プレートを密閉し、混合し、電磁シェーカー上で室温で10分間インキュベートし、続いて、37℃で2時間インキュベートした。
iv. リアルタイムPCR
384ウェルプレート(Roche カタログ番号04887301001)中のウェルあたり、2μlのcDNAおよび5μlのLightcycler 480 probe master mix(Roche カタログ番号04887301001)を、0.5μlのHuman GAPDH TaqMan Probe(4326317E)および0.5μlのhuman MAPT probe(hs00902194_m1、Thermo)または0.5μlのMouse GAPDH TaqMan Probe(4352339E)および0.5μlのmouse MAPT probe(Mm00521988_m1、Thermo)のいずれかに添加した。リアルタイムPCRをLightCycler480 Real Time PCR system(Roche)において行った。各二重鎖を少なくとも2回試験し、非標的化対照siRNAをトランスフェクトされた細胞に対してデータを正規化した。相対変化倍数を算出するために、ΔΔCt法を使用してリアルタイムデータを分析し、非標的化対照siRNAでトランスフェクトされた細胞を用いて実施されたアッセイに対して正規化した。
384ウェルプレート(Roche カタログ番号04887301001)中のウェルあたり、2μlのcDNAおよび5μlのLightcycler 480 probe master mix(Roche カタログ番号04887301001)を、0.5μlのHuman GAPDH TaqMan Probe(4326317E)および0.5μlのhuman MAPT probe(hs00902194_m1、Thermo)または0.5μlのMouse GAPDH TaqMan Probe(4352339E)および0.5μlのmouse MAPT probe(Mm00521988_m1、Thermo)のいずれかに添加した。リアルタイムPCRをLightCycler480 Real Time PCR system(Roche)において行った。各二重鎖を少なくとも2回試験し、非標的化対照siRNAをトランスフェクトされた細胞に対してデータを正規化した。相対変化倍数を算出するために、ΔΔCt法を使用してリアルタイムデータを分析し、非標的化対照siRNAでトランスフェクトされた細胞を用いて実施されたアッセイに対して正規化した。
表2. 核酸配列表現において使用されるヌクレオチドモノマーの略称。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、5'-3'-ホスホジエステル結合により互いに連結されることが理解されるであろう。また、ヌクレオチドが2'-フルオロ修飾を含む場合、次いでフルオロが、親ヌクレオチドの当該位置におけるヒドロキシに取って換わっていることが理解される(すなわち、ヌクレオチドは、2'-デオキシ-2'-フルオロヌクレオチドである)。
トランスジェニックマウスにおけるインビボ(in vivo)評価
この実施例は、ヒトMAPT RNAを発現するトランスジェニックマウスにおけるMAPT RNAi剤のインビボ評価の方法を記載する。
この実施例は、ヒトMAPT RNAを発現するトランスジェニックマウスにおけるMAPT RNAi剤のインビボ評価の方法を記載する。
実施例1において設計およびアッセイされた選択されたdsRNA剤の能力を、ヒトMAPT RNAを発現するマウスにおいてセンス含有凝集体またはアンチセンス含有凝集体の両方のレベルを低減させる能力について評価する。
簡潔に述べれば、上記のインビトロ研究から特定され、表2~7および11~12に示される目的の二重鎖を、インビボにおいて評価した。詳細には、投与14日前に、野生型の8週齢雌マウス(C57BL/6)に、ヒトMAPT遺伝子の一部を発現するAAVの2×1010ゲノムコピーを後眼窩に投与することによって形質導入した。詳細には、NM_016841.4のヒトMAPT遺伝子コード配列の一部(323~1648)および3’UTR(4473~5811)の部分をコードするAAVをマウスに投与し、そこでクローニングした。
2週後および0日目に、マウスに、3mg/Kgの目的のdsRNA剤のうちの1つまたはPBS対照の単回用量を皮下投与する。投与する二重鎖は、AD-393752、AD-396420、AD-396425、AD-393239、AD-397167、AD-523561、AD-523565、AD-523562、およびAD-535094から選択する。二重鎖投与の2週後および14日目に、動物を屠殺し、肝臓試料を収集し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織mRNAを抽出し、ヒトMAPT発現についてRT-QPCR法により分析した。
ヒトMAPT mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子GAPDHと比較した。次いで、PBS媒体対照群の平均に対して値を正規化した。データを、ベースライン値のパーセントとして表し、平均値および標準偏差として示した。表29に列記し、図1に示した結果は、試験された例示的な二重鎖薬剤が、インビボにおいてヒトMAPT mRNAのレベルを効果的に低減させることを実証している。
マウスにおけるMAPT mRNA抑制のインビボ評価
この実施例は、ヒトMAPT RNAを発現するトランスジェニックマウスにおけるMAPT RNAi剤のインビボ評価の方法を記載する。
この実施例は、ヒトMAPT RNAを発現するトランスジェニックマウスにおけるMAPT RNAi剤のインビボ評価の方法を記載する。
実施例1の表25~26において設計およびアッセイされた選択されたdsRNA剤の能力を、ヒトMAPT RNAを発現するマウスにおけるセンス含有凝集体またはアンチセンス含有凝集体の両方のレベルを低減させる能力について評価する。
簡潔に述べれば、上記のインビトロ研究から特定され、表25~26に示された目的の二重鎖を、インビボにおいて評価した。詳細には、第1の研究には、投与前日にヒトMAPT遺伝子の一部を発現するAAVの2×1010ゲノムコピーを後眼窩に投与することによって形質導入された野生型6~8週齢雌マウス(C57BL/6)72匹が含まれた。第2の研究には、投与前日にヒトMAPT遺伝子の一部を発現するAAVの2×1010ゲノムコピーを後眼窩に投与することによって形質導入された野生型6~8週齢雌マウス(C57BL/6)60匹が含まれた。第1および第2の研究の両方において、NM_005910のヒトMAPT遺伝子コード配列の一部をコードするAAVをマウスに投与し、そこでクローニングした。
2週後および0日目に、1群当たり3匹の16群に分けた第1の研究の48匹のマウスに、3mg/Kgの目的のdsRNA剤のうちの1つまたはPBS対照の単回用量を皮下投与した。投与する二重鎖は、AD-397167.1、AD-523565.1、AD-1397072.3、AD-1397073.3、AD-1397076.3、AD-1397077.3、AD-1397078.3、AD-1397252.2、AD-1397257.2、AD-1397258.2、AD-1397259.2、AD-1397263.2、AD-1397264.2、AD-1397309.2、およびAD-64958.114から選択する。同様に、0日目に、1群当たり3匹の18群に分けた第2の研究の54匹のマウスに、3mg/Kgの目的のdsRNA剤のうちの1つまたはPBS対照の単回用量を皮下投与した。投与する二重鎖は、AD-397167.1、AD-393758.4、AD-1397080.3、AD-1397293.2、AD-1397294.2、AD-1397081.3、AD-1397083.3、AD-1397298.2、AD-1397299.2、AD-1397084.2、AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2、およびAD-1397088.2から選択する。二重鎖投与の2週後および14日目に、両方の研究の動物を屠殺し、肝臓試料を収集し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織mRNAを抽出し、ヒトMAPT発現についてRT-QPCR法により分析した。
ヒトMAPT mRNAレベルを、ハウスキーピング遺伝子GAPDHと比較し、対応するPBS媒体対照群におけるレベルの平均に対して正規化した。データは、ベースライン値のパーセントとして表し、平均値および標準偏差として示した。結果は、それぞれ表29および30に列記し、それぞれ図2および3に示した。結果は、選択された試験された例示的な二重鎖薬剤がインビボにおいてヒトMAPT mRNAのレベルを効果的に低減させることを実証している。
均等物
当業者であれば、本明細書において説明される特定の実施形態および方法に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験法だけを使用して確かめることができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
当業者であれば、本明細書において説明される特定の実施形態および方法に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験法だけを使用して確かめることができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
MAPT配列
配列番号1
>NM_016841.4 ヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体4、mRNA
GGACGGCCGAGCGGCAGGGCGCTCGCGCGCGCCCACTAGTGGCCGGAGGAGAAGGCTCCCGCGGAGGCCG
CGCTGCCCGCCCCCTCCCCTGGGGAGGCTCGCGTTCCCGCTGCTCGCGCCTGCGCCGCCCGCCGGCCTCA
GGAACGCGCCCTCTTCGCCGGCGCGCGCCCTCGCAGTCACCGCCACCCACCAGCTCCGGCACCAACAGCA
GCGCCGCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCC
CGTCCTCGCCTCTGTCGACTATCAGGTGAACTTTGAACCAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAG
TGATGGAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAGGGGGGCTACACCATGCACCA
AGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGCTGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAGCCTG
GAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCG
ATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGG
CCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGC
TCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCA
GCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCCGTAC
TCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAG
AATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAG
TCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACC
AGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGG
TCCCTGGACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCC
GCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGGGA
CACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTC
GCCACGCTAGCTGACGAGGTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCTGGGGCGGTC
AATAATTGTGGAGAGGAGAGAATGAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCCGCCCTCT
GCCCCCAGCTGCTCCTCGCAGTTCGGTTAATTGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCACTCGGCTTTGG
CTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAGTAAGAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAGT
AATAAAATATTTAAAAAAAAACATTCAAAAACATGGCCACATCCAACATTTCCTCAGGCAATTCCTTTTG
ATTCTTTTTTCTTCCCCCTCCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTCTGAAAGCTGCTTCTGGGGGATT
TCAAGGGACTGGGGGTGCCAACCACCTCTGGCCCTGTTGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGTGGCAGCAACA
AAGGATTTGAAACTTGGTGTGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGG
GGTTGGGGTGGGGCGGGAGGCCACGGGGGAGGCCGAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGCACAA
GAAGTGGGAGTGGGAGAGGAAGCCACGTGCTGGAGAGTAGACATCCCCCTCCTTGCCGCTGGGAGAGCCA
AGGCCTATGCCACCTGCAGCGTCTGAGCGGCCGCCTGTCCTTGGTGGCCGGGGGTGGGGGCCTGCTGTGG
GTCAGTGTGCCACCCTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAGGGACAGCGGGTAAAAAGAGAAGGCAAGCTG
GCAGGAGGGTGGCACTTCGTGGATGACCTCCTTAGAAAAGACTGACCTTGATGTCTTGAGAGCGCTGGCC
TCTTCCTCCCTCCCTGCAGGGTAGGGGGCCTGAGTTGAGGGGCTTCCCTCTGCTCCACAGAAACCCTGTT
TTATTGAGTTCTGAAGGTTGGAACTGCTGCCATGATTTTGGCCACTTTGCAGACCTGGGACTTTAGGGCT
AACCAGTTCTCTTTGTAAGGACTTGTGCCTCTTGGGAGACGTCCACCCGTTTCCAAGCCTGGGCCACTGG
CATCTCTGGAGTGTGTGGGGGTCTGGGAGGCAGGTCCCGAGCCCCCTGTCCTTCCCACGGCCACTGCAGT
CACCCCGTCTGCGCCGCTGTGCTGTTGTCTGCCGTGAGAGCCCAATCACTGCCTATACCCCTCATCACAC
GTCACAATGTCCCGAATTCCCAGCCTCACCACCCCTTCTCAGTAATGACCCTGGTTGGTTGCAGGAGGTA
CCTACTCCATACTGAGGGTGAAATTAAGGGAAGGCAAAGTCCAGGCACAAGAGTGGGACCCCAGCCTCTC
ACTCTCAGTTCCACTCATCCAACTGGGACCCTCACCACGAATCTCATGATCTGATTCGGTTCCCTGTCTC
CTCCTCCCGTCACAGATGTGAGCCAGGGCACTGCTCAGCTGTGACCCTAGGTGTTTCTGCCTTGTTGACA
TGGAGAGAGCCCTTTCCCCTGAGAAGGCCTGGCCCCTTCCTGTGCTGAGCCCACAGCAGCAGGCTGGGTG
TCTTGGTTGTCAGTGGTGGCACCAGGATGGAAGGGCAAGGCACCCAGGGCAGGCCCACAGTCCCGCTGTC
CCCCACTTGCACCCTAGCTTGTAGCTGCCAACCTCCCAGACAGCCCAGCCCGCTGCTCAGCTCCACATGC
ATAGTATCAGCCCTCCACACCCGACAAAGGGGAACACACCCCCTTGGAAATGGTTCTTTTCCCCCAGTCC
CAGCTGGAAGCCATGCTGTCTGTTCTGCTGGAGCAGCTGAACATATACATAGATGTTGCCCTGCCCTCCC
CATCTGCACCCTGTTGAGTTGTAGTTGGATTTGTCTGTTTATGCTTGGATTCACCAGAGTGACTATGATA
GTGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGACGCATGTATCTTGAAATGCTTGTAAAGAGGTTTCTAACCCA
CCCTCACGAGGTGTCTCTCACCCCCACACTGGGACTCGTGTGGCCTGTGTGGTGCCACCCTGCTGGGGCC
TCCCAAGTTTTGAAAGGCTTTCCTCAGCACCTGGGACCCAACAGAGACCAGCTTCTAGCAGCTAAGGAGG
CCGTTCAGCTGTGACGAAGGCCTGAAGCACAGGATTAGGACTGAAGCGATGATGTCCCCTTCCCTACTTC
CCCTTGGGGCTCCCTGTGTCAGGGCACAGACTAGGTCTTGTGGCTGGTCTGGCTTGCGGCGCGAGGATGG
TTCTCTCTGGTCATAGCCCGAAGTCTCATGGCAGTCCCAAAGGAGGCTTACAACTCCTGCATCACAAGAA
AAAGGAAGCCACTGCCAGCTGGGGGGATCTGCAGCTCCCAGAAGCTCCGTGAGCCTCAGCCACCCCTCAG
ACTGGGTTCCTCTCCAAGCTCGCCCTCTGGAGGGGCAGCGCAGCCTCCCACCAAGGGCCCTGCGACCACA
GCAGGGATTGGGATGAATTGCCTGTCCTGGATCTGCTCTAGAGGCCCAAGCTGCCTGCCTGAGGAAGGAT
GACTTGACAAGTCAGGAGACACTGTTCCCAAAGCCTTGACCAGAGCACCTCAGCCCGCTGACCTTGCACA
AACTCCATCTGCTGCCATGAGAAAAGGGAAGCCGCCTTTGCAAAACATTGCTGCCTAAAGAAACTCAGCA
GCCTCAGGCCCAATTCTGCCACTTCTGGTTTGGGTACAGTTAAAGGCAACCCTGAGGGACTTGGCAGTAG
AAATCCAGGGCCTCCCCTGGGGCTGGCAGCTTCGTGTGCAGCTAGAGCTTTACCTGAAAGGAAGTCTCTG
GGCCCAGAACTCTCCACCAAGAGCCTCCCTGCCGTTCGCTGAGTCCCAGCAATTCTCCTAAGTTGAAGGG
ATCTGAGAAGGAGAAGGAAATGTGGGGTAGATTTGGTGGTGGTTAGAGATATGCCCCCCTCATTACTGCC
AACAGTTTCGGCTGCATTTCTTCACGCACCTCGGTTCCTCTTCCTGAAGTTCTTGTGCCCTGCTCTTCAG
CACCATGGGCCTTCTTATACGGAAGGCTCTGGGATCTCCCCCTTGTGGGGCAGGCTCTTGGGGCCAGCCT
AAGATCATGGTTTAGGGTGATCAGTGCTGGCAGATAAATTGAAAAGGCACGCTGGCTTGTGATCTTAAAT
GAGGACAATCCCCCCAGGGCTGGGCACTCCTCCCCTCCCCTCACTTCTCCCACCTGCAGAGCCAGTGTCC
TTGGGTGGGCTAGATAGGATATACTGTATGCCGGCTCCTTCAAGCTGCTGACTCACTTTATCAATAGTTC
CATTTAAATTGACTTCAGTGGTGAGACTGTATCCTGTTTGCTATTGCTTGTTGTGCTATGGGGGGAGGGG
GGAGGAATGTGTAAGATAGTTAACATGGGCAAAGGGAGATCTTGGGGTGCAGCACTTAAACTGCCTCGTA
ACCCTTTTCATGATTTCAACCACATTTGCTAGAGGGAGGGAGCAGCCACGGAGTTAGAGGCCCTTGGGGT
TTCTCTTTTCCACTGACAGGCTTTCCCAGGCAGCTGGCTAGTTCATTCCCTCCCCAGCCAGGTGCAGGCG
TAGGAATATGGACATCTGGTTGCTTTGGCCTGCTGCCCTCTTTCAGGGGTCCTAAGCCCACAATCATGCC
TCCCTAAGACCTTGGCATCCTTCCCTCTAAGCCGTTGGCACCTCTGTGCCACCTCTCACACTGGCTCCAG
ACACACAGCCTGTGCTTTTGGAGCTGAGATCACTCGCTTCACCCTCCTCATCTTTGTTCTCCAAGTAAAG
CCACGAGGTCGGGGCGAGGGCAGAGGTGATCACCTGCGTGTCCCATCTACAGACCTGCAGCTTCATAAAA
CTTCTGATTTCTCTTCAGCTTTGAAAAGGGTTACCCTGGGCACTGGCCTAGAGCCTCACCTCCTAATAGA
CTTAGCCCCATGAGTTTGCCATGTTGAGCAGGACTATTTCTGGCACTTGCAAGTCCCATGATTTCTTCGG
TAATTCTGAGGGTGGGGGGAGGGACATGAAATCATCTTAGCTTAGCTTTCTGTCTGTGAATGTCTATATA
GTGTATTGTGTGTTTTAACAAATGATTTACACTGACTGTTGCTGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTA
TTACTCTGATTAAA
配列番号2
>配列番号1の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACAGCAACAGTCAGTGTAAATCATTTGTTAAAACACACAATACACTATATAGACATTCACAGACAGAAAGCTAAGCTAAGATGATTTCATGTCCCTCCCCCCACCCTCAGAATTACCGAAGAAATCATGGGACTTGCAAGTGCCAGAAATAGTCCTGCTCAACATGGCAAACTCATGGGGCTAAG
TCTATTAGGAGGTGAGGCTCTAGGCCAGTGCCCAGGGTAACCCTTTTCAAAGCTGAAGAGAAATCAGAAG
TTTTATGAAGCTGCAGGTCTGTAGATGGGACACGCAGGTGATCACCTCTGCCCTCGCCCCGACCTCGTGG
CTTTACTTGGAGAACAAAGATGAGGAGGGTGAAGCGAGTGATCTCAGCTCCAAAAGCACAGGCTGTGTGT
CTGGAGCCAGTGTGAGAGGTGGCACAGAGGTGCCAACGGCTTAGAGGGAAGGATGCCAAGGTCTTAGGGA
GGCATGATTGTGGGCTTAGGACCCCTGAAAGAGGGCAGCAGGCCAAAGCAACCAGATGTCCATATTCCTA
CGCCTGCACCTGGCTGGGGAGGGAATGAACTAGCCAGCTGCCTGGGAAAGCCTGTCAGTGGAAAAGAGAA
ACCCCAAGGGCCTCTAACTCCGTGGCTGCTCCCTCCCTCTAGCAAATGTGGTTGAAATCATGAAAAGGGT
TACGAGGCAGTTTAAGTGCTGCACCCCAAGATCTCCCTTTGCCCATGTTAACTATCTTACACATTCCTCC
CCCCTCCCCCCATAGCACAACAAGCAATAGCAAACAGGATACAGTCTCACCACTGAAGTCAATTTAAATG
GAACTATTGATAAAGTGAGTCAGCAGCTTGAAGGAGCCGGCATACAGTATATCCTATCTAGCCCACCCAA
GGACACTGGCTCTGCAGGTGGGAGAAGTGAGGGGAGGGGAGGAGTGCCCAGCCCTGGGGGGATTGTCCTC
ATTTAAGATCACAAGCCAGCGTGCCTTTTCAATTTATCTGCCAGCACTGATCACCCTAAACCATGATCTT
AGGCTGGCCCCAAGAGCCTGCCCCACAAGGGGGAGATCCCAGAGCCTTCCGTATAAGAAGGCCCATGGTG
CTGAAGAGCAGGGCACAAGAACTTCAGGAAGAGGAACCGAGGTGCGTGAAGAAATGCAGCCGAAACTGTT
GGCAGTAATGAGGGGGGCATATCTCTAACCACCACCAAATCTACCCCACATTTCCTTCTCCTTCTCAGAT
CCCTTCAACTTAGGAGAATTGCTGGGACTCAGCGAACGGCAGGGAGGCTCTTGGTGGAGAGTTCTGGGCC
CAGAGACTTCCTTTCAGGTAAAGCTCTAGCTGCACACGAAGCTGCCAGCCCCAGGGGAGGCCCTGGATTT
CTACTGCCAAGTCCCTCAGGGTTGCCTTTAACTGTACCCAAACCAGAAGTGGCAGAATTGGGCCTGAGGC
TGCTGAGTTTCTTTAGGCAGCAATGTTTTGCAAAGGCGGCTTCCCTTTTCTCATGGCAGCAGATGGAGTT
TGTGCAAGGTCAGCGGGCTGAGGTGCTCTGGTCAAGGCTTTGGGAACAGTGTCTCCTGACTTGTCAAGTC
ATCCTTCCTCAGGCAGGCAGCTTGGGCCTCTAGAGCAGATCCAGGACAGGCAATTCATCCCAATCCCTGC
TGTGGTCGCAGGGCCCTTGGTGGGAGGCTGCGCTGCCCCTCCAGAGGGCGAGCTTGGAGAGGAACCCAGT
CTGAGGGGTGGCTGAGGCTCACGGAGCTTCTGGGAGCTGCAGATCCCCCCAGCTGGCAGTGGCTTCCTTT
TTCTTGTGATGCAGGAGTTGTAAGCCTCCTTTGGGACTGCCATGAGACTTCGGGCTATGACCAGAGAGAA
CCATCCTCGCGCCGCAAGCCAGACCAGCCACAAGACCTAGTCTGTGCCCTGACACAGGGAGCCCCAAGGG
GAAGTAGGGAAGGGGACATCATCGCTTCAGTCCTAATCCTGTGCTTCAGGCCTTCGTCACAGCTGAACGG
CCTCCTTAGCTGCTAGAAGCTGGTCTCTGTTGGGTCCCAGGTGCTGAGGAAAGCCTTTCAAAACTTGGGA
GGCCCCAGCAGGGTGGCACCACACAGGCCACACGAGTCCCAGTGTGGGGGTGAGAGACACCTCGTGAGGG
TGGGTTAGAAACCTCTTTACAAGCATTTCAAGATACATGCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCAC
TATCATAGTCACTCTGGTGAATCCAAGCATAAACAGACAAATCCAACTACAACTCAACAGGGTGCAGATG
GGGAGGGCAGGGCAACATCTATGTATATGTTCAGCTGCTCCAGCAGAACAGACAGCATGGCTTCCAGCTG
GGACTGGGGGAAAAGAACCATTTCCAAGGGGGTGTGTTCCCCTTTGTCGGGTGTGGAGGGCTGATACTAT
GCATGTGGAGCTGAGCAGCGGGCTGGGCTGTCTGGGAGGTTGGCAGCTACAAGCTAGGGTGCAAGTGGGG
GACAGCGGGACTGTGGGCCTGCCCTGGGTGCCTTGCCCTTCCATCCTGGTGCCACCACTGACAACCAAGA
CACCCAGCCTGCTGCTGTGGGCTCAGCACAGGAAGGGGCCAGGCCTTCTCAGGGGAAAGGGCTCTCTCCA
TGTCAACAAGGCAGAAACACCTAGGGTCACAGCTGAGCAGTGCCCTGGCTCACATCTGTGACGGGAGGAG
GAGACAGGGAACCGAATCAGATCATGAGATTCGTGGTGAGGGTCCCAGTTGGATGAGTGGAACTGAGAGT
GAGAGGCTGGGGTCCCACTCTTGTGCCTGGACTTTGCCTTCCCTTAATTTCACCCTCAGTATGGAGTAGG
TACCTCCTGCAACCAACCAGGGTCATTACTGAGAAGGGGTGGTGAGGCTGGGAATTCGGGACATTGTGAC
GTGTGATGAGGGGTATAGGCAGTGATTGGGCTCTCACGGCAGACAACAGCACAGCGGCGCAGACGGGGTG
ACTGCAGTGGCCGTGGGAAGGACAGGGGGCTCGGGACCTGCCTCCCAGACCCCCACACACTCCAGAGATG
CCAGTGGCCCAGGCTTGGAAACGGGTGGACGTCTCCCAAGAGGCACAAGTCCTTACAAAGAGAACTGGTT
AGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGCAAAGTGGCCAAAATCATGGCAGCAGTTCCAACCTTCAGAACTCAATAA
AACAGGGTTTCTGTGGAGCAGAGGGAAGCCCCTCAACTCAGGCCCCCTACCCTGCAGGGAGGGAGGAAGA
GGCCAGCGCTCTCAAGACATCAAGGTCAGTCTTTTCTAAGGAGGTCATCCACGAAGTGCCACCCTCCTGC
CAGCTTGCCTTCTCTTTTTACCCGCTGTCCCTTCTCCCACAGGCTGCCCTGCAGAGGGTGGCACACTGAC
CCACAGCAGGCCCCCACCCCCGGCCACCAAGGACAGGCGGCCGCTCAGACGCTGCAGGTGGCATAGGCCT
TGGCTCTCCCAGCGGCAAGGAGGGGGATGTCTACTCTCCAGCACGTGGCTTCCTCTCCCACTCCCACTTC
TTGTGCTTCCTCTCCCCTCTGCCCAGCCCCTGCCTCGGCCTCCCCCGTGGCCTCCCGCCCCACCCCAACC
CCCGTCACACTCACACAAGGTTGACATCGTCTGCCTGTGGCTCCACGAACACACCAAGTTTCAAATCCTT
TGTTGCTGCCACTGCCTCTGTGACACCCCCACAACAGGGCCAGAGGTGGTTGGCACCCCCAGTCCCTTGA
AATCCCCCAGAAGCAGCTTTCAGAGCCTCTCCTTCTCCCTCTTCTACATGGAGGGGGAAGAAAAAAGAAT
CAAAAGGAATTGCCTGAGGAAATGTTGGATGTGGCCATGTTTTTGAATGTTTTTTTTTAAATATTTTATT
ACTAGCCCACCCATCAATTTGGAAAGATGAAATTTGCTCTTACTCCCATCACTGATTTTGAAGTCCCGAG
CCAAAGCCGAGTGACAAAAGCAGGTTAAGTGATTAACCAATTAACCGAACTGCGAGGAGCAGCTGGGGGC
AGAGGGCGGGGGCCGGGTCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCTCATTCTCTCCTCTCCACAATTATT
GACCGCCCCAGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCAGACACCTCGTCAGCTAGCGTGGC
GAGCTGGGGCGAGTCTACCATGTCGATGCTGCCGGTGGAGGAGACATTGCTGAGATGCCGTGGAGACGTG
TCCCCAGACACCACTGGCGACTTGTACACGATCTCCGCCCCGTGGTCTGTCTTGGCTTTGGCGTTCTCGC
GGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATTTCCTCCGCCAGGGACGTGGGTGATATTGTCCAGGGA
CCCAATCTTCGACTGGACTCTGTCCTTGAAGTCAAGCTTCTCAGATTTTACTTCCACCTGGCCACCTCCT
GGTTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGGTCAACTGGTTTGTAGA
CTATTTGCACCTTCCCGCCTCCCGGCTGGTGCTTCAGGTTCTCAGTGGAGCCGATCTTGGACTTGACATT
CTTCAGGTCTGGCATGGGCACGGGGGCTGTCTGCAGGCGGCTCTTGGCGGAAGACGGCGACTTGGGTGGA
GTACGGACCACTGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGGTGGGTGGGGTTGGAAGGGACGGGGTGCGGGAGCGGC
TGCCGGGAGTGCCTGGGGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCGCTGCGATCCCCTGATTTTGGAGGTTCACCAGA
GCTGGGTGGTGTCTTTGGAGCGGGCGGGGTTTTTGCTGGAATCCTGGTGGCGTTGGCCTGGCCCTTCTGG
CCTGGAGGGGCTGCTCCCCGCGGTGTGGCGATCTTCGTTTTACCATCAGCCCCCTTGGCTTTTTTGTCAT
CGCTTCCAGTCCCGTCTTTGCTTTTACTGACCATGCGAGCTTGGGTCACGTGACCAGCAGCTTCGTCTTC
CAGGCTGGGGGTGTCTCCAATGCCTGCTTCTTCAGCTTTCAGGCCAGCGTCCGTGTCACCCTCTTGGTCT
TGGTGCATGGTGTAGCCCCCCTGATCTTTCCTGTCCCCCAACCCGTACGTCCCAGCGTGATCTTCCATCA
CTTCGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTGGTTCAAAGTTCACCTGATAGTCGACAGAGGCGAGGACG
GGAGAGGACAGCGGAGGAGGAGAAGGTGGCTGTGGTGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCAGCGGCGC
TGCTGTTGGTGCCGGAGCTGGTGGGTGGCGGTGACTGCGAGGGCGCGCGCCGGCGAAGAGGGCGCGTTCC
TGAGGCCGGCGGGCGGCGCAGGCGCGAGCAGCGGGAACGCGAGCCTCCCCAGGGGAGGGGGCGGGCAGCG
CGGCCTCCGCGGGAGCCTTCTCCTCCGGCCACTAGTGGGCGCGCGCGAGCGCCCTGCCGCTCGGCCGTCC
配列番号3
>NM_005910.6 ヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体2、mRNA
GGACGGCCGAGCGGCAGGGCGCTCGCGCGCGCCCACTAGTGGCCGGAGGAGAAGGCTCCCGCGGAGGCCG
CGCTGCCCGCCCCCTCCCCTGGGGAGGCTCGCGTTCCCGCTGCTCGCGCCTGCGCCGCCCGCCGGCCTCA
GGAACGCGCCCTCTTCGCCGGCGCGCGCCCTCGCAGTCACCGCCACCCACCAGCTCCGGCACCAACAGCA
GCGCCGCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCC
CGTCCTCGCCTCTGTCGACTATCAGGTGAACTTTGAACCAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAG
TGATGGAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAGGGGGGCTACACCATGCACCA
AGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGAATCTCCCCTGCAGACCCCCACTGAGGACGGATCT
GAGGAACCGGGCTCTGAAACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACAGCGGAAGATGTGACAGCACCCTTAG
TGGATGAGGGAGCTCCCGGCAAGCAGGCTGCCGCGCAGCCCCACACGGAGATCCCAGAAGGAACCACAGC
TGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGC
ATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGTAAAACGA
AGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAGGATTCCAGC
AAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGC
TACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCA
CCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCT
GCAGACAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTG
AAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCA
AGTGTGGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGT
TGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAG
GTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTGGACAATA
TCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAA
AGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGG
CATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCTG
ACGAGGTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCTGGGGCGGTCAATAATTGTGGAG
AGGAGAGAATGAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCCGCCCTCTGCCCCCAGCTGCT
CCTCGCAGTTCGGTTAATTGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCACTCGGCTTTGGCTCGGGACTTCAA
AATCAGTGATGGGAGTAAGAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAGTAATAAAATATTTA
AAAAAAAACATTCAAAAACATGGCCACATCCAACATTTCCTCAGGCAATTCCTTTTGATTCTTTTTTCTT
CCCCCTCCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTCTGAAAGCTGCTTCTGGGGGATTTCAAGGGACTGGG
GGTGCCAACCACCTCTGGCCCTGTTGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGTGGCAGCAACAAAGGATTTGAAAC
TTGGTGTGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGGGGTTGGGGTGGGG
CGGGAGGCCACGGGGGAGGCCGAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGCACAAGAAGTGGGAGTGG
GAGAGGAAGCCACGTGCTGGAGAGTAGACATCCCCCTCCTTGCCGCTGGGAGAGCCAAGGCCTATGCCAC
CTGCAGCGTCTGAGCGGCCGCCTGTCCTTGGTGGCCGGGGGTGGGGGCCTGCTGTGGGTCAGTGTGCCAC
CCTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAGGGACAGCGGGTAAAAAGAGAAGGCAAGCTGGCAGGAGGGTGGC
ACTTCGTGGATGACCTCCTTAGAAAAGACTGACCTTGATGTCTTGAGAGCGCTGGCCTCTTCCTCCCTCC
CTGCAGGGTAGGGGGCCTGAGTTGAGGGGCTTCCCTCTGCTCCACAGAAACCCTGTTTTATTGAGTTCTG
AAGGTTGGAACTGCTGCCATGATTTTGGCCACTTTGCAGACCTGGGACTTTAGGGCTAACCAGTTCTCTT
TGTAAGGACTTGTGCCTCTTGGGAGACGTCCACCCGTTTCCAAGCCTGGGCCACTGGCATCTCTGGAGTG
TGTGGGGGTCTGGGAGGCAGGTCCCGAGCCCCCTGTCCTTCCCACGGCCACTGCAGTCACCCCGTCTGCG
CCGCTGTGCTGTTGTCTGCCGTGAGAGCCCAATCACTGCCTATACCCCTCATCACACGTCACAATGTCCC
GAATTCCCAGCCTCACCACCCCTTCTCAGTAATGACCCTGGTTGGTTGCAGGAGGTACCTACTCCATACT
GAGGGTGAAATTAAGGGAAGGCAAAGTCCAGGCACAAGAGTGGGACCCCAGCCTCTCACTCTCAGTTCCA
CTCATCCAACTGGGACCCTCACCACGAATCTCATGATCTGATTCGGTTCCCTGTCTCCTCCTCCCGTCAC
AGATGTGAGCCAGGGCACTGCTCAGCTGTGACCCTAGGTGTTTCTGCCTTGTTGACATGGAGAGAGCCCT
TTCCCCTGAGAAGGCCTGGCCCCTTCCTGTGCTGAGCCCACAGCAGCAGGCTGGGTGTCTTGGTTGTCAG
TGGTGGCACCAGGATGGAAGGGCAAGGCACCCAGGGCAGGCCCACAGTCCCGCTGTCCCCCACTTGCACC
CTAGCTTGTAGCTGCCAACCTCCCAGACAGCCCAGCCCGCTGCTCAGCTCCACATGCATAGTATCAGCCC
TCCACACCCGACAAAGGGGAACACACCCCCTTGGAAATGGTTCTTTTCCCCCAGTCCCAGCTGGAAGCCA
TGCTGTCTGTTCTGCTGGAGCAGCTGAACATATACATAGATGTTGCCCTGCCCTCCCCATCTGCACCCTG
TTGAGTTGTAGTTGGATTTGTCTGTTTATGCTTGGATTCACCAGAGTGACTATGATAGTGAAAAGAAAAA
AAAAAAAAAAAAAGGACGCATGTATCTTGAAATGCTTGTAAAGAGGTTTCTAACCCACCCTCACGAGGTG
TCTCTCACCCCCACACTGGGACTCGTGTGGCCTGTGTGGTGCCACCCTGCTGGGGCCTCCCAAGTTTTGA
AAGGCTTTCCTCAGCACCTGGGACCCAACAGAGACCAGCTTCTAGCAGCTAAGGAGGCCGTTCAGCTGTG
ACGAAGGCCTGAAGCACAGGATTAGGACTGAAGCGATGATGTCCCCTTCCCTACTTCCCCTTGGGGCTCC
CTGTGTCAGGGCACAGACTAGGTCTTGTGGCTGGTCTGGCTTGCGGCGCGAGGATGGTTCTCTCTGGTCA
TAGCCCGAAGTCTCATGGCAGTCCCAAAGGAGGCTTACAACTCCTGCATCACAAGAAAAAGGAAGCCACT
GCCAGCTGGGGGGATCTGCAGCTCCCAGAAGCTCCGTGAGCCTCAGCCACCCCTCAGACTGGGTTCCTCT
CCAAGCTCGCCCTCTGGAGGGGCAGCGCAGCCTCCCACCAAGGGCCCTGCGACCACAGCAGGGATTGGGA
TGAATTGCCTGTCCTGGATCTGCTCTAGAGGCCCAAGCTGCCTGCCTGAGGAAGGATGACTTGACAAGTC
AGGAGACACTGTTCCCAAAGCCTTGACCAGAGCACCTCAGCCCGCTGACCTTGCACAAACTCCATCTGCT
GCCATGAGAAAAGGGAAGCCGCCTTTGCAAAACATTGCTGCCTAAAGAAACTCAGCAGCCTCAGGCCCAA
TTCTGCCACTTCTGGTTTGGGTACAGTTAAAGGCAACCCTGAGGGACTTGGCAGTAGAAATCCAGGGCCT
CCCCTGGGGCTGGCAGCTTCGTGTGCAGCTAGAGCTTTACCTGAAAGGAAGTCTCTGGGCCCAGAACTCT
CCACCAAGAGCCTCCCTGCCGTTCGCTGAGTCCCAGCAATTCTCCTAAGTTGAAGGGATCTGAGAAGGAG
AAGGAAATGTGGGGTAGATTTGGTGGTGGTTAGAGATATGCCCCCCTCATTACTGCCAACAGTTTCGGCT
GCATTTCTTCACGCACCTCGGTTCCTCTTCCTGAAGTTCTTGTGCCCTGCTCTTCAGCACCATGGGCCTT
CTTATACGGAAGGCTCTGGGATCTCCCCCTTGTGGGGCAGGCTCTTGGGGCCAGCCTAAGATCATGGTTT
AGGGTGATCAGTGCTGGCAGATAAATTGAAAAGGCACGCTGGCTTGTGATCTTAAATGAGGACAATCCCC
CCAGGGCTGGGCACTCCTCCCCTCCCCTCACTTCTCCCACCTGCAGAGCCAGTGTCCTTGGGTGGGCTAG
ATAGGATATACTGTATGCCGGCTCCTTCAAGCTGCTGACTCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGAC
TTCAGTGGTGAGACTGTATCCTGTTTGCTATTGCTTGTTGTGCTATGGGGGGAGGGGGGAGGAATGTGTA
AGATAGTTAACATGGGCAAAGGGAGATCTTGGGGTGCAGCACTTAAACTGCCTCGTAACCCTTTTCATGA
TTTCAACCACATTTGCTAGAGGGAGGGAGCAGCCACGGAGTTAGAGGCCCTTGGGGTTTCTCTTTTCCAC
TGACAGGCTTTCCCAGGCAGCTGGCTAGTTCATTCCCTCCCCAGCCAGGTGCAGGCGTAGGAATATGGAC
ATCTGGTTGCTTTGGCCTGCTGCCCTCTTTCAGGGGTCCTAAGCCCACAATCATGCCTCCCTAAGACCTT
GGCATCCTTCCCTCTAAGCCGTTGGCACCTCTGTGCCACCTCTCACACTGGCTCCAGACACACAGCCTGT
GCTTTTGGAGCTGAGATCACTCGCTTCACCCTCCTCATCTTTGTTCTCCAAGTAAAGCCACGAGGTCGGG
GCGAGGGCAGAGGTGATCACCTGCGTGTCCCATCTACAGACCTGCAGCTTCATAAAACTTCTGATTTCTC
TTCAGCTTTGAAAAGGGTTACCCTGGGCACTGGCCTAGAGCCTCACCTCCTAATAGACTTAGCCCCATGA
GTTTGCCATGTTGAGCAGGACTATTTCTGGCACTTGCAAGTCCCATGATTTCTTCGGTAATTCTGAGGGT
GGGGGGAGGGACATGAAATCATCTTAGCTTAGCTTTCTGTCTGTGAATGTCTATATAGTGTATTGTGTGT
TTTAACAAATGATTTACACTGACTGTTGCTGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTATTACTCTGATTAA
A
配列番号4
>配列番号3の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACAGCACAGTCAGTGTAAATCATTTGTTAAA
ACACACAATACACTATATAGACATTCACAGACAGAAAGCTAAGCTAAGATGATTTCATGTCCCTCCCCCC
ACCCTCAGAATTACCGAAGAAATCATGGGACTTGCAAGTGCCAGAAATAGTCCTGCTCAACATGGCAAAC
TCATGGGGCTAAGTCTATTAGGAGGTGAGGCTCTAGGCCAGTGCCCAGGGTAACCCTTTTCAAAGCTGAA
GAGAAATCAGAAGTTTTATGAAGCTGCAGGTCTGTAGATGGGACACGCAGGTGATCACCTCTGCCCTCGC
CCCGACCTCGTGGCTTTACTTGGAGAACAAAGATGAGGAGGGTGAAGCGAGTGATCTCAGCTCCAAAAGC
ACAGGCTGTGTGTCTGGAGCCAGTGTGAGAGGTGGCACAGAGGTGCCAACGGCTTAGAGGGAAGGATGCC
AAGGTCTTAGGGAGGCATGATTGTGGGCTTAGGACCCCTGAAAGAGGGCAGCAGGCCAAAGCAACCAGAT
GTCCATATTCCTACGCCTGCACCTGGCTGGGGAGGGAATGAACTAGCCAGCTGCCTGGGAAAGCCTGTCA
GTGGAAAAGAGAAACCCCAAGGGCCTCTAACTCCGTGGCTGCTCCCTCCCTCTAGCAAATGTGGTTGAAA
TCATGAAAAGGGTTACGAGGCAGTTTAAGTGCTGCACCCCAAGATCTCCCTTTGCCCATGTTAACTATCT
TACACATTCCTCCCCCCTCCCCCCATAGCACAACAAGCAATAGCAAACAGGATACAGTCTCACCACTGAA
GTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGAGTCAGCAGCTTGAAGGAGCCGGCATACAGTATATCCTAT
CTAGCCCACCCAAGGACACTGGCTCTGCAGGTGGGAGAAGTGAGGGGAGGGGAGGAGTGCCCAGCCCTGG
GGGGATTGTCCTCATTTAAGATCACAAGCCAGCGTGCCTTTTCAATTTATCTGCCAGCACTGATCACCCT
AAACCATGATCTTAGGCTGGCCCCAAGAGCCTGCCCCACAAGGGGGAGATCCCAGAGCCTTCCGTATAAG
AAGGCCCATGGTGCTGAAGAGCAGGGCACAAGAACTTCAGGAAGAGGAACCGAGGTGCGTGAAGAAATGC
AGCCGAAACTGTTGGCAGTAATGAGGGGGGCATATCTCTAACCACCACCAAATCTACCCCACATTTCCTT
CTCCTTCTCAGATCCCTTCAACTTAGGAGAATTGCTGGGACTCAGCGAACGGCAGGGAGGCTCTTGGTGG
AGAGTTCTGGGCCCAGAGACTTCCTTTCAGGTAAAGCTCTAGCTGCACACGAAGCTGCCAGCCCCAGGGG
AGGCCCTGGATTTCTACTGCCAAGTCCCTCAGGGTTGCCTTTAACTGTACCCAAACCAGAAGTGGCAGAA
TTGGGCCTGAGGCTGCTGAGTTTCTTTAGGCAGCAATGTTTTGCAAAGGCGGCTTCCCTTTTCTCATGGC
AGCAGATGGAGTTTGTGCAAGGTCAGCGGGCTGAGGTGCTCTGGTCAAGGCTTTGGGAACAGTGTCTCCT
GACTTGTCAAGTCATCCTTCCTCAGGCAGGCAGCTTGGGCCTCTAGAGCAGATCCAGGACAGGCAATTCA
TCCCAATCCCTGCTGTGGTCGCAGGGCCCTTGGTGGGAGGCTGCGCTGCCCCTCCAGAGGGCGAGCTTGG
AGAGGAACCCAGTCTGAGGGGTGGCTGAGGCTCACGGAGCTTCTGGGAGCTGCAGATCCCCCCAGCTGGC
AGTGGCTTCCTTTTTCTTGTGATGCAGGAGTTGTAAGCCTCCTTTGGGACTGCCATGAGACTTCGGGCTA
TGACCAGAGAGAACCATCCTCGCGCCGCAAGCCAGACCAGCCACAAGACCTAGTCTGTGCCCTGACACAG
GGAGCCCCAAGGGGAAGTAGGGAAGGGGACATCATCGCTTCAGTCCTAATCCTGTGCTTCAGGCCTTCGT
CACAGCTGAACGGCCTCCTTAGCTGCTAGAAGCTGGTCTCTGTTGGGTCCCAGGTGCTGAGGAAAGCCTT
TCAAAACTTGGGAGGCCCCAGCAGGGTGGCACCACACAGGCCACACGAGTCCCAGTGTGGGGGTGAGAGA
CACCTCGTGAGGGTGGGTTAGAAACCTCTTTACAAGCATTTCAAGATACATGCGTCCTTTTTTTTTTTTT
TTTTTCTTTTCACTATCATAGTCACTCTGGTGAATCCAAGCATAAACAGACAAATCCAACTACAACTCAA
CAGGGTGCAGATGGGGAGGGCAGGGCAACATCTATGTATATGTTCAGCTGCTCCAGCAGAACAGACAGCA
TGGCTTCCAGCTGGGACTGGGGGAAAAGAACCATTTCCAAGGGGGTGTGTTCCCCTTTGTCGGGTGTGGA
GGGCTGATACTATGCATGTGGAGCTGAGCAGCGGGCTGGGCTGTCTGGGAGGTTGGCAGCTACAAGCTAG
GGTGCAAGTGGGGGACAGCGGGACTGTGGGCCTGCCCTGGGTGCCTTGCCCTTCCATCCTGGTGCCACCA
CTGACAACCAAGACACCCAGCCTGCTGCTGTGGGCTCAGCACAGGAAGGGGCCAGGCCTTCTCAGGGGAA
AGGGCTCTCTCCATGTCAACAAGGCAGAAACACCTAGGGTCACAGCTGAGCAGTGCCCTGGCTCACATCT
GTGACGGGAGGAGGAGACAGGGAACCGAATCAGATCATGAGATTCGTGGTGAGGGTCCCAGTTGGATGAG
TGGAACTGAGAGTGAGAGGCTGGGGTCCCACTCTTGTGCCTGGACTTTGCCTTCCCTTAATTTCACCCTC
AGTATGGAGTAGGTACCTCCTGCAACCAACCAGGGTCATTACTGAGAAGGGGTGGTGAGGCTGGGAATTC
GGGACATTGTGACGTGTGATGAGGGGTATAGGCAGTGATTGGGCTCTCACGGCAGACAACAGCACAGCGG
CGCAGACGGGGTGACTGCAGTGGCCGTGGGAAGGACAGGGGGCTCGGGACCTGCCTCCCAGACCCCCACA
CACTCCAGAGATGCCAGTGGCCCAGGCTTGGAAACGGGTGGACGTCTCCCAAGAGGCACAAGTCCTTACA
AAGAGAACTGGTTAGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGCAAAGTGGCCAAAATCATGGCAGCAGTTCCAACCTT
CAGAACTCAATAAAACAGGGTTTCTGTGGAGCAGAGGGAAGCCCCTCAACTCAGGCCCCCTACCCTGCAG
GGAGGGAGGAAGAGGCCAGCGCTCTCAAGACATCAAGGTCAGTCTTTTCTAAGGAGGTCATCCACGAAGT
GCCACCCTCCTGCCAGCTTGCCTTCTCTTTTTACCCGCTGTCCCTTCTCCCACAGGCTGCCCTGCAGAGG
GTGGCACACTGACCCACAGCAGGCCCCCACCCCCGGCCACCAAGGACAGGCGGCCGCTCAGACGCTGCAG
GTGGCATAGGCCTTGGCTCTCCCAGCGGCAAGGAGGGGGATGTCTACTCTCCAGCACGTGGCTTCCTCTC
CCACTCCCACTTCTTGTGCTTCCTCTCCCCTCTGCCCAGCCCCTGCCTCGGCCTCCCCCGTGGCCTCCCG
CCCCACCCCAACCCCCGTCACACTCACACAAGGTTGACATCGTCTGCCTGTGGCTCCACGAACACACCAA
GTTTCAAATCCTTTGTTGCTGCCACTGCCTCTGTGACACCCCCACAACAGGGCCAGAGGTGGTTGGCACC
CCCAGTCCCTTGAAATCCCCCAGAAGCAGCTTTCAGAGCCTCTCCTTCTCCCTCTTCTACATGGAGGGGG
AAGAAAAAAGAATCAAAAGGAATTGCCTGAGGAAATGTTGGATGTGGCCATGTTTTTGAATGTTTTTTTT
TAAATATTTTATTACTAGCCCACCCATCAATTTGGAAAGATGAAATTTGCTCTTACTCCCATCACTGATT
TTGAAGTCCCGAGCCAAAGCCGAGTGACAAAAGCAGGTTAAGTGATTAACCAATTAACCGAACTGCGAGG
AGCAGCTGGGGGCAGAGGGCGGGGGCCGGGTCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCTCATTCTCTCCT
CTCCACAATTATTGACCGCCCCAGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCAGACACCTCGT
CAGCTAGCGTGGCGAGCTGGGGCGAGTCTACCATGTCGATGCTGCCGGTGGAGGAGACATTGCTGAGATG
CCGTGGAGACGTGTCCCCAGACACCACTGGCGACTTGTACACGATCTCCGCCCCGTGGTCTGTCTTGGCT
TTGGCGTTCTCGCGGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATTTCCTCCGCCAGGGACGTGGGTGA
TATTGTCCAGGGACCCAATCTTCGACTGGACTCTGTCCTTGAAGTCAAGCTTCTCAGATTTTACTTCCAC
CTGGCCACCTCCTGGTTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGGTCA
ACTGGTTTGTAGACTATTTGCACACTGCCGCCTCCCGGGACGTGTTTGATATTATCCTTTGAGCCACACT
TGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTATTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCCCGGCTGGTGCTT
CAGGTTCTCAGTGGAGCCGATCTTGGACTTGACATTCTTCAGGTCTGGCATGGGCACGGGGGCTGTCTGC
AGGCGGCTCTTGGCGGAAGACGGCGACTTGGGTGGAGTACGGACCACTGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGG
TGGGTGGGGTTGGAAGGGACGGGGTGCGGGAGCGGCTGCCGGGAGTGCCTGGGGAGCCGGGGCTGCTGTA
GCCGCTGCGATCCCCTGATTTTGGAGGTTCACCAGAGCTGGGTGGTGTCTTTGGAGCGGGCGGGGTTTTT
GCTGGAATCCTGGTGGCGTTGGCCTGGCCCTTCTGGCCTGGAGGGGCTGCTCCCCGCGGTGTGGCGATCT
TCGTTTTACCATCAGCCCCCTTGGCTTTTTTGTCATCGCTTCCAGTCCCGTCTTTGCTTTTACTGACCAT
GCGAGCTTGGGTCACGTGACCAGCAGCTTCGTCTTCCAGGCTGGGGGTGTCTCCAATGCCTGCTTCTTCA
GCTGTGGTTCCTTCTGGGATCTCCGTGTGGGGCTGCGCGGCAGCCTGCTTGCCGGGAGCTCCCTCATCCA
CTAAGGGTGCTGTCACATCTTCCGCTGTTGGAGTGCTCTTAGCATCAGAGGTTTCAGAGCCCGGTTCCTC
AGATCCGTCCTCAGTGGGGGTCTGCAGGGGAGATTCTTTCAGGCCAGCGTCCGTGTCACCCTCTTGGTCT
TGGTGCATGGTGTAGCCCCCCTGATCTTTCCTGTCCCCCAACCCGTACGTCCCAGCGTGATCTTCCATCA
CTTCGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTGGTTCAAAGTTCACCTGATAGTCGACAGAGGCGAGGACG
GGAGAGGACAGCGGAGGAGGAGAAGGTGGCTGTGGTGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCAGCGGCGC
TGCTGTTGGTGCCGGAGCTGGTGGGTGGCGGTGACTGCGAGGGCGCGCGCCGGCGAAGAGGGCGCGTTCC
TGAGGCCGGCGGGCGGCGCAGGCGCGAGCAGCGGGAACGCGAGCCTCCCCAGGGGAGGGGGCGGGCAGCG
CGGCCTCCGCGGGAGCCTTCTCCTCCGGCCACTAGTGGGCGCGCGCGAGCGCCCTGCCGCTCGGCCGTCC
配列番号5
>NM_001038609.2 ハツカネズミ微小管関連タンパク質タウ(Mapt)、転写物変異体1、mRNA
CCGCCGGCCTCCAGAACGCGCTTTCTCGGCCGCGCGCGCTCTCAGTCTCCGCCACCCACCAGCTCCAGCA
CCAGCAGCAGCGCCGCCGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCGCCACAACCACCTTCTCCTCCGCTGTC
CTCTTCTGTCCTCGCCTTCTGTCGATTATCAGGCTTTGAACCAGTATGGCTGACCCTCGCCAGGAGTTTG
ACACAATGGAAGACCATGCTGGAGATTACACTCTGCTCCAAGACCAAGAAGGAGACATGGACCATGGCTT
AAAAGAGTCTCCCCCACAGCCCCCCGCCGATGATGGAGCGGAGGAACCAGGGTCGGAGACCTCCGATGCT
AAGAGCACTCCAACTGCTGAAGACGTGACTGCGCCCCTAGTGGATGAGAGAGCTCCCGACAAGCAGGCCG
CTGCCCAGCCCCACACGGAGATCCCAGAAGGAATTACAGCCGAAGAAGCAGGCATCGGAGACACCCCGAA
CCAGGAGGACCAAGCCGCTGGGCATGTGACTCAAGCTCGTGTGGCCAGCAAAGACAGGACAGGAAATGAC
GAGAAGAAAGCCAAGGGCGCTGATGGCAAAACCGGGGCGAAGATCGCCACACCTCGGGGAGCAGCCTCTC
CGGCCCAGAAGGGCACGTCCAACGCCACCAGGATCCCGGCCAAGACCACGCCCAGCCCTAAGACTCCTCC
AGGGTCAGGTGAACCACCAAAATCCGGAGAACGAAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCTCCCGGAACGCCT
GGCAGTCGCTCGCGCACCCCATCCCTACCAACACCGCCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCC
GCACTCCCCCTAAGTCACCATCAGCTAGTAAGAGCCGCCTGCAGACTGCCCCTGTGCCCATGCCAGACCT
AAAGAATGTCAGGTCGAAGATTGGCTCTACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCAGGAGGTGGCAAGGTGCAG
ATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCGAAGGATAATATCAAACACG
TCCCGGGTGGAGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAGCCGGTGGACCTGAGCAAAGTGACCTCCAAGTGTGG
CTCGTTAGGGAACATCCATCACAAGCCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCAGAGAAGCTGGACTTC
AAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGCTCCTTGGATAATATCACCCACGTCCCTGGAGGAGGGAATAAGA
AGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCAGGGAGAATGCCAAAGCCAAGACAGACCATGGAGCAGAAATTGT
GTATAAGTCACCCGTGGTGTCTGGGGACACATCTCCACGGCACCTCAGCAATGTGTCTTCCACGGGCAGC
ATCGACATGGTGGACTCACCACAGCTTGCCACACTAGCCGATGAAGTGTCTGCTTCCTTGGCCAAGCAGG
GTTTGTGATCAGGCTCCCAGGGCAGTCAATAATCATGGAGAGAAGAGAGAGTGAGAGTGTGGAAAAAAAA
AAAAAAAAAGAATGATCTGGCCCCTTGCCCTCTGCCCTCCCCGCTGCTCCTCATAGACAGGCTGACCTGC
TTGTCACCTAACCTGCTTTTGTGGCTCGGATTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAAAAGTACA
TTTCATCTTTCCAAATTGATTTGTGGGCTAAAAATAAAACATATTTAAGGGAAAAAAAAACATGTAAAAA
CATGGCCAAAAAATTTCCTTGGGCAATTGCTAATTGATTTCCCCCCCCTGACCCCGCCCTCCCTCTCTGA
GTATTAGAGGGTGAAGAAGGCTCTGGAGGCTGCTTCTGGGGAGTGGCTGAGGGACTAGGGCAGCTAATTG
CCCATAGCCCCATCCTAGGGGCTTCAGGGACAGTGGCAGCAATGAGAGATTTGAGACTTGGTGTGTTCGT
GGGGCCGTAGGCAGGTGCTGTTAACTTGTGTGGGTGTGAGTGGGGACTGAAACAGCGACAGCGAAGGCTG
AGAGATGGATGGGTGGACTGAGTTAGAGGACAGAGGTGAGGAAGGCAGGTTGGGAGAGGGGACACTGGCT
CCTTGCCAAGTAGCTTGGGGAGGACAGGGTGCTGCAGCTGCCTGCAGCAGTCCTAGCTAGCTCAGATGCC
TGCTTGATAAAGCACTGTGGGGGTAACGTGGGTGTGTGTGCCCCTTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAG
GGGTATTGGGCAGAAGGAAGGTAAGCCAGCAGGTGGTACCTTGTAGATTGGTTCTCTTGAAGGCTGCTCT
TGACATCCCAGGGCACTGGCTTCTTCCTCCCTCCCCGCAAGGTGGGAGGTCCTGAGCGAGGTGTTTCCCT
TCGCTCCCACAGGAAAAGCTGCTTTACTGAGTTCTCAAGTTTGGAACTACAGCCATGATTTGGCCACCAT
TACAGACCTGGGACTTTAGGGCTAACCAGATCTTTGTAAGGACTTGTGCCTCTTGGGGGACCTCTGCCTG
TTCTCATGCTTGGCCCTCTGGCACTTCTGTAGTGGGAGGGATGGGGGGTGGTATTCTGGGATGTGGGTCC
CAGGCCTCCCATCCCTCACACAGCCACTGTATCCCCTCTCTCTGTCCTATCATGCCCACGTCTGCCACGA
GAGCTAGTCACTGCCGTCCGTACATCACGTCTCACTGTCCTGAGTGCCATGCCTCTCCCAGCCCCCATCC
CTGGCCCCTGGGTAGATATGGGCAATATCTGCTCTACACTAGGGGTTGGAGTCCAGGGAAGGCAAAGATT
TGGGCCTCAGTCTCTAGTCCTACGTTCCACGAATCCAACCAGTGTGCCTCCCACAAGGAACCTTACGACC
TTGTTTGGTTCACTCCATTACTTCCTATCCTGGATGGGAACTGGTGTGTGCCTGCCTGGGGATGACCTTG
GACCTCTGCCTTTTCTTTTATCTAAGTGGATGCCTCCTAGGCCTGACTCCTTGTGTTGAGCTGGAGGCAG
CCAAGTCAGGTGCCAATGTCTTGGCATCAGTAAGAACAGTCAAGAGTCCCAGGGCAGGGCCACACTTCTC
CCATCTTTCGCTTCCACCCCAGCTTGTGATCGCTAGCCTCCCAGAGCTCAGCTGCCATTAAGTCCCCATG
CACGTAATCAGTCTCCACACCCCAGTTTGGGGAACATACCCCCTTGATTGAAGTGTTTTTTTCCTCCGGT
CCCATGGAAACCATGCTGCCTGCCCTGCTGGAGCAGACGGCCACCTCCATAGATGCAGCCCTTTCTTTCC
CGTCTTCGCCCTGTTACGTTGTAGTTGGATTTGTCTGTTTGTCTGGGTTCACCAGAGTGACTATGATAGT
GAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAGAAAAAGGAAAAAAAAAAGGACGCAT
GTATCTTGAAATATTTGTCAAAAGGTTCTAGCCCACCACGTGATGGAGAGTCTGGATATCTCCTTCCTGA
CGTGGCTCCAGGCCAGTGCAGTGCTAACCTGCTGGGACATCCCATGTTTTGAAGGGTTTCTTCTGCATCT
GGGACCTCACAGACACTGGATTGTGACATTGGAGGTCTGTGACATTGGAGGTCAATGGCATTGGCCAAGG
CCTGAAGCACAGGACCAGCTAGAGGCAGCAGGCTCCGAGTGCCAGGGAGAGCTTGTGGCTGGCCTGTTTT
GTATGAAGATGGTCCTTTCTGATCACGACTTCAAATCCCACAGTAGCCCTGAAAGACATCTAAGAACTCC
TGCATCACAAGAGAAAAGGACACCAGTACCAGCAGGGAGAGCTGTGACCCTAGAAATTCCATGACGACCC
AGTAGATATCCTTGGGCCCTCTCCAAGCCTGGGCCTTTTCACCATAGAGTTTGGGATGGACTGTCCCACT
GATGAAGGGGACATCTTAGGAGACTCCCTTGGTTTCCAAGCTGTCAGCCCCCTGAACTTGCACGACCTCC
TACAGCTTCAGGGACTAGGCCTTTGAAGATTAGGAACCTCAGGCCCACATCAGCCACTTCTGATGTACAG
TTAAGGACAATGTGGAGACTAGGAGGAAGCAGCCAGCCTTTCCCATTAAAGAACTCTTGAGTGCCCAGGG
CTACCTATTGTGAGCTTCCCCACTGATAAGACTTTAGCTGTCCATAGAAGTGAGTCCGAGGGAGGAAAAG
TGTGGTTTCTTCATCATGGTTACCTGTCGTGGTTCTCTCTCTTACACCCATTTACCCATCCCGCAGTTCC
TGTCCTTGAATGGGGGGTGGGGTGCTCTGCCTATCTCTTGTGGGGTGATCAGCCCAAAAATCATGATTTG
GAGTGATCTGATCAGTGCTGATAGGCAGTTTACAAAGGGATTCTGGCTTGTGACTTCAGTGAGGACAATC
CCCCAGGGCCCTTTCTTTCCATGCCTCTCCAACTCAGAGCCAATGTCTTTGGGTGGGCTAGATAGATAGG
GCATACAATTGGCCTGGTTCCTCCAAGCTCTTAATTCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGACTTCA
ATGATAAGAGTGTATCCCATTTGAGATTGCTTGCGTTGTGGGGGAGGGGGAGGAGGAACACATTAAGATA
ATTCACATGGGCAAAGGGAGGTCTTGGAGTGTAGCCGTTAAGCCATCTTGTAACCCCATTCATGATTTTG
ACCACCTGCTAGAGAGAAGAGGTGCCAAGAGACTAGAACTTGGAGGCTTGGCTGTCCCACTAATAGGCTT
TCGCAAGGCAGAGGTAGCCAGCTAGGTCCCTGCCTTCCCAGCCAGGTACAGCTCTCAGGTTTGTGGAGGT
AATCTGTGAACTTCTCTTCCTGCTGCCTTCTTGTGATGTCCAGAGCCCACAGTCAAATACCTCCTAAGAA
CCCTGGCTTCCTTCCCTCTAATCCACTGGCACATGACTATCACCTCTGGATTGACCTCAGATCCATAGCC
TACACACTGCTAGCAGTGGCCAAGATCACTTCCTTTATCTCCATCTGTTCTGTTCTCCAGGAAAGTAAGT
GGGGATGAGGGTGGAGGTGGTAATCAACTGTAGATCTGTGGCTTTATGAGCCTTCAGACTTCTCTCTGGC
TTCTTCTGGAAGGGTTACTATTGGCAGTATTGCAATCTCACCCTCCTGATGAACTGTAGCCTGTGCCGTT
ACTGTGCTGGGCATGATCTCCAGTGCTTGCAAGTCCCATGATTTCTTTGGTGATTTTGAGGGTGGGGGGA
GGGACACAAATCAGCTTAGCTTAGCTTCCTGTCTGTGAATGTCCATATAGTGTATTGTGTTTTAACAAAT
GATCTACACTGACTGTTGCTGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTATTACTCTGAATAAAAAAAAAAAA
AAAAAA
配列番号6
>配列番号5の逆相補物
TTTTTTTTTTTTTTTTTTATTCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACAGCAACAGTCAGTGTAGATC
ATTTGTTAAAACACAATACACTATATGGACATTCACAGACAGGAAGCTAAGCTAAGCTGATTTGTGTCCC
TCCCCCCACCCTCAAAATCACCAAAGAAATCATGGGACTTGCAAGCACTGGAGATCATGCCCAGCACAGT
AACGGCACAGGCTACAGTTCATCAGGAGGGTGAGATTGCAATACTGCCAATAGTAACCCTTCCAGAAGAA
GCCAGAGAGAAGTCTGAAGGCTCATAAAGCCACAGATCTACAGTTGATTACCACCTCCACCCTCATCCCC
ACTTACTTTCCTGGAGAACAGAACAGATGGAGATAAAGGAAGTGATCTTGGCCACTGCTAGCAGTGTGTA
GGCTATGGATCTGAGGTCAATCCAGAGGTGATAGTCATGTGCCAGTGGATTAGAGGGAAGGAAGCCAGGG
TTCTTAGGAGGTATTTGACTGTGGGCTCTGGACATCACAAGAAGGCAGCAGGAAGAGAAGTTCACAGATT
ACCTCCACAAACCTGAGAGCTGTACCTGGCTGGGAAGGCAGGGACCTAGCTGGCTACCTCTGCCTTGCGA
AAGCCTATTAGTGGGACAGCCAAGCCTCCAAGTTCTAGTCTCTTGGCACCTCTTCTCTCTAGCAGGTGGT
CAAAATCATGAATGGGGTTACAAGATGGCTTAACGGCTACACTCCAAGACCTCCCTTTGCCCATGTGAAT
TATCTTAATGTGTTCCTCCTCCCCCTCCCCCACAACGCAAGCAATCTCAAATGGGATACACTCTTATCAT
TGAAGTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGAATTAAGAGCTTGGAGGAACCAGGCCAATTGTATGC
CCTATCTATCTAGCCCACCCAAAGACATTGGCTCTGAGTTGGAGAGGCATGGAAAGAAAGGGCCCTGGGG
GATTGTCCTCACTGAAGTCACAAGCCAGAATCCCTTTGTAAACTGCCTATCAGCACTGATCAGATCACTC
CAAATCATGATTTTTGGGCTGATCACCCCACAAGAGATAGGCAGAGCACCCCACCCCCCATTCAAGGACA
GGAACTGCGGGATGGGTAAATGGGTGTAAGAGAGAGAACCACGACAGGTAACCATGATGAAGAAACCACA
CTTTTCCTCCCTCGGACTCACTTCTATGGACAGCTAAAGTCTTATCAGTGGGGAAGCTCACAATAGGTAG
CCCTGGGCACTCAAGAGTTCTTTAATGGGAAAGGCTGGCTGCTTCCTCCTAGTCTCCACATTGTCCTTAA
CTGTACATCAGAAGTGGCTGATGTGGGCCTGAGGTTCCTAATCTTCAAAGGCCTAGTCCCTGAAGCTGTA
GGAGGTCGTGCAAGTTCAGGGGGCTGACAGCTTGGAAACCAAGGGAGTCTCCTAAGATGTCCCCTTCATC
AGTGGGACAGTCCATCCCAAACTCTATGGTGAAAAGGCCCAGGCTTGGAGAGGGCCCAAGGATATCTACT
GGGTCGTCATGGAATTTCTAGGGTCACAGCTCTCCCTGCTGGTACTGGTGTCCTTTTCTCTTGTGATGCA
GGAGTTCTTAGATGTCTTTCAGGGCTACTGTGGGATTTGAAGTCGTGATCAGAAAGGACCATCTTCATAC
AAAACAGGCCAGCCACAAGCTCTCCCTGGCACTCGGAGCCTGCTGCCTCTAGCTGGTCCTGTGCTTCAGG
CCTTGGCCAATGCCATTGACCTCCAATGTCACAGACCTCCAATGTCACAATCCAGTGTCTGTGAGGTCCC
AGATGCAGAAGAAACCCTTCAAAACATGGGATGTCCCAGCAGGTTAGCACTGCACTGGCCTGGAGCCACG
TCAGGAAGGAGATATCCAGACTCTCCATCACGTGGTGGGCTAGAACCTTTTGACAAATATTTCAAGATAC
ATGCGTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTCTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTCTTTCTTTTCTTTTC
ACTATCATAGTCACTCTGGTGAACCCAGACAAACAGACAAATCCAACTACAACGTAACAGGGCGAAGACG
GGAAAGAAAGGGCTGCATCTATGGAGGTGGCCGTCTGCTCCAGCAGGGCAGGCAGCATGGTTTCCATGGG
ACCGGAGGAAAAAAACACTTCAATCAAGGGGGTATGTTCCCCAAACTGGGGTGTGGAGACTGATTACGTG
CATGGGGACTTAATGGCAGCTGAGCTCTGGGAGGCTAGCGATCACAAGCTGGGGTGGAAGCGAAAGATGG
GAGAAGTGTGGCCCTGCCCTGGGACTCTTGACTGTTCTTACTGATGCCAAGACATTGGCACCTGACTTGG
CTGCCTCCAGCTCAACACAAGGAGTCAGGCCTAGGAGGCATCCACTTAGATAAAAGAAAAGGCAGAGGTC
CAAGGTCATCCCCAGGCAGGCACACACCAGTTCCCATCCAGGATAGGAAGTAATGGAGTGAACCAAACAA
GGTCGTAAGGTTCCTTGTGGGAGGCACACTGGTTGGATTCGTGGAACGTAGGACTAGAGACTGAGGCCCA
AATCTTTGCCTTCCCTGGACTCCAACCCCTAGTGTAGAGCAGATATTGCCCATATCTACCCAGGGGCCAG
GGATGGGGGCTGGGAGAGGCATGGCACTCAGGACAGTGAGACGTGATGTACGGACGGCAGTGACTAGCTC
TCGTGGCAGACGTGGGCATGATAGGACAGAGAGAGGGGATACAGTGGCTGTGTGAGGGATGGGAGGCCTG
GGACCCACATCCCAGAATACCACCCCCCATCCCTCCCACTACAGAAGTGCCAGAGGGCCAAGCATGAGAA
CAGGCAGAGGTCCCCCAAGAGGCACAAGTCCTTACAAAGATCTGGTTAGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGTA
ATGGTGGCCAAATCATGGCTGTAGTTCCAAACTTGAGAACTCAGTAAAGCAGCTTTTCCTGTGGGAGCGA
AGGGAAACACCTCGCTCAGGACCTCCCACCTTGCGGGGAGGGAGGAAGAAGCCAGTGCCCTGGGATGTCA
AGAGCAGCCTTCAAGAGAACCAATCTACAAGGTACCACCTGCTGGCTTACCTTCCTTCTGCCCAATACCC
CTTCTCCCACAGGCTGCCCTGCAGAAGGGGCACACACACCCACGTTACCCCCACAGTGCTTTATCAAGCA
GGCATCTGAGCTAGCTAGGACTGCTGCAGGCAGCTGCAGCACCCTGTCCTCCCCAAGCTACTTGGCAAGG
AGCCAGTGTCCCCTCTCCCAACCTGCCTTCCTCACCTCTGTCCTCTAACTCAGTCCACCCATCCATCTCT
CAGCCTTCGCTGTCGCTGTTTCAGTCCCCACTCACACCCACACAAGTTAACAGCACCTGCCTACGGCCCC
ACGAACACACCAAGTCTCAAATCTCTCATTGCTGCCACTGTCCCTGAAGCCCCTAGGATGGGGCTATGGG
CAATTAGCTGCCCTAGTCCCTCAGCCACTCCCCAGAAGCAGCCTCCAGAGCCTTCTTCACCCTCTAATAC
TCAGAGAGGGAGGGCGGGGTCAGGGGGGGGAAATCAATTAGCAATTGCCCAAGGAAATTTTTTGGCCATG
TTTTTACATGTTTTTTTTTCCCTTAAATATGTTTTATTTTTAGCCCACAAATCAATTTGGAAAGATGAAA
TGTACTTTTCCCATCACTGATTTTGAAGTCCCGAGCCAAATCCGAGCCACAAAAGCAGGTTAGGTGACAA
GCAGGTCAGCCTGTCTATGAGGAGCAGCGGGGAGGGCAGAGGGCAAGGGGCCAGATCATTCTTTTTTTTT
TTTTTTTTCCACACTCTCACTCTCTCTTCTCTCCATGATTATTGACTGCCCTGGGAGCCTGATCACAAAC
CCTGCTTGGCCAAGGAAGCAGACACTTCATCGGCTAGTGTGGCAAGCTGTGGTGAGTCCACCATGTCGAT
GCTGCCCGTGGAAGACACATTGCTGAGGTGCCGTGGAGATGTGTCCCCAGACACCACGGGTGACTTATAC
ACAATTTCTGCTCCATGGTCTGTCTTGGCTTTGGCATTCTCCCTGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCT
TCTTATTCCCTCCTCCAGGGACGTGGGTGATATTATCCAAGGAGCCAATCTTCGACTGGACTCTGTCCTT
GAAGTCCAGCTTCTCTGATTTTACTTCCACCTGGCCACCTCCTGGCTTGTGATGGATGTTCCCTAACGAG
CCACACTTGGAGGTCACTTTGCTCAGGTCCACCGGCTTGTAGACTATTTGCACACTGCCTCCACCCGGGA
CGTGTTTGATATTATCCTTCGAGCCACACTTGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTATTAATTAT
CTGCACCTTGCCACCTCCTGGCTGGTGCTTCAGGTTCTCAGTAGAGCCAATCTTCGACCTGACATTCTTT
AGGTCTGGCATGGGCACAGGGGCAGTCTGCAGGCGGCTCTTACTAGCTGATGGTGACTTAGGGGGAGTGC
GGACCACTGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGGTGGGCGGTGTTGGTAGGGATGGGGTGCGCGAGCGACTGCC
AGGCGTTCCGGGAGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCGCTTCGTTCTCCGGATTTTGGTGGTTCACCTGACCCT
GGAGGAGTCTTAGGGCTGGGCGTGGTCTTGGCCGGGATCCTGGTGGCGTTGGACGTGCCCTTCTGGGCCG
GAGAGGCTGCTCCCCGAGGTGTGGCGATCTTCGCCCCGGTTTTGCCATCAGCGCCCTTGGCTTTCTTCTC
GTCATTTCCTGTCCTGTCTTTGCTGGCCACACGAGCTTGAGTCACATGCCCAGCGGCTTGGTCCTCCTGG
TTCGGGGTGTCTCCGATGCCTGCTTCTTCGGCTGTAATTCCTTCTGGGATCTCCGTGTGGGGCTGGGCAG
CGGCCTGCTTGTCGGGAGCTCTCTCATCCACTAGGGGCGCAGTCACGTCTTCAGCAGTTGGAGTGCTCTT
AGCATCGGAGGTCTCCGACCCTGGTTCCTCCGCTCCATCATCGGCGGGGGGCTGTGGGGGAGACTCTTTT
AAGCCATGGTCCATGTCTCCTTCTTGGTCTTGGAGCAGAGTGTAATCTCCAGCATGGTCTTCCATTGTGT
CAAACTCCTGGCGAGGGTCAGCCATACTGGTTCAAAGCCTGATAATCGACAGAAGGCGAGGACAGAAGAG
GACAGCGGAGGAGAAGGTGGTTGTGGCGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCGGCGGCGCTGCTGCTGG
TGCTGGAGCTGGTGGGTGGCGGAGACTGAGAGCGCGCGCGGCCGAGAAAGCGCGTTCTGGAGGCCGGCGG
配列番号7
>予想されるXM_005584540.1:カニクイザル微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体X13、mRNA
GCCGAGCGGCAGGGCGCTCGCGCGCGCCCACTGGTGGCCGGAGGAGAAGGCTCCCGCGGAGGCCGGGCTG
CCCGCCCCCTCCCCTGGGGAGGCTCGCGCTCCCGCTGCTCGCGCCTGCGCCGCCTGCCGGCCTCGGGAAC
GCGCCCTCTTCCCCGGCGCGCGCCCTCGCAGTCACCGCCACCCACCAGCTCCGGCACCAACAGCAGCGCC
GCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCCCGTCC
TCGCCTCTGTCGACTATCAGGCGAGCCTTGAACCAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGATGTGATG
GAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAAGAGGGCTACACCATGCTCCAAGACC
AAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGAATCTCCCCTGCAGACCCCCGCTGAGGATGGATCTGAGGA
ACTGGGCTCTGAAACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACGGCGGAAGATGTGACAGCGCCCTTAGTGGAT
GAGAGAGCTCCCGGCGAGCAGGCTGCCGCCCAGCCCCACATGGAGATCCCAGAAGGAACCACAGCTGAGG
AAGCAGGCATCGGAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGT
CAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGGAAAACGAAGATC
GCCACACCCCGGGGAGCGGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAAGCCAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAA
CCCCGCCCGCCCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGTGGCTACAG
CAGCCCCGGCTCCCCGGGCACTCCCGGCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCTCCAGCCCGG
GAGCCCAAGAAGGTGGCGGTGGTCCGTACTCCACCTAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGA
CAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAACGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACCGAGAACCTGAAGCA
CCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGT
GGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACC
TGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGA
AGTAAAATCTGAGAAGCTGGACTTCAAGGACAGAGTGCAGTCGAAGATCGGGTCCCTGGACAATATCACC
CATGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCA
AGACAGACCACGGGGCGGAAATCGTGTACAAGTCGCCGGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGGCACCT
CAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCCGACGAG
GTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCCGGGGCGGTCAATAATCGTGGAGAGAAG
AGAGAGTGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCGCCCTCTGCCCCCAGCTGCTCCTCGC
AGTTCGGTTAATCGGTTCATCACTTAACCGGCTTTTATCGCTCGGCTTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAG
TGATGGGAATAAGAGCAAATTGCATCTTTCCAAATTGATCGGTGGGCTAATAATAAAATATTTTTTAAAA
AACATTCAAAAACATGGCCACACCCAACATTTCCTCGGGCAATTCCTTTTGATTCTTTTTTTTTCCCCCT
CCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTGTGAAAGCTGCTTCGGGGGGATTTCAAGAGACTGGGGGTGCC
CACCGCCTCTGGCCCTGTCGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGCGGCAGCAACAAAGGATTTGAAACTTGGTG
TGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGGTGGGGGTGGGGCGGGAGGC
CATGGGGGAGGCCAAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGGACGAGAAGGGGGAGTGGGAGAGGAA
GCCACATGCTGGAGAGGAGATGCCCTCCTCCGCGCCACTGGGAGGGCCAAGGCCTCCGCCACCTGCAGTG
TCTCAGACTGAGCGGCTGCCTGTCCTTGGTGGCCAGGGTCTGCTGCGAGTTGATGTGCCACCCTCTGCAG
GGCAGCCTGTGGGAGAAGGGGCGGCGGGTAAGAAGAGAAGGCAAGCTGGCGGGAGGGTGGCACCCCGTGG
ATGACCTCCTTGGAAAAGACTGACCTTGATGTCGGAGGGCGCTGGCCTCTTCCTCCCTCCCTGCAGGGTA
GGGGGCCTGAGCCGAGGGGCTTCCCTCTGCTCCACAGAAACCCTGTTTTATTGAGTTCTGAAGGTTGGAA
CTGCAGCCATGATTTTGGCCACTTTGCAGACCTGGGACTTTAGGGCTAACCAGTTCTCTTTGTAAGGACT
TGTGCCTCTTGGGAGACGTCCACCCGTTTCCAAGCCTGGGCCACCGGCATCTCTGGAGTGTGCAGGGGTC
TGGGAGGCGGGTCCCGAGCCCCCTGTCCTTCCCACGGCCACTGCAGTCACCCCTGTCTGCCCCACTGTGC
TGTCGTCTGCCATGAGAACCCAGTCACTGCCTATACCCCTCATCACGTCACAATGTCCAAATTCCCAGCC
TCACCACCCCCCTTCTCAGTAAGGACCCTGGTTGGCTGTGGGAGGCACCTACTCCATACTGAGGGTGAAA
TTAAGGGAAGGTAAAGTCCAGGCACAAGAGTGGGACCCCAGCCTCTCACTCTCAGTTCCACTCATCCAAC
TGGGTCCCTCACCACGAATCTCACGACCTGATTCGGTTCCCTGCCTCCTCCTCCCATCACAGATGTGAGC
CAGGGCACTGCTCAGCTGTGACCCTCGGTGTTTCTGCCTTGTTGACATAGAGAGAGCCCTTTCCCCCCGA
GAAGGCCTGGCCCCTTCCTGTGCTGAGCCCGCAGCAGGAGGCTGGGTGTCCTGGTTGTCGGTGACGGCAC
CAGGATGGGCGGGCAAGGCACCCAGGGCAGGCCCACAGTCCCGCTGTCCCCCACTTGCACCCCAGCTTGT
GGCTGCCAGCCTCCCAGACAGCCCAGCCCGCTGCTCAGCTCCACATGCATAGAATCAGCCCTCCACATCC
CAAAAAGGGGAACACACCCCCTTCGAAATGGTTTTCTCCCCGGTCCCAGCTGGAAGCCATGCTGTCTGTT
CTGCTGGAGCAGCTGAACATATACATAGATGTTGCCCTGCCCTCCCCATCTGCACCCTGTTGCGTTGTAG
TTGGATTTGTCTGTTTATGCTTGGATTCACCAGAGTGACTATGATAGTGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAGGACGCATGTATCTTGAAATGCTTGTAAAGAGGTTTCTAACCCACCCTCACAAGGTGTCTCTCACCC
CCACGCTGGGACGCGTGTGGCCTGTGTGGCGCCGCCCTGCTGGGGCCTCCCAAGGTTTGAAAGGCTTTCC
TCAGCATCCGGGACCCAACAGAGACCAGATTCTAGCATCTAAGGAGGCCGTTCAGCTGTGAAGAAGGCCT
GAAGCACAGGATTAGGACTGAAGCGATGACATCTCCTTCCCTACTTCCCCTTGGGGCTCTCTGTGTCAGG
GCAGAGAGTAGGTCTTGTGGCTGGTCTGGCTTGCGGCACGAGGATGGTTCTCTCTGGTCACAGCCCGAAG
TCCCACAGCAGTCCTAAAGGAGGCTTACAACTCCTGCATCACAAGAAGAAGGAAGCCAGTGCCAGCTGGG
GGGATCTGCAGCTCCCAGAAGCTCCATGAGCCTCAGCCACCCCGCAGACTGGGTTCCTCGCCAAGCTCGC
CCTCTGGAGGGGCAGCCAGCCTCCCACCAAGGGCCCTGCGACCACAGCAGGGATTGGGATGAATGGCCTA
TCCTGGATCTGCTCCAGAGGCCCGAGCCACCTGCCTGAGGAAGGATAAGTCAGGAGACACCGTTCCCAAA
GCCTTGACCAGAGCACCTCAGCCCACTGACCTTGCACAAACTCCATCTGCTGCCATGAGAAAAGGGAAGC
CGCCTTTGCAAAAAATTGCTGCCTAAAGAAACTCAGCAGCCTCAGGCTCAATTCTGCCGCTTCTGGTTTG
GGTACAGTTAAAGGCAACCCTGAGGGACTTGGCAGTAGAAATCCAGGGCATCCCCTAGGGCTGGCAACTT
CGTGTGCAGCTAGAGCTTTCCCTGCAAGAAGTTTCTGGGCCCAGAACTCTCCACCAGGAAGCTCCCTGCT
GTTCGCTAAGTCCCAGCAATTCTCTAAGTGAAGGGATCTGAGAATGAGGAGGAAATGTGGGGTAGAGATT
TGGTGGTGGTTAGAGACATGCCCCCCTCATTACTGCCAACAGTTTCGGCTGCATTTTTCACGTACCTCGG
TTCCTCTTCCTGAAGTTCTTGTGCCCTGCTCTTCAGCACCGTGGGCCTTATCCGGTAGGCTCTGGGATCT
CCCCCTTGTGGGGCAGGCTCTTGGGGCCAGCCTAAGATCATGGTTTAGGGTGATCAGTGCTGGCAGATAA
ATTGCAAAGGCACGCTGGCTTGTGACCTCAAATGACAATCCCCCCAGGGCTGGGCACTCCTCCCCTCCCC
TCACTTCTCCCACCTGCAGAGCCAGTGTCCGTGGGTGGGCTAGATAGGATATACTGTATGCCGGCTCCTT
CAAGCTGTTGACTCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGACTTCAATGGTGAGACTGTATCCTGTTTG
CTATTGCTTATTGTGCTATGGGGGGAGGGGGGAGGAATGTGTAACATAGTTAACATGGGTAAAGGGAGAT
CTTGGGGTGCAGCACTTCAATTGCCTCGTAACCCTTTTCATCATTTCAACCACATTTGCTAAAGGGAGGG
AGCAGCCACGCGGTTAGAGGCCCTTGGGGTTTCTCTTTTCCACTGACAGCCTTTCCCAGGCAGCTGGCCA
GTTCCCCATTCCCTCCCCAGCCAGGTGCAGGCGTAGCAATATGGACATCTGGTTGCTTTGGCCTGCTGCC
CTCTTTCAGGGGTCCTAAGCCCACAATCATGCCTCCCTAAGACCCTGGCATCCTTCCTTTTAAGCCGTTG
GCACCTCTGTGCCACCTCTCACACTGGCTCCAGACACAGCCTGTGCTTCTGGCAGCTGAGATCACTCACT
TCCCCCTCCTCATCTTTGTTGGAGCTCCAAGTCAAGCCACGAGGTCAGGGCGAGGGCAGAGGTGGTCACC
AGCGTGTCCCATCTACAGACCTGTGGCTTCGTAAGACTTCTGATTTCTCTTCAGCTTTGAAAAGGGTTAC
CCTGGGCACTGGCCTAGAGTCTCACCTCCTAATAGACTTACCCCCATGAGTTTGCCATGTTGAGCAGGAC
AATTTCTGGCACTTGCAAGTCCCATGATTTCTTCGGTAATTGTGAGGGTGGGGGGAGGGACATGAAATCA
TCTTAGCTTAGCTTCCTGTCTGTGAATGTCTATATAGTGTATTGTGTGTTTTAACAAATGATTTACACTG
ACTGTTGCCGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTATTACTCTGATTAAA
配列番号8
>配列番号7の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACGGCAACAGT
CAGTGTAAATCATTTGTTAAAACACACAATACACTATATAGACATTCACAGACAGGAAGCTAAGCTAAGA
TGATTTCATGTCCCTCCCCCCACCCTCACAATTACCGAAGAAATCATGGGACTTGCAAGTGCCAGAAATT
GTCCTGCTCAACATGGCAAACTCATGGGGGTAAGTCTATTAGGAGGTGAGACTCTAGGCCAGTGCCCAGG
GTAACCCTTTTCAAAGCTGAAGAGAAATCAGAAGTCTTACGAAGCCACAGGTCTGTAGATGGGACACGCT
GGTGACCACCTCTGCCCTCGCCCTGACCTCGTGGCTTGACTTGGAGCTCCAACAAAGATGAGGAGGGGGA
AGTGAGTGATCTCAGCTGCCAGAAGCACAGGCTGTGTCTGGAGCCAGTGTGAGAGGTGGCACAGAGGTGC
CAACGGCTTAAAAGGAAGGATGCCAGGGTCTTAGGGAGGCATGATTGTGGGCTTAGGACCCCTGAAAGAG
GGCAGCAGGCCAAAGCAACCAGATGTCCATATTGCTACGCCTGCACCTGGCTGGGGAGGGAATGGGGAAC
TGGCCAGCTGCCTGGGAAAGGCTGTCAGTGGAAAAGAGAAACCCCAAGGGCCTCTAACCGCGTGGCTGCT
CCCTCCCTTTAGCAAATGTGGTTGAAATGATGAAAAGGGTTACGAGGCAATTGAAGTGCTGCACCCCAAG
ATCTCCCTTTACCCATGTTAACTATGTTACACATTCCTCCCCCCTCCCCCCATAGCACAATAAGCAATAG
CAAACAGGATACAGTCTCACCATTGAAGTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGAGTCAACAGCTTG
AAGGAGCCGGCATACAGTATATCCTATCTAGCCCACCCACGGACACTGGCTCTGCAGGTGGGAGAAGTGA
GGGGAGGGGAGGAGTGCCCAGCCCTGGGGGGATTGTCATTTGAGGTCACAAGCCAGCGTGCCTTTGCAAT
TTATCTGCCAGCACTGATCACCCTAAACCATGATCTTAGGCTGGCCCCAAGAGCCTGCCCCACAAGGGGG
AGATCCCAGAGCCTACCGGATAAGGCCCACGGTGCTGAAGAGCAGGGCACAAGAACTTCAGGAAGAGGAA
CCGAGGTACGTGAAAAATGCAGCCGAAACTGTTGGCAGTAATGAGGGGGGCATGTCTCTAACCACCACCA
AATCTCTACCCCACATTTCCTCCTCATTCTCAGATCCCTTCACTTAGAGAATTGCTGGGACTTAGCGAAC
AGCAGGGAGCTTCCTGGTGGAGAGTTCTGGGCCCAGAAACTTCTTGCAGGGAAAGCTCTAGCTGCACACG
AAGTTGCCAGCCCTAGGGGATGCCCTGGATTTCTACTGCCAAGTCCCTCAGGGTTGCCTTTAACTGTACC
CAAACCAGAAGCGGCAGAATTGAGCCTGAGGCTGCTGAGTTTCTTTAGGCAGCAATTTTTTGCAAAGGCG
GCTTCCCTTTTCTCATGGCAGCAGATGGAGTTTGTGCAAGGTCAGTGGGCTGAGGTGCTCTGGTCAAGGC
TTTGGGAACGGTGTCTCCTGACTTATCCTTCCTCAGGCAGGTGGCTCGGGCCTCTGGAGCAGATCCAGGA
TAGGCCATTCATCCCAATCCCTGCTGTGGTCGCAGGGCCCTTGGTGGGAGGCTGGCTGCCCCTCCAGAGG
GCGAGCTTGGCGAGGAACCCAGTCTGCGGGGTGGCTGAGGCTCATGGAGCTTCTGGGAGCTGCAGATCCC
CCCAGCTGGCACTGGCTTCCTTCTTCTTGTGATGCAGGAGTTGTAAGCCTCCTTTAGGACTGCTGTGGGA
CTTCGGGCTGTGACCAGAGAGAACCATCCTCGTGCCGCAAGCCAGACCAGCCACAAGACCTACTCTCTGC
CCTGACACAGAGAGCCCCAAGGGGAAGTAGGGAAGGAGATGTCATCGCTTCAGTCCTAATCCTGTGCTTC
AGGCCTTCTTCACAGCTGAACGGCCTCCTTAGATGCTAGAATCTGGTCTCTGTTGGGTCCCGGATGCTGA
GGAAAGCCTTTCAAACCTTGGGAGGCCCCAGCAGGGCGGCGCCACACAGGCCACACGCGTCCCAGCGTGG
GGGTGAGAGACACCTTGTGAGGGTGGGTTAGAAACCTCTTTACAAGCATTTCAAGATACATGCGTCCTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCACTATCATAGTCACTCTGGTGAATCCAAGCATAAACAGACAAATCCAA
CTACAACGCAACAGGGTGCAGATGGGGAGGGCAGGGCAACATCTATGTATATGTTCAGCTGCTCCAGCAG
AACAGACAGCATGGCTTCCAGCTGGGACCGGGGAGAAAACCATTTCGAAGGGGGTGTGTTCCCCTTTTTG
GGATGTGGAGGGCTGATTCTATGCATGTGGAGCTGAGCAGCGGGCTGGGCTGTCTGGGAGGCTGGCAGCC
ACAAGCTGGGGTGCAAGTGGGGGACAGCGGGACTGTGGGCCTGCCCTGGGTGCCTTGCCCGCCCATCCTG
GTGCCGTCACCGACAACCAGGACACCCAGCCTCCTGCTGCGGGCTCAGCACAGGAAGGGGCCAGGCCTTC
TCGGGGGGAAAGGGCTCTCTCTATGTCAACAAGGCAGAAACACCGAGGGTCACAGCTGAGCAGTGCCCTG
GCTCACATCTGTGATGGGAGGAGGAGGCAGGGAACCGAATCAGGTCGTGAGATTCGTGGTGAGGGACCCA
GTTGGATGAGTGGAACTGAGAGTGAGAGGCTGGGGTCCCACTCTTGTGCCTGGACTTTACCTTCCCTTAA
TTTCACCCTCAGTATGGAGTAGGTGCCTCCCACAGCCAACCAGGGTCCTTACTGAGAAGGGGGGTGGTGA
GGCTGGGAATTTGGACATTGTGACGTGATGAGGGGTATAGGCAGTGACTGGGTTCTCATGGCAGACGACA
GCACAGTGGGGCAGACAGGGGTGACTGCAGTGGCCGTGGGAAGGACAGGGGGCTCGGGACCCGCCTCCCA
GACCCCTGCACACTCCAGAGATGCCGGTGGCCCAGGCTTGGAAACGGGTGGACGTCTCCCAAGAGGCACA
AGTCCTTACAAAGAGAACTGGTTAGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGCAAAGTGGCCAAAATCATGGCTGCAG
TTCCAACCTTCAGAACTCAATAAAACAGGGTTTCTGTGGAGCAGAGGGAAGCCCCTCGGCTCAGGCCCCC
TACCCTGCAGGGAGGGAGGAAGAGGCCAGCGCCCTCCGACATCAAGGTCAGTCTTTTCCAAGGAGGTCAT
CCACGGGGTGCCACCCTCCCGCCAGCTTGCCTTCTCTTCTTACCCGCCGCCCCTTCTCCCACAGGCTGCC
CTGCAGAGGGTGGCACATCAACTCGCAGCAGACCCTGGCCACCAAGGACAGGCAGCCGCTCAGTCTGAGA
CACTGCAGGTGGCGGAGGCCTTGGCCCTCCCAGTGGCGCGGAGGAGGGCATCTCCTCTCCAGCATGTGGC
TTCCTCTCCCACTCCCCCTTCTCGTCCTTCCTCTCCCCTCTGCCCAGCCCCTGCCTTGGCCTCCCCCATG
GCCTCCCGCCCCACCCCCACCCGTCACACTCACACAAGGTTGACATCGTCTGCCTGTGGCTCCACGAACA
CACCAAGTTTCAAATCCTTTGTTGCTGCCGCTGCCTCTGTGACACCCCCACGACAGGGCCAGAGGCGGTG
GGCACCCCCAGTCTCTTGAAATCCCCCCGAAGCAGCTTTCACAGCCTCTCCTTCTCCCTCTTCTACATGG
AGGGGGAAAAAAAAAGAATCAAAAGGAATTGCCCGAGGAAATGTTGGGTGTGGCCATGTTTTTGAATGTT
TTTTAAAAAATATTTTATTATTAGCCCACCGATCAATTTGGAAAGATGCAATTTGCTCTTATTCCCATCA
CTGATTTTGAAGTCCCGAGCCAAAGCCGAGCGATAAAAGCCGGTTAAGTGATGAACCGATTAACCGAACT
GCGAGGAGCAGCTGGGGGCAGAGGGCGGGGCCGGGTCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCACTCTCT
CTTCTCTCCACGATTATTGACCGCCCCGGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCAGACAC
CTCGTCGGCTAGCGTGGCGAGCTGGGGCGAGTCTACCATGTCGATGCTGCCGGTGGAGGAGACATTGCTG
AGGTGCCGTGGAGACGTGTCCCCAGACACCACCGGCGACTTGTACACGATTTCCGCCCCGTGGTCTGTCT
TGGCTTTGGCGTTCTCGCGGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATTTCCTCCGCCAGGGACATG
GGTGATATTGTCCAGGGACCCGATCTTCGACTGCACTCTGTCCTTGAAGTCCAGCTTCTCAGATTTTACT
TCCACCTGGCCACCTCCTGGTTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCA
GGTCAACTGGTTTGTAGACTATTTGCACACTGCCGCCTCCCGGGACGTGTTTGATATTATCCTTTGAGCC
ACACTTGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTATTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCCCGGCTGG
TGCTTCAGGTTCTCGGTGGAGCCGATCTTGGACTTGACGTTCTTCAGGTCTGGCATGGGCACGGGGGCTG
TCTGCAGGCGGCTCTTGGCGGAAGACGGCGACTTAGGTGGAGTACGGACCACCGCCACCTTCTTGGGCTC
CCGGGCTGGAGGGGTTGGAAGGGACGGGGTGCGGGAGCGGCTGCCGGGAGTGCCCGGGGAGCCGGGGCTG
CTGTAGCCACTGCGATCCCCTGATTTTGGAGGTTCACCAGAGCTGGGTGGTGTCTTTGGGGCGGGCGGGG
TTTTTGCTGGAATCCTGGTGGCGTTGGCTTGGCCCTTCTGGCCTGGAGGGGCCGCTCCCCGGGGTGTGGC
GATCTTCGTTTTCCCATCAGCCCCCTTGGCTTTTTTGTCATCGCTTCCAGTCCCGTCTTTGCTTTTACTG
ACCATGCGAGCTTGGGTCACGTGACCAGCAGCTTCGTCTTCCAGGCTGGGGGTGTCTCCGATGCCTGCTT
CCTCAGCTGTGGTTCCTTCTGGGATCTCCATGTGGGGCTGGGCGGCAGCCTGCTCGCCGGGAGCTCTCTC
ATCCACTAAGGGCGCTGTCACATCTTCCGCCGTTGGAGTGCTCTTAGCATCAGAGGTTTCAGAGCCCAGT
TCCTCAGATCCATCCTCAGCGGGGGTCTGCAGGGGAGATTCTTTCAGGCCAGCGTCCGTGTCACCCTCTT
GGTCTTGGAGCATGGTGTAGCCCTCTTGATCTTTCCTGTCCCCCAACCCGTACGTCCCAGCGTGATCTTC
CATCACATCGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTGGTTCAAGGCTCGCCTGATAGTCGACAGAGGCGA
GGACGGGAGAGGACAGCGGAGGAGGAGAAGGTGGCTGTGGTGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCAGC
GGCGCTGCTGTTGGTGCCGGAGCTGGTGGGTGGCGGTGACTGCGAGGGCGCGCGCCGGGGAAGAGGGCGC
GTTCCCGAGGCCGGCAGGCGGCGCAGGCGCGAGCAGCGGGAGCGCGAGCCTCCCCAGGGGAGGGGGCGGG
CAGCCCGGCCTCCGCGGGAGCCTTCTCCTCCGGCCACCAGTGGGCGCGCGCGAGCGCCCTGCCGCTCGGC
配列番号9
>予想されるXM_008768277.2:ドブネズミ(Rattus norvegicus)微小管関連タンパク質タウ(Mapt)、転写物変異体X7、mRNA
ACCGCCCACCTTCTGCTGTCGCCGCCGCCACAACCACCTTCCCCTCCGCTGTCCTCTTCTGTCCTCGCCT
CCTGTCGATTATCAGGCTTTGAAGCAGCATGGCTGAACCCCGCCAGGAGTTTGACACAATGGAAGACCAG
GCCGGAGATTACACTATGCTCCAAGACCAAGAAGGAGACATGGACCATGGCTTAAAAGAGTCTCCCCCAC
AGCCCCCAGCCGATGATGGATCAGAAGAACCAGGGTCGGAGACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACTGC
TGAAGACGTGACTGCGCCCCTAGTGGAAGAGAGAGCTCCCGACAAGCAGGCGACTGCCCAGTCCCACACG
GAGATCCCAGAAGGCACCACAGCTGAAGAAGCAGGCATCGGAGACACCCCGAACATGGAGGACCAAGCTG
CTGGGCATGTGACTCAAGCTCGAGTGGCCGGCGTAAGCAAAGACAGGACAGGAAATGACGAGAAGAAAGC
CAAGGGCGCCGATGGCAAAACGGGGGCGAAGATCGCCACACCTCGGGGAGCAGCCACTCCGGGCCAGAAA
GGCACATCCAATGCCACCAGGATCCCAGCCAAGACCACACCCAGCCCAAAGACTCCTCCAGGATCAGGTG
AACCACCAAAATCCGGAGAACGAAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCGCCCGGAACCCCTGGCAGTCGCTC
CCGTACCCCATCCCTACCAACGCCGCCCACCCGAGAGCCCAAAAAGGTGGCAGTGGTTCGCACTCCCCCT
AAGTCACCGTCTGCCAGTAAGAGCCGCCTACAGACTGCCCCTGTGCCCATGCCAGACCTAAAGAACGTCA
GGTCCAAGATTGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCGGGAGGCGGCAAGGTGCAGATAATTAATAA
GAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCAAAGGACAATATCAAACACGTCCCGGGCGGA
GGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAGCCAGTGGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGTTCCTTAGGGA
ACATCCATCACAAGCCAGGAGGTGGCCAGGTAGAAGTAAAATCAGAGAAGCTGGACTTCAAGGATAGAGT
CCAGTCGAAGATTGGCTCCTTGGATAACATCACCCATGTCCCTGGAGGAGGGAATAAGAAGATTGAAACC
CACAAGCTGACCTTCAGGGAGAATGCCAAAGCCAAGACAGACCATGGAGCAGAAATCGTGTACAAGTCAC
CTGTGGTGTCTGGGGACACATCTCCACGGCACCTCAGCAACGTCTCCTCCACGGGCAGCATCGACATGGT
GGACTCTCCACAGCTTGCCACGTTAGCCGATGAAGTGTCCGCCTCTTTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCA
GGCCCCTGGGGCCGTCACTGATCATGGAGAGAAGAGAGAGTGAGAGTGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAG
AATGACCTGGCCCCTCACCCTCTGCCCTCCCCGCTGCTCCTCATAGACAGGCTGACCAGCTTGTCACCTA
ACCTGCTTTTGTGGCTCGGGTTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAAAAAGTAAATTTCATCTT
TCCAAATTGATTTGTGGGCTAGTAATAAAATATTTTTAAGGAAGGAAAAAAAAAAAAACACGTAAAACCA
TGGCCAAACAAAACCCAACATTTCCTTGGCAATTGTTATTGACCCCGCCCCCCCCCTCTGAGTTTTAGAG
GGTGAAGGAGGCTTTGGATGGAGGCTGCTTCTGGGGATTGGCTGAGGGACTAGGGCAACTAATTGCCCAC
AGCCCCATCTTAGGGGCATCAGGGACAGCGGCAGCAATGAAAGACTTGGGACTTGGTGTGTTTGTGGAGC
CGTAGGCAGGTGATGTTAACTTTGTGTGGGTTTGAGGGAGGACTGTGATAGTGAAGGCTGAGAGATGGGT
GGGCTGGGAGTCAGAGGAGAGAGGTGAGGAAGACAGGTTGGGAGAGGGGACATTGGCTCCTTGCCAAGGA
GCTTGGGAAGCACAGGTAGCCCTGGCTGCCTGCAGCAGTCTTAGCTAGCACAGATGCCTGCCTGAGAAAG
CACAGTGGGGTACAGTGGGTGTGTGTGCCCCTTCTGAAGGGCAGCCCATGGGAGAAGGGGTATTGGGCAG
AAGGAAGGTAGGCCAGAAGGTGGCACCTTGTAGATTGGTTCTCTGAAGGCTGACCTTGCCATCCCAGGGC
ACTGGCTCCCACCCTCCAGGGAGGGAGGTCCTGAGCTGAGGAGCTTCCCTTTGCTCTCACAGGAAAACCT
GTGTTACTGAGTTCTGAAGTTTGGAACTACAGCCATGATTTTGGCCACCATACAGACCTGGGACTTTAGG
GCTAACCAGTTCTTTGTAAGGACTTGTGCCTCTTGCGGGAACATCTGCCTGTTCTCAAGCCTGGTCCTCT
GGCACTTCTGCAGTGTGAGGGATGGGGGTGGTAATTCTGGGATGTGGGTCCCAGGCCTCCCATCCTCGCA
CAGCCACTGTATCCCCTCTACCTGTCCTATCATGCCCACGTCTGCCATGAGAGCCAGTCACTGCCGTCCG
TACATCACGTCTCACCGTCCTGAGTGCCCAGCCTCCCCAAGCCCCATCCCTGGCCCCTGGGTAGTTATGG
CCAATATCTGCTCTACACTAGGGGTTGGAGTCCAGGGAAGGCAAAGATTTGGGCCTTGGTCTCTAGTCCT
ACGTTGCACGAATCCAACCAGTGTGCCTCCCACAAGGAACCTTACAACCTTGTTTGGTTTGCTCCATCAT
TTCCCATCGTGGATGGGAGTCCGTGTGTGCCTGGAGATTACCCTGGACACCTCTGCTTTTTTTTTTTTAC
TTTAGCGGTTGCCTCCTAGGCCTGACTCCTTCCCATGTTGAACTGGAGGCAGCCACGTTAGGTGTCAATG
TCCTGGCATCAGTATGAACAGTCAGTAGTCCCAGGGCAGGGCCACACTTCTCCCATCTTCTGCTTCCACC
CCAGCTTGTGATTGCTAGCCTCCCAGAGCTCAGCCGCCATTAAGTCCCCATGCACGTAATCAGCCCTTCA
TACCCCAATTTGGGGAACATACCCCTTGATTGAAATGTTTTCCCTCCAGTCCTATGGAAGCGGTGCTGCC
TGCCCTGCTGGAGCAGCCAGCCATCTCCAGAGACGCAGCCCTTTCTCTCCTGTCCGCACCCTGTTGCGCT
GTAGTCGGATTCGTCTGTTTGTCTGGGTTCACCAGAGTGACTATGATAGTGAAAAGAAAAAGAAAAAGAA
AAAAGAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGGACGCATGTTATCTTGAAATATTTGTCAAAAGGTTGTAGCCCACC
GCAGGGATTGGAGGGCCTGGATATTCCTTGTCTTCTTCGTGACTTAGGTCCAGGCCGGTGCAGTGCTACC
CTGCTGGGACATCCCATGTTTTGAAGGGTTTCTTCTTCATCTGGGACCCTGCAGACACTGGATTGTGACA
TTGGAGGTCTATGACATTGGCCAAGGCCTGAAGCACAGGACCCGTTAGAGGCAGCAGGCTCCGACTGTCA
GGGAGAGCTTGTGGCTGGCCTGTTTCTCTGAGTGAAGATGGTCCTCTCTAATCACAACTTCAAGTCCCAC
AGCAGCCCTGGCAGACATCTAAGAACTCCTGCATCACAAGAGAAAAGGACACTAGTACCAGCAGGGAGAG
CTGTGGCCCTAGAAATTCCATGACTCTCCACTACATATCCGTGGGTCCTTTCCAAGCCTTGGCCTCGTCA
CCAAGGGCTTGGGATGGACTGCCCCACTGATGAAAGGGACATCTTTGGAGACCCCCTTGGTTTCCAAGGC
GTCAGCCCCCTGACCTTGCATGACCTCCTACAGCTGTAAGGATGAGGCCTTTAAAGATTAGGAACCTCAG
GCCCAGGTCGGCCACTTTGGGCTTGGGTACAGTTAGGGACGATGCGGTAGAAGGAGGTGGCCAACCTTTC
CCATATAAGAGTTCTGTGTGCCCAGAGCTACCCTATTGTGAGCTCCCCACTGCTGATGGACTTTAGCTGT
CCTTAGAAGTGAAGAGTCCAACGGAGGAAAAGGAAGTGTGGTTTGATGGTCTGTGGTCCCTTCATCATGG
TTACCTGTTGTGGTTTTCTCTCGTATACCCATTTACCCATCCTGCAGTTCCTGTCCTTGAATAGGGGTGG
GGGTACTCTGCCATATCTCTTGTAGGGCAGTCAGCCCCCAAGTCATAGTTTGGAGTGATCTGGTCAGTGC
TAATAGGCAGTTTACAAAGGAATTCTGGCTTGTTACTTCAGTGAGGACAATCCCCCAAGGGCCCTGGCAC
CTGTCCTGTCTTTCCATGGCTCTCCACTGCAGAGCCAATGTCTTTGGGTGGGCTAGATAGGGTGTACAAT
TTGCCTGGTTCCTCCAAGCTCTTAATCCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGACTTCAATGATAAGA
GTGTATCCCATTTGAGATTGCTTGTGTTGTGGGGTAAAGGGGGGAGGAGGAACATGTTAAGATAATTGAC
ATGGGCAAGGGGAAGTCTTGAAGTGTAGCAGTTAAACCATCTTGTAGCCCCATTCATGATGTTGACCACT
TGCTAGAGAGAAGAGGTGCCATAAGGCTAGAACCTAGAGGCTTGGCTGTCCCACCAACAGGCAGGCTTTT
GCAAGGCAGAGGCAGCCAGCTAGGTCCCTGACTTCCCAGCCAGGTGCAGCTCTAAGAACTGCTCTTGCCT
GCTGCCTTCTTGTGGTGTCCAGAGCCCACAGCCAATGCCTCCTCAAAACCCTGGCTTCCTTCCTTCTAAT
CCACTGGCACATCAGCATCACCTCCGGATTGACTTCAGATCCACAGCCTACACTACTAGCAGTGGGTAAG
ACCACTTCCTTTGTCCTTGTCTGTTCTCCAGAAAAGTGGGCATGGAGGCGGTGTTAATAACTATAGGTCT
GTGGCTTTATGAGCCTTCAAACTTCTCTCTAGCTTCTGAAAGGGTTACTTTTGGGCAGTATTGCAGTCTC
ACCCTCCCGATGGGCTGTAGCCTGTGCAGTTGCTGTACTGGGCATGATCTCCAGTGCTTGCAAGTCCCAT
GATTTCTTTGGTGATTTTGAGGGTGGGGGGAGGGACATGAATCATCTTAGCTTAGCTTCCTGTCTGTGAA
TGTCCATATAGTGTACTGTGTTTTAACAAACGATTTACACTGACTGTTGCTGTACAAGTGAATTTGGAAA
TAAAGTTATTACTCTGATTAAA
配列番号10
>配列番号9の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTA
TTTCCAAATTCACTTGTACAGCAACAGTCAGTGTAAATCGTTTGTTAAAACACAGTACACTATATGGACA
TTCACAGACAGGAAGCTAAGCTAAGATGATTCATGTCCCTCCCCCCACCCTCAAAATCACCAAAGAAATC
ATGGGACTTGCAAGCACTGGAGATCATGCCCAGTACAGCAACTGCACAGGCTACAGCCCATCGGGAGGGT
GAGACTGCAATACTGCCCAAAAGTAACCCTTTCAGAAGCTAGAGAGAAGTTTGAAGGCTCATAAAGCCAC
AGACCTATAGTTATTAACACCGCCTCCATGCCCACTTTTCTGGAGAACAGACAAGGACAAAGGAAGTGGT
CTTACCCACTGCTAGTAGTGTAGGCTGTGGATCTGAAGTCAATCCGGAGGTGATGCTGATGTGCCAGTGG
ATTAGAAGGAAGGAAGCCAGGGTTTTGAGGAGGCATTGGCTGTGGGCTCTGGACACCACAAGAAGGCAGC
AGGCAAGAGCAGTTCTTAGAGCTGCACCTGGCTGGGAAGTCAGGGACCTAGCTGGCTGCCTCTGCCTTGC
AAAAGCCTGCCTGTTGGTGGGACAGCCAAGCCTCTAGGTTCTAGCCTTATGGCACCTCTTCTCTCTAGCA
AGTGGTCAACATCATGAATGGGGCTACAAGATGGTTTAACTGCTACACTTCAAGACTTCCCCTTGCCCAT
GTCAATTATCTTAACATGTTCCTCCTCCCCCCTTTACCCCACAACACAAGCAATCTCAAATGGGATACAC
TCTTATCATTGAAGTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGGATTAAGAGCTTGGAGGAACCAGGCAA
ATTGTACACCCTATCTAGCCCACCCAAAGACATTGGCTCTGCAGTGGAGAGCCATGGAAAGACAGGACAG
GTGCCAGGGCCCTTGGGGGATTGTCCTCACTGAAGTAACAAGCCAGAATTCCTTTGTAAACTGCCTATTA
GCACTGACCAGATCACTCCAAACTATGACTTGGGGGCTGACTGCCCTACAAGAGATATGGCAGAGTACCC
CCACCCCTATTCAAGGACAGGAACTGCAGGATGGGTAAATGGGTATACGAGAGAAAACCACAACAGGTAA
CCATGATGAAGGGACCACAGACCATCAAACCACACTTCCTTTTCCTCCGTTGGACTCTTCACTTCTAAGG
ACAGCTAAAGTCCATCAGCAGTGGGGAGCTCACAATAGGGTAGCTCTGGGCACACAGAACTCTTATATGG
GAAAGGTTGGCCACCTCCTTCTACCGCATCGTCCCTAACTGTACCCAAGCCCAAAGTGGCCGACCTGGGC
CTGAGGTTCCTAATCTTTAAAGGCCTCATCCTTACAGCTGTAGGAGGTCATGCAAGGTCAGGGGGCTGAC
GCCTTGGAAACCAAGGGGGTCTCCAAAGATGTCCCTTTCATCAGTGGGGCAGTCCATCCCAAGCCCTTGG
TGACGAGGCCAAGGCTTGGAAAGGACCCACGGATATGTAGTGGAGAGTCATGGAATTTCTAGGGCCACAG
CTCTCCCTGCTGGTACTAGTGTCCTTTTCTCTTGTGATGCAGGAGTTCTTAGATGTCTGCCAGGGCTGCT
GTGGGACTTGAAGTTGTGATTAGAGAGGACCATCTTCACTCAGAGAAACAGGCCAGCCACAAGCTCTCCC
TGACAGTCGGAGCCTGCTGCCTCTAACGGGTCCTGTGCTTCAGGCCTTGGCCAATGTCATAGACCTCCAA
TGTCACAATCCAGTGTCTGCAGGGTCCCAGATGAAGAAGAAACCCTTCAAAACATGGGATGTCCCAGCAG
GGTAGCACTGCACCGGCCTGGACCTAAGTCACGAAGAAGACAAGGAATATCCAGGCCCTCCAATCCCTGC
GGTGGGCTACAACCTTTTGACAAATATTTCAAGATAACATGCGTCCTTTTTTTTTTTTCTTTTTTCTTTT
TTCTTTTTCTTTTTCTTTTCACTATCATAGTCACTCTGGTGAACCCAGACAAACAGACGAATCCGACTAC
AGCGCAACAGGGTGCGGACAGGAGAGAAAGGGCTGCGTCTCTGGAGATGGCTGGCTGCTCCAGCAGGGCA
GGCAGCACCGCTTCCATAGGACTGGAGGGAAAACATTTCAATCAAGGGGTATGTTCCCCAAATTGGGGTA
TGAAGGGCTGATTACGTGCATGGGGACTTAATGGCGGCTGAGCTCTGGGAGGCTAGCAATCACAAGCTGG
GGTGGAAGCAGAAGATGGGAGAAGTGTGGCCCTGCCCTGGGACTACTGACTGTTCATACTGATGCCAGGA
CATTGACACCTAACGTGGCTGCCTCCAGTTCAACATGGGAAGGAGTCAGGCCTAGGAGGCAACCGCTAAA
GTAAAAAAAAAAAAGCAGAGGTGTCCAGGGTAATCTCCAGGCACACACGGACTCCCATCCACGATGGGAA
ATGATGGAGCAAACCAAACAAGGTTGTAAGGTTCCTTGTGGGAGGCACACTGGTTGGATTCGTGCAACGT
AGGACTAGAGACCAAGGCCCAAATCTTTGCCTTCCCTGGACTCCAACCCCTAGTGTAGAGCAGATATTGG
CCATAACTACCCAGGGGCCAGGGATGGGGCTTGGGGAGGCTGGGCACTCAGGACGGTGAGACGTGATGTA
CGGACGGCAGTGACTGGCTCTCATGGCAGACGTGGGCATGATAGGACAGGTAGAGGGGATACAGTGGCTG
TGCGAGGATGGGAGGCCTGGGACCCACATCCCAGAATTACCACCCCCATCCCTCACACTGCAGAAGTGCC
AGAGGACCAGGCTTGAGAACAGGCAGATGTTCCCGCAAGAGGCACAAGTCCTTACAAAGAACTGGTTAGC
CCTAAAGTCCCAGGTCTGTATGGTGGCCAAAATCATGGCTGTAGTTCCAAACTTCAGAACTCAGTAACAC
AGGTTTTCCTGTGAGAGCAAAGGGAAGCTCCTCAGCTCAGGACCTCCCTCCCTGGAGGGTGGGAGCCAGT
GCCCTGGGATGGCAAGGTCAGCCTTCAGAGAACCAATCTACAAGGTGCCACCTTCTGGCCTACCTTCCTT
CTGCCCAATACCCCTTCTCCCATGGGCTGCCCTTCAGAAGGGGCACACACACCCACTGTACCCCACTGTG
CTTTCTCAGGCAGGCATCTGTGCTAGCTAAGACTGCTGCAGGCAGCCAGGGCTACCTGTGCTTCCCAAGC
TCCTTGGCAAGGAGCCAATGTCCCCTCTCCCAACCTGTCTTCCTCACCTCTCTCCTCTGACTCCCAGCCC
ACCCATCTCTCAGCCTTCACTATCACAGTCCTCCCTCAAACCCACACAAAGTTAACATCACCTGCCTACG
GCTCCACAAACACACCAAGTCCCAAGTCTTTCATTGCTGCCGCTGTCCCTGATGCCCCTAAGATGGGGCT
GTGGGCAATTAGTTGCCCTAGTCCCTCAGCCAATCCCCAGAAGCAGCCTCCATCCAAAGCCTCCTTCACC
CTCTAAAACTCAGAGGGGGGGGGCGGGGTCAATAACAATTGCCAAGGAAATGTTGGGTTTTGTTTGGCCA
TGGTTTTACGTGTTTTTTTTTTTTTCCTTCCTTAAAAATATTTTATTACTAGCCCACAAATCAATTTGGA
AAGATGAAATTTACTTTTTCCCATCACTGATTTTGAAGTCCCGAGCCAAACCCGAGCCACAAAAGCAGGT
TAGGTGACAAGCTGGTCAGCCTGTCTATGAGGAGCAGCGGGGAGGGCAGAGGGTGAGGGGCCAGGTCATT
CTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCACACTCTCACTCTCTCTTCTCTCCATGATCAGTGACGGCCCCAGGGGCC
TGATCACAAACCCTGCTTGGCCAAAGAGGCGGACACTTCATCGGCTAACGTGGCAAGCTGTGGAGAGTCC
ACCATGTCGATGCTGCCCGTGGAGGAGACGTTGCTGAGGTGCCGTGGAGATGTGTCCCCAGACACCACAG
GTGACTTGTACACGATTTCTGCTCCATGGTCTGTCTTGGCTTTGGCATTCTCCCTGAAGGTCAGCTTGTG
GGTTTCAATCTTCTTATTCCCTCCTCCAGGGACATGGGTGATGTTATCCAAGGAGCCAATCTTCGACTGG
ACTCTATCCTTGAAGTCCAGCTTCTCTGATTTTACTTCTACCTGGCCACCTCCTGGCTTGTGATGGATGT
TCCCTAAGGAACCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGGTCCACTGGCTTGTAGACTATTTGCACACTGCC
TCCGCCCGGGACGTGTTTGATATTGTCCTTTGAGCCACACTTGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTC
TTATTAATTATCTGCACCTTGCCGCCTCCCGGCTGGTGCTTCAGGTTCTCAGTGGAGCCAATCTTGGACC
TGACGTTCTTTAGGTCTGGCATGGGCACAGGGGCAGTCTGTAGGCGGCTCTTACTGGCAGACGGTGACTT
AGGGGGAGTGCGAACCACTGCCACCTTTTTGGGCTCTCGGGTGGGCGGCGTTGGTAGGGATGGGGTACGG
GAGCGACTGCCAGGGGTTCCGGGCGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCGCTTCGTTCTCCGGATTTTGGTGGTT
CACCTGATCCTGGAGGAGTCTTTGGGCTGGGTGTGGTCTTGGCTGGGATCCTGGTGGCATTGGATGTGCC
TTTCTGGCCCGGAGTGGCTGCTCCCCGAGGTGTGGCGATCTTCGCCCCCGTTTTGCCATCGGCGCCCTTG
GCTTTCTTCTCGTCATTTCCTGTCCTGTCTTTGCTTACGCCGGCCACTCGAGCTTGAGTCACATGCCCAG
CAGCTTGGTCCTCCATGTTCGGGGTGTCTCCGATGCCTGCTTCTTCAGCTGTGGTGCCTTCTGGGATCTC
CGTGTGGGACTGGGCAGTCGCCTGCTTGTCGGGAGCTCTCTCTTCCACTAGGGGCGCAGTCACGTCTTCA
GCAGTTGGAGTGCTCTTAGCATCAGAGGTCTCCGACCCTGGTTCTTCTGATCCATCATCGGCTGGGGGCT
GTGGGGGAGACTCTTTTAAGCCATGGTCCATGTCTCCTTCTTGGTCTTGGAGCATAGTGTAATCTCCGGC
CTGGTCTTCCATTGTGTCAAACTCCTGGCGGGGTTCAGCCATGCTGCTTCAAAGCCTGATAATCGACAGG
AGGCGAGGACAGAAGAGGACAGCGGAGGGGAAGGTGGTTGTGGCGGCGGCGACAGCAGAAGGTGGGCGGT
配列番号11
>予想されるXM_005624183.3:イヌ(Canis lupus familiaris)微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体X23、mRNA
CGCGCTCGCGCTCTCAGCCACCCACCAGCTCCCGCACCAGCAGCAGCAGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC
CGCCGCCGCCCACCTTCTGCTGCCGCCACCACAGCCACTTTCTCCTCTTTCCTCTCCTGTCCTCGCCCTC
TGTCGACTATCAGGTGGGCCTTGACCTAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCACTGTGATGGAAGATC
ATGCTGGGACATACGGGAAAGATCTCCCCTCTCAGGGGGGCTACACCCTGCTGCAAGACCATGAGGGGGA
CGTGGATCACGGCCTGAAAGCTGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAACCTGGAAGACCAAGCTGCT
GGACATGTGACTCAAGCTCGCATGGTCAGTAAAGGCAAAGATGGGACTGGAACCGATGACAAAAAAGCCA
AGGGGGCTGATGGTAAAACTGGAACGAAGATCGCCACACCCCGGGGAGCGACCCCTTCAGGCCAGAAAGG
CCAGGCCAATGCCACCAGGATTCCAGCGAAAACCACGCCCTCCCCCAAGACCCCACCGGGCGGTGAATCT
GGAAAATCTGGGGATCGCAGTGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCTGGCAGCCGCTCCCGCA
CCCCGTCCCTGCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCGGTGGTCCGCACCCCACCCAAGTC
GCCGTCTGCAGCCAAGAGTCGCCTGCAGACCGCCCCTGTGCCCATGCCAGACCTAAAGAACGTCAGATCC
AAGATCGGCTCCACTGAAAACCTGAAGCACCAGCCAGGAGGTGGGAAGGTGCAAATAGTGTACAAACCAG
TGGATCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGCGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAGCCAGGAGGCGGTCA
GGTGGAAGTCAAATCTGAGAAGCTGGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATCGGGTCCCTGGACAAC
ATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGGAATAAAAAGATCGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGTGAGAACGCCA
AAGCCAAGACCGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCCGTGGTGTCCGGGGACACGTCTCCGCG
GCACCTGAGCAACGTGTCCTCCACGGGCAGCATCGACATGGTCGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCC
GACGAAGTGTCCGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCCGGGGCGGTCAATGATCGTGGA
GAGAAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGATCTGGCCCTTCTCGCCCTCTGCCCTCCCCCAGCTGCT
CCTCACAGACCGGTTAATCGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCGCTCGGCTCTGGCTCGGGACTTCAA
AATCAGTGACGGGAAAAAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAATAATAATAAAATATTT
TTAAAACCATTTAAAAA
配列番号12
>配列番号11の逆相補物
TTTTTAAATGGTTTTAA
AAATATTTTATTATTATTAGCCCACCCATCAATTTGGAAAGATGAAATTTGCTTTTTCCCGTCACTGATT
TTGAAGTCCCGAGCCAGAGCCGAGCGACAAAAGCAGGTTAAGTGATTAACCGATTAACCGGTCTGTGAGG
AGCAGCTGGGGGAGGGCAGAGGGCGAGAAGGGCCAGATCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCTTCTC
TCCACGATCATTGACCGCCCCGGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCGGACACTTCGTC
GGCTAGCGTGGCGAGCTGGGGCGAGTCGACCATGTCGATGCTGCCCGTGGAGGACACGTTGCTCAGGTGC
CGCGGAGACGTGTCCCCGGACACCACGGGCGACTTGTACACGATCTCCGCCCCGTGGTCGGTCTTGGCTT
TGGCGTTCTCACGGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCGATCTTTTTATTCCCTCCGCCAGGGACGTGGGTGAT
GTTGTCCAGGGACCCGATCTTCGACTGGACTCTGTCCTTGAAGTCCAGCTTCTCAGATTTGACTTCCACC
TGACCGCCTCCTGGCTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCGCACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGATCCA
CTGGTTTGTACACTATTTGCACCTTCCCACCTCCTGGCTGGTGCTTCAGGTTTTCAGTGGAGCCGATCTT
GGATCTGACGTTCTTTAGGTCTGGCATGGGCACAGGGGCGGTCTGCAGGCGACTCTTGGCTGCAGACGGC
GACTTGGGTGGGGTGCGGACCACCGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGGTGGGTGGGGTTGGCAGGGACGGGG
TGCGGGAGCGGCTGCCAGGAGTGCCTGGGGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCACTGCGATCCCCAGATTTTCC
AGATTCACCGCCCGGTGGGGTCTTGGGGGAGGGCGTGGTTTTCGCTGGAATCCTGGTGGCATTGGCCTGG
CCTTTCTGGCCTGAAGGGGTCGCTCCCCGGGGTGTGGCGATCTTCGTTCCAGTTTTACCATCAGCCCCCT
TGGCTTTTTTGTCATCGGTTCCAGTCCCATCTTTGCCTTTACTGACCATGCGAGCTTGAGTCACATGTCC
AGCAGCTTGGTCTTCCAGGTTGGGGGTGTCTCCAATGCCTGCTTCTTCAGCTTTCAGGCCGTGATCCACG
TCCCCCTCATGGTCTTGCAGCAGGGTGTAGCCCCCCTGAGAGGGGAGATCTTTCCCGTATGTCCCAGCAT
GATCTTCCATCACAGTGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTAGGTCAAGGCCCACCTGATAGTCGACA
GAGGGCGAGGACAGGAGAGGAAAGAGGAGAAAGTGGCTGTGGTGGCGGCAGCAGAAGGTGGGCGGCGGCG
GCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTGCTGCTGGTGCGGGAGCTGGTGGGTGGCTGAGAGCGCGAGCGCG
配列番号1533
>MAPT(NM_005910)エクソン10
GTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTA
GGCAACATCCATCATAAACCAG
配列番号1
>NM_016841.4 ヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体4、mRNA
GGACGGCCGAGCGGCAGGGCGCTCGCGCGCGCCCACTAGTGGCCGGAGGAGAAGGCTCCCGCGGAGGCCG
CGCTGCCCGCCCCCTCCCCTGGGGAGGCTCGCGTTCCCGCTGCTCGCGCCTGCGCCGCCCGCCGGCCTCA
GGAACGCGCCCTCTTCGCCGGCGCGCGCCCTCGCAGTCACCGCCACCCACCAGCTCCGGCACCAACAGCA
GCGCCGCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCC
CGTCCTCGCCTCTGTCGACTATCAGGTGAACTTTGAACCAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAG
TGATGGAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAGGGGGGCTACACCATGCACCA
AGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGCTGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAGCCTG
GAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCG
ATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGTAAAACGAAGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGG
CCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGC
TCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCA
GCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCCGTAC
TCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGACAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAG
AATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAAATAG
TCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACC
AGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGG
TCCCTGGACAATATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCC
GCGAGAACGCCAAAGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGGGA
CACGTCTCCACGGCATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTC
GCCACGCTAGCTGACGAGGTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCTGGGGCGGTC
AATAATTGTGGAGAGGAGAGAATGAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCCGCCCTCT
GCCCCCAGCTGCTCCTCGCAGTTCGGTTAATTGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCACTCGGCTTTGG
CTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAGTAAGAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAGT
AATAAAATATTTAAAAAAAAACATTCAAAAACATGGCCACATCCAACATTTCCTCAGGCAATTCCTTTTG
ATTCTTTTTTCTTCCCCCTCCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTCTGAAAGCTGCTTCTGGGGGATT
TCAAGGGACTGGGGGTGCCAACCACCTCTGGCCCTGTTGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGTGGCAGCAACA
AAGGATTTGAAACTTGGTGTGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGG
GGTTGGGGTGGGGCGGGAGGCCACGGGGGAGGCCGAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGCACAA
GAAGTGGGAGTGGGAGAGGAAGCCACGTGCTGGAGAGTAGACATCCCCCTCCTTGCCGCTGGGAGAGCCA
AGGCCTATGCCACCTGCAGCGTCTGAGCGGCCGCCTGTCCTTGGTGGCCGGGGGTGGGGGCCTGCTGTGG
GTCAGTGTGCCACCCTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAGGGACAGCGGGTAAAAAGAGAAGGCAAGCTG
GCAGGAGGGTGGCACTTCGTGGATGACCTCCTTAGAAAAGACTGACCTTGATGTCTTGAGAGCGCTGGCC
TCTTCCTCCCTCCCTGCAGGGTAGGGGGCCTGAGTTGAGGGGCTTCCCTCTGCTCCACAGAAACCCTGTT
TTATTGAGTTCTGAAGGTTGGAACTGCTGCCATGATTTTGGCCACTTTGCAGACCTGGGACTTTAGGGCT
AACCAGTTCTCTTTGTAAGGACTTGTGCCTCTTGGGAGACGTCCACCCGTTTCCAAGCCTGGGCCACTGG
CATCTCTGGAGTGTGTGGGGGTCTGGGAGGCAGGTCCCGAGCCCCCTGTCCTTCCCACGGCCACTGCAGT
CACCCCGTCTGCGCCGCTGTGCTGTTGTCTGCCGTGAGAGCCCAATCACTGCCTATACCCCTCATCACAC
GTCACAATGTCCCGAATTCCCAGCCTCACCACCCCTTCTCAGTAATGACCCTGGTTGGTTGCAGGAGGTA
CCTACTCCATACTGAGGGTGAAATTAAGGGAAGGCAAAGTCCAGGCACAAGAGTGGGACCCCAGCCTCTC
ACTCTCAGTTCCACTCATCCAACTGGGACCCTCACCACGAATCTCATGATCTGATTCGGTTCCCTGTCTC
CTCCTCCCGTCACAGATGTGAGCCAGGGCACTGCTCAGCTGTGACCCTAGGTGTTTCTGCCTTGTTGACA
TGGAGAGAGCCCTTTCCCCTGAGAAGGCCTGGCCCCTTCCTGTGCTGAGCCCACAGCAGCAGGCTGGGTG
TCTTGGTTGTCAGTGGTGGCACCAGGATGGAAGGGCAAGGCACCCAGGGCAGGCCCACAGTCCCGCTGTC
CCCCACTTGCACCCTAGCTTGTAGCTGCCAACCTCCCAGACAGCCCAGCCCGCTGCTCAGCTCCACATGC
ATAGTATCAGCCCTCCACACCCGACAAAGGGGAACACACCCCCTTGGAAATGGTTCTTTTCCCCCAGTCC
CAGCTGGAAGCCATGCTGTCTGTTCTGCTGGAGCAGCTGAACATATACATAGATGTTGCCCTGCCCTCCC
CATCTGCACCCTGTTGAGTTGTAGTTGGATTTGTCTGTTTATGCTTGGATTCACCAGAGTGACTATGATA
GTGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGACGCATGTATCTTGAAATGCTTGTAAAGAGGTTTCTAACCCA
CCCTCACGAGGTGTCTCTCACCCCCACACTGGGACTCGTGTGGCCTGTGTGGTGCCACCCTGCTGGGGCC
TCCCAAGTTTTGAAAGGCTTTCCTCAGCACCTGGGACCCAACAGAGACCAGCTTCTAGCAGCTAAGGAGG
CCGTTCAGCTGTGACGAAGGCCTGAAGCACAGGATTAGGACTGAAGCGATGATGTCCCCTTCCCTACTTC
CCCTTGGGGCTCCCTGTGTCAGGGCACAGACTAGGTCTTGTGGCTGGTCTGGCTTGCGGCGCGAGGATGG
TTCTCTCTGGTCATAGCCCGAAGTCTCATGGCAGTCCCAAAGGAGGCTTACAACTCCTGCATCACAAGAA
AAAGGAAGCCACTGCCAGCTGGGGGGATCTGCAGCTCCCAGAAGCTCCGTGAGCCTCAGCCACCCCTCAG
ACTGGGTTCCTCTCCAAGCTCGCCCTCTGGAGGGGCAGCGCAGCCTCCCACCAAGGGCCCTGCGACCACA
GCAGGGATTGGGATGAATTGCCTGTCCTGGATCTGCTCTAGAGGCCCAAGCTGCCTGCCTGAGGAAGGAT
GACTTGACAAGTCAGGAGACACTGTTCCCAAAGCCTTGACCAGAGCACCTCAGCCCGCTGACCTTGCACA
AACTCCATCTGCTGCCATGAGAAAAGGGAAGCCGCCTTTGCAAAACATTGCTGCCTAAAGAAACTCAGCA
GCCTCAGGCCCAATTCTGCCACTTCTGGTTTGGGTACAGTTAAAGGCAACCCTGAGGGACTTGGCAGTAG
AAATCCAGGGCCTCCCCTGGGGCTGGCAGCTTCGTGTGCAGCTAGAGCTTTACCTGAAAGGAAGTCTCTG
GGCCCAGAACTCTCCACCAAGAGCCTCCCTGCCGTTCGCTGAGTCCCAGCAATTCTCCTAAGTTGAAGGG
ATCTGAGAAGGAGAAGGAAATGTGGGGTAGATTTGGTGGTGGTTAGAGATATGCCCCCCTCATTACTGCC
AACAGTTTCGGCTGCATTTCTTCACGCACCTCGGTTCCTCTTCCTGAAGTTCTTGTGCCCTGCTCTTCAG
CACCATGGGCCTTCTTATACGGAAGGCTCTGGGATCTCCCCCTTGTGGGGCAGGCTCTTGGGGCCAGCCT
AAGATCATGGTTTAGGGTGATCAGTGCTGGCAGATAAATTGAAAAGGCACGCTGGCTTGTGATCTTAAAT
GAGGACAATCCCCCCAGGGCTGGGCACTCCTCCCCTCCCCTCACTTCTCCCACCTGCAGAGCCAGTGTCC
TTGGGTGGGCTAGATAGGATATACTGTATGCCGGCTCCTTCAAGCTGCTGACTCACTTTATCAATAGTTC
CATTTAAATTGACTTCAGTGGTGAGACTGTATCCTGTTTGCTATTGCTTGTTGTGCTATGGGGGGAGGGG
GGAGGAATGTGTAAGATAGTTAACATGGGCAAAGGGAGATCTTGGGGTGCAGCACTTAAACTGCCTCGTA
ACCCTTTTCATGATTTCAACCACATTTGCTAGAGGGAGGGAGCAGCCACGGAGTTAGAGGCCCTTGGGGT
TTCTCTTTTCCACTGACAGGCTTTCCCAGGCAGCTGGCTAGTTCATTCCCTCCCCAGCCAGGTGCAGGCG
TAGGAATATGGACATCTGGTTGCTTTGGCCTGCTGCCCTCTTTCAGGGGTCCTAAGCCCACAATCATGCC
TCCCTAAGACCTTGGCATCCTTCCCTCTAAGCCGTTGGCACCTCTGTGCCACCTCTCACACTGGCTCCAG
ACACACAGCCTGTGCTTTTGGAGCTGAGATCACTCGCTTCACCCTCCTCATCTTTGTTCTCCAAGTAAAG
CCACGAGGTCGGGGCGAGGGCAGAGGTGATCACCTGCGTGTCCCATCTACAGACCTGCAGCTTCATAAAA
CTTCTGATTTCTCTTCAGCTTTGAAAAGGGTTACCCTGGGCACTGGCCTAGAGCCTCACCTCCTAATAGA
CTTAGCCCCATGAGTTTGCCATGTTGAGCAGGACTATTTCTGGCACTTGCAAGTCCCATGATTTCTTCGG
TAATTCTGAGGGTGGGGGGAGGGACATGAAATCATCTTAGCTTAGCTTTCTGTCTGTGAATGTCTATATA
GTGTATTGTGTGTTTTAACAAATGATTTACACTGACTGTTGCTGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTA
TTACTCTGATTAAA
配列番号2
>配列番号1の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACAGCAACAGTCAGTGTAAATCATTTGTTAAAACACACAATACACTATATAGACATTCACAGACAGAAAGCTAAGCTAAGATGATTTCATGTCCCTCCCCCCACCCTCAGAATTACCGAAGAAATCATGGGACTTGCAAGTGCCAGAAATAGTCCTGCTCAACATGGCAAACTCATGGGGCTAAG
TCTATTAGGAGGTGAGGCTCTAGGCCAGTGCCCAGGGTAACCCTTTTCAAAGCTGAAGAGAAATCAGAAG
TTTTATGAAGCTGCAGGTCTGTAGATGGGACACGCAGGTGATCACCTCTGCCCTCGCCCCGACCTCGTGG
CTTTACTTGGAGAACAAAGATGAGGAGGGTGAAGCGAGTGATCTCAGCTCCAAAAGCACAGGCTGTGTGT
CTGGAGCCAGTGTGAGAGGTGGCACAGAGGTGCCAACGGCTTAGAGGGAAGGATGCCAAGGTCTTAGGGA
GGCATGATTGTGGGCTTAGGACCCCTGAAAGAGGGCAGCAGGCCAAAGCAACCAGATGTCCATATTCCTA
CGCCTGCACCTGGCTGGGGAGGGAATGAACTAGCCAGCTGCCTGGGAAAGCCTGTCAGTGGAAAAGAGAA
ACCCCAAGGGCCTCTAACTCCGTGGCTGCTCCCTCCCTCTAGCAAATGTGGTTGAAATCATGAAAAGGGT
TACGAGGCAGTTTAAGTGCTGCACCCCAAGATCTCCCTTTGCCCATGTTAACTATCTTACACATTCCTCC
CCCCTCCCCCCATAGCACAACAAGCAATAGCAAACAGGATACAGTCTCACCACTGAAGTCAATTTAAATG
GAACTATTGATAAAGTGAGTCAGCAGCTTGAAGGAGCCGGCATACAGTATATCCTATCTAGCCCACCCAA
GGACACTGGCTCTGCAGGTGGGAGAAGTGAGGGGAGGGGAGGAGTGCCCAGCCCTGGGGGGATTGTCCTC
ATTTAAGATCACAAGCCAGCGTGCCTTTTCAATTTATCTGCCAGCACTGATCACCCTAAACCATGATCTT
AGGCTGGCCCCAAGAGCCTGCCCCACAAGGGGGAGATCCCAGAGCCTTCCGTATAAGAAGGCCCATGGTG
CTGAAGAGCAGGGCACAAGAACTTCAGGAAGAGGAACCGAGGTGCGTGAAGAAATGCAGCCGAAACTGTT
GGCAGTAATGAGGGGGGCATATCTCTAACCACCACCAAATCTACCCCACATTTCCTTCTCCTTCTCAGAT
CCCTTCAACTTAGGAGAATTGCTGGGACTCAGCGAACGGCAGGGAGGCTCTTGGTGGAGAGTTCTGGGCC
CAGAGACTTCCTTTCAGGTAAAGCTCTAGCTGCACACGAAGCTGCCAGCCCCAGGGGAGGCCCTGGATTT
CTACTGCCAAGTCCCTCAGGGTTGCCTTTAACTGTACCCAAACCAGAAGTGGCAGAATTGGGCCTGAGGC
TGCTGAGTTTCTTTAGGCAGCAATGTTTTGCAAAGGCGGCTTCCCTTTTCTCATGGCAGCAGATGGAGTT
TGTGCAAGGTCAGCGGGCTGAGGTGCTCTGGTCAAGGCTTTGGGAACAGTGTCTCCTGACTTGTCAAGTC
ATCCTTCCTCAGGCAGGCAGCTTGGGCCTCTAGAGCAGATCCAGGACAGGCAATTCATCCCAATCCCTGC
TGTGGTCGCAGGGCCCTTGGTGGGAGGCTGCGCTGCCCCTCCAGAGGGCGAGCTTGGAGAGGAACCCAGT
CTGAGGGGTGGCTGAGGCTCACGGAGCTTCTGGGAGCTGCAGATCCCCCCAGCTGGCAGTGGCTTCCTTT
TTCTTGTGATGCAGGAGTTGTAAGCCTCCTTTGGGACTGCCATGAGACTTCGGGCTATGACCAGAGAGAA
CCATCCTCGCGCCGCAAGCCAGACCAGCCACAAGACCTAGTCTGTGCCCTGACACAGGGAGCCCCAAGGG
GAAGTAGGGAAGGGGACATCATCGCTTCAGTCCTAATCCTGTGCTTCAGGCCTTCGTCACAGCTGAACGG
CCTCCTTAGCTGCTAGAAGCTGGTCTCTGTTGGGTCCCAGGTGCTGAGGAAAGCCTTTCAAAACTTGGGA
GGCCCCAGCAGGGTGGCACCACACAGGCCACACGAGTCCCAGTGTGGGGGTGAGAGACACCTCGTGAGGG
TGGGTTAGAAACCTCTTTACAAGCATTTCAAGATACATGCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCAC
TATCATAGTCACTCTGGTGAATCCAAGCATAAACAGACAAATCCAACTACAACTCAACAGGGTGCAGATG
GGGAGGGCAGGGCAACATCTATGTATATGTTCAGCTGCTCCAGCAGAACAGACAGCATGGCTTCCAGCTG
GGACTGGGGGAAAAGAACCATTTCCAAGGGGGTGTGTTCCCCTTTGTCGGGTGTGGAGGGCTGATACTAT
GCATGTGGAGCTGAGCAGCGGGCTGGGCTGTCTGGGAGGTTGGCAGCTACAAGCTAGGGTGCAAGTGGGG
GACAGCGGGACTGTGGGCCTGCCCTGGGTGCCTTGCCCTTCCATCCTGGTGCCACCACTGACAACCAAGA
CACCCAGCCTGCTGCTGTGGGCTCAGCACAGGAAGGGGCCAGGCCTTCTCAGGGGAAAGGGCTCTCTCCA
TGTCAACAAGGCAGAAACACCTAGGGTCACAGCTGAGCAGTGCCCTGGCTCACATCTGTGACGGGAGGAG
GAGACAGGGAACCGAATCAGATCATGAGATTCGTGGTGAGGGTCCCAGTTGGATGAGTGGAACTGAGAGT
GAGAGGCTGGGGTCCCACTCTTGTGCCTGGACTTTGCCTTCCCTTAATTTCACCCTCAGTATGGAGTAGG
TACCTCCTGCAACCAACCAGGGTCATTACTGAGAAGGGGTGGTGAGGCTGGGAATTCGGGACATTGTGAC
GTGTGATGAGGGGTATAGGCAGTGATTGGGCTCTCACGGCAGACAACAGCACAGCGGCGCAGACGGGGTG
ACTGCAGTGGCCGTGGGAAGGACAGGGGGCTCGGGACCTGCCTCCCAGACCCCCACACACTCCAGAGATG
CCAGTGGCCCAGGCTTGGAAACGGGTGGACGTCTCCCAAGAGGCACAAGTCCTTACAAAGAGAACTGGTT
AGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGCAAAGTGGCCAAAATCATGGCAGCAGTTCCAACCTTCAGAACTCAATAA
AACAGGGTTTCTGTGGAGCAGAGGGAAGCCCCTCAACTCAGGCCCCCTACCCTGCAGGGAGGGAGGAAGA
GGCCAGCGCTCTCAAGACATCAAGGTCAGTCTTTTCTAAGGAGGTCATCCACGAAGTGCCACCCTCCTGC
CAGCTTGCCTTCTCTTTTTACCCGCTGTCCCTTCTCCCACAGGCTGCCCTGCAGAGGGTGGCACACTGAC
CCACAGCAGGCCCCCACCCCCGGCCACCAAGGACAGGCGGCCGCTCAGACGCTGCAGGTGGCATAGGCCT
TGGCTCTCCCAGCGGCAAGGAGGGGGATGTCTACTCTCCAGCACGTGGCTTCCTCTCCCACTCCCACTTC
TTGTGCTTCCTCTCCCCTCTGCCCAGCCCCTGCCTCGGCCTCCCCCGTGGCCTCCCGCCCCACCCCAACC
CCCGTCACACTCACACAAGGTTGACATCGTCTGCCTGTGGCTCCACGAACACACCAAGTTTCAAATCCTT
TGTTGCTGCCACTGCCTCTGTGACACCCCCACAACAGGGCCAGAGGTGGTTGGCACCCCCAGTCCCTTGA
AATCCCCCAGAAGCAGCTTTCAGAGCCTCTCCTTCTCCCTCTTCTACATGGAGGGGGAAGAAAAAAGAAT
CAAAAGGAATTGCCTGAGGAAATGTTGGATGTGGCCATGTTTTTGAATGTTTTTTTTTAAATATTTTATT
ACTAGCCCACCCATCAATTTGGAAAGATGAAATTTGCTCTTACTCCCATCACTGATTTTGAAGTCCCGAG
CCAAAGCCGAGTGACAAAAGCAGGTTAAGTGATTAACCAATTAACCGAACTGCGAGGAGCAGCTGGGGGC
AGAGGGCGGGGGCCGGGTCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCTCATTCTCTCCTCTCCACAATTATT
GACCGCCCCAGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCAGACACCTCGTCAGCTAGCGTGGC
GAGCTGGGGCGAGTCTACCATGTCGATGCTGCCGGTGGAGGAGACATTGCTGAGATGCCGTGGAGACGTG
TCCCCAGACACCACTGGCGACTTGTACACGATCTCCGCCCCGTGGTCTGTCTTGGCTTTGGCGTTCTCGC
GGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATTTCCTCCGCCAGGGACGTGGGTGATATTGTCCAGGGA
CCCAATCTTCGACTGGACTCTGTCCTTGAAGTCAAGCTTCTCAGATTTTACTTCCACCTGGCCACCTCCT
GGTTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGGTCAACTGGTTTGTAGA
CTATTTGCACCTTCCCGCCTCCCGGCTGGTGCTTCAGGTTCTCAGTGGAGCCGATCTTGGACTTGACATT
CTTCAGGTCTGGCATGGGCACGGGGGCTGTCTGCAGGCGGCTCTTGGCGGAAGACGGCGACTTGGGTGGA
GTACGGACCACTGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGGTGGGTGGGGTTGGAAGGGACGGGGTGCGGGAGCGGC
TGCCGGGAGTGCCTGGGGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCGCTGCGATCCCCTGATTTTGGAGGTTCACCAGA
GCTGGGTGGTGTCTTTGGAGCGGGCGGGGTTTTTGCTGGAATCCTGGTGGCGTTGGCCTGGCCCTTCTGG
CCTGGAGGGGCTGCTCCCCGCGGTGTGGCGATCTTCGTTTTACCATCAGCCCCCTTGGCTTTTTTGTCAT
CGCTTCCAGTCCCGTCTTTGCTTTTACTGACCATGCGAGCTTGGGTCACGTGACCAGCAGCTTCGTCTTC
CAGGCTGGGGGTGTCTCCAATGCCTGCTTCTTCAGCTTTCAGGCCAGCGTCCGTGTCACCCTCTTGGTCT
TGGTGCATGGTGTAGCCCCCCTGATCTTTCCTGTCCCCCAACCCGTACGTCCCAGCGTGATCTTCCATCA
CTTCGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTGGTTCAAAGTTCACCTGATAGTCGACAGAGGCGAGGACG
GGAGAGGACAGCGGAGGAGGAGAAGGTGGCTGTGGTGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCAGCGGCGC
TGCTGTTGGTGCCGGAGCTGGTGGGTGGCGGTGACTGCGAGGGCGCGCGCCGGCGAAGAGGGCGCGTTCC
TGAGGCCGGCGGGCGGCGCAGGCGCGAGCAGCGGGAACGCGAGCCTCCCCAGGGGAGGGGGCGGGCAGCG
CGGCCTCCGCGGGAGCCTTCTCCTCCGGCCACTAGTGGGCGCGCGCGAGCGCCCTGCCGCTCGGCCGTCC
配列番号3
>NM_005910.6 ヒト微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体2、mRNA
GGACGGCCGAGCGGCAGGGCGCTCGCGCGCGCCCACTAGTGGCCGGAGGAGAAGGCTCCCGCGGAGGCCG
CGCTGCCCGCCCCCTCCCCTGGGGAGGCTCGCGTTCCCGCTGCTCGCGCCTGCGCCGCCCGCCGGCCTCA
GGAACGCGCCCTCTTCGCCGGCGCGCGCCCTCGCAGTCACCGCCACCCACCAGCTCCGGCACCAACAGCA
GCGCCGCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCC
CGTCCTCGCCTCTGTCGACTATCAGGTGAACTTTGAACCAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGAAG
TGATGGAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAGGGGGGCTACACCATGCACCA
AGACCAAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGAATCTCCCCTGCAGACCCCCACTGAGGACGGATCT
GAGGAACCGGGCTCTGAAACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACAGCGGAAGATGTGACAGCACCCTTAG
TGGATGAGGGAGCTCCCGGCAAGCAGGCTGCCGCGCAGCCCCACACGGAGATCCCAGAAGGAACCACAGC
TGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGC
ATGGTCAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGTAAAACGA
AGATCGCCACACCGCGGGGAGCAGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAGGCCAACGCCACCAGGATTCCAGC
AAAAACCCCGCCCGCTCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGCGGC
TACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCCGGCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCACCCA
CCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCCGTACTCCACCCAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCT
GCAGACAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAATGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACTGAGAACCTG
AAGCACCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCA
AGTGTGGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGT
TGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAG
GTGGAAGTAAAATCTGAGAAGCTTGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGGTCCCTGGACAATA
TCACCCACGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAA
AGCCAAGACAGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCAGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGG
CATCTCAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCTG
ACGAGGTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCTGGGGCGGTCAATAATTGTGGAG
AGGAGAGAATGAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCCGCCCTCTGCCCCCAGCTGCT
CCTCGCAGTTCGGTTAATTGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCACTCGGCTTTGGCTCGGGACTTCAA
AATCAGTGATGGGAGTAAGAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAGTAATAAAATATTTA
AAAAAAAACATTCAAAAACATGGCCACATCCAACATTTCCTCAGGCAATTCCTTTTGATTCTTTTTTCTT
CCCCCTCCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTCTGAAAGCTGCTTCTGGGGGATTTCAAGGGACTGGG
GGTGCCAACCACCTCTGGCCCTGTTGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGTGGCAGCAACAAAGGATTTGAAAC
TTGGTGTGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGGGGTTGGGGTGGGG
CGGGAGGCCACGGGGGAGGCCGAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGCACAAGAAGTGGGAGTGG
GAGAGGAAGCCACGTGCTGGAGAGTAGACATCCCCCTCCTTGCCGCTGGGAGAGCCAAGGCCTATGCCAC
CTGCAGCGTCTGAGCGGCCGCCTGTCCTTGGTGGCCGGGGGTGGGGGCCTGCTGTGGGTCAGTGTGCCAC
CCTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAGGGACAGCGGGTAAAAAGAGAAGGCAAGCTGGCAGGAGGGTGGC
ACTTCGTGGATGACCTCCTTAGAAAAGACTGACCTTGATGTCTTGAGAGCGCTGGCCTCTTCCTCCCTCC
CTGCAGGGTAGGGGGCCTGAGTTGAGGGGCTTCCCTCTGCTCCACAGAAACCCTGTTTTATTGAGTTCTG
AAGGTTGGAACTGCTGCCATGATTTTGGCCACTTTGCAGACCTGGGACTTTAGGGCTAACCAGTTCTCTT
TGTAAGGACTTGTGCCTCTTGGGAGACGTCCACCCGTTTCCAAGCCTGGGCCACTGGCATCTCTGGAGTG
TGTGGGGGTCTGGGAGGCAGGTCCCGAGCCCCCTGTCCTTCCCACGGCCACTGCAGTCACCCCGTCTGCG
CCGCTGTGCTGTTGTCTGCCGTGAGAGCCCAATCACTGCCTATACCCCTCATCACACGTCACAATGTCCC
GAATTCCCAGCCTCACCACCCCTTCTCAGTAATGACCCTGGTTGGTTGCAGGAGGTACCTACTCCATACT
GAGGGTGAAATTAAGGGAAGGCAAAGTCCAGGCACAAGAGTGGGACCCCAGCCTCTCACTCTCAGTTCCA
CTCATCCAACTGGGACCCTCACCACGAATCTCATGATCTGATTCGGTTCCCTGTCTCCTCCTCCCGTCAC
AGATGTGAGCCAGGGCACTGCTCAGCTGTGACCCTAGGTGTTTCTGCCTTGTTGACATGGAGAGAGCCCT
TTCCCCTGAGAAGGCCTGGCCCCTTCCTGTGCTGAGCCCACAGCAGCAGGCTGGGTGTCTTGGTTGTCAG
TGGTGGCACCAGGATGGAAGGGCAAGGCACCCAGGGCAGGCCCACAGTCCCGCTGTCCCCCACTTGCACC
CTAGCTTGTAGCTGCCAACCTCCCAGACAGCCCAGCCCGCTGCTCAGCTCCACATGCATAGTATCAGCCC
TCCACACCCGACAAAGGGGAACACACCCCCTTGGAAATGGTTCTTTTCCCCCAGTCCCAGCTGGAAGCCA
TGCTGTCTGTTCTGCTGGAGCAGCTGAACATATACATAGATGTTGCCCTGCCCTCCCCATCTGCACCCTG
TTGAGTTGTAGTTGGATTTGTCTGTTTATGCTTGGATTCACCAGAGTGACTATGATAGTGAAAAGAAAAA
AAAAAAAAAAAAAGGACGCATGTATCTTGAAATGCTTGTAAAGAGGTTTCTAACCCACCCTCACGAGGTG
TCTCTCACCCCCACACTGGGACTCGTGTGGCCTGTGTGGTGCCACCCTGCTGGGGCCTCCCAAGTTTTGA
AAGGCTTTCCTCAGCACCTGGGACCCAACAGAGACCAGCTTCTAGCAGCTAAGGAGGCCGTTCAGCTGTG
ACGAAGGCCTGAAGCACAGGATTAGGACTGAAGCGATGATGTCCCCTTCCCTACTTCCCCTTGGGGCTCC
CTGTGTCAGGGCACAGACTAGGTCTTGTGGCTGGTCTGGCTTGCGGCGCGAGGATGGTTCTCTCTGGTCA
TAGCCCGAAGTCTCATGGCAGTCCCAAAGGAGGCTTACAACTCCTGCATCACAAGAAAAAGGAAGCCACT
GCCAGCTGGGGGGATCTGCAGCTCCCAGAAGCTCCGTGAGCCTCAGCCACCCCTCAGACTGGGTTCCTCT
CCAAGCTCGCCCTCTGGAGGGGCAGCGCAGCCTCCCACCAAGGGCCCTGCGACCACAGCAGGGATTGGGA
TGAATTGCCTGTCCTGGATCTGCTCTAGAGGCCCAAGCTGCCTGCCTGAGGAAGGATGACTTGACAAGTC
AGGAGACACTGTTCCCAAAGCCTTGACCAGAGCACCTCAGCCCGCTGACCTTGCACAAACTCCATCTGCT
GCCATGAGAAAAGGGAAGCCGCCTTTGCAAAACATTGCTGCCTAAAGAAACTCAGCAGCCTCAGGCCCAA
TTCTGCCACTTCTGGTTTGGGTACAGTTAAAGGCAACCCTGAGGGACTTGGCAGTAGAAATCCAGGGCCT
CCCCTGGGGCTGGCAGCTTCGTGTGCAGCTAGAGCTTTACCTGAAAGGAAGTCTCTGGGCCCAGAACTCT
CCACCAAGAGCCTCCCTGCCGTTCGCTGAGTCCCAGCAATTCTCCTAAGTTGAAGGGATCTGAGAAGGAG
AAGGAAATGTGGGGTAGATTTGGTGGTGGTTAGAGATATGCCCCCCTCATTACTGCCAACAGTTTCGGCT
GCATTTCTTCACGCACCTCGGTTCCTCTTCCTGAAGTTCTTGTGCCCTGCTCTTCAGCACCATGGGCCTT
CTTATACGGAAGGCTCTGGGATCTCCCCCTTGTGGGGCAGGCTCTTGGGGCCAGCCTAAGATCATGGTTT
AGGGTGATCAGTGCTGGCAGATAAATTGAAAAGGCACGCTGGCTTGTGATCTTAAATGAGGACAATCCCC
CCAGGGCTGGGCACTCCTCCCCTCCCCTCACTTCTCCCACCTGCAGAGCCAGTGTCCTTGGGTGGGCTAG
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TTCAGTGGTGAGACTGTATCCTGTTTGCTATTGCTTGTTGTGCTATGGGGGGAGGGGGGAGGAATGTGTA
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TTTCAACCACATTTGCTAGAGGGAGGGAGCAGCCACGGAGTTAGAGGCCCTTGGGGTTTCTCTTTTCCAC
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ATCTGGTTGCTTTGGCCTGCTGCCCTCTTTCAGGGGTCCTAAGCCCACAATCATGCCTCCCTAAGACCTT
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GCTTTTGGAGCTGAGATCACTCGCTTCACCCTCCTCATCTTTGTTCTCCAAGTAAAGCCACGAGGTCGGG
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TTCAGCTTTGAAAAGGGTTACCCTGGGCACTGGCCTAGAGCCTCACCTCCTAATAGACTTAGCCCCATGA
GTTTGCCATGTTGAGCAGGACTATTTCTGGCACTTGCAAGTCCCATGATTTCTTCGGTAATTCTGAGGGT
GGGGGGAGGGACATGAAATCATCTTAGCTTAGCTTTCTGTCTGTGAATGTCTATATAGTGTATTGTGTGT
TTTAACAAATGATTTACACTGACTGTTGCTGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTATTACTCTGATTAA
A
配列番号4
>配列番号3の逆相補物
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ACACACAATACACTATATAGACATTCACAGACAGAAAGCTAAGCTAAGATGATTTCATGTCCCTCCCCCC
ACCCTCAGAATTACCGAAGAAATCATGGGACTTGCAAGTGCCAGAAATAGTCCTGCTCAACATGGCAAAC
TCATGGGGCTAAGTCTATTAGGAGGTGAGGCTCTAGGCCAGTGCCCAGGGTAACCCTTTTCAAAGCTGAA
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CCCGACCTCGTGGCTTTACTTGGAGAACAAAGATGAGGAGGGTGAAGCGAGTGATCTCAGCTCCAAAAGC
ACAGGCTGTGTGTCTGGAGCCAGTGTGAGAGGTGGCACAGAGGTGCCAACGGCTTAGAGGGAAGGATGCC
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GTCCATATTCCTACGCCTGCACCTGGCTGGGGAGGGAATGAACTAGCCAGCTGCCTGGGAAAGCCTGTCA
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TCATGAAAAGGGTTACGAGGCAGTTTAAGTGCTGCACCCCAAGATCTCCCTTTGCCCATGTTAACTATCT
TACACATTCCTCCCCCCTCCCCCCATAGCACAACAAGCAATAGCAAACAGGATACAGTCTCACCACTGAA
GTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGAGTCAGCAGCTTGAAGGAGCCGGCATACAGTATATCCTAT
CTAGCCCACCCAAGGACACTGGCTCTGCAGGTGGGAGAAGTGAGGGGAGGGGAGGAGTGCCCAGCCCTGG
GGGGATTGTCCTCATTTAAGATCACAAGCCAGCGTGCCTTTTCAATTTATCTGCCAGCACTGATCACCCT
AAACCATGATCTTAGGCTGGCCCCAAGAGCCTGCCCCACAAGGGGGAGATCCCAGAGCCTTCCGTATAAG
AAGGCCCATGGTGCTGAAGAGCAGGGCACAAGAACTTCAGGAAGAGGAACCGAGGTGCGTGAAGAAATGC
AGCCGAAACTGTTGGCAGTAATGAGGGGGGCATATCTCTAACCACCACCAAATCTACCCCACATTTCCTT
CTCCTTCTCAGATCCCTTCAACTTAGGAGAATTGCTGGGACTCAGCGAACGGCAGGGAGGCTCTTGGTGG
AGAGTTCTGGGCCCAGAGACTTCCTTTCAGGTAAAGCTCTAGCTGCACACGAAGCTGCCAGCCCCAGGGG
AGGCCCTGGATTTCTACTGCCAAGTCCCTCAGGGTTGCCTTTAACTGTACCCAAACCAGAAGTGGCAGAA
TTGGGCCTGAGGCTGCTGAGTTTCTTTAGGCAGCAATGTTTTGCAAAGGCGGCTTCCCTTTTCTCATGGC
AGCAGATGGAGTTTGTGCAAGGTCAGCGGGCTGAGGTGCTCTGGTCAAGGCTTTGGGAACAGTGTCTCCT
GACTTGTCAAGTCATCCTTCCTCAGGCAGGCAGCTTGGGCCTCTAGAGCAGATCCAGGACAGGCAATTCA
TCCCAATCCCTGCTGTGGTCGCAGGGCCCTTGGTGGGAGGCTGCGCTGCCCCTCCAGAGGGCGAGCTTGG
AGAGGAACCCAGTCTGAGGGGTGGCTGAGGCTCACGGAGCTTCTGGGAGCTGCAGATCCCCCCAGCTGGC
AGTGGCTTCCTTTTTCTTGTGATGCAGGAGTTGTAAGCCTCCTTTGGGACTGCCATGAGACTTCGGGCTA
TGACCAGAGAGAACCATCCTCGCGCCGCAAGCCAGACCAGCCACAAGACCTAGTCTGTGCCCTGACACAG
GGAGCCCCAAGGGGAAGTAGGGAAGGGGACATCATCGCTTCAGTCCTAATCCTGTGCTTCAGGCCTTCGT
CACAGCTGAACGGCCTCCTTAGCTGCTAGAAGCTGGTCTCTGTTGGGTCCCAGGTGCTGAGGAAAGCCTT
TCAAAACTTGGGAGGCCCCAGCAGGGTGGCACCACACAGGCCACACGAGTCCCAGTGTGGGGGTGAGAGA
CACCTCGTGAGGGTGGGTTAGAAACCTCTTTACAAGCATTTCAAGATACATGCGTCCTTTTTTTTTTTTT
TTTTTCTTTTCACTATCATAGTCACTCTGGTGAATCCAAGCATAAACAGACAAATCCAACTACAACTCAA
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TGGCTTCCAGCTGGGACTGGGGGAAAAGAACCATTTCCAAGGGGGTGTGTTCCCCTTTGTCGGGTGTGGA
GGGCTGATACTATGCATGTGGAGCTGAGCAGCGGGCTGGGCTGTCTGGGAGGTTGGCAGCTACAAGCTAG
GGTGCAAGTGGGGGACAGCGGGACTGTGGGCCTGCCCTGGGTGCCTTGCCCTTCCATCCTGGTGCCACCA
CTGACAACCAAGACACCCAGCCTGCTGCTGTGGGCTCAGCACAGGAAGGGGCCAGGCCTTCTCAGGGGAA
AGGGCTCTCTCCATGTCAACAAGGCAGAAACACCTAGGGTCACAGCTGAGCAGTGCCCTGGCTCACATCT
GTGACGGGAGGAGGAGACAGGGAACCGAATCAGATCATGAGATTCGTGGTGAGGGTCCCAGTTGGATGAG
TGGAACTGAGAGTGAGAGGCTGGGGTCCCACTCTTGTGCCTGGACTTTGCCTTCCCTTAATTTCACCCTC
AGTATGGAGTAGGTACCTCCTGCAACCAACCAGGGTCATTACTGAGAAGGGGTGGTGAGGCTGGGAATTC
GGGACATTGTGACGTGTGATGAGGGGTATAGGCAGTGATTGGGCTCTCACGGCAGACAACAGCACAGCGG
CGCAGACGGGGTGACTGCAGTGGCCGTGGGAAGGACAGGGGGCTCGGGACCTGCCTCCCAGACCCCCACA
CACTCCAGAGATGCCAGTGGCCCAGGCTTGGAAACGGGTGGACGTCTCCCAAGAGGCACAAGTCCTTACA
AAGAGAACTGGTTAGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGCAAAGTGGCCAAAATCATGGCAGCAGTTCCAACCTT
CAGAACTCAATAAAACAGGGTTTCTGTGGAGCAGAGGGAAGCCCCTCAACTCAGGCCCCCTACCCTGCAG
GGAGGGAGGAAGAGGCCAGCGCTCTCAAGACATCAAGGTCAGTCTTTTCTAAGGAGGTCATCCACGAAGT
GCCACCCTCCTGCCAGCTTGCCTTCTCTTTTTACCCGCTGTCCCTTCTCCCACAGGCTGCCCTGCAGAGG
GTGGCACACTGACCCACAGCAGGCCCCCACCCCCGGCCACCAAGGACAGGCGGCCGCTCAGACGCTGCAG
GTGGCATAGGCCTTGGCTCTCCCAGCGGCAAGGAGGGGGATGTCTACTCTCCAGCACGTGGCTTCCTCTC
CCACTCCCACTTCTTGTGCTTCCTCTCCCCTCTGCCCAGCCCCTGCCTCGGCCTCCCCCGTGGCCTCCCG
CCCCACCCCAACCCCCGTCACACTCACACAAGGTTGACATCGTCTGCCTGTGGCTCCACGAACACACCAA
GTTTCAAATCCTTTGTTGCTGCCACTGCCTCTGTGACACCCCCACAACAGGGCCAGAGGTGGTTGGCACC
CCCAGTCCCTTGAAATCCCCCAGAAGCAGCTTTCAGAGCCTCTCCTTCTCCCTCTTCTACATGGAGGGGG
AAGAAAAAAGAATCAAAAGGAATTGCCTGAGGAAATGTTGGATGTGGCCATGTTTTTGAATGTTTTTTTT
TAAATATTTTATTACTAGCCCACCCATCAATTTGGAAAGATGAAATTTGCTCTTACTCCCATCACTGATT
TTGAAGTCCCGAGCCAAAGCCGAGTGACAAAAGCAGGTTAAGTGATTAACCAATTAACCGAACTGCGAGG
AGCAGCTGGGGGCAGAGGGCGGGGGCCGGGTCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCTCATTCTCTCCT
CTCCACAATTATTGACCGCCCCAGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCAGACACCTCGT
CAGCTAGCGTGGCGAGCTGGGGCGAGTCTACCATGTCGATGCTGCCGGTGGAGGAGACATTGCTGAGATG
CCGTGGAGACGTGTCCCCAGACACCACTGGCGACTTGTACACGATCTCCGCCCCGTGGTCTGTCTTGGCT
TTGGCGTTCTCGCGGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATTTCCTCCGCCAGGGACGTGGGTGA
TATTGTCCAGGGACCCAATCTTCGACTGGACTCTGTCCTTGAAGTCAAGCTTCTCAGATTTTACTTCCAC
CTGGCCACCTCCTGGTTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGGTCA
ACTGGTTTGTAGACTATTTGCACACTGCCGCCTCCCGGGACGTGTTTGATATTATCCTTTGAGCCACACT
TGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTATTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCCCGGCTGGTGCTT
CAGGTTCTCAGTGGAGCCGATCTTGGACTTGACATTCTTCAGGTCTGGCATGGGCACGGGGGCTGTCTGC
AGGCGGCTCTTGGCGGAAGACGGCGACTTGGGTGGAGTACGGACCACTGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGG
TGGGTGGGGTTGGAAGGGACGGGGTGCGGGAGCGGCTGCCGGGAGTGCCTGGGGAGCCGGGGCTGCTGTA
GCCGCTGCGATCCCCTGATTTTGGAGGTTCACCAGAGCTGGGTGGTGTCTTTGGAGCGGGCGGGGTTTTT
GCTGGAATCCTGGTGGCGTTGGCCTGGCCCTTCTGGCCTGGAGGGGCTGCTCCCCGCGGTGTGGCGATCT
TCGTTTTACCATCAGCCCCCTTGGCTTTTTTGTCATCGCTTCCAGTCCCGTCTTTGCTTTTACTGACCAT
GCGAGCTTGGGTCACGTGACCAGCAGCTTCGTCTTCCAGGCTGGGGGTGTCTCCAATGCCTGCTTCTTCA
GCTGTGGTTCCTTCTGGGATCTCCGTGTGGGGCTGCGCGGCAGCCTGCTTGCCGGGAGCTCCCTCATCCA
CTAAGGGTGCTGTCACATCTTCCGCTGTTGGAGTGCTCTTAGCATCAGAGGTTTCAGAGCCCGGTTCCTC
AGATCCGTCCTCAGTGGGGGTCTGCAGGGGAGATTCTTTCAGGCCAGCGTCCGTGTCACCCTCTTGGTCT
TGGTGCATGGTGTAGCCCCCCTGATCTTTCCTGTCCCCCAACCCGTACGTCCCAGCGTGATCTTCCATCA
CTTCGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTGGTTCAAAGTTCACCTGATAGTCGACAGAGGCGAGGACG
GGAGAGGACAGCGGAGGAGGAGAAGGTGGCTGTGGTGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCAGCGGCGC
TGCTGTTGGTGCCGGAGCTGGTGGGTGGCGGTGACTGCGAGGGCGCGCGCCGGCGAAGAGGGCGCGTTCC
TGAGGCCGGCGGGCGGCGCAGGCGCGAGCAGCGGGAACGCGAGCCTCCCCAGGGGAGGGGGCGGGCAGCG
CGGCCTCCGCGGGAGCCTTCTCCTCCGGCCACTAGTGGGCGCGCGCGAGCGCCCTGCCGCTCGGCCGTCC
配列番号5
>NM_001038609.2 ハツカネズミ微小管関連タンパク質タウ(Mapt)、転写物変異体1、mRNA
CCGCCGGCCTCCAGAACGCGCTTTCTCGGCCGCGCGCGCTCTCAGTCTCCGCCACCCACCAGCTCCAGCA
CCAGCAGCAGCGCCGCCGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCGCCACAACCACCTTCTCCTCCGCTGTC
CTCTTCTGTCCTCGCCTTCTGTCGATTATCAGGCTTTGAACCAGTATGGCTGACCCTCGCCAGGAGTTTG
ACACAATGGAAGACCATGCTGGAGATTACACTCTGCTCCAAGACCAAGAAGGAGACATGGACCATGGCTT
AAAAGAGTCTCCCCCACAGCCCCCCGCCGATGATGGAGCGGAGGAACCAGGGTCGGAGACCTCCGATGCT
AAGAGCACTCCAACTGCTGAAGACGTGACTGCGCCCCTAGTGGATGAGAGAGCTCCCGACAAGCAGGCCG
CTGCCCAGCCCCACACGGAGATCCCAGAAGGAATTACAGCCGAAGAAGCAGGCATCGGAGACACCCCGAA
CCAGGAGGACCAAGCCGCTGGGCATGTGACTCAAGCTCGTGTGGCCAGCAAAGACAGGACAGGAAATGAC
GAGAAGAAAGCCAAGGGCGCTGATGGCAAAACCGGGGCGAAGATCGCCACACCTCGGGGAGCAGCCTCTC
CGGCCCAGAAGGGCACGTCCAACGCCACCAGGATCCCGGCCAAGACCACGCCCAGCCCTAAGACTCCTCC
AGGGTCAGGTGAACCACCAAAATCCGGAGAACGAAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCTCCCGGAACGCCT
GGCAGTCGCTCGCGCACCCCATCCCTACCAACACCGCCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCAGTGGTCC
GCACTCCCCCTAAGTCACCATCAGCTAGTAAGAGCCGCCTGCAGACTGCCCCTGTGCCCATGCCAGACCT
AAAGAATGTCAGGTCGAAGATTGGCTCTACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCAGGAGGTGGCAAGGTGCAG
ATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCGAAGGATAATATCAAACACG
TCCCGGGTGGAGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAGCCGGTGGACCTGAGCAAAGTGACCTCCAAGTGTGG
CTCGTTAGGGAACATCCATCACAAGCCAGGAGGTGGCCAGGTGGAAGTAAAATCAGAGAAGCTGGACTTC
AAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATTGGCTCCTTGGATAATATCACCCACGTCCCTGGAGGAGGGAATAAGA
AGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCAGGGAGAATGCCAAAGCCAAGACAGACCATGGAGCAGAAATTGT
GTATAAGTCACCCGTGGTGTCTGGGGACACATCTCCACGGCACCTCAGCAATGTGTCTTCCACGGGCAGC
ATCGACATGGTGGACTCACCACAGCTTGCCACACTAGCCGATGAAGTGTCTGCTTCCTTGGCCAAGCAGG
GTTTGTGATCAGGCTCCCAGGGCAGTCAATAATCATGGAGAGAAGAGAGAGTGAGAGTGTGGAAAAAAAA
AAAAAAAAAGAATGATCTGGCCCCTTGCCCTCTGCCCTCCCCGCTGCTCCTCATAGACAGGCTGACCTGC
TTGTCACCTAACCTGCTTTTGTGGCTCGGATTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAAAAGTACA
TTTCATCTTTCCAAATTGATTTGTGGGCTAAAAATAAAACATATTTAAGGGAAAAAAAAACATGTAAAAA
CATGGCCAAAAAATTTCCTTGGGCAATTGCTAATTGATTTCCCCCCCCTGACCCCGCCCTCCCTCTCTGA
GTATTAGAGGGTGAAGAAGGCTCTGGAGGCTGCTTCTGGGGAGTGGCTGAGGGACTAGGGCAGCTAATTG
CCCATAGCCCCATCCTAGGGGCTTCAGGGACAGTGGCAGCAATGAGAGATTTGAGACTTGGTGTGTTCGT
GGGGCCGTAGGCAGGTGCTGTTAACTTGTGTGGGTGTGAGTGGGGACTGAAACAGCGACAGCGAAGGCTG
AGAGATGGATGGGTGGACTGAGTTAGAGGACAGAGGTGAGGAAGGCAGGTTGGGAGAGGGGACACTGGCT
CCTTGCCAAGTAGCTTGGGGAGGACAGGGTGCTGCAGCTGCCTGCAGCAGTCCTAGCTAGCTCAGATGCC
TGCTTGATAAAGCACTGTGGGGGTAACGTGGGTGTGTGTGCCCCTTCTGCAGGGCAGCCTGTGGGAGAAG
GGGTATTGGGCAGAAGGAAGGTAAGCCAGCAGGTGGTACCTTGTAGATTGGTTCTCTTGAAGGCTGCTCT
TGACATCCCAGGGCACTGGCTTCTTCCTCCCTCCCCGCAAGGTGGGAGGTCCTGAGCGAGGTGTTTCCCT
TCGCTCCCACAGGAAAAGCTGCTTTACTGAGTTCTCAAGTTTGGAACTACAGCCATGATTTGGCCACCAT
TACAGACCTGGGACTTTAGGGCTAACCAGATCTTTGTAAGGACTTGTGCCTCTTGGGGGACCTCTGCCTG
TTCTCATGCTTGGCCCTCTGGCACTTCTGTAGTGGGAGGGATGGGGGGTGGTATTCTGGGATGTGGGTCC
CAGGCCTCCCATCCCTCACACAGCCACTGTATCCCCTCTCTCTGTCCTATCATGCCCACGTCTGCCACGA
GAGCTAGTCACTGCCGTCCGTACATCACGTCTCACTGTCCTGAGTGCCATGCCTCTCCCAGCCCCCATCC
CTGGCCCCTGGGTAGATATGGGCAATATCTGCTCTACACTAGGGGTTGGAGTCCAGGGAAGGCAAAGATT
TGGGCCTCAGTCTCTAGTCCTACGTTCCACGAATCCAACCAGTGTGCCTCCCACAAGGAACCTTACGACC
TTGTTTGGTTCACTCCATTACTTCCTATCCTGGATGGGAACTGGTGTGTGCCTGCCTGGGGATGACCTTG
GACCTCTGCCTTTTCTTTTATCTAAGTGGATGCCTCCTAGGCCTGACTCCTTGTGTTGAGCTGGAGGCAG
CCAAGTCAGGTGCCAATGTCTTGGCATCAGTAAGAACAGTCAAGAGTCCCAGGGCAGGGCCACACTTCTC
CCATCTTTCGCTTCCACCCCAGCTTGTGATCGCTAGCCTCCCAGAGCTCAGCTGCCATTAAGTCCCCATG
CACGTAATCAGTCTCCACACCCCAGTTTGGGGAACATACCCCCTTGATTGAAGTGTTTTTTTCCTCCGGT
CCCATGGAAACCATGCTGCCTGCCCTGCTGGAGCAGACGGCCACCTCCATAGATGCAGCCCTTTCTTTCC
CGTCTTCGCCCTGTTACGTTGTAGTTGGATTTGTCTGTTTGTCTGGGTTCACCAGAGTGACTATGATAGT
GAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAGAAAAAGGAAAAAAAAAAGGACGCAT
GTATCTTGAAATATTTGTCAAAAGGTTCTAGCCCACCACGTGATGGAGAGTCTGGATATCTCCTTCCTGA
CGTGGCTCCAGGCCAGTGCAGTGCTAACCTGCTGGGACATCCCATGTTTTGAAGGGTTTCTTCTGCATCT
GGGACCTCACAGACACTGGATTGTGACATTGGAGGTCTGTGACATTGGAGGTCAATGGCATTGGCCAAGG
CCTGAAGCACAGGACCAGCTAGAGGCAGCAGGCTCCGAGTGCCAGGGAGAGCTTGTGGCTGGCCTGTTTT
GTATGAAGATGGTCCTTTCTGATCACGACTTCAAATCCCACAGTAGCCCTGAAAGACATCTAAGAACTCC
TGCATCACAAGAGAAAAGGACACCAGTACCAGCAGGGAGAGCTGTGACCCTAGAAATTCCATGACGACCC
AGTAGATATCCTTGGGCCCTCTCCAAGCCTGGGCCTTTTCACCATAGAGTTTGGGATGGACTGTCCCACT
GATGAAGGGGACATCTTAGGAGACTCCCTTGGTTTCCAAGCTGTCAGCCCCCTGAACTTGCACGACCTCC
TACAGCTTCAGGGACTAGGCCTTTGAAGATTAGGAACCTCAGGCCCACATCAGCCACTTCTGATGTACAG
TTAAGGACAATGTGGAGACTAGGAGGAAGCAGCCAGCCTTTCCCATTAAAGAACTCTTGAGTGCCCAGGG
CTACCTATTGTGAGCTTCCCCACTGATAAGACTTTAGCTGTCCATAGAAGTGAGTCCGAGGGAGGAAAAG
TGTGGTTTCTTCATCATGGTTACCTGTCGTGGTTCTCTCTCTTACACCCATTTACCCATCCCGCAGTTCC
TGTCCTTGAATGGGGGGTGGGGTGCTCTGCCTATCTCTTGTGGGGTGATCAGCCCAAAAATCATGATTTG
GAGTGATCTGATCAGTGCTGATAGGCAGTTTACAAAGGGATTCTGGCTTGTGACTTCAGTGAGGACAATC
CCCCAGGGCCCTTTCTTTCCATGCCTCTCCAACTCAGAGCCAATGTCTTTGGGTGGGCTAGATAGATAGG
GCATACAATTGGCCTGGTTCCTCCAAGCTCTTAATTCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGACTTCA
ATGATAAGAGTGTATCCCATTTGAGATTGCTTGCGTTGTGGGGGAGGGGGAGGAGGAACACATTAAGATA
ATTCACATGGGCAAAGGGAGGTCTTGGAGTGTAGCCGTTAAGCCATCTTGTAACCCCATTCATGATTTTG
ACCACCTGCTAGAGAGAAGAGGTGCCAAGAGACTAGAACTTGGAGGCTTGGCTGTCCCACTAATAGGCTT
TCGCAAGGCAGAGGTAGCCAGCTAGGTCCCTGCCTTCCCAGCCAGGTACAGCTCTCAGGTTTGTGGAGGT
AATCTGTGAACTTCTCTTCCTGCTGCCTTCTTGTGATGTCCAGAGCCCACAGTCAAATACCTCCTAAGAA
CCCTGGCTTCCTTCCCTCTAATCCACTGGCACATGACTATCACCTCTGGATTGACCTCAGATCCATAGCC
TACACACTGCTAGCAGTGGCCAAGATCACTTCCTTTATCTCCATCTGTTCTGTTCTCCAGGAAAGTAAGT
GGGGATGAGGGTGGAGGTGGTAATCAACTGTAGATCTGTGGCTTTATGAGCCTTCAGACTTCTCTCTGGC
TTCTTCTGGAAGGGTTACTATTGGCAGTATTGCAATCTCACCCTCCTGATGAACTGTAGCCTGTGCCGTT
ACTGTGCTGGGCATGATCTCCAGTGCTTGCAAGTCCCATGATTTCTTTGGTGATTTTGAGGGTGGGGGGA
GGGACACAAATCAGCTTAGCTTAGCTTCCTGTCTGTGAATGTCCATATAGTGTATTGTGTTTTAACAAAT
GATCTACACTGACTGTTGCTGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTATTACTCTGAATAAAAAAAAAAAA
AAAAAA
配列番号6
>配列番号5の逆相補物
TTTTTTTTTTTTTTTTTTATTCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACAGCAACAGTCAGTGTAGATC
ATTTGTTAAAACACAATACACTATATGGACATTCACAGACAGGAAGCTAAGCTAAGCTGATTTGTGTCCC
TCCCCCCACCCTCAAAATCACCAAAGAAATCATGGGACTTGCAAGCACTGGAGATCATGCCCAGCACAGT
AACGGCACAGGCTACAGTTCATCAGGAGGGTGAGATTGCAATACTGCCAATAGTAACCCTTCCAGAAGAA
GCCAGAGAGAAGTCTGAAGGCTCATAAAGCCACAGATCTACAGTTGATTACCACCTCCACCCTCATCCCC
ACTTACTTTCCTGGAGAACAGAACAGATGGAGATAAAGGAAGTGATCTTGGCCACTGCTAGCAGTGTGTA
GGCTATGGATCTGAGGTCAATCCAGAGGTGATAGTCATGTGCCAGTGGATTAGAGGGAAGGAAGCCAGGG
TTCTTAGGAGGTATTTGACTGTGGGCTCTGGACATCACAAGAAGGCAGCAGGAAGAGAAGTTCACAGATT
ACCTCCACAAACCTGAGAGCTGTACCTGGCTGGGAAGGCAGGGACCTAGCTGGCTACCTCTGCCTTGCGA
AAGCCTATTAGTGGGACAGCCAAGCCTCCAAGTTCTAGTCTCTTGGCACCTCTTCTCTCTAGCAGGTGGT
CAAAATCATGAATGGGGTTACAAGATGGCTTAACGGCTACACTCCAAGACCTCCCTTTGCCCATGTGAAT
TATCTTAATGTGTTCCTCCTCCCCCTCCCCCACAACGCAAGCAATCTCAAATGGGATACACTCTTATCAT
TGAAGTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGAATTAAGAGCTTGGAGGAACCAGGCCAATTGTATGC
CCTATCTATCTAGCCCACCCAAAGACATTGGCTCTGAGTTGGAGAGGCATGGAAAGAAAGGGCCCTGGGG
GATTGTCCTCACTGAAGTCACAAGCCAGAATCCCTTTGTAAACTGCCTATCAGCACTGATCAGATCACTC
CAAATCATGATTTTTGGGCTGATCACCCCACAAGAGATAGGCAGAGCACCCCACCCCCCATTCAAGGACA
GGAACTGCGGGATGGGTAAATGGGTGTAAGAGAGAGAACCACGACAGGTAACCATGATGAAGAAACCACA
CTTTTCCTCCCTCGGACTCACTTCTATGGACAGCTAAAGTCTTATCAGTGGGGAAGCTCACAATAGGTAG
CCCTGGGCACTCAAGAGTTCTTTAATGGGAAAGGCTGGCTGCTTCCTCCTAGTCTCCACATTGTCCTTAA
CTGTACATCAGAAGTGGCTGATGTGGGCCTGAGGTTCCTAATCTTCAAAGGCCTAGTCCCTGAAGCTGTA
GGAGGTCGTGCAAGTTCAGGGGGCTGACAGCTTGGAAACCAAGGGAGTCTCCTAAGATGTCCCCTTCATC
AGTGGGACAGTCCATCCCAAACTCTATGGTGAAAAGGCCCAGGCTTGGAGAGGGCCCAAGGATATCTACT
GGGTCGTCATGGAATTTCTAGGGTCACAGCTCTCCCTGCTGGTACTGGTGTCCTTTTCTCTTGTGATGCA
GGAGTTCTTAGATGTCTTTCAGGGCTACTGTGGGATTTGAAGTCGTGATCAGAAAGGACCATCTTCATAC
AAAACAGGCCAGCCACAAGCTCTCCCTGGCACTCGGAGCCTGCTGCCTCTAGCTGGTCCTGTGCTTCAGG
CCTTGGCCAATGCCATTGACCTCCAATGTCACAGACCTCCAATGTCACAATCCAGTGTCTGTGAGGTCCC
AGATGCAGAAGAAACCCTTCAAAACATGGGATGTCCCAGCAGGTTAGCACTGCACTGGCCTGGAGCCACG
TCAGGAAGGAGATATCCAGACTCTCCATCACGTGGTGGGCTAGAACCTTTTGACAAATATTTCAAGATAC
ATGCGTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTCTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTCTTTCTTTTCTTTTC
ACTATCATAGTCACTCTGGTGAACCCAGACAAACAGACAAATCCAACTACAACGTAACAGGGCGAAGACG
GGAAAGAAAGGGCTGCATCTATGGAGGTGGCCGTCTGCTCCAGCAGGGCAGGCAGCATGGTTTCCATGGG
ACCGGAGGAAAAAAACACTTCAATCAAGGGGGTATGTTCCCCAAACTGGGGTGTGGAGACTGATTACGTG
CATGGGGACTTAATGGCAGCTGAGCTCTGGGAGGCTAGCGATCACAAGCTGGGGTGGAAGCGAAAGATGG
GAGAAGTGTGGCCCTGCCCTGGGACTCTTGACTGTTCTTACTGATGCCAAGACATTGGCACCTGACTTGG
CTGCCTCCAGCTCAACACAAGGAGTCAGGCCTAGGAGGCATCCACTTAGATAAAAGAAAAGGCAGAGGTC
CAAGGTCATCCCCAGGCAGGCACACACCAGTTCCCATCCAGGATAGGAAGTAATGGAGTGAACCAAACAA
GGTCGTAAGGTTCCTTGTGGGAGGCACACTGGTTGGATTCGTGGAACGTAGGACTAGAGACTGAGGCCCA
AATCTTTGCCTTCCCTGGACTCCAACCCCTAGTGTAGAGCAGATATTGCCCATATCTACCCAGGGGCCAG
GGATGGGGGCTGGGAGAGGCATGGCACTCAGGACAGTGAGACGTGATGTACGGACGGCAGTGACTAGCTC
TCGTGGCAGACGTGGGCATGATAGGACAGAGAGAGGGGATACAGTGGCTGTGTGAGGGATGGGAGGCCTG
GGACCCACATCCCAGAATACCACCCCCCATCCCTCCCACTACAGAAGTGCCAGAGGGCCAAGCATGAGAA
CAGGCAGAGGTCCCCCAAGAGGCACAAGTCCTTACAAAGATCTGGTTAGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGTA
ATGGTGGCCAAATCATGGCTGTAGTTCCAAACTTGAGAACTCAGTAAAGCAGCTTTTCCTGTGGGAGCGA
AGGGAAACACCTCGCTCAGGACCTCCCACCTTGCGGGGAGGGAGGAAGAAGCCAGTGCCCTGGGATGTCA
AGAGCAGCCTTCAAGAGAACCAATCTACAAGGTACCACCTGCTGGCTTACCTTCCTTCTGCCCAATACCC
CTTCTCCCACAGGCTGCCCTGCAGAAGGGGCACACACACCCACGTTACCCCCACAGTGCTTTATCAAGCA
GGCATCTGAGCTAGCTAGGACTGCTGCAGGCAGCTGCAGCACCCTGTCCTCCCCAAGCTACTTGGCAAGG
AGCCAGTGTCCCCTCTCCCAACCTGCCTTCCTCACCTCTGTCCTCTAACTCAGTCCACCCATCCATCTCT
CAGCCTTCGCTGTCGCTGTTTCAGTCCCCACTCACACCCACACAAGTTAACAGCACCTGCCTACGGCCCC
ACGAACACACCAAGTCTCAAATCTCTCATTGCTGCCACTGTCCCTGAAGCCCCTAGGATGGGGCTATGGG
CAATTAGCTGCCCTAGTCCCTCAGCCACTCCCCAGAAGCAGCCTCCAGAGCCTTCTTCACCCTCTAATAC
TCAGAGAGGGAGGGCGGGGTCAGGGGGGGGAAATCAATTAGCAATTGCCCAAGGAAATTTTTTGGCCATG
TTTTTACATGTTTTTTTTTCCCTTAAATATGTTTTATTTTTAGCCCACAAATCAATTTGGAAAGATGAAA
TGTACTTTTCCCATCACTGATTTTGAAGTCCCGAGCCAAATCCGAGCCACAAAAGCAGGTTAGGTGACAA
GCAGGTCAGCCTGTCTATGAGGAGCAGCGGGGAGGGCAGAGGGCAAGGGGCCAGATCATTCTTTTTTTTT
TTTTTTTTCCACACTCTCACTCTCTCTTCTCTCCATGATTATTGACTGCCCTGGGAGCCTGATCACAAAC
CCTGCTTGGCCAAGGAAGCAGACACTTCATCGGCTAGTGTGGCAAGCTGTGGTGAGTCCACCATGTCGAT
GCTGCCCGTGGAAGACACATTGCTGAGGTGCCGTGGAGATGTGTCCCCAGACACCACGGGTGACTTATAC
ACAATTTCTGCTCCATGGTCTGTCTTGGCTTTGGCATTCTCCCTGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCT
TCTTATTCCCTCCTCCAGGGACGTGGGTGATATTATCCAAGGAGCCAATCTTCGACTGGACTCTGTCCTT
GAAGTCCAGCTTCTCTGATTTTACTTCCACCTGGCCACCTCCTGGCTTGTGATGGATGTTCCCTAACGAG
CCACACTTGGAGGTCACTTTGCTCAGGTCCACCGGCTTGTAGACTATTTGCACACTGCCTCCACCCGGGA
CGTGTTTGATATTATCCTTCGAGCCACACTTGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTATTAATTAT
CTGCACCTTGCCACCTCCTGGCTGGTGCTTCAGGTTCTCAGTAGAGCCAATCTTCGACCTGACATTCTTT
AGGTCTGGCATGGGCACAGGGGCAGTCTGCAGGCGGCTCTTACTAGCTGATGGTGACTTAGGGGGAGTGC
GGACCACTGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGGTGGGCGGTGTTGGTAGGGATGGGGTGCGCGAGCGACTGCC
AGGCGTTCCGGGAGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCGCTTCGTTCTCCGGATTTTGGTGGTTCACCTGACCCT
GGAGGAGTCTTAGGGCTGGGCGTGGTCTTGGCCGGGATCCTGGTGGCGTTGGACGTGCCCTTCTGGGCCG
GAGAGGCTGCTCCCCGAGGTGTGGCGATCTTCGCCCCGGTTTTGCCATCAGCGCCCTTGGCTTTCTTCTC
GTCATTTCCTGTCCTGTCTTTGCTGGCCACACGAGCTTGAGTCACATGCCCAGCGGCTTGGTCCTCCTGG
TTCGGGGTGTCTCCGATGCCTGCTTCTTCGGCTGTAATTCCTTCTGGGATCTCCGTGTGGGGCTGGGCAG
CGGCCTGCTTGTCGGGAGCTCTCTCATCCACTAGGGGCGCAGTCACGTCTTCAGCAGTTGGAGTGCTCTT
AGCATCGGAGGTCTCCGACCCTGGTTCCTCCGCTCCATCATCGGCGGGGGGCTGTGGGGGAGACTCTTTT
AAGCCATGGTCCATGTCTCCTTCTTGGTCTTGGAGCAGAGTGTAATCTCCAGCATGGTCTTCCATTGTGT
CAAACTCCTGGCGAGGGTCAGCCATACTGGTTCAAAGCCTGATAATCGACAGAAGGCGAGGACAGAAGAG
GACAGCGGAGGAGAAGGTGGTTGTGGCGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCGGCGGCGCTGCTGCTGG
TGCTGGAGCTGGTGGGTGGCGGAGACTGAGAGCGCGCGCGGCCGAGAAAGCGCGTTCTGGAGGCCGGCGG
配列番号7
>予想されるXM_005584540.1:カニクイザル微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体X13、mRNA
GCCGAGCGGCAGGGCGCTCGCGCGCGCCCACTGGTGGCCGGAGGAGAAGGCTCCCGCGGAGGCCGGGCTG
CCCGCCCCCTCCCCTGGGGAGGCTCGCGCTCCCGCTGCTCGCGCCTGCGCCGCCTGCCGGCCTCGGGAAC
GCGCCCTCTTCCCCGGCGCGCGCCCTCGCAGTCACCGCCACCCACCAGCTCCGGCACCAACAGCAGCGCC
GCTGCCACCGCCCACCTTCTGCCGCCGCCACCACAGCCACCTTCTCCTCCTCCGCTGTCCTCTCCCGTCC
TCGCCTCTGTCGACTATCAGGCGAGCCTTGAACCAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCGATGTGATG
GAAGATCACGCTGGGACGTACGGGTTGGGGGACAGGAAAGATCAAGAGGGCTACACCATGCTCCAAGACC
AAGAGGGTGACACGGACGCTGGCCTGAAAGAATCTCCCCTGCAGACCCCCGCTGAGGATGGATCTGAGGA
ACTGGGCTCTGAAACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACGGCGGAAGATGTGACAGCGCCCTTAGTGGAT
GAGAGAGCTCCCGGCGAGCAGGCTGCCGCCCAGCCCCACATGGAGATCCCAGAAGGAACCACAGCTGAGG
AAGCAGGCATCGGAGACACCCCCAGCCTGGAAGACGAAGCTGCTGGTCACGTGACCCAAGCTCGCATGGT
CAGTAAAAGCAAAGACGGGACTGGAAGCGATGACAAAAAAGCCAAGGGGGCTGATGGGAAAACGAAGATC
GCCACACCCCGGGGAGCGGCCCCTCCAGGCCAGAAGGGCCAAGCCAACGCCACCAGGATTCCAGCAAAAA
CCCCGCCCGCCCCAAAGACACCACCCAGCTCTGGTGAACCTCCAAAATCAGGGGATCGCAGTGGCTACAG
CAGCCCCGGCTCCCCGGGCACTCCCGGCAGCCGCTCCCGCACCCCGTCCCTTCCAACCCCTCCAGCCCGG
GAGCCCAAGAAGGTGGCGGTGGTCCGTACTCCACCTAAGTCGCCGTCTTCCGCCAAGAGCCGCCTGCAGA
CAGCCCCCGTGCCCATGCCAGACCTGAAGAACGTCAAGTCCAAGATCGGCTCCACCGAGAACCTGAAGCA
CCAGCCGGGAGGCGGGAAGGTGCAGATAATTAATAAGAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGT
GGCTCAAAGGATAATATCAAACACGTCCCGGGAGGCGGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACC
TGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAACCAGGAGGTGGCCAGGTGGA
AGTAAAATCTGAGAAGCTGGACTTCAAGGACAGAGTGCAGTCGAAGATCGGGTCCCTGGACAATATCACC
CATGTCCCTGGCGGAGGAAATAAAAAGATTGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGCGAGAACGCCAAAGCCA
AGACAGACCACGGGGCGGAAATCGTGTACAAGTCGCCGGTGGTGTCTGGGGACACGTCTCCACGGCACCT
CAGCAATGTCTCCTCCACCGGCAGCATCGACATGGTAGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCCGACGAG
GTGTCTGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCCGGGGCGGTCAATAATCGTGGAGAGAAG
AGAGAGTGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGACCCGGCCCCGCCCTCTGCCCCCAGCTGCTCCTCGC
AGTTCGGTTAATCGGTTCATCACTTAACCGGCTTTTATCGCTCGGCTTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAG
TGATGGGAATAAGAGCAAATTGCATCTTTCCAAATTGATCGGTGGGCTAATAATAAAATATTTTTTAAAA
AACATTCAAAAACATGGCCACACCCAACATTTCCTCGGGCAATTCCTTTTGATTCTTTTTTTTTCCCCCT
CCATGTAGAAGAGGGAGAAGGAGAGGCTGTGAAAGCTGCTTCGGGGGGATTTCAAGAGACTGGGGGTGCC
CACCGCCTCTGGCCCTGTCGTGGGGGTGTCACAGAGGCAGCGGCAGCAACAAAGGATTTGAAACTTGGTG
TGTTCGTGGAGCCACAGGCAGACGATGTCAACCTTGTGTGAGTGTGACGGGTGGGGGTGGGGCGGGAGGC
CATGGGGGAGGCCAAGGCAGGGGCTGGGCAGAGGGGAGAGGAAGGACGAGAAGGGGGAGTGGGAGAGGAA
GCCACATGCTGGAGAGGAGATGCCCTCCTCCGCGCCACTGGGAGGGCCAAGGCCTCCGCCACCTGCAGTG
TCTCAGACTGAGCGGCTGCCTGTCCTTGGTGGCCAGGGTCTGCTGCGAGTTGATGTGCCACCCTCTGCAG
GGCAGCCTGTGGGAGAAGGGGCGGCGGGTAAGAAGAGAAGGCAAGCTGGCGGGAGGGTGGCACCCCGTGG
ATGACCTCCTTGGAAAAGACTGACCTTGATGTCGGAGGGCGCTGGCCTCTTCCTCCCTCCCTGCAGGGTA
GGGGGCCTGAGCCGAGGGGCTTCCCTCTGCTCCACAGAAACCCTGTTTTATTGAGTTCTGAAGGTTGGAA
CTGCAGCCATGATTTTGGCCACTTTGCAGACCTGGGACTTTAGGGCTAACCAGTTCTCTTTGTAAGGACT
TGTGCCTCTTGGGAGACGTCCACCCGTTTCCAAGCCTGGGCCACCGGCATCTCTGGAGTGTGCAGGGGTC
TGGGAGGCGGGTCCCGAGCCCCCTGTCCTTCCCACGGCCACTGCAGTCACCCCTGTCTGCCCCACTGTGC
TGTCGTCTGCCATGAGAACCCAGTCACTGCCTATACCCCTCATCACGTCACAATGTCCAAATTCCCAGCC
TCACCACCCCCCTTCTCAGTAAGGACCCTGGTTGGCTGTGGGAGGCACCTACTCCATACTGAGGGTGAAA
TTAAGGGAAGGTAAAGTCCAGGCACAAGAGTGGGACCCCAGCCTCTCACTCTCAGTTCCACTCATCCAAC
TGGGTCCCTCACCACGAATCTCACGACCTGATTCGGTTCCCTGCCTCCTCCTCCCATCACAGATGTGAGC
CAGGGCACTGCTCAGCTGTGACCCTCGGTGTTTCTGCCTTGTTGACATAGAGAGAGCCCTTTCCCCCCGA
GAAGGCCTGGCCCCTTCCTGTGCTGAGCCCGCAGCAGGAGGCTGGGTGTCCTGGTTGTCGGTGACGGCAC
CAGGATGGGCGGGCAAGGCACCCAGGGCAGGCCCACAGTCCCGCTGTCCCCCACTTGCACCCCAGCTTGT
GGCTGCCAGCCTCCCAGACAGCCCAGCCCGCTGCTCAGCTCCACATGCATAGAATCAGCCCTCCACATCC
CAAAAAGGGGAACACACCCCCTTCGAAATGGTTTTCTCCCCGGTCCCAGCTGGAAGCCATGCTGTCTGTT
CTGCTGGAGCAGCTGAACATATACATAGATGTTGCCCTGCCCTCCCCATCTGCACCCTGTTGCGTTGTAG
TTGGATTTGTCTGTTTATGCTTGGATTCACCAGAGTGACTATGATAGTGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAGGACGCATGTATCTTGAAATGCTTGTAAAGAGGTTTCTAACCCACCCTCACAAGGTGTCTCTCACCC
CCACGCTGGGACGCGTGTGGCCTGTGTGGCGCCGCCCTGCTGGGGCCTCCCAAGGTTTGAAAGGCTTTCC
TCAGCATCCGGGACCCAACAGAGACCAGATTCTAGCATCTAAGGAGGCCGTTCAGCTGTGAAGAAGGCCT
GAAGCACAGGATTAGGACTGAAGCGATGACATCTCCTTCCCTACTTCCCCTTGGGGCTCTCTGTGTCAGG
GCAGAGAGTAGGTCTTGTGGCTGGTCTGGCTTGCGGCACGAGGATGGTTCTCTCTGGTCACAGCCCGAAG
TCCCACAGCAGTCCTAAAGGAGGCTTACAACTCCTGCATCACAAGAAGAAGGAAGCCAGTGCCAGCTGGG
GGGATCTGCAGCTCCCAGAAGCTCCATGAGCCTCAGCCACCCCGCAGACTGGGTTCCTCGCCAAGCTCGC
CCTCTGGAGGGGCAGCCAGCCTCCCACCAAGGGCCCTGCGACCACAGCAGGGATTGGGATGAATGGCCTA
TCCTGGATCTGCTCCAGAGGCCCGAGCCACCTGCCTGAGGAAGGATAAGTCAGGAGACACCGTTCCCAAA
GCCTTGACCAGAGCACCTCAGCCCACTGACCTTGCACAAACTCCATCTGCTGCCATGAGAAAAGGGAAGC
CGCCTTTGCAAAAAATTGCTGCCTAAAGAAACTCAGCAGCCTCAGGCTCAATTCTGCCGCTTCTGGTTTG
GGTACAGTTAAAGGCAACCCTGAGGGACTTGGCAGTAGAAATCCAGGGCATCCCCTAGGGCTGGCAACTT
CGTGTGCAGCTAGAGCTTTCCCTGCAAGAAGTTTCTGGGCCCAGAACTCTCCACCAGGAAGCTCCCTGCT
GTTCGCTAAGTCCCAGCAATTCTCTAAGTGAAGGGATCTGAGAATGAGGAGGAAATGTGGGGTAGAGATT
TGGTGGTGGTTAGAGACATGCCCCCCTCATTACTGCCAACAGTTTCGGCTGCATTTTTCACGTACCTCGG
TTCCTCTTCCTGAAGTTCTTGTGCCCTGCTCTTCAGCACCGTGGGCCTTATCCGGTAGGCTCTGGGATCT
CCCCCTTGTGGGGCAGGCTCTTGGGGCCAGCCTAAGATCATGGTTTAGGGTGATCAGTGCTGGCAGATAA
ATTGCAAAGGCACGCTGGCTTGTGACCTCAAATGACAATCCCCCCAGGGCTGGGCACTCCTCCCCTCCCC
TCACTTCTCCCACCTGCAGAGCCAGTGTCCGTGGGTGGGCTAGATAGGATATACTGTATGCCGGCTCCTT
CAAGCTGTTGACTCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGACTTCAATGGTGAGACTGTATCCTGTTTG
CTATTGCTTATTGTGCTATGGGGGGAGGGGGGAGGAATGTGTAACATAGTTAACATGGGTAAAGGGAGAT
CTTGGGGTGCAGCACTTCAATTGCCTCGTAACCCTTTTCATCATTTCAACCACATTTGCTAAAGGGAGGG
AGCAGCCACGCGGTTAGAGGCCCTTGGGGTTTCTCTTTTCCACTGACAGCCTTTCCCAGGCAGCTGGCCA
GTTCCCCATTCCCTCCCCAGCCAGGTGCAGGCGTAGCAATATGGACATCTGGTTGCTTTGGCCTGCTGCC
CTCTTTCAGGGGTCCTAAGCCCACAATCATGCCTCCCTAAGACCCTGGCATCCTTCCTTTTAAGCCGTTG
GCACCTCTGTGCCACCTCTCACACTGGCTCCAGACACAGCCTGTGCTTCTGGCAGCTGAGATCACTCACT
TCCCCCTCCTCATCTTTGTTGGAGCTCCAAGTCAAGCCACGAGGTCAGGGCGAGGGCAGAGGTGGTCACC
AGCGTGTCCCATCTACAGACCTGTGGCTTCGTAAGACTTCTGATTTCTCTTCAGCTTTGAAAAGGGTTAC
CCTGGGCACTGGCCTAGAGTCTCACCTCCTAATAGACTTACCCCCATGAGTTTGCCATGTTGAGCAGGAC
AATTTCTGGCACTTGCAAGTCCCATGATTTCTTCGGTAATTGTGAGGGTGGGGGGAGGGACATGAAATCA
TCTTAGCTTAGCTTCCTGTCTGTGAATGTCTATATAGTGTATTGTGTGTTTTAACAAATGATTTACACTG
ACTGTTGCCGTAAAAGTGAATTTGGAAATAAAGTTATTACTCTGATTAAA
配列番号8
>配列番号7の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTATTTCCAAATTCACTTTTACGGCAACAGT
CAGTGTAAATCATTTGTTAAAACACACAATACACTATATAGACATTCACAGACAGGAAGCTAAGCTAAGA
TGATTTCATGTCCCTCCCCCCACCCTCACAATTACCGAAGAAATCATGGGACTTGCAAGTGCCAGAAATT
GTCCTGCTCAACATGGCAAACTCATGGGGGTAAGTCTATTAGGAGGTGAGACTCTAGGCCAGTGCCCAGG
GTAACCCTTTTCAAAGCTGAAGAGAAATCAGAAGTCTTACGAAGCCACAGGTCTGTAGATGGGACACGCT
GGTGACCACCTCTGCCCTCGCCCTGACCTCGTGGCTTGACTTGGAGCTCCAACAAAGATGAGGAGGGGGA
AGTGAGTGATCTCAGCTGCCAGAAGCACAGGCTGTGTCTGGAGCCAGTGTGAGAGGTGGCACAGAGGTGC
CAACGGCTTAAAAGGAAGGATGCCAGGGTCTTAGGGAGGCATGATTGTGGGCTTAGGACCCCTGAAAGAG
GGCAGCAGGCCAAAGCAACCAGATGTCCATATTGCTACGCCTGCACCTGGCTGGGGAGGGAATGGGGAAC
TGGCCAGCTGCCTGGGAAAGGCTGTCAGTGGAAAAGAGAAACCCCAAGGGCCTCTAACCGCGTGGCTGCT
CCCTCCCTTTAGCAAATGTGGTTGAAATGATGAAAAGGGTTACGAGGCAATTGAAGTGCTGCACCCCAAG
ATCTCCCTTTACCCATGTTAACTATGTTACACATTCCTCCCCCCTCCCCCCATAGCACAATAAGCAATAG
CAAACAGGATACAGTCTCACCATTGAAGTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGAGTCAACAGCTTG
AAGGAGCCGGCATACAGTATATCCTATCTAGCCCACCCACGGACACTGGCTCTGCAGGTGGGAGAAGTGA
GGGGAGGGGAGGAGTGCCCAGCCCTGGGGGGATTGTCATTTGAGGTCACAAGCCAGCGTGCCTTTGCAAT
TTATCTGCCAGCACTGATCACCCTAAACCATGATCTTAGGCTGGCCCCAAGAGCCTGCCCCACAAGGGGG
AGATCCCAGAGCCTACCGGATAAGGCCCACGGTGCTGAAGAGCAGGGCACAAGAACTTCAGGAAGAGGAA
CCGAGGTACGTGAAAAATGCAGCCGAAACTGTTGGCAGTAATGAGGGGGGCATGTCTCTAACCACCACCA
AATCTCTACCCCACATTTCCTCCTCATTCTCAGATCCCTTCACTTAGAGAATTGCTGGGACTTAGCGAAC
AGCAGGGAGCTTCCTGGTGGAGAGTTCTGGGCCCAGAAACTTCTTGCAGGGAAAGCTCTAGCTGCACACG
AAGTTGCCAGCCCTAGGGGATGCCCTGGATTTCTACTGCCAAGTCCCTCAGGGTTGCCTTTAACTGTACC
CAAACCAGAAGCGGCAGAATTGAGCCTGAGGCTGCTGAGTTTCTTTAGGCAGCAATTTTTTGCAAAGGCG
GCTTCCCTTTTCTCATGGCAGCAGATGGAGTTTGTGCAAGGTCAGTGGGCTGAGGTGCTCTGGTCAAGGC
TTTGGGAACGGTGTCTCCTGACTTATCCTTCCTCAGGCAGGTGGCTCGGGCCTCTGGAGCAGATCCAGGA
TAGGCCATTCATCCCAATCCCTGCTGTGGTCGCAGGGCCCTTGGTGGGAGGCTGGCTGCCCCTCCAGAGG
GCGAGCTTGGCGAGGAACCCAGTCTGCGGGGTGGCTGAGGCTCATGGAGCTTCTGGGAGCTGCAGATCCC
CCCAGCTGGCACTGGCTTCCTTCTTCTTGTGATGCAGGAGTTGTAAGCCTCCTTTAGGACTGCTGTGGGA
CTTCGGGCTGTGACCAGAGAGAACCATCCTCGTGCCGCAAGCCAGACCAGCCACAAGACCTACTCTCTGC
CCTGACACAGAGAGCCCCAAGGGGAAGTAGGGAAGGAGATGTCATCGCTTCAGTCCTAATCCTGTGCTTC
AGGCCTTCTTCACAGCTGAACGGCCTCCTTAGATGCTAGAATCTGGTCTCTGTTGGGTCCCGGATGCTGA
GGAAAGCCTTTCAAACCTTGGGAGGCCCCAGCAGGGCGGCGCCACACAGGCCACACGCGTCCCAGCGTGG
GGGTGAGAGACACCTTGTGAGGGTGGGTTAGAAACCTCTTTACAAGCATTTCAAGATACATGCGTCCTTT
TTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCACTATCATAGTCACTCTGGTGAATCCAAGCATAAACAGACAAATCCAA
CTACAACGCAACAGGGTGCAGATGGGGAGGGCAGGGCAACATCTATGTATATGTTCAGCTGCTCCAGCAG
AACAGACAGCATGGCTTCCAGCTGGGACCGGGGAGAAAACCATTTCGAAGGGGGTGTGTTCCCCTTTTTG
GGATGTGGAGGGCTGATTCTATGCATGTGGAGCTGAGCAGCGGGCTGGGCTGTCTGGGAGGCTGGCAGCC
ACAAGCTGGGGTGCAAGTGGGGGACAGCGGGACTGTGGGCCTGCCCTGGGTGCCTTGCCCGCCCATCCTG
GTGCCGTCACCGACAACCAGGACACCCAGCCTCCTGCTGCGGGCTCAGCACAGGAAGGGGCCAGGCCTTC
TCGGGGGGAAAGGGCTCTCTCTATGTCAACAAGGCAGAAACACCGAGGGTCACAGCTGAGCAGTGCCCTG
GCTCACATCTGTGATGGGAGGAGGAGGCAGGGAACCGAATCAGGTCGTGAGATTCGTGGTGAGGGACCCA
GTTGGATGAGTGGAACTGAGAGTGAGAGGCTGGGGTCCCACTCTTGTGCCTGGACTTTACCTTCCCTTAA
TTTCACCCTCAGTATGGAGTAGGTGCCTCCCACAGCCAACCAGGGTCCTTACTGAGAAGGGGGGTGGTGA
GGCTGGGAATTTGGACATTGTGACGTGATGAGGGGTATAGGCAGTGACTGGGTTCTCATGGCAGACGACA
GCACAGTGGGGCAGACAGGGGTGACTGCAGTGGCCGTGGGAAGGACAGGGGGCTCGGGACCCGCCTCCCA
GACCCCTGCACACTCCAGAGATGCCGGTGGCCCAGGCTTGGAAACGGGTGGACGTCTCCCAAGAGGCACA
AGTCCTTACAAAGAGAACTGGTTAGCCCTAAAGTCCCAGGTCTGCAAAGTGGCCAAAATCATGGCTGCAG
TTCCAACCTTCAGAACTCAATAAAACAGGGTTTCTGTGGAGCAGAGGGAAGCCCCTCGGCTCAGGCCCCC
TACCCTGCAGGGAGGGAGGAAGAGGCCAGCGCCCTCCGACATCAAGGTCAGTCTTTTCCAAGGAGGTCAT
CCACGGGGTGCCACCCTCCCGCCAGCTTGCCTTCTCTTCTTACCCGCCGCCCCTTCTCCCACAGGCTGCC
CTGCAGAGGGTGGCACATCAACTCGCAGCAGACCCTGGCCACCAAGGACAGGCAGCCGCTCAGTCTGAGA
CACTGCAGGTGGCGGAGGCCTTGGCCCTCCCAGTGGCGCGGAGGAGGGCATCTCCTCTCCAGCATGTGGC
TTCCTCTCCCACTCCCCCTTCTCGTCCTTCCTCTCCCCTCTGCCCAGCCCCTGCCTTGGCCTCCCCCATG
GCCTCCCGCCCCACCCCCACCCGTCACACTCACACAAGGTTGACATCGTCTGCCTGTGGCTCCACGAACA
CACCAAGTTTCAAATCCTTTGTTGCTGCCGCTGCCTCTGTGACACCCCCACGACAGGGCCAGAGGCGGTG
GGCACCCCCAGTCTCTTGAAATCCCCCCGAAGCAGCTTTCACAGCCTCTCCTTCTCCCTCTTCTACATGG
AGGGGGAAAAAAAAAGAATCAAAAGGAATTGCCCGAGGAAATGTTGGGTGTGGCCATGTTTTTGAATGTT
TTTTAAAAAATATTTTATTATTAGCCCACCGATCAATTTGGAAAGATGCAATTTGCTCTTATTCCCATCA
CTGATTTTGAAGTCCCGAGCCAAAGCCGAGCGATAAAAGCCGGTTAAGTGATGAACCGATTAACCGAACT
GCGAGGAGCAGCTGGGGGCAGAGGGCGGGGCCGGGTCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCACTCTCT
CTTCTCTCCACGATTATTGACCGCCCCGGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCAGACAC
CTCGTCGGCTAGCGTGGCGAGCTGGGGCGAGTCTACCATGTCGATGCTGCCGGTGGAGGAGACATTGCTG
AGGTGCCGTGGAGACGTGTCCCCAGACACCACCGGCGACTTGTACACGATTTCCGCCCCGTGGTCTGTCT
TGGCTTTGGCGTTCTCGCGGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCAATCTTTTTATTTCCTCCGCCAGGGACATG
GGTGATATTGTCCAGGGACCCGATCTTCGACTGCACTCTGTCCTTGAAGTCCAGCTTCTCAGATTTTACT
TCCACCTGGCCACCTCCTGGTTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCA
GGTCAACTGGTTTGTAGACTATTTGCACACTGCCGCCTCCCGGGACGTGTTTGATATTATCCTTTGAGCC
ACACTTGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTCTTATTAATTATCTGCACCTTCCCGCCTCCCGGCTGG
TGCTTCAGGTTCTCGGTGGAGCCGATCTTGGACTTGACGTTCTTCAGGTCTGGCATGGGCACGGGGGCTG
TCTGCAGGCGGCTCTTGGCGGAAGACGGCGACTTAGGTGGAGTACGGACCACCGCCACCTTCTTGGGCTC
CCGGGCTGGAGGGGTTGGAAGGGACGGGGTGCGGGAGCGGCTGCCGGGAGTGCCCGGGGAGCCGGGGCTG
CTGTAGCCACTGCGATCCCCTGATTTTGGAGGTTCACCAGAGCTGGGTGGTGTCTTTGGGGCGGGCGGGG
TTTTTGCTGGAATCCTGGTGGCGTTGGCTTGGCCCTTCTGGCCTGGAGGGGCCGCTCCCCGGGGTGTGGC
GATCTTCGTTTTCCCATCAGCCCCCTTGGCTTTTTTGTCATCGCTTCCAGTCCCGTCTTTGCTTTTACTG
ACCATGCGAGCTTGGGTCACGTGACCAGCAGCTTCGTCTTCCAGGCTGGGGGTGTCTCCGATGCCTGCTT
CCTCAGCTGTGGTTCCTTCTGGGATCTCCATGTGGGGCTGGGCGGCAGCCTGCTCGCCGGGAGCTCTCTC
ATCCACTAAGGGCGCTGTCACATCTTCCGCCGTTGGAGTGCTCTTAGCATCAGAGGTTTCAGAGCCCAGT
TCCTCAGATCCATCCTCAGCGGGGGTCTGCAGGGGAGATTCTTTCAGGCCAGCGTCCGTGTCACCCTCTT
GGTCTTGGAGCATGGTGTAGCCCTCTTGATCTTTCCTGTCCCCCAACCCGTACGTCCCAGCGTGATCTTC
CATCACATCGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTGGTTCAAGGCTCGCCTGATAGTCGACAGAGGCGA
GGACGGGAGAGGACAGCGGAGGAGGAGAAGGTGGCTGTGGTGGCGGCGGCAGAAGGTGGGCGGTGGCAGC
GGCGCTGCTGTTGGTGCCGGAGCTGGTGGGTGGCGGTGACTGCGAGGGCGCGCGCCGGGGAAGAGGGCGC
GTTCCCGAGGCCGGCAGGCGGCGCAGGCGCGAGCAGCGGGAGCGCGAGCCTCCCCAGGGGAGGGGGCGGG
CAGCCCGGCCTCCGCGGGAGCCTTCTCCTCCGGCCACCAGTGGGCGCGCGCGAGCGCCCTGCCGCTCGGC
配列番号9
>予想されるXM_008768277.2:ドブネズミ(Rattus norvegicus)微小管関連タンパク質タウ(Mapt)、転写物変異体X7、mRNA
ACCGCCCACCTTCTGCTGTCGCCGCCGCCACAACCACCTTCCCCTCCGCTGTCCTCTTCTGTCCTCGCCT
CCTGTCGATTATCAGGCTTTGAAGCAGCATGGCTGAACCCCGCCAGGAGTTTGACACAATGGAAGACCAG
GCCGGAGATTACACTATGCTCCAAGACCAAGAAGGAGACATGGACCATGGCTTAAAAGAGTCTCCCCCAC
AGCCCCCAGCCGATGATGGATCAGAAGAACCAGGGTCGGAGACCTCTGATGCTAAGAGCACTCCAACTGC
TGAAGACGTGACTGCGCCCCTAGTGGAAGAGAGAGCTCCCGACAAGCAGGCGACTGCCCAGTCCCACACG
GAGATCCCAGAAGGCACCACAGCTGAAGAAGCAGGCATCGGAGACACCCCGAACATGGAGGACCAAGCTG
CTGGGCATGTGACTCAAGCTCGAGTGGCCGGCGTAAGCAAAGACAGGACAGGAAATGACGAGAAGAAAGC
CAAGGGCGCCGATGGCAAAACGGGGGCGAAGATCGCCACACCTCGGGGAGCAGCCACTCCGGGCCAGAAA
GGCACATCCAATGCCACCAGGATCCCAGCCAAGACCACACCCAGCCCAAAGACTCCTCCAGGATCAGGTG
AACCACCAAAATCCGGAGAACGAAGCGGCTACAGCAGCCCCGGCTCGCCCGGAACCCCTGGCAGTCGCTC
CCGTACCCCATCCCTACCAACGCCGCCCACCCGAGAGCCCAAAAAGGTGGCAGTGGTTCGCACTCCCCCT
AAGTCACCGTCTGCCAGTAAGAGCCGCCTACAGACTGCCCCTGTGCCCATGCCAGACCTAAAGAACGTCA
GGTCCAAGATTGGCTCCACTGAGAACCTGAAGCACCAGCCGGGAGGCGGCAAGGTGCAGATAATTAATAA
GAAGCTGGATCTTAGCAACGTCCAGTCCAAGTGTGGCTCAAAGGACAATATCAAACACGTCCCGGGCGGA
GGCAGTGTGCAAATAGTCTACAAGCCAGTGGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGTTCCTTAGGGA
ACATCCATCACAAGCCAGGAGGTGGCCAGGTAGAAGTAAAATCAGAGAAGCTGGACTTCAAGGATAGAGT
CCAGTCGAAGATTGGCTCCTTGGATAACATCACCCATGTCCCTGGAGGAGGGAATAAGAAGATTGAAACC
CACAAGCTGACCTTCAGGGAGAATGCCAAAGCCAAGACAGACCATGGAGCAGAAATCGTGTACAAGTCAC
CTGTGGTGTCTGGGGACACATCTCCACGGCACCTCAGCAACGTCTCCTCCACGGGCAGCATCGACATGGT
GGACTCTCCACAGCTTGCCACGTTAGCCGATGAAGTGTCCGCCTCTTTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCA
GGCCCCTGGGGCCGTCACTGATCATGGAGAGAAGAGAGAGTGAGAGTGTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAG
AATGACCTGGCCCCTCACCCTCTGCCCTCCCCGCTGCTCCTCATAGACAGGCTGACCAGCTTGTCACCTA
ACCTGCTTTTGTGGCTCGGGTTTGGCTCGGGACTTCAAAATCAGTGATGGGAAAAAGTAAATTTCATCTT
TCCAAATTGATTTGTGGGCTAGTAATAAAATATTTTTAAGGAAGGAAAAAAAAAAAAACACGTAAAACCA
TGGCCAAACAAAACCCAACATTTCCTTGGCAATTGTTATTGACCCCGCCCCCCCCCTCTGAGTTTTAGAG
GGTGAAGGAGGCTTTGGATGGAGGCTGCTTCTGGGGATTGGCTGAGGGACTAGGGCAACTAATTGCCCAC
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CGTAGGCAGGTGATGTTAACTTTGTGTGGGTTTGAGGGAGGACTGTGATAGTGAAGGCTGAGAGATGGGT
GGGCTGGGAGTCAGAGGAGAGAGGTGAGGAAGACAGGTTGGGAGAGGGGACATTGGCTCCTTGCCAAGGA
GCTTGGGAAGCACAGGTAGCCCTGGCTGCCTGCAGCAGTCTTAGCTAGCACAGATGCCTGCCTGAGAAAG
CACAGTGGGGTACAGTGGGTGTGTGTGCCCCTTCTGAAGGGCAGCCCATGGGAGAAGGGGTATTGGGCAG
AAGGAAGGTAGGCCAGAAGGTGGCACCTTGTAGATTGGTTCTCTGAAGGCTGACCTTGCCATCCCAGGGC
ACTGGCTCCCACCCTCCAGGGAGGGAGGTCCTGAGCTGAGGAGCTTCCCTTTGCTCTCACAGGAAAACCT
GTGTTACTGAGTTCTGAAGTTTGGAACTACAGCCATGATTTTGGCCACCATACAGACCTGGGACTTTAGG
GCTAACCAGTTCTTTGTAAGGACTTGTGCCTCTTGCGGGAACATCTGCCTGTTCTCAAGCCTGGTCCTCT
GGCACTTCTGCAGTGTGAGGGATGGGGGTGGTAATTCTGGGATGTGGGTCCCAGGCCTCCCATCCTCGCA
CAGCCACTGTATCCCCTCTACCTGTCCTATCATGCCCACGTCTGCCATGAGAGCCAGTCACTGCCGTCCG
TACATCACGTCTCACCGTCCTGAGTGCCCAGCCTCCCCAAGCCCCATCCCTGGCCCCTGGGTAGTTATGG
CCAATATCTGCTCTACACTAGGGGTTGGAGTCCAGGGAAGGCAAAGATTTGGGCCTTGGTCTCTAGTCCT
ACGTTGCACGAATCCAACCAGTGTGCCTCCCACAAGGAACCTTACAACCTTGTTTGGTTTGCTCCATCAT
TTCCCATCGTGGATGGGAGTCCGTGTGTGCCTGGAGATTACCCTGGACACCTCTGCTTTTTTTTTTTTAC
TTTAGCGGTTGCCTCCTAGGCCTGACTCCTTCCCATGTTGAACTGGAGGCAGCCACGTTAGGTGTCAATG
TCCTGGCATCAGTATGAACAGTCAGTAGTCCCAGGGCAGGGCCACACTTCTCCCATCTTCTGCTTCCACC
CCAGCTTGTGATTGCTAGCCTCCCAGAGCTCAGCCGCCATTAAGTCCCCATGCACGTAATCAGCCCTTCA
TACCCCAATTTGGGGAACATACCCCTTGATTGAAATGTTTTCCCTCCAGTCCTATGGAAGCGGTGCTGCC
TGCCCTGCTGGAGCAGCCAGCCATCTCCAGAGACGCAGCCCTTTCTCTCCTGTCCGCACCCTGTTGCGCT
GTAGTCGGATTCGTCTGTTTGTCTGGGTTCACCAGAGTGACTATGATAGTGAAAAGAAAAAGAAAAAGAA
AAAAGAAAAAAGAAAAAAAAAAAAGGACGCATGTTATCTTGAAATATTTGTCAAAAGGTTGTAGCCCACC
GCAGGGATTGGAGGGCCTGGATATTCCTTGTCTTCTTCGTGACTTAGGTCCAGGCCGGTGCAGTGCTACC
CTGCTGGGACATCCCATGTTTTGAAGGGTTTCTTCTTCATCTGGGACCCTGCAGACACTGGATTGTGACA
TTGGAGGTCTATGACATTGGCCAAGGCCTGAAGCACAGGACCCGTTAGAGGCAGCAGGCTCCGACTGTCA
GGGAGAGCTTGTGGCTGGCCTGTTTCTCTGAGTGAAGATGGTCCTCTCTAATCACAACTTCAAGTCCCAC
AGCAGCCCTGGCAGACATCTAAGAACTCCTGCATCACAAGAGAAAAGGACACTAGTACCAGCAGGGAGAG
CTGTGGCCCTAGAAATTCCATGACTCTCCACTACATATCCGTGGGTCCTTTCCAAGCCTTGGCCTCGTCA
CCAAGGGCTTGGGATGGACTGCCCCACTGATGAAAGGGACATCTTTGGAGACCCCCTTGGTTTCCAAGGC
GTCAGCCCCCTGACCTTGCATGACCTCCTACAGCTGTAAGGATGAGGCCTTTAAAGATTAGGAACCTCAG
GCCCAGGTCGGCCACTTTGGGCTTGGGTACAGTTAGGGACGATGCGGTAGAAGGAGGTGGCCAACCTTTC
CCATATAAGAGTTCTGTGTGCCCAGAGCTACCCTATTGTGAGCTCCCCACTGCTGATGGACTTTAGCTGT
CCTTAGAAGTGAAGAGTCCAACGGAGGAAAAGGAAGTGTGGTTTGATGGTCTGTGGTCCCTTCATCATGG
TTACCTGTTGTGGTTTTCTCTCGTATACCCATTTACCCATCCTGCAGTTCCTGTCCTTGAATAGGGGTGG
GGGTACTCTGCCATATCTCTTGTAGGGCAGTCAGCCCCCAAGTCATAGTTTGGAGTGATCTGGTCAGTGC
TAATAGGCAGTTTACAAAGGAATTCTGGCTTGTTACTTCAGTGAGGACAATCCCCCAAGGGCCCTGGCAC
CTGTCCTGTCTTTCCATGGCTCTCCACTGCAGAGCCAATGTCTTTGGGTGGGCTAGATAGGGTGTACAAT
TTGCCTGGTTCCTCCAAGCTCTTAATCCACTTTATCAATAGTTCCATTTAAATTGACTTCAATGATAAGA
GTGTATCCCATTTGAGATTGCTTGTGTTGTGGGGTAAAGGGGGGAGGAGGAACATGTTAAGATAATTGAC
ATGGGCAAGGGGAAGTCTTGAAGTGTAGCAGTTAAACCATCTTGTAGCCCCATTCATGATGTTGACCACT
TGCTAGAGAGAAGAGGTGCCATAAGGCTAGAACCTAGAGGCTTGGCTGTCCCACCAACAGGCAGGCTTTT
GCAAGGCAGAGGCAGCCAGCTAGGTCCCTGACTTCCCAGCCAGGTGCAGCTCTAAGAACTGCTCTTGCCT
GCTGCCTTCTTGTGGTGTCCAGAGCCCACAGCCAATGCCTCCTCAAAACCCTGGCTTCCTTCCTTCTAAT
CCACTGGCACATCAGCATCACCTCCGGATTGACTTCAGATCCACAGCCTACACTACTAGCAGTGGGTAAG
ACCACTTCCTTTGTCCTTGTCTGTTCTCCAGAAAAGTGGGCATGGAGGCGGTGTTAATAACTATAGGTCT
GTGGCTTTATGAGCCTTCAAACTTCTCTCTAGCTTCTGAAAGGGTTACTTTTGGGCAGTATTGCAGTCTC
ACCCTCCCGATGGGCTGTAGCCTGTGCAGTTGCTGTACTGGGCATGATCTCCAGTGCTTGCAAGTCCCAT
GATTTCTTTGGTGATTTTGAGGGTGGGGGGAGGGACATGAATCATCTTAGCTTAGCTTCCTGTCTGTGAA
TGTCCATATAGTGTACTGTGTTTTAACAAACGATTTACACTGACTGTTGCTGTACAAGTGAATTTGGAAA
TAAAGTTATTACTCTGATTAAA
配列番号10
>配列番号9の逆相補物
TTTAATCAGAGTAATAACTTTA
TTTCCAAATTCACTTGTACAGCAACAGTCAGTGTAAATCGTTTGTTAAAACACAGTACACTATATGGACA
TTCACAGACAGGAAGCTAAGCTAAGATGATTCATGTCCCTCCCCCCACCCTCAAAATCACCAAAGAAATC
ATGGGACTTGCAAGCACTGGAGATCATGCCCAGTACAGCAACTGCACAGGCTACAGCCCATCGGGAGGGT
GAGACTGCAATACTGCCCAAAAGTAACCCTTTCAGAAGCTAGAGAGAAGTTTGAAGGCTCATAAAGCCAC
AGACCTATAGTTATTAACACCGCCTCCATGCCCACTTTTCTGGAGAACAGACAAGGACAAAGGAAGTGGT
CTTACCCACTGCTAGTAGTGTAGGCTGTGGATCTGAAGTCAATCCGGAGGTGATGCTGATGTGCCAGTGG
ATTAGAAGGAAGGAAGCCAGGGTTTTGAGGAGGCATTGGCTGTGGGCTCTGGACACCACAAGAAGGCAGC
AGGCAAGAGCAGTTCTTAGAGCTGCACCTGGCTGGGAAGTCAGGGACCTAGCTGGCTGCCTCTGCCTTGC
AAAAGCCTGCCTGTTGGTGGGACAGCCAAGCCTCTAGGTTCTAGCCTTATGGCACCTCTTCTCTCTAGCA
AGTGGTCAACATCATGAATGGGGCTACAAGATGGTTTAACTGCTACACTTCAAGACTTCCCCTTGCCCAT
GTCAATTATCTTAACATGTTCCTCCTCCCCCCTTTACCCCACAACACAAGCAATCTCAAATGGGATACAC
TCTTATCATTGAAGTCAATTTAAATGGAACTATTGATAAAGTGGATTAAGAGCTTGGAGGAACCAGGCAA
ATTGTACACCCTATCTAGCCCACCCAAAGACATTGGCTCTGCAGTGGAGAGCCATGGAAAGACAGGACAG
GTGCCAGGGCCCTTGGGGGATTGTCCTCACTGAAGTAACAAGCCAGAATTCCTTTGTAAACTGCCTATTA
GCACTGACCAGATCACTCCAAACTATGACTTGGGGGCTGACTGCCCTACAAGAGATATGGCAGAGTACCC
CCACCCCTATTCAAGGACAGGAACTGCAGGATGGGTAAATGGGTATACGAGAGAAAACCACAACAGGTAA
CCATGATGAAGGGACCACAGACCATCAAACCACACTTCCTTTTCCTCCGTTGGACTCTTCACTTCTAAGG
ACAGCTAAAGTCCATCAGCAGTGGGGAGCTCACAATAGGGTAGCTCTGGGCACACAGAACTCTTATATGG
GAAAGGTTGGCCACCTCCTTCTACCGCATCGTCCCTAACTGTACCCAAGCCCAAAGTGGCCGACCTGGGC
CTGAGGTTCCTAATCTTTAAAGGCCTCATCCTTACAGCTGTAGGAGGTCATGCAAGGTCAGGGGGCTGAC
GCCTTGGAAACCAAGGGGGTCTCCAAAGATGTCCCTTTCATCAGTGGGGCAGTCCATCCCAAGCCCTTGG
TGACGAGGCCAAGGCTTGGAAAGGACCCACGGATATGTAGTGGAGAGTCATGGAATTTCTAGGGCCACAG
CTCTCCCTGCTGGTACTAGTGTCCTTTTCTCTTGTGATGCAGGAGTTCTTAGATGTCTGCCAGGGCTGCT
GTGGGACTTGAAGTTGTGATTAGAGAGGACCATCTTCACTCAGAGAAACAGGCCAGCCACAAGCTCTCCC
TGACAGTCGGAGCCTGCTGCCTCTAACGGGTCCTGTGCTTCAGGCCTTGGCCAATGTCATAGACCTCCAA
TGTCACAATCCAGTGTCTGCAGGGTCCCAGATGAAGAAGAAACCCTTCAAAACATGGGATGTCCCAGCAG
GGTAGCACTGCACCGGCCTGGACCTAAGTCACGAAGAAGACAAGGAATATCCAGGCCCTCCAATCCCTGC
GGTGGGCTACAACCTTTTGACAAATATTTCAAGATAACATGCGTCCTTTTTTTTTTTTCTTTTTTCTTTT
TTCTTTTTCTTTTTCTTTTCACTATCATAGTCACTCTGGTGAACCCAGACAAACAGACGAATCCGACTAC
AGCGCAACAGGGTGCGGACAGGAGAGAAAGGGCTGCGTCTCTGGAGATGGCTGGCTGCTCCAGCAGGGCA
GGCAGCACCGCTTCCATAGGACTGGAGGGAAAACATTTCAATCAAGGGGTATGTTCCCCAAATTGGGGTA
TGAAGGGCTGATTACGTGCATGGGGACTTAATGGCGGCTGAGCTCTGGGAGGCTAGCAATCACAAGCTGG
GGTGGAAGCAGAAGATGGGAGAAGTGTGGCCCTGCCCTGGGACTACTGACTGTTCATACTGATGCCAGGA
CATTGACACCTAACGTGGCTGCCTCCAGTTCAACATGGGAAGGAGTCAGGCCTAGGAGGCAACCGCTAAA
GTAAAAAAAAAAAAGCAGAGGTGTCCAGGGTAATCTCCAGGCACACACGGACTCCCATCCACGATGGGAA
ATGATGGAGCAAACCAAACAAGGTTGTAAGGTTCCTTGTGGGAGGCACACTGGTTGGATTCGTGCAACGT
AGGACTAGAGACCAAGGCCCAAATCTTTGCCTTCCCTGGACTCCAACCCCTAGTGTAGAGCAGATATTGG
CCATAACTACCCAGGGGCCAGGGATGGGGCTTGGGGAGGCTGGGCACTCAGGACGGTGAGACGTGATGTA
CGGACGGCAGTGACTGGCTCTCATGGCAGACGTGGGCATGATAGGACAGGTAGAGGGGATACAGTGGCTG
TGCGAGGATGGGAGGCCTGGGACCCACATCCCAGAATTACCACCCCCATCCCTCACACTGCAGAAGTGCC
AGAGGACCAGGCTTGAGAACAGGCAGATGTTCCCGCAAGAGGCACAAGTCCTTACAAAGAACTGGTTAGC
CCTAAAGTCCCAGGTCTGTATGGTGGCCAAAATCATGGCTGTAGTTCCAAACTTCAGAACTCAGTAACAC
AGGTTTTCCTGTGAGAGCAAAGGGAAGCTCCTCAGCTCAGGACCTCCCTCCCTGGAGGGTGGGAGCCAGT
GCCCTGGGATGGCAAGGTCAGCCTTCAGAGAACCAATCTACAAGGTGCCACCTTCTGGCCTACCTTCCTT
CTGCCCAATACCCCTTCTCCCATGGGCTGCCCTTCAGAAGGGGCACACACACCCACTGTACCCCACTGTG
CTTTCTCAGGCAGGCATCTGTGCTAGCTAAGACTGCTGCAGGCAGCCAGGGCTACCTGTGCTTCCCAAGC
TCCTTGGCAAGGAGCCAATGTCCCCTCTCCCAACCTGTCTTCCTCACCTCTCTCCTCTGACTCCCAGCCC
ACCCATCTCTCAGCCTTCACTATCACAGTCCTCCCTCAAACCCACACAAAGTTAACATCACCTGCCTACG
GCTCCACAAACACACCAAGTCCCAAGTCTTTCATTGCTGCCGCTGTCCCTGATGCCCCTAAGATGGGGCT
GTGGGCAATTAGTTGCCCTAGTCCCTCAGCCAATCCCCAGAAGCAGCCTCCATCCAAAGCCTCCTTCACC
CTCTAAAACTCAGAGGGGGGGGGCGGGGTCAATAACAATTGCCAAGGAAATGTTGGGTTTTGTTTGGCCA
TGGTTTTACGTGTTTTTTTTTTTTTCCTTCCTTAAAAATATTTTATTACTAGCCCACAAATCAATTTGGA
AAGATGAAATTTACTTTTTCCCATCACTGATTTTGAAGTCCCGAGCCAAACCCGAGCCACAAAAGCAGGT
TAGGTGACAAGCTGGTCAGCCTGTCTATGAGGAGCAGCGGGGAGGGCAGAGGGTGAGGGGCCAGGTCATT
CTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCACACTCTCACTCTCTCTTCTCTCCATGATCAGTGACGGCCCCAGGGGCC
TGATCACAAACCCTGCTTGGCCAAAGAGGCGGACACTTCATCGGCTAACGTGGCAAGCTGTGGAGAGTCC
ACCATGTCGATGCTGCCCGTGGAGGAGACGTTGCTGAGGTGCCGTGGAGATGTGTCCCCAGACACCACAG
GTGACTTGTACACGATTTCTGCTCCATGGTCTGTCTTGGCTTTGGCATTCTCCCTGAAGGTCAGCTTGTG
GGTTTCAATCTTCTTATTCCCTCCTCCAGGGACATGGGTGATGTTATCCAAGGAGCCAATCTTCGACTGG
ACTCTATCCTTGAAGTCCAGCTTCTCTGATTTTACTTCTACCTGGCCACCTCCTGGCTTGTGATGGATGT
TCCCTAAGGAACCACACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGGTCCACTGGCTTGTAGACTATTTGCACACTGCC
TCCGCCCGGGACGTGTTTGATATTGTCCTTTGAGCCACACTTGGACTGGACGTTGCTAAGATCCAGCTTC
TTATTAATTATCTGCACCTTGCCGCCTCCCGGCTGGTGCTTCAGGTTCTCAGTGGAGCCAATCTTGGACC
TGACGTTCTTTAGGTCTGGCATGGGCACAGGGGCAGTCTGTAGGCGGCTCTTACTGGCAGACGGTGACTT
AGGGGGAGTGCGAACCACTGCCACCTTTTTGGGCTCTCGGGTGGGCGGCGTTGGTAGGGATGGGGTACGG
GAGCGACTGCCAGGGGTTCCGGGCGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCGCTTCGTTCTCCGGATTTTGGTGGTT
CACCTGATCCTGGAGGAGTCTTTGGGCTGGGTGTGGTCTTGGCTGGGATCCTGGTGGCATTGGATGTGCC
TTTCTGGCCCGGAGTGGCTGCTCCCCGAGGTGTGGCGATCTTCGCCCCCGTTTTGCCATCGGCGCCCTTG
GCTTTCTTCTCGTCATTTCCTGTCCTGTCTTTGCTTACGCCGGCCACTCGAGCTTGAGTCACATGCCCAG
CAGCTTGGTCCTCCATGTTCGGGGTGTCTCCGATGCCTGCTTCTTCAGCTGTGGTGCCTTCTGGGATCTC
CGTGTGGGACTGGGCAGTCGCCTGCTTGTCGGGAGCTCTCTCTTCCACTAGGGGCGCAGTCACGTCTTCA
GCAGTTGGAGTGCTCTTAGCATCAGAGGTCTCCGACCCTGGTTCTTCTGATCCATCATCGGCTGGGGGCT
GTGGGGGAGACTCTTTTAAGCCATGGTCCATGTCTCCTTCTTGGTCTTGGAGCATAGTGTAATCTCCGGC
CTGGTCTTCCATTGTGTCAAACTCCTGGCGGGGTTCAGCCATGCTGCTTCAAAGCCTGATAATCGACAGG
AGGCGAGGACAGAAGAGGACAGCGGAGGGGAAGGTGGTTGTGGCGGCGGCGACAGCAGAAGGTGGGCGGT
配列番号11
>予想されるXM_005624183.3:イヌ(Canis lupus familiaris)微小管関連タンパク質タウ(MAPT)、転写物変異体X23、mRNA
CGCGCTCGCGCTCTCAGCCACCCACCAGCTCCCGCACCAGCAGCAGCAGCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC
CGCCGCCGCCCACCTTCTGCTGCCGCCACCACAGCCACTTTCTCCTCTTTCCTCTCCTGTCCTCGCCCTC
TGTCGACTATCAGGTGGGCCTTGACCTAGGATGGCTGAGCCCCGCCAGGAGTTCACTGTGATGGAAGATC
ATGCTGGGACATACGGGAAAGATCTCCCCTCTCAGGGGGGCTACACCCTGCTGCAAGACCATGAGGGGGA
CGTGGATCACGGCCTGAAAGCTGAAGAAGCAGGCATTGGAGACACCCCCAACCTGGAAGACCAAGCTGCT
GGACATGTGACTCAAGCTCGCATGGTCAGTAAAGGCAAAGATGGGACTGGAACCGATGACAAAAAAGCCA
AGGGGGCTGATGGTAAAACTGGAACGAAGATCGCCACACCCCGGGGAGCGACCCCTTCAGGCCAGAAAGG
CCAGGCCAATGCCACCAGGATTCCAGCGAAAACCACGCCCTCCCCCAAGACCCCACCGGGCGGTGAATCT
GGAAAATCTGGGGATCGCAGTGGCTACAGCAGCCCCGGCTCCCCAGGCACTCCTGGCAGCCGCTCCCGCA
CCCCGTCCCTGCCAACCCCACCCACCCGGGAGCCCAAGAAGGTGGCGGTGGTCCGCACCCCACCCAAGTC
GCCGTCTGCAGCCAAGAGTCGCCTGCAGACCGCCCCTGTGCCCATGCCAGACCTAAAGAACGTCAGATCC
AAGATCGGCTCCACTGAAAACCTGAAGCACCAGCCAGGAGGTGGGAAGGTGCAAATAGTGTACAAACCAG
TGGATCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGCGGCTCATTAGGCAACATCCATCATAAGCCAGGAGGCGGTCA
GGTGGAAGTCAAATCTGAGAAGCTGGACTTCAAGGACAGAGTCCAGTCGAAGATCGGGTCCCTGGACAAC
ATCACCCACGTCCCTGGCGGAGGGAATAAAAAGATCGAAACCCACAAGCTGACCTTCCGTGAGAACGCCA
AAGCCAAGACCGACCACGGGGCGGAGATCGTGTACAAGTCGCCCGTGGTGTCCGGGGACACGTCTCCGCG
GCACCTGAGCAACGTGTCCTCCACGGGCAGCATCGACATGGTCGACTCGCCCCAGCTCGCCACGCTAGCC
GACGAAGTGTCCGCCTCCCTGGCCAAGCAGGGTTTGTGATCAGGCCCCCGGGGCGGTCAATGATCGTGGA
GAGAAGAGAGTGTGGAAAAAAAAAGAATAATGATCTGGCCCTTCTCGCCCTCTGCCCTCCCCCAGCTGCT
CCTCACAGACCGGTTAATCGGTTAATCACTTAACCTGCTTTTGTCGCTCGGCTCTGGCTCGGGACTTCAA
AATCAGTGACGGGAAAAAGCAAATTTCATCTTTCCAAATTGATGGGTGGGCTAATAATAATAAAATATTT
TTAAAACCATTTAAAAA
配列番号12
>配列番号11の逆相補物
TTTTTAAATGGTTTTAA
AAATATTTTATTATTATTAGCCCACCCATCAATTTGGAAAGATGAAATTTGCTTTTTCCCGTCACTGATT
TTGAAGTCCCGAGCCAGAGCCGAGCGACAAAAGCAGGTTAAGTGATTAACCGATTAACCGGTCTGTGAGG
AGCAGCTGGGGGAGGGCAGAGGGCGAGAAGGGCCAGATCATTATTCTTTTTTTTTCCACACTCTCTTCTC
TCCACGATCATTGACCGCCCCGGGGGCCTGATCACAAACCCTGCTTGGCCAGGGAGGCGGACACTTCGTC
GGCTAGCGTGGCGAGCTGGGGCGAGTCGACCATGTCGATGCTGCCCGTGGAGGACACGTTGCTCAGGTGC
CGCGGAGACGTGTCCCCGGACACCACGGGCGACTTGTACACGATCTCCGCCCCGTGGTCGGTCTTGGCTT
TGGCGTTCTCACGGAAGGTCAGCTTGTGGGTTTCGATCTTTTTATTCCCTCCGCCAGGGACGTGGGTGAT
GTTGTCCAGGGACCCGATCTTCGACTGGACTCTGTCCTTGAAGTCCAGCTTCTCAGATTTGACTTCCACC
TGACCGCCTCCTGGCTTATGATGGATGTTGCCTAATGAGCCGCACTTGGAGGTCACCTTGCTCAGATCCA
CTGGTTTGTACACTATTTGCACCTTCCCACCTCCTGGCTGGTGCTTCAGGTTTTCAGTGGAGCCGATCTT
GGATCTGACGTTCTTTAGGTCTGGCATGGGCACAGGGGCGGTCTGCAGGCGACTCTTGGCTGCAGACGGC
GACTTGGGTGGGGTGCGGACCACCGCCACCTTCTTGGGCTCCCGGGTGGGTGGGGTTGGCAGGGACGGGG
TGCGGGAGCGGCTGCCAGGAGTGCCTGGGGAGCCGGGGCTGCTGTAGCCACTGCGATCCCCAGATTTTCC
AGATTCACCGCCCGGTGGGGTCTTGGGGGAGGGCGTGGTTTTCGCTGGAATCCTGGTGGCATTGGCCTGG
CCTTTCTGGCCTGAAGGGGTCGCTCCCCGGGGTGTGGCGATCTTCGTTCCAGTTTTACCATCAGCCCCCT
TGGCTTTTTTGTCATCGGTTCCAGTCCCATCTTTGCCTTTACTGACCATGCGAGCTTGAGTCACATGTCC
AGCAGCTTGGTCTTCCAGGTTGGGGGTGTCTCCAATGCCTGCTTCTTCAGCTTTCAGGCCGTGATCCACG
TCCCCCTCATGGTCTTGCAGCAGGGTGTAGCCCCCCTGAGAGGGGAGATCTTTCCCGTATGTCCCAGCAT
GATCTTCCATCACAGTGAACTCCTGGCGGGGCTCAGCCATCCTAGGTCAAGGCCCACCTGATAGTCGACA
GAGGGCGAGGACAGGAGAGGAAAGAGGAGAAAGTGGCTGTGGTGGCGGCAGCAGAAGGTGGGCGGCGGCG
GCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGCTGCTGCTGCTGGTGCGGGAGCTGGTGGGTGGCTGAGAGCGCGAGCGCG
配列番号1533
>MAPT(NM_005910)エクソン10
GTGCAAATAGTCTACAAACCAGTTGACCTGAGCAAGGTGACCTCCAAGTGTGGCTCATTA
GGCAACATCCATCATAAACCAG
Claims (122)
- MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は、配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤。 - MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤。 - MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、表3~8および16~28のいずれか1つに記載のアンチセンスヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤。 - センス鎖が、配列番号3のヌクレオチド512~532、513~533、514~534、515~535、516~536、517~537、518~538、519~539、520~540、1063~1083、1067~1087、1072~1092、1074~1094、1075~1095、1125~1145、1126~1146、1127~1147、1129~1149、1170~1190、1395~1415、1905~1925、1906~1926、1909~1929、1911~1931、1912~1932、1913~1933、1914~1934、1915~1935、1916~1936、1919~1939、1951~1971、1954~1974、1958~1978、2387~2407、2409~2429、2410~2430、2469~2489、2471~2491、2472~2492、2476~2496、2477~2497、2478~2498、2480~2500、2481~2501、2482~2502、2484~2504、2762~2782、2764~2784、2766~2786、2767~2787、2768~2788、2769~2789、2819~2839、2821~2841、2828~2848、2943~2963、2944~2964、2946~2966、2947~2967、3252~3272、3277~3297、3280~3300、3281~3301、3282~3302、3284~3304、3285~3305、3286~3306、3331~3351、3332~3352、3333~3353、3334~3354、3335~3355、3336~3356、3338~3358、3340~3360、3342~3362、3343~3363、3344~3364、3345~3365、3346~3366、3347~3367、3349~3369、3350~3370、3353~3373、3364~3384、3366~3386、3367~3387、3368~3388、3369~3389、3370~3390、3412~3432、3414~3434、3415~3435、3416~3436、3417~3437、3419~3439、3420~3440、3424~3444、3425~3445、3426~3446、3427~3447、3428~3448、3429~3449、3430~3450、3431~3451、3434~3454、4132~4152、4134~4154、4179~4199、4182~4202、4184~4204、4395~4415、4425~4445、4426~4446、4429~4449、4469~4489、4470~4490、4471~4491、4472~4492、4473~4493、4474~4494、4569~4589、4571~4591、4572~4592、4596~4616、4623~4643、4721~4741、4722~4742、4725~4745、4726~4746、4766~4786、4767~4787、4768~4788、4769~4789、4770~4790、4779~4799、4805~4825、4806~4826、4807~4827、4808~4828、4809~4829、4812~4832、4813~4833、4814~4834、4936~4956、5072~5092、5073~5093、5345~5365、5346~5366、5349~5369、5350~5370、5351~5371、5460~5480、5461~5481、5463~5483、5465~5485、5467~5487、5468~5488、5469~5489、5470~5490、5471~5491、5505~5525、5506~5526、5507~5527、5508~5528、5509~5529、5511~5531、5513~5533、5514~5534、5541~5561、5544~5564、5546~5566、5547~5567、5548~5568、5550~5570、5551~5571、5574~5594、5576~5596、5614~5634、521~541、522~542、523~543、524~544、525~545、526~546、527~547、528~548、529~549、530~550、531~551、532~552、533~553、534~554、535~555、536~556、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、1044~1064、1045~1065、1046~1066、1047~1067、1048~1068、1049~1069、1050~1070、1051~1071、1052~1072、1053~1073、1054~1074、1062~1082、1064~1084、1065~1085、1066~1086、1068~1088、1069~1089、1070~1090、1071~1091、1073~1093、1076~1096、1077~1097、1078~1098、1079~1099、1080~1100、1081~1101、1082~1102、1128~1148、1129~1149、1130~1150、1131~1151、1132~1152、1133~1153、1134~1154、1135~1155、1136~1156、1137~1157、1138~1158、1139~1159、1140~1160、1141~1161、1142~1162、1143~1163、1144~1164、1145~1165、1146~1166、1147~1167、1148~1168、975~995、976~996、977~997、978~998、979~999、980~1000、981~1001、982~1002、983~1003、984~1004、985~1005、986~1006、987~1007、988~1008、989~1009、990~1010、991~1011、992~1012、993~1013、994~1014、995~1015、996~1016、997~1017、998~1018、999~1019、1000~1020、1001~1021、1002~1022、1003~1023、1004~1024、1005~1025、1006~1026、1007~1027、1008~1028、1009~1029、1010~1030、1011~1031、1012~1032、1013~1033、1014~1034、1015~1035、1016~1036、1017~1037、1018~1038、1019~1039、1020~1040、1021~1041、1022~1042、1023~1043、1024~1044、1025~1045、1026~1046、1027~1047、1028~1048、1029~1049、1030~1050、1031~1051、1032~1052、1033~1053、1034~1054、1035~1055、1036~1056、1037~1057、1038~1058、1039~1059、1040~1060、1041~1061、1042~1062、1043~1063、および1045~1065のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- センス鎖が、配列番号3のヌクレオチド520~541、520~556、510~534、512~536、516~541、516~540、520~544、524~547、526~551、529~556、532~556、1065~1089、1068~1095、1068~1094、1075~1100、1076~1100、1079~1103、1123~1147、1127~1151、1130~1155、1903~1934、1903~1930、1914~1940、1949~1975、2470~2497、2941~2965、3275~3302、3278~3302、3329~3353、3333~3357、3338~3367、3338~3366、3348~3390、3348~3388、3351~3385、5507~5562、および5549~5597のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号4の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- センス鎖が、配列番号1のヌクレオチド977~997、980~1000、973~993、988~1008、987~1007、972~992、979~999、1001~1021、976~996、994~1014、1002~1022、978~998、974~994、520~540、521~541、5464~5484、1813~1833、2378~2398、3242~3262、5442~5462、1665~1685、524~544、5207~5227、4670~4690、3420~3440、3328~3348、5409~5429、5439~5459、4527~4547、5441~5461、5410~5430、および5446~5466のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号2の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- アンチセンス鎖が、AD-523799.1、AD-523802.1、AD-523795.1、AD-523810.1、AD-523809.1、AD-1019331.1、AD-523801.1、AD-523823.1、AD-523798.1、AD-523816.1、AD-523824.1、AD-523800.1、AD-523796.1、AD-535094.1、AD-535094.1、AD-535095.1、AD-538647.1、AD-535922.1、AD-536317.1、AD-536911.1、AD-538626.1、AD-535864.1、AD-523561.1、AD-523565.1、AD-523562.1、AD-526914.1、AD-526394.1、AD-395452.1、AD-525343.1、AD-524274.1、AD-526956.1、AD-526986.1、AD-526296.1、AD-526988.1、AD-526957.1、AD-526993.1、AD-1397070.1、AD-1397070.2、AD-1397071.1、AD-1397071.2、AD-1397072.1、AD-1397072.2、AD-1397073.1、AD-1397073.2、AD-1397074.1、AD-1397074.2、AD-1397075.1、AD-1397075.2、AD-1397076.1、AD-1397076.2、AD-1397077.1、AD-1397077.2、AD-1397078.1、AD-1397078.2、AD-1397250.1、AD-1397251.1、AD-1397252.1、AD-1397253.1、AD-1397254.1、AD-1397255.1、AD-1397256.1、AD-1397257.1、AD-1397258.1、AD-1397259.1、AD-1397260.1、AD-1397261.1、AD-1397262.1、AD-1397263.1、AD-1397264.1、AD-1397265.1、AD-1423242.1、AD-1423243.1、AD-1423244.1、AD-1423245.1、AD-1423246.1、AD-1423247.1、AD-1423248.1、AD-1423249.1、AD-1423250.1、AD-1423251.1、AD-1423252.1、AD-1423253.1、AD-1423254.1、AD-1423255.1、AD-1423256.1、AD-1423257.1、AD-1423258.1、AD-1423259.1、AD-1423260.1、AD-1423261.1、AD-1423262.1、AD-1423263.1、AD-1423264.1、AD-1423265.1、AD-1423266.1、AD-1423267.1、AD-1423268.1、AD-1423269.1、AD-1423270.1、AD-1423271.1、AD-1423272.1、AD-1423273.1、AD-1423274.1、AD-1423275.1、AD-1423276.1、AD-1423277.1、AD-1423278.1、AD-1423279.1、AD-1423280.1、AD-1423281.1、AD-1423282.1、AD-1423283.1、AD-1423284.1、AD-1423285.1、AD-1423286.1、AD-1423287.1、AD-1423288.1、AD-1423289.1、AD-1423290.1、AD-1423291.1、AD-1423292.1、AD-1423293.1、AD-1423294.1、AD-1423295.1、AD-1423296.1、AD-1423297.1、AD-1423298.1、AD-1423299.1、AD-1423300.1、AD-1397266.1、AD-1397266.2、AD-1397267.1、AD-1423301.1、AD-1397268.1、AD-1397268.2、AD-1397269.1、AD-1423302.1、AD-1397270.1、AD-1397270.2、AD-1397271.1、AD-1397271.2、AD-1397272.1、AD-1423303.1、AD-1397273.1、AD-1423304.1、AD-1397274.1、AD-1423305.1、AD-1397275.1、AD-1423306.1、AD-1397276.1、AD-1397277.1、AD-1397277.2、AD-1397278.1、AD-1397279.1、AD-1397280.1、AD-1397281.1、AD-1397282.1、AD-1397283.1、AD-1397284.1、AD-1397285.1、AD-1397286.1、AD-1397287.1、AD-1397079.1、AD-1397079.2、AD-1397288.1、AD-1397289.1、AD-1397290.1、AD-1397080.1、AD-1397080.2、AD-1397291.1、AD-1397292.1、AD-1397293.1、AD-1397294.1、AD-1397081.1、AD-1397081.2、AD-1397295.1、AD-1397082.1、AD-1397082.2、AD-1397083.1、AD-1397083.2、AD-1397296.1、AD-1397297.1、AD-1397298.1、AD-1397299.1、AD-1397300.1、AD-1397301.1、AD-1397302.1、AD-1397084.1、AD-1397085.1、AD-1397086.1、AD-1397303.1、AD-1397087.1、AD-1397087.2、AD-1397304.1、AD-1397305.1、AD-1397306.1、AD-1397307.1、AD-1397308.1、AD-1397309.1、AD-1397310.1、AD-1397311.1、AD-1397312.1、AD-1397313.1、AD-1397314.1、AD-1397315.1、AD-1397316.1、AD-1397317.1、AD-1397318.1、AD-1397319.1、AD-1397320.1、AD-1397321.1、AD-1397322.1、AD-1397088.1、AD-1397089.1、AD-1397090.1、AD-1397091.1、AD-1397092.1、AD-1397093.1、AD-1397094.1、AD-1397095.1、AD-1397096.1、AD-1397097.1、AD-1397098.1、AD-1397099.1、AD-1397101.1、AD-1397102.1、AD-1397103.1、AD-1397104.1、AD-1397105.1、AD-1397106.1、AD-1397107.1、AD-1397108.1、AD-1397109.1、AD-1397110.1、AD-1397111.1、AD-1397112.1、AD-1397113.1、AD-1397114.1、AD-1397115.1、AD-1397116.1、AD-1397117.1、AD-1397118.1、AD-1397119.1、AD-1397120.1、AD-1397121.1、AD-1397122.1、AD-1397123.1、AD-1397124.1、AD-1397125.1、AD-1397126.1、AD-1397127.1、AD-1397128.1、AD-1397129.1、AD-1397130.1、AD-1397131.1、AD-1397132.1、AD-1397133.1、AD-1397134.1、AD-1397135.1、AD-1397136.1、AD-1397137.1、AD-1397138.1、AD-1397139.1、AD-1397140.1、AD-1397141.1、AD-1397142.1、AD-1397143.1、AD-1397144.1、AD-1397145.1、AD-1397146.1、AD-1397147.1、AD-1397148.1、AD-1397149.1、AD-1397150.1、AD-1397151.1、AD-1397152.1、AD-1397153.1、AD-1397154.1、AD-1397155.1、AD-1397156.1、AD-1397157.1、AD-1397158.1、AD-1397159.1、AD-1397160.1、AD-1397161.1、AD-1397162.1、AD-1397163.1、AD-1397164.1、AD-1397165.1、AD-1397166.1、AD-1397167.1、AD-1397168.1、AD-1397169.1、AD-1397170.1、AD-1397171.1、AD-1397172.1、AD-1397173.1、AD-1397174.1、AD-1397175.1、AD-1397176.1、AD-1397177.1、AD-1397178.1、AD-1397179.1、AD-1397180.1、AD-1397181.1、AD-1397182.1、AD-1397183.1、AD-1397184.1、AD-1397185.1、AD-1397186.1、AD-1397187.1、AD-1397188.1、AD-1397189.1、AD-1397190.1、AD-1397191.1、AD-1397192.1、AD-1397193.1、AD-1397194.1、AD-1397195.1、AD-1397196.1、AD-1397197.1、AD-1397198.1、AD-1397199.1、AD-1397200.1、AD-1397201.1、AD-1397202.1、AD-1397203.1、AD-1397204.1、AD-1397205.1、AD-1397206.1、AD-1397207.1、AD-1397208.1、AD-1397209.1、AD-1397210.1、AD-1397211.1、AD-1397212.1、AD-1397213.1、AD-1397214.1、AD-1397215.1、AD-1397216.1、AD-1397217.1、AD-1397218.1、AD-1397219.1、AD-1397220.1、AD-1397221.1、AD-1397222.1、AD-1397223.1、AD-1397224.1、AD-1397225.1、AD-1397226.1、AD-1397227.1、AD-1397228.1、AD-1397229.1、AD-1397230.1、AD-1397231.1、AD-1397232.1、AD-1397233.1、AD-1397234.1、AD-1397235.1、AD-1397236.1、AD-1397237.1、AD-1397238.1、AD-1397239.1、AD-1397240.1、AD-1397241.1、AD-1397242.1、AD-1397243.1、AD-1397244.1、AD-1397245.1、AD-1397246.1、AD-1397247.1、AD-1397248.1、AD-1397249.1、AD-523565.1、AD-1397072.3、AD-1397073.3、AD-1397076.3、AD-1397077.3、AD-1397078.3、AD-1397252.2、AD-1397257.2、AD-1397258.2、AD-1397259.2、AD-1397263.2、AD-1397264.2、AD-1397309.2、AD-64958.114、AD-393758.4、AD-1397080.3、AD-1397293.2、AD-1397294.2、AD-1397081.3、AD-1397083.3、AD-1397298.2、AD-1397299.2、AD-1397084.2、
AD-1397085.2、AD-1397087.3、AD-1397306.2、AD-1397307.2、AD-1397308.2、AD-1397088.2、AD-1566238、AD-1566239、AD-1566240、AD-1566241、AD-1566242、AD-1566243、AD-1566244、AD-1566245、AD-1566246、AD-1091965、AD-1566248、AD-1566249、AD-1566250、AD-1091966、AD-1566251、AD-1566252、AD-1566253、AD-1566254、AD-1566255、AD-1566256、AD-1566257、AD-1566258、AD-1566259、AD-692906、AD-1566575、AD-1566576、AD-1566577、AD-1566580、AD-1566581、AD-1566582、AD-1566583、AD-1566584、AD-1566586、AD-1566587、AD-1566588、AD-1566590、AD-1566591、AD-1566634、AD-1566635、AD-1566638、AD-1566639、AD-1566641、AD-1566642、AD-1566643、AD-1566679、AD-1566861、AD-1567153、AD-1567154、AD-1567157、AD-1567159、AD-1567160、AD-1567161、AD-1567164、AD-1567167、AD-1567199、AD-1567202、AD-1567550、AD-1567554、AD-1567784、AD-1567896、AD-1567897、AD-1568105、AD-1568108、AD-1568109、AD-1568139、AD-1568140、AD-1568143、AD-1568144、AD-1568148、AD-1568150、AD-1568151、AD-1568152、AD-1568153、AD-1568154、AD-1568158、AD-1568161、AD-1568172、AD-1568174、AD-1568175、AD-692908、AD-1568176、AD-1569830、AD-1569832、AD-1569834、AD-1569835、AD-1569862、AD-1569872、AD-1569890およびAD-1569892からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項1~6のいずれか一項に記載のdsRNA剤。 - センスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列が、表3~8および16~28のいずれか1つに記載のセンスおよびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つを含む、請求項1または2に記載のdsRNA剤。
- センス鎖のヌクレオチド配列が、配列番号1533において説明されるMAPT遺伝子エクソン10のセンス鎖配列に対応する少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖がそれに対して相補的な配列を含む、請求項1または2に記載のdsRNA剤。
- MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は、配列番号5のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号6のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤。 - MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、配列番号6のヌクレオチド配列と3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤。 - MAPTの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)剤であって、dsRNA剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
アンチセンス鎖は、タウをコードするmRNAに対して相補性の領域を含み、相補性の領域は、表12~13のいずれか1つに記載のアンチセンスヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、dsRNA剤。 - センス鎖が、配列番号5のヌクレオチド1065~1085、1195~1215、1066~1086、1068~1088、705~725、1067~1087、4520~4540、3341~3361、4515~4535、5284~5304、5285~5305、344~364、5283~5303、5354~5374、2459~2479、1061~1081、706~726、972~992、4564~4584、995~1015、4546~4566、968~988、1127~1147、4534~4554、158~178、4494~4514、1691~1711、3544~3564、198~218、979~999、4548~4568、4551~4571、543~563、715~735、542~562、352~372、362~382、4556~4576、4547~4567、4542~4562、4558~4578、4549~4569、5074~5094、4552~4572、5073~5093、5076~5096、4550~4570、および2753~2773のヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が、配列番号6の対応するヌクレオチド配列からの少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項10~12のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- アンチセンス鎖が、AD-393758.1、AD-393888.1、AD-393759.1、AD-393761.1、AD-393495.1、AD-393760.1、AD-396425.1、AD-395441.1、AD-396420.1、AD-397103.1、AD-397104.1、AD-393239.1、AD-397102.1、AD-397167.1、AD-394791.1、AD-393754.1、AD-393496.1、AD-393667.1、AD-396467.1、AD-393690.1、AD-396449.1、AD-393663.1、AD-393820.1、AD-396437.1、AD-393084.1、AD-396401.1、AD-394296.1、AD-395574.1、AD-393124.1、AD-393674.1、AD-396451.1、AD-396454.1、AD-393376.1、AD-393505.1、AD-393375.1、AD-393247.1、AD-393257.1、AD-396459.1、AD-396450.1、AD-396445.1、AD-396461.1、AD-396452.1、AD-396913.1、AD-396455.1、AD-396912.1、AD-396915.1、AD-396453.1およびAD-394991.1からなる群から選択される二重鎖のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列のいずれか1つと3個以下のヌクレオチドが異なる少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む、請求項10~13のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方が、1つまたは複数の親油性部分にコンジュゲートしている、請求項1~14のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、dsRNA剤の二本鎖領域中の1つまたは複数の内部位置にコンジュゲートしている、請求項15に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートしている、請求項15または16に記載のdsRNA剤。
- logKowによって測定された親油性部分の親油性が、0を超える、請求項15~17のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖RNAi剤の血漿タンパク質結合アッセイにおいて未結合画分によって測定される二本鎖RNAi剤の疎水性が、0.2を超える、請求項1~18のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである、請求項19に記載のdsRNA剤。
- dsRNA剤が、少なくとも1つの修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1~20のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- センス鎖ヌクレオチドの5個以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの5個以下が、修飾されていないヌクレオチドである、請求項21に記載のdsRNA剤。
- センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが、修飾されたヌクレオチドである、請求項21に記載のdsRNA剤。
- 修飾されたヌクレオチドの少なくとも1つが、デオキシヌクレオチド、3’末端デオキシチミジン(dT)ヌクレオチド、2’-O-メチル修飾されたヌクレオチド、2’-フルオロ修飾されたヌクレオチド、2’-デオキシ修飾されたヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、非ロックドヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ変性ヌクレオチド、2’-O-アリル修飾されたヌクレオチド、2’-C-アルキル修飾されたヌクレオチド、2’-ヒドロキシル(hydroxly)修飾されたヌクレオチド、2’-メトキシエチル修飾されたヌクレオチド、2’-O-アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾されたヌクレオチド、1,5-アンヒドロヘキシトール修飾されたヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾されたヌクレオチド、5’-ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’-メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’リン酸または5’リン酸ミミックを含むヌクレオチド、ビニルホスホネートを含むヌクレオチド、アデノシン-グリコール核酸(GNA)を含むヌクレオチド、チミジン-グリコール核酸(GNA)S-異性体を含むヌクレオチド、2-ヒドロキシメチル-テトラヒドロフラン-5-ホスフェートを含むヌクレオチド、2’-デオキシチミジン-3’ホスフェートを含むヌクレオチド、2’-デオキシグアノシン-3’-ホスフェートを含むヌクレオチド、ならびにコレステリル誘導体およびドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチド;ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項21~23のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 修飾されたヌクレオチドが、2’-デオキシ-2’-フルオロ修飾されたヌクレオチド、2’-デオキシ修飾されたヌクレオチド、3’末端デオキシチミジンヌクレオチド(dT)、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’-アミノ変性ヌクレオチド、2’-アルキル修飾されたヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項24に記載のdsRNA剤。
- 修飾されたヌクレオチドが、3’末端デオキシチミジンヌクレオチド(dT)の短い配列を含む、請求項24に記載のdsRNA剤。
- ヌクレオチドへの修飾が、2’-O-メチル、GNAおよび2’フルオロ修飾である、請求項24に記載のdsRNA剤。
- 少なくとも1つのホスホロチオエートインターヌクレオチド連結をさらに含む、請求項1~27のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 6~8個のホスホロチオエートインターヌクレオチド連結を含む、請求項28に記載のdsRNA剤。
- 各鎖が、30個以下のヌクレオチドの長さである、請求項1~29のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 少なくとも1つの鎖が、少なくとも1ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1~30のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 少なくとも1つの鎖が、少なくとも2ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1~31のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域が、15~30ヌクレオチド対の長さである、請求項1~32のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域が、17~23ヌクレオチド対の長さである、請求項33に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域が、17~25ヌクレオチド対の長さである、請求項33に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域が、23~27ヌクレオチド対の長さである、請求項33に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域が、19~21ヌクレオチド対の長さである、請求項33に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域が、21~23ヌクレオチド対の長さである、請求項33に記載のdsRNA剤。
- 各鎖が、19~30ヌクレオチドを有する、請求項1~38のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 各鎖が、19~23ヌクレオチドを有する、請求項1~37のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 各鎖が、21~23ヌクレオチドを有する、請求項1~38のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 1つまたは複数の親油性部分が、少なくとも1つの鎖における1つまたは複数の内部位置にコンジュゲートしている、請求項16~41のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 1つまたは複数の親油性部分が、リンカーまたは担体を介して少なくとも1つの鎖における1つまたは複数の内部位置にコンジュゲートされる、請求項42に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、少なくとも1つの鎖の各端から末端の2つの位置を除く全ての位置を含む、請求項43に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、少なくとも1つの鎖の各端から末端の3つの位置を除く全ての位置を含む、請求項43に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、センス鎖の切断部位領域を除く、請求項43~45のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、センス鎖の5’端から数えて位置9~12を除く全ての位置を含む、請求項46に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、センス鎖の3’端から数えて位置11~13を除く全ての位置を含む、請求項46に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、請求項43~45のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、アンチセンス鎖の5’端から数えて位置12~14を除く全ての位置を含む、請求項49に記載のdsRNA剤。
- 内部位置が、3’端から数えて位置11~13および5’端から数えて位置12~14を除く全ての位置を含む、請求項43~45のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 1つまたは複数の親油性部分が、各鎖の5’末端から数えて、センス鎖における4~8位および13~18位、ならびにアンチセンス鎖における6~10位および15~18位からなる群から選択される内部位置の1つまたは複数にコンジュゲートしている、請求項16~51のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 1つまたは複数の親油性部分が、各鎖の5’末端から数えて、センス鎖における5、6、7、15、および17位、ならびにアンチセンス鎖における15および17位からなる群から選択される内部位置の1つまたは複数にコンジュゲートしている、請求項52に記載のdsRNA剤。
- 二本鎖領域中の内部位置が、センス鎖の切断部位領域を排除している、請求項16に記載のdsRNA剤。
- センス鎖が、21ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖が、23ヌクレオチド長であり、親油性部分が、センス鎖の位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6、もしくは位置2またはアンチセンス鎖の位置16にコンジュゲートされる、請求項15~54のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、センス鎖の21位、20位、15位、1位、または7位にコンジュゲートしている、請求項55に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、センス鎖の21位、20位、または15位にコンジュゲートしている、請求項55に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、センス鎖の20位または15位にコンジュゲートしている、請求項55に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、アンチセンス鎖の16位にコンジュゲートしている、請求項55に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である、請求項15~59のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、1,3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される、請求項60に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、飽和または不飽和C4~C30炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される適宜の官能基とを含有する、請求項60に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、飽和または不飽和C6~C18炭化水素鎖を含有する、請求項62に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、飽和または不飽和C16炭化水素鎖を含有する、請求項62に記載のdsRNA剤。
- 飽和または不飽和C16炭化水素鎖が、鎖の5’端から数えて位置6にコンジュゲートされる、請求項64に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、内部位置または二本鎖領域における1つまたは複数のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる、請求項15~65のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環状基であるか、あるいはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格に基づく非環状部分である、請求項66に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド-チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖iRNA剤にコンジュゲートされる、請求項15~65のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる、請求項15~68のいずれか一項に記載の二本鎖iRNA剤。
- 親油性部分または標的化リガンドが、DNA、RNA、ジスルフィド、アミド、ガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、およびそれらの組合せからなる群から選択される生物切断性リンカーを介してコンジュゲートされる、請求項15~69のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- センス鎖の3’端が、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、前記環状基が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、[1,3]ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される、請求項15~70のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 神経細胞を標的化する標的化リガンドをさらに含む、請求項15~69のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 肝臓細胞を標的化する標的化リガンドをさらに含む、請求項15~69のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 標的化リガンドが、GalNAcコンジュゲートである、請求項73に記載のdsRNA剤。
- Sp立体配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’末端における第1のインターヌクレオチド連結に存在する末端のキラル修飾、Rp立体配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’末端における第1のインターヌクレオチド連結に存在する末端のキラル修飾、およびRp立体配置またはSp立体配置のいずれかで連結リン原子を有する、センス鎖の5’末端における第1のインターヌクレオチド連結に存在する末端のキラル修飾をさらに含む、請求項1~74のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
RpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、請求項1~74のいずれか一項に記載のdsRNA剤。 - Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1、第2、および第3のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
RpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる、末端キラル修飾
をさらに含む、請求項1~74のいずれか一項に記載のdsRNA剤。 - Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第3のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
RpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、請求項1~74のいずれか一項に記載のdsRNA剤。 - Sp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の3’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
Rp立体配置において連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の5’端における第1および第2のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾、および
RpまたはSp立体配置のどちらかにおいて連結リン原子を有する、センス鎖の5’端における第1のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾
をさらに含む、請求項1~74のいずれか一項に記載のdsRNA剤。 - アンチセンス鎖の5’端におけるホスフェートまたはホスフェート模倣物をさらに含む、請求項1~79のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- ホスフェート模倣物が、5’-ビニルホスホネート(VP)である、請求項80に記載のdsRNA剤。
- 二重鎖のアンチセンス鎖の5’端の1つの位置における塩基対が、AU塩基対である、請求項1~79のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- センス鎖が、合計21ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖が、合計23ヌクレオチドを有する、請求項1~79のいずれか一項に記載のdsRNA剤。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤を含有する細胞。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤を含む、MAPTをコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤と脂質製剤とを含む医薬組成物。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤を含む、エクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害するための医薬組成物。
- dsRNA剤が、緩衝化されていない溶液中である、請求項85~87のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 緩衝化されていない溶液が、生理食塩水または水である、請求項88に記載の医薬組成物。
- 前記dsRNA剤が、緩衝溶液中である、請求項85~87のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 緩衝溶液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらのあらゆる組合せを含む、請求項90に記載の医薬組成物。
- 緩衝溶液が、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、請求項90に記載の医薬組成物。
- 細胞におけるMAPT遺伝子の発現を阻害する方法であって、細胞を、請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させること、それによって細胞におけるMAPT遺伝子の発現を阻害することを含む、方法。
- 細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に阻害する方法であって、細胞を、請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させること、それによって細胞におけるエクソン10含有MAPT転写物を選択的に分解することを含む、方法。
- 細胞が、対象内にある、請求項94に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項95に記載の方法。
- 対象が、MAPT関連障害を有する、請求項96に記載の方法。
- MAPT関連障害が神経変性障害である、請求項97に記載の方法。
- 神経変性障害が、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連する、請求項98に記載の方法。
- MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常が、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす、請求項99に記載の方法。
- 神経変性障害が家族性障害である、請求項99に記載の方法。
- 神経変性障害が孤発性障害である、請求項99に記載の方法。
- 障害が、タウオパチー、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)からなる群から選択される、請求項97に記載の方法。
- 細胞をdsRNA剤と接触させることが、MAPTの発現を少なくとも25%阻害する、請求項93~103のいずれか一項に記載の方法。
- MAPTの発現を阻害することが、対象の血清中のタウタンパク質レベルを少なくとも25%減少させる、請求項93~103のいずれか一項に記載の方法。
- MAPT遺伝子発現の低減が有益であろう障害を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与すること、それによってMAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象を処置することを含む、方法。
- MAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象における少なくとも1つの症状を防止する方法であって、予防有効量の請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与すること、それによってMAPT発現の低減が有益であろう障害を有する対象における少なくとも1つの症状を防止することを含む、方法。
- 障害が、MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常に関連する、請求項106または107に記載の方法。
- MAPT遺伝子にコードされるタンパク質タウの異常が、対象の脳内でのタウの凝集を引き起こす、請求項108に記載の方法。
- 障害が、タウオパチー、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、行動障害型前頭側頭型認知症(bvFTD)、非流暢性亜型原発性進行性失語(nfvPPA)、意味型原発性進行性失語(PPA-S)、ロゴペニック型原発性進行性失語(PPA-L)、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、ピック病(PiD)、嗜銀顆粒病(AGD)、初老期認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(GGIを伴うFTLD)、MAPT突然変異を伴うFTLD、神経原線維変化(NFT)認知症、運動ニューロン疾患を伴うFTD、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、皮質基底核症候群(CBS)、皮質基底核変性症(CBD)、進行性核上性麻痺(PSP)、パーキンソン病、脳炎後パーキンソニズム、ニーマン・ピック病、ハンチントン病、筋強直性ジストロフィー1型、およびダウン症候群(DS)からなる群から選択される、請求項108に記載の方法。
- 対象が、ヒトである、請求項107~110のいずれか一項に記載の方法。
- dsRNA剤、または医薬組成物の投与が、対象の脳内でのタウの凝集の減少をもたらす、請求項111に記載の方法。
- dsRNA剤が、約0.01mg/kgから約50mg/kgの用量において対象に投与される、請求項106~112のいずれか一項に記載の方法。
- dsRNA剤が、対象に髄腔内投与される、請求項106~113のいずれか一項に記載の方法。
- dsRNA剤が、対象に大槽内投与される、請求項106~113のいずれか一項に記載の方法。
- 対象からの試料中のMAPTのレベルを決定することをさらに含む、請求項106~115のいずれか一項に記載の方法。
- 対象試料中のMAPTのレベルが、髄液試料中のタウタンパク質レベルである、請求項116に記載の方法。
- 追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む、請求項98~117のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むキット。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むバイアル。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物を含むシリンジ。
- 請求項1~83のいずれか一項に記載のdsRNA剤、または請求項85~92のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、髄腔内ポンプ。
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