DE69835913T2 - Aspartat-Proteinase 2 (ASP2) - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft neu identifizierte Polynucleotide und die Verwendung solcher Polynucleotide. Insbesondere betreffen die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung die Aspartat-Proteinase-Familie, die nachstehend als ASP2 bezeichnet wird.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es gibt derzeit fünf bekannte menschliche Aspartat-Proteasen (Aspartat-Proteinasen), nämlich Pepsin, Gastricsin, Cathepsin D, Cathepsin E und Renin, und diese besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. Pepsin und Gastricsin sind an Ernährungsprozessen im Magen beteiligt, Cathepsin D ist am Proteinumsatz in vielen Zellarten beteiligt, und Renin besitzt die hoch spezifische Funktion der Angiotensinproduktion von dessen Vorläuferform Angiotensinogen. Die genaue Rolle von Cathepsin E muss noch bestätigt werden, auch wenn dessen Standort in einigen Epithelialzelltypen eine Rolle bei der Antigenprozessierung anzeigte. Es kann auch an bestimmten Entzündungszuständen wie einer Helicobacter-pylori-Entzündung im Magen beteiligt sein. Dies zeigt, dass die Aspartat-Proteasefamilie eine anerkannte, nachgewiesene Geschichte als therapeutisches Ziel besitzt. Es gibt eine klare Notwendigkeit, weitere Mitglieder der Aspartat-Proteasefamilie zu identifizieren und kennzeichnen, die eine Rolle in der Verhinderung, Verbesserung oder Korrektur von Dysfunktionen oder Erkrankungen spielen können, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Alzheimer-Krankheit, Krebs und Prohormonprozessierung.
  • Verschiedene Aspartatsäure-Proteasen sind im Stand der Technik bekannt. Der Artikel von Kiyoshi Mori (FEBS Letters, Bd. 401, 20. Jan. 1997, Seiten 218-222) offenbart eine Aspartatsäureprotease, die als ASP1 bezeichnet wird, und Polynucleotide, die die Aspartatsäureprotease codieren. Die Polynucleotidsequenz besitzt 1863 Basenpaare und codiert die ASP1-Polypeptidsequenz.
  • WO 96/40885 offenbart ein Beta-Secretaseenzym und die teilweise Reinigung des Beta-Secretasepolypeptids von menschlichen 239-Zellen. WO 96/40885 erkennt ebenfalls an, dass weder die Aminosäuresequenz noch die Nucleinsäuresequenz des Beta-Secretasegens bestimmt wurde.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Aspartat-Protease-Polynucleotid bereit, welches ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Aspartat-Proteinase-Polynucleotid nach Anspruch 1 bereit, das eine Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein isoliertes Polynucleotid bereit, das zu einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung komplementär ist, und ein isoliertes Polynucleotid, das unter hoch stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid von SEQ ID NO: 1 hybridisiert, das mindestens 95% Identität mit einem Polynucleotid von SEQ ID NO: 1 hat und das ein Polypeptid codiert, das Aspartat-Protease-Aktivität aufweist.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein DNA- oder RNA-Molekül bereit, das ein Expressionssystem umfasst, wobei das Expressionssystem ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung und eine Wirtszelle umfasst, die ein solches Expressionssystem umfasst.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Aspartat-Protease-Polypeptids bereit, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle der vorliegenden Erfindung unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptids ausreichend sind, und die Gewinnung des Polypeptids aus der Kultur.
  • In noch einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle bereit, die ein Aspartat-Protease-Polypeptid herstellt, umfassend das Transformieren oder Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionssystem der vorliegenden Erfindung, so dass die Wirtszelle unter geeigneten Kulturbedingungen ein Aspartat-Protease-Polypeptid herstellt.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Die folgenden Definitionen werden zum leichteren Verständnis bestimmter Ausdrücke, die nachstehend häufig verwendet werden, bereitgestellt.
  • „ASP2" bezieht sich unter anderem im Allgemeinen auf ein Polypeptid, das die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz besitzt, oder eine allelische Variante davon.
  • „ASP2-Aktivität oder ASP2-Polypeptidaktivität" oder „biologische Aktivität von ASP2 oder des ASP2-Polypeptids" bezieht sich auf die metabolische oder physiologische Funktion von ASP2, einschließlich ähnlicher Aktivitäten oder verbesserter Aktivitäten oder dieser Aktivitäten mit verringerten unerwünschten Nebenwirkungen. Antigene und immunogene Aktivitäten von ASP2 sind ebenfalls eingeschlossen.
  • „ASP2-Gen" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, oder allelische Varianten davon und/oder ihre Komplemente.
  • „Antikörper", wie hierin verwendet", schließen polyclonale und monoclonale Antikörper, chimäre, einzelkettige und humanisierte Antikörper sowie Fab-Fragmente, einschließlich der Produkte einer Fab- oder anderen Immunoglobulinexpressionsbibliothek, ein.
  • „Isoliert" bedeutet „durch die menschliche Hand" vom natürlichen Zustand verändert. Wenn eine „isolierte" Zusammensetzung oder ein „isolierter" Stoff in der Natur vorkommen, wurde sie oder er verändert oder von ihrer oder seiner ursprünglichen Umgebung entfernt oder beides. Zum Beispiel ist ein Polynucleotid oder ein Polypeptid, das in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht „isoliert", aber das gleiche Polynucleotid oder Polypeptid, das von den daneben bestehenden Materialien seines natürlichen Zustandes getrennt wurde, ist nach der Verwendung des Ausdrucks hierin „isoliert".
  • „Polynucleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf jedes Polyribonucleotid oder Polydesoxiribonucleotid, das eine nicht modifizierte RNA oder DNA oder eine modifizierte RNA oder DNA sein kann. „Polynucleotide" schließen ohne Beschränkung einzel- oder doppelsträngige DNA, DNA, die eine Mischung aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die eine Mischung aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, Hybidmoleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig oder typischerweise doppelsträngig oder eine Mischung aus einzel- und doppelsträngigen Regionen sein können, ein. Zusätzlich betrifft der Ausdruck „Polynucleotid" dreisträngige Regionen, die RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA umfassen. Der Ausdruck Polynucleotid schließt ebenfalls DNAs oder RNAs, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten, und DNAs oder RNAs mit Rückgraten, die wegen der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert wurden, ein. „Modifizierte" Basen schließen zum Beispiel tritylierte Basen und ungewöhnliche Basen wie Inosin ein. Die DNA oder RNA wurde einer Vielzahl von Modifikationen unterzogen; somit umfasst „Polynucleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynucleotiden, wie sie typischerweise in der Natur gefunden werden, sowie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren oder Zellen kennzeichnend sind. „Polynucleotid" umfasst ebenfalls relativ kurze Polynucleotide, die oft als Oligonucleotide bezeichnet werden.
  • „Polypeptid" bezieht sich auf jedes Peptid oder Protein, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, die durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen, d.h. Peptidisostere, miteinander verbunden sind. „Polypeptid" bezieht sich sowohl auf kurze Ketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Ketten, die im Allgemeinen als Proteine bezeichnet werden. Polypeptide können andere als die 20 von Genen codierten Aminosäuren enthalten. „Polypeptide" schließen Aminosäuresequenzen ein, die entweder durch natürliche Verfahren wie posttranslationale Prozessierung oder durch chemische Modifikationstechniken, die im Stand der Technik wohl bekannt sind, modifiziert werden. Solche Modifikationen sind in grundlegenden Texten und in detaillierten Monographien sowie in umfangreicher Forschungsliteratur gut beschrieben. Modifikationen können überall in einem Polypeptid auftreten, einschließlich dem Rückgrat des Peptids, der Seitenketten der Aminosäuren und den Amino- oder Carboxyltermini. Es wird anerkannt, dass die gleiche Art von Modifikation im gleichen Ausmaß oder in verschiedenen Ausmaßen an mehreren Stellen in einem beliebigen Polypeptid vorhanden sein kann. Ebenso kann ein beliebiges Polypeptid viele Arten von Modifikationen enthalten. Polypeptide können als Ergebnis von Ubiquitinierung verzweigt sein und sie können zyklisch mit oder ohne Verzweigung sein. Zyklische, verzweigte und verzweigte zyklische Polypeptide können aus posttranslationalen natürlichen Verfahren resultieren oder können durch synthetische Verfahren hergestellt sein. Modifikationen schließen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Kopplung von Flavin, kovalente Kopplung einer Hämeinheit, kovalente Kopplung eines Nucleotids doer Nucleotidderivats, kovalente Kopplung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Kopplung von Phosphotidylinosit, Quervernetzung, Zyklisierung, Bildung von Disulfidbindungen, Demethylierung, Bildung von kovalenten Quervernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Anker-Bildung, Hydroxylierung, Iodinierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA vermitteltes Anfügen von Aminosäuren an Proteine wie Arginylierung und Ubiquitinierung. Vergleiche zum Beispiel PROTEINS – STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2. Aufl., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 und Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, Seiten 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., „Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646 und Rattan et al., „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. NYAcad. Sci. (1992) 663: 48-62.
  • Der Ausdruck „Variante", wie hierin verwendet, ist ein Polynucleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenzpolynucleotid bzw. -polypeptid unterscheidet, jedoch die wesentlichen Eigenschaften erhält. Eine typische Variante eines Polynucleotids unterscheidet sich in der Nucleotidsequenz von einem anderen Referenzpolynucleotid. Veränderungen in der Nucleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids verändern oder nicht verändern, das durch das Referenzpolynucleotid codiert wird. Nucleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und -verkürzungen in dem Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz, wie vorstehend diskutiert, codiert wird. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Referenzpolypeptid. Im Allgemeinen beschränken sich die Unterschiede, so dass die Sequenzen des Referenzpolypeptids und die Variante insgesamt sehr ähnlich, in manchen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenzpolypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeglicher Kombination unterscheiden. Ein sustituierter oder inserierter Aminosäurerest kann ein Rest sein, der durch den genetischen Code codiert wird, oder auch nicht. Eine Variante eines Polynucleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende Variante wie eine allelische Variante sein, oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, dass sie natürlich vorkommt. Nicht natürlich vorkommende Varianten von Polynucleotiden und Polypeptiden können mit Hilfe von Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
  • „Identität", wie im Stand der Technik bekannt, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynucleotidsequenzen, wie sie durch Vergleich der Sequenzen bestimmt wird. Im Stand der Technik bedeutet „Identität" auch der Grad einer Sequenzverwandtschaft zwischen Polypeptid- oder Polynucleotidsequenzen, je nach dem, wie durch die Übereinstimmung von Strängen solcher Sequenzen bestimmt. „Identität" und „Ähnlichkeit" kann einfach mittels bekannter Verfahren errechnet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die, die in Computerational Molecular Biology, Lesk, A. M., Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; und Carillo, H., und Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) beschrieben sind. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität sind so ausgelegt, dass sie zu der größten Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen führen. Verfahren zur Bestimmung der Identität oder Ähnlichkeit sind in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen codiert. Bevorzugte Computerprogrammverfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit von Sequenzen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf das GCG-Programmpaket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1) 387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215. 403-410 (1990). Das BLAST X-Programm ist öffentlich erhältlich von NCBI und aus anderen Quellen (BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Biol. 215. 403-410 (1990). Der wohl bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenso zur Bestimmung der Identität verwendet werden.
  • Bevorzugte Parameter zum Vergleich von Polypeptidsequenzen schließen die folgenden ein:
    • 1) Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Hentikoff und Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10915-10919 (1992). Lücken-Strafe: 12 Lücken-längen-Strafe: 4
  • Ein nützliches Programm mit diesen Parametern ist öffentlich als „Gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI erhältlich. Die vorstehend genannten Parameter sind die Standartwertparameter für Polypeptidvergleiche (zusammen mit keiner Strafe für eine Lücke am Ende).
  • Bevorzugte Parameter für Polynucleotidvergleiche schließen die folgenden ein:
    • 1) Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970) Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlpaarung = 0 Lücken-Strafe: 50 Lücken-längen-Strafe: 3
  • Ein nützliches Programm mit diesen Parametern ist öffentlich als „Gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI erhältlich. Die vorstehend genannten Parameter sind die Standardparameter für Polynucleotidvergleiche.
  • Tabelle 1a
    Figure 00090001
    • a eine Nucleotidsequenz eines menschlichen ASP2 (SEQ ID NO: 1)
  • Tabelle 2b
    Figure 00100001
    • b Eine Aminosäuresequenz eines menschlichen ASP2 (SEQ ID NO: 2)
  • Ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, das ASP2 codiert, kann unter Verwendung von Standardclonierung und -Screening von einer cDNA-Bibliothek, die von mRNA in Zellen der menschlichen Bauchspeicheldrüse und des menschlichen Gehirns stammt, unter Verwendung der exprimierten Sequenzmarker (EST)-Analyse (Adams, M. D., et al., Science (1991) 252: 1651-1656; Adams, M. D., et al., Nature (1992) 355 632-634; Adams, M. D., et al., Nature (1995) 377 Erg.: 3-174) erhalten werden. Erfindungsgemäße Polynucleotide können ebenfalls von natürlichen Quellen wie genomischen DNA-Bibliotheken erhalten werden oder können unter Verwendung wohl bekannter und im Handel erhältlicher Techniken synthetisiert werden.
  • Die Nucleotidsequenz, die das ASP2-Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert, kann identisch zu dem Polypeptid sein, das die in Tabelle 1 (Nucleotid Nummer 1 bis 1503 von SEQ ID NO: 1) enthaltene Sequenz codiert, oder sie kann eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Degeneration) des genetischen Codes auch das Polypeptid von SEQ ID NO: 2 codiert.
  • Wenn die erfindungsgemäßen Polynucleotide zur rekombinanten Herstellung des ASP2-Polypeptids verwendet werden, kann das Polynucleotid die codierende Sequenz für das reife Polypeptid selbst; die codierende Sequenz für das reife Polypeptid im Leserahmen mit anderen codierenden Sequenzen wie denjenigen, die eine Leader- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz oder andere Fusionspeptidteile codieren, einschließen. Zum Beispiel kann eine Markersequenz, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert, codiert werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Aspekts ist die Markersequenz ein Hexa-Histidinpeptid, wie in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 821-824 beschrieben, oder ein HA-Tag. Das Polynucleotid kann ebenfalls nicht codierende 5'- und 3'-Sequenzen wie transkribierte, nicht translatierte Sequenzen, Spleiß- und Polyadenylierungssignale, Ribosomenbindungsstellen und Sequenzen, die mRNA stabilisieren, enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Polynucleotide, die mit den hierin vorstehend beschriebenen Sequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung vor allem Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hierin vorstehend beschriebenen Polynucleotiden hybridisieren. Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „stringente Bedingungen", dass die Hybridisierung nur stattfinden wird, wenn mindestens 95%, noch stärker bevorzugt 97-99% Identität zwischen den Sequenzen besteht.
  • Erfindungsgemäße Polynucleotide, die identisch oder ausreichend identisch sind mit einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 enthalten ist, können als Hybridisierungssonden für cDNA und genomischen DNA verwendet werden, um cDNAs mit voller Länge und genomische Clone, die das ASP2-Polypeptid codieren, zu isolieren und cDNA und genomische Clone anderer Gene (einschließlich Gene, die Homologe und Orthologe von anderen Arten als dem Mensch codieren), die eine hohe Sequenzähnlichkeit mit dem ASP2-Gen besitzen. Solche Hybrisidierungstechniken sind den Fachleuten bekannt. Typischerweise sind diese Nucleotidsequenzen zu 95% mit denen der Referenz identisch.
  • Das Erhalten eines Polynucleotids, das das ASP2-Polypeptid codiert, einschließlich Homologe und Orthologe anderer Arten als dem Menschen, umfasst die Schritte des Durchmusterns einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer geeigneten Sonde, die die SEQ ID NO: 1 besitzt, und des Isolierens einer cDNA mit voller Länge und genomischer Clone, die die Polynucleotidsequenz enthalten. Solche Hybridisierungstechniken sind den Fachleuten wohl bekannt.
  • Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können als Forschungsreagentien und -materialien zum Entdecken von Behandlungen und Diagnostika von tierischen und menschlichen Erkrankungen verwendet werden.
  • Vektoren, Wirtszellen, Expression
  • Die vorliegende Erfindung betrifft DNA- oder RNA-Moleküle, die ein Expressionssystem umfassen, das (ein) Polypeptid(e) der vorliegenden Erfindung umfasst, und Wirtszellen, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionssystem genetisch manipuliert sind, und die Herstellung von erfindungsgemäßen Polypeptiden mittels rekombinanter Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls zur Herstellung derartiger Proteine unter Verwendung von RNAs verwendet werden, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen.
  • Für die rekombinante Herstellung können Wirtszellen genetisch manipuliert sein, um Expressionssysteme oder Teile davon für Polynucleotide der vorliegenden Erfindung einzuschließen. Das Einführen von Polynucleotiden in Wirtszellen kann durch Verfahren erfolgen, die in vielen Standardlaborhandbüchern wie Davis et al., BASIC METHODS ON MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) beschrieben sind, wie Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Transvection, Mikroinjektion, kationische Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape-Beladen, ballistische Einführung oder Infektion.
  • Repräsentative Beispiele von geeigneten Wirten schließen Bakterienzellen wie Streptokokken-, Staphlyokokken-, E. coli; Streptomyces; und Bacillus subtilis-Zellen; Pilzzellen wie Hefezellen und Aspergillus-Zellen; Insektenzellen wie Orosophila 52- und Spodoptera Sf9-Zellen; tierische Zellen wie CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3-, BHK-, HEK 293- und Bowes-Melanom-Zellen; und Pflanzenzellen ein.
  • Eine große Vielfalt an Expressionssystemen kann verwendet werden. Derartige Systeme schließen unter anderem chromosomale, episomale und von Viren stammende Systeme wie zum Beispiel Vektoren, die von bakeriellen Plasmiden, von Bakteriophagen, von Transposons, von Hefeepisomen, von Insertionselementen, von chromosomalen Hefeelementen, von Viren wie Baculoviren, Papovaviren wie SV40, Vacciniaviren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabiesviren und Retroviren stammen, und Vektoren ein, die von Kombinationen daraus stammen, wie diejenigen, die von genetischen Plasmid- und Bakteriophagenelementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssysteme können Kontrollregionen enthalten, die die Expression sowohl regulieren als auch erzeugen. Im Allgemeinen kann jegliches System oder jeglicher Vektor verwendet werden, das oder der zum Aufrechterhalten, Vermehren oder Exprimieren der Polynucleotide geeignet ist, um ein Polypeptid in einem Wirt herzustellen. Die geeignete Nucleotidsequenz kann in ein Expressionssystem durch eine Vielzahl wohl bekannter Routinetechniken wie zum Beispiel derjenigen, die in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (supra) beschrieben sind, eingefügt werden.
  • Zum Sekretieren des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in das gewünschte Polypeptid eingebaut werden. Diese Signale können endogen in Bezug auf das Polypeptid sein oder sie können heterologe Signale sein.
  • Wenn das ASP2-Polypeptid für die Verwendung in Screening Tests exprimiert werden soll, ist im Allgemeinen bevorzugt, dass das Polypeptid an der Oberfläche der Zelle hergestellt wird. In diesem Fall können die Zellen vor der Verwendung in dem Screening Test geerntet werden. Wenn das ASP2-Polypeptid in das Medium sekretiert wird, kann das Medium gewonnen werden, um das Polypeptid zu gewinnen und zu reinigen; wenn es intrazellulär hergestellt wird, müssen die Zellen zuerst lysiert werden, bevor das Polypeptid gewonnen wird. ASP2-Polypeptide können von den rekombinanten Zellkulturen mittels wohl bekannter Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchomatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatidchromatographie und Lektinchromatographie. Am stärksten bevorzugt wird eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie für die Reinigung verwendet. Wohl bekannte Techniken zum erneuten Falten von Proteinen können zur Erneuerung der aktiven Konformation verwendet werden, wenn das Polypeptid während der Isolierung oder Reinigung denaturiert wird.
  • Beispiele
  • Die nachstehenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die den Fachleuten wohl bekannt und für sie Routine sind, außer wenn anders im Detail beschrieben. Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken diese jedoch nicht ein.
  • Clonieren:
  • Die schnelle Amplifikation von cDNA-Enden mitels Polymerasekettenreaktionstechnologie (RACE-PCR) wurde zur Identifizierung der fehlenden 5'-cDNA-Sequenz des Aspartyl-Protease-2-Gens verwendet. Die Quelle der cDNA-Matritze für die Amplifikationsreaktionen war eine Reihe von Marathon-ReadyTM-cDNA-Zubereitungen (Clontech Laboratories, Inc., 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303-4230, USA). Diese Marathon-Ready-cDNAs sind im Wesentlichen cDNA-Bibliotheken, an die Oligonucleotidadaptoren ligiert sind. Dies erlaubt den Forschern eine 5'-RACE-PCR unter Verwendung von zwei Primern durchzuführen, wobei der eine zu einer Region von bekannter Sequenz in dem Gen von Interesse komplementär ist und der andere zu dem ligierten Adaptor komplementär ist, was zu einer Verlängerung zu der bekannten Sequenz am 5'-Ende führt. Die PCR erfolgte unter Verwendung von AmpliTaq® Gold DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Corp.).
  • Man fand heraus, dass es notwendig ist, 5% Dimethylsulphoxid in den Reaktionspuffer für eine erfolgreiche Amplifikation einzuschließen, wahrscheinlich aufgrund des hohen GC-Nucleotidanteils dieser Region der DNA.
  • Die DNA-Sequenz wurde cloniert und es wurde bestätigt, dass eine DNA-Region (Nucleotid 1-273 in Tabelle 1) am 5'-Ende des Asp2-Gens als Verlängerung vom Start-Codon aus mit den vorstehend identifizierten EST-Sequenzen überlappt.
  • Diese neue Sequenz wurde in cDNA-Matritzen von sieben menschlichen Geweben, Herz, Leukocyt, Brustdrüse, Milz, Skelettmuskel, Thymus und Aorta, identifiziert.
  • Northern-Analyse:
  • Ein menschlicher Multiple Tissue Northern-Blot (MTN-Katalognummer 7760-1) (Clontech) wurde mit einer Asp-2 spezifischen Sonde (mit einer Länge von 325 Nucleotiden) hybridisiert, hergestellt durch PCR unter Verwendung der spezifischen Oligonucleotide 5' GATGAGTTCAGGACGGCAG 3' (SEQ ID NO: 5) und 5' GGTGCCATATGTGTCTCC 3' (SEQ ID NO: 6). Die Sonde wurde durch Einbau von 32P-dCTP während der PCR-Amplifikation radioaktiv markiert, und das markierte PCR-Produkt wurde anschließend unter Verwendung des Qiagen PCR Purificationkit gereinigt. Nach einer Stunde Prähybridisierung wurde die Hybridisierung zwei Stunden lang unter Verwendung von ExpressHyb-PufFer (Clontech) bei 68°C durchgeführt, und die markierte Sonde wurde in einer Endkonzentration von 1 × ???? CpM/ml zugegeben. Nach der Hybridisierung wurde die Membran zweimal in 2 × SSC/0,05% SDS 20 Minuten lang und zweimal in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 50°C 20 Minuten lang gewaschen. Die Membran wurde dann in Plastikverpackung verpackt und einem Röntgenfilm bei –70°C mit zwei Verstärkerschirmen ausgesetzt. Dies zeigte, dass die höchste Expression (die untersuchten Gewebe waren Herz, Hirn, Placenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse) von Asp2 in der Bauchspeicheldrüse erfolgte, gefolgt von Hirn.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00160001
  • Figure 00170001
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  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001

Claims (8)

  1. Isoliertes Asparatat-Proteinase-Polynucleotid, welches ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist.
  2. Isoliertes Aspartat-Proteinase-Polynucleotid nach Anspruch 1, das eine Polynucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
  3. Isoliertes Polynucleotid, das zu einem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 komplementär ist.
  4. Isoliertes Polynucleotid welches unter hoch stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid der SEQ ID NO: 1 hybridisiert, mindestens 95% Identität mit einem Polynucleotid der SEQ ID NO: 1 hat und welches ein Polypeptid codiert, das Aspartat-Proteinase-Aktivität aufweist.
  5. DNA- oder RNA-Molekül, das ein Expressionssystem umfasst, wobei das Expressionssystem ein Polynucleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst.
  6. Wirtszelle, umfassend das Expressionssystem nach Anspruch 5.
  7. Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines Aspartat-Proteinase-Polypeptids, umfassend die Züchtung eines Wirts nach Anspruch 6 unter Bedingungen, die für die Herstellung des Polypeptids ausreichend sind, und Gewinnung des Polypeptids aus der Kultur.
  8. Verfahren zur Herstellung einer Zelle, welche ein Aspartat-Proteinase-Polypeptid herstellt, umfassend das Transformieren oder Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Expressionssystem nach Anspruch 5, so dass die Wirtszelle unter geeigneten Kulturbedingungen ein Aspartat-Proteinase-Polypeptid herstellt.
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