JP4547152B2 - β−セクレターゼ阻害剤および使用方法 - Google Patents

β−セクレターゼ阻害剤および使用方法 Download PDF

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Description

（関連出願）
本願は、米国仮特許出願第６０／３３５，９５２号（これは、２００１年１０月２３日に出願された）；第６０／３３３，５４５号（これは、２００１年１１月２７日に出願された）；第６０／３４８，４６４号（これは、２００２年１月１４日に出願された）；第６０／３４８，６１５号（これは、２００２年１月１４日に出願された）；第６０／３９０，８０４号（これは、２００２年６月２０日に出願された）；第６０／３９７，５５７号（これは、２００２年７月１９日に出願された）；および第６０／３９７，６１９号（これは、２００２年７月１９日に出願された）から優先権を主張しており、これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている。
（政府の援助）
本発明は、全部または一部、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成ＡＧ−１８９３３およびＡＩ−３８１８９により、援助された。政府は、本発明の一定の権利を有する。
（発明の背景）
アルツハイマー病は、ヒトにおける進行性の痴呆であり、これは、特に、記憶喪失、混同および失見当識を生じる。アルツハイマー病は、感覚痴呆の大部分を占め、成人の死亡の主要な原因である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｎ．，Ｎａｔｌ．Ｖｉｔａｌ Ｓｔａｔ．Ｒｅｐ．４９：１−８７（２００１）、それらの内容は、本明細書中で参考として援用されている）。組織学的には、アルツハイマー病に罹った人の脳は、細胞内神経原線維の歪みおよび老人斑（これは、アミロイドタンパク質コアを伴う顆粒状または糸状の銀親和性塊から構成され、大部分は、脳内でのβ−アミロイドペプチド（Ａβ）の蓄積が原因である）により、特徴付けられる。Ａβの蓄積は、この疾患の病因および進行において、一定の役割を果たし（Ｓｅｌｌｏｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９９．２３−３１（１９９９））、そしてアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク分解性断片である。ＡＰＰは、初期には、β−セクレターゼに続いてγ−セクレターゼで開裂されて、Ａβを生成する（Ｌｉｎ，Ｘ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１４５６−１４６０（２０００）；Ｄｅ Ｓｔｒｏｐｐｅｒ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：３８７−３９０（１９９８））。
アルツハイマー病を治療するのに有効な化合物および方法を開発することが必要とされている。
（発明の要旨）
本発明は、構造式Ｉで表わされる化合物および該化合物を含有する医薬組成物に関する：
Figure 0004547152
 式Ｉにおいて、Ｙは、キャリア分子である；Ｚは、結合、−ＯＰ（Ｏ）− ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３３−、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３３−またはアミノ酸配列であり、該アミノ酸配列は、加水分解酵素で開裂可能である；Ｒ３３は、結合またはアルキレンである；ｋは、０、または１〜約１００の整数である；ｒは、１〜約１００の整数である；そしてＡ１は、各出現例について、以下の構造式で表わされる化合物であるか、またはそれらの光学異性体、ジアステレオマーまたは薬学的に受容可能な塩である：
Figure 0004547152
 式ＩＩにおいて、Ｘは、Ｃ＝ＯまたはＳ（Ｏ）ｎである。ｎは、１または２である。Ｐ１は、脂肪族基、ヒドロキシアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルキルスルファニルアルキルである。Ｐ２、Ｐ１’およびＰ２’は、それぞれ別個に、置換または非置換脂肪族基、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロアラルキル、置換または非置換複素環または置換または非置換ヘテロシクロアルキルである。Ｒは、−Ｈである。Ｒ１は、置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アルコキシ、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換複素環、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロオキシ、置換または非置換ヘテロシクロアルコキシ、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロアラルキル、置換または非置換ヘテロアラルコキシまたは−ＮＲ５Ｒ６である。あるいは、Ｒ１は、Ｘと一緒になって、ヘプチドまたはＹ−Ｚ−である。Ｒ４は、Ｈである；またはＲ４およびＰ１’は、Ｒ４およびＰ１’を結合する原子と一緒になって、５員〜６員複素環を形成する。Ｒ２およびＲ３は、それぞれ別個に、Ｈ、置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換複素環、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアリールおよび置換または非置換ヘテロアラルキルからなる群から選択される；またはＲ２およびＲ３の１個は、それが結合する窒素と一緒になって、ペプチドまたはＹ−Ｚ−である。あるいは、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合する窒素と一緒になって、置換または非置換複素環または置換または非置換ヘテロアリールを形成する。Ｒ５およびＲ６は、それぞれ別個に、Ｈ、置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換複素環、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換ヘテロアリールまたは置換または非置換ヘテロアラルキルである。あるいは、ＲとＲ５またはＲ６の１個とは、Ｘおよびそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５員、６員または７員の置換または非置換複素環または置換または非置換ヘテロアリール環である。しかしながら、Ａ１は、以下の化合物を含まない：
Figure 0004547152
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 一実施形態において、本発明は、式ＩＩＩで表わされる化合物および該化合物を含有する医薬組成物に関する：
Figure 0004547152
 式ＩＩＩにおいて、Ｙ、Ｚ、ｋおよびｒは、式Ｉのように定義され、そしてＡ２は、各出現例について、以下の式ＩＶで表わされる化合物、またはそれらの光学異性体、ジアステレオマーまたは薬学的に受容可能な塩である：
Figure 0004547152
 式ＩＶにおいて、Ｘ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、式ＩＩのように定義され、そしてＲ１９は、脂肪族基であり、該脂肪族基は、１個またはそれ以上の置換基で置換されており、ここで、少なくとも１個の置換基は、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｒ１６、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）２Ｒ１６および−ＮＲ１５Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６からなる群から選択される置換基である。Ｒ１５およびＲ１６は、それぞれ別個に、Ｈ、脂肪族基、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであり、ここで、該脂肪族基、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルが、必要に応じて、脂肪族基、ヒドロキシ、−ＯＲ９、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−ＮＲ９Ｒ１０、グアニジノ、−ＯＰＯ３ −２、−ＰＯ３ −２、ＯＳＯ３ −、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ９、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ９、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）２Ｒ１０、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよび複素環からなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されている。ｐは、０、１または２である。しかしながら、Ｒ１９が−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｒ１６または−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）２Ｒ１６で置換されているとき、−ＮＲ２Ｒ３は、以下の構造式を有する基ではない：
Figure 0004547152
 別の実施形態において、本発明は、メマプシン１β−セクレターゼ部位に対してメマプシン２β−セクレターゼ部位の加水分解を選択的に阻害する化合物および該化合物を含有する医薬組成物に関する。メマプシン１β−セクレターゼ部位に対してメマプシン２β−セクレターゼ部位の加水分解を選択的に阻害する本発明の化合物は、式Ｖで表わされる：
Figure 0004547152
 式Ｖにおいて、Ｙ、Ｚ、ｋおよびｒは、式Ｉのように定義され、そしてＡ３は、各出現例について、以下の式ＩＩで表わされる化合物、またはそれらの光学異性体、ジアステレオマーまたは薬学的に受容可能な塩である：
別の実施形態において、本発明は、式ＶＩで表わされる化合物および該化合物を含有する医薬組成物に関する：
Figure 0004547152
 式ＶＩにおいて、Ｙ、Ｚ、ｋおよびｒは、式Ｉのように定義され、そしてＡ４は、各出現例について、以下の式ＶＩＩで表わされる化合物、またはそれらの光学異性体、ジアステレオマーまたは薬学的に受容可能な塩である：
Figure 0004547152
 式ＶＩＩにおいて、Ｘ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、式ＩＩのように定義され、そしてＲ１８は、置換または非置換ヘテロアラルコキシ、置換または非置換ヘテロアラルキルまたは−ＮＲ２０Ｒ２１である。Ｒ２０およびＲ２１は、それぞれ別個に、−Ｈまたは置換または非置換ヘテロアラルキルである。あるいは、ＲとＲ２０またはＲ２１の１個とは、Ｘおよびそれらが結合する窒素原子と一緒になって、５員、６員または７員の置換または非置換複素環または置換または非置換ヘテロアリール環である。
別の実施形態において、本発明は、式ＶＩＩＩで表わされる化合物および該化合物を含有する医薬組成物に関する：
Figure 0004547152
 式ＶＩＩＩにおいて、式ＶＩＩＩで表わされる化合物のＡ５は、各出現例について、表１の化合物の群、またはそれらの光学異性体、ジアステレオマーまたは薬学的に受容可能な塩から選択される。
別の実施形態において、本発明は、インビトロサンプルに、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該インビトロサンプルにおけるβ−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害する方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、インビトロサンプルに、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該インビトロサンプルにおけるβ−アミロイドタンパク質を減少させる方法に関する（Ｗａｌｓｈ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２５９４５−２５９５２（１９９９）ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ ４１：３１２８−３１３６（２００２））。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該哺乳動物におけるβ−アミロイドタンパク質を減少させる方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、インビトロサンプルに、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該インビトロサンプルにおけるメマプシン１に対するメマプシン２によるβ−セクレターゼ部位の加水分解を選択的に阻害する方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該哺乳動物におけるメマプシン１に対するメマプシン２によるβ−セクレターゼ部位の加水分解を選択的に阻害する方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該哺乳動物におけるβ−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を選択的に阻害する方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、哺乳動物に、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる化合物を投与することにより、該哺乳動物におけるアルツハイマー病を治療する方法に関する。
別の実施形態において、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質に関する：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６および配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６、および配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択される；および化合物であって、ここで、該化合物は、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる。該結晶化タンパク質は、約４．０Å以下のＸ線回折分解能限界を有する。
別の実施形態において、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質に関する：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む；および化合物であって、ここで、該化合物は、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる。該結晶化タンパク質は、約４．０Å以下のＸ線回折分解能限界を有する。
別の実施形態において、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質に関する：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号５でコード化されたアミノ酸配列を含む；および化合物であって、ここで、該化合物は、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩで表わされる。該結晶化タンパク質は、約４．０Å以下のＸ線回折分解能限界を有する。
別の実施形態において、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質に関する：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６および配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；および該タンパク質と会合した化合物であって、ここで、該化合物は、Ｓ３’結合ポケット、Ｓ４’結合ポケットまたはＳ４結合ポケットで、該タンパク質と会合している。好ましくは、該化合物は、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩの化合物である。
別の実施形態において、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質に関する：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６および配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６および配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；および該タンパク質と会合した化合物であって、ここで、該化合物は、Ｓ３結合ポケットで、該タンパク質と会合している。好ましくは、該化合物は、式Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩの化合物である。
別の実施形態において、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質に関する：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６および配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６および配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；および該タンパク質と会合した、式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩＩの化合物であって、ここで、該化合物は、Ｓ３結合ポケットで、該タンパク質と会合している。
本明細書中で記述した発明は、メマプシン２（β−セクレターゼ）の活性を阻害する化合物および該化合物を使用する方法（例えば、β−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害し、アルツハイマー病を治療し、そしてβ−アミロイドタンパク質を減少させる）を提供する。請求した発明の利点には、例えば、メマプシン１活性に対してメマプシン２活性を阻害するための化合物の選択性が挙げられ、それにより、β−セクレターゼに対する特異的な阻害剤およびβ−セクレターゼ活性に関連した疾患または病気の治療を提供する。請求した方法は、メマプシン２阻害剤を使用することにより、β−アミロイドタンパク質の蓄積または産生、ヒトにおけるアルツハイマー病に関連した現象の阻害に関与した生体反応を阻害する方法を提供する。
それゆえ、本発明の化合物は、β−セクレターゼ活性に関連した疾患または病気の治療で使用され得、これは、この疾患または病気（特に、アルツハイマー病）の進行を停止、逆行または減退し得る。
（発明の詳細な説明）
本発明の特徴および他の詳細は、本発明の工程として、または本発明の一部の組合せとして、いずれかとして、今ここで、さらに詳細に記述し、また、請求の範囲で指摘している。本発明の特定の実施形態は、例として示されており、本発明を限定するものではないことが理解できるはずである。本発明の主な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の実施形態で使用できる。本明細書中で引用した参考文献の全ての教示内容は、本明細書中で参考として援用されている。
本明細書中で使用する「脂肪族」との用語は、直鎖、分枝Ｃ１〜Ｃ１２炭化水素または環状Ｃ３〜Ｃ１２炭化水素を意味し、これらは、完全に飽和されているか、または１単位またはそれ以上の不飽和を含有するが、芳香族ではない。例えば、適当な脂肪族基には、置換または非置換の直鎖、分枝または環状アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基およびそれらの混成体（例えば、（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニル）が挙げられる。単独でまたはそれより大きい部分の一部として使用される「アルキル」との用語は、１個〜１２個の炭素原子を含有する直鎖および分枝鎖の両方、あるいは環状の飽和炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は、１個〜約４個の炭素原子を有する直鎖炭化水素基である。
本明細書中で使用するアルキレンとは、他の部分との２個の結合点を有するアルキル基（例えば、メチレン）である。
本明細書中で使用するヘテロアルキルとは、１個またはそれ以上の炭素原子をヘテロ原子で置き換えたアルキル基である。好ましいヘテロアルキルは、メトキシメトキシである。
本明細書中で使用するヒドロキシアルキルとは、１個またはそれ以上の水酸基で置換したアルキル基である。
単独でまたは「アラルキル」または「アラルコキシ」のようなそれより大きい部分の一部として使用される「アリール」との用語は、炭素環式芳香環系（例えば、フェニル）、縮合多環式芳香環系（例えば、ナフチルおよびアントラセニル）、および５個〜約１４個の炭素原子を有する炭素環式非芳香環系に縮合した芳香環系（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロナフチルおよびインダニル）である。
「ヘテロ原子」との用語は、炭素または水素以外の任意の原子を意味する。好ましいヘテロ原子には、窒素、酸素、イオウおよびリンがあり、例えば、窒素およびイオウの任意の酸化形状、および任意の塩基性窒素の四級化形状を含む。
本明細書中で使用する「複素環」との用語は、５員〜１４員、好ましくは、５員〜１０員を有する非芳香族環系を含み、ここで、１個またはそれ以上、好ましくは、１個〜４個の環炭素は、それぞれ、ヘテロ原子で置き換えられている。複素環の例には、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピリミジン−２−オン、ピロリジン−２−オン、ヘキサヒドロ−シクロペンタ［ｂ］フラニル、ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピラノン、［１，３］−ジオキサニル、［１，３］−ジチアニル、テトラヒドロチオフェニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピロリジノン、ピペラジニル、ピペリジニルおよびチアゾリジニルが挙げられる。また、本明細書中で使用する「複素環」との用語の範囲内には、非芳香族ヘテロ原子含有環が１個またはそれ以上の芳香環または非芳香環に縮合した基（例えば、インドリル、クロマニル、フェナントリジニルまたはテトラヒドロキノリニル）が含まれ、この場合、そのラジカルまたは結合点は、この非芳香族ヘテロ原子含有環上にある。好ましい複素環には、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピロリジニル、テトラヒドロピリミジン−２−オンおよびピロリジン−２−オンがある。
単独でまたは「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルコキシ」のようなそれより大きい部分の一部として使用される「ヘテロアリール」との用語は、５員〜１４員および少なくとも１個のヘテロ原子を有する芳香環系を意味する。好ましくは、ヘテロアリールは、１個〜約４個のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール環の例には、ピラゾリル、フラニル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジニル、プリニル、ピリダジニル、ピラジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チエニル、４，６−ジヒドロ−チエノ［３，４−ｃ］ピラゾリル、５，５−ジオキシド−４，６−ジヒドロチエノ［３，４−ｃ］ピラゾリル、チアナフテニル、１，４，５，６−テトラヒドロシクロペンタピラゾリル、カルバゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、インドリル、アザインドリル、インダゾリル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、イソインドリル、アクリジニルおよびベンゾイサゾリルが挙げられる。好ましいヘテロアリール基には、ピラゾリル、フラニル、ピリジル、キノリニル、インドリルおよびイミダゾリルがある。
ヘテロアザアリールとは、そのヘテロ原子の少なくとも１個が窒素であるヘテロアリールである。好ましいヘテロアザアリール基には、ピラゾリル、イミダゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、ピロリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、チアゾリル、トリアゾリル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリルおよびベンゾイサゾリルがある。ピラゾリルは、最も好ましいヘテロアザアリールである。
本明細書中で使用するアラルキル基は、１個〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基により化合物に結合したアリール置換基である。好ましいアラルキル基には、ベンジルおよびインダニルメチルがある。
本明細書中で使用するヘテロシクロアルキル基は、１個〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基により化合物に結合した複素環置換基である。好ましいヘテロシクロアルキル基には、テトラヒドロフラニルメチルおよびピロリジニルメチルがある。
本明細書中で使用するヘテロアラルキル基は、１個〜１２個の炭素原子を有する直鎖または分枝アルキル基により化合物に結合したヘテロアリール置換基である。好ましいヘテロアラルキル基には、ピラゾリルメチル、２−ピラゾリルエチル、２−ピラゾリル−１−メチルエチルおよび２−ピラゾリル−１−イソプロピルエチルがある。
本明細書中で使用するアルコキシ基は、酸素原子を介して化合物に連結した直鎖または分枝または環状Ｃ１〜Ｃ１２または環状Ｃ３〜Ｃ１２アルキル基である。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシおよびｔ−ブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で使用するヘテロシクロオキシは、酸素置換基を介して分子に結合した複素環基である。
本明細書中で使用するアラルコキシ基は、アラルキルのＣ１〜Ｃ１２アルキル部分上の酸素置換基を介して化合物に結合したアラルキル基である。好ましいアリールアルコキシは、フェニルメトキシである。
本明細書中で使用するヘテロアラルコキシ基は、ヘテロアラルキルのＣ１〜Ｃ１２アルキル部分上の酸素置換基を介して化合物に結合したヘテロアラルキル基である。好ましいアリールアルコキシには、ピラゾリルメトキシおよび２−ピラゾリルエトキシがある。
本明細書中で使用するヘテロシクロアルコキシ基は、ヘテロアラルキルのＣ１〜Ｃ１２アルキル部分上の酸素置換基を介して化合物に結合したヘテロシクロアルキル基である。
本明細書中で使用するアルキルスルファニルアルキル基は、２個のＣ１〜Ｃ１２アルキル基に結合したイオウ原子であり、ここで、これらのアルキル基の１個はまた、化合物に結合している。
ハロゲンは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉである。
ハロアルキルは、１個またはそれ以上のハロゲンで置換されたアルキル基である。
ハロアルコキシは、１個またはそれ以上のハロゲンで置換されたアルコキシ基である。
アリール（アラルキル、アラルコキシなどを含めて）またはヘテロアリール（ヘテロアラルキルおよびヘテロアラルコキシなどを含めて）は、１個またはそれ以上の置換基を含有し得る。適当な置換基の例には、脂肪族基、アリール基、ハロアルコキシ基、ヘテロアリール基、ハロ、ヒドロキシ、ＯＲ２４、ＣＯＲ２４、ＣＯＯＲ２４、ＮＨＣＯＲ２４、ＯＣＯＲ２４、ベンジル、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）、シアノ、ニトロ、ＳＯ３ −、ＳＨ、ＳＲ２４、ＮＨ２、ＮＨＲ２４、ＮＲ２４Ｒ２５、ＮＲ２４Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２５およびＣＯＯＨが挙げられ、ここで、Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ別個に、脂肪族基、アリール基またはアラルキル基である。アリール基またはヘテロアリール基のための他の置換基には、−Ｒ２６、−ＯＲ２６、−ＳＲ２６、１，２−メチレン−ジオキシ、１，２−エチレンジオキシ、保護ＯＨ（例えば、アシルオキシ）、フェニル（Ｐｈ）、置換Ｐｈ、−Ｏ（Ｐｈ）、置換−Ｏ（Ｐｈ）、−ＣＨ２（Ｐｈ）、置換−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）、置換−ＣＨ２ＣＨ２（Ｐｈ）、−ＮＲ２６Ｒ２７、−ＮＲ２６ＣＯ２Ｒ２７、−ＮＲ２６ＮＲ２７Ｃ（Ｏ）Ｒ２８、−ＮＲ２６Ｒ２７Ｃ（Ｏ）ＮＲ２８Ｒ２９、−ＮＲ２６ＮＲ２７ＣＯ２Ｒ２８、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、−ＣＯ２Ｒ２６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２６Ｒ２７、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１６Ｒ２７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ２６、−ＳＯ２ＮＲ２６Ｒ２７、−Ｓ（Ｏ）Ｒ２６、−ＮＲ２６ＳＯ２ＮＲ２６Ｒ２７、−ＮＲ２６ＳＯ２Ｒ２７、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ２６Ｒ２７、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲ２６Ｒ２７、−（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２６が挙げられ、ここで、Ｒ２６、Ｒ２７およびＲ２８は、それぞれ別個に、水素、置換または非置換ヘテロアリールまたは複素環、フェニル（Ｐｈ）、置換Ｐｈ、−Ｏ（Ｐｈ）、置換−Ｏ（Ｐｈ）、−ＣＨ２（Ｐｈ）または置換−ＣＨ２（Ｐｈ）である；そしてｙは、０〜６である。脂肪族基またはフェニル基上の置換基の例には、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、ハロゲン、アルキル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ヒドロキシ、ハロアルコキシまたはハロアルキルが挙げられる。ヘテロアリール基に好ましい置換基（例えば、ピラゾール基）は、置換または非置換脂肪族基、−ＯＲ９、−Ｒ２３−Ｏ−Ｒ９、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−ＮＲ９Ｒ１０、グアニジノ、−ＯＰＯ３ −２、−ＰＯ３ −２、ＯＳＯ３ −、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ９、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ９、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）２Ｒ１０、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロアラルキル、置換または非置換複素環、または置換または非置換ヘテロシクロアルキルであり、ここで、Ｒ９およびＲ１０は、それぞれ別個に、Ｈ、脂肪族基、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルであり、ここで、該脂肪族基、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルは、必要に応じて、１個またはそれ以上の脂肪族基で置換されている。
脂肪族基、アルキレン、ヘテロアルキルの炭素原子、および複素環（ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロオキシおよびヘテロシクロアルコキシを含めて）は、１個またはそれ以上の置換基を含有し得る。複素環の脂肪族基の飽和炭素上の適当な置換基の例には、アリール基またはヘテロアリール基について上で枚挙したものおよび以下が挙げられる：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＨＲ２９、＝ＮＮＲ２９Ｒ３０、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ２９、＝ＮＮＨＣＯ２（アルキル）、＝ＮＮＨＳＯ２（アルキル）または＝ＮＲ２９（ここで、各Ｒ２９およびＲ３０は、それぞれ別個に、水素、非置換脂肪族基または置換脂肪族基から選択される）。この脂肪族基上の置換基の例には、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、ハロゲン、アルキル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルオキシ、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アルコキシ、チオアルキル、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ヒドロキシ、ハロアルコキシまたはハロアルキルが挙げられる。
非芳香族複素環の窒素またはヘテロアリールの不飽和窒素上の適当な置換基には、−Ｒ３１、−ＮＲ３１Ｒ３２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３１、−ＣＯ２Ｒ３１、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ３１、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ３１、−ＳＯ２Ｒ３１、−ＳＯ２ＮＲ３１Ｒ３２、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ３１Ｒ３２、−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＲ３１Ｒ３２および−ＮＲ３１ＳＯ２Ｒ３２が挙げられる；ここで、Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ別個に、水素、脂肪族基、置換脂肪族基、フェニル（Ｐｈ）、置換Ｐｈ、−Ｏ（Ｐｈ）、置換−Ｏ（Ｐｈ）、−ＣＨ２（Ｐｈ）またはヘテロアリールまたは複素環である。脂肪族基またはフェニル環上の置換基の例には、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノカルボニル、ハロゲン、アルキル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニルオキシ、アルコキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ヒドロキシ、ハロアルコキシまたはハロアルキルが挙げられる。
疎水性基とは、オクタン中での化合物の溶解度を下げないかオクタン中での化合物の溶解度を高める基である。疎水性基の例には、脂肪族基、アリール基およびアラルキル基が挙げられる。
本明細書中で使用する「天然アミノ酸」との用語は、当該技術分野で公知の２３種の天然アミノ酸を意味し、これらは、以下のとおりである（３文字の略語で表示する）：Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ。本明細書中で使用する「アミノ酸の側鎖」との用語は、天然アミノ酸のα−炭素上の置換基である。
「非天然アミノ酸」との用語は、式ＮＨ２−Ｃ（Ｒ３２）２−ＣＯＯＨの化合物を意味し、ここで、Ｒ３２は、各出現例について、別個に、当業者により認められた任意の側鎖部分である；非天然アミノ酸の例には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒドロキシプロリン、ホモプロリン、４−アミノ−フェニルアラニン、ノルロイシン、シクロヘキシルアラニン、α−アミノイソ酪酸、Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グリシン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、第三級ブチルグリシン、α−アミノ酪酸、第三級ブチルアラニン、オルニチン、α−アミノイソ酪酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸など、およびそれらの誘導体が挙げられ、特に、ここで、このアミン窒素は、モノ−またはジ−アルキル化されている。
ペプチド置換基は、あるアミノ酸のα−アミンと隣接アミノ酸のα−カルボン酸との反応により形成されたアミド結合を介して共に連結された天然または非天然アミノ酸の配列である。好ましくは、ペプチド配列は、天然アミノ酸だけを含む。１実施形態では、ペプチド置換基は、約６個の天然アミノ酸の配列である。他の実施形態では、ペプチド置換基は、２個の天然アミノ酸の配列である。さらに他の実施形態では、ペプチド置換基は、１個の天然アミノ酸である。
本明細書中で使用する「遷移状態アイソスター」または「アイソスター」とは、２個またはそれ以上の天然または非天然アミノ酸の配列を有する化合物であり、ここで、２個の連続したアミノ酸間の少なくとも１個のアミド結合は、そのアミドの−ＮＨ−基が−ＣＨ２−基で置き換えられかつアミド基のカルボニルが−ＣＨ（ＯＨ）−で置き換えられるように、改変されている。このアイソスターはまた、本明細書中では、ペプチドの一対のアミノ酸間のアミド連鎖が改変されてアミノ酸間でヒドロキシエチレン連鎖を形成するので、「ヒドロキシエチレンアイソスター」とも呼ばれている。ヒドロキシエチレン基は、アミド連鎖の加水分解の遷移状態のアイソスターである。好ましくは、アイソスターは、改変アミド連鎖を１個だけ有する。ペプチドアイソスターのヒドロキシエチレン成分はまた、本明細書中では、「＊」または「Ψ」と呼ばれている。例えば、ジ−アイソスターの表現ロイシン＊アラニン、Ｌｅｕ＊Ａｌａ、Ｌ＊ＡまたはＬΨＡは、それぞれ、以下の構造を意味する：
Figure 0004547152
 ここで、この分子の囲み部分は、その分子のヒドロキシエチレン成分を意味する。
「結合ポケット」または「結合サブサイト」または「サブサイト」とは、酵素またはプロテアーゼ内で、化合物の官能基または側鎖またはそれらへの基質結合と相互作用する酵素またはプロテアーゼ内の位置を意味する。メマプシン１およびメマプシン２内のサブサイトは、ＳｑおよびＳｑ’で標識されており、そしてペプチド基質またはペプチドアイソスター（例えば、本発明の化合物）の側鎖ＰｑおよびＰｑ’と相互作用しているか、そうでなければ、収容し、その結果、このペプチド基質またはペプチド阻害剤のＰｑ側鎖は、その酵素のＳｑサブサイト内のアミノ酸残基と相互作用する。ｑは、ＳｃｈｅｃｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒの命名法に従って、その酵素により開裂されたペプチド基質の切断し易い結合に対して、また、ヒドロキシエチルアイソスター阻害剤（例えば、本発明の化合物）のヒドロキシエチル基に対して、遠位で高くなる整数である（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９６７），２７：１５７−１６２）。サブサイトの組成は、その化合物がサブサイトに結合したとき、またはそうでなければ、近接する溶媒アクセス可能な表面を形成するとき、この化合物の相互作用距離内にある酵素またはプロテアーゼの一連のアミノ酸であり、これらは、そのアミノ酸配列内のそれらの数で示される。アスパラギン酸のプロテアーゼサブサイトの代表的な参考文献には、以下が挙げられ、それらの教示内容は、その全体が本明細書中で参考として援用されている：Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１９：１８９−２１５（１９９０）およびＢａｉｌｅｙ，Ｄ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｂ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３：２１２９−２１４３（１９９４）。さらに具体的には、サブサイトは、水分子にアクセス可能な近接表面または非近接表面に相当する酵素の原子の基を規定することにより定義され、その表面は、ペプチド基質またはペプチド阻害剤がサブサイトに結合するとき、ペプチド基質またはペプチド阻害剤（例えば、本発明の化合物）の官能基または側鎖と相互作用する可能性を有する。
「相互作用距離」は、基礎教本、例えば、Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．，「Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、（１９８５），Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋで記載されているように、ファンデルワールス相互作用、水素結合またはイオン相互作用に適当な距離として、定義される。一般に、互いの４．５Å以内にある原子は、互いの相互作用距離内に入ると考えられている。
本発明の化合物の多くでは、上記命名法を使用するとき、その側鎖がＰ３、Ｐ４などと標識されるアミノ酸残基は、アミノ酸ではない化学基で置き換えた。それゆえ、式ＩＩ、ＩＶおよびＶＩＩの化合物では、それぞれ、Ｒ１は、Ｘと一緒になって、Ｒ１９は、Ｘと一緒になって、そして、Ｒ１８は、Ｘと一緒になって、アミノ酸残基だけでなく、上で定義した他の化学基も含有し得る（Ｒ１、Ｒ１９およびＲ１８の定義を参照）。本発明の化合物において、Ｒ１がＸと一緒になって、Ｒ１９がＸと一緒になって、またはＲ１８がＸと一緒になって、ペプチド基であるとき、そのペプチド基の側鎖は、Ｐ３、Ｐ４などと標識され、そして上記命名法と同様に、酵素サブサイトＳ３およびＳ４で結合する。本発明の化合物において、Ｒ１がＸと一緒になって、Ｒ１９がＸと一緒になって、またはＲ１８がＸと一緒になって、非ペプチド部分であるとき、これらの基はまた、その酵素のＳ３サブサイトおよび／またはＳ４サブサイトで結合し得る。
「基質」とは、以下の図式に従って、その酵素の活性部位間隙に結合し得る化合物である：
Figure 0004547152
 上記反応図式では、「Ｅ」は、酵素であり、「Ｓ」は、基質であり、そして「Ｅ・Ｓ」は、基質に結合された酵素の複合体である。この酵素と基質との複合体化は、可逆反応である。
式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物および表１の化合物は、薬学的に受容可能な酸との塩として、存在し得る。本発明は、このような塩を包含する。このような塩の例には、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（例えば、（＋）−酒石酸塩、（−）−酒石酸塩またはそれらの混合物（ラセミ混合物を含める））、コハク酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸のようなアミノ酸との塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法により、調製され得る。
式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物および表１の化合物（これは、酸性置換基を有する）は、薬学的に受容可能な塩基との塩として存在し得る。本発明は、このような塩を包含する。このような塩の例には、ナトリウム塩、カリウム塩、リジン塩およびアルギニン塩が挙げられる。これらの塩は、当業者に公知の方法により、調製され得る。
式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの特定の化合物および表１の化合物は、１個またはそれ以上のキラル中心を含み得、そして異なる光学活性形態で存在し得る。式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物または表１の化合物が１つのキラル中心を含むとき、これらの化合物は、２種の鏡像異性形態で存在し、本発明は、鏡像異性体および鏡像異性体混合物（例えば、ラセミ混合物）の両方を包含する。これらの鏡像異性体は、当業者に公知の方法（例えば、ジアステレオ異性体塩（これは、例えば、結晶化により、分離され得る）の形成；ジアステレオ異性体誘導体または錯体（これは、例えば、結晶化、気液クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーにより、分離され得る）の形成；ある鏡像異性体と鏡像異性体に特異的な試薬との選択的な反応（例えば、酵素的エステル化）；またはキラル環境（例えば、キラル支持体（例えば、キラル配位子を結合したシリカ）上またはキラル溶媒の存在下）での気液クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィー）により、分離され得る。所望の鏡像異性体が上記分離手順の１つにより他の化学要素に変換される場合、所望の鏡像異性体形態を遊離するさらに別の工程が必要であることが分かる。あるいは、特定の鏡像異性体は、光学活性試薬、基質、触媒または溶媒を使用する不斉合成により、または一方の鏡像異性体を不斉変換によりもう一方の鏡像異性体に変換することにより、合成され得る。
式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物または表１の化合物は、１個より多いキラル中心を含むとき、ジアステレオ異性体の形態で存在し得る。そのジアステレオ異性体対は、当業者に公知の方法（例えば、クロマトグラフィーまたは結晶化）により分離され得、各対内の個々の鏡像異性体は、上記のようにして、分離され得る。本発明は、式Ｉの化合物の各ジアステレオ異性体およびそれらの混合物を包含する。
式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの特定の化合物または表１の化合物は、双性イオン形態で存在し得、本発明は、式（Ｉ）の化合物の各双性イオン形態およびそれらの混合物を包含する。
好ましい実施形態では、式ＩＩまたはＩＶの化合物は、別々に、またはそれらの各個の医薬組成物と共に、それぞれ、Ｒ１基またはＲ１９基を有し、このＲ１基またはＲ１９基は、Ｘと共に、天然アミノ酸誘導体または非天然アミノ酸誘導体である。この実施形態の化合物は、好ましくは、式ＩＸで表わされる：
Figure 0004547152
 式ＩＸでは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、式ＩＩのように定義され、Ｒ１６は、式ＩＶのように定義され、そしてＲ１７は、置換脂肪族基または非置換脂肪族基である。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩまたはＶＩＩの化合物は、別々に、またはそれらの各個の医薬組成物と共に、それぞれ、Ｒ１基またはＲ１８基を有し、このＲ１基またはＲ１８基は、置換ヘテロアラルコキシまたは非置換ヘテロアラルコキシあるいは置換ヘテロアラルキルまたは非置換ヘテロアラルキルである。この実施形態の化合物は、好ましくは、式Ｘで表わされる：
Figure 0004547152
 式Ｘでは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、式ＩＩのように定義される。Ｘ１は、−Ｏ−、−ＮＲ２２−または共有結合である。Ｒ７は、置換アルキレンまたは非置換アルキレンである。ｍは、０、１、２または３である。Ｒ８は、置換脂肪族基または非置換脂肪族基、−ＯＲ９、−Ｒ２３−Ｏ−Ｒ９、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ＮＲ９Ｒ１０、グアニジノ、−ＯＰＯ３ −２、−ＰＯ３ −２、ＯＳＯ３ −、−Ｓ（Ｏ）ｐＲ９、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）Ｒ９、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ９、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）Ｒ１０、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ９Ｒ１０、−ＮＲ９Ｃ（Ｏ）２Ｒ１０、置換アリールまたは非置換アリール、置換アラルキルまたは非置換アラルキル、置換ヘテロアリールまたは非置換ヘテロアリール、置換ヘテロアラルキルまたは非置換ヘテロアラルキル、置換複素環または非置換複素環または置換ヘテロシクロアルキルまたは非置換ヘテロシクロアルキルである。ｐは、０、１または２である。Ｒ９およびＲ１０は、式ＩＶのように定義される。Ｒ２３は、置換または非置換のアルキレンである。Ｒ２２は、−Ｈである。あるいは、ＲおよびＲ２２は、Ｘおよびそれらが結合する窒素と一緒になって、５員、６員または７員の置換または非置換の複素環または置換または非置換のヘテロアリール環を形成する。
好ましい１実施形態では、式ＩＩのＲ１は、−ＯＲ１５または−ＮＲ１５Ｒ１６である。Ｒ１５およびＲ１６は、式ＩＶのように定義される。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩのＲ１は、置換脂肪族基である。さらに好ましくは、Ｒ１は、脂肪族基であり、この脂肪族基は、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）２Ｒ１６、−ＮＲ１５Ｃ（Ｏ）Ｒ１６および−ＮＲ１５Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６からなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されている。Ｒ１５およびＲ１６は、式ＩＶのように定義される。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩのＲ１は、Ｘと一緒になって、式ＸＩで表わされるペプチドである：
Figure 0004547152
 式ＸＩでは、Ｐ３およびＰ４は、それぞれ別個に、アミノ酸側鎖である。Ｐ５は、トリプトファン側鎖、メチオニン側鎖およびロイシン側鎖からなる群から選択されるアミノ酸側鎖である。Ｐ６は、トリプトファン側鎖である。Ｐ７は、トリプトファン側鎖、チロシン側鎖およびグルタミン酸側鎖からなる群から選択されるアミノ酸側鎖である。Ｐ８は、トリプトファン側鎖、チロシン側鎖およびグルタミン酸側鎖からなる群から選択されるアミノ酸側鎖である。さらに好ましくは、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７およびＰ８は、それぞれ、トリプトファン側鎖である。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩ、ＩＶまたはＶＩＩのＰ１は、脂肪族基である。さらに好ましくは、Ｐ１は、イソブチル、ヒドロキシメチル、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、フェニルメチル、シクロペンチルメチルおよびヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩ、ＩＶまたはＶＩＩのＰ２’は、疎水性基である。さらに好ましくは、Ｐ２’は、イソプロピルまたはイソブチルである。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩ、ＩＶまたはＶＩＩのＰ２は、疎水性基である。さらに好ましくは、Ｐ２は、−Ｒ１１ＳＲ１２、−Ｒ１１Ｓ（Ｏ）Ｒ１２、−Ｒ１１Ｓ（Ｏ）２Ｒ１２、−Ｒ１１Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、−Ｒ１１ＯＲ１２、−Ｒ１１ＯＲ１４ＯＲ１３またはヘテロシクロアルキルであり、ここで、このヘテロシクロアルキルは、必要に応じて、１個またはそれ以上のアルキル基で置換されている。Ｒ１１およびＲ１４は、それぞれ別個に、アルキレンである。Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ別個に、Ｈ、脂肪族基、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアラルキルである。さらにより好ましくは、Ｐ２は、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−２−イル−メチル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロフラン−３−イル−メチル、ピロリジン−２−イル−メチル、ピロリジン−３−イル−メチルまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＯＣＨ３である。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩ、ＩＶまたはＶＩＩにおいて、Ｒ２は、Ｈであり、そしてＲ３は、それが結合する窒素と一緒になって、ペプチドである。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩ、ＩＶまたはＶＩＩにおいて、Ｒ２は、Ｈであり、そしてＲ３は、２−フラニルメチル、フェニルメチル、インダン−２−イル、ｎ−ブチル、イソプロピル、イソブチル、１−フルオロメチル−２−フルオロエチル、インドール−３−イルおよび３−ピリジルメチルからなる群から選択される。
他の好ましい実施形態では、式ＩＩ、ＩＶまたはＶＩＩのＲ２およびＲ３は、それらが結合する窒素と一緒になって、モルホリノ、ピペラジニルまたはピペリジニルを形成し、ここで、このモルホリノ、ピペラジニルおよびピペリジニルは、必要に応じて、１個またはそれ以上の脂肪族基で置換されている。
他の実施形態では、式ＩＩのＲ１は、置換または非置換のヘテロアラルコキシまたは置換または非置換のヘテロアラルキルである。
他の好ましい実施形態では、式ＩのＲ１または式ＶＩＩのＲ１８は、置換または非置換のヘテロアラルコキシまたは置換または非置換のヘテロアラルキルであり、ここで、このヘテロアラルコキシまたはヘテロアラルキルのこのヘテロアリール基は、置換または非置換のピラゾリル、置換または非置換のフラニル、置換または非置換のイミダゾリル、置換または非置換のイソキサゾリル、置換または非置換のオキサジアゾリル、置換または非置換のオキサゾリル、置換または非置換のピロリル、置換または非置換のピリジル、置換または非置換のピリミジル、置換または非置換のピリダジニル、置換または非置換のチアゾリル、置換または非置換のトリアゾリル、置換または非置換のチエニル、置換または非置換の４，６−ジヒドロ−チエノ［３，４−ｃ］ピラゾリル、置換または非置換の５，５−ジオキシド−４，６−ジヒドロチエノ［３，４−ｃ］ピラゾリル、置換または非置換のチアナフテニル、置換または非置換のカルバゾリル、置換または非置換のベンズイミダゾリル、置換または非置換のベンゾチエニル、置換または非置換のベンゾフラニル、置換または非置換のインドリル、置換または非置換のキノリニル、置換または非置換のベンゾトリアゾリル、置換または非置換のベンゾチアゾリル、置換または非置換のベンゾオキサゾリル、置換または非置換のベンズイミダゾリル、置換または非置換のイソキノリニル、置換または非置換のイソインドリル、置換または非置換のアクリジニルおよび置換または非置換のベンゾイサゾリルからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、式ＩのＲ１または式ＶＩＩのＲ１８は、置換または非置換のヘテロアラルコキシまたは置換または非置換のヘテロアラルキルであり、ここで、このヘテロアラルコキシまたはヘテロアラルキルのこのヘテロアリール基は、ヘテロアザアリールである。さらにより好ましい実施形態では、上記ヘテロアザアリールは、置換または非置換のピラゾリル、置換または非置換のイミダゾリル、置換または非置換のイソキサゾリル、置換または非置換のオキサジアゾリル、置換または非置換のオキサゾリル、置換または非置換のピロリル、置換または非置換のピリジル、置換または非置換のピリミジル、置換または非置換のピリダジニル、置換または非置換のチアゾリル、置換または非置換のトリアゾリル、置換または非置換のベンズイミダゾリル、置換または非置換のキノリニル、置換または非置換のベンゾトリアゾリル、置換または非置換のベンゾオキサゾリル、置換または非置換のベンズイミダゾリル、置換または非置換のイソキノリニル、置換または非置換のインドリル、置換または非置換のイソインドリルおよび置換または非置換のベンゾイサゾリルからなる群から選択される。
他の好ましい実施形態では、本発明の化合物は、キャリア分子を含まない。この実施形態では、式Ｉ、ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩＩにおいて、ｋは、０であり、そしてｒは、１である。
本発明の他の好ましい実施形態では、式Ｉ、ＩＩＩ、ＶまたはＶＩＩにおいて、ｋは、１であり、そしてｒは、１である。この実施形態では、各アイソスター阻害剤は、１個のキャリア分子に結合している。
本発明の化合物（これらは、本明細書中では、「阻害剤」または「阻害化合物」と呼ばれている）は、番号で参照される。これらの阻害剤はまた、「ＧＴ−１」に続く数字表示（例えば、ＧＴ−１１３８）、「ＭＭ」に続く数字表示（例えば、ＭＭ１３８）、「ＭＭＩ」に続く数字表示（例えば、ＭＭＩ−１３８）または「ＯＭ」に続く数字表示（例えば、ＯＭ−１３８）で呼ばれる。本明細書中で記述する「ＧＴ−１」、「ＭＭ」、「ＭＭＩ」および「ＯＭ」との記号は、等価である。同様に、「ＧＴ−１」、「ＭＭ」、「ＭＭＩ」および「ＯＭ」なしで「ＧＴ−１」、「ＭＭ」、「ＭＭＩ」および「ＯＭ」に続いて数値を使用することは、「ＧＴ−１」、「ＭＭ」、「ＭＭＩ」および「ＯＭ」の接頭辞を付けた同じ化合物を意味する。それゆえ、例えば、「ＧＴ−１１３８」、「ＭＭ １３８」、「ＭＭＩ−１３８」、「ＯＭ−１３８」と、「１３８」とは、同じ阻害化合物を意味する。
他の実施形態では、本発明は、メマプシン１β−セクレターゼに対してメマプシン２β−セクレターゼを選択的に阻害する方法を包含し、この方法は、本発明の化合物を投与する工程を包含する。メマプシン１β−セクレターゼと比較したメマプシン２β−セクレターゼの選択的な阻害は、インビトロサンプルまたは哺乳動物において、行うことができる。
本明細書中で使用する「選択的に阻害する」または「選択的阻害」とは、各々の阻害割合（「％ｉｎｈ」）で測定されるとき、同じ条件下にて、本発明の化合物がメマプシン１のβ−セクレターゼ活性を阻害、阻止または減少させる能力よりも、同じ化合物がメマプシン２のβ−セクレターゼ活性を阻害、阻止または減少させる能力の方が高いことを意味する。「阻害割合」は、以下のようにして計算される：％ｉｎｈ＝（１−Ｖｉ／Ｖ０）×１００。例えば、図２および表９で示すように、阻害剤化合物１３８（これはまた、本明細書中にて、ＭＭＩ−１３８およびＧＴ−１１３８とも呼ばれる）は、化合物１３８がメマプシン１β−セクレターゼ活性を阻害するよりも約６０倍高い様式で、メマプシン２の酵素活性を阻害する（メマプシン２のＫｉ１４．２ｎＭとメマプシン１のＫｉ８１１．５ｎＭとの比較）。それゆえ、化合物１３８は、メマプシン１に対するメマプシン２の選択的阻害剤であり、すなわち、メマプシン１β−セクレターゼ活性に対して、メマプシン２β−セクレターゼ活性を選択的に阻害する。
本明細書中で使用する「メマプシン１に対して」とは、メマプシン１のβ−セクレターゼ活性と比較したメマプシン２のβ−セクレターゼ活性を意味する。本発明の阻害剤化合物がβ−セクレターゼ活性を阻害する能力は、化合物がβ−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位のメマプシン１切断を阻害する程度と比較して、同じ化合物がβ−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位のメマプシン２切断を阻害する程度を決定することにより、評価できる。これらのデータは、例えば、Ｋｉ、見かけ上のＫｉ、Ｖｉ／Ｖ０、または阻害割合として表わすことができ、そしてメマプシン１β−セクレターゼ活性に対するメマプシン２β−セクレターゼ活性についての化合物の阻害を描写する。例えば、もし、本発明の阻害剤化合物とメマプシン１との間の反応のＫｉが１０００であり、そして本発明の阻害剤化合物とメマプシン２との間の反応のＫｉが１００であるなら、この阻害剤化合物は、メマプシン１に対して、メマプシン２のβ−セクレターゼ活性を１０倍阻害する。
Ｋｉは、阻害平衡定数であり、これは、化合物がメマプシン２およびメマプシン１のβ−セクレターゼ活性を阻害する能力を示す。Ｋｉの数値が低いことは、本発明の化合物がメマプシン２またはメマプシン１に対して高い親和性を有することを意味する。このＫｉ値は、基質とは無関係であり、そして見かけ上のＫｉから変換される。
見かけ上のＫｉ（Ｋｉ ａｐｐまたはＫｉ ａｐｐａｒｅｎｔ）、基質存在下にて、既に確立された技術に従って、決定される（例えば、Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．，Ｂａｙｅｒ−Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｖ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐｐ．４６３−４６９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）を参照）。
Ｖｉ／Ｖ０は、本発明の化合物の非存在下（Ｖ０）または存在下（Ｖｉ）にて、メマプシン１またはメマプシン２による基質ＦＳ−２の初期切断速度の比を示す（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２４５０−１２４５６（２０００））。１．０のＶｉ／Ｖ０値は、本発明の化合物が、酵素メマプシン１またはメマプシン２のβ−セクレターゼ活性を阻害しないことを意味する。１．０未満のＶｉ／Ｖ０値は、本発明の化合物が、酵素メマプシン１またはメマプシン２のβ−セクレターゼ活性を阻害することを意味する。表１で示したＶｉ／Ｖ０値は、酵素および阻害剤の濃度が等しい（例えば、約８０ｎＭ、１００ｎＭ）という条件で決定した。
（表１）
Figure 0004547152
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 立体化学が示されていない場合、その化合物は、異性体混合物である。
Figure 0004547152
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 Ｎ．Ｉ．は、阻害なしである。
見かけ上のＫｉの標準誤差は、周知の技術を使用して、本発明の化合物の異なる濃度（例えば、約１０ｎＭ〜約１０００ｎＭの間）で測定したＶｉ／Ｖｏの非線形回帰からの誤差である（例えば、Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．，Ｂａｙｅｒ−Ｓｙｍｐｏｓｉｉｕｍ Ｖ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐｐ．４６３−４６９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）を参照のこと。
メマプシン（ｍｅｍａｐｓｉｎ）１および２に対する阻害剤のＫｉａｐｐ（見かけ上のＫｉ）を、以前に記載された手順（Ｅｒｍｏｌｉｅｆ，Ｊ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００）（この教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用して、決定した。Ｋｉａｐｐに対するＫｉ（基質濃度に非依存性）の関係は、以下の関係によって表される、このアッセイにおける基質濃度と、メマプシン１またはメマプシン２のいずれかによる基質の切断についてのＫｍの関数である：
Ｋｉａｐｐ＝Ｋｉ（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）。
「メマプシン１」または「メマプシン１タンパク質」とは、本明細書中で使用される場合、配列番号４のアミノ酸５８〜４６１を含むタンパク質をいう。
一実施形態において、メマプシン１は、膜貫通タンパク質（配列番号２（図５））を含む。配列番号２（図５）の膜貫通タンパク質は、アミノ酸残基４６７〜４９４である。配列番号２（図５）のシグナルペプチドは、アミノ酸残基１〜２０である。配列番号２（図５）のプロペプチドは、アミノ酸残基２１〜６２である。
メマプシン１をコードする構築物は、宿主細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞もしくは２９３細胞のような哺乳動物宿主細胞、またはＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞）において発現され得る。本明細書中で用いられるプロメマプシン１−Ｔ１をコードする核酸配列（配列番号３（図６））は、配列番号１（図４）において、４７位で、Ｃの代わりにＧを有し、そして配列番号１（図４）において、９１位で、Ｇの代わりにＡを有する。これら２つの核酸の差異は、アミノ酸残基１６（配列番号４（図７））において、アラニン（配列番号２（図５）の２１位）の代わりにグリシン残基を生じ；そしてアミノ酸残基３１（配列番号４（図７））において、アラニン（配列番号２（図５）の３６位）の代わりにスレオニンを有する。
プロメマプシン１−Ｔ１をコードする核酸構築物（配列番号４（図７））を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてそのタンパク質を、封入体から精製し、そしてｐＨ３〜５で３０分間（３７℃）でインキュベートすることによって、自己触媒的に活性化して、アラニンのアミノ末端（配列番号４（図７）のアミノ酸残基）を有するメマプシン１を得、このメマプシン１を、本発明の化合物による、メマプシン１に対するメマプシン２の阻害を評価するためのアッセイにおいて使用した。
「メマプシン２」または「メマプシン２タンパク質」は、本明細書中で同定されたアミノ酸配列を含む任意のタンパク質であり、これは、配列番号で同定されているか否かに関わらず、基語「メマプシン２」または任意のアミノ酸の配列を含み、基語のメマプシン２を含む用語で標識されたタンパク質（例えば、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６、および配列番号９由来の種々の等価物）由来であり、そしてペプチド結合を加水分解し得ることが、本明細書中で同定されている。一般的に、メマプシン２は、β−セクレターゼ部位（例えば、ＡＰＰ ＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲ（配列番号１１のＳｗｅｄｉｓｈ変異；ネイティブのＡＰＰ ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号１２））を切断し得る。一実施形態において、メマプシン２は、より長い配列の活性化（例えば、自発的活性化、自己触媒的活性化、またはプロテアーゼ（例えば、クロストリパイン））から生じるアミノ酸配列から本質的に構成される。このような活性化から生じるアミノ酸フラグメントから本質的に構成されるメマプシン２の実施形態は、ペプチド結合を加水分解する能力を有する。メマプシン２の結晶化形態は、結晶化の間のβ−セクレターゼ活性の任意の損失にも関わらず、メマプシン２であり続けると考えられる。メマプシン２の実施形態はまた、ＢＡＣＥ、ＡＳＰ２およびβ−セクレターゼと呼ばれる。
一実施形態において、メマプシン２は、膜貫通タンパク質（配列番号６（図９））であり、そして核酸配列番号５（図８）によってコードされる。メマプシン２のこの実施形態（配列番号６（図９））膜貫通ドメインは、アミノ酸残基４５５〜４８０である。
別の実施形態において、メマプシン２は、プロメマプシン２−Ｔ１（核酸配列番号７（図１０）；アミノ酸配列番号８（図１１））であり、そして配列番号５（図８）のヌクレオチド４０〜１３６２由来であり得る。
得られたプロメマプシン２−Ｔ１（配列番号７（図８））の核酸構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、タンパク質を精製し、そして自発的にメマプシン２に活性化した。自発的に活性化したメマプシン２は、配列番号８（図１１）のアミノ酸残基４３〜４５６、および配列番号８（図１１）のアミノ酸残基４５〜４５６を含む。この自発的に活性化されたメマプシン２を、本発明の化合物による、メマプシン１に対するメマプシン２の阻害を評価するためのアッセイ、およびいくつかの結晶化研究に用いた。
プロメマプシン２−Ｔ１が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そして自己触媒的に活性化されて、配列番号８（図１１）のアミノ酸残基１６〜４５６および配列番号８（図１１）のアミノ酸残基２７〜４５６を含むメマプシン２を生成し得ることもまた想定される。
配列番号８（図１１）のアミノ酸残基６０〜４５６；および配列番号９（図１２）のアミノ酸残基２８Ｐから３９３を含むメマプシン２もまた、結晶化研究において用いられ得る。配列番号８（図１１）のアミノ酸残基６０〜４５６を、阻害剤化合物ＭＭＩ−１３８を用いる結晶化研究において使用した。
メマプシン１β−セクレターゼ活性に関してメマプシン２β−セクレターゼ活性を選択的に阻害する化合物は、メマプシン１およびメマプシン２βセクレターゼ活性に関連する疾患もしくは状態または生物学的プロセスではなく、メマプシン２β−セクレターゼ活性に関連する疾患もしくは状態または生物学的プロセスを処置するために有用である。メマプシン１およびメマプシン２の両方は、β−セクレターゼ部位において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断して、β−アミロイドタンパク質（本明細書中では、Ａβ、Ａベータまたはβ−アミロイドペプチドとも呼ばれる）を形成するため、メマプシン１およびメマプシン２は、β−セレクターゼ活性を有する（Ｈｙｕｓｓａｉｎ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２３３２２−２３３２８（２００１）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））。しかし、メマプシン１のβーセクレターゼ活性は、メマプシン２のβーセクレターゼ活性よりも有意に小さい（Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｉ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２３３２２−２３３２８（２００１）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））。メマプシン２は、脳、膵臓および他の組織中に存在し（Ｌｉｎ，Ｘ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１４５６−１４６０（２０００）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））、そしてメマプシン１は、胎盤中に優勢に存在する（Ｌｉｎ，Ｘ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９７：１４５６−１４６０（２０００）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））。アルツハイマー病は、β−セレクターゼ（本明細書中で、メマプシン２、ＡＳＰ２およびＢＡＣＥとも呼ばれる）によるＡＰＰの切断の結果として、脳中のＡβの蓄積に関連する。従って、メマプシン１β−セクレターゼ活性に対してメマプシン２β−セクレターゼ活性を選択的に阻害する化合物を用いる方法が、メマプシン２関連疾患（例えば、アルツハイマー病）の処置において重要である。メマプシン２β−セクレターゼ活性の選択的阻害は、本発明の化合物を、アルツハイマー病の処置における使用のための適切な薬物候補にする。
さらに別の実施形態において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）におけるアルツハイマー病を処置する方法であり、この方法は、この哺乳動物に、本発明の化合物を投与する工程を包含する。本発明の化合物で処置された哺乳動物は、ヒト霊長類、非ヒト霊長類および非ヒト哺乳動物（例えば、げっ歯類、イヌ）であり得る。一実施形態において、この哺乳動物は、β−セレクターゼを阻害する（メマプシン１およびメマプシン２βセレクターゼ活性を阻害する）化合物を投与される。別の実施形態において、この哺乳動物は、メマプシン２β−セレクターゼ活性を選択的に阻害し、かつメマプシン１β−セクレターゼ活性の阻害に対して最小の影響しか有さないかまたは全く影響を有さない化合物を投与される。
さらなる実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるβ−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害する方法であり、この方法は、この哺乳動物に、本発明の化合物を投与する工程を包含する。
「β−セレクターゼ部位」は、メマプシン１またはメマプシン２（本明細書中において、β−セレクターゼおよびＡＳＰ２とも呼ばれる）によって切断（すなわち、加水分解）されるアミノ酸配列である。特定の実施形態において、β−セレクターゼ部位は、配列番号８（図１１）の配列４３〜４５６を有するタンパク質によって切断されるアミノ酸配列である。β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ；図２３、配列番号１０）は、β−セレクターゼ部位（矢印、図２３）において切断されて、β−アミロイドタンパク質を生成する。本発明の一実施形態において、β−セレクターゼ部位は、アミノ酸配列ＳＥＶＫＭ／ＤＡＥＦＲ（配列番号１２）を含み、これはまた、配列番号１０（図２３）のアミノ酸残基６６７〜６７６としても示される。β−セレクターゼは、ＳＥＶＫＭ／ＤＡＥＦＲ（配列番号１２）を、メチオニン（Ｍ）とアスパラギン酸（Ｄ）との間で切断する。本発明の別の実施形態において、β−セレクターゼ部位は、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異ＳＥＶＮＬ／ＤＡＥＦＲ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む。β−セレクターゼは、ＳＥＶＮＬ／ＤＡＥＦＲ（配列番号１１）を、ロイシン（Ｌ）とアスパラギン（Ｄ）との間で切断する。本本発明の化合物は、β−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セレクターゼ部位の加水分解を阻害する。β−セレクターゼ部位は、ＳＥＶＫＭＤＡＥＦＲ（配列番号１２）またはＳＥＶＮＬ／ＤＡＥＦＲ（配列番号１１）を含む任意の化合物であり得る。上記のスラッシュ（「／」）は、隣接アミノ酸残基の間のアミド結合が、メマプシン２によって切断されることを示す。
別の実施形態において、本発明の化合物は、β−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害するために、哺乳動物に投与される。別の実施形態において、これらの化合物は、インビトロサンプルに投与されて、β−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害する。
「インビトロサンプル」とは、本明細書中で使用される場合、哺乳動物全体ではない任意のサンプルをいう。例えば、インビトロサンプルは、メマプシン２と本発明の阻害剤化合物の試験管のインビトロの組合せであり得るか；またはこれらの阻害剤化合物および／またはメマプシンタンパク質（メマプシン１または２）が添加される、インビトロ細胞培養物（例えば、Ｈｅｌａ細胞、２９３細胞）であり得る。
さらなる実施形態において、本発明は、インビトロサンプルまたは哺乳動物におけるβ−アミロイドタンパク質の量または産生を減少させる方法であり、この方法は、本発明の化合物を投与する工程を包含する。β−アミロイドタンパク質の量またはβ−アミロイドタンパク質の産生における減少は、ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡアッセイを含む標準的な技術を使用して測定され得る。β−アミロイドタンパク質の減少またはβ−アミロイドタンパク質の産生の減少は、例えば、インビトロサンプルまたは哺乳動物から得られたサンプル中の細胞培養培地において、測定され得る。哺乳動物から得られたサンプルは、血漿または血清サンプルのような流体サンプルであり得るか；または脳生検のような組織サンプルであり得る。
本発明の化合物は、キャリア分子と共にかまたはなしで投与され得る。「キャリア分子」とは、本明細書中で使用される場合、本発明の化合物（単数または複数）に結合または結合体化される共有結合（分子）によって一緒に保持される原子のクラスターをいう。血液脳関門（ＢＢＢ）を透過するために、このキャリア分子は、比較的小さく（例えば、約５００ダルトン未満）、かつ比較的疎水性でなければならない。本発明の化合物は、共有結合相互作用（例えば、ペプチド結合）によって、または非共有結合相互作用（例えば、イオン結合、水素結合、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ引力）によって、キャリア分子に結合または結合体化され得る。さらに、キャリア分子は、本発明の化合物上の任意の官能基に結合され得る。例えば、キャリア分子は、本発明のペプチド阻害剤のアミノ末端におけるアミノ基に結合され得る。例えば、式ＩＩのＲ１は、キャリア分子であり得る。キャリア分子は、本発明のペプチド阻害剤のカルボン酸末端におけるカルボン酸基に結合され得る。例えば、式ＩＩのＮＲ３Ｒ３は、キャリア分子であり得る。あるいは、キャリア分子は、本発明の化合物の成分であるアミノ酸残基の側鎖（例えば、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’など）に結合され得る。
ＣＰＩ−１と共にインキュベートされた細胞の共焦点顕微鏡画像は、本発明の阻害剤が、細胞の内側に均一に分布していないことを示した。ある程度高い蛍光強度は、エンドゾームおよびリソソームを含む細胞内小胞構造に関連していた。これらの画像は、この阻害剤が、これらの細胞成分区画の内側に捕捉された。このことは、ＣＰＩ−１が、リソソームおよびエンドソームに入る場合、キャリアペプチド部分（この場合は、ｔａｔ）が、リソソーム区画またはエンドソーム区画をでることができない阻害剤を生じるリソソームまたはエンドソーム内のプロテアーゼによって改変されることを示した。
リソソームおよびエンドソームは、多くのプロテアーゼ（ヒドロラーゼ（例えば、カテプシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＨおよびＬ）を含む）を含む。これらのいくつかは、エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤおよびＨ）である。他は、エキソペプチダーゼ（例えば、カテプシンＡおよびＣ）であり、カテプシンＢは、エンドペプチダーゼ活性およびエキソペプチダーゼ活性の両方を有し得る。これらのプロテアーゼの特異性は、ｔａｔペプチドを阻害剤化合物から加水分解するのに十分に広く、従って、キャリアペプチドを等電子阻害剤から加水分解する。
これらの事実によって、薬剤（例えば、式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物、または表１の化合物）の特異的な送達のためのｔａｔおよび他のキャリアペプチドを使用することが可能になる。例えば、送達されるべき式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物、または表１の化合物は、ｔａｔのようなキャリアペプチドに化学的に連結されて、結合体化薬物を生成する。注射のような機構によって哺乳動物に投与される場合、この結合体化化合物は、細胞に浸透し、そしてリソソームおよびエンドソームの内部に浸透する。リソソームおよびエンドソーム中のプロテアーゼは、次いで、ｔａｔを加水分解する。この結合体化化合物は、リソソームおよびエンドソームから離れる能力を失う。
キャリアペプチドは、ｔａｔまたは、リソソームプロテアーゼおよびエンドソームプロテアーゼによって加水分解可能な他の基本的なペプチド（例えば、オリゴ−Ｌ−アルギニン）であり得る。リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼの切断に対して感受性の特定のペプチド結合が、式ＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩの化合物または表１の化合物とキャリアペプチドとの間の連結ペプチド領域に組み込まれ得る。このことは、キャリアペプチドの化合物からの除去を容易にする。例えば、ジペプチドのＰｈｅ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒなどが、カテプシンＤによって切断される。
さらに、解離可能なキャリア分子は、オリゴサッカリド単位、あるいはホスホエステルもしくは脂質エステルまたは他の加水分解可能な結合（これらは、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼまたはリソソームおよびエンドソーム中の他のヒドロラーゼによって切断される）によって化合物に連結された他の分子であり得る。
このタイプの薬物送達は、本発明の阻害剤を、メマプシン２が高濃度で見出されるリソソームおよびエンドソームに送達するために使用され得る。この薬物送達系はまた、リソソーム貯蔵疾患のような疾患を処置するために使用され得る。
一実施形態において、キャリア分子は、ペプチド（例えば、ｔａｔ−ペプチドのＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号１３）（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）、または９アルギニン残基のＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１４）（Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８（２０００）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））である。別の実施形態において、キャリア分子は、カチオン性分子（すなわち、生理学的ｐＨにおいてイオン性である分子）、好ましくはポリカチオン性分子を含む。カチオンを形成する好ましい官能基としては、グアニジン、アミノまたはイミジゾール（ｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）が挙げられる。キャリア分子は、サッカリドまたは以下の官能基の約１〜１０個を含む脂質を含む：グアニジン、アミドまたはイミジゾール。キャリア分子はまた、約１０アミノ酸長の、約１−１０リジン、１−１０アルギニンまたは１−１０ヒスチジン残基、あるいは以下の官能基：グアニジン、アミノまたはイミジゾールを含むアミノ酸の１−１０残基から構成される、ペプチドを含む。キャリア分子はまた、ペプチドではなく、アミノ酸の側鎖を含み、約１−１０リジン、１−１０リジン、１−１０アルギニンまたは１−１０ヒスチジン側鎖、あるいは以下の官能基：グアニジン、アミノまたはイミジゾールを含む１−１０側鎖の組合せから構成される他の構築物を含む。本発明の化合物が、キャリア分子に結合体化または結合される場合、得られる結合体は、本明細書中で、「キャリアペプチド−阻害剤」結合体、または「ＣＰＩ」と呼ばれる。ＣＰＩ結合体は、インビトロサンプルに投与され得るか、または哺乳動物に投与され得、それによって、インビトロサンプルまたは哺乳動物における細胞への、本発明の化合物（単数または複数）の輸送ビヒクルとして働く。このキャリア分子またはＣＰＩ結合体は、本発明の化合物が効率的に細胞および血液脳関門に浸透して、メマプシン２がＡＰＰを切断するのを阻害し、続いてＡβを生成する能力を増加させる。
他の実施形態では、本発明は、本発明の化合物の医薬組成物である。本発明の化合物の医薬組成物（キャリア分子と共にまたはそれなしで）または本発明の化合物（キャリア分子と共にまたはそれなしで）は、経腸手段または非経口手段により、哺乳動物に投与できる。具体的には、その投与経路は、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射；経口摂取（例えば、錠剤、カプセル形状）または筋肉内注射による。他の投与経路もまた、本発明に包含され、これには、静脈内経路、動脈内経路または皮下経路、および鼻内投与が挙げられる。座薬または経皮パッチもまた、使用できる。
本発明の化合物は、患者に、単独で投与できるか、または同時投与できる。同時投与とは、これらの化合物を個々にまたは組み合わせて（１種より多い化合物）、同時または逐次に投与することを意味する。これらの化合物を個々に投与する場合、その投与様式は、β−セクレターゼ活性またはβ−アミロイド産生を減少させる効果が最大になるように、時間的に互いに十分に近く行うことが好ましい（例えば、ある化合物を他の化合物と時間的に近く投与する）。また、本発明の化合物を投与するには、複数の投与経路（例えば、筋肉内、経口、経皮）が使用できると想定される。
これらの化合物は、単独で、薬学的に適当なキャリアとの混合物として、投与できる。本明細書中で使用する「薬学的に適当なキャリア」とは、その抽出物と有害に反応しない通常の賦形剤（例えば、経腸用途または非経口用途に適当で、薬学的、生理学的に受容可能な有機または無機キャリア物質）を意味する。適当な薬学的に受容可能なキャリアには、水、塩溶液（例えば、リンガー液）、アルコール、オイル、ゼラチンおよび炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。このような製剤は、滅菌でき、もし望ましいなら、本発明の化合物と有害に反応しない補助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤および／または芳香性物質など）と混合できる。これらの製剤はまた、望ましいとき、代謝分解を少なくするために、他の活性物質と併用できる。これらの化合物を投与する好ましい方法には、経口投与（例えば、錠剤またはカプセル）がある。本発明の化合物は、単独で投与するとき、または混合物と併用するとき、所望の効果（例えば、β−アミロイドタンパク質の低下）を与える時間にわたって、単一用量で、または１つより多い用量で、投与できる。
非経口投与が必要であるか望ましいとき、本発明の化合物の特に適当な混合物は、注射可能な無菌溶液（好ましくは、油性また水性溶液）、ならびに懸濁液、乳濁液または移植片（座薬を含めて）である。特に、非経口投与用のキャリアには、デキストロース、生理食塩水、純水、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、落花生油、ゴマ油、ポリオキシエチレンブロック重合体などが挙げられる。アンプルは、便利な単位投薬量である。本発明の化合物はまた、リポソームに取り込むことができるか、または経皮ポンプまたはパッチを介して投与できる。本発明で使用するのに適当な医薬混合物は、当業者に周知であり、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）およびＷＯ ９６／０５３０９で記述されており、両者の教示内容は、本明細書中で参考として援用されている。
哺乳動物に投与する投薬量および頻度（単一用量または複数用量）は、種々の要因に依存して変えることができ、これには、メマプシン２の活性を高めるかβ−アミロイドタンパク質の蓄積を多くする疾患、哺乳動物が他の疾患に罹っているかどうか、およびその投与経路；レシピエントのサイズ、年齢、性別、健康状態、体重、肥満度指数および食餌；治療する疾患（例えば、アルツハイマー病）の性質および症状の程度、同時に行う治療の種類、治療する疾患に由来の合併症または他の健康に関連した問題が挙げられる。他の治療レジメンまたは薬剤は、出願人の発明の方法および化合物と併用できる。確立した投薬量の調節および操作（例えば、頻度および持続時間）は、当業者の能力の範囲内である。
追加実施形態では、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質である：配列番号６（図９）および化合物であって、ここで、該化合物は、本発明の化合物であり、ここで、該結晶化タンパク質は、約４Å以下（例えば、約３．５Å、約３．０Å、約２．５Å、約２．０Å、約１．５Å、約１．０Å、約０．５Å）のＸ線回折分解能限界を有する。
さらに他の実施形態では、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質である：タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１−４５６（図１１）、配列番号８のアミノ酸残基１６−４５６（図１１）、配列番号８のアミノ酸残基２７−４５６（図１１）；配列番号８のアミノ酸残基４３−４５６（図１１）および配列番号８のアミノ酸残基４５−４５６（図１１）からなる群から選択されるタンパク質を含むタンパク質；および化合物であって、ここで、該化合物は、本発明の化合物であり、ここで、該結晶化タンパク質は、約４．０Å以下（例えば、約３．５Å、約３．０Å、約２．５Å、約２．０Å、約１．５Å、約１．０Å、約０．５Å）のＸ線回折分解能限界を有する。
この結晶化タンパク質は、本明細書中で記述した技術（下記）を使用して、形成される。要約すると、配列番号６のアミノ酸残基（図９）；配列番号８のアミノ酸残基１−４５６（図１１）；配列番号８のアミノ酸残基１６−４５６（図１１）；配列番号８のアミノ酸残基２７−４５６（図１１）；配列番号８のアミノ酸残基４３−４５６（図１１）；または配列番号８のアミノ酸残基４５−４５６（図１１）をコードする核酸構築物が生成でき、Ｅ．ｃｏｌｉで発現でき、封入体から精製でき、そして本発明の化合物で結晶化できる。この結晶化タンパク質の回折分解能限界を決定した。本発明の実施形態では、この結晶化タンパク質は、約２Å以下のＸ線回折分解能限界を有する。この結晶化タンパク質の回折分解能限界は、標準Ｘ線回折技術を使用して、決定できる。
さらに他の実施形態では、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質である：配列番号６（図９）のタンパク質および化合物であって、ここで、該化合物は、本発明の化合物であり、ここで、該結晶化タンパク質は、約４．０Å以下（例えば、約３．５Å、約３．０Å、約２．５Å、約２．０Å、約１．５Å、約１．０Å、約０．５Å）のＸ線回折分解能限界を有する。配列番号６は、メマプシン２タンパク質のアミノ酸配列である（これはまた、本明細書中にて、ＢＡＣＥ、ＡＳＰ２、β−セクレターゼとも呼ばれている）。上述のように、この結晶化タンパク質は、本明細書中で記述した技術（下記）を使用して、形成される。要約すると、配列番号６をコードする核酸構築物が作製され、宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞、２９３細胞）または細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））において発現され、精製され、そして本発明の化合物を用いて結晶化される。この結晶化タンパク質の回折分解能限界を、例えば、Ｘ線回折技術または中性子回折技術を使用して、決定できる。配列番号６は、必要に応じて、膜貫通ドメインを欠くことができる。メマプシン２の膜貫通は、配列番号６（図９）のアミノ酸残基４５５−４８０であり、これは、アミノ酸配列ＬＭＴＩＡＹＶＭＡＡＩＣＡＬＦＭＬＰＬＣＬＭＶＣＱＷ（配列番号６）を有し、この配列は、配列番号５の核酸１３６３−１４４０により、コードされる（図８）。特定の実施形態では、この結晶化タンパク質は、２Å以下のＸ線回折分解能限界を有する。
さらに他の実施形態では、本発明は、以下を含有する結晶化タンパク質である：配列番号５でコードされたタンパク質（図８）および化合物であって、ここで、該化合物は、本発明の化合物であり、ここで、該結晶化タンパク質は、約４．０Å以下（例えば、約３．５Å、約３．０Å、約２．５Å、約２．０Å、約１．５Å、約１．０Å、約０．５Å）のＸ線回折分解能限界を有する。配列番号５は、メマプシン２タンパク質をコードする核酸配列である（図８）。上述のように、この結晶化タンパク質は、本明細書中で記述した技術（下記）を使用して、形成される。要約すると、配列番号５の核酸構築物は、宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞（例えば、Ｈｅｌａ細胞、２９３細胞）または細菌宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））において発現され、コードされたタンパク質は、精製される。精製したタンパク質は、本発明の化合物で結晶化される。この結晶化タンパク質の回折分解能限界が決定できる。配列番号５は、必要に応じて、メマプシン２の膜貫通ドメインをコードする核酸を欠くことができる。この膜貫通ドメインは、配列番号５のコードした核酸１３６３−１４４０により、コードされる。特定の実施形態では、この結晶化タンパク質は、２Å以下のＸ線回折分解能限界を有する。
本発明の１実施形態は、メマプシン１に対してメマプシン２の活性を選択的に阻害する化合物を包含する。本発明の化合物は、β−セクレターゼ活性を減少させる方法、β−アミロイドタンパク質の蓄積を減少させる方法、およびβ−セクレターゼ活性およびβ−アミロイドタンパク質の蓄積に関連した疾患または病気の治療で使用される。本発明の化合物は、哺乳動物におけるアルツハイマー病を治療する方法で、使用できる。
本発明は、メマプシン２（これはまた、ＢＡＣＥまたはＡＳＰ２とも呼ばれている）を阻害する化合物の発見に関する。本発明の１実施形態は、メマプシン１に対してメマプシン２の活性を選択的に阻害する化合物を包含する。本発明の化合物は、β−セクレターゼ活性を減少させる方法、β−アミロイドタンパク質の蓄積を減少させる方法、およびβ−セクレターゼ活性およびβ−アミロイドタンパク質の蓄積に関連した疾患または病気の治療で使用できる。本発明の化合物は、哺乳動物におけるアルツハイマー病を治療する方法で、使用できる。
本発明は、以下の実施例により、さらに説明するが、これらは、いずれにしても、本発明を限定するとは解釈されない。
（例示）
（実施例１：メマプシン２について選択的である阻害剤）
阻害剤を設計し、構築し、そしてメマプシン１と比較してメマプシン２を選択的に阻害する能力について評価した。
（材料および方法）
（メマプシン１の触媒ドメインの発現および精製）
メマプシン１のプロテアーゼドメイン（配列番号４（図７）のアミノ酸残基１５〜４６１）を、メマプシン２について以前に記載された（Ｌｉｎ，Ｘ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１４５６〜１４６０（２０００）（その教示は、その全体が参考として本明細書中で援用される））ように、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。
図５は、メマプシン１の推定アミノ酸配列を示す。
そのＥ．ｃｏｌｉは、プロメマプシン１−Ｔ１（配列番号４（図７）のアミノ酸残基１〜４６１）を封入体として生成した。その封入体を、以前に記載された（Ｌｉｎ，Ｘ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１：１９５〜２２４（１９９４）（その教示は、その全体が参考として本明細書中で援用される）ように回収し洗浄し、８Ｍ尿素、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ酸化グルタチオン、１ｍＭ還元グルタチオン中に溶解し、そして、２０倍容量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓベース、１０％グリセロール中に希釈し、４８時間かけてｐＨを１０から９に、その後８に調整することによって、再生した。その組換えプロメマプシン１−Ｔ１（配列番号４（図７）のアミノ酸残基１〜４６１）を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＴＭおよびＲｅｓｏｕｒｃｅＱＴＭカラム（後者は、０．４Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８．０中）によりさらに精製し、そして同じ緩衝液中の０〜１．０Ｍ ＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。プロメマプシン１−Ｔ１を、ｐＨ４にて、メマプシン１（配列番号４（図７）のアミノ酸残基５８〜４６１）へと自己触媒的に転換した（Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｉ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６：２３３２２〜２３３２８（２００１）（その教示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））。
（阻害研究において使用したメマプシン２の発現）
メマプシン２（配列番号８（図１１）のアミノ酸１〜４５６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換え生成した（Ｌｉｎ，Ｘ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１４５６〜１４６０（２０００））。
メマプシン２（図１２；配列番号９）を、再生緩衝液（０．４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０μＭグルタチオン（還元型）、５μＭグルタチオン（酸化型）、ｐＨ８．０）において４℃にて２週間インキュベートすることによって再生プロメマプシン２−Ｔ１を自発的に活性化することによって得、その後、ゲル濾過により精製した（Ｈｏｎｇら、Ｓｃｉｎｅｃｅ ２９０：１５０〜１５３（２０００）。プロメマプシン２−Ｔ１（配列番号８（図１１）のアミノ酸残基１〜４５６）を、メマプシン２（配列番号８（図１１）のアミノ酸４３〜４５６および配列番号８（図１１）のアミノ酸４５〜４５６）へと自発的に活性化させ、それを使用して、選択的阻害を測定し、結晶化研究において一般的に使用した。
（メマプシン２特異性）
（規定された基質混合物の設計）
メマプシン２基質として公知であるペプチド配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号１５）（Ｇｈｏｓｈ Ａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２〜３５２３（２０００）、その教示は、その全体が参考として援用される）を、テンプレート構造として使用して、基質混合物における残基優先度を研究した。これらの８つのサブサイトの各々の特徴付けのために、別々の基質混合物を、適切なサイクルの固体状態ペプチド合成（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）において６アミノ酸誘導体または７アミノ酸誘導体の等モル混合物を添加することによって得た。生じた６ペプチド混合物または７ペプチド混合物は、１つの位置で１アミノ酸だけ異なった。各位置にて、１９個の変化したアミノ酸（システイン以外）を、３つの基質混合物中に収容させた。これには、８つの位置を特徴付けるために２４個の基質混合物が必要であった。既知のＫｃａｔ／ＫＭの基質もまた、内部標準として役立てるために各混合物に添加した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）における分析を容易にするために、テンプレート配列を、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、およびＰ４’での変化のために、Ｃ末端で４残基伸長させ（ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ；配列番号１６）、位置Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４を研究するためにＮ末端で４残基伸長させた（ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＥＦ；配列番号１７）。「基質混合物」とは、本明細書中で言及される場合、上記のような、配列番号１６および１７の改変体の混合物である。基質混合物の例が、以下の表２に示される。
（表２：位置Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４における残基優先度の決定のためのメマプシン２基質混合物）
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 ａ［ｍｉｘ］は、合成中にアミノ酸誘導体の等モル混合物がその位置に組み込まれたことを示し、その混合物中のアミノ酸によりその位置で変化するペプチド混合物を生じる。
ｂその［ｍｉｘ］位置に添加されたアミノ酸誘導体の混合物。
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による初速決定）
基質混合物を、２ｍｇ／ｍｌにて、１０％氷酢酸中に溶解し、そして０．００９Ｍ ＮａＯＨ中に希釈して、ｐＨ４．１にてμＭ範囲の基質混合物を得た。２５℃での平衡後、メマプシン２のアリコートを添加することによって、反応を開始した。アリコートを時間間隔で取り出し、等容量のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマトリックス（アセトン中のα−ヒドロキシケイ皮酸、２０ｍｇ／ｍｌ）と合わせ、そしてすぐに、ステンレス鋼ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に２連でスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を、ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒのキャンパスにて、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ装置にて実施した。その装置を、ポジティブモードにて、２５，０００加速ボルトで、１５０ｎｓ遅延にて動作させた。質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンを、６５０〜２０００原子質量単位の範囲にて検出した。データを、Ｖｏｙａｇｅｒ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒモジュールにより分析して、基質の質量種および所定混合物中に対応生成物についてのイオン強度データを得た。相対的生成物形成を、（その生成物のシグナル強度）対（生成物および対応基質両方のシグナル強度の合計）比として計算した。この分析の定量的局面を、以下のように確立した。７つの基質ペプチドであるＥＶＮＬＸＡＥＦＷＨＤＲ（配列番号１８）（Ｘ＝アミノ酸Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｄ、Ｅ，およびＦ）からなる混合物から、それらの加水分解生成物であるＸＡＥＦＷＨＤＲ（配列番号１９）を、完全な加水分解によって調製した。一連のモック部分消化物を、既知量のその基質混合物を加水分解生成物と合わせることによって調製し、各々を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ分析に供した。観察された強度データからの（生成物）対（生成物と基質ペプチドの合計）の比を、その混合物中の各ペプチド対についての予測比と相関付けた（平均傾き１．０４±０．０１；平均切片０．０１９±０．０２１；平均相関係数０．９８７±０．００６）。単位時間当たりに形成される相対生成物を、初期１５％の生成物形成を示すデータの非線形回帰分析から得た。これは、モデル
１−ｅ−ｋＴ
を使用した。このモデルにおいて、ｋは、相対的加水分解速度定数であり、Ｔは時間（秒）である。未知の基質の相対的初期加水分解速度を、式：
相対ｋｃａｔ／ＫＭ＝ｖｘ／ｖｓ
によって、相対ｋｃａｔ／ＫＭに変換した。この式において、ｖｘおよびｖｓは、基質ｘおよび参照基質の初期加水分解速度である。考察を簡便にするために、相対ｋｃａｔ／ＫＭ値はまた、優先度指数とも呼ぶ。
（ランダム配列阻害剤ライブラリー）
コンビナトリアル阻害剤ライブラリーは、ＯＭ９９−２の配列であるＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦ（配列番号２０；「＊」は、ヒドロキシエチレン遷移状態アイソスターを示し、これは、本明細書中で使用されるΨと等価である）に基づき、４つの位置Ｐ２、Ｐ３、Ｐ２’、およびＰ３’においてランダムなアミノ酸（システイン以外）を含んだ。ジアイソスターであるＬｅｕ＊Ａｌａを、単一合成工程において使用し、それにより、位置Ｐ１およびＰ１’における構造を固定した。ペプチドを、固体状態ペプチド合成法により合成し、樹脂ビーズ上に付着したままにした。「分割合成」手順（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４（１９９１））を使用することによって、その樹脂ビーズの各々は、唯一の配列を含み、一方、その配列は、ビーズ間で異なった。全体的なライブラリー配列は、
Ｇｌｙ−Ｘｘ１−Ｘｘ２−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ｘｘ３−Ｘｘ４−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−
（Ｐ４ Ｐ３ Ｐ２ Ｐ１ Ｐ１’ Ｐ２’ Ｐ３’ Ｐ４’）
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（樹脂ビーズ）（配列番号２１）
であり、Ｘｘａ残基（ａは、１、２、３、または４のいずれかを示す）は、各位置にて、１９アミノ酸を用いてランダムにした。これらのペプチドのより短いバージョン（これは、Ｐ２’にて始まる、配列：Ｘｘ３−Ｘｘ４−Ｐｈａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（樹脂ビーズ）（配列番号２２）である）もまた、各ビーズ中に存在し、長い方の配列に対する比は、約７：３であった。アイソスターを含まない場合、この短い配列は、メマプシン２に有意な強度では結合しないが、その存在は、自動エドマン分解によりＰ２’およびＰ３’の残基を同定するためには便利であった。その残基を、以下のようなランダムな位置から同定した：
エドマンサイクル数： １ ２ ３ ４
配列１（長い配列由来） Ｇｌｙ Ｘｘ１ Ｘｘ２
配列２（短い配列由来） Ｘｘ３ Ｘｘ４ Ｐｈｅ Ａｒｇ。
Ｘｘ３およびＸｘ２の割り当ては、曖昧さを有さなかった。なぜなら、これらは、それぞれ、サイクル１および３における唯一の未知残基であるからである。アミノ酸Ｘｘ１およびＸｘ４は、その相対量から割当てた。メチオニンの存在を、ＣＮＢｒ切断後の放出からのペプチドフラグメントのＭＳ／ＭＳ同定を可能にするように設計した。
（ランダム配列ライブラリーのプロービング）
約１３０，０００個の個々のビーズ（これは、そのライブラリーの１コピーを示し、確定したビーズ１．１ｍｌ中に含まれると推定した）を、緩衝液Ａ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４ｍＭ尿素、０．０２％アジ化ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、ｐＨ３．５；５ミクロンフィルターで濾過済み）中に水和した。そのビーズを、緩衝液Ａ中３％ウシ血清アルブミン中に１時間浸漬して、非特異的結合をブロックし、同じ緩衝液で２回リンスした。組換えメマプシン２を、緩衝液Ａ中に４ｎＭになるように希釈し、このライブラリーとともに１時間インキュベートした。１つのストリンジェンシーの洗浄を実施した。これは、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．０２％アジ化ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ５．５；５ミクロンフィルターで濾過済み）中の６．７μＭの遷移状態アイソスター阻害剤ＯＭ９９−２を含んだ。その後、ＯＭ９９−２を含まない緩衝液Ｂを用いてさらに２回洗浄した。組換えメマプシン２に特異的なアフィニティ精製ＩｇＧを、緩衝液Ｂ中に１００倍希釈し、このライブラリーとともに３０分間インキュベートした。緩衝液Ｂを用いて３回洗浄した後、アフィニティ精製した抗ヤギ／アルカリホスファターゼ結合体を、緩衝液Ｂ中に希釈し（１：２００）、そして３０分間インキュベートし、その後３回洗浄した。１つのアルカリホスファターゼ基質錠剤（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；Ｓｉｇｍａ）を、１０ｍｌの水中に溶解し、１ｍｌをこのビーズに適用し、そして１時間インキュベートした。ビーズを、水中０．０２％のアジ化ナトリウム中に再懸濁し、解剖顕微鏡下で試験した。暗く染色したビーズを、視覚により程度分けし、個々に単離し、８Ｍ尿素中で２４時間ストリッピングし、ジメチルホルムアミド中で脱染色した。そのビーズの配列決定を、ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒのキャンパスにて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにおいて実行した。逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、フェニルチオヒダントイン−アミノ酸を定量した。
（阻害剤ＯＭ００−３の合成）
阻害剤ＯＭ００−３（ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ、配列番号２３）を、Ｇｈｏｓｈらにより記載された方法（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２〜３５２３（２０００））を使用して、合成した。
（動力学パラメーターの決定）
１つのペプチド基質を使用する動力学パラメーターＫＭおよびｋｃａｔ、ならびに遊離阻害剤に対するＫｉを、以前に記載された（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０〜１２４５６（２０００））ように決定した。
Ｋｉは、メマプシン２およびメマプシン１のβ−セクレターゼ活性を化合物が阻害する能力を示す、阻害平衡定数である。数値がより低いＫｉ値は、メマプシン２またはメマプシン１についての本発明の化合物のより高い親和性を示す。Ｋｉ値は、基質とは独立しており、見かけ上のＫｉから変換される。
見かけ上のＫｉは、確立された技術（例えば、Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．，Ｂａｙｅｒ−Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｖ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐｐ．４６３〜４６９、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）を参照のこと）に従って、基質の存在下で決定される。
Ｖｉ／Ｖｏは、本発明の化合物の非存在下（Ｖｏ）または存在下（Ｖｉ）での、メマプシン１またはメマプシン２による基質ＦＳ−２（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４０：１２４５０〜１２４５６（２０００））の初期切断速度の比を示す。Ｖｉ／Ｖｏ値１．０は、本発明の化合物が、酵素メマプシン１またはメマプシン２のβ−セクレターゼ活性を阻害しないことを示す。１．０未満のＶｉ／Ｖｏ値は、本発明の化合物が、酵素メマプシン１またはメマプシン２のβ−セクレターゼ活性を阻害することを示す。表１に示されるＶｉ／Ｖｏ値は、その酵素濃度と阻害剤濃度とが等しい（例えば、約８０ｎＭ、１００ｎＭ）条件で決定した。
見かけ上のＫｉについての標準誤差は、種々の濃度の本発明の化合物（例えば、約１０ｎＭ〜約１０００ｎＭの間）にて周知技術（例えば、Ｂｉｅｔｈ，Ｊ．，Ｂａｙｅｒ−Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｖ：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ｐｐ．４６３〜４６９、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９４）を参照のこと）を使用して測定した、Ｖｉ／Ｖｏデータの非線形回帰からの誤差である。
（結果および考察）
（メマプシン２サブサイトにおける基質側鎖優先度の決定）
種々の基質側鎖についての各サブサイトにおける残基優先度を、相対ｋｃａｔ／ＫＭ値により規定する。この値は、基質濃度がＫＭより低い条件下で基質と競合するこれらの混合物の相対的初期加水分解速度に関連する（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．，Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，第２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。この方法は、基質混合物の初期速度を測定することにより残基優先度を決定するためのあまり大変でない方法であり、他のアスパラギン酸プロテアーゼの特異性を分析するために使用されている（Ｋｏｅｌｓｃｈ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８０：１１７〜１３１（２０００）；Ｋａｓｓｅｌ，Ｄ．Ｂ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２８：２５９〜２６６（１９９５）。速度決定は、生成物と基質との相対量の定量のためのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳイオン強度の使用によって、改善された。
基質側鎖優先度（メマプシン２の８つのサブサイトにおける優先度指数として報告される）を、図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈにおいて示す。Ｐ側およびＰ’側の両方において、切れやすい結合に対して近位である側鎖（Ｐ１およびＰ１’）は、遠位の側鎖（Ｐ４およびＰ４’）よりもストリンジェントである。このことは、非優先的残基の優先度指数（バックグラウンドレベル）を優先的残基と比較する場合に、明らかである。ストリンジェンシーの欠如は、Ｐ’部位の４つの側鎖について、特に、Ｐ３’およびＰ４’について、バックグラウンドが比較的高い場合に、より顕著である。
ＡＰＰのスウェーデン変異（ＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲ；配列番号１１）により引き起こされる家族性アルツハイマー病において、Ｌｙｓ−ＭｅｔからＡｓｎ−ＬｅｕへのＰ２−Ｐ１の変化は、メマプシン２切断のｋｃａｔ／ＫＭの約６０倍の増加をもたらし、これは、触媒効率の最大の増加が、Ｐ２における変化に由来することを示す（図２Ａ〜２Ｈ）。Ｐ１のＬｅｕを伴うこの位置のＡｓｐまたはＭｅｔは、Ａβ生成を上昇させ得、アルツハイマー病を引き起こす。
（コンビナトリアル阻害剤ライブラリーから決定した側鎖優先度）
側鎖に結合するメマプシン２の優先度もまた、コンビナトリアルライブラリーを使用して決定した。そのライブラリーの塩基配列は、ＯＭ９９−２：ＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦ（配列番号２０）（「＊」は、ヒドロキシエチレン遷移状態アイソスターを示す）に由来した。ここで、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ２’、およびＰ３’（太字体）を、システイン以外のすべてのアミノ酸を用いてランダムにした。このビーズライブラリーをメマプシン２とともにインキュベートし、ＯＭ９９−２溶液を用いてストリンジェントな洗浄選択した後、ほぼ１３０，０００個のビーズからの約６５個のビーズが暗く染色された。このことは、強力なメマプシン２結合を示した。４つのランダムな位置の残基を、１０個の最も強く染色されたビーズについて決定した。表３は、これらの位置にて明確なコンセンサスが存在することを示す。このコンセンサスは、２つのネガティブコントロールの配列中には存在しない（表３）。これを確認するために、新たな阻害剤ＯＭ００−３：ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ（配列番号２３）を、このコンセンサスに基づいて設計し、合成した。ＯＭ００−３は、メマプシン２をＫｉ ０．３１ｎＭ（ＯＭ９９−２のＫｉのほぼ５分の１）で阻害することが見出された。さらに、この阻害剤のＰ３、Ｐ２およびＰ２’にて決定した残基優先度は、基質研究からの結果とよく一致した（図２Ａ〜２Ｈ）。
（表３：コンビナトリアル阻害剤ライブラリーａから選択した１０個の強力なメマプシン２結合ビーズからの４つの側鎖位置で観察された残基）
Figure 0004547152
 ａライブラリーテンプレート：Ｇｌｙ−Ｘｘ１−Ｘｘ２−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ｘｘ３−Ｘｘ４−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−樹脂（配列番号２１）（ここで、Ｘｘ１は、側鎖Ｐ３のアミノ酸残基に対応し；Ｘｘ２は、側鎖Ｐ２のアミノ酸残基に対応し；Ｘｘ３は、側鎖Ｐ２’のアミノ酸残基に対応し；そしてＸｘ４は、側鎖Ｐ３’のアミノ酸残基に対応する。
ｂＮｅｇ１およびＮｅｇ２は、メマプシン２結合能力を有さない、ランダムに選択された２つのビーズである。
（基質混合物中の基質の相対ｋｃａｔ／Ｋｍの決定）
基質混合物中の個々のペプチドの相対初期加水分解速度を、決定した。これらの相対速度はそのｋｃａｔ／Ｋｍ値に比例するので、その混合物中の基質が１残基だけ異なる場合の残基優先度として得る。優先度指数を、混合基質の相対初期加水分解速度から計算した。この優先度指数は、相対ｋｃａｔ／Ｋｍと比例する。基質混合物の設計および実験条件は、上記の通りである。
メマプシン１は、メマプシン２切断部位のうちのいくつかを加水分解する（Ｆａｒｚａｎ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：９７１２〜９７１７（２０００）（その教示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）ので、メマプシン２のサブサイト特異性を研究するために首尾良く使用した基質混合物（テンプレート配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ、配列番号１５）を、この研究に採用した。各基質混合物は、１つの位置で１アミノ酸だけ異なる、６ペプチドまたは７ペプチドを含んだ。各位置にて、天然の１９個のアミノ酸（システインは、例えば、ジスルフィド結合によるダイマー形成を防ぐために、使用しなかった）の各々を、３つの基質混合物中に含めた。既知のｋｃａｔ／Ｋｍ値の基質もまた、各セットに加えて、他の基質の相対初期速度の正規化およびｋｃａｔ／Ｋｍ値の計算のための内部標準として役立てた。
４つのＰ’側鎖（Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’）について、テンプレート配列を、Ｃ末端で４アミノ酸残基伸長して（ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ（配列番号１６））、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにおける検出を容易にした。同様に、さらなる４つのアミノ酸残基を、Ｎ末端に付加して、４つのＰ側鎖を特徴付けた（ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＥＦ、配列番号１７）。動力学実験のための手順および条件は、メマプシン２について以前に記載された（上記）のと本質的に同様であった。基質および加水分解産物の量を、上記のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用して定量測定した。相対ｋｃａｔ／Ｋｍ値を、優先度指数として示す。
（ランダム配列阻害剤ライブラリーのプロービング）
コンビナトリアル阻害剤ライブラリーは、ＯＭ９９−２の配列：ＥＶＮＬΨＡＡＥＦ（配列番号２４）（ここで、文字は、アミノ酸を１文字コードで示し、Ψは、ヒドロキシエチレン遷移状態アイソスターを示す）、以前に記載された（１９９９年６月２８日出願の米国特許出願番号６０／１４１，３６３；１９９９年１１月３０日に出願した同６０／１６８，０６０；２０００年１月２５日出願の同６０／１７７，８３６；２０００年１月２７日出願の同６０／１７８，３６８；２０００年６月８日出願の６０／２１０，２９２；２０００年６月２７日出願の同０９／６０３，７１３；２０００年６月２７日出願の０９／６０４，６０８；２０００年１２月２８日出願の同６０／２５８，７０５；２００１年３月１４日出願の６０／２７５，７５６；２０００年６月２７日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／１７７４２、ＷＯ ０１／００６６５；２０００年６月２７日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／１７６６１、ＷＯ ０１／００６６３；２００２年１０月２２日に出願した、発明の名称「Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｈｉｃｈ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｂｅｔａ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ Ｔｈｅｒｅｏｆ」）であり、代理人整理番号２９３２．１００１−００３を有する、米国特許出願；ならびにＧｈｏｓｈら（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２〜３５２３（２０００）（これらすべての教示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））ように基づいた。４つの位置Ｐ２、Ｐ３、Ｐ２’およびＰ３’を、ランダムなアミノ酸残基（システイン以外）で満たした。位置Ｐ１およびＰ１’ｗｐ、１工程の阻害剤固体状態ペプチド合成においてジアイソスターＬｅｕΨＡｌａを使用することが原因で、固定した（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２〜３５２３（２０００）（その教示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。分割合成手順（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４（１９９１）（その教示は、その全体が参考として本明細書中に援用される））を使用することによって、樹脂ビーズ各々は、１つだけ配列を含んだが、配列はビーズ間で異なった。全体的ライブラリー配列は、Ｇｌｙ−Ｘｘ１−Ｘｘ２−ＬｅｕΨＡｌａ−Ｘｘ３−Ｘｘ４−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（樹脂ビーズ）（配列番号２５）であった。
コンビナトリアルライブラリーへのメマプシン１の結合のプロービングおよび阻害剤の配列の決定を、上記の通り実施した。メマプシン２に対するアフィニティ精製抗体を使用した。なぜなら、これらの抗体は、タンパク質であるメマプシン１およびメマプシン２と交差反応するからである。
（阻害剤の調製）
本発明の阻害剤は、その阻害剤のアイソスター部分を合成することに続いて１種またはそれ以上のアミノ酸および／または改変アミノ酸を有するペプチドとカップリングすることにより、調製される。
Ｉ．ロイシン−アラニンアイソスター６の調製
ロイシン−アラニンアイソスター単位は、以下の阻害剤に含まれる：ＭＭＩ−００１−ＭＭＩ−００９；ＭＭＩ−０１１−ＭＭＩ−０２０；ＭＭＩ−０２２−ＭＭＩ−０２６；ＭＭＩ−０３４−ＭＭＩ−０３５；ＭＭＩ−０３９；ＭＭＩ−０４１−ＭＭＩ−０４７；ＭＭＩ−０４９−ＭＭＩ−０６０；ＭＭＩ−０６３−ＭＭＩ−０７７；ＭＭＩ−０７９−ＭＭＩ−０９１；ＭＭＩ−０９３−ＭＭＩ−１００；ＭＭＩ−１０３−ＭＭＩ−１０５；ＭＭＩ−１０７−ＭＭＩ−１３１；ＭＭＩ−１３３−ＭＭＩ−１４４；ＭＭＩ−１４６−ＭＭＩ−１５４；ＭＭＩ−１５６−ＭＭＩ−１６３；ＭＭＩ−１６５−ＭＭＩ−１６７；ＭＭＩ−１７１；ＭＭＩ−１７３−ＭＭＩ−１７７；ＭＭＩ−１８０；ＭＭＩ−１８３−ＭＭＩ−８６；ＭＭＩ−１８８−ＭＭＩ−９０；ＭＭＩ−１９３−ＭＭＩ−２００；ＭＭＩ−２０３−ＭＭＩ−２１０；ＭＭＩ−２１２−ＭＭＩ−２１７；ＭＭＩ−２１９−ＭＭＩ−１３０。このロイシン−アラニンアイソスターは、図式Ｉで示した方法を使用して、調製した。
図式Ｉ：
Figure 0004547152
 Ａ．Ｎ−（第三級ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン−Ｎ’−メトキシ−Ｎ’−メチルアミド（１）：
Figure 0004547152
 Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミン塩酸塩（５．５２ｇ、５６．６ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２５ｍｌ）攪拌溶液に、Ｎ２雰囲気下にて、０℃で、Ｎ−メチルピペリジン（６．９ｍＬ、５６．６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、０℃で、３０分間攪拌した。別のフラスコにて、Ｎ２雰囲気下にて、市販のＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（１１．９ｇ、５１．４ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（４５ｍＬ）およびジクロロメタン（１８０ｍＬ）の混合物に溶解した。得られた溶液を、−２０℃まで冷却した。この溶液に、１−メチルピペリジン（６．９ｍＬ、５６．６ｍｍｏｌ）に続いて、クロロギ酸イソブチル（７．３ｍＬ、５６．６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−２０℃で、５分間攪拌し、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシアミンの上記溶液を滴下した。この反応混合物を、−２０℃で、３０分間攪拌したのに続いて、室温まで温めた。この反応を水でクエンチし、層分離した。その水層をＣＨ２Ｃｌ２（３回）で抽出した。合わせた有機層を、１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２５％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ））にかけると、１（１３．８ｇ、９７％）が得られた。
Figure 0004547152
 Ｂ．Ｎ−（第三級ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（２）：
Figure 0004547152
 水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＨ）（７７０ｍｇ、２０．３ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（６０ｍＬ）攪拌懸濁液に、−４０℃で、Ｎ２雰囲気下にて、１（５．０５ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（２０ｍＬ）溶液を滴下した。得られた反応混合物を３０分間攪拌し、続いて、１０％ＮａＨＳＯ４水溶液（３０ｍＬ）でクエンチし、そして３０分間にわたって、室温まで温めた。この溶液を濾過し、その濾過ケークをジエチルエーテル（２回）で洗浄した。合わせた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、２（３．４１ｇ）を得、これを、さらに精製することなく、直ちに使用した。
Figure 0004547152
 Ｃ．（４Ｓ，５Ｓ）−および（４Ｒ，５Ｓ）−５−［（第三級ブトキシカルボニル）アミノ］−４−ヒドロキシ−７−メチルオクト−２−イノエート（３）：
Figure 0004547152
 エチルプロピオラート（８０１ｍＬ）のＴＨＦ（２ｍＬ）攪拌溶液に、−７８℃で、５分間にわたって、リチウムヘキサメチルジシラジドの１．０Ｍ溶液（７．９ｍＬ）を滴下した。その混合物を３０分間攪拌し、その後、無水ＴＨＦ（８ｍＬ）中のＮ−（第三級ブトキシカルボニル）−Ｌ−ロイシナール２（またはＮ−Ｂｏｃ−Ｌ−ロイシナール）（１．５５ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。その反応を、−７８℃で、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、続いて、室温まで温めた。ブラインを加え、層分離した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）にかけると、アセチレン性アルコール３の混合物が得られた（６８％）。
Figure 0004547152
 Ｄ．（５Ｓ，１’Ｓ）−５−［１’−（第三級ブトキシカルボニル）アミノ］−３’−メチルブチル］ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（４）：
Figure 0004547152
 ３（１．７３ｇ、５．５ｍｍｏｌ）のメタノール（ＭｅＯＨ）（２０ｍＬ）攪拌溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）を加えた。得られた混合物を水素バルーン下に置き、そして１時間攪拌した。この期間の後、その反応物をセライトのパッドで濾過し、その濾液を、減圧下にて濃縮した。その残渣を、トルエン（２０ｍＬ）および酢酸（１００Ｌ）に溶解した。得られた混合物を６時間還流したのに続いて、室温まで冷却し、そして減圧下にて濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の４０％ジエチルエーテル）にかけると、４（０．９４ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）および５％未満のそのジアステレオマーが得られた。
Figure 0004547152
 Ｅ．（３Ｒ，５Ｓ，１’Ｓ）−５−［１’−（第三級ブトキシカルボニル）アミノ］−３’−メチルブチル］−３−メチル−（３Ｈ）−ジヒドロフラン−２−オン（５）：
Figure 0004547152
 ラクトン４（４５１．８ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（８ｍＬ）攪拌溶液に、−７８℃で、Ｎ２雰囲気下にて、リチウムヘキサメチルジシラジド（３．６７ｍＬ、ＴＨＦ中の１．０Ｍ、３．６７ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。ヨウ化メチル（ＭｅＩ）（２２８ｍＬ）を滴下し、得られた混合物を、−７８℃で、２０分間攪拌した。その反応をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、そして室温まで温めた。その反応混合物を減圧下にて濃縮し、その残渣をＥｔＯＡｃ（３回）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）にかけると、５（０．３６ｇ、７６％）が得られた。Ｃ２−メチル基の空間的配置は、ＮＯＥＳＹ実験およびＣＯＳＹ実験に基づいて、割り当てた。そのＣ２−メチル基の照射は、Ｃ３α−プロトンで６％ＮＯＥを示し、また、Ｃ４−プロトンで５％ＮＯＥを示した。Ｃ３のα−およびβ−プロトンは、２Ｄ−ＮＭＲで割り当てた。
Figure 0004547152
 Ｆ．（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−５−［（第三級ブトキシカルボニル）アミノ］−４−［（第三級ブチルジメチルシリル）−オキシ］−２，７−メチルオクタン酸（６）：
Figure 0004547152
 ＴＨＦおよび水の混合物（５：１；６ｍＬ）中のラクトン５（０．３３ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．０７３ｇ、１．８当量）を加えた。得られた混合物を、室温で、１時間攪拌した。減圧下にて揮発性物質を除去し、残留している溶液を０℃まで冷却し、そして２５％クエン酸水溶液でｐＨ３まで酸性化した。得られた酸性溶液をＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、白色発泡体として、対応するヒドロキシ酸（３３０ｍｇ）を得た。このヒドロキシ酸を、さらに精製することなく、次の反応に直接使用した。
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の上記ヒドロキシ酸（３３０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）に、イミダゾール（１．５９ｇ、２３．３４ｍｍｏｌ）および第三級ブチルジメチルクロロシラン（１．７６ｇ、１１．６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、室温で、２４時間攪拌した。ＭｅＯＨ（４ｍＬ）を加え、その混合物を、さらに１時間攪拌した。この混合物を２５％クエン酸水溶液でｐＨ３まで酸性化し、そしてＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた抽出物を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の３５％ＥｔＯＡｃ）にかけると、６（０．４４ｇ、９０％）が得られた。
Figure 0004547152
 ＩＩ．他のアイソスター（ここで、Ｐ１’は、アルキル基である）の調製
Ａ．ＭＭＩ−１３３を調製するのに使用するアイソスター
アルキル化工程（セクションＩ、工程Ｅ）の少量生成物を使用して、Ｌｅｕ−Ａｌａアイソスターのメチルジアステレオマーを合成した。
ラクトンをアルキル化するために、セクションＩ、工程Ｅにおいて、異なるアルキル化剤を使用したこと以外は、上で述べたロイシン−アラニンアイソスターを調製する一般手順に従って、Ｐ１’（ＭＭＩ−０１０、ＭＭＩ−０２１、ＭＭＩ−０２７−ＭＭＩ−０３３、ＭＭＩ−０３６、ＭＭＩ−２０２、ＭＭＩ−２１１、ＭＭＩ−２１８）に簡単なアルキル置換基を備えた他のアイソスターを生成した。例えば：
Ｂ．ＭＭＩ−０１０およびＭＭＩ−０２１を調製するのに使用されるロイシン−アリルアイソスター
図式ＩＩ：ＭＭＩ−０１０およびＭＭＩ−０２１を調製するのに使用されるロイシン−アリルアイソスターの合成
Figure 0004547152
 ４（２．４１ｇ、８．８９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、１９．５６ｍＬ、１９．５６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化アリル（０．８９ｍＬ、９．７８ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−７８℃で、１５分間攪拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、７（１．９４ｇ、７０％）を得た。
７（３２５ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）のジオキサン／水（３：１、４ｍＬ）溶液に、ＬｉＯＨ（６６ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を加え、そして１時間攪拌した。この反応混合物を、２５％クエン酸水溶液でｐＨ３に酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、対応するヒドロキシル酸（３０７ｍｇ、８９％）を得た。
上記ヒドロキシル酸（３０７ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）溶液に、イミダゾール（１．０７ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）およびＴＢＳＣｌ（１．１２ｇ、７．４７ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、室温で、１５時間攪拌した。この期間の後、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）を加え、得られた混合物を１時間攪拌した。次いで、この混合物を２５％クエン酸水溶液で希釈し、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、８（３８３ｍｇ、９３％）を得た。
Ｃ．ＭＭＩ−０３７を調製するのに使用されるロイシン−ホモセリンアイソスター：
図式ＩＩＩ：ＭＭＩ−０３７を調製するのに使用されるロイシン−ホモセリンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 ９を得る標準的なＥＤＣＩ／ＨＯＢｔ条件（セクションＩＶ）下にて、上記ロイシン−アリルアイソスター８をバリン−Ｎ−ベンジルアミドとカップリングすることにより、ＭＭＩ−０３７のアイソスター部分を生成する。
−７８℃で、化合物９のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：１、６ｍＬ）溶液に、青色が持続するまで（約１０分間）、オゾンを泡立たせた。この混合物に、青色が消えるまで、酸素を泡立たせ、その後、その混合物に、１０分間にわたって、窒素を泡立たせた。−７８℃で、トリフェニルホスフィン（１２４ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を攪拌し、そして１時間にわたって、室温まで温めた。減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、対応するアルデヒド（８６ｍｇ、５６％）を得た。
上記アルデヒド（８６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液に、０℃で、ＮａＢＨ４（７．４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を加え、そして１５分間攪拌した。ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液を加えることにより、その反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、１０（８７％）を得た。
Ｄ．ＭＭＩ−１６４を調製するのに使用されるロイシン−メチオニンアイソスター：
図式ＩＶ：ＭＭＩ−１６４を調製するのに使用されるロイシン−メチオニンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 １０（７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）溶液をＥｔ３Ｎ（０．０３ｍＬ、０．２２ｍｍｏｌ）およびメタンスルホニルクロライド（０．０１ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）で処理することにより、ＭＭＩ−１６４のアイソスター部分を生成し、そして１時間攪拌する。その反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、そしてＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で洗浄した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、対応するメシレート（６７ｍｇ）を得た。
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の上記メシレートに、ＮａＳＭｅ（１５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を加え、続いて、１時間にわたって、７０℃まで加熱した。その反応物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃで希釈し、そして水で洗浄した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、１１（２工程で６５％）を得た。
Ｅ．ＭＭＩ−０３８を調製するのに使用されるロイシン−アスパラギンアイソスター：
図式Ｖ：ＭＭＩ−０３８を調製するのに使用されるロイシン−アスパラギンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 １０（１７０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、二クロム酸ピリジニウム（３０２ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を加え、そして室温で、１２時間攪拌した。その反応混合物をＥｔ２Ｏで希釈し、そしてセライト（登録商標）で濾過した。その濾液を減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の１０％ＭｅＯＨ）で精製して、１２（１３０ｍｇ、７７％）を得た。
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の１２（３０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）に、ＨＯＢｔ（７．１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（１０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３０分間攪拌した後、この溶液を、−７８℃で、ＣＨ２Ｃｌ２中の液状ＮＨ３に加えた。−７８℃で３０分間攪拌した後、その反応混合物を室温まで温め、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、そして水で洗浄した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、１３（１９ｍｇ、６３％）を得た。
Ｆ．ＭＭＩ−０７８およびＭＭＩ−１３２を調製するのに使用されるロイシン−セリンアイソスター：
図式ＶＩ：ＭＭＩ−０７８およびＭＭＩ−１３２を調製するのに使用されるロイシン−セリンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 公知カルボン酸１８（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９６，８４５１）（１．０５ｇ、６．７８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に、−２０℃で、Ｅｔ３Ｎ（１．２ｍＬ、８．８２ｍｍｏｌ）を滴下し、続いて、塩化ピバロイル（１．０８ｍＬ、８．８２ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を、−２０℃で、３０分間攪拌し、続いて、−７８℃まで冷却した。
別のフラスコにて、オキサゾリジノン１５（１．５６ｇ、８．８２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解し、−７８℃まで冷却し、そしてＢｕＬｉ（５．５ｍＬ、ヘキサン中で１．６Ｍ、８．８２ｍｍｏｌ）を滴下した。３０分間攪拌した後、その溶液を、カニューレを経由して、−７８℃で、第一フラスコ（これは、この混合無水物を含む）に移した。得られた混合物を３０分間攪拌し、そして−７８℃で、ＮａＨＳＯ４（３０ｍＬのＨ２Ｏ中で５ｇ）でクエンチし、そして室温まで温めた。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、１６（２．３７ｇ、７１％）を得た。
１６（４７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、０．１９ｍＬ、０．１９ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ベンジルクロロメチルエーテル（０．０２７ｍＬ、０．１９ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−７８℃で、１５分間攪拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発すると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、１７（６８％）を得た。
１７（１５７ｍｇ、０．３６ｍｏｌ）のＤＭＥ／Ｈ２Ｏ（３：１、８ｍＬ）溶液に、０℃で、ＮＢＳ（７０．８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で４５分間攪拌した後、Ｈ２Ｏを加えることにより、その反応をクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層を、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発すると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、１８（５９％）を得た。
室温で、３日間にわたって、ＤＭＰＵ（１ｍＬ）中にて、１８（７３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）とＮａＮ３（２７ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）とを反応させると、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）後、１９（６６％）が得られた。
先に記述した手順（セクションＩ、工程Ｆ）に従って、アイソスターの合成を完了して、２０を得、続いて、標準的なＥＤＣＩ／ＨＯＢｔカップリング条件（セクションＩＶ）下にて、バリン−Ｎ−ベンジルアミドをカップリングし、そして標準的な水素化条件下にて、そのアジド保護基およびベンジル保護基を水素化して、対応するアミノアルコールを得た。標準的な水素化手順：ＭｅＯＨ、ＥｔＯＡｃまたはそれらの混合物（５ｍＬ）中のアルケン、ベンジル保護アルコールまたはアジド（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）とＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（２０％、２０ｍｇ）との混合物を、Ｈ２雰囲気下にて、５時間攪拌した。この触媒を濾過により除き、その濾液を減圧下にて濃縮して、定量的に、対応する飽和化合物、遊離アルコールまたは遊離アミンを得た。
Ｇ．ＭＭＩ−１４５を調製するのに使用されるロイシン−ＣＨ２アイソスター：
図式ＶＩＩ：ＭＭＩ−１４５を調製するのに使用されるロイシン−ＣＨ２アイソスターの合成
Figure 0004547152
 １９（３５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に、Ｂｏｃ２Ｏ（０．０３８ｍＬ、０．１６ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（２０％Ｐｄ、５ｍｇ）を加えた。この混合物を水素雰囲気下に置き、そして室温で、１２時間攪拌した。その反応物をセライト（登録商標）で濾過し、その濾液を減圧下にて濃縮し、その残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２１（４４％）を得た。
（ジエチルアミノ）三フッ化イオウ（０．００９５ｍＬ、０．０７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）溶液に、−７８℃で、２１（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）溶液を滴下した。その反応物を室温まで暖め、そして１２時間攪拌した。この期間の後、この反応混合物を０℃まで冷却し、そしてＨ２Ｏでクエンチした。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２２（６１％）を得た。
２２（４６．５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＥ：Ｈ２Ｏ（１：１、３ｍＬ）溶液に、１Ｎ ＬｉＯＨ（０．４６ｍＬ）を加え、そして室温で、２時間攪拌したのに続いて、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ３まで酸性化し、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィーで精製して、生成物の混合物を得た。この混合物（４４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、そしてイミダゾール（２０７ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ）およびＴＢＳＣＩ（２０９ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）を加え、そして１２時間攪拌した。その反応をＭｅＯＨ（１ｍＬ）でクエンチし、１時間攪拌し、５％クエン酸でｐＨ３まで酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィーで精製して、２３（１３．８ｍｇ）およびアイソスター２４（３７．６ｍｇ）を得た。
Ｈ．ＭＭＩ−１０１およびＭＭＩ−１０２を調製するのに使用されるロイシン−チロシンアイソスター：
図式ＶＩＩＩ：ＭＭＩ−１０１およびＭＭＩ−１０２を調製するのに使用されるロイシン−チロシンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 ４（２２０ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、１．７８ｍＬ、１．７８ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化物２５（２２ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−７８℃で、１５分間攪拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２６（２４２ｍｇ、６３％）を得た。
２６（２４２ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）のジオキサン／水（３：１、４ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（３２ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、そして１時間攪拌した。この反応混合物を２５％クエン酸水溶液でｐＨ３まで酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、対応するヒドロキシ酸（２４０ｍｇ、９６％）を得た。
上記ヒドロキシル酸（２４０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液に、イミダゾール（５３３ｍｇ、７．８４ｍｍｏｌ）およびＴＢＳＣｌ（５８８ｍｇ、３．９２ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、室温で、１５時間攪拌した。この期間の後、ＭｅＯＨ（４ｍＬ）を加え、得られた混合物を１時間攪拌した。次いで、この混合物を２５％クエン酸水溶液で希釈し、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２７（８９％）を得た。
標準的なＥＤＣＩ／ＨＯＢｔカップリング（セクションＩＶ）でＭＭＩ−１０１を生成した後、そのベンジル保護基を、先に記述した標準的な水素化手順（セクションＩＩ、工程Ｆ）に従った水素化により、除去した。
ＩＩＩ．他のアイソスター
Ａ．反転水酸基を有するアイソスター（ＭＭＩ−００３、ＭＭＩ−１１３、ＭＭＩ−１３３）
ロイシン−アラニンアイソスターについての通常の順序に従って、そのエチルプロピオラート添加工程（セクションＩ、工程Ｃ）から得た少量生成物を使用して、ロイシン−アラニンアイソスターのメチル／ヒドロキシジアステレオマー（ＭＭＩ−１３３）を合成した。
そのメチルキラル中心を反転させる以下の手順により、上記ジアステレオマーからＭＭＩ−１３３を生成した。
図式ＩＸ：ＭＭＩ−１３３を調製するのに使用されるロイシン−アラニンアイソスターについてのキラル中心の反転
Figure 0004547152
 ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０７ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液に、０℃で、ＢｕＬｉ（０．３２ｍＬ、ヘキサン中で１．６Ｍ、０．５１ｍｍｏｌ）を加え、そして３０分間攪拌した。上記溶液を−７８℃まで冷却し、そしてＴＨＦ（１ｍＬ）中の２８（２８．３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）に続いて、ＨＭＰＡ（０．１ｍＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を加えた。−７８℃で１時間、そして−４２℃で１．５時間攪拌した後、その反応物を−７８℃まで冷却し、そしてマロン酸ジメチル（０．１１ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を室温まで暖め、ＥｔＯＡｃで希釈し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２９（８６％）を得た。次いで、２９を、ＭＭＩ−１３３のアイソスターを生成する通常の手順（セクションＩを参照）にかけた。
Ｂ．ＭＩ−０６１、ＭＭＩ−０６２、ＭＭＩ−０９２、ＭＭＩ−１０６を調製するのに使用されるヒドロキシエチルアミンアイソスター：
図式Ｘ：ＭＩ−０６１、ＭＭＩ−０６２、ＭＭＩ−０９２、ＭＭＩ−１０６を調製するのに使用されるヒドロキシエチルアミンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 公知エポキシド３０（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，２７５３−２７５６）（２２９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）溶液に、メチルアミン（２．５ｍＬ、ＭｅＯＨ中の２．０Ｍ溶液、５．０ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を、室温で、４〜５時間攪拌した。減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、３１（収率９０％）を得た。
Ｃ．Ｐ１’およびＲ４がピロリジン−２−オン環を形成するアイソスター（ＭＭＩ−１８１、ＭＭＩ−１８５、ＭＭＩ−１８７、ＭＭＩ−１９１、ＭＭＩ−１９２）：
図式ＸＩ：Ｐ１’およびＲ４がピロリジン−２−オン環を形成するアイソスター（ＭＭＩ−１８１、ＭＭＩ−１８５、ＭＭＩ−１８７、ＭＭＩ−１９１、ＭＭＩ−１９２）の合成
Figure 0004547152
 ４（２．４１ｇ、８．８９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、１９．５６ｍＬ、１９．５６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化アリル（０．８９ｍＬ、９．７８ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−７８℃で、１５分間攪拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、７（１．９４ｇ、７０％）を得た。
７（１．５ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチレンジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、１０．６０ｍＬ、１０．６０ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化メチル（０．３９ｍＬ、６．２６ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、０℃で、１時間暖めた。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発すると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１２％ＥｔＯＡｃ）で精製して、３２（０．６８４ｇ、４４％）を得た。
−７８℃で、３２（２５０ｍｇ、０．７６８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：１、２０ｍＬ）溶液に、青色が持続するまで、オゾンを泡立たせた。次いで、この溶液を、Ｎ２で、１０分間フラッシュした。Ｍｅ２Ｓ（０．３１ｍＬ、４．２３ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、その反応混合物を室温まで暖めた。１２時間攪拌した後、減圧下にて溶媒を除去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、３３（１５５ｍｇ、６２％）を得た。
一例として、ＭＭＩ−１９１を調製するのに使用されるアイソスターへの化合物３４の取り込みを記述する。
ロイシンＮ−ブチルアミド（０．０９２ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）塩および酢酸ナトリウム（１０ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で、化合物３４（２０ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を、室温で、１５時間攪拌したのに続いて、ＮａＮＨ３ＣＮ（５．４ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、室温で、２４時間攪拌し、Ｈ２Ｏに注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて濃縮すると、残渣が得られ、これをクロマトグラフィー（ヘキサン中の４０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、化合物１３（３０ｍｇ、９９％）を得た。
Ｄ．ＭＭＩ−２０１を調製するのに使用されるフェニルアラニン−メチオニンアイソスター：
図式ＸＩＩ：ＭＭＩ−２０１を調製するのに使用されるフェニルアラニン−メチオニンアイソスターの合成
Figure 0004547152
 ３５（６３５ｍｇ、２．０８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、４．５７ｍＬ、４．５７ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、３０分間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化アリル（０．２１ｍＬ、２．２９ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−７８℃で、１５分間攪拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発すると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、３６（４１３ｍｇ、５８％）を得た。
−７８℃で、３６（４００ｍｇ、１．１５８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（１：１、３０ｍＬ）溶液に、青色が持続するまで、オゾンを泡立たせた。次いで、この溶液を、Ｎ２で、１０分間フラッシュした。トリフェニルホスフィン（３３４ｍｇ、１．２７４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、その反応混合物を室温まで暖めた。１５分間攪拌した後、減圧下にて溶媒を除去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の４０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、３７（３３６ｍｇ、８４％）を得た。
アルデヒド３７（３００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、ＮａＢＨ４（４９ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を０℃まで暖め、その温度で、２０分間攪拌した。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて濃縮すると、残渣が得られ、これを、クロマトグラフィー（ヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、対応するアルコール（２００ｍｇ、６６％）を得た。
上記アルコール（１７０ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液に、０℃で、イミダゾール（８３ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、Ｐｈ３Ｐ（３１９ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）およびヨウ化物（２４７ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、０℃で、１５分間攪拌し、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液に注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、３８（１２４ｍｇ、５５％）を得た。
ヨウ化物３８（１２４ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、０℃で、ナトリウムチオメトキシド（ｓｏｄｉｕｍ ｔｈｉｏｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）（２３ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を１０分間攪拌し、ＮＨ４Ｃｌ飽和溶液に注ぎ、そしてジエチルエーテルで抽出した。その有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて濃縮すると、残渣が得られ、これを、クロマトグラフィー（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）にかけ、３９（６６ｍｇ、６４％）を得た。次いで、このラクトンをＬｉＯＨで加水分解し、得られた遊離アルコールを、ロイシン−アラニンアイソスターの合成と同様に、保護した。
Ｅ．そのＰ１’位置にジメチル基を有するアイソスター（ＭＭＩ−２１８）：
図式ＸＩＩＩ：そのＰ１’位置にジメチル基を有するアイソスター（ＭＭＩ−２１８）の合成
Figure 0004547152
 ４（６２５ｍｇ、２．１９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、４．８ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた反応混合物を、−７８℃で、１時間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化メチル（０．１５ｍＬ、２．４１ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−４５℃まで１時間暖めた。この期間の後、この反応混合物に、−７８℃で、リチウムヘキサメチルジシラザン（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、４．８ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、−７８℃で、１時間攪拌した。この期間の後、−７８℃で、ヨウ化メチル（０．１５ｍＬ、２．４１ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を、−４５℃まで１時間暖めた。この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発すると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、４０（４１６ｍｇ、６３％）を得た。
４０（４１６ｍｇ、１．３８９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）溶液に、０℃で、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加え、得られた混合物を、０℃で、３．５時間攪拌した。この時点の後、その反応物を減圧下にて濃縮して、その粗アミンを得た。ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中のこの粗アミンに、−７８℃で、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．８ｍＬ、４．５８ｍｍｏｌ）およびクロロギ酸ベンジル（ｂｅｎｚｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）（０．２２ｍＬ、１．５３ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、−７８℃で、１時間攪拌し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、４１（４０８ｍｇ、８８％）を得た。
４１（４０８ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５ｍＬ）溶液に、室温で、１Ｎ ＬｉＯＨ水溶液（９．８ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を、室温で、１５時間攪拌した。この期間の後、その反応物を減圧下にて濃縮し、残りの水性残渣を０℃まで冷却し、そして２５％クエン酸水溶液でｐＨ４まで酸性化した。得られた酸性溶液を、ＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の７０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、４２（１１０ｍｇ、３７％）を得た。
標準的なＥＤＣＩ／ＨＯＢｔカップリング条件（セクションＩＶ）下にて、４２をバリン−Ｎ−ｎ−ブチルアミドとカップリングして、４３を得た。
４３（８１ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）溶液に、０℃で、Ｅｔ３Ｎ（０．０３２ｍＬ、０．２２４ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ２Ｏ（５３ｍｇ、０．２４５ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間攪拌した後、その反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ３中の５％ＭｅＯＨ）で精製して、対応するＢｏｃ−保護オキサゾリジノン（９９ｍｇ、９８％）を得た。
ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中の上記Ｂｏｃ−保護オキサゾリジノン（７４ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）に、室温で、Ｃｓ２ＣＯ３（９７ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０時間攪拌した後、その反応混合物を１Ｎ ＨＣｌ水溶液で中和し、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の２％ＭｅＯＨ）で精製して、対応するアミノアルコール（３８ｍｇ、５４％）を得た。
ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の上記アミノアルコール（３８ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）に、−７８℃で、ｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（０．０２２ｍＬ、０．０９７ｍｍｏｌ）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（０．０３４ｍＬ、０．１９３ｍｍｏｌ）を加えた。−７８℃で１５分間攪拌した後、その反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の１．５％ＭｅＯＨ）で精製して、４４（４２ｍｇ、８９％）を得た。
Ｂ．ロイシン側鎖以外のＰ１アミノ酸側鎖を有するアイソスター
セクションＩ、工程Ａにおいて、適当なＢｏｃ−保護アミノ酸をＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｌ−ロイシン（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ：ＭＭＩ−０４０、ＭＭＩ−０４８、ＭＭＩ−２０１；Ｂｏｃ−Ｓｅｒ：ＭＭＩ−１５５）で置換することにより、Ｐ１で異なるアミノ酸ベースの側鎖を備えた阻害剤を生成した。
Ｃ．非天然Ｐ１アミノ酸側鎖を有するアイソスター（ＭＭＩ−１７８、ＭＭＩ−１７９、ＭＭＩ−１７０、ＭＭＩ−１７２）
図式ＸＩＶ：非天然Ｐ１アミノ酸側鎖を有するアイソスターの合成
Figure 0004547152
 ｉ）化合物４６の調製：
ＮａＨ（４．８ｇ、０．１２ｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）溶液に、０℃で、１０分間にわたって、トリエチルホスホノアセテート（２３．８ｍＬ、０．１２ｍｏｌ）を滴下した。その攪拌混合物に、シクロブタノン（７．５ｍＬ、０．１０ｍｏｌ）を加えた（ｑ＝２については、シクロブタノンの代わりに、シクロペンタノンを加えた）。室温で１時間後、この反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の５％ＥｔＯＡｃ）で精製して、４６（１３．６６ｇ、９６％）を得た。
ｉｉ）化合物４７の調製：
化合物４６を、４０ｐｓｉで、エタノール（ＥｔＯＨ）中のＰｄ／Ｃで水素化して、収率８４％で、化合物４７を得た。
ｉｉｉ）化合物４８の調製：
化合物４７を、−７８℃で、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）でアルデヒドに還元し、このアルデヒドを、−２０℃で、臭化ビニルマグネシウムと反応させて、化合物４８を得た（２工程で３９％）。
ｉｖ）化合物４９の調製：
化合物４８（２．１５８ｇ、１７．１ｍｍｏｌ）および１，５−ヘキサジエン（１．５２ｍＬ、１２．８３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液に、０℃で、ＳＯＢｒ２（２．０ｍＬ、２５．６５ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を、０℃で、４５時間攪拌した後、Ｈ２Ｏを加えることにより、この反応をクエンチし、そして０℃で、１５分間攪拌した。この混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製して、化合物４９（２．８５ｇ、８８％）を得た。
ｖ）化合物５０の調製：
化合物４９（２．４ｇ、１２．６９ｍｏｌ）のアセトン（４０ｍＬ）溶液に、ＮａＩ（２．４７ｇ、１６．５０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間後、Ｈ２Ｏを加えることにより、その反応をクエンチした。その混合物を減圧下にて濃縮し、残りの水性残渣をＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン）で精製して、化合物５０（２．４３ｇ、８１％）を得た。
ｖｉ）化合物５１の調製：
Ｅｖａｎのプロトコル（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：２３３５−２３４２（１９９０））に従って、化合物５０から、収率７１％で、化合物３０を調製した。
ｖｉｉ）化合物５２の調製：
化合物５２（２．１ｇ、６．１５ ｍｏｌ）のエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）／Ｈ２Ｏ（１：１、４０ｍＬ）溶液に、０℃で、Ｎ−ブロモスクシンアミド（ＮＢＳ）（１．２ｇ、６．７７ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で４５分間攪拌した後、Ｈ２Ｏを加えることにより、その反応をクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａＨＣＯ３飽和水溶液、ブラインで洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、５２（７２７ｍｇ、４５％）を得た。
ｖｉｉｉ）５３の調製：
室温で、３日間にわたって、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）中にて、化合物５２とＮａＮ３とを反応させて、化合物３２を得た（６５％）。このラクトンをＬｉＯＨで加水分解し、得られたアルコールをＴＢＳで保護し（Ｉ部、工程Ｆを参照）、そして先に記述した標準的な水素化手順（セクションＩＩ、工程Ｆ）に従って、そのアジドを水素化することにより、このアイソスター合成を完了した。
Ｈ．ＭＭＩ−１６２、ＭＭＩ−１６３、ＭＭＩ−１６８、ＭＭＩ−１６９でのアイソスターは、以下の図式で記述されている：
図式ＸＶ：ＭＩ−１６２、ＭＭＩ−１６３、ＭＭＩ−１６８、ＭＭＩ−１６９の調製で使用されるアイソスター（ＭＭＩ−１６２およびＭＭＩ−１６３の調製は、化合物５８の他の異性体を使用する）
Figure 0004547152
 ＭＭＩ−１６２およびＭＭＩ−１６３の合成は、化合物５８の一方の異性体を使用し、そして、ＭＭＩ−１６８およびＭＭＩ−１６９の合成は、化合物５８の他方の異性体を使用した。
ＩＶ．アミド結合形成
本発明の阻害剤中のアミド結合を、一般に、適切なカルボン酸およびアミドの、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣＩ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）が媒介するカップリングにより、作成した。アイソスター６とアミン含有化合物６２とのカップリングについて、一例を以下で示す。
図式ＸＶＩ：アミド結合の形成
Figure 0004547152
 Ｂｏｃ−保護アミン化合物６２（７１ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、そして室温で、ＴＦＡ（０．７５ｍＬ）を加えた。その反応混合物を３０分間攪拌したのに続いて、減圧下にて濃縮して、遊離アミンを得た（６１ｍｇ、定量）。ロイシン−アラニンアイソスター６（４２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、室温で、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を連続的に加え、そして５分間攪拌した。この溶液に、上記遊離アミン（４１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）の溶液を滴下し、得られた混合物を、一晩攪拌した。この混合物をＨ２Ｏに注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）にかけると、化合物６３が得られた（５７ｍｇ、９５％）。
Figure 0004547152
 Ｖ．Ｒ１がヘテロアザアラルコキシである阻害剤
Ａ．一般合成方法
Ｇｈｏｓｈら、２００１（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４：２８６５−２８６８（２００１）（その教示内容は、本明細書中でその全体が参考として援用されている）で記述された手順に従って、Ｎ−（３，５−ジメチルピラゾール−１−メトキシカルボニル）−Ｌ−メチオニンおよびＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ψ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＮＨＣＨ２Ｐｈを使用して、阻害剤ＭＩ−１３８（これはまた、本明細書中にて、ＭＭＩ−１３８、ＯＭ−１３８、ＧＴ−１３８とも呼ばれている）を合成した。Ｇｈｏｓｈら、１９９２（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ ２２：７８１−８４（１９９２）（その教示内容は、本明細書中でその全体が参考として援用されている）で記述されているように、メチオニンメチルエステルを市販の３，５−ジメチルピラゾール−１−メタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）でアルコキシカルボニル化することに続いて水酸化リチウム水溶液でケン化（全体で３６％）することにより、Ｎ−（３，５−ジメチルピラゾール−１−メトキシカルボニル）−Ｌ−メチオニンを調製した。ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸で処理することにより、以下で示す化合物４３のＢｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）基を除去すると（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４：２８６５−２８６８（２００１）；その教示内容は、本明細書中で参考として援用されている）、対応するアミンが得られ、これを、ジクロロメタン中にて、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩、ジイソプロピルエチルアミンおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下で、Ｎ−（３，５−ジメチルピラゾール−１−メトキシカルボニル）−Ｌ−メチオニンと反応させて、収率５０％で、化合物ＭＭＩ−１３８を得た。
Figure 0004547152
 上記方法を使用して、Ｒ１またはＲ１８がヘテロアザアラルコキシ基である本発明の他の化合物を調製したが、ここで、３，５−ジメチル−ピラゾール−１−メタノールの代わりに、表４の種々のヘテロアザアラルキル−アルコールを使用した。
表４：ヘテロアザアラルキル−アルコールの構造および名称
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 図式ＸＶＩＩで概説した典型的な手順にて、注射器ポンプを使用して、３０分間にわたって、トリホスゲンの塩化メチレン溶液（モル比１：０．３７）に、第三級塩基の存在下にて、塩化メチレン中のＬ−メチオニンメチルエステル塩酸塩を加えて、イソシアネート中間体を形成した。次いで、上記溶液にアルコール成分を加え、そして１２時間攪拌して、そのウレタン−メチルエステルを得、これを、１０％ＴＨＦ水溶液中にて、ＬｉＯＨで加水分解して、対応する酸を得た。
Figure 0004547152
 図式ＸＶＩＩ：Ｎ−（３，５−ジメチルピラゾール−１−メトキシカルボニル）−Ｌ−メチオニンの合成
（ａ）Ｌ−メチオニンメチルエステル塩酸塩、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ２Ｃｌ２、２３℃、３０分間；
（ｂ）（３，５−ジメチルピラゾール−１−イル）−メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２、２３℃、１２時間；
（ｃ）ＬｉＯＨ、１０％ＴＨＦ水溶液、２３℃、３時間。
図式ＸＶＩＩで示した合成で使用され得る他のヘテロアラルキル−アルコールを、表５で列挙する。
表５：ヘテロアラルキル−アルコールの構造および名称
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 表６は、ヘテロアザアラルコキシＲ１基を有する、調製した本発明のメマプシン阻害剤を列挙する。表６で列挙した種々の阻害剤の一般合成の代表的な例は、図式ＸＶＩＩＩで概説する。
図式ＸＶＩＩＩ：本発明の阻害剤の代表的な合成
Figure 0004547152
 （ａ）ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、化合物６７、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）、０〜２３℃；
（ｂ）ＤＦ３ＣＯ２Ｈ、ＣＨ２Ｃｌ２、２３℃；
（ｃ）ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、化合物６６（図式ＸＶＩＩを参照）、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（１：１）、０〜２３℃。
こうして、ＤＭＦおよびＣＨ２Ｃｌ２の混合物中にて、Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジイソプロピルエチルアミンおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物の存在下にて、バリン誘導体６７（図式ＸＶＩＩＩ）を公知ジペプチドアイソスター６（Ｉ部、工程Ｆを参照）と反応させて、アミド誘導体を生成した。化合物６８を、まず最初に、ＣＨ２Ｃｌ２中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に晒して、そのＢｏｃ基およびシリル基を除去した。得られたアミノールを化合物６６とカップリングして、阻害剤ＭＭＩ−１３８を生成した。対応する置換したヘテロアザアラルコキシウレタンおよびバリン（またはロイシン）誘導体を使用して、類似の手順に従って、異なるＲ１基、Ｐ２’基およびＲ３基を含む他の全ての阻害剤を調製した。
表６：メマプシン阻害剤の構造
Figure 0004547152
 図式ＸＩＸで描写したようにして、メタノールおよび水の混合物（１：１）中にて、２３℃で、１２時間にわたって、ＭＭＩ−１３８をＯＸＯＮＥ（登録商標）で酸化することにより、阻害剤ＭＭＩ−１３９を合成した。
図式ＸＩＸ：ＭＭＩ−１３９を形成する、ＭＭＩ−１３８の酸化
Figure 0004547152
 （ａ）ＯＸＯＮＥ（登録商標）、ＮａＨＣＯ３、ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（１：１）、２３℃、１２時間。
Ａ．ＭＭＩ−１３８およびＭＭＩ−１３９の代表的な合成
ｉ）２−（２−メチルスルファニル−エチル）−コハク酸−４−（３，５−ジメチル−ピラゾール−１−イルメチル）エステル １−メチルエステル（６５）：
図式ＸＸ
Figure 0004547152
 トリホスゲン（１３２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（２ｍＬ）攪拌溶液に、２３℃で、注射器ポンプを使用して、３０分間にわたって、Ｌ−メチオニンメチルエステル塩酸塩５０（２４２ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．４２ｍＬ、３．０３ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（４ｍＬ）溶液をゆっくりと加えた。さらに５分間攪拌した後、（３，５−ジメチル−ピラゾール−１−イル）−メタノール４９（１５２ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液を一度に加えた。その反応混合物を１２時間攪拌し、酢酸エチルで希釈し、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。その残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、１４３ｍｇ（３６％）の化合物６５を得た。
Figure 0004547152
 一般に、トリホスゲンを使用してアルコール基を有する化合物をアミン基を有する化合物とカップリングする上記方法により、本発明の阻害剤のカーバメート連鎖を合成した。上記手順を使用して、トリホスゲンを使用してアミン基を有する２種の化合物をカップリングする類似の方法により、本発明の阻害剤中の尿素連鎖を形成した。
ｉｉ）２−（２−メチルスルファニル−エチル）−コハク酸−４−（３，５−ジメチル−ピラゾール−１−イルメチル）エステル（６６）：
１０％ＴＨＦ水溶液（３ｍＬ）の混合物中の上記エステル６５（１４０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、ＬｉＯＨ（２７ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を３時間攪拌した。この期間の後、溶媒を除去し、その残渣を、１Ｎ ＨＣｌ水溶液で、ｐＨ約４まで酸性化した。その白色固形物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、化合物６６（１３４ｍｇ、定量）を得、これを、さらに精製することなく、次の工程に進めた。
Figure 0004547152
 ｉｉｉ）化合物６７：
ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）およびＤＭＦ（２ｍＬ）の混合物中のＮ−Ｂｏｃ−バリン（５００ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびベンジルアミン（０．５０ｍＬ、４．６０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、０℃で、ＨＯＢｔ（３７３ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（５２９ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（２．４ｍＬ、１３．８ｍｍｏｌ）を連続的に加えた。この添加後、その反応混合物を２３℃まで暖め、そして一晩攪拌した。この混合物をＮａＨＣＯ３水溶液に注ぎ、その混合物を３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、フラッシュカラムクロマトグラフィー（３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、４４２ｍｇ（６３％）のカップリング生成物を得た。得られたアミンをＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、そして２３℃で、ＴＦＡ（４ｍＬ）を加えた。この反応混合物を３０分間攪拌し、次いで、減圧下にて濃縮して、化合物６７（２９７ｍｇ、定量）を得た。
Figure 0004547152
 ｉｖ）化合物６８：
ジペプチドアイソスター６（４２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）および化合物６７（４１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、０℃で、ＨＯＢｔ（２０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を連続的に加えた。この添加後、その反応混合物を２３℃まで暖め、そして一晩攪拌した。この混合物をＮａＨＣＯ３水溶液に注ぎ、そして３０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、５５ｍｇ（９５％）の化合物６８を得た。
Figure 0004547152
 ｖ）ＭＭＩ−１３８：
６８（３７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）溶液に、２３℃で、ＴＨＦ（０．４ｍＬ）を加えた。得られた混合物を、２３℃で、１時間攪拌し、減圧下にて濃縮し、その残渣をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。この溶液に、０℃で、化合物６６（１８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１１ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）を連続的に加えた。この添加後、その反応混合物を２３℃まで暖め、そして一晩攪拌した。この混合物をＮａＨＣＯ３水溶液に注ぎ、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をブラインで洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（２％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製して、阻害剤ＭＭＩ−１３８（１６ｍｇ、４０％）を得た。
Figure 0004547152
 ｖｉ）阻害剤ＭＭＩ−１３９の調製：
ＭＭＩ−１３８（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（１：１）（２ｍＬ）溶液に、ＮａＨＣＯ３（１１．６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびカリウムペルオキシモノサルフェート（ＯＺＯＮＥ（登録商標））（２７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加え、そして１２時間攪拌した。次いで、この反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、そして無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発させると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（４％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製して、阻害剤ＭＭＩ−１３９（６．８ｍｇ、６５％）を得た。
Figure 0004547152
 Ｃ．本発明の他の阻害剤
ＭＭＩ−１３８およびＭＭＩ−１３９を調製する方法と類似の方法により、本発明の以下のメマプシン阻害剤を調製した。その分子のウレタン部分を調製する方法（図式１０を参照）にて、表１で枚挙した適切なヘテロアザアリールアルキル（ｈｅｔｅｒｏａｚａａｒｙａｌｋｙｌ）−アルコールを（３，５−ジメチルピラゾール−１−イル）−メタノールで置き換えることにより、以下で枚挙した阻害剤の種々のＲ１基を得た。セクションＶ−Ｂ（ｉｉｉ）で記述した方法において、Ｎ−Ｂｏｃ−ロイシンをＮ−Ｂｏｃ−バリンで置き換えることにより、以下で枚挙した阻害剤のＰ２’位置にて、ロイシン側鎖を得た。他の天然および非天然のＢｏｃ−保護アミノ酸は、セクションＶ−Ｂ（ｉｉｉ）で記述された方法におけるＮ−Ｂｏｃ−バリンの代わりをし得、本発明の阻害剤における他のＰ２’基が得られる。セクションＶ−Ｂ（ｉｉｉ）で記述された合成においてベンジルアミンを２−メチルプロピルアミンまたは１−メチルエチルアミンで置き換えることにより、２−メチルプロプ−１−イル基または１−メチルエト−１−イルＲ３基を有する阻害剤を得た。アミン基を含む他の化合物もまた、セクションＶ−Ｂ（ｉｉｉ）で記述された合成におけるベンジル基の代わりをし得る。例えば、セクションＶ−Ｂ（ｉｉｉ）で記述された合成におけるベンジルアミンに代えて、脂肪族アミン、アリールアミン、アラルキルアミン、複素環アミン、ヘテロシクロアルキルアミン、ヘテロアリールアミン、ヘテロアラルキルアミン、アミン基を含有するペプチドまたはキャリア分子が使用され得る。それに加えて、セクションＶ−Ｂ（ｉｉｉ）のベンジルアミンに代えて、第二級アミンを有する複素環化合物またはヘテロアリール化合物が使用され得る。
Figure 0004547152
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 ＶＩ．出発物質の合成
市販されていない本発明の阻害剤の調製で使用される化合物の合成を、以下で記述する。
Ａ．ヘテロアザアラルキルＲ１基を有する阻害剤用の出発物質の合成
Figure 0004547152
 一般的な手順（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｃｈｅｍ．（ＵＵＳＲ）３３：５１１（１９６３））：１，３−ジメチルピラゾール（３９５ｍｇ、４．１１ｍｍｏｌ）および２−メチルアクリル酸メチルエステル（１．０ｍＬ）の混合物を、封管中にて、２００℃で、４時間加熱した。その反応物を室温まで冷却し、減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン中の３５％ ＥｔＯＡｃ）にかけて、５１（４７０ｍｇ、５８％）を得、これを、阻害剤ＭＭＩ−１９５、ＭＭＩ−１９６、ＭＭＩ−２１４およびＭＭＩ−２２６を調製するのに使用した。類似の手順を使用して、ピラゾール７２および７３を合成した。化合物７２を使用して阻害剤ＭＭＩ−１９４およびＭＭＩ−２１３を調製し、そして、化合物７３を使用して、阻害剤ＭＭＩ−２０４、ＭＭＩ−２２５、ＭＭＩ−２２８およびＭＭＩ−２２９を調製した。これらのメチルエステルの加水分解は、そのエステルを１０％ＴＨＦ水溶液中のＬｉＯＨの室温飽和溶液中で３〜４８時間攪拌することにより、達成した。
Ｂ．ヘテロアザアラルコキシＲ１基を有する阻害剤用の出発物質の合成
Figure 0004547152
 ｉ）以下の一般的な手順を使用して、化合物６９および７４〜７７を調製した：
２−ヒドロキシエチルヒドラジン（１．０２ｍｍｏｌ）の無水エタノール（１ｍＬ）溶液を、０℃で、対応するジケトン（１．０ｍｍｏｌ）の溶液に滴下した。この混合物を室温まで暖め、そして１時間攪拌した。減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そして水で洗浄した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、そしてフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、生成物を得た。
ｉｉ）化合物７８を得るための化合物７７の酸化手順：
化合物７７（１８４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のアセトン／Ｈ２Ｏ（３：１、２０ｍＬ）溶液に、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド（２９２ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）に続いてＯｓＯ４（０．３８ｍＬ、ｔ−ＢｕＯＨ中で２重量％、０．０３ｍｍｏｌ）を加え、そして一晩攪拌した。減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そして水で洗浄した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の４％ＭｅＯＨ）で精製して、化合物７８（１１０ｍｇ、５１％）を得た。
ｉｉｉ）阻害剤ＭＭＩ−２１９を調製するのに使用される１−（３，５−ジメチル−ピラゾール−１−イル）−２−メチル−プロパン−２−オール（６０）の調製：
Figure 0004547152
 臭化メチルマグネシウム（５．４ｍＬ、ＴＨＦ中で１．４Ｍ、７．６ｍｍｏｌ）を、０℃で、（３，５−ジメチルピラゾール−１−イル）−酢酸エチルエステル（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｐ．１６５９（１９８３））（化合物７９、５５４ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液に滴下した。３０分後、その反応をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の４０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２７６ｍｇ（６５％）の化合物８０を得た。
Ｃ．ヘテロアザアラルコキシＲ１基を有する阻害剤用の追加出発物質の合成
引用した参考文献で記述された方法により、以下のヘテロアザアラルキル−アルコール出発物質を合成した。
Figure 0004547152
 Ｄ．阻害剤ＭＭＩ−０１３、ＭＭＩ−０１４、ＭＭＩ−０１９、ＭＭＩ−０２０、ＭＭＩ−０３４、ＭＭＩ−０３５、ＭＭＩ−２０５およびＭＭＩ−２１５のＰ１置換基を形成するのに使用されるテトラヒドロフラニルメチル側鎖を有するＢｏｃ−保護非天然アミノ酸の合成：
Figure 0004547152
 ｉ）工程１：
化合物８１（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，ｐ．４９５−５０５（１９９７））（１．１７ｇ、４．８ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル（２０ｍＬ）溶液に、−７８℃で、臭化アリルマグネシウム（７．５ｍＬ、ジエチルエーテル中で１．０Ｍ、７．５ｍｍｏｌ）を滴下した。３０分間攪拌した後、その反応を、−７８℃で、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチした。この混合物を室温まで暖め、そして層分離した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。それらのジアステレオマーをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２５％ＥｔＯＡｃ）で分離して、５００ｍｇ（３７％）のより速い異性体および６３０ｍｇ（４６％）のより遅い異性体を得た。この合成の残りは、これらの異性体の各々で別々に実行して、阻害剤ＭＭＩ−２０５およびＭＭＩ−２１５を形成するのに使用される非天然アミノ酸を調製した。
１個少ないメチレンを有する適当なアルデヒドを使用する同じプロトコル（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１７９−１８２（１９９８））により、阻害剤ＭＭＩ−０１３、ＭＭＩ−０１４、ＭＭＩ−０１９、ＭＭＩ−０２０、ＭＭＩ−０３４、ＭＭＩ−０３５を調製するのに使用される非天然アミノ酸を合成した。
ｉｉ）工程２（１種の異性体のみを使う例）：
工程１から得た生成物（５００ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ）（３．８６ｍＬ、ＴＨＦ中で０．５Ｍ、１．９３ｍｍｏｌ）を加え、そして１２時間攪拌し、その後、その反応混合物を−２０℃まで冷却し、そしてＭｅＯＨ（０．１３ｍＬ）、３Ｎ ＮａＯＨ（０．８７ｍＬ）および３０％Ｈ２Ｏ２（０．８７ｍＬ）を順次加えた。この反応混合物を６０℃まで暖め、そして１時間攪拌した。得られた透明溶液をブライン（２５ｍＬ）に注ぎ、ジエチルエーテルで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、そしてフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の７０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、２８０ｍｇ（５３％）の生成物を得た。
ｉｉｉ）工程３：
工程２から得た生成物（１１２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（０．１ｍＬ、０．７４ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホニルクロライド（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（９ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を順次加え、反応物を室温で１２時間攪拌し、その後、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、そしてＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、８３ｍｇ（８６％）の対応するテトラヒドロフランを得た。
ｉｖ）工程４：
工程３で調製したテトラヒドロフランのＭｅＯＨ（３ｍＬ）攪拌溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸水和物（１３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を加え、そして室温で、１時間攪拌した。次いで、その反応をＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の５０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、化合物８２（５５ｍｇ、６５％）を得た。
ｖ）カルボン酸の形成：
以下の手順（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，ｐ．５３２３（１９９８））により、湿潤ＣＨ３ＣＮ中のＨ５ＩＯ６／ＣｒＯ３を使用して、化合物８２を対応するカルボン酸に酸化した：Ｈ５ＩＯ６（１１．４ｇ、５０ｍｍｏｌ）およびＣｒＯ３（２３ｍｇ、１．２ｍｏｌ％）を１１４ｍＬの容量まで湿潤ＣＨ３ＣＮ（０．７５ｖ％の水）に溶解することにより（完全な溶解には、典型的には、１〜２時間を要する）、Ｈ５ＩＯ６／ＣｒＯ３のストック溶液を調製した。次いで、このＨ５ＩＯ６／ＣｒＯ３溶液（０．７ｍＬ）を、０℃で、３０分間にわたって、化合物８２（３０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の湿潤ＣＨ３ＣＮ（１ｍｌ）溶液に加えた。Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液を加えることにより、その反応をクエンチした。この混合物をジエチルエーテルで抽出し、その有機層をブライン、Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮した。８３の粗収量は、２２ｍｇ（６９％）であった。
Ｅ．阻害剤ＭＭＩ−１９０のＰ２置換基を形成するのに使用されるメトキシメトキシエチル側鎖を有するＣｂｚ−保護非天然アミノ酸の合成：
Figure 0004547152
 Ｃｂｚ−保護ホモセリン（Ｊ．Ｏｒｇ．，Ｃｈｅｍ．，５４４２（１９９７））（６０、１４０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）溶液に、０℃で、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．２８ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ）およびクロロメチルメチルエーテル（ＭＯＭＣｌ）（０．０５ｍＬ、０．６２ｍｍｏｌ）を加えた。３時間攪拌した後、その反応をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、ジエチルエーテルで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の３０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、１１６ｍｇ（７１％）の化合物８５を得た。このＣｂｚ保護基を水素化により除去すると、カップリング用の遊離アミンが得られた。
Ｆ．阻害剤ＭＭＩ−０７９、ＭＭＩ−１８５、ＭＭＩ−２２８のＰ２置換基を形成するのに使用されるメトキシエチル側鎖を有するＢｏｃ−保護非天然アミノ酸の合成：
Figure 0004547152
 Ｂｏｃ−保護ホモセリン（８６、４００ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）溶液に、０℃で、ＮａＨ（６０％、１５５ｍｇ、４．０２ｍｍｏｌ）に続いてＭｅＩ（０．４５ｍＬ、７．３ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、室温で、１２時間攪拌した。このＤＭＦを、減圧下にて、除去した。その残渣をＥｔＯＡｃに溶解し、そしてＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、３２３ｍｇ（７２％）の化合物８７を得た。化合物８７をＬｉＯＨ（上記）で加水分解して、その遊離酸を定量的に得た。
Ｇ．大環状阻害剤ＭＭＩ−１４９、ＭＭＩ−１５０、ＭＭＩ−１５２、ＭＭＩ−１５３、ＭＭＩ−１７４およびＭＭＩ−１７５用ならびに大環状阻害剤前駆体ＭＭＩ−１４８、ＭＭＩ−１５１およびＭＭＩ−１７３用の出発物質の合成
Figure 0004547152
 Ｂｏｃ−Ａｓｐメチルエステルをアリルアミン（セクションＩＶを参照）でＥＤＣＩ／ＨＯＢｔカップリングすることに続いて、そのＢｏｃ保護基のＴＦＡを除去し、そして種々のＶａｌ誘導体８９でカップリングした（これらのカーバメートは、Ｖａｌメチルエステルを、種々のアルコール（アリルアルコール、４−ブテノールおよび５−ペンテノール）でトリホスゲンカップリングすることにより、生成した）（セクションＶ−Ｂ（ｉ）を参照）。構造９０で表わされる化合物を、加水分解に続いて遊離酸のカップリングにより、阻害剤ＭＭＩ−１４８、ＭＭＩ−１５１およびＭＭＩ−１７３に取り込んだ。これらの大環状分子は、閉環オレフィン複分解を使用して形成し、阻害剤ＭＭＩ−１４９、ＭＭＩ−１５０、ＭＭＩ−１５２、ＭＭＩ−１５３、ＭＭＩ−１７４およびＭＭＩ−１７５にて、その大環基を形成した。この大環基を形成する代表的な手順は、以下である：
ジエン（９０）の０．００２Ｍ ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（２０ｍｏｌ％）を加えた。そのフラスコをアルゴンでフラッシュし、そして室温で、１２時間攪拌した。減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の２％ＭｅＯＨ）にかけて、約７５％の所望の大環状分子を得た。この複分解工程に続いて、ＬｉＯＨで加水分解して、さらにカップリングするための遊離酸を得た。これにより、ＭＭＩ−１４９、ＭＭＩ−１５２およびＭＭＩ−１７４用の配位子を生成した。
阻害剤ＭＭＩ−１５０、ＭＭＩ−１５３およびＭＭＩ−１７５を調製するために、阻害剤ＭＭＩ−１４９、ＭＭＩ−１５２、およびＭＭＩ−１７４を、それぞれ、先に記述した標準的な水素化手順（セクションＩＩ、工程Ｆ）に従って、水素化した。
Ｈ．阻害剤ＭＭＩ−１５４およびそのピラン誘導体のＲ３置換基を形成するのに使用される２−メチル−１−（テトラヒドロフラン−２−イル）−プロピルアミンおよび２−メチル−１−（テトラヒドロピラン−２−イル）−プロピルアミンの合成：
Figure 0004547152
 代表的な手順：
ｉ）工程１：
化合物９２（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１１：１１４１（１９８８））（５３０ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液に、０℃で、ＮａＨ（６０％、１３０ｍｇ、３．２８ｍｍｏｌ）およびヨウ化アリル（０．２３ｍＬ、２．４６ｍｍｏｌ）を加え、そして室温で、１２時間攪拌した。その反応をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、ジエチルエーテルで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の２％ＥｔＯＡｃ）にかけて、５３０ｍｇ（９０％）のアリルエーテル９３を得た。
ｉｉ）工程２：
化合物９３（２００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液に、Ｇｒｕｂｂｓ触媒（２０ｍｇ、５ｍｏｌ％）を加え、その混合物を、アルゴン下にて、２時間還流した。減圧下にて溶媒を除去し、その残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン中の３％ＥｔＯＡｃ）にかけて、１７１ｍｇ（９３％）のジヒドロピラン９４を得た。
ｉｉｉ）工程３：
ＭｅＯＨ中の化合物９４（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＯＨ）２／Ｃ（２０％、２０ｍｇ）の混合物を、Ｈ２雰囲気下にて、５時間攪拌した。この触媒を濾過により除き、その濾液を減圧下にて濃縮して、定量的に、化合物９５を得た。
Ｉ．阻害剤ＭＭＩ−１４０、ＭＭＩ−１４１、ＭＭＩ−１４６およびＭＭＩ−１４７のＲ３置換基を形成するのに使用される３−（１−アミノ−２−メチル−プロピル）−５−ベンジル−シクロヘキサノン（１００）および１−（３−ベンジル−シクロヘキシル）−２−メチル−プロピルアミン（１０１）の合成：
Figure 0004547152
 ｉ）ＭＭＩ−１４０およびＭＭＩ−１４１を調製するための３−（１−アミノ−２−メチル−プロピル）−５−ベンジル−シクロヘキサノン（１００）の合成：
ａ）工程１：
９６（９３０ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に、０℃で、Ｅｔ３Ｎ（１．２ｍＬ、８．６４ｍｍｏｌ）および塩化アクリロイル（０．３ｍＬ、３．７４ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、室温で、１時間攪拌し、そしてＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチした。その水層をジエチルエーテルで抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の４％ＥｔＯＡｃ）にかけて、ラクトン９７（７００ｍｇ、６６％）を得た。
ｂ）工程２：
セクションＶＩ Ｇ部で先に記述した手順と同じ手順に従って、閉環オレフィン複分解を実行し、そして収率８９％で、化合物９８を得た。
ｃ）工程３：
化合物９８（７５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のジエチルエーテル溶液に、ＣｕＣＮ（２ｍｇ、１０ｍｏｌ％）を加えた。その混合物を−７８℃まで冷却し、そしてＰｈＣＨ２ＭｇＣｌ（０．２４ｍＬ、ジエチルエーテル中で１．０Ｍ、０．２４ｍｍｏｌ）を滴下した。この反応物を、１時間にわたって、室温まで暖め、そしてＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチし、ジエチルエーテルで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の２５％ＥｔＯＡｃ）にかけて、化合物９８（４７ｍｇ、５０％）を得た。
ｄ）工程４：
先に記述したようにして（セクションＩＩ、工程Ｆ）化合物９９を水素化してベンジル保護基を除去すると、３−（１−アミノ−２−メチル−プロピル）−５−ベンジル−シクロヘキサノン（１００）が生じ、これを、阻害剤ＭＭＩ−１４０およびＭＭＩ−１４１を調製するのに使用した。
ｉ）ＭＭＩ−１４６およびＭＭＩ−１４７を調製するための１−（３−ベンジル−シクロヘキシル）−２−メチル−プロピルアミン（１０１）の合成：
化合物９９（２２５ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）のトルエン（３ｍＬ）溶液に、−７８℃で、ＤＥＢＡＬ−Ｈ（１．２８ｍｍｏｌ、ヘキサン中で１．０Ｍ、１．２８ｍｍｏｌ）を加え、そして３０分間攪拌した。その反応を水性Ｎａ−Ｋ−酒石酸塩でクエンチし、室温まで暖め、そしてジエチルエーテルで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、粗ラクトールを得た。
この粗ラクトールをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却し、そしてＥｔ３ＳｉＨ（０．１２ｍＬ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＢＦ３・ＯＥｔ２（０．０７ｍＬ、０．５５ｍｍｏｌ）を順次加えた。３０分後、その反応をＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。その有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィーにかけて、対応するテトラヒドロピラン（１７５ｍｇ、８０％）を得、これを、先に記述のようにして水素化して、そのベンジル保護基を除去し、化合物１０１を得た。化合物１０１を、阻害剤ＭＭＩ−１４６およびＭＭＩ−１４７を調製するのに使用した。
Ｊ．阻害剤ＭＭＩ−０９１のＰ２’〜Ｐ３’置換基を形成するのに使用される４−アミノ−６−メチル−１−フェニル−ヘプタン−３−オールの合成：
Figure 0004547152
 ｉ）工程１：
ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中の公知のオキサゾリジノン８１（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：６１４６−６１５２（１９９８））（８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）および１０％Ｐｄ／Ｃ（１５ｍｇ）の混合物を、Ｈ２雰囲気下にて、１時間攪拌した。この触媒を濾過により除き、その濾液を減圧下にて濃縮し、そしてクロマトグラフィー（ヘキサン中の４０％ＥｔＯＡｃ）にかけて、４８ｍｇ（６１％）の飽和生成物を得た。
ｉｉ）工程２：
工程１の生成物（４８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、４ｍＬ）溶液に、ＫＯＨ（４５ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を加え、そして１２時間攪拌した。次いで、その反応物を、１Ｍ ＨＣｌでｐＨ３に酸性化し、ＣＨＣｌ３で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、そして減圧下にて濃縮して、３５ｍｇ（８３％）の８２を得た。
Ｋ．ＭＭＩ−００３、ＭＭＩ−００７、ＭＭＩ−００９、ＭＭＩ−０１６、ＭＭＩ−０１８、ＭＭＩ−０２４、ＭＭＩ−０２６、ＭＭＩ−０３５、ＭＭＩ−０４３、ＭＭＩ−０４５、ＭＭＩ−０４７、ＭＭＩ−０５２、ＭＭＩ−０５４、ＭＭＩ−０５６、ＭＭＩ−０５８、ＭＭＩ−０６０、ＭＭＩ−０６７、ＭＭＩ−０６９、ＭＭＩ−０７１、ＭＭＩ−０７３、ＭＭＩ−０８２、ＭＭＩ−０８８、ＭＭＩ−０９０、ＭＭＩ−０９６、ＭＭＩ−０９８、ＭＭＩ−１００、ＭＭＩ−１０５、ＭＭＩ−１２２、ＭＭＩ−１２３、ＭＭＩ−１２６、ＭＭＩ−１２８、ＭＭＩ−１２９、ＭＭＩ−１３５、ＭＭＩ−１３６、ＭＭＩ−１３７、ＭＭＩ−１３９のスルホン配位子の調製：
代表的な手順：
阻害剤ＭＭＩ−１３９：ＭＭＩ−１３８（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（１：１）（２ｍＬ）溶液に、ＮａＨＣＯ３（１１．６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＯｘｏｎｅ（登録商標）（カリウムパーオキシモノサルフェート）（２７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を加え、そして１２時間攪拌した。その反応物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、そしてＮａ２ＳＯ４で乾燥した。減圧下にて溶媒を蒸発すると、残渣が得られ、これを、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３中の４％ＭｅＯＨ）で精製して、阻害剤ＭＭＩ−１３９（６．８ｍｇ、６５％）を得た。
Figure 0004547152
 Ｌ．
Ｍ．他の出発物質の文献参照：
引用した文献で記述されたようにして、以下の出発物質を調製した。以下に引用されるこれらの文献の全ての教示内容は、本明細書中で参考として援用されている。
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 本発明の阻害剤を合成するのに必要な他の全ての断片は、市販されており、これらを、上記の適当な手順を使用して、カップリングした。
（動力学パラメーターの決定）
既知濃度の阻害剤を含有するＤＭＳＯのアリコートを、１．８ｍｌ ０．１Ｍ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０に希釈し、そしてＤＭＳＯを１０％（ｖ／ｖ）まで加え、そしてメマプシン（ｍｅｍａｐｓｉｎ）２（最終濃度８０ｎＭ）を加え、次いで２０分３７℃で平衡化した。化合物を、メマプシン１およびメマプシン２を、約１０ｎＭと約１０μＭとの間の阻害剤濃度で阻害する能力について評価した。阻害剤の存在下におけるタンパク質分解活性を、ＤＭＳＯに溶解した３００μＭの基質ＦＳ−２を２０μｌ加えることにより測定し、そして蛍光強度の増加を、以前に記載されたように測定した（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）。
メマプシン１およびメマプシン２に対するＫｉａｐｐ（見かけ上の）値を、以前に記載された手順（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，Ｊら．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｌｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００）、この教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用して決定した。Ｋｉａｐｐに対するＫｉ（基質濃度と独立している）の関係は、このアッセイにおける基質濃度、およびメマプシン１またはメマプシン２のいずれかによる基質の切断についてのＫｍの関数であり、以下の関係：Ｋｉａｐｐ＝Ｋｉ（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）による。
（結果および考察）
メマプシン１は、メマプシン２（本明細書中でＢＡＣＥ、ＡＳＰ−２、β−セクレターゼとも呼ばれる）に対して密接に相同なプロテアーゼである。メマプシン２は、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断を触媒して、β−アミロイド（Ａβ）ペプチド（本明細書中で、β−アミロイドタンパク質またはβ−アミロイドペプチドとも呼ばれる）を産生する。Ａβペプチドの蓄積は、アルツハイマー病に関連する。メマプシン１は、ＡＰＰのβ−セクレターゼ部位を加水分解するが、脳には有意には存在していない。さらに、メマプシン１活性が、アルツハイマー病と関連しているという直接的な証拠はない。８つのメマプシン１の下位部位（ｓｕｂｓｉｔｅ）の残基特異性は、以下：基質のＰ４位、Ｐ３位、Ｐ２位、Ｐ１位、Ｐ１’位、Ｐ２’位、Ｐ３’位、およびＰ４’位にあり、最も好ましい残基は、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＰｈｅおよびＴｒｐであるが；２番目に好ましい残基は、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＰｈｅである。他のあまり好ましくない残基もまた、基質のこれらの位置に受け入れられ得る。メマプシン１の残基優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、上記のように、ヒトメマプシン２の残基優先度と同様である。本出願人らの発明の一実施形態は、メマプシン１を超えるメマプシン２についての阻害剤の選択性を達成するための、阻害剤のＰ３におけるＮ末端ブロック基である。例えば、Ｐ３にジメチルピラゾール基を有する化合物ＭＭＩ−１３８は、メマプシン１と比較してメマプシン２に対して約６０倍低いＫｉ値を有する阻害剤を生じた（表１を参照のこと）。
（メマプシン１下位部位における側鎖優先度の決定）
ペプチド基質の８つの位置全てにおけるメマプシン１の相対的加水分解優先度を、図１に示す。複数の基質残基は、メマプシン１下位部位の各々に適合し得る。Ｐ側の側鎖は、概して、Ｐ’側における特異性よりも特異性に置いてよりストリンジェントである。Ｐ１は、これまでで最もストリンジェントな位置である。Ｐｈｅ、ＬｅｕおよびＴｙｒは、Ｐ１において最も効果的なアミノ酸残基であることが見いだされている。他の全ての位置は、より多くの残基を受け入れ得る（図１）。最も好ましい残基を表４にまとめる。
Ｆａｒｚａｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ９７：９７１２−９７１７（２０００）、この教示は、本明細書にその全体が参考として援用される）は、メマプシン１が、配列中の２つの部位（配列ＫＬＶＦＦＡＥＤ（配列番号４２）中のｐｈｅ−ｐｈｅ間およびｐｈｅ−ａｌａ間）において優先的にＡＰＰを加水分解すると報告した。本明細書中に記載される特異性データに基づいて、いずれかの切断部位は、Ｐ１に最も好ましい残基Ｐｈｅを有し、そして中程度または高く格付けされる残基をＰ２、Ｐ１’、Ｐ２’およびＰ３’に有する。Ｐ２、Ｐ４およびＰ４’残基のうちの１つは、明らかに不利である（図１）。これらの観察は、メマプシン１基質が、いくつかの不利な残基を有するが、なおメマプシン１の基質であり得ることを示唆する。
コンビナトリアル阻害剤ライブラリーに結合するメマプシン１のスクリーニングは、約３０個の濃く染色されたビーズを生じた。最も濃いもののうちの１４の配列は、その基質の４つの無作為化された位置のうちの３つにおいてコンセンサス残基を生じた：Ｐ３、Ｌｅｕ＞Ｉｌｅ；Ｐ２、Ａｓｐ＞Ａｓｎ／Ｇｌｕ；Ｐ２’Ｖａｌ（表５）。側鎖Ｐ３’は、明確なコンセンサスを生じなかった。ＬｅｕおよびＴｒｐおよびＧｌｕ（これらは、１回よりおおく出現する）もまた、基質加水分解において好ましい（図１）。しかし、基質に不利な他の残基もまた存在する。阻害剤ライブラリーにおける側鎖Ｐ３’におけるコンセンサスの欠如は、基質動力学的結果（明らかにＧｌｕおよびＧｌｎが有利）において異なる（表４）。この不一致は、Ｐ３’残基の性質が、阻害剤結合に対してよりも効率的な基質加水分解に対してより重要であることを示す。
（メマプシン１およびメマプシン２の下位部位優先度における比較）
上で考察したように、メマプシン１の全体の基質特異性は、メマプシン２の基質特異性と類似している。表４に示されるように、上部側鎖の優先度は、同一（Ｐ４について）であるか、または優先度の順番においてのみ異なる（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ２’について）かのいずれかである。これら２種のメマプシンは、少なくとも特定のＰ３’位およびＰ４’位における残基優先度において異なる。位置Ｐ３、Ｐ２およびＰ２’におけるコンセンサス阻害剤残基の密接な類似性はまた、阻害剤ライブラリーから見られた（表７）。メマプシン下位部位Ｓ３’におけるＧｌｕおよびＧｌｎの優先度と対照的に、メマプシン１は、この下位部位における優先度を示さなかった。Ｐ３’側鎖は、メマプシン１のＳ３’部位とわずかな相互作用をし得る。Ｐ３’およびＰ４’の両方があまり結合しないことは、メマプシン２への阻害剤ＯＭ９９−２の結合について観察された。
（メマプシン２阻害剤に対する選択性の設計における推測）
β−セクレターゼ（本明細書中でメマプシン２またはＡｓｐ２とも呼ばれる）は、アルツハイマー病に関与する。なぜなら、β−セクレターゼは、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のβ−セクレターゼ部位を切断して、脳に局在化するβ−アミロイド（Ａβ）タンパク質を生成するからである。メマプシン１は、メマプシン２に比べて弱いβ−セクレターゼ酵素であり、そして脳には局在化しない。メマプシン１およびメマプシン２の、組織分布およびβ−セクレターゼ活性における差異は、これらが異なる生理学的機能を有することを示す。
本発明のメマプシン２阻害剤中のＰ３位におけるキャップ基（本明細書中で「ブロック基」とも呼ばれる）を評価して、メマプシン２阻害の選択性を作成した。小さいが強力なメマプシン２阻害剤は、上記のように、Ｐ４の除去およびキャップ基によりＰ３残基の置換により達成され得る。新規な阻害剤ＭＭＩ−１３８（本明細書中で「ＧＴ−１１３８」とも呼ばれる）（これは、Ｎ末端においてＢｏｃではなくジメチルピラゾールであることにより阻害剤化合物ＭＭＩ−０１７と異なる）は、メマプシン１についてのＫｉよりも約６０倍低いメマプシン２についてのＫｉを生じた（表９、表中の空白は、その値を決定しなかったことを示す）。Ｐ３ピラゾールキャップ基を含む他の阻害剤は、メマプシン２に対して類似の選択性を示し（表９、％Ｉｎｈ（Ｍ１／Ｍ２））、一方、Ｐ３位に標準的なアミノ酸側鎖を有する化合物は類似の選択性を示さなかった（表９）。
図３に示されるデータは、表９に示されるＫｉの見かけ上のデータから算出した。阻害剤ＧＴ−１０１７（本明細書中で、０．１７およびＭＭＩ−０１７とも称する）、ＧＴ−１０２６（本明細書中で、ＭＭＩ−０２６とも称する）およびＯＭ００−３は、Ｐ３位に天然アミノ酸を有するが、ＧＴ−１１３８（本明細書中で、ＭＭＩ−１３８とも称する）は、Ｐ３カルボニルに３，５−ジメチルフラゾリル誘導体を有する。図３に示されるように、阻害剤ＭＭＩ−１３８は、メマプシン２と比較して、メマプシン１の約６０倍の感度を生じた。
血液脳関門への効果的な浸透のために、メマプシン２阻害剤薬は、サイズが小さいべきである。メマプシン１およびメマプシン２の阻害剤特異性における類似性の近さの観点から、Ｐ３ブロック基およびメマプシン２阻害剤の結合および選択性を増強する他のブロック基を用いて、所望の特性（例えば、血液脳関門を浸透するための適切な大きさ、最小のペプチド結合、最大の疎水性）を有する選択的メマプシン２阻害剤を設計した。阻害剤の合成は上述されており、そしてＫｉ、Ｋｉａａｐおよび相対的選択的阻害を、表１および９に列挙する。
（表７：メマプシン１および２の下位部位における優先アミノ酸残基）
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 ＊アミノ酸残基は、１文字コードで示す。
＊メマプシン２（配列番号８（図１１）のアミノ酸残基４３〜４５６）および配列番号８（図１１）のアミノ酸残基４５〜４５６）
（表８：コンビナトリアル阻害剤ライブラリーから選択されたメマプシン１に強く結合するビーズからのＰ３、Ｐ２、Ｐ２’、およびＰ３’位で観察された残基）
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 ａライブラリーテンプレート：Ｇｌｙ−Ｐ３−Ｐ２−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−樹脂（配列番号２７）。アスタリスク「＊」はヒドロキシエチレンを示す。
ｂ決定不可能
ｃネガティブコントロールは、メマプシン１結合能を有さない無作為に選択されたビーズである。
（表９：メマプシン２およびメマプシン１の阻害剤の選択性）
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 ａヘテロアラルキルまたはヘテロアラルコキシ誘導体は、Ｐ３カルボニルまたは標準Ｐ３アミノ酸側鎖に結合した。
ｂ１以下の値は、メマプシン１よりもメマプシン２に対する方が大きい阻害を示す。
ｃより大きな値は、メマプシン１に対するよりもメマプシン２に対する親和性が大きい阻害剤を示す。
ｄタンパク質分解活性の阻害のパーセンテージは、酵素濃度が化合物濃度に等しい条件下で測定した。
ｅ「Ｍｅｐ２」および「Ｍ２」はメマプシン２のことである。
ｆ「Ｍｅｐ１」および「Ｍ１」はメマプシン１のことである。
（実施例２：メマプシン２タンパク質およびメマプシン２阻害剤の結晶化）
アルツハイマー病（ＡＤ）のホールマークは、アミロイドβペプチド（本明細書中では、アミロイドタンパク質とも称する）の蓄積に起因する脳の進行性改変である（Ｓｅｌｋｏｅ，Ｄ．Ｊ．，ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｖ ８１：７４１−６６（２００１））。β−アミロイドタンパク質産生の第１段階は、β−セクレターゼとして公知のプロテアーゼによる、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる膜タンパク質の切断であり、β−セクレターゼは、メマプシン２（またはＢＡＣＥもしくはＡＳＰ−２）と命名された、膜アンカーアスパラギン酸プロテーゼとして同定されている。第１世代の阻害剤ＯＭ９９−２（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２−３５２３（２０００））は、１ｎＭ付近のＫｉを有する８残基の遷移状態のアナログであるＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦ（配列番号２０）（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓｙ ３９：１２４５０−６（２０００））である基質情報（Ｌｉｎ，Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１４５６−６０（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）に基づいて設計された。ＯＭ９９−２に結合したメマプシン２の触媒単位の１．９Å結晶構造（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０：１５０−３（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）は、プロテアーゼのコンホメーションおよびその活性部位の中心的な特徴がペプシンファミリーのアスパラギン酸プロテアーゼのそれらであることを明らかにした。ＯＭ９９−２の全８残基は、メマプシン２の基質結合裂に収容されていた。ＯＭ９９−２のＰ４からＰ２’の残基の結合のための６つのメマプシン下位部位の位置および構造が、その構造において明確に定義された（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）。阻害剤のこの部分から、Ｐ１とＰ１’との間の遷移状態アイソスター付近に位置する活性部位アスパルチルを有する本質的に拡張されたコンホメーションが想定された。思いがけず、この阻害剤の骨格は、Ｐ２’Ａｌａで曲がり、この拡張されたコンホメーションから外れており、欠点となっていた。ほとんど規定されていない電子密度から、Ｐ３’ＧｌｕおよびＰ４’Ｐｈｅの側鎖は分子表面に位置し、プロテアーゼとの相互作用をほとんど有さないようであった。これらの観察は、メマプシン２におけるＳ３’およびＳ４’の下位部位は十分に形成されず、おそらく、基質および阻害剤との相互作用が乏しいことに起因していたという考えを想起させた（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）。
メマプシン２の詳細な下位部位の優先度は、上述のように決定され、そしてコンビナトリアル阻害剤ライブラリーから選択された優先結合残基を用いることによって、第２世代の阻害剤ＯＭ００−３、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ＊Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号２３）を設計し、そして以下に記載されるように、０．３ｎＭのＫｉを有することが見出された。ＯＭ００−３との複合体におけるメマプシン２の触媒単位の構造が、本明細書中に記載されている。この新規の構造は、下位部位Ｓ３’およびＳ４’の位置および構造を規定し、下位部位Ｓ４を再規定し、そしてそれらの機能の新規の洞察を提供する。新規の阻害剤／酵素の相互作用もまた、他の下位部位において観察された。
（タンパク質結晶を生成する方法および基質の結晶化）
プロメマプシン２−Ｔ１（配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６（図１１））を、封入体としてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてその後リフォールディングさせ、そして以前に記載されたように精製した（Ｌｉｎ，Ｘ．ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１４５６−６０（２０００）；Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−６（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）。配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６（図１１）の結晶化；ＯＭ９９−２と複合体化した配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６（図１１）は、確立された手順を若干改良して実施した（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）。メマプシン２／ＯＭ９９−２については、その結晶を、ハンギングドロップ蒸気拡散法（ウェル対サンプル溶液の容積比１：１）を用いて、２０℃、０．１Ｍ Ｎａ−カコジレートで緩衝化された２５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）８０００、０．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ６．５において成長させた。ＯＭ００−３については、２２．５％ ＰＥＧ８０００をｐＨ６．２において使用した。斜方晶を、これらの条件下で取得した。
（データの収集および処理）
１００°Ｋでのデータ収集のために、２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するウェル溶液に移すことによって結晶をまず凍結保護し、次いで液体窒素によりすばやく凍結させた。回折データを、オズミックフォーカスミラーを有するＭｓｃ−Ｒｉｇａｋｕ ＲＵ−３００ Ｘ線ジェネレーターに取り付けられたＭａｒ３４５イメージプレート上で収集した。これらのデータを、ＨＫＬプログラムパッケージ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．ら，Ｗ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｙｎｏｌ．２７６：３０７−３２６（１９９７）、この教示は、その全体が本明細書に参考として援用される）を用いて処理した。統計を、表１０に示す。
（構造決定および精密化）
分子置換解を、以前に決定したメマプシン２構造（識別子コード：ＰＤＢ ＩＤ１ＦＫＮ）を検索モデルとして使用して、プログラムＡｍｏＲｅ（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５７：１３６７−７２（２００１）、この教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を用いて、両方の結晶について得た。並進（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）検索により、２つの結晶形が、結晶学的に非対称な単位あたり２つのメマプシン２／阻害剤複合体を含む空間群Ｐ２１２１２１（表７）において同形であることを確認した。精密化を、グラフィックプログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ４７：１１０−９（１９９１）、この教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用する手動によるモデルフィッティングの反復サイクルにより完了し、そしてＣＮＳ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．ら，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４：９０５−２１（１９９８）、その教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）を使用してモデル精密化を行った。水分子を、３σレベルで等高線を引いた｜Ｆｏ｜−｜Ｆｃ｜マップにおいて同定された場合、精密化の後の段階で加えた。１０％の回折データを、Ｒｆｒｅｅ値をモニターするためのプロセスの最初に精密化から外した。結晶学的非対称単位中の２つのメマプシン２／阻害剤複合体が、本質的に同一であることが見いだされた。本明細書中に報告される構造の座標を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（アクセッションコード１Ｍ４Ｈ）に保管した。
（動力学的測定）
Ｐ３’およびＰ４’における残基優先度の決定のための相対的ｋｃａｔ／Ｋｍの測定を、上記のように行った。２つのテンプレート基質配列（ＷＨＤＲＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号２８）およびＷＨＤＲＥＶＮＬＡＶＥＦ（配列番号４４））を使用した。前者は、Ｐ３’Ａｌａを有し、そして後者は、Ｐ３’Ｖａｌを有する。４つのＮ末端残基（ＷＨＤＲ（配列番号２９））を、質量分光法を使用する分析を容易にするために付加した。各テンプレートについて、Ｐ３’またはＰ４’のいずれかにおいてそれぞれ、合計１１の代表的残基（一文字コードで、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹ）を含む、各２つのペプチド混合物を設計し、合成した。これらの混合物における各ペプチドのメマプシン２加水分解についての初期速度を、上記のようにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析機で決定した。内部標準および相対的ｋｃａｔ／Ｋｍ値の計算もまた上記のとおりであった。
（結果および考察）
メマプシン２に結合したＯＭ９９−２の結晶構造は、単斜晶系空間群Ｐ２１で以前に記載されている（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、その教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）。この研究において、ＯＭ９９−２複合体およびＯＭＯＯ−３／メマプシン２の構造が解かれ、そして同じ空間群Ｐ２１２１２１（表１０）で比較された。
ＯＭ００−３を、メマプシン２に結合したＯＭ９９−２の結晶構造および上記のようなコンビナトリアル阻害剤ライブラリーへのメマプシン２の結合に基づいて設計した。３つのアミノ酸残基が、ＯＭ９９−２に対してＯＭ００−３において異なる：Ｐ３ Ｌｅｕに対してＶａｌ 、Ｐ２ Ａｓｐに対してＡｓｎ、およびＰ２’ Ｖａｌに対してＡｌａ。これらの改変は、上で示されるように、Ｋｉを５．２倍改善した。ＯＭＯＯ−３／メマプシン２複合体の結晶構造は、阻害剤および酵素の両方についてコンホメーション変化を示す。阻害剤における最も有意な変化は、Ｐ４ Ｇｌｕにおいて観察され得る。
ＯＭ９９−構造において、Ｐ４ Ｇｌｕ側鎖カルボキシレートは、Ｐ２ Ａｓｎ側鎖アミド窒素と強い水素結合を形成する（結合距離２．９Å）。このコンホメーションは、阻害剤のＮ末端を安定化するが、Ｐ４側鎖は、ほとんど酵素と接触しない。ＯＭ００−３におけるＡｓｎからＡｓｐへのＰ２の変化は、Ｐ２側鎖とＰ４側鎖との間に静電反発を導入し、そしてそれらの間の水素結合を排除する。同じ理由で、Ｐ４ Ｇｌｕ主鎖の約１５２度の捻れの回転が存在し、これは、Ｐ４側鎖を新しい結合ポケットには位置する。この位置において、Ｐ４ Ｇｌｕのカルボキシレート酸素原子は、Ａｒｇ３０７（配列番号９（図１２））側鎖のグアニジニウム窒素原子といくつかのイオン結合を形成する。（本実施例において言及される、アミノ酸残基の位置は、配列番号９（図１２）を参照する）。
Ｐ３ Ｌｅｕ、Ｐ１ Ｌｅｕ、Ｐ２’Ｖａｌ、およびＰ４’ Ｐｈｅと接触する（４Å未満の距離）メマプシン２の残基を、太字の枠付き文字で示す。塩結合（イオン対）は、メマプシン２へのＰ４ Ｇｌｕの結合エネルギー寄与を増加させるようであるが；Ｐ４は、それらの結晶学的Ｂ因子により示されるようにＯＭ９９−２の可動性と比較して増加した可動性を有し、一方、Ｐ３からＰ２’への２つの阻害剤間の平均Ｂ因子差異は有意ではない（図１３）。この大きな差は、おそらく、Ｐ２側鎖への水素結合の損失に起因する。このΨ回転の結果として、Ｐ４の骨格窒素は、ＯＭ９９−２構造において観察されたように、Ｇｌｙ１１（配列番号９（図１２））の代わりに、Ｔｈｒ２３２（配列番号９（図１２））に水素結合する。
ＯＭ９９−２を、ＡＰＰのＳｗｅｄｉｓｈ Ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲ；配列番号１１）（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４４：２８６５−８（２００１）、その教示は本明細書にその全体が参考として援用される）に基づいて設計した。メマプシン２とのその複合体において、Ｐ２ ＡｓｎおよびＡｒｇ２３５（配列番号９（図１２））の側鎖は、水素結合を形成し、これが、アルツハイマー病の早期発症をもたらす（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、その教示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。ＯＭ００−３構造において、Ｐ２側鎖は、Ａｓｐに変更され、そしてＡｒｇ２３５側鎖は、新しいコンホメーションに適合し、Ｐ２ Ａｓｐ側への２つの塩結合を形成する。これらの新しいイオン結合は、阻害剤結合にさらに寄与する。
Ｐ３におけるＶａｌからＬｅｕへの変更の影響はわずかであり、疎水性相互作用の付加および再配置を含む。Ｐ３におけるＬｅｕのより長い側鎖は、Ｐ１ Ｌｅｕの側鎖とのｖａｎ でｒ Ｗａａｌｓ接触を可能にする。Ｐ１側鎖とＰ３側鎖との間の相互作用は、これらを、酵素の対応する疎水性結合ポケット中によりよく適合させる。コンホメーション変化は、酵素上でＬｅｕ３０において観察される。
ＯＭ９９−２構造において、Ｌｅｕ３０（配列番号９（図１２））側鎖は、阻害剤と接触しないが、Ｔｒｐ１１５（配列番号９（図１２））側鎖ならびにＧｌｕ１２（配列番号９（図１２））およびＧｌｙ１３（配列番号９（図１２））の主鎖原子と広範囲の相互作用を有する。しかし、ＯＭ００−３構造において、Ｐ１ Ｌｅｕの阻害剤側鎖はＬｅｕ３０（配列番号９（図１２））の側鎖の近傍まで伸長している。この場合、Ｌｅｕ３０側鎖は、χ２捻れ角において６０度回転する。この新しい位置において、Ｌｅｕ３０側鎖は、Ｔｒｐ１１５（配列番号９（図１２））との減少した相互作用を有するが、阻害剤のＰ３ ＬｅｕおよびＰ１ Ｌｅｕの側鎖ならびにＧｌｙ１３（配列番号９（図１２））およびＴｙｒ１４（配列番号９（図１２））の主鎖原子とｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触する。
メマプシン２の基質結合部位の構造的柔軟性（例えば、ＯＭ９９−２およびＯＭ００−３への結合の際の、Ａｒｇ２３５（配列番号９（図１２））およびＬｅｕ３０（配列番号９（図１２））の側鎖位置のバリエーション）を観察した。この構造的柔軟性は、酵素と基質および／または阻害剤との間のコンホメーション補完性を改善することにより、広範囲の基質および／または阻害剤と酵素を結合させる。
ＯＭ００−３からＯＭ９９−２への第３の残基変化は、Ｐ２’においてＡｌａからＶａｌである。Ｐ２’は、病原性基質ＡＰＰにおいてＡｌａであるが、Ｖａｌは、かなりよい選択である。結晶構造は、エネルギー的な利得が、この疎水性ポケットにおいて加えられたｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ 相互作用から生じることを示す。より大きなＶａｌ側鎖は、酵素とのｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ接触を、より小さなＡｌａ側鎖よりも５つ多く有する（表１１）。Ｐ３、Ｐ１およびＰ２’における構造的変化に起因して、ＯＭ９９−２よりもＯＭ００−３において１５個多いｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ 酵素／阻害剤接触が存在する（原子間距離＜４Å）。
（表１１：メマプシン２と化合物ＯＭ００−３との複合体の結晶構造から決定されたそれらの間の相互作用）
Figure 0004547152
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 注釈：
ａ残基は、（配列番号９（図１２）に従って）メマプシン２のアミノ酸残基およびその数を示し、そしてメマプシン２の側鎖（ｓｃ）原子であるか骨格（ｂｂ）原子であるかについては、相互作用に記載する。残基はサブサイトによって分類する。化合物ＯＭ００−３のアミノ酸は、それが相互作用しているサブサイトの次に太字で示す。
ｂ残基は、（配列番号８（図１１）に従って）メマプシン２のアミノ酸残基およびその数を記載する。
ｃ相互作用の型：Ｐｈｏｂｉｃ，疎水性またはファンデルワールス接触（ｃｏｎｔａｃｔ）；Ｈｂｏｎｄ，水素結合；ｉｏｎｉｃ，反対の電荷のイオン化可能な官能基間でのイオン対。
ｄ化合物ＯＭ００−３の相互作用基は、側鎖原子（ｓｃ）または骨格原子（ｂｂ）のいずれかである。
ＧｌｕおよびＰｈｅは、阻害剤の両方についてのＰ３’およびＰ４’を含む。空間群Ｐ２１において得られた結果とは違って（Ｈｏｎｇ，Ｌ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、この教示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）、Ｐ３’およびＰ４’の位置は、空間群Ｐ２１２１２１における電子密度によってより良好に規定される。しかし、図１３が、ＯＭ−００３構造におけるＰ３’およびＰ４’残基についての平均Ｂ因子は、ＯＭ９９−２の平均Ｂ因子よりもかなり低いことを示す（その値は、それぞれ、前者については２７．１および３７．６であり、後者については３９．２および４７．０である）。阻害剤と酵素との立体配座はこれらの部分でほぼ同じなので、これらの２つのＣ末端残基でのＯＭ００−３の改良された構造安定性（より低い平均Ｂ因子によって証明される）は、Ｐ３’およびＰ４’でファンデルワールス接触からなる阻害剤のエネルギー性結合に有益である。ＯＭ９９−２とＯＭ００−３との間のＰ３’およびＰ４’における立体配座的および化学的な類似性を考慮すると、Ｂ因子における大きな差異は、Ｐ２’でのＡｌａからＶａｌへの変化によって引き起こされることが考えられる。議論されるように、Ｖａｌは、この位置での阻害剤と酵素との間で適合を改良する。Ｐ２’で増強された結合は、相対的に移動可能なＰ３’およびＰ４’を安定化させ得る。
メマプシン２／ＯＭ９９−２の結晶構造は、酵素のＳ５基質結合部位の構造を示す。ＯＭ９９−２位置のＮ末端窒素は、メマプシン２上の親水性オープニング（ｏｐｅｎｉｎｇ）（Ｌｙｓ９、Ｓｅｒ１０、Ｇｌｙ１１、Ｇｌｎ１２、Ｐｒｏ１６０、およびＰｒｏ３０８（配列番号９（図１２）を含む）を示し、そしてＳ４を越えて基質結合ポケットまたは阻害剤結合ポケットとして潜在的に使用され得る。ＯＭ００−３のＮ末端窒素は、酵素の内部を示し、そしてタンパク質基質の伸長したＮ末端位置をおそらく模倣しない。対照的に、両方の阻害剤のＣ末端カルボシキ基の方向は、次の残基がこの酵素から表面から離れて示され、そしてさらなる結合部位がＳ４’を越えて見出されないことを示す。
同じ空間群において、メマプシン２と化合物（ＯＭ００−３）との結晶構造を、メマプシン２と阻害剤化合物（ＯＭ９９−２）との結晶構造と比較した。新規の酵素／阻害剤相互作用は、いくつかの結合ポケットにおいて同定されている。これらは、電気的およびファンデルワールス接触の両方を含む。潜在的なＳ４を越えた基質結合部位もまた、同定した。
阻害剤ＯＭ００−３（ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ；配列番号２３，Ｋ；＝０．３ｎＭ，＊は、ヒドロキシエチレン遷移状態アイソスターを示す）に結合したヒトメマプシン２の触媒ドメインの構造を、２．１Å分解能で測定した。Ｓ３’およびＳ４’サブサイトの位置が構造内に特有に規定されるが、これらのサブサイトは阻害剤ＯＭ９９−２（ＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦ；配列番号２０ Ｋｉ＝１ｎＭ）との複合体におけるメマプシン２の以前の構造においては同定されなかった。Ｐ２およびＰ４側鎖についての異なる結合形式もまた同定された。構造的および動態的なデータは、ＯＭ９９−２におけるＰ２’アラニンのＯＭ００−３におけるバリンでの置換が、Ｐ３’およびＰ４’の結合を安定化することを実証する。
（表１０）
Figure 0004547152
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 （構造および阻害剤結合）
空間群Ｐ２１２１２１におけるＯＭ００−３／メマプシン２複合体の構造を、分子置換法を用いて２．１Åにて決定した。酵素の構造、ＯＭ００−３のＰ１／Ｐ１’（Ｌｅｕ＊Ａｌａ）領域とメマプシン２の基質結合の裂目との相互作用、およびＰ３からＰ２’までの阻害剤の骨格立体配座は、ＯＭ９９−２／メマプシン２複合体の構造についてと本質的に同じである。しかし、現行の構造は、ＯＭ９９−２構造と比較した場合、Ｓ４、Ｓ３およびＳ２のサブサイト内で異なる側鎖配置を示す（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）、これらの教示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。さらに、Ｓ３’およびＳ４’の結合ポケットの位置および性質が規定される。
（Ｓ４、Ｓ３およびＳ２のサブサイト）
現行の構造における新規Ｓ４ポケットは、メマプシン２残基（Ｇｌｙ１１、Ｇｌｎ７３、Ｔｈｒ２３２、Ａｒｇ３０７およびＬｙｓ３２１を含む。このＡｒｇ３０７およびＬｙｓ３２１（配列番号９（図１２））は、阻害剤Ｐ４ Ｇｌｕのカルボキシル化された酸素原子にいくつかのイオン結合を形成する。以前のＯＭ９９−２／メマプシン２構造において、Ｐ４ Ｇｌｕの主鎖のねじれ角（ｔｏｒｓｉｏｎ ａｎｇｌｅ）（Ψ）は、現行のものとは１５２°異なる。従って、ＯＭ９９−２構造におけるＰ４ ＧｌｕとＰ２ Ａｓｎの側鎖との間には水素結合が存在し、このような構造におけるＰ４ Ｇｌｕ側鎖は、プロテアーゼとほとんど相互作用しない。しかし、ＯＭ００−３構造において、Ｐ２はＡｓｐである。従って、Ｐ４ Ｇｌｕとの相互作用は望ましくない。Ｐ４Ｇｌｕの平均Ｂ因子は、Ｐ３〜Ｐ２’（１７〜２０Å２）よりも幾分高く（４２Å２）、プロテアーゼ残基との多重相互作用は、新しく観察されたＳ４ポケットが、阻害剤結合に有意に寄与することが示唆される。
ＯＭ００−３構造において、プロテアーゼのＳ３のＬｅｕ３０（配列番号９（図１２））は、Ｐ３およびＰ１で阻害剤のロイシンと接触した。これらの２つの側鎖はまた、互いに接触し、阻害剤の立体配座のさらなる安定性に寄与する。これらの生成的な相互作用は、Ｐ３がＬｅｕではなくＶａｌであり、かつχ２周りでの６０度の回転の結果、Ｌｅｕ３０の立体配座が異なるＯＭ９９−２構造において、存在しない。
Ｓ２ポケットにおいて、ＯＭ００−３のＰ２ Ａｓｐは、Ａｒｇ２３５（配列番号９（図１２））側鎖への２つのイオン架橋（ｉｏｎｉｃ ｂｒｉｄｇｅ）を形成する。Ａｒｇ２３５（配列番号９（図１２））の立体配座は、ＯＭ９９−２構造の立体配座（ここで、Ｐ２残基はＡｓｎである）とは異なる。Ｓ２ポケット内での順応性は、Ｐ２においてＡｓｐまたはＡｓｎのいずれかとの相互作用を可能にし、そしてこれらの２つの残基が最も好ましい基質であり、かつこのサブサイトについての阻害剤残基であるというこの観察と一致する（表７および図２）。
（Ｓ３’およびＳ４’サブサイト）
ＯＭ９９−２／メマプシン２構造とは対照的に、Ｐ３’およびＰ４’側鎖の立体配座は、ＯＭ００−３／メマプシン２構造における電子密度によって十分に規定される。ＯＭ００−３のＰ３’およびＰ４’での骨格は、Ｐ３’骨格のカルボニルからＡｒｇ１２８までの水素結合によって安定化された伸びた立体配座を想定する（配列番号９（図１２））。Ｐ４’骨格の窒素からＴｙｒ１９８までの非常に弱い水素結合は、この結合にわずかに寄与し得る。Ｓ３’およびＳ４’サブサイトは、いくつかの直接的なファンデルワールス相互作用（＜４．５Å（表１１））によって規定される。阻害剤のＣ末端でのそれらの配置によって、Ｐ３’およびＰ４’残基の両方は、Ｐ３からＰ２’までの領域における残基よりも幾分高い平均Ｂ因子の値（それぞれ、２８Å２、３７Å２）を有する。より容易に処理が可能な電子密度の存在において、これらのより高い温度因子は、サブサイトＳ３’およびＳ４’に対する相互作用の構造情報および分析の信頼性を損ないはしない。
（Ｐ３’およびＰ４’の結合に対するＰ２’の寄与）
阻害剤ＯＭ９９−２およびＯＭ００−３は、同一のＰ３’残基およびＰ４’残基を有する。それゆえに、Ｐ３’およびＰ４’が、後者の構造についてより良好に規定されることは予想されなかった。動力的研究により、他のサブサイトと比較して、Ｐ３’およびＰ４’に結合するサブサイトが、かなり広い範囲のアミノ酸選択性を有することが示された（図２）。ＯＭ００−３中のＰ２’Ｖａｌは、ＯＭ９９−２中のＡｌａより、酵素との幾つかより多い接触を有するので（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）（これらの教示は、その全体が本明細書で参考として援用される））、Ｐ２’Ｖａｌのより良好な結合は、ＯＭ００−３中のＰ３’残基およびＰ４’残基の安定性に寄与し得ることが理由付けられた。Ｐ２’Ｖａｌは、Ｐ３’位置およびＰ４’位置においてそれぞれＧｌｕおよびＰｈｅに向かって残基選択性をシフトさせ得る。従って、２つのセットの基質（ＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号１５）およびＥＶＮＬＡＶＥＦ（配列番号４５））（これらは、Ｐ２’におけるＡｌａまたはＶａｌのみ違う）についてのＰ３’およびＰ４’における相対残基優先度を、測定した。
１０個の代表的な残基を、ネイティブな残基に加えてＰ３’およびＰ４’の各位置から選んだ。単一の混合物におけるこれらの１１個の基質の相対的なｋｃａｔ／Ｋｍ値を、上記のような質量分析法を用いて、それらの相対的な開始加水分解速度によって決定した。これらの結果は、２つの基質セット（Ｐ２’ ＡｌａおよびＰ２’ Ｖａｌを含む）に関して、Ｐ３’側鎖（図１５Ａ）およびＰ４’側鎖（図１５Ｂ）に結合したサブサイトでの残基優先度における差異が、非常に小さいことを示す。
アミノ酸残基優先度を識別するために使用したテンプレート配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号１５）（図１５Ａおよび１５Ｂ）は、Ｐ４〜Ｐ４’を含んだ。Ｐ３’でのグルタミン酸（Ｅ）およびＰ４’でのフェニルアラニン（Ｆ）（これらは、１．ｋｃａｔ／Ｋｍ値を入れる）を含む基質と比較した相対的ｋｃａｔ／Ｋｍを示すデータを、両方の基質混合物のＰ２’位置でアラニンおよびＰ２’位置でバリンを含む基質について正規化した。
本発明の阻害剤化合物とメマプシン２との間の多くの相互作用が注目される。表１１に示されるように、Ｐ３側鎖とＰ１側鎖とＰ２’側鎖との間の疎水性の接触が存在する。さらに、Ｐ４側鎖およびＰ２側鎖由来の塩の架橋および水素結合、ならびに阻害剤のＰ３’骨格およびＰ４’骨格の塩の架橋および水素結合もまた、観察される。
Ｐ２’がＶａｌである場合、それぞれＰ３’側鎖におけるＧｌｕへの優先度およびＰ４’側鎖におけるＰｈｅへの優先度は、不変である；しかし、Ｐ２’においてＶａｌを有するペプチド基質は、Ｐ２’においてＡｌａを有するそれらの対応物より、平均で約３０％高いｋｃａｔ／Ｋｍ値を有する。どの動力学的パラメーターがこの差異に寄与するかを決定するために、Ｐ２’のみがＶａｌで異なるかまたはＡｌａで異なる、２つの基質に対する個々のｋｃａｔ値およびＫｍ値を測定した。基質ＥＶＮＬＡＶＥＦＷＨＤＲ（配列番号３０）は、８３±８．９ｍＭのＫｍおよび１，００７±１０６ｓ−１のｋｃａｔ値を生じ（ｎ＝３）、一方、基質ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ（配列番号３１）は、１２５±１１ｍＭのＫｍおよび２７４±２３ｓ−１のｋｃａｔ値を生じた（ｎ＝２）。Ｐ２’Ｖａｌ基質とＰ２’Ａｌａ基質との間の動力学的パラメーターにおける差異は、Ｋｍ（約１．５倍）よりｋｃａｔ（約４倍）において、ずっと大きい。従って、Ｐ２’Ａｌａと比較して、Ｐ２’Ｖａｌは、主に、Ｐ３’残基およびＰ４’残基の遷移状態の結合を改善するが、それら残基の特異性を変更しない。
（阻害剤設計における新規基質）
阻害剤ＯＭ９９−３と複合体化したメマプシン２触媒ドメインの一次構造（Ｈｏｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−３（２０００）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））は、より小さくかつ強力なメマプシン２阻害剤（表１）の、構造ベースの設計に有用であることが示された。ここに示された新規構造は、阻害剤設計に対して、改善された多くの能力（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）を提供する。臨床治療能力を有するメマプシン２阻害剤は、強力であり、選択的であり、かつ血液脳関門を透過するほど十分小さくあるべきである。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤薬物のインジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ）は、６１４Ｄａであり、血液脳関門を横断し得ることが公知である（Ｍａｒｔｉｎら、Ａｉｄｓ １３：１２２７−３２（１９９９）（この教示は、その全体が本明細書中で参考として援用される））。同程度のサイズのメマプシン２阻害剤は、約５つのサブサイト（ｓｕｂ−ｓｉｔｅ）に連続的に結合する。Ｐ３’サブサイトおよびＰ４’サブサイトで結合を誘起しない低ｎＭ範囲でＫｉを有する阻害剤が、設計され得る（表１）。Ｐ４およびＰ２での新規の結合形態は、このタイプの阻害剤の設計のために利用され得る。上記のＳ３’およびＳ４’の新規のサブサイト構造は、Ｐ３’残基およびＰ４’残基を有するがＰ４残基もＰ３残基も有さない阻害剤の設計に組み込まれ得る。このような設計は、Ｐ２’におけるＶａｌのような、強力な結合性側鎖を有することが予測される。
（実施例３：メマプシン２と複合体化した化合物ＭＭＩ−１３８の結晶構造）
化合物ＭＭＩ−１３８は、メマプシン２をメマプシン１より選択的に阻害し、前者に対するＫｉ値が、後者に対するＫｉ値のより６０倍低いことを証拠とする。さらに、式ＩＩのＲ１基のようなピラゾールを含む官能基を有する他の化合物も、同様に、相対的Ｖｉ／Ｖｏ測定値に基づく選択性を実証する（表９）。阻害剤の選択性に寄与するＭＭＩ−１３８の構造特性を決定するために、ＭＭＩ−１３８と複合体となったメマプシン２の結晶構造を決定した。この構造は、ピラゾール基がＳ３サブサイトで水素結合を形成して酵素に結合したことを明らかにする。メマプシン２と、ＯＭ９９−２（Ｈｏｎｇ，Ｌ．Ｔｕｒｎｅｒ．Ｒ．Ｔ．三世，Ｋｏｅｌｓｃｈ，Ｇ．，Ｓｈｉｎ，Ｄ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．，「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｍａｐｓｉｎ ２（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＯＭ００−３」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１０９６３−１０９６７（２００２）；およびＨｏｎｇ，Ｌ．，Ｋｏｅｌｓｈ，Ｇ．，Ｌｉｎ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｓ．，Ｔｅｒｚｙａｎ，Ｓ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．Ｃ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｍｅｍａｐｓｉｎ ２（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５０−１５３（２０００））またはＯＭ００−３（Ｈｏｎｇ，Ｌ．Ｔｕｒｎｅｒ．Ｒ．Ｔ．三世，Ｋｏｅｌｓｃｈ，Ｇ．，Ｓｈｉｎ，Ｄ．，Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．，「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｍａｐｓｉｎ ２（β−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＯＭ００−３」，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１０９６３−１０９６７（２００２））のいずれかとの間の複合体の結晶構造において、メマプシン２中のペプチド結合を、その配向に対して反転させた（ｆｌｉｐ）。ピラゾール結合領域近傍におけるメマプシン１構造のモデル化は、このような配向がメマプシン１に対して有利でないことを示唆する。選択性を付与する他のエネルギー特性または構造的特性の可能性は、このモデルによっては除外されない。
（実験手順）
（酵素の調製）
プロメマプシン（ｐｒｏｍｅｍａｐｓｉｎ）２−Ｔ１を、実施例１に概説した通りに発現させ、そして精製した。結晶化手順において使用したメマプシン２を、プロメマプシン２−Ｔ１（図１１に示される、配列番号８）のクロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）を用いた活性化、およびアニオン交換ＦＰＬＣによる精製（Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００））によって、得た。活性化メマプシン２は、配列番号８（図１１に示される）のアミノ酸６０−４５６に対応した。
（結晶化）
メマプシン２／ＭＭＩ−１３８の結晶を、交換手順または「浸漬」手順によって得た（Ｍｕｎｓｈｉ，Ｓ．Ｃｈｅｎ，Ｚ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｆｒａｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｒ．Ｗ．およびＫｕｏ，Ｌ．Ｃ．，「Ｒａｐｉｄ Ｘ−ｒａｙ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｒｙｓｔａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ」，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５４：１０５３−１０６０（１９９８）；以下を参照のこと）。この手順において、タンパク質と、目的の化合物（この場合、ＭＭＩ−１３８）より小さい親和性の化合物との間の複合体が、得られる。次いで、この結晶を目的の化合物の溶液中に入れて（すなわち、「浸漬して」）、目的の化合物を、分散させ、そして結晶のタンパク質中に存在するより弱い親和性の化合物との交換を可能とする。従って、ＭＭＩ−１３８との複合体中のメマプシン２の結晶について、最初に、メマプシン２の複合体およびより弱い親和性の化合物を用いて、結晶を得なければならない。この手順において使用されるより弱い親和性の化合物を、ＯＭ０１−１（Ｋｉ＝１２６ｎＭ）と名付けた：
Figure 0004547152
 ＯＭ０１−１をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に、２５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解した。メマプシン２（配列番号８のアミノ酸６０−４５６（図１１））を、上記の通りに作製した。精製したメマプシン２タンパク質を、４０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そして最終ＤＭＳＯ濃度は１０％であり、そして最終ＯＭ０１−１濃度は２．５ｍｇ／ｍｌとなるように、２５ｍｇ／ｍｌのＯＭ０１−１溶液と混合した。結晶化緩衝液（２０％ ＰＥＧ ８０００、０．２Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、および０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム（ｐＨ ６．５））を、メマプシン２／ＯＭ０１−１複合体溶液と合わせ、そして結晶化緩衝液（ウェル溶液）と１：１（容量：容量）で混合し、そして確立された懸滴手順（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に従って、ウェル溶液と２０℃で平衡化させた。
（化合物交換のための浸漬手順）
メマプシン２と化合物ＭＭＩ−１３８との間の複合体の結晶を得るために、置き換え手順または「浸漬」手順を続けた（Ｍｕｎｓｈｉら、１９９８）。本発明者らの研究室で確立されたＦＭＯＣ保護されたヒドロキシエチレンアイソスターを使用する、標準的な固相ペプチド合成（Ｇｈｏｓｈら、２０００）を使用して、ＯＭ０１−１を合成した。ＯＭ０１−１の存在下でのメマプシン２の結晶を、上記の結晶化手順により得、そして１０％ ＤＭＳＯおよび２ｍｇ／ｍｌの化合物ＭＭＩ−１３８、ならびにメマプシン２のタンパク質を含む結晶化緩衝液の１０μｌ溶液（ＭＭＩ−１３８の濃度の１／２モル濃度以下で存在するが、浸漬手順の間の結晶の安定性の目的のためには、好ましくはＭＭＩ−１３８の１／５モル量である）に移した。この溶液を、２０℃で４８時間インキュベートして、結晶中に存在する化合物ＯＭ０１−１を、化合物ＭＭＩ−１３８で平衡化させ、結果として化合物ＭＭＩ−１３８と、結晶中でメマプシン２と複合体となったＯＭ０１−１との間の交換を生じる。
（Ｘ線回折、データ収集および分析）
ＭＭＩ−１３８と複合体となったメマプシン２の結晶を、上記の手順によって得、凍結防止緩衝液（２０％グリセロールを含む結晶化緩衝液）中で１〜２分間インキュベートし、その後、液体窒素の流れの中で瞬時凍結させた。回折データを、Ｒｉｇａｋｕ ＲＵ−３００ Ｘ線生成機上で１００°ＫのＭ３４５イメージプレートを用いて収集した。データに見出しをつけ、そしてＨＫＬプログラムパッケージを用いて換算した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．およびＭｉｎｏｒ，Ｗ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３２６（１９９７））。分子置換法を使用して、最初のモデルとして、メマプシン２／ＯＭ９９−２結晶構造を解いた。分子置換の解を、プログラムＡｍｏＲｅを用いて得た。（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５７：１３６７−７２（２００１））。グラフィックプログラムＯを使用した手動モデルフィット化の反復サイクル（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，Ｚｏｕ，Ｊ．Ｙ．，Ｃｏｗａｎ，Ｓ．Ｗ．およびＫｊｅｌｄｇａａｒｄ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ａ ４７：１１０−９（１９９１））を用いて、精密化（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）を完了し、そしてＣＮＳを用いたモデル精密化（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．，Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｃｌｏｒｅ，Ｇ．Ｍ．，ＤｅＬａｎｏ，Ｗ．Ｌ．，Ｇｒｏｓ，Ｐ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｊｉａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｋｕｓｚｅｗｓｋｉ，Ｊ．，Ｎｉｌｇｅｓ，Ｍ．，Ｐａｎｎｕ，Ｎ．Ｓ．，Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｉｃｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｓｏｎ，Ｔ．およびＷａｒｒｅｎ，Ｇ．Ｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ５４：９０５−２１（１９９８））を完了した。これらの得られたデータを、表１２に示す。
（表１２ メマプシン２と複合体化したＭＭＩ−１３８についてのデータ収集および精密化の統計値）
Figure 0004547152
 ａＲｍｅｒｇｅ＝ΣｈｋｌΣｉ｜Ｉｈｋｌ’ｉ−＜Ｉｈｋｌ＞Σ／Σｈｋｌ＜Ｉｈｋｌ＞、ここで、Ｉｈｋｌ’ｉは、ｉ番目の強度の測定値であり、そして＜Ｉｈｋｌ＞は、Ｉｈｋｌの全ての測定値の重量平均である。
ｂＲｗｏｒｋ（フリー）＝Σ｜｜Ｆ０｜−｜Ｆｃ｜｜／Σ｜Ｆ０｜、ここで、Ｆ０およびＦｃは、観察された構造因子および計算上の構造因子である。括弧中の数は、最も高い分解能殻（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｈｅｌｌ）に対応する数（２．１８〜２．１Å）である。Ｆ０／σ（Ｆ０）＞＝０．０を用いた反射は、精密化およびＲ因子計算に含まれる。
（結果と考察）
本発明の化合物のＮ末端のジメチルピラゾール基（例えば、式ＩＩのＲ１基）は、メマプシン１よりメマプシン２に対する阻害選択性を提供する（図２４を参照のこと）。図２４は、メマプシン２（細い結合で示す）と複合体化したＭＭＩ−１３８（濃い結合で示す）の結晶構造の活性部位領域を示す。ジメチルピラゾール部分は、ＭＭＩ−１３８のピラゾール環Ｎ１１と、Ｔｈｒ２３２骨格と、メマプシン２側鎖原子との間の水素結合（破線）で図示される。本節の考察全体にわたり、アミノ酸残基は、配列番号９（図１２）に従って番号付けされる。ＭＭＩ−１３８のメマプシン２に対するＫｉは、メマプシン１のＫｉより、約６０倍低い（約６０倍強力である）。図２４に示される結晶構造は、このピラゾール基がメマプシン２のＳ３ポケットに結合することを示す。このピラゾール基は、それぞれＯＭ９９−２におけるＶａｌおよびＯＭ００−３におけるＬｅｕのような、Ｐ３アミノ酸側鎖の位置より、ポケット内のずっと深い位置に位置する。ピラゾール基に対するメマプシン２の接触残基は、Ｇｌｙ１１、Ｇｌｎ１２、Ｇｌｙ１３、Ｇｌｙ２３０、Ｔｈｒ２３１およびＴｈｒ２３２９からなる。このピラゾール誘導体は、さらに、Ｌｅｕ３０、Ｉｌｅ１１０、Ｔｒｐ１１５との疎水性の接触を形成する。
図２５は、ＭＭＩ−１３８の構造の概略である。ＭＭＩ−１３８の原子は、ＭＭＩ−１３８とメマプシン２との間の複合体の結晶構造の原子座標において命名された原子に対応するように番号をつけられる。上に議論されるように、ピラゾール環の窒素原子Ｎ１１は、Ｔｈｒ２３２骨格窒素原子および側鎖酸素原子と２つの水素結合を形成する。この位置において、ＯＭ９９−２とＬＲＬ−メマプシン２との間の複合体の構造（Ｈｏｎｇら、２０００）およびＯＭ００−３とＬＲＬ−メマプシン２との間の複合体の構造（Ｈｏｎｇら、２００２）中に存在する場合、Ｎ１１は、Ｓｅｒ１０のカルボニル炭素に非常に近い（約２．４Å）。２つの電気的に陰性の原子の密接な接触は、非常にエネルギーコストが高い。ピラゾール環の結合を可能にし、Ｎ１１との密接な接触を避けるために、Ｓｅｒ１０の骨格カルボニル酸素は、再配列し、ペプチド結合は、ひっくり返る。ＬＲＬ−メマプシン２／ＭＭＩ−１３８複合体の結晶構造は、他のメマプシン２／阻害剤化合物複合体の構造と比較した場合、Ｓｅｒ１０骨格炭素の１８０°のフリップを明らかに示す。このコンホメーションの変化は、Ｓ３ポケット中のピラゾール環に適応するのに必要である。
しかし、結晶構造は、同様に、Ｓｅｒ１０のカルボニル酸素のフリップが、メマプシン１については可能ではないことを示す。メマプシン２中のＬｙｓ９は、メマプシン１ではＡｓｐである。本発明者がモデル構築したメマプシン１構造に従って、Ａｓｐ側鎖は、Ａｒｇ１２の骨格窒素と水素結合を形成する（２．９Å）。このＡｓｐ９側鎖の水素結合および位置は、Ｓｅｒ９〜Ａｒｇ１２のヘアピンループを安定化し得、ピラゾール基の結合に必要とされる場合、ペプチドフリップを防止し得る。フリップは、負に帯電したＡｓｐ９側鎖のごく近傍（約２．３Å）においてＳｅｒ１０カルボニル酸素を位置決めし、そして／または水素結合を歪ませ、これは、エネルギー的に好ましくはない。メマプシン１において、主鎖コンホメーションは、Ｓｅｒ１０の周りのメマプシン２のコンホメーションと異なり、ペプチドフリップは、主鎖ねじれ角が、好ましくないΨおよびΦの組み合わせを有するようにする。
（実施例４：メマプシン２活性を阻害する化合物の投与後の哺乳動物中のβ−アミロイドタンパク質産生の阻害）
（キャリアペプチド−阻害剤（ＣＰＩ）結合体の調製）
これらの実験において使用されるキャリア分子ペプチドは、ＨＩＶｔａｔタンパク質のセグメント（アミノ酸残基４７−５７）に由来するペプチドであるか（Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２（１９９９）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））、またはアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号３２）およびオリゴ−Ｄ−アラニン残基（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３３））（Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ ９７：６６４−６６８（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））を有する。
キャリアペプチド−阻害剤結合体は、本明細書中で、命名「ＣＰＩ」続く数によっていわれる（例えば、ＣＰＩ−１、ＣＰＩ−２およびＣＰＩ−３）。ＣＰＩ−１は、キャリアペプチドに結合体化ＯＭ９９−２阻害剤である。ＣＰＩ−２は、キャリアペプチドに結合体化ＯＭ００−３阻害剤である。
実験において使用されるキャリアペプチド阻害剤結合体の構造は、以下であった：
ＣＰＩ−１：ＦＡＭ−Ａｈｘ−（ＥＶＮＬ＊ＡＡＥＦ）−Ｇ−（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号３４）
ＣＰＩ−２：ＦＡＭ−Ａｈｘ−（ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ）−ＧＧ−（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）（配列番号３５）
ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｖ、Ｎ、Ｌ、Ａ、ＦおよびＤは、それぞれ、Ｌアミノ酸の、チロシン、アルギニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸である。下線のＲは、Ｄ−アルギニンを示す。５−（および６−）カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）は、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）基のアミノ基に連結される。Ａｈｘのカルボキシ基を、アミド結合によって阻害剤部分の最初のアミノ酸のアミノ基へと連結する。
Ａｈｘおよびグリシン残基は、複合体中のスペーサーとして使用された。角括弧は、キャリアペプチドを含み、これは、それぞれ、ＣＰＩ−１中のｔａｔ残基４７−５７およびＣＰＩ−２中の９個のＤ−アルギニン残基である（Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））。阻害剤配列中のアステリスクは、遷移状態のイソステア（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）であるヒドロキシエチレンを示す（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２−３５２３（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））。
キャリアペプチドは、本明細書中で、「ＣＰ」続く数によっていわれる。結合体化阻害剤部分を除く、フルオレセイン標識キャリアペプチド（ＣＰ−１）はまた、コントロール実験のために設計される。ＣＰ−１の構造は以下である：
ＣＰ−１：ＦＡＭ−Ａｈｘ−ＧＧＧ−（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号３６）
。
ＣＰＩ−１、ＣＰＩ−２、およびＣＰ−１のペプチド部分を、固相ペプチド合成を使用して合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。保護されたＬｅｕ＊Ａｌａジイソステア誘導体を、ＣＰＩ−１およびＣＰＩ−２の合成において、単一工程で使用した（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２−３５２３（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））。ＦＡＭ結合を、供給者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の手順に従って活性エステル化学によって容易にした。
Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される）に記載される手順を使用する動力学的阻害実験（図２１）は、結合体化阻害剤ＣＰＩ−１およびＣＰＩ−２が、これらの阻害剤として類似する阻害能力を有する（ぞれぞれ３９ｎＭおよび５８ｎＭの見かけのＫｉ値を有するＯＭ９９−２およびＯＭ００−３）（Ｌｉｎ，Ｘ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１４５６−１４６０（２０００）；Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））ことを示した。
結合体およびコントロールの濃度を、アミノ酸分析からか、または蛍光分光光度計ＡＭＩＮＣＯ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ２を使用する蛍光値によってかのいずれかでペプチド濃度を正規化する。４９２ｎｍの励起波長および５１６ｎｍの放出波長を使用して、結合されたフルオレセインからの蛍光の量をモニターした。
（結合された阻害剤のマウス脳への輸送）
（実験手順）
２ヶ月齢〜４ヶ月齢のＣｄ７２ｃマウスに、２００μｌのＰＢＳ中の、０．３〜１０ｎｍｏｌの結合体（ＣＰＩ−１またはＣＰＩ−２）またはコントロールフルオレセインを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。全血液細胞（シリンジ中またはキャピラリーチューブ中の抗凝固薬としてＥＤＴＡを含む）を、内側前頭脳底動脈から、または心臓穿刺によって麻酔された動物から単離し、そしてＰＢＳ中に１：１０に希釈した。他の組織サンプルの採取の前に、動物を、麻酔し、そして１５０ｍｌの中性緩衝化１０％ホルマリンで灌流した。脾臓を、傷つけずに採取した。脳を採取し、そして大脳半球を単離し、１つをクライオスタットによる切片化のためであり、もう一方は、フローサイトメトリーのための単一細胞単離のためである。
大脳半球の切片を、ＯＣＴ／ＰＢＳ中４℃で一晩浸漬することによって得、回収し、そしてＨｉｓｔｏ Ｐｒｅｐ Ｍｅｄｉａ中で凍結した。切片（１０μｍ）を、クライオスタットで切断し、０．２５％のホルマリン中で１５分間固定し、そして以下の３つの抗体で組織学的に染色した：（１）Ａｌｅｘｉａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合体化抗フルオレセイン（Ｍｏｌｅｃｕａｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；（２）ポリクローナルヤギ抗ヒト−プロ−メマプシン２抗体；（３）次いで、Ｃｙ３結合体化抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；および（４）ビオチン結合体化抗ウシα−チューブリン、次いで、ニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）に結合されたＡｌｅｘｉａ Ｆｌｕｏｒ ３５０ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。カバーガラスを用いて抗フェード溶液でマウントした後、切片を、蛍光共焦点顕微鏡法によって分析した。
単一細胞の懸濁物を採取するために、脾臓および大脳半球を、３０μｍのスクリーンを通してホモジネートし、フローサイトメトリー分析によって直接分析した。脳細胞を染色するための代替の手段を、まず、ＰＢＳ中の０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０中で透過性にし、１％正常ウサギ血清でブロックし、１：５０希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ＴＭ結合体化フルオレセイン（１ｍｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共に３０分間インキュベートし、次いで、フローサイトメトリー分析によって分析した。
フルオレセインを、ＮＨＳ−フルオレセイン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）と共にインキュベーションすることによってＯＭ００−３のアミノ末端に結合体化し、そして逆相ＨＰＬＣによって９０％を超えるまで精製し、ＤＭＳＯ中で５０ｍｇ／ｍｌまで希釈した。
蛍光標識された阻害剤またはコントロールとしてのフルオレセイン（Ｆｓ）を、１０〜３０分の範囲の時間間隔の間、懸濁細胞と共にインキュベートした。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０中で６分間透過性にし、そして抗フルオレセイン−ＡｌｅｘａＴＭ４８８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）と共にインキュベートし、貫入から示される細胞内阻害剤の検出を増大した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ）および共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳＮＴＴＭ）を、Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｌａｂ，ＯＵＨＳＣで実施した。
（結果）
結合体化阻害剤（ＣＰＩ−１およびＣＰＩ−２）は、ＦＡＭ基の細胞内蛍光によって示されるように、数分以内に培養細胞内に迅速に貫入した（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃ）。
Ｆｓ［ＯＭ９９−２］ｔａｔとのＨＥＫ２９３細胞のインキュベーションは、フローサイトメトリーによって示されるように、フルオレセインのみと共にインキュベートされた細胞と比較して、蛍光の増加を生じた（図１８Ａ）。さらに、インキュベートした細胞の蛍光強度は、４ｎＭ〜４００ｎＭの範囲の阻害剤濃度と相関した（図１８Ｂ）。同様に、ＣＰＩ−２は細胞を貫入し、その一方で、ＣＰ部分（オリゴ−Ｄ−アルギニン）を有さないＦｓ［ＯＭ００−３］は貫入せず（図１８Ｃ「ペプチド」）、このことは、ＣＰが、細胞膜を貫入する阻害剤の輸送に必要であったことを示した。結合された阻害剤の輸送を、いくつかの細胞株（ＨｅＬａ細胞およびＭ１７細胞を含む）で観察し、後者は、ニューロン性細胞株であった。
ＣＰＩ−１およびＣＰＩ−２結合体の哺乳動物の脳への侵入を決定した。マウス株Ｃｄ２７ｃに、ＣＰＩ−１、ＣＰＩ−２、またはＣＰ−１のいずれかの０．３ｎｍｏｌをｉ．ｐ．注射し、注射された化合物中のＦＡＭ基に起因して、細胞および器官を、蛍光についてモニターした。ＣＰＩ−１でのｉ．ｐ．注射の２０分後に単離された全血のフローサイトメトリー分析は、血液細胞の約１００％中の強い蛍光信号を示した（図１９Ａ）。コントロールとしてフルオレセインを注射されたマウスからの血液細胞は、バックグラウンド蛍光の小さな一定の増加を示し、これは、リンパ系による腹膜から化合物の取り込みに起因し、そして細胞表面に吸着した化合物の取り込みに起因するようであった。
マウスのｉ．ｐ．注射２時間後の脾摘出術を実施し、脾細胞を単離することによって、膵臓細胞を、ＣＰＩ−１、ＣＰＩ−２、またはＣＰ−１の存在について分析した。フローサイトメトリー分析は、全ての脾細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを含む）への結合体のトランスロケーションを示し、このことは、ほぼ１００％の細胞における蛍光ピークシフトを生じる（図１９Ｂ）。血液細胞のように、等量の遊離フルオレセインのコントロールｉ．ｐ．注射は、バックグラウンドレベルより上の蛍光のわずかな上昇のみを示した。注射された結合体を、マウス中の血液細胞および脾細胞に迅速に（それぞれ、約２０分間および２時間）導入した。
脳組織へのＣＰＩ−１の取り込みを決定した。全脳を、結合体またはコントロールとしてのフルオレセインのｉ．ｐ．注射の８時間後に、灌流マウスから切除する。半球を分離し、そしていずれかをクライオスタット切片化のためにか、またはナイロンメッシュ上でのホモジナイゼーションによる細胞の単離のために、凍結した。フローサイトメトリー分析は、全ての脳細胞に蛍光結合体の貫入を明らかにし、蛍光ピークシフトを生じた（図１９Ｃ）。基底レベルの集団からより大きな蛍光強度を含むレベルまで徐々に移動する２つのピークの中間段階を示す脳細胞を、観察した（図２０）。
１０μｍの半球の矢状脳切片の蛍光共焦点顕微鏡分析は、ＣＰＩ−２を注射されたマウスから脳の全ての領域において強い信号を示し、その一方で、フルオレセインコントロールを注射されたマウスにおける信号は、バックグラウンドレベルのままであった。ｉ．ｐ．注射の８時間後、共焦点顕微鏡法の結果は、フルオレセインは、脳切片全体にわたって細胞体の核に主に局在化したことを示した。
（結合体化阻害剤による培養細胞からのＡβ分泌の阻害）
上記される観察は、２つの結合体化阻害剤（ＣＰＩ−１およびＣＰＩ−２）が、インビトロで細胞の形質膜またはインビボで血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し得た。結合体化された阻害剤による培養細胞中でのメマプシン２の活性の阻害を決定した。メマプシン２によるＡＰＰの加水分解は、Ａβの形成を導き、そしてその培養培地への分泌を導くので、結合体化阻害剤ＣＰＩ−２のＡＰＰに対する効果を、培養培地中の分泌されたＡβを測定することによって決定した。
（実験手順）
培養細胞（ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ＨｅＬａ、および神経芽細胞腫株Ｍ１７を含む）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入された）を、ヒトＡＰＰ Ｓｗｅｄｉｓｈ変異型（ＡＰＰｓｗ；ＳＥＶＮＬＤＡＥＦＲ（配列番号１１））；およびヒトメマプシン２（配列番号６のアミノ酸残基１４−５０１（図９））をコードする２つの核酸構築物で安定にトランスフェクトし、この核酸構築物は、ＰＳＥＣ−タグ遺伝子からのリーダーペプチドを含んだ。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地中に維持した。２つの抗生物質（Ｚｅｏｃｉｎ（１μｇ／ｍｌ）およびＧ４１８（２５０μｇ／ｍｌ））を、安定なトランスフェクト株の維持のために培地中に含めた。
親株（２９３、ＨｅＬａ、またはＭ１７）または安定なトランスフェクト株（２９３−Ｄ、ＨｅＬａ−Ｄ、またはＭ１７−Ｄ）のいずれかを、６ウェルプレート上にプレートし、９０％コンフルエントまで、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で増殖した。次いで、細胞を、１０ｐｍｏｌのＣＰＩ−２で一晩処理するか、または処理せず、次いで、メチオニン非含有ＤＭＥＭおよびシステイン非含有ＤＭＥＭ中の［３５Ｓ］ＴｒａｎｓＬａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｍｉｘ（１００μＣｉ／ｍｌ）（ＩＣＮ）を使用することによってさらに１８時間標識した。細胞のＣＰＩ−２での処理について、１０ｐｍｏｌの阻害剤結合体を、細胞に２０分間分配し、その後、標識し、そして同様に、標識培地中で処理した。
細胞を、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプシン、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１μＭ ペプスタチンおよび０．２３Ｕ／ｍｌアプロトニンを補充した１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ、および１％ ＮＰ−４０）中で溶解した。全細胞溶解物を、２０μｌのプロテインＧ−セファロースビーズを有するヒトＡβ１７−２４（ＭＡＢ１５６１，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）に対して特異的に惹起されたモノクローナル抗体（１ｍｇ／ｍｌ）の１μｌの添加によって、免疫沈降に供した。免疫沈降されたタンパク質を、２．５％β−メルカプトエタノールを含むＴｒｉｃｉｎｅ−ＳＤＳサンプル緩衝液中で５分間煮沸することによって改変した。免疫沈降されたタンパク質を、１０〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮＯＶＥＸ）を使用することによって分析し、放射標識されたタンパク質をオートラジオグラフィーによって視覚化した。定量的結果を、ＳＴＯＲＭＴＭりん光画像化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用することによって得た。
（結果）
ｓｗ（Ｓｗｅｄｉｓｈ ｍｕｔａｔｉｏｎ）ＡＰＰおよびメマプシン２（配列番号６のアミノ酸残基１４−５０１（図９））でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（２９３−Ｄ細胞）由来のＡβの免疫沈降は、ネイティブなＨＥＫ２９３細胞の同じ処理に比べた場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて４．５ｋＤａの位置に明瞭なＡβバンドを示した。細胞のＣＰＩ−２での処理後、安定にトランスフェクトされた細胞株によって産生されたＡβの量は、著しく減少し、その一方で、コントロールＨＥＫ２９３細胞において効果は見られなかった。りん光画像化によるバンドの３５Ｓ強度の定量化は、結合体化阻害剤ＣＰＩ−２による９５％を超えるＡβの阻害を示した。
（さらなるキャリアペプチド−阻害剤結合体の調製）
キャリアペプチド阻害剤結合体ＣＰＩ−３の構造を、以下のように設計した：
ＣＰＩ−２：ＦＡＭ−Ａｈｘ−（ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ）−ＧＧ−（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）（配列番号３５）
ＣＰＩ−３：（ＥＬＤＬ＊ＡＶＥＦ）−ＧＧ−（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）（配列番号３７）
ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｙ、Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｖ、Ｎ、Ｌ、Ａ、ＦおよびＤは、それぞれ、Ｌアミノ酸の、チロシン、アルギニン、リジン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、アスパラギン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸である。下線のＲは、Ｄ−アルギニンを示す。ＣＰＩ−２の調製は、上記である。ＣＰＩ−３を、同様の手順を使用して合成した。ＣＰＩ−３は、ＣＰＩ−２と同じアミノ酸配列を有するが、蛍光ＦＡＭタグを欠く。ＣＰＩ−３のアミノ末端は、遊離一級アミンであり、アミノヘキシルにもＦＡＭ基にも連結されない。阻害剤配列中のアステリスクは、遷移状態アイソステア（ヒドロキシエチレン）を示す。
ＣＰＩ−３のペプチド部分を、固相ペプチド合成を使用して合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。保護されたＬｅｕ＊Ａｌａジイソステア誘導体（以前に記載された（Ｇｈｏｓｈ，Ａ．Ｋ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２−３５２３（２０００））（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））を、Ｇｈｏｓｈら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：３５２２−３５２３（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））に記載されるような、ＣＰＩ−３の合成において、単一工程で使用した。
Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１２４５０−１２４５６（２０００）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される）に記載される手順を使用する動力学的阻害実験は、結合体化阻害剤ＣＰＩ−３が、親阻害剤と類似する阻害能力を有する（３５ｎＭのＫｉ ＯＭ００−３）ことを示した。
（トランスジェニックマウス中のＡβ産生の阻害）
（実験手順）
６ヶ月齢ｔｇ２５７６マウス（ｎ＝２１）に、２００μｇの結合体ＣＰＩ−３または２００μｌのＰＢＳ中のコントロールＤＭＳＯを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。麻酔された動物から、眼窩出血またはセファナス（ｓｅｐｈａｎｅｏｕｓ）静脈によって、血漿を、ヘパリン化されたキャピラリーチューブに回収し、遠心分離によって清浄化した。血漿Ａβ１−４０レベルを、捕捉ＥＬＩＳＡによって決定した（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）。ヒドロキシエチレンイソステアの代わりにアミド基を有するＣＰＩ−３のペプチドアナログを、ＳｙｎＰｅｐ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）によって合成した。
（結果）
結合体化阻害剤ＣＰＩ−２は、上記されるようにＦＡＭ基の細胞内蛍光によって示されるように、数分のうちに迅速に培養細胞に貫入し、数時間のうちに脳および他の組織に貫入した。
結合体化阻害剤が、インビボで血液脳関門を横切り、インビトロおよびインビボで細胞に入り、そしてインビトロでＡβ産生を阻害し得るので、Ａβのインビボ産生の阻害を決定した。ヒトアミロイド前駆体タンパク質のＳｗｅｄｉｓｈ変異（配列番号１１を含む）（Ｈｓｉａｏ，Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９−１０２（１９９６）（この教示は、その全体を本明細書中に援用される））を発現するＴｇ２５７６マウスに、ＣＰＩ−３を注射し、このＣＰＩ−３は、アミノ酸配列がＣＰＩ−２と同一であり、アミノ末端フルオレセイン（ＦＡＭ）誘導体を欠く。血液を、４００μｇのＣＰＩ−３の注射後に、時間間隔でｔｇ２５７６動物から回収した。
９ヶ月齢までで、ｔｇ２５７６中の血漿Ａβは、メマプシン２活性の結果として、脳Ａβ産生に対する信頼できるマーカーとして働く（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３７２−３８１（２００１））。９匹のｔｇ２５７６マウスに種々の用量の阻害剤ＣＰＩ−３を腹腔内注射した。ＣＰＩ−３血漿注射の２時間後、血漿Ａβ４０は、ＰＢＳを注射されたコントロールマウス由来のＡβ４０に比べて、有意な用量依存性の減少を示した（図２１Ａ）。
阻害の遅延の研究に対して、８匹のｔｇ２５７６マウスに、阻害剤ＣＰＩ−３を腹腔内的に注射した。血漿Ａβ４０レベルは、注射２時間後、初期値の約１／３に減少し（図２１Ｂ）、このことは、共焦点顕微鏡によって証明された、同じ時間範囲での脳中のＣＰＩ−３の存在と一致する。阻害は、相対的に短い半減期の３時間を有し、血漿Ａβ４０レベルは、次いで、８時間で徐々に初期値まで戻り（図２１Ｂ）、これは、共焦点顕微鏡法で観察された、注射後８時間で、マウスの脳から蛍光阻害剤ＣＰＩ−３の消失の観察と一致する。遷移状態イソステア（図２１Ｃ「ペプチド」）を含まない結合体化されない阻害剤ＯＭ００−３またはＣＰＩ−３のペプチドアナログのいずれかの注射によって、血漿Ａβ４０レベルは減少しなかった。ＣＰＩ−３のペプチドアナログおよび阻害剤ＯＭ００−３を同時に注射することによって血漿Ａβ４０が減少しなかった（図２１ ＣＯＭ００−３＋ペプチド）ように、後者のＣＰＩ−３のペプチドアナログは、キャリア分子が観察された阻害を担わず、血液脳関門の一般的通過を容易にしなかったことを確立した。全Ａβに比べたＡβ４０のパーセンテージは、処置された動物および処置されない動物それぞれにおいて、Ａβレベルについて７３±８％および７５±５％で一定であり、約１０００ｐｇ／ｍｌ〜約５０００ｐｇ／ｍｌの範囲にある。これらの観察は、測定されたＡβ４０変化が、観察された阻害の範囲において全Ａβの変化としてとられ得ることを確立した。
観察された阻害の遅延が、相対的に短かったので、繰り返しの注射によるこの阻害剤の最大阻害レベルを、決定した。２時間間隔での４回の注射を用いる実験は、平均初期値の２９％の平均最低値（２２％〜３３％の範囲にわたる）までＡβレベルを有意に減少した（図２１Ｄ）。ＰＢＳまたはＣＰＩ−３のペプチドアナログを受容した実験群およびコントロール群のＡβ値の差異は、所定の注射の２時間後の時点で統計的に有意であった。これらのＡＤマウスにおける血漿Ａβの観察された減少は、主として、脳のほぼ全体で産生されたＡβの阻害を示す。なぜなら、Ａβは、脳から血漿までの迅速な流出を示すからである（Ｇｈｅｒｓｉ−Ｅｇｅａ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：８８０−８８３（１９９６））。従って、約８０％の血漿Ａβの阻害は、脳からのＡβの産生量の減少を含まなければならない。
キャリア分子は、天然高分子（例えば、タンパク質およびＤＮＡ）の細胞膜を越える輸送を容易にすることを以前に示された。キャリア分子が、細胞膜および血液脳関門（ＢＢＢ）を越えての非ペプチド結合を含む合成阻害剤の輸送を補助するという本明細書での証明は、キャリア分子が、アルツハイマー病治療薬および標的化された他の疾患の中枢神経系または他の組織もしくは細胞小器官への送達のために使用され得る可能性を上げる。このようなアプローチの利点は、親阻害剤が、ＢＢＢ貫入に十分少量である必要はなく、従って、薬物が、効能、選択性および他の薬物特性に基づいてより広いレパートリーの候補化合物から選択され得るということである。キャリアを使用する薬物送達は、細胞膜貫入に適切な特性を有する薬物を得るのが困難である標的について考慮され得る。
（アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおけるＡβ産生の阻害）
本発明の多くの化合物が、インビトロでの蛍光アッセイにおいてメマプシン２（配列番号８（図１１）のアミノ酸残基４３〜４５６および配列番号８（図１１）のアミノ酸残基４５〜４５６）の強い抑制を証明したが、これらの化合物のいずれがインビボでのＡβ（本明細書中ではβアミロイドタンパク質とも称される）産生を阻害し得るか否かは未知であった。概して、この化合物の分子サイズは、非常に大きいので、血液脳関門の横断を許容できないとみなされる。約５００ｇ／モル以下の制限が報告されている（Ｂｒｉｇｈｔｍａｎ，Ｍ．Ｗ．，ら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２：６３〜７８（１９９５）；Ｚｏｌｋｏｖｉｃ，Ｂ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．４：２３〜２６（１９９７）；Ｅｇｌｅｔｏｎ，Ｒ．Ｄ．，ら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１８：１４３１〜１４３９（１９９７）；ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ，Ｈ．，ら，Ｊ．Ｄｒｕｇ．Ｔａｒｇｅｔ ６：１５１〜１６５（１９９８）（これらの全ての教示は、その全体が本明細書中で援用される））。Ａβ産生をブロックするための化合物の作用に必要とされる重大な特徴は、その化合物が血液脳関門に浸透し得ることである。脳は記憶および認識を媒介するので、脳は、アルツハイマー病の処置における作用の重要な部位である。
ｔｇ２５６７トランスジェニックマウスは、主に脳における発現を指向するようにヒトスウェーデンアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をプリオンプロモーターのコントロール下で発現する（Ｈｓｉａｏ，Ｋ．，ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９９〜１０２（１９９６）（この教示は、その全体が本明細書中で援用される））。脳で産生されるＡβペプチドは、３ヶ月齢〜１２ヶ月齢のこれらのトランスジェニック動物の血漿中で検出され得（Ｋａｗａｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．，ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３７２〜３８１（２００１）（この教示は、その全体が本明細書中で援用される））、その脳からの流出が生じる（数分以内に生じることが公知である）（Ｇｈｅｒｓｉ−Ｅｇｅａ，ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６７：８８０〜８８３（１９９６）（この教示は、その全体が本明細書中で援用される））。従って、血漿Ａβのモニターは、脳におけるＡβ産生の効果的な阻害の有効な連続測定を提供する。
メマプシン２阻害剤の投与に引き続く血漿中のＡβレベルの低下は、血液脳関門を横断することによって、この化合物が脳におけるＡβ産生を阻害したことの指標である。キャリアーペプチド（ＣＰＩ−２）に結合体化した蛍光標識されたメマプシン２阻害剤は、血液脳関門を横断することが示され、そして上記で議論されるように、Ａβ産生を抑制した。上述された同じ実験プロトコルを実行することで、本発明の３つの阻害剤化合物、ＭＭＩ−１３８、ＭＭＩ−１６５、およびＭＭＩ−１８５が、トランスジェニックマウス（株ｔｇ２５７６）において血液脳関門を浸透し、Ａβ産生の縮小を生じることが実証された。
（材料および方法）
（化合物）
化合物ＭＭＩ−１３８、ＭＭＩ−１６５、およびＭＭＩ−１８５が、上述されるように合成される。化合物は、１ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で溶解され、ＭＭＩ−１６５およびＭＭＩ−１８５に関しては約１ｍｇ／ｍｌ、ならびにＭＭＩ−１３８に関しては約１０ｍｇ／ｍｌの最終濃度にされた。阻害剤ＯＭ００−３は、上述されるように合成され、そしてＤＭＳＯ中に溶解され、約１０ｍｇ／ｍｌにされた。阻害剤は、以下に記載されるように、注射直前にＰＢＳまたはＨ２Ｏで希釈された。阻害定数は、Ｅｒｍｏｌｉｅｆｆ，ら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１２４５０〜１２４５６（２０００）（この教示は、その全体が本明細書中で援用される）によって記載される方法によって決定された。
（動物モデル、処置およびサンプリングプロトコル）
マウスのｔｇ２５７６株は、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍｅｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から得た。マウスのＡＰＰ／Ｆ株は、ｔｇ２５７６マウスとＦＶＢ／Ｎ株との交配によって得た。ＡＰＰ／ＦマウスにおけるスウェーデンＡＰＰ遺伝子の存在を決定するために、マウス由来のＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＤｎｅａｓｙＴＭ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔによって単離した。ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎキットおよびプロトコル）を用いて、ヒトスウェーデンＡＰＰ遺伝子と一致するｃＤＮＡフラグメントを増幅した。以下のプライマーを使用した：
Figure 0004547152
 βアクチンプライマーを、陽性コントロールとして使用した。ＰＣＲを実行した後、サンプルを、０．５μｇ／ｍｌ ＥｔＢｒを含む１％アガロースゲル上で１×ＴＡＥ（トリス−アセテート−ＥＤＴＡ）泳動緩衝液において分析した。
３ヶ月齢のアルツハイマー病動物（マウスモデルＡＰＰ／Ｆ）に、化合物ＭＭＩ−１３８（分子量６７４ｇ／モル；動物１頭あたり１１０μｇ、ｎ＝２）、ＭＭＩ−１６５（分子量６２６ｇ／モル；動物１頭あたり１０２μｇ、ｎ＝２）、またはＭＭＩ−１８５（分子量６８６ｇ／モル；動物１頭あたり１１２μｇ、ｎ＝２）のいずれかのうちの１６３ナノモルを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。コントロール動物には、ＤＭＳＯ単独（１００μｌのＰＢＳに希釈された１００μｌ）またはＰＢＳで希釈し、最終容量を２００μｌとしたＤＭＳＯにおいて１０ｍｇ／ｍｌストックとした阻害剤ＯＭ００−３（表３）の１６３ｎモルのいずれかを注射した。
ヘパリン処理したキャピラリーチューブに、後方眼窩洞または伏在静脈のいずれかから注射後特定の間隔で、麻酔動物から血液サンプルを回収した。この血液サンプルを、無菌１．５ｍＬ微小遠心チューブに移し、血漿（上清）を収集するために５，１００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、そして酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によるＡβ４０についての分析まで−７０°Ｃで保存した。
サンドイッチＥＬＩＳＡ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いて、血漿サンプル中のＡβ４０のレベルを決定した。ＥＬＩＳＡは、アミノ末端の固定化のためのヒトＡβに特異的な１次抗体およびＡβ４０のカルボキシ末端のアミノ酸に特異的な検出抗体を利用する。結合体化２次抗体は、安定な色素原基質を用いて三重複合系を検出するために使用される（１Ｍ ＨＣｌの定量可能な追加の後に、４５０ｎｍで光学密度を測定した）。その手順は、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅプロトコルに従った。光学密度は、市販のキットから得られた標準の光学密度の線形回帰を使用して、Ａβ４０のｐｇ／ｍｌ量（既知の濃度）に転換された。
（結果および考察）
６匹のＡＰＰ／Ｆ動物に、３つの異なるメマプシン２阻害剤、ＭＭＩ−１３８、ＭＭＩ−１６５、またはＭＭＩ−１８５のうちの１つを腹腔内注射した。注射に引き続いて、血液サンプルを、種々の時間で伏在静脈からの採血によって収集し、そしてＡβ４０の量について分析した。図２２Ａおよび２２Ｂは、試験される全化合物について、注射に引き続く３０分以内のＡβ４０における著しい低下を示すデータを示す。Ａβ４０における減少は、ＭＭＩ−１８５に関して最も低く、６３％降下した一方で、ＭＭＩ−１３８およびＭＭＩ−１６５の両方は、Ａβ４０をそれぞれ５７％および４６％減少した。
トランスジェニックマウスには、１６３ｎＭのＭＭＩ−１３８、ＭＭＩ−１６５またはＭＭＩ−１８５の単回注射で注射し、そして阻害剤化合物の投与（０時間）および２時間後、４時間後、６時間後および８時間後の阻害剤化合物の追加投与前に血液が回収した。血漿βアミロイドタンパク質（Ａβ４０）を決定した。データは、平均値±その平均値の標準誤差を表す。２匹の動物を、それぞれの処置群において使用した。図２２Ａにおいて示されるように、血漿中のβアミロイドレベルは、化合物の投与に引き続く約１時間以内に減少を示した。図２２Ｂで示されるように、血漿βアミロイドタンパク質レベルは、阻害剤化合物の投与に引き続く１５０時間を過ぎて減少された。これらのデータは、阻害剤化合物の投与に引き続くβアミロイドタンパク質の産生を実質的に阻害するメマプシン２活性の阻害に対する長期間の効果を示す。
ＤＭＳＯまたは阻害剤ＯＭ００−３で処置したコントロール動物は、注射に引き続く２時間後に、それぞれ２１％および１６％のみ減少を示した（図２１）。阻害は、ＭＭＩ−１３８またはＭＭＩ−１６５のいずれかで処置した動物について、２４時間にわたってほとんど不変のままである一方で、血漿Ａβ４０レベルは、ＭＭＩ−１８５で処置した動物において初期レベルに戻るようであった（図２２Ｂ）。概して、処置に引き続く１７０時間にわたって観察した全処置動物について、Ａβ４０レベルは、その初期レベルに幾分かは戻り（それは、持続的にはより低いが）、これは、これらのトランスジェニック動物の脳からのＡβ４０産生阻害の長期レベルを示した。
３０分で観察される阻害の範囲（図２２Ａ）は、化合物のＫｉ値を反映する（ＭＭＩ−１８５、ＭＭＩ−１３８、およびＭＭＩ−１６５について、それぞれＫｉ＝４．５、８．８、１５．３ｎＭ）。この観察は、哺乳動物におけるＡβ４０産生の成功した抑制の程度を確認するために、阻害効力のインビトロでの決定の（表３）信頼性を示す。この化合物は、阻害の持続性と関連する。ＭＭＩ−１３８およびＭＭＩ−１６５は、密接に関連し、そして両方とも選択的ジメチルピラゾール基を有し（表３）、ＭＭＩ−１８５（構造的に類似性が少ない）は、同じ時間範囲にわたって阻害を持続させる。それにもかかわらず、試験した全化合物は、Ａβ４０産生を阻害し得た。Ａβ４０の減少が観察されたことは、これらの化合物のサイズが、５００ｇ／モル（特に阻害剤ＯＭ００−３（ＭＷ９３５ｇ／モル）はＡβ４０産生の阻害に失敗しているので（図２１Ｃ）、このサイズは血液脳関門から排除のためのサイズ限界である）より大きいとしても、インビボでのメマプシン２活性を抑制するために、この化合物が首尾よく血液脳関門を横断したことを示す。インビボでのＡβ４０産生の阻害は、化合物自体または効力のインビトロ測定からは予測され得なかった。さらに、これは、この種類の化合物の投与による哺乳動物におけるインビボメマプシン２阻害（脳からのＡβ４０産生の縮小を生じる）の最初の実証である。
（実施例５）
（メマプシン２による新規の上流基質特異性決定）
メマプシン２（Ｍｅｍａｐｓｉｎ２）は、アルツハイマー疾患の病因に関与するβ−セクレターゼ酵素として同定され、それを実験的に証明されている。そしてさらに、メマプシン２は、新規の膜結合アスパラギンプロテアーゼとして特徴付けられている。このように、メマプシン２は、アスパラギンプロテアーゼファミリーに観察される多くの特徴を有している。これらの特徴としては、以下が挙げられる：酸性ｐＨ至適、保存的Ｄ Ｔ／Ｓ Ｇ触媒性アスパラギン酸モチーフ、観察される大型基質結合裂、および拡張されたペプチド基質特異性。これらのアスパラギンプロテアーゼファミリーの特徴の最後の２つは、多くの実験研究において、様々な種に渡って分析されている。これらの研究の一致する点は、拡張された基質結合裂が、基質ペプチドの８アミノ酸残基、（切れやすい結合の両側にそれぞれ４アミノ酸）の相互作用を促進することである。ここで、本発明者らは、その基質の４つの遠位の（すなわち、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７およびＰ８の位置（Ｎ末端（上流）から従来の触媒結合配列まで）における）アミノ酸残基から生じる、触媒効果の観察を報告する。本発明者らは、触媒に最適なアミノ酸組成物を決定するために、これらの位置の特異性分析を、さらに行っている。
（実験手順）
（規定された基質テンプレートおよび上流分析ペプチドの設計）
ペプチド配列ＥＶＮＬＡＡＥＦ（実施例１に記載される）を、メマプシン２を基礎テンプレートペプチドとして使用し拡張された上流相互作用を分析する、メマプシン２残基優先分析において、うまく利用した。
最初の一連の分析のために、３つのペプチドを、固相ペプチド合成（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を使用して作製した。これらのペプチド（ＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ（配列番号１６）（ＷＨＤＲと名付ける）、ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号１７）（ＲＷＨＨと名付ける）、およびＥＥＩＳＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号４６）（ＥＥＩＳと名付ける）（アスタリスクは、各ペプチドにおける切断部位を示す））は、それぞれ、下流、上流およびネイティブなＡＰＰ配列伸長を、調べるために作製した。加えて、伸長させたネイティブＡＡＰ配列（Ｐ５：ＲＴＥＥＩｘＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号４７）；Ｐ６：ＲＴＥＥｘＳＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号４８）；Ｐ７：ＲＴＥｘＩＳＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号４９）；Ｐ８：ＲＴｘＥＩＳＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号５０）；ｘは、その位置の、９アミノ酸混合物を表す）に基づき、４つのペプチド混合物を合成し、４つの上流アミノ酸の残基優先度を調べた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出を促進するため、アルギニンをペプチドのＮ末端に添加した。これらのペプチドを、固相ペプチド合成を通して、適切な合成周期に添加した等モル濃度量の９アミノ酸混合物により、作製した。生じる９ペプチド混合物は、１部位の１アミノ酸のみにより、異なっている。ネイティブなＡＰＰ配列基質に相当するアミノ酸は、内部標準を提供するために、それぞれの混合物に含まれる。
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ動力学分析）
基質混合物を、実施例１の方法に従って調製し、メマプシン２（配列番号９（図１２））およびマイクロモル濃度範囲内のペプチドと共にｐＨ４．０で行うインキュベーション混合物を得た。反応を、周期的にアリコートを除去しながら、６０分間行った。アリコートを、等容量のＭＡＬＤＩマトリックス（アセトン中α−ヒドロキシ桂皮酸）と混合し、そして直ちに９６二重ウェルＴｅｆｌｏｎ（登録商標）被膜分析プレート上にスポットした。ＭＡＬＤＩデータの回収および分析を、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ機器において行った。データを、Ｖｏｙａｇｅｒ Ｄａｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒモジュールを使用して分析し、イオン強度データを得た。単位時間あたりに作られた関連産物を、産物形成の最初の１５％を表すデータの非直線状回帰分析から得、そしてこのデータを、相対的ｋｃａｔ／Ｋｍ値を決定するために使用した。
（結果と考察）
（動力学効果の観察）
阻害剤ＯＭ００−３に結合するメマプシン２の結晶構造は、この酵素の基質結合裂内に収容された８アミノ酸側鎖を示す（Ｌｉｎ，２０００）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を、この初期特異性を決定するためのこの最初の研究において、利用した。この分析のために、２つのテンプレートペプチド配列を設計し、上流および下流両方の相互作用残基の検査を促進した。これらのテンプレート（ＲＷＨＨＥＶＮＬＡＡＦＦ（配列番号１７）（ＲＷＨＨと名付けられる）およびＥＶＮＬＡＡＥＦＷＨＤＲ（配列番号１６）（ＷＨＤＲと名付けられる））を、通常の触媒産物を特別な触媒産物と分離させるための、不均衡な設計（アッセイ系の感度を劇的に増大させる）として利用した。この設計が、観察する結合部位の特異性の非常に高感度な分析をさせる間、Ｐ側の全ての基質混合物をＰ’側と比べた触媒率の間に、とても興味深く劇的な相違が、観察された。この相違は、単純に、テンプレート配列上流のＲＷＨＨ（配列番号５３）またはテンプレート配列下流のＷＨＤＲ（配列番号２９）のどちらかによる、基質の伸長から生じ得た。従来の相互作用残基の外側のペプチド配列における変化による、この触媒率の変化は、一般に、アスパラギンプロテアーゼの新規の観察である（Ｄａｖｉｅｓ，１９９０）。この最初の観察は個々のアッセイで行ったが、この効果を、２つのペプチドの混合物の競合開裂アッセイによって、証明および直接測定しようと試みた。これらのデータは、上流ＲＷＨＨ（配列番号５３）配列付加に対する触媒率における、下流ＷＨＤＲ（配列番号２９）配列付加と比較した場合の６０倍の減少を明らかにした、最初の観察を支持した。
（触媒効率に対する、観察された影響の分析）
メマプシン（ｍｅｍａｐｓｉｎ）２の結晶構造の分析（Ｌｉｎ、２０００）および結合阻害剤の位置づけの特異性は、下流のＷＨＤＲ（配列番号２９）配列が、触媒に対して影響を有さない酵素から十分に離れていることを示唆する。しかし、上流のＲＷＨＨ（配列番号５３）配列の付加は、酵素裂溝（ｃｌｅｆｔ）の近傍の外部ペプチドループ挿入を超えて延びず、そしてメマプシン２の２つの配列挿入と、潜在的に相互作用し得る。ペプシンの結晶構造とメマプシン２の結晶構造との比較は、結合裂溝の上流側で同定された、これらの観察された構造的差異を示し、従って、遠位上流基質相互作用を支持し得る。さらに、触媒速度の差異の観察と組み合わせた構造的特徴の存在は、アスパラギン酸プロテアーゼについて以前に観察されなかった、遠位基質結合裂溝の仮定を可能にする。結合裂溝の存在は、基質選択性の可能性を示す。これらの観察に基づいて、本発明者らは、観察された反応動力学的相互作用が、ＲＷＨＨ（配列番号５３）Ｎ末端配列付加（選択的に延びた結合裂溝を示す）から特異的に生じたか否か、またはこの相互作用が、任意の延びた上流配列から生じるか否かを試験した。この目的のために、第三のペプチドを、同じ８残基テンプレート配列であるＥＶＮＬＡＡＥＦ（配列番号５１）を使用し、そしてこれを、ヒトＡＰＰ由来のネイティブ配列であるアミノ酸ＥＥＩＳ（配列番号５２）を用いて上流に伸長させて、合成した。これら３つのペプチドの混合物の競合的切断分析は、上流ＥＥＩＳ（配列番号５１）配列付加および下流ＷＨＤＲ（配列番号２９）配列付加について、実質的に同じ触媒速度を生じ、一方、ＲＷＨＨ（配列番号５３）配列付加は、触媒速度における１／６０の低下をなお実証した。この結果は、触媒効率における変化が、ペプチドの上流残基との相互作用から生じ、特定のアミノ酸配列ＲＷＨＨ（配列番号５３）が、負の影響を有することを確認した。さらに、Ｎ末端アミノ酸組成は、触媒速度を直接変更したので、これら４つの遠位位置にある残基優先度の可能性の分析は、次なる実験の目的となった。
（上流結合相互作用についての基質側鎖特異性の決定）
触媒効率に対する負の影響が、ＲＷＨＨ（配列番号５３）の特異的上流配列伸長に起因したという観察は、結合相互作用が生じていることを示唆する。この相互作用をさらに特徴付けるため、酵素効率におけるこの変化についてのアミノ酸特異性の分析を実施した。この分析を、実施例１に以前に記載されたように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ定量法を使用し、遠位上流位置Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７およびＰ８を調査するための合成基質混合ライブラリーを利用して、実施した。優先度指標として報告された、これら４つの位置についての得られた基質側鎖優先度は、図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄに示される。興味深いことに、Ｔｒｐは、４つ全ての位置において最も優先される残基であり、そしてＴｙｒおよびＭｅｔもまた、改善された触媒効率を実証する。観察された最大の影響を有する位置は、明らかにＰ６であり、Ｔｒｐは、ネイティブのＡＰＰ Ｉｌｅよりも５０倍の増加を有し、そしてＲＷＨＨ（配列番号６３）のＨｉｓ残基は、インキュベーション中に検出可能な産物を生じなかった。疎水性残基に対する強力な優先度は、改善された触媒効率を生じる疎水性相互作用が存在することを示唆する。
（配列の概要）
表１３は、本明細書中に記載される核酸配列およびアミノ酸配列の概要である。
（表１３）
Figure 0004547152
Figure 0004547152
Figure 0004547152
 。
図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｇおよび１Ｈは、メマプシン２基質混合物の８つの位置（それぞれＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’）におけるアミノ酸残基（一文字コード）についてのメマプシン１の選択指標を示す。 図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇおよび２Ｈは、メマプシン２基質混合物の８つの位置（それぞれＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’）におけるアミノ酸残基（一文字コード）についてのメマプシン２の選択指標を示す。 図３は、メマプシン１活性の阻害に対するメマプシン２活性の阻害についての阻害剤（ＧＴ−１０１７、ＧＴ−１０２６、ＯＭ００−３およびＧＴ−１１３）の選択性を示す。 図４は、メマプシン１の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｉｎｄｅｘ（ＧＩ）：２１０４０３５８；配列番号１）を示す。 図５は、メマプシン１の核酸配列（ＧＩ：２１０４０３５８；配列番号１）の推定アミノ酸配列（ＧＩ：１９９２３３９５；配列番号２）を示す。アミノ酸残基４６７〜４９４の膜貫通ドメインに下線を付す。 図６は、プロメマプシン１−Ｔ１（配列番号３）の核酸配列を示す。 図７は、プロメマプシン１−Ｔ１ヌクレオチド配列（配列番号３）の推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。ベクター（ｐＥＴ−１１）配列（残基１〜１４）は下線が引かれる。 図８は、メマプシン２の核酸配列（ＧＩ番号２１０４０３６９；配列番号５）を示す。 図９は、メマプシン２の核酸配列（ＧＩ：２１０４０３６９；配列番号５）の推定アミノ酸配列（ＧＩ：６９１２２６６；配列番号６）を示す。アミノ酸残基１〜２１は、シグナルペプチドを示す。アミノ酸残基２２〜４５は、プロペプチドを示す。アミノ酸残基４５５〜４８０（下線が引かれる）は、メマプシン２の膜貫通ドメインを示す。 図１０は、プロメマプシン２−Ｔ１の核酸配列（配列番号７）を示す。 図１１は、プロメマプシン２−Ｔ１の核酸配列（配列番号７）によってコードされたプロメマプシン２−Ｔ１の推定アミノ酸（配列番号８）を示す。ベクター（ｐＥＴ−１１）配列（アミノ酸残基１〜１５）は、下線が引かれる。 図１２は、結晶構造決定において一般的に使用されるメマプシン２のアミノ酸配列（配列番号９）の番号付けスキームを示す。残基は、アミノ末端Ｌｅｕ ２８Ｐ〜Ｖａｌ ４８Ｐから番号付けされ、隣接するＧｌｕ １に続き、そしてＴｈｒ３９３まで連続して番号付けされる。アミノ酸Ｇｌｕ １は、成熟プペプシンのアミノ末端に対応する。 図１３は、阻害剤ＯＭ９９−２およびＯＭ００−３の阻害剤残基（Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’）についての平均Ｂ Ｆａｃｔｏｒを示す。 図１４は、阻害剤化合物ＯＭ００−３、およびメマプシン２とＯＭ００−３との結晶化複合物から決定されるようなメマプシン２とのその相互作用の略図である。ＯＭ００−３と接触する（４．５Å未満の残基）メマプシン２残基は、太字で示される。ＯＭ００−３の原子とメマプシン２のアミノ酸残基との間に示される点線は、水素結合相互作用である。ＯＭ００−３複合体と異なる阻害剤ＯＭ９９−２とメマプシン２のアミノ酸残基との間の相互作用は、イタリック体で示される。 図１５Ａおよび１５Ｂは、アラニン（点描の棒）またはバリン（黒塗りの棒）のＰ２’アミノ酸残基とのＰ３’位およびＰ４’位のアミノ酸残基選択性を示す。 図１６は、メマプシン２とＯＭ００−３またはＯＭ９９−２との結晶性複合体における、阻害剤化合物ＯＭ００−３およびＯＭ９９−２とメマプシン２との間の相互作用を示す。化合物の側鎖は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’およびＰ４’として示される。 図１７は、キャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−２によるメマプシン２活性の阻害を図示する。 図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃは、Ｈｅｌａ細胞へのキャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−１（４、４０または４００ｎＭ）、ＣＰＩ−２およびフルオレセイン（Ｆｓ）単独の侵入を示す。未処理の細胞は、「細胞のみ」と標識される。 図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、２５ｎＭのＣＰＩ−１（パネルＡの斜線部分およびパネルＢまたはＣの斜線でない部分）またはフルオレセインコントロール（パネルＡの斜線でない部分およびパネルＢおよびＣの斜線部分）の腹腔内注射のそれぞれ、２０分後、２時間後または８時間後のマウスから単離された全血細胞、球状赤血球（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）および脳細胞のフローサイトメトリー分析を示す。 図２０は、キャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−１（斜線部分）およびフルオレセインコントロール（斜線でない部分）の投与後のマウスの脳へのＣＰＩ−１（２５ｎＭ）の侵入のフローサイトメトリー分析を示す。 図２１Ａは、トランスジェニックマウスに、キャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−３（１６、８０、４００μｇ）の投与の２時間後の血漿β−アミロイドタンパク質の用量依存性減少を示す。有意差が、アスタリスク（＊、Ｐ＜０．０１）によって示される。図２１Ｂは、ＤＭＳＯ単独処理と比較したキャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−３またはＯＭ００−３を受けたトランスジェニック動物におけるβ−アミロイドタンパク質の血漿レベルの持続した阻害を示す。ＤＭＳＯコントロールと比較した値における有意差は、単一のアスタリスク（＊、Ｐ＜０．０５）または２つのアスタリスク（＊＊、Ｐ＜０．０１）によって示され、そしてスチューデントｔ検定によって決定された。図２１Ｃは、ＰＢＳコントロールおよびＤＭＳＯコントロールと比較したキャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−３（４００μｇ）、ＯＭ００−３（４００μｇ）、ペプチド（４００μｇ）、ＯＭ００−３とペプチド（４００μｇ）の投与後のトランスジェニックマウスにおけるβ−アミロイドタンパク質血漿レベルの減少を示す。コントロールと比較した値の有意差は、スチューデントｔ検定によって決定され、そしてアスタリスク（＊、Ｐ＜０．０１）によって示される。図２１Ｄは、キャリアペプチド−阻害剤結合体ＣＰＩ−３、ペプチドまたはＰＢＳの４回の注射を受けた（矢印）トランスジェニックマウスにおけるβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）の血漿レベルの減少を示す。有意差は、アスタリスク（＊、Ｐ＜０．０１）によって示される。 図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスジェニックｔｇ２５７６マウスに、阻害剤化合物ＭＭＩ−１３８、ＭＭＩ−１６５およびＭＭＩ−１８５の投与後、β−アミロイドタンパク質（Ａβ）の血漿レベルの減少を示す。 図２３は、アミロイド前駆体タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｐ０５０６７，ＧＩ：１１２９２７；配列番号１０）を示す。アミノ酸残基６６７〜６７６のβ−セクリターゼ部位は、下線が引かれる。アミノ酸残基６７１と６７２との間のβ−セクリターゼ切断部位は、矢印によって示される。 図２４は、メマプシン２（薄い結合として示される）と複合体化したＭＭＩ−１３８（濃い結合として示される）の結晶構造の活性部位領域を示す。 図２５は、ＭＭＩ−１３８とメマプシン２との間の複合体の結晶構造の原子座標において名付けられた原子に対応するように番号付けされたＭＭＩ−１３８の原子を示すＭＭＩ−１３８の構造略図である。 図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄは、メマプシン２基質の、それぞれＰ５、Ｐ６、Ｐ７およびＰ８でのアミノ酸残基選択性を示す。

Claims (18)

  1. 以下の構造式を有する、化合物：
    Figure 0004547152
    、またはその光学異性体、ジアステレオマーまたは薬学的に受容可能な塩であって、
    ここで、Ｒ７−Ｘ１が、−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−、または−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ（ＣＨ３）２）−であり；
    ｍが、２であり；
    Ｒ８が、メチルであり；
    Ｐ１が、イソブチルまたはシクロブチルメチルであり；
    Ｐ１’が、−ＣＨ３であり；
    Ｐ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり；
    Ｐ２’が、イソプロピルまたはイソブチルであり；
    Ｒが、−Ｈであり；
    Ｒ４が、−Ｈであり；
    Ｒ２が、−Ｈであり；そして
    Ｒ３が、２−フラニルメチル、フェニルメチル、ｎ−ブチル、イソプロピル、イソブチル、１−フルオロメチル−２−フルオロエチルである、
    化合物。
  2. Ｐ１が、イソブチルである、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｐ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３である、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｒ３が、２−フラニルメチルまたはフェニルメチルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
  5. Ｒ３が、ｎ−ブチル、イソプロピル、イソブチル、または１−フルオロメチル−２−フルオロエチルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
  6. 以下からなる群より選択される、化合物、またはその薬学的に受容可能な塩：
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    。
  7. 以下からなる群より選択される、化合物、またはその薬学的に受容可能な塩：
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    。
  8. 以下からなる群より選択される、化合物、またはその薬学的に受容可能な塩：
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    Figure 0004547152
    。
  9. 医薬としての使用のための、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
  10. 請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を含む、医薬組成物。
  11. アルツハイマー病の処置における使用のための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の使用。
  12. 以下による状態の処置における使用のための医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の使用：
    ａ）メマプシン１β−セクレターゼ活性に対してメマプシン２β−セクレターゼ活性を選択的に阻害すること、または
    ｂ）β−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害すること、または
    ｃ）該β−セクレターゼ部位が、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目ｂ）、または
    ｄ）β−アミロイドタンパク質を減少させること、
    ここで、該状態が、老人性痴呆またはアルツハイマー病である、使用。
  13. ａ）インビトロサンプルにおけるメマプシン１β−セクレターゼ活性に対してメマプシン２β−セクレターゼ活性を選択的に阻害する方法、または
    ｂ）インビトロサンプルにおけるβ−アミロイド前駆体タンパク質のβ−セクレターゼ部位の加水分解を阻害する方法、または
    ｃ）該β−セクレターゼ部位が、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる、ｂ）に規定される方法、または
    ｄ）インビトロサンプルにおけるβ−アミロイドタンパク質を減少させる方法であって、該インビトロサンプルに、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物を加える工程を包含する、方法。
  14. 結晶化タンパク質を含有する生成物であって、該生成物は、以下：
    請求項１〜９のいずれかに記載の化合物、ならびに
    ａ）タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６、および配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；または
    ｂ）タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含む；または
    ｃ）タンパク質ｂ）由来のタンパク質であって、配列番号６のアミノ酸配列が、膜貫通ドメインを欠いている；または
    ｄ）配列番号５でコード化されたアミノ酸配列を含むタンパク質；または
    ｅ）タンパク質ｄ）由来のタンパク質であって、配列番号５でコード化されたアミノ酸配列が、膜貫通ドメインを欠いている、
    のうちの１つを含む、生成物。
  15. 以下を含有する、結晶化錯体：
    ａ）タンパク質であって、該タンパク質は、配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６、および配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；ならびに
    ｂ）該タンパク質と会合した、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物であって、ここで、該化合物は、Ｓ３結合ポケットおよび／またはＳ３’結合ポケット、および／またはＳ４’結合ポケットおよび／またはＳ４結合ポケットで、該タンパク質と会合している、
    結晶化錯体。
  16. 前記化合物が、
    ａ）前記Ｓ３’結合ポケット、前記Ｓ４’結合ポケットおよび前記Ｓ４結合ポケットからなる群から選択される少なくとも２個の結合ポケットで、前記タンパク質と会合しているか、
    ｂ）該Ｓ３’結合ポケット、該Ｓ４’結合ポケットおよび該Ｓ４結合ポケットで、該タンパク質と会合しているか、または
    ｃ）該Ｓ３’結合ポケットおよび該Ｓ４’結合ポケットで、該タンパク質と会合している、
    請求項１５に記載の結晶化錯体。
  17. 前記Ｓ４’結合ポケットが、配列番号８のＧｌｕ１８８、Ｉｌｅ１８９、Ｔｒｐ２６０およびＴｙｒ２６１からなる群から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、そして／または
    前記Ｓ３’結合ポケットが、配列番号８のＰｒｏ１３３、Ｔｙｒ１３４、Ａｒｇ１９１およびＴｙｒ２６１からなる群から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、そして／または
    前記Ｓ４結合ポケットが、配列番号８のＧｌｙ７４、Ｇｌｎ１３６、Ｔｈｒ２９５、Ａｒｇ３７０およびＬｙｓ３８４からなる群から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、そして／または
    前記Ｓ３結合ポケットが、配列番号８のＧｌｙ７４、Ｇｌｎ７５、Ｇｌｙ７６、Ｌｅｕ９３、Ｉｌｅ１７５、Ｔｒｐ１７８、Ｇｌｙ２９３、Ｔｈｒ２９４およびＴｈｒ２９５からなる群から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含む、
    請求項１５に記載の結晶化錯体。
  18. 以下を含有する、結晶化タンパク質：
    ａ）メマプシン２タンパク質、または配列番号８のアミノ酸残基１〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基１６〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基２７〜４５６、配列番号８のアミノ酸残基４３〜４５６、および配列番号８のアミノ酸残基４５〜４５６からなる群から選択されるアミノ酸残基からなるメマプシン２タンパク質；ならびに
    ｂ）請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
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