ES2397302T3 - Oligonucleótido antisentido contra la isoforma R de la acetilcolinesterasa humana (ACHE-R) y sus usos - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido sintético antisentido dirigido contra el ARNm de AChE humano que tiene la secuencia denucleótidos: 5'CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3' (SEQ ID NO: 1), en la que dicho oligonucleótido antisentido suprime de formaselectiva la producción de la isoforma AChE-R.

Description

Oligonucleótido antisentido contra la isoforma R de la acetilcolinesterasa humana (ACHE-R) y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un oligonucleótido sintético antisentido dirigido al dominio común que codifica el ARNm de la acetilcolinesterasa (AChE), y a composiciones farmacéuticas o médicas que comprenden el mismo, particularmente para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo.

Antecedentes de la invención

Las uniones neuromusculares (UNM) están muy especializadas, son morfológicamente distintas, y comprenden sinapsis colinérgicas bien caracterizadas [Hall y Sanes (1993) Cell 72 Suppl., 99.121]. La discapacidad crónica de la actividad de las UNM induce trastornos neuromusculares caracterizados por un progresivo deterioro de la estructura y la función muscular. No se han elucidado los mecanismos moleculares y celulares que conducen, a partir de una actividad de la UNM comprometida, al debilitamiento del músculo.

Uno de dichos trastornos es la miastenia grave (MG), producida por un defecto en la transmisión neuromuscular mediada por autoanticuerpos que reducen drásticamente el número de receptores funcionales de la acetilcolina nicotínica del músculo post-sináptico. (AChR) [Drachman D.G. (1994) N. Engl. J. Med. 330, 1797-1810, Vincent A. (1999) Curr. Opin. Neurol. 12, 545-551]. MG se caracteriza por una debilidad muscular fluctuante que puede mejorarse transitoriamente mediante inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE) [Penn A.S. y Rowland L.P. (1995) Myasthenia Gravis En: Meritt’s Textbook of Neurology, 9ª Edición, Williams y Wilkins, Baltimore, sección XVII, 754-761]. La anormalidad electrodiagnóstica característica es un declive progresivo, rápido en la amplitud de los potenciales de acción muscular del compuesto (PAMC) evocados por una estimulación nerviosa repetitiva a 3 o 5 Hz. Hasta la fecha, el tratamiento normalizado para la MG incluye la terapia inmunosupresora combinada con la administración crónica de múltiples dosis diarias de inhibidores de la AChE periféricos tales como piridostigmina (Mestinon™). Aunque los inhibidores de la AChE restauran eficazmente el comportamiento muscular en los pacientes con MG, sus efectos son de corta duración, solicitándose el desarrollo de un tratamiento eficaz adicional.

La tecnología antisentido, ofrece una alternativa atractiva basada en los genes a los agentes terapéuticos convencionales de la acetilcolinesterasa. La tecnología antisentido aprovecha las reglas del emparejamiento de bases de Watson y Crick para diseñar oligonucleótidos cortos, de 15-25 restos de longitud, cuya secuencia es complementaria a la de un ARNm diana [Agrawal S. y Kandimalla E.R. (2000) Mol. Med. Today, 6, 72-81]. Los tramos de ARN bicatenario, resultantes de la hibridación del oligonucleótido antisentido (ASON) con su diana activan la ARNasa H [Crooke S.T. (2000) Methods Enzymol. 313, 3-45] y promueven la degradación específica del duplete de ARNm. Ya que el ARN terapéutico diana antisentido, más bien que las proteínas, ofrece el potencial para diseñar fármacos muy específicos con concentraciones eficaces en el intervalo nanomolar [Galyam N. y col. (2001) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 11, 51-57]. Los oligonucleótidos 2’-O-metilo antisentido, fosforotioados y protegidos en el extremo 3’ dirigidos al ARNm de la AChE de ratón demostraron ser eficaces en el bloqueo de la expresión de AChE in vitro en células de roedores y seres humanos cultivadas [Koenigsberger C. y col. (1997) J. Neurochem. 69, 1389-1397; documento WO 98/26062; Grisaru D. y col. (2001) Mol. Med. 7, 93-105], e in vivo en cerebro [Shohami E. y col. (2000) J. Mol. Med. 78, 278-236; Cohen y col. (2002) Molecular Psychiatry, en prensa], músculo [Lev-Lehman E. y col. (2000) J. Mol. Neurosci. 14, 93-105] y médula ósea [Grisaru y col. (2001) ibíd.].

Los inventores han observado recientemente que el tratamiento con diisopropilfluorofosfonato (DFP), inhibidor irreversible de la colinesterasa induce la expresión en exceso de una por lo demás rara, variante de corte y empalme no sináptica alternativa de la AChE, AChE-R, en el cerebro [Kaufer D. y col. (1998) Nature, 393, 373-377] y el intestino [Shapira M. y col. (2000) Hum. Mol. Genet. 9, 1273-1282]. Los músculos de los animales tratados con DPF, expresan en exceso también la AChE-R, acompañada por una ramificación exagerada de neuritas, fibras debilitadas desorganizadas y proliferación en la UNM. Los oligonucleótidos 2’-O-metilo antisentido parcialmente protegidos dirigidos al ARNm de la AChE de ratón suprimieron la regulación en exceso de la retroalimentación de la AChE y la proliferación mejorada de la UNM inducida por DFP [Lev-Lehman y col. (2000) ibíd.]. Estas observaciones demostraron que el estrés colinérgico estimula la expresión en exceso de la AChE-R en el músculo y que los oligonucleótidos antisentido pueden suprimir dicho exceso de AChE-R y evitar su resultado perjudicial.

Tal como se ha mencionado anteriormente, la anomalía característica del electrodiagnóstico es un declive progresivo, rápido en la amplitud de los potenciales de acción muscular evocados por una estimulación nerviosa repetitiva a 3 o 5 Hz. Esta fatiga miasténica está producida por la disminución en el número de moléculas de ACR disponible en el sitio post-sináptico. Los anticuerpos dirigidos contra AChR inhibidores están presentes en un 85 % a 90 % de los pacientes [Vincent, A. (1999) id ibíd].

Los pacientes con MG, pero no con miastenias congénitas debidas a otras causas [Triggs y col. (1992) Muscle Nerve 15, 267-72], muestran una respuesta clínica transitoria a los inhibidores de la AChE tales como edrofonio. Los fármacos anti-AChE disponibles están en primera línea de tratamiento, pero la mayoría de los pacientes requieren ayuda adicional.

Esto incluye drásticas medidas, tales como intercambio de plasma, timectomía e inmunosupresión. Desafortunadamente, todos los regímenes de fármacos contra la MG empleados actualmente están asociados a consecuencias a largo plazo perjudiciales. Estas incluyen perturbación de la transmisión neuromuscular, exacerbación e inducción de los síntomas de la MG. También, el uso seguro por lo demás de fármacos comunes tales como antiinfecciosos, fármacos cardiovasculares, anticolinérgicos, anticonvulsivos, antirreumáticos y otros se ha notificado que empeoran los síntomas de los pacientes con MG [Wittbrodt (1997) Arch. Intern. Med., 157, 399-408].

Aunque el malfuncionamiento asociado con la MG puede aliviarse transitoriamente mediante la administración sistémica crónica de inhibidores de la carbamato acetilcolinesterasa (AChE) (por ejemplo, piridostigmina), los inventores han encontrado que la piridostigmina induce una respuesta de retroalimentación que conduce a una acumulación de AChE en exceso [Friedman y col. (1996) Nature Medicine 2, 1382-1385; Kaufer y col. (1998) id ibíd; Meshorer, E. y col. (2002) Science 295, 508-12]. Esto sugirió que el uso crónico de dichos inhibidores podría modificar el equilibrio colinérgico en el sistema neuromuscular del paciente y requeriría un aumento de las dosis de estos fármacos; se proporciona también una explicación de los regímenes de dosis muy variables en pacientes con MG y se consideró esto para el desarrollo de una solución alternativa para suprimir la hidrólisis de la acetilcolina.

El ARN que codifica la AChE está sujeto a un corte y empalme en 3’ alternativo que da como resultado un ARNm que codifica una isoforma (S) “sináptica”, que contiene los exones 1-4 y 6, designada también ARNm E6 en el presente documento, una isoforma (E) “eritrocítica”, que contiene los exones 1-6, designada también ARNm E5 en el presente documento, y la AChE-R “translectura” derivada del transcrito 3’ sin corte y empalme, que contiene los exones 1-6 y el pseudointrón 14, designado también ARNm 14 en el presente documento.

Ratones transgénicos que expresaban en exceso la AChE-S humana en las motoneuronas de la médula espinal, pero no en el músculo, presentaron deficiencias neuromotoras progresivas que se asociaron con cambios en la ultraestructura de la UNM [Andres, C. y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8173-8178]. Sin embargo, no está claro si la moderada extensión de la AChE expresada en exceso en el músculo fue por sí misma suficiente para mediar esta grave miopatología. En el cerebro de roedor, los inventores encontraron previamente que el estrés traumático y los inhibidores de la colinesterasa inducen la expresión en exceso drástica dependiente del calcio de la AChE-R [Kaufer, y col. (1998) id ibid.], asociada con hipersensibilidad neuronal a los agonistas y antagonistas colinérgicos [Meshorer y col. (2002) id ibíd].

Se ha encontrado que el exceso de AChE crónico produce un deterioro neuromotor progresivo en ratones transgénicos y embriones de anfibios [Ben Aziz-Aloya y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 2471-2475; Seidman y col. (1994) J. Neurochem. 62, 1670-1681; Seidman, y col. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 2993-3002; Andres, C. y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 8173-8178; Sternfeld y col. (1998) J. Neurosci. 18, 1240-1249]. También, los pacientes miasténicos padecen episodios agudos de crisis, con una incidencia anual promedio notificada de 2,5 % [Berrouschot y col. (1997) Crit. Care Med. 25, 1228-35] asociadas con reminiscencias de insuficiencia respiratoria debidas a intoxicaciones producidas por agentes anti-AChE.

En una solución, la técnica anterior enseña que se pueden desarrollar aptámeros de ARN capaces de bloquear los autoanticuerpos del receptor de la acetilcolina nicotínica (nAChR) y usarse para tratar la MG. Esta solución tiene algunos inconvenientes puesto que los aptámeros de ARN no tienen la amplificación característica de potencia de los agentes antisentido que inducen la ARNasa y puesto que fracasan al tratar el problema de las respuestas de retroalimentación en la MG.

Los presentes inventores habían encontrado previamente que los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la región de codificación común de la AChE son útiles para suprimir la producción de AChE [documento WO 98/26062]. Esta publicación enseña también que los oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la AChE humana son útiles en el tratamiento de las deficiencias de memoria tal como se ha observado en ratones transgénicos que expresaban la AChE humana en su cerebro. Los efectos observados (véase la Tabla 4-5 en el documento WO 98/26062) son similares en su efecto, considerablemente más largo además en la duración de su acción que la tacrina inhibidora de la AChE de la técnica anterior (véase la Fig. 9B en el documento WO 98/26062).

A la vista de lo anterior, es deseable mejorar además las soluciones de tratamiento de la MG y otras enfermedades que implican del deterioro en la transmisión neuromuscular. El tratamiento de la técnica anterior implica el uso de inhibidores de la AChE en pacientes que padecen efectos secundarios indeseables debidos a la inducción de la AChE y a las deficiencias neuromusculares asociadas a dichos inhibidores, y debido a que esto está sujeto a una eficacia variable en un estado mental alterado (estrés).

El documento WO 01/36627 enseña que cambios morfológicos y funcionales en l UNM están correlacionados con la expresión en exceso de una isoforma específica del ARNm de la AChE, a saber, la isoforma “translectura” que contiene el pseudointrón 14 en el ARN maduro. Dicha solicitud PCT, muestra también que los oligonucleótidos antisentido dirigidos a la región de codificación común de la AChE, pueden usarse para destruir específicamente el ARNm de la AChE-R, y que los agentes antisentido de la AChE son de lejos superiores a los fármacos convencionales inhibidores de la enzima AChE en el tratamiento de los trastornos neuromusculares. La superioridad de estos agentes antisentido puede ser debida al hecho de que los inhibidores convencionales de la enzima inducen activamente la expresión en exceso del ARNm de la AChE 14. De acuerdo con las enseñanzas del documento WO 01/36627, esto puede conducir a

cambios perjudiciales en la UNM. Esta consecuencia del tratamiento puede evitarse completamente usando los agentes antisentido del documento WO 01/36627.

La barrera hematoencefálica (BHE) mantiene un entorno hemostático en el sistema nervioso central (SNC). Los capilares que suministran la sangre al cerebro tienen estrechas uniones que bloquean el paso de la mayoría de moléculas a través de las membranas endoteliales capilares. Aunque las membranas permiten el paso de materiales solubles en lípidos, los materiales solubles en agua no atraviesan en general la BHE. Existen mecanismos de transporte mediado para transportar la glucosa soluble en agua y los aminoácidos esenciales a través de la BHE. Los mecanismos de soporte activo eliminan las moléculas que llegan en exceso, tales como el potasio, procedentes del cerebro [para una revisión general véanse Betz y col., Blood-Brain-Cerebrospinal Fluid Barriers, Capítulo 32, en Basic Neurochemistry, 5ª ed., Eds Siegel, Albers Agranoff, Molinoff, pp.681-701; Goldstein y Betz (1986) Scientific American, septiembre, pp. 74-83].

La BHE impide la administración de fármacos al SNC. Se han diseñado procedimientos para administrar fármacos necesarios, que se pueden usar en el SNC, tales como la administración directa mediante administración intratecal con, por ejemplo, un depósito de Ommaya. La Patente de los Estados Unidos Nº 5.455.044 proporciona el uso de un sistema de dispersión para administración en SNC [para la descripción de otros sistemas de administración en el SNC, véanse la Patente de los estados Unidos Nº 5.658.852, Betz y col., ibíd., y Goldstein y Betz, ibíd.]. Tavitan y col. [Tavitan y col. (1998) Nat Med 4(4): 467-71] observaron que los oligonucleótidos 2’-O-metilo son capaces de penetrar en el cerebro. Otros sistemas hacen uso de fármacos especialmente diseñados que usan la estructura y la función de la propia BHE para administrar los fármacos, mediante, por ejemplo, el diseño de fármacos solubles en lípidos o mediante el acoplamiento con péptidos que pueden penetrar la BHE.

Se ha demostrado que el estrés afecta a la permeabilidad de la BHE [Sharma H.S. y col. (1992) Prog. Brain Res. 91, 189-196; Ben-Nathan D. y col. (1991) Life .Sci. 489, 1493-1500]. Además, en mamíferos, el estrés agudo estimula un aumento rápido, transitorio de la acetilcolina liberada con una correspondiente fase de aumento de la excitabilidad neuronal [Imperato A. y col. (1991) Brain Res. 538, 111-117]. Los presentes inventores han observado anteriormente que la isoforma, AChE-R, y el péptido 14 de la AChE, pueden actuar como agentes que imitan el estrés y la ruptura de la BHE. Estos hallazgos constituyen la base de la solicitud PCT WO 98/22132.

El documento WO 98/22132 se refiere a composiciones para facilitar el paso de compuestos a través de la BHE, que comprenden la variante de corte y empalme AChE-R y/o el péptido 14.

En la búsqueda de un oligonucleótido antisentido dirigido contra un dominio de la AChE humana, que pueda ser particularmente aceptable en la terapia humana, los inventores han encontrado ahora, y esto es un objeto de la presente invención, que un oligodesoxinucleótido sintético antisentido que tiene la secuencia de nucleótidos: 5’-CTGCCACGTTCTCCTGCACC-3’, designada en el presente documento SEQ ID NO: 1, no solo es útil para suprimir selectivamente la producción de la isoforma AChE-R sino que también posee especificidad interespecies, lo que permite el uso en modelos animales de roedores de diversas enfermedades y, además, parece, de forma remarcable, que penetra la BHE, y puede de esta manera ser útil en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central, sola o en combinación con diferentes agentes terapéuticos. El hallazgo de que el novedoso oligonucleótido antisentido de la invención puede penetrar la BHE fue inesperado, particularmente a la vista de la expectativa de que la BHE sería impermeable para grandes moléculas polares.

La aplicación de la tecnología antisentido para el tratamiento de los trastornos del sistema nervioso se ha considerado, hasta hace poco, como limitada por la ausencia de sistemas adecuados para administrar oligonucleótidos al cerebro. No obstante, se han realizado algunos intentos para soslayar esta dificultad [revisados en Seidman S. y col. (1999) Antisense Nucl. Acid Drug Devel, 9, 333-340]. El acceso de agentes químicos en circulación en la sangre a los espacios intersticiales del cerebro está restringido por la barrera biomecánica conocida como la BHE. El fuerte carácter aniónico del esqueleto del fosfodiéster hace que los oligonucleótidos sean especialmente malos para cruzar la BHE. Los estudios farmacocinéticos in vivo han demostrado que menos de un 0,01 % de una dosis inyectada sistémicamente de un oligonucleótido antisentido fosforotioato puede alcanzar el cerebro, en el que su tiempo de residencia puede ser tan pequeño como de 60 min, una solución de investigación para este problema en el laboratorio es dirigir la derivación de la BHE m3ediante la inyección intracraneal de oligonucleótidos. Usando coordenadas estereotácticas publicadas de ratas y ratones, se pueden administrar oligonucleótidos usando inyecciones individuales, mediante la administración repetida a través de una cánula implantada, o mediante infusión continua usando una minibomba osmótica tal como Alzet (Alza, Palo Alto, CA). Los oligonucleótidos pueden administrarse tanto en el FCE o directamente en la región cerebral de interés. En general, se considera que los oligonucleótidos permanecen relativamente localizados tras la administración intraparenquimal. De esta manera, una inyección individual de 24 μg de oligonucleótido antisentido dirigida al elemento de respuesta del AMPc (CREB) en la amígdala de la rata se notificó que difundía únicamente 0,72 ± 0,04 μl alrededor del sitio de inyección, ejerciendo efectos específicos en la región sobre la aversión condicionada a sabor (CTA). La inyección del mismo oligonucleótido en los ganglios basales, 2 mm por encima de la amígdala no tuvo efecto sobre la CTA. De forma similar, se notificaron efectos específicos sobre el comportamiento tras la inyección de oligonucleótidos antisentido contra el factor de transcripción c-fos asociado al estrés en la corteza frontal medial (una única administración; 10 μg) tras la administración de oligonucleótidos contra la enzima glutamato decarboxilasa que sintetiza el neurotransmisor en el hipotálamo ventromedial (una única administración; 1 μg), y tras 5 días de infusión continua de oligonucleótidos dirigidos al ARNm que codifica el factor CREB de trascripción sensible al AMPc en el locus coeruleus (20 μg/día). Se notificó

adicionalmente que se podría conseguir una amplia distribución de oligonucleótidos en el cerebro (de hasta 443 μl alrededor del sitio de inyección después de 48 horas) mediante microinfusión intraparenquimal directa de flujo alto. En este caso, se calculó la concentración promedio del oligonucleótido en el tejido para ser entre 3-15 μM – pocillo dentro de lo que se considera fisiológicamente significativo. Con respecto a la captación en las neuronas, se ha demostrado que las neuronas en el cuerpo estriado de las ratas captan preferentemente oligonucleótidos en comparación con la glía. A pesar de la retención general de oligonucleótidos alrededor del sitio de inyección notificada en este estudio, se observó que alguna señal era transportada a lo largo de las rutas de proyección a sitios distantes. Sin embargo, para ser terapéuticamente eficaces, los oligonucleótidos deben prepararse de una manera que permita su estabilidad y penetración libre en el sistema nervioso central tras la inyección intravenosa, o de forma aún más preferible, tras la administración oral. De esta manera la presente invención está dirigida a un novedoso oligodesoxinucleótido antisentido preferiblemente protegido de nucleasa, que suprime selectivamente la producción de AChE-R, con mejoras clínicas rápidas y de larga duración en la función muscular, que posee especificidad interespecies y que puede penetrar la BHE y destruir el ARNm de la AChE-R en las neuronas del sistema nervioso central.

Resumen de la invención

La invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido hEN101 antisentido, definido por la SEQ ID NO: 1. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido hEN101 antisentido, definido por la SEQ ID NO: 1, para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, para mejorar la resistencia y/o para el uso en la fatiga muscular crónica, preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de la miastenia grave, en el que dicho oligodesoxinucleótido antisentido suprime la producción de la isoforma AChE-R La invención se refiere a una composición farmacéutica o médica para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo que comprende como ingrediente activo un oligodesoxinucleótido sintético antisentido dirigido contra el ARNm de la AChE humana que tiene la secuencia de nucleótidos:

5’ CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3’ (SEQ ID NO: 1).

El oligonucleótido antisentido produce preferiblemente la destrucción preferente del ARNm de la AChE-R, posee especificidad interespecies, se ha demostrado que no produce toxicidad en roedores o primates, y puede penetrar la BHE en primates (monos) mediante las rutas de administración i.v. y p.o.

Por tanto, la invención se refiere además a un oligodesoxinucleótido sintético antisentido dirigido contra el ARNm de la AChE humana que tiene la secuencia de nucleótidos: 5’ CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3’ (SEQ ID NO:1), en la que dicho oligodesoxinucleótido antisentido suprime selectivamente la producción de la isoforma AChE-R.

En una realización preferida, el oligodesoxinucleótido sintético antisentido, que tiene la secuencia de nucleótidos designada SEQ ID NO: 1, es resistente a la nucleasa. Se puede conseguir la resistencia a la nucleasa modificando el oligodesoxinucleótido antisentido de la invención de tal manera que comprenda una cadena de un hidrocarburo alifático parcialmente insaturado y uno o más grupos polares o cargados, incluyendo grupos de ácidos carboxílicos, grupos éster, y grupos alcohol.

En las realizaciones particulares, el oligodesoxinucleótido antisentido resistente a la nucleasa de la invención tiene al menos uno de los tres últimos nucleótidos del extremo 3’ 2’-O-metilado. Alternativamente además, el oligodesoxinucleótido antisentido de la invención puede tener al menos uno de los últimos nucleótidos fluorados del extremo 3’. Más alternativamente el oligodesoxinucleótido antisentido resistente a la nucleasa de la invención tiene enlaces fosforotioato que se unen entre al menos dos de las últimas bases de nucleótidos del extremo 3’, preferiblemente, tiene enlaces fosforotioato que se unen entre al menos cuatro bases de nucleótidos del extremo 3’ Más alternativamente, se puede conseguir la resistencia a la nucleasa mediante el oligodesoxinucleótido sintético antisentido resistente a la nucleasa, que tiene un bucle de nucleótidos que forman la secuencia en el extremo 3’, por ejemplo un bucle de 9 nucleótidos que tiene la secuencia de nucleótidos CGCGAAGCG (SEQ ID NO: 2).

El oligodesoxinucleótido sintético antisentido resistente a la nucleasa de la invención es capaz de modular selectivamente la producción de AChE de mamífero, de forma particular, modular selectivamente la producción de AChE de primates en neuronas que residen en el sistema nervioso central, que incluyen la AChE humana de interneuronas.

Por tanto, la invención se refiere además a un oligodesoxinucleótido antisentido resistente a la nucleasa de la invención que tiene la secuencia de nucleótidos: 5’ CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3’ (SEQ ID NO: 1), en el que dicho oligodesoxinucleótido antisentido suprime selectivamente la producción de la isoforma AChE-R.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligodesoxinucleótido antisentido de la invención, y que comprende opcionalmente además un adyuvante, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención comprende un oligodesoxinucleótido antisentido de la SEQ ID NO: 1, que esta 2’-O-metilado en al menos uno, preferiblemente al menos tres nucleótidos del extremo 3’.

La composición farmacéutica de la invención es útil en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, para mejorar la resistencia y/o para el uso en la disminución de la fatiga muscular crónica.

La composición farmacéutica de la invención puede ser para usarse una vez al día por un paciente con una dosificación de entre aproximadamente 0,001 μg/g y aproximadamente 50 μg/g de ingrediente activo, preferiblemente una dosificación del ingrediente activo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5,0 μg/g, más preferiblemente una dosificación del ingrediente activo de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,5 μg/g.

La composición farmacéutica de la invención está particularmente prevista para el uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, en el que dicho trastorno está asociado con un exceso de ARNm o proteína de la AChE. Dicho trastorno puede ser, por ejemplo, un trastorno neuromuscular, en el que dicho trastorno está asociado con un exceso del ARNm de la AChE-R.

La composición farmacéutica de la invención es de esta manera particularmente adecuada para el tratamiento o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, en el que dicho trastorno está asociado con un deterioro de la transmisión colinérgica.

De particular interés son las composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un trastorno neuromuscular progresivo, en el que dicho trastorno implica la perturbación del músculo, la reinervación muscular de las anomalías de la UNM, por ejemplo, miastenia grave, enfermedad de Eaton-Lambert, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, trastorno por estrés postraumático (TEPT), esclerosis múltiple, distonía, esclerosis posterior a ictus, daño muscular posterior a lesión, parálisis posterior a cirugía, reinervación excesiva, e exposición posterior los a inhibidores de la AChE.

La composición farmacéutica de la invención es también útil en la mejora de la resistencia en el ejercicio físico o en la disminución de la fatiga muscular.

Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligodesoxinucleótido antisentido que se denota por la SEQ ID NO: 1, para facilitar el paso de los compuestos a través de la BHE, que comprende opcionalmente además un agente farmacéuticamente activo adicional y/o un adyuvante, vehículo o diluyente aceptable. El agente farmacéuticamente activo adicional es un compuesto que se va a transportar a través de la BHE, en el que dicho compuesto puede ser uno de los agentes de contraste usados para adquirir imágenes del sistema nervioso central, agentes que funcionan para bloquear los efectos de la toxicomanía, antibióticos, fármacos y vectores quimioterapéuticos que se van a usar en la terapia génica. Esta composición funcionaría principalmente suprimiendo la producción de la AChE-R, que se encuentra aparentemente implicada en el mantenimiento de la BHE.

En una realización preferida, la invención se refiere al uso de un oligodesoxinucleótido antisentido tal como se describe en el presente documento para la fabricación de una composición farmacéutica. En otra realización preferida, la invención se refiere al uso de un oligodesoxinucleótido antisentido tal como se describe en el presente documento para la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, para mejorar la resistencia y/o para uso en la fatiga muscular crónica, preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de la miastenia grave.

En una realización adicional, la invención se refiere al uso de un oligodesoxinucleótido antisentido tal como se describe en el presente documento, o al uso de una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento, para facilitar el paso de compuestos a través de la BHE, que comprende opcionalmente además un agente farmacéuticamente activo adicional que se va a transportar a la BHE y/o un adyuvante, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención se describirá con más detalle en la siguiente descripción detallada y mediante las siguientes figuras.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 ARNm de la AChE humana [Nº de Acceso del GenBank M55040; Soreq y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87(24), 9688-9692 (1990)], y de la EN 101 humana (hEN101, SEQ ID NO: 1), dirigido a los nucleótidos 795-5’ a 3’-814 (sombreados) de la secuencia de codificación.

Figura 2A-B Representación de las diversas propiedades físicas y químicas de la EN101 humana (SEQ ID NO: 1).

Fig. 2A: Estructura interna que se espera del oligonucleótido, y una estimación de la energía (en kcal/mol) requerida para perturbar dicha estructura.

Fig. 2B: Composición base, y la temperatura de fusión prevista de su híbrido con el ARN complementario.

Figura 3 ARNm de la AChE de ratón [Nº de Acceso del GenBank X56518; Rachinsky y col. (1990) Neuron 5(3), 317327], y de la EN101 de ratón (mEN101, SEQ ID NO: 3), dirigido a los nucleótidos 639-5’ a 3’-658 (sombreados) de la secuencia de codificación.

Figura 4A-B Representación de diversas propiedades físicas y químicas de la EN101 de ratón (SEQ ID NO: 3).

Fig. 4A: Estructura interna que se espera del oligonucleótido, y una estimación de la energía (en kcal/mol) requerida para perturbar esta estructura.

Fig. 4B: Composición base y temperatura de fusión prevista de su híbrido con el ARNm complementario.

Figura 5 ARNm de la AChE de rata (parcial, 2066 nucleótidos) [Nº de Acceso del GenBank S50879; Legay y col. (1993),

J. Neurochem. 60(1), 337-346], y de la EN102 de rata (rEN102, SEQ ID NO:5), dirigido a los nucleótidos 51-5’ a 3’-70 (sombreados) y de la EN101 de rata (rEN101, SEQ ID NO:4), dirigido a los nucleótidos 639-5’ a 3’-658 (sombreados) de la secuencia de codificación.

Figura 6A-B Representación de diversas propiedades físicas y químicas de la EN101 de rata (SEQ ID NO: 4).

Fig. 6A: Estructura interna que se espera del oligonucleótido, y una estimación de la energía (en kcal/mol) requerida para perturbar esta estructura.

Fig. 6B: Composición base y la temperatura de fusión prevista de su hibrido con el ARN complementario.

Figura 7 AChE inmunoreactiva en ratas EAMG (mistemia gravis autoinmune experimental).

Se llevó a cabo la separación del suero de rata en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante, y el gen ensayado para la AChE-R inmunoreactiva. Una rata EAMG tuvo un nivel considerablemente mayor de la variante rR que migra rápidamente que la de la rata del control.

Abreviaturas; electroph., electroforesis; cont., control.

Figura 8A-C Expresión de la AChE-R en exceso en los músculos EAMG.

Fig. 8A: Transcritos de ARNm de la AChE expresados en el músculo. Se muestra el gen ACHE de mamífero que responde al estrés con un elemento de respuesta glucocorticoide (GRE) en su potenciador distal, y sus dos transcritos de ARNm expresados en el músculo. Señalar que el exón 6 es único para la AChE-S del transcrito sináptico, mientras que el pseudointrón 4’ se expresa solo en el ARNm de la AChE-R inducido por estrés. Los anticuerpos dirigidos al pseudointrón del péptido C terminal 4’ derivado que sirvió para detectar la proteína de la AChE-R y las sondas de ARNc para el exón 6 y el pseudointrón 4’ etiquetan los dos transcritos (asteriscos).

Fig. 8B: nAChR agotada y AChE-R en exceso en los músculos EAMG. Se muestra una tinción inmunohistoquímica de secciones incluidas en parafina del músculo tríceps de ratas normales o EAMG tratadas con oligonucleótidos (rinvEN102) inversos inertes, similar a las de las rata sin tratar. La tinción fue con anticuerpos policlonales de conejo para la nAChR (1,2) y la AChE-R (3,4). Las áreas inmunopositivas se tiñeron de rojo. Señalar que la proteína AChE-R fue marcadamente elevada y que la nAChR se redujo drásticamente en EAMG. La hibridación in situ con sondas específicas para los ARNm de la AChE-R o S dio como resultado ARN teñido de rojo, usándose DAPI (blanco) para visualizar los núcleos de las células. Señalar la marcada acumulación subnuclear del ARNm de la AChE-R en preparaciones procedentes de EAMG, pero no en animales del control (5,6). El ARNm de la AChE-S presentó una expresión interrumpida en las zonas subnucleares en las ratas del control y EAMG (7,8).

Fig. 8C: Tratamiento con EN101. En ratas EAMG, EN101 redujo los niveles del ARNm de la AChE-R (1,29 y AChE-R (5,6), pero afectó al ARNm de la nAChR (3,4) o la AChE-S (7,8), en comparación con las ratas tratadas con la secuencia inversa (véase la Fig 8B, anterior).

Abreviaturas: health., sano, r., rata, prot., proteína.

Figura 9A-D Electrofisiología normalizada del músculo EAMG con supresión de la AChE-R.

Fig. 9A: Se detectó la AChE-R inmunoreactiva, como en la Fig. 7B, en el suero de ratas EAMG gravemente afectadas, tratadas con rEN101 o r-invEN102, y las densidades de las bandas se representaron en el gráfico de barras.

Fig. 9B: se trataron los animales (al menos 6 ratas en cada grupo) con una única inyección i.p. (75 μg/kg) del inhibidor de la AChE neostigmina, y se midió la tasa PAMC relativa al valor inicial. La tasa PAMC promedio de las ratas EAMG incluidas en el estudio antes del tratamiento fue de 87 ± 2,5 % de la primera despolarización, y la tasa PAMC promedio en los animales tratados con rEN101 fue de 107,4 ± 3,8 % (recuadro)

Fig. 9C: Se trataron los animales (al menos 6 ratas en cada grupo) con diversas dosis de rEN101. El tratamiento (dosis entre 10-500 μg/kg) restauró el declive de los PAMC durante hasta 72 h. Señalar que mayores dosis confirieron un relieve crecientemente duradero.

Fig. 9D: Dosis respuesta. Las respuestas del PAMC en cada momento se representaron gráficamente como una función de la concentración de EN101. Señalar que a las 1 y 5 h existen claramente dos efectos, un aumento pronunciado dependiente de una baja concentración de EN101 (IC50 < 10 μg/kg), superpuestos sobre un efecto de mucha más baja afinidad que persiste mucho tiempo.

Abreviaturas. ser., suero, t., tiempo, dep., dependencia, neostig., neostigmina, resp., respuesta, h., horas, perc., porcentaje, cont., control, rat., relación; bas., valor inicial.

Figura 10 EN101 de rata (SEQ ID NO: 4) mejora la resistencia en ratas miasténicas.

Se pincharon ratas experimentales con miastenia grave autoinmune (EAMG) con síntomas clínicos de gravedad variable y ratas Lewis sanas para correr sobre una cinta sin fin alimentada eléctricamente (25 m/min, recuadro) hasta que estuvieron visiblemente fatigadas. Se presenta el tiempo promedio (s. ± SEM) en el que las ratas pudieron correr antes y 24 h después de la administración i.v. de 250 μg/kg de rEN101. Señalar que el tiempo de carrera de las ratas EAMG disminuyó con la gravedad de la enfermedad, y aumentó para cada grupo tratado con rEN101.

Abreviaturas: trml., cinta sin fin, treat., tratamiento; h., hora, clin., clinico, est., estado, run., correr, t., tiempo; s., segundos.

Figura 11A-B reversión estable de la disminución de la respuesta del PAMC en ratas EAMG tratadas por vía oral con rEN101.

Las ratas EAMG recibieron rEN101 una vez al día durante hasta 4 días mediante inyección intravenosa (25 μg/kg) o mediante sonda nasogástrica oral (50 μg/kg), o piridostigmina (1000 μg/kg mediante sonda nasogástrica oral. Se determinó la relación del PAMC a 1 y 5 h después de la primera administración del fármaco y a continuación, 24 horas antes de la administración de la dosis posterior.

Fig. 11A: Dosis única. Piridostigmina administrada por vía oral (n=4) y rEN101 (n=8) alivió el declive de las respuestas a PAMC en un plazo de 1 h. 24 h después de la administración de piridostigmina, las relaciones de los PAMC en los músculos de ratas tratadas volvieron al valor inicial del declive. En contraste, no se detectó declive en las ratas tratadas con rEN101.

Fig. 11B: Dosis diarias repetidas. La gráfica representa gráficamente la mejora equivalente en la función muscular estimulada por la vía oral (50 μg/kg, n=8) en comparación con la i.v. (25 μg/kg, n=4) de rEN101. Señalar que la administración repetida de rEN101 confirió alivio estable a largo plazo de los declives del PAMC. La administración diaria repetida de piridostigmina a intervalos de 24 h dio como resultado unas mejoras del PAMC considerablemente más cortas que las obtenidas con EN101, disminuyendo posteriormente hasta el declive del valor inicial antes de la siguiente dosis.

Abreviaturas. sing., individual; dos., dosis, rep., repetida, d., diaria, piridostig., piridostigmina; h., horas, rat., relación; bas., valor inicial; ab., anterior.

Figura 12A-C: El tratamiento con rEN101 a largo plazo cambia el curso de EAMG.

Fig. 12A: Supervivencia. Una fracción mayor de animales tratados una vez al día con rEN101 (50 μg/Kg, diaria, p.o.) sobrevivieron a los tratados con piridostigmina (1000 μg/kg) a pesar de su mal estado inicial de similitud y al número inicial de animales en cada grupo.

Fig. 12B: Estado clínico. Muestra los valores promedio para el estado clínico (tal como se ha definido en los Procedimientos Experimentales) de supervivencia de los animales procedentes de cada uno de los grupos tratados. Señalar la creciente gravedad de la enfermedad en animales tratados con solución salina y piridostigmina, en comparación con la mejora del estado de los animales tratados con rEN101.

Fig. 12C: Resistencia. Se muestran los tiempos de carrera promedio en s. para los animales tratados con rEN101 y piridostigmina. Señalar que antes del tratamiento, las ratas EAMG se comportaron como animales gravemente enfermos (estado clínico 4).

Abreviaturas, surv., supervivencia; clin, clinico; estat., stam., resistencia, an., animales; al., vivo, sc., puntuación; run., correr; t., tiempo, sec., segundos; s., semanas; sal., solución salina, piridostig., piridostigmina.

Figura 13 Modelo propuesto para EN101

En la unión neuromuscular, la acetilcolina (ACh) liberada procedente del terminal de la motoneurona (parte superior) en la hendidura sináptica viaja hacia la membrana postsináptica del músculo (parte inferior). Así, esta interactúa con la nAChR para iniciar una corriente iónica hacia el interior y estimular los potenciales de acción muscular. La ACh se hidroliza posteriormente por la AChE-S unida a sinapsis. Los núcleos musculares sinápticos (elipsis) producen, además del transcrito de ARNm de la AChE primaria, el ARNm de la AChE-R normalmente rara con su extremo 3’ alternativo. Este transcrito se traduce en monómeros solubles de la AChE-R secretora. Los anticuerpos autoinmunes miasténicos dirigidos hacia nAChR bloquean el inicio de los potenciales de acción, imitando un estado deficiente de la ACh. El desequilibrio colinérgico da como resultado una acumulación de la AChE-R que potencia la destrucción de la ACh, conduciendo a la fatiga muscular. Las anticolinesterasas químicas (círculos indentados), que no bloquean selectivamente la AChE-S y la AChE-R, que aumentan transitoriamente los niveles de la ACh, intensifican adicionalmente más la producción en exceso de la AChE-R. En contraste, el agente antisentido EN101 induce selectivamente la destrucción del

ARNm de la AChE-R, evitando la síntesis de la AChE-R que mantiene a la vez la AChE-S y que sostiene la transmisión neuromuscular normal.

Figura 14 Supresión de hEN101 dependiente de la dosis del ARNm de la AChE-R neuronal, pero no del ARNm de la AChE-S. Se muestran los campos representativos de secciones de la médula espinal de monos tratados con hEN101 tras la hibridación in situ con las sondas de AChE-R o AChE-S. Señalar que disminuyó el etiquetado del ARNm de la AChE-R, pero los niveles del ARNm de la AChE-S aparecieron sin cambiar. Una dosis creciente de hEN101 administrada o.g. suprimió el ARNm de la AChE-R más eficazmente sugiriendo una dependencia de la dosis. La administración de la mayor dosis vía intraventricular pareció más eficaz que la de la ruta o.g.

Abreviaturas. d., día.

Figura 15 La supresión de hEN101 de los niveles del ARNm de la AChE-R es específica del tipo de célula.

Las neuronas de la médula espinal procedentes de secciones de mono teñidas con hematoxilina-eosina se dividieron por tamaño en células con diámetros pericariales de < 40, 40 a 70 y > 70 μm. El porcentaje de células en cada grupo de tamaño que se etiquetaron positivamente para el ARNm de la AChE-R se registró en 5 diferentes campos de 1 mm2 cada uno, para cada tratamiento de hEN101. Señalar que la eficacia de hEN101 fue aparentemente más elevada en las interneuronas relativamente pequeñas, y más baja en las motoneuronas más grandes.

Abreviaturas: pos., positiva; cel., célula; siz., tamaño; gr., grupo., bo., cuerpo, diam., diámetro; nv., no expuesto a tratamiento anteriormente

Figura 16 Se muestran los niveles de acetilcolina hidrolizada, indicando la actividad de la acetilcolinesterasa en el plasma de macacos tratados i.v. durante dos días consecutivos con 150 o 500 μg/kg de hEN101 o con 500 μg/kg de hEN101 administrados por vía oral.

Fig. 16A: Actividad total

Fig. 16B Actividad con 5 x 10-5 M de iso-OMPA (AChE). Señalar el aumento inducido por inyección en la actividad de la enzima y las reducciones de AS-ON.

Abreviaturas: t., tiempo; fol., tras; Treat., tratamiento; hrs., horas.

Figura 17 Efecto de rEN101 sobre el ARNm de la AChE-R en neuronas de médula espinal de rata. Se determinó la presencia de células positivas para el ARNm de la AChE-R en la sección de médula espinal que se ha tratado durante 7 días con rEN101 (500 μg/kg, i.v., diariamente).

Abreviaturas. cont., control

Descripción detallada de la invención

A fines de claridad, se definen en el presente documento las siguientes abreviaturas

-

AChE: acetilcolinesterasa

-AChE-R: acetilcolinesterasa, variante o isoforma “translectura”, su ARNm incluye el pseudointrón 14

-

AChE-S: acetilcolinesterasa, variante o isoforma sináptica

-

AS-ON: oligonucleótido antisentido

-

BHE: barrera hematoencefálica

-

PAMC: potencial de acción compuesto del músculo

-

SNC. Sistema nervioso central

-

rata EAMG: ratas en las que se ha inducido la miastenia grave autoinmune experimental

-

EN101: puede denominarse también AS3, oligonucleótido antisentido dirigido contra ser el ARNm de la AChE human, de rata o ratón (hEN101, rEN101 o mEN101, respectivamente)

-

EN102. Puede denominarse también AS1 oligonucleótido antisentido dirigido contra el ARNm de la AChE, en una región diferente que EN101

-

MG: miastenia grave, una enfermedad de la unión neuromuscular

-

i.v.: intravenosa

-

o.g.: sonda nasogástrica oral

-

p.o. por vía oral

Oligonucleótido antisentido: nucleótido que comprende esencialmente una secuencia complementaria inversa a una secuencia del ARNm de la AChE. El nucleótido es preferiblemente un oligodesoxinucleótido, pero también se contemplan por la invención los análogos de ribonucleótidos o nucleótidos, o sus mezclas. El oligonucleótido antisentido puede modificarse a fin de potenciar su resistencia a la nucleasa, para mejorarse su capacidad de cruzar la membrana, o ambas. El oligonucleótido puede ser lineal, o puede comprender una estructura secundaria, puede comprender también la actividad enzimática, tal como la actividad de la ribozima.

Trastorno neuromuscular progresivo: un trastorno o dolencia asociado con la producción en exceso de ARNm o proteína de la AChE, caracterizada por cambios en la morfología de la UNM y en el deterioro de la transmisión neuromuscular. El trastorno neuromuscular puede implicar la perturbación del músculo, la reinervación muscular, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, trastorno por estrés postraumático (PSTD), o distonía.

La presente invención se refiere a un novedoso oligodesoxinucleótido antisentido que se denota mediante la SEQ ID NO: 1, designado también en el presente documento como hEN101.

Además de la parte de la secuencia que es complementaria a la secuencia de la AChE, el oligonucleótido antisentido de la invención puede comprender también las secuencias de ARN con actividad nucleolítica enzimática, o que se pueden unir a dicha secuencias. Secuencias nucleolíticas preferidas son secuencias de ribozimas, que demostraron interactuar específicamente con transcritos de ARNm. Son secuencias de ácido ribonucleico, que incluyen sitios activos para la ARNasa flanqueados por oligonucleótidos antisentido [Haseloff y Gerlach (1988) Nature 3, p. 585, Sarver y col. (1990) Science 247, p. 1222]. Las ribozimas preferidas son las ribozimas de cabeza de martillo [Conaty y col. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 2400-2407; y Xu y col. (1999) Endocrinology, 140, 2134-44]. Otra ribozima preferida. Otra ribozima preferida es la ribozima con estructura en horquilla, por ejemplo, tal como se ha derivado del ARN satélite del virus de la mancha anular del tabaco [véase Perez-Ruiz (1999) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9, 33-42].

El novedoso oligodesoxinucleótido antisentido de la invención corresponde al complemento inverso de la secuencia de ARNm de la AChE humana, desde el nucleótido 795-5’ al nucleótido 3’-814 (Fig. 1). El trabajo anterior de los presentes inventores ha demostrado la utilidad del oligonucleótido antisentido en la supresión de la producción de AChE y en el tratamiento de la deficiencia de memoria. En dicho trabajo previo, se han dado a conocer numerosos oligonucleótidos antisentido de la AChE. Dicho trabajo previo da a conocer además las características deseables de dichos oligonucleótidos antisentido y sus posibles medicaciones, tales como la resistencia a la nucleasa, modificaciones para potenciar el transporte de membrana de los oligonucleótidos, y similares. – En otra publicación, los presentes inventores describen el papel de los oligonucleótidos antisentido en el tratamiento de una variedad de enfermedades neurodegenerativas [Seidman, S. y col., Antisense Res. Nucl. Acids Drug Devel. 9, 333. 340 (1999)].

El oligodesoxinucleótido de la invención es preferiblemente resistente a la nucleasa. Existen numerosas modificaciones que imparten resistencia a la nucleasa a un oligonucleótido dado. Se hace referencia al documento WO 98/26062, cuya publicación da a conocer que los oligonucleótidos se pueden preparar resistentes a la nucleasa, sustituyendo, por ejemplo, los enlaces fosfodiéster internucleótidos con enlaces fosforotioato, sustituyendo el grupo 2’-hidroxilo de uno o más nucleótidos por grupo 2’-O-metilo, o añadiendo una secuencia de nucleótidos capaz de formar una estructura en bucle en condiciones fisiológicas en el extremo 3’ de la secuencia del oligonucleótido antisentido. Un ejemplo de una estructura formadora de bucle es la secuencia 5’ CGCGAAGCG (SEQ ID NO:2), que se puede añadir en el extremo 3’ de un oligonucleótido antisentido dado para impartir resistencia a la nucleasa a la anterior.

Las células sobre las cuales el oligonucleótido antisentido de la invención ejerce sus efectos son preferiblemente las células de los músculos y las células de la UNM, incluyendo los axones nerviosos de las estructuras de las placas terminales.

Usando los oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la invención, se espera que la cantidad de AChE-R y los niveles del ARNm de la AChE-R se reduzcan en las neuronas del sistema nervioso central en al menos aproximadamente un 30 %, preferiblemente en al menos aproximadamente un 40 %, y de forma más preferible en al menos aproximadamente un 50 %, en las 24 h del tratamiento, y en aproximadamente un 80 % con tratamiento repetido. Esta reducción se demostró mediante la hibridación in situ fluorescente (FISH) y el inmunoetiquetado y se confirmó su eficacia mediante electrofisiología y en las pruebas de la cinta sinfín. Estas excedieron de lejos todos los informes previos de la destrucción del AS-ON del ARNm de la AChE en otras células y tejidos.

En otra realización más de la invención, la ventana de tratamiento preferida de los oligonucleótidos candidatos se evaluó mediante FISH. La técnica de hibridación in situ es bien conocida de las personas expertas en la técnica, y se describe, por ejemplo en In situ Hybridization, Wilkinson, D.G. (Ed.) ISBN: 0199633274; In situ Hybridization for the Brain, Wisden W., Morris B.J. (Eds.), ISBN: 0127599207, PCR in situ Hybridization: A Practical Approach (Practical Approach Series 186), Herrington C.S., John O’Leary J., (Eds.) ISBN: 019963632X. Se encuentran disponibles protocolos detallados que se refieren a la hibridación in situ que usan sondas marcadas radioactivamente de Microsynth GmbH (Balgach, Suiza).

Se pueden usar secuencias de ARNc de la AChE-R etiquetadas como sondas para la hibridación in situ. La sonda de ARNc de la AChE comprende preferiblemente secuencias de 14 pseudointrones.

En una realización preferida de la invención, se llevó a cabo la determinación del ARNm de la AChE usando la RT-PCR in situ, cuya técnica se describe, por ejemplo, en las referencias anteriormente mencionadas, véase también la PCR in situ hybridization: Protocols and Applications, 3rd ed., por Nuovo, G.J. Lippincott, Raven Press, Nueva York (1996).

Los oligonucleótidos modificados con fosforotioato se consideran generalmente seguros y exentos de efectos secundarios. Peng y col. enseñan que los efectos secundarios in vivo no deseados de los oligonucleótidos antisentido de fosforotioato se pueden reducir cuando se usan como una estructura de fosfodiéster-fosforotioato mixta. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se ha encontrado que son eficaces como fosforotioatos parcialmente y aún más eficaces como oligonucleótidos 2’-O-metilo parcialmente protegidos. El documento WO 98/26062 enseña que los oligonucleótidos antisentido de la AChE que contienen tres enlaces de fosforotioato de aproximadamente veinte enlaces de internucleótidos son generalmente seguros para usar en concentraciones de entre aproximadamente 1 y 10 μm. Sin embargo, para aplicaciones a largo plazo, se pueden preferir oligonucleótidos que no liberan grupos tóxicos cuando se degradas. Estos incluyen oligonucleótidos 2’-O-metilo protegidos, pero no oligonucleótidos de fosforotioato. Una ventaja adicional de la protección 2’-O-metilo sobre la protección de fosforotioato es la reducida cantidad de oligonucleótido que se requiere para la supresión de AChE. Se cree que esta diferencia está relacionada con la mejora de la estabilidad de los dupletes obtenidos cuando se usan oligonucleótidos 1’-O-metilo protegidos [Lesnik, E.A. y Freier, S.M., Biochemistry 37, 6991-7, (1998)]. Una explicación alternativa para la mayor potencia de los oligonucleótidos 2’-O-metilo es que esta modificación puede facilitar la penetración de la cadena del oligonucleótido a través de la membrana celular. Una ventaja adicional de la protección de 2’-O-metilo es la mejor protección frente a la degradación mediada por nucleasa que esta confiere, extendiendo de esta manera el tiempo de vida útil del oligonucleótido antisentido protegido de esta manera.

De acuerdo con la invención, la dosificación del oligodesoxinucleótido antisentido es aproximadamente de 0,001 a 50 μg de oligonucleótido por gramo de peso corporal del animal tratado. Preferiblemente, la dosificación es aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 5,0 μg/g. Más preferiblemente, la dosificación está entre aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 μg/g. de esta manera, el intervalo de dosis óptimo está entre 50-500 μg/kg de peso corporal del animal tratado, para ratas y monos.

El oligonucleótido antisentido de la invención se proporciona para uso en el tratamiento de un trastorno que implica una producción excesiva de ARNm de la AChE.

El trastorno es preferiblemente un trastorno que implica cambios funcionales y morfológicos en la UNM.

El trastorno neuromuscular progresivo implica preferiblemente la expresión en exceso del ARNm de la AChE-R.

Más preferiblemente, el trastorno se selecciona entre, pero no se limita a, esclerosis múltiple, TEPT, miastenia grave, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, distonía, perturbación muscular, reinervación muscular o excesiva inervación muscular.

La excesiva inervación muscular se selecciona preferiblemente entre, pero no se limita a, excesiva inervación después de trauma, preferiblemente después de amputación.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, para mejorar la resistencia en el ejercicio físico y/o para el uso en la disminución de la fatiga muscular crónica, que comprende como principio activo el oligodesoxinucleótido sintético antisentido hEN101, que se denota por la SEQ ID NO: 1, y que comprende además opcionalmente agentes terapéuticos adicionales y o vehículos, excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento y/o la prevención de la miastenia grave.

El trastorno neuromuscular progresivo que se va a tratar y/o evitar mediante la composición farmacéutica de la invención está asociado con un exceso de la proteína AChE. Normalmente, dicha AChE excesiva será la variante o la isoforma AChE-R.

Además, dicha enfermedad neuromuscular progresiva que se va a tratar y/o evitar mediante la composición farmacéutica de la invención está asociada con el deterioro de la transmisión colinérgica. Dicho trastorno puede implicar la perturbación del músculo, la reinervación del músculo, o anomalías en la unión neuromuscular (UNM).

La composición farmacéutica de la invención es para uso en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno tal como la miastenia grave (MG) enfermedad de Eaton-lambert, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), trastorno por estrés postraumático (PSTD), esclerosis múltiple (EM), distonía, esclerosis posterior a ictus, daño muscular posterior a lesión, reinervación excesiva, parálisis posterior a cirugía de origen desconocido, y exposición posterior a inhibidores de la AChE.

En una realización, la composición farmacéutica de la invención es para uso diario por un paciente que necesita dicho

tratamiento, a una dosificación de principio activo entre aproximadamente 0,001 μg/g y aproximadamente 50 μg/g. Preferiblemente, el tratamiento y/o la prevención comprende administrar una dosificación de principio activo de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5,0 μg/g. Lo más preferible, dicha dosificación de principio activo está entre aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,50 μg/g, e incluso lo más preferible, la dosificación esta entre 0,15 a 0,50 μg/g de peso corporal del paciente.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligodesoxinucleótido antisentido que se denota por la SEQ ID NO: 1, para facilitar el paso de los compuestos a través de la BHE, que comprende opcionalmente además el agente farmacéuticamente activo adicional y/o el adyuvante, vehículo

o diluyente farmacéuticamente aceptable. El agente farmacéuticamente activo adicional es un compuesto que se va a transportar a través de la BHE. Estas composiciones farmacéuticas de la invención se pueden usar para el tratamiento de los trastornos asociados con el sistema nervioso central, particularmente dichos trastornos que requieren la administración de un agente activo en el SNC, por ejemplo, para el tratamiento de los tumores cerebrales. Los agentes quimioterapéuticos convencionales no pasan la BHE, y son por tanto ineficaces [de Angelis, L.M., N. Engl. J Med. 433, 114-123 (2001)]. Ya que los oligonucleótidos antisentido de la invención han demostrado penetrar la BHE, los tumores cerebrales podrían tratarse mediante la inyección o la administración oral del oligonucleótido antisentido de la invención, evitando o reduciendo la necesidad de procedimientos que requieren la invasión del SNC. Se pueden preparar oligonucleótidos antisentido específicos del tumor [Ratajczak M.Z. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11823-11827 (1992)]; por tanto, para que pasen la BHE, deben ser específicos y eficaces. De esta manera, los agentes farmacéuticos adicionales comprendidos en estas composiciones de la invención pueden ser, por ejemplo, fármacos carcinostáticos y metastásicos.

Son necesarios numerosos compuestos para el diagnóstico o el tratamiento de las dolencias que afectan el sistema nervioso central, en el que la BHE podría impedir normalmente su administración. Estas dolencias pueden incluir cualquier enfermedad o patología que incluya, pero no se limite a infecciones, trastornos neuroquímicos, tumores cerebrales y gliomas, desmielinación, otras neuropatías, encefalopatías, coma, isquemia, hipoxia, epilepsia, demencias, trastornos cognitivos, enfermedades neuropsiquiátricas, (como por ejemplo, depresión, ansiedad, esquizofrenia y similares), así como trastornos genéticos. De esta manera, dicho compuesto o agente farmacéuticamente activo adicional que se va a transportar a través de la BHE puede ser, por ejemplo, un agente de contraste (colorante) usado para la adquisición de imágenes del sistema nervioso central, fármacos tales como antibióticos o agentes quimioterapéuticos, vectores de terapia génica, o incluso, agentes que funcionan para bloquear los efectos de las toxicomanías. La administración y la dosificación de estos compuestos deberán ser de acuerdo con los que se conoce en la práctica médica, que generalmente tendría en cuenta la dolencia del paciente que necesita de dicho tratamiento, así como la edad, el sexo, el peso corporal y otros factores conocidos de dicho paciente por ser importantes en la práctica médica. El sitio y el procedimiento de administración deben escogerse también de acuerdo con esto. La cantidad farmacéuticamente eficaz para los fines del presente documento se determina de esta manera mediante dichas consideraciones que se conocen en la técnica. El compuesto se puede administrar de diversas maneras, tal como se describe para la administración de la composición (véase a continuación).

El compuesto que se va a transportar a través de la BHE puede administrarse simultáneamente con la composición de la invención o se puede administrar en algún momento durante el periodo biológicamente eficaz de la acción de la composición. En otras palabras, la composición de la invención facilita la perturbación de la BHE, es decir, abre la BHE, durante un periodo de tiempo dependiendo de su dosis y del compuesto que se va a administrar durante este periodo de “apertura”.

Para que sea eficaz, el oligonucleótido antisentido de la invención, también cuando está comprendido en una composición farmacéutica de la invención, debe desplazarse a través de las membranas celulares. En general, los oligonucleótidos antisentido tienen la capacidad de cruzar las membranas celulares, aparentemente mediante un mecanismo de captación saturable vinculado a receptores específicos. Como moléculas monocatenarias de oligonucleótidos antisentido, están en un grado hidrofóbico que potencia la difusión pasiva a través de las membranas. Se pueden introducir modificaciones a un oligonucleótido antisentido para mejorar su capacidad de cruzar las membranas. Por ejemplo, la molécula de oligonucleótido puede unirse a un grupo que comprenda opcionalmente una cadena de hidrocarburo alifático parcialmente insaturado y uno o más grupos polares o cargados tales como grupos de ácido carboxílico, grupos éster, y grupos alcohol. De forma alternativa, los oligonucleótidos pueden unirse a estructuras peptídicas, que son preferiblemente péptidos membranotrópicos. Dichos oligonucleótidos modificados penetran las membranas más fácilmente, lo que es crítico para su función y puede potenciar por tanto significativamente su actividad.

Gerster y col. [Anal. Biochem. 262, 177-84 (1998)] han descrito oligonucleótidos unidos a palmitilo. Shoji y col. [J. Drug Target 5, 261-73 (1998)] han descrito oligonucleótidos unidos a geraniol. Soukchareun y col. [Bioconjug. Chem. 9, 466-75 (1998)]. Han descrito péptidos membranotrópicos, y su preparación. Wang, J. [Controlled Release 53, 39-48 (1998)] describen modificaciones de moléculas antisentido u otros fármacos que dirigen la molécula a determinadas células y potencian la captación del oligonucleótido por dichas células.

Cualquiera de las composiciones de la invención son para uso mediante inyección, administración tópica o captación oral. Los usos preferidos de las composiciones farmacéuticas de la invención mediante inyección son la inyección subcutánea, la inyección intraperitoneal, y la inyección intraneuromuscular. Tal como se muestra en los siguientes

Ejemplos, también la administración oral probó ser muy eficaz.

Las composiciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden presentarse como unidades discretas tales como cápsulas, sobrecitos o comprimidos, que contienen cada uno una cantidad predeterminada del principio activo, como un polvo o gránulos; como una disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de agua en aceite o una emulsión líquida de aceite en agua. El ingrediente activo puede presentarse también como un bolo, electuario o pasta. Un comprimido puede prepararse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Pueden prepararse comprimidos comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, mezclarse opcionalmente con un aglutinante (por ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, desintegrante (por ejemplo, almidón glicolato de sodio, povidona reticulada, carboximetilcelulosa de sodio reticulada, agente tensioactivo o dispersante. Se pueden preparar comprimidos moldeados moldeando en una máquina una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden opcionalmente revestirse o almacenarse y se pueden formular de tal manera que proporciones una liberación lenta o controlada del principio activo del anterior usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado. Pueden proporcionarse opcionalmente comprimidos con un revestimiento entérico para proporcionar la liberación en partes del intestino diferentes de las del estómago.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden generalmente un agente tamponante, un agente que ajusta su osmolaridad, y opcionalmente, uno o más vehículos, excipientes y/o aditivos tal como se conoce en la técnica, por ejemplo, a fines de añadir aromas, colores, lubricación, o similares a la composición farmacéutica. Un agente tamponante preferido es la solución salina tamponada con fosfato (PBS), cuya solución se ajusta también para la osmolaridad.

Los vehículos pueden incluir almidón y sus derivados, celulosa y sus derivados, por ejemplo, celulosa microcristalina, goma xantana, y similares. Los lubricantes pueden incluir aceite de ricino hidrogenado y similar.

Una formulación farmacéutica preferida es una que carece de vehículo. Dichas formulaciones se usan preferiblemente para la administración mediante inyección, incluyendo la inyección intravenosa.

Se conoce bien en la técnica la preparación de las composiciones farmacéuticas y se ha descrito en muchos artículos y libros de texto, véase por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, y especialmente pp. 1521-1712 del anterior.

Se pueden diseñar también aditivos para potenciar la captación del oligonucleótido antisentido a través de las membranas celulares. Dichos agentes son generalmente agentes que potencian la captación celular de las moléculas de ADN bicatenario. Por ejemplo, se han desarrollado para este fin determinadas moléculas lípidas, que incluyen los reactivos de transfección DOTAP (Roche Diagnostics), Lipofectina, Lipofectam, y Transfectam, que están comercialmente disponibles. Para una comparación de diversos de estos reactivos en la potenciación de la captación del oligonucleótido antisentido véanse por ejemplo, Quattrone y col. [Biochemica 1, 25, (1995)] y Capaccioli y col. [Biochem. Biophys. Res. Comm. 197, 818 (1993). El oligonucleótido antisentido de la invención puede también encerrarse en liposomas. La preparación y el uso de los liposomas, por ejemplo, usando los reactivos de transfección anteriormente mencionados, son bien conocidos en la técnica. Otros procedimientos para obtener liposomas incluyen el uso del virus Sendai o de otros virus. Los ejemplos de publicaciones que dan a conocer la transferencia de oligonucleótidos en células usando la técnica de los liposomas son, por ejemplo, Meyer y col. [J. Biol. Chem. 273, 15621-7 (1998)], Kita y Saito [Int.

J. Cancer 80, 553-8 (1999)], Nakamura y col. [Gene Ther. 5, 1455-61 (1998)] Abe y col. [Antivir. Chem. Chemother. 9, 253-62 (1998)], Soni y col. [Hepatology, 28, 1402-10 (1998)], Bai y col. [Ann. Thorac. Surg. 66, 814-9 (1998) y véase también la discusión en la misma revista p. 819-20], Bochot y col. [Pharm. Res. 15, 1364-9 (1998)], Noguchi y col. [FEBS Lett. 433, 169-73 (1998)], Yang y col. [Circ. Res. 83, 552-9 (1998)], Kanamaru y col. [J. Drug Target. 5, 235-46 (1998)] y las referencias del anterior. Se describe en [J. Neurooncol. 39, 237-44 (1998)] el uso de Lipofectina en la captación del oligonucleótido mediada por liposomas. Se describe en Waelti y col. [Int. J. Cancer, 77, 728-33 (1998)] el uso de envueltas del virus de la gripe reconstituido con lípido catiónico fusogénico (virosomas catiónicos).

Los agentes lípidos catiónicos o no iónicos anteriormente mencionados no sirven solamente para potenciar la captación de oligonucleótidos en las células, sino que también mejoran la estabilidad de los oligonucleótidos que han sido captados por las células.

La invención se refiere también a un procedimiento para el tratamiento o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo u otra enfermedad que implica una excesiva producción de ARNm de la AChE-R, que comprende administrar el oligodesoxinucleótido de la invención o una composición farmacéutica de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, a un paciente que lo necesita.

En última instancia, la invención se refiere a un procedimiento para administrar un agente terapéutico para el tratamiento de un trastorno o enfermedad del SNC a un paciente que necesita dicho tratamiento, que comprende las etapas de administrar a dicho paciente el oligodesoxinucleótido antisentido de la invención y dicho agente terapéutico. La administración del agente terapéutico puede ser simultánea con la administración de la del oligodesoxinucleótido

antisentido de la invención que facilitará el paso del agente terapéutico a través de la BHE en el SNC, en el que se requiere su efecto.

Como se da a conocer y se describe, debe entenderse que esta invención no se limita a los ejemplos, etapas de procedimiento, y materiales particulares dados a conocer en el presente documento, ya que dichas etapas de procedimiento y materiales pueden variar algo. Debe entenderse también que la terminología usada en el presente documento es solo para los fines de las realizaciones particulares que se describen y no se pretende que esté limitada ya que el alcance de la presente invención estará limitado solo por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Debe señalarse que, tal como se usa en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “uno” y “el” incluye los referentes plurales a no ser que el contenido dicte claramente otra cosa.

A lo largo de esta memoria y de las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprende”, y variaciones tales como “comprenden” y “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un entero o etapa o grupo de enteros o etapas indicados pero no la exclusión de ningún otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.

Ejemplos

Procedimientos experimentales

Animales:

Ratas: Se indujo EAMG en ratas Lewis hembras (120-150 g) adquiridas del Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), y se alojaron en la Instalación para Animales en la Hebrew University Faculty of Medicine, de acuerdo con las directrices NIH. Los ratones FVB/N del control se sometieron a estrés por giro en confinamiento tal como describe [Kaufer y col., 1998 id ibíd.]. Ratones FVB/N transgénicos que expresaban en exceso la AChE-R tal como se ha detallado [Sternfeld y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8647-8652].

Monos: Se usaron una hembra y un macho de macaco de 15 meses de edad criados para ese fin.

Oligonucleótidos: Se adquirieron oligonucleótidos de calidad GLP purificados mediante HPLC (pureza > 90 % tal como se verificó mediante electroforesis capilar) de Hybridon, Inc. (Worchester, EE.UU.). Los oligonucleótidos liofilizados se volvieron a suspender en agua doblemente destilada (24 mg/ml), y se almacenaron a -20 ºC. se prepararon todos los oligonucleótidos con enlaces fosfodiéster pero en tres posiciones 3’ terminales se realizaron sustituciones con el ribonucleótido 2’-O-metilo. Las secuencias primarias usadas es este estudio fueron:

hEN101 5’-CTGCCACGTTCTCCTGCACC-3’ (AS3 humana, SEQ ID NO: 1

hEN101 2’-O-metilado (nucleótidos metilados marcados con *) 5’-CTGCCACGTTCTCCTGCA*C*C*-3’

mEN101 5’-CTGCAATATTTTCTTGCACC-3’ (AS3 de ratón, SEQ ID NO: 3) [Grifman, M., y Soreq,

H. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7, 351-9]

rEN101 5’-CTGCGATATTTTCTTGTACC-3’ (AS3 de rata, SEQ ID NO: 4) [documento WO98/26062]

rEN102 5’-GGGAGAGGAGGAGGAAGAGG-3’ (SEQ ID NO: 5) [documento WO98/26062]

r.invEN102 5’-GGAGAAGGAGGAGGAGAGGG-3’ (SEQ ID NO: 6) [Meshorer, E. y col. (2002) id ibíd]

Estabilidad de hEN101: se encontró que hEN101 era estable (> 90 % de la concentración original) después del almacenamiento durante 2 h en plasma humano con EDTA a temperatura ambiente, tras tres ciclos de congelación/descongelación, o después de 1 mes a -20 ºC. La exposición a temperatura ambiente de la sangre tratada con Li-heparina produjo una descomposición de hEN101 con una semivida del orden de 30 min.

Anticuerpos: Se prepararon anticuerpos policlonales de conejo dirigidos contra la AChE-R c terminal y se purificaron tal como se ha descrito [Sternfeld y col. (2000) ibíd.]. Los anticuerpos policlonales de cabra dirigidos contra AChR (C-20, S.C.-1448) eran de Santa Cruz, (Santa Cruz, CA).

Inducción de EAMG: Se purificó el receptor de la acetilcolina Torpedo (T-AChR) a partir de electroplax de T. californica mediante cromatografía de afinidad sobre resina de neurotoxina-sefarosa, tal como se ha descrito previamente [Boneva,

N. y col. (2000) Muscle & Nerve 23, 1204-8]. Se inmunizaron la ratas con 40 μg de T-AChR purificada emulsionada en adyuvante de Freund completo suplementado con 1 mg de M. tuberculosis H37Ra (Difco, Detroit MI). Se inyectaron los animales por vía subcutánea en las almohadillas de las patas posteriores y se proporcionó una inyección de refuerzo de la misma cantidad después de 30 días. Se administró una tercera inyección a los animales que no desarrollaron EAMG tras la segunda inyección. Se pesaron los animales y se inspeccionaron semanalmente durante el primer mes y diariamente después de la inmunización de refuerzo, para la evaluación de la debilidad muscular. Se clasificó el estado clínico de las ratas de acuerdo con: 0 – Sin debilidad definida (tiempo de carrera en la cinta sin fin, 23 ± 3 min); leve (1) – pérdida de peso > 3 % durante una semana, > 10 min tiempo de carrera en la cinta sin fin; moderado (2) – debilidad

moderada acompañada por débil agarre o grito con fatiga, pérdida de peso del 5-10 %, 3-5 min corriendo en la cinta sin fin; moderado-grave (3) – debilidad moderada a grave, postura con el dorso jorobado en el resto, cabeza inclinada , dedos de las extremidades anteriores en flexión, ambulación con temblor, pérdida de un 10 % del peso corporal, 1-2 min. de carrera en la cinta sin fin); grave (4) debilidad general grave, sin grito o agarre, tiempo de carrera en la cinta sin fin < 1 min, pérdida de peso > 10 %; (5) – muerte.

Determinación del anticuerpo dirigido contra AChR. Se evaluó el suero mediante radioinmunoensayo directo, usando 125I-a bungarotoxina (BgT) unida a T-AChR y a AChR de rata (R) [Boneva y col. (2000) id ibíd]. Todas las ratas EAMG presentaron unos elevados títulos de anti-T-AChR o anti-R-AChR con unos valores promedio ± error estándar (SE) en suero de 82,1 ± 16,0 nM para anticuerpo dirigidos contra T-AChR y 19,9 ± 1,8 nM para los anticuerpos dirigidos contra R-AChR. Se ensayó suero humano para el nivel de anticuerpos dirigidos contra AChR tal como se ha descrito anteriormente [Drachman, D.B. (1994) N Engl J Med 330, 1797-810].

Cuantificación de nAChR: Se determinó la concentración de AChR en los músculos gastrocnemio y tibialis usando la unión de 125I-a-BgT seguida por precipitación por sulfato de amonio saturado tal como se ha descrito anteriormente [Boneva y col. (2000) id ibíd].

Inmunohistoquímica: Se desparafinaron secciones de músculo con xileno y se volvieron a hidratar en disoluciones de etanol de calidad decreciente (100 %, 90 %, 70 %) y PBS. Se llevó a cabo del antígeno inducida térmicamente mediante tratamiento con microondas (800 W para una rápida ebullición tras 10 min a intensidad reducida) en 500 ml de tampón citrato 0,01 M pH 6,0. Se enfriaron los portas a temperatura ambiente y se enjuagaron en agua doblemente destilada. Se bloqueó la unión específica en suero normal de burro al 4 % en PBS con Triton X-100 al 0,3 % y Tween 20 al 0,05 % (1 h a temperatura ambiente). Se diluyó el anticuerpo primario biotinilado (1:100 y 1:30 para anticuerpo de conejo dirigido contra AChE-R [Sternfeld y col. (2000) id ibíd] y anticuerpo de cabra dirigido contra nAChR, respectivamente), en el mismo tampón y se incubaron los portas 1 h a temperatura ambiente tras una incubación durante la noche a 4 ºC. se enjuagaron e incubaron las secciones con anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina, se diluyeron en el mismo tampón de bloqueo 1 h a temperatura ambiente y a continuación durante la noche a 4 ºC. La detección fue con el sustrato de la fosfatasa alcalina Fast Red (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se transfirieron los portas simultáneamente a una disolución de detención (EDTA 25 mM, Triton X-100 al 0,05 %, levamisol 1 mM en PBS, pH 7,2), se enjuagaron en PBS y se recubrieron tapándolos con Immunomount (Shandon).

Para las secciones de la médula espinal, se diluyó anticuerpo primario de ratón dirigido contra SC35 (1:100) en el mismo tampón que los anticuerpos primarios anteriores, y se incubaron los portas 1 h a temperatura ambiente tras una incubación durante la noche a 4 ºC. Se enjuagaron e incubaron las secciones con anticuerpo secundario de cabra conjugado con peroxidasa dirigido contra ratón, se diluyeron en el mismo tampón de bloqueo, durante 1 h a temperatura ambiente y a continuación durante la noche a 4 ºC. Se llevó a cabo la detección con sustrato DAB (Sigma). Los portas se recubrieron tapándolos con Immunomount (Shandon, Pittsburgh, PA).

Electromiografía: Se anestesiaron las ratas mediante inyección i.p. de 2,5 mg/Kg de pentobarbital, se inmovilizaron, y se sometieron a estimulación repetitiva del nervio ciático, usando un par de electrodos de aguja concéntricos a 3 Hz. Se registró el valor inicial del potencial de acción muscular compuesto (PAMC) mediante un electrodo de aguja concéntrico colocado en el músculo gastrocnemio, tras un adiestramiento de estimulaciones nerviosas repetitivas a una intensidad supramáxima. Se determinó la disminución (porcentaje) de la amplitud del quinto frente al primer potencial de acción muscular en dos conjuntos de estimulaciones repetitivas par cada animal. Una reducción del 10 % o más se consideró indicativa de una disfunción en la transmisión neuromuscular.

Administración del fármaco. Las inyecciones intravenosas y el muestreo de la sangre para los anticuerpos dirigidos contra AChR fueron a través de la vena yugular derecha con anestesia, Para la administración oral, se usó una aguja especial para la administración mediante sonda nasogástrica oral, que estaba curvada con un extremo redondeado (Stoelting, Wood Dale IL). Se administró Mestinon® en una dosis de 1 mg/kg/día, y se adquirió de Hoffmann La-Roche, Basel, Suiza.

Adiestramiento de ejercicio sobre la cinta sin fin: Para establecer una medida clínica del comportamiento neuromuscular en ratas EAMG, se llevó a cabo un ensayo de cinta sin fin. Se colocaron los animales sobre una cinta sin fin alimentada eléctricamente [Moran y col. (1996) J Therm Biol 21, 171-181] a 25 m/min (un esfuerzo físico de moderada intensidad) hasta que se fatigaron visiblemente. Se registró la cantidad de tiempo que los animales fueron capaces de correr antes y después del tratamiento antisentido o el Mestinon®.

Hibridación in situ: Se fijaron los tejidos en paraformaldehído al 4 % y se cortaron en secciones de 7 μm inmersas en parafina. Se desparafinaron secciones de la médula espinal, se rehidrataron usando diluciones en serie en etanol y se permeabilizaron con proteinasa K (10 μg/ml a temperatura ambiente). Se expusieron los portas a sondas de 50 mer específicas de AChE-R o AChE-S 5’biotiniladas, completamente 2’ oximetiladas complementarias al pseudointrón 4 o al exón 6 de ACHE humano, respectivamente [Grisaru y col. (2001) id ibíd.]. Se llevó a cabo la hibridación durante la noche a 52 ºC en mezcla de hibridación que contenía 10 μg/ml de sonda, 50 μg/ml de ARNt de levadura, 50 μg/ml de heparina y formamida al 50 % en cloruro de sodio 375 nM, citrato de sodio 37,5 mM, pH 4,5. Para las secciones de mono, se construyó la sonda de acuerdo con la secuencia de la AChE-R humana; para las secciones de rata, de acuerdo con la

secuencia de ratón. Se lavaron los portas para eliminar la sonda no hibridada, se bloquearon con leche desnatada al 1 % que contenía Tween-20 al 0,01 %, y levamisol 2 mM, se usó un inhibidor de la fosfatasa alcalina para suprimir la tinción no específica e incubar con estreptavidina-fosfatasa alcalina (Amersham Pharmacia). Se usó sustrato Fast RedTM (Roche Diagnostic) para la detección. La tinción DAPI (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) sirvió para visualizar los núcleos. Se analizaron las imágenes del microscopio con el software Image Pro Plus 4.0 (Media Cybernetics)

Análisis del suero: Se extrajeron muestras de sangre de ratas EAMG y se sometieron pacientes con MG a electroforesis en gel no desnaturalizante tal como se describe por [Kaufer y col. (1998) id ibíd], así como a medidas de la actividad catalítica de AChE [Shapira y col. (2000) id ibíd]. Se usó iso-OMPA (tetraisopropilpirofosforamida, 5x10-5 μM), para bloquear la actividad de la butirilcolinesterasa en las muestras de suero. Para la tinción de la actividad en geles de poliacrilamida [Kaufer y col. (1998) id ibíd] los inventores usaron 5x10-6 M de iso-OMPA.

Ejemplo 1

AChE-R se acumula en la sangre y el músculo de ratas EAMG

Tal como los inventores habían demostrado anteriormente, la variante AChE-R migra en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes más rápidos que la enzima tetramérica sináptica, AChE-S [Kaufer y col. (1998) id ibid.], y está presente en el suero de pacientes con MG [WO01/36627]. De forma similar, el análisis mediante inmunotransferencia confirma que en las ratas EAMG, con comparación con las ratas sanas, se producía un aumento masivo de AChE-R en suero (Fig. 7).

La expresión de las variantes alternativas de AChE (Fig. 8A), así como del receptor nicotínico de la acetilcolina (nAChR), se ensayó en ratas del control y EAMG. Se detectó el agotamiento de nAChR en las secciones musculares de las ratas EAMG, según evidenció un ensayo cuantitativo usando anticuerpos dirigidos contra nAChR (Fig. 8B, 1 y 2). La inmunotinción mostró que todo el nAChR muscular se redujo en un 48 ± 7 % respecto de los valores normales en 10 animales levemente afectados (grados de enfermedad 1-2, véanse los Procedimientos experimentales) y en un 75 ± 5 % en 10 ratas gravemente afectadas (grado 4) en comparación con los controles (Fig. 8B, 1 y 2), atestiguando la naturaleza miasténica de este modelo animal. La tinción inmunohistoquímica con un antisuero policlonal de detectaba selectivamente AChE-R [Sternfeld y col. (2000) id ibid] reveló señales positivas en algunas, pero no todas, las fibras musculares de las ratas del control. Aparecieron diseños similares con el tratamiento con el oligonucleótido r- invEN102 inerte de orientación inversa (véase la Fig. 8B, 3). En ratas EAMG (Fig. 8B, 4), la tinción con AChE-R la mostró distribuida de una forma más general, con la ubicación citoplasmática dispersa que es característica de esta isoforma [Soreq, H., y Seidman, S. (2001) Reviews Neuroscience 2, 294-302], en contraste con la distribución subsináptica agrupada de la variante sináptica [Rossi, S. G. y Rotundo, R. L. (1993) J Biol Chem 268, 19152-9]. Tanto el nivel de expresión como la distribución celular de AChE-S en el músculo fueron similares en las ratas EAMG y las ratas sanas no tratadas, así como en las ratas tratadas con r-invEN102.

La hibridación in situ usando sondas selectivas para variantes demostró que el ARNm de la AChE-S estaba ubicado subsinápticamente en músculos de las ratas tanto no tratadas como tratadas con r-invEN102, en las ratas sanas y las ratas tratadas con EAMG (Fig. 8B, 5 y 6). En contraste, las ratas sanas mostraron un marcado más débil y difuso del transcripto de ARNm de AChE-R, mientras que apareció un marcado puntuado más intenso de ARNm de AChE-R en los músculos tríceps de las ratas EAMG, no afectadas por el tratamiento con r-invEN102 (Fig. 8B, 7 y 8). Esta acumulación en regiones ricas en núcleos densamente agrupados fue consistente con las observaciones anteriores de las regiones subsinápticas [Rossi y Rotundo (1993) id ibid]. Estos datos indican una expresión en exceso selectiva de AChE-R en los músculos de ratas del control EAMG y reforzar la idea del papel de esta variante enzimática en la patofisiología de MG.

Ejemplo 2

Los niveles de AChE-R y de ARNm de AChE-R en el músculo responden a rEN101

La naturaleza soluble y secretora de AChE-R establece que esta podría degradar la acetilcolina antes de alcanzar la membrana postsináptica, limitando de esta forma la activación del receptor. Para probar esta hipótesis, se usó el oligonucleótido antisentido rEN101, que puede suprimir de forma selectiva la producción de AChE-R [Galyam, N. y col. (2001) Antisense Nucl Acid Drug Dev 11, 51-57]. La supresión de AChE-R se ensayó en ratas sanas y ratas EAMG con niveles musculares reducidos en nAChR (Fig. 8B, 1 and 2) 24 h después de una única inyección i.v. de 250 mg/kg de rEN101. La tinción inmunohistoquímica demostró que AChE-R, pero no AChE-S, se redujo significativamente en los músculos tanto de las ratas sanas como de las ratas EAMG (Fig. 8C, 3 y 4 y datos no mostrados). Los diseños de etiquetado del receptor permanecieron elevados en las ratas sanas y bajos en los animales EAMG, de forma similar a los de los animales no tratados, y en los animales tratados con r-invEN102 (comparar la Fig. 8B, 1 y 2 con la Fig. 8C, 1 y 2). La hibridación in situ indicó que el marcado con ARNm de AChE-S, limitado a los sitios de los agrupamientos de núcleos subsinápticos, solo quedó nominalmente afectada por rEN101, indicando que la transmisión neuromuscular no se vería afectada por este tratamiento (Fig. 8C, 5 y 6). En contraste, rEN101 redujo el marcado con ARNm de AChE-R por lo menos hasta el límite de detección tanto en ratas sanas como en ratas miasténicas (Fig. 8C, 7 y 8).

Ejemplo 3

La supresión de AChE-R restaura el PAMC normal en ratas EAMG

La cuantificación por densitometría de un análisis por inmunotransferencia confirmó el aumento de AChE-R en suero en ratas EAMG y la eficacia de una única inyección i.v. de 250 mg/kg de rEN101, pero no de r-invEN102, en la reducción de 5 su nivel en suero 24 h después (Fig. 9A). Para evaluar el resultado fisiológico de esta supresión, se registraron los potenciales de acción muscular (PAMC) del músculo gastrocnemio. Las ratas EAMG, pero nunca los animales sanos, mostraron una disminución en los PAMC durante la estimulación repetida a 3 Hz. Con la disminución del valor inicial, la diferencia porcentual en las alturas del quinto y el primer potencial evocado estuvo en un intervalo del 10 % al 36 % (promedio ± SEM = 13,0 ± 2,5 %, Fig. 9B, recuadro) en comparación con 4,0 ± 0,9 % entre ratas sanas. El tratamiento 10 estándar de los pacientes de MG es la administración de anticolinesterasas, que aumentan los niveles de ACh hasta un umbral que permite la activación del receptor. Según esto, se administró por vía i.p. bromuro de neostigmina (Prostigmine™, 75 !g/kg). Este corrigió de forma rápida y eficaz el declive de PAMC en ratas EAMG, desde un 87,6 % del primer potencial evocado en los animales no tratados hasta más del 120 % de este nivel (es decir, 107,4 % del primer potencial evocado). Los efectos del bloqueo de la colinesterasa fueron evidentes a partir de los 15 min tras la inyección y

15 duraron 2 h, tras dicho plazo el valor de PAMC volvió al valor inicial (Fig. 9B).

A diferencia de las anticolinesterasas, que bloquean todas las variantes de AChE, se demostró que rEN101 suprimía selectivamente la producción de AChE-R en el músculo [Lev-Lehman y col. (2000) id ibid]. Por tanto, la recuperación de un PAMC estable en ratas EAMG tratadas con rEN101 puede atestiguar el papel causal de AChE-R en la disfunción neuromuscular que es característica del fenotipo miasténico. Para probar este concepto, se inyectó rEN101 por vía i.v. en

20 dosis comprendidas en el intervalo 10-500 !g/Kg (2 a 20 nmol/rata). rEN101 no afectó los PAMC en los animales sanos, pero recuperó índices de PAMC estables en 1 h (Fig. 9B, recuadro, 9C y Tabla 1). La normalización de los PAMC vino acompañada de un aumento de la movilidad, postura erguida, mejor agarre, y una reducción en los temblores durante la ambulación.

Tabla 1. Índices de PAMC después del tratamientoa

Oralb

Intravenosob

FenotipoTratamiento

Sin tratamiento anterior EN101 EAMG EN101 EAMG EN102 EAMGinvEN102 EAMGpiridostigmina Sintratamiento anterior EN101 EAMG EN101 EAMG EN102 EAMGinvEN102

0h

1,01 ± 0,01(4) 0,84 ± 0,03(8) 0,82 ± 0,02(4) 0,78 ± 0,06(4) 0,90 ± 0,01 (6) 1,00 ± 0,0 (6) 0,87 ± 0,01 (6) 0,85 ± 0,06(4) 0,89 ± 0,02(5)

1 hc

1,0 ± 0,02 (4) 0,97 ± 0,02(8) 0,86 ± 0,04(3) 0,86 ± 0,05(4) 0,98 ± 0,01 (6) 0,02 ± 0,01(7) 1,00 ± 0,01(4) 1,04 ± 0,01(4) 0,89 ± 0,03(5)

5h

1,03 ± 0,02(4) 0,97 ± 0,03(7) 0,96 ± 0,02(4) 0,86 ± 0,05(4) 0,96 ± 0,02 (6) 1,00 ± 0,01(6) 0,98 ± 0,02(4) 0,98 ± 0,03(4) 0,89 ± 0,02(5)

24 h

1,01 ± 0,00(7) 1,01 ± 0,01(6) 0,95 ± 0,03(5) 0,81 ± 0,08(4) 0,87 ± 0,02 (6) 1,02 ± 0,01(6) 1,00 ± 0,00(4) 1,00 ± 0,01(4) 0,90 ± 0,02(5)

a Los índices de PAMC (amplitud 5ª vs. 1ª) se determinaron en los tiempos indicados después del tratamiento. Se muestran los promedios ± SEM. Cada tratamiento representa un número de ratas similar, aunque no ratas tratadas simultáneamente, cuyo número se muestra entre paréntesis. b Las dosis de fármacos fueron de 50 !g/kg para rEN101, rEN102 o r-invEN102 y de 1000 !g/Kg para piridostigmina (Bromuro de mestinon), para ambas rutas deadministración.c Tenga en cuenta el efecto aparentemente retrasado del rEN102 administrado oralmente en comparación con rEN101 o piridostigmina.

Tanto la extensión como la duración de la corrección de los PAMC fueron dependientes de la dosis. Por ejemplo, 500!g/Kg proporcionaron � 72 h de rectificación de los PAMC de hasta un 125 % del valor inicial, mientras que 50 !g/kg fueron eficaces durante solo 24 h. rEN102, un AS-ON con el extremo 3’ protegido dirigido a una secuencia única para el ARNm de rAChE-R (anteriormente denominado como AS1) [Grifman y Soreq (1997) id ibid], indujo una rectificación similar del declive de los PAMC en ratas EAMG, confirmando la relevancia de of AChE-R como un elemento contribuyente a este efecto. Cantidades comparables de r-invEN102 no mejoraron la función muscular, atestiguando la especificidad de secuencia del tratamiento con AS-ON (Tabla 1). Las curvas dosis-respuesta revelaron que hasta 5 h después de la inyección, rEN101 produjo una respuesta saturada con CI50 de <10 !g/kg. Este efecto pareció superponerse a un efecto de mayor duración y menos dependiente de la dosis, que no mostró saturación en el intervalo estudiado (Fig. 9D). Este fenómeno reflejó posiblemente las propiedades alteradas del músculo y la unión neuromuscular con la recuperación estable de los PAMC conseguida mediante rEN101.

Ejemplo 4

La prevención antisentido de la acumulación de AChE-R estimula la resistencia en ratas EAMG

Colocada en una cinta sin fin ajustada a 25 m/min, ratas sanas corrieron durante 23,0 ± 3,0 min, tras dicho tiempo mostraron signos visibles de fatiga. A partir de las 5h, y durante al menos 24 h tras la administración de 250 %g/kg de rEN101, las ratas EAMG demostraron un rendimiento mejorado en la cinta sin fin. El tiempo de carrera aumentó desde 247 ± 35, 179 ± 21 y 32 ± 6 s hasta 488 ± 58, 500 ± 193 y 212 6 59 s para animales con grados de enfermedad 2, 3 y 4, respectivamente (valores promedio para 6 -9 animales por grupo). Por el contrario, los animales sanos no se vieron significativa mente afectados por la inyección de rEN101 (Fig. 10).

Otros han demostrado la eficacia de los agentes AS-ON protegidos con 2’-oximetilo administrado oralmente [Monia, B. P. (1997) Ciba Found. Symp. 209, 107-119]. Por tanto, los inventores probaron este modo en el modelo EAMG. Basándose en sus propios hallazgos, los inventores seleccionaron la dosis de 50 !g/kg de rEN101, que se administró a las ratas EAMG una vez al día mediante sonda nasográstrica oral, y se midieron los PAMC 1, 5, y 24 h después. Esta dosis fue tan eficaz como la dosis de 25 !g/Kg administrada i.v. (Tabla 1 y Figs. 9 y 13). rEN102 administrado oralmente fue también activo en la reversión del declive de los PAMC, pero su efecto parece algo retrasado en comparación con rEN101. La piridostigmina oral (1000 !g/kg) restauró los PAMC durante varias horas, mientras que r-invEN102 no tuvo un efecto significativo (Tabla 1).

Ejemplo 5

Administración oral de EN101 humano a ratas EAMG

EN101 humano (hEN101) (0,25 !g/g, dosis única) se administró oralmente a ratas con EAMG de gravedad intermedia (puntuación 2,5 – 3,5), que implicaba los síntomas definidos como "moderados" anteriormente en el presente documento. Los resultados se han resumido en la Tabla 1. El tiempo desde el tratamiento se ha indicado arriba; junto con el tiempo de carrera en la cinta sin fin en segundos. En cada punto temporal, los animales se sometieron a exploración para evaluar la debilidad muscular. El estado clínico de las ratas se valoró de acuerdo con: (0) – Sin debilidad definida (s (tiempo de carrera en la cinta sin fin, 23 ± 3 min); Leve (1) – pérdida de peso >3 % durante una semana, >10 min de tiempo de carrera en la cinta sin fin; Moderada (2) – debilidad moderada acompañada por debilidad en el agarre o grito con fatiga, pérdida de peso de 5-10 %, 3-5 min de carrera en la cinta sin fin; Moderada-grave (3) - debilidad moderada a grave, postura en descanso con joroba, cabeza inclinada, y dedos de las extremidades anteriores en flexión, ambulación con temblores, 10 % pérdida de peso corporal, 1-2 min de carrera en la cinta sin fin); Grave (4) - debilidad general grave, sin grito ni agarre, tiempo de carrera en la cinta sin fin < 1 min, pérdida de peso >10 %; Muerte (5).Cada línea representa una rata individual. Debe resaltarse que la puntuación clínica (entre paréntesis) se redujo en todos los animales tratados, lo que refleja mejora temporal, y que el tiempo de carrera aumentó significativamente a las 5 y 24 h para la mayoría de los animales y para dos de los animales tratados, también a las 48 h.

Tabla 2

Comportamiento del tiempo de carrera (Puntuación clínica)

Animal

antes (basal) 5 h 24 h 48 h Efecto

1

110 s (3) 150 s 360 s (1) ND ++

2

0 (3,5) 70 s 30 s (3) ND +

3

210 s (2,5) 300 s 345 s (1) ND ++

4

80 (3) ND 170 s (2) 85 (2,5) +

5

180 (2,5) | | | | 380 , (1) 290 (2) ++

6

30 (3,5) 120 | | | | (3) | | (5) +

Estos resultados de muestran que análogamente al EN101 de rata (véase el ejemplo de la cinta sin fin, más arriba), el oligodesoxinucleótido antisentido humano EN101 de la invención estimuló la resistencia muscular en ratas con EAMG inducida.

Ejemplo 6

Análisis comparativo de hEN101 y rEN101 en un modelo animal de rata

Se llevó a cabo un estudio tanto de la posible eficacia como de la toxicidad de hEN101 sobre ratas Crl:CD de 4 semanas de edad. En grupos de 12 animales (6 machos, 6 hembras) se administraron 0,0 (solo solución), 0,50 o 2,50 !g/g/día de hEN101 mediante sonda nasográstrica oral (o.g.), 0,50 !g/g/día de rEN101 mediante o.g., o 0,50 !g/g/día de rEN101 o hEN101 mediante inyección i.v. Además, hubo un grupo de control que no recibió inyecciones. Durante 7 días, los animales se examinaron en busca de signos importantes de toxicidad: mortalidad, peso corporal, consumo de alimento, oftalmología, hematología (sangre periférica) y perfil químico sanguíneo. A los 7 días, se sacrificaron y examinaron post mortem para determinar la patología macroscópica y el peso de los órganos. Secciones fijadas del cerebro (cerebelo, cerebro, mesencéfalo, médula), corazón (regiones auricular y ventricular), riñones (regiones de la corteza, médula, papila), hígado (todos los lóbulos principales), pulmones (dos lóbulos principales, incluyendo los bronquios), ganglios linfáticos (mandibular y mesentérico), espina dorsal (secciones transversal y longitudinal a la altura cervical, lumbar y torácico), intestino ciego, colon, duodeno, íleon, yeyuno, esófago, recto, bazo y estómago (queratinizado, glandular y píloro) se tiñeron con hematoxilina/eosina para revelar necrosis o muerte celular.

Los ganglios linfáticos mandibulares se examinaron para determinar el efecto de EN101 sobre el ARNm de la AChE-R. En comparación con el control que había recibido solución salina inyectada, rEN101 (oral o i.v.) o hEN101 (i.v.) fueron inconsistentes al disminuir los niveles de ARNm de la AChE-R dentro de dichos ganglios linfáticos (no se muestran los datos). En contraste, la administración de rEN101 (oral o i.v.) o hEN101 (i.v.) no afectó a la expresión de la variante sináptica AChE-S de AChE en estos ganglios linfáticos mandibulares (no se muestran los datos). De este modo, el oligodesoxinucleótido antisentido de la invención se puede usar para suprimir la variante AChE-R sin afectar la expresión de la variante sináptica, es decir, sin afectar adversamente a la transmisión colinérgica.

Ejemplo 7

La supresión de AChE-R modifica la evolución de la patofisiología de EAMG

Como se muestra en el Ejemplo 5, a diferencia de las anticolinesterasas, rEN101 consiguió el mantenimiento de PAMC estables. Esto permitió adicionalmente a los inventores probar si el desequilibrio colinérgico contribuye al deterioro fisiológico que es característico de EAMG. Las ratas se trataron en primer lugar con rEN101 una vez al día durante 5 días. Los PAMC se determinaron antes de cada tratamiento. Tanto la eficacia de rEN101 para recuperar PAMC normales como su capacidad para reducir la variabilidad entre animales de los valores de los PAMC alcanzó niveles similares a los de la piridostigmina (Fig. 11A y 11B). Sin embargo, el inicio de la respuesta la piridostigmina fue más rápido (Tabla 1), mientras que el observado con rEN101 fue más prolongado. La administración diaria oral o i.v de rEN101 estabilizó los PAMC durante la totalidad del tratamiento (Fig. 11B). Por el contrario, el efecto de la piridostigmina desapareció a las pocas horas, ocasionando fluctuaciones pronunciadas en el estado del músculo (Tabla 1 y Fig. 11). Entre los animales tratados diariamente con piridostigmina, 5 de 6 murieron a lo largo de los 5 días del experimento. Por el contrario, 6 de los 8 animales tratados una vez al día con el rEN101 vía o.g. sobrevivieron al periodo de 5 días. Esta importante diferencia podría reflejar la susceptibilidad de las ratas EAMG a la repetición de la anestesia y medidas de PAMC. Para evitar estas tensiones adicionales y evaluar el efecto del tratamiento antisentido sobre la patofisiología del EAMG, los inventores sometieron a grupos de animales moderadamente enfermos a 1 mes de tratamiento oral diario con interferencia mínima. Las ratas EAMG que recibieron dosis orales de rEN101 diariamente presentaron una mejora significativa en la supervivencia, estado clínico y rendimiento en la cinta sin fin, en comparación con los animales tratados con piridostigmina y solución salina (Fig. 12; P<0,041 para incidentes de supervivencia a las 4 semanas, test exacto de Fisher, AS-ON vs. otros tratamientos). El ANOVA de una vía sobre medidas repetidas proporcionó P<0,05 para el resto de las medidas (AS vs. otros tratamientos a las 4 semanas). El efecto de rEN101 sobre los síntomas clínicos también se corroboró mediante los cambios en el peso corporal. Las ratas tratadas con solución salina y los grupos tratados con Mestinon perdieron 13,5 y 11 g/animal, respectivamente, mientras que los animales tratados con rEN101 ganaron de media 13 g durante el periodo de tratamiento. Así, la administración diaria de rEN101 estimuló el cambio prolongado en la evolución de EAMG en ratas con síntomas de moderados a graves, en las mismas condiciones en las que los animales no tratados o tratados con piridostigmina se deterioraron.

Usando MG y EAMG como casos de estudio para evaluar las consecuencias del desequilibrio neuromuscular en el nivel de la expresión génica, los inventores han confirmado que la variante AChE-R está sistémicamente elevada en MG y EAMG. Adicionalmente, los inventores han demostrado que la supresión antisentido de AChE-R normalizó las respuestas de la UNM a la estimulación nerviosa repetida, estimulando la resistencia del músculo y recuperando un estado más saludable en animales que estaban demasiado débiles incluso para comer. Estas observaciones respaldan la idea de AChE-R desempeña un papel directo en la patofisiología de MG y es un intento de evaluar el fundamento de la terapia prolongada dirigida al ARNm contra el desequilibrio de la función colinérgica en las UNM.

Ejemplo 8

Administración oral de hEN101 a macacos

Este experimento se llevó a cabo con seis macacos (3 machos y 3 hembras) criados a este fin de 15 meses de edad (adultos jóvenes) divididos en tres grupos (1, 2 y 3) compuestos por un macho y una hembra cada uno. Los grupos 1 y 2 recibieron hEN101 diariamente mediante o.g. durante un periodo de 7 días, a una concentración de 0,15 y 0,50 !g/g/día, respectivamente. El grupo 3 recibió inyecciones i.v. diarias de hEN101 durante un periodo de 7 días, con una dosificación de 0,50 !g/g/día.

Durante un periodo de 12 horas, se tomaron muestras de plasma durante el segundo día de tratamiento para investigar el perfil toxicocinético en cada dosificación. El estudio toxicológico consistió en explorar a los animales durante los 7 días de tratamiento en busca de signos importantes de toxicidad mediante los siguientes parámetros; mortalidad, peso corporal, consumo de alimento, electrocardiografía, presión arterial, hematología (sangre periférica) y perfil químico sanguíneo. A los 7 días, los monos se sacrificaron y examinaron post mortem para determinar la patología macroscópica y el peso de los órganos. Secciones fijadas del cerebro (cerebelo, cerebro, mesencéfalo, médula), corazón (regiones auricular y ventricular), riñones (regiones de la corteza, médula, papila), hígado (todos los lóbulos principales), pulmones (dos lóbulos principales, incluyendo los bronquios), ganglios linfáticos (mandibular y mesentérico), espina dorsal (secciones transversal y longitudinal a la altura cervical, lumbar y torácico), intestino ciego, colon, duodeno, íleon, yeyuno, esófago, recto, bazo y estómago (queratinizado, glandular y píloro) se tiñeron con hematoxilina/eosina para revelar necrosis o muerte celular

Estas investigaciones clínicas no revelaron efectos toxicológicos debidos a ninguno de los protocolos del tratamiento. El análisis post-mortem no descubrió efectos relacionados con el tratamiento salvo ligeras erosiones en cicatrización en el cuerpo del estómago posiblemente asociadas con el tratamiento, en 1 de 2 animales en cada grupo, y cierta irritación del tejido perivascular en el punto de la inyección intravenosa.

Se examinaron secciones de la espina dorsal de 7 mm incluidas en parafina mediante hibridación in situ para determinar los niveles de ARNm de AChE-R y AChE-S. Para las tres pautas (oral 0,15 y 0,50, e i.v. 0,50 !g/g/día), no hubo reducción aparente en el ARNm de AChE-S (Fig. 14). Sin embargo, hubo una reducción significativa en el ARNm de AChE-R al aumentar la dosis diaria de hEN101 desde 0,15 (oral) a 0,50 (oral o i.v.) siendo la dosis i.v. más eficaz.

Las secciones positivas para AChE-R de la espina doras de los monos se analizaron para determinar la relación entre el diámetro del cuerpo celular y el porcentaje de células positivas para AChE-R (Fig. 15). Las células se dividieron en tres clases en función de su diámetro del cuerpo, y se evaluó el porcentaje de células positivas para AChE-R en cada clase. El tratamiento con la menor concentración de EN101 (150 !g/g/día) produjo un aumento en el porcentaje de las células positivas para AChE-R pequeñas (diámetro <70 mm) en comparación con los monos no sometidos a tratamiento, probablemente debido a la respuesta al estrés de inyección en el punto, que se sabe que aumenta los niveles de ARNm de AChE-R (Kaufer y col, 1998). La administración tanto i.v. o p.o. de la concentración mayor de EN101 (500 g/g/día) redujo el porcentaje de neuronas positivas para AChE-R, en comparación con la concentración inferior (p <0,05, prueba de la t de Student). La disminución fue más notable en neuronas pequeñas (23-40 mm) que en neuronas con un diámetro del cuerpo celular de 40-70 mm, y no se observó disminución en neuronas grandes (diámetro >70 mm) (Fig. 15). El porcentaje de neuronas pequeñas (diámetro de 23 a 40 mm) y de tamaño intermedio (40 a 70 mm) marcadas disminuyó significativamente al desplazarse de la dosis oral de hEN101 inferior hasta la superior, e incluso más con la administración i.v. Entre las neuronas más grandes (>70 mm), no se produjo efecto apreciable del hEN101. Los inventores de la presente invención han descubierto por tanto la correlación funcional para el tamaño de célula que determina la eficacia de la supresión antisentido de la expresión de AChE-R. Esto sugiere que EN101 evitará el desequilibrio inducido por estrés en la entrada de las interneuronas hacia las motoneuronas, evitando de esta forma la parálisis –por ejemplo, posterior a la cirugía.

Ejemplo 9

Supresión mediante hEN101 de la actividad de AChE en plasma de mono

En las 12 h posteriores al Segundo día de administración de hEN101, se recogieron y almacenaron muestras de plasma de mono. Las actividades de la colinesterasa en plasma se midieron mediante espectrofotometría para evaluar la tasa de hidrolisis de acetiltiocolina (medida por el ensayo de Ellman, que cuantifica la hidrólisis de la acetiltiocolina) [Ellman, G.L., y col. (1961), Biochem. Pharmacol. 7, 88-95], en ausencia o presencia de iso-OMPA (un inhibidor selectivo de la butirilcolinesterasa, BChE). La actividad total, debida en gran medida al BChE sérico, en general permaneció inalterada (Fig. 16A). Cuando se midió en presencia de 1 x 10-5 M de iso-OMPA, la actividad de AChE aumentó en las 5 h posteriores a la inyección. Este aumento, observado para 150 !g/kg fue eficazmente suprimido o atenuado por la dosis más elevada de 500 !g/kg de hEN101, e incluso más eficaz cuando esta dosis se administró i.v. (Fig. 16B).

Ejemplo 10

Efecto de rEN101 sobre la expresión de ARNm de AChE-R en las neuronas de la espina dorsal de rata Al contrario que el efecto de hEN101 sobre las neuronas de la espina dorsal de mono, rEN101 no suprimió el ARNm de AChE-R en la espina dorsal de rata (Fig. 17), cuando se evaluó mediante hibridación in situ usando una sonda de ratón. Ni el número de células positivas ni la intensidad de la tinción cambiaron de forma significativa. Una explicación de este resultado es que la barrera hematoencefálica que protege el SNC es más permeable en monos que en ratas, al menos en las condiciones experimentales seleccionadas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> YISSUM RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY OF THE HEB

<120> Oligonucleótido antisentido dirigido contra AChE humano y usos del mismo

<130> Solicitud PCT - Mona.

<140> 13122/WO/01

<141> 2002-05-23

<160> 6

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: EN101 humano

<400> 1 ctgccacgtt ctcctgcacc 20

<210> 2 40<211> 9

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: bucle dentro de hEN101

<400> 2 cgcgaagcg 9

<210> 3

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: EN101 de ratón

<400> 3

ctgcaatatt ttcttgcacc

20

<210> 4

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: EN101 de rata

<400> 4

ctgcgatatt ttcttgtacc

20

<210> 5

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> <223> Descripción de la secuencia artificial: EN102 de rata

<400> 5

gggagaggag gaggaagagg

20

<210> 6

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: invEN102 de rata

<400> 6

ggagaaggag gaggagaggg

20

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un oligonucleótido sintético antisentido dirigido contra el ARNm de AChE humano que tiene la secuencia de nucleótidos:

   5’CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3’ (SEQ ID NO: 1), en la que dicho oligonucleótido antisentido suprime de forma selectiva la producción de la isoforma AChE-R.

2. 2.

   Un oligonucleótido antisentido resistente a nucleasa sintética que tiene la secuencia de nucleótidos:

   5’CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3’ (SEQ ID NO: 1), en la que dicho oligonucleótido antisentido suprime de forma selectiva la producción de la isoforma AChE-R.

3. 3.

   Un oligonucleótido de la reivindicación 1 o 2 que es un oligodesoxinucleótido.

4. 4.

   Un oligodesoxinucleótido antisentido sintético de la reivindicación 3, que es un oligodesoxinucleótido modificado que comprende una cadena de hidrocarburo alifático parcialmente insaturada y uno o más grupos polares o cargados incluyendo grupos de ácido carboxílico, grupos éster y grupos alcohol.

5. 5.

   Un oligodesoxinucleótido antisentido resistente a nucleasa sintética de la reivindicación 3 o 4, en el que al menos uno de los tres nucleótidos del extremo 3’, preferiblemente los últimos tres nucleótidos del extremo 3’, están 2’-O-metilados, y/o en que al menos un nucleótido está fluorado, y/o tiene enlaces de fosfotioato uniendo al menos dos de las últimas bases de nucleótidos del extremo 3’, preferiblemente entre las últimas cuatro bases de nucleótidos del extremo 3’, y/o que tiene una secuencia formadora de bucle de nucleótidos en el extremo 3’, en el que dicho bucle preferiblemente es un bucle de 9 nucleótidos que tiene la secuencia de nucleótidos CGCGAAGCG (SEQ ID NO:2).

6. 6.

   Un oligonucleótido antisentido resistente a nucleasa sintética de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, capaz de suprimir selectivamente la producción de AChE-R humano en el sistema nervioso central.

7. 7.

   Una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido hEN101 definido en la SEQ ID NO:1.

8. 8.

   Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, para mejorar la resistencia y/o para usar en la fatiga muscular crónica, preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de la miastenia grave, en la que dicho oligodesoxinucleótido antisentido suprime selectivamente la producción de la isoforma AChE-R.

9. 9.

   La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, que es para el uso diario por un paciente de una dosis de ingrediente activo entre aproximadamente 0,001 !g/g y aproximadamente 50 !g/g, preferiblemente aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 5,0 !g/g, lo más preferiblemente aproximadamente de 0,15 a aproximadamente 0,50 !g/g.

10. 10.

    La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 para uso en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, en donde dicho trastorno está asociado a un exceso de ARNm o proteína de AChE-R, y/o en donde dicho trastorno está asociado al desequilibrio de la transmisión colinérgica, y/o en donde dicho trastorno implica anomalías en la distorsión muscular, la reinervación muscular o la unión neuromuscular (UNM), y/o en donde dicho trastorno está seleccionado entre miastenia grave, enfermedad de Eaton-Lambert, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, trastorno por estrés postraumático (TEPT), esclerosis múltiple, distonía, esclerosis posterior a ictus, daño muscular posterior a una lesión, reinervación excesiva, parálisis posterior a cirugía de origen desconocido, y tras exposición a inhibidores de AChE.

11. 11.

    La composición farmacéutica como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para uso en la mejora de la resistencia en el ejercicio físico o en la disminución de la fatiga muscular.

12. 12.

    Una composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 o un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para facilitar el paso de los compuestos a través de la barrera hematoencefálica (BHE), que comprende además otros principios farmacéuticamente activos a transportar a través de la BHE y/o un adyuvante, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptables.

13. 13.

    La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en la que dicho principio farmacéuticamente activo a transportar se selecciona entre uno cualquiera de los agentes de contraste usados para obtener imágenes del sistema nervioso central, agentes que actúan bloqueando los efectos del abuso de fármacos, antibióticos, fármacos quimioterapéuticos y vectores a usar en terapia génica.

14. 14.

    Uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de una composición farmacéutica.

15. 15.

    Uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de un trastorno neuromuscular progresivo, para

    mejorar la resistencia y/o para usar en la fatiga muscular crónica, preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de la miastenia grave.

    DEFINICIÓN ARNm de la acetilcolinesterasa humana (ACNE), cds. completo ACCESO M55040 VERSIÓN M55040.1 GI: 177974 FUENTE ADN de feto humano de 21 semanas de edad, y ADNc y ARNm ORGANISMO Homo sapiens AUTORES SoreqH. E., Ben-Aziz R, Pmdy C.A., Seidman S., Gnatt, A,, Neville L.,

    Liernan-Hurwitz, J., Lev-Lehman, E., Ginzberg, D., Lapidot-Lifson, Y. y Zakut H, TÍTULO Clonación y construcción molecular de la región de codificación de la

    acetilcolinesterasa humana revela un estructura atenuante rica en G+C REVISTA Proc. Natl, Acad, Sd. U.S.A. 87(24), 9688-9692(1990) MEDLINE 91088577 AChE humana

    795-5’ ggtgcaggagaacgtggcag 3-814 Secuencia de codificación 3 ccacgtcctcttgcaccgtc 5’ Secuencia complementaria 5’ CTGCCACGTTCTCCTGCACC 3’ Secuencia de ASODN (SEQ ID NO: 1) hEN101

    Fig. 1

    hEN101 5’-CTGCCACGTTCTCCTGCACC-3’ Oligo actual, 20-mer [1]: Oligo+ actual: sin formación de dímero en el extremo 3’ Oligo- actual: sin formación de dímero en el extremo 3’ Oligo+ actual: el dímero más estable en su conjunto: 4 roturas, -6,9 kcal/mol

    Horquilla: G= -0,5 kcal/mol, Bucle = 11 nucleótidos, Tm=34°

    Fig. 2A

    Oligo actual, 20-mer [1]: Td = 70,4° [procedimiento del vecino más próximo] Tm = 74,4° [procedimiento % GC] Tm = 66° [procedimiento 2º*(A+T) + 4º*(G + C)] Mr = 6045 [monocatenario] Mr = 12,4k [bicatenario] !g/OD = 45,6 [ADNds]

    Base

    Número y %

    A

    2 [10,0]

    C

    10 [50,0]

    G

    3 [15,0]

    T

    5 [25,0]

    A+T

    7 [35,0]

    G+C

    13 [65,0]

    Temperatura de fusión del ADN en diferentes concentraciones de sal y formamida [°C]

    [mM]

    xSSC 0 % 10 % 50 %

    1 10 50 165 330 500 1000

    (0,006) (0,06) (0,03) (1) (2) (3) (6) 24,6 41,2 52,8 61,4 66,4 69,4 74,4 18,1 34,7 46,3 54,9 59,9 62,9 67,9 -7,9 8,7 20,3 28,9 33,9 36,9 41,9

    Tm [°C] = 81,5 + 16,6 * log[Na] + 0,41*(% GC}

    675/longitud - 0,65 * (% formamida) — (% no emparejado) Tm aproximada del oligo no emparejado:

    (1) 64,4°; (2) 58,4; (3) 52,4°; (4) 45,4° Tm no emp, = Td — 1,2° x [% no emparejado]

    Fig. 2B

    DEFINICIÓN ARNm de la acetilcolinesterasa de ratón

    ACCESO X56518

    VERSIÓN X56518.1 Gi: 49844

    FUENTE Ratón doméstico

    ORGANISMO Mus musculus

    REFERENCIA 1 (bases 1 a 2089)

    AUTORES Taylor, P.

    REVISTA (Enviado el 30-oct-1990) Taylor P., University of California, San Diego, Departament of Pharmacology, La Jolla, CA 92093-0636

    REFERENCIA 2 (bases 1 a 2089)

    AUTORES Rachinsky, T,L, Camp, S., Li,Y., Ekstrom, T.J., Newton, M, y Taylor, P. Molecular cloning of mouse acetylcholinesterase tissue distribution of alternatively spliced mRNA species

    REVISTA Neurpn 5(3), 317-327(1990)

    MEDLINE 90380429

    AChE de ratón (se muestran las bases 1-720)

    639-5’ ggtgcaagaaaatattgcag 3’658 Secuencia de codificación 3’ caacgttcttttataacgtc 5’ Secuencia complementaria 5 CTGCAATA1TITCUGCACC 3’ ODN antisentido (SEQ ID NO: 3) mEN101

    Fig. 3

    mEN101 5’-CTGCAATATTTTCTTGCACC-3’ Oligo actual, 20-mer [1}: Oligo+ actual: sin formación de dímero en el extremo 3’ Oligo- actual: sin formación de dímero en el extremo 3’ Oligo+ actual: el dímero más estable en su conjunto: 5 pb, -8,8 kcal/mol

    Horquilla: G = -4,7 kcal/mol, Bucle = 7 nucleótidos, Tm=77°

    Fig. 4A

    Oligo actual, 20-mer [1]: Td = 60,4° [procedimiento del vecino más próximo] Tm = 64,2° [procedimiento % GC] Tm = 66° [procedimiento 2º*(A+T) + 4º*(G + C)] Mr = 6098 [monocatenario] Mr = 12,4k [bicatenario] !g/OD = 48,1 [ADNds]

    Base

    Número y %

    A

    4 [20,0]

    C

    6 [30,0]

    G

    2 [10,0]

    T

    8 [40,0]

    A+T

    12 [60,0]

    G+C

    8 [20,0]

    Temperatura de fusión del ADN en diferentes concentraciones de sal y formamida [°C]

    [mM]

    xSSC 0 % 10 % 50 %

    1 10 50 165 330 500 1000

    (0,006) (0,06) (0,03) (1) (2) (3) (6) 14,4 31,0 42,6 51,2 56,2 59,2 64,2 7,9 24,5 36,1 44,7 49,7 52,7 57,7 -18,1 -1,5 10,1 38,7 23,1 26,7 31,7

    Tm [°C] = 81,5 + 16,6 * log[Na] + 0,41*(% GC}

    675/longitud - 0,65 * (% formamida) — (% no emparejado) Tm aproximada del oligo no emparejado:

    (1) 54,4°; (2) 48,4; (3) 42,4°; (4) 36,4° Tm no emp, = Td — 1,2° x [% no emparejado]

    Fig. 4B

    DEFINICIÓN Subunidad T de la acetilcolinesterasa (rata, ARNm parcial, 2066 nucleótidos)

    ACCESO S50879

    VERSIÓN 550879.1 GI: 262092

    FUENTE Rattus sp.

    ORGANISMO Rattus sp.

    REFERENCIA 1 (bases 1 a 2066)

    AUTORES Legay, C., Bon, S., Vemier, P., Coussen, F. y Massoulie J.

    TÍTULO Clonación y expresión de una subunidad de la acetilcolinesterasa de rata: generación de múltiples formas moleculares y complementariedad con una unidad colagénica Torpedo

    REVISTA J. Neurochern, 60(1), 337-346(1 993)

    MEDLINE 93107932 AChE de rata (se muestran las bases 1-720)

    rAS1 51-5’ cctcttcctcctcctctccc 3’-70 - Secuencia de codificación 3’ ggagaaggaggaggagaggg 5’ Secuencia complementaria 5’ GGGAGAGGAGGAGGAGAGG 3’ ODN antisentido (SEQ ID NO: 5) =rEN 102 rAS3 639-5’gtacaagaaaatatcgcag 3-658 Secuencia de codificación 3’ ccatgttcttltatagcgtc 5’ Secuencia complementaria 5’ CTGCGATA1TTTCTTGTACC 3’ ODN antisentido (SEQ ID NO: 4) rEN 101 NOTA: AS1 de ratón y AChE de rata son idénticas

    Fig. 5

    rEN101 5’- CTGCGATATflTCflGTACC-3’

    Oligo actual, 20-mer [1]:

    Oligo+ actual: sin formación de dímero en el extremo 3’

    Oligo- actual: sin formación de dímero en el extremo 3’

    Oligo+ actual: el dímero más estable en su conjunto: 4 pb, -4,0 kcal/mol

    Sin vástagos en forma de horquilla 3 pg

    Fig. 6A

    Oligo actual, 20-mer [1]: Td = 57,1° [procedimiento del vecino más próximo] Tm = 64,2° [procedimiento % GC] Tm = 56° [procedimiento 2º*(A+T) + 4º*(G + C)] Mr = 6129 [monocatenario] Mr = 12,4k [bicatenario]

    !g/OD = 48,1 [ADNds]

    Base

    Número y %

    A

    3 [150]

    C

    5 [25,0]

    G

    3 [15,0]

    T

    9 [45,0]

    A+T

    12 [60,0]

    G+C

    8 [40,0]

    Temperatura de fusión del ADN en diferentes concentraciones de sal y formamida [°C]

    [mM]

    xSSC 0 % 10 % 50 %

    1 10 50 165 330 500 1000

    (0,006) (0,06) (0,03) (1) (2) (3) (6) 14,4 31,0 42,6 51,2 56,2 59,2 64,2 7,9 24,5 36,1 44,7 49,7 52,7 57,7 -18,1 -1,5 10,1 38,7 23,7 26,7 31,7

    Tm [°C] = 81,5 + 16,6 * log[Na] + 0,41*(% GC}

    675/longitud - 0,65 * (% formamida) — (% no emparejado) Tm aproximada del oligo no emparejado:

    (1) 51,1°; (2) 45,1; (3) 39,1°; (4) 33,1° Tm no emp, = Td — 1,2° x [% no emparejado]

    Fig. 6B