DE4338817A1 - Gensequenzen von Cellular X Binding Proteinen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Gensequenzen von Fatty Acid Binding Proteinen (FABPs), insbesondere das Gen Cxbp für das Cellular X Binding Protein (CXBP) und seine Homologen. Sie betrifft ferner die von diesen Gensequenzen abgeleiteten cDNS- Sequenzen und die daraus exprimierten Proteine. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die pharmazeutische Industrie, die medizinische Diagnostik und die molekularbiologische Forschung.

Die FABPs sind kleine (14-16 kD) zytoplasmatische Proteine, die hydrophobe Liganden wie Fettsäuren, Retinoide, Eikosanoide u. a. binden (Veerkamp et al., 1991). Gegenwärtig sind etwa 10 verschiedene FABPs bekannt. In der Regel werden diese in spezifischen ausdifferenzierten Geweben exprimiert. Über ihre Funktion ist wenig bekannt. Es wird angenommen, daß sie den intrazellulären Transport ihrer Liganden vermitteln. Das allein kann jedoch nicht erklären, warum es derartig viele gewebsspezifische FABPs gibt.

Die Cellular Retinoid Binding Proteins (CRtBPs) stellen eine Subfamilie der FABPs dar. Diese werden im Gegensatz zu den anderen FABPs auch in embryonalem Geweben exprimiert, u. a. im sich entwickelnden Nervensystem (Ruberte et al., 1993). Es konnte gezeigt werden, daß die CRtBP den Metabolismus der Retinsäure regulieren, indem sie einerseits den Transport von Retinol, Retinal und Retinsäure in der Zelle vermitteln, andererseits aber als Kofaktoren mit spezifischen Enzymen des Retinoid-metabolismus interagieren (Napoli, 1993; Ross, 1993). Die Retinoide sind entscheidende morphogenetisch wirksame Substanzen, die an der Ausprägung der Anterior-Posterior-Achse im Zentralnervensystem aber auch bei der Morphogenese und Differenzierung anderer Gewebe beteiligt sind (Eichele, 1993). Gegenwärtig verdichten sich die Hinweise, daß auch die anderen FABPs an der Steuerung des Metabolismus von morphogenetisch wirksamen hydrophoben Substanzen beteiligt sind (Bass, 1993), wie z. B. Arachidonsäuremetaboliten. Deshalb besteht großes Interesse an der Auffindung und Untersuchung weiterer FABPs.

Die Erfindung hat das Ziel, FABPs für eine medizinische Nutzbarmachung zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe besteht darin, FABP-Gene zu isolieren, gegebenenfalls die von ihnen kodierten Proteine zu synthetisieren und die von den Proteinen im Organismus natürlicherweise gebundenen Liganden zu analysieren. Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1-9 realisiert. Die Nukleotidsequenzen der Ansprüche 1 bis 4 und die Aminosäuresequenz des Anspruchs 5 werden durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 und 9 erhalten:

Zwei Aminosäureregionen werden ausgewählt, die innerhalb der FABP-Familie relativ konserviert sind und die gemäß der generellen Exon/Intron-Struktur der bekannten FABP-Gene (Matarese et al., 1989) auf verschiedenen benachbarten Exons kodiert sind. Für diese beiden Aminosäuresequenzen werden entsprechende degenerierte Oligonukleotide synthetisiert, die als Primer für die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) mit genomischer DNS als Template eingesetzt werden. Die erhaltenen PCR-Fragmente enthalten Teile der beiden Exons und das vollständige Intron, das in der Gensequenz zwischen den beiden Exons liegt. Die Größe der erhaltenen PCR-Fragmente wird durch Agarose-Elektrophorese analysiert und entspricht den Introngrößen verschiedener homologer FABP-Gene. Die einzelnen PCR-Fragmente werden gereinigt, reamplifiziert und als genspezifische Sonde zur Isolierung des entsprechenden Gens aus einer genomischen Bank eingesetzt. Durch Vergleich der Nukleotidsequenzen des isolierten Gens mit bekannten FABP- cDNA-Sequenzen werden die Exonregionen des Gens abgeleitet. Diese werden als Sonde eingesetzt, um verschiedene Gewebe mittels Northern-Blot-Analyse bezüglich der Expression des Gens zu untersuchen. Aus einem exprimierenden Gewebe wird die entsprechende cDNS mittels PCR erhalten, wobei die Sequenzen der benötigten Primer aus der Gensequenz abgeleitet werden. Die Aminosäuresequenz des zugehörigen Proteins wird durch Translation der kodierenden Nukleotidsequenzen des Gens abgeleitet.

Das erhaltene Gen mit der vorläufigen Bezeichnung Cxbp besteht aus folgenden Regionen:

Die Verfügbarkeit des CXBP-Gens erlaubt die Untersuchung der Regulation von Wachstum- und Differenzierung früher neuraler Vorläuferzellen anhand der Expressionsregulation des CXBP-Gens.

Aus dem Gen können ferner Vektoren konstruiert werden, die die ektopische Expression von Fremdproteinen, z. B. Toxinen, in dedifferenzierten neuralen Zellen ermöglichen. Solche Vektoren sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Dieses Gen kodiert für eine mRNA folgender Sequenz:

Daraus leitet sich folgende Aminosäuresequenz des CXBP ab:

Das Protein kann in an sich bekannter Weise exprimiert werden. Mittels des Proteins kann der endogene Ligand analysiert werden, der möglicherweise eine morphogenetische Aktivität analog zur Retinsäure besitzt. Dieser Ligand ist von großem pharmazeutischem Interesse.

Aus der Kenntnis der Primärstruktur lassen sich ebenfalls monospezifische Antikörper erzeugen. Diese sind von diagnostischem Interesse zur Charakterisierung von neuralen Zellen, wie z. B. Neuroblastomen oder Gliomen.

Zum Vorkommen und zur Struktur von CXBP werden folgende weitere Angaben gemacht:
Im Gegensatz zu den meisten FABPs und in Analogie zu den CRtBPs wird CXBP hauptsächlich während der Embryonalentwicklung exprimiert und zwar, soweit bekannt, ausschließlich im Nervengewebe. Besonders auffällig ist die starke Expression im Gebiet der "Floor Plate" im frühen Neuralrohr und Hinterhirn. Diese Region ist dafür bekannt, daß sie ein noch nicht näher charakterisiertes morphogenetisches Signal aussendet, das mitverantwortlich ist für die Ausprägung der Ventral-Dorsal-Struktur. Im adulten Tier konnte eine Expression von CXBP nur in einigen spezifischen Gliazelltypen nachgewiesen werden (olfaktorische Ensheathing Cells, Satelliten-Zellen in sensorischen Ganglien).

Die Primärstruktur des CXBP weist die größte Sequenzhomologie zum Herz-FABP auf, was auf einen ähnlichen endogenen Liganden hinweist. Der endogene Ligand des Herz-FABP wie der meisten anderen FABPs ist jedoch nicht bekannt. Aus in­ vitro-Experimenten ist bekannt, daß Herz-FABP verschiedene mittel- und langkettige Fettsäuren, besonders aber ungesättigte Fettsäuren wie Arachidonsäure bindet. Zusammenfassend wird festgestellt, daß durch die Erfindung eine Nutzbarmachung von FABP für die molekularbiologische Forschung (Gen Cxbp) und für die medizinische Diagnostik (Protein CXBP) als auch Therapie (CXBP-Ligand) ermöglicht wird.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Anwendungsbeispiele näher erläutert werden:

1. Identifizierung eines neuen FABP-Gens (Cxbp)

Es wurden zwei Aminosäuresequenzbereiche ausgewählt, die innerhalb einer FABP- Subfamilie konserviert sind (Abb. 1, Consensus). Aus der generellen Exon/lntron- Struktur der FABP-Gene (Matarese et al., 1989) konnte vermutet werden, daß das dem N-Terminus zugewandte Peptid auf Exon 2 und das dem C-Terminus zugewandte auf Exon 3 kodiert sind. In einem FABP-Gen werden diese durch Intron 2 voneinander getrennt.

Den beiden Peptidsequenzen entsprechende Oligonukleotide wurden synthetisiert, in deren Sequenz alle möglichen Codons (5′-G-primer) bzw. Anticodons (3′-G- primer) für die betreffenden Aminosäuresequenzen berücksichtigt wurden (Abb. 1). 30 Zyklen der Polymerase-Kettenreaktion (1 min 95°C, 2 min 52°C, 2 min 72°C) wurden durchgeführt, wobei der Reaktionsansatz folgende Komponenten enthielt:

50 ng genomische Maus-DNS
je 10 pmol 5′-G-primer und 3′-G-primer
2,5 U Taq-DNA-Polymerase
10 mM Tris, pH 8,4
50 mM KCl
1,5 mM MgCl₂
0,01% Gelatine
je 200 µM dATP, dCTP, dGTP, dTTP

Die Reaktionsprodukte wurden durch 0,8% Agarose/0,5*TBE-Elektrophorese hinsichtlich ihrer Größen analysiert, die den Größen der zweiten Introns verschiedener FABP-Gene entsprechen: Es ergaben sich die drei Hauptprodukte A, B und C.

Die einzelnen Produkte der PCR-Reaktion wurden mittels HPLC (GenPak-FAX, Waters) gereinigt und analog zur obigen PCR-Reaktion reamplifiziert. Die gereinigten und reamplifizierten PCR-Produkte wurden mittels "fmol DNA Sequencing System" (Promega) unter Benutzung der gleichen beiden Primer sequenziert. Dadurch wurde festgestellt, daß Produkt A ein Fragment des bekannten Gens Fabph und das Produkt C ein Fragment des bekannten Pseudogens Fabph­ ps darstellen. Das Produkt B konnte anhand der im PCR-Fragment enthaltenen flankierenden Exonsequenzen eindeutig als bisher unbekanntes FAB P-Gen identifiziert werden, das als Cxbp bezeichnet wurde.

2. Isolierung des Gens Cxbp

500 000 plaque forming units einer genomischen Maus-Bank im Vektor λGEM1 1 (Stratagene) wurden mittels Phagentransfer auf Nitrozellulose und Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten PCR-Fragment B ("megaprime-kit", Amersham) hinsichtlich Cxbp- enthaltender Klone durchmustert (Sambrook et al., 1989). Die Hybridisierung wurde bei 37°C über Nacht in 6*SSC, 5*Denhardt, 1% SDS, 50 µg/ml denaturierte Heringssperma-DNS durchgeführt. Die Filter wurden anschließend dreimal für 10 Minuten gewaschen in 0,2*SSC, 0,1% SDS bei 50°C und auf Röntgenfilm (HS1 1, ORWO) exponiert. Die Cxbp enthaltenen Klone wurden anhand der spezifisch gebundenen Radioaktivität identifiziert. Zwei unabhängige Klone wurden durch Ausverdünnen der Phagen schrittweise vereinzelt und isoliert. Diese Phagen wurden durch Suspensionskultur vermehrt und ihre DNS in bekannter Weise gereinigt. Fragmente der in der Phagen-DNS enthaltenen genomischen Maus-DNS wurde durch Verdauung von jeweils 10 µg Phagen-DNS mit den Enzymen HindIII, SacI und EcoRI gewonnen und in die Plasmidvektoren pBluescript SK(+) (Stratagene) und pGEM3Z (Promega) durch Ligation eingesetzt (Sambrook et al., 1989). Die in den Plasmiden enthaltenen Fragmente genomischer Maus-DNS wurden sequenziert (Sequenase 2.0, USB) und die Teilsequenzen durch ihre Überlappungen aneinander gefügt.

3. Identifizierung der kodierenden Genbereiche (Exons)

Die Exons 2 (Aminosäuren 25-82) und 3 (Aminosäuren 83-110) konnten direkt durch das Vorhandensein der zu den beiden Primern (5′-G- und 3′-G-) homologen Sequenzabschnitte identifiziert werden.

Exons 1 (Aminosäuren 1-24) und 4 (Aminosäuren 117-132) konnten zuerst nur durch die Homologien der Cxbp-kodierten Aminosäuresequenzen mit anderen bereits bekannten FABPs vermutet werden (Abb. 4).

Deshalb wurden verschiedene Mausgewebe bezüglich der Expression von Cxbp untersucht. Als Probe diente ein PCR-Fragment, das die Nukleotidsequenzen der bereits bekannten Exons 2 und 3 umfaßte. 15 µg RNA präpariert aus den verschiedenen Mausgeweben wurde durch Northern-Blot-Analyse untersucht. Nur in der Hirn-RNA konnte ein Cxbp-verwandtes Transkript identifiziert werden (Abb. 2).

Um die vermuteten Exons1 und 4 zu bestätigen, wurde eine Reverse Transkriptase- PCR durchgeführt. Die dazu benötigten Primer (5′-R- und 3′-R-) wurden aus der Gensequenz entsprechend der Vermutung abgeleitet (Abb. 3). 1 µg der Hirn-RNA wurde in einsträngige cDNS umgeschrieben ("First strand cDNA Synthesis kit" Pharmacia) und als Template in einer PCR mit jeweils 10 pmol der beiden R-Primer im oben angegebenen PCR-Puffer eingesetzt (30 Zyklen á 1 min 95°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C). Das erhaltene PCR-Fragment wurde in den HincII-Ort des Vektors pGEM3Z einkloniert und sequenziert. Die Exons 1 und 4 wurden durch die erhaltene Sequenz bestätigt.

Aus den somit bestimmten kodierenden Regionen des Gens Cxbp kann die Primärstruktur des Proteins CXBP abgeleitet werden (Abb. 3). Seine Homologie zu bekannten FABPs weist es als ein neues Mitglied der FABP-Familie aus (Abb. 4).

Abb.

(oben) Auswahl zweier Aminosäureregionen (Consensus), die zwischen Herz- (H-) und Adipozyten-(A-) FABP sowie Myelin P2 konserviert sind und die Sequenzen der abgeleiteten Oligonukleotid-Primer für die PCR (5′-G-primer und 3′- G-primer). (unten) Elektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte die mittels der 5′- und 3′-G-primer aus genomischer Maus-DNS erhalten wurden. Die Fragmente wurden durch ihre Sequenzierung dem H-FABP/MDGl-Gen (Fabph, Fragment A), dem intronlosen H-FABP/MDGI-Pseudogen (Fabph-ps, Fragment C) und dem neu identifizierten Gen Cxbp (Fragment B) zugeordnet.

Abb. 2: Untersuchung der Cxbp Expression verschiedener Mausgewebe im Vergleich zur Expression des homologen Gens Fabph

Abb. 3: Die Exon/Intron-Struktur des Gens Cxbp. Die Exonbereiche sind durch Großbuchstaben gekennzeichnet, die Intronb

iche wurden klein gedruckt und abgekürzt. Unter die Codons in den kodierenden Bereichen wurde die Aminosäuresequenz gedruckt. Die TATA-box und das Polyadenylierungssignal wurden doppelt unterstrichen. Das mittels der beiden G-Primer aus der genomischen Maus-DNS erhaltenene PCR-Fragment wurde durch einfache Unterstreichung hervorgehoben. Die für die Reverse Transkriptase-PCR benutzten P-Primer wurden eingetragen.

Abb. 4: Homologievergleich der zur Zeit bekannten FABPs der Spezies Maus bzw. Ratte. Im Anschluß an die Sequenzen wurde die Homologie im Vergleich zum CXBP in Klammern angegeben.

Literatur

Bass, N.M. (1993). Cellular Binding Proteins for Fatty Acids and Retinoids-Similar or Specialized Functions. Mol. Cell Biochem. 123, 191-202.
Eichele, G. (1993). Retinoids in Embryonic Development. Maternal. Nutrition. and. Pregnancy. Outcome. 678. 1993. 22-36. -36.
Matarese, V., Stone, R.L., Waggoner, D.W., and Bernlohr, D.A. (1989). Intracellular fatty acid trafficking and the role of cytosolic lipid binding proteins. Prog. Lipid Res. 28, 245-272.
Napoli, J.L. (1993). Biosynthesis and Metabolism of Retinoic Acid - Roles of CRBP and CRABP in Retinoic Acid - Roles of CRBP and CRABP in Retinoic Acid Homeostasis. J. Nutr. 1993. FEB. 123, 362-366.
Ross, A.C. (1993). Cellular Metabolism and Activation of Retinoids - Roles of Cellular Retinoid-Binding Proteins. FASEB J. 1993. FEB. 1. 7, 317-327.
Ruberte, E., Friederich, V., Chambon, P., and Morrisskay, G. (1993). Retinoic Acid Receptors and Cellular Retinoid Binding Proteins, 3. Their Differential Transcript Distribution During Mouse Nervous System Development. Development 1993. MAY. 118, 267-282.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. A laboratory manual. Anonymous, ed. (Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press), pp. 7.79-7.83.
Veerkamp, J.H., Peeters, R.A., and Maatman, R.G. (1991). Structural and functional features of different types of cytoplasmic fatty acid-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta 1081, 1-24.

Claims (9)

1. Sequenzen des Maus-Cellular X Binding Protein (CXBP) kodierenden Gens Cxbp und homologer Gene anderer Säugerspezies, die durch Kreuzhybridisierung mit der dargestellten Gensequenz isoliert werden können.

2. Sequenz des Maus-Cellular X Binding Protein (CXBP) kodierenden Gens Cxbp bestehend aus folgenden Regionen:

3. Komplementäre Sequenz zu einer der kodierenden Regionen (cDNS) nach Anspruch 1 und 2.

4. Komplementäre Sequenz nach Anspruch 3 mit der kodierenden Region Nukleotide 88-463 und dem Polyadenylierungsignal Nukleotide 744-749 und mit der Nukleotidsequenz:

5. Cellular X Binding Protein (CXBP) der Maus folgender Primärstruktur und seine Homologen anderer Säugerspezies, die durch ihre immunologische Kreuzreaktion mit CXBP oder ihre mit CXBP vergleichbare Ligandenspezifität identifiziert werden können:

6. Konstrukte bestehend aus einem Vektor und einer der Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4.

7. Komplexe bestehend aus CXBP nach Anspruch 5 und einem Liganden.

8. Verfahren zur Gewinnung der Gen- und Proteinsequenzen gemäß den Ansprüchen 1-5, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• - Auswahl von innerhalb der Fatty Acid Binding Potein (FABP)-Familie konservierten Aminosäuresequenzbereichen, die gemäß der allgemeinen Genstruktur der FABPs auf benachbarten Exons kodiert sind,
• - Synthese von vollständig degenerierten Oligonukleotiden, 5′-Primer und 3′-Primer entsprechend den möglichen Codons (5′-Primer) und Anticodons (3′-Primer) der beiden Aminosäuresequenzen,
• - Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit diesen beiden Primern und genomischer DNS als Template; Identifizierung verschiedener Gene anhand der Größe der erhaltenen PCR-Fragmente, die der Größe der Introns entsprechen, die in der jeweiligen Gensequenz zwischen den beiden die konservierten Aminosäuresequenzen kodierenden Exons liegen,
• - Isolierung der gesamten Gensequenz durch Screening einer genomischen Bank unter Benutzung des erhaltenen PCR-Fragments als Sonde,
• - Identifizierung der kodierenden Genbereiche durch Homologievergleich mit bekannten FABP-Sequenzen,
• - Screening von verschiedenen Geweben hinsichtlich Expression des identifizierten Gens durch Northern-Blot-Analyse unter Benutzung eines Exonfragmentes dieses Gens als Sonde und
• - Isolierung der entsprechenden cDNS-Sequenz durch PCR mittels Primern, die aus der Gensequenz abgeleitet werden.

9. Verfahren zur Gewinnung der Proteine nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die nach Anspruch 8 gewonnene kodierende Sequenz in prokaryotische oder eukaryotische Expressionsvektoren einkloniert, Bakterien bzw. eukaryotische Zellen mit dem Konstrukt transfiziert und gegebenenfalls induziert, und das Protein aus dem Kulturüberstand bzw. Zellhomogenat in an sich bekannter Weise isoliert und reinigt.