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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein menschliches Proinsulinderivat,
eine kodierende DNA, einen DNA enthaltenden Expressionsvektor, einen
mit diesem transformierten Mikroorganismus und eine Verwendung dieses
menschlichen Proinsulins gemäß den Patentansprüchen.
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Insulin
ist ein Polypeptidhormon, das von den β-Zellen der Pankreas abgegeben
wird und an der Steuerung des Blutzuckerspiegels teilnimmt. Es besteht
aus zwei Peptidketten, d.h. der A- und der B-Kette, die an ihren
Cysteinresten über
Disulfidbrücken
verbunden sind, und es wird durch proteolytisches Verarbeiten von Proinsulin
in den β-Zellen
der Pankreas hergestellt (Insulin: Molecular Biology and Pathology,
Hg. Ashcroft, F. M. & Ashcroft,
S. J. H., IRL Press, Oxford, 1992). Kommerziell ist menschliches
Insulin entweder durch ein enzymatisches Verfahren hergestellt worden,
wobei ein Alaninrest an der Position Nr. 30 der B-Kette von Schweineinsulin
durch eine Transpeptidierungsreaktion unter Verwendung von Trypsin
durch einen Threoninrest ersetzt wurde (Markussen, J., Proceedings
ist International Symposium "Neue
Insuline", S. 38-44
(1982), Hg. Petersen, K. G. et al., Freiburger Graphische Betriebe,
Freiburg); oder durch ein Verfahren, bei dem genetisch veränderte E.
coli verwendet wird (Chance, R. E. et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function,
S. 721-728 (1981), in Proceedings of the Seventh American Peptide
Symposium, Hg. Rich, D. H. & Gross,
E., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.; und Frank, B. H.
et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, S. 729-738 (1981),
in Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Hg. Rich,
D. H. & Gross,
E., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.) oder Saccharomyces
cerevisiae (Thim, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83,
S. 6766-6770 (1986); und Markussen, J. et al., Protein Engineering,
1, S. 205-213 (1987)). Da das enzymatische Verfahren zur Herstellung
von menschlichem Insulin aus Schweineinsulin wegen seiner hohen
Kosten beschränkt
ist, haben sich neuere Untersuchungen auf Verfahren zur Herstellung
von menschlichem Insulin durch Gentechnologie-Verfahren konzentriert.
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Chance
et al. haben von einem Verfahren berichtet, bei dem Insulin dadurch
hergestellt wird, daß sowohl
die A- als auch die B-Kette
von Insulin in Form eines Fusionsproteins durch Züchten von
E. coli hergestellt wird, das einen Vektor umfaßt, der eine das Fusionsprotein
kodierende DNA enthält;
Spalten des Fusionsproteins mit Bromcyan, wodurch die A- und B-Ketten
erhalten werden; Sulfonieren der A- und B-Ketten, wodurch sulfonierte
Ketten erhalten werden; Umsetzen der sulfonierten B-Kette mit einem Überschuß der sulfonierten A-Kette
und dann Reinigen des entstandenen Produkts, wodurch Insulin erhalten
wird (Chance, R.E. et al., supra). Dieses Verfahren weist jedoch
insofern Nachteile auf, daß es
umständlich
ist, zwei Fermentationsverfahren zu betreiben, und daß die Reaktion
der sulfonierten A- und B-Ketten nur eine geringe Ausbeute an Insulin
ergibt, was das Verfahren an sich unpraktisch macht.
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Frank
et al. haben von einem Verfahren zur Herstellung von Insulin berichtet,
das die folgenden Schritte umfaßt:
Herstellen von Proinsulin in der Form eines Fusionsproteins durch
Züchten
von E. coli, die einen Vektor aufweist, der eine ein Fusionsprotein
kodierende DNA enthält;
Schneiden des Fusionsproteins mit Bromcyan, wodurch Proinsulin erhalten
wird; Sulfonieren von Proinsulin und Abtrennen des sulfonierten
Proinsulins; Rückfalten
des sulfonierten Proinsulins zur Bildung der korrekten Disulfidbindungen;
Behandeln des rückgefalteten
Proinsulins mit Trypsin und Carboxypeptidase B; und dann Reinigen
des erhaltenen Produkts, wodurch Insulin erhalten wird (Frank et
al., supra). Die Ausbeute an rückgefaltetem
Proinsulin mit den korrekten Disulfidbindungen nimmt jedoch stark
ab, wenn die Konzentration an Proinsulin zunimmt. Diese Tatsache wird
durch Fehlfaltung und ein gewisses Maß an Polymerisation bewirkt,
so daß das
Verfahren den Nachteil mit sich bringt, daß während der Gewinnung von Proinsulin
arbeitsaufwendige Reinigungsschritte durchgeführt werden müssen.
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Thim
et al. haben von einem Verfahren zur Herstellung von Insulin in
Saccharomyces cerevisiae berichtet, das die Schritte umfaßt: Herstellen
eines einkettigen Insulinanalogs mit einer bestimmten Aminosäurensequenz
durch Züchten
von Saccharomyces cerevisiae-Zellen
und Isolieren des Insulins davon durch eine Reihe von Schritten,
d.h. eine Reinigung, Enzymumsetzung, Säurehydrolyse und eine weitere
Reinigung (Thim, L. et al., supra). Obwohl dieses Verfahren deshalb
vorteilhaft ist, daß die
Reinigungsschritte relativ einfach sind und kein Rückfaltungsverfahren
notwendig ist, ergibt es wegen des per se geringen Expressionsgrades
eines Hefesystems im Vergleich zu E. coli ebenfalls nur eine geringe
Insulinausbeute.
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Die
EP 55 945 A2 offenbart
ein Proinsulin-Derivat, in dem die Insulin-A- und -B-Ketten über eine
kurze Peptidkette mit der Sequenz Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg anstelle
des C-Peptids von Proinsulin verbunden sind. Diese Peptidkette weist
keine β-Schleifenstruktur
auf. Die
DE 39 19 852 beschreibt
ein Prolinsulin-Derivat, das anstelle des C-Peptids eine einzige
Aminosäure,
nämlich
Arg, aufweist.
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Die
Rolle des C-Peptids bei der Faltung von Proinsulin ist nicht genau
bekannt. In einem Biochemie-Lehrbuch wird beschrieben, daß das C-Peptid
für das
Faltungsverfahren notwendig ist (Biochemistry, 3. Ausgabe, S. 41
(1988), Freeman), andere Untersuchungen haben aber gezeigt, daß etwa 30
bis 50% korrekt gefaltetes Insulin erhalten werden können, wenn
die A- und B-Ketten
allein in Abwesenheit des C-Peptids in sehr geringen Konzentrationen
verwendet werden (Katsoyannis, P. G. et al., Biochemistry, 6. S.
2642-2635 (1967); und Chance, R. E. et al., supra). Es ist auch
gezeigt worden, daß bei
Verwendung eines Peptids bei dem die A- und B-Ketten direkt miteinander
verbunden sind, eine sehr hohe Ausbeute an korrekt gefaltetem Produkt
erhalten werden kann, die mit der Ausbeute vergleichbar ist, die
unter Verwendung von Proinsulin erreicht werden kann (Steiner, D.
F. & Clark, J.
L., Proc Natl Acad Sci U. S. A., 60, S. 622-629 (1968); und Varandani,
P. T. & Nafz,
M. A., Arch. Biochem. Biophys., 141, S. 533-537 (1970)). Diese Ergebnisse
deuten an, daß die
Rolle des C-Peptids einfach darin besteht, die A- und B-Ketten nahe zusammen
zu bringen, um so das Faltverfahren zu vereinfachen.
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Gemäß den bekannten
dreidimensionalen Strukturen von Insulinen in der Brookhaven Datenbank
beträgt
der Abstand zwischen dem α-Kohlenstoffatom am
C-Terminus der B-Kette (Thr-30) und dem α-Kohlenstoffatom am N-Terminus der A-Kette
(Gly-1) etwa 0,5 bis 1,1 nm, was einen geeigneten Abstand für den Einschub
einer β-Schleifenstruktur
darstellt. Es ist schon seit längerem
anerkannt, daß bestimmte
Aminosäurensequenzen
mit hoher Wahrscheinlichkeit Teil einer Schleifenkonformation in
Proteinen sind (Chou, P. Y. & Fasman,
G. O., J. Mol. Biol., 115, 135-175 (1977)), und es ist in jüngerer Zeit
gezeigt worden, daß dies
auch für Peptide
in wäßriger Lösung gilt
(Dyson, H. J. et al., J. Mol. Biol., 201, 161-200 (1988); und Shin,
H. C. et al., Biochemistry, 32, 6348-6355 (1993)). Es wurde gefunden,
daß Prolin
in der zweiten Position und Glycin in der dritten Position die höchste β-Schleifenpopulation
ergeben, und eine umfangreiche Untersuchung zeigte, daß die Art
der Aminosäuren
an Position 4 die Stabilität
der β-Schleife
in der trans Position beeinflußt,
und es wird eine deprotonierte Asp 4 Seitenkette bevorzugt (Wright,
P. E. et al., Biochemistry, 27, 7167-7175 (1988); und Dyson, H.
J. et al., supra).
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β-Schleifen
sind wahrscheinliche Stellen für
den Start einer Proteinfaltung und da sie durch kurze Wechselwirkungen
bestimmt werden, beschränken
sie den für
die Polypeptidkette verfügbaren
Konformationsraum, und sie können
dadurch zur Steuerung nachfolgender Faltungen beitragen, daß sie entferntere
Teile der Polypeptidkette zusammenbringen (Zimmerman, S. S. & Scheraga, H.
A., Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A., 74, 4126-4129 (1977); und Wright,
P. E. et al., supra). Es ist auch bekannt, daß diese β-Schleifen eine wichtige Rolle bei enzymatischen
Spaltungen spielen.
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Trypsin
ist eine typische Serinprotease und hydrolysiert ein Protein oder
ein Peptid an dem Carboxy-Terminus eines Arginin- oder Lysinrests (Enzymes, S. 261-262
(1979), Hg. Dixon, M. & Webb,
E. C., Longman Group Ltd., London). Insbesondere kommt an einer
dibasischen Stelle, an der zwei aufeinanderfolgende Arginin- oder
Lysinreste existieren, leicht eine Hydrolyse vor, und es ist bekannt,
daß diese
Hydrolyse am ehesten dort stattfindet, wo die dibasische Stelle
in oder neben einer β-Schleifenstruktur
angeordnet ist (Rholam, M et al., FEBS Lett., 207, 1-6 (1986)).
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Wie
vorstehend beschrieben, besteht ein Bedarf an Verfahren mit hohen
Ausbeuten zur Herstellung von menschlichem Insulin in einem Mikroorganismus,
und die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben es unternommen,
ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Insulin zu entwickeln
und haben ein Verfahren mit hoher Ausbeute gefunden, wobei ein Proinsulinderivat
mit einem geringen Molekulargewicht und einer leicht hydrolysierbaren β-Schleifenstruktur
verwendet wird.
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Demgemäß ist es
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein menschliches Proinsulinderivat,
das eine hohe Faltungsausbeute aufweist und leicht hydrolysierbar
ist, und eine dieses Derivat kodierende DNA bereitzustellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Expressionsvektor
zur Expression von menschlichem Proinsulin bereitzustellen, der
die DNA umfaßt.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen mit dem
Expressionsvektor transformierten Mikroorganismus bereitzustellen.
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Es
ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Herstellung von menschlichem Insulin bereitzustellen, das das
Züchten
des transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten. Medium,
wodurch menschliches Proinsulin hergestellt wird, das Abtrennen
des menschlichen Proinsulins davon und Herstellen von menschlichem
Insulin aus dem Proinsulin umfaßt.
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Die
vorstehenden und andere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung
werden durch die folgende Beschreibung der Erfindung zusammen mit
den beigefügten
Zeichnungen klarer, von denen:
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1 ein
schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT7-T1 und pT7-T2
darstellt;
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2 ein
schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT1-hPI und
pT2-hPI darstellt;
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3 ein
schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT1-M1PI, pT1-M2PI,
pT1-M3PI und pT1-M4PI darstellt;
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4 ein
schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT2-M1PI, pT2-M2PI,
pT2-M3PI und pT2-M4PI darstellt;
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5 die
HPLC-Chromatogramme von rückgefalteten
M1PI, M2PI, M3PI, M4PI und hPI darstellt; und
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6 die
HPLC-Chromatogramme von durch Hydrolyse von rückgefalteten Miniproinsulinen
(MiPIs) und hPI gebildeten Insulinen darstellt.
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Alle
hierin zitierten Referenzen werden hiermit unter Bezugnahme auf
ihren gesamten Inhalt aufgenommen.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein menschliches Proinsulinderivat der Formel (I)
bereitgestellt, das nachstehend als "Miniproinsulin" bezeichnet wird, worin ein Peptid,
das aus maximal 12 Aminosäuren
besteht und eine feste β-Schleifenstruktur
bildet, anstelle des aus 35 Aminosäuren bestehenden C-Peptids zwischen
die A- und B-Ketten von menschlichem Insulin eingeführt wird: B-Kette-Z-A-Kette (I)worin Z
ein Peptid der Formel U-U-X-P-J-(X')n-U-U ist,
U ein Arginin- oder
Lysinrest ist;
X und X' unabhängig voneinander
Aminosäurereste
sind und
(X')n
n unterschiedliche oder gleiche Aminosäurereste sein kann;
P
ein Prolinrest ist;
J ein Glycin-, Arginin- oder Lysinrest
ist; und
n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
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Bevorzugte
Miniproinsuline sind diejenigen, worin X ein Alanin, Tyrosin-, Histidin-
oder Glycinrest ist; X' ein
Asparaginsäure-,
Valin-, Arginin- oder Glycinrest ist; und n 0 oder 2 ist. Beispielhafte
bevorzugte Miniproinsuline sind diejenigen, worin Z Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ
ID NR: 1); Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ
ID NR: 2); Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NR: 3) oder Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ
ID NR: 4) ist.
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Das
Miniproinsulin der vorliegenden Erfindung kann selbst oder in Form
eines Fusionsproteins hergestellt werden, worin es mit einem Fusionspartnerprotein,
vorzugsweise einem eine β-Struktur
bildenden Protein fusioniert wird.
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Beispielhafte
Fusionspartnerproteine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können, umfassen
den gesamten menschlichen Tumornekrose-Faktor (TNF) oder Teile davon
mit der nachstehend gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 5),
den gesamten mutierten TNF oder Teile davon, worin einige der Aminosäuren in
SEQ ID NR: 5 durch andere Aminosäuren
ersetzt worden sind, und diejenigen Polypeptide, worin 1 bis 7 vorzugsweise
7, Aminosäuren
von dem N-Terminus von TNF entfernt worden sind
Val Arg Ser
Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn
Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala
Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln
Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile
Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser
Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr
Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg
Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser
Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
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Eine
menschlichen TNF oder einen mutierten TNF kodierende DNA kann chemisch
unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers oder über eine Polymerase-Kettenreaktion
("PCR") hergestellt werden
(Saiki, K. K. et al., Science, 230, S. 1350-1354 (1985)), wobei
menschliche TNF cDNA als Matrize und geeignete, chemisch hergestellte
Primer verwendet werden.
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Die
einen Teil oder den gesamten mutierten TNF kodierende DNA kann z.B.
durch folgende Schritte hergestellt werden: Gewinnen von menschlicher
TNF DNA durch PCR einer aus einer U937-Zellinie hergestellten menschlichen
Monocyten cDNA-Bibiothek (Clontech, U.S.A.); und Durchführen einer
anderen PCR durch Verwendung der TNF DNA als Matrize und von chemisch
hergestellten Primern, d.h. einem Sinn Primer, der eine Erkennungsstelle
für ein
Restriktionsenzym und modifizierte Nucleotidsequenzen an seinem 5'-Ende aufweist, und
einem Antisinn Primer, der eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym
an seinem 5'-Ende
aufweist.
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Das
Miniproinsulin der vorliegenden Erfindung kann chemisch mit einem
Peptidsynthesizer gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren oder unter Verwendung eines üblichen gentechnischen Verfahrens
in einem Mikroorganismus hergestellt werden.
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Zur
Herstellung eines Miniproinsulins in einem Mikroorganismus wird
eine kompatible Wirtszelle, z.B. eine E. coli oder Saccharomyces
cerevisiae-Zelle mit einem Expressionsvektor transformiert, der
eine das Miniproinsulin allein kodierende DNA, oder eine fusionierte
DNA enthält,
die ein aus einem Fusionspartnerprotein und dem Miniproinsulin bestehendes
Fusionsprotein kodiert; und die transformierte Zelle wird unter
Bedingungen gezüchtet,
die die Expression des Miniproinsulins ermöglicht. Dann wird das hergestellte
Miniproinsulin rückgefaltet,
durch eine Proteinase hydrolysiert und zum Erhalten von menschlichem
Insulin gereinigt.
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Demgemäß wird durch
die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Miniproinsulins in
einem Verfahren zur Herstellung von Insulin bereitgestellt, das
die folgenden Schritte umfaßt:
Herstellen einer ein Miniproinsulin kodierenden DNA; Einführen der
DNA allein oder zusammen mit einer ein Fusionspartnerprotein kodierenden
DNA in einen geeignten Vektor, um einen Expressionsvektor zur Expression
des Miniproinsulins herzustellen; Transformieren einer Wirtszelle
mit dem Expressionsvektor; Züchten
der entstandenen Transformante unter Bedingungen, die die Expression
des Miniproinsulins ermöglichen,
Trennen des Miniproinsulins von der Kultur und Herstellen von Insulin
aus dem Miniproinsulin.
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Ein
Expressionsvektorsystem kann durch Einführen der das Miniproinsulin
allein kodierenden DNA oder durch aufeinanderfolgendes Einführen der
das Fusionspartnerprotein und das Miniproinsulin kodierenden DNAs
in einen Vektor hergestellt werden, der einen geeigneten Promotor,
z.B. lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40 und 1(pL/pR) enthält; oder
durch Ligieren der das Miniproinsulin oder das Fusionsprotein kodierenden DNA
mit einer DNA, die einen dieser Promotoren und einen Ribosomen bindenden
Bereich enthält,
gefolgt von Einführen
der ligierten DNA in ein geeignetes Plasmid, z.B. pBR322.
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Die
vorstehend hergestellten Expressionsvektoren können gemäß üblicher Verfahren, z.B. des
Verfahrens von Cohen, wie in Proc. Natl Acad Sci U. S. A., 69, 2110
(1972) beschrieben, in eine geeignete Wirtszelle, z.B. E. coli eingeführt werden,
die unter Berücksichtigung
einer Anzahl von auf dem Fachgebiet wohlbekannten Faktoren ausgewählt wird,
z.B. der Kompatibilität
mit dem ausgewählten
Vektor, der Leichtigkeit, das gewünschte Polypeptid zu gewinnen,
der Polypeptideigenschaften, der biologischen Sicherheit und der
Kosten, wodurch eine transformierte E. coli-Zelle erhalten wird.
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Zwei
derartige Transformanten wurden als E. coli BL21 (DE3 + pT1M1PI)
und E. coli BL21 (DE3 + pT2M2PI) bezeichnet und am 29. Dezember
1994 bei dem Korean Culture Center of Microorganism (KCCM) (Adresse:
Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University,
Sodaemun-gu, Seoul 120-749, Korea) mit den Hinterlegungsnummern
KCCM-10059 bzw. KCCM-10060 unter den Bedingungen des Budapester
Vertrages über
die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die
Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.
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Die
transformierten Zellen werden unter Bedingungen gezüchtet, die
die Expression des Miniproinsulins ermöglichen.
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Die
in einer Wirtszelle hergestellten Polypeptide können isoliert werden und das
gewünschte
Miniproinsulin kann davon durch die kombinierte Verwendung von üblichen
Verfahren, z.B. der Zellzerstörung,
Zentrifugation, Sulfitolyse, Dialyse, Behandlung mit Bromcyan und
HPLC getrennt werden.
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Insbesondere
kann das in E. coli in Form eines das Fusionsprotein umfassenden
Einschlußkörpers hergestellte
Miniproinsulin durch die folgenden Verfahren gereinigt werden.
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Die
Zellen in der Kultur werden durch Ultraschall zerstört, und
die das Fusionsprotein enthaltenden Einschlußkörper durch Zentrifugation gesammelt.
Die Einschlußkörper werden
in einem geeigneten Lösungsmittel,
z.B. 6M Guanidin-HCl gelöst;
die -SH-Gruppen
der Cysteinreste in dem Protein werden durch Sulfitolyse in -SSO3-Gruppen überführt, und die Proteine werden
dann durch Dialyse oder Gelfiltrationschromatographie ausgefällt. Die
ausgefällten
Proteine werden durch Zentrifugation gesammelt und mehrfach mit
einer wäßrigen Lösung gewaschen.
Das entstandene Protein wird mit Bromcyan behandelt, und das erhaltene
Produkt durch HPLC gereinigt, wodurch das Miniproinsulin erhalten
wird.
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Das
Miniproinsulin wird dann zur Rückfaltung
mit β-Mercaptoethanol
behandelt, und das rückgefaltete Miniproinsulin
wird mit Trypsin und Carboxypeptidase B vorzugsweise in solchen
Mengen behandelt, daß Gewichtsverhältnisse
von Trypsin:Carboxypeptidase B:Miniproinsulin von 1:5:12.500 eingestellt
werden, so daß Insulin
erhalten wird.
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Wie
vorstehend beschrieben, wurde es durch die vorliegende Erfindung
möglich,
die Ausbeute an menschlichem Insulin gegenüber dem Stand der Technik durch
Expression eines menschlichen Miniproinsulins zu verbessern, wobei
anstelle des sperrigen C-Peptids in Proinsulin ein kurzes Peptid
zwischen die A- und B-Ketten von menschlichem Insulin eingeführt wird.
Das kurze Peptid besteht aus nur 7 bis 12, vorzugsweise 9, Aminosäuren, ist
aber dazu fähig,
eine festere β-Schleifenstruktur
auszubilden als das C-Peptid.
Die Verfahren der Rückfaltung
und Hydrolyse können
daher mit dem Miniproinsulin effizienter durchgeführt werden als
mit dem Proinsulin.
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Die
folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern, ohne
ihren Umfang zu beschränken.
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Die
nachstehend für
Fest-in-fest-, Flüssig-in-flüssig- und
Fest-in-flüssig-Mischungen
angegebenen Prozentsätze
beziehen sich auf eine G/G-, V/V- bzw. G/V-Basis, wenn nicht anders
angegeben.
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PCRs
werden in den Beispielen gemäß dem üblichen
in Saiki, K.K. et al., supra, beschriebenen PCR-Verfahren durchgeführt.
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Beispiel 1: Herstellung
des Plasmids pT7-T150
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<Schritt 1> Herstellung von TNF DNA
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Zum
Erhalten einer TNF DNA wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
gemäß dem Verfahren von
Saiki, K. K. et al., supra, unter Verwendung einer menschlichen
Monocyten cDNA-Bibliothek (Clontech. U.S.A.), die aus einer U937-Zellinie
hergestellt worden war, als Matrize und von P1-Primern mit den folgenden Nucleotidsequenzen
durchgeführt:
Primer
P1
Sinn Primer (SEQ ID NR: 6):
5'-GCCATACATA TGGTCAGATC ATCTTCTCGA ACC-3'
Antisinn Primer
(SEQ ID NR: 7)
3'-TGAAA
CCCTAGTAAC GGGACACTAT TCCTAGGTGT-5'
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<Schritt 2> Herstellung des eine DNA für ein mutiertes
TNF enthaltenden Plamids pT7-T150
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Um
eine DNA für
mutiertes TNF zu erhalten, wurden eine Reihe von PCRs durchgeführt, wobei
die in <Schritt
1> hergestellte TNF
DNA als Matrize und P2 und P3 Primer mit den folgenden Nucleotidsequenzen verwendet
wurden:
Primer P2 (der die gewünschte Nucleotid-Substitution
umfaßt)
Sinn
Primer (SEQ ID NR: 8):
5'-GTGGTGCCAA
TAGAGGGCCT GTTCCTCATC TAC-3'
Antisinn
Primer (SEQ ID NR: 9):
3'-CAC
CACGGTTATC TCCCGGACAA GGAGTAGATG-5'
Primer P3 (komplementär zu den
5' – und 3' -Enden der TNF DNA)
Sinn
Primer (SEQ ID NR: 10):
5'-ATACATATGC
CGAGTGACAA GCCTGTA-3'
Antisinn
Primer (SEQ ID NR: 11):
3'-A
TGAAACCCTA GTAACGGGCC CCTAGGTACA-5'.
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Die
erste PCR wurde unter Verwendung der in <Schritt 1> hergestellten TNF DNA als Matrize, eines P2
Sinn Primers und eines P3 Antisinn Primers durchgeführt, und
die zweite PCR wurde nach demselben Verfahren wie bei der ersten
PCR durchgeführt,
außer
daß ein
P2 Antisinn Primer und ein P3 Sinn Primer verwendet wurden. Die
beiden entstandenen PCR-Produkte wurden gemischt und dann annealt.
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Dann
wurde die DNA für
das mutierte TNF durch PCR unter Verwendung eines P3 Sinn Primers
mit einer NdeI-Erkennungsstelle an seinem 5'-Ende und eines P3 Antisinn Primers
mit SmaI- und BamHI-Erkennungsstellen
an seinem 3'-Ende
amplifiziert. Das entstandene PCR-Produkt, das T150 genannt wurde,
kodiert ein mutiertes TNF, worin 7 Aminosäuren von dem N-Terminus von
TNF entfernt worden waren, und Serin an der 52. Position, Tyrosin
an der 56. Position und Leucin an der 157. Position des TNF durch
Isoleucin, Phenylalanin bzw. Argirin ersetzt worden waren.
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T150
wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann unter Verwendung von T4
DNA-Ligase an die NdeI/BamHI-Stelle eines Vektors ligiert, der durch
Verdauen von Plasmid pT7-7 (Department of Biological Chemistry,
Harvard Medical School) mit NdeI und BamHI hergestellt worden war.
Das entstandene Plasmid wurde als pT7-T150 bezeichnet.
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Beispiel 2: Herstellung
des Plasmids pT7-T1
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Eine
PCR wurde unter Verwendung der in <Schritt
1> hergestellten TNF
DNA als Matrize, von P3 als Sinn Primer und einem Antisinn Primer
mit der folgenden Nucleotid-Sequenz durchgeführt:
Antisinn Primer (SEQ
ID NR: 12):
3'-G
ACATGGAGTA GATGAGGGCC CCTAGGTACA-5'
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Das
entstandene PCR-Produkt, das T1 genannt wurde, kodiert ein mutiertes
TNF, worin 7 Aminosäuren
von dem N-Terminus von TNF entfernt worden waren, und Serin an der
52. Position und Glutamin an der 61. Position durch Isoleucin bzw.
Arginin ersetzt worden waren.
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T1
wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann unter Verwendung einer
T4 DNA-Ligase an die NdeI/BamHI-Stelle eines Vektors ligiert, der
durch Verdauen des Plasmids pT7-7 mit NdeI und BamHI hergestellt
worden war. Das entstandene Plasmid wurde als pT7-T1 bezeichnet,
und sein Herstellungsverfahren wird in 1 gezeigt.
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Beispiel 3: Herstellung
des Plasmids pT7-T2
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Es
wurde ein ein Polypeptid kodierendes synthetisches Polynucleotid
T2 hergestellt. Das Polypeptid enthält die B. bis 12. Aminosäuren des
N-Terminus von TNF und auch zehn Histidinreste, die seine Reinigung erleichtern.
Die folgende Aminosäure-Sequenz
wird in T2 kodiert (SEQ ID NR: 13):
H2N-Pro
Ser Asp Lys Pro His His His His His His His His His His Ser Ser-COOH
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Es
wurde eine PCR unter Verwendung der Primer T20-I, T20-II und T20-III
in einem Verhältnis
von 10:1:10 durchgeführt,
wodurch eine das Polynucleotid T2 umfassende und NdeI- und BamHI-Erkennungsstellen
an ihren 5'- bzw.
3'-Enden aufweisende
DNA erhalten wurde:
T20-I (Sinn Primer; SEQ ID NR: 14):
5'-TATACATATG CCGAGTGACA
AGCCT-3'
T20-II
(Sinn Primer; SEQ ID NR: 15):
5'-AGTGACAAGC CTCATCATCA TCATCATCAT CATCATCATC
ACAGCAG-3'
T20-III
(Antisinn Primer; SEQ ID NR: 16):
3'-TAGT AGTGTCGTCG CCTAGGTACA-5'
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Das
entstandene PCR-Produkt wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann
unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase mit einem mit NdeI/BamHI behandelten
Plasmid pT7-7 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pT7-T2
bezeichnet, und sein Herstellungsverfahren wird in 1 gezeigt.
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Beispiel 4: Herstellung
des Plasmids pT150-hPI
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<Schritt 1> Herstellung von menschlicher Proinsulin
DNA
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Auf
der Basis der Information über
die Aminosäuren-Sequenz
von menschlichem Proinsulin (Ullrich, A. et al., Science, 612-615
(1980)) wurde eine synthetische, menschliches Proinsulin kodierende
DNA, die die folgende Nucleotid-Sequenz (SEQ ID NR: 17) aufweist,
unter Verwendung der in E. coli in hohem Maße bevorzugten Kodone hergestellt,
um die Expressionsrate der DNA zu steigern:
5' -TTC GTT AAT CAG
CAC CTG TGC GGC TCT CAC CTG GTA GAA GCT CTG TAC CTG GTT TGC GGT GAA
CGT GGT TTT TTC TAC ACC CCG AAA ACC CGT CGC GAG GCT GAA GAC CTG
CAG GTA GGT CAG GTT GAA CTG GGC GGT GGT CCG GGT GCA GGC TCT CTG
CAG CCG TTG GCG CTG GAA GGT TCC CTG CAG AAA CGT GGC ATC GTT GAA
CAA TGC TGT ACT AGC ATC TGC TCT CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAT TGT
AAC-3'
-
Insbesondere
wurden Oligonucleotide mit den folgenden Nucleotid-Sequenzen zur Verwendung
bei der Herstellung eines Proinsulingens unter Einsatz eines automatischen
ABI DNA-Synthetisierers (Modell 392) hergestellt, wobei das Festphasen-Phosphit-Syntheseverfahren
verwendet wurde:
pTA (SEQ ID NR. 18):
3'-GATCATGT CGTAACAAGT
TGCTACGGTG CAAAGACGTC CCTTGGAAG GTCGCGGTTGC CGACGTCTCT-5'
pTB (SEQ ID
NR: 19):
5 ' -AAGCTTTTAC
TAGTTACAAT AGTTCTCCAG CTGGTAGAGA GAGCAGATGC TAGTACAGCA TTGTTCAA-3'
pTC (SEQ ID
NR: 20):
3'-ACGTC
CAGAAGTCGG AGCGCTGCCC AAAAGCCCCA CATCTTTTTT GGTGCAAGTG GCGTTTGGTC-5'
pTD (SEQ ID
NR: 21):
5'-CAGAGAGCCT
GCACCCGGAC CACCGCCCAG TTCAACCTGA CCTACCTGCA GGTCTTCAGC CTCGC-3'
pTE (SEQ ID
NR: 22):
5'-CATGTTCGTT
AATCAGCACC TGTGCGGCTC TCACCTGGTA GAAGCTCTGT ACCTGGTTTG CGGTGAAC-3'
p31 (SEQ ID
NR: 23): 5'-GTACCTGGTT
TGCGGTGAAC GTGGT-3'
p112
(SEQ ID NR: 24): 3'-TAAC
ATTGATCATT TTCGAAGCAT-5'
pBAM
(SEQ ID NR: 25): 5'-GCAGGATCCA
TGTTCGTTAA T-3'
pHIN
(SEQ ID NR: 26): 3'-ATAA
CATTGATCAT TTTCGAAACG-5'
p71
(SEQ ID NR: 27): 5'-GGTGCAGGCT
CTCTGCAGCC GTTGG-3'
p72
(SEQ ID NR: 28): 3'-CCGAG
AGACGTCGGC AACCGCGACC-5'
-
Ein
DNA-Fragment wurde durch die PCR unter Verwendung der Oligonucleotide
pTA und pTB als Matrizen und der Oligonucleotide p71 und p112 als
Primer hergestellt und als Fragment pAB bezeichnet. Ein anderes
Fragment, das als Fragment pCD bezeichnet wurde, wurde ebenfalls
nach demselben Verfahren unter Verwendung der Oligonucleotide pTC
und pTD als Matrizen und der Oligonucleotide p31 und p72 als Primer hergestellt.
Gleiche Mengen der Fragmente pAB und pCD wurden gemischt und dann
annealt. Ein drittes Fragment, das als Fragment pABCD bezeichnet
wurde, wurde dann durch PCR hergestellt, wobei das annealte Oligonucleotid
als Matrize und die Oligonucleotide p31 und p112 als Primer verwendet
wurden.
-
Außerdem wurden
gleiche Mengen des Fragments pABCD und des Oligonucleotids pTE gemischt
und dann annealt. Es wurde eine das gesamte menschliche Proinsulin
kodierende DNA durch PCR hergestellt, wobei das annealte Oligonucleotid
als Matrize und die Oligonucleotide pBAM und pHIN als Primer verwendet
wurden.
-
<Schritt 2> Herstellung des Plasmids pT150-hPI
-
Die
in <Schritt 1> erhaltene DNA für das menschliche
Proinsulin wurde mit BamHI und HindIII verdaut, wodurch eine doppelsträngige DNA
mit kohäsiven
Enden hergestellt wurde, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren
5'- bzw. 3'-Enden enthielt.
-
Das
in Beispiel 1 hergestellte Plasmid pT7-T150 wurde mit BamHI und
HindIII verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit
der mit BamHI/HindIII behandelten DNA für das menschliche Proinsulin, die
vorstehend erhalten wurde, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde
als Plasmid pT150-hPI bezeichnet.
-
Beispiel 5: Herstellung
des Plasmids pT1-hPI
-
Die
in <Schritt 1> von Beispiel 4 erhaltene
hPI DNA wurde mit BamHI und HindIII verdaut, wodurch eine doppelsträngige DNA
mit kohäsiven
Enden erhalten wurde, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren
5'- bzw. 3'-Enden enthielt.
-
Das
in Beispiel 2 hergestellte Plasmid pT7-T1 wurde mit BamHI und HindIII
verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit
BamHI/HindIII behandelten hPI DNA, die vorstehend erhalten worden
ist, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pT1-hPI bezeichnet
und sein Herstellungsverfahren wird in 2 gezeigt.
-
Beispiel 6: Herstellung
des Plasmids pT2-hPI
-
Die
in <Schritt 1> von Beispiel 4 erhaltene
hPI DNA wurde mit BamHI und HindIII verdaut, wodurch eine doppelsträngige DNA
mit kohäsiven
Enden erhalten wurde, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren
5'- bzw. 3'-Enden enthielt.
-
Das
in Beispiel 3 hergestellte Plasmid pT7-T2 wurde mit BamHI und HindIII
verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit
BamHI/HindIII behandelten hPI DNA, die vorstehend erhalten worden
war, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pT2-hPI bezeichnet,
und sein Herstellungsverfahren wird in 2 gezeigt.
-
Beispiel 7: Herstellung
des Plasmids pT1-MiPI
-
Miniproinsuline,
von denen jedes ein zwischen den A- und B-Ketten angeordnetes, eine β-Schleife
bildendes Peptid umfaßt,
kodierende DNAs wurden auf eine Weise hergestellt, daß die zweite
Aminosäure des Peptids
ein Prolinrest ist, von dem bekannt ist, daß er eine feste β-Schleifenstruktur
bewirkt (Dyson, H. J. et al., J. Mol. Biol., 201, S. 161-200 (1988)).
Das Peptid ist Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg
(SEQ ID NR: 1) (M1PI); Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NR: 2) (M2PI);
Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ
ID NR: 3) (M3PI); oder Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg (SEQ ID NR: 4) (M4PI).
-
Insbesondere
wurden unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthetisierers Primer mit den folgenden
Nucleotid-Sequenzen hergestellt:
Primer pBAM (SEQ ID NR: 25):
5'-GCAGGATCCA TGTTCGTTAA
T-3'
Primer
pHIN (SEQ ID NR: 26): 3'-ATAA
CATTGATCAT TTTCGAAACG-5'
Primer
psM1
Sinn Primer (SEQ ID NR: 29)
5'-GCTCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3'
Antisinn Primer
(SEQ ID NR: 30)
3'-TGG
GGCTTTTGGG CAGCGCGAGG CCCACTGCAA-5'
Primer psM2
Sinn Primer (SEQ
ID NR: 31)
5'-TACCCGGGTG
ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3'
Antisinn
Primer (SEQ ID NR: 32)
3'-TGG
GGCTTTTGGG CAGCGATGGG CCCACTGCAA-5'
Primer psM3
Sinn Primer (SEQ
ID NR: 33)
5'-CACCCGGGTG
ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3'
Antisinn
Primer (SEQ ID NR: 34)
3'-TGG
GGCTTTTGGG CAGCGGTGGG CCCACTGCAA-5'
Primer psM4
Sinn Primer (SEQ
ID NR: 35)
5'-GGTCCGGGTA
AACGTGGCAT CGTTGAACAA-3'
Antisinn
Primer (SEQ ID NR: 36)
3'-TGGGGCT
TTTGGGCAGC GCCAGGCCCA-5'
-
Eine
Miniproinsulin M1 kodierende DNA wurde wie folgt hergestellt. Ein
DNA-Fragment, das den 5'-Endbereich
enthält,
der Miniproinsulin 1("sM1-A") kodiert, wurde
durch PCR unter Verwendung des in Beispiel 4 hergestellten Proinsulingens
als Matrize und des Primers pBAM und des Antisinn Primers von psM1 hergestellt.
Ein DNA-Fragment, das den 3'-Endbereich
enthält,
der Miniproinsulin 1("sM1-B") kodiert, wurde ebenfalls
durch PCR unter Verwendung des in Beispiel 4 hergestellten Proinsulingens
als Matrize und des Primers pHIN und des Sinn Primers von psM1 hergestellt.
Gleiche Mengen von sM1-A und sM1-B wurden gemischt und rekombiniert.
Eine Miniproinsulin M1 kodierende DNA wurde durch PCR unter Verwendung
der rekombinierten DNA als Matrize und der Primer pBAM und pHIN
hergestellt.
-
Die
Miniproinsulin M1 DNA wurde mit BamHI und HindIII verdaut, um eine
doppelsträngige
DNA mit kohäsiven
Enden zu erhalten, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren
5'- bzw. 3'-Enden enthielt.
-
Das
in Beispiel 2 hergstellte Plasmid pT7-T1 wurde mit BamHI und HindIII
verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit
BamHI/HindIII behandelten Miniproinsulin M1 DNA, die vorstehend erhalten
worden war, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als Plasmid pT1-M1PI
bezeichnet.
-
Die
die Miniproinsuline M2, M3 bzw. M4 kodierenden DNAs wurden gemäß demselben
Verfahren wie vorstehend beschrieben hergestellt, außer daß jeder
der Primer psM2, psM3 und psM4 anstelle des Primers psM1 verwendet
wurde. Dann wurden die Plasmide pT1-M2PI, pT1-M3PI und pT1-M4PI,
die die Miniproinsulin M2, M3 bzw. M4 DNAs umfassen, ebenfalls gemäß demselben
Verfahren wie vorstehend hergestellt. Die Herstellungsverfahren
der Plasmide pT1-M1PI, pT1-M2PI, pT1-M3PI und pT2-P4PI werden in 3 gezeigt.
-
Beispiel 8: Herstellung
des Plasmids pT2-M1PI
-
Das
in Beispiel 3 hergestellte Plasmid pT7-T2 wurde mit BamHI und HindIII
verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit einer mit
BamHI/HindIII behandelten Miniproinsulin M1 DNA ligiert. Das entstandene
Plasmid wurde als Plasmid pT2-M1PI bezeichnet. Die Plasmide pT2-M2PI,
pT2-M3PI und pT2-M4PI, die M1-niproinsulin
M2, M3 bzw. M4 DNAs umfassen, wurden ebenfalls gemäß denselben
Verfahren wie vorstehend hergestellt. Die Herstellungsverfahren
der Plasmide pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI und pT2-M4PI werden in 4 gezeigt.
-
Beispiel 9: Expression
des TNF-Miniproinsulinfusionsproteins
-
E.
coli XL-1-Blue wurde gemäß dem Verfahren
von Hanahan, wie in DNA Cloning, Band 1, Hg. D.M. Glover, IRS Presse,
109-135 (1985) beschrieben, mit den Plasmiden pT1-M1PI, pT1-M2PI,
pT1-M3PI, pT1-M4PI,
pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI, pT2-M4PI, pT1-hPI bzw. pT2-hPI transformiert.
Danach wurden die auf dem festen Medium gebildeten Ampicillin-resistenten
Kolonien ausgewählt
und dann wurde 1 ml LB-Medium (10 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Hefeextrakt
und 10 g NaCl pro pro 1), das 50 μg/ml
Ampicillin enthielt, damit geimpft.
-
Die
Kolonien wurden 12 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und die entstandene
Kultur wurde 2 Minuten lang bei 8.000 × g zentrifugiert, wodurch
E. coli-Zellpellets erhalten wurden. Plasmide wurden unter Verwendung
des alkalischen Lysis-Verfahrens (Methods in Molecular Biolog, Hg.
Leonard G. Davis et al., Elsevier, S. 99-101 (1986)) von den Pellets
abgetrennt und 1 μg
des Plasmids wurde in 50 μl
TE-Puffer (pH 8,0) gelöst.
0,1 μg der
Plasmidlösung
wurden mit 2 μl
von 10 × One-phor-all-Puffer
(100 mM Trisacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 500 mM Kaliumacetat),
1 Einheit NdeI und 5 Einheiten HindIII gemischt und es wurde destilliertes
Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 μl zu dem Gemisch gegeben. Man
ließ die
Lösung
2 Stunden lang bei 37°C
reagieren, und unterzog sie dann einer 1%igen Agarosegel-Elektrophorese, um
den Einschub eines DNA-Fragments zu bestätigen.
-
Die
Plasmide, bei denen bestätigt
wurde, daß sie
das DNA-Fragment enthielten, wurden verwendet, um die Expressionswirtszelle
E. coli BL21 (DE3) gemäß demselben
Verfahren wie vorstehend zu transformieren, und es wurden die Ampicillin-resistenten
Kolonien ausgewählt.
-
Mit
den Plasmiden pT1-M1PI bzw. pT2-M2PI transformierte E. coli BL21(DE3)-Zellen,
d.h. E coli BL21(DE3+pT1-M2PI) und E coli BL21(DE3+pT2-M2PI) wurden
am 29. Dezember 1994 mit den Hinterlegungsnummern KCCM-10059 bzw.
KCCM-10060 bei dem Korean Culture Center of Microorganisms hinterlegt.
-
1
ml eines LB-Mediums wurde mit den vorstehend ausgewählten Kolonien
geimpft und die Kolonien wurden 12 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Die
Kultur wurde in 50 ml eines 50 μg/ml
Ampicillin enthaltenden LB-Mediums überführt, und, sobald die optische
Dichte der Kultur bei 600 nm 0,1 bis 0,4 betrug, wurde IPTG(Isopropylthiogalactopyranosid)
bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Kultur gegegeben.
Die Kultur wurde 4 Stunden lang auf 37°C gehalten, während mit
200 U pro Min gerührt
wurde, und dann 2 Minuten lang bei 8.000 U pro Min zentrifugiert,
wodurch E. coli-Zellpellets erhalten wurden.
-
Beispiel 10: Trennung
und Reinigung von Miniproinsulin
-
Die
in Beispiel 8 erhaltenen E. coli-Zellpellets wurden in 5 ml eines
10 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) suspendiert und dann einer
Ultraschallbehandlung unterworfen, um die Zellen zu zerstören. Das Zell-Lvsat
wurde 10 Minuten bei 4°C
und 6.000 × g
zentrifugiert, um Pellets zu erhalten. Die Pellets wurden mit dem
10-fachen Volumen von bei 4°C
gehaltenem Triton X-100-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,5%
(v/v) Triton X-100, 100 mM NaCl) gewaschen und dann 5 Minuten lang
bei 8.000 × g
zentrifugiert, um die Pellets abzutrennen. Diese Wasch- und Wiedergewinnungsschritte
wurden zweimal wiederholt.
-
Die
Pellets wurden in 1 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,9) gelöst, die
6 M Guanidin-HCl enthielt, und es wurden 50 mg Natriumsulfit und
25 mg Natriumtetrathionat zu der Lösung gegeben. Das entstandene
Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt und dann
30 Minuten lang bei 12.000 × g
zentrifugiert, wodurch eine überstehende
Flüssigkeit
erhalten wurde. Die überstehende
Flüssigkeit
wurde in eine Spectra Por #3-Dialysemembran gebracht und dann 24
Stunden lang gegen destilliertes Wasser von 4°C dialysiert. Das entstandene
Dialysat wurde 30 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert, wodurch
Niederschläge
erhalten wurden. Zu den Niederschlägen wurden Harnstoff und Salzsäure bis
zu Endkonzentrationen von 8 M bzw. 0,1 M gegeben. Dann wurden 5
mg Bromcyan zu dem Gemisch gegeben, und die entstandene Lösung wurde
20 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Das entstandene Reaktionsgemisch
wurde unter Verwendung eines HPLC-Systems (Hitachi, Japan) und einer
C-18-Umkehrphasensäule
(Pharmacia) gereinigt.
-
Beispiel 11: Rückfaltung
von Miniproinsulin und Herstellung von Insulin daraus
-
Das
in Beispiel 10 erhaltene sulfonierte Miniproinsulin wurde getrocknet
und dann in 50 mM Glycinpuffer (pH 11,0) bis zu einer Konzentration
von 53 μM
gelöst.
Die entstandene Lösung
wurde in Eis abgekühlt, und
es wurden 50 mM 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration
von 636 μM
dazugegeben. Das Gemisch wurde 19 Stunden lang bei 4°C gerührt, während das
Reaktionsgefäß mit einem
Parafilm versiegelt gehalten wurde. 100 mM Phosphorsäure wurden
zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu stoppen, und
dann wurden die Produkte bei 215 nm mit einer HPLC analysiert. Das
Ergebnis wird in
5 gezeigt, worin (a), (b), (c),
(d) und (e) die Chromatogramme der korrekt gefalteten M1PI, M2PI,
M3PI und M4PI und hPI darstellen. Wie in
5 gezeigt,
weist jedes der Miniproinsuline der vorliegenden Erfindung ein größeres Peakgebiet,
d.h. eine höhere
Ausbeute auf, als menschliches Proinsulin (hPI). Die Rückfaltungsausbeuten
von verschiedenen Miniproinsulinen und von menschlichem Proinsulin
werden in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle
1
-
Weiter
wurden 0,5 M Natriumhydroxid bis zu einem pH-Wert von 7,5 bis 8,0
zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Trypsin und Carboxypeptidase wurden
in derartigen Mengen zu dem Gemisch gegeben, daß das Verhältnis von Trypsin, Carboxypeptidase
B und Miniproinsulin auf 1:5:12.500 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde
20 Stunden lang bei 16°C
umgesetzt und dann durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 2
bis 3 eingestellt, um die Reaktion zu stoppen.
-
Die
entstandenen Lösungen
wurden bei 215 nm mit einer HPLC analysiert. Das Ergebnis wird in
6 gezeigt,
worin (a), (b), (c), (d) und (e) die Chromatogramme von Insulinen
darstellen, die durch Behandlung der rückgefalteten M1PI, M2PI, M3PI,
M4PI und hPI mit Trypsin und Carboxypeptidase B hergestellt worden sind.
Das Ergebnis bestätigt,
daß die
Miniproinsuline der vorliegenden Erfindung höhere Ausbeuten an Insulin ergeben,
als menschliches Proinsulin. SEQUENZLISTE
