ES2282292T3 - Estructura cristalina de bace y usos de la misma. - Google Patents
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Abstract
Un complejo cristalizado de la enzima de escisión de la APP en el sitio beta (BACE) y SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE.
Description
Estructura cristalina de BACE y usos de la
misma.
La presente invención se refiere a la estructura
cristalina tridimensional de la enzima de escisión de APP en el
sitio \beta (BACE, por sus siglas en inglés:
Beta-site APP Cleaving Enzyme), y al uso de esta
estructura en procedimientos de diseños de fármacos racionales para
identificar agentes que pueden interaccionar con sitios activos de
BACE. Dichos agentes pueden representar nuevos agentes terapéuticos
en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer.
Una patología característica de la enfermedad de
Alzheimer es la formación de placas amiloides insolubles en el
cerebro. Estas placas proteicas están compuestas de un fragmento de
42 aminoácidos de 4 kDa de la proteína precursora de
\beta-amiloide (APP) y se denomina péptido beta
amiloide (A\beta). Por lo tanto, el mecanismo de producción de
A\beta tiene una importancia crítica para comprender el inicio y
el avance de la enfermedad de Alzheimer. Se ha mostrado que
A\beta deriva de la escisión proteolítica de una proteína mayor,
la proteína precursora de \beta-amiloide (APP).
Hay dos enzimas responsables de esta escisión; primero, la enzima
\beta-secretasa escinde la APP en el resto 671
(isoforma de 770 aa de la numeración de la APP) y después la
\gamma-secretasa escinde en el resto 716. Más
recientemente, se ha identificado la nueva proteasa aspártica
transmembrana BACE como una \beta-secretasa. Esta
proteína ahora es un objetivo importante en un enfoque terapéutico
para la enfermedad de Alzheimer. En los casos raros de la
enfermedad de Alzheimer que son hereditarios (enfermedad de
Alzheimer familiar (EAF)) se ha aislado el fenotipo de la enfermedad
de mutaciones en la proteína precursora de
\beta-amiloide. Una cohorte particular, la
"mutación sueca", presenta una mutación doble del sitio de
escisión de la \beta-secretasa.
Además de la función de BACE en la enfermedad de
Alzheimer, la elucidación de la estructura tridimensional de BACE,
así como su sitio de unión con APP tendría implicaciones importantes
en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer y
enfermedades similares asociadas con la presencia de placas
amiloides insolubles compuestas del fragmento de 42 aminoácidos de
la APP en el cerebro.
La presente invención proporciona un cristal de
BACE en complejo con un péptido inhibidor de APP, así como la
estructura tridimensional de BACE derivada de los datos de
difracción de rayos X del cristal de BACE/péptido inhibidor de APP.
Específicamente, la estructura tridimensional de BACE se define por
las coordenadas estructurales mostradas en la Figura 1, \pm una
desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de
los aminoácidos no mayor de 1,5 \ring{A}. Las coordenadas
estructurales de BACE son útiles para una serie de aplicaciones,
incluyendo, pero sin limitar, la visualización, identificación y
caracterización de diferentes sitios activos de BACE, y del
complejo de BACE/péptido inhibidor de APP, incluyendo el sitio de
unión de APP. Después las estructuras de los sitios activos se
pueden usar para diseñar diferentes agentes que interaccionen con
BACE, así como con BACE en complejo con una proteína o péptido de
APP, o moléculas relacionadas.
Un sitio activo de una proteína o péptido de
unión a APP, y preferiblemente el sitio de unión del péptido a APP
de BACE, se puede elucidar y obtener a partir de la estructura
tridimensional de BACE definida por las coordenadas estructurales
relativas expuestas en la Figura 1, \pm una desviación cuadrática
media de los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no
mayor que 1,5 \ring{A}.
El sitio activo de la proteína o péptido de
unión a APP, preferiblemente el sitio de unión del péptido a APP de
BACE puede comprender las coordenadas estructurales relativas según
la Figura 1 de los restos SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96,
VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187,
ALA188,
ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 y ARG368, \pm una desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}.
ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 y ARG368, \pm una desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}.
El sitio activo de la proteína o péptido de
unión a APP, preferiblemente el sitio de unión del péptido a APP de
BACE puede comprender las coordenadas estructurales relativas según
la Figura 1 de los restos LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74,
TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98,
TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, GLY135, LYS136,
TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172, SER174, TRP176,
GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184, ALA185, GLU186,
ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192, ARG256, TRP258,
TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287, VAL288, ASP289,
SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295, ARG296, GLY325,
GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384, ILE385, SER386,
GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392, VAL393, GLY395,
ALA396 y ILE447, \pm una desviación cuadrática media de los
átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5
\ring{A}.
\newpage
La presente invención proporciona además un
procedimiento para identificar un agente que interaccione con un
sitio activo de BACE. El procedimiento comprende las etapas de: (a)
determinar un supuesto sitio activo de BACE a partir de un modelo
tridimensional de BACE usando las coordenadas estructurales
relativas de la Figura 1, \pm una desviación cuadrática media de
los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no mayor
que 1,5 \ring{A}; y (b) llevar a cabo diferentes análisis de
ajustes por ordenador para identificar un agente que interaccione
con el supuesto sitio activo.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para identificar un agente que interaccione con un
sitio activo de una proteína o péptido de unión a APP,
preferiblemente BACE. El procedimiento comprende las etapas de: (a)
generar un modelo tridimensional de un sitio activo de una proteína
o péptido de unión a APP usando las coordenadas estructurales
relativas de acuerdo con la Figura 1, de los restos SER71, GLY72,
LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134,
ILE171, ILE179, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259,
ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 y
ARG368, \pm una desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A};
y (b) diseñar un agente usando el modelo tridimensional generado en
la etapa (a).
La presente invención también proporciona otro
procedimiento para identificar un agente que interacciona con un
sitio activo de una proteína o péptido de unión a APP,
preferiblemente BACE. El procedimiento comprende las etapas de: (a)
generar un modelo tridimensional de un sitio activo de una proteína
o péptido de unión a APP usando las coordenadas estructurales
relativas según la Figura 1, de los restos LYS70, SER71, GLY72,
GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94, GLY95, SER96,
SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134,
GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE171, ASN172,
SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181, ALA183, TYR184,
ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191, ASP192,
ARG256, TRP258, TYR259. TYR283, ASP284, LYS285, SER286, ILE287,
VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294, LEU295,
ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383, ALA384,
ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391, THR392,
VAL393, GLY395, ALA396 y ILE447, \pm una desviación cuadrática
media de los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no
mayor que 1,5 \ring{A}; y (b) diseñar un agente usando el modelo
tridimensional generado en la etapa (a).
Moléculas pequeñas u otros agentes que inhiben o
interfieren de otra forma con la capacidad de BACE para escindir la
APP, pueden ser útiles en el tratamiento y/o prevención de la
enfermedad de Alzheimer.
Objetivos adicionales de la presente invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción.
la fig. 1 proporciona las coordenadas
estructurales atómicas para BACE y el péptido inhibidor de APP
obtenidas por difracción de rayos X de un cristal del complejo de
BACE y péptido inhibidor de APP. "Tipo de átomo" se refiere al
átomo cuyas coordenadas se miden. "Resto" se refiere al tipo de
resto del cual forma parte cada átomo medido, es decir, aminoácido,
cofactor, ligando o disolvente. Las coordenadas "x, y y z"
indican las coordenadas cartesianas para la localización de cada
átomo medido en la celda unidad (\ring{A}). "Oc" indica el
factor de ocupación. "B" indica el "valor B", que es una
medida del grado de movilidad del átomo en la estructura atómica
(\ring{A}^{2}).
Tal como se usa en el presente documento, los
siguientes términos y frases tienen los significados expuestos a
continuación:
Salvo que se indique lo contrario "BACE" es
la enzima de escisión de APP en el sitio beta, y es la enzima
\beta-secretasa que escinde la proteína precursora
de \beta-amiloide (APP) en el resto 671 (isoforma
de 770 aa en la numeración de APP). Después de la escisión de APP
por BACE, la APP que queda es escindida en el resto 716 por la
\gamma-secretasa, dejando un fragmento de 42
aminoácidos de la APP que se encuentra en las placas proteicas de
los pacientes de Alzheimer. La secuencia de aminoácidos de BACE
preferiblemente tiene la secuencia de aminoácidos depositada en
Swiss Prot con el número de acceso P56817, incluidas las
sustituciones conservadoras. Tal como se usa en el presente
documento, BACE también incluye "péptidos de BACE", que son
moléculas que tienen menos que la secuencia completa de aminoácidos
de BACE. Preferiblemente, los péptidos de BACE incluyen el sitio
activo en el que BACE se une y escinde la APP. Más preferiblemente,
el péptido de BACE corresponde a los restos 58-447
expuestos en la Figura 1 ("BACE_{58-447}"),
incluidas las sustituciones conservadoras.
La "APP" es la proteína precursora de
\beta-amiloide que tiene la secuencia de
aminoácidos depositada en Swiss Prot con el número de acceso
CAA31830, incluidas las sustituciones conservadoras. Tal como se usa
en el presente documento, APP también incluye "péptidos de
APP", que son moléculas que tienen menos que la secuencia
completa de aminoácidos de la APP. Preferiblemente, los péptidos de
APP incluyen el sitio activo en el que la APP es escindida por
BACE.
Un "péptido inhibidor de APP" es un péptido
que inhibe la unión entre BACE y APP. Preferiblemente, el péptido
de APP tienen la secuencia de aminoácidos
SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE,
en la que Sta es el aminoácido raro
(S)-estatina.
Una "proteína o péptido de unión a APP" es
una proteína o péptido que se une a APP y tiene un sitio de unión a
APP, e incluye, pero no se limita, BACE y péptidos de BACE.
Salvo que se indique lo contrario,
"proteína" incluirá una proteína, dominio de proteína,
polipéptido o péptido.
Las "coordenadas estructurales" son las
coordenadas cartesianas correspondientes a la relación espacial de
un átomo respecto a otros átomos en una molécula o complejo
molecular. Las coordenadas estructurales se pueden obtener usando
técnicas de cristalografía de rayos X o técnicas de RMN, o se pueden
obtener usando análisis de reemplazo molecular o modelado por
homología. Diferentes programas de software permiten la
representación gráfica de un conjunto de coordenadas estructurales
para obtener la representación tridimensional de una molécula o
complejo molecular. Las coordenadas estructurales de la presente
invención se pueden modificar a partir del conjunto original
proporcionado en la Figura 1, mediante manipulación matemática, tal
como por inversión o sumas o restas de números enteros. Por lo
tanto, se reconoce que las coordenadas estructurales de la presente
invención son relativas, y no están específicamente limitadas de
ninguna forma por las coordenadas x, y, z literales de la Figura
1.
Un "agente" incluirá una proteína,
polipéptido, péptido, ácido nucleico, incluido ADN o ARN, molécula,
compuesto o fármaco.
La "desviación cuadrática media" es la raíz
cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones
de la media, y es una forma de expresar la desviación o variación
de las coordenadas estructurales de BACE descritas en el presente
documento. La presente invención incluye todas las realizaciones que
comprenden sustituciones conservadoras de los restos aminoácidos
indicados que dan como resultado las mismas coordenadas
estructurales dentro de la desviación cuadrática media
expuesta.
La numeración de los restos aminoácidos
identificados en la Figura 1 se basa en la numeración de la longitud
completa de la proteína BACE desde el principio de la secuencia
señal. Será evidente para el experto que la numeración de los
restos aminoácidos de BACE puede ser diferente de la expuesta en el
presente documento o puede contener sustituciones de aminoácidos
conservadoras que dan las mismas estructurales tridimensionales que
las definidas en la Figura 1. Los correspondientes aminoácidos y
sustituciones conservadoras en otras isoformas o análogos se
identifican fácilmente por inspección visual de las secuencias de
aminoácidos importantes o usando programas de software de homología
disponibles en el comercio (p. ej., MODELLAR, MSI, San diego,
CA).
Las "sustituciones conservativas" son
aquellas sustituciones de aminoácidos que son funcionalmente
equivalentes al resto aminoácido sustituido, bien teniendo la misma
polaridad, disposición estérica, o bien perteneciendo a la misma
clase que el resto sustituido (p. ej., hidrófobo, ácido o básico) e
incluyen sustituciones que tienen un efecto irrelevante en la
estructura tridimensional de BACE, con respecto al uso de esta
estructura para la identificación y diseño de agentes que
interaccionen con BACE, para el análisis de reemplazo molecular y/o
para el modelado por homología.
Tal como se usa en el presente documento, un
"sitio activo" se refiere a una región de una molécula o
complejo molecular que como resultado de su forma y potencial de
carga, interacciona favorablemente o se asocia con otro agente
(incluidos, sin limitación, una proteína, polipéptido, péptido,
ácido nucleico, incluidos ADN y ARN, molécula, compuesto,
antibiótico o fármaco) por diferentes fuerzas covalentes y/o no
covalentes. Preferiblemente, el sitio activo de BACE corresponde al
sitio en el que BACE escinde la molécula de APP.
Como tal, el sitio activo de BACE puede incluir,
por ejemplo, tanto el sitio real en el que BACE se une y escinde la
APP, como sitios de unión accesorios adyacentes o próximos al sitio
de unión real, que no obstante, pueden afectar a la capacidad de
BACE para unirse y escindir la APP, sea por interferencia directa
con el sitio de unión real o afectando indirectamente a la
conformación estérica o potencial de carga de la molécula BACE y
así previniendo o reduciendo la capacidad de BACE para unirse a APP
en el sitio de unión real. Tal como se usa en el presente
documento, un sitio activo también incluye BACE o restos análogos de
BACE que presentan perturbaciones observables por RMN en presencia
de un ligando de unión, tal como APP o un péptido de APP. Aunque
dichos restos que presentan perturbaciones observables por RMN
pueden no estar necesariamente en contacto directo con o
inmediatamente próximos a los restos de unión del ligando, pueden
ser críticos para los restos BACE para los protocolos de diseño
racional de
fármacos.
fármacos.
La presente invención se dirige a un complejo
cristalizado de BACE y un péptido inhibidor de APP que difracta
eficazmente los rayos X para la determinación de las coordenadas
estructurales del complejo. Tal como se usa en el presente
documento, BACE preferiblemente corresponde a
BACE_{58-447} como se expone en la Figura 1, con
el dominio N-terminal constituido por los restos
aminoácidos 58-207 mostrados en la Figura 1, y el
dominio C-terminal constituido por los restos
aminoácidos 208-447 mostrados en la Figura 1. El
péptido inhibidor de APP preferiblemente es
SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE.
Usando el complejo cristalino de la presente
invención, los datos de difracción de rayos X se pueden recoger
mediante una variedad de medios con el fin de obtener las
coordenadas atómicas de la molécula o complejo molecular
cristalizado. Con la ayuda de software de ordenador diseñado
específicamente, dichos datos cristalográficos se pueden usar para
generar una estructura tridimensional de la molécula o complejo
molecular. Los expertos en la materia conocen los diferentes
procedimientos usados para generar y refinar la estructura
tridimensional de una molécula o estructura molecular cristalizada,
e incluyen, sin limitación, dispersión anómala múltiple (MAD),
reemplazo isomorfo múltiple, aplanamiento por el disolvente del
espacio recíproco, reemplazo molecular, y reemplazo isomorfo simple
con dispersión anómala (SIRAS).
La estructura tridimensional de BACE se puede
obtener de los datos de difracción de rayos X del cristal de
BACE/péptido inhibidor de APP. Específicamente, la estructura
tridimensional de BACE ser puede definir por las coordenadas
estructurales mostradas en la Figura 1, \pm una desviación
cuadrática media de los átomos de la cadena principal de los
aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}; preferiblemente no mayor
que 1,0 \ring{A}, y más preferiblemente no mayor que 0,5
\ring{A}. Las coordenadas estructurales de BACE son útiles para
una serie de aplicaciones, incluidas, pero sin limitar, la
visualización, identificación y caracterización de diferentes sitios
activos de BACE, y el complejo de BACE/péptido inhibidor de APP,
incluido el sitio de unión de APP o péptido de APP. Después las
estructuras de los sitios activos se pueden usar para diseñar
agentes que interaccionen con BACE, así como con BACE en complejo
con APP, un péptido de APP o moléculas relacionadas.
Un sitio activo de una proteína o péptido de
unión a APP, preferiblemente el sitio de unión del péptido a APP de
BACE, puede comprender las coordenadas estructurales relativas según
la Figura 1 de los restos SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96,
VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187,
ALA188,
ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 y ARG368, \pm una desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}, más preferiblemente no mayor que 1,0 \ring{A}, más preferiblemente no mayor que 1,0 \ring{A} y lo más preferiblemente no mayor que 0,5 \ring{A}.
ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 y ARG368, \pm una desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}, más preferiblemente no mayor que 1,0 \ring{A}, más preferiblemente no mayor que 1,0 \ring{A} y lo más preferiblemente no mayor que 0,5 \ring{A}.
Alternativamente, un sitio activo de una
proteína o péptido de unión a APP, preferiblemente el sitio de unión
del péptido a APP de BACE puede comprender las coordenadas
estructurales relativas según la Figura 1 de los restos LYS70,
SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93, THR94,
GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132, THR133,
GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170, ILE172,
ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU 180, GLY181, ALA183,
TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190, ASP191,
ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285, SER286,
ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293, ASN294,
LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382, PHE383,
ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390, GLY391,
THR392, VAL393, GLY395, ALA396 y ILE447, \pm una desviación
cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos
aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}, más preferiblemente no
mayor que 1,0 \ring{A}, y más preferiblemente no mayor que 0,5
\ring{A}.
Otro aspecto de la presente invención se dirige
a un procedimiento para identificar un agente que interacciona con
un sitio activo de BACE que comprende las etapas de: (a) determinar
un sitio activo de BACE a partir de un modelo tridimensional de
BACE usando las coordenadas estructurales relativas de la Figura 1,
\pm una desviación cuadrática media de los átomos de la cadena
principal de dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}, más
preferiblemente no mayor que 1,0 \ring{A}, y lo más
preferiblemente no mayor que 0,5 \ring{A}; y (b) realizar el
análisis de ajuste por ordenador para identificar un agente que
interaccione con dicho sitio activo. El análisis de ajuste por
ordenador usa diferentes programas de software para evaluar el
"ajuste" entre el supuesto sitio activo y el agente
identificado, (a) generando un modelo tridimensional del supuesto
sitio activo de una molécula o complejo molecular usando modelado
por homología o las coordenadas estructurales atómicas del sitio
activo, y (b) determinando el grado de asociación entre el supuesto
sitio activo y el agente identificado. Los modelos tridimensionales
del supuesto sitio activo se pueden generar usando cualquiera de
una serie de procedimientos conocidos en la técnica, e incluyen,
pero no se limitan, modelado por homología así como análisis por
ordenador de datos brutos generados usando datos cristalográficos o
espectroscópicos. Los programas de ordenador usados para generar
dichos modelos tridimensionales y/o realizar los análisis de ajuste
necesarios incluyen, pero no se limitan: GRID (Oxford University,
Oxford, UK), MCSS (Molecular Simulations, San Diego, CA), AUTODOCK
(Scripps Research Institute, La Jolla, CA), DOCK (University of
California, San Francisco, CA), Flo99 (Thistlesoft, Morris Township,
NJ), Ludi (Molecular Simulations, San Diego, CA), QUANTA (Molecular
Simulations, San Diego, CA), Insight (Molecular Simulations, San
Diego, CA), SYBYL (TRIPOS, Inc., St. Louis. MO) y LEAPFROG (TRIPOS,
Inc., St. Louis, MO).
La presente invención también proporciona un
procedimiento para identificar un agente que interacciona con un
sitio activo de una proteína o péptido de unión a APP, y
preferiblemente el sitio de unión del péptido a APP en BACE. El
procedimiento comprende las etapas de: (a) generar un modelo
tridimensional de un sitio activo de una proteína o péptido de
unión a APP usando las coordenadas estructurales relativas según la
Figura 1 de los restos SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96,
VAL130, PRO131, TYR132, THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187,
ALA188, ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289,
GLY291, THR292, THR293, ASN294, ARG296 y ARG368, \pm una
desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de
dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}, más preferiblemente
no mayor que 1,0 \ring{A}, y lo más preferiblemente no mayor que
0,5 \ring{A}; y (b) diseñar un agente usando el modelo
tridimensional generado en la etapa (a). En otra realización
preferida, el sitio activo de la proteína o péptido de unión a APP
se genera usando el modelo tridimensional definido por las
coordenadas estructurales relativas según la Figura 1 de los restos
LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93,
THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132,
THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170,
ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181,
ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190,
ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285,
SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293,
ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382,
PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390,
GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 y ILE447, \pm una
desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de
dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}, más preferiblemente
no mayor que 1,0 \ring{A}, y lo más preferiblemente no mayor que
0,5 \ring{A}.
El efecto de tal agente, identificado por
análisis de ajuste por ordenador, en la proteína o péptido de unión
a APP se puede evaluar más obteniendo o sintetizando el agente, y
poniendo en contacto el agente identificado con el péptido o
proteína de unión a APP con el fin de determinar el efecto que el
agente tiene en el péptido o proteína de unión a APP.
Preferiblemente, el péptido o proteína de unión a APP es BACE (o un
péptido de BACE), y el agente es un inhibidor potencial de la unión
entre BACE (o un péptido de BACE) y la APP (o un péptido de APP).
Por lo tanto, en la realización preferida, el agente se pone en
contacto con BACE (o un péptido de BACE) en presencia de APP (o un
péptido de APP), para determinar la capacidad del agente para
inhibir la unión entre BACE (o el péptido de BACE) y la APP (o el
péptido de APP). Dependiendo de la acción del agente en el sitio
activo, el agente puede actuar como un inhibidor o activador de la
unión de BACE/APP. Se pueden llevar a cabo ensayos y analizar los
resultados para determinar si el agente es un inhibidor (es decir,
el agente puede reducir o prevenir la afinidad de unión entre BACE
y APP), un activador (es decir, el agente puede aumentar la
afinidad de unión entre BACE y APP), o no tiene efecto en la
interacción entre BACE y APP. Después, los agentes identificados
usando los procedimientos anteriores, y preferiblemente los
inhibidores de la escisión de APP por BACE, se pueden ensayar como
agentes terapéuticos en el tratamiento y/o prevención de la
enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades que también se
caracterizan por la presencia del fragmento de APP de 42
aminoácidos en las placas proteicas del cerebro.
Se describen diferentes análisis moleculares y
técnicas de diseño de fármacos racionales con más detalle en las
patentes de EE.UU. nº 5.834.228, 5.39.528 y 5.865.116, así como en
la solicitud PCT nº PCT/US98/7.6879, documento publicado WO
99/09148, cuyos contenidos se incorporan mediante referencia en el
presente documento.
Los agentes, y preferiblemente los inhibidores,
identificados usando los procedimientos anteriores, pueden ser una
proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico, incluidos ADN y ARN,
molécula, compuesto o fármaco, y preferiblemente son moléculas
pequeñas que inhiben eficazmente la unión entre BACE y APP o un
péptido de APP. Dichas moléculas pueden ser útiles para tratar,
prevenir o inhibir el avance de la enfermedad de Alzheimer.
La presente invención se puede entender mejor
haciendo referencia al siguiente ejemplo no limitante. El siguiente
Ejemplo se presenta con el fin de ilustrar de forma más completa las
realizaciones preferidas de la invención, y no debe considerarse de
ninguna forma limitante del alcance de la invención.
Ejemplo
1
Clonación de BACE1 humana. ARNm poliA+ humano de
cerebro entero (Clontech) se convirtió en ADNc
mediante cebado aleatorio usando el sistema de RT-PCR Thermoscript, según las instrucciones del fabricante
(Lifetechnologies). Este ADNc se amplificó por PCR usando los cebadores directos e inversos, 5' GCTCTAGAACC
CAGC ACGGCATCCGGCTG 3' (sitio XbaI indicado mediante la secuencia subrayada; nts. 517-537 con el nº de acceso AF190725) y 5' CCAAGCATGCGGCCGCAATAGGCTATGGTCA TGAGGGTTGAC 3' (sitio NotI indicado mediante la secuencia subrayada; nts. 1809-1833; la "A" en negrita indica nucleótido adicional para permitir la traducción en el marco de la quimera Fc; véase a continuación), respectivamente. La PCR se llevó a cabo usando el kit de Expand Long Polymerase de acuerdo con las condiciones del fabricante (Roche Biochemicals; tampón nº 3), con el ciclo de PCR que consistía en una etapa de desnaturalización inicial a 95°C durante 3 min, 30-40 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, reasociación a 65°C durante 30 s, elongación a 68°C durante 1 min 30 s, seguido por elongación final a 68°C durante 5 min. Los productos de la PCR se hicieron correr en un gel de agarosa al 1%. Se cortó la banda adecuada del gel, se purificó por columnas de extracción de ADN Quantum Prep Freeze 'N Squeeze (Bio-Rad), y se clonó en los sitios SpeI/NotI del vector de expresión de mamífero, pED/Fc (Kaufman, RJ y col., 1991, Nucl. Acids. Res. 19:4485-4490).
mediante cebado aleatorio usando el sistema de RT-PCR Thermoscript, según las instrucciones del fabricante
(Lifetechnologies). Este ADNc se amplificó por PCR usando los cebadores directos e inversos, 5' GCTCTAGAACC
CAGC ACGGCATCCGGCTG 3' (sitio XbaI indicado mediante la secuencia subrayada; nts. 517-537 con el nº de acceso AF190725) y 5' CCAAGCATGCGGCCGCAATAGGCTATGGTCA TGAGGGTTGAC 3' (sitio NotI indicado mediante la secuencia subrayada; nts. 1809-1833; la "A" en negrita indica nucleótido adicional para permitir la traducción en el marco de la quimera Fc; véase a continuación), respectivamente. La PCR se llevó a cabo usando el kit de Expand Long Polymerase de acuerdo con las condiciones del fabricante (Roche Biochemicals; tampón nº 3), con el ciclo de PCR que consistía en una etapa de desnaturalización inicial a 95°C durante 3 min, 30-40 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s, reasociación a 65°C durante 30 s, elongación a 68°C durante 1 min 30 s, seguido por elongación final a 68°C durante 5 min. Los productos de la PCR se hicieron correr en un gel de agarosa al 1%. Se cortó la banda adecuada del gel, se purificó por columnas de extracción de ADN Quantum Prep Freeze 'N Squeeze (Bio-Rad), y se clonó en los sitios SpeI/NotI del vector de expresión de mamífero, pED/Fc (Kaufman, RJ y col., 1991, Nucl. Acids. Res. 19:4485-4490).
Una construcción intermedia contenía la
secuencia líder segregadora de meletina de la abeja de miel
fusionada al prodominio y región codificadora de BACE1, justo
secuencia arriba del dominio transmembrana predicho de BACE1
(Vassar, R., y col., 1999, Science
286:735-741). La ausencia del dominio transmembrana
hidrófobo predicho en esta construcción permitiría extraer la
proteína BACE.Fc secretada soluble del medio condicionado.
Secuencia abajo de BACE1 había un sitio de escisión de enteroquinasa
diseñado seguido de la secuencia codificadora de la parte Fc de la
inmunoglobulina IgG. La construcción final contenía el gen de
BACE1.Fc, flanqueado por SalI y EcoRI en pED/Fc, clonado en los
sitios SalI/ECoRI del vector de expresión de mamíferos, pHTop, un
derivado de pED, en el que la mayor parte del promotor tardío
principal de adenovirus se sustituyó por seis repeticiones de un
operador de tetraciclina bacteriana (descrito por Gossen y col,
1992, PNAS, 89:5547-5551). La secuenciación
del gen recombinante BACE1.Fc se llevó a cabo mediante la
secuenciación del didesoxi BigDye Terminator usando un ABI3700. El
análisis de secuencia se llevó a cabo usando el paquete de software
DNAstar.
Expresión de BACE1 humana. El vector, pHTOP, con
el inserto BACE.Fc, contiene el gen de la dihidrofolato reductasa y
cuando se introduce en la línea celular CHO/A2 (véase la descripción
a continuación) funciona de forma muy eficaz y se pueden
seleccionar genes con expresión alta aislando las células que
sobreviven en concentraciones altas de metotrexato. La línea
celular CHO/A2 se obtiene de CHO DUKX B11 (Urlaub and Chasin, 1980,
PNAS USA 77:4216-4220) por la integración estable
de un activador de la transcripción (tTA), una proteína de fusión
entre el represor Tet y el dominio de transcripción VP16 del virus
del herpes (Gossen y col.). Se estableció una línea de células CHO
que expresaban BACE1.Fc extracelular transfectando (lipofección)
pHTOPBACE1.Fc en células CHO/A2 y seleccionando clones en
metotrexato 0,02 y 0,05 \muM. Los medios condicionados de
múltiples clones se cribaron por transferencia Western usando un
anticuerpo HRP IgG.Fc (ratón) anti-humano. Los
mismos clones también se marcaron metabólicamente con 35 S
(met/cys). El mejor clon, determinado en virtud de su alta
expresión, era uno que resultaba de la selección en MTX 0,05 \muM
y se eligió para pasarlo a escala de producción de medio
condicionado en botella giratorio (4 litros). Después el medio
condicionado se usó para la purificación. La proteína expresada
tiene los restos 22-460 y nueve restos extra en el
C terminal (un artefacto de la clonación y permanece del sitio de
escisión EK).
Purificación de BACE1. Para purificar BACE se
usaron 102 litros de medio condicionado. Durante la purificación la
actividad de la enzima se calculó a temperatura ambiente mediante
seguimiento continuo de la intensidad fluorescente durante
5-10 min a 420 nm (ext - 320 nm) de
Abz-Ser-Glu-Val-Asn-Leu-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-Dpa
(Abz = ácido aminobenzoio, Dpa =
9,10-difenilantraceno) como sustrato. La mezcla de
reacción contenía sustrato 20 \muM, diferentes cantidades de
enzima en 0,5 ml de Tris-HCl 20 mM pH 8,0 y NaCl 100
mM. El material del medio condicionado concentrado (1,61) se aplicó
a una columna (2,8 x 12 xm) que contenía agarosa con proteína A
inmovilizada ImmunoPure (Pierce, II, EE.UU.) equilibrada en tampón
de PBS. La velocidad de aplicación era 2 ml/min. La columna se lavó
con 1 litro de tampón de PBS y la proteína BACE-Fc
se eluyó con tampón de elución de IgG ImmunoPure (Pierce, II,
EE.UU.). Las fracciones que contenían proteína se neutralizaron
inmediatamente con Tris-HCl 1 M a pH 8,0.
El material proteico obtenido se trató con
enteroquinasa a 25ºC. La relación de BACE-Fc a
enteroquinasa era 3000:1 y el tiempo de reacción era 3 h. La
reacción se paró separando la enteroquinasa de la mezcla de reacción
aplicando la proteína a una columna (1 x 5 cm) que contenía agarosa
con inhibidor de tripsina de soja (Sigma, Mo, EE.UU.) equilibrada
en Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 que contenía NaCl 100 mM
(la velocidad era 1 ml/min). El flujo a través del material
contenía BACE y Fc escindido. El Fc escindido se separó de BACE por
flujo a través de una columna de proteína A equilibrada en
Tris-HCl 20 mM pH 8,0.
Se desglicosiló parcialmente BACE usando PNGasa
F (New England Labs., Ma, EE.UU). Se añadieron 8-9
\mug de PNGasa a 1 mg de BACE y la incubación se llevó a cabo a
37ºC durante 16 horas. Se añadieron 5-6 \mug
adicionales de PNGasa a cada mg de BACE y la incubación se continuó
durante 4 horas. El BACE purificado se separó de la PNGasa por
cromatografía de exclusión por tamaños HPLC usando una columna de
21,5 x 30 cm G-3000SW (TosoHaas, Pa, EE.UU.)
equilibrada en tris-HCl 20 mM pH 8,0 que contenía
NaCl 200 mM. (La velocidad de elución era 3 ml/min). La BACE
purificada se concentró y se usó para los experimentos de
cristalización.
La secuenciación N-terminal de
BACE purificada pone de manifiesto una mezcla de especies de
proteínas, en la que la que la muestra principal tiene el dominio
de procesamiento escindido y empieza en el resto 47 (toda la
numeración se refiere a BACE de longitud completa; código de acceso:
A59090) y una muestra minoritaria que no se había escindido empieza
en el resto 22. También se detectó una muestra menor con la
secuencia MTIAY.
Cristalización. Los cristales se hicieron crecer
usando el procedimiento de difusión de vapor de gotas suspendidas.
La proteína de concentró a mg/ml en Tris 20 mM pH 7,5, cloruro
sódico 200 mM. La secuencia del péptido inhibidor es SEVNStaVAEF,
donde Sta es el aminoácido raro (S)-estatina. Se
concentró a 100 mM en DMSO al 100% y se mezcló con proteína
concentrada con un exceso de péptido de dos veces para formar el
complejo. Se añadió 1 \mul de complejo a 1 \mul de solución de
pocillo que contenía cacodilato sódico 100 mM pH 6,5, PEG8K al 25%,
sulfato de litio 300 mM. Crecieron grupos de cristales de tipo placa
en una semana con dimensiones de 200 \mum x 400 \mum x 75
\mum. Se transfirieron cristales individuales a una solución
estabilizante crioprotectora que contenía la solución del pocillo
más glicerol al 25% durante un momento, 10 segundos, se empaparon y
después se congelaron en nitrógeno líquido. Los cristales de
difracción de rayos X tenían un grupo espacial 1222, y unos
parámetros de la celda unidad de a=86,627, b=130,861, c=13,729,
\alpha=\beta=\gamma=90º.
Determinación estructural y plegado general.
BACE de longitud completa se expresó en células CHO como una
proteína de fusión con fc, y después de purificación, escisión y
desglicosilación parcial, se formó el complejo con el inhibidor
peptídico y se cristalizó. Los cristales difractaban a 2,3
\ring{A} y la estructura se resolvió usando la técnica del
reemplazo molecular. El modelo de búsqueda usado se obtuvo de la
pepsina de bacalao del atlántico y contenía 63% del número de
átomos finales. Los mapas de densidad modificados obtenidos usando
una versión de polialanina del modelo de búsqueda (39% de los átomos
finales) proporcionaron suficiente información para construir todo
salvo 12 aminoácidos. El modelo final contiene los restos 59 a 448
(usando la numeración de la longitud completa), todos los 9 restos
del inhibidor de estatina y 360 moléculas de agua. De los cuatro
sitios de glicosilación unidos a N predichos, sólo dos tienen
densidad electrónica interpretable.
La forma global de la proteína BACE es esférica
y está compuesta de dos dominios distintos, uno
N-terminal (58-207) y uno
C-terminal (208-447). Los trece
primeros aminoácidos (58-71) están empaquetados
contra los restos 238-243. Hay un canal de tipo
hendidura significativo a lo largo de una superficie de la interfase
entre los dominios. Este contiene el motivo del péptido inhibidor y
ácido aspártico conservado que definen los sitios activos de las
proteasas aspárticas.
El dominio N-terminal está
compuesto de una sola hélice \alpha que precede al bucle que une
los dos dominios y 13 cadenas \beta. El dominio
C-terminal más largo tienen un total de 17 cadenas
\beta y 3 hélices \alpha. La topología global se caracteriza
por un interdominio de lámina \beta de 8 cadenas antiparalelas.
Esta lámina central comprende la mayor parte de los restos del
sitio activo incluyendo los dos aspartatos conservados (uno de cada
dominio: 93 y 289). Asp93 y Asp289 definen la posición de un eje
seudobinario para la lámina \beta central. Fuera de esta simetría
los dos dominios difieren significativamente. El dominio
N-terminal tiene dos cadenas extras que extiende la
lámina central. Además, hay dos láminas \beta antiparalelas encima
y debajo de la lámina central compuestas de 3 y 4 cadenas \beta
respectivamente. Los restos de la lámina superior
(131-135) se pliegan sobre los aspartatos del sitio
activo y forman un "alerón" sobre el centro de la hendidura de
unión del péptido.
El dominio C-terminal contiene
dos lóbulos además de las cadenas que forman la lámina \beta
central. Estas son débilmente homólogas con las estructuras de
proteasas aspárticas conocidas. En cambio el bolsillo de unión para
las posiciones P1' y P3' derivan de 3 vueltas \beta
388-391, 284-286 y
255-261.
Hay un total de 6 restos cisteína en BACE. Cada
uno de estos está implicado en una interacción disulfuro. El patrón
de reticulación disulfuro, Cys278-Cys443,
Cys380-Cys330, Cys420-Cys216 es
único en las proteasas aspárticas conocidas hasta la fecha.
Una nueva proteasa aspártica. Los primeros
intentos de estudiar la relación de la función con la estructura de
una proteasa aspártica empezaron en 1930 con la pepsina. Desde
entonces este rico campo de investigación se ha aplicado con éxito
al diseño de inhibidores usados en clínica en solo un sistema, la
proteasa del VIH. Las razones de esto están más relacionadas con la
validez del objetivo farmacológico que con la eficacia de los
inhibidores. La \beta-secretasa se ha descrito
como una proteasa nueva y se ha mostrado que está ligada al inicio
y avance de la enfermedad de Alzheimer.
Desde un punto de vista general el plegado
global y la organización de dominios es muy similar a la de una
proteasa aspártica canónica. La comparación a un nivel más detallado
pone de manifiesto un número significativo de diferencias. El sitio
activo se caracteriza por 2 restos aspárticos rodeados por un grupo
de enlaces de hidrógeno conservados llamados un "agarre de
bombero". Esto se reproduce en la estructura de secretasa
presentada aquí. El alerón característico que se pliega sobre el
sitio activo en la pepsina está ausente en el dominio
C-terminal de una forma análoga a la catepsina D. En
la \beta-secretasa el enlace de hidrógeno crítico
de la amida de la cadena principal al grupo carboxilo de la
estatina se mantiene con el Thr133 de esté alerón. La amida de la
estatina forma un enlace de hidrógeno con el grupo carboxilo de la
Gly95, enfatizando que el resto de estatina ocupa tanto la posición
P1 como la P1'.
Mecanismo enzimático. Se ha mostrado que la
escisión por la \beta-secretasa depende de la
proximidad a la membrana celular. Tanto la
\beta-secretasa como su sustrato la APP tienen
supuestas regiones transmembrana. La construcción BACE expresada de
la invención termina un aminoácido antes de la región transmembrana
predicha. El resto final en la estructura actual es Ile447, a 13
restos del principio del supuesto dominio de transmembrana. En la
estructura cristalina actual la Ile447 está sólo a 6 \ring{A} del
ácido glutámico P3 del inhibidor, lo que sugiere una función para
los restos C-terminales restantes en el mecanismo
enzimático. El resto estatina del péptido inhibidor está unido a la
posición S1 en el sitio activo. La posición del grupo hidroxilo
C-3, coplanar con y a la distancia de enlace de
hidrógeno de los grupos carboxilo tanto del aspartato 93 como del
289, confirma que los aminoácidos raros mimetizan el estado de
transición tetraédrico, es decir, el intermedio de la hidrólisis
del enlace peptídico. La distancia entre los átomos de oxígeno de
Asp93 y Asp289 es 2,8 \ring{A}, lo que sugiere fuertemente un
átomo protónico compartido y un perfil clásico de pK de proteasa
aspártica para estas cadenas laterales y un mecanismo enzimático
común con otras proteasas aspárticas conocidas.
Unión del inhibidor. El péptido inhibidor se une
en una forma extendida a lo largo de una hendidura de 20 \ring{A}
formada en la interfase entre los dominios. Los restos aspárticos
catalíticos conservados caen en medio de esta hendidura. El péptido
unido consta de 8 aminoácidos más un aminoácido estatina en la
posición 5. Hay una densidad electrónica continua para el péptido
entero. Se ha mostrado que el inhibidor basado en estatina usado en
este estudio inhibe a la enzima \beta-secretasa
con eficacia nanomolar. La secuencia peptídica se basa en la
mutación de la familia sueca APP751 P10 a P4'. Esta mutación de
Lys-Asn en la posición P2 y Met-Leu
en la posición P1 se correlaciona fuertemente con la aparición
temprana de la enfermedad de Alzheimer. El péptido inhibidor usa la
cadena lateral de tipo leucilo de la estatina para explorar esta
interacción. Debido a la naturaleza dipeptídica de la estatina, la
posición P1' del sustrato se desplaza a P2' dejando un bolsillo S1'
vacío. Parece que la enzima \beta-secretasa tiene
una preferencia nueva por un aspartato o glutamato en la posición
P1', mientras que otras proteasas aspárticas muestran una
preferencia por restos hidrófobos. Esta preferencia inusual por un
aminoácido en P1' con carga negativa se explica por el grupo
guanidinio de la Arg189 que forma parte del supuesto bolsillo S1'.
Incluso al pH ácido óptimo de BACE la cadena lateral de arginina
formaría un entorno de carga positiva para los posibles átomos
carboxilo protonados de la cadena lateral.
Los bolsillos de unión S1 y S3 son bolsillos
contiguos e hidrófobos formados por las cadenas laterales de los
restos Tyr132, Phe169, Ile171, Trp176, Ile179 y átomos de la cadena
principal de Gly74 y Gln73. Este empaquetamiento de las cadenas
laterales P1 y P3 del inhibidor se ha visto en complejos de
proteasas aspárticas previos.
Parece que el sitio de escisión de APP canónico
para la \beta-secretasa tiene preferencia por un
resto pequeño hidrófobo en la posición P2'. La cadena lateral del
resto valina unido en el supuesto sitio S2' de la
\beta-secretasa parece que no tiene ninguna
interacción significativa con la proteína, sin embargo, su cadena
principal forma un grupo apretado de enlaces de hidrógeno con el
carboxilo de la Gly95 de la cadena principal y la cadena lateral OH
de la Tyr259. A su vez, la Tyr259 es mantenida rígidamente en el
sitio por una interacción pi de borde con el Trp258, que se
empaqueta contra el grupo guanidinio de la Arg256.
Mutación sueca. Las mutaciones dominantes
autosómicas identificadas en la proteína precursora de
\beta-amiloide se han correlacionado con la
aparición temprana de casos de la enfermedad de Alzheimer. Se ha
mostrado que estas se agrupan entorno a los 3 sitios de escisión
canónicos. Una mutación doble (la llamada sueca) de
Lys670-Met671 (isoforma de 770 aa de la numeración
de APP) a Asn-Leu produce un aumento de la cantidad
total de A\beta detectable en el plasma y en el medio de
fibroblastos cultivados de portadores de la mutación sueca. Estos 2
aminoácidos caen en las posiciones P2 y P1 del sitio activo de la
\beta-secretasa. El inhibidor basado en estatina
usado aquí se basa en esta mutación sueca. Una metionina en la
posición P1 se acomodaría claramente, pero perdería la
complementaridad de Van der Waals expuesta por la cadena lateral de
la estatina con la Leu90 e Ile 178. El átomo C\varepsilon de la
metionina complementaría la interacción hidrófoba con la Phe169.
Todas las publicaciones mencionadas
anteriormente en el presente documento, sean patentes presentadas,
solicitudes pendientes de publicación, artículos publicados,
secuencias depositadas, u otras formas, se incorporan mediante
referencia en el presente documento en su totalidad. Aunque la
invención precedente se ha descrito con algún detalle con el
propósito de la claridad y el entendimiento, el experto en la
materia a partir de la lectura de la descripción observará que se
pueden hacer diferentes cambios en la forma y en el detalle sin
salirse del verdadero alcance de la invención en las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Wyeth
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Estructura cristalina de bace y usos
de la misma
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
WYE-001-EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 01973243.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-09-19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> WO 02/25276
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-09-19
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/234,576
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-09-22
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = Sta =
(S)-estatina
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<400> 1
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\sa{Ser Glu Val Asn Xaa Val Ala Glu Phe}
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<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctctagaac ccagcacggc atccggctg
\hfill29
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\newpage
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipccaagcatgc ggccgcaata ggctatggtg catgagggtt gac
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> MISC_CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = Abz = ácido aminobenzoico
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (12)...(12)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = Dpa =
9,10-difenilantraceno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg
Xaa}
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Wyeth
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Estructura cristalina de bace y usos
de la misma
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<130>
WYE-001-EP
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<140> EP 01973243.7
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-09-19
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<150> WO 02/25276
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<151>
2001-09-19
\vskip1.000000\baselineskip
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<150> US 60/234,576
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<151>
2000-09-22
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido sintético
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<220>
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<221> MISC_CARACTERÍSTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
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<223> X = Sta =
(S)-estatina
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<400> 1
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\sa{Ser Glu Val Asn Xaa Val Ala Glu Phe}
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<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgctctagaac ccagcacggc atccggctg
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<210> 3
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<211> 43
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador
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<400> 3
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido sintético
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<221> MISC_CARACTERÍSTICA
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<222> (1)...(1)
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<223> X = Abz = ácido aminobenzoico
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<221> MISC_CARACTERÍSTICA
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<222> (12)...(12)
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<223> X = Dpa =
9,10-difenilantraceno
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<400> 4
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\sa{Xaa Ser Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg
Xaa}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un complejo cristalizado de la enzima de
escisión de la APP en el sitio beta (BACE) y
SER-GLU-VAL-ASN-Sta-VAL-ALA-GLU-PHE.
2. El complejo cristalizado de la
reivindicación 1, en el que BACE tiene un dominio
N-terminal constituido por los restos aminoácidos
58-207 mostrados en la Figura 1, y un dominio
C-terminal constituido por los restos aminoácidos
208-447 mostrados en la Figura 1.
3. Un procedimiento para identificar un agente
que interaccione con un sitio activo de la enzima de escisión de la
APP en el sitio beta, BACE, que comprende las etapas de:
(a) determinar un sitio activo de BACE a partir
de un modelo tridimensional de BACE usando las coordenadas
estructurales relativas de la Figura 1, \pm una desviación
cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos
aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}; y
(b) realizar el análisis de ajuste por ordenador
para identificar un agente que interaccione con dicho sitio
activo.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la \pm desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no es mayor que 1,0
\ring{A}.
5. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que la \pm desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no es mayor que 0,5
\ring{A}.
6. Un procedimiento para identificar un agente
que interaccione con un sitio activo de la proteína o péptido de
unión a APP, que comprende las etapas de:
(a) generar un modelo tridimensional de un sitio
activo de una proteína o péptido de unión a APP usando las
coordenadas estructurales relativas según la Figura 1 de los restos
SER71, GLY72, LEU91, ASP93, GLY95, SER96, VAL130,
PRO131,TYR132,THR133, GLN134, ILE171, ILE179, ILE187, ALA188,
ARG189, PRO190, TRP258, TYR259, ASP284, LYS285, ASP289, GLY291,
THR292, THR293, ASN294, ARG296 y ARG368, \pm una desviación
cuadrática media de los átomos de la cadena principal de dichos
aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}; y
(b) diseñar un agente usando el modelo
tridimensional generado en la etapa (a).
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la \pm desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no es mayor que 1,0
\ring{A}.
8. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la \pm desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no es mayor que 0,5
\ring{A}.
9. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que el agente se diseña realizando el análisis de ajuste por
ordenador del agente con el modelo tridimensional generado en la
etapa (a).
10. El procedimiento de la reivindicación 6,
que además comprende las etapas de:
(c) obtener o sintetizar el agente así diseñado;
y
(d) poner en contacto el agente con la proteína
o péptido de unión a APP con el fin de determinar el efecto que
tiene el agente en la proteína o péptido de unión a APP.
11. El procedimiento de la reivindicación 6, en
el que la proteína o péptido de unión a APP es BACE.
12. El procedimiento de la reivindicación 11,
en el que el agente es un inhibidor potencial de la unión entre
BACE y APP.
13. El procedimiento de la reivindicación 12,
que además comprende las etapas de:
(c) obtener o sintetizar el agente así diseñado;
y
(d) poner en contacto el agente con BACE en
presencia de APP.
14. Un procedimiento para identificar un agente
que interacciona con un sitio activo de una proteína o péptido de
unión a APP, que comprende las etapas de:
\newpage
(a) generar un modelo tridimensional de un sitio
activo de una proteína o péptido de unión a APP usando las
coordenadas estructurales relativas según la Figura 1 de los restos
LYS70, SER71, GLY72, GLN73, GLY74, TYR75, LEU91, VAL92, ASP93,
THR94, GLY95, SER96, SER97, ASN98, TYR129, VAL130, PRO131, TYR132,
THR133, GLN134, GLY135, LYS136, TRP137, LYS168, PHE169, PHE170,
ILE171, ASN172, SER174, TRP176, GLY178, ILE179, LEU180, GLY181,
ALA183, TYR184, ALA185, GLU186, ILE187, ALA188, ARG189, PRO190,
ASP191, ASP192, ARG256, TRP258, TYR259, TYR283, ASP284, LYS285,
SER286, ILE287, VAL288, ASP289, SER290, GLY291, THR292, THR293,
ASN294, LEU295, ARG296, GLY325, GLU326, ARG368, VAL370, LYS382,
PHE383, ALA384, ILE385, SER386, GLN387, SER388, SER389, THR390,
GLY391, THR392, VAL393, GLY395, ALA396 y ILE447, \pm una
desviación cuadrática media de los átomos de la cadena principal de
dichos aminoácidos no mayor que 1,5 \ring{A}; y
(b) diseñar un agente usando el modelo
tridimensional generado en la etapa (a).
15. El procedimiento de la reivindicación 14,
en el que la \pm desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no es mayor que 1,0
\ring{A}.
16. El procedimiento de la reivindicación 14,
en el que la \pm desviación cuadrática media de los átomos de la
cadena principal de dichos aminoácidos no es mayor que 0,5
\ring{A}.
17. El procedimiento de la reivindicación 14,
en el que el agente se diseña realizando el análisis de ajuste por
ordenador del agente con el modelo tridimensional generado en la
etapa (a).
18. El procedimiento de la reivindicación 14,
que además comprende las etapas de:
(c) obtener o sintetizar el agente así diseñado;
y
(d) poner en contacto el agente con la proteína
o péptido de unión a APP con el fin de determinar el efecto que
tiene el agente en la proteína o péptido de unión a APP.
19. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que la proteína o péptido de unión a APP es BACE.
20. El procedimiento de la reivindicación 19,
en el que el agente es un inhibidor potencial de la unión entre
BACE y APP.
21. El procedimiento de la reivindicación 20,
que además comprende las etapas de: (c) obtener o sintetizar el
agente así diseñado; y (d) poner en contacto el agente con BACE en
presencia de APP.
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Families Citing this family (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5773500A (en) * | 1999-06-28 | 2001-01-31 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The | Inhibitors of memapsin 2 and use thereof |
| US7217556B1 (en) | 2000-12-23 | 2007-05-15 | Pfizer Inc | Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in Alzheimer's disease |
| US7806980B2 (en) | 2000-12-23 | 2010-10-05 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Method for crystallizing human beta secretase in complex with an inhibitor |
| US7601528B1 (en) | 2000-12-23 | 2009-10-13 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Crystallization and structure determination of glycosylated human beta secretase, an enzyme implicated in alzheimer's disease |
| US20040121947A1 (en) * | 2000-12-28 | 2004-06-24 | Oklahoma Medical Research Foundation | Compounds which inhibit beta-secretase activity and methods of use thereof |
| US7384773B1 (en) * | 2001-05-10 | 2008-06-10 | Pfizer Inc | Crystal of HIV protease-cleaved human beta secretase and method for crystallization thereof |
| US7524668B1 (en) | 2001-05-10 | 2009-04-28 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Crystal of human beta secretase having monoclinic space group symmetry C2 and methods for crystallization thereof |
| AU2002359301B2 (en) * | 2001-10-23 | 2008-07-03 | Comentis, Inc. | Beta-secretase inhibitors and methods of use |
| US20060234944A1 (en) * | 2001-10-23 | 2006-10-19 | Oklahoma Medical Reseach Foundation | Beta-secretase inhibitors and methods of use |
| CH698246B1 (de) * | 2001-12-20 | 2009-06-30 | Hoffmann La Roche | Test zur Identifizierung von Inhibitoren von Beta-Sekretasen. |
| US20040014194A1 (en) * | 2002-03-27 | 2004-01-22 | Schering Corporation | Beta-secretase crystals and methods for preparing and using the same |
| US7442537B1 (en) | 2002-05-10 | 2008-10-28 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Crystals of unliganded beta secretase and/or beta secretase-like proteins and the use thereof |
| US7166454B1 (en) * | 2002-05-24 | 2007-01-23 | Schering Corporation | Codon-optimized β-secretase and methods of refolding and processing |
| AU2003251344A1 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-16 | Astex Technology Limited | Crystal structure of beta-site app-cleaving enzyme (bace) mutants and uses thereof |
| WO2004035606A2 (en) * | 2002-10-15 | 2004-04-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Bace binding peptides and uses thereof |
| PL376770A1 (pl) | 2002-10-16 | 2006-01-09 | Isis Innovation Limited | Hydroksylazy asparaginylowe i ich modulatory |
| WO2006081171A1 (en) * | 2005-01-24 | 2006-08-03 | Amgen Inc. | Humanized anti-amyloid antibody |
| CN101142194B (zh) * | 2005-03-14 | 2012-10-10 | 顶点制药有限责任公司 | 吲哚衍生物，组合物及用作β-分泌酶抑制剂的方法 |
| AU2006279896A1 (en) * | 2005-08-10 | 2007-02-22 | Oklahoma Medical Research Foundation | Truncated memapsin 2 for use for treating Alzheimer's disease |
| TW200815349A (en) | 2006-06-22 | 2008-04-01 | Astrazeneca Ab | New compounds |
| AU2008343855B2 (en) | 2007-12-21 | 2013-08-15 | Amgen Inc. | Anti-amyloid antibodies and uses thereof |
| TW201020244A (en) | 2008-11-14 | 2010-06-01 | Astrazeneca Ab | New compounds |
| EP2281824A1 (en) | 2009-08-07 | 2011-02-09 | Noscira, S.A. | Furan-imidazolone derivatives, for the treatment of cognitive, neurodegenerative or neuronal diseases or disorders |
| TW201300417A (zh) | 2010-11-10 | 2013-01-01 | Genentech Inc | 用於神經疾病免疫療法之方法及組合物 |
| JP2013542973A (ja) | 2010-11-22 | 2013-11-28 | ノスシラ、ソシエダッド、アノニマ | 神経変性疾患または神経変性状態を治療するためのビピリジンスルホンアミド誘導体 |
| WO2015109275A1 (en) * | 2014-01-20 | 2015-07-23 | New York University | Atomic model for janus kinase-2 (jak2) and uses thereof |
| EP3845565A3 (en) | 2014-11-19 | 2021-09-08 | Genentech, Inc. | Antibodies against bace1 and use thereof for neural disease immunotherapy |
| CN107250158B (zh) | 2014-11-19 | 2022-03-25 | 基因泰克公司 | 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5331573A (en) * | 1990-12-14 | 1994-07-19 | Balaji Vitukudi N | Method of design of compounds that mimic conformational features of selected peptides |
| JPH11507538A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-07-06 | アテナ ニューロサイエンシズ インコーポレイティド | β−セクレターゼ、β−セクレターゼに対する抗体、及びβ−セクレターゼ阻害を検出するためのアッセイ |
| GB9626022D0 (en) | 1996-12-14 | 1997-01-29 | Smithkline Beecham Plc | Novel compounds |
| EP0848062A3 (en) | 1996-12-14 | 2000-07-05 | Smithkline Beecham Corporation | Aspartic protease ASP1 |
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