DE19605657A1

DE19605657A1 - Proinsulinderivat und Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin

Info

Publication number: DE19605657A1
Application number: DE19605657A
Authority: DE
Inventors: Hang-Cheol Shin; Seung-Gu Chang; Dae-Young Kim; Chong-Suhl Kim
Original assignee: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd
Current assignee: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd
Priority date: 1995-02-15
Filing date: 1996-02-15
Publication date: 1996-08-22
Anticipated expiration: 2016-02-16
Also published as: FR2730495B1; FR2730495A1; GB2298206B; GB9602998D0; US5962267A; DE19605657B4; GB2298206A; KR960031602A; JPH08333395A; KR0150565B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein menschliches Proinsulin derivat und ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem In sulin unter Verwendung eines Expressionsvektors, der eine das menschliche Proinsulinderivat kodierende DNA umfaßt. Spezieller betrifft sie ein menschliches Proinsulinderivat, das anstelle des C-Peptids eine kurze Peptidsequenz zwischen den A- und B-Ketten von Insulin aufweist; einen Expressionsvektor, der eine das menschliche Proinsulinderivat kodierende DNA umfaßt; einen mit dem Expressionsvektor transformierten Mikroorganismus und ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin durch Kultivierung des Mikroorganismus in einem geeigneten Medium.

Insulin ist ein Polypeptidhormon, das von den β-Zellen der Pan kreas abgegeben wird und an der Steuerung des Blutzuckerspiegels teilnimmt. Es besteht aus zwei Peptidketten, d. h. der A- und der B-Kette, die an ihren Cysteinresten über Disulfidbrücken verbunden sind, und es wird durch proteolytisches Verarbeiten von Proinsulin in den β-Zellen der Pankreas hergestellt (Insulin: Molecular Biology and Pathology, Hg. Ashcroft, F. M. & Ashcroft, S. J. H., IRL Press, Oxford, 1992) . Kommerziell ist menschliches Insulin entweder durch ein enzymatisches Verfahren hergestellt worden, wobei ein Alaninrest an der Position Nr. 30 der B-Kette von Schweineinsulin durch eine Transpeptidierungsreaktion unter Verwendung von Trypsin durch einen Threoninrest ersetzt wurde (Markussen, J., Proceedings 1st International Symposium "Neue Insuline", S. 38-44 (1982), Hg. Petersen, K. G. et al., Freiburger Graphische Betriebe, Freiburg); oder durch ein Verfahren, bei dem genetisch veränderte E. coli verwendet wird (Chance, R. E. et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, S. 721-728 (1981), in Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Hg. Rich, D. H. & Gross, E., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.; und Frank, 3. H. et al., Peptides: Synthesis-Structure-Function, S. 729-738 (1981), in Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Hg. Rich, D. H. & Gross, E., Pierce Chemical Co., Rockford, IL, U.S.A.) oder Saccharomyces cerevisiae (Thim, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83, S. 6766-6770 (1986); und Markussen, J. et al., Protein Engineering, 1, S. 205-213 (1987)). Da das enzymatische Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin aus Schweineinsulin wegen seiner hohen Kosten beschränkt ist, haben sich neuere Untersuchungen auf Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin durch Gentechnologie-Verfahren konzentriert.

Chance et al. haben von einem Verfahren berichtet, bei dem In sulin dadurch hergestellt wird, daß sowohl die A- als auch die B- Kette von Insulin in Form eines Fusionsproteins durch Züchten von E. coli hergestellt wird, das einen Vektor umfaßt, der eine das Fusionsprotein kodierende DNA enthält; Spalten des Fusions proteins mit Bromcyan, wodurch die A- und B-Ketten erhalten werden; Sulfonieren der A- und B-Ketten, wodurch sulfonierte Ketten erhalten werden; Umsetzen der sulfonierten B-Kette mit einem Überschuß der sulfonierten A-Kette und dann Reinigen des entstandenen Produkts, wodurch Insulin erhalten wird (Chance, R.E. et al., supra). Dieses Verfahren weist jedoch insofern Nachteile auf, daß es umständlich ist, zwei Fermentationsver fahren zu betreiben, und daß die Reaktion der sulfonierten A- und B-Ketten nur eine geringe Ausbeute an Insulin ergibt, was das Verfahren an sich unpraktisch macht.

Frank et al. haben von einem Verfahren zur Herstellung von In sulin berichtet, das die folgenden Schritte umfaßt: Herstellen von Proinsulin in der Form eines Fusionsproteins durch Züchten von E. coli, die einen Vektor aufweist, der eine ein Fusions protein kodierende DNA enthält; Schneiden des Fusionsproteins mit Bromcyan, wodurch Proinsulin erhalten wird; Sulfonieren von Proinsulin und Abtrennen des sulfonierten Proinsulins; Rückfalten des sulfonierten Proinsulins zur Bildung der korrekten Disulfidbindungen; Behandeln des rückgefalteten Proinsulins mit Trypsin und Carboxypeptidase 3; und dann Reinigen des erhaltenen Produkts, wodurch Insulin erhalten wird (Frank et al., supra). Die Ausbeute an rückgefaltetem Proinsulin mit den korrekten Disulfidbindungen nimmt jedoch stark ab, wenn die Konzentration an Proinsulin zunimmt. Diese Tatsache wird durch Fehlfaltung und ein gewisses Maß an Polymerisation bewirkt, so daß das Verfahren den Nachteil mit sich bringt, daß während der Gewinnung von Proinsulin arbeitsaufwendige Reinigungsschritte durchgeführt werden müssen.

Thim et al. haben von einem Verfahren zur Herstellung von Insulin in Saccharomyces cerevisiae berichtet, das die Schritte umfaßt:
Herstellen eines einkettigen Insulinanalogs mit einer bestimmten Aminosäurensequenz durch Züchten von Saccharomyces cerevisiae- Zellen und Isolieren des Insulins davon durch eine Reihe von Schritten, d . h. eine Reinigung, Enzymumsetzung, Säurehydrolyse und eine weitere Reinigung (Thim, L et al, supra). Obwohl dieses Verfahren deshalb vorteilhaft ist, daß die Reinigungsschritte relativ einfach sind und kein Rückfaltungs verfahren notwendig ist, ergibt es wegen des per se geringen Expressionsgrades eines Hefesystems im Vergleich zu E. coli ebenfalls nur eine geringe Insulinausbeute.

Die Rolle des C-Peptids bei der Faltung von Proinsulin ist nicht genau bekannt. In einem Biochemie-Lehrbuch wird beschrieben, daß das C-Peptid für das Faltungsverfahren notwendig ist (Biochemistry, 3. Ausgabe, S. 41 (1988), Freeman), andere Un tersuchungen haben aber gezeigt, daß etwa 30 bis 50% korrekt gefaltetes Insulin erhalten werden können, wenn die A- und B- Ketten allein in Abwesenheit des C-Peptids in sehr geringen Konzentrationen verwendet werden (Katsoyannis, P. G. et al., Biochemistry, 6, S. 2642-2635 (1967); und Chance, R. E. et al., supra) . Es ist auch gezeigt worden, daß bei Verwendung eines Peptids bei dem die A- und B-Ketten direkt miteinander verbunden sind, eine sehr hohe Ausbeute an korrekt gefaltetem Produkt er halten werden kann, die mit der Ausbeute vergleichbar ist, die unter Verwendung von Proinsulin erreicht werden kann (Steiner, D. F. & Clark, J. L., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, S. 622-629 (1968); und Varandani, P. T. & Nafz, M. A., Arch. Biochem. Biophys., 141, S. 533-537 (1970)). Diese Ergebnisse deuten an, daß die Rolle des C-Peptids einfach darin besteht, die A- und B- Ketten nahe zusammen zu bringen, um so das Faltverfahren zu vereinfachen.

Gemäß den bekannten dreidimensionalen Strukturen von Insulinen in der Brookhaven Datenbank beträgt der Abstand zwischen dem α- Kohlenstoffatom am C-Terminus der B-Kette (Thr-30) und dem α- Kohlenstoffatom am N-Terminus der A-Kette (Gly-1) etwa 5 bis 11 Å, was einen geeigneten Abstand für den Einschub einer β- Schleifenstruktur darstellt. Es ist schon seit längerem aner kannt, daß bestimmte Aminosäurensequenzen mit hoher Wahrschein lichkeit Teil einer Schleifenkonformation in Proteinen sind (Chou, P. Y. & Fasman, G. O., J. Mol. Biol., 115, 135-175 (1977)), und es ist in jüngerer Zeit gezeigt worden, daß dies auch für Peptide in wäßriger Lösung gilt (Dyson, H. J. et al., J Mol. Biol., 201, 161-200 (1988); und Shin, H. C. et al., Biochemistry, 32, 6348-6355 (1993)) . Es wurde gefunden, daß Prolin in der zweiten Position und Glycin in der dritten Position die höchste β-Schleifenpopulation ergeben, und eine umfangreiche Untersuchung zeigte, daß die Art der Aminosäuren an Position 4 die Stabilität der β-Schleife in der trans Position beeinflußt, und es wird eine deprotonierte Asp 4 Seitenkette bevorzugt (Wright, P. E. et al., Biochemistry, 27, 7167-7175 (1988); und Dyson, H. J. et al., supra).

β-Schleifen sind wahrscheinliche Stellen für den Start einer Proteinfaltung und da sie durch kurze Wechselwirkungen bestimmt werden, beschränken sie den für die Polypeptidkette verfügbaren Konformationsraum, und sie können dadurch zur Steuerung nach folgender Faltungen beitragen, daß sie entferntere Teile der Polypeptidkette zusammenbringen (Zimmerman, S. S. & Scheraga, H. A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 4126-4129 (1977); und Wright, P. E. et al., supra) . Es ist auch bekannt, daß diese β- Schleifen eine wichtige Rolle bei enzymatischen Spaltungen spielen.

Trypsin ist eine typische Serinprotease und hydrolysiert ein Protein oder ein Peptid an dem Carboxy-Terminus eines Arginin- oder Lysinrests (Enzymes, S. 261-262 (1979), Hg. Dixon, M. & Webb, E. C., Longman Group Ltd., London). Insbesondere kommt an einer dibasischen Stelle, an der zwei aufeinanderfolgende Argi nin- oder Lysinreste existieren, leicht eine Hydrolyse vor, und es ist bekannt, daß diese Hydrolyse am ehesten dort stattfindet, wo die dibasische Stelle in oder neben einer β-Schleifenstruktur angeordnet ist (Rholam, Met al., FEBS Lett., 207, 1-6 (1986)).

Wie vorstehend beschrieben, besteht ein Bedarf an Verfahren mit hohen Ausbeuten zur Herstellung von menschlichem Insulin in einem Mikroorganismus, und die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben es unternommen, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Insulin zu entwickeln und haben ein Verfahren mit hoher Ausbeute gefunden, wobei ein Proinsulinderivat mit einem geringen Molekulargewicht und einer leicht hydrolysierbaren β- Schleifenstruktur verwendet wird.

Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein menschliches Proinsulinderivat, das eine hohe Faltungsausbeute aufweist und leicht hydrolysierbar ist, und eine dieses Derivat kodierende DNA bereitzustellen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Expressionsvektor zur Expression von menschlichem Proinsulin bereitzustellen, der die DNA umfaßt.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen mit dem Expressionsvektor transformierten Mikroorganismus be reitzustellen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin bereit zustellen, das das Züchten des transformierten Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, wodurch menschliches Proinsulin hergestellt wird, das Abtrennen des menschlichen Proinsulins davon und Herstellen von menschlichem Insulin aus dem Proinsulin umfaßt.

Die vorstehenden und andere Aufgaben und Merkmale der vorlie genden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der Er findung zusammen mit den beigefügten Zeichnungen klarer, von denen:

Fig. 1 ein schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT7-T1 und pT7-T2 darstellt;

Fig. 2 ein schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT1-hPI und pT2-hPI darstellt;

Fig. 3 ein schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT1-M1PI, pT1-M2PI, pT1-M3PI und pT1-M4PI darstellt;

Fig. 4 ein schematisches Diagramm der Herstellung der Plasmide pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI und pT2-M4PI darstellt;

Fig. 5 die HPLC-Chromatogramme von rückgefalteten M1PI, M2PI, M3PI, M4PI und hPI darstellt; und

Fig. 6 die HPLC-Chromatogramme von durch Hydrolyse von rückge falteten Miniproinsulinen (MiPIs) und hPI gebildeten Insulinen darstellt.

Alle hierin zitierten Referenzen werden hiermit unter Bezugnahme auf ihren gesamten Inhalt aufgenommen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein menschliches Proinsu linderivat der Formel (I) bereitgestellt, das nachstehend als "Miniproinsulin" bezeichnet wird, worin ein Peptid, das aus maximal 12 Aminosäuren besteht und eine feste β-Schleifenstruktur bildet, anstelle des aus 35 Aminosäuren bestehenden C-Peptids zwischen die A- und B-Ketten von menschlichem Insulin eingeführt wird:

B-Kette-Z-A-Kette (I)

worin Z ein Peptid der Formel U-U-X-P-J-(X′)n-U-U ist,
U ein Arginin- oder Lysinrest ist;
X und X′ unabhängig voneinander Aminosäurereste sind und
(X′)n n unterschiedliche oder gleiche Aminosäurereste sein kann;
P ein Prolinrest ist;
J ein Glycin-, Arginin- oder Lysinrest ist; und
n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.

Bevorzugte Miniproinsuline sind diejenigen, worin X ein Alanin, Tyrosin-, Histidin- oder Glycinrest ist; X′ ein Asparaginsäure-, Valin-, Arginin- oder Glycinrest ist; und n 0 oder 2 ist. Beispielhafte bevorzugte Miniproinsuline sind diejenigen, worin Z Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NR: 1); Arg-Arg-Tyr- Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NR: 2); Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp- Val-Lys-Arg(SEQ ID NR: 3) oder Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NR: 4) ist.

Das Miniproinsulin der vorliegenden Erfindung kann selbst oder in Form eines Fusionsproteins hergestellt werden, worin es mit einem Fusionspartnerprotein, vorzugsweise einem eine β-Struktur bildenden Protein fusioniert wird.

Beispielhafte Fusionspartnerproteine, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen den gesamten menschlichen Tumornekrose-Faktor (TNF) oder Teile davon mit der nachstehend gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 5), den ge samten mutierten TNF oder Teile davon, worin einige der Ami nosäuren in SEQ ID NR: 5 durch andere Aminosäuren ersetzt worden sind, und diejenigen Polypeptide, worin 1 bis 7 vorzugsweise 7, Aminosäuren von dem N-Terminus von TNF entfernt worden sind:

Eine menschlichen TNF oder einen mutierten TNF kodierende DNA kann chemisch unter Verwendung eines DNA-Synthetisierers oder über eine Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") hergestellt werden (Saiki, K. K. et al., Science, 230, S. 1350-1354 (1985)), wobei menschliche TNF cDNA als Matrize und geeignete, chemisch herge stellte Primer verwendet werden.

Die einen Teil oder den gesamten mutierten TNF kodierende DNA kann z. B. durch folgende Schritte hergestellt werden: Gewinnen von menschlicher TNF DNA durch PCR einer aus einer U937-Zellinie hergestellten menschlichen Monocyten cDNA-Bibliothek (Clontech, U.S.A.); und Durchführen einer anderen PCR durch Verwendung der TNF DNA als Matrize und von chemisch hergestellten Primern, d. h. einem Sinn Primer, der eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym und modifizierte Nucleotidsequenzen an seinem 5′-Ende aufweist, und einem Antisinn Primer, der eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym an seinem 5′-Ende aufweist.

Das Miniproinsulin der vorliegenden Erfindung kann chemisch mit einem Peptidsynthesizer gemäß einem herkömmlichen Verfahren oder unter Verwendung eines üblichen gentechnischen Verfahrens in einem Mikroorganismus hergestellt werden.

Zur Herstellung eines Miniproinsulins in einem Mikroorganismus wird eine kompatible Wirtszelle, z. B. eine E. coli oder Saccha romyces cerevisiae-Zelle mit einem Expressionsvektor transfor miert, der eine das Miniproinsulin allein kodierende DNA, oder eine fusionierte DNA enthält, die ein aus einem Fusionspartner protein und dem Miniproinsulin bestehendes Fusionsprotein ko diert; und die transformierte Zelle wird unter Bedingungen ge züchtet, die die Expression des Miniproinsulins ermöglicht. Dann wird das hergestellte Miniproinsulin rückgefaltet, durch eine Proteinase hydrolysiert und zum Erhalten von menschlichem Insulin gereinigt.

Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Insulin bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfaßt: Herstellen einer ein Miniproinsulin kodierenden DNA; Einführen der DNA allein oder zusammen mit einer ein Fusionspartnerprotein kodierenden DNA in einen geeigneten Vektor, La einen Expressionsvektor zur Expression des Miniproinsulins herzustellen; Transformieren einer Wirtszelle mit dem Ex pressionsvektor; Züchten der entstandenen Transformante unter Bedingungen, die die Expression des Miniproinsulins ermöglichen, Trennen des Miniproinsulins von der Kultur und Herstellen von Insulin aus dem Miniproinsulin.

Ein Expressionsvektorsystem kann durch Einführen der das Mini proinsulin allein kodierenden DNA oder durch aufeinanderfolgendes Einführen der das Fusionspartnerprotein und das Miniproinsulin kodierenden DNAs in einen Vektor hergestellt werden, der einen geeigneten Promotor, z. B. lac, trp, tac, pL, T3, T7, SP6, SV40 und 1(pL/pR) enthält; oder durch Ligieren der das Miniproinsulin oder das Fusionsprotein kodierenden DNA mit einer DNA, die einen dieser Promotoren und einen Ribosomen bindenden Bereich enthält, gefolgt von Einführen der ligierten DNA in ein geeignetes Plasmid, z. B. pBR322.

Die vorstehend hergestellten Expressionsvektoren können gemäß üblicher Verfahren, z. B. des Verfahrens von Cohen, wie in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972) beschrieben, in eine geeignete Wirtszelle, z. B. E. coli eingeführt werden, die unter Berücksichtigung einer Anzahl von auf dem Fachgebiet wohlbe kannten Faktoren ausgewählt wird, z. B. der Kompatibilität mit dem ausgewählten Vektor, der Leichtigkeit, das gewünschte Polypeptid zu gewinnen, der Polypeptideigenschaften, der biologischen Sicherheit und der Kosten, wodurch eine transformierte E. coli- Zelle erhalten wird.

Zwei derartige Transformanten wurden als E. coli BL21 (DE3+pT1M1PI) und E. coli BL21 (DE3+pT2M2PI) bezeichnet und am 29. Dezember 1994 bei dem Korean Culture Center of Microorganismen (KCCM) (Adresse: Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemun-gu, Seoul 120-749, Korea) mit den Hinterlegungsnummern KCCM-10059 bzw. KCCM-10060 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren hinterlegt.

Die transformierten Zellen werden unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression des Miniproinsulins ermöglichen.

Die in einer Wirtszelle hergestellten Polypeptide können isoliert werden und das gewünschte Miniproinsulin kann davon durch die kombinierte Verwendung von üblichen Verfahren, z. B. der Zellzerstörung, Zentrifugation, Sulfitolyse, Dialyse, Behandlung mit Bromcyan und HPLC getrennt werden.

Insbesondere kann das in E. coli in Form eines das Fusionsprotein umfassenden Einschlußkörpers hergestellte Miniproinsulin durch die folgenden Verfahren gereinigt werden.

Die Zellen in der Kultur werden durch Ultraschall zerstört, und die das Fusionsprotein enthaltenden Einschlußkörper durch Zen trifugation gesammelt. Die Einschlußkörper werden in einem ge eigneten Lösungsmittel, z. B. 6M Guanidin-HCl gelöst; die -SH- Gruppen der Cysteinreste in dem Protein werden durch Sulfitolyse in -SSO₃-Gruppen überführt, und die Proteine werden dann durch Dialyse oder Gelfiltrationschromatographie ausgefällt. Die ausgefällten Proteine werden durch Zentrifugation gesammelt und mehrfach mit einer wäßrigen Lösung gewaschen. Das entstandene Protein wird mit Bromcyan behandelt, und das erhaltene Produkt durch HPLC gereinigt, wodurch das Miniproinsulin erhalten wird.

Das Miniproinsulin wird dann zur Rückfaltung mit β-Mercap toethanol behandelt, und das rückgefaltete Miniproinsulin wird mit Trypsin und Carboxypeptidase B vorzugsweise in solchen Mengen behandelt, daß Gewichtsverhältnisse von Trypsin : Carboxypeptidase B : Miniproinsulin von 1 : 5 : 12.500 eingestellt werden, so daß Insulin erhalten wird.

Wie vorstehend beschrieben, wurde es durch die vorliegende Er findung möglich, die Ausbeute an menschlichem Insulin gegenüber dem Stand der Technik durch Expression eines menschlichen Mini proinsulins zu verbessern, wobei anstelle des sperrigen C-Peptids in Proinsulin ein kurzes Peptid zwischen die A- und B-Ketten von menschlichem Insulin eingeführt wird. Das kurze Peptid besteht aus nur 7 bis 12, vorzugsweise 9, Aminosäuren, ist aber dazu fähig, eine festere β-Schleifenstruktur auszubilden als das C- Peptid. Die Verfahren der Rückfaltung und Hydrolyse können daher mit dem Miniproinsulin effizienter durchgeführt werden als mit dem Proinsulin.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern, ohne ihren Umfang zu beschränken.

Die nachstehend für Fest-in-fest-, Flüssig-in-flüssig- und Fest in-flüssig-Mischungen angegebenen Prozentsätze beziehen sich auf eine G/G-, V/V- bzw. G/V-Basis, wenn nicht anders angegeben.

PCRs werden in den Beispielen gemäß dem üblichen in Saiki, K.K. et al., supra, beschriebenen PCR-Verfahren durchgeführt.

Beispiel 1 Herstellung des Plasmids pT7-T150 <Schritt 1< Herstellung von TNF DNA

Zum Erhalten einer TNF DNA wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemäß dem Verfahren von Saiki, K. K. et al., supra, unter Verwendung einer menschlichen Monocyten cDNA-Bibliothek (Clontech. U.S.A.), die aus einer U937-Zellinie hergestellt worden war, als Matrize und von P1-Primern mit den folgenden Nucleotidsequenzen durchgeführt:

Primer P1
Sinn Primer (SEQ ID NR: 6):

5′-GCCATACATA TGGTCAGATC ATCTTCTCGA ACC-3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 7)
3′-TGAAA CCCTAGTAAC GGGACACTAT TCCTAGGTGT-5′

<Schritt 2< Herstellung des eine DNA für ein mutiertes TNF enthaltenden Plamids pT7-T150

Um eine DNA für mutiertes TNF zu erhalten, wurden eine Reihe von PCRs durchgeführt, wobei die in <Schritt 1< hergestellte TNF DNA als Matrize und P2 und P3 Primer mit den folgenden Nucleotidsequenzen verwendet wurden:
Primer P2 (der die gewünschte Nucleotid-Substitution umfaßt)
Sinn Primer (SEQ ID NR: 8):

5′-GTGGTGCCAA TAGAGGGCCT GTTCCTCATC TAC-3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 9):

3′-cAC CACGGTTATC TCCCGGACAA GGAGTAGATG-5′
Primer P3 (komplementär zu den 5′- und 3′-Enden der TNF DNA)
Sinn Primer (SEQ ID NR: 10):

5′ -ATACATATGC CGAGTGACAA GCCTGTA-3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 11):

3′-A TGAAACCCTA GTAACGGGCC CCTAGGTACA-5′.

Die erste PCR wurde unter Verwendung der in <Schritt 1< herge stellten TNF DNA als Matrize, eines P2 Sinn Primers und eines P3 Antisinn Primers durchgeführt, und die zweite PCR wurde nach demselben Verfahren wie bei der ersten PCR durchgeführt, außer daß ein P2 Antisinn Primer und ein P3 Sinn Primer verwendet wurden. Die beiden entstandenen PCR-Produkte wurden gemischt und dann annealt.

Dann wurde die DNA für das mutierte TNF durch PCR unter Verwen dung eines P3 Sinn Primers mit einer NdeI-Erkennungsstelle an seinem 5′-Ende und eines P3 Antisinn Primers mit SmaI- und BamHI- Erkennungsstellen an seinem 3′-Ende amplifiziert. Das entstandene PCR-Produkt, das T150 genannt wurde, kodiert ein mutiertes TNF, worin 7 Aminosäuren von dem N-Terminus von TNF entfernt worden waren, und Serin an der 52. Position, Tyrosin an der 56. Position und Leucin an der 157. Position des TNF durch Isoleucin, Phenylalanin bzw. Arginin ersetzt worden waren.

T150 wurde mit NdeI und BamHl verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase an die Ndel/BamHI-Stelle eines Vektors ligiert, der durch Verdauen von Plasmid pT7-7 (Department of Biological Chemistry, Harvard Medical School) mit NdeI und BamHl hergestellt worden war. Das entstandene Plasmid wurde als pT7-T150 bezeichnet.

Beispiel 2 Herstellung des Plasmids pT7-T1

Eine PCR wurde unter Verwendung der in <Schritt 1< hergestellten TNF DNA als Matrize, von P3 als Sinn Primer und einem Antisinn Primer mit der folgenden Nucleotid-Sequenz durchgeführt:

Antisinn Primer (SEQ ID NR: 12):

3′-G ACATGGAGTA GATGAGGGCC CCTAGGTACA-5′

Das entstandene PCR-Produkt, das T1 genannt wurde, kodiert ein mutiertes TNF, worin 7 Aminosäuren von dem N-Terminus von TNF entfernt worden waren, und Serin an der 52. Position und Glutamin an der 61. Position durch Isoleucin bzw. Arginin ersetzt worden waren.

T1 wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase an die NdeI/BamHI-Stelle eines Vektors li giert, der durch Verdauen des Plasmids pT7-7 mit NdeI und BamHI hergestellt worden war. Das entstandene Plasmid wurde als pT7-T1 bezeichnet, und sein Herstellungsverfahren wird in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pT7-T2

Es wurde ein ein Polypeptid kodierendes synthetisches Po lynucleotid T2 hergestellt. Das Polypeptid enthält die 8. bis 12. Aminosäuren des N-Terminus von TNF und auch zehn Histidinreste, die seine Reinigung erleichtern. Die folgende Aminosäure-Sequenz wird in T2 kodiert (SEQ ID NR: 13):

H₂N-Pro Ser Asp Lys Pro His His His His His His His His His His Ser Ser-COOH

Es wurde eine PCR unter Verwendung der Primer T20-I, T20-II und T20-III in einem Verhältnis von 10 : 1 : 10 durchgeführt, wodurch eine das Polynucleotid T2 umfassende und NdeI- und BamHI-Erken nungsstellen an ihren 5′- bzw. 3′-Enden aufweisende DNA erhalten wurde:

T20-I (Sinn Primer; SEQ ID NR: 14):

5′-TATACATATG CCGAGTGACA AGCCT-3′
T20-II (Sinn Primer; SEQ ID NR: 15):

5′-AGTGACAAGC CTCATCATCA TCATCATCAT CATCATCATC ACAGCAG-3′
T20-III (Antisinn Primer; SEQ ID NR: 16) :

3′-TAGT AGTGTCGTCG CCTAGGTACA-5′

Das entstandene PCR-Produkt wurde mit NdeI und BamHI verdaut und dann unter Verwendung einer T4 DNA-Ligase mit einem mit NdeI/BamHI behandelten Plasmid pT7-7 ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pT7-T2 bezeichnet, und sein Herstellungsver fahren wird in Fig. 1 gezeigt.

Beispiel 4 Herstellung des Plasmids pT150-hPI <Schritt 1< Herstellung von menschlicher Proinsulin DNA

Auf der Basis der Information über die Aminosäuren-Sequenz von menschlichem Proinsulin (Ullrich, A. et al., Science, 612-615 (1980)) wurde eine synthetische, menschliches Proinsulin kodie rende DNA, die die folgende Nucleotid-Sequenz (SEQ ID NR: 17) aufweist, unter Verwendung der in E. coli in hohem Maße bevor zugten Kodone hergestellt, um die Expressionsrate der DNA zu steigern:

Insbesondere wurden Oligonucleotide mit den folgenden Nucleotid- Sequenzen zur Verwendung bei der Herstellung eines Proinsulingens unter Einsatz eines automatischen ABI DNA-Synthetisierers (Modell 392) hergestellt, wobei das Festphasen-Phosphit-Syntheseverfahren verwendet wurde:
pTA (SEQ ID NR. 18):

pTB (SEQ ID NR: 19):

pTC (SEQ ID NR: 20):

pTD (SEQ ID NR: 21):

pTE (SEQ ID NR: 22):

p31 (SEQ ID NR: 23) : 5′-GTACCTGGTT TGCGGTGAAC GTGGT-3′
p112 (SEQ ID NR: 24): 3′-TAAC ATTGATCATT TTCGAAGCAT-5′
pBAM (SEQ ID NR: 25): 5′-GCAGGATCCA TGTTCGTTAA T-3′
pHIN (SEQ ID NR: 26): 3′-ATAA CATTGATCAT TTTCGAAACG-5′
p7l (SEQ ID NR: 27): 5′-GGTGCAGGCT CTCTGCAGCC GTTGG-3′
p72 (SEQ ID NR: 28): 3′-CCGAG AGACGTCGGC AACCGCGACC-5′

Ein DNA-Fragment wurde durch die PCR unter Verwendung der Oli gonucleotide pTA und pTB als Matrizen und der Oligonucleotide p71 und p112 als Primer hergestellt und als Fragment bezeichnet. Ein anderes Fragment, das als Fragment pCD bezeichnet wurde, wurde ebenfalls nach demselben Verfahren unter Verwendung der Oligonucleotide pTC und pTD als Matrizen und der Oligonucleotide p31 und p72 als Primer hergestellt. Gleiche Mengen der Fragmente pAB und pCD wurden gemischt und dann annealt. Ein drittes Fragment, das als Fragment pABCD bezeichnet wurde, wurde dann durch PCR hergestellt, wobei das annealte Oligonucleotid als Matrize und die Oligonucleotide p31 und p112 als Primer verwendet wurden.

Außerdem wurden gleiche Mengen des Fragments pABCD und des Oli gonucleotids pTE gemischt und dann annealt. Es wurde eine das gesamte menschliche Proinsulin kodierende DNA durch PCR hergestellt, wobei das annealte Oligonucleotid als Matrize und die Oligonucleotide pBAM und pHIN als Primer verwendet wurden.

<Schritt 2< Herstellung des Plasmids pT150-hPI

Die in <Schritt 1< erhaltene DNA für das menschliche Proinsulin wurde mit BamHI und HindIII verdaut, wodurch eine doppelsträngige DNA mit kohäsiven Enden hergestellt wurde, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren 5′- bzw. 3′-Enden enthielt.

Das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid pT7-T150 wurde mit BamHI und HindIII verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit BamHI/HindIII behandelten DNA für das menschliche Proinsulin, die vorstehend erhalten wurde, ligiert. Das ent standene Plasmid wurde als Plasmid pT150-hPI bezeichnet.

Beispiel 5 Herstellung des Plasmids pT1-hPI

Die in <Schritt 1< von Beispiel 4 erhaltende hPI DNA wurde mit BamHI und HindIII verdaut, wodurch eine doppelsträngige DNA mit kohäsiven Enden erhalten wurde, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren 5′- bzw. 3′-Enden enthielt.

Das in Beispiel 2 hergestellte Plasmid pT7-T1 wurde mit BamHI und HindIII verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit BamHI/HindIII behandelten hPI DNA, die vorstehend erhalten worden ist, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pTl-hPI bezeichnet und sein Herstellungsverfahren wird in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 6 Herstellung des Plasmids pT2-hPI

Die in <Schritt 1< von Beispiel 4 erhaltene hPI DNA wurde mit BamHI und HindIII verdaut, wodurch eine doppelsträngige DNA mit kohäsiven Enden erhalten wurde, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren 5′- bzw. 3′-Enden enthielt.

Das in Beispiel 3 hergestellte Plasmid pT7-T2 wurde mit BamHI und HindIII verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit BamHl/HindIII behandelten hPI DNA, die vorstehend er halten worden war, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als pT2-hPI bezeichnet, und sein Herstellungsverfahren wird in Fig. 2 gezeigt.

Beispiel 7 Herstellung des Plasmids pT1-MiPI

Miniproinsuline, von denen jedes ein zwischen den A- und B-Ketten angeordnetes, eine β-Schleife bildendes Peptid umfaßt, kodierende DNAs wurden auf eine Weise hergestellt, daß die zweite Aminosäure des Peptids ein Prolinrest ist, von dem bekannt ist, daß er eine feste β-Schleifenstruktur bewirkt (Dyson, H. J. et al., J. Mol. Biol., 201, S. 161-200 (1988)). Das Peptid ist Arg-ArgAla-Pro- Gly-Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NR: 1) (M1PI); Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly- Asp-Val-Lys-Arg (SEQ ID NR: 2) (M2PI); Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp- Val-Lys-Arg (SEQ ID NR: 3) (M3PI); oder Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Lys- Arg (SEQ ID NR: 4) (M4PI)

Insbesondere wurden unter Verwendung eines automatischen DNA- Synthetisierers Primer mit den folgenden Nucleotid-Sequenzen hergestellt:
Primer pBAM (SEQ ID NR: 25): 5′-GCAGGATCCA TGTTCGTTAA T-3′
Primer pHIN (SEQ ID NR: 26): 3′-ATAA CATTGATCAT TTTCGAAACG-5′
Primer psM1
Sinn Primer (SEQ ID NR: 29)
5′-GCTCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 30)
3′-TGG GGCTTTTGGG CAGCGCGAGG CCCACTGCAA-s′
Primer psM2
Sinn Primer (SEQ ID NR: 31)
5′-TACCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA-3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 32)
3′-TGG GGCTTTTGGG CAGCGATGGG CCACTGAA-5′
Primer psM3
Sinn Primer (SEQ ID NR: 33)
5′ - CACCCGGGTG ACGTTAAACG TGGCATCGTT GAACAA- 3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 34)
3′ - TGG GGCTTTTGGG CAGCGGTGGG CCCACTGCAA- 5′
Primer psM4
Sinn Primer (SEQ ID NR: 35)
5′ -GGTCCGGGTA AACGTGGCAT CGTTGAACAA-3′
Antisinn Primer (SEQ ID NR: 36)
3′ -TGGGGCT TTTGGGCAGC GCCAGGCCCA-5′

Eine Miniproinsulin M1 kodierende DNA wurde wie folgt herge stellt. Ein DNA-Fragment, das den 5′-Endbereich enthält, der Miniproinsulin 1 ("sM1-A") kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung des in Beispiel 4 hergestellten Proinsulingens als Matrize und des Primers pBAM und des Antisinn Primers von psM1 hergestellt. Ein DNA-Fragment, das den 3′-Endbereich enthält, der Miniproinsulin 1 ("sM1-B") kodiert, wurde ebenfalls durch PCR unter Verwendung des in Beispiel 4 hergestellten Proinsulingens als Matrize und des Primers pHIN und des Sinn Primers von psM1 hergestellt. Gleiche Mengen von sM1-A und sM1-B wurden gemischt und rekombiniert. Eine Miniproinsulin Ml kodierende DNA wurde durch PCR unter Verwendung der rekombinierten DNA als Matrize und der Primer pBAM und pHIN hergestellt.

Die Miniproinsulin M1 DNA wurde mit BamHI und HindIII verdaut, um eine doppelsträngige DNA mit kohäsiven Enden zu erhalten, die Erkennungsstellen für BamHI und HindIII an ihren 5′- bzw. 3′- Enden enthielt.

Das in Beispiel 2 hergestellte Plasmid pT7-T1 wurde mit BamHI und HindIII verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit der mit BamHI/HindIII behandelten Miniproinsulin M1 DNA, die vorstehend erhalten worden war, ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als Plasmid pT1-M1PI bezeichnet.

Die die Miniproinsuline M2, M3 bzw. M4 kodierenden DNAs wurden gemäß demselben Verfahren wie vorstehend beschrieben hergestellt, außer daß jeder der Primer psM2, psM3 und psM4 anstelle des Primers psMl verwendet wurde. Dann wurden die Plasmide pT1-M2PI, pT1-M3PI und pT1-M4PI, die die Miniproinsulin M2, M3 bzw. M4 DNAs umfassen, ebenfalls gemäß demselben Verfahren wie vorstehend hergestellt. Die Herstellungsverfahren der Plasmide pT1-M1PI, pT1-M2PI, pT1-M3PI und pT2-P4PI werden in Fig. 3 gezeigt.

Beispiel 8 Herstellung des Plasmids pT2-MiPI

Das in Beispiel 3 hergestellte Plasmid pT7-T2 wurde mit BamHI und HindIII verdaut und dann unter Verwendung von T4 DNA-Ligase mit einer mit BamHI/HindIII behandelten Miniproinsulin M1 DNA ligiert. Das entstandene Plasmid wurde als Plasmid pT2-M1PI be zeichnet. Die Plasmide pT2-M2PI, pT2-M3PI und pT2-M4PI, die Mi niproinsulin M2, M3 bzw. M4 DNAs umfassen, wurden ebenfalls gemäß denselben Verfahren wie vorstehend hergestellt. Die Her stellungsverfahren der Plasmide pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI und pT2-M4PI werden in Fig. 4 gezeigt.

Beispiel 9 Expression des TNF-Miniproinsulinfusionsproteins

E. coli XL-1-Blue wurde gemäß dem Verfahren von Hanahan, wie in DNA Cloning, Band 1, Hg. D.M. Glover, IRS Presse, 109-135 (1985) beschrieben, mit den Plasmiden pT1-M1PI, pT1-M2PI, pT1-M3PI, pT1- M4PI, pT2-M1PI, pT2-M2PI, pT2-M3PI, pT2-M4PI, pT1-hPI bzw. pT2- hPI transformiert. Danach wurden die auf dem festen Medium gebildeten Ampicillin-resistenten Kolonien ausgewählt und dann wurde 1 ml LB-Medium (10 g Bacto Trypton, 5 g Bacto Hefeextrakt und 10 g NaCI pro pro 1), das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, damit geimpft.

Die Kolonien wurden 12 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und die entstandene Kultur wurde 2 Minuten lang bei 8.000 × g zen trifugiert, wodurch E. coli-Zellpellets erhalten wurden. Plasmide wurden unter Verwendung des alkalischen Lysis-Verfahrens (Methods in Molecular Biology, Hg. Leonard G. Davis et al., Elsevier, S. 99-101 (1986)) von den Pellets abgetrennt und 1 µg des Plasmids wurde in 50 µl TE-Puffer (pH 8,0) gelöst. 0,1 µg der Plasmidlösung wurden mit 2 kl von 10 × One-phor-all-Puffer (100 mM Trisacetat, 100 mM Magnesiumacetat, 500 mM Kaliumacetat) , 1 Einheit NdeI und 5 Einheiten HindIII gemischt und es wurde destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 µl zu dem Gemisch gegeben. Man ließ die Lösung 2 Stunden lang bei 37°C reagieren, und unterzog sie dann einer 1%igen Agarosegel- Elektrophorese, um den Einschub eines DNA-Fragments zu bestäti gen.

Die Plasmide, bei denen bestätigt wurde, daß sie das DNA-Fragment enthielten, wurden verwendet, um die Expressionswirtszelle E.

coli BL21 (DE3) gemäß demselben Verfahren wie vorstehend zu transformieren, und es wurden die Ampicillin-resistenten Kolonien ausgewählt.

Mit den Plasmiden pT1-M1PI bzw. pT2-M2PI transformierte E. coli BL21 (DE3)-Zellen, d. h. E. coli BL21 (DE3+pT1-M2PI) und E. coli BL21 (DE3+pT2-M2PI) wurden am 29. Dezember 1994 mit den Hinter legungsnummern KCCM-10059 bzw. KCCM-10060 bei dem Korean Culture Center of Microorganismus hinterlegt.

1 ml eines LB-Mediums wurde mit den vorstehend ausgewählten Ko lonien geimpft und die Kolonien wurden 12 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Die Kultur wurde in 50 ml eines 50 µg/ml Ampicillin enthaltenden LB-Mediums überführt, und, sobald die optische Dichte der Kultur bei 600 nm 0,1 bis 0,4 betrug, wurde IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Kultur gegegeben. Die Kultur wurde 4 Stunden lang auf 37°C gehalten, während mit 200 U pro Min gerührt wurde, und dann 2 Minuten lang bei 8,000 U pro Min zentrifugiert, wodurch E. coli-Zellpellets erhalten wurden.

Beispiel 10 Trennung und Reinigung von Miniproinsullin

Die in Beispiel 8 erhaltenen E. coli-Zellpellets wurden in 5 ml eines 10 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) suspendiert und dann einer Ultraschallbehandlung unterworfen, um die Zellen zu zerstören. Das Zell-Lysat wurde 10 Minuten bei 4°C und 6.000 × g zentrifugiert, um Pellets zu erhalten. Die Pellets wurden mit dem 10-fachen Volumen von bei 4°C gehaltenem Triton X-100-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) Triton X-100, 100 mM NaCl) gewaschen und dann 5 Minuten lang bei 8.000 × g zentrifugiert, um die Pellets abzutrennen. Diese Wasch- und Wiedergewinnungsschritte wurden zweimal wiederholt.

Die Pellets wurden in 1 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,9) gelöst, die 6 M Guanidin-HCI enthielt, und es wurden 50 mg Natriumsulfit und 25 mg Natriumtetrathionat zu der Lösung gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt und dann 30 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert, wodurch eine überstehende Flüssigkeit erhalten wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde in eine Spectra Por #3-Dialysemembran gebracht und dann 24 Stunden lang gegen destilliertes Wasser von 4°C dialysiert. Das entstandene Dialysat wurde 30 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert, wodurch Niederschläge erhalten wurden. Zu den Niederschlägen wurden Harnstoff und Salzsäure bis zu Endkonzentrationen von 8 M bzw. 0,1 M gegeben. Dann wurden 5 mg Bromcyan zu dem Gemisch gegeben, und die entstandene Lösung wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Das entstandene Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines HPLC-Systems (Hitachi, Japan) und einer C-18-Umkehrphasensäule (Pharmacia) gereinigt.

Beispiel 11 Rückfaltung von Miniproinsulin und Herstellung von Insulin daraus

Das in Beispiel 10 erhaltene sulfonierte Miniproinsulin wurde getrocknet und dann in 50 mM Glycinpuffer (pH 11,0) bis zu einer Konzentration von 53 µM gelöst. Die entstandene Lösung wurde in Eis abgekühlt, und es wurden 50 mM 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 636 µM dazugegeben. Das Gemisch wurde 19 Stunden lang bei 4°C gerührt, während das Reaktionsgefäß mit einem Parafilm versiegelt gehalten wurde. 100 mM Phosphorsäure wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben, um die Reaktion zu stoppen, und dann wurden die Produkte bei 215 nm mit einer HPLC analysiert. Das Ergebnis wird in Fig. 5 gezeigt, worin (a), (b), (c), (d) und (e) die Chromatogramme der korrekt gefalteten M1PI, M2PI, M3PI und M4PI und hPI darstellen. Wie in Fig. 5 gezeigt, weist jedes der Miniproinsuline der vorliegenden Erfindung ein größeres Peakgebiet, d. h. eine höhere Ausbeute auf, als menschliches Proinsulin (hPI) . Die Rückfaltungsausbeuten von verschiedenen Miniproinsulinen und von menschlichem Proinsulin werden in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Weiter wurden 0,5 M Natriumhydroxid bis zu einem pH-Wert von 7,5 bis 8,0 zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Trypsin und Car boxypeptidase wurden in derartigen Mengen zu dem Gemisch gegeben, daß das Verhältnis von Trypsin, Carboxypeptidase B und Mi niproinsulin auf 1 : 5 : 12.500 eingestellt wurde. Das Gemisch wurde 20 Stunden lang bei 16°C umgesetzt und dann durch Zugabe von 1 M Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 3 eingestellt, um die Reaktion zu stoppen.

Die entstandenen Lösungen wurden bei 215 nm mit einer HPLC ana lysiert. Das Ergebnis wird in Fig. 6 gezeigt, worin (a), (b), (c), (d) und (e) die Chromatogramme von Insulinen darstellen, die durch Behandlung der rückgefalteten M1PI, M2PI, M3PI, M4PI und hPI mit Trypsin und Carboxypeptidase B hergestellt worden sind. Das Ergebnis bestätigt, daß die Miniproinsuline der vorliegenden Erfindung höhere Ausbeuten an Insulin ergeben, als menschliches Proinsulin.

Sequenzliste

Claims

Menschliches Proinsulinderivat der Formel (1):
B-Kette-Z-A-Kette (I)
worin:
die A- und B-Ketten jeweils menschliche Insulinketten sind;
Z ein Peptid der Formel U-U-X-P-J-(x′)n-U-U ist;
U ein Arginin- oder Lysinrest ist;
X und X′ unabhängig voneinander ein Aminosäurerest sind und (X′)n n unterschiedliche oder gleiche Aminosäurereste sein kann;
P ein Prolinrest ist;
J ein Glycin-, Arginin- oder Lysinrest ist; und
n 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
2. Menschliches Proinsulinderivat nach Anspruch 1, worin X ein Alanin-, Tyrosin-, Histidin- oder Glycinrest ist; X′ ein Asparaginsäure-, Valin-, Arginin- oder Glycinrest ist; und n 2 ist.
3. Menschliches Proinsulinderivat nach Anspruch 1, worin X ein Alaninrest ist; J ein Glycinrest ist; und (X′)n Aspa raginSäUre-Valin ist.
4. Menschliches Proinsulinderivat nach Anspruch 1, worin X ein Tyrosinrest ist; J ein Glycinrest ist; und (X′)n As paraginsäure-Valin ist.
5. Menschliches Proinsulinderivat nach Anspruch 1, worin X ein Histidinrest ist; J ein Glycinrest ist; und (X′)n As paraginsäure-Valin ist.
6. Menschliches Proinsulinderivat nach Anspruch 1, worin X ein Glycinrest ist; J ein Argininrest ist; und (X′)n Arginin- Glycin ist.
7. Menschliches Proinsulinderivat nach Anspruch 1, worin X ein Glycinrest ist; J ein Glycinrest ist; und n 0 ist.
8. DNA, die ein menschliches Proinsulinderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
9. Expressionsvektor, der die DNA nach Anspruch 8 enthält.
10. Expressionsvektor nach Anspruch 9, der das Plasmid pT1-M1PI (KCCM-10059) oder das Plasmid pT2-M2PI (KCCM-10060) ist.
11. Mikroorganismus, der mit einem Vektor nach Anspruch 9 oder 10 transformiert worden ist.
12. Mikroorganismus nach Anspruch 11, der eine mit dem Plasmid pT1-MlPI (KCCM-10059) transformierte E. coli BL21(DE3) ist.
13. Mikroorganismus nach Anspruch 11, der mit dem Plasmid pT2- M2PI (KCCM-l0060) transformierte E. coli BL21(DE3) ist.
14. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Insulin, das die folgenden Schritte umfaßt: Herstellen einer ein menschliches Proinsulinderivat der Formel (I) kodierenden DNA; Einführen der DNA in einen Vektor, wodurch ein Ex pressionsvektor zur Expression des menschlichen Proinsu linderivats hergestellt wird; Transformieren einer Wirts zelle mit dem Expressionsvektor; Züchten der resultierenden Transformante unter Bedingungen, die die Expression des menschlichen Proinsulinderivats ermöglichen; Abtrennen des menschlichen Proinsulinderivats von der Kultur und Herstellen von menschlichem Insulin aus dem menschlichen Proinsulinderivat durch enzymatische Hydrolyse.