JPH10327875A - アスパラギン酸プロテイナーゼａｓｐ２ - Google Patents

アスパラギン酸プロテイナーゼａｓｐ２

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JPH10327875A
JPH10327875A JP10016134A JP1613498A JPH10327875A JP H10327875 A JPH10327875 A JP H10327875A JP 10016134 A JP10016134 A JP 10016134A JP 1613498 A JP1613498 A JP 1613498A JP H10327875 A JPH10327875 A JP H10327875A
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asp2
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ジェイ．ポウェル デビッド
Conrad G Chapman
ジー．チャップマン コンラッド
Kay Murphy
マーフィー ケイ
Trudi S Smith
エス．スミス トルディ
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SmithKline Beecham Corp
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＡＳＰ２ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方法を
提供する。 【解決手段】 配列番号２のＡＳＰ２ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
０％同一であり、かつＡＳＰ２ポリペプチドの活性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
配列を含んでなるポリヌクレオチドを単離する。 【効果】 ＡＳＰ２ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドはアルツハイマー病、癌、プロホルモンプロセシング
を含む機能障害または疾病の治療と、このような症状の
診断アッセイに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドはアスパラギン酸プロテイナーゼファミリーの新規な
メンバー（以後ＡＳＰ２と記す）に関する。本発明はま
た、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの
作用を阻害または活性化することに関する。
【０００２】
【従来の技術】現在知られているヒト・アスパラギン酸
プロテアーゼは５種類存在し、すなわちペプシン、ガス
トリシン、カテプシンＤ、カテプシンＥおよびレニンで
ある。これらは多様な機能を有している。ペプシンとガ
ストリシンは胃での栄養過程に関与し、カテプシンＤは
多くの細胞型においてタンパク質の代謝回転に関与し、
そしてレニンは前駆体アンギオテンシノーゲンからアン
ギオテンシンを産生するという高度に特異的な機能を有
する。カテプシンＥの正確な役割はまだ確認されていな
いが、いくつかの上皮細胞型にそれが局在することか
ら、抗原プロセシングでの役割が示唆されている。それ
はまた、ある種の炎症状態、例えば胃におけるヘリコバ
クター・ピロリ(Helicobacter pylori) 感染、に関与し
ている可能性がある。こうしたことは、アスパラギン酸
プロテイナーゼファミリーに治療用ターゲットとしての
確立され実証された歴史があることを示している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】明らかに、アルツハイ
マー病、癌、およびプロホルモンプロセシングを含むが
これらに限らない、機能障害または疾病を予防し、改善
し、治療する上で何らかの役割を果たすアスパラギン酸
プロテイナーゼファミリーの新たなメンバーを同定して
特性付ける必要性が存在している。本発明はかかるメン
バーを提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、ＡＳＰ２ポリペプチドおよび組換え物質、並び
にその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はＡ
ＳＰ２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
に関する。こうした使用には、とりわけ、アルツハイマ
ー病、癌、プロホルモンプロセシングの治療が含まれ
る。他の態様では、本発明は、本発明により提供される
物質を用いてアゴニストおよびアンタゴニストを同定す
る方法、並びに同定された化合物を用いてＡＳＰ２の不
均衡と関連した状態を治療することに関する。本発明の
さらに他の態様は、不適当なＡＳＰ２活性またはＡＳＰ
２レベルと関連した疾病を検出するための診断アッセイ
に関する。
【０００５】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「ＡＳＰ２」とは、
特に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはそのアレリック変異体を意味
する。「ＡＳＰ２活性またはＡＳＰ２ポリペプチド活
性」または「ＡＳＰ２またはＡＳＰ２ポリペプチドの生
物学的活性」とは、類似の活性、向上した活性、または
望ましくない副作用が低下したこれらの活性を含めて、
ＡＳＰ２の代謝的または生理的機能を意味する。さら
に、前記ＡＳＰ２の抗原的および免疫原的活性も含まれ
る。「ＡＳＰ２遺伝子」とは、配列番号１で表されるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはそのア
レリック変異体および／またはそれらの相補体を意味す
る。
【０００６】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。
【０００７】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮ
ＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩
基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または
他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮ
ＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例え
ば、トリチル化された塩基およびイノシンのような普通
でない塩基がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざ
まな修飾が行われてきた。こうして、「ポリヌクレオチ
ド」は、自然界に一般的に存在するポリヌクレオチドの
化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、並びに
ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化
学的形態を包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、
しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリ
ヌクレオチドも包含する。
【０００８】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチドバックボーン、アミ
ノ酸側鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリ
ペプチドのどこでも行うことができる。同じタイプの修
飾が所定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でま
たはさまざまに異なる程度で存在してもよい。また、所
定のポリペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいても
よい。ポリペプチドはユビキチン化のために分枝してい
ても、分枝のある又はない環状であってもよい。環状
の、分枝した、または分枝した環状のポリペプチドは翻
訳後の天然プロセスから生じることがあり、また、合成
法によって製造することもできる。修飾としては、アセ
チル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フ
ラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド
またはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質
誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有
結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル
化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメー
トの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシ
ル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解
処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル
化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミ
ノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。
例えば、PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERT
IES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Com
pany, New York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENT M
ODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic
Press, New York, 1983中のWold, F., Posttranslatio
nal Protein Modifications: Perspectives and Prospe
cts, pgs. 1-12; Seifter ら, "Analysis for protein
modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzy
mol (1990) 182:626-646; および Rattan ら, "Protein
Synthesis: Posttranslational Modifications andAgi
ng", Ann NY Acid Sci (1992) 663:48-62を参照のこ
と。
【０００９】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合および末端切断（トランケーション）を
生じさせることができる。典型的なポリペプチドの変異
体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。
一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が
全般的によく類似しており、多くの領域で同一となるよ
うな相違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意
に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ
酸配列が相違していてよい。置換または挿入されるアミ
ノ酸残基は遺伝子コードによりコードされるものであっ
ても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドの変異体はアレリック変異体のように天然に存在す
るものでも、天然に存在することが知られていない変異
体であってもよい。天然に存在しないポリヌクレオチド
およびポリペプチドの変異体は、突然変異誘発法または
直接合成により調製することができる。
【００１０】当技術分野で知られた「同一性」とは、ポ
リペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の比較によ
り決定された、２以上のかかる配列間の関係のことであ
る。当技術分野ではまた、「同一性」はポリペプチド配
列またはポリヌクレオチド配列の鎖間の一致（マッチ）
により決定された、このような配列間の配列関係の程度
を意味する。「同一性」および「類似性」は公知の方法
により難なく算出することができ、こうした方法とし
て、例えば Computational Molecular Biology,Lesk,
A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; B
iocomputing: Informatics and Genome Projects, Smit
h, D.W. 編, Academic Press, New York,1993; Compute
r Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.
and Griffin, H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1
994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von H
einje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis
Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. 編, M Stock
ton Press, New York, 1991; および Carillo, H. and
Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)
に記載された方法があるが、これらに限らない。「同
一性」を決定する好適な方法は、検討する配列間で最大
級の一致（マッチ）が得られるように設計される。「同
一性」および「類似性」を決定する方法は一般に利用可
能なコンピュータプログラムに編集されている。「同一
性」および「類似性」を決定する好適なコンピュータプ
ログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ (De
vereux,J.ら, Nucleic Acids Research 12(1):387 (198
4))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ (A
tschul, S.F. ら, J. Molec. Biol. 215:403-410 (199
0)) があるが、これらに限らない。ＢＬＡＳＴ Ｘプロ
グラムはＮＣＢＩおよび他のソース (BLAST Manual, Al
tschul, S.ら, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894;Alts
chul, S. ら, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))か
ら一般に入手可能である。公知の Smith Waterman アル
ゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
【００１１】ポリペプチド配列を比較するための好まし
いパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Bi
ol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：Hentikoff and Hentikoff, Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992) からの
BLOSSUM62 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４ これらのパラメーターと共に有用なプログラムは Genet
ics Computer Group (Madison WI) から「ｇａｐ」プロ
グラムとして入手可能である。前記のパラメーターはポ
リペプチド比較のためのデフォルトパラメーター(defau
lt parameter)である（末端ギャップのペナルティーは
無し）。
【００１２】ポリヌクレオチド配列を比較するための好
ましいパラメーターは次のものを含む： １）アルゴリズム：Needleman and Wunsch, J. Mol. Bi
ol. 48: 443-453 (1970) 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３ これらのパラメーターと共に有用なプログラムは Genet
ics Computer Group (Madison WI) から「ｇａｐ」プロ
グラムとして入手可能である。前記のパラメーターはポ
リヌクレオチド比較のためのデフォルトパラメーターで
ある。
【００１３】好適なポリヌクレオチドの態様としてはさ
らに、配列番号１のポリヌクレオチド基準配列と少なく
とも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７
または１００％同一であるポリヌクレオチドを含んでな
る単離されたポリヌクレオチドがある。この基準配列は
配列番号１の配列と同一であっても、該基準配列に対し
て、ある整数までのヌクレオチド変異を含んでいてもよ
い。前記変異は少なくとも１個のヌクレオチドの欠失、
置換（トランジションおよびトランスバージョンを含
む）または挿入よりなる群から選択され、こうした変異
は基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位置、また
はこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中
のヌクレオチドの中で個々に、または基準配列内に１以
上の連続するグループとして点在することができる。ヌ
クレオチド変異の前記の数は、配列番号１のヌクレオチ
ドの総数にそれぞれの同一性の％数値を掛け、その積を
配列番号１のヌクレオチドの総数から差し引くことによ
り、すなわち、次式：
【００１４】
【式１】ｎn ≦ｘn −（ｘn ×ｙ） 〔式中、ｎn はヌクレオチド変異の数であり、ｘn は配
列番号１のヌクレオチドの総数であり、そしてｙは５０
％については０．５０、６０％については０．６０、７
０％については０．７０、８０％については０．８０、
８５％については０．８５、９０％については０．９
０、９５％については０．９５、９７％については０．
９７、または１００％については１．００であり、ここ
でｘn とｙの非整数積はその積をｘn から差し引く前に
最も近い整数に切り下げる〕により求めることができ
る。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列の変異は、このコード配列中にナンセンス、
ミスセンスまたはフレームシフト変異を生じさせ、かか
る変異後に該ポリヌクレオチド配列によりコードされた
ポリペプチドを改変することができる。
【００１５】好適なポリペプチドの態様としてはさら
に、配列番号２のポリペプチド基準配列と少なくとも５
０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または
１００％同一であるポリペプチドを含んでなる単離され
たポリペプチドがある。この基準配列は配列番号２の配
列と同一であっても、該基準配列に対して、ある整数ま
でのアミノ酸変異を含んでいてもよい。前記変異は少な
くとも１個のアミノ酸の欠失、置換（同類置換および非
同類置換を含む）または挿入よりなる群から選択され、
こうした変異は基準ポリペプチド配列のアミノもしくは
カルボキシ末端位置、またはこれらの末端位置の間のど
こかで起こり、基準配列中のアミノ酸の中で個々に、ま
たは基準配列内に１以上の連続するグループとして点在
することができる。アミノ酸変異の前記の数は、配列番
号２のアミノ酸の総数にそれぞれの同一性の％数値を掛
け、その積を配列番号２のアミノ酸の総数から差し引く
ことにより、すなわち、次式：
【００１６】
【式２】ｎa ≦ｘa −（ｘa ×ｙ） 〔式中、ｎa はアミノ酸変異の数であり、ｘa は配列番
号２のアミノ酸の総数であり、そしてｙは５０％につい
ては０．５０、６０％については０．６０、７０％につ
いては０．７０、８０％については０．８０、８５％に
ついては０．８５、９０％については０．９０、９５％
については０．９５、９７％については０．９７、また
は１００％については１．００であり、ここでｘa とｙ
の非整数積はその積をｘa から差し引く前に最も近い整
数に切り下げる〕により求めることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明はＡＳＰ２ポリペプチド
（またはＡＳＰ２タンパク質）に関する。このＡＳＰ２
ポリペプチドには、配列番号２のポリペプチドだけでな
く、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、そ
の全長において配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも
８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは
少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドも含まれる。さらに、少なくとも９７〜９９％同
一であるものが特に好適である。また、その全長におい
て配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと少
なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好
ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有
するポリペプチドもＡＳＰ２ポリペプチドに含まれる。
さらに、少なくとも９７〜９９％同一であるものが特に
好適である。ＡＳＰ２ポリペプチドはＡＳＰ２の少なく
とも１つの生物学的活性を示すことが好ましい。
【００１８】ＡＳＰ２ポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形であっても、融合タンパク質のような、より大き
いタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加の
アミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなア
ミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ
配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列な
どがある。
【００１９】また、ＡＳＰ２ポリペプチドの断片も本発
明に含まれる。こうした断片は全体的に前記ＡＳＰ２ポ
リペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部
とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。ＡＳＰ２ポリペプチドと同様に、断片は「フリース
タンディング」（それ自体で独立）していても、より大
きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその
大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましく
は一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発
明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見
当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、
６１−８０、８１−１００、および１０１からＡＳＰ２
ポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。これに関
連して、「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端
で数個、５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸
が増えたり減ったりした範囲を含むものである。
【００２０】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、Ａ
ＳＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケー
ション(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、α
ヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシー
ト形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、
β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合
領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造
的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適で
ある。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片であ
る。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、
その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減
少した断片を含めて、ＡＳＰ２活性を媒介するものであ
る。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫
原性がある断片も含まれる。
【００２１】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めたＡＳＰ２の生物学的活性を保持することが
好ましい。中でも、最も好ましい断片は配列番号４のア
ミノ酸配列をもつものである。特定された配列および断
片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は
同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわ
ち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されている
ものである。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Leu
と Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu の
間；Asn とGln の間；塩基性残基 LysとArg の間；また
は芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に、数個、５
〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意の
組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好適
である。
【００２２】本発明のＡＳＰ２ポリペプチドは任意の適
当な方法で製造することができる。このようなポリペプ
チドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組
換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造された
ポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造
されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。
【００２３】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様はＡＳＰ２ポリヌクレオチドに
関する。ＡＳＰ２ポリヌクレオチドには、ＡＳＰ２ポリ
ペプチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレ
オチド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチ
ドが含まれる。さらに特定すると、本発明のＡＳＰ２ポ
リヌクレオチドとしては、配列番号２のＡＳＰ２ポリペ
プチドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１の特
定配列を有するポリヌクレオチドがある。さらに、ＡＳ
Ｐ２ポリヌクレオチドには、配列番号２のＡＳＰ２ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列と全長において
少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列
と全長において少なくとも８０％同一であるヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。これに関連
して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチドが
好適であり、特に少なくとも９５％同一であるものが好
適である。さらに、少なくとも９７％同一であるものが
より好ましく、少なくとも９８〜９９％同一であるもの
がより一層好ましく、少なくとも９９％同一であるもの
が最も好ましい。また、増幅反応に使用できる条件下、
またはプローブやマーカーとして使用できる条件下でハ
イブリダイズするのに十分な、配列番号１中に含まれる
ヌクレオチド配列との同一性を有するヌクレオチド配列
もＡＳＰ２ポリヌクレオチドに含まれる。本発明はま
た、このようなＡＳＰ２ポリヌクレオチドと相補的なポ
リヌクレオチドを提供する。
【００２４】本発明のＡＳＰ２は、ヒトＡＳＰ２をコー
ドするｃＤＮＡの配列決定の結果により示されるよう
に、アスパラギン酸プロテイナーゼファミリーの他のタ
ンパク質と構造的に関連している。配列番号１のｃＤＮ
Ａ配列は配列番号２の５０１個のアミノ酸からなるポリ
ペプチドをコードするオープンリーディングフレーム
（ヌクレオチド番号１−１５０３）を含んでいる。表２
のアミノ酸配列（配列番号２）は新規なアスパラギン酸
プロテイナーゼＡＳＰ１〔1997年10月６日付けの米国特
許出願（出願番号未決定、代理人文書番号 GH70262）〕
と４６０個のアミノ酸残基において約４８．７％同一で
ある（FASTA(GCG)使用）。表１のヌクレオチド配列（配
列番号１）は新規なアスパラギン酸プロテイナーゼＡＳ
Ｐ１〔1997年10月６日付けの米国特許出願（出願番号未
決定、代理人文書番号 GH70262）〕と１５１６個のヌク
レオチド残基において約５９．２％同一である。したが
って、本発明のＡＳＰ２ポリペプチドおよびポリヌクレ
オチドは、とりわけ、それらの相同ポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性をもつこ
とが予測され、それらの有用性は当業者には自明であ
る。
【００２５】ヒトＡＳＰ２のヌクレオチド配列（配列番
号１）
【表１】
【００２６】ヒトＡＳＰ２のアミノ酸配列（配列番号
２）
【表２】
【００２７】ＡＳＰ２をコードする本発明の一つのポリ
ヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリー
ニングにより、ヒト膵臓および脳の細胞中のｍＲＮＡか
ら誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、発現配列タグ
（expressed sequence tag:EST)分析を用いて得ること
ができる (Adams, M.D. ら, Science (1991) 252:1651-
1656; Adams, M.D. ら, Nature (1992) 355:632-634; A
dams, M.D.ら, Nature(1995) 377 Supp:3-174) 。ま
た、本発明のポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡライブラ
リーのような天然源から得ることができ、商業的に入手
可能な公知の技法を用いて合成することもできる。
【００２８】配列番号２のＡＳＰ２ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリペプ
チドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号１−１
５０３）と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮
重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコード
する配列であってもよい。
【００２９】本発明のポリヌクレオチドをＡＳＰ２ポリ
ペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌ
クレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列または
その断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもし
くは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タン
パク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする
もの）と同じリーディングフレームにある成熟ポリペプ
チドのコード配列またはその断片が含まれる。例えば、
融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコ
ードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例とし
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)に
より提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ−ヒス
チジンペプチド、またはＨＡタグである。また、このポ
リヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例えば、転
写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポ
リアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍ
ＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。
【００３０】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、表２のＡＳＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配
列番号２）を含むＡＳＰ２変異型をコードするポリヌク
レオチドである。とりわけ、本発明の好適なポリヌクレ
オチドは表４のアミノ酸配列をコードする表３のポリヌ
クレオチド（配列番号３）中に含まれるものである。
【００３１】ヒトＡＳＰ２の部分ヌクレオチド配列（配
列番号３）
【表３】
【００３２】ヒトＡＳＰ２の部分アミノ酸配列（配列番
号４）
【表４】
【００３３】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。
【００３４】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片（配列番号３のヌクレオチド配列を含
む）と同一であるか実質的に同一である本発明のポリヌ
クレオチドは、ＡＳＰ２ポリペプチドをコードする全長
ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、ま
た、ＡＳＰ２遺伝子との配列類似性が高い他の遺伝子
（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体(o
rtholog)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡおよび
ゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノ
ムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして用い
ることができる。このようなハイブリダイゼーション技
法は当業者には公知である。一般的に、これらのヌクレ
オチド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０％、好ま
しくは９０％、より好ましくは９５％同一である。プロ
ーブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含み、好ま
しくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレオチドを
有していてもよい。特に好ましいプローブは３０〜５０
個の範囲のヌクレオチドを有するものである。
【００３５】一実施態様において、ＡＳＰ２ポリペプチ
ド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体
を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、
配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片（配列番
号３のヌクレオチド配列を含む）を有する標識プローブ
を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、前記
のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノ
ムクローンを単離する各工程を含んでなる。このような
ハイブリダイゼーション技法は当業者には公知である。
かくして、もう一つの態様では、本発明のＡＳＰ２ポリ
ヌクレオチドはさらに、配列番号１のヌクレオチド配列
またはその断片（配列番号３のヌクレオチド配列を含
む）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする
ヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド配列を含む
ものである。ＡＳＰ２ポリペプチドも、前記のハイブリ
ダイゼーション条件により得られたヌクレオチド配列に
よりコードされるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチ
ドを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件は上で定義したとおりであるか、または、50% ホル
ムアミド、５×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナト
リウム) 、50mMリン酸ナトリウム (pH7.6)、５×Denhar
dt溶液、10% デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し
剪断したサケ精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で一
夜インキュベートし、次いでフィルターを 0.1×SSC 中
約６５℃で洗浄する条件である。本発明のポリヌクレオ
チドおよびポリペプチドは、動物およびヒトの疾病に対
する治療薬および診断薬を探索するための研究用の試薬
および材料として利用することができる。
【００３６】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。
【００３７】組換え生産に関しては、本発明のポリヌク
レオチドの発現系またはその一部を組み入れるために、
宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌクレ
オチドの導入は、Davis ら, BASIC METHODS IN MOLECUL
AR BIOLOGY (1986) および Sambrook ら, MOLECULAR CL
ONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold SpringHa
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1
989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載さ
れる方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、トランスベクション(transvection)、マイクロイン
ジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクショ
ン、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープロ
ーディング(scrape loading)、射出導入(ballistic int
roduction)または感染により行うことができる。
【００３８】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。
【００３９】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。
【００４０】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。
【００４１】スクリーニングアッセイで使用するためＡ
ＳＰ２ポリペプチドを発現させようとする場合、そのポ
リペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先
立って細胞を回収する。ＡＳＰ２ポリペプチドが培地に
分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、そ
の細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する
必要がある。
【００４２】組換え細胞培養物からＡＳＰ２ポリペプチ
ドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタ
ノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロ
マトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め
た公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、
高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリ
ペプチドが単離および／または精製中に変性されるとき
は、タンパク質を再生させるための公知の技法を用い
て、活性のあるコンフォメーションを復元することが可
能である。
【００４３】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのＡＳＰ２ポリヌクレオチ
ドの使用に関する。機能障害と関連したＡＳＰ２遺伝子
の変異型の検出は、ＡＳＰ２の過少発現、過剰発現また
は変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診
断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツー
ルを提供するだろう。ＡＳＰ２遺伝子に変異がある個体
を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すこ
とができる。
【００４４】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様のやり方でＲＮＡまたはｃＤＮＡ
を使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常
な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化に
より検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識ＡＳＰ
２ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定
できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖と
はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により
区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用い
たまたは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動
度の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても
検出できる（例えば、Myers ら, Science (1985) 230:1
242 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレア
ーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよ
びＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても
確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1
985) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様で
は、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを
行うため、ＡＳＰ２ヌクレオチド配列またはその断片を
含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築するこ
とができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性
を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を
含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために
用いられている（例えば、M. Chee ら, Science, Vol.2
74, pp.610-613 (1996) を参照のこと）。
【００４５】診断アッセイは、前記の方法によりＡＳＰ
２遺伝子の変異を検出することで、アルツハイマー病、
癌およびプロホルモンプロセシングへの感受性を診断ま
たは判定する方法を提供する。
【００４６】さらに、被験者から得られたサンプルから
ＡＳＰ２ポリペプチドまたはＡＳＰ２ｍＲＮＡのレベル
の異常な低下または増加を測定する方法により、アルツ
ハイマー病、癌およびプロホルモンプロセシングの診断
を下すことができる。発現の低下または増加は、当技術
分野で公知のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例え
ばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、
ノーザンブロット、その他のハイブリダイゼーション法
によりＲＮＡレベルで測定することができる。宿主から
得られたサンプル中のＡＳＰ２ポリペプチドのようなタ
ンパク質のレベルを測定するためのアッセイ法は当業者
によく知られている。こうしたアッセイ法として、ラジ
オイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロ
ット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。
【００４７】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、疾病（特にアルツハイマー病、癌およびプロホル
モンプロセシング）または疾病への感受性を診断するた
めのキットに関し、このキットは、(a) ＡＳＰ２ポリヌ
クレオチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配
列）またはその断片、(b) (a) のポリヌクレオチドに相
補的なヌクレオチド配列、(c) ＡＳＰ２ポリペプチド
（好ましくは、配列番号２のポリペプチド）またはその
断片、または(d) ＡＳＰ２ポリペプチド（好ましくは、
配列番号２のポリペプチド）に対する抗体、を含んでな
る。このようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) また
は (d)が実質的な構成成分であることが理解されよう。
【００４８】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。患者と正常個
体とのｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異も調べることが
できる。患者の一部または全部に変異が観察されて、ど
の正常個体にも観察されない場合は、その変異が疾病の
原因である可能性がある。ＡＳＰ２の染色体位置はGenb
ank Locus G24698 (ヒトSTS WI-14206) との相同性（２
１０個のヌクレオチドにおいて９９％）により１１ｑ２
２であると推測された。
【００４９】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、ＡＳＰ２ポリペプチド
に免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使
用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が
従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親
和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い
親和性を有することを意味する。
【００５０】ＡＳＰ２ポリペプチドに対する抗体は、慣
用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以
外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノ
クローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により
産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることがで
きる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Kohler, G.
およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、ト
リオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法 (Kozbor
ら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技法(Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 198
5) などがある。
【００５１】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。ＡＳＰ２ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、
アルツハイマー病、癌およびプロホルモンプロセシング
の治療に使用できる可能性がある。
【００５２】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特にアルツハイマー
病、癌およびプロホルモンプロセシングから前記動物を
防御するための抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生
ずるのに十分なＡＳＰ２ポリペプチドまたはその断片を
哺乳動物に接種することを含んでなる。本発明のさらに
別の態様は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生さ
せるような免疫学的応答を引き出すために、in vivo で
ＡＳＰ２ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを
介してＡＳＰ２ポリペプチドを供給することを含んでな
る、哺乳動物において免疫学的応答を引き出す方法に関
する。
【００５３】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてＡＳＰ２ポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン
製剤（組成物）に関し、この組成物はＡＳＰ２ポリペプ
チドまたはＡＳＰ２遺伝子を含有する。ワクチン製剤は
適当な担体をさらに含んでいてもよい。ＡＳＰ２ポリペ
プチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、
筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含む）に投与するこ
とが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液
と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注
射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含んでいてもよい
水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は
１回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルお
よびバイアル）で提供することができ、また、使用直前
に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫
原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油型
のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバン
ト系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で
変化し、ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。
【００５４】スクリーニングアッセイ 本発明のＡＳＰ２ポリペプチドは、このポリペプチドを
活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害
する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）
のスクリーニング法において使用することができる。こ
うして、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細
胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合
物からアゴニストまたはアンタゴニストを評価し同定す
るためにも用いられる。これらのアゴニストまたはアン
タゴニストは、本発明のポリペプチドの、場合によっ
て、天然のまたは修飾された基質、リガンド、受容体、
酵素などであってよく、また、本発明のポリペプチドの
構造的または機能的な模擬物であってもよい（Coligan
ら, Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter
5 (1991)を参照のこと）。
【００５５】ＡＳＰ２ポリペプチドは多くの病理を含め
て多数の生物学的機能に関与している。したがって、一
方ではＡＳＰ２ポリペプチドを刺激し、他方ではＡＳＰ
２ポリペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を
見つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストはア
ルツハイマー病、癌、プロホルモンプロセシングのよう
な症状の治療および予防目的で用いられる。アンタゴニ
ストはアルツハイマー病、癌、プロホルモンプロセシン
グのような症状のさまざまな治療および予防目的で使用
しうる。
【００５６】一般に、こうしたスクリーニング法はＡＳ
Ｐ２ポリペプチドを発現する適当な細胞、またはＡＳＰ
２ポリペプチドに応答する適当な細胞を用いるものであ
る。この種の細胞には哺乳動物、酵母、ショウジョウバ
エ由来の細胞または大腸菌細胞が含まれる。次いで、Ａ
ＳＰ２ポリペプチドを発現する細胞（もしくは発現され
たポリペプチドを含む細胞膜）またはＡＳＰ２ポリペプ
チドに応答する細胞を試験化合物と接触させて、その結
合または機能的応答の刺激もしくは阻害を観察する。候
補化合物と接触させた細胞の能力を、接触させなかった
同一細胞とＡＳＰ２活性に関して比較する。さらに、ア
スパラギン酸プロテイナーゼはペプスタチンにより阻害
される。したがって、ペプスタチン阻害アッセイを検出
法またはスクリーニングアッセイとして本発明と共に使
用することもできる。
【００５７】これらのアッセイでは候補化合物の結合を
簡単に試験することができ、そこでは候補化合物と直接
または間接に結合された標識により、または標識した競
合物質との競合を用いるアッセイにより、ＡＳＰ２ポリ
ペプチドを担持する細胞への付着が検出される。さら
に、これらのアッセイでは、ＡＳＰ２ポリペプチドを担
持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物がＡＳ
Ｐ２ポリペプチドの活性化により生ずるシグナルを結果
的にもたらすか否かを試験することができる。一般的
に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下でアッ
セイされ、そしてアゴニストによる活性化に対する候補
化合物の存在による影響が調べられる。さらに、これら
のアッセイは、候補化合物とＡＳＰ２ポリペプチドを含
む溶液とを混ぜ合わせて混合物をつくり、この混合物中
のＡＳＰ２活性を測定し、そしてこの混合物のＡＳＰ２
活性を標準と比較する各ステップを単に含むだけでよ
い。
【００５８】また、ＡＳＰ２のｃＤＮＡ、タンパク質ま
たはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内での
ＡＳＰ２ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加
化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てるこ
とができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によ
りモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、
ＡＳＰ２タンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベル
を測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、こ
れは適切に操作された細胞または組織からのＡＳＰ２の
生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニス
トまたはアゴニストともいう）の探索に用いることがで
きる。
【００５９】膜結合受容体または可溶性受容体が存在す
るのであれば、当技術分野で公知の標準的な受容体結合
法によりこの種の受容体を同定するためにＡＳＰ２タン
パク質を用いることができる。こうした受容体結合法に
は、限定するものではないが、リガンド結合および架橋
アッセイがあり、このアッセイでは、ＡＳＰ２を放射性
アイソトープ（例：125I）で標識するか、化学的に修飾
（例：ビオチン化）するか、または検出や精製に適した
ペプチド配列に融合させ、そして推定上の受容体源（細
胞、細胞膜、細胞上清、組織抽出物、体液など）とイン
キュベートする。その他の方法としては、表面プラズモ
ン共鳴および分光学のような生物物理的方法がある。受
容体の精製およびクローニングに用いることに加えて、
これらの結合アッセイは、もし存在するのであれば、Ａ
ＳＰ２のその受容体への結合と競合するＡＳＰ２のアゴ
ニストまたはアンタゴニストを同定するために用いるこ
ともできる。スクリーニングアッセイを行うための標準
的な方法は当技術分野でよく理解されている。
【００６０】ＡＳＰ２ポリペプチドの潜在的なアンタゴ
ニストの例としては、抗体、ある場合には、ＡＳＰ２ポ
リペプチドの、場合により、リガンド、基質、受容体、
酵素などと密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしく
はタンパク質（例えば、リガンド、基質、受容体、酵素
などの断片）、または本発明のポリペプチドと結合する
が応答を誘導しない（それゆえポリペプチドの活性を妨
げる）小分子などがある。
【００６１】かくして、他の態様において、本発明は、
ＡＳＰ２ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、
リガンド、受容体、基質、酵素など、またはＡＳＰ２ポ
リペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定
するためのスクリーニングキットに関し、このキット
は、(a) ＡＳＰ２ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）(b) ＡＳＰ２ポリペプチド（好まし
くは、配列番号２のポリペプチド）を発現する組換え細
胞、(c) ＡＳＰ２ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）を発現している細胞膜、または(d)
ＡＳＰ２ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリ
ペプチド）に対する抗体、を含んでなる。このようなキ
ットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な
構成成分であることが理解されよう。
【００６２】予防および治療法 本発明は、ＡＳＰ２ポリペプチド活性の過剰量と不足量
のどちらにも関係したアルツハイマー病、癌、プロホル
モンプロセシングなどの異常な状態の治療法を提供す
る。ＡＳＰ２ポリペプチドの活性が過剰である場合は、
いくつかのアプローチが利用可能である。一つのアプロ
ーチは、例えば、リガンド、基質、受容体、酵素などの
結合をブロックすることにより、または第２のシグナル
を抑制することで異常な状態を軽減することにより、Ａ
ＳＰ２ポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で、
前記の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製剤学上許容
される担体とともに患者に投与することを含んでなる。
もう一つのアプローチでは、リガンド、基質、酵素、受
容体などと結合する能力がまだある可溶性形態のＡＳＰ
２ポリペプチドを、内因性のＡＳＰ２ポリペプチドとの
競合状態で投与する。このような競合剤の典型的な例は
ＡＳＰ２ポリペプチドの断片である。
【００６３】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性ＡＳＰ２ポリペプチドをコードする遺伝子
の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、
体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列
の使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCPre
ss, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J Neurochem
(1991) 56:560 を参照のこと。あるいはまた、この遺
伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを
供給することもできる。例えば、Lee ら, Nucleic Acid
s Res (1979) 6:3073; Cooney ら, Science (1988) 24
1:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参照の
こと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することも
できるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させること
もできる。
【００６４】ＡＳＰ２およびその活性の過少発現に関係
した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプロー
チを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有
効な量のＡＳＰ２ポリペプチドを活性化する化合物（す
なわち、前記のアゴニスト）を製剤学上許容される担体
とともに患者に投与して、異常な状態を緩和することを
含んでなる。別法として、患者の関連細胞においてＡＳ
Ｐ２を内因的に産生させるために遺伝子治療を用いるこ
とができる。例えば、上で述べたような複製欠損レトロ
ウイルスベクターによる発現のために本発明のポリヌク
レオチドを遺伝子操作する。次にレトロウイルス発現構
築物を単離し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮ
Ａを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質
導入されたパッケージング細胞に導入する。その結果、
パッケージング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性の
ウイルス粒子を産生するようになる。in vivo での細胞
処理およびin vivo でのポリペプチド発現のために、こ
れらの産生細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に
関しては、Human Molecular Genetics, T Strachanand
A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 中
のChapter 20, GeneTherapy and other Molecular Gene
tic-based Therapeutic Approaches(およびその中の引
用文献) を参照のこと。もう一つのアプローチは治療量
のＡＳＰ２ポリペプチドを適当な製剤学上の担体ととも
に投与することである。
【００６５】製剤および投与 可溶性形態のＡＳＰ２ポリペプチドのようなペプチド、
アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小型
の分子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化す
ることができる。このような製剤は治療上有効な量のポ
リペプチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体ま
たは賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩
水、生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、
エタノール、およびこれらの組合せがあるが、これらに
限らない。製剤は投与様式に適合させるべきであり、こ
れは当技術分野の技量の範囲内である。本発明はさら
に、前記の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以
上の容器を含んでなる医薬用パックおよびキットに関す
る。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使
用しても、他の化合物例えば治療用化合物と一緒に使用
してもよい。
【００６６】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、筋
肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用できる。
全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、その他
の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経皮投
与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として適切
に製剤化されているのであれば、経口投与も可能であ
る。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤形
で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。
【００６７】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。
【００６８】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。
【００６９】
【実施例】以下の実施例は、特に詳細に記載したところ
を除いて、当業者には公知のルーチンな標準的手法を用
いて実施した。これらの実施例は本発明を例示するもの
であって、制限するものではない。
【００７０】クローニング：ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅
をもたらすポリメラーゼ連鎖反応技術（ＲＡＣＥＰＣ
Ｒ）をアスパラギン酸プロテアーゼ２遺伝子の５'側の
欠失しているｃＤＮＡ配列を同定するために用いた。増
幅反応に用いるｃＤＮＡ鋳型は、ある範囲のMarathon-R
eadyｃＤＮＡ調製物 (Clontech Laboratories,Inc.,102
0 East Meadow Circle,Palo Alto,CA 9430 3-4230,USA)
から供給された。これらのMarathon-ReadyｃＤＮＡ
は、本質的に、オリゴヌクレオチドアダプターが連結さ
れているｃＤＮＡライブラリーである。これにより研究
者は２つのプライマー（一方は目的の遺伝子中の既知配
列の領域に相補的であり、他方は連結されたアダプター
に相補的である）を使用して５'ＲＡＣＥ ＰＣＲを行
なうことができ、結果として５'末端の既知配列を伸長
させることができる。AmpliTaq（登録商標）Gold ＤＮ
Ａポリメラーゼ(Perkin-Elmer 社)を使用してＰＣＲを
行なった。うまく増幅を行なうには反応緩衝液中に５％
のジメチルスルホキシドを加える必要があることがわか
った。これは、おそらくＤＮＡのこの領域がＧＣヌクレ
オチドを多く含有するためだろう。このＤＮＡ配列をク
ローン化したところ、ＤＮＡの一領域（表１中のヌクレ
オチド１−２７３）が、開始コドンから伸長して以前同
定したＥＳＴ配列と重なるとして、ＡＳＰ２遺伝子の
５'末端で確認された。７のヒト組織（心臓、白血球、
乳腺、脾臓、骨格筋、胸腺、大動脈）由来のｃＤＮＡ鋳
型においてこの新規な配列を同定した。
【００７１】ノーザン分析：ヒト多組織ノーザンブロッ
ト（ＭＴＮカタログ番号7760-1）（Clontech）を、特異
的オリゴヌクレオチド 5' GATGAGTTCAGGACGGCAG 3'（配
列番号５）および 5' GGTGCCATATGTGTCTCC 3'(配列番号
６)を用いてＰＣＲにより生産されたＡＳＰ２特異的プ
ローブ（長さ３２５ヌクレオチド）とハイブリダイズさ
せた。このプローブはＰＣＲ増幅中に32Ｐ−ｄＣＴＰの
取り込みにより放射性標識し、次いでこの標識ＰＣＲ産
物をQiagenＰＣＲ精製キットを用いて精製したものであ
った。１時間のプレハイブリダイゼーションの後、Expr
essHyb緩衝液(Clontech)を用いて６８℃で２時間ハイブ
リダイゼーションを行い、標識プローブを最終濃度１×
106cpm／mlまで加えた。ハイブリダイゼーションの後、
膜を20分間ずつ、２×SSC／0.05％ SDSで２回洗い、さ
らに50℃で20分間ずつ、0.１×SSC／0.１％ SDSで２回
洗った。次に膜をプラスチック製のラップで覆い、２枚
の増感紙を用いて−70℃でＸ線フィルムに露出した。こ
れによりＡＳＰ２の発現が最も高かったのは膵臓、次に
脳であることがわかった（試験した組織は心臓、脳、胎
盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓であった）。
【００７２】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。
【００７３】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：２５４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ATGGCCCAAG CCCTGCCCTG GCTCCTGCTG TGGATGGGCG CGGGAGTGCT GCCTGCCCAC 60 GGCACCCAGC ACGGCATCCG GCTGCCCCTG CGCAGCGGCC TGGGGGGCGC CCCCCTGGGG 120 CTGCGGCTGC CCCGGGAGAC CGACGAAGAG CCCGAGGAGC CCGGCCGGAG GGGCAGCTTT 180 GTGGAGATGG TGGACAACCT GAGGGGCAAG TCGGGGCAGG GCTACTACGT GGAGATGACC 240 GTGGGCAGCC CCCCGCAGAC GCTCAACATC CTGGTGGATA CAGGCAGCAG TAACTTTGCA 300 GTGGGTGCTG CCCCCCACCC CTTCCTGCAT CGCTACTACC AGAGGCAGCT GTCCAGCACA 360 TACCGGGACC TCCGGAAGGG TGTGTATGAG CCCTACACCC AGGGCAAGTG GGAAGGGGAG 420 CTGGGCACCG ACCTGGTAAG CATCCCCCAT GGCCCCAACG TCACTGTGCG TGCCAACATT 480 GCTGCCATCA CTGAATCAGA CAAGTTCTTC ATCAACGGCT CCAACTGGGA AGGCATCCTG 540 GGGCTGGCCT ATGCTGAGAT TGCCAGGCCT GACGACTCCC TGGAGCCTTT CTTTGACTCT 600 CTGGTAAAGC AGACCCACGT TCCCAACCTC TTCTCCCTGC AGCTTTGTGG TGCTGGCTTC 660 CCCCTCAACC AGTCTGAAGT GCTGGCCTCT GTCGGAGGGA GCATGATCAT TGGAGGTATC 720 GACCACTCGC TGTACACAGG CAGTCTCTGG TATACACCCA TCCGGCGGGA GTGGTATTAT 780 GAGGTGATCA TTGTGCGGGT GGAGATCAAT GGACAGGATC TGAAAATGGA CTGCAAGGAG 840 TACAACTATG ACAAGAGCAT TGTGGACAGT GGCACCACCA ACCTTCGTTT GCCCAAGAAA 900 GTGTTTGAAG CTGCAGTCAA ATCCATCAAG GCAGCCTCCT CCACGGAGAA GTTCCCTGAT 960 GGTTTCTGGC TAGGAGAGCA GCTGGTGTGC TGGCAAGCAG GCACCACCCC TTGGAACATT 1020 TTCCCAGTCA TCTCACTCTA CCTAATGGGT GAGGTTACCA ACCAGTCCTT CCGCATCACC 1080 ATCCTTCCGC AGCAATACCT GCGGCCAGTG GAAGATGTGG CCACGTCCCA AGACGACTGT 1140 TACAAGTTTG CCATCTCACA GTCATCCACG GGCACTGTTA TGGGAGCTGT TATCATGGAG 1200 GGCTTCTACG TTGTCTTTGA TCGGGCCCGA AAACGAATTG GCTTTGCTGT CAGCGCTTGC 1260 CATGTGCACG ATGAGTTCAG GACGGCAGCG GTGGAAGGCC CTTTTGTCAC CTTGGACATG 1320 GAAGACTGTG GCTACAACAT TCCACAGACA GATGAGTCAA CCCTCATGAC CATAGCCTAT 1380 GTCATGGCTG CCATCTGCGC CCTCTTCATG CTGCCACTCT GCCTCATGGT GTGTCAGTGG 1440 CGCTGCCTCC GCTGCCTGCG CCAGCAGCAT GATGACTTTG CTGATGACAT CTCCCTGCTG 1500 AAGTGAGGAG GCCCATGGGA GAAAGATAGA GATTCCCCTG GGACCACACC TCCGTGGTTC 1560 ACTTTGGTCA CAAGTAGGAG ACACAGATGG CACCTGTGGC CAGAGCACCT CAGGACCCTC 1620 CCCACCCACC AAATGCCTCT GCCTTGATGG AGAAGGAAAA GGCTGGCAAG GTGGGTTCCA 1680 GGGACTGTAC CTGTAGGAAA CAGAAAAGAG AAGAAAGAAG CACTCTGCTG GCGGGAATAC 1740 TCTTGGTCAC CTCAAATTTA AGTCGGGAAA TTCTGCTGCT TGAAACTTCA GCCCTGAACC 1800 TTTGTCCACC ATTCCTTTAA ATTCTCCAAC CCAAAGTATT CTTCTTTTCT TAGTTTCAGA 1860 AGTACTGGCA TCACACGCAG GTTACCTTGG CGTGTGTCCC TGTGGTACCC GGGCAGAGAA 1920 GAGACCAAGC TTGTTTCCCT GCTGGCCAAA GTCAGTAGGA GAGGATGCAC AGTTTGCTAT 1980 TTGCTTTAGA GACAGGGACT GTATAAACAA GCCTAACATT GGTGCAAAGA TTGCCTCTTG 2040 AATTAAAAAA AAAAACTAGA TTGACTATTT ATACAAATGG GGGCGGCTGG AAAGAGGAGA 2100 AGGAGAGGGA GTACAAAGAC AGGGAATAGT GGGATCAAAG CTAGGAAAGG CAGAAACACA 2160 ACCACTCACC AGTCCTAGTT TTAGACCTCA TCTCCAAGAT AGCATCCCAT CTCAGAAGAT 2220 GGGTGTTGTT TTCAATGTTT TCTTTTCTGT GGTTGCAGCC TGACCAAAAG TGAGATGGGA 2280 AGGGCTTATC TAGCCAAAGA GCTCTTTTTT AGCTCTCTTA AATGAAGTGC CCACTAAGGA 2340 AGTTCCACTT GAACACATGG AATTTCTGCC ATATTAATTT CCATTGTCTC TATCTGGAAC 2400 CACCCTTTAA TCTCTACATA TGATTAGGTC CAGCACTTGA AAATATTCCT AACCNNAATT 2460 TGNCTTGGGG GCTTTGCNGN CCAGGTGCTA AAAGGGNTTG GGTAGGNGNC CNCTTNTATN 2520 TNATNCCTNA AAAGGTTANN G 2541
【００７４】配列番号：２ 配列の長さ：５０１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45 Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60 Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80 Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95 Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 100 105 110 Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val 115 120 125 Tyr Glu Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp 130 135 140 Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 145 150 155 160 Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175 Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp 180 185 190 Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro 195 200 205 Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln 210 215 220 Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile 225 230 235 240 Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg 245 250 255 Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln 260 265 270 Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val 275 280 285 Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala 290 295 300 Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp 305 310 315 320 Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr 325 330 335 Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val 340 345 350 Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg 355 360 365 Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380 Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala 405 410 415 Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu 420 425 430 Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro 435 440 445 Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala 450 455 460 Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp 465 470 475 480 Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp 485 490 495 Ile Ser Leu Leu Lys 500
【００７５】配列番号：３ 配列の長さ：２３７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGCAGCTTTG TGGAGATGGT GGACAACCTG AGGGGCAAGT CGGGGCAGGG CTACTACGTG 60 GAGATGACCG TGGGCAGCCC CCCGCAGACG CTCAACATCC TGGTGGATAC AGGCAGCAGT 120 AACTTTGCAG TGGGTGCTGC CCCCCACCCC TTCCTGCATC GCTACTACCA GAGGCAGCTG 180 TCCAGCACAT ACCGGGACCT CCGGAAGGGT GTGTATGAGC CCTACACCCA GGGCAAGTGG 240 GAAGGGGAGC TGGGCACCGA CCTGGTAAGC ATCCCCCATG GCCCCAACGT CACTGTGCGT 300 GCCAACATTG CTGCCATCAC TGAATCAGAC AAGTTCTTCA TCAACGGCTC CAACTGGGAA 360 GGCATCCTGG GGCTGGCCTA TGCTGAGATT GCCAGGCCTG ACGACTCCCT GGAGCCTTTC 420 TTTGACTCTC TGGTAAAGCA GACCCACGTT CCCAACCTCT TCTCCCTGCA GCTTTGTGGT 480 GCTGGCTTCC CCCTCAACCA GTCTGAAGTG CTGGCCTCTG TCGGAGGGAG CATGATCATT 540 GGAGGTATCG ACCACTCGCT GTACACAGGC AGTCTCTGGT ATACACCCAT CCGGCGGGAG 600 TGGTATTATG AGGTGATCAT TGTGCGGGTG GAGATCAATG GACAGGATCT GAAAATGGAC 660 TGCAAGGAGT ACAACTATGA CAAGAGCATT GTGGACAGTG GCACCACCAA CCTTCGTTTG 720 CCCAAGAAAG TGTTTGAAGC TGCAGTCAAA TCCATCAAGG CAGCCTCTCC ACGGGAGAAG 780 TTCCCTGATG GTTTCTGGCT AGGAGAGCAG CTGGTGTGCT GGCAAGCAGG CACCACCCCT 840 TGGAACATTT TCCCAGTCAT CTCACTCTAC CTAATGGGTG AGGTTACCAA CCAGTCCTTC 900 CGCATCACCA TCCTTCCGCA GCAATACCTG CGGCCAGTGG AAGATGTGGC CACGTCCCAA 960 GACGACTGTT ACAAGTTTGC CATCTCACAG TCATCCACGG GCACTGTTAT GGGAGCTGTT 1020 ATCATGGAGG GCTTCTACGT TGTCTTTGAT CGGGCCCGAA AACGAATTGG CTTTGCTGTC 1080 AGCGCTTGCC ATGTGCACGA TGAGTTCAGG ACGGCAGCGG TGGAAGGCCC TTTTGTCACC 1140 TTGGACATGG AAGACTGTGG CTACAACATT CCACAGACAG ATGAGTCAAC CCTCATGACC 1200 ATAGCCTATG TCATGGCTGC CATCTGCGCC CTCTTCATGC TGCCACTCTG CCTCATGGTG 1260 TGTCAGTGGC GCTGCCTCCG CTGCCTGCGC CAGACAATGG ATGACTTTGC TGATGACATC 1320 TCCCTGCTGA AGTGAGGAGG CCCATGGGAG AAAGATAGAG ATTCCCCTGG GACCACACCT 1380 CCGTGGTTCA CTTTGGTCAC AAGTAGGAGA CACAGATGGC ACCTGTGGCC AGAGCACCTC 1440 AGGACCCTCC CCACCCACCA AATGCCTCTG CCTTGATGGA GAAGGAAAAG GCTGGCAAGG 1500 TGGGTTCCAG GGACTGTACC TGTAGGAAAC AGAAAAGAGA AGAAAGAAGC ACTCTGCTGG 1560 CGGGAATACT CTTGGTCACC TCAAATTTAA GTCGGGAAAT TCTGCTGCTT GAAACTTCAG 1620 CCCTGAACCT TTGTCCACCA TTCCTTTAAA TTCTCCAACC CAAAGTATTC TTCTTTTCTT 1680 AGTTTCAGAA GTACTGGCAT CACACGCAGG TTACCTTGGC GTGTGTCCCT GTGGTACCCG 1740 GGCAGAGAAG AGACCAAGCT TGTTTCCCTG CTGGCCAAAG TCAGTAGGAG AGGATGCACA 1800 GTTTGCTATT TGCTTTAGAG ACAGGGACTG TATAAACAAG CCTAACATTG GTGCAAAGAT 1860 TGCCTCTTGA ATTAAAAAAA AAAACTAGAT TGACTATTTA TACAAATGGG GGCGGCTGGA 1920 AAGAGGAGAA GGAGAGGGAG TACAAAGACA GGGAATAGTG GGATCAAAGC TAGGAAAGGC 1980 AGAAACACAA CCACTCACCA GTCCTAGTTT TAGACCTCAT CTCCAAGATA GCATCCCATC 2040 TCAGAAGATG GGTGTTGTTT TCAATGTTTT CTTTTCTGTG GTTGCAGCCT GACCAAAAGT 2100 GAGATGGGAA GGGCTTATCT AGCCAAAGAG CTCTTTTTTA GCTCTCTTAA ATGAAGTGCC 2160 CACTAAGGAA GTTCCACTTG AACACATGGA ATTTCTGCCA TATTAATTTC CATTGTCTCT 2220 ATCTGGAACC ACCCTTTAAT CTCTACATAT GATTAGGTCC AGCACTTGAA AATATTCCTA 2280 ACCNNAATTT GNCTTGGGGG CTTTGCNGNC CAGGTGCTAA AAGGGNTTGG GTAGGNGNCC 2340 NCTTNTATNT NATNCCTNAA AAGGTTANNG 2370
【００７６】配列番号：４ 配列の長さ：７７４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Ser Phe Val Glu Met Val Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln 1 5 10 15 Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn 20 25 30 Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro 35 40 45 His Pro Phe Leu His Arg Tyr Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr 50 55 60 Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val Tyr Glu Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp 65 70 75 80 Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn 85 90 95 Val Thr Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe 100 105 110 Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala 115 120 125 Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu 130 135 140 Val Lys Gln Thr His Val Pro Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly 145 150 155 160 Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly 165 170 175 Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu 180 185 190 Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val 195 200 205 Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr 210 215 220 Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu 225 230 235 240 Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser 245 250 255 Pro Arg Glu Lys Phe Pro Asp Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val 260 265 270 Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser 275 280 285 Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile 290 295 300 Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln 305 310 315 320 Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val 325 330 335 Met Gly Ala Val Ile Met Glu Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala 340 345 350 Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu 355 360 365 Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu 370 375 380 Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr 385 390 395 400 Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu 405 410 415 Cys Leu Met Val Cys Gln Trp Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Thr 420 425 430 Met Asp Asp Phe Ala Asp Asp Ile Ser Leu Leu Lys Gly Gly Pro Trp 435 440 445 Glu Lys Asp Arg Asp Ser Pro Gly Thr Thr Pro Pro Trp Phe Thr Leu 450 455 460 Val Thr Ser Arg Arg His Arg Trp His Leu Trp Pro Glu His Leu Arg 465 470 475 480 Thr Leu Pro Thr His Gln Met Pro Leu Pro Trp Arg Arg Lys Arg Leu 485 490 495 Ala Arg Trp Val Pro Gly Thr Val Pro Val Gly Asn Arg Lys Glu Lys 500 505 510 Lys Glu Ala Leu Cys Trp Arg Glu Tyr Ser Trp Ser Pro Gln Ile Val 515 520 525 Gly Lys Phe Cys Cys Leu Lys Leu Gln Pro Thr Phe Val His His Ser 530 535 540 Phe Lys Phe Ser Asn Pro Lys Tyr Ser Ser Phe Leu Ser Phe Arg Ser 545 550 555 560 Thr Gly Ile Thr Arg Arg Leu Pro Trp Arg Val Ser Leu Trp Tyr Pro 565 570 575 Gly Arg Glu Glu Thr Lys Leu Val Ser Leu Leu Ala Lys Val Ser Arg 580 585 590 Arg Gly Cys Thr Val Cys Tyr Leu Leu Arg Gln Gly Leu Tyr Lys Gln 595 600 605 Ala His Trp Cys Lys Asp Cys Leu Leu Asn Lys Lys Lys Leu Asp Leu 610 615 620 Phe Ile Gln Met Gly Ala Ala Gly Lys Arg Arg Arg Arg Gly Ser Thr 625 630 635 640 Lys Thr Gly Asn Ser Gly Ile Lys Ala Arg Lys Gly Arg Asn Thr Thr 645 650 655 Thr His Gln Ser Phe Thr Ser Ser Pro Arg His Pro Ile Ser Glu Asp 660 665 670 Gly Cys Cys Phe Gln Cys Phe Leu Phe Cys Gly Cys Ser Leu Thr Lys 675 680 685 Ser Glu Met Gly Arg Ala Tyr Leu Ala Lys Glu Leu Phe Phe Ser Ser 690 695 700 Leu Lys Ser Ala His Gly Ser Ser Thr Thr His Gly Ile Ser Ala Ile 705 710 715 720 Leu Ile Ser Ile Val Ser Ile Trp Asn His Pro Leu Ile Ser Thr Tyr 725 730 735 Asp Val Gln His Leu Lys Ile Phe Leu Thr Xaa Ile Xaa Leu Gly Gly 740 745 750 Phe Ala Xaa Gln Val Leu Lys Gly Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 755 760 765 Xaa Leu Lys Arg Leu Xaa 770
【００７７】配列番号：５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GATGAGTTCA GGACGGCAG 19
【００７８】配列番号：６ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GGTGCCATAT GTGTCTCC 18
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＥＤ 48/00 ＡＥＤ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/64 Ｚ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/64 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/531 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ａ６１Ｋ 37/54 ＡＡＭ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ (72)発明者 コンラッド ジー．チャップマン イギリス国 ビー アール６ ７ディー エヌ ケント，オーピントン，ファーンボ ロー ビレッジ， テュベンデン レーン サウス 292 (72)発明者 ケイ マーフィー イギリス国 エス ジー13 ７ジェイ イ ー ハーツ，ハートフォード，ウッドラン ズ ロード，５ (72)発明者 トルディ エス．スミス アメリカ合衆国 19087 ペンシルバニア 州， ラドナー，レモントン ウェイ 122

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号２のＡＳＰ２ポリペプチドをコ
    ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
    ０％同一であり、かつＡＳＰ２ポリペプチドの活性を有
    するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
    はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
    配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
    のＡＳＰ２ポリペプチドをコードする配列番号１中に含
    まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載
    のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 前記のポリヌクレオチドが、その全長に
    おいて配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０
    ％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１
    に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
    請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
    記載のポリヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 配列番号２のＡＳＰ２ポリペプチドのア
    ミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、
    欠失または置換されており、かつＡＳＰ２ポリペプチド
    の活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
    配列を含んでなるポリヌクレオチド。
  7. 【請求項７】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
    するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％
    同一であるアミノ酸配列を含むＡＳＰ２ポリペプチドを
    産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡまたは
    ＲＮＡ分子。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現系を含有する宿主
    細胞。
  9. 【請求項９】 ＡＳＰ２ポリペプチドを産生させるのに
    十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、こ
    の培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んで
    なる、ＡＳＰ２ポリペプチドの産生方法。
  10. 【請求項１０】 宿主細胞が適当な培養条件下でＡＳＰ
    ２ポリペプチドを産生するように、請求項７に記載の発
    現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
    ションすることを含んでなる、ＡＳＰ２ポリペプチドを
    産生する細胞の作製方法。
  11. 【請求項１１】 全長において配列番号２のアミノ酸配
    列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで
    なるＡＳＰ２ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
    求項１１に記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のＡＳＰ２ポリペプ
    チドに免疫特異的な抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のＡＳＰ２ポリペプ
    チドの活性増加または発現を必要としている患者を治療
    するための医薬組成物であって、治療上有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアゴニスト、および／ま
    たは(b) 前記ポリペプチド活性のin vivo 生産をもたら
    す形の、配列番号２のＡＳＰ２ポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列と全長において少なくとも８０％同
    一であるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配
    列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離
    されたポリヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のＡＳＰ２ポリペプ
    チドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療
    するための医薬組成物であって、治療上有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および
    ／または(b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチ
    ド配列の発現を抑制する核酸分子、および／または(c)
    前記ポリペプチドのリガンド、基質または受容体に関し
    て前記ポリペプチドと競合するポリペプチド、を含んで
    なる医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のＡＳＰ２ポリペプ
    チドの発現または活性と関連した被験者の疾病またはそ
    の罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者由来のゲノム中にＡＳＰ２ポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列の突然変異があるかどう
    かを調べる、および／または(b) 前記被験者から得られ
    たサンプル中のＡＳＰ２ポリペプチド発現の存在または
    量を分析する、ことを含んでなる方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のＡＳＰ２ポリペプ
    チドを阻害（拮抗）または活性化する化合物の同定方法
    であって、 (a) ＡＳＰ２ポリペプチドを発現している細胞（もしく
    はＡＳＰ２ポリペプチドを発現している細胞膜）または
    ＡＳＰ２ポリペプチドに応答する細胞と候補化合物とを
    接触させ、そして(b) その結合、または機能的応答の刺
    激もしくは抑制を観察するか、または候補化合物と接触
    させた細胞（または細胞膜）の能力を、接触させなかっ
    た同一の細胞と、ＡＳＰ２ポリペプチド活性に関して比
    較する、ことを含んでなる方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法により同定さ
    れたアゴニスト。
  19. 【請求項１９】 請求項１７に記載の方法により同定さ
    れたアンタゴニスト。
  20. 【請求項２０】 請求項１０に記載の方法により作製さ
    れた組換え宿主細胞、またはＡＳＰ２ポリペプチドを発
    現するその膜。
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