CN1217028A - 调控黑色素合成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种使脊椎动物的表皮、毛发、羊毛、和皮毛的颜色变浅或加深的方法,包括使用多肽、抗体、抗体片段、或编码多肽的DNA序列,这些物质都调控由蛋白激酶C－β调控的酪氨酸酶的活化,即黑素细胞内的酶限制性黑色素生成作用。

Description

调控黑色素合成的方法
相关申请
本发明是1996年3月28日提交的序列号为08/623,364的部分继续申请，该篇申请中的内容都通过在此引述而全部合并于本文。
本发明的技术背景
过量色素沉积造成的外观上的不美观，是由于黑素细胞中的黑色素的增多而造成的，其原因可以是烧伤、或其它外伤，也是某些胎记和某些疾病的特征。当前，对这些状态的纠正，往往需要涉及痛苦的对烧伤皮肤的移植，外科手术，例如，激光外科手术，或者对不需要的颜色进行切除。
有些时候，需要使头发、羊毛、或毛皮的颜色变浅。例如，某些人出于化装的需要，对面部或头部的毛发进行“漂白”。现在可以使用的漂白头发的方法一般包括使用化学品，因而有可能对头发周围的皮肤发生刺激，损害头发杆，甚至会造成断裂。进而，这些染发都仅仅对毛发的顶部有效果，但是，深色的根部和皮下部分未发生变化。这些深色的根部最终回长出来，需要再次进行漂白的化学处理。
如果不需要外科手术或化学处理就能够使皮肤、毛发、羊毛或毛皮的色素被减少、或被抑制，则这种方法是具有优越性的。
本发明概述
本发明是基于本申请人的发现，即酪蛋白酶的活化，也就是黑色素生产作用的效率限制酶，依赖于蛋白激酶C-β(也称为PKC-β)调控的酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基和苏氨酸残基的磷酸化。
酪氨酸酶仅仅发现在黑素细胞(色素细胞)中。这些细胞存在于表皮的基部和毛囊中。黑色素沉积在黑素细胞特有的称为黑素体的细胞器中，然后从黑素细胞被转移到周围的角质化细胞，所以，色素是在皮肤或毛发杆的表皮(外层)中广泛传播的。脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛和皮毛的颜色大部分取决于它们的黑色素含量。
酪氨酸酶是一种结合铜的横跨膜的糖蛋白，位于黑素体中，是黑色素合成中的主要的和效率限制性的酶，其对酪氨酸羟基化的催化和随后的氧化这两个生物合成序列反应中的头两个反应证明了这一点。转染反应已经证明酪氨酸酶自身可以使在其它的情况下为非黑素细胞的细胞产生黑色素[参见Bouchard,B.et al.,J.Exp.Med.,169:2029-2042(1989)]；克隆的人和鼠的酪氨酸酶基因已经能够对多种负责白化病的变异进行图谱化，白化病是遗传性色素缺失[King,R.A.,et al.,PIGMENTATION AND PIGMENTARY DISORDERS,Levine,N.,(ed),CRC Press,Boca Raton.FL,pp.297-336(1993)]。
已经知道其它几种酶也参与黑色素的生物合成。它们包括酪氨酸酶相关的蛋白质1和蛋白质2(TRP1 and TRP2)[Cohen,T.,etal.,Nucleic Acids Res.,18:2807-2808(1990)；Jackson,I.J.,et al.,EMBO J.,11:527-535(1992)]。正如它们的名字所暗示的，这些TRP与酪氨酸酶是结构相关的。特别是，它们的基因在铜结合位点和半胱氨酸丰富区是同源的，这些区域是对其功能和结构为重要的区域[Hearing,V.J.and King,R.A.,PIGMENTATION ANDPIGMENTARY DISORDERS,Levine,N.,(ed.),CRC Press,BocaRaton.FL,pp.3-32(1993)]。这些TRP的准确功能是未知的。然而，最近的数据显示，酪氨酸酶、TRP1和TRP2在体内相互作用生成复合体，在这个复合体内，酪氨酸酶的活性消失，这就意味着这些TRP起着对酪氨酸酶活性的抑制作用[Orlow,S.J.,et al.,J.Invest.Dermatol.,103:196-201(1994)]。
具体而言，本申请人已经鉴定出了被PKC-β磷酸化的酪氨酸酶的细胞质区中的具体丝氨酸残基。作为这个发现的结果，就得到了在脊椎动物黑素细胞中调控酪氨酸酶活化的方法。在本文中所述的调控，指的是通过防止或抑制(降低)其活性，或者提高或维持其活性的对酪氨酸酶活性的改变。例如，可以实质上降低或彻底封闭PKC-β调控的酪氨酸酶磷酸化来控制酪氨酸酶的活化，从而使黑色素的生成被降低。另外，酪氨酸酶的活化还可以被提高，例如，通过促进对酪氨酸酶的磷酸化，或通过防止对酪氨酸酶的去磷酸化而延续其活化，从而使黑色素的生成得到提高。
另外，本发明还提供了改变脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、皮毛中色素量的方法，这是通过调控在毛发囊、羊毛囊、和皮毛囊，和表皮中黑素细胞中的酪氨酸酶活化来得到的。
在本文中，术语表皮黑素细胞指的是在皮肤、囊泡、毛囊、羊毛囊、毛皮囊中含有的黑素细胞。术语改变色素量，指的是在表皮黑素细胞中的色素量由于提高了酪氨酸酶的活化而被提高，或者是由于对酪氨酸酶的活化给予抑制而降低，从而使黑色素生成被降低。
本发明的一个实施方案涉及防止或抑制脊椎动物表皮黑素细胞中酪氨酸酶的活化的方法。酪氨酸酶是一种单体蛋白质，具有内部区域、短的横跨膜的区域，以及细胞质区域。酪氨酸酶的细胞质区域含有丝氨酸残基。这些丝氨酸残基很可能是PKC-β进行磷酸化的底物。在本文中，本申请人已经证实了在酪氨酸酶氨基酸序列的第505和第509位置的丝氨酸是PKC-β对酪氨酸酶进行磷酸化的位点[Shibahara,S.,et al.,Tohoku J.Exp.Med.,156:403-411(1988)]。对第505位和第509位的丝氨酸的抑制防止了酪氨酸酶的活化。
对PKC-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的抑制防止了表皮黑素细胞中的酪氨酸酶的活化，结果是黑素细胞中的黑色素生产被降低。因此，本发明的另一个实施方案涉及对脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或皮毛中的色素生成的降低和彻底抑制。
另外，提高或延续酪氨酸酶的活化，例如，通过防止被激活的酪氨酸酶的去磷酸化，可以延续或延长表皮黑素细胞中的黑色素生成，从而使脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、和皮毛中的色素量被提高。
在本发明的另一个实施方案中，提供了鉴定那些在脊椎动物表皮细胞中降低或彻底抑制色素生成的物质的方法。这些物质，例如，对PKC-β与酪氨酸酶相互作用为特异性干涉的多肽，它们模仿酪氨酸酶磷酸化位点的序列/结构(例如，多肽模拟物)，从而防止PKC-β对酪氨酸酶的磷酸化，并进而防止酪氨酸酶的活化。
此外，还提供了对那些提高脊椎动物表皮黑素细胞的色素量的物质的鉴定方法。这些物质，例如，对酪氨酸酶的去磷酸化中涉及的磷酸酶为特异性的多肽，防止酪氨酸酶的失活。由本文中所揭示的方法鉴定的物质也是本发明的内容。
由于本申请人发现了酪氨酸酶的磷酸化的特异性位点，即黑色素生成的效率限制性酶，因此，调控脊椎动物表皮黑素细胞的色素量和酪氨酸酶的活化的方法已经成为现实。已经实现的还有提高皮肤、毛发、羊毛、和皮毛的色素量的方法。具体而言，已经实现的方法有不涉及外科手术和化学处理的降低或(部分地或全部地)抑制皮肤、毛发、羊毛、和皮毛的色素量的方法。
附图的简要说明
附图是图示的实验结果，表示构建的合成肽模仿人的酪氨酸酶的磷酸化位点，抑制被培养的黑素细胞的酪氨酸酶的活性。
本发明的详细叙述
本发明是基于本申请人的发现，即酪蛋白酶的活化，也就是黑色素生产作用的效率限制酶，依赖于蛋白激酶C-β(也称为PKC-β)调控的酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基和苏氨酸残基的磷酸化。酪氨酸酶是一种横跨膜的蛋白质，位于黑素细胞中的黑素体。对人的酪氨酸酶的cDNA克隆的核苷酸序列的报道，可见于Shibahara,S.,et at.,Tohoku J.Exp.Med.,156:403-414(1988),Chinatamaneni,C.D.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:5272-5276(1991)and Kown,B.S.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7473-7477(1987)，这些文章的教导都通过在此引述而全部合并于本文。推断的人的酪氨酸酶含有511个氨基酸[Shibahara,S.,et al.Tohoku J.Exp.Med.,156:403-414(1988)]。其细胞质区域含有两个丝氨酸残基，位于Shibauhaer等人和Chinatamanei,C.D.等人描述的氨基酸序列第505和第509位置。
酪氨酸酶是被蛋白激酶C的β异构体(PKC-β)激活的。在缺少PKC-β的时候，没有黑色素产生[Park,H-Y,et al.,J.Biol.Chem.,268:11742-11749(1993)]。另外，将PKC-β激活到基本水平以上，就在培养的人的黑素细胞、鼠黑素瘤细胞和豚鼠皮肤中提高了它们的色素量。PKC-β是丝氨酸/苏氨酸的激酶，通过对氨基酸残基的磷酸化来激活蛋白质[Park,H-Y.and Gilchrest,B.A.,J.Dermatol.Sci.,6:185-193(1993)]。酪氨酸酶的全长显示结合有22个磷酸酶，但是，其内部区域没有这种结合，这就意味着PKC-β的磷酸化仅仅发生在细胞质区域[Park,H-Y.,et al.,J.Invest.Dermatol.,104:585 Abstract186(1995)]。
正如在本文中描述的那样，本申请人已经证实了在黑素细胞中对PKC-β的激活导致了对酪氨酸酶的磷酸化，在酪氨酸酶的细胞质区域的第505和第509位置的丝氨酸残基上发生特异性磷酸化。本申请人还进一步证实，通过蛋白水解将酪氨酸酶的细胞质区域去处后，就防止了由PCK-β进行的磷酸化。因此，本申请人证实了防止PKC-β调控的对酪氨酸酶的磷酸化，就防止了在黑素生成中的效率限制性酶的活化，其结果是，降低或彻底地抑制了在目标组织中的色素量，例如，在脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛和毛皮中。
对PKC-β与酪氨酸酶之间的结合或相互作用有特异性干扰或封闭的物质或分子，可以特异性地抑制或实质上降低酪氨酸酶的活化。例如，对第505或第509丝氨酸残基中的一个或两者的磷酸化发生特异性干扰的分子，可以防止酪氨酸酶的活化。如果酪氨酸酶没有被活化，黑色素的生成就会明显地被抑制，其结果是，在表皮黑素细胞中的色素量被降低或彻底被抑制。
有众多的分子，例如，蛋白质、多肽、抗体、以及抗体片段，都可以干扰PKC-β与酪氨酸酶之间的相互作用。有机分子和无机分子也可以干扰这种相互作用。这些分子可以是天然的，提纯的，或从自然界中分离的，使用的方法都是本领域的技术人员所熟知的。这些分子也可以是被化学方法合成的、重组方法产生的，使用的技术都是本领域的技术人员所熟知的。
在本文中，对PKC-β与酪氨酸酶之间的相互作用具有特异性干扰，指的是防止或封闭PKC-β调控的对酪氨酸酶的磷酸化。封闭可以是彻底的或部分的，结果是在表皮黑素细胞中的黑色素生成的彻底抑制或大部分的降低。对表皮黑素细胞中的黑色素生成的彻底抑制或实质性地降低，导致在脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或毛皮中的色素量的彻底被抑制或实质性地降低。
本发明具体包括的有那些模仿PKC-β与酪氨酸酶相互作用的位点的多肽和多肽片段。这些“肽模拟物”模仿了PKC-β调控的对酪氨酸酶进行磷酸化的位点，即含有对PKC-β调控的酪氨酸酶磷酸化的底物序列的氨基酸残基。酪氨酸酶底物序列的模拟物一般包括丝氨酸或苏氨酸残基。酪氨酸酶模拟物的氨基酸序列包括，例如，第505或第509位丝氨酸，以及它们各自周围的氨基酸残基。这些酪氨酸酶的肽模拟物直接与PKC-β结合，其方式类似PKC-β与酪氨酸酶的结合，从而防止了PKC-β与酪氨酸酶的结合，进而防止了、减少了或彻底地消除了酪氨酸酶的活化和随后的黑色素生成。
在本发明中描述的方法中所使用的酪氨酸酶模拟物可以是，例如，蛋白质、多肽(包括天然和非天然的氨基酸)，也可以是肽的类似物(包括肽部分和非肽部分)。这些肽模拟物可以被构建成为氨基酸的D-型异构体，而不是天然的L型异构体，从而提高它们对在活细胞中的蛋白水解降解的抗性。在这些方法中使用的所有酪氨酸酶模拟物都具有与生物学活性要求的特异性特点。这些特点包括模拟物与PKC-β结合的能力，对生物学活性形式的保持能力。
在这些方法中使用的酪氨酸酶的肽的模拟物，都包括至少5个氨基酸残基，而且一般都具有范围在大约10到大约30个氨基酸残基的范围内，通常为约20个氨基酸残基。然而，如果具有所需要的上述特点，也可以使用更长的模拟物(例如，整个细胞质区域的长度，或多至约60-65个氨基酸残基)。通常，酪氨酸酶的肽的模拟物的残基中的一个是丝氨酸残基或苏氨酸残基。例如，序列号1和序列号4的模拟物是特别适合用于本发明的这些方法中的。
模拟PKC-β的活性位点的分子也可以用于本发明的方法中。这样的PKC-β模拟分子将会与酪氨酸酶底物序列结合，而不激活酪氨酸酶。然而，这些与底物结合的PKC-β模拟物防止了PKC-β月酪氨酸酶的结合。因此，这些PKC-β模拟物就作为竞争拮抗剂还可以封闭PKC-β调控的酪氨酸酶的磷酸化，抑制酪氨酸酶的活化，并降低色素量。这些PKC-β模拟物可以包括，例如，蛋白质、多肽、有机的和无机的分子。
酪氨酸酶模拟物和PKC-β模拟物都可以用本领域的技术人员所熟知的方法推理设计和合成出来，例如，在Jameson,B.A.等人发表在Nature,368:744-746(1994)的文章中介绍的方法。使用本领域的技术人员熟知的方法，可以在体外检测中根据它们的生物学活性(即封闭PKC-β与酪氨酸酶相互作用的能力)来鉴定和筛选酪氨酸酶模拟物和PKC-β模拟物的候选者。
例如，正如本文中所描述的那样，这些方法之一是包括在有放射性标记物例如32P-正磷酸盐存在下培养含有酪氨酸酶的黑素细胞。黑素细胞可以通过皮肤采样、新生儿包皮、或黑素瘤细胞系获得[参见，例如，Park,H-Y.et al.,J.Biol.Chem.,268:11742-11749(1993)]。这些黑素细胞与佛波醇酯接触，例如，与四佛波醇乙酸酯(TPA)接触来激活PKC-β。本领域技术人员熟知的其它的适宜的PKC-β激活子也可以被使用。与此同时或随后，在适宜的PKC-β调控的酪氨酸酶磷酸化的条件下，这些被培养的黑素细胞与受试底物接触。然后，从TPA处理过的黑素细胞中提纯出含有酪氨酸酶的黑素体，再从黑素体中分离出酪氨酸酶。分离可以采用常规的实验室技术。特别是，本发明的方法包括使用了对酪氨酸酶为特异性的抗体的免疫沉淀法。抗体可以是多克隆或单克隆的[参见，例如，Jimenez,M.et al.,J.Biol.Chem.,266:147-1156(1991)；Bouchard,B.et al.,J.Invest.Dermatol.,102:291-295(1994)；or EPO679,660 A102/11/95]。
免疫沉淀检测可以按照例如Park,H-Y.et al.,J.Biol.Chem.,268:11742-11749(1993)所描述的来进行。被整合到免疫沉淀的酪氨酸酶中的32P-正磷酸盐的数量可以被常规实验室技术来确定，在由有受试底物存在的培养的黑素细胞中分离出来的被整合的32P-正磷酸盐的数量，与在由没有受试底物存在的培养的黑素细胞中分离出来的被整合的32P-正磷酸盐的数量相比。被整合的32P-正磷酸盐的数量的下降表明，受试物质防止了酪氨酸酶的磷酸化(即酪氨酸酶的活化)。由于受试物质防止了酪氨酸酶的活化，而酪氨酸酶对黑素生成和色素沉积又是基本的，所以，脊椎动物的表皮黑素细胞中的色素沉积就被彻底抑制或实质性地被降低。
另外，使用其它的已知的实验室技术也可以直接测定酪氨酸酶的活性。例如，Pomerantz,S.H.描述的测量酪氨酸酶活性的检测法[J.Biol.Chem.,241:161-168(1966)该篇文献的教导通过在此引述全部合并于本文]。简言之，5×106个细胞在含有1％Triton X-100的80 mM PO4 -2(pH 6.8)中简短超声处理，在4℃对酪氨酸酶提取60分钟。将10-50μg的细胞蛋白质培养在37℃的250nML-酪氨酸，25nML-脱氧苯基丙氨酸，12.5μg的氯霉素，和5μCi的L-[3,5-3H]的酪氨酸中30-60分钟。加入含有0.2％BSA的500μl的10％三氯乙酸终止反应。溶于三氯乙酸的物质与Norit A反应，用闪烁计数器测量释放的3H2O。活性的表达为读数/分3H2O释放/μg蛋白质/h减去非特异性整合的放射活性，由溶胞物煮沸30分钟来确定(背景值)。
此外，黑素细胞中的黑色素也可以直接测定，例如，Gordon,P.R.和Gilchrest,B.A.在J.Invest.Dermatol.,93:700-702(1989)中所描述的那样，其中的教导都通过在此引述而合并于本文。简言之，在常规实验室条件下培养人黑素瘤细胞，对1×105个细胞定期测定其黑色素含量。细胞在2,500rpm旋转15分钟，将得到的沉积物溶于0.5ml的1N NaOH。根据OD475计算黑色素的浓度，并且与合成的黑色素的标准曲线对比。
在体外表现出活性的酪氨酸酶模拟物和PKC-β模拟物可以进一步在活体上进行测试，例如，在豚鼠的皮肤或毛发上局部使用，具体方法如Eller,M.等人的文章，Nature,372:413-414(1994)，或Allen等人的文章，J.Invest.Dermatol.,(1995)，这些文章中的教导都通过在此引述而合并于本文。
另外，由于本申请人发现了PKC-β对酪氨酸酶的活化，以及在黑色素生成中的效率限制酶，因此，就提供了提高黑色素合成并进而加深皮肤、毛发、羊毛或皮毛颜色的方法。还提供了利用细胞中磷酸化酶的假底物来封闭酪氨酸酶中细胞质区域的丝氨酸和苏氨酸残基的去磷酸化，从而提高或维持PKC-β对酪氨酸酶的磷酸化水平。
具体而言，黑素细胞中黑色素合成的速率已知是由酪氨酸酶的活化状态来决定的。这个活化态是细胞内黑素体相关的酶的活化(磷酸化)和失活(去磷酸化)之间的动态平衡。磷酸化是由PKC-β调控的，而去磷酸化是由一种或一种以上的磷酸酶调控的。因此，可以合理地假设不同的磷酸酶负责不同的PKC-β底物的去磷酸化，正如在有多个PKC底物的情况下，需要对它们分别调控来获得正常的细胞功能。
负责PKC-β调控的酪氨酸酶的去磷酸化的磷酸酶的催化区的特异性肽序列可以被制造，并被送到皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的黑素细胞中，或者送到其它的需要提高黑色素生成的位置。这种磷酸酶的“假底物”竞争酪氨酸酶上面的磷酸化的活性位点，并因此减少了生理学底物酪氨酸酶的可使用的磷酸酶。需要提高黑色素含量的时候，可以使用这个方法，例如，通常发生在低度湿疹皮炎患者消炎后的皮肤区，或需要增加人发颜色，或改变动物皮毛或羊毛的颜色等。
因此，给细胞提供调控酪氨酸酶活化的物质可以表皮黑素细胞中黑色素的合成。具体而言，给细胞或组织提供酪氨酸酶的肽的模拟物，结果是假如的肽与PKC-β发生竞争作用，降低了可以与正常细胞内底物发生反应的PKC-β可使用性，此时，酪氨酸酶的细胞质区域含在黑素细胞中。这种底物序列可以与PKC-β发生特异性或优先性的反应，而不于其它的PKC异构体反应，因为其它的PKC异构体不激活酪氨酸酶蛋白。虽然PKC异构体可以随机地在细胞和组织中发现，并且已知是调控众多关键的细胞功能的，但是，对PKC-β为特异性的底物序列却是优先在黑素细胞的黑色素生成的过程中发挥作用，因为PKC-β在角质化细胞、成纤维细胞、皮肤中其它的主要细胞中的表达都是最小的[参见，Park,H-Y.et a1.,Clin.Res.,39:148A(1991)]。
进而言之，已经知道的是，彻底缺少PKC-β的人黑素细胞系是无法与表达该PKC异构体父代细胞系相区分的，除了它们缺少黑色素之外[Park,H.E.et al.,J.Biol.Chem.,268(16):11742-11749(1993)]。这就强烈地建议PKC-β除了在黑色素生成中发挥作用之外，它在黑素细胞/黑素瘤细胞的其它主要功能中都不起作用。
本发明的方法可以用于通过调控酪氨酸酶来改变脊椎动物的黑素细胞中的色素量。具体而言，本文中所描述的方法可以用于降低或彻底抑制脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的色素量。这些方法包括，将有效剂量的通过降低或抑制黑素细胞中酪氨酸酶活化来降低或抑制色素量的物质与表皮细胞接触，接触的方式要使该物质进入到细胞中，包括处于基层的黑素细胞(例如，使用引入、送达、或给药的方式)。例如，可以将该物质放在生理学相容的组合物中，局部用于皮肤、毛发周围的皮肤、羊毛、或皮毛囊。
另外，本发明的方法还可以用于提高脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的色素量。这些方法包括，将有效剂量的通过提高或延续黑素细胞中酪氨酸酶活化来提高或延续色素量的物质与表皮黑色素细胞(位于皮肤、毛发、羊毛、或毛发囊周围的黑素细胞)接触或送达到该部位。
这些被鉴定了的物质的有效剂量是能够调控(例如，实质上减少、或彻底抑制，或实质上提高或延续)PKC-β调控的表皮黑素细胞中酪氨酸酶的磷酸化的数量。对黑素细胞中酪氨酸酶的磷酸化的调控，可以使用本文中描述的方法来检测。
适合于本发明使用的各种传递系统都是本领域技术人员所熟知的，并且可以传递有效剂量的物质，例如，酪氨酸酶肽模，来抑制黑素细胞中的酪氨酸酶的活化。例如，蛋白质包被在脂质体、微颗粒、微胶囊中；由重组的细胞表达，或由受体调控的细胞内吞作用来表达，建造天然存在的或假配体编码核酸作为逆病毒的一部分，或其它的载体。
在一个实施方案中，使用了脂质体制剂。该脂质体制剂可以包括任何能穿过角质层和与细胞膜融合的脂质体，从而将该脂质体所携带的成分带到细胞中。脂质体的制备方法是本领域的技术人员所熟知的。例如，美国专利第5,077,221,4,621,023,4,800,635,5,147,652号所介绍的脂质体都可以被使用。还可以参见Yarosh,D.,et al.,J.Invest.Dermatol.,103(4):461-468(1994),Caplen,N.J.,et al.,Nature Med.,1(1):39-46(1995)。
脂质体可以特异性地对准适当的细胞(例如，表皮黑素细胞)。例如，优先在黑素细胞上表达的细胞膜标记物，如黑素细胞刺激的荷尔蒙(MSH)受体，可以被加入到含有防止酪氨酸酶活化的肽模拟物的脂质体中。脂质体还可以特异性地对准和传递物质到毛囊，例如，参见Li,L.和Hoffman,R.M.等人的文章，该文献的教导都通过在此引述而合并于本文。这样的脂质体传递系统还可以用于传递物质到羊毛和皮毛囊中。
例如，可以将肽模拟物，或编码肽模拟物的DNA构造用本领域技术人员熟知的方法包被到脂质体中。该DNA构造将含有编码肽的DNA序列，以及在脊椎动物中表达肽所必须的核酸序列[参见，Li,L.and Hoffman,R.M.,Natured Med.,1:705-706(1995)or Yarosh,D.et al.,J.Invest.Dermatol.,103:461-468(1994)]。该脂质体-DNA构造，或脂质体-肽组合物(含有肽模拟物)可以提供给脊椎动物，例如，局部用于皮肤、毛发、羊毛、或皮毛，或者用于毛发、羊毛、或皮毛囊周围的皮肤。这些脂质体-DNA构造，脂质体-肽组合物等，与黑素细胞接触，结果是脂质体内的成分(DNA或肽)被引入到黑素细胞中，使肽模拟物在其中表达或释放，最终调控酪氨酸酶的活化。
本发明的方法中所用的物质可以放在生理学相容的载体中而直接提供。例如，竞争性抑制PKC-β对酪氨酸酶的磷酸化的肽是足够的小，因而可以穿过表皮到达位于表皮、毛发、羊毛、皮毛囊中的黑素细胞。这些肽可以与局部用药的载体混合，例如，凝胶、油膏、乳液、乳剂、泡沫剂、香波等，还可以包括各种载体，例如水、甘油、酒精、乙二醇、乙醇(95％)，含于水中的聚氧乙烯一月桂酸酯(5％)，含于水中的月桂基硫酸钠(5％)。如果需要，还可以加入其它的物质，例如，抗氧化剂、湿润剂、黏度稳定剂，或类似的添加剂。
此外，在某些情况下，这些物质可以被放入那些放置在皮肤表面、皮肤中、或皮肤下的装置中。这些装置包括皮肤补丁、植入物，将物质用被动或主动释放机制来使其与皮肤或毛囊接触的注射剂。
这些传递介质还可以包括香水、色素、稳定剂、防晒剂，以及其它的成分。可以定期间隔地局部使用这些物质到表皮上，例如，每日1-2次，这些物质可以放入适当的载体中并具有有效浓度。
有效剂量的调控酪氨酸酶活性的模拟物，都可以使用上述的方法提供给脊椎动物，包括人。具体选用的有效量要依据所用的模拟物、具体的组合物制剂、使用的方式、具体使用的脊椎动物的部位来确定。使用已知的常规药学方法，可以确定对脊椎动物包括人防止酪氨酸酶活化的模拟物的有效剂量。
本发明还包括对能够在脊椎动物表皮黑素细胞中改变色素量的物质的鉴定方法，以及这被这些方法鉴定出来的物质。这些方法对这些物质的鉴定依据的是其对表皮黑素细胞中PKC-β调控的酪氨酸酶活化的影响。
例如，对脊椎动物表皮黑素细胞在适宜于其生长和存活的条件下进行培养。然后，将受试物质加入到培养基中，从而进入到培养的细胞中。含有受试物质的培养物，维持在适宜于影响酪氨酸酶活性的条件下，例如，抑制PKC-β调控酪氨酸酶的磷酸化。黑素细胞的对照也培养在类似的条件下，但是，不加入受试物质。在一段适当的时间后，取出黑素细胞，或将它们从培养物中分离出来，例如，经过离心，再将酪氨酸酶与黑素细胞分离，可以使用对酪氨酸酶为特异性的抗体的免疫沉淀方法。使用识别酪氨酸酶的一部分，例如，酪氨酸酶细胞质区域的特异性抗体，也可以实现免疫沉淀法。
然后对酪氨酸酶的磷酸化进行评定。这种评定一般包括对黑素细胞与受试物质一起培养的过程中所发生的磷酸化的定量和定性分析。标准的定量分析确定的是被整合到酪氨酸酶中的放射性标记磷酸盐，例如32P-正磷酸盐。将有受试物质的条件下培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化与没有受试物质的条件下培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化进行比较。如果受试物质具有抑制PKC-β对酪氨酸酶的磷酸化效应，则从含有受试物质条件下生长的黑素细胞培养物中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化就比从对照的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化数量低。
本发明的方法还可以用于鉴定那些具有提高脊椎动物表皮黑素细胞的色素量的功能的物质。这些物质应该具有提高酪氨酸酶的磷酸化或延续该磷酸化的稳定态的效果。这些方法的步骤与上述的方法相似，不同之处在于受试物质具有所需要的提高那些在没有受试物质条件下培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化的数量和程度的特征。为了确定受试物质是否具有维持或延长酪氨酸酶的磷酸化态(由此而维持或延长酪氨酸酶的活性)的功能，黑素细胞的培养可以含有受试物质或不含有受试物质，培养的时间可以持续到将黑素细胞分离出来之前，然后分析这些黑素细胞的酪氨酸酶的磷酸化。
用这些体外方法鉴定的物质可以进一步在活体上鉴定，例如，在豚鼠上鉴定，方法正如Eller,M.S.等人在Nature,372:413-414(1994)中介绍的那样，该篇文献的教导都通过在此引述而合并于本文。在活体上有效的物质可以用于上述的改变脊椎动物表皮黑素细胞的色素量的方法。
下面的实施例将更为详细地说明本发明，但是，将不从任何方面限制本发明。实施例1  蛋白激酶C-β对酪氨酸酶的磷酸化
为了检验PKC-β而不是任何其它的PKC异构体可以在活体上对酪氨酸酶进行磷酸化，将表达PKC-β的黑素细胞、相对表达酪氨酸酶但是不表达PKC-β的无色素的MM4人黑素瘤细胞，一起在32P-正磷酸盐的条件下预培养90分钟[参见J.Invest.Derm.,Vol.100,No.4:Abst.#37(April1993)]。用10-7M的TPA处理细胞30分钟来激活PKC,TPA是一种熟知的对所有PKC异构体的激活子。对照样品仅仅接受载体。随后，使用抗人酪氨酸酶的多克隆抗体对酪氨酸酶进行免疫沉淀，结合到酪氨酸酶中的32P-正磷酸盐用放射性自显影鉴定。只有那些用TPA处理过的表达PKC-β的黑素细胞的酪氨酸酶被磷酸化，这就意味着只有PKC-β而不是其它的PKC异构体可以在活体上对酪氨酸酶进行磷酸化。实施例2  磷酸化对酪氨酸酶活性的提高
为了确定酪氨酸酶的活性是否可以被磷酸化提高，将纯化的蘑菇酪氨酸酶用纯化的PKC-β预培养[参见Park,H-Y.et al.,J.Invest.Dermatol.,100:607(1993)and Park,H-Y.et al.,J.Biol.Chem.,268:11742-11749(1993)]。在非变性的7.5％聚酰胺凝胶电泳上分离酪氨酸酶和PKC-β，然后与L-多巴反应，检测酪氨酸酶的活性。在酪氨酸酶发生迁移的地方有一条棕色带，其强度对应于酶活性。纯化的酪氨酸酶自身表现了一定的活性，在用纯化的活性PKC-β预培养后，该活性提高了10倍以上。这种提高的原因不是PKC-β与L-多巴之间的相互作用，因为PKC-β自己不与L-多巴反应。这些数据明显地表示，PKC-β对酪氨酸酶的直接磷酸化导致酶的激活。实施例3  PKC-β对酪氨酸酶的细胞质区域的磷酸化
人的酪氨酸酶的氨基酸序列已经被报道了。酪氨酸酶在其细胞质区域的第505位和509位具有两个丝氨酸残基[Shibahara,S.,et al.Tohoku J.Exp.Med.,156:403-414(1988)]。大约90％的酪氨酸酶蛋白都在黑素体之内，黑素体是黑素细胞内与膜相接的细胞器，黑色素在此合成并沉积。PKC-β一般位于细胞质中。为了检验是否只有酪氨酸酶的细胞质区域被PKC磷酸化，将黑素细胞培养物用32P-正磷酸盐预培养，用10-7M的TPA处理60分钟激活PKC，使用蔗糖剃度离心分离黑素体(含有酪氨酸酶)。
纯化的黑素体分成两组：一组保持不经任何处理而作为对照，另一组在37℃用0.25％胰蛋白酶处理60分钟来释放细胞质区域。随后，经过胰蛋白酶处理的和未处理的(全长)酪氨酸在0.1％TritonX-100中培养60分钟，用抗内部(黑素体内)区域的特异性多克隆抗体，或用抗全长酪氨酸酶的多克隆抗体分别对经过处理和未经过处理的酪氨酸酶进行免疫沉淀。
32P-正磷酸盐只能被结合到全长的或未经过处理的酪氨酸酶中[Park,H-Y.,et al.,J.Invest.Dermatol.,1041,585 Abstract186(April1995)]。胰蛋白酶处理过的酪氨酸酶缺少细胞质区域，所以没有表现出对32P-正磷酸盐的结合，这就表明只有细胞质区域是被PKC磷酸化的。在一个平行实验中，黑素细胞的培养物的处理如上所述，不同之处在于对酪氨酸酶的磷酸化是在没有放射性标记的磷酸盐存在的条件下进行的。对未经过和经过胰蛋白酶处理的酪氨酸酶的免疫印记分析证实，使用两种不同的抗体都得到了相当数量的酪氨酸酶的免疫沉淀物。实施例4  PKC-β对丝氨酸残基和苏氨酸残基的磷酸化
为了检验是否丝氨酸残基和苏氨酸残基都被PKC磷酸化，PKC是一种已知的丝氨酸/苏氨酸激酶，将酪氨酸酶在活体磷酸化，方法如实施例1所述，用32P-正磷酸盐对黑素细胞预培养，然后用TPA对PKC激活。随后，对酪氨酸酶进行免疫沉淀，从凝胶上电洗脱，在完全水解。采用常规技术用二维薄层色谱分离放射性标记的氨基酸，并对未标记的和磷酸化的丝氨酸、苏氨酸、和酪氨酸标准作图。
结果表明，高于90％的放射性标记的磷酸盐与丝氨酸结合。没有检测到放射性标记的磷酸盐与酪氨酸的结合。这些数据进一步表示酪氨酸酶是通过PKC依赖的过程被磷酸化的，而且丝氨酸残基有优先被磷酸化。实施例5  丝氨酸残基505和509被磷酸化
为了确定主要被PKC-β磷酸化的丝氨酸残基和苏氨酸残基的位置，用放射性磷酸盐与黑素细胞一起培养并用PKC激活使酪氨酸酶被32P-正磷酸盐标记。随后，分离黑素体，并免疫沉淀全长酪氨酸酶。然后对酪氨酸酶用胰蛋白酶和热解酶(thermalysin)处理。因为只有细胞质区域被磷酸化，对全长酪氨酸酶的酶解将仅仅产生被磷酸化的细胞质区域。
根据Sibahara的人的酪氨酸酶的氨基酸序列，预计的是在人的酪氨酸酶的细胞质区域被胰蛋白酶酶解的时候，会产生三个片段。制备了在丝氨酸残基上有或没有磷酸化的合成肽。在三个独立的实验中，所有放射性标记的磷酸盐都是在合成的肽3上，表明两个‘丝氨酸残基都被PKC-β磷酸化。
                       酪氨酸酶的细胞质区域
                           序列号1
Gln- Leu- Pro- Glu- Glu- Lys- Gln- Pro- Leu- Leu- Met- Glu-
Lys- Glu- Tyr- His- (Ser)505- Leu- Tyr- Gln- (Ser)509- His-
Leu(序列号1)
                          ↓胰蛋白酶
片段1 Gln- Leu- Pro- Glu- Glu- Lys    (序列号2)
片段2 Gln- Pro- Leu- Leu- Met- Glu- Lys    (序列号3)
片段3 Glu- Asp- Tyr- His- (Ser)505- Leu- Tyr- Gln-
      (Ser)509- His- Leu    (序列号4)
合成肽：
肽段1 Glu- Asp- Tyr- His- p(Ser)505- Leu- Tyr- Gln-
      (Ser)509- His- Leu   (序列号4)
肽段2 Glu- Asp- Tyr- His- (Ser)505-  Leu- Tyr- Gln-
      p(Ser)509- His- Leu    (序列号4)
肽段3 Glu- Asp- Tyr- His- p(Ser)505- Leu- Tyr- Gln-
      p(Ser)509- His- Leu    (序列号4)实施例6  合成肽对酪氨酸酶活性的抑制
人的黑素细胞的成对培养物用或不用5、10、20μg/dish的合成肽来处理，这些合成肽的序列与人的含在第505和509位氨基酸位置为丝氨酸的酪氨酸酶的对应部分相同。该合成肽的具体序列为Glu- Asp- Tyr- His- p(Ser)505- Leu- Tyr- Gln-(Ser)509- His- Leu    (序列号4)
合成肽用10μl的Lipofactamine预处理来提高对细胞的送达。对照组不进行处理，而且Lipofactamine为0。用经过Lipofactamine处理的合成肽接触黑素细胞22小时，收获后对酪氨酸酶的活性进行确定。
                             表1
   TyrAct/μg蛋白质 CPM1 CPM2 CPMneg1 CPMneg2
  对照   14679.2  118490  119159   50443   40414
   0   14807.4  126917  119698   50248   48203
   5   17152.6  148889  119059   47579   48843
  10    9536.9  96566   93442   46135   48504
  20    7811.3  90265   84051   46312   49891
正如表1和附图所示，培养的人黑素细胞的酪氨酸酶的活性，在用20μg/dish的模拟人酪氨酸酶磷酸化位点的合成肽构造处理的培养物中有多于50％被抑制，等于2μg/ml。在下一个剂量，几1μg/ml的情况是有大约40％的抑制。实施例7  蛋白激酶C-β与TRP1的相互作用
为了调查PKC是否调控其它的黑素蛋白，例如酪氨酸酶相关的蛋白(TRP1和TRP2)，用10-7M的TPA处理黑素细胞2周，这是排除PKC的已知的条件，然后，采用特异性抗体的免疫印记分析来确定TRP1和TRP2的水平。PKC的排除对TRP1没有影响，但是，TRP2的糖基化的成熟形式被减少了50-70％(80kd)。而65kd的未糖基化的TRP2前体不受排除PKC的影响。为了确认仅仅是糖基化的TRP2受到影响，对黑素细胞用TPA处理2周，并用3H-葡糖胺标记。对TRP1和TRP2进行免疫沉淀，结合在这些蛋白质上的3H-葡糖胺被检测。排除PKC没有影响糖基化的和未糖基化的TRP1，但是结合到TRP2上的3H-葡糖胺被降低了50％以上。这些结果表明，PKC对黑素生成的调控是，优先对酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基进行磷酸化，以及调控成熟的TRP2的水平。等价方案
上述实施例都是对本发明的说明性的实施例。本技术领域内的普通技术人员可以确定对本发明的等价物和修饰。这些等价物和修饰都是被包括在本发明的权利要求书中的。

Claims (39)

1．一种调控脊椎动物表皮黑素细胞的酪氨酸酶活性的方法，该方法包括调节蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化。
2．一种调控脊椎动物表皮黑素细胞的酪氨酸酶活性的方法，该方法包括抑制蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化。
3．根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的第505或第509位、或第505和第509位丝氨酸残基的磷酸化被抑制。
4．一种防止脊椎动物表皮黑素细胞的酪氨酸酶活性的方法，该方法包括向黑素细胞提供对调节酪氨酸酶细胞质区域中丝氨酸残基/苏氨酸残基的磷酸化的蛋白激酶C-β为特异性干扰的肽。
5．根据权利要求4所述的方法，其中所述的第505或第509位、或第505和第509位丝氨酸残基的磷酸化被抑制。
6．根据权利要求4所述的方法，其中所述的肽包括的氨基酸序列与包括酪氨酸酶细胞质区域发生蛋白激酶C-β调控的磷酸化的位点的氨基酸序列同源。
7．根据权利要求6所述的方法，其中所述的肽包括约5-30个氨基酸残基且其中至少一个残基是丝氨酸残基或苏氨酸残基。
8．根据权利要求7所述的方法，其中所述的肽包括选自序列号1和序列号4中的氨基酸序列。
9．一种改变脊椎动物皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的色素量的方法，该方法包括调节表皮黑素细胞中的蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化。
10．根据权利要求9所述的方法，其中所述的脊椎动物皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的色素量被降低，该方法包括抑制表皮黑素细胞中的蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化。
11．根据权利要求10所述的方法，其中所述的第505或第509位、或第505和第509位丝氨酸残基的磷酸化被抑制。
12．根据权利要求10所述的方法，其中所述的对调节酪氨酸酶细胞质区域中丝氨酸残基/苏氨酸残基的磷酸化的蛋白激酶C-β为特异性干扰的肽被引入到表皮黑素细胞中。
13．根据权利要求12所述的方法，其中所述的肽包括的氨基酸序列与包括酪氨酸酶细胞质区域发生蛋白激酶C-β调控的磷酸化的位点的氨基酸序列同源。
14．根据权利要求13所述的方法，其中所述的肽包括约5-30个氨基酸残基且其中至少一个残基是丝氨酸残基或苏氨酸残基。
15．根据权利要求14所述的方法，其中所述的肽包括选自序列号1和序列号4中的氨基酸序列。
16．根据权利要求12所述的方法，其中所述的肽是被放在含有该肽的药用组合物中以局部给药的方式提供给表皮黑素细胞的。
17．一种降低脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或毛皮的色素量的方法，该方法包括抑制含在皮肤、毛发、羊毛、或毛皮中的脊椎动物表皮黑素细胞内的酪氨酸酶的磷酸化，以局部给药的方式向脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或毛皮囊中提供包被在脂质体中的一种DNA构造，其中该DNA构造编码包括与包含酪氨酸酶细胞质区域发生蛋白激酶C-β调控的磷酸化的位点的氨基酸序列同源的氨基酸序列的肽，当该DNA构造被引入到黑素细胞中后就在其中表达该肽，抑制酪氨酸酶的磷酸化，从而降低色素量。
18．一种鉴定改变脊椎动物表皮黑素细胞中色素量的物质的方法，该方法包括检测该物质对表皮黑素细胞中蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶活化的效应，其中，如果该蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的活化被改变，则脊椎动物的黑素细胞的色素量就被改变。
19．一种鉴定降低脊椎动物表皮黑素细胞中色素量的物质的方法，该方法包括检测该物质对表皮黑素细胞中蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶活化的抑制效应，该方法包括下述步骤：
(1)向培养的脊椎动物黑素细胞引入受试物质，引入的数量要足以抑制酪氨酸酶的磷酸化，如果该受试物质具有该抑制特性的话；
(2)从(1)步骤中的培养的黑素细胞中分离酪氨酸酶并检测被分离出来的酪氨酸酶的磷酸化；以及
(3)将从(1)步骤中培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化与在相似但是没有受试物质的条件下培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化相比较，来确定受试物质对蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的抑制效应，如果该物质抑制蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化，则黑素细胞中的色素量就被降低。
20．根据权利要求19所述的方法，其中所述的黑素细胞培养在有32P-正磷酸盐的条件下；在步骤(2)中，对结合到被分离的酪氨酸酶中的32P-正磷酸盐的数量进行确定，在步骤(3)中，将从步骤(1)中培养的黑素细胞中分离的酪氨酸酶所结合的32P-正磷酸盐的数量与在相似的但是没有受试物质的条件下培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶所结合的32P-正磷酸盐的数量进行比较。
21．根据权利要求19所述的方法，其中所述的对步骤(2)中培养的黑素细胞的酪氨酸酶的分离是用对酪氨酸酶为特异性的抗体或其片段以免疫沉淀方法进行的。
22．一种抑制蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的物质，它们是或可以被权利要求19所述的方法鉴定，其用途是治疗。
23．一种鉴定提高脊椎动物表皮黑素细胞的的色素量的方法，该方法包括确定该物质提高黑素细胞中蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的效果，其所包括的步骤如下：
(1)向培养的脊椎动物黑素细胞中引入受试物质，其数量要足以提高酪氨酸酶的磷酸化，如果该物质具有这种提高提高性质；
(2)从步骤(1)中培养的黑素细胞中分离酪氨酸酶，检测被分离的酪氨酸酶的磷酸化；以及
(3)将从步骤(1)中培养的黑素细胞中分离的酪氨酸酶的磷酸化与在相似的但是没有受试物质的条件下培养的黑素细胞中分离出来的酪氨酸酶的磷酸化进行比较，确定该物质对提高蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的效果，如果该物质抑制蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化，则黑素细胞中的色素量就被提高。
24．一种抑制蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的物质，它们是或可以被权利要求23所述的方法鉴定，其用途是治疗。
25．对蛋白激酶C-β调控的脊椎动物表皮黑素细胞所含有的酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化进行调控的试剂的应用，所述的应用是制备调控脊椎动物表皮黑素细胞的酪氨酸酶的活化的药剂。
26．对蛋白激酶C-β调控的脊椎动物表皮黑素细胞所含有的酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化进行抑制的试剂的应用，所述的应用是制备防止脊椎动物表皮黑素细胞的酪氨酸酶的活化的药剂。
27．对蛋白激酶C-β调控的脊椎动物表皮黑素细胞所含有的酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化进行特异性干扰的肽的应用，所述的应用是制备通过将所述的肽提供给黑素细胞的防止脊椎动物表皮黑素细胞的酪氨酸酶的活化的药剂。
28．根据权利要求27所述的应用，其中所述药剂用于改变脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、和皮毛的色素量。
29．根据权利要求28所述的应用，其中所述的药剂用于降低脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、和皮毛的色素量。
30．根据权利要求27、28和29中任何一项所述的应用，其中的第505或509位的丝氨酸残基的磷酸化被抑制。
31．根据权利要求29或30所述的应用，其中所述的试剂包括在被提供给表皮黑素细胞后可以对蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的细胞质区域的丝氨酸残基或苏氨酸残基的磷酸化进行特异性干扰的肽。
32．根据权利要求27或31所述的应用，其中所述的肽包括的氨基酸序列与包括酪氨酸酶细胞质区域发生蛋白激酶C-β调控的磷酸化的位点的氨基酸序列同源。
33．根据权利要求32所述的应用，其中所述的肽包括5-30个氨基酸残基切含有至少一个丝氨酸残基。
34．根据权利要求33所述的应用，其中的所述的肽包括选自序列号1和序列号4所组成的一组氨基酸序列。
35．根据权利要求34所述的应用，其中所述的药剂是含有提供给表皮黑素细胞的肽的局部药用组合物。
36．一种DNA构造在制备药剂中的应用，所述的药剂是通过抑制包含在皮肤、毛发、羊毛、或皮毛囊中的脊椎动物表皮黑素细胞降酪氨酸酶的磷酸化来降低脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的色素量，该药剂包括局部用于脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的包被在脂质体中的DNA构造，其中的DNA构造编码的肽的氨基酸序列与包括酪氨酸酶细胞质区域发生蛋白激酶C-β调控的磷酸化的位点的氨基酸同源，因此，当将该DNA构造提供给黑素细胞时，黑素细胞表达该肽，结果是抑制酪氨酸酶的磷酸化。
37．一种肽在制备药剂中的应用，所述的药剂是通过抑制包含在皮肤、毛发、羊毛、或皮毛囊中的脊椎动物表皮黑素细胞降酪氨酸酶的磷酸化来降低脊椎动物的皮肤、毛发、羊毛、或皮毛的色素量，该药剂包括用于脊椎动物的皮肤、或围绕毛发、羊毛、或皮毛囊的皮肤的包被在脂质体中的肽，其中的肽包括的氨基酸序列与包括酪氨酸酶细胞质区域发生蛋白激酶C-β调控的磷酸化的位点的氨基酸同源，因此，当将该肽被提供给黑素细胞时，酪氨酸酶的磷酸化被抑制。
38．调控蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的物质在改变色素量的治疗中的应用。
39．调控蛋白激酶C-β调控的酪氨酸酶的磷酸化的物质在以美容为目的的改变色素量方面的应用。
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